KR20100135779A - 활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절 - Google Patents

활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절 Download PDF

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길버트 에이 켈러
그레고리 아이 프로스트
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할로자임, 아이엔씨
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Abstract

기질-분해효소의 생체내 활동 지속시간을 조절하기 위한 방법 및 조합이 제공된다. 본 방법 및 조합은 세포외 기질(ECM)로 투여시 기질-분해효소의 일시적인 생체내 활성화를 허용한다. 제어된 활동 지속시간을 갖는 기질-분해효소는 하나 이상의 ECM 성분들의 증가된 침착 또는 축적에 의해 특징지어지는 ECM-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절{IN VIVO TEMPORAL CONTROL OF ACTIVATABLE MATRIX-DEGRADING ENZYMES}
기질-분해효소의 생체내 활동 지속시간을 조절하기 위한 방법 및 조합이 제공된다. 본 방법 및 조합은 세포외 기질(또는 "ECM")로 투여시 기질-분해효소의 일시적인 생체내 활성화를 허용한다. 제어된 활동 지속시간을 갖는 기질-분해효소는 하나 이상의 ECM 성분들의 증가된 침착 또는 축적에 의해 특징지어지는 ECM-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
세포외 기질(ECM)은 세포와 조직을 위한 중요한 구조적 지지체를 제공한다. ECM 성분들의 과도한 침착 또는 축적의 결과로써 세포외 기질의 결함 내지 변화는 ECM-매개 질환 또는 상태를 초래할 수 있다. 이러한 것들 중에 콜라겐-매개 장애 또는 상태는 풍부한 콜라겐의 섬유성 격막(fibrous septae)의 존재로 특징지어진다. 그러한 질환 또는 상태에 대한 유일하게 허가된 치료법은 수술이며, 이는 매우 침윤성(invasive)일 수 있다. 다른 치료법, 예컨대 듀피트렌 증후군(또한 듀피트렌 구축이라 불림)의 치료를 위한 바늘 건막절개술(needle aponeurotomy) 또는 셀룰라이트에 대한 지방흡입, 또한 매우 침윤성이다.
중성 pH에서 활성인 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제가 ECM-매개 상태, 예컨대, 셀룰라이트(예컨대, 공개된 미국출원번호 US20070224184) 참조; 듀피트렌 증후군(puytren's syndrome)(예컨대, 미국특허번호 USRE39941; 5589171; 6086872 참조); 및 페로니병(Peyronie's disease)(예컨대, 미국특허 6022539 참조)를 치료하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 콜라게나제는 I, II 및 III형 콜라겐을 불가역적으로 절단할 수 있다. 콜라게나제의 연장된 활성은 투여될 수 있는 용량을 제한하며, 또한 연장된 활성화와 관련된 부작용의 위험이 있다. 따라서, ECM-매개 질환 및 상태의 대안적인 치료에 대한 필요가 있다.
따라서, 본원의 목적 중 하나는 ECM-매개 질환 및 상태의 치료를 위한 활성화가능한 기질-분해효소의 방법 및 조합을 제공하는 것이다.
관련 출원
우선권의 이익은 Gilbert Keller 및 Gregory Frost의 "활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절"이라는 제목의 2008.3.6.자 미국 가출원번호 61/068,667호와, Gilbert Keller 및 Gregory Frost의 "활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절"이라는 제목의 미국 가출원번호 61/127,725호에 대해 주장된다. 허용된다면, 상기 주지된 출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 삽입된다.
본 출원은 또한 미국 가출원번호 61/068,667호 및 미국 가출원번호 61/127,725호에 대해 우선권을 주장하는, "활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절"이라는 제목의 미국 특허출원번호(Attorney Dkt. No. 119374-00082/ 3056)와 관련 있다.
본 출원은 또한 "기질 메탈로프로테아제의 온도 민감성 돌연변이체와 이의 용도"라는 제목의 미국 가출원번호(Attorney Dkt. No. 119374-00103/p3077)와 관련 있다.
허용된다면, 상기 주지된 관련 출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 삽입된다.
콤팩트 디스크로 제공된 서열 목록의 참조 삽입
서열목록의 콤팩트 디스크(CD-R)의 전자 버전이 4개의 사본으로 본원에서 제출되며(카피1, 카피2, 카피3, 및 CRF로 표지), 이들의 내용은 그 전체로 참조로서 삽입된다. 위에서 언급된 콤팩트 디스크의 각각의 컴퓨터-인식가능 파일은 2009.3.6자로 제작되었으며, 동일하고, 1.96 메가바이트 크기이며, 명칭은 3056SEQ.PC1.txt.이다.
요약
활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 투여함에 의하여 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로 치료적으로 유효한 양의 AMDE을 투여한다. 상기 양은 치료될 질환 또는 상태의 함수이며, 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 선택되는 AMDE는 생체내 투여 부위, 예컨대, ECM에서 불활성인 것이다. AMDE는 천연적으로-발생하는 기질-분해효소, 이의 종 및 대립형질 및 다른 변이체, 예컨대, 기질 특이성과 같은 활성 또는 안정성과 같은 성질을 변경하기 위해 변형된 효소를 포함한다. 상기 AMDE는 특정 형태의 콜라겐의 절단에 대한 증가된 특이성과 같은 성질을 갖기 위하거나 또는 본원의 방법을 위한 변경된 pH 커브 또는 최적화를 갖기 위한 공정 및 방법에 의하여 변형될 수 있다. 투여 장소에는 없는, 활성화제와 함께 투여 또는 활성화제의 조합은 상기 활성화제가 없어지거나 또는 그렇지 않다면 그 장소로부터 제거됨에 따라 제한된 기간의 시간 동안 활성인 AMDE를 초래한다. 상기 AMDE 및 활성화제는 순차적으로, 동일하거나 분리된 조성물 내 동시에, 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 조건은 활성 시간의 기간이 미리 결정되도록 선택할 수 있다. AMDE는 활성 또는 충분한 활성을 위하여 하나 초과의 활성화제를 필요로 할 수 있다. 상기 AMDE는 자이모겐으로, 전장 성숙 폴리펩티드, 예컨대, 단일-사슬 또는 2개-사슬 폴리펩티드로, 또는 전구체 폴리펩티드로 투여될 수 있다. 상기 AMDE는 조성물, 예컨대, 용액 또는 현탁액 내에, 또는 결정화되거나 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 예시적인 AMDE는 카텝신(cathepsins), 칼페인(calpains) 및 헤파라나제(heparanases)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 상기 AMDE는 표피하로(sub-epidermally) 투여된다. 국소를 포함한 다른 장소에 투여시, 상기 AMDE는 AMDE가 pH 5.5에서 실질적으로 활성이도록(전형적으로 그것의 pH 최대값에서와 비교하여 적어도 약 또는 10%, 11%, 12%, 13% 또는 15%의 이상의 활성이 잔존) 선택된다. 또한, 그러한 투여를 위하여, 상기 AMDE는 전형적으로 중성 pH에서 불활성이다(약 또는 10%, 11%, 12%, 13% 또는 15% 미만의 활성이 잔존). ECM의 질환 및 상태는 예를 들어 콜라겐-매개 질환 및 상태를 포함한다. 그러한 질환 및 상태는 셀룰라이트; 듀피트렌 질환(Dupuytren's disease) 수술후 유착(surgical adhesion), 켈로이드(keloid), 비후성 반흔(hypertrophic scar) 및 함몰된 반흔(depressed scar); 페로니병(Peyronie's disease); 레더호스 섬유증; 관절 경직; 오십견(frozen shoulder) 포함; 기존의 반흔, 수술후 유착, 켈로이드, 비후성 반흔 및 함몰된 반흔 포함; 피부경화증(scleroderma); 림프부종(lymphedema) 및 교원성 대장염(collagenous colitis)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 표피하 투여는 피하 투여, 근육내 투여, 병변내 투여 및 피내(intradermal) 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, ECM으로 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 표피하로 투여함으로써 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 AMDE는 활성화제의 부재시 불활성이거나 부분적으로 불활성이고; ECM에 투여시 상기 활성화제는 상기 효소에 대한 활성화 조건을 제공하여, 이에 의해 AMDE는 활성이 되며, 상기 활성화 조건은 일반적으로 활성화제의 투여전에는 ECM 내에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 AMDE는 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 효소이도록 선택된다.
또한, 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 투여함으로써 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로써, 여기서 상기 AMDE는 중성 pH에서 불활성이고, 상기 활성화제는 상기 AMDE가 투여시 또는 투여후 활성이도록 하는 상기 효소에 대한 산성 pH 활성화 조건을 제공하며, 상기 활성화 조건은 활성화제의 투여전에 투여 위치에 존재하지 않고; 상기 AMDE는 pH 5.5에서 실질적으로 활성인 방법이 제공된다. 상기 AMDE 및 활성화제는 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 및 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 표피하 투여일 수 있다.
또한, 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 투여함으로써 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로써, 여기서 상기 AMDE는 활성화제의 부재시 ECM에서 불활성이며, 따라서, 상기 활성화제는 투여시 상기 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소에 대한 활성화 조건을 제공하고, 상기 활성화 조건은 활성화제의 투여전에 ECM 내에 존재하지 않으며, 상기 활성화제는 금속이온, 온도 및 부형제의 이온강도 또는 환원 또는 산화제 중에서 선택되는 방법이 제공된다. 상기 AMDE 및 활성화제 또는 활성화제들의 조합은 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 및 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 표피하 투여일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 ECM으로 투여함으로써 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로써, 여기서 상기 AMDE는 활성화제의 부재시 ECM에서 불활성이며, 따라서, 상기 활성화제는 ECM에 투여시 상기 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소에 대한 활성화 조건을 제공하고, 상기 활성화 조건은 활성화제의 투여전에 ECM 내에 존재하지 않으며, 상기 활성화제는 금속이온, 온도 및 이온강도 중에서 선택되는 방법이 제공된다. 상기 AMDE 및 활성화제는 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 및 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 표피하 투여일 수 있다.
다른 예시적인 구현예에서, 치료적으로 유효한 양의 활성화가능한 카텝신 L 및 활성화제를 ECM으로 표피하로 투여함으로써 콜라겐-매개 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로써, 여기서 상기 활성화가능한 카텝신 L은 활성화제의 부재시 ECM에서 불활성이며, 상기 활성화제는 ECM으로 투여시 상기 활성화가능한 카텝신 L이 활성이도록 하는 상기 효소에 대한 활성화 조건을 제공하며, 상기 활성화 조건은 활성화제의 투여전에는 ECM 내에 존재하지 않으며, 상기 활성화 조건은 산성 pH인 방법이 제공된다. 예시적인 카텝신 L 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열, 이의 대립형질 또는 종 또는 다른 변이체를 포함하는 것들이며, 여기서 상기 변이체는 변경된 성질 또는 활성을 가지도록 변형되고, 전형적으로는 서열번호 1의 임의로 기재된 아미노산 서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 가지거나 그 이상을 가진다.
일반적으로, 본원의 방법에서, 시간이 경과함에 따라, 활성화제는 국소 환경에 의하여 제거되거나 또는 소멸되거나 또는 중화되며, 따라서 AMDE는 더이상 활성을 잃게 된다. 활성화 조건 및/또는 활성화제는 AMDE가 제한되거나 미리결정된 시간 동안 활성이도록 선택되거나 제조될 수 있다. 활성화제는 AMDE와 동일한 조성물 내 또는 별개의 조성물 내 제공되거나 투여될 수 있으며, 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, AMDE는 투여전 또는 투여시 활성화제에 노출되며, 이에 의해 상기 효소가 투여시 활성을 가진다. 활성화 조건은 pH, 이온강도, 온도 및 금속이온을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 활성화 조건 중 pH는 예컨대 산성 pH, 예를 들면 3 내지 6.5, 또는 3.5 내지 6, 또는 3 내지 5.5, 또는 3 내지 4.5, 또는 4 내지 6, 또는 4 내지 5.5, 또는 4.5 내지 5, 또는 5 내지 6, 예를 들면 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 또는 6.5에서 또는 대략 상기 범위의 pH이다. pH는 AMDE를 원하는 pH에서 완충액 용액과 접촉시킴으로써 얻어질 수 있다. 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 말레이트, 숙시네이트, 락테이트, 글리시네이트, 시트르 인산 및 히스트딘 중에서 선택되는 산을 포함하는 것들을 포함한다. 다른 예시적인 활성 조건은 금속이온 및 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 활성화 조건은 금속이온, 예컨대, Ca2 +, Zn2 + 또는 Mg2 +일 수 있다. 온도는 낮거나 또는 높은 온도일 수 있으며, 여기서 상기 효소는 투여 장소의 온도, 전형적으로 37℃에서 실질적으로 불활성이다. 따라서, 활성화 조건은 온도이며, 온도는 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 또는 37℃ 초과, 예컨대 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 80℃ 및 생체내 조직 또는 세포에 손상을 주지 않는 허용되는 임의의 온도까지의 높은 온도이거나 대략 상기 온도이다.
상기 활성의 시간적 조절은 예를 들면 완충액의 완충용량 및/또는 이의 이온강도의 선택에 의하여 달성될 수 있다. 활성을 위한 미리결정된 시간은 상기 조건들의 선택에 의해 달성될 수 있으며, 그 조건들은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하거나 경험적으로 결정될 수 있다. 미리결정된 시간은 약 또는 1분 내지 수시간 미만의 범위일 수 있으며, 예컨대 약 또는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간일 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, AMDE는 활성화가능하거나 또는 특별한 활성화제 또는 활성화 조건에 의해 활성화될 수 있도록 변형된, 임의의 기질분해효소일 수 있다. 본원의 방법에서 사용하기 위한 AMDE 중에는 리소좀 효소(lysosomal enzyme)가 있다. AMDE는 예를 들면 카텝신, 예를 들면 시스테인 또는 아스파르트산 프로테아제인 카텝신을 포함한다. 이들은 예를 들면 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 카텝신 D 및 카텝신 E를 포함한다. 상기 카텝신들의 예는 서열번호 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96에 기재된 아미노산 서열을 갖는 카텝신, 또는 서열번호 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체로부터 선택되는 임의의 것이다. 다른 변이체는 예를 들면 변경된 성질, 예컨대, 안정성, 또는 활성, 예컨대 기질 특이성을 가지도록 변형된 효소를 포함한다. 변이체는, 예를 들면 서열번호 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열의 폴리펩티드들 중 어느 것과 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 상동성을 가질 수 있다.
본원의 방법에서, AMDE는 투여시 임의의 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 성분들을 절단할 수 있다. 상기 절단은 제한된 시간 동안 일어나며, 제한된 시간은 미리결정될 수 있다. 절단되는 ECM 성분들은 예를 들면 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 프로테오글리칸, 예컨대 I형, II형, III,형 또는 IV형 콜라겐을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 AMDE는 예컨대 방향적 진화 방법(directed evolution method) 또는 다른 방법에 의하여 변경된 성질 또는 활성, 예컨대 IV 형 콜라겐 보다 I형 콜라겐에 대한 증가된 기질 특이성을 갖도록 변형될 수 있다.
다른 제제가 상기 활성화제 및 효소와 함께 투여될 수 있다. 상기 활성화제 및/또는 효소와 동일한 조성물 내에서 또는 별개의 조성물로써 투여될 수 있다. 투여는 동시에, 별개로 또는 간헐적으로 수행될 수 있다. 예시적인 제제는 예를 들면 다른 생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제 및 혈관수축제, 및/또는 이들의 조합 중에서 선택되는 약리 제제(pharmacologic agents)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 분산제는 히알루로산(hyaluronan) 분해 효소, 예를 들면 히알루로니다아제(hyaluronidase), 예를 들면 PH20, 예를 들면 이의 가용성 형태, 특히는 rHuPH20이 있다. 그러한 히알루로니다아제는 전형적으로 상기 효소 및 활성화제의 투여전에 투여된다. 가용성 히알루로니다아제의 예는 서열번호: 226에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 코딩된 rHuPH20 이라 명명된 제품 또는 이의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 또는 서열번호: 226에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 상기 폴리펩티드의 변이체이다.
다른 제제는 리도카인과 같은 마취제 및 예컨대 레보노르데프린(levonordefrin), 에피네프린 및 노르에피네프린을 포함하는 알파 아드레날린성 수용체 작용제와 같은 혈관수축제을 포함한다. 전형적으로 상기 제제는 AMDE 및 활성화제와 함께 또는 그 전에 투여된다. 따라서, 상기 기재한 바와 같이, 활성화가능한 기질-분해효소, 활성화제, 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린을 표피하로 투여함으로써 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 AMDE는 활성화제의 부재시 ECM에서 불활성이다. 상기 효소, 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린은 리도카인이 효소에 앞서 투여됨을 전제로 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린은 효소의 투여에 앞서 투여되거나, 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린은 단일 조성물 내에서 투여될 수 있다. 상기 AMDE 및 활성화제 및 다른 제제는 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 및 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 표피하 투여일 수 있다.
또한, 상기 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 조성물, 용기, 조합물 및 키트를 포함한, 제품이 제공된다. 예를 들면, 2개의 구획을 포함하는 용기가 제공된다. 제1구획은 치료적으로 유효한 양의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)를 포함하며, 여기서 상기 양은 단일 용량 또는 복수의 용량을 위한 것이며, 단일 용량은 ECM의 질환 또는 상태의 치료에 유효하며; 제2구획은 활성화제를 포함하고, 여기서 활성화제는 상기 효소를 활성화하는 것이다. AMDE는 예를 들면, 상기 방법에서 사용되기 위한 앞서 기술된 것들을 포함한 리소좀 효소, 예컨대, 카텝신, 칼페인 및 헤파라나제를 포함한다. 용기 내 AMDE는 예를 들면 pH 5.5에서 실질적으로 활성이며, 선택적으로는 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 AMDE를 포함한 상기 기술된 것들이다. 활성화제는 상기 기술한 것과 같은 활성화 조건을 제공한다. 따라서, 제2구획은 pH 또는 이온강도 변화를 야기하거나 유지시키거나, 예컨대 완충액, Ca2 +, Zn2+, Mg2 +와 같은 금속이온을 제공하는 조성물을 포함할 수 있다. 예시적인 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 말레이트, 숙시네이트, 락테이트, 글리시네이트, 시트르 인산 및 히스트딘 중에서 선택되는 산을 포함하는 것들을 포함한다. 상기 질환 및 상태는 상기 기술된 것들을 포함한다. 용기는 또한 제1 및 제2 구획 내 성분들을 혼합하기 위한 혼합 구획을 포함할 수 있다. 예시적인 용기는 튜브, 병, 무균 용기, 예컨대 주사용 바늘이 있거나 없는 주사기를 포함할 수 있다.
AMDE 및 활성화제는 단일 또는 복수 용량 투여를 위한 양으로 제공된다. 용기 내 AMDE는 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg, 또는 2mg 내지 4mg 인 양으로 제공될 수 있다. 이는 결정화 형태 또는 동결건조 형태와 같은 고체로서, 또는 용액 또는 현탁액, 겔 또는 다른 적절한 형태와 같은 액체 형태로서 제공될 수 있다. 용기 내 액체의 총 부피는 예를 들면 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml, 및 1 내지 10ml 일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 2 이상의 구획을 가지는 용기가 제공되며, 여기서 제1구획은 치료적으로 유효한 양의 활성화가능한 카텝신 L을 포함하며, 그 양은 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태의 치료에 유효하며; 제2구획은 카텝신 L을 활성화하는 것인 산성 완충액를 포함한다. 상기 질환 및 상태는 상기 치료방법을 위해 위에서 기술된 것들이다. 활성화제는 완충액에 의해 제공되는 pH 일 수 있으며, 특히는 산성 완충액은 pH 4.0 내지 5.0, 특히는 4.5 내지 6, 더욱 특히는, 4.0, 4.5, 5, 5.5 또는 6 의 범위이거나 대략 위 범위를 가진다. 예시적인 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 숙신산, 락트산, 말레산, 글리신-염화수소산, 시트르 인산 및 히스트딘과 같은 산을 포함하는 산성 완충액이다. 예시적인 카텝신 L 폴리펩티드는 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열, 이의 대립형질, 종 또는 다른 변이체를 포함하는 것들이고, 여기서 상기 변이체는 변경된 성질 또는 활성을 가지도록 변형되고, 전형적으로 서열번호 1의 어느 곳에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가진다. 활성화가능한 카텝신 L은 특히는 2개-사슬 또는 단일-사슬 형태인 활성화된 성숙한 형태의 동결건조 분말 형태로 제공될 수 있다. 용기 내 활성화가능한 카텝신 L의 양은 상기 특정 질환 또는 상태의 치료를 위하여 치료적으로 유효한 것이며, 예를 들면, 약 또는 10㎍로부터 또는 100mg 까지, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg 및 2mg 내지 4mg의 범위일 수 있다. 상기 특정 량은 특정 질환 또는 상태에 따를 수 있으며, 필요한 경우, 경험적으로 결정될 수 있다. 카텝신 L은 고체 예컨대 동결건조 분말, 페이스트 또는 액체 예컨대 현탁액, 분산액 또는 용액으로써 제공될 수 있다. 용기 내 부피는 카텝신 L의 양 및 의도된 경로 및/또는 투여 장소에 적절할 수 있다. 예를 들면, 전형적인 용기 내 부피는 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml이다.
또한, 상기 기술된 용기(들) 및 다른 약리학적으로 유효한 제제를 포함하는 하나 이상의 추가적 용기를 포함하는 조합물을 제공한다. 상기 제제는 생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제 및 혈관수축제 및 이들의 조합 중에서 선택될 수 있다. 이들 제제는 상기 방법에 관련된 상기 기술된 것과 같은 제제와 양을 포함한다. 예를 들면, 추가적인 용기는 히알루로니다아제, 예컨대 rHuPH20을 포함할 수 있다. 양은 예를 들면 약/또는: 10유닛 내지 500,000유닛, 100유닛 내지 100,000유닛, 500유닛 내지 50,000유닛, 1000유닛 내지 10,000유닛, 5000유닛 내지 7500유닛, 5000유닛 내지 50,000유닛, 또는 1,000유닛 내지 10,000유닛일 수 있다. 다른 용기는 마취제, 예컨대 리도카인을 예를 들어 약 또는 10mg 내지 1000mg, 100mg 내지 500mg, 200mg 내지 400mg, 20mg 내지 60mg, 또는 30mg 내지 50mg 의 양으로, 및/또는 혈관수축제, 예컨대 레보노르데프린, 에피네프린 또는 노르에피네프린을 포함한 알파 아드레날린성 수용체 작용제를 투여 장소 및 지역에서 혈관수축을 실행할 수 있는 양으로 포함할 수 있다. 상기 양은 예를 들면 에피네프린 또는 다른 혈관수축제, 약 또는 10㎍ 내지 5mg, 50㎍ 내지 1mg, 50㎍ 내지 500㎍, 50㎍ 내지 250㎍, 100㎍ 내지 500㎍, 200㎍ 내지 400㎍, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg 이다. 상기 추가적인 약리학적으로 유효한 제제의 각각은 한 용기 내에 임의의 조합으로 혼합되거나, 단일 용기 내에 제공될 수 있다. 이들은 카텝신 L을 위한 상기 예시되고 기재된 것과 같은 액체 또는 고체로서 제공될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 조합물은 AMDE 및 활성화제를 포함할 수 있고, 상기 용기는 적어도 2개의 약리학적으로 유효한 제제를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 약리학적 제제는 서로 분리된 별개의 조성물로써 제공되거나 또는 동일한 조성물 내에 동일한 용기내에 제공된다. 예를 들면, 상기 추가적인 용기는 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린의 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 용기는 바늘이 있거나 없는 주사기의 형태일 수 있다. 상기 추가적인 용기(들) 내 전체 부피는 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml, 또는 1 내지 10ml이다.
예시적인 구현예에서, 상기 조합물은 카텝신 L 및 히알루로니다아제, 예컨대 rHuPH20을 포함한다. 이들은 별개의 조성물로써 제공될 수 있거나, 한 용기 내 단일 조성물 내에 존재한다. 상기 조합물은 카텝신 L을 활성화시키는 산성 완충액을 포함한다. 상기 완충액은 별개의 용기 내에 제공되거나 상기 카텝신 L 및 히알루로니다아제 중 어느 하나 또는 둘다와 혼합되어 제공될 수 있다.
또한 산성 완충액과 동시에 또는 순차적으로 투여시 ECM-매개 질환 또는 상태의 치료에 유효한 양의 카텝신 L을 포함하는 약학적 조성물로써, 상기 조성물은 단일 용량 투약을 위해 제형화되고; 상기 완충액은 카텝신 L을 활성화하는 pH를 가지는 조성물이 제공된다. 상기 카텝신 L의 양은 상기 특정 질환 또는 상태에 대하여 유효한 것이며, 예를 들면, 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg, 또는 2mg 내지 4mg 이다. 상기 조성물은 리도카인, 에피네프린 및 히알루로니다아제의 하나 이상을 추가로 포함한다.
상기 용기 및/또는 조합물 및 조성물은 키트로서 포장될 수 있다. 상기 키트는 용기 및/또는 조합물 및 선택적으로 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 추가적인 시약, 본원에서 제공되는, 바이알, 튜브, 주사기 및 바늘과 같은 투약장치 및/또는 상기 사용을 위한 사용설명서를 포함한다.
본 발명의 방법 및 조합물은 세포외 기질(ECM)로 투여시 기질-분해효소의 일시적인 생체내 활성화를 허용한다. 제어된 활동 지속시간을 갖는 기질-분해효소는 하나 이상의 ECM 성분들의 증가된 침착 또는 축적에 의해 특징지어지는 ECM-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
도1 내지 7: 도1 내지 7은 프로펩티드, 촉매작용 도메인, 링커 도메인, 헤모펙신 도메인 1-4, 피브로넥틴 II형 반복, 염기성 지역, 시스테인 스위치, 칼슘(Ca) 결합 위치 I 및 II, 및 아연 결합 위치를 지시하는 자이모겐 MMP들의 배열이다. 상기 배열은 MMP-1(서열번호:327), MMP-8(서열번호:101의 아미노산 21-467), MMP-13(서열번호:104의 아미노산 20-471), MMP-18(서열번호:107의 아미노산 18-467), MMP-2(서열번호:110의 아미노산 30-660), MMP-9(서열번호:113의 아미노산 20-707), MMP-3(서열번호:116의 아미노산 18-477), MMP-10(서열번호:119의 아미노산 18-476), MMP-11(서열번호:122의 아미노산 32-488), MMP-7(서열번호:125의 아미노산 18-267), MMP-26(서열번호:128의 아미노산 18-261), MMP-12(서열번호:131의 아미노산 17-470), 및 MMP-19(서열번호:146의 아미노산 19-508)을 포함한 자이모겐 MMP들을 포함한다. "*"는 그 컬럼의 잔기들 또는 뉴클레오티드들이 상기 배열 내에서 모든 서열들에서 동일한 것을 의미하고, ":"은 보존적 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."는 반-보존적 치환이 관찰되는 것을 의미한다.
도8 내지 11: 도8 내지 11은 예시적인 보존적(conserved) 및 보전적(conservative) 아미노산 잔기들을 지시하는, 예시적인 MMP들의 촉매작용 도메인의 배열이다. 다른 보존적 및 보전적 아미노산 잔기들이 MMP들 간에 존재하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 도면 및 잔기들의 확인은 MMP들 간에 상응하는 잔기들을 한정하는 의도는 아니다. 예시적인 MMP들은 MMP-1(서열번호:327의 아미노산 81-242), MMP-8(서열번호:101의 아미노산 101-242), MMP-13(서열번호:104의 아미노산 104-248), MMP-18(서열번호:107의 아미노산 100-246), MMP-2(서열번호:110의 아미노산 110-417), MMP-9(서열번호:113의 아미노산 94-425), MMP-3(서열번호:116의 아미노산 100-247), MMP-10(서열번호:119의 아미노산 99-246), MMP-11(서열번호:122의 아미노산 98-228), MMP-7(서열번호:125의 아미노산 95-242), MMP-26(서열번호:128의 아미노산 90-236), MMP-12(서열번호:131의 아미노산 106-247), 및 MMP-19(서열번호:146의 아미노산 98-239)를 포함한다. 예시적인 보존적 및 보전적인 치환이 강조되어 있다.
상세한 설명
개요
A. 정의
B. 세포외 기질
1. ECM 의 성분
a. 콜라겐
b. 엘라스틴
c. 피브로넥틴
d. 글리코사미노글리칸( GAG )
i. 프로테오글리칸
ii . 히알루론산
2. 피부의 조직학
a. 표피
b. 진피
c. 피하조직
3. ECM 의 질환
C. 기질-분해효소
1. 효소 활성화
a. 세린 프로테아제
b. 시스테인 프로테아제
i. 카텝신
카텝신 L
ii . 칼페인
c. 아스파르트산 프로테아제
d. 메탈로프로테아제
e. 헤파라나제
D. 활성화가능한 기질-분해효소( AMDE )
1. 활성화 조성 및 활성화가능한 기질-분해효소의 활성화 방법
a. 활성화 조건 - 산성 pH
b. 활성화 조건 - 금속 양이온 농도
c. 활성화 조건 - 환원제
d. 활성화 조건 - 온도
i. 온도-민감성 기질 메탈로프로테아제
1) 예시적인 tsMMP -1 변형
2) 조합
3) 추가적 변형
4) 다른 MMP 들
2. 기질-분해효소 및 활성화제의 조합
E. 기질-분해효소를 코딩하는 핵산 및 이의 폴리펩티드 제조 방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵세포
b. 효모세포
c. 곤충세포
d. 포유동물 세포
e. 식물
3. 정제 기술
F. 활성화가능한 기질-분해효소의 제조, 제형화 및 투여
1. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
동결건조 분말
2. 국소 투여
3. 다른 투여경로를 위한 조성물
4. 조합 치료법
a. 히알루로난 분해효소
i. 히알루로니다아제
1) 포유동물-형 히알루로니다아제
2) 박테리아 히알루로니다아제
3) 거머리, 다른 기생동물 및 갑각류 유래 히알루로니다아제
ii . 다른 히알루로난 분해 효소
iii . 가용성 히알루로난 분해 효소
1) 가용성 인간 PH20
2) rHuPH20
iv . 약동학적 성질을 개선하기 위한 히알루로난 분해효소의 변형
G. 활성화가능한 기질-분해효소의 포장 및 제조품
1. 단일 챔버 장치
2. 이중 챔버 장치
3. 키트
H. 기질-분해효소의 활성 평가 방법
1. 효소적 활성 평가 방법
2. ECM 분해 평가 방법
a. 시험관내 시험
b. 생체내 시험
c. 비인간 동물 모델
I. 예시적인 ECM 의 질환 또는 결함의 치료 방법
콜라겐-매개 질환 또는 상태
a. 셀룰라이트
b. 듀피트렌 질환
c. 페로니병
d. 레더호스 섬유증
e. 관절 경직
f. 기존의 반흔
i. 수술후 유착
ii . 켈로이드
iii . 비후성 반흔
iv . 함몰된 반흔
g. 피부경화증
h. 림프부종
i. 교원성 대장염
J. 실시예
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우세한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공공의 전파를 증명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포외 기질(ECM)은 특정화된 조직 및 기관의 세포들을 둘러싸고, 이들의 구조적 지지체를 제공하는 복잡한 그물망(meshwork) 구조물을 나타낸다. ECM은 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조 단백질; 피브로넥틴과 같은 특수 단백질; 및 프로테오글리칸으로 이루어져 있다. 정확한 생화학적 조성은 조직과 조직 간에 다양하다. 예를 들면, 피부에서 이는 ECM을 포함하는 진피층이다. "간질(interstitium)"이란 언급은 ECM을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, ECM의 성분은 결합 조직의 세포에 의해 만들어지고, 간질로 분비되는 임의의 물질을 나타낸다. 본원의 목적을 위하여, ECM 성분이라는 언급은 단백질 및 당단백질을 나타내며, 다른 세포 성분 또는 다른 ECM 성분을 나타내지는 않는다. 예시적인 ECM 성분은 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 프로테오글리칸을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기질분해효소는 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는 임의의 효소를 나타낸다. 기질-분해효소는 공유 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소인 프로테아제를 포함한다. 기질-분해효소는 당해 기술분야의 당업자에게 알려진 임의의 것, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 것(예를 들어, 표3 참조), 이들의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기질 메탈로프로테아제(MMP)는 활성을 위해 필요한 활성 위치 Zn2 + 를 포함하는 아연-종속적 엔도펩티다아제인 기질분해효소의 한 종류이다. MMP는 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 프로테오글리칸을 포함하나 이에 제한되지 않는 ECM 성분을 분해하는 효소를 포함한다. MMP는 일반적으로 프로펩티드, 촉매작용 도메인, 프롤린 링커 및 헤모펙신(또한 헤모펙신-유사 C-말단이라 불림) 도메인을 포함한다. 일부 MMP들은 추가적인 도메인을 포함한다. 예시적인 MMP는 표 5에 기재되어 있다. MMP에 대한 언급은 모든 형태, 예를 들면, (시그널 서열을 포함하는) 전구체 형태, (프로펩티드를 포함하는) 프로엔자임 형태, 프로세싱된 활성 형태, 및 하나 이상의 도메인을 결여한 이들의 형태를 포함한다. 예시적인 MMP의 도메인들은 도 1 내지 7 에서 확인된다. MMP는 또한 이들의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 변형된 기질-분해효소 (또는 기질-분해효소의 변이체)는 야생형 효소와 비교하여 1차 서열에 하나 이상의 변형을 가지는 효소를 나타낸다. 상기 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 교체(치환), 삽입, 결실 및 이들의 임의의 조합일 수 있다. 변형된 효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 변형된 위치를 가지는 것들을 포함한다. 변형된 효소는 야생형 효소의 활성을 유지하나, 변경된 기질 특이성 또는 안정성을 가질 수 있다. 변형된 효소는 전형적으로 야생형 효소의 상응하는 아미노산 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 리소좀 효소는 그의 분해 기능이 산성 pH에서 최적인 효소를 나타낸다. 낮은 pH의 필요에 의하여, 상기 효소들은 일반적으로 세포의 리소좀 내에 존재한다. 리소좀 효소는 카텝신 S, K, L, B, C, H, F, O, R, V, D 및 E 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 리소좀 효소의 예는 서열번호 56, 59, 62, 64, 179, 67, 70, 73, 76, 182, 185, 188, 79, 194, 89, 92 및 95 에 기재된 전구체 형태 및 서열번호 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96에 기재된 이들의 성숙한 형태 또는 이들의 대립형질 변이체 또는 종 변이체 또는 다른 변이체를 포함한다. 다른 리소좀 효소는 리소좀 산성 리파아제(lysosomal acid lipase), 위 리파아제(gastric lipase), 담즙산염-활성화 리파아제(서열번호:196 내지 207 중 어느 것에 기재된, 이들의 성숙한 형태를 포함하는, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산서열)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "온도 민감성(ts) 돌연변이체 또는 돌연변이" 또는 "온도 민감성을 수여하는 변이체 또는 변형"은 비-허용 온도라 불리는 어떤 온도와 비교하여 허용 온도라 불리는 다른 온도에서 더 높은 효소 활성을 나타내도록 변형된 폴리펩티드를 나타낸다. 일반적으로, 온도-민감성 돌연변이체는 더 높은 온도 보다 더 낮은 온도에서 더 높은 효소 활성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 허용 온도는 폴리펩티드가 비허용 온도라 불리는 제2의 온도에서보다 더 높은 효소 활성을 나타내는 온도이다. 따라서, 본원에서 제공되는 변형된 효소는 한 온도에서 다른 온도에서보다 더 높은, 상이한 온도에서 상이한 활성을 나타낸다. 폴리펩티드가 더욱 높은 활성을 나타내는 온도가 허용 온도이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비허용 온도는 폴리펩티드가 허용 온도 보다 더 낮은 효소 활성을 나타내고, 변형되지 않은 효소와 비교하여 감소된 활성을 나타내는 온도이다. 본원에서 제공되는 온도-민감성 돌연변이체는 허용 온도 활성의 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 내지 100% 미만까지의 효소 활성을 비허용 온도에서 나타낸다. 본원에서 제공되는 온도 민감성 돌연변이체는 또한 비허용 온도에서 변형되지 않은 효소(예를 들면, 야생형 효소)와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 내지 100% 미만까지의 활성을 비허용 온도에서 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비허용 온도와 비교한 허용 온도에서의 효소 활성의 비율은 허용 및 비허용 온도에서 효소 활성의 관계를 나타낸다. 이는 허용 온도에서 활성을 비허용 온도에서 활성으로 나눈 몫으로 표현된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 생리학적 온도는 체내에서 유지되는 온도 조건을 나타내며, 약 37℃이며, 예를 들면 약 또는 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃ 또는 39℃이다. 인체 온도의 정상 범위는 대사속도, 특정 기관 및 다른 요인들과 같은 요인에 따라 변한다. 본원의 목적을 위하여, 생리학적 온도는 정상 실내 온도(예를 들면, 22.7℃ 내지 24.4℃)에서 유지되는 방안에 실내에 있는 단식하지 않은, 편안하게 입은 대상에 대해 존재하는 온도이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가역적인"은 허용 온도에서 효소의 활성이 비허용 온도에 노출되고 허용 온도에 재노출시 회복되거나 또는 부분적으로 회복될 수 있는 변형된 효소를 나타낸다. 따라서, 일단 비허용 온도에 노출되면 가역적인 효소의 활성은 허용 조건에만 노출된 효소의 활성과 비교하여 동일하거나 상당히 유지되며, 비허용 온도에만 노출된 효소의 활성보다는 더 크다. 예를 들면, 비허용 조건으로부터 허용 조건으로 복귀시 가역적인 효소는 비허용 온도에만 노출된 효소의 활성의 약 또는 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200% 또는 그 이상을 나타내며, 허용 온도에만 노출된 효소의 활성을 유지한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비가역적" 또는 "불가역적"은 비허용 온도에 노출되고 허용 온도에 재노출시 효소의 허용 온도에서 효소 활성이 회복되지 않는 변형된 효소를 나타낸다. 따라서, 일단 비허용 온도에 노출되면 비가역적인 효소의 활성은 허용 온도에만 노출된 효소의 활성 미만이고, 또한 비허용 조건에만 노출된 효소의 활성 미만이거나, 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, 허용 조건으로 복귀시, 비가역적인 효소는 비허용 온도에서 활성 약 또는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120% 및 오직 허용 온도에만 노출된 효소의 활성에서 활성의 100% 미만을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 도메인은 구조적으로 및/또는 기능적으로 구별할 수 있거나 또는 정의할 수 있는 폴리펩티드의 부분(3개 이상, 일반적으로 5 또는 7 이상의 아미노산의 서열)을 나타낸다. 예를 들면, 도메인은 1개 이상의 구조적 모티프(예를 들면, 루프 지역으로 연결된 알파 헬릭스 및/또는 베타 스트랜드의 조합)로 이루어진 단백질 내 독립적으로 폴딩된 구조를 형성할 수 있거나/있고 기능적 활성, 예컨대 키나아제 활성에 의하여 인식되는 것들을 포함한다. 단백질은 하나 또는 하나 초과의 구별되는 도메인을 가질 수 있다. 예를 들면, 도메인은 관련 족 구성원(family member)에 대한 그안의 서열 상동성, 예를 들면, 세포외 도메인을 정의하는 상동성 및 모티프에 의하여 식별되거나, 정의되거나, 구별될 수 있다. 다른 예에서, 도메인은 그 기능, 예를 들면, 키나아제 활성, 또는 생물분자와 상호작용하는 능력, 예컨대 DNA 결합, 리간드 결합 및 이량체화와 같은 효소 활성에 의하여 구별될 수 있다. 도메인은 독립적으로 또는 다른 분자에 융합되어 예컨대, 단백질 가수분해 활성 또는 리간드 결합과 같은 활성을 달성할 수 있도록 독립적으로 기능 또는 활성을 나타낼 수 있다. 도메인은 아미노산의 선형 서열 또는 폴리펩티드 유래 아미노산의 비선형 서열일 수 있다. 많은 폴리펩티드들은 복수의 도메인을 포함한다. 예를 들어, MMP들의 도메인 구조가 도 1 내지 7 에 나타나 있다. 당업자는 도메인들에 익숙하고, 구조적 및/또는 기능적 상동성에 의하여 이들을 다른 그러한 도메인과 식별할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 촉매작용 도메인은 촉매적 또는 효소적 기능을 나타내는 폴리펩티드의 임의의 부분을 나타낸다. 상기 도메인 또는 지역은 일반적으로 기질과 상호작용하여 그의 촉매작용을 일으킨다. MMP의 경우, 촉매작용 도메인은 아연 결합 모티프를 포함하고, 이는 3개의 히스티딘 잔기에 의해 결합된 Zn2 + 이온을 포함하고, 보존된 서열 HExxHxxGxxH에 의해 나타내어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프롤린 리치 링커(또한 힌지 지역이라고 불림)는 결정가능한 기능을 갖지 않는 유연성 있는 힌지 또는 링커 지역을 나타낸다. 상기 지역은 전형적으로 도메인들 또는 지역들 사이에서 발견되며, 폴리펩티드의 유연성에 기여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 헤모펙신 결합 도메인(hemopexin binding domain) 또는 헤모펙신-유사 C-말단 도메인(haemopexin-like C-terminal domain)은 MMP의 C-말단 지역을 나타낸다. 이는 4개 잎의 β-프로펠라 구조이며, 이는 단백질-단백질 상호작용에 관여한다. 예를 들면, MMP의 헤모펙신 결합 도메인은 다양한 기질과 상호작용하며, 또한 억제제, 예를 들면 메탈로프로테아제의 조직 저해제(tissue inhibitor of metalloprotease: TIMP)와 상호작용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "필수적으로 이루어진" 또는 폴리펩티드가 특정 도메인, 예를 들면 촉매작용 도메인으로 필수적으로 이루어져 있다는 기재는 폴리펩티드의 오직 MMP 부분만이 상기 도메인 또는 이의 촉매적으로 활성인 부분이라는 것을 의미한다. 폴리펩티드는, 예컨대 다른 폴리펩티드 내로 삽입 또는 그에 결합에 의해, 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의, 추가적인 아미노산의 비-MMP-유래 서열을 임의적으로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "자이모겐"은 불활성 전구체이며, 활성이 되기 위하여 어떤 변화, 예컨대, 폴리펩티드의 단백질가수분해(proteolysis)를 필요로 하는 효소를 나타낸다. 일부 자이모겐은 또한 예를 들어 활성화를 위하여 pH, 이온강도, 금속이온 또는 온도, 그러나 이에 제한되지 않는 보조인자(cofactor)의 추가를 필요로 한다. 자이모겐은 효소의 프로엔자임(proenzyme) 형태를 포함한다. 따라서, 자이모겐은 일반적으로 불활성이고, 추가적인 보조인자의 존재 또는 부재하 자이모겐으로부터 프로리전(proregion)의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의하여 성숙한 폴리펩티드로 전환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프로세그먼트(prosegment) 또는 프로리전(proregion)은 성숙한 단백질을 생산하기 위해 절단되는 지역 또는 조각을 나타낸다. 이는 촉매 기구를 차폐함으로써 효소 활성을 억제하는 기능을 하는 조각을 포함할 수 있다. 프로리전은 성숙한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열이며, 몇 아미노산 정도로 작을 수 있으며, 복수도메인 구조일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 활성화 서열은 활성인 프로테아제를 형성하기 위한 활성화 절단 또는 성숙화 절단을 위해 요구되는 위치인 자이모겐 내 아미노산 서열을 나타낸다. 활성화 서열의 절단은 자가촉매적으로 또는 활성화 파트너에 의하여 촉매될 수 있다.
활성화 절단은 활성을 위해 요구되는 구조적 변화가 일어나는 성숙화 절단의 한 종류이다. 활성화는 프로테아제의 다중-사슬 형태, 예를 들면, 2개-사슬 형태의 생산을 초래한다. 일부 예에서, 프로테아제의 단일 사슬 형태는 단일 사슬로써 단백질 가수분해 활성을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 보조인자(cofactor)는 효소의 활성을 위해 요구되는 조건 또는 인자를 나타낸다. 보조인자는 효소적 활성을 위해 필요한 임의의 것을 포함한다. 보조인자의 예로 pH, 이온강도, 금속이온 또는 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 효소의 생체내 투여와 관련하여, 보조인자는 내인성 존재 인자 및 외인성 제공 인자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 활성화 조건은 효소의 활성을 위해 요구되는 임의의 물리적 조건 또는 조건들의 조합을 나타낸다. 본원의 목적을 위하여, 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)를 위한 활성화 조건은 효소의 활성화를 위해 요구되는 양(즉, 양, 정도, 수준 또는 다른 물리적 치수)으로 투여 위치에 존재하지 않는, 예를 들면 세포외 기질에는 존재하지 않는 것들을 포함한다. 활성화 조건의 예는 pH, 금속이온, 환원 또는 산화제, 온도 및 이온강도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 낮은 pH 의 조건에서 활성이나, 중성 pH 에서 불활성인 리소좀 기질-분해효소의 경우, 상기 불활성 효소의 산성 pH 인 활성화 조건에의 노출은 상기 효소의 활성화를 초래한다. 활성화 조건은 효소의 투여 위치에는 존재하지 아니하나 외인성으로 첨가되어야 한다는 사실에 의하여, 상기 활성화 조건은 시간 경과에 따라 소멸하거나/하고 중화되어 상기 활성화 조건은 더이상 효소를 활성화하도록 존재하지 않는다. 따라서, 상기 효소는 투여시 제한되거나, 미리결정된 시간동안 활성일 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 활성화제는 활성화가능한 기질-분해효소를 위한 활성화 조건을 제공하는 임의의 조성물을 나타낸다. 활성화제의 예는 pH 완충액, 냉각된 완충액, 또는 칼슘 완충액을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)"는 활성이기 위한 활성화 조건을 필요로 하는 기질분해효소를 나타낸다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들면, AMDE는 AMDE의 투여 전에, 함께 또는 이어서 활성화제에 노출되지 않았다면 ECM에서 실질적으로 불활성이며, 이에 의하여 효소를 위한 활성화 조건을 제공한다. 따라서, 활성화가능한 효소의 활성화는 생체내 장소 또는 위치에서 상기 효소가 활성인 동안인 시간의 기간이 활성화 조건의 소멸 및/또는 중화의 결과로써 미리 결정되거나/되고 조절(즉, 시간적으로 제어할 수 있거나, 또는 시간-조절)될 수 있도록 외인성 조건에 의해 조절된다. 따라서, 활성화 조건에의 노출에 의하여, 상기 효소는 ECM 내에서 제한된 시간 동안 및/또는 제한된 정도로 활성을 나타낸다. 활성화의 정도 및 시간은 활성화제 또는 활성화 조건의 선택에 의하여 제어될 수 있고, 미리결정될 시간 동안일 수 있다. 예를 들면, 리소좀 효소, 예컨대, 카텝신 L은 그것이 산성 완충 용액에 의해 제공되는 것과 같은 활성화 조건인 pH에 노출됨으로써 활성화될 수 있다는 점에서 활성화가능하다. 활성화된 효소를 ECM의 중성 pH 환경으로 투여시, 상기 pH 환경은 산성 완충액의 완충용량에 기초하여 미리결정된 시간의 기간 내에 중성을 회복하여 효소는 불활성이 될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "활성화제의 양"은 활성화제의 양, 정도 또는 수준을 나타낸다. 활성화제의 양은 농도 또는 절대적인 양, 또는 특정 온도 또는 pH일 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 활성화제의 양은 전형적으로 효소의 조건적 활성화를 초래하기 위해 충분한 양이다. 상기 양은 활성화의 지속시간을 변경하기 위하여 활성화가 제한되거나 미리결정된 시간 동안일 수 있도록 조정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적으로 유효한 양" 또는 "치료적으로 유효한 복용량"은 치료적 효과를 생산하기 위해 최소한으로 충분한 제제, 화합물, 물질 또는 화합물을 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 제한된 시간 동안 또는 제한된 지속시간 동안 활성인 효소는 시간 경과에 따라 소멸하거나/하고 중화되는 활성을 가지는 활성 효소를 나타낸다. 따라서, 활성화 조건의 부재에 의하여 효소는 불활성이 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 미리결정된 시간은 사전에 알려진 제한된 것을 의미하고 조절될 수 있다. 효소의 활성을 위해 요구되는 활성화 조건의 소멸 및/또는 중화는 적정화될 수 있으며, 따라서 활성 효소가 불활성이 되기 위해 요구되는 시간을 알 수 있다. 예를 들면, 산성 매질 내 투여되어, 중성 pH를 가지는 생체내 환경(즉, ECM)에 노출되는 산 활성화 효소는 시간 경과에 따라 점차적으로 증가되는 pH에 노출되며, 따라서, 상기 효소는 오직 제한된 시간 동안 활성을 유지하게 될 것이다. pH 증가 속도는 예를 들어 산성 완충액의 완충용량을 변화시킴으로써 조절될 수 있으며, 따라서, 활성 효소가 불활성이 되기 위해 요구되는 시간의 기간을 미리결정할 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 효소는 약 또는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 또는 4시간의 미리결정된 시간 동안 활성일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중성 pH에서 실질적으로 불활성인"은 효소가 중성 pH에서, 유사한 조건, 즉, 분석, 완충액, 이온강도 (pH 차이는 제외)에서 최적 pH 에서 효소의 활성의 10% 미만을 나타내는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pH 5.5에서 실질적으로 활성인"은 효소가 pH 5.5에서, 유사한 조건, 즉, 분석, 완충액, 이온강도 (pH 차이는 제외)에서 최적 pH 에서 효소의 활성의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과를 나타낸 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표피하(sub-epidermal) 투여는 피부의 가장 바깥쪽 층 아래로 효소의 전달을 초래하는 임의의 투여를 나타낸다. 표피하 투여는 피부의 바깥층에의 국소 적용을 포함하지 않는다. 표피하 투여의 예는 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 병변내(intralesional) 투여 및 피내 (intradermal) 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 기질은 효소에 의해 절단되는 분자를 나타낸다. 최소한, 표적 기질은 프로테아제에 의해 인식되는 절단 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 따라서 길이에 있어서 2, 3, 4, 5, 6, 또는 이상의 잔기들일 수 있다. 기질은 또한 전장 단백질, 대립형질 변이체, 이소폼(isoform), 또는 효소에 의해 절단되는 그의 임의의 부분일 수 있다. 추가적으로, 기질은 효소에 의한 기질의 절단에 영향을 주지 않는 추가적인 부위를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 예를 들면, 기질은 4개 아미노산 펩티드 또는 형광생성 부위(fluorogenic moiety)에 화학적으로 연결된 전장 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 절단은 하나 이상의 분해 산물을 초래하는 효소에 의한 펩티드 결합 또는 다른 결합의 파괴를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 활성은 폴리펩티드 또는 전장 (완전한) 단백질과 연관된 그의 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 나타낸다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매적 또는 효소적 활성, 항원성(항-폴리펩티드 항체에 결합하기 위한 폴리펩티드와 결합하거나 경쟁하는 능력), 면역원성, 멀티머 생성 능력 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 효소적 활성 또는 촉매적 활성 또는 절단 활성은 선택된 기질의 단백질가수분해를 검출하는 시험관내 단백질가수분해 분석에서 평가되는 프로테아제의 활성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 활성 효소는 효소 활성을 나타내는 효소를 나타낸다. 본원의 목적을 위하여, 활성 효소는 콜라겐과 같은 하나 이상의 ECM 성분을 절단하는 것들이다. 활성 효소는 단일 사슬 또는 2개-사슬 형태인 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 불활성인 효소는 실질적으로 활성(즉, 촉매 활성 또는 절단 활성)을 나타내지 않는, 예컨대, 효소의 최대 활성의 10% 미만의 활성을 나타내는 효소를 나타낸다. 효소는 그것의 구조(conformation), 그것의 활성을 위해 요구되는 활성화 조건의 부재, 또는 상기 효소가 실질적으로 불활성이도록 하는 억제제 또는 임의의 다른 조건 또는 인자 또는 형태의 존재에 의하여 불활성일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 단백질은 인간의 게놈에 존재하는, 그들의 모든 대립형질 변이체 및 보전적인 변이를 포함하는 핵산 분자, 예컨대, DNA에 의해 코드화되는 것이다. 변형이 인간 단백질의 야생형 또는 현저한 서열 상에 기초한다면 단백질의 변이체 또는 변형체는 인간 단백질이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 히알루로난 분해효소(hyaluronan degrading enzyme)는 히알루로난 중합체(또한 히알루론산 또는 HA)의 더 작은 분자량 절편으로의 절단을 촉매하는 효소를 나타낸다. 히알루로난 분해효소의 예는 히알루로니다아제, 및 히알루로난을 탈중합하는 능력을 가지는 특정 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해효소인 예시적인 콘드로이티나제는 콘드로이틴 ABC 리아제(또한 콘드로이티나제 ABC로 공지), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 설페이트 리아제 또는 콘드로이틴 설페이트 엘리미나제로 공지) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함한다. 예시적인 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris ) 및 프라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum) (상기 프로테우스 불가리스 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호:305에 기재되어 있다; Sato 등(1994) Appl . Microbiol . Biotechnol . 41(1):39-46). 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소는 서열번호:308에 기재된 프라보박테리움 헤파리넘 빅티발리스 바덴시스(Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis ), 및 아르쓰로박터 아우레스켄스(Arthrobacter aurescens (Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 C 효소는 스트렙토코커스(Streptococcus ) 및 플라보박테리움 ( Flavobacterium ) (Hibi 등(1989) FEMS - Microbiol - Lett . 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol . Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur . J. Biochem. 262:127-133)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소를 나타낸다. 히알루로니다아제는 박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.99.1), 거머리, 다른 기생동물, 및 갑각류 동물 유래 히알루로니다아제(EC 3.2.1.36), 및 포유동물-형 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 쥣과(murine), 개, 고양이과, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-인간 기원의 어느 것, 및 거머리, 다른 기생동물 및 갑각류 유래의 어느 것을 포함한다. 예시적인 비-인간 히알루로니다아제는 서열번호:237-260에 기재된 어느 것을 포함한다. 예시적인 인간 히알루로니다아제는 HYAL1(서열번호:262), HYAL2(서열번호:263), HYAL3(서열번호:264), HYAL4(서열번호:265), 및 PH20(서열번호:232)를 포함한다. 또한 히알루로니다아제 중에 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20을 포함한다.
히알루로니다아제에 대한 언급은 전구체 히알루로니다아제 폴리펩티드 및 성숙한 히알루로니다아제 폴리펩티드(예컨대, 시그널 서열이 제거된 것들), 활성을 가지는 이들의 절단된 형태를 포함하며, 서열번호:232의 어느 곳에 기재된 전구체 폴리펩티드 또는 이의 성숙한 형태에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함한, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화되는 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형은 페길화(pegylation), 알부민화(albumination), 글리코실화(glycosylation), 파르네실화(farnesylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 인산화(phosphorylation) 및 다른 당업계에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20는 발현시 상기 폴리펩티드는 가용성이도록 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부를 결여한 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 sHuPH20 폴리펩티드는 서열번호:226-231 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 가지는 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 상기 예시적 sHuPH20 폴리펩티드를 위한 전구체 폴리펩티드는 아미노산 시그널 서열을 포함한다. 전구체의 예는 서열번호:225에 기재되어 있으며, 이는 1-35번 아미노산 위치에 35개 아미노산 시그널 서열을 포함한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 본원에 기재된 제조 및 정제 방법 동안 또는 이후에 분해될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 rHuPH20는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary(CHO)) 세포에서 재조합적으로 발현된 인간 PH20의 가용성 형태를 나타낸다. 가용성 rHuPH20는 서열번호:225에 기재된 아미노산 1 내지 482를 코드화하는 핵산에 의해 코드화된다. 또한 이의 대립형질 변이체 및 다른 가용성 변이체인 DNA 분자가 포함된다. 가용성 rHuPH20를 코드화하는 핵산은 성숙한 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포 내에서 발현된다. 배양 배지에서 생산되는 것과 같이, C-말단에 이질성(heterogeneity)이 있기 때문에 산물은 서열번호:226 내지 231의 종들의 혼합물을 포함한다. 상응하는 대립형질 변이체 및 다른 변이체가 또한 포함된다. 다른 변이체는 이들이 히알루로니다아제 활성을 유지하고, 가용성인 한 서열번호:226 내지 231의 어느 것과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제 폴리펩티드에 의해 나타나는 어떤 활성을 나타낸다. 상기 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 측정될 수 있으며, 효소 활성, 예컨대, 히알루론산을 절단하는 능력, 분산제 또는 전착제로써 작용하는 능력 및 항원성을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 측정법은 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 형성되는 불용성 침전물을 검출함으로써 간접적으로 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 측정하는 미세탁도측정법(microturbidity assay)(예컨대, 실시예 16 참조)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 천연적으로 발생하는 α-아미노산 잔기들은 인간에서 동질(cognate) mRNA 코돈으로 충전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질 내에 삽입된 자연계에서 발견되는 20 α-아미노산들 잔기들이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA) 및 이들의 혼합물을 포함하는 이들의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 임의로는 예컨대, 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능한 표지로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 전형적으로 그들의 표적이 통계적으로 고유한 길이를 갖거나, 라이브러리 탐지 또는 프라이밍을 위하여 낮은 카피수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 14, 16 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 펩티드는 2 내지 40 아미노산 길이인 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 절편 내 존재하는 뉴클레오티드들은 당해 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에서 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 간주된다. "D" 이성체 형태 내 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol . Chem., 243:3552-3559(1969)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어는 표 1에 나타나 있다:
[표 1] 대응 표
Figure pct00001
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가지는 것을 주의해야 한다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응 표(표 1)에 기재된 아미노산 및 변형되고 희귀 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 넓게 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타내는 것임을 주의해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드 내에 존재하는 20개의 L-아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지나 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 흉내내도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 나타낸다. 따라서, 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 예를 들면 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 비-천연 아미노산은 본원에 기재되고, 당업계의 당업자에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 조각을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, DNA 세그먼트(segment)는 특이한 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 세그먼트는 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드화하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편의 일부분이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 자연 자원으로부터 분리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 본원에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자를 위해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 전체 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이들의 말단이 엇갈려 있을 수 있고, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 수 있다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당해 기술분야에 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 상동성을 나타내는 방식으로 배열된다. "상동성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열 및 어느 정도로 뉴클레오티드 서열에 대한 배열은 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보전적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보전적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는 비교된 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 지역 또는 지역들을 포함하는 서열의 일부의 배열)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체로 기술로-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예컨대: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에서 사용되는 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) "상동인(homologous)"은 약 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분률이 특정될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 지시된바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분률 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 최고 수준 매칭이 얻어지도록 서열을 배열한다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data , Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 상동성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의하여 결정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalties)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이 전부를 따라 전형적으로 보통의 엄격성(stringency)으로, 또는 높은 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 축퇴성 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, Pearson 등(1988) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 파라미터들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분률 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman (1970) J. Mol . Biol . 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv . Appl . Math . 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0 의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl . Acids Res . 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 참조 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분률의 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 참조 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85-90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되고, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있는 2 이상의 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예컨대, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 폴합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 평가될 수 있다. 그러나, 프라이머는 연장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"은 증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드)의 표적 핵산 분자에의 상보적 염기-쌍에 의한 어닐링을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관내 및 생체내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 시험관내 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격성(stringency)에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 보통 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위한 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 상보적인은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분률은 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 이들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "산물에 실질적으로 동일한"은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(코드화된 폴리펩티드 내 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체"는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코드화되는 단백질을 지시하기 위하여 본원에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 코드화한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자 및 비교가 이종간인지 종내인지에 종속한다. 일반적으로, 이종간 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 참조는 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립형질"은 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립형질은 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 대상이 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유동물 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 상이한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA 형태를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사물의 차별적 프로세싱에 의해 생성되는 변이체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 변형은 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 서열의 변형을 지칭하며, 아미노산 및 뉴클레오티드 각각의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자에게 통상적인 일이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-코드화 지역에서 발견된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염시키는 단백질이 실질적으로 부재이거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 부재인 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되는, 쉽게 검출가능한 불순물이 부재인 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 부재인 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.
용어 "세포 물질로부터 실질적으로 유리된"은 상기 단백질이 그것이 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 "세포 물질로부터 실질적으로 유리된"은 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질로서 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리된 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질의 실질적 부재는 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 코드화되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원 (heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위한 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 절편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 지역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 부분은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점(replication origin), 하나 이상의 선택마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외래 유전자를 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, DNA 세그먼트를 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 세그먼트가 그들의 의도된 목적, 예컨대, 전사가 프로모터에서 개시되어 코드화 세그먼트를 거쳐 터미네이터까지 진행되는 목적으로 일제히 기능하도록 배열된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 평가(assessing)는 시료 내 존재하는 프로테아제 또는 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 의도이다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 예를 들면 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 보체 단백질의 절단 산물의 검출.
본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 초래되는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물의 치료적 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적을 위하여, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드가 가수분해되는 프로테아제의 촉매 활성이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 "동등한"은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 코드화하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 변형만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. "동등한"이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 존재할 필요는 없으나(예컨대, 2개의 펩티드가 동일한 종류의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 의미한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 업-레귤레이션 또는 작용제 활성), 활성의 감소(즉, 다운-레귤레이션 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 파라미터의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 종류 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조합은 2개 이상의 아이템 간의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 아이템, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 아이템의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 키트는 임의적으로는 다른 요소, 예컨대, 부가적 시약, 및 상기 조합 또는 그의 요소의 사용설명서를 포함하는 포장된 조합물이다. 특히, 본원의 목적을 위하여 "키트"는 본원에서 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소와 활성화, 투여, 진단 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원의 목적을 위한 다른 아이템의 조합물을 의미한다. 임의적으로는 키트는 사용설명서를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 징후로 특징 지어지는 개체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 관심 있는 질환 및 장애는 ECM 성분을 포함하는 것들이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, ECM-매개 질환 또는 상태는 임의의 하나 이상의 ECM 성분들이 병리 또는 병인에 관여하는 경우의 것이다. 본원의 목적을 위하여, ECM-매개 질환 또는 상태는 하나 이상의 ECM 성분의 증가된 침착 또는 축적에 의해 야기되는 것들을 포함한다. 상기 상태는 셀룰라이트, 듀피트렌 질환(Dupuytren's disease), 페로니병(peyronie's disease), 오십견, 기존의 반흔, 예컨대 켈로이드(keloids), 피부경화증 및 림프부종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상을 "치료"는 대상의 징후가 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 징후의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다. 치료는 또한 변형된 히알루로니다제 및 본원에서 제공되는 조성물의 임의의 약학적 이용을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 임의의 치료적 제제 또는 생물활성 제제, 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 징후를 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료적 효과는 질환 또는 상태의 징후를 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상에 투여 후 치료적 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상"은 포유동물, 예컨대 사람을 포함한 동물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 환자는 인간 대상을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료, 예컨대, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 징후의 개선은 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련할 수 있는 징후의 영구적 또는 일시적인, 지속적 또는 일시적인, 임의의 경감을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유효량은 질환 또는 장애의 징후를 예방, 치유, 개선, 저지 또는 부분적 저지에 필요한 치료적 제제의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단위 복용 형태는 인간 및 동물 대상에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단일 복용 제형은 직접 투여를 위한 제형을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이,"제조품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장된 물품 내 포함된 활성화 가능한 기질분해효소를 포함하는 의도이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려된 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 효소는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵 및 진균 유래이다. 대부분 효소들은 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태로 감염되지 않은 정상적 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는, 그와 달리 지시되지 않았다면, 그들의 일반적 사용법, 인식된 축약형, 또는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회((1972) Biochem . 11:1726 참조)에 따른다.
B. 세포외 기질
시간 제어 방식으로 세포외 기질(ECM)의 하나 이상의 단백질 성분들을 분해하는 활성화가능한 기질-분해효소가 본원에서 제공된다. 그러한 표적화 및 시간적 생체내 활성화에 의하여, ECM의 질환 및/또는 상태가 치료될 수 있다. 활성화가능한 기질-분해효소는 ECM의 임의의 성분을 분해할 수 있으며; 효소 선택은 표적하는 성분 및/또는 치료될 특정 질환 또는 상태에 좌우될 수 있다.
ECM은 결합 조직, 또는 세포 밖의 공간 및 혈관 및 림프 계를 둘러싸서 다른 조직들 사이에 기계적 및 구조적 지지체를 제공하는 간질로 구성된다. ECM의 복잡하고 역학적인 미세환경은 피부와 같은 결합 조직 내 구조 및 시그널링 시스템을 대표한다. ECM의 복잡한 성질 때문에, 이는 세포에 대한 지지 및 정착의 제공, 조직의 구분, 세포내 연락의 조절, 및 세포 성장 인자의 격리와 같은 다양한 기능을 제공할 수 있다. ECM의 조직 또는 구성의 결함 또는 변화는 많은 수의 질환 또는 상태의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 섬유의 합성, 분해 및 조직화의 변화는 지질영양이상증(예컨대, 셀룰라이트) 및 림프부종의 원인이 된다.
ECM은 섬유성 구조 단백질, 예컨대, 콜라겐, 폴리사카라이드, 예컨대 프로테오글리칸 및 히알루론산, 및 기질 성분들 서로에 또는 세포에 연결하는 결합 단백질로 이루어져 있다. 일부 결합 조직, 예컨대 힘줄 및 연골은 주로 ECM으로 이루어져 있다. 그러나, 피부의 결합 조직을 구성하는 ECM은 또한 섬유아세포, 혈관 및 다른 성분들과 함께 분포되어 있다. ECM은 또한 물 및 그에 용해된 구성성분들이 혈장으로부터 림프관으로 이동하는 경우 공간으로써 제공된다. 간질 유체는 세포질과 등장이며, 중성 pH인 세포외 환경을 제공하는 완충된 중탄산염이다.
1. ECM 의 성분
ECM(또한 간질 기질이라 불림)은 콜라겐, 엘라스틴 및 피브로넥틴과 같은 섬유성 단백질을 포함한 수많은 구조적 거대분자를 포함하는 복잡한 3차원의 역동적 구조물이며, 그 안에서 글리코시아미노글리칸(glycosyaminoglycans, GAGs)이 수화된 겔-유사 물질을 형성한다. ECM의 성분은 상주 세포, 전형적으로는 섬유아세포 또는 섬유아세포의 패밀리인 세포에 의해 생성되며, 이들이 ECM의 다른 성분과 상호작용하는 경우 엑소사이토시스를 거쳐 분비된다. 다양한 결합 조직, 예컨대, 뼈, 피부 또는 각막을 생성하는 것은 상기 성분들이 조직화하고 함께 형성하는 상대적 양 및 방식의 차이이다(Albert 등, "cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix." Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Publishers, 1994. Page 972.).
a. 콜라겐
콜라겐은 결합 조직, 예컨대, 피부의 주된 구조적 구성성분이며, 조직 건축, 조직 강도 및 세포-세포 상호작용의 발달 및 유지에 역할을 한다. 콜라겐은 콜라겐 3중 나선의 구조를 가지는 하나 이상의 도메인을 포함하는 ECM 의 구조적으로-연관된 단백질의 패밀리를 포함한다(Van der Rest 등 (1991) FASEB J., 5:2814-2823). 콜라겐은 Gly-X-Y 반복 구조를 포함하며, 이는 콜라겐 사슬이 나선 구조로 구부러질 수 있도록 한다. 각 콜라겐 분자는 α1 내지 α3로 명명되는 3중 나선을 형성하기 위한, 서로 빙 둘러 구부러진 3개의 사슬을 포함한다. 3중 나선 구조는 콜라겐 분자에 높은 기계적 강도를 제공한다. 27 종 이상의 상이한 콜라겐 종류가 있으며, 이는 아미노산 서열 및 사슬 조성에서 상이하다. 예를 들면, 콜라겐의 종류에 따라, 3중 나선을 형성하는 3개의 사슬은 동일하거나 상이할 수 있다. 콜라겐은 동종삼량체이거나(homotrimeric)(즉, 3중 나선의 모든 3개의 폴리펩티드 사슬이 동일한 콜라겐으로 구성됨) 이종형(heterotypic)(즉, 하나 이상의 콜라겐 종류로 구성된 피브릴)일 수 있다. 콜라겐은 그들이 형성하는 구조에 따라 다양한 패밀리로 나뉠 수 있다. 이들은 섬유성 콜라겐(또한 간질성(interstitial) 콜라겐이라고 불림; 예컨대, I, II, III, V 및 XI형) 및 비-섬유성 콜라겐, 예컨대, 패시트(facit)(예컨대, IX, XII, XIV형), 단 사슬(예컨대, VIII, X형), 기저막(예컨대, IV형), 및 다른 콜라겐(예컨대, VI, VII, 및 XIII형)을 포함한다. 하기 표 2는 콜라겐 종류 및 그들의 대표적인 위치를 나타낸다(Van der Rest 등(1991) FASEB J., 5:2814-2823); www.collagenlife.com/page_1167323108078.html; www.indstate.edu/thcme/mwking/ extracellularmatrix.html).
간질성 콜라겐 사이에 콜라겐 분자는 연합하여 큰 피브릴을 형성하고, 이는 독특한 줄무늬 패턴을 가진다. 줄무늬 패턴은 인접하는 분자 사이의 겹침에 기인한다. 콜라겐 섬유의 강도는 결합 조직의 밀집한 콜라겐 섬유 네트워크를 형성하는 콜라겐 섬유들의 분자내 및 분자간 연결의 다양성에 기초한다. 가장 일반적인 섬유성 콜라겐은 I형, II형 및 III형 콜라겐을 포함한다. I형 콜라겐은 대부분 결합 조직, 예컨대, 피부, 뼈, 힘줄 및 각막에서 발견되며, 2개의 α1(I) 사슬 및 1개의 α2(I) 사슬([α1(I)]2 α2(I))로 구성된다. II형 콜라겐은 동종삼량체이며([α1(II)]3), 연골에서 우세하게 발견된다. III형 콜라겐 또한 동종삼량체이며([α1(III)]3), 피부 및 혈관에서 우세하게 발견된다.
모든 콜라겐들이 피브릴 네트워크를 형성하는 것은 아니다. 예를 들면, 기저막 IV형 콜라겐은 비-섬유성이고, 나선 내 비-나선적 간섭(non-helical interruption)을 가지며, 이는 분자에 더 큰 유연성을 부여하는 힌지로써 작용한다. 따라서, IV형 콜라겐은 선형 피브릴에 의하기보다 필라멘트의 그물망에 의해 만들어진 시트를 형성한다.
피부의 가장 풍부한 단백질은 콜라겐이며, 이는 I형(80-85%) 및 III형 (8-11%)의 피부 전체 콜라겐으로 주로 이루어져 있다. I형 콜라겐은 III형 콜라겐과 연합하여 진피의 주된 콜라겐 섬유를 형성한다. 피부의 인장 강도는 상기 섬유성 콜라겐 분자에 주로 기인하며, 이는 머리-대-꼬리로, 엇갈린 측면-대-측면의 측면 정렬로 미세섬유로 조립된다. 콜라겐 분자는 인접하는 콜라겐 분자와 교차-연결되어 콜라겐 섬유 내 추가적인 강도 및 안정성을 생성한다. 예를 들어, V형 콜라겐은 또한 I/III형 콜라겐 섬유와 연합하여, 피브릴 직경을 조절한다. 피부 내 다른 콜라겐 종류는 예를 들어 IV형, VI형, VII형, XII형, XIV형 및 XVII형을 포함한다.
[표 2] 콜라겐의 종류
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b. 엘라스틴
ECM 내 탄성 섬유의 네트워크는 늘어난 후 움츠려드는 탄력을 요구하는 조직, 예컨대, 피부, 동맥 및 폐에 유연성을 제공한다. 탄성 섬유의 주된 성분은 엘라스틴 분자이며, 이는 이웃하는 엘라스틴 분자와 교차-연결을 형성한다. 이들 분자는 탄성 섬유의 중심을 형성하고, 엘라스틴에 결합하고, 탄성 섬유의 완전한 상태에 중요한 거대 당단백질인 피브릴린(fibrillin)에 의해 둘러싸여 있다.
c. 피브로넥틴
피브로넥틴은 카르복실 말단 근처에 한 쌍의 이황화 결합에 의해 연결된 한 쌍의 2개의 거대 서브유닛으로써 존재하는 당단백질이다. 각 서브유닛은 다른 기질 거대분자 및 세포 표면의 수용체에 특이적인 기능적으로 구별되는 도메인들을 포함한다. 예를 들어, 피브로넥틴 상의 구별되는 도메인들은 콜라겐(I, II 및 III형에 대해 별개의 도메인), 헤파린, 피브린 및 인테그린과 같은 세포 표면 수용체에 결합한다. 피브로넥틴은 혈장 및 조직 모두에 존재한다. 조직에서, 피브로넥틴은 상이한 종류의 ECM 분자 및 세포와 함께 결합하는 기능을 한다. 이는 또한 3개의 아미노산 Arg-Gly-Asp(RGD)로 구성된 중요한 세포-결합 도메인을 포함하며, 이는 세포의 원형질 막의 인테그린 수용체에 의해 인식된다. 세포의 인테그린 수용체에 피브로넥틴 분자의 결합은 세포 부착, 이동 및 분화를 촉진하는 신호 경로의 자극을 야기한다. 이러한 특징은 피브로넥틴이 세포 부착에 중요한 역할을 수행하고, 세포와 ECM의 성분들 사이의 신호 교환을 가능하게 한다.
d. 글리코사미노글리칸( GAGs )
GAGs는 강하게 친수성인 반복 이당 유닛(repeating disaccharide unit)으로 구성된 비분지 다당(polysaccharide) 사슬이다. GAGs는 높은 음성 전하를 가지며, 따라서, 활성인 Na+를 삼투적으로 끌어당겨 많은 양의 물이 그의 구조 내로 이끌려 오는 것을 야기하여 ECM을 수화된 상태로 유지한다. GAGs, 예를 들면, 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)는 전형적으로 선형 단백질 중심으로부터 갈라진 70 내지 200 당 길이의 (반복 이당 유닛으로부터 형성된) 복수의 글리코사미노글리칸 사슬을 포함한다. 이는 GAGs가 그의 질량 대비 거대한 부피를 차지하고, 매우 낮은 농도에서 겔을 형성하는 것을 야기한다. GAGs의 친수성 성질은 팽윤압 또는 팽창을 야기하고, 이는 ECM이 압력으로부터 견디게 한다.
ECM에서, GAGs는 ECM 단백질에 결합하여 프로테오글리칸을 형성하거나, 또는 히알루론산(또한 히알루로난이라 불림)의 경우 비-프로테오글리칸 기질 성분으로써 존재한다. 세포외 프로테오글리칸은 ECM 내 쿠션 세포들을 도와주는 거대하고, 매우 수화된 분자이다. 글리코사미노글리칸, 예를 들어 히알루로난은 그의 점성 및 수화된 물에 의하여 간질성 콜라겐 기질을 통한 대량의 유체 흐름에 대한 장벽을 형성함으로써 "세포간 물질"에 기여한다. 프로테오글리칸 및 비-프로테오글리칸 GAGs는 연합하여 ECM 내 거대 중합체 복합체를 형성한다. 이들은 서로 연합하고, 또한 콜라겐과 같은 섬유성 단백질과도 연합한다.
i. 프로테오글리칸
데르마탄 설페이트(dermatan sulfate) 및 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 헤파린 및 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 및 케라틴 설페이트(keratan sulfate)를 포함한, ECM 의 프로테오글리칸을 형성하는 3개의 주된 종류의 GAGs가 있다. 일반적으로, 프로테오글리칸은 전형적으로 긴 비분지 GAG 사슬의 형태 내 95 중량% 탄수화물이다. 세포 주변에 수화된 공간을 제공하는 것 이외에, 프로테오글리칸은 또한 분자와 세포의 수송을 조절하며, 신호 분자에 결합하여 세포 활성화에 역할을 수행하고, 다른 분비성 단백질, 예컨대 프로테아제 및 프로테아제 억제제에 결합하여 분비성 단백질의 활성을 조절한다(Albert 등, "Cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix." Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Publishers, 1994. pp. 972-978). 예를 들어, 프로테오글리칸의 헤파린 황산 사슬은 여러 상이한 성장 인자, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자(FGFs)에 결합하여 이들이 그들의 특이적 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 도와준다.
어그레칸(aggrecan)은 프로테오글리칸의 하나이며, 이는 주로 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트 GAGs를 포함하고, 히알루로난과 거대 응집물을 형성하여 기계적 지지체를 제공하는 연골에서 전형적으로 발견된다. 데코린(decorin)은 주로 콘드로이틴 설페이트 및 데르마탄 설페이트 GAGs로 구성된 결합 조직의 다른 예시적인 GAG이다. 이는 I형 콜라겐 피브릴에 결합한다. 페르레칸(Perlecan) 및 베타글리칸(betaglycan)은 ECM의 다른 예시적인 프로테오글리칸이다. 모든 프로테오글리칸이 ECM 과 연합하는 것은 아니고; 예를 들어 세르글리신(serglycin)은 그것이 분비성 분자의 포장 및 저장을 돕는 경우 분비성 소포와 연합하고, 신데칸(syndecans)은 세포 표면에서 발견되며, 공-수용체로써 작용한다(Albert 등, "Cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix" Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Publishers, 1994. pp. 972-978).
헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPGs)은 척추동물 및 무척추동물 조직의 광범위한 세포의 세포 표면 및 세포외 기질(ECM)과 연합하는 어디에나 존재하는 거대분자이다 (Wight, T. N., Kinsella, M. G., and Qwarnstromn, E. E. (1992) Curr . Opin. Cell Biol., 4,793-801; Jackson, R. L., Busch, S. J., and Cardin, A. L. (1991) Physiol . Rev., 71,481-539; Wight, T. N. (1989) Arteriosclerosis , 9,1-20; Kjellen, L., and Lindahl, U. (1991) Annu . Rev . Biochem., 60,443-475; and Ruoslahti, E., and Yamaguchi, Y. (1991) Cell, 64,867-869). 기본적 HSPG 구조는 여러개의 선형 헤파란 설페이트가 공유 결합된 단백질 중심으로 이루어져 있다. 다당 사슬은 전형적으로 N- 및 O-연결 설페이트(황산) 부위 및 N-연결 아세틸 기와 다양한 정도로 치환된, 반복 헥수론산 및 D-글루코사민 이당 유닛으로 이루어져 있다. 세포 부착, 성장 및 분화에서 ECM 분자의 관여에 대한 연구는 배아 형태형성, 혈관형성, 전이, 신경돌기 성장 및 조직 재생에서 HSPGs 의 중심적 역할을 밝혔다. 다수의 단백질에 결합하는 그들의 능력에 있어서 독특한 헤파란 설페이트(HS) 사슬은 널리 다양한 이펙터 분자가 세포 표면에 달라 붙는 것을 보장한다. HSPGs 는 또한 혈관의 중요한 성분이다. 큰 혈관에서, 이들은 맥관 내막 및 내부 매질에 주로 모여있으며, 반면 모세혈관에서 이들은 이들이 내피세포의 증식 및 이동을 지지하고, 모세혈관 벽의 구조를 안정화하는 경우 내피밑의 기저막에서 주로 발견된다. ECM 거대분자, 예컨대, 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴과, 원형질막의 상이한 부착 부위와 상호작용하는 HSPGs의 능력은 ECM 성분들의 자가-조립 및 불용성에서 뿐만 아니라 세포 부착 및 이동(locomotion)에서 상기 프로테오글리칸에 대한 핵심 역할을 시사한다.
ii . 히알루론산
히알루론산(HA; 또한 히알루로난이라 불림)은 물을 끌어당기는 큰 GAG이며, 물과 결합시, 점착성의, 겔-유사한 형태로 존재한다. 따라서, HA는 윤활제로서 제공되며, 겔-유사 결합 조직을 함께 잡아준다. HA는 이당류의 중합체이며(때때로 길이가 25,000 반복만큼 됨), 2개의 변형된 단당의 반복 유닛으로 이루어져 있다: 글루쿠론산 및 N-아세틸 글루코사민. HA는 많은 결합 조직의 ECM의 부분이다. HA는 피부에서 가장 많은 양으로 발견되고, 몸의 HA의 거의 50% 가 피부에서 발견된다. HA는 물을 잡아둠으로써 피부에 계속적 수분을 공급한다. 노화 등에 의한 HA의 생산 감소는 주름지고 건강하지 못한 피부를 초래한다.
HA는 또한, 주로 그의 수용체 CD44를 통하여, 배아 발생 및 형태 형성, 상처 치유, 회복 및 재생, 염증 및 암 진행 및 침습 동안 세포 행동을 조절하는 기능을 한다(Harada 등(2006) J. Biol . Chem., 8:5597-5607). HA는 히알루로니다아제에 의해 분해된다. HA의 분해 산물은 손상되거나 성장하는 조직 및 다양한 염증성 상태에서 발견될 수 있다. HA 절편은 혈관형성을 촉진하고, 조직 손상 및 피부 이식에서 대식세포 및 수상돌기세포에 의한 사이토카인 생산을 자극할 수 있다.
2. 피부의 조직학
피부는 여러 개의 구별되는 층, 주로는 표피 및 진피로 이루어져 있다. 표피는 외배엽으로부터 유래한 특수화된 상피이고, 그 아래가 진피이며, 이는 중배엽의 유도체이고, 혈관이 밀집한 결합 조직이다. 이들 2개 층은 서로 견고하게 결합되어 있으며, 몸의 상이한 영역에서 전체 두께 약 0.5 내지 4mm로 변하는 지역을 형성한다. 진피 아래는 느슨한 결합 조직의 층이며, 이는 특징에 있어서 그물코 모양(areolar)에서 지방질로 다양하다. 이는 피하조직(hypodermis)라고 언급되나, 전형적으로 피부의 일부라고 고려되지는 않는다. 진피는 한 층으로부터 다른 층을 통과하는 결합 조직 섬유에 의해 피하조직에 연결되어 있다.
a. 표피
표피는 진피 바로 위의 피부 층이며, 피부의 표면 층이다. 표피의 주된 기능은 물 손실, 화학적 손상 및 병원균의 침입에 대한 보호 장벽으로써 작용하는 것이다. 표피는 주로 케라티노사이트로 이루어진 약 0.1 내지 1.5 밀리미터 두께인 약 15 세포 층의 얇은 층이다(Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7(1998)). 표피는 그 자체로 케라티노사이트의 분화 상태에 기초하여 여러 층으로 나뉜다(예컨대, 기저 세포층(stratum basale), 유극층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum), 투명층(stratum lucidum), 각질층(stratum corneum)). 케라티노사이트는 케라티노사이트 줄기세포로부터의 기저층에서 유래한다. 케라티노사이트가 성장하고 분리됨에 따라 이들은 점진적 분화를 겪고 결국 이들이 편평상피세포(또한 코르네오사이트(corneocyte)라고 불림)라 불리는, 무핵의, 납작하고, 매우 케라틴화된 세포의 층을 형성하는 경우 각질층에 이르게 된다. 코르네오사이트로 이루어진 것 이외에, 각질층은 또한 피지를 포함한다. 피지는 피지선에 의해 분비되며, 이는 대개 모발로-덮힌, 모낭에 연결된 지역에서 발견된다. 피지는 코르네오사이트를 서로 지탱하고, 수분을 지탱하는 것을 도와주는 약한 산성 층이다. 이러한 산성은 피지를 구성하는 양성 아미노산, 락트산 및 지방산의 존재에 기인한다. 따라서, 피부 표면의 pH 는 일반적으로 5 내지 6 사이, 전형적으로 약 5.5이다. 피지는 모발 및 피부에 방수 작용을 하고, 이들이 건조하고, 잘 부서지고, 갈라지는 것을 방지하고, 또한 피부의 미생물의 성장을 억제한다. 용어 "산성 막(acid mantle)"은 피부의 대부분 지역에 수용성 물질의 존재를 의미한다.
b. 진피
피부의 결합 조직이 진피라 불린다. 진피는 1.5 내지 4 밀리미터 두께이다. 피부에서 진피는 ECM 성분들을 포함하며; 주된 단백질 성분은 콜라겐 및 엘라스틴이다. 진피는 포어(pore)라 불리는 피부 내 구멍, 또는 여드름, 모낭, 신경 종말, 및 혈관 및 림프관을 통하여 물질을 분비하는 땀샘 및 기름샘을 포함한 대부분의 피부 구조물에 대한 거주지이다(Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7(1998)).
c. 피하조직
진피 아래가 피하조직이며, 이는 지방층이며, 피부의 가장 깊은 층이다. 이는 체열 저장을 위한 단열제 및 기관 보호를 위한 충격 흡수제 모두로서 작용한다(Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7(1998)). 또한, 피하조직은 에너지 보존을 위한 지방을 보관한다.
3. ECM 의 질환
특정 질환 및 상태는 ECM 성분들의 이상 발현 또는 생산에 기인한 세포외 기질의 건축의 결함 또는 변화에 기인하다. 예를 들면, 상처 치유시 발생하는 것과 같은 어떤 염증성 조건에서, 사이토카인이 분비되며 이는 섬유아세포를 자극하여 ECM 성분, 예컨대 콜라겐을 분비시킨다. ECM 성분들은 축적되고, 지역적으로 침착되어 광범위한 섬유증 상태(fibrotic condition)를 초래한다. 기질 침착은 많은 만성적 염증성 질환 및 다른 질환 및 상태에서 빈번한 특징이다. 이들 중에 켈로이드(keloid) 및 비후성 반흔(hypertrophic scars)과 같은 반흔, 듀피트렌 증후군, 페로지병 및 림프부종과 같지만 이에 제한되지 않는 콜라겐-매개 질환이 포함된다. 셀룰라이트가 또한 증가된 지방형성에 추가로 콜라겐의 비정상적 섬유로 된 격막 네트워크를 초래하는 결합 조직 기질 내 변경으로 특징지어지는 현저한 ECM의 질환이다 (Rawlings 등(2006) Int. J Cos. Science, 28:175-190).
기질 성분의 이상 발현 및 과다생산, 이들의 축적 및 원치않는 침착의 초래로 특징지어지는 ECM 의 질환 및 상태는 본원에서 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소에 의해 치료될 수 있다. 생체내 투여시 상기 효소의 시간적 활성화에 의하여, 상기 질환 및 상태의 치료가 기질 성분들의 효소적 분해를 제한하도록 조절된다. 예를 들면, 기질 분해 작용의 지속시간을 제한함으로써 제어되지 않은 단백질 분해와 관련된 원치않는 부작용이 최소화된다.
C. 기질-분해효소
본원에서는 활성화가능한 기질-분해효소를 포함하는 조성물, 조합물 및 용기, 및 활성화가능한 기질-분해효소를 이용하여 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 기질-분해효소는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 프로테오글리칸을 포함하나 이에 제한되지 않는 ECM의 단백질 성분 또는 당단백질을 분해한다. 하나 이상의 ECM 성분을 절단하는 이들의 능력에 의하여, 본원에서 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소는 조직의 기질, 특히 하나 이상의 ECM 단백질의 과다 또는 콜라겐과 같은 하나 이상의 ECM 단백질 내 풍부한 섬유성 조직의 원치않는 축적에 기인한 구조적 결함 또는 변화를 나타내는 것들을 변경하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 상기 효소들은 ECM 단백질이 관여하는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용하다.
기질-분해효소 중에 프로테아제 및 글리코실 가수분해효소(glycosyl hydrolases)가 있다. 따라서, 기질-분해효소들은 표적 단백질 내 아미노산 또는 폴리펩티드 기질의 서열을 인식하는 단백질-분해 효소 및 에스테르 결합 또는 글리코실 기와 같은 비-펩티드 결합을 인식하는 가수분해효소인 단백질들을 포함한다. 프로테아제 중에 세린, 시스테인, 아스파르트산 및 메탈로-프로테아제 패밀리의 엑소프로테아제(exoprotease)가 있다. 기질 서열의 인식 시, 프로테아제는 표적 단백질의 가수분해 또는 절단을 촉매한다. 상기 표적 단백질의 가수분해는, 표적 단백질의 전장 서열의 내용 안에서 펩티드 결합의 위치에 종속하여, 표적을 불활성화하거나, 일부 경우에는 활성화한다.
여러 독특한 종류의 촉매 기전이 프로테아제에 의해 사용된다(Barret 등(1994) Meth . Enzymol. 244:18-61; Barret 등(1994) Meth . Enzymol 244:461-486; Barret 등(1994) Meth . Enzymol. 248:105-120; Barret 등(1994) Meth . Enzymol. 248:183-228). 그들의 촉매 기전에 기초하여, 펩티드 결합을 절단하는 프로테아제는 세린-, 시스테인-, 아스파르트산-. 트레오닌- 및 메탈로-프로테아제로 하위-분류된다. 세린-형 펩티다아제는 그 활성 중심 내에 포함된 세린 잔기를 가지며, 아스파르트산-형 펩티다아제는 촉매 중심 내에 2개의 아스파르트산을 가지며, 시스테인-형 펩티다아제는 시스테인 잔기를 가지며, 트레오닌-형 펩티다아제는 트레오닌 잔기를 가지며, 메탈로-펩티다아제는 촉매 기전에서 금속 이온을 이용한다. 프로테아제의 촉매 활성은 표적 기질을 절단하기 위해 요구된다. 세린 및 메탈로프로테이나제(serine and metalloproteinases)는 중성 pH에서 가장 활성인 반면, 리소좀에서 주로 발견되는 시스테인 및 아스파르트산 프로테아제는 산성 pH 최적을 가진다. 따라서, 리소좀 프로테아제는 시스테인의 프로테아제 및 아스파르트산 프로테아제 패밀리를 포함한다. 효소들의 다른 패밀리는 에스테르 결합에 작용하는 에스테라아제(esterases) 및 O- 또는 S-글리코실 화합물 또는 N-글리코실 화합물을 가수분해하는 글리코라아제(glycolases)와 같은 가수분해효소를 포함한다. 글리코실 가수분해효소의 예가 헤파라나제이다.
기질-분해효소의 예는 표 3에 기재되어 있다(예를 들어, Chapman 등, Am J. Physiol Heart Circ . Physiol.(2004) 286:1-10; Iozzo RV, Proteoglycans : Structure , biology, and Molecular Interactions, CRC Press(2000), pp. 94-96; Owen(1999) J. Leuk. Biol., 65:137-150; Buhling 등(2004) Eur . Respir . J., 23:620-628; Thomas Kreis and Ronald Cale, Extracellular Matrix , Anchor and Adhesion Proteins, Oxford University Press(1999) pp. 515-523; Ian M. Clark and Gillian Murphy. "Matrix Proteinases," in Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism, Academic Press(2006), pp. 181-198; Buck 등(1992) Biochem J., 282:273-278 참조). 예시적인 프로테아제 각각의 뉴클레오티드 서열(mRNA) 및 전구체 폴리펩티드의 코드화된 아미노산 서열에 대한 서열 인식자(서열번호:SEQ ID NO)가 상기 표에 묘사되어 있다. 예시적인 프로테아제 각각의 프로단백질(proprotein)의 아미노산 서열 뿐만 아니라 프로펩티드에 상응하는 프로단백질 내 아미노산 위치에 대한 서열 인식자(서열번호:SEQ ID NO)가 상기 표에 묘사되어 있다. 변이가 또한 대립형질 및 종 변이체 및 기타 당업계에 알려진 변이체 중에 존재하며, 그러한 변이체는 또한 활성화가능한 효소로써 고려된다. 표는 또한 각 효소에 대한 예시적인 ECM 표적 기질을 기재하고 있다. 상기 기질에 대한 참조는 참조 및 예시를 위한 것이며, 모든 표적 기질의 완전한 리스트를 나타낼 의도는 아니다. 당업자라면 본원에 기재된 어느 것과 같은 통상적인 분석법을 사용하여 원하는 효소에 대한 ECM 표적 기질을 알거나 경험적으로 결정할 수 있다.
기질-분해효소는 천연 원료로부터 분리, 세포, 조직 및 개체 내에서 재조합적으로 생산된 단백질의 분리를 포함한 당업계에 공지된 임의의 방법 및 재조합 방법 및 인실리코(in silico) 단계를 포함하는 방법, 합성 방법 및 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 제조되거나 분리될 수 있다. 전형적으로, 효소는 불활성인 형태로 제조되거나 분리된다. 조건적 활성화는 하기 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.
[표 3] 기질-분해효소
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

1. 효소 활성화
대부분의 프로테아제는 불활성 형태로써 합성되고 분비되며, 활성이 되도록 하기 위해 추가의 처리를 요한다. 활성화는 전형적으로 효소 활성 부위를 노출시키는 구조적(conformational), 입체적(steric) 또는 다른 변화에 의해 달성된다. 칼페인(calpain)은 예외이나, 모든 프로테아제 효소는 전형적으로 자이모겐으로써 합성된다. 자이모겐 활성화는 프로테아제가 항상 활성인 형태로 존재한다면 발생할 수 있는 원치않는 단백질 분해를 막아준다. 일반적으로, 자이모겐은 프로테아제의 활성 부위를 입체적으로 방해하고, 프로테아제의 활성 부위에 대한 기질의 접근을 막는 N-말단 부분(또는 프로세그먼트(prosegment) 또는 프로리전(proregion))을 포함한다. 자이모겐의 프로세그먼트는 2 잔기에서 150 잔기까지의 크기의 범위에 있다. 프리프로엔자임(preproenzyme) 형태로부터 분비시, 프로엔자임(프로세그먼트를 포함)은 불활성이다.
자가촉매적으로 또는 다른 프로테아제에 의하여 자이모겐의 프로세그먼트의 단백질 가수분해적 제거시, 효소의 활성 부위가 노출되어 성숙한 프로테아제, 및 전형적으로 활성화를 초래한다. 그러나, 일부 경우에는 부가적인 보조인자가 또한 완전한 활성화를 위해 요구된다. 예를 들면, pH 변화는 시스테인, 아스파르트산 및 메탈로프로테아제 패밀리의 효소의 활성화를 유발한다. 낮은 pH는 자이모겐 전환 동안 프로세그먼트의 기질로써의 민감성을 증가시키는 작용을 하거나 프로세그먼트 또는 효소의 구조적 변화를 야기한다(Jerala 등(1998) J Biol. Chem., 273:11498-11504). 시스테인 및 아스파르트산 프로테아제 패밀리의 카텝신과 같은 리소좀 효소는 완전한 활성화가 달성되기 전에 산성 조건을 필요로 한다. pH 이외에, 다른 보조인자는 염 농도, 환원제 예컨대 시스테인, DTT 및 TCEP, 금속이온 예컨대 칼슘, 열 또는 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 자이모겐 전환의 다양한 기전이 존재하며, 프로테아제 패밀리마다 다양하다(Khan 등(1998) Protein Science, 7:815-836; Khan 등(1999) PNAS, 96: 10968-10975 참조). 예를 들면, 활성 효소로의 자이모겐 전환은 종종 자가촉매작용 또는 다른 프로테아제의 작용, pH의 변화 또는 부수적인 분자 또는 이온의 관여, 또는 상기 조건들의 조합 내지 하나 이상의 결과로써 발생한다. 시간 및 작용 위치에 대한 추가적 조절이 종종 단백질 억제제에 의해 달성된다(Stroud 등(1977) Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 6:177-93).
a. 세린 프로테아제
분비된 효소 및 세포질 저장 세포소기관 내 격리된 효소를 포함하는 세린 프로테아제(SPs)는 혈액 응고, 상처 치유, 소화, 면역 반응 및 종양 침습 및 전이를 포함한 다양한 생리학적 역할을 가진다. 많은 세린 프로테아제는 세포외 기질의 성분들을 분해한다(상기 표2 참조). 예를 들어, 세포외 기질(ECM)의 분해 및 리모델링에 관여하는 프로테아제는 조직 리모델링에 기여하며, 암 침습 및 전이에 필수적이다.
세린 프로테아제 패밀리의 프로테아제의 활성은 그들의 활성 부위를 형성하는 한 세트의 아미노산 잔기에 종속적이다. 상기 잔기 중 하나는 항상 세린이다; 따라서 세린 프로테아제라 명명됨. 세린 프로테아제에 의한 표적 단백질의 절단 기전은 세린에 의한 표적 펩티드 결합의 친핵적 공격(nucleophilic attack)에 기초한다. 상기 촉매 세린은 기질의 잘릴 수 있는 펩티드 결합의 카르보닐 원자와 함께 공유-결합된 4면체 중간체를 형성한다. 많은 경우에서 상기 기(group)의 친핵성 성질은 히스티딘의 존재에 의해 개선되며, 아스파르트산에 의한 "양성자 받개 상태"에서 유지된다. 세린, 히스티딘 및 아스파르트산의 정렬된 측쇄들이 대부분 세린 프로테아제에 공통적인 촉매적 삼인조(triad)를 형성한다.
대부분 세린 프로테아제는 전구체 형태인 자이모겐으로써 존재하고, 따라서 불활성이다. 촉매작용을 위한 프로테아제 활성 부위의 자이모겐 형태는 활성인 효소와 비교하여 비틀려있다. 실제로, 세린 프로테아제는 자이모겐과 프로테아제의 활성형 사이에 활성 부위에서 구조적 변화를 가지는 유일한 프로테아제 패밀리이다. 따라서, 상기 촉매 삼인조는 자이모겐 내에 존재하나, 프로엔자임으로부터의 비틀린 루프가 부분적으로 기질-결합 틈새를 방해한다. 결과적으로, 기질 폴리펩티드는 효과적으로 결합할 수 없고, 단백질 가수분해(proteolysis)가 일어나지 않는다. 오직 자이모겐의 형태와 구조가 변하고, 활성 부위가 열리는 활성화 후에, 단백질 가수분해가 일어난다.
세린 프로테아제는 중성 pH에서 활성이다. 자이모겐 전환은 제한된 단백질 가수분해에 이어, 예컨대, 다른 프로테아제에 의한 매우 특이적인 촉매 절단 또는 자가-활성화에 의해 일어난다. 예를 들면, 불활성 프로트롬빈의 활성형 효소(트롬빈)로의 전환은 다른 응고 효소(Xa 요소)에 의한 프로세그먼트의 매우 특이적인 촉매 절단에 의해 달성된다. 다른 세린 프로테아제는 유사한 기전을 이용하나, 활성화 절단 부위가 상이하고, 따라서 세린 프로테아제는 전형적으로 상이한 전환효소(convertases)에 의해 활성화된다.
그랜자임(granzymes) A 및 B, 카텝신 G(cathepsin G), 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase), 프로테이나제 3(proteinase 3), 및 비만세포 트립타제(tryptase) 및 키마제(chymase)를 포함하나 이에 제한되지 않는 과립-연합 세린 프로테아제(granule-associated serine proteases)는 활성화를 위하여 이중의 단백질 가수분해를 필요로 한다. 상기 효소는 프리프로엔자임으로써 합성되고; 시그널 펩티드의 절단은 불활성인 프로엔자임 자이모겐 형태를 생성한다. 과립-연합 세린 프로테아제는 효소의 N-말단에서 프로디펩티드(prodipeptide)를 포함하고, 또한 활성화를 위하여 제거되어야 하는 카르복실-말단 확장을 또한 포함한다. 프로디펩티드는 성숙한 효소의 촉매적으로 활성인 형성물로의 폴딩을 방해한다. 과립-연합 세린 프로테아제의 활성화는 카르복시-말단 확장 및 프로디펩티드 모두의 절단에 의해 달성된다. 카텝신 C는 적어도 일부의 과립-연합 세린 프로테아제 내 프로디펩티드의 절단에 원인이 되어 왔다(Kummer 등(1996) J Biol. Chem., 271:9281-9286).
b. 시스테인 프로테아제
시스테인 프로테아제는 그의 활성 부위에 Cys-His 쌍을 포함하고, 그의 촉매적 활성화에는 시스테인 설피드릴 기가 관여한다. 인접하는 히스티딘 잔기에 의한 시스테인 설피드릴의 탈양성자화(deprotonation)에 이어 펩티드 카르보닐 탄소에 시스테인의 친핵성 공격이 이어진다. 새로운 카르복시-말단이 시스테인 티올에 연결된 티오에스테르가 반응의 중간체이다(세린 프로테아제의 아실-효소 중간체와 비교할 수 있음). 시스테인 프로테아제는 파파인, 카텝신, 카스파제 및 칼페인을 포함한다. 이러한 다른 패밀리들의 시스테인 프로테아제의 활성화 기전이 상이하다.
i. 카텝신
카텝신을 포함한, 파파인-유사 시스테인 프로테아제는 파파인과 구조적 유사성으로 관련있는 티올 종속적 엔도-펩티다아제의 한 패밀리이다. 이들은 (오른쪽 및 왼쪽에 대한) R 및 L로 표지된 도메인을 가지는 2개-도메인 단백질을 형성하며, 두 도메인으로부터의 루프는 기질 인식 틈새를 형성한다. 카텝신은 프로세그먼트를 포함하는 자이모겐으로써 합성되고; 프로세그먼트는 N-말단 억제성 프로세그먼트로서 작용한다. 비록 성숙한 효소 간에 약 25% 서열 동일성이 있지만, 프로세그먼트는 거의 서열 유사성을 나타내지 않는다. 프로세그먼트는 성숙한 효소의 강력한 억제제로써 기능한다. 프로세그먼트는 또한 중성 pH에서 합성 및 수송 동안 효소의 폴딩 및 안정성에 역할을 하는 것과 같은 다른 기능을 제공한다.
시스테인 프로테아제 패밀리의 카텝신은 리소좀 효소이며, 따라서 pH 7 미만에서 최적으로 활성이며, pH 7 초과시 불활성이 된다. 카텝신은 불활성 전구체(즉, 자이모겐)로써 합성되며, 프로세그먼트의 단백질 가수분해 제거에 의해 활성화된다. 이는 단일-사슬 효소의 생성을 초래한다. 일반적으로, 단일 사슬 효소는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 2개의 사슬 형태로 처리될 수 있다. 전형적으로, 상기 2개의 사슬은 비공유적 상호작용 또는 이황화 결합을 통해 서로 잡혀 있다. 따라서, 성숙한 카텝신은 단일-사슬 또는 2개-사슬 형태로 존재한다.
프로세그먼트의 제거는 다른 프로테아제 또는 산성 pH에서 자가촉매적 활성화에 의한 활성화에 의하여 용이해질 수 있다(Turk 등(2001) The EMBO Journal, 20:4629-4633). 자이모겐 전환 과정의 pH 종속성은 프로세그먼트 내 보존된 염 다리에 의해 조절될 수 있다(예컨대, 서열번호:62에 기재된 프로카텝신 L 내 Asp82p 및 Arg38p 및 Glu87p 및 Arg48p). 더 낮은 pH에서 카르복실레이트 기의 양성자화에 의한 염 다리의 파괴는 프로세그먼트의 소수성 중심을 파괴하고, 활성 부위로부터 프로세그먼트의 분리를 초래한다(Khan 등(1998) Protein Science, 7:815-836). 염 다리의 형성을 제공하는 잔기는 카텝신 간에 상이할 수 있다. 예를 들면, 프로카텐신 B는 그의 pH-종속적 자이모겐 전환에 대하여 선택적인 염-다리 상호작용을 이용한다(Coulombe 등(1996) EMBO J., 15:5492-5503).
산성 pH 조건은 성숙한 카텝신의 활성을 위하여 요구되며; 자이모겐 전환 그 자체는 효소 활성에 대하여 충분하지 않다. 활성을 위한 그의 필요에 추가로, 산성 pH는 또한 효소를 안정화한다. 더 높은 pH 에서 카텝신의 불활성화 및 불안정화는 활성 부위 -S-/H+ im- 이온 쌍의 이미다졸 부위의 탈양성자화 및 활성 부위 홈(groove)을 따른 구조의 "지퍼열림(unzipping)"에 의해 야기된다(Dehrmann 등(1995) Arch. Biochem. Biophys., 324:93-98). 따라서, 대부분의 카텝신은 산성 pH 에서 최적의 활성 및 안정성을 가진다. 예를 들면, 카텝신 B, F, H, K, L 및 V 는 산성 환경에서 최적의 활성이며, 중성 pH에서 매우 약하게 활성이거나 활성이 없다(Lutgens 등(2007) The FASEB J., 21: 3029-3041). 일부 카텝신, 예컨대, 카텝신 L은 중성 pH에서 배양 후 빠르게 활성을 상실한다. 일부 카텝신은 중성 pH에서 배양 후 조차 효소적 활성을 유지하고, 따라서 생리학적 조건 하에서 기질 단백질을 분해할 수 있다. 카텝신 C 및 S는 가장 높은 pH 안정성을 가지는 것으로 발견되었으며, 반면 카텝신 K 및 V는 중간 pH 안정성을 나타낸다. 시험관내 시험은 카텝신 K가 중성 pH에서 피브릴 단백질을 분해할 수 있다는 것을 보여주었다(Buhling 등(2004) Eur . Respir . J., 23:620-628).
카텝신 L
카텝신 L(CatL)은 파파인 패밀리에 속하는 리소좀 산성 시스테인 프로테아제이다. 인간 카텝신 L 유전자는 17개 아미노산 시그널 펩티드, 96개-아미노산 프로펩티드 및 220개 아미노산 성숙 지역을 포함하는 333개 아미노산 시스테인 프로테아제를 코드화한다(서열번호:61 및 62 및 GenBank Accession No. P07711 참조). 카텝신 L은 또한 대립형질 및 종 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 상기 변이체의 예는 서열번호:208 내지 223 및 234에 기재된 임의의 것이다. 카텝신 L은 불활성인 프로엔자임으로써 합성되며, 다른 프로테아제와 같이, 서열번호:62에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 18-113에 상응하는 프로펩티드를 포함한다. 프로펩티드는 효소의 단백질 가수분해 활성을 억제한다. 프로펩티드 세그먼트는 또한 중성 내지 알칼리성 pH 의 변성 효과로부터 프로엔자임을 안정화하는 기능을 한다(Coulombe 등(1996) The EMBO J., 15:5492-5503). 프로펩티드의 절단은 산성 조건 하에서 자가처리(autoprocessing)에 의해 일어나며, 활성이고 산성 조건 하에서 촉매 활성을 가지는 성숙한 효소를 생성한다. 성숙한 카텝신 L(서열번호:1에 기재)은 약 28 kDa의 단일 사슬 형태로써 및/또는 약 24 및 4 kDa의 2개-사슬 형태(각각 중쇄 및 경쇄)로써 존재할 수 있다. 카텝신 L의 대립형질 및 종 변이체는 공지되어 있다. 예시적인 종 변이체는 서열번호:208 내지 223에 기재되어 있는 임의의 것이며, 핵산 및 코드화된 폴리펩티드 및 시그널 서열 및 프로펩티드를 결여한 이들의 성숙한 형태를 포함한다. 예시적인 대립형질 변이체는 서열번호:234 에 기재된 임의의 것이다.
카텝신 L은 주로 엔도좀 및 리소솜에 위치하고 있다. 성숙한 카텝신 L의 최적의 단백질 가수분해능은 약 5.5의 산성 pH에서 달성되며, 이는 중성 pH에서 불활성이다(Bohley P 등, "Intracellular Protein Turnover." in S. Holzer 및 H. Tschcsche(eds.). Biological Functions of Proteinases, pp. 17-34, Berlin: Springer-Verlag. 1979). 카텝신 L의 pH 최적은 이온 강도에 의해 영향을 받을 수 있으며, 따라서 최적 pH 는 완충액 간에 상이하다(Dehrmann 등(1995) Arch . Biochem . Biophys., 324: 93-98). 프로카텝신 L은 성숙한 카텝신 L이 불활성화되는, 중성 및 약 알칼리성 pH 조건 하에서 안정하다(Dehrmann 등(1995) Arch . Biochem. Biophys., 324: 93-98). 예를 들어, 산성 pH에서 상기 효소는 더욱 안정하고, 그 자신에 대해 덜 작용하나, 단백질 기질의 가수분해를 활발하게 촉매한다. 중성 또는 생리학적 pH에 더 근접한 pH에서, 그리고, 상승된 온도, 예컨대 37℃의 존재 하에 상기 효소는 기질로써 다른 단백질 기질보다 자신(자가촉매작용)을 선호하기 때문에 매우 불안정하다. 활성 카텝신 L에 첨가된다면, 환원제는 산성 및 생리학적 pH 모두에서 이들 활성을 증가시킬 수 있다.
카텝신 L의 활성화된 형태는 7개 반의 시스테인 잔기를 가지며, 이는 3개의 이황화 시스테인 및 1개의 자유 시스테인(시스테인 프로테아제 패밀리 내에 보존된 활성 부위 Cys25)을 포함한다. Cys25의 환원된 설피드릴기(-SH)의 존재가 활성을 위하여 요구된다. 따라서, 시스테인과 같은 환원제 또는 글루타티온의 환원형의 존재는 활성 부위 설피드릴을 환원된 상태로 유지하는 것을 도울 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 환원제는 이황화물을 환원시키고, 생체내 기질의 더 양호한 결합 및 촉매작용을 유발하는 보다 우호적인 단백질 구조(2차 및 3차)를 획득하는 것을 도울 수 있다.
카텝신 L은 콜라겐, IL-8 전구체, 신경전달물질 전구체, 프로-엔케팔린 및 면역글로불린 경쇄-관련(AL) 아밀로이드 침전물 및 아조카제인을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 기질을 분해한다(Barret & Kirschke (1981) Methods Enzymol., 80:535-561; Mason 등(1985) Biochem. J., 226:233-241). CatL은 Z-Phe-Ala-CHN2에 의해 빠르게 억제된다.
ii . 칼페인
칼페인은 2개의 우세한 형태, μ-칼페인(칼페인 1) 및 m-칼페인(칼페인 2)로 존재하는 Ca2 +-의존적 세포질 시스테인 프로테아제이다. 칼페인 기질은 세포골격 단백질, 신호-전달(signal transducing) 효소, 전사 조절 인자 및 내재성 막 단백질(integral membrane protein)을 포함한다. ECM 성분들 중, 칼페인은 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 프로테오글리칸을 분해한다(Ian M. Clark 및 Gillian Murphy. "Matrix Proteinases," in Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism, Academic Press(2006), pp. 181-198).
칼페인은 불활성 헤테로이량체(및 ~80 kDa 및~ 30 kDa 서브유닛)로써 존재하며, 자가촉매작용을 위하여 Ca2 +을 필요로 한다. μ-칼페인 및 m-칼페인은 활성화를 위하여 요구되는 Ca2 +에 대한 그의 민감성에서 상이하며; μ-칼페인은 낮은 마이크로몰 칼슘 농도에서 최고치의-절반 수준으로 활성화되며, 이는 대략 m-칼페인을 활성화하기 위하여 요구되는 상기 농도 보다 더 낮은 자릿수(order of magnitude)이다(Meyer 등(1996) Biochem. J, 314:511-519). 활성화 시, 칼페인의 두개의 서브유닛 모두는 N-말단 프로세그먼트를 제거하고 칼슘 민감성을 증가시키는 제한된 자기분해(autolysis)를 겪는다. 자기분해된 프로테아제는 여전히 기질을 절단하기 위하여 칼슘을 필요로 하기 때문에 자기분해 그 자체로는 칼페인을 활성화하는데 충분하지 못하다(Meyer 등(1996) Biochem . J., 314:511-519). 따라서, 칼페인의 지속된 활성화는 칼슘의 존재를 필요로 한다. 상기 칼슘 요구는 생리학적 Ca2 +농도보다 상당히 더 높으며, 이는 일반적으로 1μM이다. 예를 들어, 시험관내 μ-칼페인은 10 내지 50μM의 칼슘 농도를 필요로 하며, m-칼페인은 300 내지 500μM의 칼슘 농도를 필요로 한다(Hosfield 등(1999) The EMBO J., 18:6880-6889). 칼슘 요구 때문에 칼페인은 지역적 칼슘 흐름 및/또는 막 결합에 의해 조절된다(Molinari 및 Carafoli(1997) J Membr . Biol ., 43:543-5). 칼파스타틴은 칼페인의 특이적인 세포성 억제제이다.
c. 아스파르트산 프로테아제
아스파르트산 프로테아제는 ECM 성분들을 분해하는 것으로 보여진 리소좀 내에서 발견되는 어떤 프로테아제이다. 이들 중에는 카텝신 D 및 E가 포함된다. 활성을 위하여, 2개의 아스파르트산 잔기가 활성 부위에서 산/염기 촉매작용에 참여한다. 초기 반응에서, 하나의 아스파르트산은 활성 부위 H2O로부터 양성자를 수용하고, 이는 펩티드 결합의 카르보닐 탄소를 공격한다. 동시에, 다른 아스파르트산은 펩티드 카르보닐 기의 산소에 양성자를 제공한다.
아스파르트 프로테아제의 자이모겐 형태는 음전하의 세그먼트와 염다리를 형성하는 효소의 중심 부분과 상호작용하는 양전하의 N-말단 프로세그먼트를 포함한다. 프로세그먼트의 자리잡기 및 염다리의 형성 때문에, 기질은 활성 부위로의 접근으로부터 제한된다. 활성인 효소로의 자이모겐 전환은 낮은 pH에서 염다리의 파괴에 의해 일어난다. 낮은 pH 에 노출은 Asp 및 Glu 잔기의 카르복실레이트 측쇄의 양성자화를 초래하고, 프로세그먼트 및 성숙한 효소 사이의 염다리의 불안정화를 초래한다. 일단 제거되면, 프로세그먼트는 활성 효소에 의해 자가촉매적으로 분해된다. 프로세그먼트의 뒤이은 가수분해는 활성화가 비가역적이고, 방출된 프로세그먼트가 활성 효소의 경쟁적 억제제로써 작용하지 못할 것을 보장한다. 또한, 어떤 다른 부수적 분자도 전환을 위하여 요구되지 않는다(Khan 등(1998) Protein Science, 7:815-836). 그러나, 시스테인 프로테아제 패밀리의 카텝신과 마찬가지로, 산성 pH 조건이 성숙한 효소의 활성 및 안정성을 위해 요구된다.
d. 메탈로프로테아제
메탈로프로테아제(또한 아연 프로테아제라고 불림)는 소화 효소 카복시펩티다아제, 세포에 의해 분비되는 다양한 기질 메탈로프로테아제(MMPs), ADAMs(디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인), ADAMTS(디스인테그린 및 트롬보스폰딘 모티브를 갖는 메탈로프로테이나제 도메인) 및 리소좀 프로테아제를 포함한다. ADAMs 및 MMPs 를 포함하는 상기 효소들은 배아 발생, 세포 성장 및 분화, 염증성 반응, 상처 회복, 다발성 경화증, 관절염 및 암 진행 및 전이에 역할을 가진다(Manzetti 등(2003) J of Computer - Aided Mol . Design , 17: 551). 대부분의 MMPs(예컨대, 콜라게나제)는 예를 들면 조직 리모델링 동안 세포외 기질의 분해에 관여한다. 예를 들면, 상기 효소의 다수는 기저막 및 세포외 기질의 성분들을 절단할 수 있다.
메탈로프로테아제는 촉매 활성을 위해 요구되는 효소의 활성 중심에서 Zn++ 이온을 포함한다. 메탈로프로테아제의 활성 부위의 아연 결합 모티브는 이미다졸 측쇄가 Zn++에 리간드인 2개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 촉매작용 동안, Zn++는 활성 부위에서 물 분자의 산소 원자에 의한 카르보닐 탄소에의 친핵성 공격을 촉진한다. 활성 부위 염기(카르복시펩티다아제 내 글루탐산 잔기)는 공격하는 물 분자로부터 양성자를 추출함으로써 상기 반응을 용이하게 한다. 일반적으로, 상기 효소들은 그들의 활성 부위 내 공통의 아연 결합 모티브(HExxHxxGxxH) 및 활성 부위를 따라서 보존된 메티오닌 턴(turn)을 가진다. 히스티딘들 중 어느 하나의 돌연변이는 촉매 활성을 제거한다.
메탈로프로테아제의 자이모겐 형태는 약 80 내지 100 잔기 길이의 프로세그먼트를 포함한다. 자이모겐 형태에서, 성숙한 효소의 기질 결합 부위 내 잔기 및 촉매 Zn++ 이온은 활성형에서와 동일한 구조적 위치 내에 있으며, 자이모겐 전환시 변하지 않는다. 효소는 프로세그먼트가 상기 부위를 가리도록 위치하여, 따라서 기질의 접근을 방해하기 때문에 불활성이다. 자이모겐의 활성 효소로의 전환은 성숙한 효소로부터의 프로세그먼트 절단에 기인하다. 다른 프로테아제에 의한 작용, 열, 수은함유 제제(mercurial agent)(예컨대, 4-아미노-페닐머큐릭 아세테이트), SH-반응성 제제, 반응성 산소 및 세제를 포함한 복수의 기전이 절단을 개시할 수 있다(예를 들어, Khan 등(1998) Protein Science, 7:815-836; Okada 등(1988) Biochem J., 254:731-741; Okada & Nakanashi(1989) FEBS Lett., 249:353-356; Nagase 등(1990) Biochemistry, 29:5783-5789; Koklitis 등(1991) Biochem J., 276:217-221; Springman(1990) PNAS, 87:364-8; Murphy(1997) Matrix Biol., 15:511-8 참조).
e. 헤파라나제
헤파라나제는 특정 글리코사미노글리칸의 이화작용에 관여하는 글리코실화된 효소이다. 이는 특정 사슬내 위치에서 헤파란 설페이트를 절단하는 엔도-β-글루쿠로니다제이다. 헤파라나제는 글리코실 가수분해효소 집단 A(glycosyl hydrolase clan A)의 구성원이며, 이는 2개의 보존된 산성 잔기, Glu225에서 추정적 양성자 주개 및 Glu343에서 친핵체를 포함하는 공통의 촉매 기전을 공유한다(Hulett(2000) Biochemistry, 39:15659-15667). T 및 B 림프구, 혈소판, 과립구, 대식세포 및 비만세포의 내피밑의(subendothelial) 세포외 기질(ECM)과의 상호작용은 헤파라나제 활성에 의한 헤파란 설페이트의 분해와 관련 있다.
인간 헤파라나제 cDNA는 소포체(ER)로 이동시 시그널 펩티드에 의해 제거되는 시그널 펩티드 서열을 가지는 프리-프로-프로테인(pre-pro-protein)으로써 최초 합성되는 단백질을 코드화한다. 생성되는 65 kDa 프로엔자임 형태는 단백질 가수분해 절단에 의해 추가로 프로세싱되어 간섭하는(intervening) 6 kDa 절편의 절개를 초래하고, 8 kDa 폴리펩티드 및 50 kDa 폴리펩티드를 생성하여, 헤테로이량체를 형성한다. 성숙한 헤파라나제의 아미노산 서열이 서열번호:156에 기재되어 있다. 헤파라나제 활성 및 위치는 엄격히 조절된다. 예를 들면, 상기 효소는 지역적 pH 변화에 매우 민감하며, 종양 부근에 및 염증성 부위에 존재하는 산성 조건 하에서 높은 효소적 활성을 발휘하며, 생리학적 pH에서 활성이 없거나 거의 없다. 따라서, HS 스캐폴드의 헤파라나제-매개 절단은 pH-의존적 과정이며; 최대 효소 활성은 4 내지 6.8의 범위의 pH 값에서 달성된다(Gilat 등(1995) J Exp . Med., 181:1929-1934; Goldshmidt 등(2003) The FASEB J., 17:1015-1025). 생리학적 pH에서, 헤파라나제는 거의 활성을 나타내지 않는다. pH-의존성은 ECM의 구조적 고장(breakdown)이 엔도좀 내 및 상처 또는 염증 부위에서 일어나는 것과 같이 더욱 산성인 조건에 한정되는 것을 보장한다(McKenzie(2003) Biochem . J., 373:423-435).
D. 활성화가능한 기질-분해효소( AMDE )
기질-분해효소는 성숙한 효소를 생성하기 위하여 프로세그먼트의 절단에 의한 활성화를 위한 자이모겐 전환을 필요로 한다. 상기 논의된 바와 같이, 많은 기질-분해효소들이 또한 활성을 위한 하나 이상의 다른 활성화 조건의 계속된 존재를 필요로 한다. 상기 활성화 조건의 예는 pH, 금속이온, 온도, 환원제, 산화제 및 염 농도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 많은 효소들이 활성을 위하여 특정한 pH 값 또는 금속이온 농도 또는 염 농도 또는 환원제의 존재를 필요로 한다. 한 예에서는, 리소좀 프로테아제는 활성을 위하여 산성 pH 조건을 필요로 한다. 예를 들어, 프로테아제의 시스테인 및 아스파르트산 패밀리의 카텝신은 활성을 위하여 산성 pH 조건을 필요로 한다. 헤파라나제 또한 산성 환경에서 정상적 처리를 위하여 리소좀 내에 축적되는 리소좀 효소이다. 일반적으로, 산성 환경은 리소좀 프로테아제가 정상적으로 위치하는 경우 산성 리소좀 내에서 제공된다. 상기 환경의 밖에서, 리소좀 효소는 불활성이거나 활성이 거의 없으며, 활성을 위하여 산성 pH 에 외인성 노출을 필요로 한다. 다른 예에서는, 활성화 조건은 금속이온 농도를 포함한다. 예를 들어, 칼페인은 활성을 위하여 충분한 Ca2 + 농도를 필요로 한다. 상기 효소들의 활성은 활성화 조건의 부재시 되돌아갈 수 있다.
외인성 활성화 조건을 위한 요건을 이용함으로써, 활성화가능한 기질-분해효소가 생체내, 예컨대 ECM 에 투여시 제한된 지속시간 동안 일시적으로 활성이도록 만들 수 있다. 상기 활성화가능한 기질-분해효소는 오직 외인성 활성화 조건에 노출시에만 활성이다. 활성화 조건은 투여 부위에 존재하지 않고 외인적으로 적용되어야 하기 때문에, 활성화 조건은 적절한 활성화 조건을 제공하는 활성화제의 생체내 투여 후 시간이 경과함에 따라 중화되거나 소멸된다. 따라서, AMDE의 활성화는 활성화제가 소멸되거나 그렇지 않으면 중화됨에 따라 생체내 투여 후 되돌아갈 수 있다. 예를 들어, AMDE 의 일시적 활성화는 투여 부위에 존재하지 않는 외인성 활성화 조건(즉, 활성화제)의 존재 하 AMDE 의 투여에 의해 피부 및 다른 조직의 간질의 환경에서 달성될 수 있다. 전형적으로, 활성화 조건은 활성화 조건을 제공하는 활성화제의 투여 이전에는 ECM 내에 존재하지 않는 것이다. 따라서, 활성화 조건에의 활성화가능한 기질-분해효소의 노출은 활성화 조건이 간질 환경에서 소멸하거나 중화됨에 따라 제한되거나 미리결정된 시간 동안의 효소 활성화를 초래한다.
따라서, 본원에서는 생체내 투여시 효소가 그의 생물학적 작용을 수행할 수 있는, 제한되거나 미리결정된 기간의 시간 동안 효소의 활성화를 허용하는 활성화가능한 기질-분해효소를 포함하는 조성물, 조합물 및 용기가 제공된다. 활성화가능한 효소의 가역적 활성에 의하여, 상기 효소는 불활성화되고, 이에 의하여 상기 효소의 생물학적 작용의 지속시간을 제어한다. 활성화가능한 효소는 활성화 조건을 제공하는 활성화제와 함께 조합물 및 용기 내에 제공된다. 또한, 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제는 또한 하나 이상의 임의의 마취제, 알파 아드레날린성 제제 또는 분산제와 같은 다른 제제와 함께 병용되거나 조합물 내, 예컨대 용기 내에 제공될 수 있다. 활성화가능한 기질-분해효소는 활성화되는 경우 투여, 예컨대 피하 투여시 ECM의 하나 이상의 성분들을 분해하는 치료적으로 유효한 양으로 제공된다. 생성되는 활성화가능한 기질-분해효소는 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 치료제로써 사용될 수 있다.
표 3 또는 본원의 다른 곳에 기재된 것과 같은, 합성되거나 또는 천연 출 처로부터 분리된 임의의 기질-분해효소, 이들의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체, 또는 당업자에게 알려진 임의의 것이, 효소가 활성화 조건의 필요에 의하여 활성화될 수 있는 한, 본원에서 제공되는 조성물, 조합물, 방법 및 장치에서 사용을 위한 것으로 의도이다. 활성화가능한 기질-분해효소는 자이모겐으로써 또는 단일-사슬 또는 2개-사슬 형태인 불활성인 성숙한 폴리펩티드로써 불활성인 형태로 제공된다. 예를 들어, 카텝신은 그의 성숙한 형태에서조차 불활성이며, 구조적 안정을 위하여 산성 pH 조건을 필요로 한다. 활성화가능한 기질-분해효소는 리소좀 프로테아제, 예컨대 시스테인 및 아스파르트산 패밀리의 카텝신 및 헤파라나제를 포함한다. 활성화가능한 기질-분해효소의 예는 서열번호:56, 59, 62, 64, 179, 67, 70, 73, 76, 182, 185, 188, 79, 194, 89, 92, 95 및 155 중 어느 하나에 기재된 임의의 것 및 서열번호:57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93, 96 및 156 에 기재된 성숙한 형태 또는 대립형질 변이체 또는 종 변이체 또는 이들의 다른 변이체가 있다. 당업자라면 활성화가능한 기질-분해효소를 알거나 확인할 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 통상적인 효소 활성화 분석법, 예컨대, 본원에 제공되고, 당업계에 공지된 임의의 것을 사용하여 임의의 원하는 효소의 유지되거나 가역적인 활성화를 위한 외인성 활성화조건의 필요여부를 분석할 수 있다.
활성화가능한 기질-분해효소는 임의의 하나 이상의 성질 또는 활성을 변경하기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 변경된 성질 또는 활성은 효소가 더욱 안정하도록 하거나, 기질 특이성을 변경하거나/하고 효소에 온도 민감성을 수여하는 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 원한다면, 효소 안정성은 또한 효소의 페길화(pegylation) 또는 글리코실화(glycosylation)에 의하여 증가될 수 있다. 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용한 폴리펩티드의 변형은 당업자에게 통상적인 것이다. 본원의 목적을 위하여, 변형된 기질-분해효소는 변형되지 않은 효소의 하나 이상의 활성을 유지하며, 활성화가능하다. 유지된 활성은 변형되지 않은 효소의 활성의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상일 수 있다.
한 예에서는, 기질-분해효소, 예를 들어, 카텝신은 그의 프로세그먼트가 억제성이 아니도록 변형될 수 있다. 변형은 그 자신의 프로세그먼트 내에서 또는 억제성 상호작용이 일어나는 경우 활성 부위의 지역 내에서 아미노산 교체, 치환, 또는 삽입에 의해 만들어질 수 있다. 따라서, 카텝신은 산성 조건 하에서 자가촉매작용이 일어나는 경우 자이모겐 형태로 제공될 수 있으며; 상기 변형된 효소의 절단되는 프로세그먼트는, 자이모겐 형태로 제공된다면 야생형 카텝신에 대하여 일어나는 것과 같은 불활성화를 초래하지 않을 것이다.
다른 예에서는, 활성화가능한 효소는 그의 기질 특이성을 변경하기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 효소는 특정 기질에 대한 증가된 특이성을 가지기 위하여 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, I형 및 IV형 콜라겐에 기질 특이성을 나타내는 카텝신 L은 IV형 콜라겐이 아닌 I형 콜라겐에 대해 증가된 기질 특이성을 가지도록 변형될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. 폴리펩티드의 변형은 일반적인 분자 생물학 기술에 의해 달성될 수 있으며, 당업자의 기술 수준 내에 있다. 변형된 효소는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 것과 같은 기질 절단에 대한 통상적인 분석법을 이용하여 그의 기질 특이성이 시험될 수 있다. 예를 들어, 기질 절단은 형광생성 펩티드 또는 정제된 단백질에 대해 측정될 수 있다. 절단은 시험관내 또는 생체내 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 절단은 효소를 기질과 배양하고, 이어서 SDS-PAGE 겔 상에 혼합물을 걸어줌(running)으로써 측정될 수 있다. 분해는 웨스턴 블롯에 의하거나 또는 쿠마시 블루 또는 실버 스테인 시약과 같은 표준 단백질 염색을 이용하여 측정될 수 있다.
추가의 예에서는, 기질-분해효소는 온도 민감성을 가지도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 생리학적 온도(예컨대, 37℃)에서 활성인 기질-분해효소가 변형될 수 있으며, 더 낮은 온도(예컨대, 37℃ 미만; 예컨대, 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃)에서 활성이나 생리학적 온도에서 불활성인 효소가 선택된다. 따라서, 상기 변형된 효소들은 활성화 조건이 낮은 온도인 경우 활성화가능한 기질-분해효소로써 사용될 수 있다. 차가운 온도를 제공하는 활성화 조건(예컨대, 차가운 완충액)과 동시, 간헐적, 또는 뒤이은 상기 효소의 투여는 상기 효소의 활성화를 초래한다. 효소의 활성화는 생체내 온도가 생리학적 온도인 37℃ 로 회복됨에 따라 시간적으로 제어된다.
1. 활성화 조건 및 활성화가능한 기질-분해효소의 활성화를 위한 방법
활성화가능한 기질-분해효소는 활성화 조건의 부재 시에는 불활성이다. 생체내 투여시, 상기 활성화가능한 기질-분해효소의 일시적 활성화는 상기 효소의 활성화를 위한 충분한 활성화 조건을 제공하는 하나 이상의 특정 활성화제에 대한 노출(투여에 앞서 또는 투여에 뒤이어, 간헐적으로, 또는 동시에)에 의하여 달성된다. 활성화는 예를 들어, 온도(예컨대, 열 또는 냉각), pH, 염에, 활성화를 위한 충분한 농도의 금속이온(예컨대, Ca2 +)을 포함하는 용액에, 활성화를 위한 충분한 농도의 환원제 또는 산화제를 포함하는 용액에의 활성화가능한 기질-분해효소의 노출 또는 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 다른 방법에 의하여 달성될 수 있다. 활성화제의 선택은 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 효소의 선택에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 활성인 효소를 생성하기에 충분한 활성화제의 양(예컨대, 농도, 수준 또는 정도)이 사용된다. 이러한 양은 실험적으로 용이하게 결정될 수 있으며, 선택된 효소 및 선택된 적용에 좌우된다.
활성화 효소의 가역적 및 조건적 활성화에 의하여, 일시적인 활성화가 달성되며, 이에 의하여 세포외 기질(ECM) 성분에 대한 효소 작용의 지속시간이 조절된다. 이는 원치않는 장기간의 효소 활성화와 관련된 유해한 부작용을 제어할 수 있는 본 방법의 장점이다. 일시적 활성화는 활성화가능한 기질-분해효소가 활성인 상태로 유지되기 위하여는 활성화 조건에 대한 계속적 노출을 요구하기 때문에 달성된다. 활성화 조건은 활성화가능한 기질분해효소가 생체내 투여되는 위치에서 효소의 활성화를 위한 충분한 양으로 내재적으로 정상적으로 존재하지는 않는다. 예를 들면, 피부 간질은 중성 pH를 가지며, 따라서, 낮은 pH 활성화 조건은 정상적으로 존재하지는 않는다. 다른 예에서, 피부 간질 내 칼슘이온과 같은 금속이온의 생리학적 수준은 일부 효소의 활성화를 위하여 요구되는 유효한 양보다 훨씬 낮다. 따라서, 활성화가능한 효소의 생체내 투여에 이어 외인적으로 공급된 활성화 조건이 점차적으로 소멸하거나 또는 중화되는 경우 일어날 수 있는 것처럼 외인적 활성화 조건에 대한 효소의 노출 감소시 효소의 불활성화가 일어날 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 활성화 조건은 활성화가능한 기질-분해효소의 활성화를 위하여 요구되는 것들이나, 정상적으로 투여 장소에 충분한 양으로 존재하지는 않는다. 활성화가능한 기질-분해효소의 활성화를 위한 활성화 조건의 필요는 상기 활성화 조건이 소멸하거나 중화되어 상기 효소가 불활성이 되거나 불안정해져 분해될 때까지 제한된 시간 동안 기질-분해효소의 활성화를 가능하게 한다. 효소가 활성인 시간의 양은 미리결정된 시간에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 활성화제는 효소가 그것이 생체내 투여시 노출되는 환경 및 조건 하에서 정해진 시간 동안 활성이도록 선택된 활성화 조건, 예컨대 농도의 양, 유효량, 수준 또는 정도를 포함하는 것으로 제공된다. 한 예에서는, 산성 pH가 활성화 조건인 경우, 산성 완충액의 완충용량이 그의 pH 변화에 대한 저항성의 시간을 조절하도록 조정될 수 있다. 활성화제가 활성화가능한 기질-분해효소를 조건적으로 활성화하는 미리결정된 시간은 실험적으로 결정될 수 있으며, 치료될 질환, 치료될 개체, 효소의 선택 및 활성화제의 함수이다. 활성화가능한 기질-분해효소는 약 또는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 이상 동안 활성화 조건을 제공하는 활성화제의 존재 하에 생체내 투여에 뒤이어 활성일 수 있다.
예시적인 활성화 조건 및 활성화제 및 일시적 활성화 방법은 하기와 같이 본원에 기재된다. 그러한 기재에 의하여, 다른 구현예가 당업자에게 명백할 것이다.
a. 활성화 조건 - 산성 pH
활성이 pH에 의해 조절되는 기질-분해효소의 조건적 활성화를 위한 조성물 및 방법, 및 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 상기 효소의 용도가 본원에서 제공된다. 상기 방법은 산성 pH에서만 효소 활성을 가지는 반면, 중성 pH에서는 불활성이거나 불안정해지거나 분해되는 단백질을 이용한다. 상기 단백질은 시스테인 및 아스파르트산 패밀리의 카텝신 및 또한 헤파라나제를 포함하나 이에 제한되지 않는 리소좀 프로테아제를 포함한다. 예를 들어, 산성인 세포내 구획인 리소좀은 엔도시토시스에 의해 내부화된 단백질 및 다른 물질을 분해하는 매우 다양한 가수분해효소를 포함한다. 모든 리소좀내 프로테아제, 예를 들면, 카텝신 L은 산성 pH 최적을 나타낸다. 상기 프로테아제의 예는 서열번호:57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93, 96 및 156의 어느 하나에 기재된 어느 것이다.
특정 pH 조건에 노출시에만 활성인 기질-분해효소를 사용하는 방법이 피부 내 pH 차이를 이용하기 위하여 본원에서 사용된다. 인간 표피계는 피부의 중층(stratified layers) 내 pH 구배를 유지한다. 바깥층은 평균 5.5의 pH를 나타내는 것으로 보고되었다(W.P. Smith(1994) Cosmetics and Toiletries, 109:41-48). 표피의 연속적인 층들의 pH는 깊이와 함께 증가하여, 진피층에서 생리학적 범위(약 pH 7.4)에 근접한 최종 pH에 도달한다.
따라서, 산성 조건에서 활성을 나타내나, 예컨대 ECM에 존재하는 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 활성화가능한 기질-분해효소가 채택되는 것이 본원에서 고려된다. 실질적으로 불활성인 효소는 효소의 최적 pH 에서 효소의 활성의 10% 이하, 예를 들면, 효소의 pH 최적에서 나타나는 활성의 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 9.5% 또는 10%를 나타내는 임의의 것이다. 당업자는 효소의 최적 pH 를 알거나 결정할 수 있으며, 변화하는 pH 조건에서 활성 차이를 평가할 수 있다. 예를 들면, 카텝신 L의 최적 pH 는 약 또는 5.5 이나, 카텝신 L의 특정 종, 완충액 조건 또는 이온 강도에 따라 4.5 내지 6 의 범위에서 변할 수 있다. 카텝신 L 은 pH 7.4 이상에서 실질적으로 불활성이다(Dehrmann 등(1995) Arch . Biochem . Biophys., 324:93-98). 다른 예에서는, 카텝신 D의 활성을 위한 최적 pH 값은 약 또는 3.0 내지 4.0이며, 이는 약 또는 6.0 이상인 pH 값에서 실질적으로 불활성이다(Rojas-Espinosa(1973) Infection and Immunity, 8:1000-1008). 카텝신 S 는 pH 7.0에서 안정한 매우 적은 리소좀 프로테아제 중 하나이다(Bromme(1993) J Biol. Chem., 268: 4832-4838).
본원의 목적을 위하여, 활성화가능한 효소는 약 또는 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 또는 6.5 pH 조건에서 활성이나, 중성 pH에서 실질적으로 불활성이다. pH 활성 프로파일은 한 효소에 대하여 수행되어, 다양한 조건 하에서 그의 최적 pH 를 결정하기 위하여 측정된 상대적 활성일 수 있다(Dehrmann 등(1995) Arch . Biochem. Biophys., 324:93-98). 최적 pH 는 사용되는 기질, 완충액 조건, 이온 강도 및 효소의 종에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에서 최적 pH 에 대한 참조는 단지 예시를 위한 것이다. 당업자라면 특정 조건 하에서 효소의 최적 pH 를 실험적으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 완충액 조건 및 이온 강도를 변경하여 다양한 pH 조건 하에서 효소 활성을 결정할 수 있다. pH-활성 프로파일을 결정하기 위한 효소 분석은 본원에 기재되고 당업자에게 알려진 것과 같은 형광생성 기질을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 형광생성 기질의 선택은 효소마다 다양하며, 당업자에게 알려져 있거나 실험적으로 결정될 수 있다.
따라서, 투여 위치에 정상적으로 존재하지 않는 활성화 조건과 함께 투여에 의하여 기질-분해효소를 조건적으로 활성화하는 능력은 중성 pH를 나타내는 간질과 같은 기관 및 조직의 생리학적 파라미터의 일시적 조절 및 변경을 가능하게 한다. 정상적 생리학적 조건 하에서, 간질의 pH는 중성이다. 따라서, 낮은 pH에서 활성인 활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에 기재된 리소좀 효소는 정상적으로, 간질 내에 존재시, 간질의 중성 pH 때문에 촉매적으로 불활성이다. 간질의 pH가 예를 들어 완충 산성 용액의 투여에 의해 일시적으로 산성이 된 경우, 최적 산성 pH를 가지는 리소좀 효소는 간질에 투여시 활성화될 것이다. 간질의 pH 가 중성으로 복귀하게 되면, 이어서 산성 pH를 필요로 하는 기질-분해효소는 불활성화되고, 그의 효소 활성 발휘가 중단된다.
따라서, 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 활성화가능한 기질분해효소가 pH 가 중성인 피부 아래에 표피하로(subepidermally)(즉, 피하, 피내 또는 근육내 투여에 의하여) 투여될 수 있다. 조건적으로 활성화가능한 기질-분해효소의 다른 투여 경로가 또한 고려되며, 투여시 pH 변화로 인하여 효소의 활성이 가역적이 되도록 특정 효소의 최적 pH 에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 다른 투여 경로는 경구, 국소 및 경피 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
대부분 조직 및 기관의 간질은 중성 pH를 나타내기 때문에 일시적 산성화는 조직 또는 기관 간질 내로 산성 용액을 주입함으로써 달성될 수 있다. 산성 완충액은 투여시 간질의 pH를 약 또는 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5 미만으로 낮추어 활성화가능한 기질-분해효소가 활성이도록 하는 조성물이다. 완충액의 산성 성분은 간질의 중성 pH 에 의한 중화에 민감하다. 산성 완충액은 당업자에게 알려져 있다. 본원의 목적을 위하여, 완충액의 산성 성분은 유기 또는 무기 산일 수 있다. 일반적으로, 상기 용액은 약산 용액이다. 예시적인 산은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) (MES), 아세트산, 시트르산, 숙신산, 락트산, 말레산, 글리신-염산, 시트르 인산 및 히스티딘을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 산성 완충액의 효과적인 pH 범위는 공지되어 있으며, 따라서 적절한 완충액이 선택된 효소의 pH 최적에 기초하여 선택될 수 있다. 산성 완충액의 예는 아세테이트, 시트레이트, 포르메이트, 글리신, 말레이트, MES, 포스페이트, 피페라진, 프로피오네이트, 피리딘 및 숙시네이트 완충액을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, MES의 효과적인 pH 범위는 5.5 내지 6.7이다.
중화 및 뒤이은 산성 활성화가능한 기질-분해효소의 불활성화를 위하여 요구되는 기간의 시간은 산성 완충액의 제형에 좌우된다. 예를 들어, 산성 완충액 내 산 및/또는 완충제가 간질의 중화 능력에 비해 약하다면 더 짧은 기간의 시간이 발생하고; 산성 완충액 내 더 강한 산이 이용되거나 더 강한 완충제가 채택되면 더 긴 기간의 시간이 발생한다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물에서는, 주어진 pH 에서 활성화된 기질-분해효소의 시간적(일시적) 조절이 선택된 완충액의 완충용량에 의하여 추가로 제어될 수 있다. 이는 실시예 7에 예시되어 있다. 주어진 적용을 위하여 바람직한 완충액의 결정은 통상적이며, 당업자의 수준에 내에 있다.
전형적으로, 산성 용액은 하나 이상의 ECM 성분의 분해를 희망하는, 예컨대 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 부위에 직접 주입된다. 산성 용액 활성화제의 형태로의 활성화 조건의 주입은 불활성인 활성화가능한 기질-분해효소의 투여와 함께 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 행해질 수 있다. 투여가 동시에 일어난 경우, 활성화가능한 기질-분해효소 및 완충 산 용액은 동일하거나 또는 별개의 조성물 내에 있을 수 있다. 동일한 조성물 내인 경우, 상기 효소 및 완충 산 용액은 혼합물로써 조성물 내에 제공될 수 있다. 효소의 활성화는 또한 투여 전 효소의 농축된 액체 용액 또는 현탁액 또는 동결건조 또는 분말 형태에 상기 산성 용액을 첨가하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 활성화가능한 기질-분해효소의 액체 용액 또는 현탁액이 제공되는 경우, 이는 적절한 활성화 조건을 제공하는 활성화제에 노출시 상기 활성화 조건에 의한 효소의 활성화를 처리할 수 있는 용액 또는 현탁액이다.
또한, 본원에서 제공되는 조합물 및 방법에서는, 활성화 조건을 가지는 활성화제(예컨대, 완충 산 용액) 및 활성화가능한 기질-분해효소는 임의의 하나 이상의 마취제, 알파 아드레날린성 수용체 작용제 또는 분산제와 같은 임의의 하나 이상의 다른 제제와 병용하여 제공되고, 투여될 수 있다. 상기 제제의 예는 본원의 하기 "병용 요법"이라는 제목의 섹션에서 논의된다. 상기 다른 제제는 활성화제 및/또는 기질-분해효소와 함께 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법의 한 예에서, 완충 산 용액은 ECM 상태 또는 질환이 존재하는 피부 간질 또는 다른 조직 내로 투여된다. 상기 완충 산 용액은 기질-분해효소의 활성화를 위하여 요구되는 pH 및 제한된 지속시간의 활성화를 달성하기 위한 원하는 완충용량에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 카텝신 L은 예컨대, 셀룰라이트와 같은 콜라겐-매개 질환의 치료 목적을 위한 예시적인 효소이다. 따라서, 산성 완충액은 카텝신 L 활성화를 위한 최적의 pH 인 5.5 로써 제조될 것이다. 상기 산성 완충액의 예가 MES이다. 산성 용액의 완충용량은 또한 예를 들면 실시예 7에 개시된 바와 같이 원한다면 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 산성 완충액은 기질-분해효소와 함께 또는 그 전에 투여된다. 예를 들어, 기질-분해효소가 동결건조된 형태로 제공된다면, 상기 효소는 투여 직전에 산 완충 용액, 및 함께 투여되는 상기 효소 및 활성화제의 조합물과 재구성된다. 산성 완충액의 존재시, 효소는 생체내 투여에 이어 활성화된다. 산성 완충액의 완충용량에 따라, 간질의 pH는 제한되거나 미리결정된 시간 후 중성으로 복귀되며, 이에 의해 기질-분해효소의 분해 효과는 역전된다.
본원에서 제공되는 방법의 다른 예에서, 마취제 및 혈관수축제의 조합, 예컨대, 리도카인/에피네프린이 상기 활성화제 및 기질-분해효소의 투여 전에 투여된다. 일반적으로, 상기 방법에서, 분산제, 예컨대, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다아제가 또한 마취제 및 혈관수축제, 예컨대 알파 아드레날린성 수용체 작용제와 함께 투여된다.
b. 활성화 조건- 금속 양이온 농도
활성화를 위한 적절한 금속 이온, 예컨대, Ca2 +, Mg2 + 또는 Zn2 +에 노출을 요하는 활성화가능한 기질-분해효소를 포함하는 조성물, 조합물, 용기 및 방법이 본원에서 제공된다. 상기 효소의 예는 칼페인(예컨대, 서열번호:82(칼페인1) 및 서열번호:85(칼페인 2)에 기재된 거대 서브유닛 및 서열번호:87에 기재된 작은 서브유닛, 또는 이들의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체)이며, 이는 활성화를 위하여 Ca2 +를 필요로 한다. 금속 이온은 수성 조성물의 형태, 예컨대 칼슘염으로 제공될 수 있다. 불활성 효소가 금속 이온과의 혼합물로써 제공될 수 있거나, 별개의 조성물로써 제공될 수 있다. 농축된 액체 조성물의 형태 또는 동결건조 또는 분말 형태와 같은 별개의 조성물로써 제공된다면, 상기 효소에 금속 이온의 첨가는 활성화된 효소를 생성할 것이다.
일반적으로, 활성화는 불활성 효소를 활성화에 충분한 농도로 금속 이온, 예컨대, Ca2 +에 노출시킴으로써 달성된다. 정확한 양은 경험적으로 결정될 수 있거나, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, μ-칼페인 및 m-칼페인의 시험관내 활성화는 각각 10 내지 50 및 300 내지 500μM 칼슘 농도를 필요로 한다(Hosfield(1999) The EMBO J., 18: 6880-6889). 효소 활성에 대한 측정은 최적 농도를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 전형적으로, 본원의 목적을 위하여, 활성화가능한 기질-분해효소는 간질에 존재하는 금속 이온의 생리학적 수준을 초과하는 농도에서 활성화를 위한 충분한 금속 이온 농도를 필요로 하는 것들을 포함한다. μ-칼페인 및 m-칼페인의 경우, 활성화를 위하여 요구되는 칼슘 수준은 생리학적 수준을 초과한다 (미국특허번호 6,620,592; Hosfield(1999) The EMBO J., 18: 6880-6889 등 참조).
일반적으로, 불활성 효소는 효소 활성화를 유발하기에 불충분한 금속 이온이 존재하도록 포장되거나 제공된다. 따라서, 불활성 효소가 금속 이온 활성화제로부터 별개의 조성물로써 제공되는 경우, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)(적용에 따라 약 5 내지 약 100mM 또는 그 이상의 농도)을 첨가하여 원하는 때까지 활성화 반응을 유발하는 것을 방지하기 위하여 임의의 Ca2 + 또는 다른 금속 이온을 묶어두는 것이 필요하다. 이어서, 활성화 반응은 상기 킬레이터의 효과를 극복하기에 충분한 농도로 Ca2 +(또는 다른 금속 양이온)을 첨가함으로써 유발될 수 있다. 정확한 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
효소에 따라, 일시적인 활성화는 단지 금속 이온에 대한 불연속적 노출에 의해 간단히 달성될 수 있다. 예를 들어, 칼페인의 지속된 활성화는 칼슘의 존재를 필요로 한다. 따라서, 칼페인의 불활성형은 Ca2 +를 첨가함으로써 활성화될 수 있고, 동일 또는 별개의 조성물 내 생성 혼합물은 기관 또는 조직의 간질에 투여될 수 있다. 그러나, 투여시, 계속적 활성화를 위하여 요구되는 효과적인 칼슘 농도가 더이상 유효하지 않으며; 생성되는 활성 효소는 궁극적으로 불활성 상태로 복귀할 것이다. 다른 실시예에서, 활성화를 위하여 금속 이온을 요구하는 효소의 일시적인 조절은 금속 킬레이터 또는 다른 가역화제의 투여에 의해 제어될 수 있다.
c. 활성화 조건- 환원제
활성화를 위하여 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 시스테인을 포함한 적절한 티올 또는 비-티올에 대한 노출을 필요로 하는 활성화가능한 기질-분해효소를 포함하는 조성물, 조합물, 용기 및 방법이 본원에서 제공된다. 상기 효소의 예는 카텝신 L이며, 이는 활성화를 위하여 환원제를 필요로 한다. 환원제는 수성 조성물의 형태로, 예컨대, 시스테인으로써 제공된다. 불활성 효소는 환원제와의 혼합물로써 제공될 수 있거나, 별개의 조성물로써 제공될 수 있다. 농축된 액체 조성물 형태 또는 동결건조 또는 분말 형태와 같은 별개의 조성물로써 제공된다면, 상기 효소에의 환원제의 첨가는 활성화된 효소를 생성할 것이다. 환원제는 효소의 투여 전에, 그와 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 첨가될 수 있다.
일반적으로, 활성화는 활성화를 위하여 충분한 농도로 환원제, 예컨대 시스테인에 불활성 효소를 노출시킴으로써 달성된다. 정확한 양은 경험적으로 결정될 수 있거나, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 카텝신 L의 생체내 활성화는 일반적으로 1 내지 50 mM의 시스테인을 필요로 한다. 전형적으로, 본원의 목적을 위하여, 활성화가능한 효소는 간질 내 존재하는 환원제의 생리학적 수준을 초과하는 농도로 활성화를 위하여 충분한 농도의 환원제를 필요로 하는 것들을 포함한다.
일반적으로, 불활성 효소는 효소 활성화를 유발하기에 불충분한 환원제 농도이도록 포장되거나 제공된다. 이어서, 활성화 반응은 효소 활성을 회복하기에 충분한 농도로 시스테인(또는 다른 환원제)을 첨가함으로써 유발될 수 있다. 정확한 양은 실험적으로 결정될 수 있다.
효소에 따라, 일시적인 활성화가 환원제에의 불연속적인 노출에 의하여 간단히 달성될 수 있다. 예를 들어, 카텝신 L의 지속된 활성화는 시스테인 또는 TCEP 의 존재를 필요로 한다. 따라서, 그의 프로세그머트가 없는 카텝신 L의 불활성형은 시스테인을 첨가함으로써 활성화되고, 동일 또는 별개의 조성물 내 생성 혼합물은 기관 또는 조직의 간질에 투여될 수 있다. 그러나, 투여시 계속된 활성화를 위하여 요구되는 시스테인의 유효한 농도는 더이상 유효하지 않으며; 생성되는 활성 효소는 궁극적으로 불활성 상태로 복귀할 것이다. 다른 예에서, 활성화를 위하여 환원제를 요구하는 효소의 시간적 조절은 산화된 글루타티온과 같은 가역화제(reversing agent)의 투여에 의해 제어될 수 있다.
d. 활성화 조건- 온도
온도-의존적 방식으로 세포외 기질(ECM)의 하나 이상의 성분들을 분해하는 기질-분해효소의 온도 민감성(temperature sensitive: ts) 효소 돌연변이체(tsAMDE)가 본원에서 제공된다. 특히, 본원에서 제공되는 돌연변이체는 콜라겐을 분해한다. 일부 예에서, 상기 돌연변이체는 더 높은 온도, 예를 들어 생리학적 온도(예컨대, 37℃)에서보다 더 낮은 온도(예컨대, 25℃)에서 더 높은 활성을 나타낸다. 다른 예에서, 상기 돌연변이체는 더 낮은 온도에서보다 생리학적 온도에서 더 높은 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 tsAMDE, 예컨대, tsMMPs의 활성화는, 체내 투여시, 온도의 변화에 의하여 일시적으로 그리고 조건적으로 제어될 수 있다. 제어되지 않은 효소 활성은 조직 온전성(tissue integrity)에 매우 파괴적일 수 있다. 활성화가능한 tsAMDE의 조건적 활성화에 의하여, 일시적 활성화가 달성되며, 이에 의하여 세포외 기질(ECM) 성분에 대한 효소 작용 지속시간이 조절되어 원치않는 장기간의 효소 활성화와 관련한 유해한 부작용이 감소된다. 이는 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 기존의 콜라게나제 처치에 대한 본 tsAMDE, 예컨대 tsMMPs의 장점이다. 따라서, 상기 돌연변이체의 장점은 그들의 활성이 조절되어 ECM의 질환 및/또는 상태를 치료하기 위한 tsAMDE의 사용을 가능하게 한다는 것이다.
본원에서 제공되는 tsAMDE 돌연변이체, 예컨대 tsMMPs는 예를 들어 아미노산 치환, 삽입 또는 교체에 의하여 온도 민감성이도록 변형된 것들을 포함한다. 일반적으로, tsAMDEs는 상기 단백질이 비허용(non-permissive) 온도에서보다 허용(permissive) 온도에서 더욱 활성이도록 하는 그의 1차 서열 내 하나 이상의 아미노산 교체를 포함한다. 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특히, 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변형을 포함한다.
본원에서 제공되는 tsAMDEs, 예컨대, tsMMPs는 허용 온도에서 활성화가능하나, 다른 비허용 온도에서 불활성이거나 거의 활성이 없다. 본원에서 제공되는 tsAMDE는 비허용 온도와 비교하여 허용 온도에서 약 또는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 이상인 비율(ratio)을 가진다. 따라서, 본원에서 제공되는 tsAMDEs의 비허용 온도에서 활성은 허용 온도에서 활성의 약 또는 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 이하이다
예를 들어, 생리학적 온도(예컨대, 37℃)에서 정상적으로 활성인 AMDEs는 변형되어, 더 낮은 온도에서(예컨대, 37℃ 미만; 예컨대 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃에서) 활성이나, 생리학적 온도에서 불활성이거나 거의 활성이 없는 선택된 효소이다. 상기 변형된 효소는 활성화 조건이 낮은 온도인 경우 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)로써 사용될 수 있다. 효소의 활성화는 생체내 온도가 생리학적 온도인 37℃로 복귀함에 따라 시간적으로 제어된다. 따라서, 예를 들면, 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 약 또는 25℃인 허용 온도에서 활성이나, 약 또는 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃ 또는 39℃와 같은 더 높은 온도에서 덜 활성이다. 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 약 또는 34℃ 또는 37℃, 예를 들어 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃ 또는 39℃의 비허용 온도와 비교하여 낮은 허용 온도(예컨대, 37℃ 미만, 예컨대 약 또는 25℃)에서 약 또는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 3, 40, 50 이상의 비율을 가진다. 따라서, 본원에서 제공되는 tsAMDEs의 약 또는 34℃ 또는 37℃의 비허용 온도에서 활성은 약 또는 25℃의 허용 온도에서 활성의 약 또는 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 이하이다.
본원에서 제공되는 tsAMDEs, 예를 들어 tsMMPs는 하나 이상의 야생형 효소의 활성, 예컨대, 콜라겐과 같은 ECM 성분의 절단을 위한 효소 활성을 유지한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 허용 온도에서 야생형 AMDE 활성의 약 또는 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 140%, 150% 이상인 허용 온도에서 활성을 유지한다. 일반적으로, 본원에서 제공되는 tsAMDEs는 생리학적 온도(예컨대, 34 또는 37℃)에서 야생형 효소의 잔여 활성(residual activity)의 95%, 90%, 80%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 일반적으로 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%를 나타낸다.
활성화 조건이 온도인 경우, 활성화를 위하여 요구되는 허용 온도에 상기 tsAMDEs를 노출시키는 활성화제가 제공될 수 있다. 활성화제에 대한 노출은 시험관내 또는 생체내 일 수 있다. 활성화제는 생체내 투여 전에, 그와 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 tsAMDEs에 노출될 수 있다. 활성화제는 활성화를 위하여 요구되는 필요한 열 또는 냉각을 제공할 수 있다. 예를 들어, 활성화 조건이 낮은 온도인 경우, 활성화제는 냉각 완충액 또는 얼음팩으로써 제공되어 투여 부위에 적용될 수 있다. 활성화 조건이 열인 경우, 활성화제는 따뜻한 완충액 또는 열팩으로써 제공되어 투여 부위에 적용될 수 있다. 활성화 조건은 또한 사용 즉시 및 직전에 허용 온도에서 tsAMDEs의 보관에 의하여 제공될 수 있다. 활성화제에 대한 노출 지속시간은 계속적일 수 있으며, 미리결정된 시간 동안일 수 있으며, 또는 간헐적(예컨대, tsAMDEs 가 가역적이라면)일 수 있다. 따라서, 활성화를 허용하는 지속시간은 유동적이고, 사용되는 특정 효소, 치료되는 질환 또는 상태, 투여 부위 또는 다른 인자에 조정될 수 있다. 활성화제의 노출 지속시간을 결정하는 것은 당업자의 수준 이내이다.
활성화 조건을 제공하는 활성화제에의 노출의 부재시, 비허용 온도에서 존재하는 tsAMDE는 허용 온도에서 활성과 비교하여 불활성이거나 실질적으로 불활성이다. 투여 부위에 정상적으로 존재하지 않는 허용온도(예컨대, 낮은 온도)인 활성화 조건은 기관 및 조직, 예컨대 약 37℃의 생리학적 온도를 나타내는 간질의 생리학적 파라미터의 시간적 조절, 및 변경을 허용한다. 정상적 생리학적 조건 하에서, 간질의 온도는 약 37℃이다. 따라서, 예를 들어, 낮은 온도에서 활성인 tsAMDEs는 정상적으로 간질에 존재시 간질의 생리학적 온도 때문에 촉매적으로 불활성이다. 간질의 온도가 예를 들어 이웃하는 표면에 투여된 냉각된 완충액 또는 냉각팩의 노출에 의하여 일시적으로 냉각된 경우, tsAMDEs는 간질에 투여시 활성화될 것이다. 온도가 상승하고 생리학적 수준으로 복귀하는 경우, 이어서 tsAMDEs는 불활성화되거나 실질적으로 불활성이 되고, 그의 효소 활성을 나타내는 것을 중단한다. 따라서, 외인적 활성화 조건에 대한 필요를 이용함으로써, tsAMDEs는 활성화가능하고, 이용되는 동안, 예컨대 몸으로 생체내 투여시 제한된 지속시간 동안 일시적으로 활성이도록 만들어질 수 있다.
본원에서 제공되는 tsAMDEs는 비허용 온도에 노출 후 비가역적으로 불활성인 것들을 포함한다. 상기 돌연변이체는 허용 온도 조건(예컨대, 25℃)에 노출시 활성이나, 몸으로 생체내 투여 및 외인성 활성화제(예컨대, 냉각팩)의 제거시 발생하는 것과 같이 온도가 비허용 온도(예컨대, 37℃)로 변경되는 경우 불활성이거나 거의 활성이 없다. 예를 들어, 허용 조건으로 복귀시, 본원에서 제공되는 비가역적 tsAMDEs 폴리펩티드는 비허용 온도에서 활성의 약 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120%를 나타낸다. 상기 활성은 가역적이 아니다.
비허용 온도에 노출 후 가역적으로 불활성인 tsAMDEs가 또한 본원에서 제공된다. 상기 돌연변이체는 허용 온도 조건에 노출시 활성이나, 상기 온도가 비허용 온도로 변경되는 경우 불활성이거나 거의 활성이 없다. 허용 온도를 제공하는 활성화 조건(예컨대, 냉각팩)에 새로이 노출시, tsAMDEs의 활성이 회복되며, 이에 의하여 상기 효소는 하나 이상의 ECM 성분들을 분해하기 위하여 충분히 활성이 된다. 예를 들어, 비허용 조건으로부터 허용 조건으로 복귀시, 본원에서 제공되는 가역적 tsAMDEs 폴리펩티드는 비허용 온도에서 활성의 약 또는 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200% 이상을 나타낸다.
전형적으로, 본원에서 제공되는 tsAMDEs 는 자이모겐(프로펩티드를 포함) 또는 프로세싱된 효소(프로펩티드를 결함), 또는 이들의 촉매적으로 활성인 형태이다. 하기에서 논의되는 바와 같이, MMPs를 포함한 대부분의 효소는 자이모겐이며, 폴리펩티드의 N-말단으로부터 프로펩티드 세그먼트의 제거에 의하여 활성을 위한 초기 프로세싱 사건을 필요로 한다. 프로세싱 제제(processing agent), 예컨대 프로테아제 또는 화학 제제가 하나 이상의 절단 사건을 직접 또는 간접적으로 개시하여 효소의 활성 부위를 노출시키는 프로펩티드 세그먼트의 제거 및/또는 구조적 변화를 통하여 활성인 효소를 생성한다. 따라서, 정상적으로, 효소의 성숙한 형태로의 프로세싱시 효소는 활성이 된다. 프로세싱된 효소의 활성은 비가역적이며, 이에 의해 체내 프로세싱된 효소의 투여시 ECM의 제어되지 않는 분해를 초래한다. 온도 민감성을 추가로 부여하는 효소의 변형이 효소의 활성화를 조건적으로, 일시적으로 조절하여 프로세싱된 형태의 계속적 활성화를 피하는 기전을 제공한다는 것이 본원에서 고려된다.
효소가 온도 활성화 조건의 필요에 의하여 활성화가능하다면, 합성 또는 천연 출처로부터 분리된 임의의 AMDE, 예컨대 표 3 또는 본원의 다른 곳에 개시된 것과 같은 것들, 이들의 자이모겐 형태, 프로펩티드를 결한 이들의 성숙한 형태, 및 촉매 활성 도메인만을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 촉매적으로 활성인 형태, 및 이들의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체, 또는 당업자에게 공지된 임의의 것이 변형되어 온도 민감성이 될 수 있으며, 본원에서 제공되는 조성물, 조합물, 방법 및 장치에서 사용될 수 있다. 당업자는 tsAMDEs를 인식하거나 확인할 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 통상적인 분자 생물학 기술을 이용하여 기질-분해효소 내에 아미노산 돌연변이를 도입하고, 각각에 대하여 허용온도 및 비허용온도 하에서 효소 활성화를 시험하여 임의의 원하는 효소의 지속되거나 가역적인 활성화를 위한 외인적 활성화 조건의 필요를 평가할 수 있다. 효소 활성화를 위한 예시적 분석법은 본원에서 제공되고, 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 tsAMDEs는, tsMMP가 허용 온도에서 효소 활성을 나타내는 한, 자이모겐 형태(예컨대, 프로엔자임), 프로펩티드를 결한 활성 효소, 및 촉매 활성 도메인만을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 효소의 변형은 이들의 활성형 내에 존재한다. 상기 tsAMDEs의 예는 tsMMP-1이다. 본원에서 제공되는 tsMMP-1은 서열번호:327 에 개시된 야생형 MMP-1 내 하나 이상의 아미노산 치환에 상응하는 그의 1차 서열 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 예시적인 변형은 하기 기재된다. 본원에서 제공되는 tsMMP-1 돌연변이체는, 그 형태가 돌연변이를 포함하는 한, 자이모겐인 것들 및 프로펩티드를 결한 활성 효소인 것들을 포함한다. 본원에서 제공되는 자이모겐 또는 활성 폴리펩티드는, tsMMP-1 허용 온도에서 효소 활성을 유지하는 한, 전체 길이인 것들, 프롤린 리치 링커 또는 헤모펙신 결합 도메인의 전부 또는 일부를 포함한 것들, 프롤린 리치 링커 또는 헤모펙신 결합 도메인의 전부 또는 일부를 결여한 것들, 또는 이들의 촉매 활성 도메인만을 포함하는 폴리펩티드(예컨대, 서열번호: 327에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 81-242에 상응하는 것)를 포함한다.
자이모겐 형태로 제공되는 경우 tsAMDEs는 불활성이고, 프로세싱 제제에 의한 프로세싱이 활성을 위하여 요구되는 것으로 이해된다. 일반적으로, 효소의 프로세싱은 사용 전, 예컨대, 생체내 투여 전에 수행된다. 프로세싱 제제는 tsAMDEs의 활성화 조건(예컨대, 낮은 온도)에 노출 및 체내 투여와 동시에, 간헐적으로 또는 이어서 적용될 수 있다. 일반적으로, 프로세싱 제제는 대상에 투여하기 적합한 것으로 선택된다. 원한다면, 프로세싱 제제는 예컨대 투여 전에 투석 또는 다른 정제 방법에 의하여 효소로부터 정제될 수 있다. 따라서, 효소의 자이모겐 형태에 대하여, 활성화를 위한 다음의 2 단계가 요구된다: 1) 프로세싱 제제에의 노출; 및 2) 활성화 조건에의 노출. 자이모겐 또는 프로세싱된 형태이든, tsAMDEs의 허용 온도에서 활성화제에 노출은 tsAMDEs의 활성을 시간적으로 제어한다.
tsAMDEs는 하나 이상의 성질 또는 활성을 변경하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 변경된 성질 또는 활성은 효소가 더욱 안정하도록 하거나, 기질 특이성을 변경하거나/하고 하나 이상의 억제제에 대한 저항성을 증가시키는 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, tsAMDEs는 기질 특이성을 변경하도록 변형될 수 있다. 예를 들어 효소는 특정 기질에 대한 증가된 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, I형 및 IV형 콜라겐에 대한 기질 특이성을 갖는 tsAMDEs가 IV형 콜라겐이 아닌 I형 콜라겐에 대해 증가된 기질 특이성을 갖도록 변형될 수 있으며, 그 역도 성립가능하다. 원한다면, 효소 안정성 또한 효소의 페길화 또는 글리코실화에 의해 증가될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 달성될 수 있으며, 당업자의 수준 내에 있다. 본원의 목적을 위하여, 변형된 tsAMDEs는 허용 온도에서 야생형 효소의 하나 이상의 활성을 유지한다. 유지된 활성은 허용 온도에서 야생형 MMP의 활성의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% 이상일 수 있다. 변형된 효소의 기질 특이성은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 것과 같은 기질 절단에 대한 통상적 분석법을 이용하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 기질 절단은 형광형성 펩티드 또는 정제된 단백질에서 측정될 수 있다. 절단은 시험관내 또는 생체내 측정법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 절단은 효소와 기질을 배양하고, 이어서 혼합물을 SDS-PAGE 겔 상에 걸어줌으로써 측정될 수 있다. 분해는 웨스턴 블럿 또는 쿠마시 블루 또는 실버 스테인 시약과 같은 표준 단백질 염색을 이용하여 측정될 수 있다.
상기 tsAMDEs는 조성물, 조합물 및 용기로써 본원에서 제공된다. 투여시, 예컨대, 표피하 투여시 활성화되어 하나 이상의 ECM 성분들을 분해하는 tsAMDEs는 치료적으로 유효한 양으로 제공된다. 생성된 tsAMDEs는 ECM-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 치료제로써 사용될 수 있다.
예를 들어, tsAMDEs는 활성화 조건을 제공하는 활성화제와 조성물, 조합물 및/또는 용기 내에 제공된다. 일부 예에서, tsAMDEs는 또한 프로세싱 제제와 조성물, 조합물 및/또는 용기 내에 제공된다. 활성화제 및/또는 프로세싱 제제는 상기 tsAMDEs와 동일한 조성물 내 또는 별개의 조성물 내, 및 동일한 용기 내 또는 별개의 용기 내에 있을 수 있다. 또한, tsAMDEs는 다른 제제, 예컨대 마취제, 알파 아드레날린성 제제, 분산제 또는 치료제 중 임의의 하나 이상과 병용되거나 조합물 내, 예컨대 용기 내에 제공될 수 있다. tsAMDEs는 다른 제제와 동일 또는 별개의 조성물 내에 제공될 수 있거나/있고, 동일 또는 별개의 용기 내에 제공될 수 있다.
tsAMDEs는 치료적으로 유효한 농도로 액체 또는 동결건조된 형태로써 제공될 수 있다. 선택적으로, tsAMDE는 충분한 양의 활성화제의 첨가가 효소의 치료적으로 유효한 농도를 생성하도록 농축된 액체로써 제공될 수 있다. 효소는 용액 또는 현탁액으로써 제공되거나, 적절한 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 유리입자, 모세관, 약물 전달 비히클, 젤라틴, 겔, 정제, 캡슐, 알약, 시간 방출 코팅, 뿐만 아니라 경피 패치 제제 및 건조 분말 흡입기 또는 다른 그러한 비히클 내에 피막화될 수 있다. 활성화제는 전형적으로 단독으로, 또는 tsAMDEs의 재구성 후 및/또는 노출 후에 간질 내 투여를 위한 액체 용액 또는 현탁액으로써 제공된다. 일부 예에서, 활성화제는 외인적으로 제공되어 투여 부위에 적용된다. 예를 들어, 활성화제는 tsAMDEs의 투여 전, 그와 동시에, 순차적으로 도는 간헐적으로 투여 부위, 예컨대, 피부에 적용될 수 있는 열 또는 냉각 팩일 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 상기 조합을 포함하는 키트 및 또한 제조품, 예컨대 용기가 또한 제공된다.
따라서, 원하는 경우, tsAMDEs 효소는 효소가 활성화제에 노출되어 활성인 효소를 생성하는 활성화 조건을 겪게 된다. 활성화제에 노출은 시험관내 또는 생체내에서 달성될 수 있다. 예를 들면, 활성화 효소 및 활성화제가 별개로 제공되는 경우, 이들은 함께 또는 별개로 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, tsAMDEs는 활성화제와 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, tsAMDEs는 동결건조 또는 농축된 액체 형태로 사용 직전에 활성화제와 재구성될 수 있다. 상기 예에서, tsAMDEs 및 활성화제의 혼합물은 함께 투여된다. 상기 활성화 방법은 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있으며, 효소 및 활성화제의 선택, 원하는 치료방법 및 치료 요법에 따라 달라질 수 있다.
활성화가능한 기질-분해효소는 단독 또는 활성화제와의 조합물인 물품 또는 제조품으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소가 활성화제와 조합하여 제공된다면 제조 물품은 한 구획 내 동결건조 또는 액체 형태인 효소 및 인접 구획 내 활성화제를 포함할 수 있다. 상기 구획은 구분 요소(dividing member)에 의해 분리될 수 있다. 제조 물품은 프로세싱 제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제조 물품은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
tsAMDEs 및 활성화제의 조합물은 또한 하기 상세히 논의되는 다른 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 활성화제 및 tsMMPs에 추가로, 하나 이상의 마취제, 혈관수축제, 분산제 또는 다른 치료제를 포함하는 조합물이 제공된다.
i. 온도-민감성 기질 메탈로프로테아제 돌연변이체
변형되지 않은 MMP 폴리펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 1차 서열 내 변형에 의하여 온도 민감성인 tsMMP 폴리펩티드, 예를 들면, tsMMP-1 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. tsMMP 폴리펩티드는 비허용 온도에서 tsMMP 폴리펩티드의 활성과 비교하여 허용 온도에서 증가된 효소 활성을 나타낸다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 tsMMP 폴리펩티드는 약 또는 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃ 또는 39℃, 특히 약 또는 34℃ 또는 37℃인 비허용의 높은 온도와 비교하여 37℃ 미만인 낮은 온도, 예컨대, 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃, 특히 약 또는 25℃에서 증가된 효소 활성을 나타낸다. tsMMP 폴리펩티드의 온도-의존적 활성 때문에 MMP의 활성은 조건적으로 제어될 수 있으며, 이에 의하여 활성화를 시간적으로 조절하여 장기간의 원치않는 ECM의 분해를 방지할 수 있다. 특히 상기 tsMMP 폴리펩티드는 ECM의 질환 또는 상태를 치료하기 위한, 예컨대 셀룰라이트와 같은 콜라겐-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위한 용도, 처리 또는 방법에서 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 tsMMP 폴리펩티드는 비허용 온도에 비교하여 허용 온도에서 약 또는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 이상의 활성의 비율을 가진다. 따라서, 본원에서 제공되는 tsMMP 폴리펩티드의 비허용 온도에서 활성은 허용 온도에서 활성의 약 또는 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 이하이다. 본원에서 제공되는 tsMMPs 폴리펩티드는 야생형 MMP 폴리펩티드의 하나 이상의 활성, 예컨대, 콜라겐과 같은 ECM 성분의 절단을 위한 효소 활성을 유지한다. 전형적으로, 상기 활성은 야생형 또는 출발 단백질과 비교하여 실질적으로 변화되지 않는다(1%, 5%, 10%, 20% 또는 30% 미만으로 변화됨). 다른 예에서, 변형된 MMP 폴리펩티드의 활성은 야생형 또는 출발 MMP-1 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 감소된다. 허용 온도에서 활성이 측정되고, 허용 온도 또는 비허용 온도에서 출발의, 변형되지 않은 MMP 폴리펩티드의 활성과 비교된다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 tsMMP 폴리펩티드는 허용 온도 또는 비허용 온도에서 야생형 MMP-1의 활성의 약 또는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 140%, 150% 이상인 활성을 허용 온도에서 유지한다. 활성은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 측정되어, 변형되지 않은 MMP 폴리펩티드, 예컨대, 프로세싱 제제에 의하여 활성화되는 서열번호:327에 기재된 불활성 MMP 폴리펩티드, 또는 출발 물질로써 사용되는 것으로 당업자에 알려진 임의의 다른 MMP 폴리펩티드의 그것과 비교될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, MMP의 자이모겐 불활성형 또는 변형된 MMP는 사용 또는 활성의 측정 전에 활성형으로 프로세싱되어야 한다.
MMP 폴리펩티드 내 변형은 불활성 또는 활성형, 대립형질 및 종 변이체, 스플라이스 변이체, 당업계에 알려진 변이체, 또는 하이브리드 또는 키메릭 MMP 폴리펩티드를 포함한, MMP 폴리펩티드의 임의의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형은 전구체 폴리펩티드, 불활성 프로엔자임 형태, 자이모겐 형태, 이들의 활성형, 및 이들의 대립형질 또는 종 변이체를 포함한, 표 3에 기재된 임의의 예시적 MMP 폴리펩티드로 제조될 수 있다. 예를 들면, 예시적인 MMP는 서열번호:98에 기재된 전구체 MMP-1 폴리펩티드, 서열번호:327에 기재된 프로펩티드를 포함하는 불활성 프로엔자임 MMP-1, 서열번호:99에 기재된 프로펩티드를 결한 성숙한 MMP-1 폴리펩티드, 또는 서열번호:98 내지 99, 327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드의 어느 것과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 이들의 임의의 종, 대립형질 또는 변형된 변이체 및 활성 절편이다. 변형은 또한 MMP 폴리펩티드가 온도 민감성이고(즉, 상기 변형을 포함하고), 효소 활성을 유지하는 한, 하나 이상의 도메인을 결한 MMP 폴리펩티드 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 변형은 촉매 도메인만을 포함하는 MMP 폴리펩티드 내(예를 들어, 서열번호:327에 기재된 프로엔자임 MMP-1 폴리펩티드의 아미노산 81 내지 242 에 상응하는 MMP-1 내에) 있을 수 있다. 변형은 또한 프롤린 리치 링커의 전부 또는 일부를 결하거나/결하고(예를 들어, 서열번호:327에 기재된 프로엔자임 MMP-1 폴리펩티드의 아미노산 243 내지 258 에 상응하는 MMP-1 내), 헤모펙신 결합 도메인의 전부 또는 일부를 결한(예를 들어, 서열번호:327에 기재된 프로엔자임 MMP-1 폴리펩티드의 아미노산 259 내지 450 에 상응하는 MMP-1 내) MMP 폴리펩티드 내에 만들어질 수 있다. MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 변이체는 서열번호:537에 기재된 임의의 하나 이상의 아미노산 변이체를 포함하는 MMP-1 폴리펩티드의 어느 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 변형을 위한 예시적인 종 변이체는 예를 들어 서열번호:527 내지 532에 기재된 돼지, 토끼, 소, 말, 랫트, 및 마우스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 온도 민감성을 부여하기 위하여 본원에서 제공되는 MMP 폴리펩티드 내 변형은 폴리펩티드의 1차 서열의 변형 및 1차 서열이 아닌 변형을 포함한 당업계에 기술된 것들과 같은 다른 변형을 또한 포함하는 MMP 폴리펩티드로 제조될 수 있다. 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 변형은 변형된 형태가 온도 민감성 변형을 포함하고 온도에 민감성이 있는 한, 이들의 임의의 형태, 예컨대 활성 또는 불활성 형태, 촉매 도메인만을 포함하는 형태, 또는 프롤린 리치 링커 또는 헤모펙신 결합 도메인의 전부 또는 일부를 결한 형태 내의 변형을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 하기 논의되는 바와 같이, 상응하는 MMP-1 변형은 다른 MMP 폴리펩티드의 유사한 형태에도 만들어질 수 있다.
따라서, 생성되는 변형된 MMP 폴리펩티드는 불활성인 자이모겐 프로엔자임인 것들 및 활성인 폴리펩티드인 것들을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 자이모겐 프로엔자임인 임의의 변형된 폴리펩티드는 프로세싱 제제에 의해 활성화되어 활성인 MMP 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 프로세싱 제제는 하기 표 3A에 기재된 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. MMP-1 폴리펩티드의 활성화는 전형적으로 프로펩티드의 절단 및/또는 프로펩티드를 제거하기 위한 효소의 분자간 및 분자내 프로세싱 후 활성 형태를 나타낸다(예를 들어, Visse 등(2003) Cir. Res., 92:827-839; Khan 등(1998) Protein Science, 7:815-836; Okada 등(1988) Biochem J., 254:731-741; Okada & Nakanashi(1989) FEBS Lett., 249:353-356; Nagase 등(1990) Biochemistry, 29:5783-5789; Koklitis 등(1991) Biochem J., 276:217-221; Springman 등(1990) PNAS, 87:364-8; Murphy 등(1997) Matrix Biol., 15:511-8 참조).
[표 3A] 자이모겐 활성화제
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본원에서 제공되는 출발의, 변형되지 않은 참조 폴리펩티드의 변형은 아미노산 교체 또는 치환, 아미노산의 첨가 또는 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, tsMMP 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 변형된 위치를 포함한다. 출발 참조 MMP-1 폴리펩티드와 비교하여 2 이상의 변형을 가지는 변형된 tsMMP 폴리펩티드가 또한 본원에서 제공된다. 변형된 MMP 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 변형된 위치를 가지는 것들을 포함한다. 본원에서 제공되는 임의의 변형은 생성되는 변형된 MMP 폴리펩티드가 그의 활성화된 형태인 경우 효소 활성을 유지한다면, 그리고 효소 활성이 비허용 온도와 비교하여 허용 온도에서 더 크다면 당업자에게 알려진 임의의 다른 변형과 조합될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 MMP 폴리펩티드는 다양한 조건(예컨대, 허용 및 비허용 온도) 하에서 효소 활성을 측정하여 효소 활성을 유지하는 것들을 확인할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형은 당업자에게 통상적인 것과 같은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 만들어질 수 있다. 표적 단백질 내 임의의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 수행하기 위하여 당업계에 알려진 임의의 방법이 채택될 수 있다. 방법들은 고체상 폴리펩티드 합성법에 의하여 또는 (예컨대, Stratagene으로부터 입수가능한 QuickChange와 같은 키트를 이용한) 코드화하는 핵산 분자의 표준 위치-지향적 돌연변이생성법(site-directed mutagenesis)을 포함한다.
폴리펩티드의 1차 서열 내에서 혹은 그외의 다른 변형은 또한 변형된 MMP 폴리펩티드 또는 탄수화물 부위의 추가, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부위의 추가, Fc 도메인의 추가 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 컨쥬게이트 내에 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 추가적 변형은 단백질의 반감기의 안정성을 증가시키기 위하여 만들어질 수 있다.
1) 예시적 tsMMP -1 변형
출발의, 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드 내 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, 변형된 MMP-1 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 상기 아미노산 치환 또는 치환들은 다음의 위치의 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 위치에 있을 수 있다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 84, 85, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 118, 123, 124, 126, 147, 150, 151, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 170, 171, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 197, 198, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 218, 223, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 237, 240, 251, 254, 255, 256, 257 및 258, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 아미노산 치환은 아미노산의 산성(D 또는 E); 염기성(H, K 또는 R); 중성(C, N, Q, T, Y, S, G) 또는 소수성(F, M, W, I V, L A, P) 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 알려진 위치에서 아미노산 치환은 아미노산 잔기 E, H, R, C, Q, T, S, G, M, W, I, V, L , A, P , N, F, D, Y 또는 K에 의한 치환을 포함한다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 34℃ 또는 37℃의 비허용 온도와 비교하여 25℃의 허용 온도에서 증가된 활성에 의하여 온도 민감성인 MMP-1 폴리펩티드를 포함한다.
예를 들면, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 T84F(즉, 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드의 위치 84번에 상응하는 위치에서 T가 F로 치환), E85F, L95K, L95I, R98D, I99Q, E100V, E100R, E100S, E100T, E100F, E100I, E100N, T103Y, P104A, P104M, D105A, D105F, D105G, D105I, D105L, D105N, D105R, D105S, D105T, D105W, D105E, L106C, L106S, A109H, D110A, V111R, D112S, A118T, S123V, N124D, T126S, G147P, R150P, R150V, R150D, R150I, R150H, D151G, N152A, N152S, S153T, F155L, F155A, D156H, D156L, D156A, D156W, D156V, D156K, D156T, D156R, D156M, P158T, P158G, P158K, P158N, G159V, G159T, G159M, G159I, G159W, G159L, G159C, P170D, P170A, G171P, G171E, G171D, A176F, A176W, F178T, F178L, D179N, D179V, D179C, E180Y, E180R, E180T, E180F, E180G, E180S, E180N, E180D, E181T, D181L, D181K, D181C, D181G, E182T, E182Q, E182M, E182G, E183G, R183S, T185R, T185Y, T185H, T185G, T185V, T185Q, T185A, T185E, T185D, N187R, N187M, N187W, N187F, N187K, N187I, N187A, N187G, N187C, N187H, F188V, R189N, R189T, R189Q, E190G, E190Y, E190D, Y191V, N192H, N192S, N192D, N192C, H194P, R195C, R195W, R195L, R195G, R195Q, R195A, R195D, R195V, A197C, A197V, A198G, A198L, A198M, G206A, G206S, L207R, L207V, L207I, L207G, S208R, S208L, S210V, S210A, T211L, D212G, D212H, Y218S, F223C, F223E, F223G, F223A, F223S, F223K, F223M, V227C, V227D, V227E, V227L, V227S, V227W, V227G, V227H, V227Q, V227R, Q228P, L229A, L229T, L29I, A230V, D233E, I234A, I234T, I234E, I234Q, I237L, I237W, I237N, I240S, I240A, I240C, I251S, I251W, Q254S, T255H, P256C, K257P, K257T 및 A258P의 임의의 하나 이상의 변형에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 서열번호:328 내지 526의 어느 것에 기재된 아미노산 서열, 및 이의 활성형 및 다른 형태, 및 이들의 대립형질 및 종 변이체를 가진다.
일부 예에서, 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환 또는 치환들을 가지는 폴리펩티드를 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 95, 100, 103, 105, 150, 151, 153, 155, 156, 159, 171, 176, 179, 180, 181, 182, 185, 187, 190, 191, 192, 194, 195, 198, 206, 207, 210, 212, 218, 223, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 237 및 240, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 L95K, E100V, T103Y, D105A, D105F, D105G, D105I, D105L, D105N, D105R, D105S, D105T, D105W, R150P, D151G, S153T, F155L, F155A, D156H, D156L, D156A, D156W, D156V, D156K, D156T, D156R, G159V, G159T, G171P, A176F, D179N, E180Y, E180R, E180T, E180F, E181T, D181L, D181K, E182T, E182Q, T185R, T185Y, T185H, T185G, T185V, T185Q, T185A, T185E, N187R, N187M, N187W, N187F, N187K, N187I, N187A, E190G, Y191V, N192H, N192S, N192D, N192C, H194P, R195C, R195W, R195L, R195G, R195Q, R195A, R195D, R195V, A198G, A198L, A198M, G206A, G206S, L207R, L207V, S210V, D212G, Y218S, F223C, F223E, F223G, F223A, F223S, V227C, V227D, V227E, V227L, V227S, V227W, Q228P, L229A, L229T, L229I, A230V, D233E, I234A, I234T, I234E, I234Q, I237L, I240S, I240A, 및 I240C의 임의의 하나 이상의 변형에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 34℃ 또는 37℃의 비허용 온도와 비교하여 25℃의 허용 온도에서 적어도 1.2배 이상의 활성, 예컨대, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상의 활성을 나타낸다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드의 예는 서열번호:328, 331-340, 345-352, 354-357, 359, 363, 365, 368, 371, 373-374, 377-378, 380, 382-384, 388-395, 397-398, 401-419, 421-422, 424-426, 428-430, 433, 435, 437-450, 457-459, 462, 465-472, 477-478, 518의 어느 것에 기재된 아미노산의 서열, 및 이들의 활성형 및 다른 형태, 및 이들의 대립형질 및 종 변이체를 가진다.
다른 예에서, 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 다음의 위치의 어느 것에 대응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환 또는 치환들을 가지는 폴리펩티드를 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 95, 105, 150, 151, 155, 156, 159, 176, 179, 180, 181, 182, 185, 187, 195, 198, 206, 210, 212, 218, 223, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 및 240, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 예를 들면, 본원에서 제공되는 MMP-1 폴리펩티드는 L95K, D105A, D105F, D105G, D105I, D105L, D105N, D105R, D105S, D105T, D105W, R150P, D151G, F155A, D156K, D156T, D156L, D156A, D156W, D156V, D156H, D156R, G159V, G159T, A176F, D179N, E180Y, E180T, E180F, D181L, D181K, E182T, E182Q, T185R, T185H, T185Q, T185A, T185E, N187R, N187M, N187F, N187K, N187I, R195V, A198L, A198M, G206A, G206S, S210V, Y218S, F223E, V227C, V227E, V227W, Q228P, L229T, L229I, D233E, I234A, I234T, I234E, I240S, 및 I240C 의 임의의 하나 이상의 변형에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 34℃ 또는 37℃의 비허용 온도와 비교하여 25℃의 허용 온도에서 적어도 1.5배 이상의 활성, 예컨대, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 이상의 활성을 나타낸다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드의 예는 서열번호:328, 331-340, 345-346, 348-352, 354-357, 359, 363, 365, 368, 373-374, 377-378, 382-384, 388-391, 395, 397-398, 401-402, 404, 411, 415-419, 421-422, 430, 433, 437, 439-441, 443-444, 446-449의 어느 것에 기재된 아미노산의 서열, 및 이들의 활성형 및 다른 형태, 및 이들의 대립형질 및 종 변이체를 가진다.
추가적 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 25℃의 허용 온도에서 온도 민감성이고, 25℃에서 야생형 MMP-1과 비교하여 25℃에서 적어도 30%, 예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 140%, 150% 이상의 활성을 나타내는 변형된 MMP-1 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환 또는 치환들을 가지는 폴리펩티드를 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 95, 105, 150, 156, 159, 179, 180, 182, 185, 187, 195, 198, 212, 223, 227, 234, 및 240, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 예를 들면, 본원에서 제공되는 MMP-1 폴리펩티드는 L95K, D105A, D105G, D105I, D105L, D105N, D105S, D105W, D105T, R150P, D156K, D156T, D156V, D156H, D156R, G159V, G159T, D179N, E180Y, E180T, E180F, E182T, T185H, T185Q, T185E, N187M, N187K, N187I, R195V, A198L, F223E, V227E, I234E 및 I240S의 임의의 하나 이상의 변형에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 MMP-1 폴리펩티드의 예는 서열번호:328, 332-335, 337-340, 345, 349-352, 355, 359, 363, 368, 373-374, 377, 384, 388-389, 391, 397, 402, 404, 411, 416, 422, 430, 444, 449의 어느 것에 기재된 아미노산의 서열, 또는 이들의 활성형 및 다른 형태, 및 이들의 대립형질 및 종 변이체를 가진다.
특히, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환 또는 치환들을 가진다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 95, 105, 150, 156, 159, 179, 180, 182, 185, 187, 198, 227, 234 및 240, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 본원에서 제공되는 MMP-1 폴리펩티드는 임의의 하나 이상의 변형 L95K, D105I, D105N, D105L, D105A, D105G, R150P, D156R, D156H, D156K, D156T, G159V, G159T, D179N, E180T, E180F, E182T, T185Q, N187I, A198L, V227E, I234E 및 I240S에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱 특히는, 본원에서 제공되는 MMP-1 폴리펩티드는 임의의 하나 이상의 변형 L95K, D105N, R150P, D156K, D156T, G159V, D179N, E180T, A198L, V227E, 및 I240S에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 가역적 또는 비가역적(또한 불가역적이라고 불림) 온도-의존적 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 모든 경우에서, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 비허용 온도(예컨대, 34℃ 또는 37℃)와 비교하여 허용 온도(25℃)에서 증가된 활성을 나타낸다. 비가역적 폴리펩티드에 대하여, 허용 온도에 노출 전에, 순차적으로 또는 간헐적으로 비허용 온도에의 노출은 상기 폴리펩티드가 비가역적으로 불활성이도록 한다. 따라서, 온도 허용 조건, 예컨대, 25℃로 복귀된 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 비허용 조건, 예컨대, 34℃ 또는 37℃에서 상기 MMP-1 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 활성을 나타낸다. 예를 들어, 허용 조건으로 복귀시, 본원에서 제공되는 비가역적인 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 비허용 온도에서 활성의 약 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 105%, 110%, 115%, 또는 120%를 나타낸다. 본원에서 제공되는 비가역적인 변형된 MMP-1 폴리펩티드의 예는 임의의 하나 이상의 변형 L95K, D105I, D105L, D105N, D105R, D105W, D151G, F155A, D156K, D156T, D156L, D156A, D156W, D156V, D156H, D156R, G159V, A176F, D179N, D181L, D181K, E182T, E182Q, T185R, N187F, N187I, G206A, G206S, V227C, V227E, Q228E, L229T, D233E, I234A, I234T, I234E, I240S에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드, 예를 들어, 서열번호: 328, 331-332, 337-339, 346, 348, 349-352, 354-357, 363, 365, 368, 378, 382-384, 390, 401, 404, 417-418, 430, 433, 439-440, 443-444, 446-447, 449에 기재된 어느 것, 또는 이의 활성형 및 다른 형태, 및 이의 대립형질 및 종 변이체를 포함한다.
가역적 폴리펩티드에 대하여, 허용 온도에 노출 전에, 순차적으로 또는 간헐적으로 비허용 온도에의 노출은 상기 폴리펩티드가 가역적으로 활성이도록 한다. 따라서, 온도 허용 조건으로 복귀된 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 활성을 회복하고, 이에 의하여 비허용 온도와 비교하여 허용 온도에서 증가된 활성을 나타낸다. 상기 예에서, 회복된 활성은 완전하거나 부분적일 수 있다. 따라서, 온도 허용 조건, 예컨대, 25℃로 복귀된 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 비허용 온도, 예컨대, 34℃ 또는 37℃에서 활성과 비교하여 증가된 활성을 나타낸다. 예를 들어, 허용 조건으로 복귀시, 본원에서 제공되는 가역적인 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 비허용 온도에서 활성의 약 또는 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200% 이상을 나타낸다. 본원에서 제공되는 가역적인 변형된 MMP-1 폴리펩티드의 예는 임의의 하나 이상의 변형 D105A, D105F, D105G, D105S, D105T, R150P, G159T, E180Y, E180T, E180F, T185H, T185Q, T185A, T185E, N187R, N187M, N187K, R195V, A198L, A198M, S210V, Y218S, F223E, V227W, L229I 및 I240C에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드, 예를 들어, 서열번호: 333-336, 340, 345, 359, 373-374, 377, 388-389, 391, 395, 397-398, 402, 411, 415-416, 419, 421-422, 437, 441, 448에 기재된 어느 것, 또는 이의 활성형 및 다른 형태, 및 이의 대립형질 및 종 변이체를 포함한다.
2) 조합
출발 또는 참조 MMP-1 폴리펩티드와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 변형을 포함하는 변형된 MMP-1 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 상기 제공된 임의의 2 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 임의의 2 이상의 위치에서 아미노산 치환들을 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 84, 85, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 118, 123, 124, 126, 147, 150, 151, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 170, 171, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 197, 198, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 218, 223, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 237, 240, 251, 254, 255, 256, 257 및 258, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 일반적으로, 상기 조합 돌연변이체는 온도 민감성이고, 비허용 온도에서 tsMMP-1 폴리펩티드의 활성과 비교하여 허용 온도에서 증가된 효소 활성을 나타낸다. 전형적으로, 조합 돌연변이체는 또한 허용 또는 비허용 온도에서 단일 돌연변이체 MMP-1 폴리펩티드 단독과 비교하여 또는 상기 아미노산 변화들을 포함하지 않는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드(예컨대, 서열번호:327에 기재된 야생형 MMP-1 폴리펩티드 또는 이의 활성형 또는 다른 형태)와 비교하여 허용 온도에서 활성을 유지한다.
본원에서 제공되는 예시적인 MMP-1 조합 돌연변이체는 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 임의의 2 이상의 위치에서 아미노산 치환들을 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1 폴리펩티드의 95, 105, 150, 156, 159, 179, 180, 182, 185, 187, 198, 227, 234 및 240, 또는 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드에 적어도 또는 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 MMP-1 폴리펩티드의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체 내의 상응하는 위치. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 임의의 2 이상의 변형 L95K, D105I, D105N, D105L, D105A, D105G, R150P, D156R, D156H, D156K, D156T, G159V, G159T, D179N, E180T, E180F, E182T, T185Q, N187I, A198L, V227E, I234E 및 I240S에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱 특히는, 본원에서 제공되는 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 임의의 2 이상의 변형 L95K, D105N, R150P, D156K, D156T, G159V, D179N, E180T, A198L, V227E, 및 I240S에 상응하는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공되는 조합 돌연변이체 내에는 2 이상의 상이한 위치가 변형된 것으로 이해된다. 본원에서 제공되는 MMP-1 조합 돌연변이체 폴리펩티드의 예가 실시예 29의 표 27에 개시되어 있다.
3) 부가적 변형들
본원에서 제공되는 임의의 변형된 MMP, 예를 들어 임의의 변형된 MMP-1 폴리펩티드는 또한 당업계에 기술된 하나 이상의 다른 변형을 포함할 수 있다. 부가적 변형은 예를 들면, 당업계에 알려진 임의의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 상기 기재된 하나 이상의 변형을 포함하는 것에 추가로, 본원에서 제공되는 임의의 변형된 MMP-1 폴리펩티드는, 생성되는 MMP-1 폴리펩티드가 비허용 온도(예컨대, 34℃ 또는 37℃)와 비교하여 허용 온도(예컨대, 25℃)에서 증가된 활성을 나타내고 허용 또는 비허용 온도에서 야생형 MMP-1의 활성을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 부가적 변형을 포함할 수 있다. 부가적 변형은 효소에 부가적 성질, 예컨대, 증가된 안정성, 증가된 반감기 및/또는 억제제, 예컨대 TIMP에 대한 증가된 저항성을 부여할 수 있다. 부가적 변형은 폴리펩티드의 1차 서열에 대한 변형 뿐만 아니라 다른 변형, 예컨대 폴리펩티드의 페길화(PEGlaytion) 및 글리코실화(glycosylation)를 포함한다. 일반적으로, 상기 폴리펩티드는 본원에서 제공되는 하나 이상의 변형을 포함하고, 더 높은 온도에서 보다 더 낮은 온도에서 증가된 활성을 나타낸다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 변형의 예는 서열번호:327에 기재된 폴리펩티드의 T4P, Q10P, R30M, R30S, T96R, A114V, F166C, I172V, D181H, R189T, E200A, G214E, D232N, D233G, R243S, Q254P, T286A, I298T, E314G, F315S, V374M, R386Q, S387T, G391S, 및 T432A 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
4) 다른 MMPs
기질 메탈로프로테아제는 매우 상동인(homologous) 폴리펩티드이며, 세포외 기질 성분에 대한 유사한 특이성을 나타낸다. MMP의 예시적 서열은 표 3에 기재되어 있으며, 예를 들면, 서열번호:1, 711, 714, 717, 720, 723, 726, 729, 732, 735, 738, 741, 744, 747, 750, 753, 756, 759, 762, 765, 768, 771, 774 또는 777에 기재된 어느 것 또는 자이모겐 형태, 이의 활성형 또는 다른 형태, 또는 이의 대립형질 또는 종 변이체이다. 도 1 내지 7 은 예시적인 MMP 폴리펩티드의 자이모겐 형태의 배열을 제공한다. 따라서, MMP-1 내의 본원에서 제공되는 임의의 변형은 임의의 다른 MMP 폴리펩티드 내에 만들어질 수 있다. 따라서, 본원의 기재에 기초하여, 임의의 MMP, 종, 대립형질 변이체 또는 다른 변이체는 비허용 온도(일반적으로 더 높은 온도)와 비교하여 허용 온도(일반적으로 더 낮은 온도)에서의 활성에 의하여 일시적으로 (가역적 또는 비가역적) 활성인 것으로 만들어질 수 있다. 상기 tsMMP 돌연변이체는 당업자에 의하여 사용될 수 있고, ECM-매개 질환 또는 상태의 치료를 위한 조성물, 처리 또는 방법에서 사용될 수 있다.
다양한 MMPs를 MMP-1(예를 들면, 서열번호: 327에 기재된)에 배열하고, 상응하는 잔기들을 확인하는 것은 당업자의 수준 이내이다. 본원에서 제공되는 임의의 변형은 임의의 다른 MMP 내 상응하는 잔기에 만들어질 수 있다. 당업자는 비허용 온도와 비교하여 허용 온도에서의 온도 민감성에 대한 생성되는 변형된 폴리펩티드의 활성을 시험할 수 있다. 특히, MMP 내 상응하는 위치에 보존적 아미노산 차이는 기능적으로 불변인 것으로 이해된다. 따라서, MMP-1 내 잔기가 다른 MMP 내 그의 보전적 잔기와 배열되는 경우, 상기 잔기는 본원에서 변형을 위하여 고려되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 서열번호:327에 개시된 MMP-1 내 95번 위치는 루이신(L)이다. 다른 MMPs 와 서열번호:327의 배열은 다른 MMPs 내 95번 위치가 루이신, 이소루이신(I) 또는 발린(V) 잔기인 것을 나타낸다(도 1 내지 7). 각각의 L, I 및 V는 보전적 잔기이다.
특히, MMP 내 상응하는 잔기에서 상응하는 MMP-1 변형을 수행함으로써 하나 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형되어 온도 민감성을 부여하는 변형된 MMP 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 도 8 내지 11은 변형을 위한 예시적인 아미노산 잔기들을 묘사한다. 상기 확인된 잔기들은 오직 예시적이며, 다른 아미노산 잔기 또는 다른 MMP-1 상응 잔기에서 MMP의 변형을 수행하여 온도 민감성을 부여하는 것은 당업자의 수준 이내에 있는 것으로 이해된다. 본원에서 제공되는 예시적인 변형은 임의의 MMP, 예를 들면, MMP-8, MMP-13, MMP-18, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-10, MMP-11, MMP-7, MMP-26 및 MMP-12의 다음의 위치의 어느 것에 상응하는 하나 이상의 위치에서 변형을 포함한다: 서열번호:327에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-1의 95, 105, 151, 156, 159, 176, 179, 180, 181, 182, 185, 195, 198, 206, 210, 212, 218, 223, 228, 229, 233, 234, 및 240. 변형은 상기 본원에서 제공된 변형들의 임의의 하나 이상을 MMP-1 내 상기 기재된 위치에 상응하는 위치에서 포함한다. 예를 들면, 서열번호:327에 기재된 MMP-1 폴리펩티드 내 95번 잔기는 서열번호:101에 기재된 MMP-8 폴리펩티드 내 113번 잔기에 상응한다. 따라서, 서열번호: 101에 기재된 아미노산 서열을 가지는 변형되지 않은 MMP-8 폴리펩티드 의 아미노산 변형 L113K를 가지는 변형된 MMP-8이 본원에서 제공된다. 상기 기재에 기초한 유사한 변형들이 본원에서 제공된다.
본원에서 제공되는 임의의 변형된 MMP 폴리펩티드는 또한 당업계에 기술된 하나 이상의 다른 변형을 포함할 수 있다. 부가적인 변형은 예를 들면 당업계에 공지된 임의의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 상기 기재된 하나 이상의 변형을 포함하는 것에 추가로, 본원에서 제공되는 임의의 변형된 MMP 폴리펩티드는, 생성되는 MMP 폴리펩티드가 비허용 온도(예컨대, 34℃ 또는 37℃)와 비교하여 허용 온도(예컨대, 25℃)에서 증가된 활성을 나타내고, 허용 또는 비허용 온도에서 야생형 MMP의 활성을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 부가적 변형을 포함할 수 있다. 부가적 변형은 효소에 부가적 성질, 예컨대, 증가된 안정성, 증가된 반감기 및/또는 억제제, 예컨대 TIMP에 대한 증가된 저항성을 부여할 수 있다. 부가적인 변형은 폴리펩티드의 1차 서열에 대한 변형 뿐만 아니라 다른 변형, 예컨대 폴리펩티드의 페길화 및 글리코실화와 같은 다른 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 폴리펩티드는 본원에서 제공되는 하나 이상의 변형을 포함하고, 더 높은 온도에서 보다 더 낮은 온도에서 증가된 활성을 나타낸다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 예시적인 변형은 하기 표 3B에 개시된 임의의 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[표 3B] MMPs 내 변형의 예
Figure pct00011
2. 기질-분해효소 및 활성화제의 조합
기질-분해효소의 활성화를 위하여 충분한, 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제의 조합이 본원에서 제공된다. 본원의 목적을 위하여, 활성화가능한 기질-분해효소는 불활성형으로 제공된다. 일반적으로, 활성화가능한 기질-분해효소의 조성물은 활성화제와 별개로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 동일한 용기 또는 별개의 용기 내에 별개로 제공될 수 있다. 일반적으로, 단독 포장시, 상기 효소는 효소가 활성이도록 하기에 불충분한 활성화 조건이 존재하도록 제공된다.
기질-분해효소는 치료적으로 유효한 농도로 액체 또는 동결건조된 형태로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 기질-분해효소는 농축된 액체로써 제공되어, 충분한 양의 활성화제를 첨가함으로써 치료적으로 유효한 농도의 효소를 생성할 수 있다. 상기 효소는 용액 또는 현탁액으로써 제공되거나, 적절한 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 유리입자, 모세관 튜브, 약물전달장치, 젤라틴, 정제, 캡슐, 알약, 시간방출코팅 뿐만 아니라 경피패치 제제 및 건조분말 흡입기 또는 다른 그러한 비히클 내로 캡슐화될 수 있다. 상기 활성화제는 전형적으로 단독으로 또는 상기 기질-분해효소의 재구성 및/또는 노출 후에 간질 내로 투여하기 위한 액체 용액 또는 현탁액으로 제공된다. 하기 섹션 F에 기술된 바와 같이, 이러한 조합물 및 또한 제조품, 예컨대 용기를 함유하는 키트 또한 제공된다.
따라서, 원하는 경우, 활성화가능한 기질-분해효소를 상기 효소가 활성화제에 노출되어 활성인 효소를 생성하는 활성화 조건에 기인한다. 활성화제에 노출은 시험관내 또는 생체내에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성화가능한 효소 및 활성화제가 별개로 제공되는 경우, 이들은 함께 또는 별개로 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 조건적으로 활성화가능한 기질-분해효소는 상기 활성화제와 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 동결건조된 또는 농축된 액체 형태인 기질-분해효소가 사용직전 상기 활성화제와 재구성될 수 있다. 그러한 예에서, 기질-분해효소 및 활성화제의 혼합물이 함께 투여될 수 있다. 그러한 활성화 방법은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있으며, 효소 및 활성화제의 선택, 원하는 투여방법 및 투여용법에 따라 달라질 수 있다.
상기 활성화가능한 기질-분해효소는 물품 또는 제조품 단독으로, 또는 상기 활성화제와 조합물로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 효소가 상기 활성화제와 조합물로 제공된다면, 제조품은 하나의 구획에서 동결건조된 또는 액체 형태인 효소를, 그리고 인접한 구획에서 활성화제를 함유할 수 있다. 상기 구획은 분할 멤버(dividing member)에 의해 분리될 수 있다. 그러한 제조품은 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
기질-분해효소 및 활성화제의 조합은 또한 하기에서 상세하게 논의된, 다른 제제들을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 활성화제 및 기질-분해효소 뿐만 아니라, 하나 이상의 마취제, 혈관수축제 또는 분산제를 함유하는 조합이 제공될 수 있다.
E. 기질-분해효소 및 이들의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산의 생산방법
본원에 기재된 기질-분해효소의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대한 해당 기술분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 획득될 수 있다. 원하는 유전자를 코드화하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 원료로부터, 원하는 기질-분해효소를 코드화하는, 전체길이의(즉, 전체코드화부위를 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 획득할 수 있다. 변형된 또는 변이체 기질-분해효소는, 예컨대 위치-지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 제작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업자에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 그러한 방법들은 핵산분자 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 핵산분자의 PCR 증폭 및 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 핵산 함유 재료는 원하는 폴리펩티드-코드화 핵산분자가 분리될 수 있는 출발재료로써 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 조직추출물, 조직추출물, 체액시료(예컨대, 혈액, 혈청, 침), 건강한 및/또는 병에 걸린 대상의 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리 또한 출발재료의 원료로써 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현된 서열을 기초로 설계된다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기초로 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산분자는 서열분석되어 원하는 폴리펩티드를 코드화하는지 확인될 수 있다.
벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터 또는 DNA 서열을 코드화하는 핵심 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커서열을 포함하는, 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-코드화 핵산분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정화하는 추가 뉴클로오티드 서열이 폴리펩티드-코드화 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 고안된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하는 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 시그널 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 서열은 당업자에 알려져 있다. 예를 들어, 이종 시그널 서열의 예는 서열번호:2에 기재된 인간 카파 IgG 이종 시그널 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합부위를 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-코드화 핵산분자에 연결될 수 있다. 상기 부위는 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 촉진하거나 코드화하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변화시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효소는 PEG 잔기(moiety)에 연결될 수 있다.
또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위한 태그 또는 다른 잔기가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가 핵산 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열 또한 효소-코드화 핵산분자에 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호:235) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호:236)를 코드화하는 핵산서열을 포함한다.
그다음 확인되고 분리된 핵산이 적당한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 아니하나, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포와 적합(compatible)해야만 한다. 그러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)와 같은 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현벡터를 포함한다. 클로닝 벡터 내 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 절편을 연결함으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다. 만약 절편 DNA에 사용된 상보성 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결함으로써 원하는 임의의 부위가 제조될 수 있다; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 코드화하는, 특정한 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 단일중합체 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 예를 들어, 형질전환, 트렌스펙션, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입되어, 많은 카피의 유전자 서열을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 도입한 재조합 DNA 분자로 숙주세포 형질전환은 상기 유전자의 복수카피의 생성을 가능케 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 상기 유전자가 다량으로 획득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부를 함유하는 핵산이 적당한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코드화서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수 전사 및 번역 시그널이 또한 효소 유전자를 위한 고유한 프로모터, 및/또는 이들의 인접부위에 의해 제공될 수 있다.
또한 효소를 코드화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 상기 벡터는 그안에 사용하기 적합한 임의의 것이다.
상기 벡터를 함유하는, 내피세포를 포함하는 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 그러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 코팅된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 상기 세포를 이용하여 이들의 단백질을 생산한다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 효소가 배지 내로 분비될 수 있다.
고유의 또는 이종의 시그널 서열에 연결된 프로엔자임 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 복수카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 세포 내 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다. 상기 효소의 프로엔자임(즉, 자이모겐) 형태가 본원에서 활성화가능한 효소로서 사용을 위해 정제될 수 있다. 대안적으로, 분비시 프로세그먼트(prosegment)가 촉매적으로 또는 자가촉매적으로 절단되어 성숙한 효소가 생성될 수 있다. 필요하다면, 상기 효소는 프로세그먼트가 제제로부터 제거되도록 정제될 수 있다. 그러한 성숙한 형태가, 만약 불활성이라면, 단일사슬 또는 2개-사슬 형태로 활성화가능한 효소로서 본원에서 또한 사용될 수 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 코드화 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스 및 다른 바이러스)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 함유하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다르다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.
DNA 절편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적당한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 코드화 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 함유하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA와 합성기법, 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)을 포함할 수 있다. 단백질을 코드화하는 핵산서열, 또는 도메인, 유도체, 절편, 또는 이들의 동족체(homologs)의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절됨으로써, 이들의 유전자 및 절편이 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 얼리 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 긴 말단반복(long terminal repeat) 내에 함유된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)); 진핵 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 등,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 Scientific American 242:79-94(1980)내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 함유하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 등, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 등, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균의 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절부위: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift 등, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan 등, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절부위(Grosschedl 등, Cell 38:647-658(1984); Adams 등, Nature 318:533-538(1985); Alexander 등, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절부위(Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절부위(Pinckert 등, Genes 및 Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절부위(Krumlauf 등, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer 등, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절부위(Kelsey 등, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로불린 유전자 조절부위(Magram 등, Nature 315:338-340(1985); Kollias 등, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절부위(Readhead 등, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절부위(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질을 코드화하는 핵산, 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점(origins of replication) 및 임의적으로 하나 이상의 선별마커(selectable marker)(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS II), 6XHis 태그 코드화서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 그러한 플라스미드는 세개의 리딩프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, 6xHis-태그된 단백질의 N-말단 발현을 위해 제공하는 pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허 4,952,496 참조; Novagen, Madison, WI에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 그러한 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 시그널을 함유하는 pET 12a-c; 및 His 칼럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-TagTM 리더서열, 및 칼럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 부위 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
포유동물 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코드화하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 즉시-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(latd) 폴리아데닐레이션 시그널(SV40)을 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.
2. 발현
기질-분해효소는 생체내 및 시험관내 방법을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대 투여 및 치료에 필요한, 원하는 단백질은 상기 단백질의 요구되는 양 및 형태를 제조하기에 적당한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현숙주는 진핵 및 원핵 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충세포, 포유동물 세포, 사람 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한다. 발현숙주는 그들의 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역-후(post-translational) 변형의 유형에서 다르다. 발현숙주는 이러한 및 다른 요인들, 예컨대 규제 및 안전성 고려사항, 생산비용 및 정제 필요성과 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
많은 발현벡터들이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현벡터의 선택은 숙주발현시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 일반적으로, 발현벡터는 전사 프로모터와 임의적으로 인핸서, 번역 시그널, 및 전사와 번역의 종결 시그널을 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케하는 선별마커를 전형적으로 가진다. 어떤 경우에, 벡터의 카피수를 증폭시키는데 복제기점이 이용될 수 있다.
기질-분해효소 또한 단백질 융합으로서 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소융합은 효소에 추가 기능성을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소융합 단백질의 예는 시그널 서열, 예컨대 국소화용 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합, 그리고 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하는 서열의 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 기질-분해효소는 불활성 자이모겐 형태로 발현된다. 다른 프로테아제에 노출 또는 자가촉매작용에 의하여 자이모겐 전환이 달성됨으로써 성숙한 효소가 생성될 수 있다. 활성화제 부재시 불활성이기만 하면, 임의의 형태의 효소가 본원에서 고려된다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고, 그러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원환경이고, 어떤 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 유발할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 유레아는 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대체법은 산화환경 및 샤페로닌-유사의 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하고, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 상기 리더는 그다음 주변세포질 내 시그널 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자의 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자에서 유래된 리더를 포함한다. 어떤 경우에, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 어떤 경우에 단백질은 불용성이 되고, 변성제와 환원제가 재용해 및 리폴딩(refolding)이 용이하도록 사용될 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코시화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 스키조 사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 그러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아, 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 종종 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와 함께-발현은 발현수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 시그널 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 시그널, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란 스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. 프로테아제, 예컨대 Kex-2 프로테아제의 절단부위는 분비경로를 빠져나갈 때, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
곤충세포는, 특히 배큘로바이러스 발현을 이용하여, 폴리펩티드, 예컨대 기질-분해효소의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 사용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고 진핵발현의 조절우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현되는 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 아랫쪽에 융합된다. 포유동물 분비 시그널이 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 배양배지 내로 발현된 단백질을 분비하는데 사용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta )(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유동물 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.
곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터가 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재시 고수준의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신의 사용에 의해 전형적으로 유지된다.
d. 포유동물 세포
포유동물 세포 시스템은 기질-분해효소를 포함한 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 발현 구축물(constructs)은 바이러스 감염, 예컨대 아데노바이러스, 또는 직접적인 DNA 이동, 예컨대 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 및 물리적인 수단, 예컨대 전기천공과 미세주입(microinjection)에 의해 포유동물 세포로 이동할 수 있다. 포유동물 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(Kozak 공통서열) 및 폴리아데닐레이션 요소를 포함한다. IRES 요소는 또한 또다른 유전자, 예컨대 선별마커로 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 그러한 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스육종 바이러스(RSV)의 긴 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 부위 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 부위의 예는 유전자로부터 것들, 예컨대 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별하기 위하여, 메토트렉세이트 존재하에 발현이 수행될 수 있다. 세포표면 시그널링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 유도할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유동물 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특정배지에서 성장하도록 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재(free)인 현탁배지에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 사용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로, 예컨대 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로 PEG-매개 이동을 이용한 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 이동할 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 아라비돕시스(Arabidopsis)와 담배(tobacco)와 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 사이에서 나뉜다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴과 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물 내로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 기질-분해효소를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유동물 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 상기 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제기술
숙주세포로부터, 기질-분해효소 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 우유 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
일반적으로, 기질-분해효소는 본원에서 제공되는 시스템 및 방법에서 기술된 바와 같이, 차후 활성화를 위하여 불활성 형태(자이모겐 형태)로 발현되고 정제된다. 어떤 적용에서, 기질-분해효소는 본원에서 기술된 바와 같이, 활성화제 부재시 자신의 성숙한 형태로 불활성이다. 따라서, 발현후, 자가촉매작용에 의해 성숙한 형태가 생성되고, 프로세그먼트가 제거될 수 있다. 많은 효소에서, 자가촉매작용은 활성화제 존재를 필요로 한다. 필요하다면, 정제된 제제로부터 프로세그먼트를 제거하기 위하여 추가 정제단계가 수행될 수 있다. 어떤 환경에서, 예컨대 대조군으로서 사용을 위하여, 발현된 기질-분해효소는 프로세그먼트를 제거하기 위한 자가촉매작용에 의해, 또는 활성화제의 첨가에 의해, 활성형태로 정제될 수 있다. 그러한 예에서, 정제과정 동안, 또는 실온에서 24 내지 72시간 동안 배양함으로써 자가활성화가 발생할 수 있다. 활성화의 속도 및 정도는 단백질 농도 및 특정효소에 좌우되며, 따라서 예를 들어 더 희석된 시료는 실온에서 더 장기간의 시간동안 배양될 필요가 있다. 활성화는 SDS-PAGE(예컨대, 3킬로달톤 이동) 및 효소활성(형광생성 기질의 절단)에 의해 모니터링될 수 있다. 활성인 효소가 바람직한 경우, 전형적으로, 효소는 정제전 75% 초과의 활성화를 달성하도록 허용된다.
단백질, 예컨대 기질-분해효소는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 기질-분해효소에 결합하는 다른 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔전기영동 및 염색 및 분광광도기법을 포함한, 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다.
F. 활성화가능한 기질-분해효소의 제조, 제형화 및 투여
본원에서 제공되는 약학적 조성물은 불활성 형태로 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소를 함유한다. 또한 활성화제를 함유하는 조성물이 제공된다. 화합물은 적절한 약학적 제제, 예컨대 경구, 비경구 투여를 위한 용액, 현탁액, 겔, 정제(tablets), 분산정(dispersible tablets), 알약(pills), 캡슐, 분말, 지속방출 제형 또는 엘릭시르(elixirs) 뿐만 아니라, 피부패치 제제 및 건조분말 흡입기로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기법 및 절차를 이용하여 약학적 조성물로 제형화될 수 있다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조).
선택되는 기질-분해효소는, 활성화됐을 때, 치료되는 환자에게 원치않는 부작용은 없으면서 치료적으로 유용한 효과를 나타내는 충분한 양으로 포함된다. 활성화가능한 기질-분해효소를 함유하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 치료적으로 유효한 농도는 알려진 시험관내 및 생체내 시스템, 예컨대 본원에서 제공되는 분석법으로 화합물을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 조성물에서 선택되는 기질-분해효소의 농도는 복합체의 흡수, 불활성화 및 배설속도, 복합체의 물리화학적인 성질, 용량 스케줄, 및 투여되는 양뿐만 아니라 당업자에 알려진 다른 요인들에 좌우된다. 예를 들어, 정확한 용량 및 처리기간은 치료되는 조직의 함수이며, 알려진 시험프로토콜을 이용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 추정하여 경험적으로 결정될 수 있을 것으로 이해된다. 농도 및 용량 값은 또한 치료되는 개체의 연령에 따라 달라질 수 있음을 주의해야 한다. 임의의 특정 대상에 대하여, 특정 용량요법(dosage regimens)은 개인의 필요 및 투여하거나 제제의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 지나면서 조정되어야 하며, 본원에 기재된 농도범위는 단지 예시일 뿐이며 이들의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 질환 또는 상태, 예를 들어 셀룰라이트 또는 림프부종과 같은 ECM-매개 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여되는 선택된 기질-분해효소의 양은 표준임상기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 분석법 및 동물모델이 최적 용량범위의 확인을 돕는데 활용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는, 정확한 용량은 특정 효소, 투여경로, 치료되는 질환의 종류 및 질환의 위중도에 좌우될 수 있다. 용량범위의 예는 약 또는 10μg 내지 100mg, 특히 50μg 내지 75mg, 100μg 내지 50mg, 250μg 내지 25mg, 500μg 내지 10mg, 1mg 내지 5mg, 또는 2mg 내지 4mg 범위이다. 이들의 특정 용량 및 제형은 적응증 및 개체에 좌우된다. 필요하다면 용량은 경험적으로 결정될 수 있다. 전형적으로 상기 용량은, 예컨대 활성화제 첨가에 의한, 재구성후, 1 내지 100ml, 특히, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml, 또는 1 내지 10ml의 부피로 본원에 기술된 적응증에 투여된다. 전형적으로, 그러한 용량은 총부피 10 내지 50ml 내에 약 또는 100μg 내지 50mg, 일반적으로 1mg 내지 5mg이다.
선택된 활성화제는 전형적으로, 기질-분해효소에 노출되었을 때, 기질-분해효소를 활성화시키는 양으로 완충용액으로써 제공된다. 전형적으로, 완충액 내 활성화제의 양은 선택된 활성화가능한 기질-분해효소를 일시적으로 활성화시키기에 충분한 수준으로 간질 내 존재하는 활성화제의 생리학적인 양을 일시적으로 변화시키는 양이다. 예를 들어, 산성 pH가 활성화 조건인 경우, 산성 완충액 조성물 형태인 활성화제는 기질-분해효소와 함께 또는 별개로 ECM에 투여됐을 때, ECM의 pH를 생리학적 pH 미만, 즉 중성 미만으로 일시적으로 낮추는, 적어도 하나의 산을 함유한다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 상기 산성 완충액은 선택된 효소의 최적 pH 내에 유효한 pH 범위를 가지는 것이다. 산성 완충액의 중화는 간질의 중성 pH 환경으로 인해 투여시 발생할 것이며, 완충용량의 함수이다. 다른 완충용액이 또한 선택된 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제에 따라 본원에서 고려된다. 예를 들어, 완충액은 다양한 온도에서, 또는 다양한 양의 염, 환원제, 또는 금속이온으로 조제될 수 있다. 낮은 pH 활성화 조건을 함유하는 완충 활성화제 용액은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다.
기질분해효소는 즉시 투여되거나, 다수의 소용량으로 분배하여 시간 간격으로 투여될 수 있다. 선택된 기질-분해효소는 처리시간 경과에 따라, 예를 들어 몇 시간, 일, 주, 또는 달에 걸쳐, 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 어떤 경우에, 연속투여가 유용하다. 투여의 정확한 용량 및 코스는 고려된 활성화 방법 및 시스템에 의존하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 기질분해효소는 활성화제와 함께 또는 별개로 투여될 수 있다. 전형적으로, 함께 투여됐을 때, 활성화제는 사용직전, 예를 들어 동결건조된 분말의 재구성에 의하여, 기질-분해효소에 노출된다. 다른 제시에서, 활성화제는 AMDE 제형의 구성요소이거나 AMDE의 액체-기반 용량 형태와 혼합될 수 있다. 또한, 상기 AMDE는 상기 활성화제와 혼합전 적당한 희석제로 희석될 수 있다. 별개로 투여된다면, 기질-분해효소 조성물은 활성화제 제제와 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
또한, 정확한 용량 및 처리기간은 치료되는 질환의 함수이며, 알려진 시험프로토콜을 이용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 추정하여 경험적으로 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 농도 및 용량 값은 또한 완화될 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있음을 주의해야 한다. 임의의 특정 대상에 대하여, 특정 용량요법이 개인의 필요 및 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 지나면서 조정되어야 하며, 본원에 기재된 농도범위는 단지 예시일 뿐이며 이들을 함유하는 조성물 및 조합물의 범위 또는 용도를 제한하고자 함이 아닌 것으로 추가로 이해된다. 상기 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 또는 한번 투여될 수 있다. 일반적으로, 독성을 제한하도록 용량요법이 선택된다. 주치의는 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 또는 다른 조직의 기능이상 때문에 용량을 낮추도록 치료법을 종결, 중단 또는 조정하는 방법 및 때를 알 것임을 주의해야 한다. 역으로, 임상반응이 적절하지 않다면(독성 부작용을 막고), 주치의는 또한 처리를 더 고수준으로 조정하는 방법 및 때를 알 것이다.
약학적으로 허용가능한 조성물은 규제기관 또는 다른 기관에 대한 승인을 고려하여 제조되고, 동물 및 인간에서 사용을 위한 일반적으로 인정되는 약전에 준하여 제조된다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 정제, 알약, 캡슐, 분말 및 지속방출제형의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 가지는 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구제형은 표준담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 및 다른 그러한 제제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 투여방식에 적절해야만 한다.
약학적 조성물은 효소 또는 활성화제와 같이 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 그러한 약학적 담체는 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 물 및 오일과 같은 무균액체일 수 있다. 물은 상기 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체담체로써 활용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 같이 함유될 수 있다: 희석제, 예컨대 식염수, 락토오스, 수크로스, 덱스트로스, 링거 락테이트, 디칼슘 포르페이트 또는 카르복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 에컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검(gums), 예컨대 검 아카시아 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 알려진 다른 그러한 결합제. 적절한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 말토스, 만노스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크(chalk), 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트류, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 소디움 시트레이트, 말레에이트, 글리시네이트, 히스티딘, 석시네이트, 락테이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소디움 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 그러한 제제를 포함할 수 있다. 상기 제형 내 다른 부형제는 산화제 또는 환원제, 예컨대 시스테인, 산화된 글루타티온 또는 시스테인, 환원된 글루타티온; 계면활성제, 예컨대 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, 플루로닉(F68), 또는 보존제를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 본원의 목적을 위하여, 산성 완충액 제제는 사용할 때까지 일반적으로 상기 기질-분해효소와 분리된 조합물로 제공되는 활성화제로써 제공될 수 있다.
환원제는 기질-분해효소의 활성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 투여를 위한 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 형광생성 펩티드 기질(예컨대, 실시예 25 참조)을 이용하여 효소활성을 분석하는데 환원제가 요구된다. 또한, 환원제는 기질, 예컨대 콜라겐, HSA 및 rHuPH20로 명명되는 PH20 조성물(예컨대, 실시예 26 참조)에 대한 카텝신 L의 활성을 증가시킨다. 환원제의 예는 시스테인 또는 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 환원제는 장기보관을 위하여 액체제형으로 포함되지 않는데, 이는 자가분해를 증진시키고 상기 제형을 덜 안정하게 만들 수 있기 때문이다. 환원제는 액체제형(dosage form)으로 첨가되거나, 사용전, 일반적으로 사용직전 동결건조 형태의 효소를 재구성하도록 첨가되는 것이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 동결건조된 효소, 예컨대 카텝신 L은 환원제를 함유하는 희석제와 재구성될 수 있다. 대안적으로, 생성된 단백질이 일 내지 이년의 안정성을 보유하는 한, 효소는 상기 제형 내 존재하는 환원제를 함유하는 동결건조된 효소로써 제형화될 수 있다. 그러한 제형에서, 상기 동결건조된 효소는 환원제 없이 적절한 희석제 내에 재구성될 수 있다. 환원제의 양은 경험적으로 결정될 수 있으며, 특정 환원제의 함수이다. 단일용량 투여를 위한 양의 예는 약 1mM 내지 30mM, 예를 들어, 1mM, 2mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25 mM 또는 30 mM이다.
제형은 적절한 양의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 함유하는 단위제형, 예컨대 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립제, 무균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구 용액 또는 현탁액, 및 오일수 에멀젼으로 인간 및 동물에게 투여하기 위하여 제공된다. 약학적으로 치료적으로 활성인 화합물 및 이들의 유도체는 전형적으로 단위제형 또는 복수제형으로 제형화되고 투여된다. 각각의 단위용량은 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 연합하여, 원하는 치료효과를 내는데 충분한 미리결정된 양의 치료적으로 활성인 화합물을 함유한다. 단위용량 형태의 예는 앰플, 바이알 및 주사기 및 개별적으로 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위용량 형태는 분획 또는 이들의 복수로 투여될 수 있다. 복수용량 형태는 분리된 단위용량 형태로 투여되도록 단일용기에 포장된 복수의 동일한 단위용량 형태이다. 복수용량 형태의 예는 정제 또는 캡슐의 바이알, 병, 또는 파인트 또는 갤런의 병을 포함한다. 따라서, 복수용량 형태는 포장에 있어 분리되지 않는 다수의 단위용량이다. 일반적으로, 비독성 담체로부터 이루어진 균형을 가지는 0.005% 내지 100%의 범위로 활성성분을 함유하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
조성물은 근육내, 정맥내, 진피내, 병변내, 복강내 주사, 피하, 표피하, 경막외(epidural), 비강, 경구, 질, 직장, 국소(topical), 국부(local), 귀, 흡입, 구강(예컨대, 설하), 및 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함한 당업자에게 알려진 임의의 경로로 투여하기 위하여 제형화될 수 있다. 투여는 투여장소에 따라 국부, 국소 또는 전신일 수 있다. 치료가 필요한 지역에 국부투여는 예컨대, 수술중 국부주입, 국소적용, 예를 들어, 수술후 상처드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 다른 생물학적으로 활성인 제제와 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물로 투여될 수 있다. 투여는 또한 제어방출제형 및 방출조절장치를 포함한, 예컨대 펌프에 의한, 제어방출시스템을 포함할 수 있다.
임의의 주어진 경우 가장 적절한 경로는 다양한 요인, 예컨대 질환의 성질, 질환의 진행, 질환의 중증도, 사용되는 특정 조성물에 좌우된다. 본원의 목적을 위하여, 기질-분해효소 및 활성화제가 투여되어 피부 또는 조직의 간질에 도달하는 것이 바람직하다. 따라서, 표피하 방법과 같은 피부아래 직접투여가 고려된다. 이들은 예를 들어, 피하, 진피내 및 근육내 투여경로를 포함한다. 따라서, 하나의 예에서, 국부투여는 주사에 의해, 예컨대 주사기 또는 니들과 같은 주사장치를 함유하는 다른 제조품으로부터 달성될 수 있다. 다른 투여방식이 또한 고려된다. 약학적 조성물은 각각의 투여경로에 적당한 제형으로 제형화될 수 있다.
하나의 예에서, 약학적 제제는 액체형태, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 액체형태로 제공된다면, 활성화가능한 기질-분해효소의 약학적 제제는 농축된 제제로서 제공되어 활성화제 첨가시 치료적으로 유효한 농도로 희석될 수 있다. 상기 활성화제는 투여전 제제에 첨가되거나, 상기 활성화제는 상기 기질-분해효소 제제와 동시에, 간헐적으로 또는 순차적으로 첨가될 수 있다. 그러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 현탁화제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가 식용지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수용성 비히클(예컨대, 아몬드유, 유성 에스테르 또는 분별(fractionated) 식물성 기름); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 함께 통상적인 수단에 의해 조제될 수 있다.
또다른 예에서, 약학적 제제는 사용전 물 또는 다른 적절한 비히클과 재구성하기 위한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 기질-분해효소의 약학적 제제는 적당한 활성화제를 함유한 용액과 재구성될 수 있다. 상기 제제의 재구성은 적절한 활성화제내에 치료적 유효량의 기질-분해효소를 함유한 혼합물을 생성하고, 임의의 원하는 투여경로를 이용하여 함께 투여될 수 있다.
분해과정, 예컨대 단백질 가수분해, 및 항원 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 조정(immunological intervention)에 대한 선택된 기질-분해효소의 노출을 감소시키기 위한 투여방법이 채택될 수 있다. 그러한 방법의 예는 투여부위에서 국부투여를 포함한다. 치료제의 페길화는 단백질 가수분해에 대한 저항성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키며, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되어 있다. 페길화 방법론의 예는 당해 기술분야에 알려져 있다(예컨대, Lu 및 Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138,1994; Lu 및 Felix, Peptide Res., 6:142-6,1993; Felix 등, Int. J. Peptide Res., 46:253-64,1995; Benhar 등, J. Biol. Chem., 269:13398-404,1994; Brumeanu 등, J Immunol., 154:3088-95,1995 참조; 또한, Caliceti 등(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 및 Molineux(2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-8S 참조). 페길화는 또한 핵산분자의 생체내 전달에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다(예컨대, Cheng 등(2003) Pharm. Res. 20(9):1444-51 참조).
1. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
일반적으로 주사를 특징으로 하는, 피하, 근육내 또는 진피내(intradermally) 중 어느 하나의 비경구 투여가 본원에서 고려된다. 주사가능물질(injectables)은 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체내 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤 또는 에탄올이다. 추가로, 원한다면, 투여되는 약학적 조성물은 또한 용매, 예컨대 pH 완충제, 환원제 또는 산화제, 금속이온염 또는 다른 그러한 완충액의 형태로 활성화제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 또한 다른 소량의 비-독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해증진제, 및 다른 그러한 제제, 예컨대 소디움 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로 덱스트린을 함유할 수 있다. 일정수준의 복용량이 유지되는, 서방(slow-release) 또는 지속-방출(sustained-release) 시스템(예컨대, 미국특허번호 3,710,795 참조)의 이식이 또한 본원에서 고려된다. 상기 비경구 조성물에 함유된 활성 화합물의 백분률은 이들의 특정 성질뿐만 아니라 화합물의 활성 및 대상의 요구에 크게 좌우된다.
조성물의 비경구 투여는 일반적으로 진피내, 피하 및 근육내 투여와 같은 표피하 투여경로를 포함한다. 원한다면, 정맥내 투여가 또한 고려된다. 주사가능물질은 국소 및 전신투여를 위하여 설계된다. 본원의 목적을 위해, 국소투여는 영향받는(affected) 간질의 직접 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액; 주사정(hypodermic tablets)을 포함한, 사용직전 용매와 결합되도록 준비된 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조 분말; 주사용으로 준비된 멸균 현탁액; 사용직전에 비히클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품; 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산완충식염수(PBS), 및 가용화제와 증점제(thickening agents), 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한 용액을 포함한다.
비경구 제제에서 사용된 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충액, 항산화제, 국소마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제(sequestering agents) 또는 킬레이트제, 아미노산, 펩티드 및 다른 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로즈 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로스 및 락테이티드(Lactated) 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 채소 기원의 불휘발성유(fixed oils), 면실유(cottonseed oil), 옥수수기름, 참기름 및 낙화생유를 포함한다. 항미생물제는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도로 반복-용량 용기로 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있고, 페놀 또는 크레솔, 수은제(mercurials), 벤질알콜, 클로로부탄올, 파라벤, 예컨대 메틸- 및 프로필-p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로즈를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨(sodium bisulfate)을 포함한다. 국소마취제는 염산프로카인을 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리솔베이트 80(TWEEN 80), 폴리솔베이트 20(TWEEN 20), 플루로닉(F68)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한 수-혼화성(water miscible) 비히클로 에틸알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과, pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.
주사가 원하는 약리학적인 효과를 나타내는 유효량을 제공하도록 약학적으로 활성인 화합물의 농도가 조정된다. 정확한 용량은 당업자에게 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 나이, 체중 및 상태에 좌우된다. 단위-용량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 니들이 있는 주사기 내에 포장된다. 약리학적으로 활성인 화합물을 함유하는, 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는 치료할 질환과 포장을 위해 선택된 특정 제조품의 함수이다. 예를 들어, 셀룰라이트 치료를 위하여, 비경구 주사를 위한 주사부피는 약 또는 10 내지 50밀리리터임을 고려한다. 일반적으로, 상기 부피는 2개가 함께 투여되는 경우 활성화제 및 기질-분해효소의 부피를 나타낸다. 따라서, 하나의 예에서, 활성화제 10 내지 50밀리리터를 함유하는 제2구획과 분리된 동결건조된 효소제제를 함유하는 이중용기 또는 이중-챔버 주사기가 제공된다. 활성화제와 효소의 재구성후, 혼합물이 투여될 수 있다. 당업자에 알려지고 실행되는 바와 같이, 비경구 투여를 위한 모든 제제는 멸균되어야 한다. 주사제형은 약 또는 -80℃, -40℃, -20℃, 2 내지 8℃, 15℃, 실온 또는 제어된 실온과 같은 적당한 조건하에서 보관될 수 있다.
동결건조된 분말
용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로써 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조 분말이 본원의 관심이 된다. 이들은 또한 고체 또는 겔로서 재구성되고 제형화될 수 있다.
멸균되고 동결건조된 분말은 완충용액 내에 불활성 효소의 화합물을 용해시킴으로써 조제될 수 있다. 완충용액은 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말로부터 조제된, 분말 또는 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 그다음 용액의 멸균여과후, 당업자에게 알려진 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 요약하면, 동결건조된 분말은 적절한 완충액, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 당업자에게 알려진 기타 상기 완충액에 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 만노오스, 소르비톨, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 히드록시에틸 전분 또는 기타 적절한 제제를 용해시킴으로써 조제된다. 첨가될 수 있는 다른 부형제는 글리신, 알라닌, 프롤린과 같은 아미노산, 베타인과 같은 아민, 트리메틸아민 N-옥사이드, 그리고 암모늄, 소디움 또는 마그네슘의 염을 포함한다. 그다음, 선택된 효소가 생성된 혼합물에 첨가되고, 용해될까지 교반된다. 생성된 혼합물을 멸균여과하거나, 미립자를 제거하고 무균성을 보장하기 위해 처리하여, 동결건조를 위한 바이알 내로 배분한다. 각각의 바이알은 화합물의 단일용량(1mg 내지 1g, 일반적으로 1 내지 100mg, 예를 들어 1 내지 5mg) 또는 복수용량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온하에서 보관될 수 있다.
완충용액과 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여로 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위해 선택된 용액은 어떤 완충액이라도 가능하나, 일반적으로 활성화제를 함유한 완충액이다. 활성화제는 재구성되는 효소의 기능으로서 선택된다. 예를 들어, 카텝신 L의 동결건조된 제제는 약 pH 5.5에서 산성 완충액으로 재구성된다. 재구성을 위해 약 1μg 내지 20 mg, 바람직하게는 10μg 내지 1mg, 더욱 바람직하게는 약 100μg이 완충액 또는 다른 적절한 담체의 mL당 첨가된다. 정확한 양은 치료되는 적응증 및 선택된 화합물에 좌우된다. 상기 양은 실험적으로 결정될 수 있다.
2. 국소투여
국소 혼합물은 상기 국소 및 전신투여를 위해 기술된 바와 같이 조제된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르(elixirs), 로션, 현탁액, 틴크제, 페이스트, 폼(foams), 에어로졸, 관주액(irrigations), 스프레이, 좌약, 붕대, 피부패치 또는 국소투여에 적절한 다른 제형으로서 제형화된다.
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체는 흡입과 같은, 국소적용을 위한 에어로졸로써 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 4,044,126; 4,414,209; 및 4,364,923는 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달을 위한 에어로졸을 기술하고 있음). 기도(respiratory tract)로 투여를 위한 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 흡입(insufflation)을 위한 초미립자(microfine) 분말로서, 단독 또는 락토오스와 같은 불활성 담체와 병용일 수 있다. 그러한 경우에, 제형의 입자는 전형적으로 50마이크론 미만, 바람직하게는 10마이크론 미만의 직경일 것이다.
화합물은 국부(local) 또는 국소(topical) 적용을 위하여, 예컨대 피부 및 안내와 같은 점막으로의 국소적용을 위하여, 겔, 크림 및 로션의 형태로, 그리고 눈으로의 적용을 위하여, 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위하여 제형화될 수 있다. 경피전달용, 및 또한 눈 또는 점막 투여용, 또는 흡입요법용 국소투여가 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제와 병용한 비강용액이 또한 투여될 수 있다.
경피투여에 적절한 제형이 제공된다. 이들은 임의의 적절한 포맷, 예컨대 장기간의 시간 동안 수용자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 적응된 별개의 패치로써 제공될 수 있다. 상기 패치는 활성 화합물과 관련하여, 예를 들어 0.1 내지 0.2M 농도의 임의적 완충수성용액 내에 활성 화합물을 함유한다. 경피투여에 적절한 제형은 또한 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Pharmaceutical Research 3(6),318(1986) 참조), 일반적으로 활성 화합물의 임의적 완충수성용액의 형태를 취한다.
3. 다른 투여경로를 위한 조성물
치료되는 상태에 따라, 다른 투여경로, 예컨대 국소적용, 경피패치, 경구 및 직장투여가 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어 직장투여를 위한 약학적 제형(dosage forms)은 전신작용을 위한 직장좌제, 캡슐 및 정제이다. 직장좌제는 체온에서 녹거나 부드러워지면서 하나 이상의 약리학적 또는 치료적 활성성분을 방출하는, 직장내로 삽입을 위한 고체 바디(body)를 포함한다. 직장좌제에 활용된 약학적으로 허용가능한 물질은 기제(bases) 또는 비히클 및 녹는점을 높이는 제제이다. 기제의 예는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, 카르보왁스(폴리옥시에틸렌 글리콜) 그리고 지방산의 모노-, 다이- 및 트리글리세리드의 적당한 혼합물을 포함한다. 다양한 기제의 조합물이 사용될 수 있다. 좌제의 녹는점을 높이는 제제는 경랍(spermaceti) 및 왁스를 포함한다. 직장좌제는 압축방법 또는 몰딩 중 하나에 의해 조제될 수 있다. 직장좌제의 일반적인 중량은 약 2 내지 3mg이다. 직장투여를 위한 정제 및 캡슐은 동일한 약학적으로 허용가능한 물질을 이용하여, 경구투여를 위한 제형에서와 동일한 방법에 의해 제조된다.
직장투여에 적절한 제형은 단위용량 좌제로써 제공될 수 있다. 이들 제형은 활성 화합물을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 성형함으로써 조제될 수 있다.
경구투여를 위하여, 약학적 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 결합제(예를 들어, 전젤라틴화된 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 필러(예를 들어, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(lubricants)(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자전분 또는 전분글리콘산나트륨); 또는 습윤제(예를 들어, 소디움 라우릴 설페이트)를 가지는 통상적인 수단으로 조제된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업자에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다.
구강(설하)투여에 적절한 제형은, 예를 들어 맛이 나는 기제, 보통 수크로스와 아카시아 또는 트래거캔스(tragacanth)내에 활성 화합물을 함유한 로젠지(lozenges); 및 불활성 기제, 예컨대 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아 내에 화합물을 함유하는 캔디(pastilles)를 포함한다.
약학적 조성물은 또한 제어방출제형 및/또는 전달장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어 미국특허번호 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 및 5,733,566).
리포솜 내 캡슐화(encapsulation), 미립자, 미소캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스, 및 레트로바이러스 전달시스템과 같은 선택된 기질-분해효소를 코드화하는 핵산분자의 전달과 같은, 그러나 여기에 제한되지 않는, 다양한 전달시스템이 알려져 있으며, 선택된 기질-분해효소를 투여하는데 이용될 수 있다.
따라서, 어떤 구현예에서, 리포솜 및/또는 나노입자가 또한 기질-분해 효소의 투여와 함께 이용될 수 있다. 리포솜은 수성 배지 내 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)(다층소포(MLVs)로도 불림)를 형성한다. MLVs는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 가진다. 전형적으로, 리포솜은 또한 나노입자를 안정화시키기 위하여 콜레스테롤을 함유하여 조제된다. MLVs의 초음파처리는 중심부(core)에 수성용액을 함유하는 200 내지 500옹스트롬 범위 직경의 작은 단층소포(SUVs) 형성을 유발한다.
인지질은, 물에 분산됐을 때, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포솜 외에 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서, 리포솜이 형성된다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온강도 및 이가(divalent) 양이온의 존재에 좌우된다. 리포솜은 이온 및 극성 물질에 낮은 투과성을 보일 수 있으나, 상승된 온도에서 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 알려진 가깝게 뭉쳐진 정돈된(ordered) 구조로부터 유체(fluid) 상태로 알려진 느슨하게 뭉쳐진 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특유의 상-전이 온도에서 일어나고, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성 증가를 유발한다.
리포솜은 상이한 기전들: 세망내피계(reticuloendothelial system)의 포식세포(phagocytic cells), 예를 들어 대식세포 및 호중구에 의한 엔도시토시스; 비특이적이고 약한 소수성 또는 정전기적 힘, 또는 세포-표면 성분과의 특이적인 상호작용 중 어느 하나에 의한 세포표면에 흡착; 세포질 내 리포솜 내용물의 동시 방출을 수반하는, 원형질막 내로 리포솜의 지질이중층 삽입에 의한 원형질막과의 융합; 및 리포솜 내용물의 연계없이, 리포솜 지질의 세포 또는 세포하(subcellular) 막으로 이동, 또는 그 반대에 의하여 세포와 상호작용한다. 리포솜 제형을 달리함으로써 작동하는 기전을 바꿀 수 있으나, 하나 초과가 동시에 작동할 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방법으로 화합물을 포집할 수 있다. 세포내 중합체의 과부하(overloading)로 인한 부작용을 피하기 위하여, 상기 초미립자(약 0.1μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 본원의 용도로 상기 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려되며, 상기 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
4. 병용요법
본원에 기술된 임의의 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제 조합물은 다른 치료적 또는 약리학적 제제 또는 절차와 동시에, 이전에, 간헐적으로, 또는 이후에, 추가로 공동-제형화되거나(co-formulated) 또는 공동-투여될(co-administered) 수 있다. 상기 제제는 다른 생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제, 혈관수축제 및 수술, 그리고 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 다른 제제 및 치료가 이용될 수 있고, 상기 예시된 모든 것들을 포함하는, 임의의 질환 또는 상태를 위하여, 상기 질환 및 상태를 위해 선택된 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제 조합물이 이들과의 조합으로 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 국소마취제, 예를 들어 리도카인이 통증경감을 제공하기 위해 투여될 수 있다. 어떤 예에서, 마취제는 혈관수축제와 병용으로 제공되어 마취효과의 지속시간을 늘릴 수 있다. 본원에서 제공되는 약리학적 제제 중 어느 것은 예를 들어 피하투여 후, 약리학적 제제의 조직내 접근을 용이하게 하는 분산제와 병용될 수 있다. 상기 물질은 당업자에 알려져 있으며, 예를 들어 히알루로난 분해효소, 예를 들어 히알루로니다아제 당단백질 패밀리의 멤버와 같은 가용성 글리코사미노글리카나아제 효소를 포함한다(예를 들어, 미국공개번호 20050260186 및 20060104968 참조).
본원에서 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소의 조성물은 국소마취제와 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, pH가 활성화 조건으로써 제공되는 경우, 국소마취제 투여가 산성 pH에 노출과 관련된 통증을 최소화하기 위해 바람직하다. 마취제는 속효성 및 지속성 국소마취 약물제형을 포함한다. 속효성 국소마취제 약물제형은 식염수 또는 기타 적절한 주사 비히클에 용해된 리도카인 또는 관련된 국소마취제 약물을 포함한다. 일반적으로, 속효성 국소마취제를 가진 국소마취제는 약 20-30분 지속된다. 마취제의 예로는, 암부카인; 아목세카인; 아밀로카인; 아프토카인; 알티카인; 베녹시네이트; 벤질알콜; 벤조카인; 베톡시카인; 비페나민; 부크리카인; 부메카인; 부피바카인; 부타카인; 부탐벤; 부타닐리카인; 카르비조카인; 클로로프로카인; 클리부카인; 클로다카인; 코카인; 덱시바카인; 디아모카인; 디부카인; 디클로닌; 엘루카인; 에티도카인; 유프로신; 펙시카인; 포모카인; 헵타카인; 헥실카인; 히드록시프로카인; 히드록시테트라카인; 이소부탐벤; 케토카인; 루시노카인; 리도카인; 메피바카인; 메프릴카인; 옥토카인; 오르토카인; 옥세타카인; 옥시부프로카인; 페나카인; 피놀카인; 피페로카인; 피리도카인; 폴리도카인; 프라모카인; 프릴로카인; 프로카인; 프로파노카인; 프로피노카인; 프로폭시카인; 프록시메타카인; 피로카인; 쿼터카인; 퀴니소카인; 리소카인; 로도카인; 로피바키인; 살리실 알콜; 수이카인; 테트라카인; 트라펜카인; 및 트리메카인과 같은 비-흡입 국소마취제 뿐만 아니라 알팍살론; 아몰라논; 에톡사드롤; 펜타닐; 케타민; 레복사드롤; 메티투랄; 메토헥시탈; 미다졸람; 미나솔론; 프로파니디드; 프로폭사트; 프라목신; 프로포폴; 레미펜타닐; 수페타닐; 틸레타민; 및 졸라민과 같은 다양한 다른 비-흡입 마취제를 포함한다. 상기 제형에서 유효량은 특정 환자, 치료되는 질환, 투여경로 및 기타 고려사항에 따라 달라질 것이다. 상기 용량은 경험적으로 결정될 수 있다.
국소마취제의 짧은 반감기 때문에, 상기 마취제를 혈관수축제와 공동-투여하거나 공동-제형화하는 것이 종종 바람직하다. 혈관수축제의 예는 카테콜아민 및 카테콜아민 유도체를 포함한 알파 아드레날린성 수용체 작용제를 포함한다. 특정 예는 레보노르데프린, 에피네프린 및 노르에피네프린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 국소마취제 제형, 예컨대 리도카인은 저농도의 에피네프린 또는 또다른 아드레날린성 수용체 작용제, 예컨대 레보노르데프린을 함유하도록 제형화될 수 있다. 국소마취제를 아드레날린성 수용체 작용제와 병용하는 것은 약학적 제제에서 일반적이다(미국특허번호 7,261,889 및 5,976,556). 혈관수축제는 국소마취제의 반감기를 증가시키기 위해 필수적이다. 혈관수축제, 예컨대 에피네프린은 주입된 조직에서 혈관의 알파 아드레날린성 수용체를 자극한다. 이는 조직에서 혈관수축 효과를 가진다. 혈관수축으로 국소마취제가 조직에 훨씬 더 오래 유지되고, 그 결과 마취제 작용 지속시간이 크게 증가된다.
일반적으로, 혈관수축제는 마취제와 병용으로 본원에서 사용된다. 마취제가 투여되어 마취의 연장을 초래하는 부근에서 혈관수축제가 혈관을 수축하도록 작용하는 한, 마취제 및 혈관수축제는 단일 약학적 조성물의 일부로써 또는 별개의 약학적 조성물의 일부로써 함께 투여될 수 있다. 하나의 예에서, 마취제 및 혈관수축제는 용액으로 함께 투여된다. 또한, 마취제 및 혈관수축제는 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제와 함께 또는 별개로 제형화될 수 있다. 단일제형이 바람직하다. 마취제 및 혈관수축제는 주사, 침윤 또는 국소투여로, 예를 들어 겔 또는 페이스트의 일부로써 투여될 수 있다. 전형적으로, 마취제 및 혈관수축제는 마취된 부위 내로 직접 주사, 예를 들어 피하투여로 투여된다. 상기 제형에서 유효량은 특정 환자, 치료되는 질환, 투여경로 및 기타 고려사항에 따라 달라질 것이다. 그러한 복용량은 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 리도카인 양의 예는 약 또는 10mg 내지 1000mg, 100mg 내지 500mg, 200mg 내지 400mg, 20mg 내지 60mg, 또는 30mg 내지 50mg이다. 투여되는 리도카인의 복용량은 개체 및 투여경로에 따라 달라질 것이다. 에피네프린은, 예를 들어 10μg 내지 5mg, 50μg 내지 1mg, 50μg 내지 500μg, 50μg 내지 250μg, 100μg 내지 500μg, 200μg 내지 400μg, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg와 같은 양으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 에피네프린은 1:100,000 내지 1:200,000 희석으로 리도카인과 병용될 수 있으며, 이는 마취제 100ml이 에피네프린 0.5 내지 1mg을 함유함을 의미한다. 투여되는 부피는 치료되는 질환 및 투여경로에 따라 조정될 수 있다. 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml, 전형적으로 10 내지 50ml의 마취제/혈관수축제가 ECM-매개 질환 또는 상태, 예컨대 셀룰라이트 치료를 위해 피하투여될 수 있음이 본원에서 고려된다. 상기 투여는 활성화가능한 기질-분해효소 및 활성화제의 투여 이후에, 동시에 또는 간헐적일 수 있다.
본원에서 제공되는 활성화가능한 기질-분해효소의 조성물은 또한 분산제와 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 분산제는 또한 다른 약리학적 제제, 예컨대 마취제, 혈관수축제 또는 기타 생물제제와 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 분산제의 예는 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다아제와 같은, 글리코사미노글리칸 분해를 통하여 간질공간에 채널을 여는 글리코사미노글리카나제이다. 상기 채널은 용량 및 제형에 따라 24 내지 48시간의 기간 동안 비교적 열린채로 남아있을 수 있다. 상기 채널은 외인적으로 첨가된 분자, 예컨대 유체, 저분자, 단백질(예컨대, 기질분해효소), 핵산 및 유전자 치료벡터 및 약 500nm 미만 크기의 다른 분자들의 확산이 용이하도록 하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 채널의 형성은 간질 공간 안에서 큰 유체 흐름을 용이하게 하고, 때때로 "대류수송(convective transport)" 또는 간단히 대류로서 언급되는 과정으로 유체에 의해 효율적으로 운반되는, 용질(예컨대, 검출될 수 있는 분자 또는 기타 진단용 제제, 마취제 또는 기타 조직-변형제(tissue-modifying agent), 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제, 또는 화장품 또는 미용제제)의 분산 또는 이동을 결과적으로 촉진할 것으로 생각된다. 그러한 대류수송은 분자확산의 속도 및 축적효과를 실질적으로 초과하고, 따라서 치료제 또는 기타 투여된 분자가 더 빠르고 효율적으로 조직을 관류할 수 있게 된다. 더구나, 제제, 예컨대 기질분해효소, 마취제 또는 기타 제제가 글리코사미노글리카나제와 공동-제형화되거나 공동-투여되고, 비교적 좁은(confined) 국소부위, 예컨대 비-정맥내 비경구 투여부위(예를 들어, 진피내, 피하, 근육내, 또는 조직, 기관 또는 기타 체내의 비교적 좁은 공간내 또는 주변) 내로 둘다 주입되는 경우, 그다음 투여된 용량과 관련된 유체는 국소 추진력(driving force)(즉, 정수압(hydrostatic pressure))뿐만 아니라 흐름에 더 낮은 교류저항(impedance)(간질기질 내 채널을 여는 것에 의해) 둘다를 제공할 수 있고, 이들 둘다 유체 흐름을 증가시킬 수 있고, 그것과 함께 치료제 또는 기타 분자의 대류수송은 유체 내에 함유되었다. 그 결과, 글리코사미노글리카나제의 사용은 공동-제형화되거나 공동-투여된 제제, 예컨대 기질분해효소의 기타 약동학적 및/또는 약력학적 특징들을 조종할 뿐만 아니라 생체이용률 개선에도 실질적인 유용성을 가질 수 있다.
a. 히알루로난 분해효소
글리코사미노글리카나제의 예는 히알루로난-분해효소이다. 히알루로난 분해효소는 히알루로난을 분해하는 임의의 효소를 포함한다. 히알루로난 분해효소의 예는 히알루로니다아제 및 특정 콘드로이티나아제(chondroitinases) 및 히알루로난 절단능을 가지는 리아제(lyases)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로난 분해효소의 예는 가용성 히알루로난 분해효소이다. 예를 들어, 글리코사미노글리카나제의 예는 히알루로니다아제이다. 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소의 패밀리이다. 간질장벽의 주요 구성성분인 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제는 히알루론산의 점도를 낮추고, 이에 의해 조직 투과성을 증가시킨다.
히알루론산 또는 히알루로네이트로도 불리우는 히알루로난은 결합, 상피 및 신경 조직 전반에 널리 분포하는 비-황산화(non-sulfated) 글리코사미노글리칸이다. 히알루로난은 세포외 기질의 필수요소이자 간질장벽의 주요 구성성분이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해효소는 히알루로난의 점도를 낮추고, 이에 의해 조직 투과성을 증가시키고, 비경구적으로 투여된 유체의 흡수속도를 증가시킨다. 따라서, 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다아제는, 예를 들어 다른 제제, 약물 및 단백질과 함께 전착제 또는 분산제로서 사용되고, 이들의 분산 및 전달을 개선한다.
히알루로난 분해효소는 히알루로난 폴리머를 절단함으로써 히알루로난을 분해하고, 상기 폴리머는 교대하는 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통하여 함께 연결된, 반복되는 이당유 단위, D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)으로 구성되어 있다. 히알루로난 사슬은 길이가 약 25,000 이당류 반복(repeats) 이상에 달하고, 히알루로난의 폴리머는 생체내 크기가 약 5,000 내지 20,000,000Da 범위에 이른다. 따라서, 제공되는 용도 및 방법을 위한 히알루로난 분해효소는 히알루로난 이당류 사슬 또는 폴리머의 절단 촉매능을 가지는 임의의 효소를 포함한다. 어떤 예에서 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→3 글리코시드 결합을 절단한다.
i. 히알루로니다아제
히알루로니다아제는 세가지의 클래스: 주요 최종산물로써 테트라사카리드 및 헥사사카리드를 가지는 엔도-베타-N-아세틸헥소사미니다제인 포유동물형 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35); 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 설페이트(CS) 및 데르마탄 설페이트(DS)를 분해하고, 주로 이당류 최종산물을 생산하는 베타 제거반응에 의해 작용하는 엔도-베타-N-아세틸헥소사미니다제인 박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.99.1); 및 β-1-3 결합의 가수분해를 통하여 테트라사카리드 및 헥사사카리드 최종산물을 생산하는 엔도-베타-글루쿠로니다제이인 거머리, 기타 기생충 및 갑각류의 히알루로니다아제(EC 3.2.1.36)가 있다.
1) 포유동물-형 히알루로니다아제
포유동물형 히알루로니다아제는 가수분해 및 트랜스글리코시다제 활성을 모두 가지며, 히알루로난 및 콘드로이틴 설페이트(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 상기 유형의 히알루로니다아제는 암소(소의) 히알루로니다아제(서열번호:237, 266 및 272 및 BH55 (미국특허번호 5,747,027 및 5,827,721), 양(면양)(서열번호:252, 267, 271 및 272), 말벌(yellow jacket wasp)(서열번호:238 및 239), 꿀벌(서열번호:240), 흰얼굴 말벌(white-face hornet)(서열번호:241), 페이퍼 말벌(paper wasp)(서열번호:242), 마우스(서열번호:243 내지 245, 257), 돼지(서열번호:246, 247), 랫트(서열번호:248 내지 250, 256), 토끼(서열번호:251), 오랑우탄(서열번호:253), 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이(서열번호:254), 기니픽(서열번호:255) 및 인간 히알루로니다아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다아제의 예는 가용성 히알루로니다아제이다.
인간 게놈에는 여섯가지의 히알루로니다아제-유사 유전자, HYAL1(서열번호:262), HYAL2(서열번호:263), HYAL3(서열번호:264), HYAL4(서열번호:265) 및 PH20/SPAM1(서열번호:232)가 있다. 히알루로니다아제 중에, PH20은 원형 중성 활성효소인 반면, 다른 것들은 히알루로난 또는 임의의 알려진 기질에 대하여 촉매활성이 없거나, pH 조건하에서만 활성이다. 히알루로니다아제-유사 효소는 또한 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커(anchor)를 통해 형질막에 고정된 것들, 예컨대 인간 HYAL2 및 인간 PH20(Danilkovitch-Miagkova, 등(2003) Proc Natl Acad Sci USA.100(8):4580-5) 및 일반적으로 가용성인 것들, 예컨대 인간 HYAL1 (Frost 등,(1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5)로 특징지어질 수 있다. 어떤 히알루로니다아제의 N-결합 글리코실화(N-linked glycosylation)는 이들의 촉매활성 및 안정성을 위해 매우 중요할 수 있다. 당단백질을 변경하는 글리칸 유형의 변화는 단백질의 항원성, 구조적 폴딩(folding), 용해도 및 안정성에 현저한 영향을 미칠 수 있으나, 많은 효소가 최적 효소활성을 위해 글리코실화를 필요로 할 것으로 생각되지는 않는다. 따라서, 히알루로니다아제는, N-결합 글리코실화의 제거로 히알루로니다아제 활성이 거의 완전히 불활성화될 수 있다는 점에서 독특하다. 그러한 히알루로니다아제에서, N-결합 글리칸의 존재는 활성인 효소의 생산에 매우 중요하다.
따라서, 포유동물 히알루로니다아제는 중성 활성이고 고환 추출물에서 대부분 발견되는 것들 및 기관, 예컨대 간에서 대부분 발견되는 산성 활성인 것들로 더 세분화될 수 있다. 중성 활성 히알루로니다아제의 예는 PH20을 포함하고, 다른 종 유래 PH20, 예컨대 양(서열번호:267), 소(서열번호:266) 및 인간(서열번호:232)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
인간 PH20(또한 정자 표면 단백질 PH20으로 알려짐)은 정자-난자 유착(adhesion)에 자연적으로 관여하고, 히알루론산을 분해함으로써 난구세포(cumulus cells)층의 정자에 의한 침투를 돕는다. PH20 mRNA 전사물(서열번호:224에 기재된 서열의 뉴클레오티드 1058-2503에 해당)은 정상적으로 N-말단(아미노산 잔기 위치 1-35)에서 35개의 아미노산 시그널 서열 및 C-말단(아마노산 잔기 491 내지 509에 해당)에서 19개의 아미노산 GPI 앵커를 포함하는 509개의 아미노산 전구체 단백질을 생산하도록 번역된다. 전구체 서열은 서열번호:232에 기재되어 있다. 서열번호:224에 기재된 아미노산 서열의 뉴클레오티드 위치 2188에서 C에서 T로의 돌연변이를 포함하는 mRNA 전사물이 또한 존재하고, 서열번호:232에 기재된 번역된 산물을 생성하는 침묵 돌연변이(silent mutation)이다. 따라서, 성숙한 PH20은 서열번호:233에 기재된 474개의 아미노산 폴리펩티드이다. 서열번호: 232에 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에서 히알루로니다아제 활성에 필요한 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위가 있다. 이황화결합이 시스테인 잔기 C60과 C351 사이 및 C224와 C238(서열번호:232에 기재된 아미노산에 해당) 사이에 형성되어, 핵심 히알루로니다아제 도메인을 형성한다. 그러나, 추가 시스테인이 중성 효소촉매활성을 위한 카르복시 말단에 요구되고, 따라서 서열번호:232의 아미노산 36 내지 464는 최소 활성인 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 포함한다.
소의 PH20은 553개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호:266)이다. 인간 PH20과 소의 PH20의 정렬은 소의 폴리펩티드내 GPI 앵커 부재로 인하여 아미노산 470으로부터 각각의 카르복시 말단까지 내내 존재하는 다수의 틈(multiple gaps)을 가지는, 약한 상동성(homology)만을 보여준다(예컨대, Frost GI(2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440 참조). 인간 외에 다른 PH20 종에서는 분명한 GPI 앵커가 예측되지 않는다. 예를 들어, 양과 소로부터 생성된 PH20 폴리펩티드는 가용성 형태로써 존재한다. 소의 PH20이 원형질막에 매우 느슨하게 부착된 채로 존재하지만, 포스포리파아제 민감성 앵커를 거쳐 고정되지는 않는다(Lalancette 등(2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). 소의 히알루로니다아제의 상기 독특한 특징은 임상용도(Wydase™, Hyalase™)를 위한 추출물로써 가용성 소 고환 히알루로니다아제 효소의 사용을 가능케 한다.
2) 박테리아 히알루로니다아제
박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 설페이트 및 데르마탄 설페이트를 분해한다. 박테리아에서 분리된 히알루로난 리아제는 작용방식에 의해 히알루로니다아제(다른 출처의, 예컨대, 히알루로노글루코사미니다제, EC 3.2.1.35)와 다르다. 이들은 히알루로난 내의 N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기 사이의 β1→4-글리코시드결합의, 가수분해보다는, 제거반응을 촉매하여, 3-(4-디옥시-β-D-gluc-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민 테트라- 및 헥사사카리드, 및 이당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다제이다. 반응으로 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기를 가지는 올리고당이 형성된다.
제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 박테리아 유래 히알루로니다아제의 예는 아르쓰로박터(Arthrobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 클로스트리듐( Clostridium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이드( Bacteroides) 및 스트렙토마이세 스(Streptomyces)의 균주를 포함한, 미생물 내 히알루로난 분해효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 효소의 특정 예는 아르쓰로박터속(균주 FB24)(서열번호:275), 브델로비브리오 박테리오보러스(서열번호:276), 프로피오니박테륨 아크네(서열번호:277), 스트렙토코커스 아갈락티에(서열번호:278); 18RS21(서열번호:279); 혈청형 Ia(서열번호:280); 혈청형 III(서열번호:281), 스트렙토코커스 아우레우스(균주 COL(서열번호:282); 균주 MRSA252(서열번호:283 및 284); 균주 MSSA476(서열번호:285); 균주 NCTC 8325(서열번호:286); 균주 보바인 RF122(서열번호:287 및 288); 균주 USA300(서열번호:289), 스트렙토코커스 뉴모니아에(서열번호:290); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호:291); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC 7466(서열번호:292), 스트렙토코커스 피오게네스(혈청형 M1)(서열번호:293); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호:294); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호:295); 혈청형 M6(서열번호:296); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호:297 및 298); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호:299); 혈청형 M28(서열번호:300); 스트렙토코커스 수이스(서열번호:301-303); 비브리오 피셔리(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호:304)), 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 설페이트를 절단하지 않는, 스트렙토마이세스 히알루로노리티쿠스 히알루로니다아제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
3) 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제
거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제(EC 3.2.1.36)는 테트라- 및 헥사사카리드 최종산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다제이다. 상기 효소는 히알루로네이트 내 β-D-글루쿠로네이트와 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이에 β1→3-결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리 유래 히알루로니다아제의 예는 거머리과(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis)), 돌거머리과(Erpobdellidae)(예를 들어, 네펠롭시스 옵스쿠라(Nephelopsis obscura) 및 에르 포브델라 펀타타(Erpobdella punctata), 넙적거머리과(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데쎄로브델라 픽타(Desserobdella picta), 헤로브델라 스타그날리스(Helobdella stagnalis), 그로씨포니아 콤플란타(Glossiphonia complanata), 플 라코브델라 오르나 타(Placobdella ornata) 및 테로마이존속(Theromyzon sp .) 및 말거머리과(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. (Hovingh 등(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). 거머리 히알루로니다아제와 동일한 작용기전을 가지는 박테리아 유래 히알루로니다아제의 예는 시아노박테리아(cyanobacteria), 시네코코커스속(Synechococcus sp .)의 히알루로니다아제(균주RCC307, 서열번호:305)이다.
ii . 기타 히알루로난 분해효소
히알루로니다아제 패밀리뿐만 아니라, 다른 히알루로난 분해효소가 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 활성화가능한 기질분해효소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 콘드로이티나제 및 리아제를 포함한, 히알루로난 절단능을 가지는 효소가 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해할 수 있는 콘드로이티나제의 예는 콘드로이틴 ABC 리아제 (또한 콘드로이티나제 ABC로서 알려짐), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 설페이트 리아제 또는 콘드로이틴 설페이트 엘리미나제로서 알려짐) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 상기 효소의 생산 및 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국특허번호 6,054,569; Yamagata, 등(1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang 등(1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857).
콘드로이틴 ABC 리아제는 두개의 효소, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)(Hamai 등(1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30)를 포함하고, 이들은 콘드로이틴-설페이트 및 데르마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해한다. 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴-설페이트 프로테오글리칸 및 데르마탄 설페이트는 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제의 바람직한 기질이나, 상기 효소는 더 낮은 속도로 히알루로난에 작용할 수도 있다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-설페이트- 및 데르마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해하여, 궁극적으로 Δ4-불포화 테트라- 및 이당류로 분해되는 다른 크기의 Δ4-불포화 올리고당의 혼합물을 생성한다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질특이성을 가지나, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 폴리머 콘드로이틴-설페이트 및 이들의 올리고당 절편 둘다의 비-환원 말단으로부터 이당류 잔기를 제거한다(Hamai, A. 등(1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제의 예는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 황산-콘드로이틴-ABC 엔도리아제는 서열번호:306에 기재되어 있음(Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 콘드로이틴 설페이트 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이나, 데르마탄 설페이트(콘드로이틴 설페이트 B)에 대해 불활성이다. 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소의 예는 서열번호:307 및 308에 각각 기재된, 플라보박테리움 헤파리눔 및 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 이리시스(Arthrobacter aurescens) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
콘드로이티나제 C 는 콘드로이틴 설페이트 C를 절단하여, 테트라사카리드와 불포화 6-황산화 이당류(delta Di-6S)를 생성한다. 이는 또한 불포화 비-황산화 이당류(delta Di-OS)를 생성하는 히알루론산을 절단한다. 박테리아의 콘드로이티나제 C 효소의 예는 스트렙토코커스 및 플라보박테리움의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
iii . 가용성 히알루로난 분해효소
가용성 히알루로니다아제를 포함한, 가용성 히알루로난 분해효소는 기질분해효소, 활성화제, 마취제, 혈관수축제, 기타 약리학적 또는 치료적 제제, 또는 이들의 조합물과 공동-투여 또는 공동-제형화를 위한 본원에서 제공되는 상기 방법, 조합물 또는 조성물에서 사용되어, 조직 내로 확산을 가능케 할 수 있다. 가용성 히알루로난 분해효소는 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해효소를 포함하고, 히알루로니다아제, 예를 들어 소의 PH20과 양의 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 다른 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가용성 히알루로난 분해효소 중에서, 가용성으로 변형된 임의의 히알루로난 분해효소 또한 포함된다. 예를 들어, GPI 앵커를 포함하는 히알루로난 분해효소는 GPI 앵커의 모두 또는 일부를 절단(truncation)하거나 제거하여 가용성으로 만들어질 수 있다. 하나의 예에서, 보통 GPI 앵커를 통해 정상적으로 막에 고정된, 인간 히알루로니다아제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 모두 또는 일부의 절단(truncation) 및 제거에 의해 가용성으로 될 수 있다.
가용성 히알루로난 분해효소는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제를 포함한다. 투여후 효소활성의 원하는 수준 및/또는 투여부위와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 요인들에 따라, 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제가 선택될 수 있다. 특정 예에서, 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해효소는 가용성 중성 활성 히알루로니다아제이다.
히알루로니다아제가 가용성이고 히알루로니다아제 활성을 보유하기만 하면, 가용성 히알루로니다아제의 예는 임의의 종 유래 PH20, 예컨대 서열번호:232, 233, 266, 251, 267, 255, 257, 271 내지 274 중 어느 것에 기재된 임의의 것, 또는 C-말단 GPI 앵커의 모두 또는 일부가 손실된 이들의 절단된 형태이다. 가용성 히알루로니다아제 중에서 서열번호:232, 233, 266, 251, 267, 255, 257, 271 내지 274 중의 어느 것의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 또한 포함된다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호:232, 233, 266, 251, 267, 255, 257, 271 내지 274 중 임의의 것 또는 이들의 절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
전형적으로, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위하여, 가용성 인간 PH20이 사용된다. 다른 동물 유래 PH20이 이용될 수 있으나, 그러한 제제는 동물 단백질이므로, 잠재적으로 면역원성이 있다. 예를 들어, 현저한 비율의 환자가 사전에 섭취된 음식물에 대해 이차적인 민감화(sensitization)를 보여주고, 이들은 동물 단백질이기 때문에, 모든 환자는 차후에 민감화의 위험을 가진다. 따라서, 비-인간 제제는 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제를 원한다면, 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 가지도록 조제될 수 있음이 본원에서 고려된다. 그러한 변형은 당업자의 수준내에 있으며, 예를 들어 분자에서 하나 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
본원의 방법에서 사용된, 히알루로니다아제(예컨대, PH20)를 포함한, 히알루로난 분해효소는 재조합적으로 생산되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 출처로부터 정제되거나 부분적으로-정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해효소를 포함한, 재조합 단백질의 생산방법은 본원의 다른 곳에서 제공되며, 당업자에게 잘 알려져 있다.
1) 가용성 인간 PH20
예를 들어, 재조합 인간 PH20의 가용성 형태가 생산되고, 기질분해효소, 활성화제, 마취제, 혈관수축제, 기타 약리학적 또는 치료적 제제, 또는 이들의 조합과 공동-투여 또는 공동-제형화를 위하여 본원에서 기술된 상기 방법에서 사용되어, 조직 내로 확산을 가능케 할 수 있다. 상기 PH20의 가용성 형태의 생산은 관련출원번호 11/065,716 및 11/238,171, 및 하기 실시예 12 내지 15에 기술되어 있다. 가용성 형태는 서열번호:232에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 C-말단 절단을 가지는 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물 세포에 발현됐을 때, 35개의 아미노산 N-말단 시그널 서열이 프로세싱 동안에 절단되며, 상기 단백질의 성숙한 형태가 분비된다. 따라서, 성숙한 가용성 폴리펩티드는 서열번호:232의 아미노산 36 내지 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 포함한다. 아미노산 위치 477 내지 483(서열번호:232에 기재된 전구체 폴리펩티드에 해당)에서 끝나는 결실 돌연변이체는 전체길이의 GPI-앵커 형태보다도 더 높은 분비성 히알루로니다아제 활성을 보여준다. 따라서, 가용성 형태는 각각 서열번호 226-231 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 442, 443, 444, 445, 446 및 447을 함유하는 폴리펩디드를 생성하는 C-말단 절단을 가지는 임의의 것, 또는 이들의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 글리코실화는 히알루로니다아제의 촉매활성 및 안정성에 중요하므로, PH20의 가용성 형태는 폴리펩티드가 활성을 유지하는 것을 보장하기 위한 정확한 N-글리코실화를 가능케 하는 단백질 발현시스템을 이용하여 생산된다. 그러한 세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한다(예컨대, DG44 CHO 세포).
2) rHuPH20
인간 PH20의 재조합 가용성 형태가 만들어지고, 본원에서 기술된 방법을 이용하여 생산되고 정제될 수 있다. 상기 재조합 인간 PH20의 가용성 형태의 생성은 관련출원번호 11/065,716과 11/238,171, 및 하기 실시예 12 내지 15에 기술되어 있다. 그러한 폴리펩티드의 예는 서열번호:225에 기재된 아미노산 1 내지 482를 코드화하는 핵산분자로부터 생성되는 것들이다. 상기 PH20의 생성, 생산 및 정제시 하기 실시예 12 내지 15에 기술되어 있다. 생성된 정제된 rHuPH20는 생산 및 정제시 배양배지에 존재하는 펩티다아제 때문에 불균일(heterogeneous)일 수 있다. 배양배지에서 생산되기 때문에, C-말단에서 불균일(heterogeneity)이 있으며, 따라서 rHuPH20으로 불리는 산물은 다양하고 풍부하게 서열번호.226-231의 하나 이상의 임의의 것을 포함할 수 있는 종의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 글리코실화는 히알루로니다아제의 촉매활성 및 안정성에 중요하므로, PH20의 가용성 형태, 예컨대 rHuPH20은 폴리펩티드가 활성을 유지하는 것을 보장하기 위한 정확한 N-글리코실화를 가능케 하는 단백질 발현시스템을 이용하여 생산된다. 그러한 세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난소세포(예를 들어 DG44 CHO 세포)를 포함한다.
히알루로난 분해효소, 예컨대 임의의 히알루로니다아제, rHuPH20과 같은 특정 가용성 PH20은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 투여는 비경구 투여, 예컨대 진피내, 근육내, 피하 또는 혈관내 투여에 의한다. 본원에서 제공되는 화합물은 주사, 예를 들어 일시주사 또는 지속주입에 의한 비경구 투여를 위해서 제형화될 수 있다. 주사제형은 첨가된 보존제와 함께 단위용량형태(dosage form), 예를 들어 앰플 또는 다회-용량(multi-dose) 용기로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 제형화 제제(formulatory agents), 예를 들어 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성성분은 사용전 적절한 비히클, 예컨대 발열원-부재 멸균수 또는 다른 용매와 재구성하기 위한 분말형태일 수 있다. 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 동결건조된 형태로 유효량의 가용성 PH20, 예를 들어 10유닛 내지 500,000유닛, 100유닛 내지 100,000유닛, 500유닛 내지 50,000유닛, 1000유닛 내지 10,000유닛, 5000유닛 내지 7500유닛, 5000유닛 내지 50,000유닛, 또는 1,000유닛 내지 10,000유닛, 일반적으로 10,000 내지 50,000유닛을 함유하는, 비경구 제형이 본원에서 제공된다. 상기 제형은 단위-용량 형태, 예를 들어 앰플, 주사기 및 개별적으로 포장된 정제 또는 캡슐로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 분산제는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml, 또는 1 내지 10ml, 전형적으로 10 내지 50ml의 총부피로 단독으로, 또는 기타 약리학적으로 유효한 제제와 함께 투여될 수 있다.
병용요법의 하나의 예에서, 마취제, 혈관수축제 및 분산제가 활성화가능한 기질-분해효소 및/또는 활성화제와 공동-투여되거나 공동-제형화되어, 그와 함께 이후에, 동시에, 또는 간헐적으로 투여되는 것이 본원에서 고려된다. 제형의 예는 리도카인, 에피네프린 및 가용성 PH20, 예를 들어 서열번호:226에 기재된 가용성 PH20을 포함하는 제형이다. 가용성 PH20은 리도카인(자일로케인(Xylocaine)) 및 임의적으로는 또는 에피네프린과 직접 혼합될 수 있다. 상기 제형은 단위-용량 형태, 예를 들어 주사기로 준비될 수 있다. 예를 들어, 리도카인/에피네프린/가용성 PH20 제형은 사용을 위한 주사기에 가포장되어, 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml, 또는 1 내지 10ml, 전형적으로 10 내지 50ml와 같은 부피로 제공될 수 있다.
병용요법에서, 다른 약리학적 제제, 예를 들어 리도카인/에피네프린/가용성 PH20 제형은 활성화가능한 기질-분해효소(및 활성화제)와 동시에 또는 시간상으로 아주 근접하여 공동-투여될 수 있다. 전형적으로 마취제 및/또는 분산제는 약간 전에(예를 들어 5 내지 60분 전), 또는 최대로 편리하게, 약리학적 제제와 동시에 투여되는 것이 바람직하다. 당업자에게 인식될 바와 같이, 원하는 공동-투여의 근접도(proximity)는 특정 조직환경에서 제제의 유효반감기, 및 치료되는 특정 질환에 중대한 부분을 의존하고, 적절한 모델에서, 예를 들어 적절한 동물모델에서 다양한 시간에 제제 투여의 효과를 시험함으로써 쉽게 최적화될 수 있다.
iv . 약동학적 성질을 개선하기 위한 히알루로난 분해효소의 변형
히알루로난 분해효소는 약동학적 성질을 개선, 예컨대 생체내에서 반감기 및/또는 활성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소의 변형은 직접적으로 또는 간접적으로 링커, 예컨대 공유결합으로 또는 기타 안정한 결합, 폴리머, 예컨대 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜(페길화(pegylation), (PEG)) 또는 시알릴(sialyl) 잔기, 또는 다른 그러한 폴리머, 예컨대 천연 또는 당 폴리머를 통하여 부착되는 것을 포함할 수 있다.
치료제의 페길화는 단백질분해에 대한 내성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 히알루로난 분해효소에 폴리머 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 잔기(PEG)의 공유결합의(covalent) 또는 기타 안정한 부착(접합)은 생성된 효소-폴리머 조성물에 이로운 성질을 줄 수 있다. 상기 성질은 개선된 생체적합성, 대상내 혈액, 세포 및/또는 기타 조직에서 단백질(및 효소활성) 반감기의 연장, 프로테아제 및 가수분해로부터 단백질의 효과적인 차폐, 개선된 생체내분포(biodistribution), 증진된 약동학 및/또는 약력학, 그리고 증가된 수용성을 포함한다.
히알루로난 분해효소에 접합될 수 있는 폴리머의 예는 천연 및 합성 호모폴리머, 예컨대 폴리올(즉, 폴리-OH), 폴리아민(즉, 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, 폴리-COOH), 및 추가 헤테로폴리머, 즉 하나 이상의 다른 커플링 그룹, 예컨대 히드록시 그룹 및 아민 그룹을 포함하는 폴리머를 포함한다. 적절한 폴리머 분자의 예는 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하는, 폴리알킬렌 글리콜(PAG)와 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지 폴리프로필렌 글리콜(PEGs), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스틸렌-코-말레산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 헤파린, 동종 알부민, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산의 가수분해물, 히드록시에틸-전분 및 히드록시프로필-전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로오스 및 이들의 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 잔탄검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물 및 생-고분자 중에서 선택된 폴리머 분자를 포함한다.
전형적으로, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예컨대 PEG, 전형적으로 mPEG와 같은 폴리에틸렌 옥사이드이고, 이는 다당류, 예컨대 덱스트란, 풀루란 등과 비교하여 교차결합할 수 있는 반응성 그룹이 거의 없다. 전형적으로, 상기 폴리머는 비교적 간단한 화학을 이용하여 히알루로난 분해효소에(예컨대, 단백질 표면의 부착 그룹에) 공유결합으로 접합될 수 있는 비독성 폴리머 분자, 예컨대 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.
히알루로난 분해효소에 부착을 위한 적절한 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예컨대 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지 PEGs, 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예컨대, Roberts 등, Advanced Drug Delivery Review 2002,54:459-476; Harris and Zalipsky, S(eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680,1997; Mehvar 등, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136,2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq.(2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24,2004 참조). 폴리머 분자는 일반적으로 약 3kDa로부터 약 60kDa까지 범위의 분자량일 수 있다. 어떤 구현예에서 단백질, 예컨대 rHuPH20에 접합되는 폴리머 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60kDa 초과의 분자량을 가진다.
PEG 또는 PEG 유도체를 공유결합으로 부착(접합)(즉, "페길화")함으로써 폴리펩디드를 변형시키는 다양한 방법들이 당업자에 알려져 있다(미국특허번호 5,672,662 및 미국 6,737,505; 및 미국공개번호 2006/0104968 및 2004/0235734 참조). 페길화를 위한 기법은 특정 링커 및 커플링 화학(예컨대, Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476,2002 참조), 단일 접합부위에 다수의 PEG 잔기을 부착(예컨대, 분지 PEGs의 사용을 통해; 예컨대, Veronese 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180,2002 참조), 부위-특이(site-specific) 페길화 및/또는 모노-페길화(예컨대, Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783,1999 참조), 및 부위-지정(site-directed) 효소의 페길화(예컨대, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504,2002 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(또한, 예컨대, Lu and Felix(1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix(1993) Peptide Res. 6:142-6,1993; Felix 등(1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar 등(1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu 등(1995) J Immunol. 154:3088-95; 또한, Caliceti 등(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux(2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-8S 참조). 당해 기술분야에서 기술된 방법 및 기법은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 가지는 단백질을 생산할 수 있다(예컨대, 미국공개번호 2006/0104968 참조).
페길화를 위한 많은 시약들이 당해 기술분야에서 기술되어 왔다. 그러한 시약은 N-히드록시숙시니미딜(NHS) 활성화된 PEG, 숙시니미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙시니미드, mPEG 숙시니미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙시니미딜 프로피오네이트, mPEG 숙시니미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙시니미딜 에스테르, 용기성(homobifunctional) PEG-숙시니미딜 프로피오네이트, homobifunctional PEG 프로피온알데히드, 용기성(homobifunctional) PEG 부틸알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐-카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부틸알데히드, 분지 mPEG2 부틸알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커가 없는(linkerless)" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르토피리딜티오에스테르, mPEG 오르토피리딜 다이설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인(fluorescein) PEG-NHS, 및 바이오틴 PEG-NHS를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예컨대, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 5,672,662; 미국 5,932,462; 미국 6,495,659; 미국 6,737,505; 미국 4,002,531; 미국 4,179,337; 미국 5,122,614; 미국 5,183,550; 미국 5,324, 844; 미국 5,446,090; 미국 5,612,460; 미국 5,643,575; 미국 5,766,581; 미국 5,795, 569; 미국 5,808,096; 미국 5,900,461; 미국 5,919,455; 미국 5,985,263; 미국 5,990, 237; 미국 6,113,906; 미국 6,214,966; 미국 6,258,351; 미국 6,340,742; 미국 6,413,507; 미국 6,420,339; 미국 6,437,025; 미국 6,448,369; 미국 6,461,802; 미국 6,828,401; 미국 6,858,736; 미국 2001/0021763; 미국 2001/0044526; 미국 2001/0046481; 미국 2002/0052430; 미국 2002/0072573; 미국 2002/0156047; 미국 2003/0114647; 미국 2003/0143596; 미국 2003/0158333; 미국 2003/0220447; 미국 2004/0013637; 미국 2004/0235734; 미국 2005/000360; 미국 2005/0114037; 미국 2005/0171328; 미국 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; 및 WO 0187925 참조).
하나의 예에서, 제공되는 상기 방법, 조성물 및 조합물에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 페길화된 가용성 히알루로니다아제이다. 특정 예에서, 가용성 히알루로니다아제는 페길화된 PH20 히알루로니다아제이다. 또다른 특정 예에서, 가용성 히알루로니다아제는 페길화된 rHuPH20이다.
G. 활성화가능한 기질-분해효소의 포장 및 제조품
선택된 기질-분해효소, 또는 선택된 기질-분해효소를 코드화하는 핵산, 또는 이들의 유도체인 약학적 화합물은 포장재료, 질환 및 장애를 치료하는데 유효한 약학적 조성물 및 선택된 기질-분해효소 또는 핵산분자가 질환 또는 장애를 치료하는데 사용됨을 지시하는 라벨을 함유하는 제조품으로써 포장될 수 있다. 선택된 기질-분해효소, 또는 이들의 유도체 또는 변이체 및 활성화제의 조합물 또한 제조품으로써 포장될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 본원에서 전체로 통합되어진 미국특허번호 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,252 참조. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 그리고 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료방식에 적절한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제조품은 국소주사 목적으로 투여(예컨대, 표피하 투여)를 가능케 하기 위해 니들 또는 기타 주사장치를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 상기 화합물 및 조성물 제형의 광범위한 집합체가 임의의 ECM-매개 질환 또는 장애의 다양한 치료들인 것으로써 고려된다.
포장의 선택은 기질-분해효소와 활성화제, 및 그러한 조성물이 함께 또는 별개로 포장될 것인지 여부에 좌우된다. 일반적으로, 포장은 그안에 함유된 상기 조성물과 비반응(non-reactive)이며, 따라서 활성화가능한 기질-분해효소의 활성화는 활성화제 첨가 전에 일어나지 않는다. 하나의 예에서, 활성화가능한 기질-분해효소는 활성화제와 혼합물로서 포장될 수 있다. 따라서, 예를 들어 활성화를 위해 낮은 pH를 필요로 하는 리소좀 효소(예를 들어, 카텝신 L)가 완충 산성용액과 혼합물로써 포장될 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 성분은 혼합시 기질-분해효소의 활성화가 유발되는, 별개의 조성물로써 포장될 수 있다. 예를 들어, 기질-분해효소를 함유하는 조성물은 활성화제, 예컨대 완충 산성용액을 함유하는 분리된 조성물과 별개로, 및 함께 사용을 위하여 제공될 수 있다. 따라서, 상기 예에서, 활성화가능한 기질-분해효소는 활성화제와 분리된 용기내에 포장되고, 활성화는 사용자 뜻대로 활성화제에 노출에 의해 달성된다. 활성화제에 노출은 활성화제를 효소에 첨가함으로써 투여전 임의의 시간에 발생할 수 있다. 예를 들어, 용기는 기질-분해효소를 함유하고, 예컨대 구획내 구멍을 통하여 사용자에 의해 활성화제 첨가가 쉬운, 단일구획을 가질 수 있다. 기질-분해효소의 봉쇄를 위한 규정된 공간을 가지기 적절한, 활성화에 필수적인 최종성분의 첨가를 허용하는 간단한 조작이 쉬운 임의의 용기 또는 다른 제조품이 고려된다. 활성화제는 사용전에 첨가된다. 활성화제에 노출은 또한 간질에 투여후에 발생될 수 있다. 예를 들어, 열이 활성화제인 경우, 기질-분해효소는 투여되어, 국소 주사부위 열에 가해질 수 있다. 대체 예에서, 산성 완충용액이 간질에 투여된 후, 기질-분해효소, 예를 들어 활성화에 산성 pH를 요구하는 임의의 것, 예컨대 카텝신이 투여될 수 있다.
다른 예에서, 활성화가능한 기질-분해효소는 활성화제와 함께 용기 내에 포장되고, 따라서 상기 기질-분해효소의 활성화가 용기내에서 사용자 뜻대로 쉽게 활성화된다. 일반적으로, 그러한 용기의 예는 상기 기질-분해효소를 함유하는 밀폐되고 규정된 공간 및 활성화제를 함유하는 별개의 밀폐되고 규정된 공간을 가지는 것들을 포함하고, 따라서 제거시 상기 성분이 혼합되고, 이로써 반응하여 프로타아제의 활성화를 유발할 수 있는, 쉽게 제거가능한 막에 의해 두 공간이 분리된다. 기질-분해효소가 활성화제와 분리되기만 하면, 임의의 용기 또는 다른 제조품이 고려된다. 기질-분해효소에 활성화제의 노출이 사용에 앞선다. 예를 들어, 물리적인 분리수단은 사용자에 의해 쉽게 제거되어, 혼합을 허용하고, 상기 효소의 활성화를 유발하는 것들이다. 예를 들어, 제조품은 한 구획내에 기질-분해효소를, 인접한 구획내에 활성화제를 포함할 수 있다. 상기 구획은 분할멤버, 예컨대 물품 또는 제품의 압축시 분리된 성분들이 섞이도록 하는 파열되는, 막에 의해 분리된다. 적절한 구현예를 위하여, 예를 들어 미국특허번호 3,539,794 및 5,171,081에 기술된 용기를 참조.
다음은 활성화가능한 기질-분해효소의 다양한 최종사용의 포장요건에 대한 일부 예들이다. 이들은 예시로서만 제공되며, 결코 제한되고자 함이 아니다.
1. 단일챔버 장치
본원의 가장 간단한 구현예 중에서, 그안에 장치가 단일챔버 또는 용기, 그리고 필요하다면, 분출수단을 함유하는 것들이다. 단일챔버 하우징(housings) 또는 용기는 기질-분해효소가 용기내 포함된 임의의 아이템을 포함한다. 상기 기질-분해효소는 액상, 또는 분말 또는 다른 페이스트 또는 다른 편리한 조성물로써 용기(vessel)내에 보관된다. 상기 활성화제 성분은 사용직전 도입된다. 사용직전, 전형적으로 완충용액으로 제공되는, 활성화제가 첨가되고, 기질-분해효소와 접촉하여 상기 기질-분해효소의 혼합 및/또는 재구성을 허용한다. 예를 들어, 원하는 경우 및 기질-분해효소에 따라, Ca2 + 함유 액제, 예컨대 적절한 완충액 내 Ca2 +를 함유하는 혼합물, 또는 산성 완충용액, 또는 활성화 조건을 함유하는 다른 용액이 용기에 첨가된다. 상기 아이템 및 상기 활성화제를 함유하는 키트 또한 제공된다.
2. 이중챔버 장치
본원의 용도를 위해 고려되는 장치의 예는 이중챔버 용기이다. 일반적으로, 상기 장치는 두개의 챔버 또는 구획을 가짐으로써, 활성화를 원할 때까지 상기 활성화제와 분리된 상기 기질-분해효소를 유지한다. 상기 장치는 장치로부터 분배되기 전에 상기 성분의 혼합을 허용하는 혼합챔버를 포함할 수 있다. 대안적으로, 한 챔버로부터 활성화가능한 기질-분해효소를 함유하는 제2 챔버 내로 활성화제를 분출시킴으로써 혼합이 일어날 수 있다. 예를 들어, 활성화가능한 기질-분해효소는 동결건조된 형태로 제공될 수 있고, 재구성은 제1 챔버로부터 동결건조된 효소를 함유하는 제2 챔버 내로 활성화제, 예컨대 산성 완충용액을 분출함으로써 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 이중챔버 장치는 작동시 기계적인 펌프장치를 이용한다. 그러한 예에서, 분배장치는 분리된 챔버내에 상기 성분을 유지한다. 펌프장치는 각각의 챔버로부터 및 혼합챔버 내로, 또는 한 챔버로부터 제2 챔버내로 내용물을 회수하도록 작동된다. 혼합시, 혼합된 조성물은 상기 챔버내 상기 성분의 반응에 의해 활성화된다. 펌프장치는 수동으로, 예를 들어 플런저에 의해 작동될 수 있다. 그러한 이중챔버 장치의 예는 이중챔버 주사기를 포함한다(예컨대, 미국특허번호 6,972,005, 6,692,468, 5,971,953, 4,529,403, 4,202,314, 4,214,584, 4,983,164, 5,788,670, 5,395,326; 및 국제특허출원번호 WO2007006030 및 WO2001047584 참조).
본원의 용도를 위해 고려되는 이중챔버 유체 분배장치의 또다른 구현예는 압축성 병 또는 튜브 또는 다른 유사한 장치의 형태를 취한다. 상기 장치는 그안에 상기 성분이 분리되도록 유지시키는 두개의 구획을 가진다. 상기 장치의 캡이 혼합챔버로써 제공되거나, 혼합챔버가 두 챔버와 캡 사이에 위치할 수 있고, 또는 혼합이 하나의 챔버안에서 이루어질 수 있다. 상기 성분은 분리된 구획으로부터 혼합챔버 내로 강제로 압축된다. 이들은 그다음 혼합챔버로부터 분배된다. 예를 들어, 상기 혼합된 내용물은 분배말단에 플런저/주사기 장치를 부착하고 그것을 통해서 내용물을 회수함으로써 상기 장치로부터 제거될 수 있다. 그러한 장치는 당업자에 알려져 있다(예컨대, 국제특허출원번호 WO1994015848 참조).
3. 키트
선택된 기질-분해효소, 활성화제 및/또는 이들의 제조품이 또한 키트로써 제공될 수 있다. 키트는 본원에서 기술된 약학적 조성물 및 제조품으로써 제공되는 투여용 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어 선택된 기질-분해효소는 투여용 장치, 예컨대 주사기, 흡입기, 용량컵, 점적기 또는 도포기(applicator)와 함께 공급될 수 있다. 상기 조성물은 투여용 아이템내에 함유되거나 또는 별개로 공급되어 나중에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 키트는 기질-분해효소를 가지는 아이템 및 활성화 조건을 함유하는 활성화제 조성물을 함유한다. 상기 키트는 임의적으로, 용량, 복용법 및 투여방식을 위한 지시사항을 포함하는 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에서 기술된 약학적 조성물 및 진단용 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 키트는 대상에서 상기 선택된 프로테아제의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 아이템을 포함할 수 있다.
H. 기질-분해효소의 활성 평가방법
1. 효소활성 평가방법
활성화가능한 기질-분해효소는 알려진 기질에 대한 이들의 효소활성이 측정될 수 있다. 활성평가는 활성화제 존재 또는 부재시 수행될 수 있다. 활성평가는 또한 다양한 조건하에, 예를 들어 활성화에 사용되는 활성화제의 양을 다르게 함으로써 수행될 수 있다. 하나의 예에서, 다양한 pH 조건하에 효소의 상대적인 활성을 측정함으로써 pH 프로파일이 수행될 수 있다(예컨대, Dehrmann 등(1995) Arch. Biochm. Biophys., 324:93-98 참조). 활성평가는 조건배지 또는 다른 상청액에서, 또는 정제된 단백질에서 수행될 수 있다.
효소활성은 상기 효소의 알려진 기질을 이용하여 기질 절단을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 기질은 정제된 단백질 형태 또는 펩티드 기질로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 카텝신 L의 효소활성은 아조카세인, 콜라겐, 엘라스틴, 인간 혈청 알부민 및 rHuPH20의와 같은 정제된 단백질의 절단에 의해, ADME와 이들을 개별적으로 배양함으로써 또는 둘 이상의 정제된 단백질의 혼합물로써 평가될 수 있다. 효소에 의한 정제된 단백질의 절단은 HPLC, CE, 질량분석법, SDS-PAGE 분석, ELISA, 웨스턴블롯팅, 면역조직화학, 면역침전, NH2-말단 서열분석 및 단백질 표지를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 단백질 검출방법을 이용하여 평가될 수 있다.
기질상의 형광생성 그룹의 사용은 절단의 검출을 용이하게 한다. 예를 들어, 기질은 상기 펩티드 기질의 형광생성(fluorogenically) 표지된 테트라펩티드, 예컨대 ACC- 또는 7-아미노-4-메틸 쿠마린(AMC)-테트라펩티드로써 제공될 수 있다. 다른 형광생성 그룹이 알려져 있고, 사용되어 단백질 또는 펩티드 기질에 연결될 수 있다. 이들은 예를 들어, 7-아미노-4-메틸-2-퀴놀리논(AMeq), 2-나프틸아민(NHNap)과 7-아미노-4-메틸쿠마린(NHMec) 및 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(FITC)를 포함한다(Sarath 등 단백질가수분해 효소에서 "프로테아제 분석방법,": 실제적 접근(Practical Approach). Ed. Robert J. Beynon and Judith S. Bond. Oxford University Press, 2001. pp.45-76). 형광생성 펩티드 기질의 v예에서와 같이, 펩티드 기질은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 카텝신 B의 기질의 예는 N-αBZ-Phe-Val-Arg-p-NA, DNA-Phe-Arg-Nph-Leu, Z-Ala-Arg-Arg-F3MCA, Z-Arg-Arg-MBNA, Z-Arg-Arg-NHMec, Z-Phe-Arg-NHMec 및 Z-Leu-Arg-AMC, 및 예컨대 다른 형광생성 그룹을 가지는 이들의 변형을 포함한다. 따라서, 카텝신 B 및 카텝신 L은 동일한 기질, 예를 들어 Z-Phe-Arg-NHMec 및 Z-Leu-Arg-AMC을 공유하므로, 카텝신 L의 활성평가는 카텝신 B에 특이적 저해제의 존재하에 수행될 수 있다. 그러한 저해제의 예는 CA-074이다. 이는 본원의 실시예 9에 예시되어 있다. 형광강도에 의해 효소활성을 측정하는 효소분석은 표준이며, 상기 효소 및 기질의 배양시간의 함수로서 전형적으로 수행된다(예컨대, Dehrmann 등(1995) Arch. Biochem. Biophys., 324:93-98; Barrett 등(1981) Methods Enzymol., 80:536-561 참조).
형광생성 화합물의 검출은 형광계(fluorometer)를 이용하여 수행될 수 있으나, 검출은 당업자에게 잘 알려진 다양한 다른 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 형광단(fluorophores)이 가시파장에서 방출될 때, 광원에 의한 여기(excitation)에 반응하여 형광을 외관검사함으로써 간단히 검출될 수 있다. 또한 디지타이저(digitizer) 또는 다른 이미지 인식 시스템에 접속되는 비디오 카메라를 활용하는 이미지 분석 시스템을 써서 검출될 수 있다. 또한 형광 현미경 하에서처럼, 필터를 통하여 시각화함으로써 검출될 수 있다. 현미경은 오퍼레이터에 의해 간단히 시각화되는 시그널을 제공할 수 있다. 대안적으로, 상기 시그널은 사진필름으로 또는 비디오 분석 시스템을 이용하여 기록될 수 있다. 상기 시그널은 또한 이미지 분석 시스템 또는 광도계(photometer)를 이용하여 실시간으로 간단히 정량화될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 시료의 효소활성 기초분석은 완충액(분석되는 특정 프로테아제의 pH 및 이온강도 최적에서)내 시료를 현탁 또는 용해하고, 상기 완충액에 형광생성 효소 펩티드 지시약을 첨가하고, 및 예컨대, Harris 등,(1998) J Biol Chem 273:27364에서 보는 바와 같이 배양을 위한 특정온도에서 형광광도계를 이용하여 생성된 형광변화를 모니터링하는 것을 포함한다. 형광광도계는 상기 형광단의 여기파장에서 형광단을 여기시키고, 상기 형광단의 방출파장에서 시그널을 검출하도록 설정된다. 형광생성 효소 지시약은 프로테아제의 지시약 절단에 의하여 형광을 변화시키는 효소(예컨대, 프로테아제)의 기질 서열이다. 효소활성은 상기 형광생성 기질의 농도를 달리하여 생성된 검정곡선에 기초하여 표준 유닛/ml로써 전형적으로 표현되고, 비특이도(specific activity)는 유닛/mg 단백질로써 나타낸다.
2. ECM 분해 평가방법
상기에서 기술된 것들, 예컨대 카텝신 L을 포함하나, 이에 제한되지 않는 기질-분해효소에 의한 세포외 기질 단백질의 분해는 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 그러한 평가를 위한 분석은 당업자에게 알려져 있으며, 콜라겐(I, II, III 및 IV), 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 프로테오글리칸을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 세포외 기질 단백질에 대한 다양한 기질-분해효소의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
a. 시험관내 분석법
시험관내 분석의 예는 기질-분해효소와의 배양후 세포외 기질 단백질의 분해산물을 평가하는 분석법을 포함한다. 어떤 예에서, 상기 분석은 단일의, 특정한 분해산물을 검출한다. 다른 예에서, 상기 분석은 정체가 알려져 있거나 알려지지 않은, 다수의 분해산물을 검출한다. 분해산물의 평가는 HPLC, CE, 질량분석법, SDS-PAGE 분석, ELISA, 웨스턴블롯팅, 면역조직화학, 면역침전, NH2-말단 서열분석 및 단백질 표지를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 세포외 기질 분해산물은, 예를 들어 적당한 온도에서 적당한 양의 시간 동안 기질-분해효소와의 배양후 SDS-PAGE 분석에 의해, 가시화될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 활성화된 카텝신 L과 배양되고, 상기 산물을 분리하기 위하여 예컨대, 4-20% 트리스/글리신 겔을 이용한 SDS-PAGE가 수행된다. 상기 겔의 쿠마시 염색은 완전한 콜라겐과 비교하여, 더 작은 분해산물 또는 콜라겐 밴드의 소실의 가시화를 용이하게 한다. 예를 들어 세포외 기질 단백질에 특이적인 다클론 Ig를 이용한 면역블롯팅 또한 SDS-PAGE로 분리후 상기 분해산물을 가시화하는데 이용될 수 있다.
세포외 기질 단백질의 분해후 단일산물을 특이적으로 검출하는 분석법은 또한 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 세포외 기질 단백질을 분해하는 기질-분해효소의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 히드록시프롤린(HP) 분석은 콜라겐의 분해를 측정하는데 사용될 수 있다. 4-히드록시프롤린은 콜라겐 중량의 약 12%를 구성하는 변형된 이미노산이다. HP 분석은 기질-분해효소, 예컨대 활성화된 카텝신 L과 배양후 상청액에서 HP 양을 측정함으로써 용해된 콜라겐의 양을 측정한다(예컨대, 하기 실시예 2, 및 Reddy 및 Enwemeka (1996) Clinical Biochemistry 29:225-229 참조). HP 측정은 예를 들어 비색법(colorimetric methods), 고성능액체크로마토그래피, 질량분석법 및 효소적 방법에 의해 수행될 수 있다(예컨대, Edwards 등, (1980) Clin. Chim. Acta 104:161-167; Green(1992) Anal. Biochem. 201:265-269; Tredget 등,(1990) Anal. Biochem. 190:259-265; Ito 등,(1985) Anal. Biochem. 151:510-514; Garnero 등(1998) J. Biol. Chem 273:32347-32352 참조).
상기 시험관내 분석에서 사용된 콜라겐 원료는 상업적으로 입수가능한 정제된 콜라겐, 뼈입자, 피부, 연골 및 랫트 꼬리 힘줄을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기질-분해효소, 예컨대 카텝신 L의 콜라겐분해(콜라겐olytic) 활성은 불용성 콜라겐 현탁액과 활성화가능한 효소를 배양한 후, 예컨대 HCl로 가수분해함으로써 평가될 수 있다. 용해된(분해된) 콜라겐으로부터 유래된 히드록시프롤린의 양은 분광광도법, 예컨대 에를리히(Ehrlich's) 시약과 배양후 550nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 어떤 예에서, 콜라겐 원료는 마취된 동물로부터 수술로 제거된 다음, 일차로 산성용액, 이어서 기질-분해효소, 예컨대 카텝신 L로 관류되는, 랫트 또는 돼지 피부외식편이다(예컨대, 하기 실시예 3-4 참조). 그다음 상기 관류액에서 HP 수준이 평가될 수 있다. 상기 방법을 변형하여, 예를 들어 상기 외식편내 섬유성 격막의 카텝신 L의 효과가 평가될 수 있다(예컨대, 실시예 5 참조). 요약하면, 기질분해효소와 관류후, 상기 외식편을 작은 조각으로 자르고, 파라핀으로 포매하고, 콜라겐의 가시화를 위하여 마센트리크롬 염색 후에 현미경으로 분석한다. 콜라겐 섬유성 격막의 수가 가시화되어, 기질분해효소로 처리하지 않은 조직과 비교될 수 있다.
특정 콜라겐 분해를 검출하는 분석법 또한 당해 기술분야에서 알려져 있다. 그러한 분석법은 특정 콜라겐 특유의 분해산물을 검출하기 위한 면역학적 방법을 채택할 수 있다. 예를 들어, 어떤 기질-분해효소에 의한 콜라겐 I의 분해는 면역분석을 이용하여 검출될 수 있는 상이한 에피토프를 가지는 텔로펩티드를 방출한다. 그러한 분석은 교차결합된 N-텔로펩티드(NTx) 및 교차결합된 C-텔로펩티드(CTx 및 ICTP)를 검출하고, 이들 각각은 특유의 에피토프를 함유한다. 전형적으로, CTx 분석은 α1 사슬의 C-말단 텔로펩티드 지역내에, β-이성질체화 배열(isomerized configuration)내에 아스파르트산이 있는, 8개의 아미노산 서열 EKAHD-β-GGR 옥타펩티드를 인식하는 CrossLaps (Nordic Biosciences) 항체를 활용한다(Eastell(2001) Bone Markers: Biochemical and Clinical Perspectives, pg40). ICTP를 검출하는 면역분석이 또한 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 콜라겐 I의 분해를 검출하는데 사용될 수 있다(미국특허번호 5,538,853). 다른 예에서, 예를 들어 ELISAs와 같은, 면역분석은 콜라겐 I형을 프로테아제, 예컨대 카텝신 K, S, L 및 B와 배양한 후, NTx를 검출하는데 사용될 수 있다(Atley 등,(2000) Bone, 26:241-247). 분해된 콜라겐에 대해 특이적인 다른 항체 및 분석법이 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 기질-분해효소에 의한 분해를 검출하는데 사용될 수 있다. 이들은 분해된 콜라겐 I(Hartmann 등(1990) Clin. Chem. 36:421-426), 콜라겐 II(Hollander 등(1994) J. Clin. Invest. 93:1722-1732), 콜라겐 III(미국특허번호 5,34,2756) 및 콜라겐 IV(Wilkinson 등(1990) Anal. Biochem. 185:294-6)에 특이적인 항체 및 분석법을 포함한다.
b. 생체내 분석법
ECM의 생체내 분해를 검출하는 분석법이 또한 당해 기술분야에서 알려져 있다. 그러한 분석법은 생물학적 시료, 예컨대 뇨, 혈액, 혈청 및 조직에서, 예를 들어 히드록시프롤린 및 N- 및 C-텔로펩티드 및 분해된 콜라겐 또는 다른 ECM을 검출하는데 상기 기술된 방법들을 활용할 수 있다. 분해된 ECM의 검출은 환자에게 하나 이상의 기질-분해효소를 투여한 후 수행될 수 있다. 피리디놀린(PYD) 및 디옥시피리디놀린(DPYD)의 검출이 또한 콜라겐의 분해를 평가하는데 사용될 수 있다. 또한 히드록시리실피리디놀린 및 리실피리디놀린으로 각각 알려져 있는, PYD 및 DPYD는 I형 콜라겐 사슬을 안정화시키는 두개의 비환원성(nonreducible) 3가 교차결합이고, 성숙한 콜라겐 피브릴의 분해 동안에 방출된다. 피리디놀린은 뼈 및 연골에서 풍부한 반면, 디옥시피리디놀린은 뼈에 주로 제한되어 있다. III형 콜라겐은 또한 아미노 말단에서 피리디놀린 교차결합을 함유한다. 총 PYD 및 DPYD는 역상 HPLC 후에 형광측정 검출에 의하여, 예를 들어 가수분해된 뇨 시료 또는 혈청에서 측정될 수 있다(Hata 등(1995) Clin.Chimica. Acta. 235:221-227).
c. 비인간 동물모델
비인간 동물모델은 기질-분해효소의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 질환 및/또는 상태의 모델로서 사용될 수 있다. 비인간 동물은 기질-분해효소 투여전에 질환/또는 표현형-유도 물질이 주사될 수 있다. 유전모델(genetic models)이 또한 유용하다. 하나 이상의 유전자의 과다발현, 과소발현 또는 녹아웃(knock-out)에 의해 질환 또는 상태를 모방하는 동물, 예컨대 마우스가 만들어질 수 있다. 예를 들어, 페로니병(peyronie's disease)(Davila 등(2004) Biol. Reprod., 71:1568-1577), 건변증(tendinosis)(Warden 등,(2006) Br. J. Sports Med. 41:232-240) 및 피부경화증(scleroderma)(Yamamoto(2005) Cur. Rheum. Rev. 1:105-109)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 상태를 위한 동물모델은 당해 기술분야에서 알려져 있다.
비인간 동물은 또한 비-질환 동물에서 생체내 기질-분해효소의 활성을 측정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 기질-분해효소가 비인간 동물, 예컨대 마우스, 랫트 또는 돼지에게 투여되고, ECM 분해 수준이 측정될 수 있다. 어떤 예에서, 예컨대 상기 및 하기 실시예 3-5에서 기술된, ECM 분해의 생체외 평가를 위한 외식편을 확보하는데 상기 동물이 이용된다. 다른 예에서, ECM 분해는 생체내에서 평가된다. 하나의 예에서, 마취된 랫트 피부의 콜라겐 분해가 평가된다(예컨대, 하기 실시예 6 참조). 요약하면, 기질분해효소, 예컨대 pH가 5인 완충액내 카텝신 L이 꼬리피부의 진피층 내로 니들 삽입을 거쳐 관류된다. 관류액 분획이 꼬리피부로부터 수집되고, 히드록시프롤린 분석으로 콜라겐 분해가 측정된다. 특정 분해산물을 검출하기 위한, 면역분석과 같은, 하기에서 기술된 임의의 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다른 방법들이 분해를 검출하는데 이용될 수 있다. 산성용액, 예컨대 최적활성을 가능케하는, 카텝신 L을 함유하는 완충액을 투여하는 효과가 또한 비인간 동물모델에서 평가될 수 있다(예컨대, 실시예 7 참조). pH 변화에 민감한 염료, 예컨대 페놀레드가 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
I. ECM 의 질환 또는 장애의 예시적 치료방법
본원에서 제공되는 활성화가능한 기질분해효소는 임의의 하나 이상의 ECM 성분에 의해 매개된 임의의 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 섹션은 활성화가능한 기질-분해효소의 예시적 사용 및 투여방법을 제공한다. 이러한 기술된 요법들은 예시적이며, 효소의 응용을 제한하지 않는다. 그러한 방법은 임의의 하나 이상의 ECM 성분의 과잉(excess), 이상(aberrant) 또는 축적된 발현에 의해 유발되는 임의의 ECM의 상태 또는 질환의 치료방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료되는 질환 또는 상태의 예는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 또는 글리코사미노글리칸, 예컨대 프로테오글리칸에 의해 매개되는 임의의 것이다. 예를 들어, 콜라겐-매개 질환 또는 장애의 예는 셀룰라이트, 듀피트렌 질환(Dupuytren's disease)(또한 듀피트렌 구축증(Dupuytren’s contracture)으로도 불림), 페로니병, 오십견, 힘줄의 만성 건병증(chronic tendinosis) 또는 반흔조직, 국소성 피부경화증 및 림프부종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질환 또는 상태를 확인하는 것은 치료하는 의사의 기술 범위내에 있다.
치료되는 특정 질환 또는 상태는 선택된 활성화가능한 기질-분해효소를 좌우한다. 예를 들어, 콜라겐-매개 질환 또는 장애의 치료는 콜라겐을 절단하는 기질-분해효소의 투여에 의해 행해질 수 있다. 그러한 기질-분해효소는 상기 표 3에 목록화되어 있고, 있거나, 당업자에게 알려져 있다. 활성화가능한 기질-분해효소, 및 활성화를 위한 시스템과 방법은 특정 질환 및 상태를 치료하기 위하여 적합하게 선택될 수 있다. 예를 들어 시스테인 및 아스파르트산 패밀리의 카텝신은 본원에서 기술된 바와 같이 산성 pH 조건에 의해 일시적으로 활성으로 될 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, 콜라겐을 절단하는 카텝신, 예를 들어 카텝신 L은 콜라겐-매개 질환 또는 상태를 치료하기 위하여 산성 pH와 같은, 활성화 조건 존재하에 투여될 수 있다.
활성화가능한 기질-분해효소의 질환 및 상태의 치료는 피하주사, 근육내, 진피내, 경구, 및 국소 및 경피 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에서 기술된 바와 같이 적절한 제형을 이용한 임의의 적절한 투여경로에 의해 수행될 수 있다. 상기에서 기술된 바와 같이, 발병(affected)부위로 직접 피부아래에 투여되는, 활성화가능한 기질-분해효소의 투여경로가 전형적으로 선택된다. 그러한 투여경로의 예는 피하, 근육내 또는 진피내를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
필요하다면, 특정 용량 및 기간 및 치료 프로토콜이 경험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 및 고유의 활성 기질-분해효소 또는 활성화가능한 기질-분해효소의 투여량의 예가 적당한 투여량을 결정하기 위한 시발점으로써 사용될 수 있다. 용량수준은 다양한 요인, 예컨대 개체의 체중, 일반건강, 나이, 사용된 특정 화합물의 활성, 성별, 식단, 투여시간, 배설속도, 약물병용, 질환의 위중도 및 코스, 및 질환에 대한 환자의 소인과 치료하는 의사의 판단에 기초하여 결정될 수 있다. 담체 재료과 결합되어 단일용량 형태를 만들 수 있는 활성성분의 양은 특정 기질-분해효소, 치료되는 숙주, 특정한 투여방식, 및 활성화에 필요한 활성화 조건, 및/또는 미리 결정되거나 활성화를 바라는 시간의 길이에 따라 달라질 것이다. 약학적 조성물은 약 1μg/ml 내지 약 20mg/ml의 용량을 전형적으로 제공해야 한다. 일반적으로, 용량은 단일용량 투여당, 약 10μg/ml 내지 1mg/ml, 전형적으로 약 100μg/ml이다. 투여될 양은 활성화가능한 기질-분해효소와 선택된 활성화 조건, 치료되는 적응증, 및 가능한 용인될(tolerated) 부작용의 함수일 것으로 이해된다. 용량은 각각의 장애에 대하여 인식된 모델을 이용하여 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 활성화가능한 기질-분해효소는 다른 제제와 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 병용투여될 수 있다. 그러한 제제의 예는 리도카인, 에피네프린, 분산제, 예컨대 히알루로니다아제, 및 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
환자 상태의 호전에 따라, 필요하다면, 화합물 또는 조성물의 유지용량이 투여될 수 있으며; 용량, 용량 형태 또는 투여빈도, 또는 이들의 조합은 변형될 수 있다. 어떤 경우에, 대상은 임의의 질환 증상의 재발에 따라 장기적으로 간헐적인 치료를 요구할 수 있다.
콜라겐-매개 질환 또는 상태와 콜라겐의 관련성에 대한 설명이 다양한 질환 및 상태에서 ECM 구성요소의 역할로서 하기에서 제공된다. 그러한 설명은 단지 예시일 뿐, 특정 활성화가능한 기질-분해효소, 또는 특정 ECM-매개 질환 또는 상태로 한정하는 것은 아니다. 당업자는 특정 질환 또는 상태와 관련된 ECM 구성성분을 절단하거나 분해하는 특정 효소의 능력에 기초하여, 활성화가능한 기질-분해효소 및 이들의 활성화를 위한 활성화 조건을 선택하여, 임의의 원하는 ECM-매개 질환의 치료에 사용할 수 있다. 상기 특정 치료 및 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료평가에 있어 고려사항은 예를 들어, 치료되는 질환, 질환에 관련된 ECM 구성성분, 질환의 위중도 및 경과, 활성화가능한 기질-분해효소가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 환자의 임상병력 및 요법에 대한 반응, 및 주치의의 재량을 포함한다.
1. 콜라겐-매개 질환 또는 상태
콜라겐은 포유동물 유기체의 주된 구조적 구성성분이고, 피부 및 동물신체의 다른 부분의 총 단백질 함량의 큰 부분을 차지한다. 많은 질환 및 상태는 예를 들어, 콜라겐이 풍부한 섬유조직의 불규칙한 축적 또는 다른 원인으로 인한 과도한 콜라겐 침착과 관련이 있다. 콜라겐-매개 질환 또는 상태(또한 섬유증조직이상으로써 언급됨)는 당업자에 알려져 있다(예컨대, 공개미국출원번호 20070224183; 미국특허번호 6,353,028; 6,060,474; 6,566,331; 6,294,350 참조). 과도한 콜라겐은 질환 및 상태, 예컨대 반흔형성, 셀룰라이트, 듀피트렌 질환, 페로니병, 오십견, 국소성 피부경화증, 림프부종, 간질성방광염(Interstitial cystitis, IC), 텔란그렉타제(Telangrectase), 바렛 화생(Barrett’s metaplasia), 창자벽공기낭증(Pneumatosis cytoides intestinalis), 교원성 대장염을 유발하는 섬유증 질환 또는 상태와 관련되어 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 피부의 훼손상태, 예컨대 주름, 셀룰라이트 형성 및 종양섬유증은 정상조직 건축(architecture)의 원치않는 결합 및 왜곡을 초래하는 과도한 콜라겐 침착 때문이다.
카텝신 L을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에서 기술된 활성화가능한 기질-분해효소는 콜라겐-매개 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 질환 및 상태를 치료하기 위한 활성화가능한 기질분해효소의 예는 중성 pH에서 활성인 것들이며, 활성을 위해 지속된 산성조건을 필요로 한다. 예를 들어, 피부간질과 같은, 세포외 기질의 일시적인 산성화는 발병부위에 직접 완충 산성용액을 주입함으로써 달성될 수 있다. 하나의 예에서, 완충 산성용액은 상피하, 즉 피부아래를 통해 투여되며, 따라서, 투여는 ECM 구성요소가 존재하고 축적된 부위에 직접 행해진다. 활성화의 다른 방법이 이용될 수 있으며, 본원의 서술과 관련하여 당업자에 알려져 있다.
a. 셀룰라이트
카텝신 L을 포함한 활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 셀룰라이트를 치료하는데 이용될 수 있다. 정상 지방조직에서, 혈관 및 림프관의 미세한 메쉬(mesh)는 필요한 영양분 및 산소를 조직에 공급하고, 대사산물의 제거를 담당한다. 예를 들어, 트리글리세리드는 모세혈관이 풍부한 소엽(lobules)으로 그룹화되는 각각의 지방세포에 저장된다. 각각의 지방소엽은 지방세포로 구성된다. 섬유성 격막으로 명명된 콜라겐 섬유의 수직가닥(vertical strands)은 지방소엽을 분리하고 위에 놓인 얇은 근막(superficial fascia)을 밑에 있는 근육에 묶는다.
셀룰라이트는 전형적으로 피부의 진피 및 진피하(subdermal) 수준에서 혈관통합(integrity)의 파괴 및 모세혈관 네트워크의 소실로 인한 진피의 변질(deterioration)을 특징으로 한다. 혈관의 변질은 진피대사를 감소시키는 경향이 있다. 상기 감소된 대사는 단백질 합성 및 복구과정을 방해하고, 이는 진피박화(thinning)를 초래한다. 상기 상태는 지질로 충혈되고(engorged), 함께 팽창하고 응괴하는 지방세포 뿐만이 아니라, 피부의 진피 및 진피하 부분에 과도한 체액저류(fluid retention)를 추가의 특징으로 한다. 지방덩어리(globules) 또는 지방세포의 축적은 추가 영양분을 제공하기 위한 더 큰 혈관공급의 요구를 초래한다. 조직으로 혈액을 제공하기 위하여, 새로운 모세혈관들이 형성되어, 더 많은 여과액을 방출하고, 그결과 조직이 간질액으로 포화되어 지방조직내 부종을 유발한다. 간질조직내 풍부한 망상섬유(reticular fibers)가 응집된(aggregated) 지방세포 주변에 축적되고 비후해진다(thicken); 이들은 점차 콜라겐 섬유로 변형시키고 결절(nodules)로서 느껴지는, 캡슐 또는 격막을 형성한다. 이러한 격막의 형성은 지방세포를 더 막는다. 콜라겐 섬유는 또한 간질조직 공간내에 축적되어, 결합조직 경화증(hard)이 된다.
따라서, 상태가 더 진행될수록, 지방세포의 단단한 결절(hard nodules) 및 격막으로 둘러싸인 지방의 클럼프(clumps)가 진피부분에서 형성된다. 이는 상당한 이질성(heterogeneity)을 나타내고, "코티지 치즈" 또는 "오렌지 껍질" 외관을 가지는 특징인 피부표면을 초래한다. 피부를 진피와 심층 조직층으로 연결하는 섬유성 격막이 피부에서 조여지고 당겨질 때, 압흔(dimpling)이 발행한다. 따라서, 셀룰라이트의 "오렌지 껍질" 외관은 지방조직에 대한 외향력(outward forces)의 결과로서 지방소엽의 변형 때문이다. 지방소엽은, 예를 들어 폭이 1cm까지로 클 수 있으며, 위에 있는 진피 내로 쉽게 돌출되어, 피부표면에 가시적인 변형을 유발할 수 있다. 지방이 위로 밀리게 되어, 전체결과는 바깥피부(outer skin)의 파상(undulating)외관이다. 결합성 격막이 이러한 외향력과 동일방향으로 움직이기 때문에, 이들은 지방이 진피 내로 돌출되는 것을 막는 저항력을 제공할 수 없다.
셀룰라이트는 남성보다 여성에서 더 일반적이다. 셀룰라이트의 유병률은 여성인구에서 60% 내지 80% 사이로 추정되며, 위중도는 비만으로 악화되는 경향이 있다. 최근에, 공개된 연구는 생체내 자기공명영상에 의해서 셀룰라이트가 있는 여성이 셀룰라이트가 없는 여성 또는 남성보다 더 높은 백분율의 수직 섬유성 격막을 가짐을 보여주었다(Querleux 등,(2002) Skin Research and Technology, 8:118-124). 셀룰라이트는 엉덩이, 대퇴 및 상완에 매우 자주 발생한다. 예를 들어, 폐경전 여성은 피하에, 주로 셀룰라이트가 가장 흔한 둔부/대퇴부에, 지방이 축적되는 경향이 있다. 임상적으로, 셀룰라이트는 표피의 박화(thinning), 체액의 진피하 응집(agglomerations)을 초래하는 미세혈관계의 감소와 파괴, 및 지방조직의 진피하 응집을 포함하는 증상이 수반된다.
b. 듀피트렌 질환
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 듀피트렌 증후군(또한 듀피트렌 구축으로도 불림)을 치료하는데 사용될 수 있다. 듀피트렌 구축증(또한 몰부스 듀피트렌(Morbus Dupuytren)으로 알려짐)은 손의 고정된 굴곡구축으로, 손가락이 손바닥 쪽으로 굽고 완전히 펼칠 수 없다. 유사병변이 때때로 발에서 발생한다. 손의 결합조직이 비정상적으로 두꺼워지고 섬유모세포 및 콜라겐, 특히 III형 콜라겐을 함유하는 결절의 존재가 수반된다. 콜라겐의 섬유대(fibrous cord) 사이에 종종 지방조직의 격막-유사 배열이 들어간다. 이들은 임상적으로 다양한 크기의 매트리스형 "덩어리(lumps)"로써 나타나고, 듀피트렌 질환에서 결절(nodule)로 불린다. 이로 인해 손가락이 휘고, 손가락, 특히 소지, 약지의 기능이 손상될 수 있다. 듀피트렌 질환은 남성에서 우세하게 발생한다. 일반적으로 중년과 노인, 북유럽 혈통자, 어떤 만성질환, 예컨대 당뇨, 알콜중독 및 흡연이 있는 자에게서 발견된다.
듀피트렌 질환은 오랜 세월에 걸쳐 발생하는 지연성 진행성 질환으로 손가락의 중수수지(metacarpophalangeal, MP)와 근위지간(proximal interphalangeal, PIP) 관절에 고정된 굴곡기형을 야기한다. 소지, 약지에서 가장 자주 발병된다. 상기 질환은 세 단계를 거쳐 진행한다(Luck 등(1959) J. Bone Joint Surg., 41A:635-664). 초기 증식단계는 근섬유모세포로서 알려진 세포가 생기고 증식하기 시작하는, 수장근막(palmar fascia)내 결절형성을 특징으로 한다. 퇴행 또는 중기-질환 단계는 근섬유모세포증식 및 활성 III형 콜라겐 형성을 수반한다. 최종 또는 잔류기(residual phase)에서, 결절은 사라지고 무세포(acellular) 조직과 두꺼운 콜라겐 밴드가 남는다. I형 콜라겐에 대한 III형 콜라겐의 비율이 증가된다. 활성화가능한-기질분해효소로의 듀피트렌 질환의 치료는 전형적으로 중기-질환 및 잔류질환 단계에서이다.
c. 페로니병
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 페로니병을 치료하는데 사용될 수 있다. 페로니병은 무려 1-4%나 되는 남성에서 발병하고, 음경의 연조직에서 섬유성 플라크 성장을 포함하는 결합조직 장애이다. 콜라겐은 페로니병에서 상기 플라크의 주된 성분이다. 구체적으로, 섬유화 과정은 음경해면체(penile corpora cavernosa)를 둘러싸는 섬유외피(fibrous envelope)인, 백색막(tunica albuginea)에서 발생한다. 페로니병과 관련된 통증과 기형은 해면체라 불리는, 2개의 발기대(erectile rods), 방광으로부터 소변이 흐르는 통로인 통로(요도), 및 음경의 피부외층으로부터 해면체를 분리하는 막(tunica)이 발견되는 음경의 신체구조와 관련된다. 페로니병을 나타내는 사람은 막(tunica)과 이러한 피부외층(본원에서 "진피하"로서 언급됨) 사이에 플라크 또는 반흔 조직의 형성을 가질 것이다. 상기 막의 반흔 또는 플라크 축적은 막의 탄력성 원인을 감소시키고, 따라서 발병부위에서는, 주위의 비발병부위와 동일한 정도로(적어도) 늘어나지 않을 것이다. 따라서, 발기한 음경은 종종 약간의 관련된 통증과 함께, 반흔 또는 플라크 축적 방향으로 휘어진다. 페로니병의 거의 최소한 소견에서, 환자는 약간의 성기능장애를 가진다. 더 중증인 경우에, 성교가 불가능하거나, 실질적으로 엄두도 못 낼 만큼(prohibitive) 상당히 고통스럽다.
경험적인 증거는 남성인구 약 1%의 페로니병 발생률을 나타낸다. 상기 질환이 주로 중년남성에서 발생하나, 더 젊거나 나이든 남성도 걸릴 수 있다. 페니로니병을 가진 약 30%의 남성은 또한 신체의 다른 탄력조직, 예컨대 손 또는 발에서 섬유증(경화된 세포)이 생길 수 있다. 그러한 다른 상태의 일반적인 예는 손의 듀피트렌 구축증 및 발의 레더호스 섬유증을 포함한다.
d. 레더호스 섬유증
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 레더호스 섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다. 레더호스 섬유증은 섬유모세포 증식 및 콜라겐 침착으로 인한 섬유증이 발에 발생하는 점을 제외하고는, 듀피트렌 질환 및 페로니병과 유사한다. 레더호스 질환은 발의 발바닥 안쪽에 걸쳐서 발바닥 섬유화가 특징이며, 때때로 발바닥 섬유증으로써 언급된다.
e. 관절경직
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 관절경직, 예를 들어, 오십견을 치료하는데 사용될 수 있다. 오십견(유착관절낭염(adhesive capsulitis))은 어깨에서 통증 및 운동소실 또는 경직을 특징으로 하는 관절낭의 만성 섬유화(fibrozing) 상태이다. 이는 일반인의 약 2%에서 발병한다. 오십견은 증가된 섬유모세포 기질 합성에 기인한다. 상기 합성은 사이토카인 및 성장인자의 과잉생산을 유발하는 과도한 염증반응에 의해 초래된다. 섬유모세포 및 근섬유모세포는 어깨의 낭(capsule)내에 콜라겐, 특히 I형 및 III형 콜라겐의 치밀한 기질을 축적한다. 이는 반흔성의 위축된 어깨낭을 유발하고, 관절경직을 초래한다.
관절경직의 다른 예는 근골격 수술에서 기인한, 관절낭구축(capsular contracture), 유착관절낭염 및 관절섬유증(arthrofibrosis)에 의해 초래된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 관절경직은 관절, 예를 들어 무릎, 어깨, 팔꿈치, 발목 및 골반부의 관절을 포함한, 관절에서 발생할 수 있다. 오십견처럼, 그러한 관절 질환은 증가된 기질 합성 및 반흔 형성에 의해 야기된다. 관절경직은 필연적으로 발병된 부위의 관절연골로 전달되는 비정상적으로 높은 힘을 야기할 수 있다. 시간이 지남에 따라, 이러한 힘은 퇴행성 관절질환 및 관절염 발생을 야기한다. 예를 들어, 관절섬유증 및 관절낭구축에서, 섬유모세포는 국소외상, 예컨대 관절탈구에 반응하여 과도한 양의 기질을 형성한다.
f. 기존의 반흔
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 기존의 반흔을 치료하는데 사용될 수 있다. 콜라겐은 상처치유 과정과 자연노화 과정에서 특히 중요하고, 섬유모세포에 의해 생산된다. 그러나 어떤 경우, 과장된 치유반응은 엄청난 양의, 반흔조직이라고도 불리는, 치유조직(기저물질)의 생산을 유발할 수 있다. 예를 들어, 다양한 피부외상, 예컨대 화상, 수술, 감염, 상처 및 사고는 종종 콜라겐이 풍부한 섬유조직의 불규칙한 축적이 특징이다. 또한 종종 증가된 프로테오글리칸 함량이 있다. 손상되거나 파괴된 정상조직의 대체뿐만 아니라, 새 조직의 과도하고 흉한 침착이 치유과정 동안에 종종 생성된다. 과도한 콜라겐 축적은 콜라겐 합성과 콜라겐 분해간의 균형장애에 기인한다. 반흔 중에서, 예를 들어 힘줄의 만성 건병증 또는 반흔조직, 수술후 유착, 켈로이드, 비후성 반흔 및 함몰된 반흔이 포함된다.
i. 수술후 유착
수술후 유착은 기관 또는 조직이 반흔형성을 통해 서로간 부착하는 것으로, 이는 심각한 임상 문제를 초래할 수 있다. 수술 또는 조직손상 후 어떠한 반흔조직의 형성은 정상이다. 그러나, 어떤 경우, 반흔조직은 손상부위를 과도증식하여 수술후 유착을 만들고, 이는 발병된 신체부분의 정상적인 이동성 및 기능을 제한하는 경향이 있다. 특히, 섬유모세포 증식 및 기질 합성은 그러한 연조직 손상후에 국소적으로 증가된다. 그다음 신체가 치유반응을 유도함으로써 조직복구를 시도할 때, 유착이 형성된다. 예를 들어, 상기 치유과정은 둘 이상의 다른 건강한 분리된 구조 사이에(예컨대 복부수술후 장의 루프들(loops) 사이) 발생할 수 있다. 대안적으로, 말초신경에 국소외상 후, 섬유 유착이 형성되고, 정상운동 동안에 심한 통증을 유발할 수 있다.
ii . 켈로이드
켈로이드는 가장 일반적으로 외상후, 진피 및 인접한 피하조직내에 발생하는 과증식 덩이(hyperplastic masses)를 함유한 결합조직의 반흔이다. 켈로이드는 일반적으로 분홍 또는 적색 내지 암갈색으로 달라질 수 있는 섬유결절(fibrous nodules)이다. 켈로이드는 콜라겐의 과도증식의 결과로써 반흔조직에서 형성되고, 이는 상처복구에 참여한다. 켈로이드 부위는 국소피부 섬유모세포가 국소자극에 반응하여 격렬한 과형성(hyperplasia) 및 증식을 겪을 때 생성된다. 생성된 부위는 원래의 반흔보다 훨씬 더 큰 덩어리(lump)를 유발할 수 있다. 상처 또는 다른 외상의 결과로써 발생할 뿐만 아니라, 켈로이드는 또한 피어싱, 뾰루지, 스크래치, 심각한 여드름, 수두 반흔형성, 상처부위에 감염, 한 부위에 반복된 외상 또는 상처봉합 동안에 과도한 피부긴장으로부터 형성될 수 있다.
iii . 비후성 반흔
비후성 반흔은 상처부위에서 생성되는 높은(raised) 반흔이다. 이들은 일반적으로 원래 상처의 경계 이상으로 자라지 않는다. 켈로이드 반흔처럼, 비후성 반흔은 신체가 콜라겐을 과다생산한 결과이다.
iv . 함몰된 반흔
함몰된 반흔은 일반적으로 염증성 사건에서 기인하고, 피부수축이 특징이며, 미용적으로 불쾌하고 영구적인 반흔을 남긴다. 가장 일반적인 예는 염증성 여드름 후에 발생하는 반흔형성이다. 상기 함몰은 상처치유의 정상적인 결과로서 발생하며, 함몰을 초래하는 반흔조직은 섬유모세포 증식 및 대사에서 기인한 콜라겐으로 대부분 구성된다.
g. 피부경화증( Scleroderma )
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 피부경화증을 치료하는데 사용될 수 있다. 피부경화증은 콜라겐 비후(thickening)가 특징이다. 상기 질환의 더 일반적인 형태인 국소 피부경화증은 피부, 대개는 단지 몇 군데에서, 및 때때로 얼굴에서만 발병한다. 때때로 CREST 증후군으로 언급된다. 증상은 피부의 경화 및 관련된 반흔형성을 포함한다. 상기 피부는 또한 붉거나 비늘로 덮인(scaly) 것 같으며, 혈관이 더 잘 보일 수 있다. 더 심각한 경우, 피부경화증은 혈관 및 내부 장기에도 영향을 줄 수 있다. 광범위 피부경화증(Diffuse scleroderma)은 글골격, 폐, 위장관, 신장 및 기타 합병증으로 인한, 심장, 신장, 폐 또는 장 손상의 결과로써 치명적일 수 있다.
상기 상태는 탄력성 소실을 초래하는 콜라겐 축적(buildup)이 특징이다. 콜라겐 과다생산은 T 세포의 축적, 및 섬유모세포로부터 콜라겐 침착을 자극하는 사이토카인 및 다른 단백질의 생산을 유발하는, 자가면역 기능장애에 기인한다.
h. 림프부종( Lymphedema )
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 림프부종을 치료하는데 사용될 수 있다. 림프부종은 팔과 다리에 부종을 초래하는 림프액의 축적이다. 림프부종은 예를 들어, 림프선 섬유증(lymphostatic fibrosis), 경화(sclerosis) 및 유두종(papillomas)(양성 피부종양)과 같은 피부변화와 부종을 포함하도록 진행할 수 있다. 림프부종과 관련된 조직변화는 결합조직 세포, 예컨대 섬유모세포의 증식, 콜라겐 섬유의 생산, 지방축적 증가 및 섬유증 변화를 포함한다. 이러한 변화는 처음에 하지(lower extremities), 즉 손가락 및 발가락에서 발생한다. 림프부종은 사지의 확장정도에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 림프부종을 평가하는 하나의 방법은 관련된 및 관련되지 않은 사지의 네가지 비교점간에 2-cm 또는 3-cm 차이 확인에 기초한다.
i. 교원성 대장염
활성화가능한 기질-분해효소, 예컨대 본원에서 기술된 것들은 교원성 대장염을 치료하는데 사용될 수 있다. 교원성 대장염은 처음에 만성 수성설사로써 서술되었다(Lindstrom 등 (1976) Pathol. Eur., 11:87-89). 교원성 대장염은 점막 섬유모세포(fibroblasts)에 의한 콜라겐 생산과 콜라겐 분해 사이의 불균형에 의할 것 같은, 콜라겐 침착이 특징이다. 이는 분비성 설사를 유발한다. 교원성 대장염의 발생률은 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis)와 유사하다. 상기 질환은 100,000당 1.8의 연간 발생률 및 100,000당 15.7의 유병률을 가지며, 이는 원발성 담즙성 경화(100,000당 12.8)와 유사하고, 궤양성 대장염(100,000당 234), 크론병(100,000당 146) 또는 셀리악병(celiac disease)(100,000당 5)보다는 낮다. 만성설사 환자에서, 약 0.3 내지 5%는 교원성 대장염을 가진다. 교원성 대장염은 섬유모세포의 증식을 자주하여 콜라겐 축적을 증가시키는, 사이토카인 및 다른 인자들의 생산 증가를 유발하는 염증성 질환이다.
2. 척수병리( Spinal Pathologies )
ECM 또는 ECM 관련 질환은 또한 본원의 방법을 이용하여 치료될 수 있는, 전형적으로 추간판탈출(herniated disc) 또는 추간판팽윤(bulging discs)로써 언급되는, 척수병리를 포함한다. 이들은 돌출 및 탈출추간판을 포함한다. 돌출추간판은 무손상이나, 돌출된 것이다. 탈출추간판에서, 섬유 래퍼(wrapper)가 찢기고, 수핵(nucleus pulposus, NP)이 흘러나오지만, 여전히 추간판에 연결되어 있다. NP는 탈출증(herniation)의 원인이 아니나, NP는 신경을 압박하여 통증을 초래하는데 기여한다. NP는 히알루론산, 연골세포(chondrocytes), 아교원섬유(콜라겐 fibrils) 및 물을 끌어들이는 히알루론 장쇄를 가지는 프로테오글리칸 아글리칸(아글리칸s)을 함유한다. 각각의 히알루론 사슬에 콘드로이틴 설페이트 및 황산 케라탄의 측쇄가 부착된다.
추간판탈출은 화학적수핵용해(chemonucleolytic) 약물, 예컨대 카이모파파인 및 콜라게나제를 가지고, 전형적으로 상기 약물을 추간판 내로 국소도입함으로써 치료되어 왔다. 화학적수핵용해 약물은 NP의 하나 이상의 성분을 분해함으로써, 압력을 완화한다. 화학적수핵용해술은 돌출 및 탈출 추간판에 효과적이다. 화학적수핵용해술은 요추(하부 척추) 및 경추(상부 척추) 헤르니아를 치료하는데 사용되어 왔다. 본원의 방법을 위하여, NP의 구성요소를 분해하고 조건적으로 활성화되는 임의의 효소가 투여될 수 있다. 이러한 효소는 카텝신 L을 포함한다. 추가로, 조건적으로 활성화가능하지 않는 임의의 히알루로니다아제, 콜라게나제, 콘드로이티나제가 그렇게 되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이, 변형된 MMPs, 예컨대 본원에 기술된 바와 같이 변형된 MMP-1을 포함하는 온도민감성 효소가 본원의 방법에서 채택될 수 있다.
J. 실시예
다음의 예들은 예증 목적만을 위하여 포함된 것으로 발명의 범위를 제한하고자 함은 아니다.
실시예 1
활성화된 재조합 카텝신-L의 제조
히스티딘(His)-표지된 정제 재조합 인간 카텝신-L을 R&D 시스템스(Minneapolis, MN. Cat# 952-CY)로부터 구입하여 50mM 아세테이트, pH 4.0, 100mM NaCl에서 0.9mg/mL 농도로 제형화하였다. 500μL씩 분액하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
사용전에 보관된 분액의 농축 및 완충액-교환을 수행하였다. 요약하면, 0.9mg/mL의 카텝신-L 2mL을 얼음위에서 녹이고, 30KDa 차단(cut-off)의 4마이크로컨 원심분리용 필터 막 튜브(Millipore; Bedford, MA, Cat#42410)로 옮겼다. 마이크로컨 튜브를 9000rpm에서 5분 동안 회전시켜 최종부피 50μL를 얻었다. 냉각된 농축완충액 450μL(100mM Na-포메이트(Formate) pH 4, 100mM NaCl, 5mM DTT, 10mM EDTA)를 각각의 마이크론 튜브에 첨가하였다. 과정중에 5mM DTT의 첨가는 카텝신-L을 SDS-PAGE로 측정되는 대략 36KDa의 단쇄 단백질로 전환시킨다. 농축 및 완충액-교환 단계는 억제성 10-16KDa 프로-펩티드를 제거한다. 게다가, 농축 및 완충액-교환 동안에 첨가된 DTT와 EDTA는 카텝신-L의 단백질 가수분해를 최소화한다. 원심분리 과정을 3회 반복하였다. 카텝신-L은 온도에 민감하므로 분해를 최소화하고자 튜브 및 농축용액을 냉각시켰다. 최종회전 후에 마이크로컨 튜브를 뒤집고, 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 액체를 농축(retentate)컵에 수확하였다. 회수된 최종부피는 400μL로, 5배 농축되었다. 농축된 카텝신-L을 67μL 부피로 분액하였고, 이는 대략 300μg의 활성화된 효소를 함유하였다. 분액을 -80℃에 보관하고, 사용전에 얼음위에서 녹였다.
사용전에, pH 5에서 하나의 분액을 MES 완충용액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) 3mL에 첨가함으로써 카텝신-L을 최적 pH 5에서 제형화하여, 최종농도 100μg/mL의 활성화된 카텝신-L을 얻었다. 대조군으로서, 상기 효소가 최소한으로 활성인 pH 7.4에서 카텝신-L을 HEPES 완충액으로 제형화하였다.
실시예 2
히드록시프롤린 분석
카텝신-L로 관류한 이후에 피부시료에서 콜라겐 함량 변화를 측정하기 위해 히드록시프롤린 분석을 이용하였다. 다른 단백질의 히드록시프롤린 함량은 미미한 반면, 콜라겐은 히드록시프롤린을 약 8% 농도로 함유한다(TV. Burjanadze, 콜라겐 열안정성과 관련한 히드록시프롤린의 함량 및 위치. Biopolymers 18:4931-4938(2002)). 히드록시프롤린(HP) 분석은 Reddy 및 Enwemeka의 방법(Clinical Biochemistry 29:225-229(1996))을 변형하여 사용하였다.
특히, 표준 서모사이클러(thermocycler)(Eppenforf Mastercycler, Westbury, NY)에서 8-웰 0.2mL 스트립 튜브(Brandtech, Essex, CT)내에서 반응의 완료를 위해 시약의 부피를 변경하였다. 가수분해, 산성화 및 에를리히 시약(Ehrlich's reagent)으로 검출을 포함한 모든 단계를 0.2mL 튜브에서 수행하였다. 모든 화학물질을 시그마(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 요약하면, 관류실험으로부터의 관류액 시료를 5배 부피의 200proof 에탄올로 침전시킴으로써 추출하고 원심분리하였다. 수확된 관류액의 부피는 1mL 또는 200μL 피펫을 이용하여 측정하였다. 라벨을 붙인 15mL 코니칼 원심분리용 튜브로 관류액을 옮겼다. 에탄올 관류액 혼합물을 에펜도르프 스윙잉 버킷 원심분리기에서 3000rpm으로 10분 동안 원심분리하기 전에 -80℃ 냉동고에서 30분간 보관하였다. 원심분리 후에, 펠렛의 크기에 따라 침전물을 2N NaOH 150-400μL에 용해하였다. 상청액을 동결건조기에서 건조시키고, 2N NaOH 150-200μL에 용해하였다. NaOH에서 용해한 후에, 시료를 튜브당 200μL 이하의 부피로 8-웰 스트립 튜브로 옮기고, 콜라겐의 완전한 가수분해 및 히드록시프롤린의 방출을 위하여 서모사이클러에서 99℃로 12시간 동안 가수분해하였다. 시료를 진한 HCl(가수분해된 시료 25μL당 HCl 5.2μL)으로 산성화시켰다. 히드록시프롤린의 산화를 완료하기 위해 클로라민-T(Sigma; Cat# C9887) 60μL를 동일부피의 산성화 가수분해물에 첨가하였다. 완전히 산화된 후에, 에를리히 시약(Sigma, Saint Louis, MO, Cat# 39070(Fluka)) 120μL를 첨가하고 65℃에서 25분간 배양한 결과, 자색으로 변하였다. 색상강도는 관류액에서 방출된 콜라겐에서 유래한 히드록시프롤린의 양에 좌우된다. Spectramax 2E 플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 550nm의 가시범위에서 시료를 측정하였다. 정제된 히드록시프롤린 용액(Sigma, Saint Louis, MO, Cat# H54409)을 이용하여 검정곡선을 작성하고, 피부시료 중의 히드록시프롤린 함량을 검정곡선으로부터 결정하였다.
실시예 3
생체외 랫트 피부외식편에 활성화된 카텝신 -L의 관류에 의한 콜라겐 분해
2% 이소플루오란으로 마취한 3개월령 수컷 Sprague-Dawley 랫트(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)의 등외측쪽 부위로부터 피부외식편(explants)(2cm x 2cm)을 수술로 제거하였다. 외식편을 100mm 페트리디쉬에 붙인 스티로폼 패드에 바늘로 고정하고, 온열패드(heating pad)로 37℃를 유지하였다. 주입펌프(Thermo Orion, model M361, Boston, MA)를 이용하여, pH 5 MES 완충액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) 및 2500유닛/mL rHuPH20(rHuPH20 Halozyme internal manufacturing lot# 056-100; 비활성도(specific activity):124,000U/mL 및 단백질함량 1.05mg/mL)을 함유한 용액 6mL을 외식편의 진피층으로 삽입된 27-게이지 버터플라이 니들을 거쳐 피부외식편을 통하여 35분간 먼저 관류하였다. 산성 관류를 완료한 후에, pH 5 MES 완충액 내 활성화된 카텝신-L, 또는 pH 7.4 HEPES 완충액 내 대조군 카텝신-L 100μg/mL과 함께 또는 없이 피부외식편을 약 30분간 관류하였다. 관류 전과정 동안 5-10분의 시간 간격으로 200μL 마이크로피펫으로 흡입(aspiration)하고 그 내용물을 1.5mL 에펜도르프 튜브에 수확함으로써 분획을 수확하였다. 실시예 2에서 기술된 바와 같이 히드록시프롤린(GP) 분석을 수행할 때까지 분획을 에펜도르프 튜브에 모으고 재빨리 동결시켰다.
3개의 다른 실험들의 결과는 최적 pH 5에서 활성화된 카텝신-L로 관류된 시료에서만 HP수준이 유의적으로 증가되었음을 보여준다. 평균(n=3) HP 수준은 약 6분에서 관류액의 1μg/mL 미만으로부터 약 30분에서 관류액의 30μg/mL 초과로 증가되었다. pH 5 MES 완충액만; pH 7.4 HEPES 완충액만; 및 pH 7.4 대조군 카텝신-L을 주입한 관류액에서는 HP가 전혀 없거나 거의 없는 것으로 측정되었다.
실시예 4
생체외 돼지 피부외식편에 활성화된 카텝신 -L의 관류에 의한 콜라겐 분해
3개월령 암컷 Yorkshire 돼지(S and S Farm, Ramona, CA)를 하룻밤(overnight) 동안 절식시키고 케타민(20mg/kg)/자일라진(2mg/kg) 및 아트로핀(0.04mg/kg)을 근육내 주사하여 마취하였다. 그다음 동물에 삽관하고, 산소(Airgas, San Diego, CA) 중 2% 흡입 이소플루오란(Baxter, Deerfield, IL)으로 마취를 유지하였다. 전체 피부외식편(5cm x 5cm)을 동물의 등으로부터 수술로 제거하여 4℃에서 인산염완충식염수(PBS)에 놓고, 절제한 후 2시간 이내에 사용하였다. 돼지 피부외식편을 pH 5 MES 완충액 또는 PH20 부재의 카텝신-L 100μg/ml를 함유한 pH 5 MES 완충액으로 관류한 점을 제외하고, 실시예 3에서 기술한 바와 같이 외식편의 관류 및 히드록시프롤린 분석을 기본적으로 수행하였다. 초기에, 외식편을 pH 5 MES 완충액 6mL로 약 30분간 관류하고, 분획을 매 5-10분마다 수확하였다. 그 후에, 외식편을 카텝신-L 100μg/ml를 함유한 pH5 MES 완충액 3mL 또는 대조군으로서 완충액 단독으로 외식편을 관류하고 약 25분간 매 5분마다 수확하였다. HP 분석은 카텝신-L로 관류한 시료에서 시간-의존적인 HP 수준의 증가를 보였다. 카텝신-L이 부재한 pH 5 MES 완충액으로 관류한 시료에서는 HP가 검출되지 않았다. 15분에서 최고 수준의 HP가 측정되었다. 25분에서 측정된 HP 수준은 15분에서 측정된 HP 수준과 유사하였다.
실시예 5
돼지 외식편에 활성화된 카텝신-L의 관류에 의한
피하 공간에서 섬유성 격막의 감소
실시예 4에서 기술한 바와 같이 2500유닛/mL rHuPH20를 함유하는 pH 5 MES 완충액으로 돼지 피부외식편을 분당 0.17mL 속도로 30분간의 관류를 기본적으로 진행한 다음, rHuPH20 부재 100μg/ml 카텝신-L의 pH 5 MES 완충액 3mL로 0.12mL/분 속도로 25분간 관류하였다. 카텝신-L의 주입이후에, 외식편을 작은 조각으로 자르고, 4% 완충 포르말린으로 하룻밤 동안 고정하였다. 미처리 돼지 외식편 대조군도 유사하게 진행하였다. 조직을 PBS로 세척하고, 단계별 에탄올 및 크실렌 용액으로 탈수하고, 파라핀으로 포매하였다. 블록을 4μm 박편으로 절단하고 현미경 슬라이드로 옮겨서 콜라겐의 가시화를 위해 마센트리크롬 염색(Masson's Trichrome staining)을 하였다. 간단히, 절편을 탈파라핀화하고, 증류수로 탈수시키고, 매염제 Bouin's 용액(Sigma, Cat #HT10-132)으로 56℃에서 15분 내지 30분 동안 처리하였다. 절편을 냉각시키고 황색이 사라질 때까지 유수(running water)로 세척하고 증류수로 씻어냈다. 그다음 절편을 Weigert's Iron 헤마톡실린 작용액(Sigma Cat # HT107 and HT109)으로 5분간 염색하고, 유수로 10분간 세척하였다. 절편을 탈이온화수로 5분간 씻어내고, Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin(Sigma, Cat # HT151)에 5분간 놓아두었다. 절편을 작용 인텅스텐/인몰리부덴 산용액(Working Phosphotungstic/ Phosphomolybdic Acid solution; Sigma Cat # HT152 및 HT153)으로 옮기고, 최종적으로 아닐린블루(Aniline Blue) 용액(Sigma Cat # HT154)으로 5분간 염색하고 1% 아세트산으로 2분간 분화시켰다. 절편을 증류수로 씻어내고, 95% 알콜 및 무수알콜로 탈수하고, 2변화를 갖는 크실렌내에서 투명화하였다. 절편을 봉입하고 니콘 도립현미경으로 관찰하였다. SPOT 어드밴스 이미징 프로그램을 포함한 카메라 스캐너가 연결된 니콘 형광현미경(Diagnostic Instrument Inc., Sterling Heights, MI)으로 20x 오브젝티브를 이용하여 이미지를 얻었다.
피하조직(hypodermis)은 주로 지방조직을 함유한다. 콜라겐 섬유성 격막으로 만들어진 치밀한 결합조직 스트랜드는 진피 깊은 곳에서 피하조직으로 확장되고 밑에 있는(underlying) 구조에 피부를 고정시킨다. 조직학 결과는 지방세포 챔버(chambers)를 분리하는 섬유성 격막이 미처리 시료의 피하조직 도처에서 보이고 있음을 나타내고 있다. pH 5 MES 완충액 중의 카텝신-L을 처리한 후에, 콜라겐 섬유성 격막의 수는 미처리 시료에서보다도 실질적으로 더 적었으며, 이는 카텝신-L의 처리가 피하조직내 콜라겐 네트워크 조직을 크게 변화시킴을 의미한다.
실시예 6
A. 살아있는 마취된 랫트의 피부에서의 콜라겐 분해
관류실험을 2% 이소플루오란 마취하에 3개월령 수컷 Sprague-Dawley 랫트(Harlan Sprague-Dawley, Inc. Indianapolis, IN)에서 수행하였다. 관류실험은 pH 5에서 카텝신-L과 특이성을 위한 대조군으로서 pH 7.4에서 HEPES 완충액을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 주입펌프를 이용하여, 25mM pH 5 MES 완충액 또는 25mM pH 7.4 HEPES 완충액, 및 rHuPH20 2500유닛/ml(Halozyme internal manufacturing lot# 056-100, 비활성도 124,000U/mL, 단백질 함량 1.05mg/mL)를 함유하는 용액 약 15mL을 피부의 진피층으로 삽입된 27-게이지 버터플라이 니들을 이용하여 꼬리피부를 통하여 약 60분간 최초 관류하였다. 그 후에 카텝신-L 또는 완충액 대조군을 함유한 용액 3mL을 25분간 관류하였다. 관류용액을 함유한 Cat-L은 최적 pH 5의 5mM MES에서 또는 대조군 pH 7.4의 20mM HEPES에서 활성화된 Cat-L 100μg/mL을 함유하였다. pH 5 완충액의 이온강도를 25mM로부터 5mM로 낮추어 국소조직 환경에 의한 pH의 중화를 용이하고, 이에 의해 활성효소의 확산을 제한하였다. pH 7.4에서 HEPES 완충액내 Cat-L의 경우에는, pH 4에서 이온강도가 큰 완충액내 활성화되고, 제형화된, 첨가된 Cat-L이 HEPES 완충액(pH 7.4)의 pH를 실질적으로 변화시키지 않도록 하기 위해 적어도 20mM의 이온강도를 유지하였다. Cat-L을 첨가한 결과, 용액의 pH가 확실히 pH 7.4에 근접한지를 확인하기 위해 20mM pH 7.4 HEPES에 첨가된 Cat-L의 소분액을 pH 시험지로 확인하였다. 관류에 사용된 완충액 대조군 용액은 효소가 첨가되지 않은 5mM pH 5 MES 또는 20mM pH 7.4 HEPES이었다. 일정시간 간격으로, 즉 초기 관류 동안 24분, 40분, 60분에서와, Cat-L로 관류 동안 8분, 25분에서 꼬리피부로부터 관류액 분획을 수확하였다. 에펜도르프 튜브에 분획을 모으고 추가 효소작용을 방지하기 위해 재빨리 동결시켰다. 실시예 2에서 기술한 바와 같이 히드록시프롤린 분석을 수행하였다. 그 결과는 HP가 활성화된 카텝신-L로 관류된 시료에서만 측정될 수 있음을 보여준다. HP의 최고 수준은 25분 관류액 시료에서 측정되었다. pH 5 MES 완충액 단독으로, 또는 pH 7.4 HEPES 완충액 단독으로, 또는 pH 7.4 HEPES 완충액 중의 카텝신-L로 관류된 시료에서는 HP가 검출되지 않았다.
B. 카텝신 -L 처리는 시험관내에서 콜라겐의 pH -의존적인 분해를 유도한다
카텝신 B, D, L, S 와 박테리아 콜라게나제의 랫트 콜라겐 분해를 pH 5.0과 pH 8.0에서 평가하였다. 카텝신 B, D, L 및 S는 R&D 시스템스에서 구입하고, 각각의 효소들을 효소 제조사의 각각의 설명서에 기반하여 활성화시켰다. 박테리아 콜라게나제는 시그마 케미칼스로부터 구입하였고, 활성화를 요구하지 않는다. 가용성 랫트 꼬리 콜라겐 I형을 제조사의 특정한 완충액에서 또는 트리스 pH 8.0 완충식염수에서 활성화된 카텝신 B, D, L 또는 S, 또는 박테리아 콜라게나제와 배양하여 37℃에서 1시간 동안 소화시킨 후, SDS-PAGE 겔 및 쿠마시블루 염색을 수행하였다. 다른 카텝신들도 pH 5가 아닌 제조사의 특정 pH 및 완충액에서 측정하였다. 그 결과는 카텝신-L이 pH 5.0에서는 활성이나, pH 8.0에서는 불활성인 유일한 효소였음을 보여주고 있다. 카텝신 B, D 및 S는 제조사의 특정 pH 5.0에서 랫트 콜라겐을 다소 분해하고 pH 8.0에서는 랫트 콜라겐을 분해하지 않는 반면, 박테리아 콜라게나제는 pH 5.0과 pH 8.0 둘 다에서 랫트 콜라겐을 분해하였음을 보여주었다.
실시예 7
A. 살아있는 랫트 피부의 산성화 이후 중성으로의 복귀
묽은 수성 산용액을 피부간질(interstitium)으로 주사할 때, 간질의 유의한 완충능 때문에 pH 변화는 일시적이고, 피부의 중성 pH는 빠르게 회복된다. 페놀레드를 간질 pH의 가시적인 지표로서 사용하였다. 페놀레드의 나트륨염은 중성으로부터 산성 pH값으로의 변화를 확인하기 위해 세포배양 배지에서 널리 이용되고 있다. 페놀레드 용액은 pH 6.4 이하에서는 황색, pH 7.0에서는 오렌지색, pH 7.4 이상에서는 적색, pH 7.8에서는 자색이다.
3개월령 Sprague-Dawley 랫트(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)를 2% 이소플루오란 마취하 유지시켰다. 페놀레드 염색제를 쉽게 볼 수 있도록 피부를 면도하였다. rHuPH20 500U/ml을 함유한 25mM pH 5 MES 완충액 2-2.5mL을 진피층으로 삽입된 27-게이지 버터플라이 니들을 거쳐 꼬리피부 안으로 관류하였다. 다음은 10mM, 25mM, 50mM 및 100mM pH 5 MES 완충액내 0.05% 페놀레드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat# P0290) 1-1.5mL 용액이었다. MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(C16H13NO4A))는 195.2의 분자량을 가진다. rHuPH20는 페놀레드 용액에 포함되지 않았다. 마이크로칼리퍼를 이용하여 2차원으로 다른 시간대에서 페놀레드 영역(front)을 측정하고, 다음의 공식을 이용하여 면적을 계산하였다: 면적=(D1xD2)xπ/4. 색상의 변화를 관찰하고, 중성으로 복귀되는 시간을 기록하였다. 표 4A는 중성으로 복귀되는 평균시간(분)을 요약하고, 중성으로의 복귀가 완충액의 이온강도에 의해 조절될 수 있음을 나타내는 결과이다.
[표 4A] 중성으로의 평균시간
Figure pct00012
B. 마우스 피부의 산성화 이후에 중성으로의 복귀
중성으로 복귀시간 및 그 후의 카텝신-L의 불활성화는 주입된 완충액의 강도에 좌우된다. 누드마우스에서 완충액 세기(10-100mM MES)를 증가시키면서 pH 5.0에서 페놀레드 지시약을 이용하여 중화 복귀시간을 측정함으로써 간질의 고유 완충능을 평가하였다. 마취된 누드마우스에 페놀레드를 함유한 pH 5 MES 완충액(10mM 내지 100mM) 0.125mL을 주사하였다. 진피에서 페놀레드 중화시간을 가시적으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4B에 도시하였다.
[표 4B] 마우스 피부에서 간질 완충용량 측정
Figure pct00013
따라서, 완충액 세기를 증가시키면서(10-100mM pH 5.0 MES) pH 지시약을 진피 내로 주입함으로써, 1-20분/100mm2 주입으로부터 산성의 일시적이고(temporal)-공간적인(spatial) 세포외 환경이 얻어질 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 8
재조합 인간 간 카텝신 -L의 제작
인간 Cat-L cDNA 서열번호:9(서열번호:10에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화) 및 Cat-L-His cDNA 서열번호:12(서열번호:13에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화)를 인간 신장 프로카텝신-L cDNA의 공개된 서열 데이터에 따라 설계된 프라이머를 이용하여 인간 간 cDNA(Clonetech QUICK-Clone cDNA 637205)로부터 PCR 증폭하였다. 5'NheI 및 3'BamHI 제한효소 절단부위를 PCR 프라이머 합성을 위한 부분으로서 첨가하였다. 증폭에 사용한 프라이머는 표 5에 기재되어 있다.
[표 5] 프라이머
Figure pct00014
두 cDNA 기반의 구축물은 공통코작서열(consensus Kozak sequence)을 형성하도록 단일염기가 변이된 천연 Cat-L 분비성 리더 펩티드(native Cat-L secretory leader peptide)의 두번째 아미노산을 가지고 있기 때문에, 두번째 아미노산이 N에서 D로 변경된다(서열번호:9 및 12에 기재된 바와 같음). 표준 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 서열 분석으로 클론의 정체를 확인하였다.
클로닝을 위해 생성된 증폭된 산물을 HZ24(b/s) 발현벡터 내로 도입하였다. 발현벡터는 엔세파로미오카디티스(encephalomyocarditis) 바이러스로부터 내부 리보솜성 부착부위(internal ribosomal entry site, IRES)에 의해 분리되는 카텝신-L 단백질 및 뮤린 DHFR 유전자 둘다의 발현을 위한 CMV-기반 바이-시스트로닉(bi-cistronic) 카세트이다. 상기 HZ24-Cat-L 발현벡터의 생성 서열은 서열번호:11에 기재되어 있다. HZ24-Cat-L-His 발현벡터의 서열은 서열번호:14에 기재되어 있다.
Cat-L 및 Cat-L-His 발현 플라스미드 모두를 Genejuice 트랜스펙션 시약(EMD Biosciences, San Diego, CA, cat# 70967)을 이용하여 CHO-S 세포(무혈청 현탁배양에 적응된 CHO-K1 세포, Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 내로 트랜스펙션으로 도입하였다. 상기 발현 플라스미드를 또한 화학적으로 규명된(chemically defined), 동물산물-부재(free)인 배지(Invitrogen, Cat #10743-029)에서 현탁배양으로 성장하도록 적응된 DG44 CHO 세포(Dr. Lawrence Chasin, Columbia University로부터 라이센스에 의해 확보)내에 전기천공(electroporation)으로 도입하였다. 전기천공을 위해, 100μg 초과의 ClaI 선형화(linearized) 플라스미드를 각각의 플라스미드의 각각의 전기천공을 위해 사용하였다. 350볼트 정전압에서, 전기천공당 20백만개의 DG44 CHO 세포를 트랜스펙션하였다. 전기천공 완충액은 2X HeBS(pH 7.0 40mM HEPES; 274mM NaCl; 10mM KCl; 1.4mM Na2HPO4; 12mM 덱스트로즈)를 함유하였다. DHFR 플라스미드를 보유한 세포들을 선별하기 위하여 나트륨 하이포크산틴 및 티미딘 부재의 표준 CD-CHO 배지(Invitrogen #12610-010)에서 전기천공 72시간 후에 한계희석법으로 트랜스펙션된 세포를 클론하였다. 나트륨 하이포크산틴 및 티미딘 부재에서 성장하는 선별된 클론들을 메토트렉세이트를 이용한 증폭으로 추가 서브-클론하여 삽입 카피수를 증가시켰다. Mock 트랜스펙션이 음성대조군으로서 제공되었다.
트랜스펙션 72시간 후에 상청액을 수확하고, 1500rpm에서 5분 동안 회전시켰다. His-Cat-L, Cat-L 및 mock으로 트랜스펙션된 CHO-S와 CHO-DG44 세포로부터의 세포부재 상청액을 10kDa 차단 마이크론 원심분리 농축기(Millipore; Bedford, MA. Cat# 42407)에 적용하고, 4℃에서 12000rpm으로 원심분리하여 약 10배 농축하였다. 조직배양 상청액 내로 분비된 재조합 인간 카텝신-L을 capture ELISA(Calbiochem 카텝신-L ELISA Kit #QIA94), 실시예 10에서 기술된 바와 같이 단일클론 Mab 33/1(Bender MedSystems, Burlingame, CA)을 이용한 웨스턴블롯(Western Blot) 분석, 및 실시예 9에서 기술된 바와 같이 효소활성을 위해 형광펩티드 기질(Z-L-R-AMC)을 이용하여 스크리닝하였다.
실시예 9
형광생성 펩티드 기질을 이용한 카텝신 -L의 효소활성 측정
카텝신-L의 효소활성은 Z-Leu-Arg-AMC(Z=:N-카르보벤질옥시; AMC: 7-아미노-4-메틸 쿠마린, R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat# ES008)로 명명된 상업적으로 입수가능한 형광생성 기질을 이용하여 측정하였다. 상기 펩티드 기질은 자신의 아미노기와 Arg 잔기의 카르복실기 사이에 형성되는 아미드결합에 의해 소광되는(quenched) 고형광의 7-아미노-4-메틸 쿠마린 그룹(AMC)을 함유한다. 활성화된 카텝신-L은 상기 아미드결합을 절단하여 방출된 형광의 증가를 유발한다. 상기 펩티드 기질은 다른 카텝신들에 의해서 절단될 수 있고, 이들 중에서 카텝신-B이 현저한 데 반하여, 카텝신-L 활성을 카텝신-B에 대한 적절한 특이적 억제제를 사용하여, 상기 억제제의 존재시와 부재시의 활성을 측정함으로써 특이적으로 결정하였다. 구체적으로, 최종농도 1μM의 상기 선택적 카텝신-B 억제제 CA-074(Calbiochem, San Diego, CA, Cat# 205530)를 사용하였고, CA-074 존재시와 부재시에 시료를 측정하였다. CHO 세포에서 트랜스펙션 72시간 후의 세포배양 상청액에 농축된 pH 5 MES 완충액을 첨가하여 pH 5로 조정하고, 얼음위에서 30분 동안 배양하였다. 이러한 산 활성화 단계는 프로-펩티드를 절단하여 성숙한 카텝신-L을 생성한다. 카텝신-L 효소활성의 강력한 억제제인 프로펩티드 절편을 희석하기 위하여(Carmona, E. 등 카텝신-L 프로펩티드의 시스테인 프로테아제 억제제로서의 효능과 선택성. Biochemistry 35:8149-8157(1996)), 시료를 농축하고, 30KDa 마이크론 튜브에서 50mM pH 5 MES 완충액으로 3회 완충액-교환하였다. 그다음 Z-AMC 기질에 대한 형광생성 펩티드 기질 분석에 의해 시료의 효소활성을 측정하였다.
카텝신-L의 상업적인 제제(R&D Systems; Cat# 952-CY)를 상기 시료의 그것과 유사한 방법으로 활성화시키고, 계열희석(serial dilution)에 의하여 표준물로서 사용하였다. 활성화 이후에, 시료 및 표준물을 불투명 보텀 마이크로플레이트에서 5mM DTT 및 10mM EDTA를 함유한 100mM pH 5 MES 완충액으로 계열희석하고, 형광생성 펩티드 기질 Z-AMC와 37℃에서 30분간 배양하였다. 시료 또는 표준물과 병용할 때, Z-AMC 기질은 총부피 200μL에서 최종농도 10μM로 사용하였다.
생성되는 형광을 형광 플레이트 리더기(Molecular Devices, SpectraMax 3, Sunnyvale, CA)에서 기질에 대해 권장된 최적의 여기-발광(380nm-460nm) 밴드에서 판독하였다. 표준물의 희석시리즈로부터 얻은 상대적인 형광단위(RFU)값으로부터 그린 검정곡선으로부터 시료값을 산출하였다. Softmax® 소프트웨어(Molecular Devices, SpectraMax 3, Sunnyvale, CA)로 4-파라미터 조화(fit) 후, 검정곡선은 10-100ng/mL의 농도범위 사이에서 유사-선형(pseudo-linear)이었다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 상기 선택적 카텝신-B 억제제 CA-074 존재하에 측정된, CHO-S 트랜스펙션 세포의 카텝신-L의 활성은 mock 트랜스펙션 숙주세포의 백그라운드 활성보다 적어도 10-20배 더 높았다. 따라서 카텝신-L 트랜스펙션된 조직배양 배지에서 증가된 효소활성은 Cat-L 특이적 활성으로 간주될 수 있다.
[표 6] 트랜스펙션 72시간후 트랜스펙션된 세포에서 Z- AMC 분석에 의한 카텝신 -B 존재시 Cat -L 효소활성 측정
Figure pct00015
실시예 10
발현된 인간 재조합 카텝신 -L의 웨스턴블롯 분석
실시예 8에서 기술된 바와 같이 세포부재 상청액의 발현 및 농축 이후에, 발현을 확인하기 위해 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 요약하면, 6개의 다른 시료(CHO-S 또는 CHO-DG44 세포 각각의 cat-L, cat-L-His 및 mock) 각각에 대하여, 농축된 상청액 30μL와 SDS-PAGE(EMD Bioscience, San Diego, CA, cat# 70607-3)를 위한 4X(겔로딩완충액 대신) 10μL 및 100mM DTT 2μL를 혼합하고, 80℃에서 20분간 배양하였다. 양성대조군으로서, 1X PBS 30μL 중의 상업용 정제된 재조합 카텝신-L(R&D Systems) 750ng을 포함시켜서 동일하게 진행하였다. 시료의 총부피(42μL)를 4-20% 트리스-글리신 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat# EC6028BOX) 상에 로딩하고, 미리 염색된 분자량 마커(Invitrogen, Cat# LC5925) 앞쪽의 염색제가 겔 하단에 도달할 때까지 트리스-글리신 SDS 전기영동용 완충액(running buffer)으로 전기영동을 수행하였다. 제조사의 설명서에 따라 I-Blot 세미드라이 블롯팅 기구(Invitrogen, Cat# IB1001)에 의해 단백질을 PVDF 막으로 트랜스퍼하였다. 겔에서 미리 염색된 마커밴드의 색상이 거의 완전히 사라진 것으로 트랜스퍼를 확인하였다. 막을 PBS내 5% 탈지분유로 이루어진 블로커 완충액으로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 블로커에서 최종농도 1μg/mL로 사용되는 인간 카텝신-L(Bender MedSystems, Burlingame, CA, Cat# BMS 166)에 대한 마우스 단일클론항체(Mab 33/1)로 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 블로커에서 33ng/mL 농도로 사용되는 HRP 접합 염소 항-마우스 IgG(Calbiochem, San Diego, CA, Cat# DC02L)으로 실온에서 1시간 동안 배양하여 카텝신-L을 검출하였다. HRP 시그널을 TMB Insoluble(Calbiochem, Cat# 613548) 막 현상용액으로 현상하고, 실온에서 30분 후에 반응을 중단시켰다.
웨스턴블롯 분석은 Cat-L에 특이적인 단백질 밴드를 보여주었다. Mock 트랜스펙션된 세포에서는 특이밴드가 검출되지 않았다. Cat-L 및 His-Cat-L의 발현수준은 DG44 세포보다도 CHO-S 세포에서 더 높은 것으로 나타났으며, 아마도 두 세포주의 트랜스펙션 효율 때문일 것이다. 웨스턴블롯 분석 결과는 실시예 9에서 기술된 형광생성 펩티드 기질 Z-AMC로 효소활성을 분석한 결과와 일치하였다. CHO-S 및 DG44에서 발현된 카텝신-L의 분자량은 상기 프로펩티드를 여전히 함유한 단백질의 예상크기에 상응하는 44-45KDa이다. 양성대조군으로서 사용된 상업용 카텝신(R&D Systems)의 분자량은 성숙한 카텝신-L의 36KDa이었다. 트랜스펙션된 CHO-S 및 CHO-DG44 세포에서 발현된 단백질과 상업용 카텝신-L 사이에서의 크기 차이는 숙주세포 특이적인 글리코실화의 차이 또는 상업용 카텝신-L로부터의 프로펩티드 제거 때문일 것이다.
실시예 11
A. 합성 카텝신 -L 및 카텝신 -L- His 의 생산
성숙한 인간 카텝신-L(GenBank 접근번호.EAW62736의 아미노산 18-333; 서열번호:1의)을 코드화하는 DNA 구축물을 CHO 세포를 위한 코돈최적화(codon optimization)를 이용하여 합성하였다. 코돈최적화는 Blue Heron Biotech(blueheronbio.com)에 의해 목록화된 중국 햄스터(Cricetulus griseus)에 대한 코돈최적화 표에 기초하였다. 재조합 단백질이 조직배양 상청액 내로 분비될 수 있도록 상기 구축물을 인간 카파 IgG 유전자 패밀리(서열번호:2)로부터 설계된 이종(heterologous) 시그널 펩티드를 함유하도록 합성하였다. 최적화된 카텝신-L 구축물의 뉴클레오티드 서열은 서열번호:3에 기재되어 있으며, 서열번호 4에 기재된 폴리펩티드를 코드화한다. 5'Nhe I 제한효소 절단부위 및 3'BamH I 제한효소 절단부위를 구축물 합성의 일부로서 포함시켰다. 그다음 합성 구축물을 실시예 8에서 기술된 바와 같이 HZ24(b/s) 발현벡터 내로 도입하였다. 합성 Cat-L 발현벡터를 HZ24(B/S)-CAT-L로서 명명하고, 서열번호:5에 기재하였다. 링커(GGGGSG; 서열번호:15)에 의해 분리되는 C-말단 6 히스티딘 태그를 함유하는 또 다른 Cat-L 구축물도 합성하였다. 합성된 Cat-L-His 구축물의 뉴클레오티드 서열은 서열번호:6에 기재되어 있으며, 서열번호:7에 기재된 폴리펩티드를 코드화한다. 상기 구축물은 또한 구축물 합성의 일부로서 포함된 5'Nhe I 및 3'BamH I 제한효소 절단부위를 포함하고, HZ24(b/s) 발현벡터 내로 도입하였다. 합성 Cat-L-His 발현벡터를 HZ24(B/S)-CAT-L-His로서 명명하고, 서열번호:8에 기재하였다.
서열번호:5에 기재된 합성 Cat-L 발현벡터 및 서열번호:8에 기재된 합성 Cat-L-His 발현벡터를 실시예 9에서 기술된 바와 같이 전기천공에 의해 CHO-DG44 세포 내로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 72시간 이후에 상청액을 수확하고, 비-활성화된 카텝신-L을 생산하기 위해 실시예 8에서 기술된 바와 같이(pH 조정 없이) 처리하였다.
조직배양 상청액을 또한 카텝신-L의 활성화가 유발되도록 처리하였다. 이는 카텝신-L의 프로펩티드를 절단하여, 효소의 활성화를 유발하는, 낮은 pH를 이용하여 달성하였다. 합성 구축물로 트랜스펙션된 세포 및 비-트랜스펙션된 대조군 세포의 상청액을 농축된 산 완충액(1000mM pH 4 포르메이트, 1000mM NaCl, 50mM DTT, 100mM EDTA)을 상기 상청액에 각각 1:10의 비율로 첨가함으로써 pH 4로 조정하였다. 상청액을 얼음위에서 30분 동안 배양시켜 활성화가 완료되도록 하였다. 그다음 성숙한 단백질(예측크기 약 36-40kDa)은 포함되지만, 절단된 프로펩티드(대략 12-14KDa의 예측크기를 가지는)는 통과시키는 30KDa 분자량 차단 원심분리 농축장치(Microcon 30, Millipore, Bedford, MA. Cat# 42410)로 이들을 원심분리하여 농축시켰다. 농축후, 활성화된 및 비-활성화된 상청액을 4-12% SDS-PAGE 겔에서 이동시킨 후, 실시예 10에서 기술된 바와 같이 단일클론 Mab 33/1을 이용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 합성 카텝신-L 및 Cat-L-His를 트랜스펙션된 세포의 조직배양 상청액에서 유사한 수준으로 검출하였다. 카텝신-L 및 Cat-L-His의 분자량은 활성화된 상청액에서 약 36 내지 40kDa인 데 반하여, 비-활성화된 상청액에서는 프로펩티드 부재 때문에 약 44kDa이었다.
활성화된 상청액의 카텝신-L 효소활성은 또한 실시예 9에서 기술된 바와 같이 형광생성 펩티드 기질(Z-L-R-AMC)을 이용하여 스크리닝하였다. 트랜스펙션 72시간 이후에 트랜스펙션된 CHO-DG44 세포에서 Z-AMC 분석에 의해 카텝신-B 억제제(숙주 카텝신-B-유사 효소활성을 차단) 존재하에 Cat-L 효소활성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 기재되어 있다. 트랜스펙션 72시간 이후에 CHO-DG44 트랜스펙션 세포의 카텝신-L 활성은 mock 트랜스펙션 숙주세포의 백그라운드 활성보다도 약 6-17배 높았다. 선택적 카텝신-B 억제제 CA-074 존재하에 분석함으로써, 숙주 카텝신-B-유사 효소활성의 기여를 차단하였다. 따라서, 카텝신-L 트랜스펙션된 조직배양 배지에서 증가된 효소활성은 트랜스펙션된 Cat-L 클론으로부터 발현된 Cat-L 특이활성으로 간주될 수 있다.
[표 7]
Figure pct00016
B. 메토트렉세이트에서 합성 카텝신 -L 클론의 선별
상기의 섹션 A에 기술한 바와 같이 제조된 합성 카텝신-L 세포를 나트륨 하이포크산틴 및 티미딘 부재의 표준 CD-CHO 배지에서 전기천공 후에 한계희석에 의해 클론하여 DHFR 유전자를 가진 플라스미드를 보유한 세포들을 선별하였고, 그다음 50mM 메토트렉세이트 존재하에 추가로 서브-클론하고 확장시켜 삽입 카피수를 증가시켰다. 그다음 200mM 및 1000mM에서 여러 차례의 서브-클로닝 및 확장(expansion)을 수행하여, 카텝신 L의 대규모 생산에 이용하기에 적절한 메토트렉세이트-증폭된 세포주를 확인하였다.
1. 메토트렉세이트 부재시 Cat -L 세포 클론의 클로닝 및 확인
세포를 선별하고 메토트렉세이트 부재하 성장한 Cat-L 세포 클론을 확인하기 위하여, 이상에서 기술된 트랜스펙션 세포를 수확하고, 하이포크산틴 및 티미딘 첨가물질 부재의 4mM GlutaMAX™-1(GIBCO; Invitrogen)를 함유한 표준 CD-CHO 배지(GIBCO; Invitrogen)로 500x g에서 잠깐의 원심분리에 의해 2회 세척하였다. 최종세척 후, 세포들을 계수하고, mL당 10,000 내지 20,000개의 생존세포가 되도록 희석하였다. 세포현탁액의 분액 0.1mL을 10개의 96웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 모든 플레이트에 동일한 분액 0.1mL를 추가로 보충하였다. 세포를 습식배양기(humidified incubator)에서 37℃, 5% CO2에서 성장하도록 하였다.
하이포크산틴 및 티미딘 부재 선별하에서 자라는 세포 콜로니들을 포함한 웰을 카텝신-L 효소분석 및 배양 웰에서 세포성장의 시각적 외관의 조합에 의해 확인하였다. 각 웰의 조직배양 상청액에서의 효소활성을 실시예 9에서 기술된 바와 같이 평가하였다. 20개의 클론이 확인되었다(표 7a).
[표 7a]
Figure pct00017
확인된 클론들을 하이포크산틴 및 티미딘 부재의 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지 1mL을 함유한 24-웰 조직배양 플레이트의 각각의 웰 내로 확장시켰다. 세포들을 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 세포들을 동일한 배지에서 T-75 조직배양 플라스크 내로 추가로 확장시켰다. 각 클론의 3개 바이알을 10% DMSO, 45% 조건배지에서 동결하여 보관하였다.
2. 50 nM 메토트렉세이트에서 세포의 클로닝 및 확인
증식 및 Cat-L 효소활성의 발현을 보여주는 20개의 세포주 서브-클론들을, 세포들이 플레이트를 가로질러 1개가 3개로, 그리고 플레이트 아래로 1개가 2개로 희석되는 이차원 무한희석전략(two-dimensional infinite dilution strategy)을 이용하여 24웰 플레이트로부터 96웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 서브클론하였다. 희석된 서브-클론을 배양물내 초기 수일 동안 필수적인 성장인자들을 제공하기 위해, 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켰다. 서브-클론당 하이포크산틴 및 티미딘 부재의 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지내 최종농도 50nM의 메토트렉세이트를 함유한 5개의 플레이트를 만들었다. 세포들을 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다.
재조합 인간(합성) Cat-L을 발현하는, 50nM의 메토트렉세이트에서 성장하는 서브-클론들을 실시예 9에서 기술된 바와 같이 Cat-L 효소활성을 측정함으로써 확인하였다. 실질적으로 더 높은 효소활성을 보여주는 웰을 인접한 웰과 현미경으로 비교하였으며, 확장을 위해 고발현 분체(outlier) 클론을 선택하였다. 총 96개의 각각의 클론들을 하이포크산틴 및 티미딘 부재의 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지에 최종농도 50nM의 메토트렉세이트를 함유한 12-웰 조직배양 플레이트 내로 확장시켰다. 세포들을 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다.
이러한 96개의 서브-클론들은 7일 차이로(7 days apart) 두개의 다른 시간대에서 실시예 9에서 기술한 바와 같이 분비된 Cat-L 효소활성을 측정하였다. 7일 기간 이상 Cat-L 효소활성의 큰 증가 및 건강한 현미경 외관을 보여준 서브-클론을 증식(propagation)을 위해 선택하였다. 증식된 7개의 서브-클론은 9E12(#16), 7G9(#50), 1C5(#69), 4F4(#76), 1F6(#77), 5B10(#90) 및 2F2(#92)를 포함하였다. 상기 서브-클론을 50nM 메토트렉세이트 존재하에 T-25 및 T-75 플라스크 내로 확장시키고, 동결시켜 보관하였다.
3. 200 nM 메토트렉세이트에서 세포의 클로닝 및 확인
그다음 서브-클론 9E12(#16), 7G9(#50), 1C5(#69), 4F4(#76), 1F6(#77), 5B10(#90) 및 2F2(#92)를 200nM 메토트렉세이트를 포함한 배지 내로 서브-클론하였다. 7개의 서브-클론 각각에 대하여 이차원 무한희석전략을 이용하여 5개의 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트를 준비하였다. 희석된 서브-클론을 (하이포크산틴 및 티미딘 부재의) 200nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지에서 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켰다. 35개의 플레이트를 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
200nM 메토트렉세이트에서 성장하는 동안 고수준의 rHuCat-L을 발현하는 서브-클론을 실시예 9에서 기술된 바와 같이 세포배양 상청액에서 Cat-L 효소활성을 측정함으로써 확인하였다. 총 35개의 서브-클론(9E12(#16), 7G9(#50), 1C5(#69), 4F4(#76), 1F6(#77), 5B10(#90) 및 2F2(#92) 각각으로부터 5개)을 선택하고, (하이포크산틴 및 티미딘 부재의) 200nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지에서 24-웰 조직배양 플레이트 내로 확장시켰다. 서브-클론을 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
35개의 서브-클론의 Cat-L 효소활성을 측정하고, 고수준의 분비된 효소활성을 발현하는 10개의 서브-클론을 6-웰 조직배양 플레이트에 증식시켰다. 표 7b에 상기 10개의 클론 및 이로부터 얻어진 클론들. 이어서 상기 10개의 서브-클론을 T75 조직배양 플라스크 내로 확장시킨 다음, (하이포크산틴 및 티미딘 부재의) 200nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지에서 쉐이커 플라스크 내로 확장시켰다. 서브클론이 성장하는 쉐이커 플라스크를 확장시키고, 냉동시켜 세포를 보관하였다.
7 계대 초과 동안 작은 쉐이커 플라스크에서 초기에 빠른 세포확장(더 짧은 배가시간(doubling times))을 보이는 4개의 서브클론, 9E12-3D3과 7G9-2F2, 7G9-3F1과 7G9-5F2를 비교발현 및 생산연구를 위한 4x10L 조절된(controlled) 생물반응기의 접종을 위해 확장시켰다. 4개의 서브-클론을 또한 200nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1이 보충된 CD-CHO 배지를 포함한 1L 쉐이커 플라스크에서 연속적으로 확장시키고 계대하였다. 세포밀도 및 생존력을 격일로 측정하고, 세포-부재로 유지하며 차후 효소활성 평가를 위해 4℃에서 보관하였다.
[표 7b]
Figure pct00018
4. 1000 nM 메토트렉세이트에서 세포의 클로닝 및 확인
9E12-1-3D3 및 1C5-3-2F2를 2008년 7월 1일에 1000nM 메토트렉세이트 함유 배지 내로 세번째 서브-클론하였다. 2개의 서브-클론 각각에 대하여 이차원 무한희석전략을 이용하여 5개의 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트를 준비하였다. 희석된 서브-클론을 (하이포크산틴 및 티미딘 부재의) 1000nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1을 함유한 CD-CHO 배지, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켰다.
1000nM 메토트렉세이트에서 성장하는 서브-클론을 함유한 웰을 시각 및 현미경 검사에 의해 확인하였다. 그다음 9E12-1-3D3 및 1C5-3-2F2 서브-클론으로부터 희석된 성장하는 세포를 함유한 20개 웰(서브클론당 10개 웰)의 rHuCat-L 발현을 웨스턴블롯으로 분석하였다. 모든 20개의 서브-클론을 (하이포크산틴 및 티미딘 부재의) 1000nM 메토트렉세이트 및 4mM GlutaMAX™-1을 함유한 CD-CHO 배지에서 12-웰 조직배양 플레이트로 확장시키고, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 표 7c에 20개의 서브-클론 및 이들이 유래한 서브-클론이 기재되어 있다. 그리고 나서 1000nM 메토트렉세이트에서 성장할 수 있는 클론을 확장시키고, Cat-L 효소활성을 분석하고, 액체 질소에서 동결시켜 보관하였다.
[표 7c]
Figure pct00019
B. 카텝신 L의 대규모 생산 및 정제
합성 카텝신-L을 대량으로 정제하기 위하여, 하기에 기술된 바와 같이 제조된 세포주 9E12-1-3D3의 비활성화된 프로-카텝신 L 세포배양 상청액을 36L 생물반응기에서 배양하였다. 생물반응기에서 배양 후, 세포배양물을 수확필터로 징화하고(clarify), 접선유동여과(tangential flow filtration)를 이용하여 농축 및 완충액-교환하고, 용매/계면활성제에 의해 바이러스-비활성시킨 다음, Q 세파로즈 패스트 플로우(GE Healthcare) 양이온교환 크로마토그래피 및 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)에서 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 감소된 pH(pH 4.5)에서 처리한 후, 활성화된 카텝신-L을 SP 세파로즈 패스트 플로우(GE Healthcare) 음이온교환 크로마토그래피, 바이러스 여과 및 접선유동여과에 의해 추가로 정제하였다.
9E12-1-3D3 세포주를 일련의 플라스크를 통하여 먼저 확장시켰다. 요약하면, 6×105 세포/mL 및 73% 생존률의 계대 6 배양물 35mL을 40mL/L GlutaMAX™-1(Invitrogen; 저장용액 200mM) 및 200nM 메토트렉세이트가 보충된 CD CHO 배지(Invitrogen)로 200mL까지 확장시켰다. 4일에, 40mL/L GlutaMAX™-1이 보충된 CD CHO 배지를 이용하여 6L 살포 스피너(sparged spinner)에서 1200mL에 확장시켰다. 그리고 나서, 6L 스피너에서, 배양물을 40mL/L GlutaMAX™-1이 보충된 CD CHO 배지를 이용하여 매번, 11일에 2200m까지, 15일에 3500mL까지, 18일에 최종으로 5000mL까지 확장시켰다.
800 mL GlutaMAX™-1, 재조합 인간 인슐린(rHuInsulin) 100mg, 및 겐타마이신 30mL이 보충된 CD CHO 배지 20L를 함유하는 36L 생물반응기를, 4.6x105 세포/mL의 초기 파종(seeding) 밀도로 접종하였다. 배양물내 부드러운 혼합 및 약한 볼텍싱(vortex)을 제공하기 위하여, 교반 설정점은 80RPM, 온도 설정점은 37℃, pH 설정점은 pH 7.15, 그리고 용존산소 설정점은 25%로 하였다. 생물반응기 용기는 Applikon ADI 1030 조절기에 의해 조절되는, 여과된 공기 오버레이 및 공기/산소/CO2 살포(sparge)를 수용하였다. DO 조절기의 종속장치로서 O2 솔레노이드 밸브를 가지고, 0.1-0.2slpm의 일정한 공기 살포를 제공하여, O2 흐름이 필요한 만큼 일정한 공기 살포를 자동적으로 보충하였다.
생물반응기 작동동안, 생물반응기 작동 내내 배양물을 다양한 간격으로 피드(feed)배지로 보충하여, 영양분 및 글루코스를 보충할 뿐만 아니라, 세포의 초기 성장기에 추가의 기본배지 농축물 및 GlutaMAX™-1을 제공하여 성장속도 및 최고세포밀도를 극대화하였다. 단백질 소화물(이스톨레이트 Utlrafiltrate 50x (200g/L); Invitrogen) 및 부티르산 나트륨을 생물반응기 작동의 후기 생산기에 첨가하여 생산물의 발현 및 분비를 극대화하였다. 피드배지를 연동펌프(peristaltic pump)를 거쳐 생물반응기 내로 무균여과시켰다. 7일, 10일, 12일, 13일, 14일 및 16일에, 피드#1-6 500mL 각각을 생물반응기 세포 큐어(cure)에 첨가하였다. 피드#1 및 피드#2는 48.6g/L 분말 CD CHO AGT™ 배지, 200mL/L GlutaMAX™-1(최종농도 8mM), 200mL/L 이스톨레이트 Utlrafiltrate 50x(최종농도 8g/L), 50g D-글루코스(덱스트로즈; Invitrogen) 및 1.1g 부티르산 나트륨을 포함하였다. 피드#3부터 피드#6은 48.6g/L 분말 CD CHO AGT™ 배지, 100mL/L GlutaMAX™-1(최종농도 4mM), 300mL/L 이스톨레이트 Utlrafiltrate 50x(최종농도 12g/L), 40g D-글루코스(덱스트로즈; Invitrogen) 및 1.6g 부티르산 나트륨을 포함하였다. 각각의 영양분 공급전과 수확(19일)전에 세포배양물을 샘플링하여 트리판블루 염색과 함께 혈구계(hemocytometer)로 의한 생존세포밀도(VCD) 및 %생존력, 및 잔여 글루코스를 측정하였다. 표 8에 그 시험결과가 기재되어 있다.
[표 7d]
Figure pct00020
19일에 생물반응기를 수확하고, 세포배양물(약 28.5L)를 여과에 의해 징화하여 세포 및 세포잔해를 제거하였다. 세포제거 및 징화(clarification) 여과는 밀리포어 포드 필터 D0HC (0.5m2) 및 A1HC (0.1m2)로 이루어져 있다. 수확물을 첨가하기 전에, 밀리포어 포드를 주입을 위한 물(WFI)로 먼저 씻어낸 다음, PBS로 평형화하였다. 징화후, 수확된 세포배양액(HCCF)을 작은 캡슐 필터(Sartobran 300, 0.45μm, Sartorius)를 거쳐 저장백(torage bags) 내로 여과시켰다. HCCF(31.6L, 세포상청액 28.5L 및 PBS 플러시flush) 부피 3.1L로 구성)는 50mM 트리스가 되도록 보충하고, 2-8℃에서 보관하였다.
그다음 HCCF를 농축하고, 30kDa 분자량 차단값을 갖는 5x1 ft2 PES 막으로 구성된 접선유동여과(TFF)로 투석여과(diafilter)하였다. 20mM 비스-트리스, 50mM NaCl, pH 7.0으로 먼저 막을 평형화하였다. HCCF 31.6L를 3L까지 10x 농축 TFF 시스템에 첨가하고 나서, 20mM 비스-트리스, 50mM NaCl, pH 7.0 28L로 투석여과하였다. 농축된 HCCF를 0.2μm 필터를 통해 여과하여 최종부피 3L를 수득하였다. 바이러스 비활성화는 농축된/완충액-교환된 수확물을 1% 트리톤 X-100 및 0.3% 트리-n-부틸 포스페이트로 실온에서 90분간 처리함으로써 달성되었다.
Q 세파로즈 패스트 플로우(GE Healthcare) 음이온교환 칼럼을 준비하였다. 살균, 충진(charging) 및 중화 후에, 칼럼을 칼럼부피 5배의 20mM 비스-트리스, pH 7.0으로 평형화하였다. 바이러스 비활성화 이후에, 농축되고 완충액-교환된 수확물을 모든 단계(407cm/hr)를 위한 5분 체류시간을 이용하여 Q 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼부피 5배의 pH 7.0 20mM 비스-트리스 및 칼럼부피 5배의 pH 7.0 20mM 비스-트리스, 50mM NaCl로 칼럼을 순차적으로 세척하였다. 20mM 비스-트리스, 160mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시켰다.
세라믹 히드록시아파타이트(CHT) 칼럼(BioRad)을 살균, 충진 및 중화 후에 pH 7.0 5mM 나트륨 포스페이트로 평형화하였다. Q 세파로즈 정제된 단백질을 모든 단계(257cm/hr)를 위한 5분 체류시간을 이용하여 CHT 칼럼상에 로딩하였다. 칼럼부피 5배의 pH 7.0 5mM 나트륨 포스페이트 및 칼럼부피 5배의 pH 7.0 10mM 나트륨 포스페이트로 칼럼을 순차적으로 세척하였다. pH 7.0 70mM 나트륨 포스페이트로 단백질을 용출시켰다.
그리고 나서 pH 4.0 0.5M 나트륨 아세테이트로 pH를 4.5로 조정함으로써 프로-카텝신 L을 카텝신 L로 활성화시켰다. 활성화 이후, 카텝신 L을 SP 세파로즈 패스트 플로우 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. SP 세파로즈 패스트 플로우(GE Healthcare) 이온교환 칼럼을 준비하고, 살균, 충진 및 중화 후에 칼럼부피 5배의 50mM pH 4.5 나트륨 아세테이트로 평형화하였다. 로딩전에, 활성화된 카텝신 L을 50mM pH 4.0 나트륨 아세테이트로 2배 희석하였다. 활성화된 카텝신 L을 모든 단계(253cm/hr)를 위한 5분 체류시간을 이용하여 SPFF 칼럼상에 로딩하였다. 칼럼부피 5배의 50mM pH 4.5 나트륨 아세테이트로 칼럼을 세척하였다. 50mM 나트륨 포스페이트, 50mM NaCl, pH 5.0으로 단백질을 용출시켰다. 그리고 나서 정제된 단백질을 여과하여 바이러스를 제거하고, 예를 들어, 1-20mg/mL 사이로 농축하였다.
실시예 12
가용성 재조합 인간 PH20 ( rHuPH20 ) 발현 세포주의 생산
HZ24 플라스미드(서열번호:224에 기재)를 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO 세포)를 트랜스펙션하는데 사용하였다. 가용성 rHuPH20 구축물을 코드화하는 DNA는 인간 PH20 히알루로니다아제의 고유 시그널 리더(native signal leader)의 아미노산 위치 1의 메치오닌을 코드화하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 공통서열, 및 인간 PH20 히알루로니다아제의 아미노산 위치 482의 타이로신을 코드화하는 DNA 뒤에 정지코돈(stop codon), 이어서 BamHI 제한효소 절단부위를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)는 내부 리보솜성 부착부위(IRES)에 의해 분리된, PH20의 아마노산 1-482(서열번호:225에 기재) 및 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)의 아마노산 1-187(서열번호:261에 기재)를 코드화하는, CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종(species)을 결과로 한다.
비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포를 4mM GlutamaxTm 및 18ml Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장시키고, 트랜스펙션을 위해 준비된 쉐이커 플라스크에 0.5x106 세포/ml로 접종하였다. 세포들을 120rpm으로 진탕하면서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 대수적으로(exponentially) 성장한 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 생존력을 트랜스펙션 이전에 측정하였다.
비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포배양물의 6천만개 생존세포를 펠렛화하고, 2x 트랜스펙션 완충액(2x HeBS: 40mM pH 7.0 Hepes, 274mM NaCl, 10mM KCl, 1.4mM Na2HPO4, 12mM 덱스트로즈) 0.7mL에 2×107 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)으로 하룻밤 동안 소화시켜 선형화됨; 서열번호:19에 기재된 선형 HZ24 플라스미드) 0.09mL(250μg)을 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 옮겼다. 음성대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 수행하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 또는 350V 및 960μF에서 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 세포를 제거하고, 4mM Glutamine 및 18ml Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 변형 CD-CHO 배지 5mL 내로 옮겨서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 선별하지 않고 6-웰 조직배양 플레이트의 웰에서 성장하도록 하였다.
전기천공 후 2일에, 조직배양 배지 0.5 mL을 각 웰로부터 제거하여 히알루로니다아제 활성이 있는지를 측정하였다(실시예 16 참조). 그 결과는 하기 표 8에 기재하였다.
[표 8] 트랜스펙션 40시간후 HZ24 트랜스펙션 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다아제 활성
Figure pct00021
트랜스펙션 2(350V)로부터 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1mL 분액을 5개의 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 하이포크산틴 및 티미딘 첨가물 부재의 4mM GlutaMAX™-1 첨가물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함한 CD-CHO 배지(GIBCO) 100마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL)
10개의 클론이 메토트렉세이트 부재에서 성장된 5개의 플레이트로부터 확인되었다(표 9).
[표 9]
Figure pct00022
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 쉐이커 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내 초기 며칠동안 필수적인 성장인자들을 제공하였다. 서브클론당 50nM 메토트렉세이트를 함유하는 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트의 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론(메토트렉세이트 미처리의 13개 및 50nM 메토트렉세이트 처리의 11개)을 생산하였다. 24개의 서브클론 중 8개의 상청액에서 유의적인 히알루로니다아제 활성이 측정되었고(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 적절한 50nM 메토트렉세이트 존재하에 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 클론 3D3 50nM을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 쉐이커 플라스크에서 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생산하였다(클론 3D35M; 세대1 또는 Gen1 3D35M).
실시예 13
Gen1 인간 sPH20의 생산 및 정제
A. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 쉐이커 플라스크로부터 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 용존산소 설정점 25% 및 0-100 cc/분의 공기오버레이와 온도설정점 37℃, pH 7.2(시작 설정점)이었다. 168시간에서, 피드#1 배지(50g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하였다. 216시간에서, 피드#2 배지(50g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하고, 264시간에서 피드#2 배지 250ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대세포밀도와 ml당 1600유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론의 조건배지를 10mM pH 7.0 Hepes 내로 심층여과 및 접선유동여과에 의해 징화하였다. 그리고 나서 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)에서 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액으로 400mM NaCl에서 용출시켰다. 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 설페이트가 되도록 2M 암모늄 설페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 칼럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 설페이트 부재의 50mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후에, pH 6.9 Hepes로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2로 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 80mM pH 7.4 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조 표준(reference standard)을 이용한 미세탁도(microturbidity) 분석방법(실시예 16)에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성(specific activity)을 보유하였다. 정제된 sPH20는 0.1% TFA/H2O 및 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 칼럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은(broad) 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한(sharp) 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
B. 100L 생물반응기 세포배양으로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별개로 정제하여 sHuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별개로 확장시키고, 25L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 전과정 동안 시료를 취하여 효소 수득률과 같은 파라미터를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 개시와 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척과 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 3 내지 10에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 40mL/L GlutaMAX가 함유된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL을 함유한 125mL 쉐이커 플라스크에서 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 쉐이커 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20PSI에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8-2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; pH:7.2; 용존산소:25%±10%; 임펠러(Impeller) 속도 50rpm; 용기압력 3psi; 공기스파지(Sparge) 1L/분; 공기오버레이: 1L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 작동(run) 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일에서 또는 세포의 생존률이 50% 이하로 감소됐을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도와 1600유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마(mycoplasma), 미생물부하도(bioburden), 내독소(endotoxin), 바이러스, 바이러스 입자를 위한 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 먼저 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐을 통과, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과한 후 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 10은 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
[표 10] 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터
Figure pct00023
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 칼럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도(conductivity) 및 내독소(LAL)를 측정하기 위하여 세척시료를 수집하였다. 칼럼을 칼럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 투석여과(diafiltered)된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 칼럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 칼럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 칼럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 칼럼을 평형화하였다. 상기 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로, 최종농도가 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 칼럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트 및 0.1mM CaCl2 pH 7.0을 100cm/시간으로 첨가하였다. 통과흐름(flow through)을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다.
칼럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 칼럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 칼럼을 통과시키고, 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 칼럼을 세척하였다. 그리고 나서 20mM 비신, 100mM NaCl, pH 9.0으로 칼럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50mM Hepes, 100mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 칼럼(BioRad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수확하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 측정하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도가 5mM 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2를 수득하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 5mM pH 7.0 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척한 다음, 10mM pH 7.0 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑(pump)하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20nm 구멍이 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 시알산(sialic acid) 프로파일링 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그다음 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. Hepes/식염수 용액(10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척함으로써 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM Hepes, 130mM NaCl, pH7.0으로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압(osmolarity)을 측정하였다.
표 11 내지 17은 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
[표 11] Q 세파로즈 칼럼 데이터
Figure pct00024
[표 12] 페닐 세파로즈 칼럼 데이터
Figure pct00025
[표 13] 아미노 페닐 보로네이트 칼럼 데이터
Figure pct00026
[표 14] 히드록시아파타이트 칼럼 데이터
Figure pct00027
[표 15] DV20 여과 데이터
Figure pct00028
[표 16] 최종농도 데이터
Figure pct00029
[표 17] 최종제형으로 완충액 -교환 데이터
Figure pct00030
정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5mL 및 1mL 충전부피(fill volume)의 멸균 바이알에 무균적으로 충전하였다. 단백질을 오퍼레이터-조절 펌프로 0.22μm 필터를 통과시키고, 상기 펌프는 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용된다. 바이알의 마개(stoppers)를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외부입자를 가시적으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에서 담가서 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 보관하였다.
실시예 14
가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )을 함유하는 Gen2 세포의 생산
실시예 12에서 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4mM GlutaMAX™-1 및 1.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 약 4주후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX™-1 및 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(master cell bank: MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결해서 사용하였다.
4mM GlutaMAX™-1 및 4.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대후, 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일후, 배지내 메토트렉세이트 농도는 16.0μM로 증가되었고, 18일후에는 20.0μM로 증가되었다. 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대세포를 4mM GlutaMAX™-1 및 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 5-6주후 클론을 확인하고, 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(research cell bank: RCB)로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈(genomic) 2B2 세포 DNA의 서던블롯(southern blot) 분석은 다음의 제한효소분해(restriction digest) 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드(hybridizing band) 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드.
실시예 15
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 36L 스피너 플라르크를 통하여 쉐이커 플라스크로부터 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL이 있는 125mL 쉐이커 플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 쉐이커 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 이상에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 접종밀도 mL당 4.0x105개 생존세포 및 총부피 260L로, 400L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40-55rpm; 용기압력 3psi; 공기스파지(Sparge) 0.5-1.5L/분; 공기오버레이: 3L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 작동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 160mL/L GlutaMAX™-1 + 83mL/L 이스톨레이트 + 33mg/L rHuInsulin) 10.4L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 배지(2×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 80mL/L GlutaMAX™-1 + 167mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 배지(1×CD-CHO + 50g/L 글루코스 + 50mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 1.80g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 배지(1×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 33mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에서, 또는 세포의 생존률이 40% 이하로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도와 ml당 17000유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4-8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4-1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈(Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑(pump)한 다음, 셀룰로오스 막을, 그다음 0.4-0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후, 그다음 셀룰로오스 막을, 그다음 350L 용량의 멸균 일회용 연성(flexible) 백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 보충하여 pH 7.5가 되었다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 투석여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 투석여과된 수확물을 Q 칼럼에서 정제하기 전 즉시 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20 의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 칼럼(9L 레진,H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 칼럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 칼럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 투석여과된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 칼럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다아제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 측정하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 칼럼(19-21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 칼럼을 칼럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, 0.1mM CaCl2, pH7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 칼럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로 보충하여, 최종농도가 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM이 되었다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼 통과유체(flow thru)을 수집하였다. 칼럼을 100cm/시간으로 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트 및 0.1mM CaCl2 pH7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과유체에 첨가하였다. 칼럼 세척물과 합쳐진, 통과유체를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과유체를 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 칼럼(Promtics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 칼럼을 칼럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과유체를 100cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, pH7.0으로 세척하였다. 칼럼을 20mM 비신, 0.5M 암모늄 설페이트, pH9.0으로 세척하였다. 칼럼을 20mM 비신, 100mM 염화나트륨, pH9.0으로 세척하였다. 단백질을 50mM Hepes, 100mM NaCl, pH6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 칼럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 칼럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 최종농도 5mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2로 보충하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 칼럼 상에 로딩하였다. 5mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 칼럼을 세척하였다. 다음에 10mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 칼럼을 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트 2L로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP-정제된 단백질을 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일링을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
다음으로 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과물을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 완충액-교환후, 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압을 측정하였다.
그리고 나서 멸균여과된 벌크 단백질을 30mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20mL씩 무균적으로 분주하였다. 그다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 보관하였다.
C. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제(실시예 13.B에 기술됨)와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화가 있다. 표 18은 상기 방법 간에 단순한 스케일업 변화뿐만 아니라 실시예의 차이를 기재하고 있다.
[표 18]
Figure pct00031
Figure pct00032
실시예 16.
가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성 측정
세포배양물, 정제분획 및 정제된 용액과 같은 시료내 가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성은 탁도분석(tubidometric assay)을 이용하여 측정하였고, 상기 분석은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한다. 가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10분) 동안 히알루론산 나트륨(히알루론산)과 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루론산 나트륨을 침전시킴으로써 활성을 측정하였다. 생성된 시료의 탁도를 30분의 발달(development)기간 후에 640nm에서 측정하였다. 히알루론산 나트륨 기질에 대한 효소활성에서 유래된 탁도감소는 가용성 rHuPH20 효소활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 분석 작용참조표준(working reference standard)의 희석으로 만들어진 검정곡선을 이용하여 수행하고, 검정곡선과 비교하여 시료활성을 측정하였다.
효소희석용액으로 시료 희석물을 조제하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05mg을 50mM PIPES 반응 완충액(140mM NaCl, 50mM PIPES, pH 5.5) 25.0mL 및 SWFI 25.0mL에 용해하고, 25% Buminate 용액 0.2mL을 상기 혼합물 내로 희석하고 30초간 볼텍싱(vortexing)함으로써 효소희석용액을 준비하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관하였다. 시료를 평가된 1-2U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20μL 이상이었다. 분석을 수행하는데 필요한 최소 시료부피는: 공정 중 시료, FPLC 분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1mL; 농축된 재료 80μL; 정제된 또는 최종단계의 재료: 80μL이었다. 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 트리플리케이트(triplicate)로 희석하고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액으로 준비하여 검정곡선을 작성하고, Optilux 플레이트에 트리플리케이트로 첨가하였다. 희석물은 0U/mL, 0.25U/mL, 0.5U/mL, 1.0U/mL, 1.5U/mL, 2.0U/mL 및 2.5U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60μL를 포함한“공시약(Reagent blank)”웰을 음성대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 그리고 나서 플레이트를 덮고, 37℃에서 5분 동안 히트블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕후, 플레이트를 히트블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장비를 SWFI 20.0mL내 가온한 0.25mg/mL 히알루론산 나트륨 용액(100mg 히알루론산 나트륨(LifeCore Biomedical)을 용해함으로써 조제된)으로 채웠다. 2-4시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2-8℃에서 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 옮기고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루론산 나트륨 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그 다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고, 히트블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다.
혈청 작용용액(serum working solution)으로 기계를 채우고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다(혈청 저장용액 25mL[1부피의 말 혈청(Sigma)을 9부피의 500mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]을 500mM 아세테이트 완충용액 75mL내에). 플레이트를 히트블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작용용액 240μL를 웰로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분후에, 시료의 탁도를 640nm에서 측정하고, 각 시료의 효소활성(U/mL로)을 검정곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
효소활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눔으로써 비활성도(U/mg)를 계산하였다.
실시예 17
카텝신 -L은 Zucker 랫트의 피하공간에서 섬유성 격막을 절단한다
Zucker 랫트를 pH 5.3 MES 완충액내 90μg/ml 카텝신-L을 투여 처리하고, 피부절편에 대한 조직검사를 수행하여 섬유성 격막을 가시화하였다. 대조군으로써, 랫트를 pH 5.3 MES 완충액 단독으로 처리하였다. 절편을 고정하고, 실시예 5에서 기술된 바와 같이 콜라겐의 가시화를 위해 마센트리크롬 염색(Masson's Trichrome staining)을 하였다. 절편을 또한 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 요약하면, 절편을 탈파라핀화하고, 물에 수화시켰다. 절편이 쩨커-고정된(Zenker-fixed) 경우, 요오드로 염화제2수은(mercuric chloride) 크리스탈을 제거하고, 티오황산나트륨(sodium thiosulphate)으로 세척하였다. 시료를 Mayer's 헤마톡실린으로 15분간 염색하고, 흐르는 수돗물로 20분간 세척하였다. 절편을 에오신의 나이 및 원하는 대조염색의 깊이에 따라 15초 내지 20분간 에오신으로 대조-염색하였다. 균등한 염색결과를 위하여, 슬라이드가 에오신에서 고정되기 전에 슬라이드를 여러번 살짝 담궜다. 과량의 에오신이 제거될 때까지 절편을 95% 알콜 및 무수알콜로 각각 2분의 2변화로 탈수시켰다. 각각 2분의 2변화를 가지고 크실렌으로 세척하기 전에 슬라이드를 현미경하에서 확인하였다. 절편을 퍼마운트(Permount) 또는 히스토클라드(Histoclad)로 봉입하였다. 결과는 산성 완충액만을 처리한 대조군 동물에서 피하지방 소엽(hypodermal lobule)이 피부표면으로 수직으로 확장한 콜라겐 섬유성 격막의 복잡한 네트워크에 의해 분리되어 있음을 보여준다. 랫트에 카텝신-L 처리는 피하 섬유성 격막의 분해를 유발한다.
카텝신-L 부재의 pH 5.3 MES 완충액, 또는 50mM pH 7.4. HEPES 완충액내 90μg/ml 카텝신-L 또는 90μg/ml 박테리아 콜라게나제으로 처리한 후, 섬유성 격막의 조직을 토끼 항-콜라겐 항체로 추가로 가시화하였다. 결과는 산성 MES 완충액만으로 처리한 대조군 랫트에서 정상 콜라겐 분포를 보여준다. 랫트의 카텝신-L 처리는 콜라겐 분해의 증거인 감소된 콜라겐 염색을 보여주었다. 그러나 콜라겐 분해는 랫트의 박테리아 콜라게나제 처리에 의해 훨씬 더 명확하였다. 이러한 결과는 카텝신-L이 박테리아 콜라게나제와 비교하여 콜라겐 분해의 더 큰 시간적(temporal) 조절이 있음을 입증한다.
실시예 18
Zucker 랫트 진피에서 카텝신 -L의 효소작용의 지속
카텝신-L의 효소작용의 지속을 2개의 상호보완적인 방법을 이용하여 Zucker 랫트의 진피에서 평가하였다: 웨스턴블롯 및 효소활성. 랫트에 에피네프린(2.5ug/mL)를 함유한 pH 5.3 rHuPH20 1200유닛/ml 1mL을 주사하여 혈관수축을 유도하였다. 그 다음 50 mM MES 완충액내 pH 5.3 재조합 카텝신-L 100μg/mL 1mL을 즉시 주사하였다. 주사부위에 절개하여, 주사후 3분부터 70분까지 20μL 및 200μL 에펜도르프 피펫으로 간질 관류액을 수집하였다. 상기 유체를 수행에 10에 기술한 바와 같이 콜라겐 분해에 대하여 웨스턴블롯으로 분석하고, 실시예 9에서 기술된 바와 같이 1시간에 걸쳐, 그 활성이 상대적인 형광 유닛(RFU)/분으로 표현되며, Z-Leu-Arg-AMC로 명명되는 상업적으로 이용가능한 형광기질의 가수분해 속도로부터 결정되는 카텝신-L 효소활성을 측정하여 분석하였다. 간질유체 관류액의 pH값을 pH 지시약 스트립(EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, Cat#9588)을 이용하여 기록하였다. 데이터를 표 19에 나타내었다.
최대 효소활성을 처리 후 10분이내에 측정하였다. 활성은 진피에 투여한 후 30분에서 약 50%, 60분에서 약 70% 감소하였다.
[표 19] pH 5.3 재조합 카텝신 -L 100μg/ mL 투여후 , 카텝신 -L 활성 및 간질유체의 pH 와 관련된 투여후 시간
Figure pct00033
실시예 19
랫트 진피에서 카텝신-L의 콜라겐 분해에 대한 용량-반응 효과
Zucker 랫트의 진피에 pH 5.3 rHuPH20 1200U/ml 1 ml을 투여한 후, 1μg/mL 내지 500μg/mL 용량 범위의 카텝신-L 1 ml을 Zucker 랫트의 진피 내로 투여하였다. 주사후 20분에, 생검(biopsies)을 수집하고, Bouin's 고정액으로 고정하고, 조직검사를 진행하였다. 실시예 5에서 기술한 바와 같이 콜라겐의 가시화를 위하여 절편을 헤마톡실린 및 에오신, 그리고 마센트리크롬으로 염색하였다. 주사부위를 스캘퍼(scalper)로 절개하고, 간질유체를 수집하였다.
처리된 피부의 조직학적 검사 및 관류액의 웨스턴블롯 분석을 실시예 5 및 10에서 각각 기술한 바와 같이 수행하였다. 간질유체의 25μL 분액을 SDS-PAGE용 6X 겔로딩 시료 완충액 5μL와 혼합하였다. 시료의 총부피를 4-12% 트리스-글리신 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat# EC6038) 상에 로딩하고, 미리 염색된 분자량 마커(Invitrogen, Cat# LC5925) 앞쪽의 염색제가 겔 하단에 도달할 때까지 트리스-글리신 SDS 전기영동용 완충액으로 전기영동을 수행하였다. 20% 메탄올, 25mM 트리스 및 220mM 글리신의 완충액에서 4℃, 20V로 1.5시간 동안 XCell II 블롯 모듈(Invitrogen, Cat# IB1001)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen, Cat#LC2001) 상으로 단백질을 트랜스퍼시켰다. 트랜스퍼는 겔에서 미리 염색된 마커밴드의 색상이 거의 완전히 사라진 것으로 확인하였다. 실온에서 30분간 PBST(세척 완충액 및 ELISA용 희석액으로써 사용하기 위한, 계면활성제 Tween 20(0.05% v/v)를 함유한 인산염-완충식염수(PBS) 용액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM 인산염, pH 7.4)내 2% 탈지분유로 이루어진 완충액으로 막을 블로킹하였다. PBST내 1μg/mL 최종농도로 사용되고, 실온에서 1시간 동안 배양된 인간 콜라겐 I에 대한 토끼 다클론 항체(Abcam, Cambridge, MA, Cat#ab34710), 그 다음 실온에서 1시간 동안 PBST내 33ng/mL 농도로 사용된 HRP 접합 염소 항-토끼 IgG(Calbiochem, San Diego, CA, Cat#DC03L)로 콜라겐 I을 검출하였다. HRP 시그널은 TMB Insoluble(Calbiochem, Cat# 613548) 막 현상용액으로 현상하고, 실온에서 5-10분 후에 ddH2O로 씻어냄으로써 반응을 중단하였다.
조직학적 분석 및 웨스턴블롯 분석은 카텝신-L의 증량이 용량 의존적인 콜라겐 분해를 유발시킴을 보여주었다. 100μg/mL로 처리된 시료에서 많은 저분자량 밴드의 존재로 판단할 때, 웨스턴블롯 분석은 고농도의 카텝신-L이 더 극심한 콜라겐 분해를 초래함을 시사하였다.
실시예 20
섬유성 격막 파괴에 대한 카텝신 -L의 용량-의존적인 효과
50mM MES, 150mM NaCl pH 5.3내에 rHuPH20 1200U/ml 1 ml을 투여한 후, pH 5.3 MES 완충액내 1, 10, 50, 100, 250 및 500μg/mL 용량 범위의 인간 재조합 카텝신-L 1 ml을 Zucker 랫트의 진피 내로 투여하였다. 대조군으로서, 랫트에 pH 5.3 MES 단독으로 투여하였다. 주사후 20분에, 실시예 18에서 기술한 바와 같이 주사부위로부터 간질 관류액을 수집하였다. 피부생검을 수집하고, Bouin's 고정액으로 고정하고, 조직검사를 진행하였다. 실시예 5에서 기술한 바와 같이 콜라겐의 가시화를 위하여 헤마톡실린 및 에오신, 그리고 마센트리크롬으로 탈파라핀화된 절편을 염색하였다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이 웨스턴블롯을 수행하였다.
조직학 및 웨스턴블롯 분석결과는 Zucker 랫트에서 재조합 카텝신-L의 콜라겐 분해가 용량 의존적임을 보여주었다. 섬유성 격막의 분해는 카텝신-L 10μg/mL로 처리된 피부에서 명확히 관찰되었다.
실시예 21
Zucker 랫트 진피에서 카텝신-L의 효과에 대한 이온강도의 효과
완충액의 이온강도의 함수로써 진피에 주사된 카텝신-L 효소활성의 시간 기간을 조사하였다.
Zucker 랫트에 1200U/ml rHuPH20 1ml을 주사한 다음, 1, 5, 10 및 50mM의 MES 완충액, 150mM NaCl pH 5.3 내 25μg/mL 카텝신-L 1 ml을 주사하였다. 투여후 20분에서 간질 관류액을 수집하였다 간질유체 관류액의 pH값을 pH 지시약 스트립(EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, Cat#9588)을 이용하여 기록하고, 실시예 9에서 기술한 바와 같이 진피내 카텝신-L 효소활성을 측정하였다. 진피 관류액의 pH값은 낮은 이온완충강도(1, 5 및 10mM MES pH 5.3)에서 7.5이었다. 카텝신-L이 50mM MES pH 5.3 내에 전달시, 진피 관류액의 pH값은 6.5이었다. 카텝신-L이 낮은 이온완충강도(1, 5 및 10mM MES)에 있을 때, 효소활성은 검출되지 않았다. 50mM MES로 제형화된 카텝신-L을 투여한 주사부위의 관류액에서는 활발한 효소활성이 검출되었다. 상기 결과는 카텝신-L의 효소활성이 완충액의 이온강도에 의해 엄격하게 조절될 수 있음을 시사하였다.
실시예 22
Zucker 랫트 내피( subdermis ) 내로 주사된 카텝신 -L의 섬유성 격막 파괴
Zucker 랫트 내피 내로 주사된 하나의 단회량의 카텝신-L의 효과를 50mM MES 완충액, 150 mM NaCl, pH 5.3 내 rHuPH20 1200U/ml을 투여한 후, 50mM MES 완충액, 150 mM NaCl, pH 5.3 내 10 또는 100μg/mL 카텝신-L를 처리한 22마리의 수컷 Zucker 랫트에서 평가하였다. 20주의 기간 동안 매주 1번씩 생검을 취하고, 실시예 5에서 기술한 바와 같이 조직학적으로 분석하였다. 10μg/ml 또는 100μg/ml 용량의 카텝신-L 단회 처리는 실시예 17에서 기술한 바와 같이 섬유성 격막의 빠른 파괴를 초래하였다. 4주에서 취한 생검의 조직학적 검사는 섬유성 격막의 수가 미처리된 부분보다 처리된 부분에서 더 적음을 시사하였다. 20주부터는, 섬유성 격막의 전형적인 수직방향이 처리된 부분에서는 관찰되지 않았다. 오히려, 피하조직에서 콜라겐의 방향은 수평이고, 피부표면에 평행하고, 조직 리모델링과 일치하였다.
실시예 23
카텝신-L의 투여는 부작용과 무관하다
혈관내로 주사된 카텝신 L의 안전성 연구는 분명한 부작용이 없음을 보여준다. 25g 수컷 balb/c 마우스(Charles River) 및 200g 수컷 Sprague Dawley 랫트(Harlan Laboratories)의 꼬리정맥으로 12mg/kg까지의 농도로 50mM MES, 150mM NaCl, pH 5.3내 재조합 카텝신 L을 투여하였다. 부작용을 위해 일주일 동안 동물을 관찰하였다. 케이지 측면 관찰에 의해 부작용이 없음을 기록하였다.
실시예 24
카텝신 -L은 돼지 피하조직에서 섬유성 격막
미세건축(microarchitecture)의 구조를 변화시킨다
마취된 Yorkshire 돼지(SNS farms, Ramona, Ca)에 옆구리의 피하조직 내로 삽입된 23-게이지 버터플라이 니들(Terumo, Leuven, Belgium Cat#CE0197)을 통하여 rHuPH20 1200U/mL를 함유한 pH 5.3 50mM MES, 150mM NaCl 완충액 5mL를 투여하고, 이어서 i) 50mM MES, 150mM NaCl, pH 5.3 완충액내 50μg/ml 카텝신-L 5mL; 또는 ii) 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4 완충액내 50μg 박테리아 콜라게나제를 투여하였다. 대조군은 50mM MES 완충액, 150mM NaCl pH 5.3; rHuPH20 단독 pH 5.3; 및 pH 7.4에서 카텝신-L이었다. 처리후 2시간, 4시간 및 7일에 전체두께 생검을 수확하고, Bouin's 고정액으로 고정하였다. 6mm 조직학 절편을 자르고, 헤마톡실린 및 에오신으로, 또는 마센트리크롬 콜라겐 염료로 염색하였다. 극심한 갈색 변색이 특징인 육안적인(gross) 변화가 콜라게나제 주사부위에서 관찰되었으나, 카텝신-L이 처리된 부위보다는 그 정도가 훨씬 더 적었다. 대조군으로 주사된 부위에서 또는 미처리된 피부에서는 육안적인 변화가 보이지 않았다. 상기 결과는 카텝신-L 처리가 박테리아 콜라게나제 주사에 비해 최소의 출혈을 동반함을 보여준다.
육안적인 변화는 전형적으로 콜라게나제 피하 주사부위의 상당한 출혈과, 그러나 카텝신-L에서는 최소의 출혈의 조직학적 소견과 관련이 있다. 섬유성 격막의 미세건축(microarchitecture)은, MES 완충액 단독이 처리된 피부에서 밀접하게 쌓인(packed) 콜라겐 격벽과 비교하여, 카텝신-L 및 박테리아 콜라게나제가 주사된 피부에서 콜라겐 섬유의 종단의 분할(longitudinal splitting), 분열(disintegration) 및 경사(angulation)를 특징으로 한다. 그러나, 조직학 결과는, 출혈결과와 일관되게, 카텝신-L 처리 부위와 비교하여 콜라게나제-처리 부위에서 더욱 심각한 격벽의 미세건축 변화를 보였다. 뿐만 아니라, 5μg/mL와 같은 낮은 용량의 박테리아 콜라게나제의 처리는 심각한 횡문근융해를 유발하였다. 상기 결과는 카텝신-L이 콜라겐을 분해하고, 섬유성 격막의 구조를 변화시키는 반면, 그 효과가 박테리아 콜라게나제보다 더 조절됨을 보여주며, 이는 콜라게나제가 생리적 pH에서 연장시간의 기간동안 활성인 반면, 카텝신-L은 생리적 pH에서 빠르게 불활성화되기 때문이다.
또 다른 연구에서, 돼지에 pH 5.3의 120U/ml rHuPH20 5mL을 투여하고, 이어서 50mM MES, 150mM NaCl, pH 5.3 내에 5 내지 1000μg/mL(5, 25, 50, 100, 200, 500, 및 1000μg/mL) 용량범위의 재조합 카텝신-L 5mL을 투여하였다. 처리후 2시간 및 24시간에 전체두께 피부생검을 수확하고, 실시예 5에서 기술한 바대로 Bouin's 고정액으로 고정하고, H&E 또는 콜라겐 염색을 위한 마센트리크롬 염색을 하였다. 주사후 2시간 및 24시간에 적출된 피부의 육안검사는 25μg/mL 이상의 용량으로 처리된 주사부위에 중등도의 출혈이 있음을 보여주었다. 횡문근융해는 500μg/mL 및 1000μg/mL의 고용량의 재조합 카텝신-L 주사부위에서만 관찰되었다.
실시예 25
형광생성 기질에 대한 카텝신 -L의 효소활성에 대한 환원조건의 효과
환원제의 카텝신-L 효소활성에 대한 효과는 Z-His-Arg-Tyr-Arg-AMC(서열번호:536; Z=:N-카르보벤질옥시; AMC: 7-아미노-4-메틸 쿠마린)(Biomatik Corp., Wilmington, DE)으로 명명되고, 맞춤제작된 형광생성 기질을 이용하여 분석하였다. RFU/초로 카텝신-L 활성을 시스테인(Spectrum Chemical, Gardena, CA; Catalog # C1473) 또는 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO Cat#C4706)의 존재하에 측정하였다.
5mM 시스테인을 함유한 7.85mg/mL의 저장농도로 활성화된 카텝신-L을 사용하였다. 표 19A에 나타난 것처럼 적절한 농도의 시스테인 또는 TCEP를 함유한 총부피 200μl의 pH 6.5 50mM 소디움 시트레이트 완충액, 2% DMSO, 0.01% Brij-35에서 30분 동안 37℃에서 20μM 형광생성 펩티드 기질 Z-His-Arg-Tyr-Arg-AMC와 2ng/ml 카텝신-L을 배양하였다. 배양은 불투명-보텀 마이크로플레이트에서 수행하였다. 생성된 형광을 형광 플레이트 리더기(Molecular Devices, Spectramax M5, Sunnyvale, CA)에서 기질에 대한 최적 여기 발광 360nm-460nm에서 판독하였다. 시그모시드형(sigmoidal) 용량반응을 Graphpad Prizm 소프트웨어(Graphpad Software, La Jolla, CA)에서 조화 후, 곡선 조화(fits)는 0.998 초과의 R2값이었다. 하기 표 19A에 나타난 결과는 환원제의 존재가 카텝신-L 활성을 증가시킴을 지시한다.
[표 19A] 카텝신 -L 활성에 대한 환원제의 효과
Figure pct00034
실시예 26
기질에 대한 카텝신 -L의 효소활성
0.25mg/ml 농도의 카텝신-L을 pH 5 50mM 소디움 아세테이트, pH 6 50mM 소디움 아세테이트 또는 pH 7 50mM Hepes 중의 하나를 함유한 완충액에서 37℃에서 16시간까지 동안 다음 세가지 단백질(0.5mg/ml의 콜라겐 I형; 0.25mg/ml의 HSA; 및 0.25mg/ml의 PH20) 중 하나, 또는 둘 또는 셋의 혼합물과 배양하였다. 다양한 시간대(0, 15분, 30분, 60분, 120분, 240분 및 하룻밤 동안)에 시료분액을 취하여 쿠마시 블루염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 카텝신-L에 의한 단백질 분해는 용량-의존적이고, 손상되지 않은 단백질 강도의 가시적인 감소에 의해 측정된 기질 각각에서 관찰되었다. 카텝신 L에 의한 콜라겐 I형, HAS 및 PH20의 분해는 pH 5에서 더욱 완전하였다. 분해는 pH 6 이상에서 감소하였다. 중성 pH에서, 카텝신 L에 의한 콜라겐 I형, HAS 및 PH20의 분해는 매우 적었다. 카텝신 L은 pH 5에서 안정하기 때문에, 환원제를 완충액으로 첨가하는 것은 pH 5에서 카텝신 L에 의한 콜라겐, HAS 및 PH20의 분해에 거의 영향을 미치지 않거나 영향이 없다. 카텝신 L은 pH가 중성으로 증가할수록 자가촉매작용(autocatalysis)을 겪기 때문에, 중성 pH에서 환원제를 첨가하는 것은 카텝신 L의 자가촉매작용을 감소시키고, 이에 의해 콜라겐, HAS 및 PH20의 분해를 증가시켰다.
실시예 27
hMMP-1의 클로닝 및 발현
A. hMMP -1 라이브러리의 클로닝 및 고효율( high - throughput ) 발현
본 실시예에서, 인간 MMP-1를 코드화하는 DNA를 플라스미드 내로 클로닝하고, 형질전환(transformation) 및 단백질 성장/분리하여 인간 매트릭스 메탈로프로테아제 1(hMMP-1) 라이브러리를 제작하였다. 폴리펩티드의 촉매(catalytic) 도메인 및 프롤린 리치 링커 도메인에 걸칠 MMP-1의 단일 아미노산 변이체를 생산하기 위하여, 불활성 자이모겐 프로MMP-1(서열번호:327에 기재)를 코드화하는, 서열번호:534에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 모체(parent) 인간 MMP-1 DNA 서열에 돌연변이를 도입함으로써 라이브러리를 제작하였다. hMMP-1 라이브러리는 인간 MMP-1의 촉매 도메인(서열번호:327의 아미노산 81-242) 및 링커 부위(서열번호:327의 아미노산 243-258)내에 178 아미노산 위치의 각각에서 최소한 15개의 아미노산 변이체를 포함하도록 설계하였다(하기 표 20 참조).
[표 20] hMMP -1 라이브러리
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
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하기 표 21에서 확인된 178 아미노산 위치 각각을 코드화하는 야생형 코돈을 목적하는 아미노산 치환을 코드화하는 코돈으로 변경함으로써, 각각의 개별 hMMP-1 돌연변이체를 코드화하는 cDNA를 생산하였다. 야생형 코돈은 서열번호:534에 기재되어 있다. 서열번호:534는 또한 코드화된 아미노산을 도시한다. 아미노산 치환 및 해당 돌연변이된 코돈이 하기 표 21에 목록화되어 있다.
[표 21] 각각의 아미노산 치환을 코드화하는 코돈
Figure pct00044
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DNA 합성 프로토콜에 따라 개별 라이브러리 멤버를 코드화하는 DNA를 만들고, 통상의 분자생물학적 기법을 이용하여 발현시켰다. 간단하게, 통상의 분자생물학적 기법을 이용하여 DNA를 벡터 pET303CTHis(Invitrogen, 서열번호:533) 내로 연결(ligation)하였다. 하나의 각각의 hMMP-1 돌연변이체를 함유하는 플라스미드를 제조사 권장사항을 이용하여 BL21(DE3) E. coli 세포(Tigen, Beiging, China) 내로 형질전환하였다. 모든 라이브러리 멤버에 대해 상기 과정을 반복하였다.형질전환 배양물을 암피실린 첨가제를 함유한 LB 배지 1 mL을 접종하는데 사용하였다. 배양물을 16시간 동안 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 1mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 배양물을 25℃에서 진탕하면서 배양하였다. 6시간 후, 세포를 6,000g에서 10분간 원심분리하여 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 4μl DNAse(10μg/ml), 4μl RNAse(10μg/ml) 및 4μl 리소자임(10μg/ml)를 함유한 50μl OS 완충액(200mM pH 7.5 트리스-HCV, 20% 수크로스, 1mM EDTA)에서 25℃에서 10분 동안 세포를 배양함으로써 주변세포질(periplasmic) 단백질을 강화시켰다. 물 50μl를 각 웰에 첨가하고, 6000g에서 10분간 원심분리하여 세포잔해물을 제거하였다. hMMP-1 단백질을 함유한 상청액을 -20℃에 보관하였다. 다음의 실시예에서 기술한 바와 같이 상청액의 활성을 스크리닝하였다.
B. 야생형 hMMP -1의 클로닝 및 발현
본 실시예에서, 야생형 hMMP-1를 E. coli 및 CHO-S 세포 둘다에서 각각 발현시켰다.
1. E. coli 에서 발현
야생형 hMMP-1(서열번호:534에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 클론 BAP006_10)를 벡터 pET303CTHis(Invitrogen, 서열번호:533) 내로 클로닝하고, BL21(DE3) E. coli 내에서 성장시켰다. pET303CTHis 벡터는 C-말단 His 태그(서열번호:235)를 함유하였다. 상기에서 기술된 바와 같이 1mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 발현후, 실시예 27A에 기술된 바와 같이 단백질을 강화시키고, 이어서 표준 분자생물학 프로토콜에 따라 HiTrap Ni2 + 칼럼(GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. 발현 및 정제는 SDS/PAGE 및 웨스턴블롯 분석으로 모니터링하였다.
2. CHO -S 세포에서 발현
야생형 hMMP-1(서열번호:534에서 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 클론 BAP006_2)를 CHO-S 세포에서 발현시키고, 배지 내로 분비시켰다. 표준 분자생물학 프로토콜에 따라 HiTrap Ni2 + 칼럼(GE Healthcare)을 이용하여 야생형 hMMP-1 단백질을 정제하였다.
실시예 28
형광생성 펩티드 기질을 이용한 hMMP -1 돌연변이체의 효소활성 측정
본 실시예에서, 실시예 27에서 생산된 hMMP-1 돌연변이체 라이브러리를 고효율 형광활성 분석을 이용하여 스크리닝하여 온도 민감성 hMMP-1 돌연변이체를 확인하였다. 일시적으로 민감한 hMMP-1 돌연변이체를 스크리닝하기 위하여, 상업적으로 입수가능하고 Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2(서열번호:535; Mca=(7-메톡시쿠마린-4-일)아세틸; Dpa=N-3-(2,4,-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로피오닐; R&D 시스템스, Minneapolis, MN, Cat# ES010)로서 명명되는 형광생성 기질 peptide IX를 이용하여 각각의 개별 돌연변이체의 효소활성을 25℃ 및 37℃ 및/또는 34℃에서 측정하였다. 펩티드 기질은 2,4,-디니트로페닐 기로 공명에너지 전이(resonance energy transfer)에 의해 소광되는 고형광의 7-메톡시쿠마린기를 함유한다. 활성화된 hMMP-1은 글리신과 루신 사이에 아미드 결합을 절단하여 방출된 형광의 증가를 유발한다. 먼저 96-웰 분석으로 반응을 수행하고, 14ml 튜브 포맷을 이용하여 확인하였다.
A. 96-웰 분석
상청액의 활성을 평가하기 전, 상청액에 가공제(processing agent)를 처리하여 불활성 자이모겐형을 활성인 효소로 활성화시켰다. 요약하면, 실시예 27에서 생산된 각각의 hMMP-1 돌연변이체 상청액 4μl를 96-웰 플레이트에서 1mM의 p-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)를 가지는 TCNB(50nM 트리스, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05% Brij 35, pH 7.5) 100μl에 첨가하였다. 용액을 반응온도(25℃ 또는 37℃)에서 2시간 동안 배양하였다. 본 활성화 단계는 상기 프로펩티드를 절단하고, 성숙한 hMMP-1을 생성한다.
활성화 이후, 지시된 반응온도(25℃ 또는 37℃중 하나)에서 1시간 동안 10μM의 최종농도로 620μM Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2 형광기질을 함유한 TCNB 1.6μl를 각 웰에 첨가하였다. 320nm 여기/405nm 발광에서 형광 플레이트 리더기로 형광을 측정함으로써 형광을 검출하였다. 상대적인 형광 유닛 (RFU)을 측정하였다. 야생형 hMMP-1 및 플라스미드/벡터 형질전환 세포의 상청액을 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 시료, 반응온도, 그리고 양성 및 음성 대조군에 대하여 듀플리케이트(duplicate) 반응을 수행하였다.
2687개 hMMP-1 돌연변이체의 초기 스크린으로부터, 37℃에서 활성이 감소된 199개의 추정 일차 히트(hits)를 확인하였다(표 22 참조). 상기 hMMP-1 돌연변이체를 동일한 분석을 이용하여 재스크리닝하고, 104개의 일차 히트를 확인하였다(하기 표 23 참조). 25℃에서 활성이고 37℃에서 활성이 적어도 16% 감소된(예를 들어, 25℃ 또는 37℃(25℃/37℃)에서 활성의 비율은 1.2보다 크거나 동일함) hMMP-1 돌연변이체를 일차 온도 민감성 히트로 확인하는 것으로 간주하였다. 하기 표 22는 hMMP-1 돌연변이, 25℃ 및 37℃에서 평균 RFU, 및 활성 비율(25℃/37℃)를 목록화하고 있다. 표는 또한 온도 표현형을 목록화하고 있다: DOWN은 돌연변이체의 활성 비율(25℃/37℃)이 야생형의 활성 비율(25℃/37℃)에 비해 감소된 것, 즉 야생형의 활성 16%보다 더 감소된 것을 지시하며; NEUTRAL은 돌연변이체의 활성 비율(25℃/37℃)이 야생형의 활성 비율(25℃/37℃)과 유사한 것, 즉 야생형의 활성의 16% 이내인 것을 지시하며; 및 UP은 돌연변이체의 활성 비율(25℃/37℃)이 야생형의 활성 비율(25℃/37℃)에 비해 증가된 것, 즉 야생형의 활성보다 16% 더 증가된 것을 지시한다.
하기 표 22는 또한 야생형 hMMP-1과 비교하여 25℃ 및 37℃에서 잔류활성을 목록화하고 있다. 잔류활성은 25℃ 또는 37℃ 중 하나의 지시된 온도에서 야생형 hMMP-1 활성에 대한 hMMP-1 돌연변이체 활성의 비율이다. hMMP-1 돌연변이체 중 몇개는 25℃에서 야생형 hMMP-1과 비슷하거나 그보다 큰 활성을 가지나, 37℃에서 모두 감소된 활성을 보였으며, 따라서 상승된 온도에서 이들의 활성이 감소되는 것을 재확인하였다.
[표 22] 온도 민감성 hMMP -1 돌연변이체에 대한 초기 스크린 결과
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
[표 23] 재확인된 히트
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081

B. 14- mL 단백질 발현
본 실시예에서, 실시예 28A에서 온도 민감성 일차 히트로써 확인된 hMMP-1 돌연변이체를 14ml 배양튜브에서 발현시키고, 이들의 효소활성을 25℃, 34℃ 및 37℃에서 1시간, 2시간 또는 하룻밤 동안 측정하여, 상승된 온도에서 활성이 감소되는 원하는 표현형을 확인하였다. 96-웰 플레이트보다는 14ml 튜브에서 발현을 수행한 점을 제외하고, 실시예 27에서와 같이 단백질을 발현시키고 정제하였다.
각 hMMP-1 돌연변이체 상청액 4μl을 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 반응온도 25℃, 34℃ 또는 37℃에서 2시간 동안 용액을 배양한 점을 제외하고, 실시예 28A 이상에서 기술된 바와 같이 상청액을 APMA로 활성화시켰다. 상기와 같이, 활성화 이후, 10μM Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2 형광기질을 함유한 TCNB 100μl를 지시된 반응온도(25℃, 34℃ 또는 37℃)에서 1시간 동안 각 튜브에 첨가하였다. 야생형 hMMP-1를 양성대조군으로서 사용하고, 상기 벡터로 형질전환된 세포의 상청액을 음성대조군으로서 사용하였다. 320nm 여기/405nm 발광에서 형광 플레이트 리더기로 형광을 측정함으로써 형광을 검출하였다. 상대적인 형광 유닛(RFU)을 측정하였다. 각각의 시료, 반응온도, 그리고 양성 및 음성 대조군에 대하여 듀플리케이트 반응을 수행하였다.
하기 표 24A(1시간 배양); 표 24B(2시간 배양); 및 표 24C(하룻밤 동안 배양)에 데이터를 나타내었다. 25℃에서는 활성이나, 34℃ 또는 37℃에서는 적어도 33% 감소된 활성을 나타내는 (즉, 임의의 측정된 시점 조건 하에서 1.5와 동등하거나 이보다 큰 25℃ 및 34℃의 활성 비율, 또는 25℃ 및 37℃의 활성 비율을 가지는) 돌연변이체를 온도 민감성 히트(Hits)로서 확인하였다. 하기 표 24A-24C는 상승된 온도에서 효소활성이 감소된 것으로 확인된 64개의 hMMP-1 돌연변이체들의 hMMP-1 돌연변이, 25℃, 34℃ 및 37℃에서 RFU, 그리고 활성 비율(25℃/34℃ 및 25℃/37℃ 모두에서)을 목록화하고 있다. hMMP-1 돌연변이체 중 일부는 상승된 온도에서보다도 25℃에서 더 현저히 활성이었다. 예를 들어, hMMP-1 돌연변이체 D179N(서열번호:368)는 하룻밤 배양 후 37℃보다도 25℃에서 87.5% 더 활성이었다(예를 들어, 표 24C 참조). 추가로, 발현수준, 따라서 전체 RFU값이 다른 실험에서 서로 다를지라도 활성 비율은 동일하게 유지된다. 예를 들어, 돌연변이체 D156T를 2번 측정하였고(하기 표 24C), 비록 각 시험에서 다른 데이타 RFU값이 나왔지만, 값의 비율은 유사하였고, 일관되게 1.5 비율 파라미터 내이었다.
[표 24A] 온도 민감성 hMMP -1 돌연변이체, 1시간 배양
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
[표 24B] 온도 민감성 hMMP -1 돌연변이체, 2시간 배양
Figure pct00085
Figure pct00086
[표 24C] 온도 민감성 hMMP -1 돌연변이체, 하룻밤 동안 배양
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
하기 표 25는 형광기질과 하룻밤 동안 배양 후, hMMP-1 돌연변이체의 잔류활성(hMMP-1 돌연변이체 RFU/wt hMMP-1 RFU의 비율)을 도시하고 있다. 25℃, 34℃ 또는 37℃에서 돌연변이체의 활성을 각각의 온도에서 야생형 hMMP-1의 활성과 비교하였다. 25℃에서, 5개의 hMMP-1 돌연변이체(E180F, E180Y, D156T, D156K, R150P)는 1초과의 잔류활성으로 지시된 바와 같이 야생형 hMMP-1보다 더욱 활성이었다. 상승된 온도에서, 모든 hMMP-1 돌연변이체는 야생형 hMMP-1과 동일온도에서 비교했을때 전체적인 활성감소를 보였고, 따라서 온도 민감성 돌연변이체로서 hMMP-1 돌연변이체의 표현형을 확인할 수 있었다.
[표 25] hMMP -1 온도 민감성 돌연변이체의 잔류활성, 하룻밤 동안 배양
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
C. hMMP -1 탑 돌연변이체 히트
탑(top) 히트 위치에서 열네개(14)의 위치를 확인하였다: 95, 105, 150, 156, 159, 179, 180, 182, 185, 187, 198, 227, 234 및 240. 1) 활성 비율(25℃ 대 37℃, 및 25℃ 대 34℃); 및 2) 활성(RFUs)을 포함한 두가지 기준에 기초하여, 14개의 위치에서 스물세개(23)의 hMMP-1 돌연변이체를 탑 히트로써 선택하였다. 하기 표 26에 목록화된 모든 돌연변이체는 2000 초과의 활성 및 2 초과의 25℃ 대 37℃의 비율을 가졌다. **로 확인된 11개의 히트는 비율 또는 활성과 활성수준 둘다에서 상위를 차지하는 히트들이며, 실시예 29에서 기술된 바와 같은 조합 라이브러리를 만드는데 사용하였다.
[표 26] 탑 히트
Figure pct00094
실시예 29
조합 hMMP -1 변이체 라이브러리
본 실시예에서, 실시예 28C에서 선택되고 표 26에 이중별표(**)로 나타낸 돌연변이체로부터 조합 hMMP-1 변이체 라이브러리를 만들었다. 위치 182, 185 및 187의 돌연변이는 상기 위치들이 hMMP-1 촉매활성에 중요하기 때문에 조합 라이브러리 생산에서 제외하였다. 라이브러리는 선택된 돌연변이체 각각을 위한 아미노산 변이체의 모든 가능한 조합을 포함하였다. 표 27은 라이브러리에 포함된 모든 돌연변이체 조합을 도시하고 있다. 표시된 위치는 서열번호:327에 기재된 hMMP-1의 아미노산 잔기에 해당하는 위치에 관한 것이다. 각 열과 행은 언급된 돌연변이를 포함하는 하나의 폴리펩티드를 지시한다. 예를 들어, 156K 179N 227E는 서열번호:327에 기재된 위치에 해당하는 위치에서, 156 위치에서 D가 K로, 179 위치에서 D가 N으로, 및 227 위치에서 V가 E로의, 세개의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 실시예 27에서 기술한 바와 같이 라이브러리를 만들고 발현시켰다.
[표 27] 조합 라이브러리 돌연변이체
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
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Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
실시예 30
온도감소 후에 효소활성의 가역성
본 실시예에서, 실시예 28B에서 확인된 온도 민감성 hMMP-1 돌연변이체가 상승한 온도에 노출된 다음 25℃로 복귀된 후에, 25℃에서 효소활성이 가역적인지 또는 비가역적인지를 결정하기 위해 추가로 분석하였다. 실시예 28B에서 기술된 바와 같이, hMMP-1 돌연변이체를 14ml 배양튜브에 발현시켰다. 추정 히트(Hit)를 다섯가지 조건하: 25℃, 34℃ 또는 37℃에서, 및 34℃ 또는 37℃에서 이들의 활성을 측정하고, 그다음 25℃의 필요온도에 재-노출시켰다(반응조건은 표 16을 참조). 34℃ 또는 37℃로 상승됐을 때 감소된 활성을 보이고(즉, 25℃/34℃ 또는 25℃/37℃에서 활성 비율이 1.5와 동일하거나 그보다 큼), 25℃로 다시 낮추어졌을 때 기준치 활성을 나타내는, 25℃에서 활성인 돌연변이체를 "가역성 히트"로서 기록하였다. 34℃ 또는 37℃로 상승됐을 때 감소된 활성을 보이고(즉, 25℃/34℃ 또는 25℃/37℃에서 활성 비율이 1.5와 동일하거나 그보다 큼), 25℃로 다시 낮추어졌을 때 동량의 활성 감소를 나타내는, 25℃에서 활성인 돌연변이체를 "비가역성 히트"로써 기록하였다.
A. 반응조건
hMMP-1 돌연변이체 각각의 효소활성의 가역성을 하기에서 수정한 대로 이전에 기술된 형광분석을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 각각의 hMMP-1 돌연변이체의 상청액 4ul를 1mM APMA 함유 TCNB로 희석하고, 96-웰 플레이트로 옮겼다. 표 16에 기재된 바와 같이 각각의 hMMP-1 돌연변이체에 대하여 다섯개의 다른 웰을 준비하였다. 용액을 초기 반응온도(25℃, 34℃ 또는 37℃)에서 2시간 동안 배양하였다. 본 활성화 단계는 프로펩티드를 절단하고 성숙한 hMMP-1을 생산한다.
활성화 이후, 10μM Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2 형광기질 함유 TCNB 100μl를 각 웰에 첨가하였고, 반응조건은 하기 표 28에 요약된 바와 같았다. 요약하면, 초기 온도에서 한시간 동안 형광생성 기질 존재하에 hMMP-1 돌연변이체를 배양함으로써, 각각의 hMMP-1 돌연변이체를 각각의 다섯개의 반응조건에 노출시켰다. 각각의 돌연변이체에 대하여, 25℃, 34℃ 또는 37℃에서 기준치 활성을 추가 1시간(2시간 조건) 또는 하룻밤(하룻밤 동안 조건) 동안 기질과 배양한 다음, 형광을 측정함으로써 평가하였다. 활성의 가역성/비가역성을 평가하기 위하여, 34℃ 또는 37℃에서 초기 1시간 동안 배양한 시료를 25℃로 낮추고, 1시간(2시간 조건) 또는 16시간(하룻밤 동안 조건) 중의 어느 하나로 배양한 다음, 형광을 측정하였다. 야생형 hMMP-1를 양성대조군로써 사용하고, 벡터로만 형질전환된 세포의 상청액을 음성대조군으로 사용하였다. 320nm 여기/405nm 발광에서 형광 플레이트 리더기로 형광을 측정함으로써 형광을 검출하였다. 상대적 형광 유닛(RFU)을 결정하였다. 각각의 시료, 반응온도, 및 양성 및 음성 대조군에 대하여 듀플리케이트 반응을 수행하였다.
[표 28] 반응조건
Figure pct00114
B. 결과: 부분적으로 가역적인 hMMP -1 돌연변이체
26개의 hMMP-1 돌연변이체가 부분적으로 가역적인 것으로 측정하였다. 비록 활성(RFU)이 25℃에서 관찰된 기준치 활성으로 복귀되지 않았지만, 온도가 25℃로 복귀되었을 때 34℃ 또는 37℃에서의 활성에 비해 전반적인 활성 증가가 관찰되었다. 결과는 하기 표 29-32에 나타나 있고, 활성(RFU) 및 활성 비율을 목록화하고 있다. 표 29 및 30은 2시간 조건하에 hMMP-1 부분적으로 가역적인 돌연변이체의, 34℃ 또는 37℃에서 각각의 가역성 결과를 요약하고 있다. 표 31 및 32는 각각 하룻밤 동안 조건하에 hMMP-1 부분적으로 가역적인 돌연변이체의 34℃ 또는 37℃에서 가역성 결과를 요약하고 있다. 그 결과는 모든 반응조건, 온도 및 시간에서 유사하다. 34℃ 또는 37℃에서 하룻밤 동안의 활성은 34℃ 또는 37℃에서 1시간 동안 배양 후 25℃에서 하룻밤 동안 배양했을 때보다 낮았다. 예를 들어, 34℃에서 E180Y의 활성은 6080RFU이나, 34℃ 이후 25℃에서 하룻밤 동안의 활성은 8570RFU로 증가하였다(하기 표 31 참조).
[표 29] 부분적으로 가역적인 hMMP -1 돌연변이체 (2시간, 34℃)
Figure pct00115
Figure pct00116
[표 30] 부분적으로 가역적인 hMMP -1 돌연변이체 (2시간, 37℃)
Figure pct00117
Figure pct00118
[표 31] 부분적으로 가역적인 hMMP -1 돌연변이체 (하룻밤 동안, 34℃)
Figure pct00119
[표 32] 부분적으로 가역적인 hMMP -1 돌연변이체 (하룻밤 동안, 37℃)
Figure pct00120
C. 결과: 비가역적인 hMMP-1 돌연변이체
38개의 hMMP-1 돌연변이체는 비역적인 것으로 측정되었다. 25℃에서 활성과 비교하여 감소된, 34℃ 또는 37℃에서 상기 돌연변이체의 활성은 25℃로 낮추었을 때 여전히 감소된 채 유지되었다. 그 결과는 하기 표 33-36에 제시되어 있으며, 활성(RFUs) 및 활성 비율이 목록화되어 있다. 표 33 및 34는 각각 2시간 조건하에서 hMMP-1 비가역성 돌연변이체의 34℃ 또는 37℃에서 결과를 요약하고 있다. 표 35 및 36은 각각 하룻밤 동안 조건하에서 비가역성 hMMP-1 돌연변이체의 34℃ 또는 37℃에서 가역성 결과를 요약하고 있다. 그 결과는 모든 반응조건, 온도 및 시간에서 유사하다. 34℃ 또는 37℃에서 하룻밤 동안의 활성은 34℃ 또는 37℃에서 1시간 동안 배양 후 25℃에서 하룻밤 동안 배양했을 때 활성과 동일하거나 유사하다. 예를 들어, 34℃에서 D105R의 활성은 1407RFU이고, 34℃ 이후 25℃에서 하룻밤 동안의 활성은 1424RFU이다(하기 표 35 참조).
[표 33] 비가역성 hMMP -1 돌연변이체 (2시간, 34℃)
Figure pct00121
[표 34] 비가역성 hMMP -1 돌연변이체 (2시간, 37℃)
Figure pct00122
[표 35] 비가역성 hMMP -1 돌연변이체 (하룻밤 동안, 34℃)
Figure pct00123

[표 36] 비가역성 hMMP -1 돌연변이체 (하룻밤 동안, 37℃)
Figure pct00124
실시예 31
불용성 콜라겐에 대한 hMMP -1의 단백질분해 활성
본 실시예에서, SDS-PAGE 분석을 이용하여 단백질 기질 콜라겐에 대한 hMMP-1의 콜라게나제 활성을 평가하였다. 야생형 hMMP-1은 불용성 콜라겐(α1(I) 및 α2(I) 사슬)을 4분의 3(three-quarter) 및 4분의 1(one-quarter) 길이의 소화물로 절단한다. 상기 분석에서, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)-접합 콜라겐을 기질로써 사용하고, 반응 생성물의 SDS-PAGE에 의해 반응을 모니터링하였다. α1(I) 및 α2(I) 콜라겐 사슬의 절단으로 4분의 3 및 4분의 1 길이의 소화산물이 생성되고, 이는 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 분리에 의해 전체 길이의 콜라겐과 구별될 수 있다. 대안적으로, 형광측정법에 의해 절단을 평가하였다. 25℃ 대 34℃ 또는 37℃에서 절단활성에 대한 돌연변이체 hMMPs의 활성을 평가하는데 유사한 분석을 사용할 수 있다.
A. SDS - PAGE 분석
요약하면, hMMP-1(R&D 시스템스로부터 구입, #901-MP; 또는 실시예 27에서 기술된 바와 같이 정제된 BAP006_2 및 BAP006_10) 2μg을 1mM AMPA 함유 TCNB로 희석하고, 반응온도(25℃ 또는 37℃)에서 2시간 동안 배양하였다. 본 활성화 단계는 프로펩티드를 절단하고, 성숙한 hMMP-1을 생산한다. 그다음 20μl TCNB내 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 불용성 콜라겐(Anaspec #85111 또는 Sigma 콜라겐 #C4361) 6μg을 각각의 활성화된 hMMP-1 분액에 첨가하고, 그 혼합물을 25℃ 또는 37℃에서 24시간 또는 6일 동안 배양하였다.
불용성 콜라겐의 절단은 SDS/PAGE로 관찰하였다. 반응혼합물을 7.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하고, 쿠마시블루 염료로 염색함으로써 가시화하였다. SDS/PAGE 결과는 25℃ 또는 37℃에서 24시간 배양 후, hMMP-1이 측정된 모든 hMMP-1 단백질에 대해 α1(I) 및 α2(I) 콜라겐 사슬을 ¾ 및 ¼ 길이의 소화산물로 부분적으로 절단함을 보여준다. 25℃에서 6일 후, ¾ 및 ¼ 길이의 소화산물로의 완전한 절단이 관찰되었다. ¾ 및 ¼ 길이의 콜라겐 소화산물은 체온에서 열적으로 불안정하다.
B. 형광측정법
대안적으로, 콜라게나제 활성을 형광분석을 이용하여 측정하였다. hMMP-1(R&D 시스템스로부터 구입, #901-MP; 또는 실시예 27에서 기술된 바와 같이 정제된 BAP006_2 및 BAP006_10) 5μg을 1mM AMPA 함유 TCNB로 최종농도까지 희석하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. FITC-표지 콜라겐(Sigma #C4361 또는 엘라스틴 #CF308)에 대한 hMMP-1 활성을 Baici A 등(1980) Anal. Biochem.,108:230-232)로부터 조정된 프로토콜을 이용하여 측정하였다. 요약하면, hMMP-1을 37℃에서 144시간 동안 기질과 배양하였다. 음성대조군으로서, 기질을 완충액만으로 배양하였다. 배양후, 반응혼합물을 먼저 원심분리하여 불용성 입자를 제거하였다. 상청액의 형광을 495nm 여기/520nm 발광에서 형광 플레이트 리더기로 형광을 측정함으로써 검출하였다. 상대적 형광 유닛(RFU)을 측정하였다. 각 시료에 대하여 듀플리케이트 반응을 수행하였다.
그 결과(하기 표 37 및 38 참조)는 야생형 hMMP-1과 불용성 콜라겐의 37℃에서 144시간 동안의 배양이 완충액 단독 대조군과 비교하여 높은 RFU값으로 지시되는 바와 같이 콜라겐의 절단을 초래하였음을 보여준다. 예를 들어, 시그마의 콜라겐의 절단에 대하여, 약 400.00의 RFU값을 가지는 완충액 단독과 비교하여, 시험된 모든 hMMPs는 약 1000.00-1200.00 사이의 RFU를 가졌다. 시그마 불용성 콜라겐의 절단에 대한 CHO-S(BAP006_2) 및 BL21 세포(BAP006_10)로부터 정제된 콜라겐의 활성은 R&D 시스템스로부터 구입한 hMMP-1과 비슷하였다. 엘라스틴 콜라겐의 절단에 대하여, BAP006_2의 활성은 약 2000.00RFU인 반면, R&D로부터 구입한 재조합 hMMP-1 및 BAP006_10의 활성은 약 3000.00RFU이었다. 완충액 단독은 약 1500.00RFU의 엘라스틴 콜라겐 절단에 대한 백그라운드 형광을 보였다.
[표 37] 콜라겐의 절단(시그마 불용성 기질)
Figure pct00125
[표 38] 콜라겐의 절단(엘라스틴 불용성 기질)
Figure pct00126
변경이 당 분야의 당업자에게 명확할 것이므로, 본 발명이 첨부된 청구항의 범위만으로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme Inc. <120> In Vivo Temporal Control of Activatable Matrix-Degrading Enzymes <130> P10-059-INP-KNL <140> PCT/US2009/001486 <141> 2009-03-06 <150> US 61/127,725 <151> 2008-05-14 <150> US 61/068,667 <151> 2008-03-06 <160> 537 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Cathepsin L mature <220> <223> cathepsin L1 heavy chain 1-175 <220> <223> cathepsin L1 light chain 179-220 <400> 1 Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val 1 5 10 15 Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr Gly 20 25 30 Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu Gly 50 55 60 Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp Asn 65 70 75 80 Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu Glu 85 90 95 Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly Phe 100 105 110 Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala Thr 115 120 125 Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe Leu 130 135 140 Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu Asp 145 150 155 160 Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr Glu 165 170 175 Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu Glu 180 185 190 Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn His 195 200 205 Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val 210 215 220 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> kappa IgG heterologous signal sequence <400> 2 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Gly 20 <210> 3 <211> 1032 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Optimized synthetic Cat-L construct with heterologous signal sequence and Nhe1 and BamHI restriction sites <400> 3 gctagcatgg acatgcgcgt acctgctcag ttgttggggc tcttgctgct gtggttgccc 60 ggggcacgtg ggactctgac cttcgaccat tcactggagg cccagtggac taagtggaag 120 gctatgcata atcgacttta cggcatgaac gaggagggtt ggcggcgggc tgtgtgggag 180 aagaatatga aaatgatcga actgcataac caggaataca gagagggcaa gcacagtttt 240 accatggcaa tgaatgcatt tggggacatg actagcgagg aatttcggca agtgatgaat 300 ggtttccaga atcgcaagcc aagaaaaggg aaggtcttcc aggagcccct cttctacgag 360 gcccctcgta gtgtcgactg gcgggagaaa ggctacgtga caccagtcaa aaaccagggc 420 caatgcggct cctgctgggc attttctgcc accggtgctc tggaaggaca aatgttcagg 480 aagactggcc gtctcatctc cttgtccgaa cagaacctgg tggactgctc cgggccacag 540 gggaatgagg ggtgcaacgg ggggcttatg gactacgcct tccagtacgt gcaggataat 600 gggggtctcg attccgagga atcctacccc tacgaagcaa ctgaggaatc ttgcaagtat 660 aaccctaagt attccgtggc aaatgatact ggcttcgtgg atatccctaa acaggaaaag 720 gccctcatga aggccgtagc caccgtgggc cccatctctg tcgcaattga cgctggtcac 780 gagtctttcc tcttctataa ggaaggtata tactttgaac ccgattgcag cagtgaggac 840 atggatcatg gcgtactcgt cgtcgggtat ggttttgaga gtaccgaatc agataataat 900 aaatattggc tggtgaaaaa cagctggggt gaggagtggg gtatgggtgg ctacgtcaag 960 atggccaagg accgtaggaa ccattgtggt atcgcatctg ctgcatctta tcccactgtg 1020 taatagggat cc 1032 <210> 4 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Optimized synthetic Cat-L construct with heterologous signal sequence <400> 4 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Gly Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala 20 25 30 Gln Trp Thr Lys Trp Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn 35 40 45 Glu Glu Gly Trp Arg Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile 50 55 60 Glu Leu His Asn Gln Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met 65 70 75 80 Ala Met Asn Ala Phe Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val 85 90 95 Met Asn Gly Phe Gln Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln 100 105 110 Glu Pro Leu Phe Tyr Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys 115 120 125 Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp 130 135 140 Ala Phe Ser Ala Thr Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr 145 150 155 160 Gly Arg 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tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa 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cttgcaagta taaccctaag tattccgtgg caaatgatac 1740 tggcttcgtg gatatcccta aacaggaaaa ggccctcatg aaggccgtag ccaccgtggg 1800 ccccatctct gtcgcaattg acgctggtca cgagtctttc ctcttctata aggaaggtat 1860 atactttgaa cccgattgca gcagtgagga catggatcat ggcgtactcg tcgtcgggta 1920 tggttttgag agtaccgaat cagataataa taaatattgg ctggtgaaaa acagctgggg 1980 tgaggagtgg ggtatgggtg gctacgtcaa gatggccaag gaccgtagga accattgtgg 2040 tatcgcatct gctgcatctt atcccactgt gtaataggga tccatagcta acgcccctct 2100 ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt 2160 gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct 2220 ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa 2280 ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg 2340 tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc 2400 caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg 2460 agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg 2520 aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc 2580 tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg 2640 gttttccttt gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc cacagcggcc gctgccatca 2700 tggttcgacc attgaactgc atcgtcgccg tgtcccaaaa tatggggatt ggcaagaacg 2760 gagacctacc ctggcctccg ctcaggaacg agttcaagta cttccaaaga atgaccacaa 2820 cctcttcagt ggaaggtaaa cagaatctgg tgattatggg taggaaaacc tggttctcca 2880 ttcctgagaa gaatcgacct ttaaaggaca gaattaatat agttctcagt agagaactca 2940 aagaaccacc acgaggagct cattttcttg ccaaaagttt ggatgatgcc ttaagactta 3000 ttgaacaacc ggaattggca agtaaagtag acatggtttg gatagtcgga ggcagttctg 3060 tttaccagga agccatgaat caaccaggcc acctcagact ctttgtgaca aggatcatgc 3120 aggaatttga aagtgacacg tttttcccag aaattgattt ggggaaatat aaacttctcc 3180 cagaataccc aggcgtcctc tctgaggtcc aggaggaaaa aggcatcaag tataagtttg 3240 aagtctacga gaagaaagac taaacgcgtg gtacctctag agtcgacctg ggcggccgct 3300 tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 3360 aaaaaaatgc tttatttgtg 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ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 4260 ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 4320 tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 4380 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 4440 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 4500 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 4560 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 4620 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 4680 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 4740 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 4800 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 4860 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 4920 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 4980 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 5040 ccacgatgcc tgtagcaatg 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tccaccgagt cagacaacaa taaatactgg ttggtgaaaa actcctgggg 1980 ggaggagtgg ggcatgggcg gatacgtgaa gatggccaaa gacagaagga atcactgtgg 2040 aatcgcatct gctgccagct atccaactgt aggaggaggc ggttcaggtc accaccacca 2100 tcaccactag tgaggatcca tagctaacgc ccctctccct cccccccccc taacgttact 2160 ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata 2220 ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt 2280 cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa 2340 gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag 2400 cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca 2460 cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc 2520 aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat 2580 tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta 2640 aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga 2700 taagcttgcc acaacccaca gcggccgctg ccatcatggt tcgaccattg aactgcatcg 2760 tcgccgtgtc ccaaaatatg gggattggca agaacggaga cctaccctgg cctccgctca 2820 ggaacgagtt caagtacttc caaagaatga ccacaacctc ttcagtggaa ggtaaacaga 2880 atctggtgat tatgggtagg aaaacctggt tctccattcc tgagaagaat cgacctttaa 2940 aggacagaat taatatagtt ctcagtagag aactcaaaga accaccacga ggagctcatt 3000 ttcttgccaa aagtttggat gatgccttaa gacttattga acaaccggaa ttggcaagta 3060 aagtagacat ggtttggata gtcggaggca gttctgttta ccaggaagcc atgaatcaac 3120 caggccacct cagactcttt gtgacaagga tcatgcagga atttgaaagt gacacgtttt 3180 tcccagaaat tgatttgggg aaatataaac ttctcccaga atacccaggc gtcctctctg 3240 aggtccagga ggaaaaaggc atcaagtata agtttgaagt ctacgagaag aaagactaaa 3300 cgcgtggtac ctctagagtc gacctgggcg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 3360 tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 3420 ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 3480 caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggagatg tgggaggttt tttaaagcaa 3540 gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taagtatccg ggctggcgta atagcgaaga 3600 ggcccgcacc 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tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 4500 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 4560 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 4620 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 4680 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 4740 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 4800 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 4860 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 4920 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 4980 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 5040 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 5100 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 5160 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 5220 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 5280 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 5340 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 5400 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 5460 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 5520 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 5580 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 5640 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 5700 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 5760 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 5820 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 5880 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 5940 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 6000 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 6060 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 6120 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 6180 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catggctcga cagatct 6237 <210> 9 <211> 333 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human Cat-L protein containing heterologous secretory signal <400> 9 Met Asp Pro Thr Leu Ile Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser 1 5 10 15 Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala Gln Trp Thr Lys Trp 20 25 30 Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn Glu Glu Gly Trp Arg 35 40 45 Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gln 50 55 60 Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe 65 70 75 80 Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe Tyr 100 105 110 Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro 115 120 125 Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr 130 135 140 Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser 145 150 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aacggggctc tccctgatga 540 cctgaagcag ggccggttgc tggttgtgga ctatgccacc tgctccagct ctggctggtg 600 gggcagcacc gtgaagacga atatgatctg tgctgggggt gatggcgtga tatgcacctg 660 caacggagac tccggtgggc cgctgaactg tcaggcatct gacggccggt gggaggtgca 720 tggcatcggc agcctcacgt cggtccttgg ttgcaactac tactacaagc cctccatctt 780 cacgcgggtc tccaactaca acgactggat caattcggtg attgcaaata actaaccaaa 840 agaagtccct gggactgttt cagacttgga aaggtcacag aaggaaaata atattatata 900 aagtgacaac tatgcaaatc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 941 <210> 26 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Elastase-2B precursor <400> 26 Met Ile Arg Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Val Ala Gly Ala Leu Ser 1 5 10 15 Cys Gly Val Ser Thr Tyr Ala Pro Asp Met Ser Arg Met Leu Gly Gly 20 25 30 Glu Glu Ala Arg Pro Asn Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr 35 40 45 Ser Ser Asn Gly Gln Trp Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala 50 55 60 Asn Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Ser Ser Arg Ile 65 70 75 80 Tyr Arg Val Met Leu Gly Gln His Asn Leu Tyr Val Ala Glu Ser Gly 85 90 95 Ser Leu Ala Val Ser Val Ser Lys Ile Val Val His Lys Asp Trp Asn 100 105 110 Ser Asn Gln Val Ser Lys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ala 115 120 125 Asn Pro Val Ser Leu Thr Asp Lys Ile Gln Leu Ala Cys Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Gly Thr Ile Leu Pro Asn Asn Tyr Pro Cys Tyr Val Thr Gly Trp 145 150 155 160 Gly Arg Leu Gln Thr Asn Gly Ala Leu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Gly 165 170 175 Arg Leu Leu Val Val Asp Tyr Ala Thr Cys Ser Ser Ser Gly Trp Trp 180 185 190 Gly Ser Thr Val Lys Thr Asn Met Ile Cys Ala Gly Gly Asp Gly Val 195 200 205 Ile Cys Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Gln Ala 210 215 220 Ser Asp Gly Arg Trp Glu Val His Gly Ile Gly Ser Leu Thr Ser Val 225 230 235 240 Leu Gly Cys Asn Tyr Tyr Tyr Lys Pro Ser Ile Phe Thr Arg Val Ser 245 250 255 Asn Tyr Asn Asp Trp Ile Asn Ser Val Ile Ala Asn Asn 260 265 <210> 27 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Elastase-2B mature <400> 27 Met Leu Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Asn Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Ser Ser Asn Gly Gln Trp Tyr His Thr Cys Gly Gly 20 25 30 Ser Leu Ile Ala Asn Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser 35 40 45 Ser Ser Arg Ile Tyr Arg Val Met Leu Gly Gln His Asn Leu Tyr Val 50 55 60 Ala Glu Ser Gly Ser Leu Ala Val Ser Val Ser Lys Ile Val Val His 65 70 75 80 Lys Asp Trp Asn Ser Asn Gln Val Ser Lys Gly Asn Asp Ile Ala Leu 85 90 95 Leu Lys Leu Ala Asn Pro Val Ser Leu Thr Asp Lys Ile Gln Leu Ala 100 105 110 Cys Leu Pro Pro Ala Gly Thr Ile Leu Pro Asn Asn Tyr Pro Cys Tyr 115 120 125 Val Thr Gly Trp Gly Arg Leu Gln Thr Asn Gly Ala Leu Pro Asp Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Arg Leu Leu Val Val Asp Tyr Ala Thr Cys Ser Ser 145 150 155 160 Ser Gly Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Thr Asn Met Ile Cys Ala Gly 165 170 175 Gly Asp Gly Val Ile Cys Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 180 185 190 Asn Cys Gln Ala Ser Asp Gly Arg Trp Glu Val His Gly Ile Gly Ser 195 200 205 Leu Thr Ser Val Leu Gly Cys Asn Tyr Tyr Tyr Lys Pro Ser Ile Phe 210 215 220 Thr Arg Val Ser Asn Tyr Asn Asp Trp Ile Asn Ser Val Ile Ala Asn 225 230 235 240 Asn <210> 28 <211> 938 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Neutrophil elastase precursor <400> 28 gcacggaggg gcagagaccc cggagcccca gccccaccat gaccctcggc cgccgactcg 60 cgtgtctttt cctcgcctgt gtcctgccgg ccttgctgct ggggggcacc gcgctggcct 120 cggagattgt ggggggccgg cgagcgcggc cccacgcgtg gcccttcatg gtgtccctgc 180 agctgcgcgg aggccacttc tgcggcgcca ccctgattgc gcccaacttc gtcatgtcgg 240 ccgcgcactg cgtggcgaat gtaaacgtcc gcgcggtgcg ggtggtcctg ggagcccata 300 acctctcgcg gcgggagccc acccggcagg tgttcgccgt gcagcgcatc ttcgaaaacg 360 gctacgaccc cgtaaacttg ctcaacgaca tcgtgattct ccagctcaac gggtcggcca 420 ccatcaacgc caacgtgcag gtggcccagc tgccggctca gggacgccgc ctgggcaacg 480 gggtgcagtg cctggccatg ggctggggcc ttctgggcag gaaccgtggg atcgccagcg 540 tcctgcagga gctcaacgtg acggtggtga cgtccctctg ccgtcgcagc aacgtctgca 600 ctctcgtgag gggccggcag gccggcgtct gtttcgggga ctccggcagc cccttggtct 660 gcaacgggct aatccacgga attgcctcct tcgtccgggg aggctgcgcc tcagggctct 720 accccgatgc ctttgccccg gtggcacagt ttgtaaactg gatcgactct atcatccaac 780 gctccgagga caacccctgt ccccaccccc gggacccgga cccggccagc aggacccact 840 gagaagggct gcccgggtca cctcagctgc ccacacccac actctccagc atctggcaca 900 ataaacattc tctgttttgt agaaaaaaaa aaaaaaaa 938 <210> 29 <211> 267 <212> PRT <213> Homno sapiens <220> <223> Neutrophil elastase precursor <400> 29 Met Thr Leu Gly Arg Arg Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ala Cys Val Leu 1 5 10 15 Pro Ala Leu Leu Leu Gly Gly Thr Ala Leu Ala Ser Glu Ile Val Gly 20 25 30 Gly Arg Arg Ala Arg Pro His Ala Trp Pro Phe Met Val Ser Leu Gln 35 40 45 Leu Arg Gly Gly His Phe Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ala Pro Asn Phe 50 55 60 Val Met Ser Ala Ala His Cys Val Ala Asn Val Asn Val Arg Ala Val 65 70 75 80 Arg Val Val Leu Gly Ala His Asn Leu Ser Arg Arg Glu Pro Thr Arg 85 90 95 Gln Val Phe Ala Val Gln Arg Ile Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Val 100 105 110 Asn Leu Leu Asn Asp Ile Val Ile Leu Gln Leu Asn Gly Ser Ala Thr 115 120 125 Ile Asn Ala Asn Val Gln Val Ala Gln Leu Pro Ala Gln Gly Arg Arg 130 135 140 Leu Gly Asn Gly Val Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly Leu Leu Gly 145 150 155 160 Arg Asn Arg Gly Ile Ala Ser Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val 165 170 175 Val Thr Ser Leu Cys Arg Arg Ser Asn Val Cys Thr Leu Val Arg Gly 180 185 190 Arg Gln Ala Gly Val Cys Phe Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys 195 200 205 Asn Gly Leu Ile His Gly Ile Ala Ser Phe Val Arg Gly Gly Cys Ala 210 215 220 Ser Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Phe Ala Pro Val Ala Gln Phe Val Asn 225 230 235 240 Trp Ile Asp Ser Ile Ile Gln Arg Ser Glu Asp Asn Pro Cys Pro His 245 250 255 Pro Arg Asp Pro Asp Pro Ala Ser Arg Thr His 260 265 <210> 30 <211> 238 <212> PRT <213> Homno sapiens <220> <223> Neutrophil elastase mature <400> 30 Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Arg Pro His Ala Trp Pro Phe Met Val 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gly His Phe Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ala 20 25 30 Pro Asn Phe Val Met Ser Ala Ala His Cys Val Ala Asn Val Asn Val 35 40 45 Arg Ala Val Arg Val Val Leu Gly Ala His Asn Leu Ser Arg Arg Glu 50 55 60 Pro Thr Arg Gln Val Phe Ala Val Gln Arg Ile Phe Glu Asn Gly Tyr 65 70 75 80 Asp Pro Val Asn Leu Leu Asn Asp Ile Val Ile Leu Gln Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Ala Thr Ile Asn Ala Asn Val Gln Val Ala Gln Leu Pro Ala Gln 100 105 110 Gly Arg Arg Leu Gly Asn Gly Val Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Arg Asn Arg Gly Ile Ala Ser Val Leu Gln Glu Leu Asn 130 135 140 Val Thr Val Val Thr Ser Leu Cys Arg Arg Ser Asn Val Cys Thr Leu 145 150 155 160 Val Arg Gly Arg Gln Ala Gly Val Cys Phe Gly Asp Ser Gly Ser Pro 165 170 175 Leu Val Cys Asn Gly Leu Ile His Gly Ile Ala Ser Phe Val Arg Gly 180 185 190 Gly Cys Ala Ser Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Phe Ala Pro Val Ala Gln 195 200 205 Phe Val Asn Trp Ile Asp Ser Ile Ile Gln Arg Ser Glu Asp Asn Pro 210 215 220 Cys Pro His Pro Arg Asp Pro Asp Pro Ala Ser Arg Thr His 225 230 235 <210> 31 <211> 1001 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Proteinase-3 precursor <400> 31 cgtgggtgca ccctggaccc caccatggct caccggcccc ccagccctgc cctggcgtcc 60 gtgctgctgg ccttgctgct gagcggtgct gcccgagctg cggagatcgt gggcgggcac 120 gaggcgcagc cacactcccg gccctacatg gcctccctgc agatgcgggg gaacccgggc 180 agccacttct gcggaggcac cttgatccac cccagcttcg tgctgacggc cgcgcactgc 240 ctgcgggaca taccccagcg cctggtgaac gtggtgctcg gagcccacaa cgtgcggacg 300 caggagccca cccagcagca cttctcggtg gctcaggtgt ttctgaacaa ctacgacgcg 360 gagaacaaac tgaacgacgt tctcctcatc cagctgagca gcccagccaa cctcagtgcc 420 tccgtcgcca cagtccagct gccacagcag gaccagccag tgccccacgg cacccagtgc 480 ctggccatgg gctggggccg cgtgggtgcc cacgaccccc cagcccaggt cctgcaggag 540 ctcaatgtca ccgtggtcac cttcttctgc cggccacata acatttgcac tttcgtccct 600 cgccgcaagg ccggcatctg cttcggagac tcaggtggcc ccctgatctg tgatggcatc 660 atccaaggaa tagactcctt cgtgatctgg ggatgtgcca cccgcctttt ccctgacttc 720 ttcacgcggg tagccctcta cgtggactgg atccgttcca cgctgcgccg tgtggaggcc 780 aagggccgcc cctgaaccgc ccctcccaca gcgctggccg ggaccccgag cctggctcca 840 aaccctcgag gcggatcttt ggacagaagc agctcttccc cgaacactgt ggcgtccggg 900 acggccccac ccgtcccccc acactccctc ccacggggct ccgggagaca ggccggccct 960 gcacctcacc ccaccgtgac ctcaataaac gttgaaactc c 1001 <210> 32 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteinase-3 precursor <400> 32 Met Ala His Arg Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ala Ser Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Gly Ala Ala Arg Ala Ala Glu Ile Val Gly Gly His 20 25 30 Glu Ala Gln Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Ser Leu Gln Met Arg 35 40 45 Gly Asn Pro Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile His Pro Ser 50 55 60 Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Asp Ile Pro Gln Arg Leu 65 70 75 80 Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg Thr Gln Glu Pro Thr 85 90 95 Gln Gln His Phe Ser Val Ala Gln Val Phe Leu Asn Asn Tyr Asp Ala 100 105 110 Glu Asn Lys Leu Asn Asp Val Leu Leu Ile Gln Leu Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Asn Leu Ser Ala Ser Val Ala Thr Val Gln Leu Pro Gln Gln Asp Gln 130 135 140 Pro Val Pro His Gly Thr Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly Arg Val 145 150 155 160 Gly Ala His Asp Pro Pro Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr 165 170 175 Val Val Thr Phe Phe Cys Arg Pro His Asn Ile Cys Thr Phe Val Pro 180 185 190 Arg Arg Lys Ala Gly Ile Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 195 200 205 Cys Asp Gly Ile Ile Gln Gly Ile Asp Ser Phe Val Ile Trp Gly Cys 210 215 220 Ala Thr Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Tyr Val 225 230 235 240 Asp Trp Ile Arg Ser Thr Leu Arg Arg Val Glu Ala Lys Gly Arg Pro 245 250 255 <210> 33 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteinase-3 mature <400> 33 Ile Val Gly Gly His Glu Ala Gln Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Ser Leu Gln Met Arg Gly Asn Pro Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Thr 20 25 30 Leu Ile His Pro Ser Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Asp 35 40 45 Ile Pro Gln Arg Leu Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg 50 55 60 Thr Gln Glu Pro Thr Gln Gln His Phe Ser Val Ala Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Asp Ala Glu Asn Lys Leu Asn Asp Val Leu Leu Ile Gln 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Ala Asn Leu Ser Ala Ser Val Ala Thr Val Gln Leu 100 105 110 Pro Gln Gln Asp Gln Pro Val Pro His Gly Thr Gln Cys Leu Ala Met 115 120 125 Gly Trp Gly Arg Val Gly Ala His Asp Pro Pro Ala Gln Val Leu Gln 130 135 140 Glu Leu Asn Val Thr Val Val Thr Phe Phe Cys Arg Pro His Asn Ile 145 150 155 160 Cys Thr Phe Val Pro Arg Arg Lys Ala Gly Ile Cys Phe Gly Asp Ser 165 170 175 Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asp Gly Ile Ile Gln Gly Ile Asp Ser Phe 180 185 190 Val Ile Trp Gly Cys Ala Thr Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg 195 200 205 Val Ala Leu Tyr Val Asp Trp Ile Arg Ser Thr Leu Arg 210 215 220 <210> 34 <211> 846 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <223> endogenous vascular elastase <400> 34 atgcacagct ccgtgtacct cgtggctctg gtggtcctgg aggcggctgt atgtgttgcg 60 cagccccgag gtcggattct gggtggccag gaggccatgg cccatgctcg gccctacatg 120 gcttcagtgc aagtgaatgg cacgcacgtg tgcggtggca ccctggtgga tgagcagtgg 180 gtgctgagcg ccgcgcactg catggatgga gtgaccaagg atgaggttgt gcaggtgctc 240 ctgggtgccc actccctgtc cagtcctgaa ccctacaagc atttgtatga tgtgcaaagt 300 gtagtgcttc acccgggcag ccggcctgac agcgttgagg acgacctcat gctctttaag 360 ctctcccaca atgcctcact gggtccccat gtgagacccc tgcccttgca acgcgaggac 420 cgggaggtga aacccggcac gctctgcgat gtggccggtt ggggcgtggt cactcatgcg 480 ggacgcaggc ccgatgtcct gcagcaactg acagtgtcaa tcatggaccg gaacacctgc 540 aatctgcgca cgtaccatga tggggcaatc accaagaaca tgatgtgtgc agagagcaac 600 cgcagggaca cttgcagggg cgactccggc ggtcctctgg tgtgcgggga tgcggtcgaa 660 gctgtggtta cgtggggatc tcgagtctgt ggcaaccgga gaaagccagg tgtctttacc 720 cgcgtggcaa cctacgtgcc gtggattgaa aacgttctga gtggtaacgt gagtgttaac 780 gtgacggcct gaggggacac cggagaccgt gactcacaat aaatgcatgc atctaaaaaa 840 aaaaaa 846 <210> 35 <211> 262 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <223> Endogenous vascular elastase precursor <400> 35 His Ser Ser Val Tyr Leu Val Ala Leu Val Val Leu Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Cys Val Ala Gln Pro Arg Gly Arg Ile Leu Gly Gly Gln Glu Ala Met 20 25 30 Ala His Ala Arg Pro Tyr Met Ala Ser Val Gln Val Asn Gly Thr His 35 40 45 Val Cys Gly Gly Thr Leu Val Asp Glu Gln Trp Val Leu Ser Ala Ala 50 55 60 His Cys Met Asp Gly Val Thr Lys Asp Glu Val Val Gln Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly Ala His Ser Leu Ser Ser Pro Glu Pro Tyr Lys His Leu Tyr Asp 85 90 95 Val Gln Ser Val Val Leu His Pro Gly Ser Arg Pro Asp Ser Val Glu 100 105 110 Asp Asp Leu Met Leu Phe Lys Leu Ser His Asn Ala Ser Leu Gly Pro 115 120 125 His Val Arg Pro Leu Pro Leu Gln Arg Glu Asp Arg Glu Val Lys Pro 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Asp Val Ala Gly Trp Gly Val Val Thr His Ala Gly 145 150 155 160 Arg Arg Pro Asp Val Leu Gln Gln Leu Thr Val Ser Ile Met Asp Arg 165 170 175 Asn Thr Cys Asn Leu Arg Thr Tyr His Asp Gly Ala Ile Thr Lys Asn 180 185 190 Met Met Cys Ala Glu Ser Asn Arg Arg Asp Thr Cys Arg Gly Asp Ser 195 200 205 Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Asp Ala Val Glu Ala Val Val Thr Trp 210 215 220 Gly Ser Arg Val Cys Gly Asn Arg Arg Lys Pro Gly Val Phe Thr Arg 225 230 235 240 Val Ala Thr Tyr Val Pro Trp Ile Glu Asn Val Leu Ser Gly Asn Val 245 250 255 Ser Val Asn Val Thr Ala 260 <210> 36 <211> 238 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <223> endogenous vascular elastase mature <400> 36 Ile Leu Gly Gly Gln Glu Ala Met Ala His Ala Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Ser Val Gln Val Asn Gly Thr His Val Cys Gly Gly Thr Leu Val Asp 20 25 30 Glu Gln Trp Val Leu Ser Ala Ala His Cys Met Asp Gly Val Thr Lys 35 40 45 Asp Glu Val Val Gln Val Leu Leu Gly Ala His Ser Leu Ser Ser Pro 50 55 60 Glu Pro Tyr Lys His Leu Tyr Asp Val Gln Ser Val Val Leu His Pro 65 70 75 80 Gly Ser Arg Pro Asp Ser Val Glu Asp Asp Leu Met Leu Phe Lys Leu 85 90 95 Ser His Asn Ala Ser Leu Gly Pro His Val Arg Pro Leu Pro Leu Gln 100 105 110 Arg Glu Asp Arg Glu Val Lys Pro Gly Thr Leu Cys Asp Val Ala Gly 115 120 125 Trp Gly Val Val Thr His Ala Gly Arg Arg Pro Asp Val Leu Gln Gln 130 135 140 Leu Thr Val Ser Ile Met Asp Arg Asn Thr Cys Asn Leu Arg Thr Tyr 145 150 155 160 His Asp Gly Ala Ile Thr Lys Asn Met Met Cys Ala Glu Ser Asn Arg 165 170 175 Arg Asp Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Asp 180 185 190 Ala Val Glu Ala Val Val Thr Trp Gly Ser Arg Val Cys Gly Asn Arg 195 200 205 Arg Lys Pro Gly Val Phe Thr Arg Val Ala Thr Tyr Val Pro Trp Ile 210 215 220 Glu Asn Val Leu Ser Gly Asn Val Ser Val Asn Val Thr Ala 225 230 235 <210> 37 <211> 924 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Cathepsin G precursor <400> 37 gcacagcagc aactgactgg gcagcctttc aggaaagatg cagccactcc tgcttctgct 60 ggcctttctc ctacccactg gggctgaggc aggggagatc atcggaggcc gggagagcag 120 gccccactcc cgcccctaca tggcgtatct tcagatccag agtccagcag gtcagagcag 180 atgtggaggg ttcctggtgc gagaagactt tgtgctgaca gcagctcatt gctggggaag 240 caatataaat gtcaccctgg gcgcccacaa tatccagaga cgggaaaaca cccagcaaca 300 catcactgcg cgcagagcca tccgccaccc tcaatataat cagcggacca tccagaatga 360 catcatgtta ttgcagctga gcagaagagt cagacggaat cgaaacgtga acccagtggc 420 tctgcctaga gcccaggagg gactgagacc cgggacgctg tgcactgtgg ccggctgggg 480 cagggtcagc atgaggaggg gaacagatac actccgagag gtgcagctga gagtgcagag 540 ggataggcag tgcctccgca tcttcggttc ctacgacccc cgaaggcaga tttgtgtggg 600 ggaccggcgg gaacggaagg ctgccttcaa gggggattcc ggaggccccc tgctgtgtaa 660 caatgtggcc cacggcatcg tctcctatgg aaagtcgtca ggggttcctc cagaagtctt 720 caccagggtc tcaagtttcc tgccctggat aaggacaaca atgagaagct tcaaactgct 780 ggatcagatg gagacccccc tgtgactgac tcttcttctc ggggacacag gccagctcca 840 cagtgttgcc agagccttaa taaacgtcca cagagtataa ataaccaatt cctcatttgt 900 tcattaaacg tcattcagta ctta 924 <210> 38 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Cathepsin G precursor <400> 38 Met Gln Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Leu Pro Thr Gly Ala 1 5 10 15 Glu Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly Arg Glu Ser Arg Pro His Ser Arg 20 25 30 Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Gln Ile Gln Ser Pro Ala Gly Gln Ser Arg 35 40 45 Cys Gly Gly Phe Leu Val Arg Glu Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His 50 55 60 Cys Trp Gly Ser Asn Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Gln 65 70 75 80 Arg Arg Glu Asn Thr Gln Gln His Ile Thr Ala Arg Arg Ala Ile Arg 85 90 95 His Pro Gln Tyr Asn Gln Arg Thr Ile Gln Asn Asp Ile Met Leu Leu 100 105 110 Gln Leu Ser Arg Arg Val Arg Arg Asn Arg Asn Val Asn Pro Val Ala 115 120 125 Leu Pro Arg Ala Gln Glu Gly Leu Arg Pro Gly Thr Leu Cys Thr Val 130 135 140 Ala Gly Trp Gly Arg Val Ser Met Arg Arg Gly Thr Asp Thr Leu Arg 145 150 155 160 Glu Val Gln Leu Arg Val Gln Arg Asp Arg Gln Cys Leu Arg Ile Phe 165 170 175 Gly Ser Tyr Asp Pro Arg Arg Gln Ile Cys Val Gly Asp Arg Arg Glu 180 185 190 Arg Lys Ala Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Asn 195 200 205 Asn Val Ala His Gly Ile Val Ser Tyr Gly Lys Ser Ser Gly Val Pro 210 215 220 Pro Glu Val Phe Thr Arg Val Ser Ser Phe Leu Pro Trp Ile Arg Thr 225 230 235 240 Thr Met Arg Ser Phe Lys Leu Leu Asp Gln Met Glu Thr Pro Leu 245 250 255 <210> 39 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Cathepsin G mature <400> 39 Ile Ile Gly Gly Arg Glu Ser Arg Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Gln Ile Gln Ser Pro Ala Gly Gln Ser Arg Cys Gly Gly Phe 20 25 30 Leu Val Arg Glu Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser 35 40 45 Asn Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Gln Arg Arg Glu Asn 50 55 60 Thr Gln Gln His Ile Thr Ala Arg Arg Ala Ile Arg His Pro Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Arg Thr Ile Gln Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Ser Arg 85 90 95 Arg Val Arg Arg Asn Arg Asn Val Asn Pro Val Ala Leu Pro Arg Ala 100 105 110 Gln Glu Gly Leu Arg Pro Gly Thr Leu Cys Thr Val Ala Gly Trp Gly 115 120 125 Arg Val Ser Met Arg Arg Gly Thr Asp Thr Leu Arg Glu Val Gln Leu 130 135 140 Arg Val Gln Arg Asp Arg Gln Cys Leu Arg Ile Phe Gly Ser Tyr Asp 145 150 155 160 Pro Arg Arg Gln Ile Cys Val Gly Asp Arg Arg Glu Arg Lys Ala Ala 165 170 175 Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Asn Asn Val Ala His 180 185 190 Gly Ile Val Ser Tyr Gly Lys Ser Ser Gly Val Pro Pro Glu Val Phe 195 200 205 Thr Arg Val Ser Ser Phe Leu Pro Trp Ile Arg Thr Thr Met Arg Ser 210 215 220 Phe Lys Leu Leu Asp Gln Met Glu Thr Pro Leu 225 230 235 <210> 40 <211> 784 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> mast cell chymase precursor <400> 40 agcatttgct caggcagcct ctctgggaag atgctgcttc ttcctctccc cctgctgctc 60 tttctcttgt gctccagagc tgaagctggg gagatcatcg ggggcacaga atgcaagcca 120 cattcccgcc cctacatggc ctacctggaa attgtaactt ccaacggtcc ctcaaaattt 180 tgtggtggtt tccttataag acggaacttt gtgctgacgg ctgctcattg tgcaggaagg 240 tctataacag tcacccttgg agcccataac ataacagagg aagaagacac atggcagaag 300 cttgaggtta taaagcaatt ccgtcatcca aaatataaca cttctactct tcaccacgat 360 atcatgttac taaagttgaa ggagaaagcc agcctgaccc tggctgtggg gacactcccc 420 ttcccatcac aattcaactt tgtcccacct gggagaatgt gccgggtggc tggctgggga 480 agaacaggtg tgttgaagcc gggctcagac actctgcaag aggtgaagct gagactcatg 540 gatccccagg cctgcagcca cttcagagac tttgaccaca atcttcagct gtgtgtgggc 600 aatcccagga agacaaaatc tgcatttaag ggagactctg ggggccctct tctgtgtgct 660 ggggtggccc agggcatcgt atcctatgga cggtcggatg caaagccccc tgctgtcttc 720 acccgaatct cccattaccg gccctggatc aaccagatcc tgcaggcaaa ttaatcctgg 780 atcc 784 <210> 41 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mast cell chymase precursor <400> 41 Met Leu Leu Leu Pro Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ala Glu Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His Ser 20 25 30 Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Thr Ser Asn Gly Pro Ser 35 40 45 Lys Phe Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala 50 55 60 Ala His Cys Ala Gly Arg Ser Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala His Asn 65 70 75 80 Ile Thr Glu Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Leu Glu Val Ile Lys Gln 85 90 95 Phe Arg His Pro Lys Tyr Asn Thr Ser Thr Leu His His Asp Ile Met 100 105 110 Leu Leu Lys Leu Lys Glu Lys Ala Ser Leu Thr Leu Ala Val Gly Thr 115 120 125 Leu Pro Phe Pro Ser Gln Phe Asn Phe Val Pro Pro Gly Arg Met Cys 130 135 140 Arg Val Ala Gly Trp Gly Arg Thr Gly Val Leu Lys Pro Gly Ser Asp 145 150 155 160 Thr Leu Gln Glu Val Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Ser 165 170 175 His Phe Arg Asp Phe Asp His Asn Leu Gln Leu Cys Val Gly Asn Pro 180 185 190 Arg Lys Thr Lys Ser Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu 195 200 205 Cys Ala Gly Val Ala 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cgtgctgggt cactggctgg ggcgacgtgg acaataatgt gcacctgccg 540 ccgccatacc cgctgaagga ggtggaagtc cccgtagtgg aaaaccacct ttgcaacgcg 600 gaatatcaca ccggcctcca tacgggccac agctttcaaa tcgtccgcga tgacatgctg 660 tgtgcgggga gcgaaaatca cgactcctgc cagggtgact ctggagggcc cctggtctgc 720 aaggtgaatg gcacctaact gcaggcgggc gtggtcagct gggaggagag ctgtgcccag 780 cccaaccggc ctggcatcta cacccgtgtc acctactact tggactggat ccaccactat 840 gtccccaaga agccc 855 <210> 44 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mast cell tryptase precursor <400> 44 Met Leu Leu Leu Ala Pro Gln Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Tyr Val Ala Pro Ala Pro Gly Gln Ala 20 25 30 Leu Gln Gln Thr Gly Ile Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys 35 40 45 Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Val Arg Gly Pro Tyr Trp Met His 50 55 60 Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 65 70 75 80 His Cys Val Glu Pro Asp Ile Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln 85 90 95 Leu Arg Glu Gln His Leu Tyr 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ctgttcagtg tcactaagaa gcagctggga 180 gcaggaagta tagaagaatg tgcagcaaaa tgtgaggagg acgaagaatt cacctgcagg 240 gcattccaat atcacagtaa agagcaacaa tgtgtgataa tggctgaaaa caggaagtcc 300 tccataatca ttaggatgag agatgtagtt ttatttgaaa agaaagtgta tctctcagag 360 tgcaagactg ggaatggaaa gaactacaga gggacgatgt ccaaaacaaa aaatggcatc 420 acctgtcaaa aatggagttc cacttctccc cacagaccta gattctcacc tgctacacac 480 ccctcagagg gactggagga gaactactgc aggaatccag acaacgatcc gcaggggccc 540 tggtgctata ctactgatcc agaaaagaga tatgactact gcgacattct tgagtgtgaa 600 gaggaatgta tgcattgcag tggagaaaac tatgacggca aaatttccaa gaccatgtct 660 ggactggaat gccaggcctg ggactctcag agcccacacg ctcatggata cattccttcc 720 aaatttccaa acaagaacct gaagaagaat tactgtcgta accccgatag ggagctgcgg 780 ccttggtgtt tcaccaccga ccccaacaag cgctgggaac tttgcgacat cccccgctgc 840 acaacacctc caccatcttc tggtcccacc taccagtgtc tgaagggaac aggtgaaaac 900 tatcgcggga atgtggctgt taccgtttcc gggcacacct gtcagcactg gagtgcacag 960 acccctcaca cacataacag gacaccagaa aacttcccct gcaaaaattt ggatgaaaac 1020 tactgccgca atcctgacgg aaaaagggcc ccatggtgcc atacaaccaa cagccaagtg 1080 cggtgggagt actgtaagat accgtcctgt gactcctccc cagtatccac ggaacaattg 1140 gctcccacag caccacctga gctaacccct gtggtccagg actgctacca tggtgatgga 1200 cagagctacc gaggcacatc ctccaccacc accacaggaa agaagtgtca gtcttggtca 1260 tctatgacac cacaccggca ccagaagacc ccagaaaact acccaaatgc tggcctgaca 1320 atgaactact gcaggaatcc agatgccgat aaaggcccct ggtgttttac cacagacccc 1380 agcgtcaggt gggagtactg caacctgaaa aaatgctcag gaacagaagc gagtgttgta 1440 gcacctccgc ctgttgtcct gcttccagat gtagagactc cttccgaaga agactgtatg 1500 tttgggaatg ggaaaggata ccgaggcaag agggcgacca ctgttactgg gacgccatgc 1560 caggactggg ctgcccagga gccccataga cacagcattt tcactccaga gacaaatcca 1620 cgggcgggtc tggaaaaaaa ttactgccgt aaccctgatg gtgatgtagg tggtccctgg 1680 tgctacacga caaatccaag aaaactttac gactactgtg atgtccctca gtgtgcggcc 1740 ccttcatttg attgtgggaa gcctcaagtg gagccgaaga aatgtcctgg aagggttgtg 1800 ggggggtgtg tggcccaccc acattcctgg ccctggcaag 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ttgttaaaaa taaactctgt 2700 acttaacttt gatttgagta aattttggtt tt 2732 <210> 47 <211> 810 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> plasmin precursor <400> 47 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 35 40 45 Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 50 55 60 Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg 65 70 75 80 Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys 85 90 95 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 115 120 125 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser 130 135 140 Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln 145 150 155 160 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 165 170 175 Asp Ile Leu Glu Cys 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catgaaccac ctgggagaca tgaccagtga agaagtgatg tctttgatga gttccctgag 420 agttcccagc cagtggcaga gaaatatcac atataagtca aaccctaatc ggatattgcc 480 tgattctgtg gactggagag agaaagggtg tgttactgaa gtgaaatatc aaggttcttg 540 tggtgcttgc tgggctttca gtgctgtggg ggccctggaa gcacagctga agctgaaaac 600 aggaaagctg gtgtctctca gtgcccagaa cctggtggat tgctcaactg aaaaatatgg 660 aaacaaaggc tgcaatggtg gcttcatgac aacggctttc cagtacatca ttgataacaa 720 gggcatcgac tcagacgctt cctatcccta caaagccatg gatcagaaat gtcaatatga 780 ctcaaaatat cgtgctgcca catgttcaaa gtacactgaa cttccttatg gcagagaaga 840 tgtcctgaaa gaagctgtgg ccaataaagg cccagtgtct gttggtgtag atgcgcgtca 900 tccttctttc ttcctctaca gaagtggtgt ctactatgaa ccatcctgta ctcagaatgt 960 gaatcatggt gtacttgtgg ttggctatgg tgatcttaat gggaaagaat actggcttgt 1020 gaaaaacagc tggggccaca actttggtga agaaggatat attcggatgg caagaaataa 1080 aggaaatcat tgtgggattg ctagctttcc ctcttaccca gaaatctaga ggatctctcc 1140 tttttataac aaatcaagaa atatgaagca ctttctctta acttaatttt tcctgctgta 1200 tccagaagaa 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1440 ttagattctc attcacggga ctagttagct ttaagcaccc tagaggacta gggtaatctg 1500 acttctcact tcctaagttc ccttctatat cctcaaggta gaaatgtcta tgttttctac 1560 tccaattcat aaatctattc ataagtcttt ggtacaagtt tacatgataa aaagaaatgt 1620 gatttgtctt cccttctttg cacttttgaa ataaagtatt tatctcctgt ctacagttta 1680 ataaatagca tctagtacac at 1702 <210> 59 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Cathepsin K precursor <400> 59 Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr 20 25 30 His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala 50 55 60 Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp 65 70 75 80 Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro 85 90 95 Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu 100 105 110 Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr 115 120 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tctgtgaaga tggctccact cttcaaggac ttcatgacca cctataaccg 660 gacttatgaa tcaagggaag aagcccagtg gcgattgact gtctttgcaa gaaatatgat 720 acgagcacag aagattcagg ccctggaccg cggcacagct cagtatggga tcaccaagtt 780 cagtgacctc acagaggagg aattccacac catctacctg aatcccctct tacagaagga 840 gtctggcagg aagatgagtc cagccaagtc cataaatgat cttgccccgc ctgaatggga 900 ctggaggaag aaaggggctg tcactgaagt gaagaaccag ggcatgtgtg gctcctgctg 960 ggccttttct gtcacaggca acgtggaggg ccagtggttc ctgaaccggg ggactctgct 1020 ctccctgtca gagcaggagc tcttggattg tgacaaggtg gacaaggcct gcttgggtgg 1080 attgccctcc aacgcctatg cagccataaa gaatttggga gggctggaga cagaggatga 1140 ctacggctac cagggccatg ttcagacctg caacttctca gcacagatgg caaaagtcta 1200 catcaatgat tcagtggagc tgagccggaa tgaaaataag atagcagcct ggctggccca 1260 gaaaggacct atctcagttg ccattaacgc cttcggcatg cagttctatc gccacgggat 1320 tgctcaccca ttccggcccc tctgcagccc ttggttcatc gaccatgctg tgttgctggt 1380 gggctatggc aaccgctcta acattcctta ctgggccatc aagaacagct ggggcagtga 1440 ctggggtgag gagggttact 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catcatcttc ccatatctgt tgtcaatgct cagtggtcct cttctcctta ccttttcttt 2520 ctgtcagcag cattgctatt gtataagcag gccatagagt caaaaggaat tctagacaat 2580 caagttgtct cctccttaga acccattcct acatctgtct ccatcctctc tttcacgcat 2640 cctttctggg aggtacactt tttattatct cctatctaca ctcttcagtt gtttccagcc 2700 aacctaaaat aaaaagggag atatcttcat aaaagtttag gttttttttt tgtttgtttg 2760 tttgtttggt tggcttttgt cttttatttt tgtatagagt tatgatgagt tttgatgtga 2820 tgcacttcaa acactttttg tgatagtttt tgttatgtat caattatatg taacactccc 2880 tttcagtgac ttgttagctt tattcctttc gttttcttgt tagtgcctgg tgtaagtaac 2940 tccctatggt tctgacaacc tttattagta actaaactat gtgaccttta acacagtagg 3000 tcctgaacag taatctccag agcagaacag atggctttga aagatgctac tataatgtgt 3060 cctatatttc cccagattta tatttctaaa atgatgttat cattttactc acaagtttta 3120 cagcactgga aatcagtaag ataacatgca aattttttca aataagcatt atggagaggt 3180 ctctctctac ctttgtatcc cctgtaaata agtgatgacg catatacacc agctcatggg 3240 tgctcctgcc ccagaaaacc agagacagag cagccgaatg tgttccttac tacacagcat 3300 tcatactgaa gatcaccaac aggtcctgaa agtgatttga caaggtcccc attgcaactg 3360 ttaaatgggt caactttgca gtgcctttga aatatcccat cacttgggag gcagaggcag 3420 gtgaatttct gaggtcaagg ccagcccccc cac 3453 <210> 73 <211> 312 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> cathepsin O precursor <400> 73 Met Lys Pro Gln Leu Val Asn Leu Leu Leu Leu Cys Cys Cys Cys Leu 1 5 10 15 Gly Arg His Gly Val Ala Gly Thr Trp Ser Trp Ser His Gln Arg Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Leu Arg Glu Ser Leu His Arg His Arg Tyr Leu Asn Ser 35 40 45 Phe Pro His Glu Asn Ser Thr Ala Phe Tyr Gly Val Asn Gln Phe Ser 50 55 60 Tyr Leu Phe Pro Glu Glu Phe Lys Ala Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Tyr 65 70 75 80 Ala Trp Ala Pro Arg Tyr Pro Ala Glu Gly Gln Arg Pro Ile Pro Asn 85 90 95 Val Ser Leu Pro Leu Arg Phe Asp Trp Arg Asp Lys His Val Val Asn 100 105 110 Pro Val Arg Asn Gln Glu Met Cys Gly Gly Cys Trp Ala Phe Ser Val 115 120 125 Val Ser Ala Ile Glu Ser Ala Arg Ala Ile Gln Gly Lys Ser Leu Asp 130 135 140 Tyr Leu Ser Val Gln Gln Val Ile Asp Cys Ser Phe Asn Asn 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cacctcaggt 60 acttgagaca tggctgctgt tgtcttcata gccttcctgt atttgggagt ggcctcaggt 120 gttccagtac ttgattcaag tttggatgct gaatggcaag actggaagat aaagtataac 180 aaatcatata gcctgaagga agaaaaactg aagagagtgg tttgggaaga aaaattgaaa 240 atgatcaaac tacacaacag ggagaacagc ctgggtaaga atggcttcac catgaaaatg 300 aatgaatttg gtgaccagac tgatgaagaa ttcaggaaaa tgatgattga aatttcagtt 360 tggactcaca gagaggggaa aagtatcatg aaacgggaag ctggcagtat tctccccaaa 420 tttgtcgatt ggcgaaagaa aggatatgtg actcctgtac ggagacaggg agattgtgat 480 gcttgttggg catttgctgt gactggtgcc atagaagcac aggcaatctg gcaaacgggc 540 aaactcaccc ctctgagtgt gcagaacctg gtggactgtt ctaaacctca aggcaacaat 600 ggttgtcttg gtggtgatac atacaatgcc ttccagtatg ttttgcacaa tggtggtctg 660 gagtctgagg caacatatcc atatgaaggg aaagatggac catgcaggta taatccaaag 720 aattctaagg ctgaaatcac aggatttgtg tccctccccc aaagtgagga tatcctaatg 780 gctgctgtag caactattgg gcccatcact gctggaattg atgcttcaca tgagtctttc 840 aagaactata agggaggtat ttaccatgag ccaaattgta gcagtgatac tgtgactcat 900 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ctgggccatg gcagcggcag gcaacataga gaccctgtgg 540 cgcatcagtt tctgggattt tgtggacgtc tccgtgcagg aactgctgga ctgtggccgc 600 tgtggggatg gctgccacgg tggcttcgtc tgggacgcgt tcataactgt cctcaacaac 660 agcggcctgg ccagtgaaaa ggactacccg ttccagggca aagtcagagc ccacaggtgc 720 caccccaaga agtaccagaa ggtggcctgg atccaggact tcatcatgct gcagaacaac 780 gagcacagaa ttgcgcagta cctggccact tatggcccca tcaccgtgac catcaacatg 840 aagccccttc agctataccg gaaaggtgtg atcaaggcca cacccaccac ctgtgacccc 900 cagcttgtgg accactctgt cctgctggtg ggttttggca gcgtcaagtc agaggagggg 960 atatgggcag agacagtctc atcgcagtct cagcctcagc ctccacaccc caccccatac 1020 tggatcctga agaactcctg gggggcccaa tggggagaga agggctattt ccggctgcac 1080 cgagggagca atacctgtgg catcaccaag ttcccgctca ctgcccgtgt gcagaaaccg 1140 gatatgaagc cccgagtctc ctgccctccc tgaacccacc tggccccctc agctctgtcc 1200 tgttaggcca actgcctcct tgccagcccc acccccaggt ttttgcccat cctcccaatc 1260 tcaatacagc ctgaataaac caagacaaga cctctgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaa 1327 <210> 79 <211> 376 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gggggctctg tggaggacct gattgccaaa ggccccgtct caaagtactc 300 ccaggcggtg ccagccgtga ccgaggggcc cattcccgag gtgctcaaga actacatgga 360 cgcccagtac tacggggaga ttggcatcgg gacgcccccc cagtgcttca cagtcgtctt 420 cgacacgggc tcctccaacc tgtgggtccc ctccatccac tgcaaactgc tggacatcgc 480 ttgctggatc caccacaagt acaacagcga caagtccagc acctacgtga agaatggtac 540 ctcgtttgac atccactatg gctcgggcag cctctccggg tacctgagcc aggacactgt 600 gtcggtgccc tgccagtcag cgtcgtcagc ctctgccctg ggcggtgtca aagtggagag 660 gcaggtcttt ggggaggcca ccaagcagcc aggcatcacc ttcatcgcag ccaagttcga 720 tggcatcctg ggcatggcct acccccgcat ctccgtcaac aacgtgctgc ccgtcttcga 780 caacctgatg cagcagaagc tggtggacca gaacatcttc tccttctacc tgagcaggga 840 cccagatgcg cagcctgggg gtgagctgat gctgggtggc acagactcca agtattacaa 900 gggttctctg tcctacctga atgtcacccg caaggcctac tggcaggtcc acctggacca 960 ggtggaggtg gccagcgggc tgaccctgtg caaggagggc tgtgaggcca ttgtggacac 1020 aggcacttcc ctcatggtgg gcccggtgga tgaggtgcgc gagctgcaga aggccatcgg 1080 ggccgtgccg ctgattcagg 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tggttgatga tacttcccac accacaaatg ggacacatgg tctgtcaatg 1740 agagcataat ttaaaaatat atttataagg aaattttaca agggcataaa gtaaatacat 1800 gcatataatg aataaatcat tcttactaaa aagtataaaa tagtatgaaa atggaaattt 1860 gggagagcca tacataaaag aaataaacca aaggaaaatg tctgtaataa tagactgtaa 1920 cttccaaata aataattttc attttgcact gaggatattc agatgtatgt gcccttcttc 1980 acacagacac taacgaaata tcaaagtcat taaagacagg agacaaaaga gcagtggtaa 2040 gaatagtaga tgtggccttt gaattctgtt taattttcac ttttggcaat gactcaaagt 2100 ctgctctcat ataagacaaa tattcctttg catattataa aggataaaga aggatgatgt 2160 ctttttatta aaatatttca ggttcttcag aagtcacaca ttacaaagtt aaaattgtta 2220 tcaaaatagt ctaaggccat ggcatccctt tttcataaat tatttgatta tttaagacta 2280 aaagttgcat tttaacccta ttttacctag ctaattattt aattgtccgg tttgtcttgg 2340 atatataggc tattttctaa agacttgtat agcatgaaat aaaatatatc ttataaagtg 2400 gaagtatgta tattaaaaaa gagacatcca aatttttttt taaagcagtc tactagattg 2460 tgatcccttg agatatggaa ggatgccttt ttttctctgc atttaaaaaa atcccccagc 2520 acttcccaca gtgcctattg atacttgggg agggtgcttg gcacttattg aatatatgat 2580 cggccatcaa gggaagaact attgtgctca gagacactgt tgataaaaac tcaggcaaag 2640 aaaatgaaat gcatatttgc aaagtgtatt aggaagtgtt tatgttgttt ataataaaaa 2700 tatattttca acagaaaaaa aa 2722 <210> 104 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-13 precursor <400> 104 Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His 1 5 10 15 Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser 20 25 30 Glu Glu Asp Leu Gln Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His 35 40 45 Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met 50 55 60 Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys 85 90 95 Gly Val Pro Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys 100 105 110 Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp 115 120 125 Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val 130 135 140 Trp Ser 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aggcatccat accctgggtt ttcctccaac cataaggaaa attgatgcag ctgtttctga 1200 caaggaaaag aagaaaacat acttctttgc agcggacaaa tactggagat ttgatgaaaa 1260 tagccagtcc atggagcaag gcttccctag actaatagct gatgactttc caggagttga 1320 gcctaaggtt gatgctgtat tacaggcatt tggatttttc tacttcttca gtggatcatc 1380 acagtttgag tttgacccca atgccaggat ggtgacacac atattaaaga gtaacagctg 1440 gttacattgc taggcgagat agggggaaga cagatatggg tgtttttaat aaatctaata 1500 attattcatc taatgtatta tgagccaaaa tggttaattt ttcctgcatg ttctgtgact 1560 gaagaagatg agccttgcag atatctgcat gtgtcatgaa gaatgtttct ggaattcttc 1620 acttgctttt gaattgcact gaacagaatt aagaaatact catgtgcaat aggtgagaga 1680 atgtattttc atagatgtgt tattacttcc tcaataaaaa gttttatttt gggcctgttc 1740 ctt 1743 <210> 119 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-10 precursor <400> 119 Met Met His Leu Ala Phe Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Val Cys Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Pro Leu Ser Gly Ala Ala Lys Glu Glu Asp Ser Asn Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Gln Gln Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn 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cctatggaaa tggagatccc caaaatttta 780 aactttccca ggatgatatt aaaggcattc agaaactata tggaaagaga agtaattcaa 840 gaaagaaata gaaacttcag gcagaacatc cattcattca ttcattggat tgtatatcat 900 tgttgcacaa tcagaattga taagcactgt tcctccactc catttagcaa ttatgtcacc 960 cttttttatt gcagttggtt tttgaatgtc tttcactcct tttaaggata aactccttta 1020 tggtgtgact gtgtcttatt catctatact tgcagtgggt agatgtcaat aaatgttaca 1080 tacacaaata aataaaatgt ttattccatg gtaaatttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaa 1147 <210> 125 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-7 precursor <400> 125 Met Arg Leu Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Pro Leu Pro Gln Glu Ala Gly Gly Met Ser Glu Leu Gln Trp 20 25 30 Glu Gln Ala Gln Asp Tyr Leu Lys Arg Phe Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu 35 40 45 Thr Lys Asn Ala Asn Ser Leu Glu Ala Lys Leu Lys Glu Met Gln Lys 50 55 60 Phe Phe Gly Leu Pro Ile Thr Gly Met Leu Asn Ser Arg Val Ile Glu 65 70 75 80 Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Glu Tyr Ser 85 90 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180 acacagctcc tgcaacaatt ccatcggaat gggacagacc tacttgacat gcagatgcat 240 gctctgctac accagcccca ctgtggggtg cctgatgggt ccgacacctc catctcgcca 300 ggaagatgca agtggaataa gcacactcta acttacagga ttatcaatta cccacatgat 360 atgaagccat ccgcagtgaa agacagtata tataatgcag tttccatctg gagcaatgtg 420 acccctttga tattccagca agtgcagaat ggagatgcag acatcaaggt ttctttctgg 480 cagtgggccc atgaagatgg ttggcccttt gatgggccag gtggtatctt aggccatgcc 540 tttttaccaa attctggaaa tcctggagtt gtccattttg acaagaatga acactggtca 600 gcttcagaca ctggatataa tctgttcctg gttgcaactc atgagattgg gcattctttg 660 ggcctgcagc actctgggaa tcagagctcc ataatgtacc ccacttactg gtatcacgac 720 cctagaacct tccagctcag tgccgatgat atccaaagga tccagcattt gtatggagaa 780 aaatgttcat ctgacatacc ttaatgttag cacagaggac ttattcaacc tgtcctttca 840 gggagtttat tggaggatca aagaactgaa agcactagag cagccttggg gactgctagg 900 atgaagccct aaagaatgca acctagtcag gttagctgaa ccgacactca aaacgctact 960 gagtcacaat aaagattgtt ttaaagagta aaaaaaaa 998 <210> 128 <211> 261 <212> PRT <213> Homo 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aggacgaatt ctggactaca 660 cattcaggag gcaccaactt gttcctcact gctgttcacg agattggcca ttccttaggt 720 cttggccatt ctagtgatcc aaaggccgta atgttcccca cctacaaata tgttgacatc 780 aacacatttc gcctctctgc tgatgacata cgtggcattc agtccctgta tggagaccca 840 aaagagaacc aacgcttgcc aaatcctgac aattcagaac cagctctctg tgaccccaat 900 ttgagttttg atgctgtcac taccgtggga aataagatct ttttcttcaa agacaggttc 960 ttctggctga aggtttctga gagaccaaag accagtgtta atttaatttc ttccttatgg 1020 ccaaccttgc catctggcat tgaagctgct tatgaaattg aagccagaaa tcaagttttt 1080 ctttttaaag atgacaaata ctggttaatt agcaatttaa gaccagagcc aaattatccc 1140 aagagcatac attcttttgg ttttcctaac tttgtgaaaa aaattgatgc agctgttttt 1200 aacccacgtt tttataggac ctacttcttt gtagataacc agtattggag gtatgatgaa 1260 aggagacaga tgatggaccc tggttatccc aaactgatta ccaagaactt ccaaggaatc 1320 gggcctaaaa ttgatgcagt cttctactct aaaaacaaat actactattt cttccaagga 1380 tctaaccaat ttgaatatga cttcctactc caacgtatca ccaaaacact gaaaagcaat 1440 agctggtttg gttgttagaa atggtgtaat taatggtttt tgttagttca cttcagctta 1500 ataagtattt attgcatatt tgctatgtcc tcagtgtacc actacttaga gatatgtatc 1560 ataaaaataa aatctgtaaa ccataggtaa tgattatata aaatacataa tatttttcaa 1620 ttttgaaaac tctaattgtc cattcttgct tgactctact attaagtttg aaaatagtta 1680 ccttcaaagg ccaagagaat tctatttgaa gcatgctctg taagttgctt cctaacatcc 1740 ttggactgag aaattatact tacttctggc ataactaaaa ttaagtatat atattttggc 1800 tcaaataaaa ttgaaaaaaa aatca 1825 <210> 131 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-12 precursor <400> 131 Met Lys Phe Leu Leu Ile Leu Leu Leu Gln Ala Thr Ala Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ser Leu Glu Lys Asn Asn Val Leu Phe 20 25 30 Gly Glu Arg Tyr Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu Glu Ile Asn Lys Leu 35 40 45 Pro Val Thr Lys Met Lys Tyr Ser Gly Asn Leu Met Lys Glu Lys Ile 50 55 60 Gln Glu Met Gln His Phe Leu Gly Leu Lys Val Thr Gly Gln Leu Asp 65 70 75 80 Thr Ser Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp 85 90 95 Val His His Phe Arg Glu Met Pro Gly Gly Pro Val Trp Arg Lys His 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caaaaacccc acctatgggc ccaacatctg tgacgggaac 1200 tttgacaccg tggccatgct ccgaggggag atgtttgtct tcaaggagcg ctggttctgg 1260 cgggtgagga ataaccaagt gatggatgga tacccaatgc ccattggcca gttctggcgg 1320 ggcctgcctg cgtccatcaa cactgcctac gagaggaagg atggcaaatt cgtcttcttc 1380 aaaggagaca agcattgggt gtttgatgag gcgtccctgg aacctggcta ccccaagcac 1440 attaaggagc tgggccgagg gctgcctacc gacaagattg atgctgctct cttctggatg 1500 cccaatggaa agacctactt cttccgtgga aacaagtact accgtttcaa cgaagagctc 1560 agggcagtgg atagcgagta ccccaagaac atcaaagtct gggaagggat ccctgagtct 1620 cccagagggt cattcatggg cagcgatgaa gtcttcactt acttctacaa ggggaacaaa 1680 tactggaaat tcaacaacca gaagctgaag gtagaaccgg gctaccccaa gtcagccctg 1740 agggactgga tgggctgccc atcgggaggc cggccggatg aggggactga ggaggagacg 1800 gaggtgatca tcattgaggt ggacgaggag ggcggcgggg cggtgagcgc ggctgccgtg 1860 gtgctgcccg tgctgctgct gctcctggtg ctggcggtgg gccttgcagt cttcttcttc 1920 agacgccatg ggacccccag gcgactgctc tactgccagc gttccctgct ggacaaggtc 1980 tgacgcccac cgccggcccg 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aaagtggaca gaaacacaat tgactggatg aagaagcccc gatgcggtgt acctgaccag 600 acaagaggta gctccaaatt tcatattcgt cgaaagcgat atgcattgac aggacagaaa 660 tggcagcaca agcacatcac ttacagtata aagaacgtaa ctccaaaagt aggagaccct 720 gagactcgta aagctattcg ccgtgccttt gatgtgtggc agaatgtaac tcctctgaca 780 tttgaagaag ttccctacag tgaattagaa aatggcaaac gtgatgtgga tataaccatt 840 atttttgcat ctggtttcca tggggacagc tctccctttg atggagaggg aggatttttg 900 gcacatgcct acttccctgg accaggaatt ggaggagata cccattttga ctcagatgag 960 ccatggacac taggaaatcc taatcatgat ggaaatgact tatttcttgt agcagtccat 1020 gaactgggac atgctctggg attggagcat tccaatgacc ccactgccat catggctcca 1080 ttttaccagt acatggaaac agacaacttc aaactaccta atgatgattt acagggcatc 1140 cagaagatat atggtccacc tgacaagatt cctccaccta caagacctct accgacagtg 1200 cccccacacc gctctattcc tccggctgac ccaaggaaaa atgacaggcc aaaacctcct 1260 cggcctccaa ccggcagacc ctcctatccc ggagccaaac ccaacatctg tgatgggaac 1320 tttaacactc tagctattct tcgtcgtgag atgtttgttt tcaaggacca gtggttttgg 1380 cgagtgagaa 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gacaaccaaa tggcaaagaa agagacggag aaaccgacag cagcacagtc 540 acttgaaaac aagactaagg attctgagaa tgttactcaa caaaacccag acccccccaa 600 gattcggagg aagaggttct tagatatgtt aatgtactca aacaagtaca gggaagaaca 660 ggaggcgctt cagaaatcca caggcaaagt cttcaccaaa aagctgctga aatggagaat 720 gattggagaa ggctacagca atcagctttc catcaacgag caaagatatg tcttcaggct 780 ggctttccgc atgtggagtg aagtcatgcc actggacttt gaagaagata acacctcccc 840 tctatcccaa attgatatca aacttggatt cggacgaggt cgccatttag gctgtagccg 900 ggcattcgat ggctctgggc aggagttcgc ccacgcttgg tttctggggg acattcactt 960 tgacgacgat gaacatttta ctgctcccag tagtgagcat gggattagtc tgctgaaggt 1020 ggcagcccat gaaattggcc atgttcttgg attatctcac atccacaggg tgggatcaat 1080 aatgcagccc aattacattc cgcaggactc tggctttgag ctggacttgt ctgacaggag 1140 agccatacag aacctatacg gctcatgtga aggccccttt gacacagcgt ttgactggat 1200 ctataaagag aagaaccaat acggggagct tgttgttcga tacaacacct acttttttcg 1260 caacagctgg tactggatgt atgagaatcg gagcaacagg acccgatacg gggatccact 1320 tgcaattgcc aacggctggc 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gtgcatgttt gatttagaaa gatacacttg atgttattac 3060 tgagctttat acagcactgt tattctgcac aaataaaact tttactttac aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaa 3127 <210> 152 <211> 604 <212> PRT <213> Xenopus laevis <220> <223> XMMP precursor <400> 152 Met Pro Ser Ile Lys Leu Leu Val Trp Cys Cys Leu Cys Val Ile Ser 1 5 10 15 Pro Arg Leu Cys His Ser Glu Lys Leu Phe His Ser Arg Asp Arg Ser 20 25 30 Asp Leu Gln Pro Ser Ala Ile Glu Gln Ala Glu Leu Val Lys Asp Met 35 40 45 Leu Ser Ala Gln Gln Phe Leu Ala Lys Tyr Gly Trp Thr Gln Pro Val 50 55 60 Ile Trp Asp Pro Ser Ser Thr Asn Glu Asn Glu Pro Leu Lys Asp Phe 65 70 75 80 Ser Leu Met Gln Glu Gly Val Cys Asn Pro Arg Gln Glu Val Ala Glu 85 90 95 Pro Thr Lys Ser Pro Gln Phe Ile Asp Ala Leu Lys Lys Phe Gln Lys 100 105 110 Leu Asn Asn Leu Pro Val Thr Gly Thr Leu Asp Asp Ala Thr Ile Asn 115 120 125 Ala Met Asn Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Asn Gln Met Ala Lys 130 135 140 Lys Glu Thr Glu Lys Pro Thr Ala Ala Gln Ser Leu Glu Asn Lys Thr 145 150 155 160 Lys Asp Ser Glu Asn Val Thr 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catgtgaatt gggttggcag agaagactgg tagaatgccg agacattaat ggacagcctg 3120 cttccgagtg tgcaaaggaa gtgaagccag ccagcaccag accttgtgca gaccatccct 3180 gcccccagtg gcagctgggg gagtggtcat catgttctaa gacctgtggg aagggttaca 3240 aaaaaagaag cttgaagtgt ctgtcccatg atggaggggt gttatctcat gagagctgtg 3300 atcctttaaa gaaacctaaa catttcatag acttttgcac aatggcagaa tgcagttaag 3360 tggtttaagt ggtgttagct ttgagggcaa ggcaaagtga ggaagggctg gtgcagggaa 3420 agcaagaagg ctggagggat ccagcgtatc ttgccagtaa ccagtgaggt gtatcagtaa 3480 ggtgggatta tgggggtaga tagaaaagga gttgaatcat cagagtaaac tgccagttgc 3540 aaatttgata ggatagttag tgaggattat taacctctga gcagtgatat agcataataa 3600 agccccgggc attattatta ttatttcttt tgttacatct attacaagtt tagaaaaaac 3660 aaagcaattg tcaaaaaaag ttagaactat tacaacccct gtttcctggt acttatcaaa 3720 tacttagtat catgggggtt gggaaatgaa aagtaggaga aaagtgagat tttactaaga 3780 cctgttttac tttacctcac taacaatggg gggagaaagg agtacaaata ggatctttga 3840 ccagcactgt ttatggctgc tatggtttca gagaatgttt atacattatt tctaccgaga 3900 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780 tatggagtca ccaagttcag tgatctcaca gaggaggagt tccgcactat ctacctgaat 840 actctcctga ggaaagagcc tggcaacaag atgaagcaag ccaagtctgt gggtgacctc 900 gccccacctg aatgggactg gaggagtaag ggggctgtca caaaagtcaa agaccagggc 960 atgtgtggct cctgctgggc cttctcagtc acaggcaatg tggagggcca gtggtttctc 1020 aaccagggga ccctgctctc cctctctgaa caggagctct tggactgtga caagatggac 1080 aaggcctgca tgggcggctt gccctccaat gcctactcgg ccataaagaa tttgggaggg 1140 ctggagacag aggatgacta cagctaccag ggtcacatgc agtcctgcaa cttctcagca 1200 gagaaggcca aggtctacat caatgactcc gtggagctga gccagaacga gcagaagctg 1260 gcagcctggc tggccaagag aggcccaatc tccgtggcca tcaatgcctt tggcatgcag 1320 ttttaccgcc acgggatctc ccgccctctc cggcccctct gcagcccttg gctcattgac 1380 catgcggtgt tgcttgtggg ctacggcaac cgctctgacg ttcccttttg ggccatcaag 1440 aacagctggg gcactgactg gggtgagaag ggttactact acttgcatcg tgggtccggg 1500 gcctgtggcg tgaacaccat ggccagctcg gcggtggtgg actgaagagg ggcccccagc 1560 tcgggacctg gtgctgatca gagtggctgc tgccccagcc tgacatgtgt ccaggcccct 1620 ccccgggagg tacagctggc agagggaaag gcactgggta cctcagggtg agcagagggc 1680 actgggctgg ggcacagccc ctgcttccct gcaccccatt cccaccctga agttctgcac 1740 ctgcaccttt gttgaattgt ggtagcttag gaggatgtcg gggtgaaggg tggtatcttg 1800 gcagttgaag ctggggcaag aactctgggc ttgggtaatg agcaggaaga aaattttctg 1860 atcttaagcc cagctctgtt ctgcccccgc tttcctctgt ttgatactat aaattttctg 1920 gttcccttgg atttagggat agtgtccctc tccatgtcca ggaaacttgt aaccaccctt 1980 ttctaacagc aataaagagg tgtccttgtc ccgaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2032 <210> 182 <211> 484 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> cathepsin F precursor <400> 182 Met Ala Pro Trp Leu Gln Leu Leu Ser Leu Leu Gly Leu Leu Pro Gly 1 5 10 15 Ala Val Ala Ala Pro Ala Gln Pro Arg Ala Ala Ser Phe Gln Ala Trp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro Glu Leu Leu Ala Pro Thr Arg Phe Ala Leu Glu 35 40 45 Met Phe Asn Arg Gly Arg Ala Ala Gly Thr Arg Ala Val Leu Gly Leu 50 55 60 Val Arg Gly Arg Val Arg Arg Ala Gly Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Glu Ala Thr Leu Glu Glu Pro Pro Cys Asn Asp Pro 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aagattatct gggaggcatt atacagcatc actgctctag 840 tggagaagca aatcatgcag ttctcataac tgggtttgat aaaacaggaa gcactccata 900 ttggattgtg cggaattcct ggggaagttc ttggggagta gatggttatg cccatgtcaa 960 aatgggaagt aatgtttgtg gtattgcaga ttccgtttct tctatatttg tgtgacatgt 1020 tgggcagatc aagagacagc tacaaaaatg aaggttttca taatgcaatg taacatagta 1080 cttcaaagta ttattcaact tcaagtttca gcaactacct acaaaagatt ctaaggccta 1140 gtagtattta aactaagttt cagaatgttc ccttcttgta gagagatgga caaccaaagt 1200 cagtgggaca aactccagca cagaagcctg cgaggaagcc tatggaatag tttcctgtcc 1260 tgagacgaaa ttcagattag gagatatttt aggcccctgc aactggggaa ggctactgtt 1320 tgtttttgtt tgcttattat ttatttgttt gtttattgtg agatatttca ggtgggatca 1380 aagaggtcat aagaatttat tttcttttgt ggggtgtaac tactagcttt agattacccc 1440 tatacacaag aatggccaac ctaaaattat gtgtgtcttg tacagttagt tatattagca 1500 gccctctgag atggcgtatc tatcggaagg atttcaaaca ccaattgctt tacctgaaca 1560 aatggtgctt accctttgaa cagcagagtg accacgtaga aggaaggaaa agggcaaaat 1620 cgcttcagtt aaactgaaat taaatgaaca ataaggcaac tatataagta acttctagta 1680 gcattgcctg agagacaaat tattgtttga taattttcat tgtgaatagg aatccaatag 1740 atcatattgc ttactttgtt ctttttatac tatagaataa tattttgttc tctagtatat 1800 caaaatacca aaatattatc tcatattttc tccctctttc tcttactctt taccaagttt 1860 tcctggtggc ttggcttccc tgactaaaga attaagtctc atttttactt tccatttcta 1920 ttttcttacc acttggttgg ctccctttgt ctctgtacct ttaccaacat taggatctca 1980 cctctttctt cctcccttaa ttcataagca ccactcctat caaagtccca tctcttaacc 2040 ctgggtatca aacaaactgt gagttttcca gaatctgttt cccagttttc ccctcagctt 2100 tcctggtctc ccatccgaac tgcttctttg tgcacctctt gttctttctc ttggctccca 2160 gtcttgattc ctgtgatcac tcttgcatca ctaattgcac aagtgatttc aggtgcaatt 2220 ctgattagcc tgcgtccaca cagtgatcga tgatcctatg tgcctagaaa ggacactgtg 2280 tgctgctcat gacctgcaac aggaaaaaag ccatttcttg ttagcagtgt aagaacctta 2340 gagcaaagga gttgaccttc tgattgaata taagcacaac catattaaat gaatcaatac 2400 aagaaaatta tttctgatac tatgtatgta catatttctt ctctaaaatg tatcattctt 2460 ttctaatgta tatgatctaa 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cattgcttaa ttctaagact tttgaatttt 1440 cattttttaa aaagatgtac aaaacagttt gaaataaatt ttaattcgta tataaa 1496 <210> 188 <211> 334 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> cathepsin V precursor <400> 188 Met Asn Leu Ser Leu Val Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser 1 5 10 15 Ala Val Pro Lys Phe Asp Gln Asn Leu Asp Thr Lys Trp Tyr Gln Trp 20 25 30 Lys Ala Thr His Arg Arg Leu Tyr Gly Ala Asn Glu Glu Gly Trp Arg 35 40 45 Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gly 50 55 60 Glu Tyr Ser Gln Gly Lys His Gly Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe 65 70 75 80 Gly Asp Met Thr Asn Glu Glu Phe Arg Gln Met Met Gly Cys Phe Arg 85 90 95 Asn Gln Lys Phe Arg Lys Gly Lys Val Phe Arg Glu Pro Leu Phe Leu 100 105 110 Asp Leu Pro Lys Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro 115 120 125 Val Lys Asn Gln Lys Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr 130 135 140 Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Lys Leu Val Ser 145 150 155 160 Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Arg Pro Gln 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cctgttacta tgatgagaag aggtccacgt acctggggga 900 ctggtacagc gtcaactgga tggaagattc ggacgtggaa gatctgacta aagagaccct 960 gcacaagcag taccacctgg taaaatcgca caccaacacc agccacgtca tgcagtatgg 1020 aaacaaaaca atctccacca tgaaagtgat gcagtttcag ggtatgaaac gcaaagccag 1080 ttctcccgtc cccctacctc cagtcacaca ccttgacctc acccccagcc ctgatgtgcc 1140 tctcaccatc atgaaaagga aactgatgaa caccaatgat ctggaggagt ccaggcagct 1200 cacggaggag atccagcggc atctggatgc caggcacctc attgagaagt cagtgcgtaa 1260 gatcgtctcc ttgctggcag cgtccgaggc tgaggtggag cagctcctgt ccgagagagc 1320 cccgctcacg gggcacagct gctacccaga ggccctgctg cacttccgga cccactgctt 1380 caactggcac tcccccacgt acgagtatgc gttgagacat ttgtacgtgc tggtcaacct 1440 ttgtgagaag ccgtatccgc ttcacaggat aaaattgtcc atggaccacg tgtgccttgg 1500 tcactactga agagctgcct cctggaagct tttccaagtg tgagcgcccc accgactgtg 1560 tgctgatcag agactggaga ggtggagtga gaagtctccg ctgctcgggc cctcctgggg 1620 agcccccgct ccagggctcg ctccaggacc ttcttcacaa gatgacttgc tcgctgttac 1680 ctgcttcccc agtcttttct gaaaaactac aaattagggt gggaaaagct ctgtattgag 1740 aagggtcata tttgctttct aggaggtttg ttgttttgcc tgttagtttt gaggagcagg 1800 aagctcatgg gggcttctgt agcccctctc aaaaggagtc tttattctga gaatttgaag 1860 ctgaaacctc tttaaatctt cagaatgatt ttattgaaga gggccgcaag ccccaaatgg 1920 aaaactgttt ttagaaaata tgatgatttt tgattgcttt tgtatttaat tctgcaggtg 1980 ttcaagtctt aaaaaataaa gatttataac agaacccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaa 2048 <210> 191 <211> 433 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> legumain precursor <400> 191 Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly 1 5 10 15 Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val 20 25 30 Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp 35 40 45 Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu 50 55 60 Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn 65 70 75 80 Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr 85 90 95 Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val 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ctacggctcc ctctctggga 720 gggagaagat gatggcagaa atctacgcaa atggtcccat cagctgtgga ataatggcaa 780 cagaaagact ggctaactac accggaggca tctatgccga ataccaggac accacatata 840 taaaccatgt cgtttccgtg gctgggtggg gcatcagtga tgggactgag tactggattg 900 tccggaattc atggggtgaa ccatggggcg agagaggctg gctgaggatc gtgaccagca 960 cctataagga tgggaagggc gccagataca accttgccat cgaggagcac tgtacatttg 1020 gggaccccat cgtttaaggc catgtcacta gaagcgcagt ttaagaaaag gcatggtgac 1080 ccatgaccag aggggatcct atggttatgt gtgccaggct ggctggcagg aactggggtg 1140 gctatcaata ttggatggcg aggacagcgt ggtactggct gcgagtgttc ctgagagttg 1200 aaagtgggat gacttatgac acttgcacag catggctctg cctcacaatg atgcagtcag 1260 ccacctggtg aagaagtgac ctgcaacaca ggaaacgatg ggacctcagt cttcttcagc 1320 agaggacttg atattttgta tttggcaact gtgggcaata atatggcatt taagaggtga 1380 aagagttcag acttatcacc attcttatgt cactttagaa tcaagggtgg gggagggagg 1440 gagggagttg gcagtttcaa atcgcccaag tgatgaataa agtatctggc tctgcacgag 1500 a 1501 <210> 194 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> cathespin Z precursor <400> 194 Met Ala Arg Arg Gly Pro Gly Trp Arg Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Ala Ala Gln Gly Gly Leu Tyr Phe Arg Arg Gly Gln Thr 20 25 30 Cys Tyr Arg Pro Leu Arg Gly Asp Gly Leu Ala Pro Leu Gly Arg Ser 35 40 45 Thr Tyr Pro Arg Pro His Glu Tyr Leu Ser Pro Ala Asp Leu Pro Lys 50 55 60 Ser Trp Asp Trp Arg Asn Val Asp Gly Val Asn Tyr Ala Ser Ile Thr 65 70 75 80 Arg Asn Gln His Ile Pro Gln Tyr Cys Gly Ser Cys Trp Ala His Ala 85 90 95 Ser Thr Ser Ala Met Ala Asp Arg Ile Asn Ile Lys Arg Lys Gly Ala 100 105 110 Trp Pro Ser Thr Leu Leu Ser Val Gln Asn Val Ile Asp Cys Gly Asn 115 120 125 Ala Gly Ser Cys Glu Gly Gly Asn Asp Leu Ser Val Trp Asp Tyr Ala 130 135 140 His Gln His Gly Ile Pro Asp Glu Thr Cys Asn Asn Tyr Gln Ala Lys 145 150 155 160 Asp Gln Glu Cys Asp Lys Phe Asn Gln Cys Gly Thr Cys Asn Glu Phe 165 170 175 Lys Glu Cys His Ala Ile Arg Asn Tyr Thr Leu Trp Arg Val Gly Asp 180 185 190 Tyr Gly Ser Leu Ser Gly Arg Glu Lys Met Met Ala Glu 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catgttttcc tgcagcaggt gcatagtcaa atccagaaat atcacagctg tgccagtaat 1920 aaggatgcta acaattaatt ttatcaaacc taactgtgac agctgtgatt tgacacgttt 1980 taattgctca ggttaaatga aatagttttc cggcgtcttc aaaaacaaat tgcactgata 2040 aaacaaaaac aaaagtatgt tttaaatgct ttgaagactg atacactcaa ccatctatat 2100 tcatgagctc tcaatttcat ggcaggccat agttctactt atctgagaag caaatccctg 2160 tggagactat accactattt tttctgagat taatgtactc ttggagcccg ctactgtcgt 2220 tattgatcac atctgtgtga agccaaagcc ccgtggttgc ccatgagaag tgtccttgtt 2280 cattttcacc caaatgaagt gtgaacgtga tgttttcgga tgcaaactca gctcagggat 2340 tcattttgtg tcttagtttt atatgcatcc ttatttttaa tacacctgct tcacgtccct 2400 atgttgggaa gtccatattt gtctgctttt cttgcagcat catttcctta caatactgtc 2460 cggtggacaa aatgacaatt gatatgtttt tctgatataa ttactttagc tgcactaaca 2520 gtacaatgct tgttaatggt taatataggc agggcgaata ctactttgta acttttaaag 2580 tcttaaactt ttcaataaaa ttgagtgaga cttataggcc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaa 2654 <210> 197 <211> 399 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 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gagatgctga atctcctttg cagcaatgcc ttatttataa tttgtggatt 960 tgacagtaag aactttaaca cgagtcgctt ggatgtgtat ctatcacata atccagcagg 1020 aacttctgtt caaaacatgt tccattggac ccaggctgtt aagtctggga aattccaagc 1080 ttatgactgg ggaagcccag ttcagaatag gatgcactat gatcagtccc aacctcccta 1140 ctacaatgtg acagccatga atgtaccaat tgcagtgtgg aacggtggca aggacctgtt 1200 ggctgacccc caagatgttg gccttttgct tccaaaactc cccaatctta tttaccacaa 1260 ggagattcct ttttacaatc acttggactt tatctgggca atggatgccc ctcaagaagt 1320 ttacaatgac attgtttcta tgatatcaga agataaaaag tagttctgga tttaaagaat 1380 tatccgtttg tttttccaaa atactttatt ctctcataca tagtattttc ataatgtttg 1440 acatgcagtg cttctttctg taattttgac tttagaaata tattggcatc aacaaac 1497 <210> 200 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> gastric lipase precursor <400> 200 Met Trp Leu Leu Leu Thr Met Ala Ser Leu Ile Ser Val Leu Gly Thr 1 5 10 15 Thr His Gly Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Gly Ser Pro Glu Val Thr 20 25 30 Met Asn Ile Ser Gln Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Asn Glu 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<223> cathepsin L precursor <400> 221 Met Thr Pro Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Gly Thr Ala Leu 1 5 10 15 Ala Thr Pro Lys Phe Asp Gln Thr Phe Asn Ala Gln Trp His Gln Trp 20 25 30 Lys Ser Thr His Arg Arg Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Glu Glu Trp Arg 35 40 45 Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Arg Met Ile Gln Leu His Asn Gly 50 55 60 Glu Tyr Ser Asn Gly Lys His Gly Phe Thr Met Glu Met Asn Ala Phe 65 70 75 80 Gly Asp Met Thr Asn Glu Glu Phe Arg Gln Ile Val Asn Gly Tyr Arg 85 90 95 His Gln Lys His Lys Lys Gly Arg Leu Phe Gln Glu Pro Leu Met Leu 100 105 110 Gln Ile Pro Lys Thr Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Cys Val Thr Pro 115 120 125 Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Ser 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Gly Gln Met Phe Leu Lys Thr Gly Lys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser His Asp Gln Gly Asn Gln 165 170 175 Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Phe Ala Phe Gln Tyr Ile Lys Glu 180 185 190 Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Lys 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ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 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aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210> 225 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor soluble rHuPH20 <400> 225 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe 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musculus <220> <223> hyalurinidase 3 <400> 245 Met Ile Met His Leu Gly Leu Met Met Val Val Gly Leu Thr Leu Cys 1 5 10 15 Leu Met His Gly Gln Ala Leu Leu Gln Val Pro Glu His Pro Phe Ser 20 25 30 Val Val Trp Asn Val Pro Ser Ala Arg Cys Lys Ala His Phe Gly Val 35 40 45 His Leu Pro Leu Asp Ala Leu Gly Ile Val Ala Asn His Gly Gln His 50 55 60 Phe His Gly Gln Asn Ile Ser Ile Phe Tyr Lys Asn Gln Phe Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly Ile Pro 85 90 95 Gln Ala Val Ser Leu Asp His His Leu Ala Arg Ala Ala His Gln Ile 100 105 110 Leu His Ser Leu Gly Ser Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125 Glu Glu Trp Tyr Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Pro His Arg Gln 130 135 140 Val Tyr Leu Ala Ala Ser Trp Val Trp Thr Gln Gln Met Phe Pro Gly 145 150 155 160 Leu Asp Pro Gln Glu Gln Leu His Lys Ala His Thr Ser Phe Glu Gln 165 170 175 Ala Ala Arg Ala Leu Met Glu Tyr Thr Leu Gln Leu Gly Arg Thr Leu 180 185 190 Arg Pro Ser Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Arg Tyr Pro Ala 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fascicularis <220> <223> PH20 <400> 254 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asn Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Val Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Val Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125 Gln Asp Ile Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Pro Gln Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr Ile Lys Leu 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(strain FB24) <220> <223> hyaluronan lyase <400> 275 Met Thr Arg Glu Phe Ser Arg Arg Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Leu Ala Met Val His Gly Pro Ala His Ala Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Gly Leu Arg Gln 35 40 45 Arg Trp Val Asp Gln Ile Thr Gly Arg Lys Val Leu Val Ala Gly Asp 50 55 60 Asn Asp Phe Val Thr Ala Leu Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ala Arg Thr 65 70 75 80 Ala Ile Asp Leu Leu Glu Arg Ser Ala Gly Arg Leu Thr Val Phe Ser 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Thr Asp Leu Val Thr Thr His Thr Arg 100 105 110 Leu Ala Thr Met Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Gly Ser Glu His Phe 115 120 125 Ala Asp Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ile Arg Ala Gly Leu Ala Asp Ala 130 135 140 Asn Ser Leu Cys Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Glu Gln Gly Asn Trp Trp 145 150 155 160 Ser Trp Glu Ile Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ala Asp Thr Met Val Leu 165 170 175 Leu His Ala Glu Leu Thr Ala Ala Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Ala Ala 180 185 190 Ile Asp His Phe Val Pro Asp Pro Trp Gln Gln 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(strain RCC307) <220> <223> hyaluronan lyase <400> 305 Met Gly Ala Pro Ala Ile Pro Lys Val Pro Arg Ser Pro Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu His Thr Thr Arg Pro Asn Ser Gly Glu Ser Glu Val Val Arg Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Leu Phe Glu Gln Thr Leu Val Asn Val Arg Gly Gln Leu 35 40 45 Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Glu Ser Ser Val His Asp Ser Glu Leu 50 55 60 Asn Tyr Gly Glu Ile Phe Leu Arg Asp Asn Val Pro Val Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Gly Arg Phe Glu Ile Val Arg His Phe Leu Asp Leu 85 90 95 Cys Leu Glu Leu Gln Ser Arg Ser Tyr Arg Thr Arg Gly Val Phe Pro 100 105 110 Thr Ser Phe Val Glu Glu Asp Asp Lys Ile Leu Ala Asp Tyr Gly Gln 115 120 125 Arg Ser Ile Gly Arg Ile Thr Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro 130 135 140 Val Leu Cys Trp Met Tyr Val Arg Ala Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Pro Lys Val Gln Arg Ala Val Gln Leu Leu Leu Asp Leu Val 165 170 175 Leu Gln Pro Ser Phe Tyr Glu Pro Pro Val Leu Phe Val Pro Asp Cys 180 185 190 Ala Phe Met Ile Asp Arg Pro Met Asp Val Trp 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Victivallis vadensis ATCC BAA-548 <220> <223> chondroitin AC lyase <400> 308 Met His Arg Lys Ile Val Phe Pro Leu Phe Val Leu Leu Phe Thr Ala 1 5 10 15 Phe Ala Ala Phe Ala Ala Ser Gln Pro Gln Trp Lys Trp Arg Gln Ser 20 25 30 Lys Tyr Cys Arg Ile Thr Glu His Ala Gly Lys Lys Leu Leu Thr Val 35 40 45 Ala Ile Pro Ala Asp Ala Pro Glu Ile Ser Arg Arg Asn Thr Ala Asp 50 55 60 Thr Pro Val Gly Leu Thr Cys Phe Glu Gly Gln Pro Ile Glu Phe Ser 65 70 75 80 Ile Arg Leu Arg Asn Ser Gly Ile Ser Arg Pro Asp Asn Leu His Asn 85 90 95 Gly Ile Lys Phe Gln Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Asn Gly Thr Glu Arg 100 105 110 Trp Thr Gln Ala Glu Ile Pro His Glu Pro Phe Pro Trp Arg Arg Phe 115 120 125 Arg Phe Ser Glu Arg Ile Pro Ala Asp Ala Thr Ser Gly Thr Leu Arg 130 135 140 Leu Gly Leu Gln Gly Ser Ser Gly Asn Val Glu Phe Asp Leu Asp Ser 145 150 155 160 Leu Gln Ile Arg Pro Leu Asp Pro Glu Leu Ser Pro Val Pro Pro Thr 165 170 175 Pro Glu Gln Ile Arg Glu Cys Glu Leu Ile Glu Ser Arg Leu Arg Ala 180 185 190 Gly Leu Pro Ala Gln 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agatcagcat gaggacagaa ggcaggagac tttggtcagt 3420 tacctgggaa ttctgggctg ccaggaaacg atttgggcct ctgtcagttt cttttccatg 3480 tatgaggagg gggaaatttg tatattagaa acttattcat cccactcagg acaataaaaa 3540 cgaatgtaca aaaaaaaaaa aaaaa 3565 <210> 313 <211> 562 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-25 precursor <400> 313 Met Arg Leu Arg Leu Arg Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala Arg Ala Pro Lys Pro Ser Ala Gln Asp Val Ser Leu Gly 20 25 30 Val Asp Trp Leu Thr Arg Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Pro His Pro Ala 35 40 45 Gln Ala Gln Leu Gln Ser Pro Glu Lys Leu Arg Asp Ala Ile Lys Val 50 55 60 Met Gln Arg Phe Ala Gly Leu Pro Glu Thr Gly Arg Met Asp Pro Gly 65 70 75 80 Thr Val Ala Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Ser Leu Pro Asp Val Leu 85 90 95 Gly Val Ala Gly Leu Val Arg Arg Arg Arg Arg Tyr Ala Leu Ser Gly 100 105 110 Ser Val Trp Lys Lys Arg Thr Leu Thr Trp Arg Val Arg Ser Phe Pro 115 120 125 Gln Ser Ser Gln Leu Ser Gln Glu Thr Val Arg Val Leu Met Ser Tyr 130 135 140 Ala Leu Met Ala 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ggctacaccc tccctgggtg gagaaaatac aacctcacct 360 acagaataat aaactatact ccggatatgg cacgagctgc tgtggatgag gctatccaag 420 aaggtttaga agtgtggagc aaagtcactc cactaaaatt caccaagatt tcaaagggga 480 ttgcagacat catgattgcc tttaggactc gagtccatgg tcggtgtcct cgctattttg 540 atggtccctt gggagtgctt ggccatgcct ttcctcctgg tccgggtctg ggtggtgaca 600 ctcattttga tgaggatgaa aactggacca aggatggagc aggattcaac ttgtttcttg 660 tggctgctca tgaatttggt catgcactgg ggctctctca ctccaatgat caaacagcct 720 tgatgttccc aaattatgtc tccctggatc ccagaaaata cccactttct caggatgata 780 tcaatggaat ccagtccatc tatggaggtc tgcctaagga acctgctaag ccaaaggaac 840 ccactatacc ccatgcctgt gaccctgact tgacttttga cgctatcaca actttccgca 900 gagaagtaat gttctttaaa ggcaggcacc tatggaggat ctattatgat atcacggatg 960 ttgagtttga attaattgct tcattctggc catctctgcc agctgatctg caagctgcat 1020 acgagaaccc cagagataag attctggttt ttaaagatga aaacttctgg atgatcagag 1080 gatatgctgt cttgccagat tatcccaaat ccatccatac attaggtttt ccaggacgtg 1140 tgaagaaaat agatgcagcc gtctgtgata 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Asn Cys 435 440 445 <210> 532 <211> 447 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse MMP-1a <400> 532 Phe Pro Val Phe His Asn Gly Asp Arg Gln Asn Val Glu Thr Val Trp 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Glu Asn Tyr Tyr Asn Leu Gly Lys Asn Met Gln Ala Lys 20 25 30 Asn Val Asn Gly Lys Glu Met Met Ala Glu Lys Leu Arg Gln Met Gln 35 40 45 Gln Leu Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Asn Ser Asp Pro Glu Thr Leu 50 55 60 Arg Ala Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Pro Tyr 65 70 75 80 Ala Ile Thr His Asn Asn Pro Arg Trp Thr Lys Thr His Leu Thr Tyr 85 90 95 Ser Ile Leu Asn Tyr Thr Pro Tyr Leu Pro Lys Ala Val Val Glu Asp 100 105 110 Ala Ile Ala Arg Ala Phe Arg Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr 115 120 125 Phe Gln Arg Val Phe Glu Glu Glu Gly Asp Ile Val Leu Ser Phe His 130 135 140 Arg Gly Asp His Gly Asp Asn Asn Pro Phe Asp Gly Pro Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Leu Ala His Thr Phe Gln Pro Gly Pro Gly Leu Gly Gly Asp Val His 165 170 175 Tyr Asp Leu Asp Glu Thr Trp Thr Asn Ser Ser Glu Asn Phe Asn Leu 180 185 190 Phe Tyr Val Thr Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Thr His 195 200 205 Ser Ser Asp Ile Gly Ala Leu Met Phe Pro Ser Tyr Thr Trp Tyr Thr 210 215 220 Glu Asp Phe Val Leu Asn Gln Asp Asp Ile Asn Arg Ile Gln Asp Leu 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Ser Pro Asn Pro Ile Gln Pro Thr Gly Ala Thr Thr Pro 245 250 255 His Pro Cys Asn Gly Asp Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Phe Arg 260 265 270 Gly Glu Val Phe Phe Phe Lys Gly Arg Phe Tyr Ile Arg Val Asn Arg 275 280 285 Phe Met Pro Glu Pro Glu Leu Asn Leu Ile Gly Ile Leu Trp Pro Asn 290 295 300 Leu Pro Val Lys Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ala Ser Met Ile Asp Gln 305 310 315 320 Val Arg Tyr Phe Lys Gly Ser Lys Val Trp Ala Val Gln Glu Gln Ser 325 330 335 Val Leu Arg Gly Phe Pro Arg Asp Ile His Ser Phe Phe Gly Phe Pro 340 345 350 Ser Asn Val Thr His Ile Asp Ala Ala Val Cys Glu Glu Glu Thr Gly 355 360 365 Lys Thr Tyr Phe Phe Val Asp His Met Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Asn 370 375 380 Thr Gln Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Arg Leu Thr Ala Glu Asp Phe 385 390 395 400 Pro Gly Ile Asp Asp Lys Val Asp Asp Val Phe Gln Lys Gly Glu Asn 405 410 415 Phe Tyr Phe Phe His Gln Ser Val Gln His Arg Phe Asn Leu Gln Ile 420 425 430 Arg Arg Val Asp Asp Ser Arg Asp Ser Ser Thr Trp Phe Asn Cys 435 440 445 <210> 533 <211> 5369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET303CTHis vector <400> 533 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat 60 tcccctctag taataatttt gtttaacttt aagaaggagg tctagaatgc atctcgagca 120 ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 180 tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 240 gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggattggcg aatgggacgc gccctgtagc 300 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 360 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 420 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 480 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 540 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 600 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 660 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 720 aaaatattaa cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 780 atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 840 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 900 cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 960 aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 1020 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 1080 tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 1140 ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 1200 catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 1260 aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 1320 ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 1380 gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 1440 aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 1500 gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 1560 gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 1620 gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 1680 gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 1740 gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 1800 atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 1860 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 1920 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 1980 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 2040 ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 2100 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 2160 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 2220 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 2280 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 2340 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 2400 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 2460 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 2520 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 2580 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 2640 gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 2700 acgcatctgt gcggtatttc acaccgcaat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 2760 ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc 2820 ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 2880 ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 2940 accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca 3000 gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg 3060 gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca ctgatgcctc 3120 cgtgtaaggg ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag agaggatgct 3180 cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg agggtaaaca 3240 actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat gccagcgctt 3300 cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag catcctgcga tgcagatccg 3360 gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa cacggaaacc 3420 gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt cgcttcacgt 3480 tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg caaccccgcc agcctagccg 3540 ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggg gccgccatgc cggcgataat 3600 ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc 3660 gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc agcgaaagcg 3720 gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt gcatgataaa 3780 gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga aggagctgac 3840 tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag tgagctaact 3900 tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 3960 gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg 4020 tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag 4080 agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg 4140 tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga 4200 tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc agcgccatct 4260 gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt 4320 gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat 4380 tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg 4440 ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc 4500 gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa 4560 gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca 4620 gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc accgccgctt 4680 tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttgat 4740 cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agactggagg 4800 tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa 4860 tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc 4920 tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat 4980 cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc 5040 atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg acgctctccc 5100 ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc 5160 gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct 5220 gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc 5280 ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg 5340 gccacgatgc gtccggcgta gaggatcga 5369 <210> 534 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMMP-1 <220> <221> CDS <222> (1)...(1353) <223> Pro MMP-1 <220> <221> CDS <222> (241)...(726) <223> Catalytic Domain <220> <221> CDS <222> (727)...(774) <223> Linker Region <400> 534 ttc cca gcg act cta gaa aca caa gag caa gat gtg gac tta gtc cag 48 Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp Leu Val Gln 1 5 10 15 aaa tac ctg gaa aaa tac tac aac ctg aag aat gat ggg agg caa gtt 96 Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly Arg Gln Val 20 25 30 gaa aag cgg aga aat agt ggc cca gtg gtt gaa aaa ttg aag caa atg 144 Glu Lys Arg Arg Asn Ser Gly Pro Val Val Glu Lys Leu Lys Gln Met 35 40 45 cag gaa ttc ttt ggg ctg aaa gtg act ggg aaa cca gat gct gaa acc 192 Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu Thr 50 55 60 ctg aag gtg atg aag cag ccc aga tgt gga gtg cct gat gtg gct cag 240 Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Gln 65 70 75 80 ttt gtc ctc act gag ggg aac cct cgc tgg gag caa aca cat ctg acc 288 Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu Thr 85 90 95 tac agg att gaa aat tac acg cca gat ttg cca aga gca gat gtg gac 336 Tyr Arg Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Arg Ala Asp Val Asp 100 105 110 cat gcc att gag aaa gcc ttc caa ctc tgg agt aat gtc aca cct ctg 384 His Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gln Leu Trp Ser Asn Val Thr Pro Leu 115 120 125 aca ttc acc aag gtc tct gag ggt caa gca gac atc atg ata tct ttt 432 Thr Phe Thr Lys Val Ser Glu Gly Gln Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe 130 135 140 gtc agg gga gat cat cgg gac aac tct cct ttt gat gga cct gga gga 480 Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly 145 150 155 160 aat ctt gct cat gct ttt caa cca ggc cca ggt att gga ggg gat gct 528 Asn Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ala 165 170 175 cat ttt gat gaa gat gaa agg tgg acc aac aat ttc aga gag tac aac 576 His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Arg Glu Tyr Asn 180 185 190 tta cat cgt gtt gcg gct cat gaa ctc ggc cat tct ctt gga ctc tcc 624 Leu His Arg Val Ala Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Ser 195 200 205 cat tct act gat atc ggg gct ttg atg tac cct agc tac acc ttc agt 672 His Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr Thr Phe Ser 210 215 220 ggt gat gtt cag cta gct cag gat gac att gat ggc atc caa gcc ata 720 Gly Asp Val Gln Leu Ala Gln Asp Asp Ile Asp Gly Ile Gln Ala Ile 225 230 235 240 tat gga cgt tcc caa aat cct gtc cag ccc atc ggc cca caa acc cca 768 Tyr Gly Arg Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln Thr Pro 245 250 255 aaa gcg tgt gac agt aag cta acc ttt gat gct ata act acg att cgg 816 Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile Arg 260 265 270 gga gaa gtg atg ttc ttt aaa gac aga ttc tac atg cgc aca aat ccc 864 Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn Pro 275 280 285 ttc tac ccg gaa gtt gag ctc aat ttc att tct gtt ttc tgg cca caa 912 Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro Gln 290 295 300 ctg cca aat ggg ctt gaa gct gct tac gaa ttt gcc gac aga gat gaa 960 Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp Arg Asp Glu 305 310 315 320 gtc cgg ttt ttc aaa ggg aat aag tac tgg gct gtt cag gga cag aat 1008 Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln Gly Gln Asn 325 330 335 gtg cta cac gga tac ccc aag gac atc tac agc tcc ttt ggc ttc cct 1056 Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Pro 340 345 350 aga act gtg aag cat atc gat gct gct ctt tct gag gaa aac act gga 1104 Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr Gly 355 360 365 aaa acc tac ttc ttt gtt gct aac aaa tac tgg agg tat gat gaa tat 1152 Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr 370 375 380 aaa cga tct atg gat cca ggt tat ccc aaa atg ata gca cat gac ttt 1200 Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp Phe 385 390 395 400 cct gga att ggc cac aaa gtt gat gca gtt ttc atg aaa gat gga ttt 1248 Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly Phe 405 410 415 ttc tat ttc ttt cat gga aca aga caa tac aaa ttt gat cct aaa acg 1296 Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys Thr 420 425 430 aag aga att ttg act ctc cag aaa gct aat agc tgg ttc aac tgc agg 1344 Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys Arg 435 440 445 aaa aat tga 1353 Lys Asn 450 <210> 535 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescence substrate <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> 7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl <220> <221> MOD_RES <222> 7 <223> 2,4,-Dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyll <400> 535 Xaa Lys Pro Leu Gly Leu Xaa Ala Arg 1 5 <210> 536 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescence substrate <220> <221> MOD_RES <222> 1 <223> Xaa at position 1 is N-carbobenzyloxy <220> <221> MOD_RES <222> 6 <223> Xaa at position 6 is 7-Amino-4-Methyl Coumarin <400> 536 Xaa His Arg Tyr Arg Xaa 1 5 <210> 537 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> allelic variants of MMP-1 <220> <221> VARIANT <222> 4, 10, 254 <223> Xaa = Pro <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = Met or Ser <220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = Arg <220> <221> VARIANT <222> 114, 172 <223> Xaa = Val <220> <221> VARIANT <222> 166 <223> Xaa = Cys <220> <221> VARIANT <222> 181, <223> Xaa = His <220> <221> VARIANT <222> 189, 298, 387 <223> Xaa = Thr <220> <221> VARIANT <222> 200, 286, 432 <223> Xaa = Ala <220> <221> VARIANT <222> 214 <223> Xaa = Glu <220> <221> VARIANT <222> 232 <223> Xaa = Asn <220> <221> VARIANT <222> 233, 314 <223> Xaa = Gly <220> <221> VARIANT <222> 315, 391 <223> Xaa = Ser <220> <221> VARIANT <222> 374 <223> Xaa = Met <220> <221> VARIANT <222> 386 <223> Xaa = Gln <400> 537 Phe Pro Ala Xaa Leu Glu Thr Gln Glu Xaa Asp Val Asp Leu Val Gln 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly Xaa Gln Val 20 25 30 Glu Lys Arg Arg Asn Ser Gly Pro Val Val Glu Lys Leu Lys Gln Met 35 40 45 Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu Thr 50 55 60 Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Gln 65 70 75 80 Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu Xaa 85 90 95 Tyr Arg Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Arg Ala Asp Val Asp 100 105 110 His Xaa Ile Glu Lys Ala Phe Gln Leu Trp Ser Asn Val Thr Pro Leu 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Ser Glu Gly Gln Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe 130 135 140 Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly 145 150 155 160 Asn Leu Ala His Ala Xaa Gln Pro Gly Pro Gly Xaa Gly Gly Asp Ala 165 170 175 His Phe Asp Glu Xaa Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Xaa Glu Tyr Asn 180 185 190 Leu His Arg Val Ala Ala His Xaa Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Ser 195 200 205 His Ser Thr Asp Ile Xaa Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr Thr Phe Ser 210 215 220 Gly Asp Val Gln Leu Ala Xaa Xaa Asp Ile Asp Gly Ile Gln Ala Ile 225 230 235 240 Tyr Gly Xaa Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Xaa Thr Pro 245 250 255 Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile Arg 260 265 270 Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Xaa Asn Pro 275 280 285 Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro Gln 290 295 300 Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Xaa Xaa Ala Asp Arg Asp Glu 305 310 315 320 Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln Gly Gln Asn 325 330 335 Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Pro 340 345 350 Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr Gly 355 360 365 Lys Thr Tyr Phe Phe Xaa Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr 370 375 380 Lys Xaa Xaa Met Asp Pro Xaa Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp Phe 385 390 395 400 Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly Phe 405 410 415 Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys Xaa 420 425 430 Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys Arg 435 440 445 Lys Asn 450

Claims (146)

  1. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양으로 표피하로 투여하기 위한 의약의 제형화를 위한 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)의 용도로써,
    상기 AMDE는 불활성형으로 제형화된 용도.
  2. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)를 포함하고, ECM의 질환 또는 상태의 치료에 사용을 위한 표피하로 투여되도록 제형화된 약학적 조성물로써,
    상기 AMDE는 불활성형으로 제형화된 약학적 조성물.
  3. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양으로 표피하로 투여하기 위한 의약의 제형화를 위한 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제의 용도로써,
    상기 AMDE는 활성화제 부재시 ECM에서 불활성인 기질-분해효소이며,
    상기 활성화제는 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하는 용도.
  4. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 포함하고, ECM의 질환 또는 상태의 치료에 사용을 위하여 표피하로 투여되도록 제형화된 약학적 조성물로써,
    상기 AMDE는 활성화제 부재시 ECM에서 불활성이고,
    상기 활성화제는 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제형 또는 조성물은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg, 또는 2mg 내지 4mg인 양의 AMDE를 포함하는 용도 또는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 효소는 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 용도 또는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항의 용도 또는 조성물은 피하 투여, 근육내 투여, 병변내 투여 또는 피내(intradermal) 투여를 위해 제형화된 용도 또는 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 AMDE와 동일한 조성물 내 또는 별개의 조성물 내에 제형화된 용도 또는 조성물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화 조건은 pH, 이온강도, 온도 및 금속이온 중에서 선택되는 용도 또는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 활성화 조건은 금속이온이고, 상기 금속이온은 Ca2 +인 용도 또는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 활성화 조건은 온도이고, 상기 온도는 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃인 용도 또는 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 AMDE는 활성을 위한 하나 초과의 활성화 조건을 필요로 하는 용도 또는 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 활성화 조건은 pH인 용도 또는 조성물.
  14. 제9항 또는 제13항에 있어서, 상기 활성화 조건은 산성 pH인 용도 또는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신, 칼페인 및 헤파라나제 중에서 선택된 용도 또는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신이고, 상기 카텝신은 시스테인 프로테아제 또는 아스파르트산 프로테아제인 용도 또는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 카텝신은 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 카텝신 D 및 카텝신 E 중에서 선택되는 용도 또는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 카텝신은 카텝신 L인 용도 또는 조성물.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 카텝신은 서열번호: 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열번호: 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용도 또는 조성물.
  20. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양으로 의약을 제형화하기 위한 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제의 용도로써,
    상기 AMDE는 중성 pH에서 불활성이고,
    상기 활성화제는 상기 효소를 활성화하는 산성 pH 활성화 조건을 제공하며,
    상기 AMDE는 pH 5.5에서 실질적으로 활성인 용도.
  21. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 포함하며, ECM의 질환 또는 상태의 치료에 사용을 위한 약학적 조성물로써,
    상기 AMDE는 중성 pH에서 불활성이고,
    상기 활성화제는 상기 효소를 활성화하는 산성 pH 활성화 조건을 제공하며,
    상기 AMDE는 pH 5.5에서 실질적으로 활성인 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제형 또는 조성물은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50 ㎍ 내지 75 mg, 100 ㎍ 내지 50 mg, 250 ㎍ 내지 25 mg, 500 ㎍ 내지 10 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 2 mg 내지 4 mg인 양의 AMDE의 양을 포함하는 용도 또는 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 AMDE와 동일한 조성물 내 또는 별개의 조성물 내에 제공되는 용도 또는 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 용도 또는 조성물은 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 또는 직장 투여를 위해 제형화된 용도 또는 조성물.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 pH는 약 또는 3 내지 6.5, 3.5 내지 6, 3 내지 5.5, 3 내지 4.5, 4 내지 6, 4 내지 5.5, 4.5 내지 5, 또는 5 내지 6의 범위인 산성 pH인 용도 또는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 pH는 약 또는 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 또는 6.5인 용도 또는 조성물.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 상기 pH에서 완충액으로서 산성 pH 활성화 조건을 제공하는 용도 또는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 시트릭 인산 및 히스티딘 중에서 선택된 산을 포함하는 용도 또는 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 완충액의 이온강도는 AMDE가 중성 pH에서 미리결정된 시간 동안 활성이도록 선택된 용도 또는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 미리결정된 시간은 약 또는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간인 용도 또는 조성물.
  31. 제20항 내지 30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 리소좀 효소인 용도 또는 조성물.
  32. 제20항 내지 31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신 또는 헤파라나제인 용도 또는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신이고, 상기 카텝신은 시스테인 프로테아제 또는 아스파르트산 프로테아제인 용도 또는 조성물
  34. 제33항에 있어서, 상기 카텝신은 카텝신 B, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 V 및 카텝신 D 중에서 선택된 용도 또는 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 카텝신은 서열번호: 65, 71, 183, 68, 60, 1, 189 및 90 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열번호: 65, 71, 183, 68, 60, 1, 189 및 90 중 어느 것의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용도 또는 조성물.
  36. 제33항 내지 35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 카텝신은 카텝신 L인 용도 또는 조성물.
  37. 제1항 내지 36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 자이모겐인 용도 또는 조성물.
  38. 제1항 내지 36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 하나의 사슬 또는 두개의 사슬 형태의 성숙 단백질인 용도 또는 조성물.
  39. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양으로 의약을 제형화하기 위한 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제의 용도로써,
    상기 AMDE는 활성화제 부재시 불활성이고;
    상기 활성화제는 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하고;
    상기 활성화제는 금속이온, 온도 및 이온강도 중에서 선택된 용도.
  40. 하나 이상의 ECM 성분을 분해하는데 충분한 양의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE) 및 활성화제를 포함하는 ECM의 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물로써,
    상기 AMDE는 활성화제 부재시 불활성이고;
    상기 활성화제는 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하고;
    상기 활성화제는 금속이온, 온도 및 이온강도 중에서 선택된 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 AMDE는 온도에 민감하도록 변형되고; 상기 AMDE는 37℃에서 불활성인 용도 또는 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 활성화 조건은 온도이고, 상기 온도는 약 또는 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃인 용도 또는 조성물.
  43. 제39항 내지 42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 췌장 엘라스타제, 엘라스테제-2A, 엘라스타제-2B, 호중구 엘라스타제, 프로테이나제-3, 내인성 혈관 엘라스타제, 카텝신 G, 비만세포 키마제, 비만세포 트립타제, 플라스민, 트롬빈, 그랜자임 B, 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 칼페인 1, 칼페인 2, 레구메인, 카텝신 Z, 카텝신 D, 카텝신 E, MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-10, MMP-11, MMP-7, MMP-26, MMP-12, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-20, ADAMTS-1, ADAMTS-2, ADAMTS-3, ADAMTS-4, ADAMTS-5, ADAMTS-14 및 헤파라나제 또는 이들의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용도 또는 약학적 조성물.
  44. 제39항 내지 제43항의 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 냉각된 완충액인 용도 또는 조성물.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 AMDE와 동일한 조성물 내 또는 별개의 조성물 내에 제공되는 용도 또는 조성물.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 하나의 항의 용도 또는 조성물은 피하, 근육내, 병변내, 피내, 국소, 경피, 정맥내, 경구 또는 직장 투여를 위해 제형화된 용도 또는 조성물.
  47. 제1항 내지 46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 ECM 성분은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 또는 프로테오글리칸 중에서 선택된 용도 또는 약학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 ECM 성분은 콜라겐이고, 콜라겐은 I형, II형, III형 또는 IV형 콜라겐 중에서 선택된 용도 또는 약학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 AMDE는 IV형 콜라겐보다 I형 콜라겐에 증가된 기질 특이성을 가지는 용도 또는 약학적 조성물.
  50. 제1항 내지 49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 ECM의 질환 또는 상태는 콜라겐-매개 질환 또는 상태인 용도 또는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 콜라겐-매개 질환 또는 상태는 셀룰라이트, 듀피트렌 질환(Dupuytren's disease), 페로니병(peyronie's disease), 레더호스 섬유증, 관절 경직, 기존의 반흔, 피부경화증, 림프 부종 및 교원성 대장염 중에서 선택된 용도 또는 약학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 콜라겐-매개 질환 또는 상태는 오십견과 같은 관절 경직인 용도 또는 약학적 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 상기 콜라겐-매개 질환 또는 상태는 수술 후 유착, 켈로이드, 비후성 반흔 및 함몰된 반흔 중에서 선택된 기존의 반흔인 용도 또는 약학적 조성물.
  54. 하나 이상의 ECM의 콜라겐 성분을 분해하는데 충분한 양으로 의약을 제형화하기 위한 활성화가능한 카텝신 L 및 활성화제의 용도로써,
    상기 활성화가능한 카텝신 L은 활성화제 부재시 ECM에서 불활성이고;
    상기 활성화제는 활성화가능한 카텝신 L이 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하며;
    상기 활성화 조건은 산성 pH인 용도.
  55. 하나 이상의 ECM의 콜라겐 성분을 분해하는데 충분한 양의 활성화가능한 카텝신 L 및 활성화제를 포함하고, 콜라겐-매개 질환 또는 상태의 치료에 사용을 위한 약학적 조성물로써,
    상기 활성화가능한 카텝신 L은 활성화제 부재시 불활성이고;
    상기 활성화제는 활성화가능한 카텝신 L이 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하며;
    상기 활성화 조건은 산성 pH인 약학적 조성물.
  56. 상기 카텝신 L은 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 가지거나 이의 대립형질 또는 종 또는 다른 변이체인 제54항 및 55항의 용도 또는 약학적 조성물.
  57. 활성화가능한 기질-분해효소:
    활성화제; 및
    다른 생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제 및 혈관수축제 중에서 선택되는 하나 이상의 다른 제제를 포함하는 조합물로써,
    상기 AMDE는 활성화제 부재시 불활성이고;
    상기 활성화제는 AMDE가 활성이도록 하는 상기 효소를 위한 활성화 조건을 제공하는 조합물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 활성화제는 pH, 금속이온, 온도 및 이온강도 중에서 선택된 활성화 조건을 제공하는 조합물.
  59. 제57항 또는 58항에 있어서, 상기 AMDE는 췌장 엘라스타제, 엘라스타제-2A, 엘라스타제-2B, 호중구 엘라스타제, 프로테이나제-3, 내인성 혈관 엘라스타제, 카텝신 G, 비만세포 키마제, 비만세포 트립타제, 플라스민, 트롬빈, 그랜자임 B, 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 칼페인 1 , 칼페인 2, 레구메인, 카텝신 Z, 카텝신 D, 카텝신 E, MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-10, MMP-11, MMP-7, MMP-26, MMP-12, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-20, ADAMTS-1, ADAMTS-2, ADAMTS-3, ADAMTS-4, ADAMTS-5, ADAMTS-14 및 헤파라나제 또는 이들의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 조합물.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조합물 내 AMDE는 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 10 ㎍ 내지 100 mg, 50 ㎍ 내지 75 mg, 100 ㎍ 내지 50 mg, 250 ㎍ 내지 25 mg, 500 ㎍ 내지 10 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 2 mg 내지 4 mg인 양의 AMDE를 포함하는 조합물.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다른 제제는 히알루로니다아제인 분산제인 조합물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 글리코실화된 조합물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 PH20 또는 이의 절단형인 조합물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 PH20은 양, 소 또는 인간 PH20 중에서 선택되는 조합물.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 가용성인 조합물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 서열번호:226 내지 231에 기재된 아미노산 서열을 가지거나 이의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 조합물.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 rHuPH20로 지정된 조성물로써 제공되는 가용성 히알루로니다아제인 조합물.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조합물 내 상기 히알루로니다아제는 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10유닛 내지 500,000유닛, 100유닛 내지 100,000유닛, 500유닛 내지 50,000유닛, 1000유닛 내지 10,000유닛, 5000유닛 내지 7500유닛, 5000유닛 내지 50,000유닛 또는 1000유닛 내지 10,000유닛인 양의 히알루로니다아제를 포함하는 조합물.
  69. 제57항 내지 제68항의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다른 약제는 리도카인인 마취제인 조합물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 조합의 리도카인은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10mg 내지 1000mg, 100mg 내지 500mg, 200mg 내지 400g, 20mg 내지 60mg 또는 30mg 내지 50mg인 양의 리도카인을 포함하는 조합물.
  71. 제57항 내지 제70항의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다른 제제는 알파 아드레날린성 수용체 작용제인 혈관수축제인 조합물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 알파 아드레날린성 수용체 작용제는 레보노르데프린, 에피네프린 및 노르에피네프린 중에서 선택된 조합물.
  73. 제71항에 있어서, 상기 알파 아드레날린성 수용체 작용제는 혈관수축을 달성하는 양의 에피네프린인 조합물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 조합물 내 상기 에피네프린은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10㎍ 내지 5mg, 50㎍ 내지 1mg, 50㎍ 내지 500㎍, 50㎍ 내지 250㎍, 100㎍ 내지 500㎍, 200㎍ 내지 400㎍, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg인 양의 에피네프린을 포함하는 조합물.
  75. 제57항 내지 제74항 중 어느 하나의 항의 있어서, ECM의 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 조합물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신 L이고, ECM의 질환 또는 상태는 셀룰라이트인 조합물.
  77. 산성 완충액과 동시에 또는 순차적으로 투여시, ECM의 질환 또는 상태의 치료를 위한 양의 카텝신 L을 포함하는 약학적 조성물로써,
    상기 조성물은 단일용량 투여를 위해 제형화되고;
    완충액은 카텝신 L을 활성화시키는 pH인 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 조성물 내 상기 카텝신 L의 양은 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg인 조성물.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 하나 이상의 리도카인, 에피네프린 및 히알루로니다아제을 추가로 포함하는 조합물.
  80. 활성화가능한 카텝신 L 및 히알루로니다아제를 포함하는 조합물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 rHuPH20로 지정된 조성물인 조합물.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 카텝신 L 및 히알루로니다아제는 별개의 조성물 내에 또는 단일의 조성물 내에 존재하는 조합물.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 카텝신 L을 활성화시키는 산성 완충액을 추가로 포함하는 조합물.
  84. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 카텝신 L 및 히알루로니다아제는 약학적 조성물로써 제형화된 단일의 조성물 내에 존재하는 조합물.
  85. 제57항 내지 제77항 또는 제80항 내지 제84항 중 어느 하나의 항의 조합물 및 선택적으로 사용설명서를 포함하는 키트.
  86. 두 개의 구획을 포함하는 용기로서:
    제1 구획은 치료적 유효량의 활성화가능한 기질-분해효소(AMDE)를 포함하고, 그 양은 단일용량 또는 복수용량을 위한 것이고, 단일용량은 ECM의 질환 또는 상태의 치료에 유효한 것이고;
    제2 구획은 AMDE를 활성화시키는 활성화제를 포함하는 용기.
  87. 제86항에 있어서, 상기 효소는 pH 5.5에서 실질적으로 활성인 용기.
  88. 제86항 및 제87항에 있어서, 상기 효소는 중성 pH에서 실질적으로 불활성인 용기.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혼합구획을 추가로 포함하는 용기.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, 튜브 또는 병인 용기.
  91. 제86항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, 주사기인 용기.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 하나의 항에 있어서, 주사를 위한 바늘을 추가로 포함하는 용기.
  93. 제86항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 활성화제는 pH, 금속이온 또는 이온강도 중에서 선택된 활성화 조건을 제공하고, 상기 활성화제는 액체용액 또는 현탁액으로 제공되는 용기.
  94. 제93항에 있어서, 상기 액체용액은 완충액인 용기.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 pH는 산성인 용기.
  96. 제95항에 있어서, 상기 pH는 약 또는 3 내지 6.5, 또는 3.5 내지 6, 또는 3 내지 5.5, 또는 3 내지 4.5, 또는 4 내지 6, 또는 4 내지 5.5, 또는 4.5 내지 5 또는 5 내지 6의 범위인 용기.
  97. 제95항에 있어서, 상기 pH는 약 또는 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 또는 6.5인 용기.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화제는 산성 완충용액인 용기.
  99. 제98항에 있어서, 상기 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 시트릭 인산 및 히스티딘 중에서 선택된 산을 포함하는 용기.
  100. 제99항에 있어서, 상기 완충액의 이온강도는 AMDE가 투여시 미리결정된 시간 동안 활성이도록 선택된 용기.
  101. 제93항에 있어서, 상기 활성화 조건은 금속이온이고, 상기 금속이온은 Ca2 +인 용기.
  102. 제86항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 췌장 엘라스타제, 엘라스타제-2A, 엘라스타제-2B, 호중구 엘라스타제, 프로테이나제-3, 내인성 혈관 엘라스타제, 카텝 신G, 비만세포 키마제, 비만세포 트립타제, 플라스민, 트롬빈, 그랜자임 B, 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 칼페인 1 , 칼페인 2, 레구메인, 카텝신 Z, 카텝신 D, 카텝신 E, MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MMP-10, MMP-11, MMP-7, MMP-26, MMP-12, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-20, ADAMTS-1, ADAMTS-2, ADAMTS-3, ADAMTS-4, ADAMTS-5, ADAMTS-14 및 헤파라나제 또는 이들의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용기.
  103. 제86항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신, 칼페인 및 헤파라나제 중에서 선택된 용기.
  104. 제86항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 리소좀 효소인 용기.
  105. 제86항 내지 제104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 자이모겐인 용기.
  106. 제86항 내지 제104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 단일사슬 또는 두개의 사슬 형태의 성숙 단백질인 용기.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 카텝신이고, 상기 카텝신은 시스테인 프로테아제 또는 아스파르트산 프로테아제인 용기.
  108. 제107항에 있어서, 상기 카텝신은 카텝신 S, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 F, 카텝신 O, 카텝신 R, 카텝신 V, 카텝신 W, 카텝신 D 및 카텝신 E 중에서 선택된 용기.
  109. 제108항에 있어서, 상기 카텝신은 서열번호: 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호: 57, 60, 1, 65, 180, 68, 71, 74, 77, 183, 186, 189, 80, 195, 90, 93 및 96 중 어느 것의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용기.
  110. 제86항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE 및 활성화제는 복수용량 투여를 위한 양으로 제공되는 용기.
  111. 제86항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE 및 활성화제는 단일단위 용량으로 제공되는 용기.
  112. 제111항에 있어서, 상기 용기 내 AMDE는 약 또는 10㎍ 내지 100mg, 50㎍ 내지 75mg, 100㎍ 내지 50mg, 250㎍ 내지 25mg, 500㎍ 내지 10mg, 1mg 내지 5mg, 또는 2mg 내지 4mg인 용기.
  113. 제86항 내지 제112항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용기 내 액체의 총부피는 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml인 용기.
  114. 제86항 내지 제113항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 용액 또는 현탁액 내 존재하는 용기.
  115. 제86항 내지 제113항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 AMDE는 동결건조된 용기.
  116. 두 개의 구획을 포함하는 용기로서:
    제1구획은 치료적 유효량의 활성화가능한 카텝신 L을 포함하고, 그 양은 세포외 기질(ECM)의 질환 또는 상태의 치료에 유효한 것이고;
    제2구획은 카텝신 L을 활성화시키는 것인 산성 완충액을 포함하는 용기.
  117. 제116항에 있어서, 상기 산성 완충액의 pH는 약 또는 4.5 내지 6의 범위를 가지는 용기.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 산성 완충액의 pH는 약 또는 4.5, 5, 5.5 또는 6인 용기.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 아세트산, 시트르산, 시트릭 인산 및 히스티딘 중에서 선택된 산을 포함하는 용기.
  120. 제119항에 있어서, 상기 완충액의 이온강도는 AMDE가 투여시 미리결정된 시간 동안 활성이도록 선택된 용기.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 카텝신 L은 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호:1의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 용기.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성화가능한 카텝신 L은 동결건조된 용기.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용기 내 카텝신 L은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10 ㎍ 내지 100 mg, 50 ㎍ 내지 75 mg, 100 ㎍ 내지 50 mg, 250 ㎍ 내지 25 mg, 500 ㎍ 내지 10 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 2 mg 내지 4 mg인 양의 카텝신 L을 포함하는 용기.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용기 내 총부피는 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml인 용기.
  125. 제116항 내지 제124항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 ECM의 질환 또는 상태는 셀룰라이트, 듀피트렌 질환, 페로니 병, 레더호스 섬유증, 관절 경직, 기존의 반흔, 피부경화증, 림프 부종 및 교원성 대장염 중에서 선택된 콜라겐 매개 질환 또는 상태인 용기.
  126. 제116항 내지 제124항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 ECM의 질환 또는 상태는 셀룰라이트인 용기.
  127. 제86항 내지 제126항 중 어느 하나의 항의 용기; 및
    생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제 및 혈관수축제 및 이들의 조합물 중에서 선택된 또다른 약리학적으로 유효한 제제를 함유하는 하나 이상의 추가 용기를 포함하는 조합물.
  128. 제127항에 있어서, 상기 약리학적으로 유효한 약제는 히알루로니다아제인 분산제인 조합물.
  129. 제128항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 PH20인 조합물.
  130. 제128항 또는 제129항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 가용성인 조합물.
  131. 제130항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 서열번호:226에 기재된 아미노산 서열을 가지거나 이의 대립형질 또는 종 변이체, 또는 다른 변이체인 조합물.
  132. 제128항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 히알루로니다아제는 글리코실화된 조합물.
  133. 제128항 내지 제132항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용기 내 히알루로니다아제는 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10유닛 내지 500,000유닛, 100유닛 내지 100,000유닛, 500유닛 내지 50,000유닛, 1000유닛 내지 10,000유닛, 5000유닛 내지 7500유닛, 5000유닛 내지 50,000유닛 또는 1000유닛 내지 10,000유닛유닛 히알루로니다아제를 포함하는 조합물.
  134. 제127항에 있어서, 상기 약학적으로 유효한 제제는 리도카인인 마취제이고, 상기 용기내 리도카인은 단일용량 투여를 위한 것이며, 약 또는 10mg 내지 1000mg, 100mg 내지 500mg, 200mg 내지 400mg, 20mg 내지 60mg, 또는 30mg 내지 50mg인 양의 리도카인을 포함하는 조합물.
  135. 제127항에 있어서, 상기 약학적으로 유효한 약제는 알파 아드레날린성 수용체 작용제인 혈관수축제인 조합물.
  136. 제135항에 있어서, 상기 알파 아드레날린성 수용체 작용제는 레보노르데프린, 에피네프린 및 노르에피네프린 중에서 선택된 조합물.
  137. 제136항에 있어서, 상기 알파 아드레날린성 수용체 작용제는 혈관수축을 달성하는 양의 에피네프린인 조합물.
  138. 제137항에 있어서, 상기 용기 내 에피네프린은 단일용량 투여를 위한 것이고, 약 또는 10㎍ 내지 5mg, 50㎍ 내지 1mg, 50㎍ 내지 500㎍, 50㎍ 내지 250㎍, 100㎍ 내지 500㎍, 200㎍ 내지 400㎍, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg인 양의 에피네프린을 포함하는 조합물.
  139. 제127항 내지 제138항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약리학적으로 유효한 제제는 별개의 용기 내에 제공되는 조합물.
  140. 제127항 내지 제139항 중 어느 하나의 항에 있어서:
    상기 추가 용기는 적어도 두 개의 약리학적으로 유효한 제제를 포함하고;
    상기 제제는 서로 분리된 별개의 조성물로써 제공되는 조합물.
  141. 제127항 내지 제139항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유효한 제제는 동일 조성물로 동일한 용기에 제공되는 조합물.
  142. 제127항 내지 제141항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추가 용기는 히알루로니다아제, 리도카인 및 에피네프린을 포함하는 조합물.
  143. 제127항 내지 제142항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추가 용기는 주사기인 조합물.
  144. 제127항 내지 제143항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추가 용기 내 총부피는 약 또는 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml인 조합물.
  145. 제86항 내지 제126항 중 어느 하나의 항의 용기, 투여장치 및 선택적으로 투약을 위한 사용설명서를 포함하는 키트.
  146. 제127항 내지 제144항 중 어느 하나의 항의 조합물, 투여장치 및 선택적으로 투약을 위한 사용설명서를 포함하는 키트.
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