JP2014043449A - 可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御 - Google Patents

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ギルバート・エイ・ケラー
Gregory I Frost
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Abstract

【課題】マトリックス分解酵素のインビボでの作用の持続時間を制御する方法および組み合わせの提供。
【解決手段】活性化因子に曝されたときに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を分解するのに十分な量でのＥＣＭの疾患または状態の処置のための皮下投与用医薬の製造における可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）の使用。該ＡＭＤＥは、活性化因子の非存在下、ＥＣＭ中で不活性であるマトリックス分解酵素であり、該ＡＭＤＥが、活性化因子により提供される活性化条件に曝されたときにＥＣＭ中で一定時間活性である。
【効果】作用の持続時間が制御されたマトリックス分解酵素を用いることにより、１または複数のＥＣＭ成分の沈着または蓄積の増加を特徴とするＥＣＭ介在疾患または障害を処置することができる。
【選択図】なし

Description

関連出願
２００８年３月６日付提出の、ギルバート・ケラーおよびグレゴリー・フロストによる、「可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御」と題する米国仮出願番号第６１／０６８６６７号、および２００８年５月１５日付提出の、ギルバート・ケラーおよびグレゴリー・フロストによる、「可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御」と題する米国仮出願番号第６１／１２７７２５号に対し、優先権の利益を主張する。認められた場合には、上記で示した出願の内容について、出典明示により援用する。
また本願は、米国仮出願番号第６１／０６８６６７号および米国仮出願番号第６１／１２７７２５号に対し優先権を主張している、「可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御」と題する、米国特許出願（代理人事件番号１１９３７４−０００８２／３０５６）に関するものである。
本願はまた、「マトリックス金属プロテイナーゼの温度感受性突然変異体およびその使用」と題する、米国仮特許出願（代理人事件番号１１９３７４−００１０３／ｐ３０７７）に関するものである。
認められた場合には、上記で示した関連出願の内容について、出典明示により援用する。
コンパクトディスクで提供された配列リストの援用
配列リストのコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）での電子版を、本明細書と共に４コピー（ＣＯＰＹ１、ＣＯＰＹ２、ＣＯＰＹ３およびＣＲＦのラベルを貼付）で提出しており、それらについては出典明示により援用する。２００９年３月６日作製の上述のコンパクトディスクのそれぞれについてのコンピューターで読み取り可能なファイルは同一であり、サイズが１．９６メガバイト、表題が３０５６ＳＥＱ．ＰＣ１．ｔｘｔである。
発明の分野
本発明は、マトリックス分解酵素の生体内での作用の持続時間を制御する方法および組み合わせを提供する。本方法および組み合わせにより、マトリックス分解酵素が、細胞外マトリックス（または「ＥＣＭ」）へ投与されたときに、一時的に生体内で活性化され得る。作用の持続時間が制御されたマトリックス分解酵素は、一または複数のＥＣＭ成分の沈着または蓄積の増加を特徴とするＥＣＭ介在疾患または障害の処置に使用され得る。
背景
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞および組織に不可欠な構造的支持体を提供する。ＥＣＭ成分の過剰な沈着または蓄積の結果として細胞外マトリックスに欠損または変化が生じると、ＥＣＭ介在疾患または状態が誘発され得る。これらの例には、コラーゲンの過剰な線維性中隔の存在を特徴とするコラーゲン介在疾患または状態が含まれる。多くの場合、上記疾患または状態について是認される唯一の処置は、侵襲性の高いものであり得る手術である。デュピュイトラン症候群（デュピュイトラン拘縮とも呼ばれる）を処置するための穿刺腱膜切開術またはセルライト（皮下脂肪）に関する脂肪吸引などの他の処置もまた侵襲性が高い。
コラーゲンを分解する中性ｐＨで活性を呈する酵素、コラゲナーゼは、セルライト（例、公開米国出願第ＵＳ２００７０２２４１８４号参照）、デュピュイトラン症候群（例、米国特許第ＵＳＲＥ３９９４１；５５８９１７１、６０８６８７２号参照）およびペーロニー病（例、米国特許第６０２２５３９号参照）などのＥＣＭ介在状態の処置に使用されてきた。しかしながら、コラゲナーゼは、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型のコラーゲンを不可逆的に開裂し得る。コラゲナーゼの活性が長いと、投与され得る用量は制限され、長期活性化に伴う副作用の危険も生じる。このため、これに代わるＥＣＭ介在疾患および状態の処置法が要望される。したがって、本明細書の目的の一つは、ＥＣＭ介在疾患および状態の処置を目的とする方法および可活性化型（ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）マトリックス分解酵素の組み合わせを提供することである。
要約
本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）および活性化因子を投与することによる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供する。一般的には、治療有効量のＡＭＤＥを投与する。その量は、処置される疾患または状態の相関的な要素であり、経験的に決定され得る。選択されるＡＭＤＥは、生体内での投与部位、例えばＥＣＭでは不活性のものである。ＡＭＤＥは、天然に存するマトリックス分解（ＭＤ）酵素、その種および対立遺伝子および他の変異型、例えば安定性などの基質特異性または特性などの活性を改変するように修飾が加えられた酵素を包含する。ＡＭＤＥは、特定型のコラーゲンを開裂するための高い特異性などの特性を付与するか、または本方法についての改変されたｐＨ曲線または最適条件を与えるための過程および方法により修飾され得る。投与部位にはもともと存在しない、活性化因子または活性化因子の組み合わせとの連係的な投与により、活性化因子の消散に伴って限られた期間のみ活性を呈するか、または他の形でその場所から除去されるＡＭＤＥがもたらされる。ＡＭＤＥおよび活性化因子は、逐次的、同一または個別組成物中で同時、または断続的に投与され得る。活性を呈する期間が予め定められるように条件が選択され得る。ＡＭＤＥは、活性または完全活性に対して複数の活性化因子を必要とし得る。ＡＭＤＥは、チモーゲン、完全長成熟ポリペプチド、例えば１本鎖または２本鎖ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドとして投与され得る。ＡＭＤＥは、溶液または懸濁液などの組成物で、または結晶化または凍結乾燥形態で提供され得る。ＡＭＤＥの具体例としては、限定されるわけではないが、カテプシン、カルパインおよびヘパラナーゼがある。
一般的に、ＡＭＤＥは表皮下投与される。局所を含む他の場所に投与するとき、ＡＭＤＥがｐＨ５．５で実質的に活性を呈する（典型的にはそのｐＨでの最大値と比較した場合活性の少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％または１５％が残存する）ようにＡＭＤＥを選択する。さらに、上記投与の場合、ＡＭＤＥは、典型的には中性ｐＨで不活性（活性の約１０％、１１％、１２％、１３％または１５％未満が残存）である。ＥＣＭの疾患および状態には、例えばコラーゲン介在疾患および状態がある。上記疾患および状態には、限定されるわけではないが、セルライト、デュピュイトラン病、外科的癒着、ケロイド、過形成性瘢痕および陥没瘢痕、ペーロニー病、Ｌｅｄｄｅｒｈｏｓｅ線維症（足底線維腫症）、有痛性肩拘縮症を含む関節硬着、外科的癒着、ケロイド、過形成性瘢痕および陥没瘢痕を含む既存の瘢痕、硬皮症、リンパ水腫およびコラーゲン蓄積大腸炎がある。表皮下投与には、限定されるわけではないが、皮下投与、筋肉内投与、病変部内投与および皮内投与がある。
すなわち、本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）および活性化因子をＥＣＭに表皮下投与することによる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供する。ＡＭＤＥは、活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性または部分的に不活性である。活性化因子は、ＥＣＭに投与されると酵素活性化条件を提供し、それによりＡＭＤＥは活性を呈するが、活性化条件は、活性化因子の投与前には一般にＥＣＭには存在しない。一部実施態様では、中性ｐＨでは実質的に不活性の酵素であるＡＭＤＥが選択される。
また、本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）および活性化因子の投与による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供し、その方法において、ＡＭＤＥは、中性ｐＨでは不活性であり、活性化因子は、ＡＭＤＥが投与時または投与後活性を呈するように酵素に関する酸性ｐＨ活性化条件を提供し、活性化条件は、活性化因子の投与前に投与部位には存在せず、ＡＭＤＥは、ｐＨ５．５で実質的に活性を呈するものとする。ＡＭＤＥおよび活性化因子は、限定されるわけではないが、皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口および直腸投与を含む適切な経路により投与され得る。例えば、投与は表皮下投与であり得る。
また、本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）および活性化因子の投与による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供し、その方法において、ＡＭＤＥは、活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性であるが、活性化因子が投与されると、ＡＭＤＥが活性を呈するように酵素に関する活性化条件を提供する形をとり、活性化条件は、活性化因子の投与前にはＥＣＭに存在せず、活性化因子は、金属イオン、賦形剤の温度およびイオン強度、または還元または酸化剤から選択されるものとする。ＡＭＤＥおよび活性化因子または活性化因子の組み合わせは、限定されるわけではないが、皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口および直腸投与を含む適切な経路により投与され得る。例えば、投与は表皮下投与であり得る。
一実施態様において、本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）および活性化因子の投与による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供し、その方法において、ＡＭＤＥは、活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性であるが、活性化因子がＥＣＭに投与されると、ＡＭＤＥが活性を呈するように酵素に関する活性化条件を提供する形をとり、活性化条件は、活性化因子の投与前にはＥＣＭに存在せず、活性化因子は、金属イオン、温度およびイオン強度から選択されるものとする。ＡＭＤＥおよび活性化因子は、限定されるわけではないが、皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口および直腸投与を含む適切な経路により投与され得る。例えば、投与は表皮下投与であり得る。
他の実施態様において、本発明は、可活性化型カテプシンＬおよび活性化因子の治療有効量をＥＣＭへ表皮下投与することによるコラーゲン介在疾患または状態の処置方法を提供し、その方法において、可活性化型カテプシンＬは活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性であるが、活性化因子がＥＣＭに投与されると、可活性化型カテプシンＬが活性を呈するように酵素に関する活性化条件を提供する形をとり、活性化条件は、活性化因子の投与前にはＥＣＭに存在せず、活性化条件は酸性ｐＨであるものとする。典型的なカテプシンＬポリペプチドは、配列番号１に示したアミノ酸の配列を含むもの、またはその対立遺伝子、種または他の変異型であり、上記変異型は、改変された特性または活性を有するように修飾されており、典型的には、配列番号１のいずれかに示したアミノ酸の配列と比べた場合に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
一般に、本発明方法では、時間経過に伴って、活性化因子が局所的環境により除去または消散または中和されるため、ＡＭＤＥは活性を示さなくなる。ＡＭＤＥが限られた時間または予め定められた期間活性を呈するように、活性化条件および／または活性化因子が選択または調整され得る。活性化因子は、ＡＭＤＥと同一組成物または別々の組成物中で提供または投与され得、それらは逐次、同時または断続的に投与され得る。例えば、ＡＭＤＥを投与前または投与時に活性化因子に暴露することにより、酵素は投与時に活性を呈する。活性化条件には、限定されるわけではないが、ｐＨ、イオン強度、温度および金属イオンがある。活性化条件の中で、ｐＨは、例えば酸性ｐＨ、例えば３〜６．５、または３．５〜６、または３〜５．５、または３〜４．５、または４〜６、または４〜５．５、または４．５〜５、または５〜６またはその前後を含む範囲で、例えば３、３．５、４、４．５、５、５．５、６または６．５である。ＡＭＤＥを所望のｐＨの緩衝液と接触させることによりｐＨが達成され得る。緩衝液は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、マレアート、スクシナート、ラクタート、グリシナート、クエン酸リン酸系およびヒスチジンから選択される酸を含有するものを含み得る。他の典型的活性条件には、限定されるわけではないが、金属イオンおよび温度がある。例えば、活性化条件は、金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋またはＭｇ２＋であり得る。温度は低温または高温であり得、酵素は、投与場所の温度、典型的には３７℃で実質的には不活性である。すなわち、活性化条件は温度であり、温度は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、または３７℃より高温、例えば４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、８０℃および生体内組織または細胞を損傷することのない許容温度以下の温度である。
例えば、緩衝液の緩衝能力および／またはそのイオン強度を選択することにより、活性の一時的制御が達成され得る。活性に関して予め定められる時間は、上記条件の選択により遂行され得、経験的に、または当業者に周知の方法により決定され得る。予め定められる時間の範囲は、１分間未満または１分間〜数時間、例えば１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、２時間、３時間および４時間またはその前後であり得る。
上記で示したとおり、ＡＭＤＥは、活性化可能であるか、または特定の活性化因子または活性化条件により活性化可能となるように修飾されたマトリックス分解酵素であり得る。本発明方法で使用されるＡＭＤＥには、リソソーム酵素がある。ＡＭＤＥには、例えば、カテプシン類、例えばシステインまたはアスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシン類がある。これらの例としては、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カテプシンＤおよびカテプシンＥがある。上記カテプシンの典型例は、配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかに示されたアミノ酸配列を有するカテプシン、または配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかの対立遺伝子または種変異型または他の変異型から選択されるものである。他の変異型には、例えば、改変された特性、例えば安定性、または活性、例えば基質特異性を有するように修飾された酵素がある。変異型は、例えば、アミノ酸配列が配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかに示されているポリペプチドのいずれかと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有し得る。
本発明方法において、ＡＭＤＥは、投与されると、１種または複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を開裂し得る。上記開裂は、予め定められ得る限られた時間行われる。開裂されるＥＣＭ成分には、限定されるわけではないが、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびプロテオグリカン、例えばＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型コラーゲンがある。ＡＭＤＥは、改変された特性または活性、例えばＩ型コラーゲンからＩＶ型コラーゲンに対し高い基質特異性を有するように、例えば定向進化方法または他の方法により修飾され得る。
他の作用物質も活性化因子および酵素と共に投与され得る。投与は、活性化因子および／または酵素と同一の組成物または別々の組成物として行われ得る。投与は、同時に、別々にまたは断続的に実施され得る。典型的な作用物質には、限定されるわけではないが、例えば、他の生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬および／またはそれらの組み合わせから選択される薬剤がある。分散剤の例は、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０、例えばその可溶性形態、特にｒＨｕＰＨ２０である。上記のヒアルロニダーゼは、典型的には酵素および活性化因子の投与前に投与される。可溶性ヒアルロニダーゼの典型例はｒＨｕＰＨ２０と称される生成物であって、これは、配列番号２２６に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型または配列番号２２６に示されたアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有する上記ポリペプチドの変異型をコードする核酸によりコードされる。
他の薬剤には、麻酔薬、例えばリドカイン、および血管収縮薬、例えばアルファアドレナリン作用性受容体アゴニスト、例えばレボノルデフリン、エピネフリンおよびノルエピネフリンがある。典型的には、上記薬剤は、ＡＭＤＥおよび活性化因子と共に、またはその前に投与される。すなわち、本発明は、上記の可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）、活性化因子、ヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンを表皮下投与することによる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置方法を提供する。ＡＭＤＥは活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性である。酵素、ヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンは、同時に、またはリドカインを酵素の前に投与するという条件で、逐次または断続的に投与され得る。例えば、ヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンは、酵素またはヒアルロニダーゼの投与前に投与されるか、またはヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンは同時に投与されるか、またはヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンは、単一組成物で投与され得る。ＡＭＤＥおよび活性化因子および他の作用物質は、皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口および直腸投与を含む適切な経路により投与され得る。例えば、投与は表皮下投与であり得る。
また、本発明は、本方法を実施するために使用され得る組成物、容器、組み合わせおよびキットを含む製品を提供する。例えば、本発明は、２区画を含む容器を提供する。第１区画は、治療有効量の可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）を含み、その量は、単一投薬または複数投薬に向けられたものであり、単一投薬量はＥＣＭの疾患または状態の処置に有効であるものとする。また第２区画は活性化因子を含み、その活性化因子は酵素を活性化するものである。ＡＭＤＥは、例えばリソソーム酵素、例えばカテプシン、カルパインおよびヘパラナーゼ、例えば本発明方法での使用に関して上記で示したものを含む。容器中のＡＭＤＥは、例えば、ｐＨ５．５では実質的に活性を呈し、所望により中性ｐＨでは実質的に不活性でもよいＡＭＤＥを含む、上記のものである。活性化因子は、活性化条件、例えば上記活性化条件を提供する。このため、第２区画は、例えば緩衝液など、ｐＨまたはイオン強度に変化をもたらすかまたはそれを維持するか、または金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋またはＭｇ２＋を提供する組成物を含み得る。具体例としての緩衝液には、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、マレアート、スクシナート、ラクタート、グリシナート、クエン酸リン酸系およびヒスチジンから選択される酸を含むものがある。疾患および状態は、上記のものを含む。容器はまた混合用区画を含んでおり、第１および第２区画の成分の混合を実施させ得る。典型的な容器は、チューブおよびボトル、注射針を伴うかまたは伴わない滅菌内容物、例えば注射器を含む。
ＡＭＤＥおよび活性化因子は、単一または多回投薬用の量で提供される。容器中のＡＭＤＥは、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇの量で提供され得る。それは、固体として、例えば結晶化形態または凍結乾燥形態、または液体形態、例えば溶液または懸濁液、ゲルまたは他の適切な形態で提供され得る。容器中の液体の総体積は、例えば、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌおよび約１〜１０ｍｌであり得る。
一実施態様において、本発明は、少なくとも２区画を有する容器を提供し、その第１区画は、治療有効量の可活性化型カテプシンＬを含み、その量は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置に有効なものとし、第２区画は、カテプシンＬを活性化するものである酸性緩衝液を含むものとする。疾患および状態は、処置方法に関して上記で示したものである。活性化因子は、緩衝液により与えられるｐＨであり得、特に酸性緩衝液は、ｐＨ約４．０〜５．０、特に約４．５〜６、さらに特定すれば、約４．０、４．５、５、５．５または６の範囲を有する。典型的な緩衝液は、酸、例えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、グリシン−塩酸、クエン酸リン酸およびヒスチジンを含む酸性緩衝液に含まれる。具体例としてのカテプシンＬポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を含むもの、またはその対立遺伝子、種または他の変異型であり、上記変異型は、改変された特性または活性を有するように修飾されており、典型的には、配列番号１のいずれかに示されたアミノ酸配列との比較において少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するものとする。活性化され得るカテプシンＬは、特に２本鎖または１本鎖形態である活性化成熟形態の凍結乾燥粉末として提供され得る。容器中の可活性化型カテプシンＬの量は、特定疾患または状態に治療上有効な量であり、例えば、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇおよび約２ｍｇ〜４ｍｇの範囲であり得る。具体的な量は、特定疾患または状態により異なり得、必要ならば、経験的に決定され得る。カテプシンＬは、固体、例えば凍結乾燥粉末、ペーストまたは液体、例えば懸濁液、分散液または溶液として提供され得る。容器の容量は、カテプシンＬの量および意図された経路および／または投与場所に適切なものである。例えば、容器の典型的容量は、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌまたは約１〜１０ｍｌである。
また、本発明は、上記容器（複数も可）および別の薬理学的に有効な作用物質を含む１個または複数の追加容器を含む組み合わせを提供する。上記作用物質は、生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬およびそれらの組み合わせから選択され得る。これらの作用物質は、本方法に関連して上記で示した作用物質および量を含む。例えば、追加容器は、ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０を含み得る。その量は、例えば１０単位〜５０００００単位、１００単位〜１０００００単位、５００単位〜５００００単位、１０００単位〜１００００単位、５０００単位〜７５００単位、５０００単位〜５００００単位または１０００単位〜１００００単位またはその前後の範囲であり得る。他の容器は、例えば約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜４００ｍｇ、約２０ｍｇ〜６０ｍｇまたは約３０ｍｇ〜５０ｍｇの量の麻酔薬、例えばリドカイン、および／またはレボノルデフリン、エピネフリンまたはノルエピネフリンを含む血管収縮薬、例えばアルファアドレナリン作用性受容体アゴニストを、投与場所および領域で血管収縮を誘発するのに有効な量で含有し得る。この量とは、例えば、約１０μｇ〜５ｍｇ、約５０μｇ〜１ｍｇ、約５０μｇ〜５００μｇ、約５０μｇ〜２５０μｇ、約１００μｇ〜５００μｇ、約２００μｇ〜４００μｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇの例えばエピネフリンまたは他の血管収縮薬であり得る。追加的な薬理学的に有効な薬剤は、それぞれ任意の組み合わせで一容器中において混合されるか、または単一容器で提供され得る。それらは、カテプシンＬについて上記で例示および記載した液体または固体として提供され得る。
典型的な実施態様において、組み合わせは、ＡＭＤＥおよび活性化因子を含み得、容器は、少なくとも２種の薬理学上有効な薬剤を含み得、その場合、薬剤は、互いに独立した別々の組成物として提供されるか、または同一容器における同一組成物で提供される。例えば、追加容器は、ヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。追加容器は、針を伴うかまたは伴わない注射器形態をとり得る。追加容器（複数も可）における総容量は、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌまたは約１〜１０ｍｌである。
典型的な実施態様において、組み合わせは、カテプシンＬおよびヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０を含む。それらは、別々の組成物として提供され得るか、または一容器中における単一組成物で提供される。組み合わせは、カテプシンＬを活性化する酸性緩衝液を含み得る。緩衝液は、別々の容器で提供されるか、またはカテプシンＬおよびヒアルロニダーゼの一方または両方と混合され得る。また、本発明は、酸性緩衝液と同時または逐次投与されたときＥＣＭ介在疾患または状態を処置するのに有効である量のカテプシンＬを含む医薬組成物を提供し、その組成物は単一投薬用に処方され、緩衝液はカテプシンＬを活性化するｐＨを有するものとする。カテプシンＬの量は特定疾患または状態に有効であり、例えば、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇである。さらに組成物は、リドカイン、エピネフリンおよびヒアルロニダーゼのうちの１つまたはそれ以上を含有し得る。
容器および／または組み合わせおよび組成物は、キットとしてパッケージ化され得る。キットは、本発明方法で使用される容器および／または組み合わせおよび所望による追加試薬、本発明で提供される投与装置、例えばバイアル、チューブ、注射器および針および／またはそれらの使用説明書を含む。
図１は、チモーゲンＭＭＰのアラインメントであり、プロペプチド、触媒ドメイン、リンカー領域、ヘモペキシンドメイン１〜４、フィブロネクチンＩＩ型反復単位、塩基性領域、システインスイッチ、カルシウム（Ｃａ）結合部位ＩおよびＩＩ、および亜鉛結合部位を示す。アラインメントは、ＭＭＰ−１（配列番号３２７）、ＭＭＰ−８（配列番号１０１のアミノ酸２１〜４６７）、ＭＭＰ−１３（配列番号１０４のアミノ酸２０〜４７１）、ＭＭＰ−１８（配列番号１０７のアミノ酸１８〜４６７）、ＭＭＰ−２（配列番号１１０のアミノ酸３０〜６６０）、ＭＭＰ−９（配列番号１１３のアミノ酸２０〜７０７）、ＭＭＰ−３（配列番号１１６のアミノ酸１８〜４７７）、ＭＭＰ−１０（配列番号１１９のアミノ酸１８〜４７６）、ＭＭＰ−１１（配列番号１２２のアミノ酸３２〜４８８）、ＭＭＰ−７（配列番号１２５のアミノ酸１８〜２６７）、ＭＭＰ−２６（配列番号１２８のアミノ酸１８〜２６１）、ＭＭＰ−１２（配列番号１３１のアミノ酸１７〜４７０）およびＭＭＰ−１９（配列番号１４６のアミノ酸１９〜５０８）を含む、チモーゲンＭＭＰを含む。「＊」は、その列の残基またはヌクレオチドがアラインメントにおける全配列で同一であることを意味し、「：」は、同類置換が観察されたことを意味し、「・」は、半同類置換が観察されることを意味する。 上記と同様である。 上記と同様である。 上記と同様である。 上記と同様である。 上記と同様である。 上記と同様である。
図２は、典型的ＭＭＰの触媒ドメインのアラインメントであり、典型的な保存および同類アミノ酸残基を示す。他の保存および同類アミノ酸残基もＭＭＰ間に存在することは言うまでもない。すなわち、残基のこの図および同定は、ＭＭＰ間における対応する残基の限定を意図したものではない。典型的ＭＭＰには、ＭＭＰ−１（配列番号３２７のアミノ酸８１〜２４２）、ＭＭＰ−８（配列番号１０１のアミノ酸１０１〜２４２）、ＭＭＰ−１３（配列番号１０４のアミノ酸１０４〜２４８）、ＭＭＰ−１８（配列番号１０７のアミノ酸１００〜２４６）、ＭＭＰ−２（配列番号１１０のアミノ酸１１０〜４１７）、ＭＭＰ−９（配列番号１１３のアミノ酸９４〜４２５）、ＭＭＰ−３（配列番号１１６のアミノ酸１００〜２４７）、ＭＭＰ−１０（配列番号１１９のアミノ酸９９〜２４６）、ＭＭＰ−１１（配列番号１２２のアミノ酸９８〜２２８）、ＭＭＰ−７（配列番号１２５のアミノ酸９５〜２４２）、ＭＭＰ−２６（配列番号１２８のアミノ酸９０〜２３６）、ＭＭＰ−１２（配列番号１３１のアミノ酸１０６〜２４７）およびＭＭＰ−１９（配列番号１４６のアミノ酸９８〜２３９）がある。典型的な保存および同類置換を強調している。 上記と同様である。 上記と同様である。 上記と同様である。
詳細な記載
概略
Ａ．定義
Ｂ．細胞外マトリックス
１．ＥＣＭの成分
ａ．コラーゲン
ｂ．エラスチン
ｃ．フィブロネクチン
ｄ．グリコサミノグリカン類（ＧＡＧ類）
ｉ．プロテオグリカン類
ｉｉ．ヒアルロン酸
２．皮膚の組織構造
ａ．表皮
ｂ．真皮
ｃ．皮下組織
３．ＥＣＭの疾患
Ｃ．マトリックス分解酵素
１．酵素活性化
ａ．セリンプロテアーゼ類
ｂ．システインプロテアーゼ類
ｉ．カテプシン類
カテプシンＬ
ｉｉ．カルパイン
ｃ．アスパラギン酸プロテアーゼ類
ｄ．金属プロテアーゼ類
ｅ．ヘパラナーゼ
Ｄ．可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）
１．可活性化型マトリックス分解酵素の活性化条件および活性化方法
ａ．活性化条件−酸性ｐＨ
ｂ．活性化条件−金属カチオン濃度
ｃ．活性化条件−還元剤
ｄ．活性化条件−温度
ｉ．温度感受性マトリックス金属プロテイナーゼ突然変異体
１）具体例としてのｔｓＭＭＰ−１修飾
２）組み合わせ
３）追加的修飾
４）他のＭＭＰ類
２．マトリックス分解酵素および活性化因子の組み合わせ
Ｅ．マトリックス分解酵素をコードする核酸およびそのポリペプチドの製造方法
１．ベクターおよび細胞
２．発現
ａ．原核生物細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳類細胞
ｅ．植物
３．精製技術
Ｆ．可活性化型マトリックス分解酵素の調製、処方および投与
１．注射可能物質、溶液およびエマルジョン
凍結乾燥粉末
２．局所投与
３．他の投与経路用の組成物
４．組み合わせ療法
ａ．ヒアルロナン分解酵素
ｉ．ヒアルロニダーゼ類
１）哺乳類型ヒアルロニダーゼ類
２）細菌性ヒアルロニダーゼ類
３）ヒル、他の寄生生物および甲殻類からのヒアルロニダーゼ類
ｉｉ．他のヒアルロナン分解酵素
ｉｉｉ．可溶性ヒアルロナン分解酵素
１）可溶性ヒトＰＨ２０
２）ｒＨｕＰＨ２０
ｉｖ．ヒアルロナン分解酵素の修飾によるそれらの薬物動態特性の改良
Ｇ．可活性化型マトリックス分解酵素のパッケージ化および製品
１．単一チャンバー装置
２．２区画チャンバー装置
３．キット
Ｈ．マトリックス分解酵素の活性の評価方法
１．酵素活性の評価方法
２．ＥＣＭ分解の評価方法
ａ．インビトロ検定法
ｂ．インビボ検定法
ｃ．非ヒト動物モデル
Ｉ．ＥＣＭの疾患または欠損の典型的処置方法
コラーゲン介在疾患または状態
ａ．セルライト
ｂ．デュピュイトラン病
ｃ．ペーロニー病
ｄ．Ｌｅｄｄｅｒｈｏｓｅ線維症（足底線維腫症）
ｅ．関節硬着
ｆ．既存の瘢痕
ｉ．外科的癒着
ｉｉ．ケロイド
ｉｉｉ．過形成性瘢痕
ｉｖ．陥没瘢痕
ｇ．硬皮症
ｈ．リンパ水腫
ｉ．コラーゲン蓄積大腸炎
Ｊ．実施例
Ａ．定義
特に断らなければ、本明細書で使用している技術および科学用語は全て、本発明（複数も可）が属している分野における専門家が通常理解しているのと同じ意味を有する。本明細書における開示全体を通して示された特許、特許出願、公開出願および公報、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび他の出版物については、特に断らなければ、出典明示により援用する。本明細書における用語に複数の定義がある事象では、この項での定義が優先される。ＵＲＬまたはそのような他の識別名またはアドレスを参照する場合、上記の識別名は変更され得、インターネット上の特定情報は移り変わり得るものであるが、同等内容の情報はインターネットを検索することにより入手できることは言うまでもない。上記要領で参照することにより、情報の利用可能性および公開性が証明される。
本明細書で使用している細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とは、分化した組織および器官の細胞を取り囲み、細胞に構造的支持体を提供する複雑な網状構造をいう。ＥＣＭは、構造タンパク質、例えばコラーゲンおよびエラスチン、特殊なタンパク質、例えばフィブロネクチンおよびプロテオグリカンにより構成される。正確な生化学的組成は、組織ごとに異なる。例えば皮膚では、ＥＣＭを含むのは真皮層である。「間質」という表現は、本明細書ではＥＣＭを指すのに互換的に使用している。
本明細書で使用しているＥＣＭの成分とは、結合組織の細胞により生成され、間質へ分泌される物質をいう。本発明での目的の場合、ＥＣＭ成分という表現は、タンパク質および糖タンパク質を指すのであって、ＥＣＭの他の細胞成分または他の構成成分を指すのではない。典型的なＥＣＭ成分には、限定されるわけではないが、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカンがある。
本明細書で使用しているマトリックス分解酵素とは、ＥＣＭの一または複数成分を分解する酵素をいう。マトリックス分解酵素には、共有結合的ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である、プロテアーゼがある。マトリックス分解酵素は、当業者に周知のもの、例えば本明細書記載のもの（例、表３参照）、その対立遺伝子または種変異型または他の変異型を包含する。
本明細書で使用している、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）は、活性に必要とされる活性部位Ｚｎ２＋を含む亜鉛依存的エンドペプチダーゼであるマトリックス分解酵素の一タイプを指す。ＭＭＰは、限定されるわけではないが、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカンを含むＥＣＭの成分を分解する酵素を含む。ＭＭＰは、一般的にプロペプチド、触媒ドメイン、プロリンリンカーおよびヘモペキシン（ヘモペキシン様Ｃ−末端とも呼ばれる）ドメインを含む。ＭＭＰの中には追加的ドメインを含むものもある。典型的なＭＭＰを表５に示す。ＭＭＰなる語は、あらゆる形態、例えば前駆体形態（シグナル配列を含む）、プロ酵素形態（プロペプチドを含む）、プロセッシングされた活性形態、およびその１または複数ドメインを欠く形態を包含する。例えば、ＭＭＰなる語が、触媒活性ドメインのみを含むＭＭＰを指す場合もある。典型的ＭＭＰのドメインを図１に示す。ＭＭＰはまた、その対立遺伝子または種変異型または他の変異型を包含する。
本明細書で使用している修飾マトリックス分解酵素（またはマトリックス分解酵素の変異型）は、野生型酵素とは異なり一次配列に１つ以上の修飾が加えられている酵素をいう。１つ以上の突然変異は、１つ以上のアミノ酸の置き換え（置換）、挿入、欠失およびそれらの組み合わせであり得る。修飾酵素は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多数の修飾位置を伴うものを包含する。修飾酵素は、野生型酵素の活性を保持しているが、改変された基質特異性または安定性を有し得る。修飾酵素は、典型的には野生型酵素の対応するアミノ酸配列に対して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有する。
本明細書で使用しているリソソーム酵素は、その分解機能が酸性ｐＨで最適となる酵素をいう。低ｐＨという必要条件があるため、上記酵素は、一般的に細胞のリソソームに存在する。リソソーム酵素には、限定されるわけではないが、カテプシンＳ、Ｋ、Ｌ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｆ、Ｏ、Ｒ、Ｖ、ＤおよびＥがある。リソソーム酵素の典型例には、配列番号５６、５９、６２、６４、１７９、６７、７０、７３、７６、１８２、１８５、１８８、７９、１９４、８９、９２および９５のいずれかに示した前駆体形態および配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６に示したその成熟形態またはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型がある。他のリソソーム酵素には、限定されるわけではないが、リソソーム酸性リパーゼ、胃リパーゼ、リソソームホスホリパーゼおよび胆汁酸塩活性化リパーゼがある（成熟形態を含む、アミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１９６〜２０７のいずれかに示されている）。
本明細書で使用している温度感受性（ｔｓ）突然変異体または温度感受性を付与する突然変異または変異型または修飾は、許容温度と呼ばれるある温度で、非許容温度と呼ばれる他の温度の場合よりも高い酵素活性を呈するように修飾されたポリペプチドを指す。一般的に、温度感受性突然変異体は、高温よりも低温で高い酵素活性を呈する。
本明細書で使用している許容温度は、ポリペプチドが非許容温度と呼ばれる第２の温度の場合より高い酵素活性を呈する温度である。このため、本発明で提供する修飾酵素は、ある温度では別の温度の場合より高くなるといったように異なる温度では異なる活性を呈する。酵素が高い活性を呈する温度が許容温度である。
本明細書で使用している非許容温度は、ポリペプチドが許容温度の場合より低い酵素活性を呈し、修飾されていない酵素と比べて低い活性を呈する温度である。本発明が提供する温度感受性突然変異体は、非許容温度では許容温度での活性の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％〜１００％未満の酵素活性を呈する。また、本発明が提供する温度感受性突然変異体は、非許容温度での修飾されていない酵素（例、野生型酵素）の場合と比べると非許容温度での活性の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％〜１００％未満の活性を呈する。
本明細書で使用している、非許容温度の場合に対する許容温度での酵素活性の比率は、許容および非許容温度での酵素活性の関係を指す。それは、許容温度での活性を非許容温度での活性で割ることによる商により表される。
本明細書で使用している生理学的温度は、体内で維持されている温度条件をいい、約３７℃、例えば３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃または３９℃またはその前後である。人体温度の正常範囲は、代謝速度、特定臓器などの因子および他の因子により変動することは言うまでもない。本発明での目的の場合、生理学的温度は、正常な室温（例、２２．７〜２４．４℃）に保たれた室内にいる、非絶食状態で快適な服装をした対象について存在する温度である。
本明細書で使用している「可逆（性）の」という語は、許容温度でのその活性が、非許容温度に暴露され、許容温度に再暴露されたときに回復または部分的に回復され得る修飾酵素を指す。このため、可逆性酵素の活性は、それが一旦非許容温度に暴露されても、許容条件にのみ暴露された酵素の活性と同一またはそれが実質的に保持されており、非許容温度にのみ暴露された酵素の活性より大きい。例えば、非許容条件から許容条件に戻されたとき、可逆性酵素は、非許容温度にのみ暴露された酵素の約１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％またはそれより高い活性を呈し、許容温度にのみ暴露された酵素の活性を保持している。
本明細書で使用している「不可逆（性）または非可逆（性）の」という語は、許容温度でのその酵素活性が、非許容温度に暴露され、許容温度に再暴露されたときに回復されない修飾酵素を指す。このため、不可逆性酵素の活性は、それが一旦非許容温度に暴露されると、許容温度にのみ暴露された酵素の活性より低くなり、また、非許容条件にのみ暴露された酵素の活性より低いか、またはそれと同程度または実質的に同程度となる。例えば、許容条件に戻されたとき、不可逆性酵素が呈する活性は、非許容温度での活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％または１２０％となり、許容温度にのみ暴露された酵素の活性の１００％未満となる。
本明細書で使用しているドメインとは、構造的および／または機能的に区別または特定され得るポリペプチドの一部分（３またはそれより多数、一般的には５または７またはそれより多数のアミノ酸の配列）をいう。例えば、ドメインは、１または複数の構造モチーフ（例、ループ領域により連結されたアルファらせんおよび／またはベータ鎖の組み合わせ）により構成されたタンパク質内に独立した折りたたみ構造を形成し得、および／または機能的活性、例えばキナーゼ活性により認識されるものを含む。タンパク質は、一つまたは複数の異なるドメインを有し得る。例えば、ドメインは、関連ファミリー構成員とのその配列の相同性により、例えば細胞外ドメインを特定する相同性およびモチーフにより同定、特定または識別され得る。別の例では、ドメインは、その機能により、例えば酵素活性、例えばキナーゼ活性、または生体分子との相互作用能、例えばＤＮＡ結合、リガンド結合および二量体化の能力により識別され得る。ドメインは、それが独立して、または別の分子と融合して活性、例えばタンパク質加水分解活性またはリガンド結合を遂行し得るように、独立して機能または活性を呈し得る。ドメインは、ポリペプチドからのアミノ酸の線状配列またはアミノ酸の非線状配列であり得る。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含む。例えば、ＭＭＰのドメイン構造を図１に示す。当業者であれば、ドメインについて熟知しており、他の上記ドメインとの構造的および／または機能的相同性によりそれらを同定することができるはずである。
本明細書で使用している触媒ドメインは、触媒または酵素機能を呈するポリペプチドの部分を指す。上記ドメインまたは領域は、典型的には基質と相互作用して、その触媒作用を誘発する。ＭＭＰの場合、触媒ドメインは、３個のヒスチジン残基と結合したＺｎ２＋イオンを含み、保存配列ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨにより表される亜鉛結合モチーフを含む。
本明細書で使用している高プロリンリンカー（ヒンジ領域とも呼ばれる）は、測定可能な機能をもたない可撓性ヒンジまたはリンカー領域をいう。上記領域は、典型的にはドメインまたは領域間で見出され、ポリペプチドの可撓性の一助となる。
本明細書で使用しているヘモペキシン結合ドメインまたはヘモペキシン様Ｃ−末端ドメインは、ＭＭＰのＣ−末端領域を指す。それは４枚刃のβ−プロペラ構造であり、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。例えば、ＭＭＰのヘモペキシン結合ドメインは、様々な基質と相互作用し、阻害剤、例えば金属プロテアーゼ類の組織阻害剤（ＴＩＭＰ）とも相互作用する。
本明細書で使用している、「本質的に特定ドメイン、例えば触媒ドメインにより構成される」または「ポリペプチドが本質的に特定ドメイン、例えば触媒ドメインにより構成されている」という表現は、ポリペプチドのＭＭＰ部分のみがそのドメインまたは触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、所望により、典型的には少なくとも３、４、５、６またはそれより多数である、追加的な非ＭＭＰ由来のアミノ酸配列を、例えば別のポリペプチドへの挿入またはそれとの結合により含み得る。
本明細書で使用している「チモーゲン」は、不活性前駆体であり、活性となるために何らかの変化、例えばポリペプチドのタンパク質加水分解を必要とする酵素をいう。チモーゲンはまた、例えば、限定されるわけではないが、ｐＨ、イオン強度、金属イオンまたは活性化のための温度などの補因子の追加を必要とする場合もある。チモーゲンは、酵素のプロ酵素形態を含む。このため、チモーゲンは、一般的に不活性であり、追加的補因子の存在下または非存在下においてチモーゲンからのプロ領域の触媒または自触的開裂により成熟ポリペプチドに変換され得る。
本明細書で使用しているプロセグメントまたはプロ領域は、開裂されることにより、成熟タンパク質を生成する領域またはセグメントをいう。これは、触媒機構を遮蔽することにより酵素活性を抑制するように機能するセグメントを含み得る。プロ領域は、成熟ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列であり、数個程度の小さなアミノ酸であり得るかまたはマルチドメイン構造であり得る。
本明細書で使用している活性化配列は、活性化開裂または成熟開裂による活性プロテアーゼの形成に必要とされる部位であるチモーゲンにおけるアミノ酸配列をいう。活性化配列の開裂は、自触的に、または活性化パートナーにより触媒され得る。
活性化開裂は、活性に必要とされる立体配座の変化が起こる成熟開裂の一タイプである。活性化により、プロテアーゼの多鎖形態、例えば２本鎖形態が生成され得る。場合によっては、プロテアーゼの単鎖形態が単鎖としてタンパク質加水分解活性を呈することもあり得る。
本明細書で使用している補因子は、酵素活性に必要とされる条件または因子をいう。補因子は、酵素活性に必要とされるものであれば全て含む。補因子の例には、限定されるわけではないが、ｐＨ、イオン強度、金属イオンまたは温度がある。酵素のインビボ投与について言えば、補因子は内因的に存在する因子および外因的に提供される因子を含む。
本明細書で使用している活性化条件は、酵素活性に要求される物理的条件または条件の組み合わせをいう。本発明の目的の場合、可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）に関する活性化条件は、酵素活性化に必要とされる量（すなわち、量、程度、レベルまたは他の物理的尺度）では投与部位に存在しない、例えば細胞外マトリックスに存在しないものを含む。活性化条件の例には、限定されるわけではないが、ｐＨ、金属イオン、還元または酸化剤、温度およびイオン強度がある。例えば、低ｐＨ条件では活性を示すが、中性ｐＨでは不活性であるリソソームマトリックス分解酵素の場合、酸性ｐＨである活性化条件に不活性酵素を暴露することにより、酵素の活性化が誘発される。活性化条件が酵素の投与部位には存在しないため、外因的に付加しなければならないという事実により、活性化条件は、時間の経過と共に消散および／または中和され、酵素を活性化するための活性化条件は存在しなくなる。このため、酵素は、投与後限られたかまたは予め定められた期間活性を呈する。
本明細書で使用している活性化因子は、可活性化型マトリックス分解酵素についての活性化条件を提供する組成物をいう。活性化因子の例には、限定されるわけではないが、酸性ｐＨ緩衝液、冷緩衝液またはカルシウム緩衝液がある。
本明細書で使用している「可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）」は、活性となるために活性化条件を必要とするマトリックス分解酵素をいう。本発明での目的の場合、例えば、ＡＭＤＥは、ＡＭＤＥの投与の前、それと同時または後続的に活性化因子に暴露させることにより、酵素に関する活性化条件が提供されなければ、ＥＣＭにおいて実質的に不活性である。このため、酵素が活性を呈する生体内での場所または部位での持続期間が、活性化条件の消散および／または中和の結果として予め定められるか、そして／または制御され得るように、可活性化型酵素の活性化は外的条件により制御される（すなわち、一時的に制御可能または時間制御される）。すなわち、活性化条件に暴露することにより、酵素はＥＣＭで限られた期間および／または限られた範囲まで活性を呈する（すなわち、条件付きで活性を呈する）。活性化の範囲および時間は、活性化因子または活性化条件の選択により制御され得、予め定められた期間であり得る。例えば、リソソーム酵素、例えばカテプシンＬは、それが、例えば酸性緩衝液により提供される、ｐＨの活性化条件への暴露により活性化され得るという点で可活性化型である。活性化された酵素をＥＣＭの中性ｐＨ環境に投与すると、ｐＨ環境は、酵素が不活性となるように、酸性緩衝液の緩衝能力に基づいて予め定められ得る期間で中性に戻る。
本明細書で使用している「活性化因子の量」は、活性化因子の量、程度またはレベルをいう。活性化因子の量は、濃度または絶対量、または特定温度またはｐＨであり得る。本発明での目的の場合、活性化因子の量は、典型的には酵素の条件的活性化をもたらすのに十分な量である。この量は、活性化の持続時間を改変するように調節され得るため、活性化は限られたかまたは予め定められた期間続行され得る。
本明細書で使用している「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療効果を生み出すのに少なくとも十分なものである薬剤、化合物、材料、または化合物を含む組成物を指す。
本明細書で使用している、限られた期間または限られた持続時間活性を呈する酵素は、時間経過と共に消散するか、そして／または中和される活性を有する活性酵素をいう。すなわち、活性化条件が存在しないことにより、酵素は不活性の状態である。
本明細書で使用している予め定められた期間は、既知であり、制御され得る限られた期間を意味する。酵素活性に必要とされる活性化条件の消散および／または中和を滴定することにより、活性酵素を不活性にするのに要する時間が判明し得る。例えば、酸性媒質で投与され、中性ｐＨを有するインビボ環境（すなわち、ＥＣＭ）に暴露される酸活性化酵素は、時間経過とともに漸増ｐＨに暴露されるため、結果的に、酵素が活性を呈するのは限られた期間のみとなる。ｐＨ増加速度は、例えば、活性酵素を不活性にするのに要する期間が予め定められ得るように酸性緩衝液の緩衝能力を変えることにより制御され得る。本発明での目的の場合、酵素は、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間または４時間またはその前後である予め定められた期間活性を呈し得る。
本明細書で使用している、中性ｐＨで実質的に不活性とは、酵素が、中性ｐＨのときに、類似した条件（ｐＨ差異以外）、すなわち検定法、緩衝液、イオン強度下でその最適ｐＨでの酵素の活性の１０％に満たない活性を呈することを意味する。
本明細書で使用している、ｐＨ５．５で実質的に活性とは、酵素が、ｐＨ５．５のときに、類似した条件（ｐＨ差異以外）、すなわち検定法、緩衝液、イオン強度下でその最適ｐＨでの酵素活性の１０％を超える、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性を呈することを意味する。
本明細書で使用している表皮下投与は、皮膚の最外層下で酵素を送達する投与を意味する。表皮下投与は、皮膚の外層への局所適用を含まない。表皮下投与の例には、限定されるわけではないが、皮下、筋肉内、病変部内および皮内投与経路がある。
本明細書で使用している基質は、酵素により開裂される分子をいう。最小限、標的基質は、プロテアーゼにより認識される開裂配列を含むペプチドを含むため、長さが２、３、４、５、６またはそれより長い残基であり得る。基質はまた、酵素により開裂される完全長タンパク質、その対立遺伝子変異型、アイソフォームまたは一部分を含む。さらに、基質は、酵素による基質の開裂に影響を及ぼさない追加的部分を含むペプチドまたはタンパク質を含む。例えば、基質は、４アミノ酸ペプチド、または蛍光原部分に化学的に結合された完全長タンパク質を含み得る。
本明細書で使用している開裂は、１または複数の分解産物をもたらす、酵素によるペプチド結合または他の結合の破壊をいう。
本明細書で使用している活性は、完全長（完全）タンパク質に随伴するポリペプチドまたはその一部分の機能的一活性または複数活性をいう。機能的活性には、限定されるわけではないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体と結合するかまたはそれとの結合についてポリペプチドと競争する能力）、免疫原性、多量体形成能力およびポリペプチドについての受容体またはリガンドへの特異的結合能がある。
本明細書で使用している酵素活性または触媒活性または開裂活性は、選択された基質のタンパク質加水分解を検出するインビトロタンパク質加水分解検定法で評価されるプロテアーゼの活性をいう。
本明細書で使用している活性酵素は、酵素活性を呈する酵素をいう。本発明での目的の場合、活性酵素は、例えばコラーゲンなど、ＥＣＭのいずれか一または複数成分を開裂する酵素である。活性酵素は、１本鎖または２本鎖形態を含む。
本明細書で使用している不活性酵素は、実質的に活性（すなわち、触媒活性または開裂活性）を呈しない、例えば活性が酵素の最大活性の１０％に満たない酵素をいう。酵素は、その立体配座、その活性に必要とされる活性化条件の欠如、または阻害剤または酵素を実質的に不活性にする他の条件または因子または形態の存在により不活性であり得る。
本明細書で使用しているヒトタンパク質は、その全対立遺伝子変異型および保守的変異型を含む、ヒトゲノムに存在する核酸分子、例えばＤＮＡによりコードされるものである。タンパク質の変異型または修飾型は、修飾がヒトタンパク質の野生型または優勢な配列に基づいている場合には、ヒトタンパク質である。
本明細書で使用しているヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンポリマー（ヒアルロン酸またはＨＡとも称される）の小分子量フラグメントへの開裂を触媒する酵素である。ヒアルロナン分解酵素の例は、ヒアルロニダーゼ、およびヒアルロナンを脱重合させる能力をもつ特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼである。ヒアルロナン分解酵素である典型的コンドロイチナーゼには、限定されるわけではないが、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られている）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られている）およびコンドロイチンＣリアーゼがある。コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２酵素、すなわちコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２０）およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２１）を含む。典型的なコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼおよびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼには、限定されるわけではないが、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびフラボバクテリウム・ヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）由来のものがある（プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは、配列番号３０５に示されている；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１（１）：３９−４６）。細菌由来の典型的コンドロイチナーゼＡＣ酵素には、限定されるわけではないが、配列番号３０８に示されたフラボバクテリウム・ヘパリヌム・ビクチバリス・バンデンシス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ ｖａｄｅｎｓｉｓ）およびアルトロバクター・アウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）に由来するものがある（Ｔｋａｌｅｃ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６（１）：２９−３５； Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０（５）：３８７−４４４）。細菌由来の典型的コンドロイチナーゼＣ酵素には、限定されるわけではないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来するものがある（Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＦＥＭＳ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ−Ｌｅｔｔ． ４８（２）：１２１−４； Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５１：１１５４−８； Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６２：１２７−１３３）。
本明細書で使用しているヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素を指す。ヒアルロニダーゼには、細菌性ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．９９．１）、ヒル、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）および哺乳類型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）がある。また、ヒアルロニダーゼには、限定されるわけではないが、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚類、カエル、細菌を含む、ヒト以外の起源を有するもの、およびヒル、他の寄生虫および甲殻類に由来するものがある。典型的な非ヒトヒアルロニダーゼには、配列番号２３７〜２６０のいずれかに示されたものがある。典型的なヒトヒアルロニダーゼには、ＨＹＡＬ１（配列番号２６２）、ＨＹＡＬ２（配列番号２６３）、ＨＹＡＬ３（配列番号２６４）、ＨＹＡＬ４（配列番号２６５）およびＰＨ２０（配列番号２３２）がある。また、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０もヒアルロニダーゼに含まれる。
ヒアルロニダーゼなる語は、前駆体ヒアルロニダーゼポリペプチドおよび成熟ヒアルロニダーゼポリペプチド（例えばシグナル配列が除去されたもの）、活性を有するその先端切除形態を含み、対立遺伝子変異型および種変異型、スプライス変異型によりコードされる変異型および他の変異型、例えば配列番号２３２のいずれかに示された前駆体ポリペプチドまたはその成熟形態との少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチドを含む。ヒアルロニダーゼはまた、化学的または翻訳後修飾を含むもの、および化学的または翻訳後修飾を含まないものを包含する。上記修飾には、限定されるわけではないが、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当業界で周知の他のポリペプチド修飾がある。
本明細書で使用している可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、発現されると、ポリペプチドが可溶性となるようにＣ−末端におけるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位の全部または一部分を欠いた成熟ポリペプチドを含む。典型的なｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号２２６〜２３１のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドを含む。上記の典型的ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドについての前駆体ポリペプチドは、アミノ酸シグナル配列を含む。前駆体の典型は配列番号２２５に示されており、アミノ酸１〜３５位に３５アミノ酸シグナル配列を含む。可溶性ＨｕＰＨ２０ポリペプチドは、本明細書記載の製造および精製方法の最中または後に分解され得る。
本明細書で使用している可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で組換え技術により発現されるヒトＰＨ２０の可溶性形態を指す。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、配列番号２２５に示されたアミノ酸１〜４８２をコードする核酸によりコードされる。また、その対立遺伝子変異型および他の可溶性変異型であるＤＮＡ分子も含まれる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は、成熟ポリペプチドを分泌するＣＨＯ細胞で発現される。培養培地で生成されるとき、Ｃ−末端が不均一な状態であるため、生成物は配列番号２２６〜２３１の種類の混合物を含むことになる。対応する対立遺伝子変異型および他の変異型も含まれる。他の変異型は、それらがヒアルロニダーゼ活性を保持し、可溶性でありさえすれば、配列番号２２６〜２３１のいずれかとの６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有し得る。
本明細書で使用しているヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼポリペプチドが呈する活性を指す。上記活性は、インビトロおよび／またはインビボで試験され得、限定されるわけではないが、例えばヒアルロン酸の開裂を果たすための酵素活性、分散または拡散剤として作用する能力および抗原性を含む。典型的な検定法には、未開裂ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときに形成された不溶性沈殿物を検出することにより、間接的にヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の開裂を測定する微小濁度検定法（例、実施例１６参照）がある。
本明細書で使用している天然（に存する）α−アミノ酸の残基は、ヒトにおけるその同族体ｍＲＮＡコドンでの負荷ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に組み込まれた天然に見出される２０αアミノ酸の残基である。
本明細書で使用している核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体を包含し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含む。核酸は、１本または２本鎖形態であり得る。プローブまたはプライマーと言えば、所望により、例えば検出可能な標識、例えば蛍光性または放射性標識で標識されていてもよく、１本鎖分子が考えられる。上記分子は、典型的には、それらの標的がライブラリーを探索またはプライミングする上で統計的にユニークであるかまたは低コピー数（典型的には５未満、一般的には３未満）となるような長さを有する。一般的にプローブまたはプライマーは、興味の対象である遺伝子と相補的または同一である配列の少なくとも１４、１６または３０の連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれより長い核酸長であり得る。
本明細書で使用しているペプチドは、２〜４０アミノ酸長であるポリペプチドをいう。
本明細書で使用している、本発明で提供されたアミノ酸の様々な配列に出てくるアミノ酸は、それらの公知３文字または１文字省略形（表１）に従って識別される。様々な核酸フラグメントに出てくるヌクレオチドは、当業界で常用されている標準１文字名称で命名されている。
本明細書で使用している「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２またはそれより多数のアミノ酸を含む。本発明での目的の場合、アミノ酸は、２０の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
本明細書で使用している「アミノ酸残基」は、ポリペプチドに対するそのペプチド結合での化学的消化（加水分解）時に形成されるアミノ酸をいう。本明細書記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であると推定される。同様に命名された「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性をポリペプチドが保持している限り、Ｌ−アミノ酸残基に対し置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：３５５２−３５５９ （１９６９）に記載され、３７．Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２として採用された標準ポリペプチド命名法に従うものとして、アミノ酸残基についての省略形を表１に示す。
表１−対応表
Figure 2014043449
本明細書において式により示されたアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端からカルボキシ末端への慣用的方向で左から右への配向を有するものとする。さらに、「アミノ酸残基」という表現は、対応表（表１）で列挙したアミノ酸および修飾および特異アミノ酸、例えば３７Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§１．８２１−１．８２２で示され、援用されたものを含むものとして広範に定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始点または終点のダッシュは、１または複数のアミノ酸残基のさらなる配列、アミノ末端基、例えばＮＨ２またはカルボキシ末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示すものとする。
本明細書で使用している「天然アミノ酸」とは、ポリペプチドに出てくる２０Ｌ−アミノ酸をいう。
本明細書で使用している「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸と類似した構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾された有機化合物をいう。したがって、非天然アミノ酸は、例えば、２０天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、限定されるわけではないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマーを含む。本明細書では典型的非天然アミノ酸について記載しており、それらは当業者には周知である。
本明細書で使用しているＤＮＡ構築物は、天然では見出されない形で結合および並置されたＤＮＡのセグメントを含む１本または２本鎖の線状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、人為的操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書で使用しているＤＮＡセグメントは、特定の属性を有する大型ＤＮＡ分子の一部分である。例えば、特定ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、長いＤＮＡ分子の一部分、例えばプラスミドまたはプラスミドフラグメントであり、５’から３’方向へ読み取られたときに、特定ポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
本明細書で使用しているポリヌクレオチドの語は、５’から３’末端へ読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本または２本鎖ポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離されるか、インビトロ合成されるか、または天然および合成分子の組み合わせから調製され得る。本明細書ではポリヌクレオチド分子の長さをヌクレオチド（略して「ｎｔ」）または塩基対（略して「ｂｐ」）として与える。ヌクレオチドの語は、文脈上問題が無い場合１本および２本鎖分子に使用される。この語を２本鎖分子に適用する場合、それは全体の長さを示すのに使用され、塩基対の語と同等内容であるものとする。当業者であれば、２本鎖ポリヌクレオチドの２本鎖は長さが微妙に異なり得ること、およびその末端は互い違いに切断され得ること、すなわち２本鎖ポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドが全て対合され得るわけではないことを認めるはずである。一般に、上記の非対合末端が２０ヌクレオチド長を超えることはない。
本明細書で使用している２タンパク質または核酸間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の関連性をいう。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および／または相同性の度合いに基づき得る。タンパク質または核酸間の類似度の評価方法は、当業者には周知のものである。例えば、配列類似性の一評価方法では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を、配列間の最大レベルの同一性が得られるように並行整列させる。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列がインバリアントである範囲を指す。また、アミノ酸配列およびある範囲までのヌクレオチド配列のアラインメントは、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保守的差異および／または頻繁な置換を考慮に入れることが可能である。保守的差異は、関与している残基の物理化学特性を保存している場合である。アラインメントは、グローバル（全残基を含め、配列の全長にわたって比較される配列のアラインメント）またはローカル（最も類似した領域または複数領域のみを含む配列の一部分のアラインメント）であり得る。
「同一性」それ自体は、当業界公認の意味を有し、公開された技術を用いて計算され得る。（例、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、１９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、１９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー、１９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；および Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． および Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、１９９１参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する若干の方法が存在しており、「同一性」の語は当業者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ． ＆ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８））。
本明細書で使用している（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）「相同的な」は、２５％と同等またはその前後を含めそれより高い配列相同性、典型的には２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％と同等またはそれより高い配列相同性であることを意味し、必要ならば、正確なパーセンテージが特定され得る。本発明での目的の場合、「相同性」および「同一性」の語は、特に断らなければ互換的に使用されることが多い。一般には、相同性または同一性パーセンテージを測定するためには、最高順位のマッチが得られるように配列を並行整列させる（例、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、１９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、１９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， および Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー、１９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． および Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、１９９１； Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３参照）。配列相同性により、保存アミノ酸の数は、標準アラインメントアルゴリズムプログラムにより測定され、各供給業者により確立されたデフォルトギャップペナルティにより使用され得る。実質的相同性核酸分子は、典型的には興味の対象である核酸の全長に沿って中程度のストリンジェンシーまたは高度ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションする。また、ハイブリダイゼーションしている核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も考慮に入れられる。
任意の２分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」または「相同」であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知コンピューターアルゴリズムを用いることにより、例えばＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ 記載のデフォルトパラメーターを用いて決定され得る（他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（Ｉ）：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３ （１９９０））；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， サンディエゴ、１９９４， および Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ がある）。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ データベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性の測定に使用され得る。他の市販または公的に入手可能なプログラムには、ＤＮＡＳｔａｒ “ＭｅｇＡｌｉｇｎ”プログラム（マディソン、ウィスコンシン）およびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧ） “Ｇａｐ”プログラム（マディソン、ウィスコンシン）がある。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより決定され得る（例、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎにより改訂（（１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２参照）。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似している並列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２配列の短い方における記号の総数で割ったものとして類似性を定義する。ＧＡＰプログラムに関するデフォルトパラメーターは、（１）Ｓｃｈｗａｒｔｚ および Ｄａｙｈｏｆｆ編、ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁 （１９７９）により記載された、単純比較マトリックス（同一性については１および非同一性については０の値を含む）および Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５ の加重比較マトリックス、（２）各ギャップについて３．０のペナルティおよび各ギャップにおける各記号について追加の０．１０ペナルティ、および（３）エンドギャップについての無ペナルティを含み得る。
したがって、本明細書で使用している「同一性」または「相同性」の語は、試験およびリファレンスポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書で使用している少なくとも「９０％同一である」という表現は、ポリペプチドのリファレンス核酸またはアミノ酸配列に対する９０〜９９．９９％の同一性を指す。９０％またはそれより高いレベルの同一性は、具体的に示す目的で１００アミノ酸の試験およびリファレンスポリペプチド長を比較すると仮定した場合、リファレンスポリペプチドとの比較において、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸が示す差異の割合が１０％（すなわち、１００のうち１０）を越えないという事実を示すものである。同様の比較は、試験およびリファレンスポリヌクレオチド間でも行われ得る。上記の差異は、ポリペプチドの全長にわたって無作為に分布した点突然変異として表され得るか、またはそれらは、最大許容範囲、例えば１０／１００アミノ酸差異（約９０％同一性）までの様々な長さの１または複数位置でクラスターを形成させ得る。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメーター設定とは独立しているべきである。かかる高レベルの同一性は、多くの場合ソフトウェアに頼らず手動でのアラインメントにより容易に評価され得る。
本明細書で使用している整列（させた）配列は、相同性（類似性および／または同一性）の使用によりヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応位置を整列させているものを指す。典型的には、５０％またはそれより高い同一性による関連性を示す２またはそれより多数の配列を整列させる。配列の整列セットは、対応位置に整列された２またはそれより多数の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列と並べられたＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのＲＮＡから誘導された整列配列を含み得る。
本明細書で使用している「プライマー」は、適切な緩衝液中、適温で適切な条件下（例、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下）において鋳型指定ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る核酸分子をいう。ある種の核酸分子は、「プローブ」または「プライマー」としての役割を果たし得るものとする。しかしながら、プライマーは、伸長用の３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、捕捉ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＣＲ、ライゲーション伝達ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む様々な方法で使用され得る。
本明細書で使用している「プライマー対」は、（例、ＰＣＲにより）増幅される配列の５’末端とハイブリダイゼーションする５’（上流）プライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイゼーションする３’（下流）プライマーを含むプライマーのセットをいう。
本明細書で使用している「特異的にハイブリダイゼーションする」とは、標的核酸分子への核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングをいう。当業者であれば、特定分子の長さおよび組成など、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメーターについては熟知しているはずである。さらに、インビトロハイブリダイゼーションに特に関連性のあるパラメーターには、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度がある。高ストリンジェンシーでの非特異的結合核酸分子を除去するための典型的な洗浄条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および中程度ストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。同等内容のストリンジェンシー条件は、当業界では公知である。専門家であれば、特定適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメーターを容易に調節できるはずである。２つのヌクレオチド配列に対し、相補的と言えば、２つのヌクレオチド配列が、典型的には向かい合ったヌクレオチド間における誤対合が２５％未満、１５％または５％で、ハイブリダイゼーションし得ることを意味する。必要ならば、相補性のパーセンテージは特定される。典型的には、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションするように２つの分子を選択する。
本明細書で使用している「生成物と実質的に同一である」は、十分に類似しているため、興味の対象である特性が十分に保存されており、そのため実質的に同一の生成物がその生成物の代わりに使用され得ることを意味する。
また、本明細書で使用している「実質的に同一の」または「類似した」という語は、関連技術分野における専門家が理解しているとおり前後関係に応じて変化することは言うまでもない。
本明細書で使用している対立遺伝子変異型または対立遺伝子変異は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２またはそれ以上のオルターナティブ形態のいずれかを指す。対立遺伝子変異は、突然変異を通して自然に生じるもので、集団内に表現型多形をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント（コードされたポリペプチドに変化は無い）であり得るか、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また、本明細書で使用している「対立遺伝子変異型」の語は、遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされたタンパク質を示す。典型的には、遺伝子のリファレンス形態は、一つの種の集団または単一リファレンス構成員からのポリペプチドの野生型形態および／または優勢形態をコードする。典型的には、対立遺伝子変異型は、種間における変異型を含み、典型的には同一種からの野生型および／または優勢形態と少なくとも８０％、９０％またはそれより高いアミノ酸同一性を有する。同一性の度合いは、遺伝子および比較が種間であるか種内であるかにより異なる。一般的に、種内対立遺伝子変異型は、ポリペプチドの野生型および／または優勢型形態と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％またはそれより高い同一性、例えば野生型および／または優勢型形態と９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有する。本明細書において対立遺伝子変異型と言えば、一般的に同種の構成員間におけるタンパク質の変異を指す。
本明細書で使用している「対立遺伝子」については、本明細書では「対立遺伝子変異型」と互換的に使用しており、遺伝子またはその一部分のオルタナティブ形態をいう。対立遺伝子は、相同染色体における同一の遺伝子座または位置を占めている。対象が遺伝子の２つの同一対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子または対立遺伝子について同型接合であると言われる。対象が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子について異型接合であると言われる。特異遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドが互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。また、遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含む遺伝子の一形態であり得る。
本明細書で使用している種変異型は、異なる哺乳類種、例えばマウスおよびヒトを含む、異なる種間におけるポリペプチドの変異型をいう。
本明細書で使用しているスプライス変異型は、複数タイプのｍＲＮＡをもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の示差的プロセッシングにより生成される変異型をいう。
本明細書で使用している修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子におけるヌクレオチド配列の修飾に関するものであり、アミノ酸およびヌクレオチドのそれぞれ欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドの修飾方法は、当業者にとっては常用的なものであり、例えば組換えＤＮＡ方法を用いて行われる。
本明細書で使用しているプロモーターの語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始を誘導するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部分をいう。プロモーター配列は、必ずというわけではないが、一般に遺伝子の５’非コーディング領域で見出される。
本明細書で使用している単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質またはその生物活性部分は、細胞性材料またはタンパク質が由来する細胞または組織からの他の汚染タンパク質を実質的に含まず、または化学合成時の化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、当業者が純度の評価に使用する標準的分析方法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される容易に検出可能な不純物をそれらが含まないと思われる場合、実質的に不含有（含まない）であり、またはさらなる精製により検出可能な形で物質の物理および化学特性、例えば酵素および生物活性が改変されることのない程度に十分に純粋であると決定され得る。化合物を精製することにより実質的に化学的に純粋な化合物を製造する方法は、当業者には周知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合、さらに精製することにより、化合物の比活性を高めることができる。
細胞性材料を実質的に含まない、という表現は、タンパク質が単離または組換え技術により製造された細胞の細胞成分からタンパク質が分離されている調製物を指す。一実施態様において、細胞性材料を実質的に含まない、という表現は、非酵素タンパク質（本明細書では汚染タンパク質と称す）の含有率が約３０％（乾燥重量で）未満、一般的には非酵素タンパク質が約２０％未満または非酵素タンパク質が１０％または非酵素タンパク質が約５％未満である酵素タンパク質の調製物を含む。酵素タンパク質が組換え技術により製造されたとき、それもまた培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地が酵素タンパク質調製物の体積で占める率は約２０％未満、１０％または５％またはその前後である。
本明細書で使用している化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、なる表現は、タンパク質が、タンパク質合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を含む。この表現は、化学的前駆体または非酵素化学物質または成分の含有率が約３０％（乾燥重量で）未満、２０％、１０％、５％またはそれ未満である酵素タンパク質の調製物を含む。
本明細書で使用している合成的とは、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する場合、組換え方法および／または化学的合成方法により製造される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書で使用している、組換えＤＮＡ方法の使用による組換え手段での製造は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させる公知分子生物学的方法の使用を意味する。
本明細書で使用しているベクター（またはプラスミド）は、異種核酸を細胞に導入してそれを発現または複製させるのに使用される独立したエレメントをいう。ベクターは、典型的にはエピソーム的であるが、遺伝子またはその一部分をゲノムの染色体に組み込ませるように設計され得る。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。上記伝達体の選択および使用は、当業者には熟知されている。
本明細書で使用している発現ベクターは、ＤＮＡフラグメントの発現を誘導し得る調節配列、例えばプロモーター領域と機能し得るように結合されたＤＮＡを発現し得るベクターを含む。上記の追加的セグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み得、所望により１または複数の複製起点、１または複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般にプラスミドまたはウイルス性ＤＮＡから誘導されるか、または両方のエレメントを含み得る。すなわち、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターをいう。適切な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核生物細胞および／または原核生物細胞で複製可能なものおよびエピソーム的であるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。
また、本明細書で使用しているベクターは、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、外因性遺伝子に機能し得るように結合されることにより外因性遺伝子を（伝達体またはシャトルとして）細胞へ導入するように遺伝子操作されたウイルスである。
本明細書で、機能的に、または機能し得るように結合された、という表現をＤＮＡセグメントに関して用いる場合、セグメントは、それらが意図した目的に対し連係して機能するように配置されていることを意味し、例えば転写はプロモーターで開始し、コーディングセグメントを通してターミネーターまで続行される。
本明細書で使用している評価するという語は、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性についての絶対値を得、また活性のレベルの指標となる指数、比率、パーセンテージ、視覚的または他の値を得るという意味で定量的および定性的測定を含むものとする。評価は直接的または間接的であり得、勿論、実際に検出される化学種は、それ自体タンパク質加水分解産物である必要はないが、例えばその誘導体またはさらに別の物質であり得る。例えば、補体タンパク質の開裂産物の検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーでのタンパク質染色などにより行われる。
本明細書で使用している生物活性は、化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与時に生じる化合物のインビボ活性または生理学的応答をいう。したがって、生物活性は、上記化合物、組成物および混合物の治療効果および医薬的活性を包含する。生物活性は、上記活性を試験または利用するように設計されたインビトロ系で観察され得る。すなわち、本発明での目的の場合、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドが加水分解される際のその触媒活性である。
本明細書で使用している「同等（内容）の」という語を、２つの核酸配列について言うとき、問題の２配列が、アミノ酸または同等タンパク質の同一配列をコードすることを意味する。「同等（内容）の」という語を２種のタンパク質またはペプチドに関して使用するとき、２種のタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に改変することのないアミノ酸置換しか伴わない実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。「同等（内容）の」を特性について用いるとき、特性は、必ずしも同程度に存在する必要はないが（例、２ペプチドは、比率は異なるが同タイプの酵素活性を呈し得る）、活性は通常実質的に同じである。
本明細書で使用している「モジュレーションする」および「モジュレーション」または「改変する」は、分子、例えばタンパク質の活性の変化を指す。典型的活性としては、限定されるわけではないが、シグナル伝達などの生物活性がある。モジュレーションは、活性の増加（すなわち、アップレギュレーションまたはアゴニスト活性）、活性の減少（すなわち、ダウンレギュレーションまたは阻害）または活性における他の改変（例えば周期性、頻度、持続時間、速度論または他のパラメーターにおける変化）を含み得る。モジュレーションは、前後関係しだいで異なり得、典型的には、モジュレーションは、指定された状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質または指定された細胞型または条件で発現されたタンパク質と対照される。
本明細書で使用している組成物は、あらゆる混合物を包含する。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、その水性または非水性または何らかの組み合わせであり得る。
本明細書で使用している組み合わせとは、２またはそれより多数のアイテム間で提携関係にあるものをいう。組み合わせは、２またはそれより多数の独立アイテム、例えば２種の組成物または２つの集合体であり得、その混合物、例えば２またはそれより多数のアイテムの単一混合物またはその変形であり得る。組み合わせの要素は、一般的に機能的に提携または関連している。
本明細書で使用しているキットは、所望により他の構成要素、例えば追加的試薬および組み合わせまたはその構成要素の使用説明書を含んでいてもよいパッケージされた組み合わせである。特に、本発明での目的の場合、「キット」は、本発明が提供する可活性化型マトリックス分解酵素および限定されるわけではないが、活性化、投与、診断および生物活性または特性の評価を含む目的のための別のアイテムから成る組み合わせをいう。キットは、所望により使用説明書を含んでいてもよい。
本明細書で使用している「疾患または障害」は、限定されるわけではないが、感染、後天的条件、遺伝的条件を含む原因または条件から生じる、識別可能な症状を特徴とする生物体における病理学的状態をいう。本発明において興味の対象である疾患および障害は、ＥＣＭ成分を含むものである。
本明細書で使用しているＥＣＭ介在疾患または状態は、いずれか１つまたは複数のＥＣＭ成分が病理または病因に関与しているものである。本発明での目的の場合、ＥＣＭ介在疾患または状態は、１つまたは複数のＥＣＭ成分の沈着または蓄積の増加により誘発されるものを含む。上記状態には、限定されるわけではないが、セルライト、デュピュイトラン症候群、ペーロニー病、有痛性肩拘縮症、ケロイドなど既存の瘢痕、硬皮症およびリンパ水腫がある。
本明細書で使用している疾患または状態を伴う対象を「処置する」とは、対象の症状が部分的または全体的に軽減されるか、または処置後に症状が静止した状態であることを意味する。このため、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防は、潜在的な疾患の予防および／または症状の悪化または疾患の進行の阻止をいう。また処置は、本発明が提供する修飾インターフェロンおよび組成物の医薬的使用を含む。
本明細書で使用している有効薬剤は、限定されるわけではないが、例えば麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、慣用的治療薬、例えば小分子薬剤および治療性タンパク質を含む、治療剤または生物活性剤を包含する。
本明細書で使用している処置は、状態、障害または疾患または他の適応症の症状を改善させるかまたは他の形で有利に改変させる方法を包含する。
本明細書で使用している治療効果は、疾患または状態の症状を改変、典型的には改良または改善させるかまたは疾患または状態を治療する対象の処置から得られる効果を意味する。治療有効量は、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量をいう。
本明細書で使用している「対象」の語は、ヒトなどの哺乳類を含む動物を指す。
本明細書で使用している患者は、ヒト対象をいう。
本明細書で使用している、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による特定疾患または障害の症状の改善とは、組成物または治療薬の投与に起因または随伴すると考えられ得る症状の、恒久的または特定時間にせよ、永続的または一時的にせよ、低減化を指す。
本明細書で使用している阻止または予防は、疾患または状態の発現の危険を抑制する方法をいう。
本明細書で使用している有効量は、疾患または障害の症状の阻止、治療、改善、停止または部分的停止に必要な治療剤の量である。
本明細書で使用している単位用量形態は、ヒトおよび動物対象に適切であり、当業界公知の要領で個々にパッケージ化された物理的に区別される単位をいう。
本明細書で使用している単用量製剤は、直接投与用の製剤をいう。
本明細書で使用している「製造物品」は、製造および販売される生成物である。本願全体と通して使用しているとおり、この語は、パッケージング製品に含まれる可活性化型マトリックス分解酵素を含むものとする。
本明細書で使用している流体とは、流動し得る組成物をいう。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム形態の組成物および他の上記組成物を包含する。
本明細書で使用している細胞抽出物またはライゼートは、溶解または破壊された細胞から調製される調製物またはフラクションをいう。
本明細書で使用している動物は、限定されるわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類、げっ歯動物、例えばマウスおよびラット、家禽、例えばニワトリ、反芻動物、例えばヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヒツジ的な動物（ｏｖｉｎｅ）、例えばブタなどの動物および他の動物を含む。非ヒト動物は、想定される動物としてヒトを排除する。本発明が提供する酵素は、動物、植物、原核生物および真菌などあらゆる供給源に由来する。ほとんどの酵素は、哺乳類起源を含む動物起源である。
本明細書で使用している対照は、それが試験パラメーターで処置されていないという点以外は、試験試料と実質的に同一である試料をいい、または血漿試料に関する場合、対照は、興味の対象である状態に侵されていない正常なボランティアから得られたものであり得る。また、対照は内部対照であり得る。
本発明英文明細書で使用している単数形は、文脈上問題が無ければ複数形の場合を含むものとする。したがって、例えば、「一細胞外ドメイン」を含む一化合物と表現されている場合、１または複数の細胞外ドメインをもつ複数化合物の場合を含む。
本明細書で使用している範囲および量は、特定の値または範囲に「約」を付して表現され得る。約という場合、正確な量も含む。このため、「約５塩基」は、「５塩基の前後」および「５塩基」を包含する。
本明細書で使用している「所望による」または「所望により」は、後続的に記載される事象または環境が起こる場合も起こらない場合もあること、およびその記載が、上記事象または環境が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、所望により置換されていてもよい基は、その基が非置換または置換されていることを意味する。
本明細書で使用している保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省略形は、特に断らなければ、それらの一般的な使用法、認められた省略形またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：１７２６参照）に従う。
Ｂ．細胞外マトリックス
本発明は、時間制御された形で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１または複数のタンパク質成分を分解する可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）を提供する。かかるターゲッティングおよび一時的生体内活性化により、ＥＣＭの疾患および／または状態は処置され得る。可活性化型マトリックス分解酵素は、ＥＣＭのいかなる成分でも分解し得る。酵素選択は、標的とされた成分および／または処置される特定の疾患または状態に左右され得る。
ＥＣＭは、細胞外空間および脈管およびリンパ系を囲む結合組織または間質を構成することにより、異なる組織との、および異なる組織間での機構的および構造的支持体を提供する。ＥＣＭの複雑で絶えず変化する微小環境は、例えば皮膚などの結合組織内での構造的およびシグナリング系を代表する。ＥＣＭは、性質が複雑であるため、細胞に支持体および固定基礎を提供し、組織を隔離し、細胞間伝達を調節し、細胞増殖因子を封鎖するなど、様々な機能を果たし得る。ＥＣＭの組織または構成における欠損または変化は、若干の疾患または状態の一因となり得る。例えば、コラーゲン線維の合成、分解および組織化における変化は、脂肪異栄養症（例、セルライト）およびリンパ水腫の一因となる。
ＥＣＭは、線維性構造タンパク質、例えばコラーゲン、多糖類、例えばプロテオグリカンおよびヒアルロン酸、および互いにおよび細胞にマトリックスの成分を結合させる接着タンパク質により構成される。腱および軟骨などの結合組織の中には、原則的にＥＣＭにより構成されるものもある。しかしながら、皮膚の結合組織を構成するＥＣＭはまた、線維芽細胞、血管および他の成分に伴い分散している。またＥＣＭは、水分およびその溶解成分が血漿からリンパ管へ移動する空間としての役割も果たす。間質液は細胞質とほぼ等浸透圧性であり、中性ｐＨである細胞外環境を提供する重炭酸緩衝液である。
１．ＥＣＭの成分
ＥＣＭ（間質マトリックスとも呼ばれる）は、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチンなどの線維性タンパク質を含む多数の構造的高分子を含み、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が水和ゲル様物質を形成している複雑な動的三次元構造である。ＥＣＭの成分は、常駐細胞、典型的には線維芽細胞または線維芽細胞ファミリーの細胞により生成され、それらがＥＣＭの他成分と相互作用するエキソサイトーシスを介して分泌される。骨、皮膚または角膜などの多様な組織を生じさせるのは、相対量の変化および成分が組織化し、一緒になって形成する際の方法である（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｅｌｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９４． ９７２頁）。
ａ．コラーゲン
コラーゲンは、皮膚などの結合組織の主要な構成成分であり、組織構造の発生および維持、組織強度および細胞−細胞相互作用においてある一定の役割を演じる。コラーゲンは、コラーゲン三重らせんの立体配座を有する１または複数のドメインを含むＥＣＭの構造関連タンパク質の一ファミリーを含む（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ５：２８１４−２８２３）。コラーゲンはＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復構造を含み、その構造により、コラーゲン鎖がねじれてらせん構造を形成し得る。各コラーゲン分子では、３本の鎖が互いに撚り合わさって、α１−α３と称される三重らせんを形成する。三重らせん構造は、コラーゲン分子に高い機械的強度を与える。アミノ酸配列および鎖の組成が異なる、少なくとも２７の異なるタイプのコラーゲンが存在する。例えば、コラーゲンのタイプにより、三重らせんを形成する３本の鎖は、同一または異なり得る。コラーゲンは、ホモトリマー性（すなわち、三重らせんの３本のポリペプチド鎖が全て同一コラーゲンにより構成されている）であり得るか、または異型性（すなわち、複数タイプのコラーゲンで構成された原線維）であり得る。コラーゲンは、それらが形成する構造により幾つかのファミリーに分けられ得る。これらは、原線維性コラーゲン（間質コラーゲンとも呼ばれる；例、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＸＩ型）およびｆａｃｉｔなどの非原線維性コラーゲン（例、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ型）、短鎖（例、ＶＩＩＩ、Ｘ型）、基底膜（例、ＩＶ型）および他のコラーゲン類（例、ＶＩ、ＶＩＩおよびＸＩＩＩ型）を含む。下記表２は、一般的なコラーゲン型およびそれらの代表的な位置を示す（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ５：２８１４−２８２３）； ｗｗｗ．ｃｏｌｌａｇｅｎｌｉｆｅ．ｃｏｍ／ｐａｇｅ＿１１６７３２３１０８０７８．ｈｔｍｌ； ｗｗｗ．ｉｎｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｈｃｍｅ／ｍｗｋｉｎｇ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）。
間質コラーゲンの間で、コラーゲン分子は会合して、特有のバンディングパターンを有する大きな原線維を形成する。バンディングパターンは、隣接分子間の重複により生じる。コラーゲン線維の強度は、結合組織の密集したコラーゲン線維網状組織を形成するコラーゲン線維の分子内および分子間結合の多重性に基づいている。最も一般的な原線維性コラーゲンには、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラーゲンがある。Ｉ型コラーゲンは、皮膚、骨、腱および角膜などのほとんどの結合組織で見出され、２本のα１（Ｉ）鎖および１本のα２（Ｉ）鎖により構成される（［α１（Ｉ）］２α２（Ｉ））。ＩＩ型コラーゲンは、ホモトリマー（［α１（ＩＩ）］３）であり、主として軟骨で見出される。ＩＩＩ型コラーゲンも、ホモトリマー（［α１（ＩＩＩ）］３）であり、主として皮膚および脈管で見出される。
全てのコラーゲンが、原線維網状組織を形成するわけではない。例えば、基底膜ＩＶ型コラーゲンは、非線維性であり、らせんに非らせん的中断を伴わず、分子に可撓性を与えるヒンジとして作用する。すなわち、ＩＶ型コラーゲンは、線状原線維によるのではなく、繊維の網目構造により構成されたシートを形成する。
皮膚に最も豊富に存在するタンパク質はコラーゲンであり、皮膚の総コラーゲン中Ｉ型（８０〜８５％）およびＩＩＩ型（８〜１１％）により主として構成される。Ｉ型コラーゲンは、ＩＩＩ型コラーゲンと会合して、皮膚の主要コラーゲン線維を形成する。皮膚の伸張強度は、互い違いで端から端へずらされた外側配置で会合して細線維となる、これらの原線維性コラーゲン分子に因るところが大きい。コラーゲン分子は、隣接コラーゲン分子と架橋を形成し、コラーゲン線維にさらなる強度および安定性をもたらす。例えば、Ｖ型コラーゲンはまた、Ｉ／ＩＩＩ型コラーゲン線維とも会合して、原線維直径を調節する。皮膚における他のコラーゲン型には、例えば、ＩＶ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型およびＸＶＩＩ型がある。
Figure 2014043449
ｂ．エラスチン
ＥＣＭにおける弾性線維の網状構造は、伸長後にはね返るための弾性を必要とする組織、例えば皮膚、動脈および肺に可撓性を与える。弾性線維の主成分はエラスチン分子であり、隣接エラスチン分子と架橋を形成する。これらの分子は、弾性線維のコアを形成し、エラスチンに結合する、弾性線維の完全性にとって重要である大型糖タンパク質、フィブリリンにより覆われている。
ｃ．フィブロネクチン
フィブロネクチンは、カルボキシル末端付近で一対のジスルフィド結合により連結された２個の大型サブユニットの組として存在する糖タンパク質である。各サブユニットは、細胞表面上の他のマトリックス高分子および受容体に特異的な機能が異なるドメインを含む。例えば、フィブロネクチン上の異なるドメインは、コラーゲン（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型については別々のドメイン）、ヘパリン、フィブリンおよび細胞表面受容体、例えばインテグリンと結合する。フィブロネクチンは、血漿および組織の両方に存在する。組織では、フィブロネクチンは、異なる型のＥＣＭ分子および細胞を互いに結合させるべく機能する。また、それは、細胞の原形質膜におけるインテグリン受容体により認識される、３種のアミノ酸Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＤＧ）から成る重要な細胞結合ドメインを含む。細胞上のインテグリン受容体へのフィブロネクチン分子の結合により、細胞接着、移動および分化を促進するシグナル伝達経路に刺激が加えられる。これらの特徴により、フィブロネクチンは、細胞接着において重要な役割を演じ、細胞およびＥＣＭ成分間でシグナルを伝達させ得る。
ｄ．グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）
ＧＡＧは、強親水性である反復二糖単位から成る非分枝状多糖鎖である。ＧＡＧは、強く負に帯電しており、従って、浸透活性Ｎａ＋を誘引することにより、大量の水をその構造中へ引き入れ、ＥＣＭを水和状態に保つ。ＧＡＧ、例えばデルマタン硫酸は、典型的には、線状タンパク質コアから枝分かれしている７０〜２００糖長（反復二糖単位から形成されている）の多数のグリコサミノグリカン鎖を含む。この結果、ＧＡＧは、その質量に対して巨大な体積を占め、非常に低濃度のゲルを形成することになる。ＧＡＧは親水性であるため膨圧またはトルゴールが誘発され、その結果ＥＣＭは圧縮力に耐え得るものとなる。
ＥＣＭでは、ＧＡＧはＥＣＭタンパク質に結合し、プロテオグリカンを形成するか、またはヒアルロン酸（ヒアルロナンとも呼ばれる）の場合には非プロテオグリカンマトリックス成分として存在する。細胞外プロテオグリカンは、ＥＣＭにおけるクッション細胞を助ける大きな高水和分子である。ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカンは、その粘稠性および水和の水分により間質コラーゲン性マトリックスを通る大量の液流に対する障壁を形成することにより「細胞間質」を保護している。プロテオグリカンおよび非プロテオグリカンＧＡＧは、ＥＣＭにおいて会合することにより巨大ポリマー性複合体を形成する。それらは、互いに、またコラーゲンなどの線維タンパク質とも会合する。
ｉ．プロテオグリカン
デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸およびケラタン硫酸を含め、ＥＣＭのプロテオグリカンを形成するＧＡＧには、主たる３つのタイプがある。一般的に、プロテオグリカンは、典型的には長い非分枝状ＧＡＧ鎖形態をした９５重量％炭水化物である。細胞周囲に水和空間を提供する以外に、プロテオグリカンはまた、分子および細胞の往来を調節し、シグナリング分子と結合することにより、細胞活性化においてある一定の役割を演じ、プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤などの他の分泌タンパク質と結合することにより、分泌タンパク質の活性を調節する（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｅｌｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． ニューヨーク： Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９４、９７２−９７８頁）。例えば、プロテオグリカンのヘパリン硫酸鎖は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む幾つかの異なる増殖因子と結合し、それらがその特異的細胞表面受容体に結合するのを助ける。
アグレカンは、主としてコンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸ＧＡＧを含むプロテオグリカンであり、典型的にはヒアルロナンと大きな凝集体を形成して機構的支持体を提供する軟骨で見出される。デコリンは、主としてコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸ＧＡＧから成る結合組織の別の典型的ＧＡＧである。それは、Ｉ型コラーゲン原線維に結合する。ペルレカンおよびベタグリカンは、ＥＣＭの他の典型的プロテオグリカンである。全てのプロテオグリカンがＥＣＭと会合しているわけではない。例えば、セルグリシンは、分泌性小胞体と会合して分泌性分子のパッケージングおよび貯蔵を促し、シンデカンは、細胞表面で見出され、共受容体として作用する（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｅｌｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ． ニューヨーク： Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９４、９７２−９７８頁）。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、脊椎動物および無脊椎動物の広範囲の細胞の細胞表面および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と会合した偏在性高分子である（Ｗｉｇｈｔ， Ｔ． Ｎ．， Ｋｉｎｓｅｌｌａ， Ｍ． Ｇ．，およびＱｗａｒｎｓｔｒｏｍｎ， Ｅ． Ｅ． （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ４，７９３−８０１； Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｌ．， Ｂｕｓｃｈ， Ｓ． Ｊ．，およびＣａｒｄｉｎ， Ａ． Ｌ． （１９９１） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ７１，４８１−５３９； Ｗｉｇｈｔ， Ｔ． Ｎ． （１９８９） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ９，１−２０； Ｋｊｅｌｌｅｎ， Ｌ．，およびＬｉｎｄａｈｌ， Ｕ． （１９９１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６０，４４３−４７５；およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．， および Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｙ． （１９９１） Ｃｅｌｌ， ６４，８６７−８６９）。基本的ＨＳＰＧ構造は、数本の線状ヘパラン硫酸鎖が共有結合しているタンパク質コアから成る。多糖鎖は、典型的には、様々な程度までＮ−およびＯ−結合硫酸部分およびＮ−結合アセチル基により置換された反復ヘキスロン酸およびＤ−グルコサミン二糖単位により構成される。細胞結合、成長および分化におけるＥＣＭ分子の関与に関する研究は、胚形態形成、新脈管形成、転移、ニューライト発芽後成長および組織修復におけるＨＳＰＧの中心的役割を明らかにした。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖は、多数のタンパク質との結合能を有する点で独特なものであり、確実に広く多様なエフェクター分子を細胞表面に付着させ得る。ＨＳＰＧはまた、血管の主要成分でもある。それらは、太い血管では内膜中膜にほとんど集中しており、毛細血管では、主として内皮下基底膜で見出され、そこでそれらは増殖および移動している内皮細胞を支持し、毛細管の管壁の構造を安定させている。ＨＳＰＧがＥＣＭ高分子、例えばコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチン、および原形質膜上の種々の結合部位と相互作用する能力を示すことから、ＥＣＭ成分の自己集合および不溶性並びに細胞接着および移動におけるこのプロテオグリカンの重要な役割が示唆される。
ｉｉ．ヒアルロン酸
ヒアルロン酸（ＨＡ；ヒアルロナンとも呼ばれる）は、水を誘引する大型ＧＡＧであり、水に結合したときには、粘稠性ゲル様形態で存在する。すなわち、ＨＡは、ゲル様結合組織を結合させる滑沢剤としての役割を果たす。ＨＡは、二糖類（長さが２５０００もの反復単位の場合もある）の重合体であり、２修飾単糖：グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの反復単位により構成される。ＨＡは、多くの結合組織のＥＣＭの一部である。ＨＡは皮膚から最大量で見出され、身体に存在するＨＡのほぼ５０％が皮膚で見出される。ＨＡは、水分を包み込むことにより皮膚に連続的に水分を供給する。例えば加齢などによりＨＡの生産が減ると、しわの寄った不健康な皮膚となる。
また、ＨＡは、主にその受容体ＣＤ４４を通じて、胚発生および形態形成、創傷治癒、修復および再生、炎症および腫瘍の進行および浸潤中における細胞行動を調節するように機能する（Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ８：５５９７−５６０７）。ＨＡは、ヒアルロニダーゼにより分解される。ＨＡの分解産物は、損傷または成長中の組織、および様々な炎症状態で多量に見出され得る。ＨＡフラグメントは、新脈管形成を促進し、組織損傷および皮膚移植片においてマクロファージおよび樹状細胞によるサイトカイン産生を刺激し得る。
２．皮膚の組織構造
皮膚は、幾つかの異なる層、主として表皮および真皮により構成される。表皮は、外胚葉（ｅｃｏｔｏｄｅｒｍ）に由来する特殊化された上皮であり、この下が真皮であり、中胚葉の誘導体であって、脈管密集結合組織である。これら２層は、互いに堅固に付着しており、身体の領域によって全体的な厚さが約０．５〜４ｍｍの範囲で変動する一領域を形成する。真皮の下は、特徴が輪紋状組織から脂肪へと変わる目の粗い結合組織の層である。これは皮下組織と称されるが、典型的には皮膚の一部ではないと考えられる。真皮は、層から層へ通る結合組織線維により皮下組織に結合されている。
ａ．表皮
表皮は、真皮の直接上にある皮膚層であり、皮膚の表面層である。表皮の主たる機能は、水分喪失、化学的損傷および侵入病原体に対する保護バリアとして作用することである。表皮は、主としてケラチノサイトにより構成される約０．１〜１．５ミリメートル厚さの約１５細胞層の薄層である（Ｉｎｌａｎｄｅｒ， Ｓｋｉｎ， ニューヨーク、ニューヨーク： Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １−７ （１９９８））。表皮それ自体は、ケラチノサイトの分化状態に基づいて幾つかの層（例、基底層、有棘層、顆粒層、淡明層、角質層）に分割される。ケラチノサイトは、ケラチノサイト幹細胞からの基底層に由来する。ケラチノサイトが成長および分裂すると、徐々に分化が行われて最終的に角質層に達し、そこで扁平上皮細胞と呼ばれる除核した平らで高度に角質化した細胞（角質細胞とも呼ばれる）の層を形成する。角質細胞で構成される以外に、角質層はまた皮脂を含む。皮脂は、通常、毛包に結合した毛髪で覆われた領域で見出される脂腺により分泌される。皮脂は、角質細胞が結合するのを助け、そこで水分を保持させる弱酸性層である。この酸性は、皮脂を構成する両性アミノ酸、乳酸および脂肪酸の存在に因るものである。すなわち、皮膚表面のｐＨは、通常５〜６、典型的には約５．５である。皮脂は、毛髪および皮膚を防水状態にし、それらの乾燥、脆弱化および亀裂を防ぐ作用を有し、また、皮膚における微生物の増殖を阻害する。「酸性被膜」の語は、皮膚のほとんどの領域における水溶性物質の存在を指す。
ｂ．真皮
皮膚の結合組織は真皮と呼ばれる。真皮は、厚みが１．５〜４ミリリットルである。皮膚において、真皮はＥＣＭ成分を含み、主タンパク質成分はコラーゲンおよびエラスチンである。真皮はまた、孔または面ぽうと呼ばれる皮膚（ｓｋｉｌｌ）の開口部から物質を分泌する汗腺および皮脂腺、毛包、神経末端および血管およびリンパ管を含む皮膚構造の大部分にとって本拠となるものである（Ｉｎｌａｎｄｅｒ， Ｓｋｉｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．： Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １−７ （１９９８））。
ｃ．皮下組織
真皮の下は皮下組織であり、これは脂肪層であり、皮膚の最深層である。それは、体熱維持のための絶縁体および臓器保護のための衝撃吸収体の両方として作用する（Ｉｎｌａｎｄｅｒ， Ｓｋｉｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．： Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １−７ （１９９８））。さらに、皮下組織はまた、エネルギー備蓄のための脂肪を貯蔵する。
３．ＥＣＭの疾患
ＥＣＭ成分の異所的発現または生成に起因する細胞外マトリックスの構造の欠損または変化からある種の疾患および状態が生じる。例えば、創傷治癒時などに起こる炎症状態では、サイトカインが分泌され、それが線維芽細胞に刺激を加えてＥＣＭ成分、例えばコラーゲンを分泌させる。ＥＣＭ成分が蓄積し、局所的に沈着することにより、広い範囲が線維症状態となる。マトリックス分解は、多くの慢性炎症性疾患および他の疾患および状態で頻繁に見られる特徴である。これらの例としては、コラーゲン介在疾患状態、例えば、限定されるわけではないが、ケロイドおよび過形成性瘢痕などの瘢痕、デュピュイトラン症候群、ペーロニー病およびリンパ水腫がある。また、セルライトは、脂肪生成の増加に加えて、コラーゲンの異常な線維性中隔網状構造をもたらす結合組織マトリックスの改変を特徴とする顕著なＥＣＭ疾患である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｉｎｔ． Ｊ Ｃｏｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８：１７５−１９０）。
マトリックス成分の異所性発現および過剰生産によるそれらの蓄積および望ましくない沈着を特徴とするＥＣＭの疾患および状態は、本発明による可活性化型マトリックス分解酵素により処置され得る。インビボ投与時における上記酵素の一時的活性化により、上記疾患および状態の処置は、マトリックス成分の酵素分解を制限するように調整される。例えば、マトリックス分解作用の持続時間を制限することにより、統制を外れたタンパク質分解に伴う望ましくない副作用は最小限となる。
Ｃ．マトリックス分解酵素
本明細書では、可活性化型マトリックス分解酵素を含む組成物、組み合わせおよび容器、および可活性化型マトリックス分解酵素の使用によるＥＣＭ介在疾患または状態の処置方法を提供する。マトリックス分解酵素は、限定されるわけではないが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびプロテオグリカンを含むＥＣＭのタンパク質成分または糖タンパク質を分解する。１または複数のＥＣＭ成分を開裂できることにより、本発明による可活性化型マトリックス分解酵素は、組織、特に過剰に存在する１または複数のＥＣＭタンパク質または１または複数のＥＣＭタンパク質に富む線維性組織、例えばコラーゲンの望ましくない蓄積に起因する構造的欠損または変化を呈する組織のマトリックスの修飾に使用され得る。したがって、上記酵素は、ＥＣＭタンパク質が関与する疾患または状態の処置に有用である。
マトリックス分解酵素には、プロテアーゼおよびグリコシルヒドロラーゼがある。このため、マトリックス分解酵素は、標的タンパク質におけるアミノ酸の配列またはポリペプチド基質を認識するタンパク質分解酵素であり、また非ペプチド結合、例えばエステル結合またはグリコシル基を認識するヒドロラーゼであるタンパク質を含む。プロテアーゼには、セリン、システイン、アスパラギン酸および金属プロテアーゼファミリーのエキソプロテアーゼがある。基質配列を認識すると、プロテアーゼは、標的タンパク質の加水分解または開裂を触媒する。標的配列の完全長配列という状況の中におけるペプチド結合の場所によって、標的タンパク質の上記加水分解により、標的は不活化される場合もあれば、活性化される場合もあり得る。
プロテアーゼは、幾つかの異なるタイプの触媒機構を用いる（Ｂａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４４：１８−６１； Ｂａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ ２４４：４６１−４８６； Ｂａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８：１０５−１２０； Ｂａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８：１８３−２２８）。触媒機構に基づき、ペプチド結合を開裂するプロテアーゼは、セリン−、システイン−、アスパラギン酸−、トレオニン−および金属−プロテアーゼにさらに細分される。セリン型ペプチダーゼは、活性中心に関与するセリン残基を有し、アスパラギン酸型ペプチダーゼは、触媒中心に２個のアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼは、システイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼは、トレオニン残基を有し、金属ペプチダーゼは、触媒機構で金属イオンを利用する。プロテアーゼの触媒活性は、標的基質の開裂に必要とされる。セリンおよび金属プロテイナーゼは、中性ｐＨで最も高い活性を示し、主としてリソソームで見出されるシステインおよびアスパラギン酸プロテアーゼは、酸性ｐＨが最適である。すなわち、リソソームプロテアーゼは、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼファミリーのプロテアーゼを含む。酵素の他のファミリーには、ヒドロラーゼ類、例えばエステル結合に作用するエステラーゼおよびＯ−またはＳ−グリコシル化合物またはＮ−グリコシル化合物を加水分解するグリコラーゼがある。グリコシルヒドロラーゼの一例は、ヘパラナーゼである。
典型的マトリックス分解酵素を表３に示す（例、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （２００４） ２８６：１−１０； Ｉｏｚｚｏ ＲＶ， Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｂｉｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （２０００）， ９４−９６頁； Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ．， ６５：１３７−１５０； Ｂｕｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ．， ２３：６２０−６２８； Ｔｈｏｍａｓ ＫｒｅｉｓおよびＲｏｎａｌｄ Ｃａｌｅ， Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ， Ａｎｃｈｏｒ ａｎｄ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） ５１５−５２３頁； Ｉａｎ Ｍ． ＣｌａｒｋおよびＧｉｌｌｉａｎ Ｍｕｒｐｈｙ． “Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，” ｉｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （２００６）， １８１−１９８頁； Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２８２：２７３−２７８参照）。典型的プロテアーゼのそれぞれに関する前駆体ポリペプチドのヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）およびコード化アミノ酸配列に関する配列表（配列番号）を表に示す。また、典型的プロテアーゼのそれぞれに関するプロタンパク質のアミノ酸配列に関する配列表（配列番号）、並びにプロペプチドに対応するプロタンパク質内におけるアミノ酸位置も表に示す。また、対立遺伝子および種変異型および当業界で周知の他の変異型の中には変形も存在し、また上記変異型についても可活性化型酵素としての使用が考えられる。この表はまた、各酵素についての典型的なＥＣＭ標的基質を示す。上記の基質については、参照用として、また典型的具体例を示すものであり、全標的基質を完全に網羅したリストを表しているわけではない。当業者であれば、所望の酵素についてのＥＣＭ標的基質を知っているか、または本明細書記載のものなど常用の検定法を用いて経験的に決定できるはずである。
マトリックス分解酵素は、天然供給源からの単離、細胞、組織および生物体で組換えにより製造されたタンパク質の単離および遺伝子組換え方法およびインシリコ段階を含む方法、合成方法および当業者に周知の方法を含む当業界で公知のいずれかの方法により製造または単離され得る。典型的には、酵素は、不活性形態で製造または単離される。条件的活性化は、下記要領で達成され得る。
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１．酵素活性化
ほとんどのプロテアーゼは、不活性形態で合成および分泌され、活性を呈するにはさらなるプロセッシングを要する。活性化は、典型的には酵素活性部位を露出させる立体配座的、立体化学的または他の変化により達成される。カルパイン類を除き、プロテアーゼ酵素は全て、典型的にはチモーゲンとして合成される。チモーゲン活性化は、プロテアーゼが常に活性形態で存在する場合に起こり得る望ましくないタンパク質分解を阻止する。一般的に、チモーゲンは、プロテアーゼの活性部位を立体化学的に遮断し、プロテアーゼ活性部位への基質の接近を阻止するＮ−末端部分（またはプロセグメントまたはプロ領域）を含む。チモーゲンのプロセグメントは、サイズが２残基から１５０残基の範囲に及ぶ。プレプロ酵素形態から分泌されたとき、プロ酵素（プロセグメントを含む）は不活性である。
チモーゲンのプロセグメントが、自触的または他のプロテアーゼによりタンパク質加水分解的に除去されると、酵素の活性部位が暴露されて、成熟プロテアーゼ、典型的には活性化がもたらされる。しかしながら、場合によっては、追加の補因子も完全な活性化に必要とされる。例えば、ｐＨ変化により、システイン、アスパラギン酸および金属プロテアーゼファミリーの酵素の活性化が誘発される。低ｐＨは、チモーゲン変換中に基質としてプロセグメントの感受性を高めるように作用するか、またはプロセグメントまたは酵素における立体配座的変化を誘発する（Ｊｅｒａｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：１１４９８−１１５０４）。リソソーム酵素、例えばシステインおよびアスパラギン酸プロテアーゼファミリーのカテプシンなどは、完全活性化が達成される前に酸性条件を必要とする。ｐＨ以外に、他の補因子としては、限定されるわけではないが、塩濃度、還元剤、例えばシステイン、ＤＴＴおよびＴＣＥＰ、カルシウムなどの金属イオン、熱または温度がある。すなわち、チモーゲン変換の様々な機構が存在し、プロテアーゼファミリー間で異なる（例、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７：８１５−８３６； Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＰＮＡＳ， ９６： １０９６８−１０９７５参照）。例えば、活性酵素へのチモーゲン変換は、自触作用または他のプロテアーゼの作用によるタンパク質加水分解、ｐＨの変化または付帯分子またはイオンの関与または上記条件の組み合わせまたは１つまたはそれ以上の結果として起こることが多い。作用時間および場所に対するさらなる制御は、タンパク質阻害剤により達成されることが多い（Ｓｔｒｏｕｄ ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ６：１７７−９３）。
ａ．セリンプロテアーゼ類
分泌された酵素および細胞質貯蔵オルガネラでキレート形成した酵素を含む、セリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答および腫瘍浸潤および転移を含む様々な生理学的役割を有する。多くのセリンプロテアーゼは、細胞外マトリックスの成分を分解する（上記表２参照）。例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解およびリモデリングに関与するプロテアーゼは、組織リモデリングの一因となり、癌浸潤および転移に必要である。
セリンプロテアーゼファミリーにおけるプロテアーゼの活性は、それらの活性部位を形成する一連のアミノ酸残基により異なる。残基の一つは常にセリンであるため、セリンプロテアーゼと称される。セリンプロテアーゼによる標的タンパク質の開裂機構は、セリンにより標的とされたペプチド結合の求核攻撃に基づいている。触媒性セリンは、基質の容易に開裂できるペプチド結合のカルボニル原子と共有結合四面体中間体を形成する。多くの場合、この基の求核特性は、アスパラギン酸により「プロトン受容状態」で保たれた、ヒスチジンの存在により改善される。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通した触媒３残基を構築する。
ほとんどのセリンプロテアーゼは、前駆体形態のチモーゲンとして存在するため、不活性である。プロテアーゼのチモーゲン形態では、触媒活性部位は、活性酵素と比べて歪んでいる。事実、セリンプロテアーゼは、プロテアーゼのチモーゲンおよび活性形態間で活性部位の立体配座的差異を有するプロテアーゼの唯一のファミリーである。したがって、触媒３残基は、チモーゲンに存在するが、プロ酵素からの歪んだループにより、基質が結合する溝（クレフト）は部分的に遮断される。その結果、基質ポリペプチドは有効に結合し得ず、タンパク質加水分解も起こらない。チモーゲンの立体配座および構造が変化し、活性部位が開かれている活性化の後のみ、タンパク質加水分解が起こり得る。
セリンプロテアーゼは、中性ｐＨで活性を呈する。チモーゲン変換は、例えば別のプロテアーゼまたは自己活性化による高特異的触媒開裂により制限されたタンパク質加水分解後に起こる。例えば、不活性プロトロンビンから酵素（トロンビン）の活性形態への変換は、別の血液凝固酵素（因子Ｘａ）によるプロセグメントの高特異的触媒開裂により達成される。他のセリンプロテアーゼも類似した機構を利用するが、活性化開裂部位が異なるため、セリンプロテアーゼは典型的には異なる変換酵素により活性化される。
限定されるわけではないが、グランザイムＡおよびＢ、カテプシンＧ、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびマスト細胞トリプターゼおよびキマーゼを含む顆粒関連セリンプロテアーゼは、活性化に際し二相性タンパク質加水分解事象を必要とする。これらの酵素は、プレプロ酵素として合成される。シグナルペプチドの開裂により、不活性であるプロ酵素チモーゲン形態が生じる。顆粒関連セリンプロテアーゼは、酵素のＮ−末端にプロジペプチドを含み、また活性化に際し除去されなければならないカルボキシ末端伸長部も含む。プロジペプチドは、成熟酵素が折りたたまれて触媒活性形成に至るのを阻止する。顆粒関連セリンプロテアーゼの活性化は、カルボキシ末端伸長部およびプロジペプチドの両方の開裂により達成される。カテプシンＣは、少なくとも一部の顆粒関連セリンプロテアーゼにおけるプロジペプチドの開裂に関与している（Ｋｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：９２８１−９２８６）。
ｂ．システインプロテアーゼ類
システインプロテアーゼは、その活性部位にＣｙｓ−Ｈｉｓ対を含み、その触媒活性化はシステインスルフヒドリル基を必然的に伴う。隣接ヒスチジン残基によるシステインスルフヒドリルの脱プロトン化の後、ペプチドカルボニル炭素でのシステインの求核攻撃が起こる。新たなカルボキシ末端をシステインチオールに結合させるチオエステルは、反応中間体である（セリンプロテアーゼのアシル−酵素中間体に匹敵）。システインプロテアーゼには、パパイン、カテプシン、カスパーゼおよびカルパインがある。これらの異なるシステインプロテアーゼファミリーについては、活性化機構も異なる。
ｉ．カテプシン類
カテプシンを含むパパイン様システインプロテアーゼは、パパインとの構造類似性の点で関連したチオール依存性エンドペプチダーゼの一ファミリーである。それらは、ＲおよびＬ（右および左について）と標識されたドメインによる２ドメインタンパク質を形成し、両ドメインからのループは基質認識クレフトを形成する。カテプシンは、プロセグメントを含むチモーゲンとして合成される。プロセグメントは、Ｎ−末端阻害性プロセグメントとして作用する。成熟酵素間には約２５％の配列同一性があるが、プロセグメントは、ほとんど配列類似性を呈しない。プロセグメントは、成熟酵素の強力な阻害剤として機能する。またプロセグメントは、中性ｐＨでの合成および輸送中における酵素の折りたたみおよび安定性においてある一定の役割を演じるなど、他の機能も果たす。
システインプロテアーゼファミリーのカテプシンは、リソソーム酵素であるため、ｐＨ７未満で最適活性を呈し、ｐＨ７を超えると不活性になる。カテプシンは、不活性前駆体（すなわち、チモーゲン）として合成され、プロセグメントのタンパク質加水分解的除去により活性化される。この結果、１本鎖酵素が生成する。一般に、１本鎖酵素は、重鎖および軽鎖を含む２本鎖形態にプロセッシングされ得る。典型的には、２本の鎖が、非共有結合的相互作用またはジスルフィド架橋により一緒になる。このため、成熟カテプシンは、１本鎖または２本鎖形態で存在する。
プロセグメントの除去は、他のプロテアーゼによる活性化または酸性ｐＨでの自触的活性化により促され得る（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０：４６２９−４６３３）。チモーゲン変換過程のｐＨ依存性は、プロセグメントにおける保存された塩架橋（例、配列番号６２に示されたプロカテプシンＬにおけるＡｓｐ８２ｐおよびＡｒｇ３８ｐおよびＧｌｕ８７ｐおよびＡｒｇ４８ｐ）により調節される。低ｐＨでのカルボン酸基のプロトン化による塩架橋の破壊により、プロセグメントの疎水性コアが破壊され、活性部位からプロセグメントが解離する（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７：８１５−８３６）。塩架橋の形成をもたらす残基は、カテプシン間で異なり得る。例えば、プロカテプシンＢは、そのｐＨ依存的チモーゲン変換に際し選択的塩架橋相互作用を利用する（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ．， １５：５４９２−５５０３）。
酸性ｐＨ条件は、成熟カテプシンの活性に必要とされる。チモーゲン変換それ自体は、酵素活性に十分なものではない。活性に関するその必要性に加えて、酸性ｐＨはまた酵素を安定させる。高ｐＨ条件でのカテプシンの不活化および脱安定化は、活性部位−Ｓ−／Ｈ＋ｉｍ−イオン対のイミダゾール部分の脱プロトン化、および活性部位グルーブに沿った構造の「アンジッパーリング」により誘発される（Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４：９３−９８）。このため、ほとんどのカテプシンは、酸性ｐＨで最適な活性および安定性を有する。例えば、カテプシンＢ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＶは、酸性環境で最適な活性を示し、中性ｐＨでは弱い活性しか示さないか、または活性を呈しない（Ｌｕｔｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ２１： ３０２９−３０４１）。一部のカテプシン、例えばカテプシンＬは、中性ｐＨでのインキュベーション後急速にその活性を失う。カテプシンの中には、中性ｐＨでのインキュベーション後でもそれらの酵素活性を維持しているため、生理学的条件下でマトリックスタンパク質を分解し得るものもある。カテプシンＣおよびＳは、最高のｐＨ安定性を有することが見出され、カテプシンＫおよびＶは、中程度のｐＨ安定性を示す。インビトロ試験は、カテプシンＫが中性ｐＨで原線維タンパク質を分解し得ることを立証した（Ｂｕｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ．， ２３：６２０−６２８）。
カテプシンＬ
カテプシンＬ（ＣａｔＬ）は、パパインファミリーに属するリソソーム酸性システインプロテアーゼである。ヒトカテプシンＬ遺伝子は、１７アミノ酸シグナルペプチド、９６アミノ酸プロペプチドおよび２２０アミノ酸成熟領域を含む３３３アミノ酸システインプロテアーゼをコードする（配列番号６１および６２および ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号Ｐ０７７１１参照）。カテプシンＬはまた、対立遺伝子および種変異型、および他の変異型を含む。上記変異型の例を配列番号２０８〜２２３および２３４に示す。カテプシンＬは、不活性プロ酵素として合成され、他のプロテアーゼと同様、配列番号６２に示したアミノ酸配列のアミノ酸１８〜１１３に対応するプロペプチドを含む。プロペプチドは、酵素のタンパク質加水分解活性を阻害する。また、プロペプチドセグメントは、プロ酵素を中性〜アルカリ性ｐＨの変性作用から安定化させる機能を有する（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， １５：５４９２−５５０３）。プロペプチドの開裂は、酸性条件下での自己プロセッシングにより誘発され、酸性条件下で活性を呈し、触媒活性を有する成熟酵素をもたらす。成熟カテプシンＬ（配列番号１に示す）は、約２８ｋＤａの１本鎖形態として、および／または約２４および４ｋＤａ（それぞれ重鎖および軽鎖）の２本鎖形態として存在し得る。カテプシンＬの対立遺伝子および種変異型は既知である。典型的な種変異型は、配列番号２０８〜２２３に示されたものであり、シグナル配列およびプロペプチドを欠くその核酸およびコード化ポリペプチドおよび成熟形態を含む。典型的な対立遺伝子変異型は、配列番号２３４に示されたものである。
カテプシンＬは、主としてエンドソームおよびリソソームに局在する。成熟カテプシンＬの最適なタンパク質加水分解能は、約５．５の酸性ｐＨで達成され、中性ｐＨでは不活性である（Ｂｏｈｌｅｙ Ｐ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ．” 、Ｓ． Ｈｏｌｚｅｒ および Ｈ． Ｔｓｃｈｃｓｃｈｅ （編）． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ、１７−３４頁、ベルリン： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ． １９７９）。カテプシンＬのｐＨ最適値は、イオン強度により影響され得るため、最適ｐＨ値は緩衝液間で異なる（Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４： ９３−９８）。プロカテプシンＬは、中性および弱アルカリｐＨ条件では安定しており、その場合成熟カテプシンＬは不活化される（Ｊｅｒａｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：１１４９８−１１５０４）。例えば、酸性ｐＨでは、酵素はより安定しており、それ自体に対する作用も少ないが、タンパク質基質の加水分解を積極的に触媒する。ｐＨが中性または生理学的ｐＨに近づき、例えば３７℃などの高温が存在する場合、酵素は、他のタンパク質基質に対し自身を基質として優先するため（自己触媒反応）、非常に不安定である。還元剤は、活性カテプシンＬに加えられた場合、酸性および生理学的ｐＨの両方でこれらの活性を高め得る。
カテプシンＬの活性化形態は、３個のジスルフィドシステインおよび１個の遊離システイン（システインプロテアーゼファミリーで保存されている活性部位Ｃｙｓ２５）を含む７個のハーフシステイン残基を有する。Ｃｙｓ２５の還元スルフヒドリル基（−ＳＨ）の存在は、活性に必要とされる。このため、還元剤、例えばシステインまたはグルタチオンの還元形態の存在は、活性部位スルフヒドリルを還元状態に保つのを助け得る。別法として、またはさらに、還元剤は、ジスルフィドを還元し、インビボ基質の望ましい結合および触媒を誘導するさらに好適なタンパク質立体配座（２次および３次）の獲得を助け得る。
カテプシンＬは、限定されるわけではないが、コラーゲン、ＩＬ−８前駆体、神経伝達物質前駆体、プロ−エンケファリンおよび免疫グロブリン軽鎖関連（ＡＬ）アミロイド沈着物およびアゾカゼインを含むタンパク質基質を分解する（Ｂａｒｒｅｔ ＆ Ｋｉｒｓｃｈｋｅ （１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ８０：５３５−５６１； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２２６：２３３−２４１）。ＣａｔＬは、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＣＨＮ２により急速に阻害される。
ｉｉ．カルパイン
カルパインは、２つの主要形態、μ−カルパイン（カルパイン１）およびｍ−カルパイン（カルパイン２）で存在するＣａ２＋依存性細胞質システインプロテアーゼである。カルパイン基質には、細胞骨格タンパク質、シグナル伝達酵素、転写調節因子および内在性膜タンパク質がある。ＥＣＭ成分の中で、カルパインは、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびプロテオグリカンを分解する（Ｉａｎ Ｍ． Ｃｌａｒｋ および Ｇｉｌｌｉａｎ Ｍｕｒｐｈｙ． “Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，” 、Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （２００６）、１８１−１９８頁）。
カルパインは不活性ヘテロ二量体（および〜８０ｋＤａおよび〜３０ｋＤａサブユニット）として存在し、自己触媒反応にＣａ２＋を必要とする。μ−カルパインおよびｍ−カルパインは、活性化に必要とされるＣａ２＋に対する感受性が異なる。μ−カルパインは、低マイクロモルカルシウム濃度で半最大活性化され、ｍ−カルパインの活性化に必要とされる同濃度よりほぼ１桁低い（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ， ３１４：５１１−５１９）。活性化されると、カルパインの両サブユニットでは制限された自己消化が起こり、その結果Ｎ−末端プロセグメントは除去され、カルシウム感受性が高められる。自己分解したプロテアーゼは、依然としてカルシウムによる基質開裂を必要とするため、自己消化それ自体ではカルパインを活性化するのに十分ではない（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３１４：５１１−５１９）。すなわち、カルパインの持続的活性化は、カルシウムの存在を必要とする。カルシウム必要条件は、生理学的Ｃａ２＋濃度よりかなり高く、一般に１μＭである。例えば、インビトロμ−カルパインは、１０〜５０μＭのカルシウム濃度を必要とし、ｍ−カルパインは、３００〜５００μＭのカルシウム濃度を必要とする（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， １８：６８８０−６８８９）。カルシウム必要条件故に、カルパインは、領域性カルシウムフラックスおよび／または膜結合により調節される（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ａｎｄ Ｃａｒａｆｏｌｉ （１９９７） Ｊ Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．， ４３：５４３−５．）。カルシウムは、立体配座変化を誘導することにより、プロテアーゼの活性部位を暴露させると思われる。カルパスタチンは、カルパインの特異的細胞性阻害剤である。
ｃ．アスパラギン酸プロテアーゼ
アスパラギン酸プロテアーゼには、ＥＣＭ成分を分解することが示されたリソソームで見出されるプロテアーゼが含まれる。この中には、カテプシンＤおよびＥが含まれる。活性については、２個のアスパラギン酸残基が活性部位での酸／塩基触媒に関与する。初回反応で、一方のアスパラギン酸残基は、活性部位Ｈ２Ｏからプロトンを受容し、これがペプチド結合のカルボニル炭素を攻撃する。同時に、他方のアスパラギン酸残基は、プロトンをペプチドカルボニル基の酸素に供与する。
アスパラギン酸プロテアーゼのチモーゲン形態は、負に帯電したセグメントと塩架橋を形成する酵素の中心部分と相互作用する正に帯電したＮ−末端プロセグメントを含む。プロセグメントの配置および塩架橋の形成故に、基質は、活性部位への接近が妨げられる。活性酵素へのチモーゲン変換は、低ｐＨでの塩架橋の破壊により誘発される。低ｐＨに暴露されると、ＡｓｐおよびＧｌｕ残基のカルボン酸側鎖がプロトン化され、プロセグメントおよび成熟酵素間の塩架橋の脱安定化をまねく。一旦除去されると、プロセグメントは、活性酵素により自己触媒的に分解される。後続のプロセグメントの加水分解により、確実に活性化は不可逆的となり、放出されたプロセグメントは活性酵素の競合的阻害剤として作用しなくなる。それ以上、変換に他の付帯分子は必要とされない（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７：８１５−８３６）。しかしながら、システインプロテアーゼファミリーのカテプシン類と同様、酸性ｐＨ条件は、成熟酵素の活性および安定性に必要とされる。
ｄ．金属プロテアーゼ類
金属プロテアーゼ（亜鉛プロテアーゼとも呼ばれる）は、消化酵素カルボキシペプチダーゼ、細胞により分泌される様々なマトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよび金属プロテアーゼドメイン）、ＡＤＡＭＴＳ（ディスインテグリンおよびトロンボスポンジンモチーフをもつ金属プロテイナーゼドメイン）およびリソソームプロテアーゼを含む。これらの酵素は、ＡＤＡＭおよびＭＭＰを含め、胚発生、細胞成長および増殖、炎症応答、創傷修復、多発性硬化症、関節炎および癌の進行および転移においてある役割を有する（Ｍａｎｚｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｊ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ． Ｄｅｓｉｇｎ， １７： ５５１）。ほとんどのＭＭＰ（例、コラゲナーゼ）は、例えば組織リモデリング中における、細胞外マトリックスの分解に関与する。例えば、これらの酵素の多くは、基底膜および細胞外マトリックスの成分を開裂し得る。
金属プロテアーゼは、触媒活性に要求される酵素の活性中心にＺｎ＋＋イオンを含む。金属プロテアーゼの活性部位にある亜鉛結合モチーフは、イミダゾール側鎖がＺｎ＋＋に対するリガンドである２個のヒスチジン残基を含む。触媒作用中、Ｚｎ＋＋は、活性部位にある水分子の酸素原子によるカルボニル炭素での求核攻撃を促進する。活性部位塩基（カルボキシペプチダーゼにおけるグルタミン酸残基）は、攻撃性水分子からプロトンを抜き取ることによりこの反応を促す。一般的に、これらの酵素は、それらの活性部位に共通の亜鉛結合モチーフ（ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨ）を有し、保存メチオニンが活性部位の後で向きを変える。ヒスチジンのいずれか１個の突然変異により、触媒活性は除去される。
金属プロテアーゼのチモーゲン形態は、約８０〜１００残基長のプロセグメントを含む。チモーゲン形態では、成熟酵素の基質結合部位内の残基および触媒性Ｚｎ＋＋イオンは、活性形態の場合と同じ立体配座を示し、チモーゲン変換時にも変化しない。プロセグメントは部位を遮断するように配置され、従って、基質への接近が阻止されるため、この酵素は不活性である。チモーゲンから活性酵素への変換は、成熟酵素からのプロセグメントの開裂により誘発される。多重機構は、他のプロテアーゼ、熱、水銀剤（例、酢酸４−アミノ−フェニル水銀）、ＳＨ−反応剤、活性酸素およびデタージェントによる作用を含む、開裂事象を開始させ得る（例、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７：８１５−８３６； Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２５４：７３１−７４１； Ｏｋａｄａ ＆ Ｎａｋａｎａｓｈｉ （１９８９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ２４９：３５３−３５６； Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９：５７８３−５７８９； Ｋｏｋｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２７６：２１７−２２１； Ｓｐｒｉｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ， ８７：３６４−８； Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．， １５：５１１−８参照）。
ｅ．ヘパラナーゼ
ヘパラナーゼは、ある種のグリコサミノグリカンの異化に関与するグリコシル化酵素である。それは、特異的鎖内部位でヘパラン硫酸を開裂するエンド−β−グルクロニダーゼである。ヘパラナーゼは、グリコシルヒドロラーゼクランＡ（ＧＨ−Ａ）の一員であり、２個の保存酸性残基、Ｇｌｕ２２５の推定的プロトン供与体およびＧｌｕ３４３の求核基を含む共通の触媒機構を共有している（Ｈｕｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３９：１５６５９−１５６６７）。ＴおよびＢリンパ球、血小板、顆粒球、マクロファージおよびマスト細胞と内皮下細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の相互作用は、ヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸の分解と関連している。
ヒトヘパラナーゼｃＤＮＡは、小胞体（ＥＲ）への転位時にシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を伴うプレ−プロタンパク質として最初に合成されるタンパク質をコードする。生成される６５ｋＤａプロ酵素形態は、タンパク質加水分解的開裂によりさらにプロセッシングされ、介在性６ｋＤａフラグメントが切除されて８ｋＤａのポリペプチドおよび５０ｋＤａのポリペプチドを生成し、ヘテロ二量体を形成する。成熟ヘパラナーゼのアミノ酸配列を配列番号１５６に示す。ヘパラナーゼ活性および局在性は堅固に調節されている。例えば、この酵素は局所ｐＨの変化に非常に敏感であり、腫瘍付近および炎症部位に存在する酸性条件下では高い酵素活性を発揮し、生理学的ｐＨではほとんどまたは全く活性を呈しない。すなわち、ＨＳスカホールドのヘパラナーゼ介在開裂は、ｐＨ依存的過程である。最大酵素活性は、４〜６．８のｐＨ値範囲で達成される（Ｇｉｌａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８１：１９２９−１９３４； Ｇｏｌｄｓｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １７：１０１５−１０２５）。生理学的ｐＨでは、ヘパラナーゼはほとんど活性を呈しない。ｐＨ依存性であることから、確実に、ＥＣＭの構造破壊は、例えばエンドソームおよび創傷または炎症部位で起こるなど、さらなる酸性条件に制限される（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３７３：４２３−４３５）。
Ｄ．可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）
マトリックス分解酵素は、活性化するために、プロセグメントの開裂により成熟酵素を生成させるチモーゲン変換を必要とする。上記で検討したとおり、多くのマトリックス分解酵素はまた、活性化するために、１またはそれ以上の他の活性化条件の継続的存在を必要とする。上記活性化条件の例としては、限定されるわけではないが、ｐＨ、金属イオン、温度、還元剤、酸化剤および塩濃度がある。例えば、多くの酵素は、活性について、特異的ｐＨ値または金属イオン濃度または塩濃度または還元剤の存在を必要とする。一例では、リソソーム酵素は、活性について、酸性ｐＨ条件を必要とする。例えば、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼファミリーのカテプシン類は、活性について酸性ｐＨ条件を必要とする。またヘパラナーゼは、酸性環境で通常のプロセッシングのためにリソソームで蓄積するリソソーム酵素である。一般的に、酸性環境は、リソソームプロテアーゼが通常局在している酸性リソソームで与えられる。この環境外では、リソソームプロテアーゼは、不活性であるかまたは低活性であり、活性のためには酸性ｐＨへの外因的暴露を必要とする。別の例では、活性化条件は、金属イオン濃度を含む。例えば、カルパインは、活性について十分な濃度のＣａ２＋を必要とする。上記酵素の活性は、活性化条件の非存在下では可逆的である。
外因的活性化条件についての必要性を利用することにより、可活性化型マトリックス分解酵素は、例えばＥＣＭへインビボ投与されたとき限られた持続時間で一時的に活性化され得る。上記可活性化型マトリックス分解酵素は、外因的活性化条件に曝されたときのみ活性を呈する。活性化条件は投与部位には存在せず、外的に適用されなければならないため、活性化条件は、適切な活性化条件を供給する活性化因子のインビボ投与後に時間の経過に伴って中和または消散される。したがって、活性化因子は消散するかまたは他の形で中和されるため、インビボ投与後、ＡＭＤＥの活性化は可逆的である。例えば、ＡＭＤＥの一時的活性化は、投与部位には存在しない外因性活性化条件（すなわち、活性化因子）の存在下におけるＡＭＤＥの投与により皮膚および他の組織の間隙環境で達成され得る。典型的には、活性化条件は、活性化条件を提供する活性化因子の投与前にはＥＣＭに存在しないものである。すなわち、活性化条件へ可活性化型マトリックス分解酵素が暴露されると、活性化条件は間隙環境において消散するかまたは中和されるため、限られた期間または予め定められた期間酵素活性化がもたらされる。
したがって、本発明は、可活性化型マトリックス分解酵素を含む組成物、組み合わせおよび容器に関するものであり、インビボ投与されると、限られた期間または予め定められた期間、酵素が活性化され、その間のみ酵素はその生物作用を発揮し得る。可活性化型酵素の活性は可逆的であるため、酵素は脱活性化されることにより、上記酵素の生物作用の持続時間は制御される。可活性化型マトリックス分解酵素は、活性化条件を提供する活性化因子と組み合わせた形またはそれと共に容器で提供される。さらに、可活性化型マトリックス分解酵素および活性化因子はまた、他の薬剤、例えば麻酔薬、アルファアドレナリン作用薬または分散剤のいずれか１つまたはそれ以上と組み合わされるか、または例えば容器中で組み合わせた形で提供され得る。可活性化型マトリックス分解酵素は治療有効量で提供され、投与、例えば皮下投与により活性化されたとき、ＥＣＭの１または複数の成分を分解する。したがって、可活性化型マトリックス分解酵素は、ＥＣＭ介在疾患または状態を処置するための治療薬として使用され得る。
合成的または天然供給源から単離されたものであろうと、マトリックス分解酵素、例えば表３または本明細書の他の箇所に示したもの、その対立遺伝子または種変異型または他の変異型、または当業者に周知のものは、酵素が活性化条件を必要とする可活性化型であるならば、本発明が提供する組成物、組み合わせ、方法および装置で使用されるものとする。可活性化型マトリックス分解酵素は、チモーゲンとして、または１本鎖または２本鎖形態の不活性成熟ポリペプチドとして不活性形態で提供される。例えば、カテプシンは、それが成熟形態であっても不活性であり、立体配座的安定性のためには酸性ｐＨ条件を必要とする。可活性化型マトリックス分解酵素には、リソソームプロテアーゼ、例えばシステインおよびアスパラギン酸ファミリーのカテプシンおよびヘパラナーゼがある。典型的な可活性化型マトリックス分解酵素は、配列番号５６、５９、６２、６４、１７９、６７、７０、７３、７６、１８２、１８５、１８８、７９、１９４、８９、９２、９５および１５５のいずれかに示されたもの、またはその対立遺伝子変異型または種変異型または他の変異型である。当業者であれば、可活性化型マトリックス分解酵素について熟知しているかまたは同定できるはずである。例えば、当業者であれば、酵素活性化の常用的検定法、例えば本明細書記載の方法および当業界で周知の方法を用いることにより、所望の酵素の持続的または可逆的活性化のための外因性活性化条件の必要性を評価することができるはずである。
可活性化型マトリックス分解酵素は、いずれか１つまたは複数の特性または活性を改変するように修飾され得る。例えば、改変された特性または活性としては、限定されるわけではないが、酵素をより安定させる修飾、基質特異性の改変および／または酵素への温度感受性の付与がある。所望ならば、酵素安定性はまた、酵素のペグ化またはグリコシル化により高められ得る。標準組換えＤＮＡ技術を用いたポリペプチドの修飾は、当業者にとっては常用的なことである。本発明での目的の場合、修飾マトリックス分解酵素は、非修飾酵素の１つまたはそれ以上の活性を保持しており、活性化可能である。保持された活性は、非修飾酵素の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い活性を呈し得る。
一例において、マトリックス分解酵素、例えば、カテプシンは、そのプロセグメントが阻害性ではないように修飾され得る。プロセグメントそれ自体の内部または阻害性相互作用が起こる活性部位領域内におけるアミノ酸の入替、置換または挿入により、修飾が加えられ得る。したがって、カテプシンは、酸性条件下で自己触媒反応が起こるチモーゲン形態で提供され得る。上記修飾酵素の開裂されたプロセグメントは、チモーゲン形態を呈する場合、野生型カテプシンの場合と同様不活化には至らない。
別の例において、可活性化型酵素は、その基質特異性を改変するように修飾され得る。例えば、酵素は、特定基質についての特異性が高くなるように修飾され得る。すなわち、例えば、ＩおよびＩＶ型コラーゲンについての基質特異性を呈するカテプシンＬは、それが、ＩＶ型コラーゲンではなく、Ｉ型コラーゲンについて、また逆の場合も同様に高い基質特異性を有するように修飾され得る。ポリペプチドの修飾は、常用的分子生物学技術により達成され得、当業者の技能の範囲内である。例えば本明細書記載または当業界で周知の基質開裂に関する常用的検定法を用いることにより、修飾酵素をその基質特異性について試験することができる。例えば、基質開裂は、蛍光性ペプチドまたは精製タンパク質で評価され得る。開裂は、インビトロまたはインビボ検定法を用いて評価され得る。例えば、開裂は、酵素を基質とインキュベーションし、次いで混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけることにより評価され得る。分解は、ウエスタン・ブロットにより、または標準タンパク質染料、例えばクーマシーブルーまたは銀染色試薬を用いることにより評価され得る。
さらなる一例では、マトリックス分解酵素は、温度感受性を有するように修飾され得る。例えば、生理学的温度（例、３７℃）で活性を示すマトリックス分解酵素に修飾を加えることにより、低温（例、３７℃未満、例えば、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃）で活性を呈するが、生理学的温度では活性を呈しない酵素が選択され得る。このため、上記修飾酵素は、活性化条件が低温である可活性化型マトリックス分解酵素として使用され得る。低温を提供する活性化条件（例、冷緩衝液）と酵素を同時、断続的または逐次投与すると、酵素の活性化が誘発される。生体内温度は３７℃の生理学的温度に戻るため、酵素の活性化は時間的に制御される。
１．可活性化型マトリックス分解酵素の活性化条件および活性化方法
可活性化型マトリックス分解酵素は、活性化条件が存在しなければ不活性である。インビボ投与されると、上記可活性化型マトリックス分解酵素の一時的活性化は、酵素の活性化に十分な活性化条件を提供する１または複数の特異的活性化因子への暴露（逐次、断続的または同時投与前または投与時）により達成される。例えば、活性化は、例えば温度（例、加熱または冷却）、ｐＨ、塩、活性化にとって十分な濃度の金属イオン（例、Ｃａ２＋）を含む溶液、活性化にとって十分な濃度の還元剤または酸化剤を含む溶液への可活性化型マトリックス分解酵素の暴露、または本明細書記載または当業者に周知の他の方法により達成され得る。活性化因子の選択は、本明細書記載または当業者に周知のとおり酵素の選択により異なる。一般的に、活性酵素の生成に十分な活性化因子の量（例、濃度、レベルまたは度合い）を使用する。この量は、経験的に容易に決定され得、選択された酵素および選択された適用法により異なる。
可活性化型酵素の可逆的および条件的活性化により、一時的活性化が達成され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分に対する酵素作用の持続時間が調節される。これは、結果的に望ましくない長期酵素活性化に伴う有害な副作用が制御され得るため、本方法の利点である。可活性化型マトリックス分解酵素は、活性を維持するために活性化条件への連続暴露を必要とするため、一時的活性化が達成される。活性化条件は、通常、可活性化型マトリックス分解酵素がインビボ投与される部位において酵素活性化に十分な量では内因的に存在しない。例えば、皮膚間質は中性ｐＨを有するため、低ｐＨ活性化条件は通常存在しない。別の例では、皮膚間質における金属イオン、例えばカルシウムの生理学的レベルは、一部酵素の活性化に要求される有効量よりかなり低い。すなわち、酵素の脱活性化は、可活性化型酵素のインビボ投与後、外的に供給された活性化条件が徐々に消散または中和される場合に生じ得る外因性活性化条件への酵素の暴露減少時に起こり得る。
したがって、本明細書が提示する活性化条件は、可活性化型マトリックス分解酵素の活性化に必要とされるが、投与部位には通常十分な量では存在しないことである。可活性化型マトリックス分解酵素の活性化にとっての活性化条件の必要性により、マトリックス分解酵素は、酵素が不活性になるかまたは不安定になり、分解されるように活性化条件が消散または中和されるまでの限られた期間活性化され得る。酵素が活性状態である時間の量は予め定められた期間であり得る。例えば、酵素がインビボ投与時に暴露された環境および条件下において設定された期間酵素が活性であるように選択された活性化条件の量、例えば濃度、有効量、レベルまたは程度を含む活性化因子が提供され得る。一例では、酸性ｐＨが活性化条件である場合、ｐＨ変化に対するその抵抗時間をモジュレーションするように酸性緩衝液の緩衝能力を調節し得る。活性化因子が条件的可活性化型マトリックス分解酵素を活性化する予め定められる期間は、経験的に決定され得るもので、処置される疾患、処置される個体、酵素および活性化因子の選択の相関的な要素である。可活性化型マトリックス分解酵素は、少なくとも約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間またはそれより長期間活性化条件を提供する活性化因子の存在下でのインビボ投与後に活性を呈し得る。
典型的な活性化条件および活性化因子および一時的活性化方法を以下に記載する。かかる記載に照らし合わせると、他の実施態様についても当業者であれば容易に想到するはずである。
ａ．活性化条件−酸性ｐＨ
本項は、活性がｐＨにより調節されるマトリックス分解酵素の条件的活性化に関する組成物および方法、上記酵素の使用によるＥＣＭ介在疾患または状態の処置に関するものである。上記方法は、酸性ｐＨでのみ酵素活性を有し、中性ｐＨでは不活性のままであるかまたは不安定になって分解されるタンパク質を利用している。上記タンパク質には、限定されるわけではないが、システインおよびアスパラギン酸ファミリーのカテプシンおよびヘパラナーゼを含むリソソームプロテアーゼがある。例えば、酸性細胞内区画であるリソソームは、エンドサイトーシスにより内在化したタンパク質および他の物質を分解する極めて多様な加水分解酵素を含む。全てのリソソーム内プロテアーゼ、例えばカテプシンＬは酸性の至適ｐＨを呈する。上記プロテアーゼの具体例は、配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３、９６および１５６のいずれかに示したものである。
本発明では、皮膚内でのｐＨ差を利用するため、ある種のｐＨ条件への暴露時のみ活性を呈するマトリックス分解酵素の利用方法を採用している。ヒト表皮系は、皮膚の層状構造内でｐＨ勾配を維持している。外層は、５．５の平均ｐＨを呈することが報告されている（Ｗ．Ｐ． Ｓｍｉｔｈ （１９９４） Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ， １０９：４１−４８）。表皮の連続層のｐＨは深さと共に増し、真皮層では生理学的範囲（約ｐＨ７．４）に近い最終ｐＨに達する。
したがって、本発明では、酸性条件では活性を呈するが、例えばＥＣＭ中で存在する中性ｐＨでは実質的に不活性である可活性化型マトリックス分解酵素を用いることが考えられる。実質的に不活性な酵素とは、その至適ｐＨで酵素の１０％またはそれより低い活性、例えば、酵素の至適ｐＨで存在する活性の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、９．５％または１０％を呈するものである。当業者であれば、酵素の最適ｐＨを熟知しているかまたは測定し得、様々なｐＨ条件での活性差異を評価できるはずである。例えば、カテプシンＬのｐＨ最適値は５．５またはその前後であるが、カテプシンＬの特定種、緩衝液条件またはイオン強度によって４．５〜６の範囲内で変わり得る。カテプシンＬは、ｐＨ７．４またはそれより高いｐＨでは実質的に不活性である（Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４：９３−９８）。別の例では、カテプシンＤの活性にとって最適なｐＨ値は、３．０〜４．０またはその前後であり、６．０またはその前後またはそれより高いｐＨでは実質的に不活性である（Ｒｏｊａｓ−Ｅｓｐｉｎｏｓａ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ８：１０００−１００８）。カテプシンＳは、ｐＨ７．０で安定している数少ないリソソームプロテアーゼの一つである（Ｂｒｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８： ４８３２−４８３８）。
本発明での目的の場合、可活性化型酵素は、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６または６．５のｐＨ条件で活性を呈するが、中性ｐＨでは実質的に不活性である。ｐＨ活性プロファイリングを酵素について実施し、相対活性を評価することにより、様々な条件下でのその最適ｐＨが決定され得る（Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４：９３−９８）。ｐＨ最適値が、使用基質、緩衝液条件、イオン強度および酵素の種により異なり得ることは言うまでもない。したがって、本明細書でｐＨ最適値と言えば、典型的なものに過ぎない。当業者であれば、特異的条件下での酵素のｐＨ最適値を経験的に決定できるはずである。例えば、緩衝液条件およびイオン強度を変えることにより、様々なｐＨ条件下での酵素活性を測定することができる。ｐＨ活性プロフィールを測定する酵素検定法は、例えば本明細書記載および当業者に周知の蛍光基質を用いて実施され得る。使用する蛍光基質の選択は、酵素により異なり、当業者に周知であるかまたは経験的に決定され得る。
すなわち、通常投与部位には存在しない活性化条件との投与によりマトリックス分解酵素を条件付きで活性化させ得ることにより、中性ｐＨを呈する間質などの器官および組織の生理学的パラメーターの一時的調節および改変が可能となる。通常の生理学的条件下では、間質のｐＨは中性である。すなわち、低ｐＨで活性の可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のリソソーム酵素は、間質に存在するときには、間質が中性ｐＨである故に通常は触媒的に不活性である。間質のｐＨが、例えば酸性緩衝液の投与により一時的に酸性にされたとき、酸性ｐＨが最適であるリソソーム酵素は、間質に投与されたときに活性化される。間質のｐＨが中性へと戻るとき、酸性ｐＨを必要とするマトリックス分解酵素は不活化され、その酵素活性を発揮するのを停止する。
したがって、本発明では、中性ｐＨで実質的に不活性である可活性化型マトリックス分解酵素は、ｐＨが中性である皮膚の下へ（すなわち、皮下、皮内または筋肉内投与により）表皮下投与され得ると考えられる。また、条件付き可活性化型マトリックス分解酵素の他の投与経路も考えられ、投与時のｐＨ条件の変化故に酵素活性が可逆的になるように特定酵素のｐＨ最適値に基づいて経験的に決定され得る。他の投与経路としては、限定されるわけではないが、経口、局所および経皮投与経路がある。
ほとんどの組織および器官の間質は中性ｐＨを呈するため、一時的活性化は、酸性溶液を組織または器官間質に注入することにより達成され得る。酸性緩衝液は、投与されたとき、可活性化型マトリックス分解酵素が活性を示すように間質のｐＨを一時的に約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０または６．５またはそれ未満に低下させる組成物である。緩衝液の酸性成分は、間質の中性ｐＨによる中和に敏感に反応する。酸性緩衝液は当業者には周知である。本発明での目的の場合、緩衝液の酸性成分は、有機または無機酸であり得る。一般的に、溶液は弱酸溶液である。具体例としての酸には、限定されるわけではないが、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、グリシン−塩酸、クエン酸リン酸およびヒスチジンがある。酸性緩衝液の有効なｐＨ範囲は既知であるため、適切な緩衝液は、選択された酵素のｐＨ最適値に基づいて選択され得る。酸性緩衝液の例としては、限定されるわけではないが、酢酸、クエン酸、蟻酸、グリシン、マレイン酸、ＭＥＳ、リン酸、ピペラジン、プロピオン酸、ピリジンおよびコハク酸緩衝液がある。例えば、ＭＥＳ緩衝液の有効なｐＨ範囲は５．５〜６．７である。
中和に必要とされる期間、および酸可活性化型マトリックス分解酵素の後続の不活化は、酸性緩衝液の処方に左右される。例えば、酸性緩衝液中の酸および／または緩衝剤が間質の中和能力と比べて弱い場合、短い期間となる。強い酸を用いるか、または強力な緩衝剤を酸性緩衝剤中で使用する場合、期間は長くなる。このため、ｐＨ変化に対する抵抗性は、特定緩衝液の緩衝能力により異なる。緩衝液のイオン強度または濃度が高いとき、緩衝液の能力は高くなる。したがって、本発明方法および組成物において、所与のｐＨで活性化されたマトリックス分解酵素の一時的調節は、選択した緩衝液の緩衝能力によりさらに制御され得る。これは実施例７で具体的に説明している。所与の適用に関する望ましい緩衝液の決定は常用的な作業であり、当業者の技能レベルの範囲内である。
典型的には、例えばＥＣＭ介在疾患または状態を処置するために、１または複数のＥＣＭ成分の分解が所望される部位へ酸性溶液を直接注入する。酸性溶液活性化因子形態での活性化条件の注入は、不活性の可活性化型マトリックス分解酵素の投与と同時、逐次または断続的に実施され得る。投与を同時に行う場合、可活性化型マトリックス分解酵素および緩衝酸性液は、同一または別々の組成物に含まれ得る。同一組成物中の場合、酵素および緩衝酸性液は、混合物として一組成物中で提供され得る。酵素の活性化はまた、投与前に酵素の濃縮液状溶液または懸濁液または凍結乾燥または粉末化形態へ酸性溶液を加えることにより達成され得る。一般的に、可活性化型マトリックス分解酵素の液状溶液または懸濁液が提供される場合、それは、適切な活性化条件を提供する活性化因子に暴露されたとき、活性化条件による酵素の活性化に敏感に反応する溶液または懸濁液である。
さらに、本発明による組み合わせおよび方法では、活性化条件を有する活性化因子（例、緩衝酸性溶液）および可活性化型マトリックス分解酵素は、１種以上の他薬剤、例えば麻酔薬、アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストまたは分散剤のいずれか一つまたはそれ以上と組み合わせて提供および投与され得る。上記薬剤の具体例については、本明細書における下記の「併用療法」と題する項で検討している。他の薬剤は、活性化因子および／またはマトリックス分解酵素と同時、逐次または断続的に投与され得る。
本発明方法の一例では、緩衝酸性溶液を、ＥＣＭ状態または疾患が存在する皮膚間質または他の組織へ投与する。緩衝酸性溶液は、限られた期間の活性化を達成するため、マトリックス分解酵素の活性化に必要とされるｐＨおよび所望の緩衝能力に基づいて選択され得る。例えば、カテプシンＬは、コラーゲン介在疾患、例えばセルライトの処置を目的とする典型的酵素である。したがって、酸性緩衝液を、カテプシンＬの活性化のために５．５の最適ｐＨで調製する。上記の酸性緩衝液の具体例はＭＥＳである。また、酸性溶液の緩衝能力は、所望に応じて例えば実施例７に示す要領で実験的に測定され得る。一般的に、マトリックス分解酵素の直前またはそれと一緒に酸性緩衝液を投与する。例えば、マトリックス分解酵素が凍結乾燥形態で提供される場合、酵素は、投与直前に酸性緩衝液により再構成され、酵素および活性化因子の組み合わせが一緒に投与され得る。酸性緩衝液の存在下では、酵素はインビボ投与後に活性化される。酸性緩衝液の緩衝能力によって、間質のｐＨは、限られた期間または予め決定された期間の後中性に戻るため、マトリックス分解酵素の分解効果は打ち消される。
本発明方法の別の例では、麻酔薬および血管収縮薬の組み合わせ、例えばリドカイン／エピネフリンを、活性化因子およびマトリックス分解酵素の投与前に投与する。一般的に、本方法では、分散剤、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼも、麻酔薬および血管収縮薬、例えばアルファアドレナリン作用性受容体アゴニストと一緒に投与される。
ｂ．活性化条件−金属カチオン濃度
本項は、活性化に際し適切な金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋またはＺｎ２＋への暴露を必要とする可活性化型マトリックス分解酵素を含む組成物、組み合わせ、容器および方法に関するものである。上記酵素の具体例は、活性化にＣａ２＋を必要とするカルパイン（配列番号８２（カルパイン１）および配列番号８５（カルパイン２）に示した大型サブユニットおよび配列番号８７に示した小型サブユニット、またはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型）である。金属イオンは、水性組成物形態で、例えばカルシウム塩として供給され得る。不活性酵素は、金属イオンとの混合物として提供され得るか、または別々の組成物として提供され得る。別々の組成物として、例えば濃縮液状組成物形態または凍結乾燥または粉末化形態で提供される場合、酵素への金属イオンの付加により活性化酵素がもたらされる。
一般に、活性化は、活性化に十分な濃度で金属イオン、例えばＣａ２＋に不活性酵素を暴露することにより達成される。正確な量は、経験的に決定され得るか、または当業者には周知である。例えば、μ−カルパインおよびｍ−カルパインのインビトロ活性化は、それぞれ１０〜５０および３００〜５００μＭのカルシウム濃度を必要とする（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， １８： ６８８０−６８８９）。酵素活性の検定法を実施することにより、最適濃度が決定され得る。典型的には、本発明での目的の場合、可活性化型マトリックス分解酵素は、間質に存在する金属イオンの生理学的レベルを超える濃度での活性化に際し十分な濃度の金属イオンを必要とするものを含む。μ−カルパインおよびｍ−カルパインの場合については、活性化に必要とされるカルシウムレベルは生理学的レベルを超える（例、米国特許第６６２０５９２号；Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， １８： ６８８０−６８８９参照）。
一般に、不活性酵素は、酵素活性化を誘発するには金属イオンが不十分であるようにパッケージまたは提供される。このため、不活性酵素が金属イオン活性化因子とは別の組成物として提供される場合、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）（適用法によって、約５〜約１００ｍＭまたはそれより高濃度）を加えることにより、Ｃａ２＋または他の金属イオンを拘束して、所望時まで活性化反応の誘発を阻止することが必要であり得る。次いで、活性化反応は、キレート剤の影響を克服するのに十分な濃度でＣａ２＋（または他の金属カチオン）を加えることにより誘発され得る。正確な量は、経験的に決定され得る。
酵素によっては、単に金属イオンへの暴露を中止することにより一時的活性化が達成され得る。例えば、カルパインの持続的活性化は、カルシウムの存在を必要とする。すなわち、カルパインの不活性形態は、Ｃａ２＋を加えることにより活性化され得、得られた混合物は、同一または別々の組成物として器官または組織の間質に投与され得る。しかしながら、投与時には、連続活性化に必要とされる有効濃度のカルシウムはもはや入手できない。得られた活性酵素は、最終的にはその不活性状態に戻る。他の例では、活性化に金属イオンを必要とする酵素の一時的調節は、金属キレート剤または他の除去剤の投与により制御され得る。
ｃ．活性化条件−還元剤
本項は、活性化に適切なチオールまたは非チオール含有還元剤、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはシステインへの暴露を必要とする可活性化型マトリックス分解酵素を含む組成物、組み合わせ、容器および方法に関するものである。上記酵素の具体例は、活性化に還元剤を必要とするカテプシンＬである。還元剤は、例えばシステインとして、水性組成物形態で提供され得る。不活性酵素は、還元剤との混合物として提供され得るか、または別々の組成物として提供され得る。別々の組成物として、例えば濃縮液状組成物または凍結乾燥または粉末化形態で提供される場合、酵素に還元剤を加えることにより活性化酵素が得られる。還元剤は、酵素投与の前、それと同時、逐次的または断続的に加えられ得る。
一般的に、活性化に十分な濃度の還元剤、例えばシステインに不活性酵素を暴露することにより、活性化は達成される。正確な量は経験的に決定され得るかまたは当業者には周知である。例えば、カテプシンＬのインビトロ活性化は、一般に１〜５０ｍＭのシステインを必要とする。酵素活性検定法を実施することにより、最適濃度が測定され得る。典型的には、本発明での目的の場合、可活性化型マトリックス分解酵素は、間質に存在する還元剤の生理学的レベルを超える濃度での活性化に十分な濃度の還元剤を必要とするものを含む。
一般に、不活性酵素は、酵素活性化を誘発するには還元剤濃度が不十分であるようにパッケージまたは提供される。次いで、酵素活性の回復に十分な濃度でシステイン（または他の還元剤）を加えることにより、活性化反応は誘発され得る。正確な量は経験的に決定され得る
酵素によっては、単に還元剤への暴露を中止することにより一時的活性化が達成され得る。例えば、カテプシンＬの持続的活性化は、システインまたはＴＣＥＰの存在を必要とする。すなわち、そのプロセグメントを含まないカテプシンＬの不活性形態は、システインを加えることにより活性化され得、生成した混合物は、同一または別々の組成物として器官または組織の間質に投与され得る。しかしながら、投与時には、連続活性化に要求される有効濃度のシステインはもはや入手できない。得られた活性酵素は、最終的にはその不活性状態に戻る。他の例において、活性化に還元剤を必要とする酵素の一時的調節は、酸化グルタチオンなどの除去剤の投与により制御され得る。
ｄ．活性化条件−温度
本項では、温度依存的に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１または複数成分を分解するマトリックス分解酵素の温度感受性（ｔｓ）酵素突然変異体（ｔｓＡＭＤＥ）を提供する。特に、本項記載の突然変異体は、コラーゲンを分解する。具体例によっては、突然変異体が、高温、例えば生理学的温度（例、３７℃）より低温（例、２５℃）で高い活性を示す場合もある。例によっては、突然変異体が、低温より生理学的温度で高い活性を示す場合もある。すなわち、身体へ投与されると、ｔｓＡＭＤＥ、例えばｔｓＭＭＰの活性化は、温度の変化により時間的および条件的に制御され得る。制御されていない酵素活性は、組織完全性にとって非常に破壊的であり得る。可活性化型ｔｓＡＭＤＥは条件付きで活性化されるため、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分に対する酵素作用の持続時間を調節することにより一時的活性化が達成され、酵素の望ましくない長期活性化に伴う有害な副作用が低減化される。これは、ＥＣＭ介在疾患または状態を処置するための既存のコラゲナーゼ処置を凌ぐ本発明ｔｓＡＭＤＥ、例えばｔｓＭＭＰの利点である。このため、突然変異体の利点は、それらの活性を調節することにより、ｔｓＡＭＤＥがＥＣＭの疾患および／または状態の処置に使用され得ることである。
本発明が提供するｔｓＡＭＤＥ突然変異体、例えばｔｓＭＭＰは、例えば、アミノ酸置換、挿入または入替により温度感受性となるように修飾されたものを含む。一般的に、ｔｓＡＭＤＥは、その１次配列に１または複数のアミノ酸置換を含むことにより、許容温度でのタンパク質活性が非許容温度の場合より高くなっている。本発明ｔｓＡＭＤＥは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９．２０個またはそれより多いアミノ酸修飾を含み得る。特に、本発明ｔｓＡＭＤＥは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を含む。
本発明が提供するｔｓＡＭＤＥ、例えばｔｓＭＭＰは、許容温度では活性化され得るが、他の非許容温度では低活性であるかまたは不活性である。本発明ｔｓＡＭＤＥについては、非許容温度での活性に対する許容温度での活性の比率が、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれより高い。すなわち、非許容温度での本発明ｔｓＡＭＤＥの活性は、許容温度での活性の約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％またはそれ未満である。
例えば、通常生理学的温度（例、３７℃）で活性を示すＡＭＤＥは、修飾された結果、低温（例、３７℃未満、例、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃）では活性を示すが、生理学的温度では低活性または不活性である酵素が選択される。上記修飾酵素は、活性化条件が低温である可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）として使用され得る。生体内温度は３７℃の生理学的温度に戻るため、酵素の活性化は時間的に制御される。すなわち、例えば、本発明ｔｓＡＭＤＥは、約２５℃である許容温度では活性を示すが、例えば約３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃または３９℃などの高温では活性は低くなる。本発明ｔｓＡＭＤＥの場合、約３４℃または３７℃前後、例えば３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃または３９℃の非許容温度での活性に対する低許容温度（例、３７℃未満、例えば約２５℃）での活性の比率は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれより高い。すなわち、約３４℃または３７℃前後の非許容温度での本発明ｔｓＡＭＤＥの活性は、約２５℃前後の許容温度での活性の約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％またはそれ未満である。
本発明によるｔｓＡＭＤＥ、例えばｔｓＭＭＰは、野生型酵素の１つまたは複数の活性、例えば、コラーゲンなどのＥＣＭ成分の開裂に関する酵素活性を保持している。例えば、本発明ｔｓＡＭＤＥは、許容温度での野生型ＡＭＤＥの活性の約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１４０％、１５０％またはそれより高い許容温度での活性を保持している。しかしながら、一般に、本発明ｔｓＡＭＤＥは、高い非許容温度、例えば生理学的温度での野生型酵素より低活性である。例えば、本発明ｔｓＡＭＤＥは、生理学的温度（例、３４または３７℃）での野生型酵素の９５％、９０％、８０％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、一般的には４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％の残留活性を呈する。
活性化条件が温度である場合、活性化に必要とされる許容温度にｔｓＡＭＤＥを暴露する活性化因子が提供され得る。活性化因子への暴露はインビトロまたはインビボであり得る。活性化因子は、インビボ投与の前、それと同時、逐次的または断続的にｔｓＡＭＤＥに暴露され得る。活性化因子は、活性化に要求される必須の加熱または冷却因子を提供し得る。例えば、活性化条件が低温である場合、活性化因子は、冷緩衝液としてまたは投与部位に適用される氷パックとして提供され得る。活性化条件が熱である場合、活性化因子は、温緩衝液として、または投与部位に適用される加熱パックとして提供され得る。また活性化条件は、使用直前まで許容温度でｔｓＡＭＤＥを貯蔵することにより提供され得る。活性化因子への暴露の持続時間は、連続的であり得るか、予め定められた期間であり得るか、または断続的であり得る（例えば、ｔｓＡＭＤＥが可逆性である場合）。すなわち、活性化が許容される期間は、変更がきくものであり、使用される特定酵素、処置されている疾患または状態、投与部位または他の因子に適合化され得る。活性化因子への暴露の持続時間の決定は、当業者の技能レベルの範囲内である。
活性化条件を提供する活性化因子への暴露が無い場合、非許容温度で存在するｔｓＡＭＤＥは、不活性であるかまたは許容温度での活性と比べて実質的に不活性である。通常投与部位には存在しない許容温度（例、低温）の活性化条件により、器官および組織、例えば約３７℃の生理学的温度を呈する間質などの生理学的パラメーターの時間的調節および改変が可能となる。通常の生理学的条件下では、間質の温度は約３７℃である。すなわち、例えば、低温で活性を示すｔｓＡＭＤＥは、間質に存在するときには、間質の生理学的温度故に、通常触媒的に不活性である。間質の温度を、例えば冷緩衝液または隣接表面に適用される冷却パックへの暴露により一時的に冷たくすると、ｔｓＡＭＤＥは、間質に投与されたとき活性化される。温度が上昇し、生理学的レベルに戻ると、ｔｓＡＭＤＥは不活性または実質的に不活性になり、その酵素活性の発揮を中止する。このため、外因性活性化条件に対する必要性を利用することにより、ｔｓＡＭＤＥは活性化され得、使用中の限られた持続時間、例えば身体へのインビボ投与時に一時的に活性状態にされ得る。
本発明によるｔｓＡＭＤＥは、非許容温度への暴露後には不可逆的に不活性となるものを含む。上記突然変異体は、許容温度条件（例、２５℃）に暴露されたとき、活性であるが、温度が非許容温度（例えば身体へのインビボ投与および外因性活性化因子（例、冷却パック）の除去時に起こり得る、例えば３７℃）に改変されると、低活性または不活性になる。例えば、許容条件に戻ったとき、本発明による不可逆性ｔｓＡＭＤＥポリペプチドは、許容温度での活性の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％または１２０％の活性を呈する。活性は可逆性ではない。
また、本発明は、非許容温度への暴露後に可逆的不活性であるｔｓＡＭＤＥを提供する。上記突然変異体は、許容温度条件に暴露されると活性を呈するが、温度が非許容温度に改変されると、低活性または不活性となる。許容温度を提供する活性化条件（例、冷却パック）に再度暴露されると、ｔｓＡＭＤＥの活性は回復され、酵素は、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な活性を呈することになる。例えば、非許容条件から許容条件に戻ったとき、本発明による可逆性ｔｓＡＭＤＥポリペプチドは、非許容温度での活性に対し約１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％またはそれより高い活性を呈する。
典型的には、本発明によるｔｓＡＭＤＥは、チモーゲン（プロペプチドを含む）またはプロセッシングされた酵素（プロペプチドを欠く）またはその触媒活性形態である。下記で検討しているように、ＭＭＰを含め、ほとんどの酵素はチモーゲンであり、活性のためにはポリペプチドのＮ−末端からプロペプチドセグメントを除去することによる最初のプロセッシング事象を必要とする。プロテアーゼまたは化学薬剤などのプロセッシング剤は、直接的または間接的に１または複数の開裂事象を開始させ、プロペプチドセグメントの除去および／または酵素の活性部位を暴露させる立体配座の変化により、活性酵素を生成させる。このため、通常、酵素が成熟形態にプロセッシングされると、酵素は活性となる。プロセッシングされた酵素の活性は可逆性ではないため、プロセッシングされた酵素を身体に投与したとき、ＥＣＭの分解は制御が効かない状態となる。本発明によると、酵素に修飾を加えて温度感受性をさらに付与することにより、酵素活性化を条件付きで一時的に制御して、プロセッシング形態の連続的活性化を回避する機構が得られると思われる。
合成的または天然供給源から単離されるあらゆるＡＭＤＥ、例えば表３または本明細書の他の箇所に示したもの、そのチモーゲン形態、プロペプチドを欠くその成熟形態、および触媒活性ドメインのみを含むポリペプチドを含む触媒活性形態、およびその対立遺伝子または種変異型または他の変異型、または当業者に周知のものは、酵素が温度活性化条件の必要性により活性化され得る限り、温度感受性となるように修飾され得、本発明による組成物、組み合わせ、方法および装置で使用されるものとする。当業者であれば、ｔｓＡＭＤＥを知っているかまたは同定できるはずである。例えば、当業者であれば、常用的分子生物学的技術を駆使してマトリックス分解酵素にアミノ酸突然変異を導入し、許容温度および非許容温度下での酵素活性化についてそれぞれ試験することにより、所望の酵素の持続的または可逆的活性化に関する外因性活性化条件の必要性を評価できるはずである。典型的な酵素活性化検定法については、本明細書に記載しており、当業界では周知である。
このため、本発明によるｔｓＡＭＤＥは、ｔｓＡＭＤＥが許容温度で酵素活性を呈するものである限り、チモーゲン形態（例、プロ酵素）、プロペプチドを欠く活性酵素、および触媒活性ドメインのみを含むポリペプチドを全て含む。このため、酵素の修飾はその活性形態で行われる。かかるｔｓＡＭＤＥの例はｔｓＭＭＰ−１である。本発明によるｔｓＭＭＰ−１は、配列番号３２７に示した野生型ＭＭＰ−１におけるアミノ酸置換に対応するその１次配列に１または複数のアミノ酸修飾を含む。具体的な修飾については下記で報告している。本発明によるｔｓＭＭＰ−１突然変異体は、チモーゲンであるものまたはプロペプチドを欠く活性酵素であるものを含むが、ただし上記形態は必ず突然変異を含むものとする。本発明によるチモーゲンまたは活性ポリペプチドは、ｔｓＭＭＰ−１が許容温度で酵素活性を保持している限り、完全長であるもの、高プロリンリンカーまたはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部分を含むか、高プロリンリンカーまたはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部分を欠くもの、またはその触媒活性ドメインのみを含むポリペプチド（例、配列番号３２７に示したアミノ酸配列のアミノ酸８１〜２４２に対応する）を包含する。
チモーゲン形態で提供されるとき、ｔｓＡＭＤＥは不活性であり、プロセッシング剤によるプロセッシングが活性に必要とされることは言うまでもない。一般的に、酵素のプロセッシングは、使用前、例えばインビボ投与前に行われる。プロセッシング剤は、活性化条件（例、低温）へのｔｓＡＭＤＥの暴露および身体への投与と同時、断続的または逐次的に適用され得る。一般に、対象への投与について許容され得るプロセッシング剤が選択される。所望ならば、プロセッシング剤は、投与前に、例えば透析または他の精製方法により、酵素から除去され得る。すなわち、酵素のチモーゲン形態の場合、活性化には、１）プロセッシング剤への暴露および２）活性化条件への暴露という２段階を要する。チモーゲン形態であろうと、プロセッシングされた形態であろうと、許容温度での活性化因子へのｔｓＡＭＤＥの暴露により、ｔｓＡＭＤＥの活性は一時的に制御される。
ｔｓＡＭＤＥにさらに修飾を加えることにより、いずれか１つまたは複数の特性または活性を改変することができる。例えば、改変された特性または活性には、限定されるわけではないが、酵素をより安定させる修飾、基質特異性の改変および／または１または複数の阻害剤に対する抵抗性の増加がある。例えば、本明細書の他の箇所で記載したところによると、ｔｓＡＭＤＥは、その基質特異性を改変するように修飾され得る。例えば、酵素は、特定基質についての特異性を高めるように修飾され得る。すなわち、例えば、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンについて基質特異性を呈するｔｓＡＭＤＥは、それが、ＩＶ型コラーゲンではなく、Ｉ型コラーゲンについて、また逆の場合も同様に、高い基質特異性を有するように修飾され得る。所望ならば、酵素安定性はまた、酵素のペグ化またはグリコシル化により高められ得る。ポリペプチドの修飾は、常用的分子生物学技術により達成され得、当業者の技能の範囲内である。本発明での目的の場合、修飾ｔｓＡＭＤＥは、許容温度での野生型酵素の１または複数活性を保持している。保持された活性は、許容温度での野生型ＭＭＰの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％またはそれより高い活性を呈し得る。修飾酵素は、例えば本明細書記載または当業界で周知の基質開裂に関する常用的検定法を用いることにより、それらの基質特異性について試験され得る。例えば、基質開裂は、蛍光性ペプチドまたは精製タンパク質で評価され得る。開裂は、インビトロまたはインビボ検定法を用いて評価され得る。例えば、開裂は、酵素を基質とインキュベーションし、次いで混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけることにより評価され得る。分解は、ウエスタン・ブロットにより、または標準タンパク質染料、例えばクーマシーブルーまたは銀染色試薬を用いることにより評価され得る。
本発明によると、ｔｓＡＭＤＥは、組成物、組み合わせおよび容器として提供される。ｔｓＡＭＤＥは、投与時に、例えば表皮下投与時に、活性化されると、ＥＣＭの１または複数成分を分解する治療有効量で提供される。その結果、ｔｓＡＭＤＥは、ＥＣＭ介在疾患または状態を処置するための治療薬として使用され得る。
例えば、ｔｓＡＭＤＥは、活性化条件を提供する活性化因子と共に組成物、組み合わせおよび／または容器中で提供される。若干の例において、ｔｓＡＭＤＥはまた、プロセッシング剤と共に組成物、組み合わせおよび／または容器中で提供される。活性化因子および／またはプロセッシング剤はｔｓＡＭＤＥと同一組成物または別々の組成物および同一容器または別々の容器に含まれ得る。さらに、ｔｓＡＭＤＥはまた、他の薬剤、例えば麻酔薬、アルファ−アドレナリン作用性薬剤、分散剤または治療剤のいずれか１つまたはそれ以上と組み合わされるかまたは例えば容器中で組み合わされた形で提供され得る。ｔｓＡＭＤＥは、他の薬剤と同一または別々の組成物中で提供され得、そして／または同一または別々の容器中で提供され得る。
ｔｓＡＭＤＥは、治療有効濃度での液体または凍結乾燥形態で提供され得る。別法として、ｔｓＡＭＤＥは、十分な量の活性化因子を加えると、治療有効濃度の酵素が得られるように、濃縮液として提供され得る。酵素は、溶液または懸濁液として提供されるかまたは適切な輸送媒体、例えばリポソーム、ガラス粒子、毛細管、薬剤輸送媒体、ゼラチン、ゲル、錠剤、カプセル剤、丸薬、徐放性コーティング、並びに経皮パッチ製品および乾燥粉末吸入剤または他の同様の媒体中に封入され得る。活性化因子は、典型的には単独またはｔｓＡＭＤＥの再構成および／またはｔｓＡＭＤＥへの暴露後に間質へ投与される液状溶液または懸濁液として提供される。若干の例では、活性化因子は、外因的に提供され、投与部位へ適用される。例えば、活性化因子は、ｔｓＡＭＤＥの投与の前、投与と同時、投与後逐次的または断続的に、投与部位、例えば皮膚に適用され得る温熱または冷却パックであり得る。下記で記載している通り、これらの組み合わせおよび製品、例えば容器を含むキットも提供される。
したがって、所望時に、ｔｓＡＭＤＥ酵素を活性化条件にかけることにより、酵素は活性化因子に暴露され、活性酵素が生成する。活性化因子への暴露は、インビトロまたはインビボで達成され得る。例えば、可活性化型酵素および活性化因子が別々に提供される場合、それらは一緒に、または別々に投与され得る。別々に投与される場合、ｔｓＡＭＤＥは、活性化因子と同時に、逐次的にまたは断続的に投与され得る。別の例では、凍結乾燥または濃縮液形態のｔｓＡＭＤＥを、使用直前に活性化因子と共に再構成することができる。上記の例では、ｔｓＡＭＤＥおよび活性化因子の混合物をまとめて投与する。上記活性化方法は、当業者により経験的に決定され得、酵素および活性化因子の選択、所望の処置方法および処置計画の選択により異なり得る。
可活性化型マトリックス分解酵素は、単独または活性化因子と組み合わせた製造物品で提供され得る。例えば、酵素が活性化因子との組み合わせで提供される場合、製造物品は、一区画に凍結乾燥または液体形態の酵素および隣接区画に活性化因子を含み得る。区画は、分割材により分離され得る。さらに製造物品は、プロセッシング剤を含み得る。上記製造物品については、本明細書の他の箇所で記載している。
また、ｔｓＡＭＤＥおよび活性化因子の組み合わせは、下記で詳細に検討している他の薬剤を含み得る。例えば、活性化因子およびｔｓＭＭＰに加えて、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤または他の治療剤の１つまたはそれ以上を含む組み合わせが提供される。
ｉ．温度感受性マトリックス金属プロテアーゼ突然変異体
本発明は、非修飾ＭＭＰポリペプチドと比べて、ポリペプチドの一次配列での修飾により温度感受性となっているｔｓＭＭＰポリペプチド、例えば、ｔｓＭＭＰ−１ポリペプチドを提供する。ｔｓＭＭＰポリペプチドは、非許容温度でのｔｓＭＭＰポリペプチドの活性と比べると許容温度では高い酵素活性を呈する。例えば、本発明によるｔｓＭＭＰポリペプチドは、約３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃または３９℃前後、特に約３４℃または３７℃前後である非許容的高温の場合と比べると、３７℃未満である、例えば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃前後、特に２５℃またはその前後である低温では高い酵素活性を呈する。ｔｓＭＭＰポリペプチドの温度依存的活性故に、ＭＭＰの活性は、条件付きで制御されるため、活性化を一時的に調節することにより、ＥＣＭの長期にわたる望ましくない分解を阻止し得る。特に上記ｔｓＭＭＰポリペプチドは、ＥＣＭの疾患または状態を処置する、例えばコラーゲン介在疾患または状態、例えばセルライトを処置する用法、過程または方法で使用され得る。
本発明によるｔｓＭＭＰポリペプチドについては、非許容温度での活性に対する許容温度での活性の比率が、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれより高い。すなわち、非許容温度での本発明ｔｓＭＭＰポリペプチドの活性は、許容温度での活性の約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％またはそれ未満である。本発明によるｔｓＭＭＰポリペプチドは、野生型ＭＭＰポリペプチドの１または複数の活性、例えばコラーゲンなどのＥＣＭ成分の開裂に関する酵素活性を保持している。典型的には、上記活性は、野生型または出発タンパク質と比べて実質的には変化していない（１％未満、５％、１０％、２０％または３０％の変化）。他の例では、修飾ＭＭＰポリペプチドの活性は、野生型または出発ＭＭＰ−１ポリペプチドと比べて増加または減少している。活性を許容温度で評価し、許容温度または非許容温度での出発、非修飾ＭＭＰポリペプチドの活性と比較する。例えば、本発明によるｔｓＭＭＰポリペプチドは、許容温度または非許容温度での野生型ＭＭＰ−１の活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１４０％、１５０％またはそれより高い活性を許容温度では保持している。活性はインビトロ、エクスビボまたはインビボで評価され得、非修飾ＭＭＰポリペプチド、例えばプロセッシング剤により活性化される配列番号３２７に示した不活性ＭＭＰポリペプチド、または出発物質として使用される当業者に周知の他のＭＭＰポリペプチドの場合と比較され得る。本明細書の他の箇所で検討しているように、使用または活性測定前に、ＭＭＰまたは修飾ＭＭＰのチモーゲン不活性形態を活性形態にプロセッシングしなければならないことは言うまでもない。
ＭＭＰポリペプチドにおける修飾は、不活性または活性形態、対立遺伝子および種変異型、スプライス変異型、当業界で公知の変異型、またはハイブリッドまたはキメラＭＭＰポリペプチドを含むＭＭＰポリペプチドのあらゆる形態に加えられ得る。例えば、本発明による修飾は、その前駆体ポリペプチド、不活性プロ酵素形態、チモーゲン形態、活性形態およびその対立遺伝子または種変異型を含む、表３に示した典型的ＭＭＰポリペプチドに加えられ得る。例えば、具体的なＭＭＰは、配列番号９８に示した前駆体ＭＭＰ−１ポリペプチド、配列番号３２７に示したプロペプチドを含む不活性プロ酵素ＭＭＰ−１、配列番号９９に示したプロペプチドを欠く成熟ＭＭＰ−１ポリペプチド、または配列番号９８〜９９、３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドのいずれかと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する種、対立遺伝子または修飾変異型およびその活性フラグメントである。また、ＭＭＰポリペプチドが温度感受性であり（すなわち、修飾を含む）、酵素活性を保持しておりさえすれば、修飾は、１または複数のドメインを欠くＭＭＰポリペプチドにも存在し得る。例えば、修飾は、触媒ドメインのみを含むＭＭＰポリペプチド（例えば配列番号３２７に示したプロ酵素ＭＭＰ−１ポリペプチドのアミノ酸８１〜２４２に対応するＭＭＰ−１）に存在し得る。また、修飾は、高プロリンリンカーの全部または一部分を欠くＭＭＰポリペプチド（例えば、配列番号３２７に示したプロ酵素ＭＭＰ−１ポリペプチドのアミノ酸２４３〜２５８に対応するＭＭＰ−１）および／またはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部分を欠くＭＭＰポリペプチド（例えば、配列番号３２７に示したプロ酵素ＭＭＰ−１ポリペプチドのアミノ酸２５９〜４５０に対応するＭＭＰ−１）にも存在し得る。ＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子変異型は、限定されるわけではないが、配列番号５３７に示したいずれか１個または複数のアミノ酸変異型を含むＭＭＰ−１ポリペプチドのいずれかを含む。上記修飾について典型的な種変異型は、限定されるわけではないが、例えば配列番号５２７〜５３２のいずれかに示した、ブタ、ウサギ、ウシ、ウマ、ラットおよびマウスに関するものを含む。温度感受性を付与するための本発明ＭＭＰポリペプチドにおける修飾は、ポリペプチドの一次配列の修飾および一次配列に加えられたものではない修飾を含む他の修飾、例えば文献に記載された修飾も含むＭＭＰポリペプチドに加えられ得る。対立遺伝子または種変異型または他の変異型における修飾には、修飾形態が温度感受性修飾を含み、温度感受性でありさえすれば、そのいずれかの形態、例えば活性または不活性形態、触媒ドメインのみを含む形態、または高プロリンリンカーまたはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部分を欠く形態における修飾が含まれることは言うまでもない。下記で検討している通り、対応するＭＭＰ−１修飾は、他のＭＭＰポリペプチドの類似形態にも加えられ得る。
このため、得られた修飾ＭＭＰポリペプチドには、不活性チモーゲンプロ酵素であるもの、および活性ポリペプチドであるが含まれる。例えば、チモーゲンプロ酵素である本発明による修飾ポリペプチドは、プロセッシング剤により活性化されることにより、活性ＭＭＰポリペプチドを生成させ得る。プロセッシング剤には、限定されるわけではないが、下記表３Ａに示したものがある。ＭＭＰ−１ポリペプチドの活性化は、典型的には、プロペプチドの開裂および／または酵素の分子間および分子内プロセッシングによりプロペプチドが除去された後にその活性形態で示される（例、Ｖｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｃｉｒ． Ｒｅｓ．， ９２：８２７−８３９； Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７：８１５−８３６； Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２５４：７３１−７４１； Ｏｋａｄａ ＆ Ｎａｋａｎａｓｈｉ （１９８９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ２４９：３５３−３５６； Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９：５７８３−５７８９； Ｋｏｋｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２７６：２１７−２２１； Ｓｐｒｉｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ， ８７：３６４−８； Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．， １５：５１１−８参照）。
Figure 2014043449
出発非修飾リファレンスポリペプチドの本発明による修飾には、アミノ酸入替または置換、アミノ酸の付加または欠失またはそれらの組み合わせがある。例えば、ｔｓＭＭＰポリペプチドには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い修飾位置をもつものがある。また本発明は、出発リファレンスＭＭＰ−１ポリペプチドと比べて２またはそれより多数の修飾を伴う修飾ｔｓＭＭＰポリペプチドを提供する。修飾ＭＭＰポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い修飾位置をもつものを含む。生じた修飾ＭＭＰポリペプチドが、その活性化形態であるときに酵素活性を保持しておりさえすれば、また非許容温度の場合と比べて許容温度での酵素活性の方が大きい限り、本発明による修飾は、当業者に周知の他の修飾と組み合され得る。本発明による修飾ＭＭＰポリペプチドを、様々な条件（例、許容および非許容温度）下での酵素活性について検定することにより、酵素活性を保持しているものが同定され得る。
本発明による修飾は、例えば当業者にとっては常用的なものである標準組換えＤＮＡ技術により行われ得る。標的タンパク質におけるいずれか１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を誘発する当業界で周知の方法が使用され得る。方法としては、コードする核酸分子の標準位置指定突然変異導入法（例えばキットを使用、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ から入手可能な ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）または固相ポリペプチド合成方法がある。
また、ポリペプチドの一次配列に存在する場合も存在しない場合もある他の修飾は、限定されるわけではないが、炭水化物部分の付加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加、Ｆｃドメインの付加などを含め、修飾ＭＭＰポリペプチドまたはそのコンジュゲートに含まれ得る。例えば、上記のさらなる修飾を加えることによりタンパク質の半減期の安定性を高めることができる。
１）典型的ｔｓＭＭＰ−１修飾
本発明は、出発非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドに１または複数のアミノ酸修飾を含む修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドを提供する。アミノ酸置換（複数も可）は、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：８４、８５、９５、９８、９９、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１８、１２３、１２４、１２６、１４７、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１７０、１７１、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８５、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９７、１９８、２０６、２０７、２０８、２１０、２１１、２１２、２１８、２２３、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３７、２４０、２５１、２５４、２５５、２５６、２５７および２５８位のいずれかに対応するいずれか１つまたは複数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置で行われ得る。アミノ酸置換は、酸性（ＤまたはＥ）、塩基性（Ｈ、ＫまたはＲ）、中性（Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｇ）または疎水性（Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｌ Ａ、Ｐ）アミノ酸残基へのアミノ酸の置換を含む。例えば、示した位置でのアミノ酸置換は、アミノ酸残基Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、Ｄ、ＹまたはＫによる置換を含む。上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、３４℃または３７℃の非許容温度の場合と比べて２５℃の許容温度での高活性により温度感受性であるＭＭＰ−１ポリペプチドを含む。
例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｔ８４Ｋ（すなわち、配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドの８４位に対応する位置でのＦによるＴの置換）、Ｅ８５Ｆ、Ｌ９５Ｋ、Ｌ９５Ｉ、Ｒ９８Ｄ、Ｉ９９Ｑ、Ｅ１００Ｖ、Ｅ１００Ｒ、Ｅ１００Ｓ、Ｅ１００Ｔ、Ｅ１００Ｆ、Ｅ１００Ｉ、Ｅ１００Ｎ、Ｔ１０３Ｙ、Ｐ１０４Ａ、Ｐ１０４Ｍ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｆ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｒ、Ｄ１０５Ｓ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｗ、Ｄ１０５Ｅ、Ｌ１０６Ｃ、Ｌ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｈ、Ｄ１１０Ａ、Ｖ１１１Ｒ、Ｄ１１２Ｓ、Ａ１１８Ｔ、Ｓ１２３Ｖ、Ｎ１２４Ｄ、Ｔ１２６Ｓ、Ｇ１４７Ｐ、Ｒ１５０Ｐ、Ｒ１５０Ｖ、Ｒ１５０Ｄ、Ｒ１５０Ｉ、Ｒ１５０Ｈ、Ｄ１５１Ｇ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｓ、Ｓ１５３Ｔ、Ｆ１５５Ｌ、Ｆ１５５Ａ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｌ、Ｄ１５６Ａ、Ｄ１５６Ｗ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｒ、Ｄ１５６Ｍ、Ｐ１５８Ｔ、Ｐ１５８Ｇ、Ｐ１５８Ｋ、Ｐ１５８Ｎ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ｇ１５９Ｍ、Ｇ１５９Ｉ、Ｇ１５９Ｗ、Ｇ１５９Ｌ、Ｇ１５９Ｃ、Ｐ１７０Ｄ、Ｐ１７０Ａ、Ｇ１７１Ｐ、Ｇ１７１Ｅ、Ｇ１７１Ｄ、Ａ１７６Ｆ、Ａ１７６Ｗ、Ｆ１７８Ｔ、Ｆ１７８Ｌ、Ｄ１７９Ｎ、Ｄ１７９Ｖ、Ｄ１７９Ｃ、Ｅ１８０Ｙ、Ｅ１８０Ｒ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８０Ｇ、Ｅ１８０Ｓ、Ｅ１８０Ｎ、Ｅ１８０Ｄ、Ｅ１８１Ｔ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｄ１８１Ｃ、Ｄ１８１Ｇ、Ｅ１８２Ｔ、Ｅ１８２Ｑ、Ｅ１８２Ｍ、Ｅ１８２Ｇ、Ｅ１８３Ｇ、Ｒ１８３Ｓ、Ｔ１８５Ｒ、Ｔ１８５Ｙ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｇ、Ｔ１８５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ａ、Ｔ１８５Ｅ、Ｔ１８５Ｄ、Ｎ１８７Ｒ、Ｎ１８７Ｍ、Ｎ１８７Ｗ、Ｎ１８７Ｆ、Ｎ１８７Ｋ、Ｎ１８７Ｉ、Ｎ１８７Ａ、Ｎ１８７Ｇ、Ｎ１８７Ｃ、Ｎ１８７Ｈ、Ｆ１８８Ｖ、Ｒ１８９Ｎ、Ｒ１８９Ｔ、Ｒ１８９Ｑ、Ｅ１９０Ｇ、Ｅ１９０Ｙ、Ｅ１９０Ｄ、Ｙ１９１Ｖ、Ｎ１９２Ｈ、Ｎ１９２Ｓ、Ｎ１９２Ｄ、Ｎ１９２Ｃ、Ｈ１９４Ｐ、Ｒ１９５Ｃ、Ｒ１９５Ｗ、Ｒ１９５Ｌ、Ｒ１９５Ｇ、Ｒ１９５Ｑ、Ｒ１９５Ａ、Ｒ１９５Ｄ、Ｒ１９５Ｖ、Ａ１９７Ｃ、Ａ１９７Ｖ、Ａ１９８Ｇ、Ａ１９８Ｌ、Ａ１９８Ｍ、Ｇ２０６Ａ、Ｇ２０６Ｓ、Ｌ２０７Ｒ、Ｌ２０７Ｖ、Ｌ２０７Ｉ、Ｌ２０７Ｇ、Ｓ２０８Ｒ、Ｓ２０８Ｌ、Ｓ２１０Ｖ、Ｓ２１０Ａ、Ｔ２１１Ｌ、Ｄ２１２Ｇ、Ｄ２１２Ｈ、Ｙ２１８Ｓ、Ｆ２２３Ｃ、Ｆ２２３Ｅ、Ｆ２２３Ｇ、Ｆ２２３Ａ、Ｆ２２３Ｓ、Ｆ２２３Ｋ、Ｆ２２３Ｍ、Ｖ２２７Ｃ、Ｖ２２７Ｄ、Ｖ２２７Ｅ、Ｖ２２７Ｌ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｗ、Ｖ２２７Ｇ、Ｖ２２７Ｈ、Ｖ２２７Ｑ、Ｖ２２７Ｒ、Ｑ２２８Ｐ、Ｌ２２９Ａ、Ｌ２２９Ｔ、Ｌ２９Ｉ、Ａ２３０Ｖ、Ｄ２３３Ｅ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｅ、Ｉ２３４Ｑ、Ｉ２３７Ｌ、Ｉ２３７Ｗ、Ｉ２３７Ｎ、Ｉ２４０Ｓ、Ｉ２４０Ａ、Ｉ２４０Ｃ、Ｉ２５１Ｓ、Ｉ２５１Ｗ、Ｑ２５４Ｓ、Ｔ２５５Ｈ、Ｐ２５６Ｃ，Ｋ２５７Ｐ，Ｋ２５７ＴおよびＡ２５８Ｐのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含み得る。典型的な修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２８〜５２６のいずれかに示したアミノ酸の配列およびその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型の配列を有する。
若干の例において、上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１００、１０３、１０５、１５０、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１７１、１７６、１７９、１８０、１８１、１８２、１８５、１８７、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９８、２０６、２０７、２１０、２１２、２１８、２２３、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３７および２４０のいずれかに対応するいずれか１つまたは複数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換（複数も可）を有するポリペプチドを含む。例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｅ１００Ｖ、Ｔ１０３Ｙ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｆ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｒ、Ｄ１０５Ｓ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｗ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５１Ｇ、Ｓ１５３Ｔ、Ｆ１５５Ｌ、Ｆ１５５Ａ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｌ、Ｄ１５６Ａ、Ｄ１５６Ｗ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｒ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ｇ１７１Ｐ、Ａ１７６Ｆ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｙ、Ｅ１８０Ｒ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８１Ｔ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｅ１８２Ｔ、Ｅ１８２Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ｔ１８５Ｙ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｇ、Ｔ１８５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ａ、Ｔ１８５Ｅ、Ｎ１８７Ｒ、Ｎ１８７Ｍ、Ｎ１８７Ｗ、Ｎ１８７Ｆ、Ｎ１８７Ｋ、Ｎ１８７Ｉ、Ｎ１８７Ａ、Ｅ１９０Ｇ、Ｙ１９１Ｖ、Ｎ１９２Ｈ、Ｎ１９２Ｓ、Ｎ１９２Ｄ、Ｎ１９２Ｃ、Ｈ１９４Ｐ、Ｒ１９５Ｃ、Ｒ１９５Ｗ、Ｒ１９５Ｌ、Ｒ１９５Ｇ、Ｒ１９５Ｑ、Ｒ１９５Ａ、Ｒ１９５Ｄ、Ｒ１９５Ｖ、Ａ１９８Ｇ、Ａ１９８Ｌ、Ａ１９８Ｍ、Ｇ２０６Ａ、Ｇ２０６Ｓ、Ｌ２０７Ｒ、Ｌ２０７Ｖ、Ｓ２１０Ｖ、Ｄ２１２Ｇ、Ｙ２１８Ｓ、Ｆ２２３Ｃ、Ｆ２２３Ｅ、Ｆ２２３Ｇ、Ｆ２２３Ａ、Ｆ２２３Ｓ、Ｖ２２７Ｃ、Ｖ２２７Ｄ、Ｖ２２７Ｅ、Ｖ２２７Ｌ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｗ、Ｑ２２８Ｐ、Ｌ２２９Ａ、Ｌ２２９Ｔ、Ｌ２２９Ｉ、Ａ２３０Ｖ、Ｄ２３３Ｅ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｅ、Ｉ２３４Ｑ、Ｉ２３７Ｌ、Ｉ２４０Ｓ、Ｉ２４０ＡおよびＩ２４０Ｃのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。上記の修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、３４℃または３７℃の非許容温度の場合と比べて２５℃の許容温度では少なくとも１．２倍またはそれより高い活性、例えば１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれより高い活性を呈する。上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの典型例は、配列番号３２８、３３１−３４０、３４５−３５２、３５４−３５７、３５９、３６３、３６５、３６８、３７１、３７３−３７４、３７７−３７８、３８０、３８２−３８４、３８８−３９５、３９７−３９８、４０１−４１９、４２１−４２２、４２４−４２６、４２８−４３０、４３３、４３５、４３７−４５０、４５７−４５９、４６２、４６５−４７２、４７７−４７８、５１８のいずれかに示したアミノ酸配列、およびその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型を有する。
他の例において、上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１００、１０３、１０５、１５０、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１７１、１７６、１７９、１８０、１８１、１８２、１８５、１８７、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９８、２０６、２０７、２１０、２１２、２１８、２２３、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３７および２４０のいずれかに対応するいずれか１つまたは複数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換（複数も可）を有するポリペプチドを含む。例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｆ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｒ、Ｄ１０５Ｓ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｗ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５１Ｇ、Ｆ１５５Ａ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｌ、Ｄ１５６Ａ、Ｄ１５６Ｗ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｒ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ａ１７６Ｆ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｙ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｅ１８２Ｔ、Ｅ１８２Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ａ、Ｔ１８５Ｅ、Ｎ１８７Ｒ、Ｎ１８７Ｍ、Ｎ１８７Ｆ、Ｎ１８７Ｋ、Ｎ１８７Ｉ、Ｒ１９５Ｖ、Ａ１９８Ｌ、Ａ１９８Ｍ、Ｇ２０６Ａ、Ｇ２０６Ｓ、Ｓ２１０Ｖ、Ｙ２１８Ｓ、Ｆ２２３Ｅ、Ｖ２２７Ｃ、Ｖ２２７Ｅ、Ｖ２２７Ｗ、Ｑ２２８Ｐ、Ｌ２２９Ａ、Ｌ２２９Ｉ、Ｄ２３３Ｅ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｅ、Ｉ２４０ＳおよびＩ２４０Ｃのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。上記の修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、３４℃または３７℃の非許容温度の場合と比べて２５℃の許容温度では少なくとも１．５倍またはそれより高い活性、例えば１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれより高い活性を呈する。上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの典型例は、配列番号３２８、３３１−３４０、３４５−３４６、３４８−３５２、５３４−３５７、３５９、３６３、３６５、３６８、３７３−３７４、３７７−３７８、３８２−３８４、３８８−３９１、３９５、３９７−３９８、４０１−４０２、４０４、４１１、４１５−４１９、４２１−４２２、４３０、４３３、４３７、４３９−４４１、４４３−４４４、４４６−４４９のいずれかに示したアミノ酸配列、およびその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型を有する。
さらなる例において、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、２５℃の許容温度では温度感受性であり、２５℃での野生型ＭＭＰ−１の場合と比べて２５℃で少なくとも３０％、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１４０％、１５０％またはそれより高い活性を呈する修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドを含む。上記の修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１０５、１５０、１５６、１５９、１７９、１８０、１８２、１８５、１８７、１９５、１９８、２１２、２２３、２２７、２３４および２４０のいずれかに対応するいずれか１つまたは複数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換（複数も可）を有するポリペプチドを含む。例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｓ、Ｄ１０５Ｗ、Ｄ１０５Ｔ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｒ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｙ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８２Ｔ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｅ、Ｎ１８７Ｍ、Ｎ１８７Ｋ、Ｎ１８７Ｉ、Ｒ１９５Ｖ、Ａ１９８Ｌ、Ｆ２２３Ｅ、Ｖ２２７Ｅ、Ｉ２３４ＥおよびＩ２４０Ｓのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。上記修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの典型例は、配列番号３２８、３３２−３３５、３３７−３４０、３４５、３４９−３５２、３５５、３５９、３６３、３６８、３７３−３７４、３７７、３８４、３８８−３８９、３９１、３９７、４０２、４０４、４１１、４１６、４２２、４３０、４４４、４４９のいずれかに示したアミノ酸配列、またはその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型を有する。
特に、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１０５、１５０、１５６、１５９、１７９、１８０、１８２、１８５、１８７、１９８、２２７、２３４および２４０のいずれかに対応するいずれか１つまたは複数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換（複数も可）を有する。本発明による上記の修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｇ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５６Ｒ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８２Ｔ、Ｔ１８５Ｑ、Ｎ１８７Ｉ、Ａ１９８Ｌ、Ｖ２２７Ｅ、Ｉ２３４ＥおよびＩ２４０Ｓのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。さらに特定すれば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ｎ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｇ１５９Ｖ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｔ、Ａ１９８Ｌ、Ｖ２２７ＥおよびＩ２４０Ｓのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。
本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、可逆性または不可逆性（非可逆性とも呼ばれる）温度依存的活性を呈するものを含む。全ての場合において、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、非許容温度（例、３４℃または３７℃）の場合と比べて許容温度（例、２５℃）では高い活性を呈する。不可逆性ポリペプチドの場合、許容温度への暴露の前、その後または断続的に非許容温度へ暴露すると、そのポリペプチドは不可逆的に不活性となる。すなわち、温度許容条件、例えば２５℃に戻された修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、非許容温度、例えば３４℃または３７℃でのＭＭＰ−１ポリペプチドの活性と同一または類似活性を呈する。例えば、許容条件に戻されたとき、本発明による不可逆性修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、非許容温度での活性の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％または１２０％の活性を呈する。本発明による典型的な不可逆性修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｒ、Ｄ１０５Ｗ、Ｄ１５１Ｇ、Ｆ１５５Ａ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｌ、Ｄ１５６Ａ、Ｄ１５６Ｗ、Ｄ１５６Ｖ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｒ、Ｇ１５９Ｖ、Ａ１７６Ｆ、Ｄ１７９Ｎ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｅ１８２Ｔ、Ｅ１８２Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ｎ１８７Ｆ、Ｎ１８７Ｉ、Ｇ２０６Ａ、Ｇ２０６Ｓ、Ｖ２２７Ｃ、Ｖ２２７Ｅ、Ｑ２２８Ｅ、Ｌ２２９Ｔ、Ｄ２３３Ｅ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｅ、Ｉ２４０Ｓのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチド、例えば配列番号３２８、３３１−３３２、３３７−３３９、３４６、３４８、３４９−３５２、３５４−３５７、３６３、３６５、３６８、３７８、３８２−３８４、３９０、４０１、４０４、４１７−４１８、４３０、４３３、４３９−４４０、４４３−４４４、４４６−４４７、４４９のいずれかに示したものまたはその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型を含む。
可逆性ポリペプチドの場合、許容温度への暴露の前、その後または断続的に非許容温度に暴露すると、ポリペプチドは可逆的に活性となる。すなわち、温度許容条件に戻された修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、活性を回復することにより、非許容温度の場合と比べて許容温度では高い活性を呈する。上記の例では、回復された活性は、完全であり得るかまたは部分的である。すなわち、温度許容条件、例えば２５℃に戻された修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、非許容温度、例えば３４℃または３７℃での活性と比べて高い活性を呈する。例えば、許容条件に戻されると、本発明による可逆性修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、非許容温度での活性の約１２０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％またはそれより高い活性を呈する。本発明による典型的不可逆性修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｆ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｓ、Ｄ１０５Ｔ、Ｒ１５０Ｐ、Ｇ１５９Ｔ、Ｅ１８０Ｙ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ａ、Ｔ１８５Ｅ、Ｎ１８７Ｒ、Ｎ１８７Ｍ、Ｎ１８７Ｋ、Ｒ１９５Ｖ、Ａ１９８Ｌ、Ａ１９８Ｍ、Ｓ２１０Ｖ、Ｙ２１８Ｓ、Ｆ２２３Ｅ、Ｖ２２７Ｗ、Ｌ２２９ＩおよびＩ２４０Ｃのいずれか１つまたは複数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチド、例えば、配列番号３３３−３３６、３４０、３４５、３５９、３７３−３７４、３７７、３８８−３８９、３９１、３９５、３９７−３９８、４０２、４１１、４１５−４１６、４１９、４２１−４２２、４３７、４４１、４４８のいずれかに示したもの、またはその活性形態および他の形態、およびその対立遺伝子および種変異型を含む。
２）組み合わせ
本発明は、出発またはリファレンスＭＭＰ−１ポリペプチドとは異なり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多数の修飾を含む修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドを提供する。本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、上記で示した２またはそれより多数の修飾を含み得る。例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：８４、８５、９５、９８、９９、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１８、１２３、１２４、１２６、１４７、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１７０、１７１、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８５、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９７、１９８、２０６、２０７、２０８、２１０、２１１、２１２、２１８、２２３、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３７、２４０、２５１、２５４、２５５、２５６、２５７および２５８のいずれかに対応するいずれか２つまたはそれより多数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換を含む。一般的に、上記組み合わせ突然変異体は、温度感受性であり、非許容温度でのｔｓＭＭＰ−１ポリペプチドの活性と比べて許容温度では高い酵素活性を呈する。典型的には、組み合わせ突然変異体はまた、単突然変異体ＭＭＰ−１ポリペプチド単独の場合と比べて、または許容または非許容温度でのアミノ酸変化を含まない非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチド（例、配列番号３２７に示した野生型ＭＭＰ−１ポリペプチドまたはその活性形態または他の形態）と比べて許容温度での活性を保持している。
本発明による典型的ＭＭＰ−１組み合わせ突然変異体は、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１０５、１５０、１５６、１５９、１７９、１８０、１８２、１８５、１８７、１９８、２２７、２３４および２４０のいずれかに対応するいずれか２つまたはそれより多数の位置、または配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドとの少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するＭＭＰ−１ポリペプチドの対立遺伝子または種変異型または他の変異型における対応する位置でのアミノ酸置換を含む。例えば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｇ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５６Ｒ、Ｄ１５６Ｈ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｇ１５９Ｖ、Ｇ１５９Ｔ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｔ、Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８２Ｔ、Ｔ１８５Ｑ、Ｎ１８７Ｉ、Ａ１９８Ｌ、Ｖ２２７Ｅ、Ｉ２３４ＥおよびＩ２４０Ｓのいずれか２つまたはそれより多数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。さらに特定すれば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、Ｌ９５Ｋ、Ｄ１０５Ｎ、Ｒ１５０Ｐ、Ｄ１５６Ｋ、Ｄ１５６Ｔ、Ｇ１５９Ｖ、Ｄ１７９Ｎ、Ｅ１８０Ｔ、Ａ１９８Ｌ、Ｖ２２７ＥおよびＩ２４０Ｓのいずれか２つまたはそれより多数の修飾に対応するアミノ酸修飾を有するポリペプチドを含む。本発明による組み合わせ突然変異体では、少なくとも２つの異なる位置が修飾されていることは言うまでもない。本発明による典型的ＭＭＰ−１組み合わせ突然変異体ポリペプチドを、実施例２９における表２７に示す。
３）追加的修飾
また、本発明による修飾ＭＭＰ、例えば修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、当業界で報告されている１つまたはそれより多数の他の修飾を含み得る。追加的修飾は、例えば、当業界で公知のアミノ酸置換、欠失または挿入を含み得る。上記のものまたは修飾を含むことに加えて、結果的にＭＭＰ−１ポリペプチドが、非許容温度（例、３４℃または３７℃）の場合と比べて許容温度（例、２５℃）で高い活性を呈し、許容または非許容温度での野生型ＭＭＰ−１の活性を保持しておりさえすれば、本発明による修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い追加的修飾を含み得る。追加的修飾は、追加的特性、例えば高い安定性、長い半減期および／または阻害剤、例えばＴＩＭＰに対する高い抵抗性を酵素に付与し得る。追加的修飾は、ポリペプチドの一次配列への修飾、並びに他の修飾、例えばポリペプチドのペグ化およびグリコシル化を含む。一般的に、上記ポリペプチドは、本発明による１つまたはそれより多数の修飾を含み、高温よりも低温で高い活性を呈する。本発明によるポリペプチドに含まれ得る典型的修飾には、限定されるわけではないが、配列番号３２７に示したポリペプチドの修飾Ｔ４Ｐ、Ｑ１０Ｐ、Ｒ３０Ｍ、Ｒ３０Ｓ、Ｔ９６Ｒ、Ａ１１４Ｖ、Ｆ１６６Ｃ、Ｉ１７２Ｖ、Ｄ１８１Ｈ、Ｒ１８９Ｔ、Ｅ２００Ａ、Ｇ２１４Ｅ、Ｄ２３２Ｎ、Ｄ２３３Ｇ、Ｒ２４３Ｓ、Ｑ２５４Ｐ、Ｔ２８６Ａ、Ｉ２９８Ｔ、Ｅ３１４Ｇ、Ｆ３１５Ｓ、Ｖ３７４Ｍ、Ｒ３８６Ｑ、Ｓ３８７Ｔ、Ｇ３９１ＳおよびＴ４３２Ａがある。
４）他のＭＭＰ類
マトリックス金属プロテアーゼは、高相同性ポリペプチドであり、細胞外マトリックス成分についても類似した特異性を呈する。ＭＭＰの具体的配列を表３に示しており、例えば、配列番号１、７１１、７１４、７１７、７２０、７２３、７２６、７２９、７３２、７３５、７３８、７４１、７４４、７４７、７５０、７５３、７５６、７５９、７６２、７６５、７６８、７７１、７７４または７７７に示したものまたはチモーゲン形態、その活性形態または他の形態、またはその対立遺伝子または種変異型がある。図１は、典型的ＭＭＰポリペプチドのチモーゲン形態のアラインメントを示す。すなわち、ＭＭＰ−１における本発明による修飾は、いずれも他のＭＭＰポリペプチドにおいても加えられ得る。このため、本明細書の記載に基づくと、ＭＭＰ、その種、対立遺伝子変異型または他の変異型は、非許容温度（一般的には高温）の場合に対する許容温度（一般的には低温）での活性により一時的に（可逆的または不可逆的）活性化され得る。上記ｔｓＭＭＰ突然変異体は、当業者により使用され、ＥＣＭ介在疾患または状態の処置を目的とする組成物、過程または方法で使用され得る。
様々なＭＭＰ〜ＭＭＰ−１（例えば配列番号３２７に示した）を整列させ、対応する残基を同定することは、当業者の技能レベルの範囲内に含まれる。本発明による修飾はいずれも、対応する残基で他のＭＭＰにおいても加えられ得る。当業者であれば、非許容温度の場合と比べた許容温度での温度感受性について生成された修飾ポリペプチドの活性を試験することは可能である。特に、ＭＭＰにおける対応位置での同類アミノ酸差異が、機能的に不変であることは言うまでもない。すなわち、ＭＭＰ−１における残基が、別のＭＭＰにおけるそれとの同類残基と並んで整列している場合、かかる残基がこの場所での修飾に関して予測されることは言うまでもない。例えば、配列番号３２７に示したＭＭＰ−１における９５位は、ロイシン（Ｌ）である。他のＭＭＰとの配列番号３２７のアラインメントは、他のＭＭＰにおける９５位がロイシン、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）残基であることを示す（図１参照）。Ｌ、ＩおよびＶはそれぞれ同類残基である。
特に、本発明は、ＭＭＰにおける対応残基で対応するＭＭＰ−１修飾を実施することによる、温度感受性を付与するために１または複数のアミノ酸置換により修飾された修飾ＭＭＰポリペプチドを提供する。図２は、修飾に関する典型的アミノ酸残基を示す。これらの同定された残基は具体例に過ぎず、温度感受性を付与するために他のアミノ酸残基または他のＭＭＰ−１対応残基でＭＭＰの修飾を行うことは、当業者の技能レベルの範囲内であることは、言うまでもない。本発明による典型的修飾は、配列番号３２７に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−１ポリペプチドの次の位置：９５、１０５、１５１、１５６、１５９、１７６、１７９、１８０、１８１、１８２、１８５、１９５、１９８、２０６、２１０、２１２、２１８、２２３、２２８、２２９、２３３、２３４および２４０のいずれかに対応するいずれか１つまたはそれより多数の位置における、ＭＭＰ、例えば、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２６およびＭＭＰ−１２の修飾を含む。修飾は、ＭＭＰ−１において列挙した位置に対応する位置に上記の本発明修飾のいずれか１つまたはそれ以上を含む。例えば、配列番号３２７に示したＭＭＰ−１ポリペプチドにおける残基９５は、配列番号１０１に示したＭＭＰ−８ポリペプチドにおける残基１１３に対応する。すなわち、本発明は、配列番号１０１に示したアミノ酸配列を有する非修飾ＭＭＰ−８ポリペプチドのアミノ酸修飾Ｌ１１３Ｋを有する修飾ＭＭＰ−８ポリペプチドを提供する。本発明は、この記載に基づいて類似した修飾も提供する。
また、本発明による修飾ＭＭＰポリペプチドは、当業界で報告されている１つまたは複数の他の修飾を含み得る。追加的修飾は、例えば、当業者に周知のアミノ酸置換、欠失または挿入を含み得る。上記のものまたは修飾を含むことに加えて、結果的にＭＭＰポリペプチドが、非許容温度（例、３４℃または３７℃）の場合と比べて許容温度（例、２５℃）で高い活性を呈し、許容または非許容温度での野生型ＭＭＰの活性を保持しておりさえすれば、本発明による修飾ＭＭＰポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い追加的修飾を含み得る。追加的修飾は、追加的特性、例えば高い安定性、長い半減期および／または阻害剤、例えばＴＩＭＰに対する高い抵抗性を酵素に付与し得る。追加的修飾は、ポリペプチドの一次配列への修飾、並びに他の修飾、例えばポリペプチドのペグ化およびグリコシル化を含む。一般的に、上記ポリペプチドは、本発明による１つまたはそれより多数の修飾を含み、高温よりも低温で高い活性を呈する。本発明によるポリペプチドに含まれ得る典型的修飾には、限定されるわけではないが、下記表３Ｂに示した修飾が含まれる。
Figure 2014043449
２．マトリックス分解酵素および活性化因子の組み合わせ
本発明は、マトリックス分解酵素の活性化に十分なものである、可活性化型マトリックス分解酵素および活性化因子の組み合わせを提供する。本発明での目的の場合、可活性化型マトリックス分解酵素は、不活性形態で提供される。一般的に可活性化型マトリックス分解酵素の組成物は、活性化因子とは離した形で提供され得る。組成物は、同一容器で別々にまたは別々の容器で提供され得る。一般的に、単独でパッケージされるとき、酵素を活性化させるために存在する活性化条件が不十分な状態であるように酵素は提供される。
マトリックス分解酵素は、治療有効濃度の液体または凍結乾燥形態として提供され得る。別法として、マトリックス分解酵素は、十分な量の活性化因子を加えることにより治療有効濃度の酵素が得られるように、濃縮液として提供され得る。酵素は、液体または懸濁液として提供されるか、または適切な輸送媒体、例えばリポソーム、ガラス粒子、毛細管、薬剤輸送媒体、ゼラチン、錠剤、カプセル剤、丸薬、徐放性コーティング、並びに経皮パッチ製品および乾燥粉末吸入剤または他の同様の媒体中に封入され得る。活性化因子は、典型的には単独またはマトリックス分解酵素の再構成および／またはマトリックス分解酵素への暴露後に間質へ投与される液状溶液または懸濁液として提供される。下記Ｆ項で記載している通り、これらの組み合わせおよび製品、例えば容器を含むキットも提供される。
したがって、所望時に、可活性化型マトリックス分解酵素を活性化条件にかけることにより、酵素は活性化因子に暴露され、活性酵素が生成する。活性化因子への暴露は、インビトロまたはインビボで達成され得る。例えば、可活性化型酵素および活性化因子が別々に提供される場合、それらは一緒に、または別々に投与され得る。別々に投与される場合、条件付き可活性化型マトリックス分解酵素は、活性化因子と同時に、逐次的にまたは断続的に投与され得る。別の例では、凍結乾燥または濃縮液形態のマトリックス分解酵素を、使用直前に活性化因子と共に再構成することができる。上記の例では、マトリックス分解酵素および活性化因子の混合物をまとめて投与する。上記活性化方法は、当業者により経験的に決定され得、酵素および活性化因子の選択、所望の処置方法および処置計画の選択により異なり得る。
可活性化型マトリックス分解酵素は、単独または活性化因子と組み合わせた製造物品で提供され得る。例えば、酵素が活性化因子との組み合わせで提供される場合、製造物品は、一区画に凍結乾燥または液体形態の酵素および隣接区画に活性化因子を含み得る。区画は、分割材により分離され得る。上記製造物品については、本明細書の他の箇所で記載している。
また、マトリックス分解酵素および活性化因子の組み合わせは、下記で詳細に検討している他の薬剤を含み得る。例えば、活性化因子およびマトリックス分解酵素に加えて、麻酔薬、血管収縮薬または分散剤の治療剤の１つまたはそれ以上を含む組み合わせが提供される。
Ｅ．マトリックス分解酵素およびそのポリペプチドをコードする核酸の製造方法
タンパク質精製および組換えタンパク質発現に関する当業界で周知の方法により、本明細書に示したマトリックス分解酵素のポリペプチドを得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に周知の方法が使用され得る。当業界で利用可能な方法を用いることにより、例えば細胞または組織供給源から、所望のマトリックス分解酵素をコードする完全長（すなわち、全コーディング領域を含む）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンが得られる。修飾または変異型マトリックス分解酵素を、例えば位置指定突然変異導入法により、野生型ポリペプチドから遺伝子工学的に作製し得る。
ポリペプチドは、核酸分子のクローニングおよび単離を目的とする当業界で周知の利用可能な方法を用いることによりクローニングまたは単離され得る。上記方法は、核酸のＰＣＲ増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を含む、核酸の増幅方法を用いることにより、目的ポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸含有材料は、目的ポリペプチドをコードする核酸分子が単離され得る出発材料として使用され得る。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体試料（例、血液、血清、唾液）、健康および／または罹患対象からの試料が、増幅方法で使用され得る。核酸ライブラリーもまた、出発材料の供給源として使用され得る。プライマーは、目的ポリペプチドを増幅するように設計され得る。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成される発現された配列に基づいて設計され得る。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計され得る。増幅により生成された核酸分子を配列決定および確認することにより、目的ポリペプチドをコードさせ得る。
合成遺伝子をベクター、例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅用に設計されたベクターにクローニングすることを目的として、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含む、追加的ヌクレオチド配列が、ポリペプチドコード核酸分子に結合され得る。さらに、機能性ＤＮＡエレメントを特定する追加的ヌクレオチド配列を、ポリペプチドコード核酸分子に機能し得るように結合させ得る。上記配列の例としては、限定されるわけではないが、細胞内タンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促すように設計された分泌配列、例えば異種シグナル配列がある。上記配列は、当業者には周知である。例えば、典型的異種シグナル配列には、限定されるわけではないが、配列番号２に示したヒトカッパＩｇＧ異種シグナル配列がある。また、追加的ヌクレオチド残基配列、例えばタンパク質結合領域を特定する塩基配列は、酵素コード核酸分子に結合され得る。上記領域には、限定されるわけではないが、特異的標的細胞への酵素の取込みを促すかまたは促すタンパク質をコードするか、または合成遺伝子産物の薬物動態を別の形で改変する残基の配列が含まれる。例えば、酵素は、ＰＥＧ部分に結合され得る。
さらに、標識または他の部分が、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を助けるために付加され得る。また、例えば、追加のヌクレオチド残基配列、例えばエピトープ標識または他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列が、酵素コード核酸分子に結合され得る。上記配列の例には、Ｈｉｓ標識（例、６ｘＨｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２３５）またはＦｌａｇ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２３６）をコードする核酸配列がある。
次いで、同定および単離された核酸は、適切なクローニングベクターへ挿入され得る。当業界で周知の多数のベクター−宿主系が使用され得る。可能なベクターには、限定されるわけではないが、プラスミドまたは修飾ウイルスがあるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合し得るものでなくてはならない。上記ベクターには、限定されるわけではないが、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体またはプラスミド、例えばｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ、カリフォルニア）がある。他の発現ベクターには、本明細書で具体的に示したＨＺ２４発現ベクターがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば相補的付着末端を有するクローニングベクターへＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより達成され得る。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて実施され得る。ＤＮＡを分断するのに使用される相補性制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端が酵素的に修飾され得る。別法として、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより、いかなる所望の部位でも作製され得る。ライゲーションされるこれらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含み得る。別の方法では、開裂されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマー末端結合法により修飾することもできる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔およびソノポレーションにより宿主細胞へ導入され得、その結果、遺伝子配列の多数のコピーが作製される。
特定実施態様では、単離したタンパク質遺伝子を組み込ませた組換えＤＮＡ分子、または合成ＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換することにより、遺伝子の多数のコピーの作製が可能となる。すなわち、遺伝子は、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要時には、単離した組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより大量に得られる。
１．ベクターおよび細胞
例えば本明細書記載のものなど、１または複数の目的タンパク質を組換え発現させる場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部分を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入し得る。また、必要な転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子に関する天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域により供給され得る。
また、本発明は、酵素をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はまた、ベクターを含む細胞を提供する。細胞には、真核生物および原核生物細胞があり、ベクターはそこでの使用に適したものであればよい。
本発明は、ベクターを含む、原核生物および真核生物細胞、例えば内皮細胞を提供する。上記細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌、昆虫細胞および動物細胞がある。コードされたタンパク質が細胞により発現される条件下で上記細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することにより、タンパク質を製造するのに上記細胞を使用する。本発明での目的の場合、例えば、酵素は培地へ分泌され得る。
本発明は、天然または異種シグナル配列と結合されたプロ酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその多数のコピーを含むベクターを提供する。ベクターは、細胞で酵素タンパク質を発現させるために、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。酵素のプロ酵素（すなわち、チモーゲン）形態は、本発明における可活性化型酵素として使用されるために精製され得る。別法として、分泌時、プロセグメントを触媒的または自触的に開裂することにより、成熟酵素を生成させ得る。必要ならば、プロセグメントが調製物から除去されるように酵素を精製し得る。また、上記成熟形態は、不活性ならば、１本鎖または２本鎖形態の可活性化型酵素として本発明で使用され得る。
タンパク質コーディング配列を発現させるのに、様々な宿主−ベクター系が使用され得る。これらの例としては、限定されるわけではないが、ウイルス（例、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）感染させた哺乳類細胞系、ウイルス（例、バキュロウイルス）感染させた昆虫細胞系、微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌がある。ベクターの発現エレメントは、その長さおよび特異性が様々である。使用される宿主−ベクター系により、若干の適切な転写および翻訳エレメントのいずれか１つが使用され得る。
ＤＮＡフラグメントをベクターへ挿入するための当業者に周知の方法を用いることにより、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コーディング配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含み得る。タンパク質をコードする核酸配列、またはそのドメイン、誘導体、フラグメントまたは相同体の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが、組換えＤＮＡ分子（複数も可）により形質転換された宿主で発現されるように、第２の核酸配列により調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当業界で周知のプロモーター／エンハンサーにより制御され得る。一実施態様において、プロモーターは、目的タンパク質についての遺伝子にとって自然なものではない。使用され得るプロモーター類には、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０ （１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７ （１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５ （１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２ （１９８２））、原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：５５４３）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２１−２５ （１９８３）、また、“Ｕｓｅｆｕｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ”： ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７９−９４ （１９８０）も参照）、ノパリンシンテターゼプロモーターを含む植物発現ベクター（Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−２１３ （１９８４））またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：２８７１ （１９８１））、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０ （１９８４））、酵母および他の真菌からのプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、および組織特異性を呈し、トランスジェニック動物で使用されている以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６ （１９８４）； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９ （１９８６）； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５ （１９８７））、膵臓ベータ細胞で活性を示すインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２ （１９８５））、リンパ系細胞で活性を示す免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８ （１９８４）； Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８ （１９８５）； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４ （１９８７））、精巣、胸部、リンパ系およびマスト細胞で活性を示すマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５ （１９８６））、肝臓で活性を示すアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６ （１９８７））、肝臓で活性を示すアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８ （１９８５）； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８ １９８７））、肝臓で活性を示すアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１ （１９８７））、骨髄系細胞で活性を示すベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍａｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０ （１９８５）； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４ （１９８６））、脳の稀突起神経膠細胞で活性を示すミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２ （１９８７））、骨格筋で活性を示すミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６ （１９８５））、および視床下部の性腺刺激細胞で活性を示す性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８ （１９８６））がある。
一実施態様では、目的タンパク質、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体または相同体をコードする核酸に機能し得るように結合されたプロモーター、１またはそれ以上の複製起点および所望による１またはそれ以上の選択可能マーカー（例、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを使用する。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換用の典型的プラスミドベクターには、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（カリフォルニア、バレンシアのＱｉａｇｅｎから入手可能、また、この系について記載しているＱｉａｇｅｎが出版した文献も参照）がある。ｐＱＥベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換えタンパク質の堅固に調節された高レベルの発現を実現させるためのファージＴ５プロモーター（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重ｌａｃオペレーターリプレッションモジュール、有効な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳＩＩ）、６ＸＨｉｓ標識コーディング配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、Ｃｏ１Ｅ１複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に６ｘＨｉｓ標識を配置させ得る。上記プラスミドには、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１があり、これらは、３読み枠全てについての多重クローニング部位を提供し、Ｎ−末端６ｘＨｉｓ標識タンパク質を発現させる。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞形質転換用の他の典型的プラスミドベクターには、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４９５２４９６号参照、ウィスコンシン、マディソンのＮｏｖａｇｅｎから入手可能、また、この系について記載しているＮｏｖａｇｅｎにより出版された文献も参照）がある。上記プラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよびエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むｐＥＴ１２ａ−ｃ、およびＨｉｓカラムでの精製で使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（登録商標）リーダー配列およびカラムでの精製後に開裂させ得るトロンビン開裂部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含むｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ウィスコンシン、マディソンの ＮＯＶＡＧＥＮ）を含む。
哺乳類細胞発現用ベクターの具体例は、ＨＺ２４発現ベクターである。ＨＺ２４発現ベクターは、ｐＣＩベクターバックボーン（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導された。それは、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）をコードするＤＮＡ、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス極初期エンハンサー／プロモーター領域（ＣＭＶ）およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）を含む。また発現ベクターは、ＥＣＭＶウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する。
２．発現
マトリックス分解酵素は、インビボおよびインビトロ方法を含め、当業者に周知の方法により製造され得る。目的タンパク質は、例えば投与および処置に必要とされる、タンパク質の必要量および形態を製造するのに適切な生物体で発現され得る。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えばエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫細胞、ヒトセルラインを含む哺乳類細胞およびトランスジェニック動物がある。発現宿主は、それぞれのタンパク質生産レベルおよび発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプが異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば調節および安全性に関する配慮、生産費用および精製の必要性および方法に基づいて行われ得る。
多くの発現ベクターが利用可能で、当業者に周知であり、タンパク質の発現に使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に左右される。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望によるエンハンサー、翻訳シグナルおよび転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には形質転換細胞を選択し、維持させ得る選択可能マーカーを有する。場合によっては、複製起点がベクターのコピー数の増幅に使用され得る。
マトリックス分解酵素はまた、タンパク質融合体として利用または発現され得る。例えば、酵素融合体を生成することにより、さらなる機能性を酵素に付加することができる。酵素融合タンパク質の例には、限定されるわけではないが、シグナル配列、例えば位置測定用標識、例えばｈｉｓ６標識またはｍｙｃ標識、または精製用標識、例えばＧＳＴ融合体、およびタンパク質分泌および／または膜会合指令配列の融合体がある。
一般的に、マトリックス分解酵素は、不活性チモーゲン形態で発現される。チモーゲン変換は、他のプロテアーゼへの暴露または自己触媒反応により達成され、成熟酵素を生成し得る。活性化因子が存在しない場合に不活性でありさえすれば、いかなる形態の酵素であっても本発明に含まれるものとする。
ａ．原核生物細胞
原核生物、特にエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、タンパク質の大量生産システムを提供する。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換は、当業者に熟知されている単純かつ迅速な技術である。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）についての発現ベクターは、誘導性プロモーター、例えば高レベルのタンパク質発現の誘導および宿主細胞に何らかの毒性を呈するタンパク質の発現に有用なプロモーターを含み得る。誘導性プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターおよび温度調節λＰＬプロモーターがある。
例えば本発明が提供するタンパク質などは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質環境で発現され得る。細胞質は還元性環境であり、分子によっては、このことが不溶性封入体の形成をもたらす原因になり得る。還元剤、例えばジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤、例えばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素は、タンパク質を再可溶化するのに使用され得る。これに代わる方法は、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の生成を誘導し得る細菌の周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的には、リーダー配列をタンパク質と融合させて発現させ、タンパク質をペリプラズムへ指向させる。次いで、ペリプラズムの内側でシグナルペプチダーゼによりリーダーを除去する。ペリプラズムターゲッティングリーダー配列の例としては、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダーおよびアルカリ性ホスファターゼ遺伝子から誘導されたリーダーがある。ペリプラズム発現では、培養培地への発現されたタンパク質の漏出が起こる場合もある。タンパク質の分泌により、培養上清からの迅速かつ簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透性溶解によりペリプラズムから回収され得る。細胞質発現と同様に、タンパク質が不溶性となり得るため、変性剤および還元剤を用いて、可溶化および再折りたたみを促進させ得る場合もある。また、誘導および成長温度は、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得、典型的には、２５℃〜３７℃の温度が使用される。典型的には、細菌はアグリコシル化タンパク質を製造する。すなわち、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞からの精製後グリコシル化がインビトロで追加され得る。
ｂ．酵母細胞
サッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロマイシス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロマイシス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母は、例えば本明細書記載のタンパク質などの製造に使用され得る公知酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製性ベクターで、または相同的組換えによる安定した染色体組み込みにより形質転換され得る。典型的には、誘導性プロモーターを用いて、遺伝子発現を調節する。上記プロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１または他のピキア（Ｐｉｃｈｉａ）または他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、多くの場合、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のため選択可能なマーカー、例えばＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などを含む。酵母で発現されたタンパク質は、可溶性であることが多い。シャペロニン、例えばＢｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび溶解度が改善され得る。さらに、酵母で発現されたタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合体、例えばサッカロマイシス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）からの酵母交配型アルファ因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２ｐ交配型接着受容体またはアルクスラ・アデニニヴォランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼとの融合体を用いることにより分泌に向けて指令され得る。例えばＫｅｘ−２プロテアーゼについてのプロテアーゼ開裂部位に遺伝子操作を加えることにより、発現されたポリペプチドが分泌経路から出るときそれらから融合配列を除去することができる。また、酵母は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化し得る。
ｃ．昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現を用いた昆虫細胞は、マトリックス分解酵素などのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用される翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、真核生物発現の安全性を改善し、その調節に関する懸念を縮小する限定的な宿主範囲を有する。典型的発現ベクターは、高レベル発現のためのプロモーター、例えばバキュロウイルスの多角体プロモーターを使用する。常用されるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス、例えばアウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）および昆虫セルライン、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳｆ９、シューダレティア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレキシップス（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）などがある。高レベル発現のために、発現させる分子のヌクレオチド配列を、ウイルスの多角体開始コドンの下流に隣接して融合させる。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞で正確にプロセッシングされるため、培養培地へ発現されたタンパク質を分泌させるのに使用され得る。さらに、セルラインシューダレティア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレキシップス（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）は、哺乳類細胞系と類似したグリコシル化パターンをもつタンパク質を製造する。
昆虫細胞における代替的発現系は、安定した形質転換細胞の使用である。シュナイダー２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（アエデス・アルボピクツス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））などのセルラインが発現に使用され得る。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターを用いることにより、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導することができる。発現ベクターは、典型的にはネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用により維持される。
ｄ．哺乳類細胞
哺乳類発現系を用いることにより、マトリックス分解酵素を含むタンパク質を発現させることができる。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ導入により、および電気穿孔および顕微注入などの物理的手段により哺乳類細胞に導入され得る。哺乳類細胞用の発現ベクターは、典型的にはｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザック共通配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。また、ＩＲＥＳエレメントを付加することにより、別の遺伝子、例えば選択可能マーカーとのバイシストロン発現が可能となる。上記ベクターは、高レベル発現のために転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型で活性を示す。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域も発現に使用され得る。典型的プロモーター／エンハンサー領域としては、限定されるわけではないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腺腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子由来のものがある。選択可能マーカーは、発現構築物を伴う細胞についての選択およびその維持に使用され得る。選択可能マーカー遺伝子の例には、限定されるわけではないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼがある。例えば、発現をメトトレキサートの存在下で実施することにより、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞のみが選択され得る。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面における活性状態でのタンパク質の発現が指令され得る。
マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含め、多くのセルラインが哺乳類発現用に利用可能である。典型的セルラインには、限定されるわけではないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、Ｈｅｌａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）および他の骨髄腫セルライン、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマセルライン、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞がある。またセルラインは、血清不含有培地に適合させた形で利用可能であり、細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製が容易となる。例としては、ＣＨＯ−Ｓ細胞（カリフォルニア、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６１９−０１２）および血清不含有ＥＢＮＡ−１セルライン（Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４：３３２−４２）がある。また、セルラインは、最大限の発現用に最適化された特殊な培地での成長に適合させた形で利用可能である。例えば、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞を、化学的に特定された動物生成物不含有培地における懸濁培養での成長に適合させる。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物は、例えば本発明記載のタンパク質などの発現に使用され得る。典型的には、直接ＤＮＡ導入法、例えばマイクロプロジェクタイル法およびプロトプラストへのＰＥＧ介在導入、およびアグロバクテリウムによる形質転換法を用いて、発現構築物を植物に導入する。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびタバコなどの双子葉植物宿主、およびトウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主間で分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターがある。形質転換細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能マーカーを使用することが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養で維持されるかまたは総体植物へ再生され得る。また、トランスジェニック植物は、マトリックス分解酵素を製造するように遺伝子操作された藻類を含み得る。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これは、これらの宿主で製造されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
３．精製技術
宿主細胞からのマトリックス分解酵素および他のタンパク質を含むポリペプチドの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系により異なる。分泌された分子の場合、一般的には細胞除去後に培養培地からタンパク質を精製する。細胞内発現の場合、細胞を溶解し、抽出物からタンパク質を精製し得る。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物体を発現に使用するとき、組織または器官を出発材料として使用することにより、溶解細胞抽出物を調製し得る。さらに、トランスジェニック動物製造は、集められ得る乳または卵におけるポリペプチドの製造を含み得、必要ならば、当業界における標準的方法を用いてタンパク質を抽出し、さらに精製し得る。
一般的に、マトリックス分解酵素は、本発明によるシステムおよび方法で記載されている後続の活性化のために不活性形態（チモーゲン形態）をとるように発現および精製される。適用法によって、マトリックス分解酵素は、本明細書記載のとおり、活性化因子の非存在下においてその成熟形態では不活性の場合もある。このため、発現後、自己触媒反応により成熟形態が生成され、プロセグメントが除去され得る。多くの酵素の場合、自己触媒反応は、活性化因子の存在を必要とする。必要ならば、追加の精製段階を実施することにより、精製調製物からプロセグメントを除去し得る。対照としての使用など、状況によっては、発現されたマトリックス分解酵素は、自己触媒反応でプロセグメントを除去するか、または活性化因子の添加により活性化形態に精製され得る。上記の例で、自己賦活は、精製過程中、または室温で２４〜７２時間インキュベーションすることにより行われ得る。活性化の速度および程度は、タンパク質濃度および特異的酵素により異なり、例えば、さらなる希釈試料は、さらに長期間室温でのインキュベーションを必要とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例、３キロダルトンシフト）および酵素活性（蛍光性基質の開裂）により、活性化を監視することができる。活性酵素が望ましいとき、典型的には、酵素を精製前に７５％を超える活性化に到達させる。
マトリックス分解酵素などのタンパク質は、限定されるわけではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィー、例えばアニオン交換を含む当業界で周知の標準タンパク質精製技術を用いて精製され得る。また、アフィニティー精製技術は、調製物の有効性および純度を改善するのに使用され得る。例えば、マトリックス分解酵素と結合する抗体、受容体および他の分子が、アフィニティー精製で使用され得る。また、発現構築物に遺伝子操作を加えて、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合体またはＨｉｓ６などアフィニティー標識をタンパク質に付加し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ−樹脂でアフィニティー精製をすることができる。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光測光技術を含む当業界で周知の方法により評価され得る。
Ｆ．可活性化型マトリックス分解酵素の製造、処方および投与
本発明による医薬組成物は、不活性形態での可活性化型マトリックス分解酵素を含む。また本発明は、活性化因子を含む組成物を提供する。化合物は、経口、非経口投与用の溶液、懸濁液、ゲル、錠剤、分散性錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、持効性製剤またはエリキシル、および経皮パッチ製品および乾燥粉末吸入剤など、適切な医薬調製物に製剤化される。典型的には、当業界で周知の技術および手順を用いて、化合物を医薬組成物に製剤化する（例、Ａｎｓｅｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、第４版、１９８５、１２６参照）。
選択されたマトリックス分解酵素は、活性化されたとき、処置される患者に対する望ましくない副作用を伴うことなく治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。可活性化型マトリックス分解酵素を含む組成物は、医薬上許容される担体を含有し得る。治療有効濃度は、公知インビトロまたはインビボ系、例えば本明細書記載の検定法で化合物を試験することにより、経験的に決定され得る。組成物中における選択されたマトリックス分解酵素の濃度は、複合体の吸収、不活化および排泄速度、複合体の物理化学特性または投薬スケジュールおよび投与量並びに当業者に周知の他の因子により異なる。例えば、処置の正確な投薬量および持続時間は処置されている組織の相関的な要素であり、公知試験プロトコルを用いて、またはインビボまたはインビトロ試験データからの補外により経験的に決定され得ることは言うまでもない。濃度および用量値はまた、処置されている個体の年齢により変わり得るものとする。さらに、個々の対象について、詳細な投薬レジメンを時間の経過に伴い個体の必要性および処方物の投与を管理または指揮している人の専門的判断に応じて調節するべきであること、および本明細書で示した濃度範囲は具体例に過ぎず、その範囲を制限する意図は無いことは、言うまでもない。疾患または状態、例えばＥＣＭ介在疾患または状態、例えばセルライトまたはリンパ浮腫の処置のために投与される選択されたマトリックス分解酵素の量は、標準的臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロ検定法および動物モデルの使用は、最適投薬量範囲を確認する助けとなり得る。経験的に決定され得る正確な投薬量は、特定の酵素、投与経路、処置される疾患のタイプおよび疾患の重症度により異なり得る。典型的な投薬量は、約１０μｇ〜１００ｍｇ、特に５０μｇ〜７５ｍｇ、１００μｇ〜５０ｍｇ、２５０μｇ〜２５ｍｇ、５００μｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは２ｍｇ〜４ｍｇの範囲である。個々の投薬量およびその処方は、適応症および個体により異なる。必要ならば、投薬量は経験的に決定され得る。典型的には、投薬量は、本明細書記載の適応症に関して例えば活性化因子の添加による再構成後１〜１００ｍｌの量、特に１〜５０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、１０〜３０ｍｌ、１〜２０ｍｌまたは１〜１０ｍｌの量で投与される。典型的には、上記投薬量は、１０〜５０ｍｌ最終量中、約１００μｇ〜５０ｍｇ、一般には１ｍｇ〜５ｍｇである。
典型的には選択された活性化因子は、マトリックス分解酵素に暴露されたときに、マトリックス分解酵素を活性化する量での緩衝液として提供される。典型的には、緩衝液中の活性化因子の量は、間質中に存在するその活性化因子の生理学的量を、選択された可活性化型マトリックス分解酵素を一時的に活性化するのに十分なレベルまで一時的に改変する量である。例えば、酸性ｐＨが活性化条件である場合、酸性緩衝液組成物形態の活性化因子は、マトリックス分解酵素と一緒に、またはそれとは別にＥＣＭに投与されたとき、ＥＣＭのｐＨを生理学的ｐＨ未満、すなわち中性より低いｐＨに一時的に低下させる少なくとも１種の酸を含む。本明細書の他の箇所で記載したとおり、酸性緩衝液は、選択された酵素のｐＨ最適範囲内に有効なｐＨ範囲を有するものである。酸性緩衝液の中和は、間質が中性ｐＨ環境であるが故に投与時に起こり、緩衝能力の相関的要素である。また、本発明では、選択された可活性化型マトリックス分解酵素および選択された活性化因子によっては、他の緩衝液の使用も考えられる。例えば、緩衝液は、様々な温度で、または塩、還元剤または金属イオンの量を変えながら調製され得る。また、低ＰＨ活性化条件を含む活性化因子緩衝液は、医薬上許容される担体または賦形剤を含み得る。
マトリックス分解酵素は、１回で投与され得るか、または一定間隔をあけて若干の小用量で分割投与され得る。選択されたマトリックス分解酵素は、処置期間の全過程にわたって、例えば数時間、数日、数週間または数か月にわたって、１回または複数回の用量で投与され得る。連続投与が有用な場合もある。正確な用量および投与過程は、意図された活性化方法およびシステムによって異なることは言うまでもない。例えば、マトリックス分解酵素は、活性化因子と一緒に、または別々に投与され得る。典型的には、一緒に投与する場合、活性化因子を、使用直前に、例えば凍結乾燥粉末の再構成によりマトリックス分解酵素に暴露する。他の提示形態では、活性化因子は、ＡＭＤＥ製剤の一成分であり得るか、またはＡＭＤＥの液体基剤用量形態と混合され得る。また、ＡＭＤＥは、活性化因子との混合前に適切な希釈剤により希釈され得る。別々に投与する場合、マトリックス分解酵素組成物を、活性化因子調製物と逐次的、同時または断続的に投与し得る。
また、処置の正確な投薬量および持続時間は、処置されている疾患の相関的な要素であり、公知試験プロトコルを用いて、またはインビボまたはインビトロ試験データからの補外により経験的に決定され得ることは言うまでもない。濃度および用量値はまた、軽減されるべき状態の重症度により変わり得るものとする。さらに、個々の対象について、詳細な投薬レジメンを時間の経過に伴い個体の必要性および組成物の投与を管理または指揮している人の専門的判断に応じて調節するべきであること、および本明細書で示した濃度範囲は具体例に過ぎず、組成物およびそれらを含む組み合わせの範囲または使用を制限する意図は無いことは、言うまでもない。組成物は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与され得る。一般的に、毒性を制限するように投薬レジメンを選択する。担当医は、毒性、または骨髄、肝臓または腎臓または他の組織機能不全により、いつ如何なる形で治療を終結するか、中断するか、または低用量に調節するべきかを当然わきまえているものとする。逆に、担当医はまた、臨床応答が十分ではない場合（毒性副作用を排除する）、いつ、いかなる形で処置を高レベルに調節するべきかを、わきまえているものである。
医薬上許容される組成物は、動物および人間での使用に関して一般的に認められた薬局方に従って立案された監督機関または他の機関に関する認可を考慮して製造される。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤および持効性製剤の形態をとり得る。組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドにより坐薬として製剤化され得る、経口製剤は、標準的担体、例えば医薬品質のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび他の薬剤を含み得る。製剤は、投与方式に適合するべきである。
医薬組成物は、酵素または活性化因子と一緒に投与される希釈剤、補助薬、補形薬または賦形剤などの担体を含み得る。適切な医薬用担体の例は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ による Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ に記載されている。上記組成物は、患者に対し適切な投与形態を提供するための適量の担体と一緒に、一般的には精製形態である化合物の治療有効量を含む。上記医薬担体は、無菌液体、例えば水および油類、例えば石油、動物、植物または合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油およびゴマ油であり得る。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は典型的な担体である。また、食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセリン溶液は、特に注射可能溶液用の液体担体として使用され得る。組成物は、有効成分と一緒に希釈剤、例えば食塩水、ラクトース、スクロース、デキストロース、乳酸リンゲル液、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク、および結合剤、例えば澱粉、天然ゴム、例えばアラビアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に周知の他の同様の結合剤を含み得る。適切な医薬賦形剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水およびエタノールがある。所望ならば、組成物はまた、少量の湿潤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤、例えばアセテート、クエン酸ナトリウム、マレエート、グリシネート、ヒスチジン、スクシネート、ラクテート、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート、ポリエチレングリコールおよび他の同様の薬剤を含み得る。製剤中の他の賦形剤は、酸化または還元剤、例えばシステイン、酸化グルタチオンまたはシステイン、還元グルタチオン、界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニック（Ｆ６８）または保存剤を含み得る。本発明での目的のために、酸性緩衝剤は活性化因子として提供され得、一般的には使用時までマトリックス分解酵素とは独立した組み合わせで提供される。
還元剤は、マトリックス分解酵素の活性を高め得るため、投与用製剤で提供され得る。例えば、還元剤は、蛍光性ペプチド基質を用いて酵素活性を検定するのに必要とされる（例、実施例２５参照）。また、還元剤は、コラーゲン、ＨＳＡおよびｒＨｕＰＨ２０と称されるＰＨ２０組成物などの基質についてのカテプシンＬの活性を高める（例、実施例２６参照）。典型的還元剤には、限定されるわけではないが、システインまたはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）がある。一般的に、還元剤は、自己分解を促し、製剤の安定性を低下させ得るため、長期貯蔵用液体製剤には含有されない。本発明では、使用前、一般的には使用直前に、還元剤を液体用量形態に添加するか、または酵素の凍結乾燥形態を再構成するために添加するものとする。例えば、凍結乾燥酵素、例えばカテプシンＬは、還元剤を含有する希釈剤により再構成され得る。別法として、結果的にタンパク質が、１〜２年間の安定性を保持するものでありさえすれば、酵素は、製剤中に存在する還元剤を含む凍結乾燥酵素として製剤化され得る。かかる製剤では、還元剤が存在しない適切な希釈剤で凍結乾燥酵素を再構成する。還元剤の量は、経験的に決定され得、個々の還元剤の相関的な要素である。単一用量投与に関する典型的な量は、約１ｍＭ〜３０ｍＭ、例えば１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭまたは３０ｍＭである。
処方物は、ヒトおよび動物への投与用に、化合物またはその医薬上許容される誘導体の適量を含む単位用量形態、例えば錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤、顆粒、無菌非経口溶液または懸濁液、および経口用溶液または懸濁液、および油水エマルジョンで提供される。医薬的治療活性化合物およびその誘導体は、典型的には、単位用量形態または多用量形態で処方および投与される。各単位用量は、必要とされる医薬用担体、賦形剤または希釈剤と連係的に、所望の治療効果を生じさせるのに十分な予め定められた量の治療活性化合物を含有する。単位用量形態の例には、アンプル、バイアルおよび注射器および個別包装した錠剤またはカプセル剤がある。単位用量形態は、小部分で、またはそのまとまりで投与され得る。多用量形態は、単一容器にパッケージされた複数の同一単位用量形態であり、分離した単位用量形態で投与される。多用量形態の例には、バイアル、錠剤またはカプセル剤のボトルまたはパイントまたはガロン単位のボトルがある。したがって、多用量形態は、パッケージでは分離されていない多数の単位用量である。一般的に、０．００５％〜１００％の範囲で有効成分を含み、残量は非毒性担体により構成される用量形態または組成物が調製され得る。
組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、病変部内、腹腔内注射、皮下、表皮下、硬膜外、鼻、経口、膣、直腸、局所、局部、耳、吸入、頬側（例、舌下）および経皮投与または経路を含む当業者に周知の経路での投与用に製剤化され得る。投与は、処置の場所しだいで局部的、局所的または全身的であり得る。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば、限定されるわけではないが、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷包帯剤と連係的な局所適用、注射、カテーテル手段、坐薬手段または移植体手段により達成され得る。また、組成物は、他の生物活性剤と逐次的、断続的または同一組成物で投与され得る。投与はまた、放出制御型製剤および例えばポンプ手段による放出制御装置を含む放出制御システムを含み得る。
所与の症例における最適経路は、様々な因子、例えば病気の性質、病気の進行、病気の重症度、使用される特定組成物により異なる。本発明での目的のためには、マトリックス分解酵素と活性化因子が、皮膚または組織の間質に到達するようにそれらを投与するのが望ましい。すなわち、例えば表皮下投与方法による皮膚下での直接投与が考えられる。これらの例としては、皮下、皮内および筋肉内投与経路がある。すなわち、一例では、局所投与は、例えば注射器または例えば針などの注入装置を含む他の製造物品からの注入により達成され得る。他の投与方式も考えられる。医薬組成物は、各投与経路に適した剤型で製剤化され得る。
一例では、医薬調製物は、液体形態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であり得る。液体形態を呈する場合、可活性化型マトリックス分解酵素の医薬調製物は、活性化因子の添加時に治療有効濃度に希釈される濃縮調製物として提供され得る。活性化因子は、投与前に調製物に添加され得るか、または活性化因子は、マトリックス分解酵素調製物と同時、断続的または逐次的に添加され得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば懸濁剤（例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油）、乳化剤（例、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性賦形剤（例、扁桃油、油性エステル類または分画植物油）、および保存剤（例、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いた慣用的手段により製造され得る。
別の例では、医薬調製物は、使用前に水または適切な賦形剤で再構成される凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、マトリックス分解酵素の医薬調製物は、適切な活性化因子を含む溶液により再構成され得る。調製物の再構成により、適切な活性化因子中にマトリックス分解酵素の治療有効量を含む混合物が得られ、所望の投与経路を用いて一緒に投与され得る。
例えばタンパク質加水分解（的分解）および抗原性および免疫原性応答による免疫学的干渉などの分解過程への選択されたマトリックス分解酵素の暴露を減らす投与方法が使用され得る。上記方法の例には、処置部位での局所投与がある。治療薬のペグ化は、タンパク質加水分解への抵抗性を高め、血漿半減期を増加させ、抗原性および免疫原性を減らすことが報告されている。ペグ化方法の例は当業界では公知である（例えば、Ｌｕ および Ｆｅｌｉｘ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ４３： １２７−１３８， １９９４； Ｌｕ および Ｆｅｌｉｘ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， ６： １４２−６， １９９３； Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， ４６ ： ２５３−６４， １９９５； Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９： １３３９８−４０４， １９９４； Ｂｒｕｍｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５４： ３０８８−９５， １９９５ 参照、また、Ｃａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５（１０）：１２６１−７７ および Ｍｏｌｉｎｅｕｘ （２００３） Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２３ （８ Ｐｔ ２）：３Ｓ−８Ｓも参照）。またペグ化は、核酸分子のインビボ送達にも使用され得る。例えば、アデノウイルスのペグ化により安定性および遺伝子導入は高められ得る（例、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２０（９）： １４４４−５１参照）。
１．注射可能物質、溶液およびエマルジョン
本発明では、一般的には皮下、筋肉内または皮内注射を特徴とする非経口投与も考えられる。注射可能物質は、慣用的形態で、液状溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁させるのに適切な固体形態として、またはエマルジョンとして製造され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリンまたはエタノールである。さらに、所望ならば、投与される医薬組成物はまた、ｐＨ緩衝剤、還元または酸化剤、金属イオン塩類または他の同様の緩衝液などの溶媒形態に活性化因子を含み得る。医薬組成物はまた、他の少量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤および他の同様の薬剤、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートおよびシクロデキストリンを含み得る。また、本発明では、一定レベルの投薬量が維持されるように徐放性または持続放出系の移植も考えられる（例、米国特許第３７１０７９５号参照）。上記非経口組成物中に含まれる活性化合物のパーセンテージは、その特異的な性質並びに化合物の活性および対象の必要性に大きく左右される。
組成物の非経口投与には、一般に皮内、皮下および筋肉内投与などの表皮下投与経路が含まれる。所望ならば、静脈内投与もまた含まれる。注射可能物質は、局所および全身投与用に設計されている。本発明での目的の場合、局所投与は、冒された間質への直接投与に望ましい。非経口投与用調製物には、注射用に調整された滅菌溶液、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒と合わせるように調整された滅菌乾燥可溶性生成物、例えば凍結乾燥粉末、注射用に調整された滅菌懸濁液、使用直前に賦形剤と合わせるように調整された滅菌乾燥不溶性生成物および無菌エマルジョンがある。溶液は、水性または非水性であり得る。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および増粘剤および可溶化剤を含む溶液、例えばグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびその混合物がある。
非経口調製物で使用される医薬上許容される担体には、水性賦形剤、非水性賦形剤、抗菌剤、等張剤、緩衝液、酸化防止剤、局所麻酔薬、懸濁および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、アミノ酸、ペプチドおよび他の医薬上許容される物質がある。水性賦形剤の例には、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、等張性デキストロース注射剤、滅菌水注射剤、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射剤がある。非水性非経口用賦形剤には、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油および落花生油がある。静菌または静真菌濃度の抗菌剤が、多用量型容器にパッケージされた非経口調製物に添加され得、フェノールまたはクレゾール類、水銀製剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラベン類、例えばメチル−およびプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類、チメロサール、ベンザルコニウムクロリドおよびベンゼトニウムクロリドが含まれる。等張剤には、塩化ナトリウムおよびデキストロースがある。緩衝液には、リン酸およびクエン酸がある。酸化防止剤には、重硫酸ナトリウムがある。局所麻酔薬は、プロカイン塩酸塩を含む。懸濁および分散剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンがある。乳化剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ ８０）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ ２０）、プルロニック（Ｆ６８）がある。金属イオン封鎖剤またはキレート剤には、ＥＤＴＡがある。また、医薬用担体には、水混和性賦形剤用のエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調節用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸がある。
医薬活性化合物の濃度は、注射が所望の薬理学的効果を生じさせる有効量を提供するように調節される。正確な用量は、当業界で周知のとおり患者または動物の年齢、体重および状態により異なる。単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは注射器に針と共にパッケージされる。医薬活性化合物を含む液状溶液または再構成粉末調製物の量は、処置される疾患およびパッケージに選択された個々の製造物品形態の相関的な要素である。例えば、セルライトの処置の場合、非経口注射については、注射量は約１０〜５０ミリリットルであると考えられる。一般的に、この量は、活性化因子およびマトリックス分解酵素を一緒に投与する場合、その２物質の量を表す。すなわち、一例において、本発明は、１０〜５０ミリリットルの活性化因子を含む第２の区画と離して凍結乾燥酵素調製物を含む２相容器または２相チャンバー注射器を提供する。活性化因子と共に酵素を再構成した後、混合物が投与され得る。当業界では周知であり、実践されているとおり、非経口投与用調製物は全て、無菌でなくてはならない。注射可能製剤は、適切な条件下、例えば約−８０℃、−４０℃、−２０℃、２〜８℃、１５℃、室温または制御された室温で貯蔵され得る。
凍結乾燥粉末
本発明では、溶液、エマルジョンおよび他の混合物としての投与用に再構成され得る凍結乾燥粉末は、興味の対象である。それらはまた、固体またゲルとして再構成および処方され得る。
滅菌凍結乾燥粉末は、不活性酵素の化合物を緩衝溶液に溶解することにより製造される。緩衝溶液は、粉末または粉末から製造された再構成溶液の安定性または他の薬理学的要素を改善する賦形剤を含み得る。それに続いて溶液を滅菌ろ過し、次いで当業者に周知の標準条件下で凍結乾燥することにより、所望の処方物が提供される。簡単に述べると、凍結乾燥粉末は、適切な緩衝液、例えばクエン酸、リン酸ナトリウムまたはカリウムまたは当業者に周知の他の同様の緩衝液に、賦形剤、例えばデキストロース、ソルビタール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、マンノース、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ヒドロキシエチル澱粉または他の適切な薬剤を溶かすことにより製造される。添加され得る他の賦形剤には、アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、プロリン、アミン類、例えばベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、およびアンモニウム、ナトリウムまたはマグネシウムの塩類がある。次いで、選択された酵素を生じた混合物に添加し、それが溶解するまで撹拌する。生成した混合物を滅菌ろ過するかまたは処理することにより、微粒子を除去して無菌性を確実にし、凍結乾燥用バイアル中に配分する。各バイアルは、化合物の単回用量（１ｍｇ〜１ｇ、一般的に１〜１００ｍｇ、例えば１〜５ｍｇ）または多回用量を含む。凍結乾燥粉末は、適切な条件下、例えば約４℃〜室温で貯蔵され得る。
この凍結乾燥粉末を緩衝溶液で再構成することにより、非経口投与で使用される処方物が得られる。再構成用に選択される溶液は、いかなる緩衝液でもよいが、典型的には、活性化因子を含む緩衝液である。活性化因子は、再構成される酵素の相関的な要素として選択される。例えば、カテプシンＬの凍結乾燥調製物を約ｐＨ５．５の酸性緩衝液で再構成する。再構成する場合、約１μｇ〜２０ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１ｍｇ、さらに好ましくは約１００μｇを緩衝液または他の適切な担体１ｍＬに対して加える。正確な量は、処置される適応症および選択された化合物により異なる。上記の量は、経験的に決定され得る。
２．局所投与
局所および全身投与に関して記載したとおり、局所用混合物を製造する。生成した混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、液剤、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、泡沫、エーロゾル、洗腸剤、スプレー、坐薬、包帯、皮膚パッチまたは局所投与に適した他の剤型として製剤化される。
化合物またはその医薬上許容される誘導体は、例えば吸入による局所適用エーロゾルとして製剤化され得る（例、米国特許第４０４４１２６、４４１４２０９および４３６４９２３号参照、炎症性疾患、特に喘息の処置に有用なステロイドを送達するためのエーロゾルについて記載）。気道投与用のこれらの製剤は、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた形で、エーロゾルまたはネブライザー用液剤形態、または吸入用微粉末形態であり得る。上記の場合、処方物の粒子は、典型的には直径５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満である。
化合物は、局部または局所適用、例えばゲル、クリームおよびローション形態で、例えば眼における皮膚および粘膜への局所適用および眼への適用または槽内または脊髄内適用に向けて製剤化され得る。局所投与は、経皮送達用および眼または粘膜への投与、または吸入治療について想到される。活性化合物単独または他の医薬上許容される賦形剤との組み合わせでの点鼻液も投与され得る。
本発明は、経皮投与に適した処方物を提供する。それらは適切な形で、例えば長期間にわたって受容者の表皮と直に接触した状態で残存するように適合化された個別パッチで提供され得る。上記パッチは、例えば、活性化合物に関して０．１〜０．２Ｍ濃度の所望による緩衝水溶液中に活性化合物を含む。また、経皮投与に適した処方物は、イオントホレシス（例、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３（６）， ３１８ （１９８６）参照）により送達され、典型的には活性化合物の所望による緩衝水溶液の形態をとり得る。
３．他の投与経路用組成物
本発明では、処置される状態によって、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与など他の投与経路も考えられる。例えば、直腸投与用医薬用量形態は、全身的効果をもたらす直腸用坐薬、カプセル剤および錠剤である。直腸用坐薬は、体温で溶けるか軟化して、１種または複数の薬理学的または治療有効成分を放出する直腸挿入用固体を含む。直腸用坐薬に用いられる医薬上許容される物質は、基剤または賦形剤および融点を上昇させる薬剤である。基剤の例としては、カカオバター（カカオ油）、グリセリン−ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）および脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドの適切な混合物がある。様々な基剤の組み合わせが使用され得る。坐薬の融点を上昇させる薬剤には、鯨ろうおよびワックスがある。直腸用坐薬は、圧縮方法または鋳型法により製造され得る。直腸用坐薬の典型的重量は、約２〜３ｇである。直腸投与用錠剤およびカプセル剤は、経口投与用製剤の場合と同じ医薬上許容される物質を用いて、同じ方法により製造される。
直腸投与に適切な製剤は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、活性化合物を１または複数の慣用的固体担体、例えばカカオバターと混合し、次いで生じた混合物を成形することにより製造され得る。
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤（例、アルファ化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例、ラクトース、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当業界で周知の方法によりコーティングされ得る。
頬側（舌下）投与に適切な製剤には、例えば、味付けした基剤、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に活性化合物を含むロゼンジ、およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に化合物を含むトローチ剤がある。
また医薬組成物は、放出制御型製剤および／または送達装置により投与され得る（例、米国特許第３５３６８０９、３５９８１２３、３６３０２００、３８４５７７０、３８４７７７０、３９１６８９９、４００８７１９、４６８７６１０、４７６９０２７、５０５９５９５、５０７３５４３、５１２０５４８、５３５４５６６、５５９１７６７、５６３９４７６、５６７４５３３および５７３３５６６号参照）。
様々な送達系が知られており、選択されたマトリックス分解酵素の投与に使用され得、例えば、限定されるわけではないが、リポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体伝達エンドサイトーシス、および選択されたマトリックス分解酵素をコードする核酸分子の送達系、例えばレトロウイルス送達系が含まれる。
したがって、ある種の実施態様において、リポソームおよび／またはナノ粒子もマトリックス分解酵素の投与で使用され得る。リポソームは、水性媒質に分散され、自然に多重ラメラ同心円２層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般的に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。典型的には、ナノ粒子を安定させるコレステロールを含むリポソームも製造される。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含む直径が２００〜５００オングストロームの範囲である小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。
リン脂質は、脂質対水のモル比によって、水に分散したとき、リポソーム以外にも様々な構造を形成し得る。低比率では、リポソームが形成する。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度および２価カチオンの存在により変化する。リポソームは、イオン性および極性物質には低い透過性を示すが、高温では、それらの透過性を著しく改変する相転移が起こり得る。相転移は、ゲル状態として知られている密度の高い規則正しい構造から、流動状態として知られている隙間の多い不規則な構造への変化を伴う。これは、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖類および薬物に対する透過性の増加をもたらす。
リポソームは、次の種々の機構を介して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的弱疎水性または静電引力、または細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着；細胞質へのリポソーム内容物の同時放出を伴う原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による原形質膜との融合；およびリポソーム内容物の会合を伴わない、細胞膜または細胞レベル下の膜へのリポソーム脂質の転移、またはその逆の転移。リポソーム製剤を変えると、複数の機構が同時に機能し得るが、どの機構が機能的であるかも改変され得る。ナノカプセル剤は、一般的に安定した再生可能な方法で化合物を封入し得る。細胞内ポリマー過負荷による副作用を回避するためには、インビボ分解され得るポリマーを用いて上記の超微粒子（０．１μｍ前後のサイズ）を設計するべきである。これらの必要条件を満たす生物分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は本発明で使用されるものであり、上記粒子は容易に製造され得る。
４．併用療法
さらに、本明細書記載の可活性化型マトリックス分解酵素および活性化因子の組み合わせは、いずれも他の治療的または薬理学的作用因子または手順と一緒に、その前に、それとは断続的に、またはそれに続いて共に処方または共投与され得る。上記作用因子には、限定されるわけではないが、他の生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬、血管収縮薬および手術、およびそれらの組み合わせがある。例えば、上記で例として挙げたものを全て含め、他の薬剤および処置が利用可能であるいかなる疾患または状態についても、上記疾患および状態に関して選択された可活性化型マトリックス分解酵素と活性化因子の組み合わせは、それらと組み合わせて使用され得る。別の例では、局所麻酔薬、例えばリドカインを投与することにより痛みを軽減させ得る。麻酔効果の持続時間を長くするために、麻酔薬が血管収縮薬と併用される場合もあり得る。本発明が提供する薬剤はいずれも、例えば、皮下投与後に薬剤の組織への接近を促す分散剤と併用され得る。上記物質は、当業界では公知であり、例えば可溶性グリコサミノグリカナーゼ酵素、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ糖タンパク質ファミリーの構成員が含まれる（例、米国特許第２００５０２６０１８６および２００６０１０４９６８号参照）。
本発明による可活性化型マトリックス分解酵素の組成物は、局所麻酔薬と共に処方または投与され得る。例えば、ｐＨが活性化条件として提示されている場合、酸性ｐＨへの暴露に伴う痛みを最小限にするために局所麻酔薬の投与が望まれる。麻酔薬には、短時間作用性および長時間作用性局所麻酔薬製剤がある。短時間作用性局所麻酔薬製剤は、リドカインまたは関連局所麻酔薬を食塩水または他の適切な注射用賦形剤に溶かしたものを含む。典型的には、短時間作用性局所麻酔薬による局所麻酔は、約２０〜３０分間続く。麻酔薬の例としては、例えば、非吸入局所麻酔薬、例えばアンブカイン、アモキセイカイン、アミロカイン、アプトカイン、アルチカイン、ベノキシネート、ベンジルアルコール、ベンゾカイン、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブクリカイン、ブメカイン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタムベン、ブタニリカイン、カルビゾカイン、クロロプロカイン、クリブカイン、クロダカイン、コカイン、デキシバカイン、ジアモカイン、ジブカイン、ジクロニン、エルカイン、エチドカイン、エウプロシン、フェキシカイン、フォモカイン、ヘプタカイン、ヘキシルカイン、ヒドロキシプロカイン、ヒドロキシテトラカイン、イソブタムベン、ケトカイン、ロイシノカイン、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、オクトカイン、オルトカイン、オキセタカイン、オキシブプロカイン、フェナカイン、ピノルカイン、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモカイン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロピポカイン、プロポキシカイン、プロキシメタカイン、ピロカイン、カタカイン、キニソカイン、リソカイン、ロドカイン、ロピバカイン、サリチルアルコール、スイカイン、テトラカイン、トラペンカインおよびトリメカイン、並びに様々な他の非吸入麻酔薬、例えばアルファキサロン、アモラノン、エトキサドロール、フェンタニル、ケタミン、レボキサドロール、メチツラール、メトヘキシタール、ミダゾラム、ミナキソロン、プロパニジド、プロポキセート、プラモキシン、プロポフォール、レミフェンタニル、スフェンタニル、チレタミンおよびゾラミンがある。製剤における有効量は、個々の対象、処置される疾患、投与経路および他の要件により変化する。上記投薬量は、経験的に決定され得る。
局所麻酔薬の半減期は短いため、多くの場合、上記麻酔薬と血管収縮薬と共に投与または処方するのが望ましい。血管収縮薬の例には、カテコールアミンおよびカテコールアミン誘導体を含むアルファアドレナリン作用性受容体アゴニストがある。特に、例えば、限定されるわけではないが、レボノルデフリン、エピネフリンおよびノルエピネフリンがある。例えば、局所麻酔製剤、例えばリドカインは、低濃度のエピネフリンまたは別の受容体アゴニスト、例えばレボノルデフリンを含むように処方され得る。局所麻酔薬とアドレナリン作用性受容体アゴニストの組み合わせは、薬剤では一般的である（例、米国特許第７２６１８８９および５９７６５５６号参照）。血管収縮薬は、麻酔薬の半減期を延ばすのに必要である。血管収縮薬、例えばエピネフリンは、注入された組織の血管でアルファ−アドレナリン作用性受容体を刺激する。これは、組織において血管を収縮させる効果を有する。血管収縮により、局所麻酔薬は組織にさらに長く留まるため、麻酔効果の持続時間が非常に長くなる。
概して、本発明では、血管収縮薬を麻酔薬と組み合わせて使用する。血管収縮薬が、麻酔剤の投与部位の付近の血管を収縮させるべく作用することにより、麻酔の持続時間を延長させ得る限り、麻酔薬および血管収縮薬は、単一医薬組成物の一部として、または別々の医薬組成物の一部として一緒に投与され得る。一例では、麻酔剤と血管収縮薬を、溶液に溶かして一緒に投与する。さらに、麻酔薬および血管収縮薬は、可活性化型マトリックス分解酵素および活性化因子と一緒に、または別々に処方され得る。単一製剤が好ましい。麻酔剤および血管収縮薬は、注入、浸潤により投与されるか、または例えばゲルまたはペーストの一部として局所投与され得る。典型的には、麻酔剤および血管収縮薬は、麻酔すべき部位へ直接注射により、例えば皮下注射により投与される。製剤中の有効量は、個々の患者、処置すべき疾患、投与経路および他の要件により変わる。上記投薬量は経験的に決定され得る。例えば、リドカインの典型的な量は、約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、２００ｍｇ〜４００ｍｇ、２０ｍｇ〜６０ｍｇまたは３０ｍｇ〜５０ｍｇである。リドカインの投薬量は、個体および投与経路により変化する。エピネフリンは、例えば１０μｇ〜５ｍｇ、５０μｇ〜１ｍｇ、５０μｇ〜５００μｇ、５０μｇ〜２５０μｇ、１００μｇ〜５００μｇ、２００μｇ〜４００μｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは２ｍｇ〜４ｍｇの量で投与され得る。典型的には、エピネフリンは、１：１０００００〜１：２０００００希釈率でリドカインと併用され得、これは、１００ｍｌの麻酔薬が０．５〜１ｍｇのエピネフリンを含むことを意味する。投与量は、処置される疾患および投与経路により調節され得る。本発明では、１〜１００ｍｌ、１〜５０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、１０〜３０ｍｌ、１〜２０ｍｌまたは１〜１０ｍｌ、典型的には１０〜５０ｍｌの麻酔薬／血管収縮薬製剤が、例えばセルライトなど、ＥＣＭ介在疾患または状態の処置に皮下投与され得るものとする。投与は、可活性化型マトリックス分解酵素および活性化因子の投与と逐次的、同時または断続的に行われ得る。
本発明による可活性化型マトリックス分解酵素の組成物はまた、分散剤と共に処方または投与され得る。分散剤もまた、他の薬剤、例えば麻酔薬、血管収縮薬または他の生物製剤と共に処方または投与され得る。分散剤の例としては、グリコサミノグリカンの分解を通して間質空間においてチャンネルを開口させる、グリコサミノグリカナーゼ、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼがある。これらのチャンネルは、用量および処方によって２４〜４８時間の間は比較的開いた状態のままであり得る。上記チャンネルは、外来分子、例えば流体、小分子、タンパク質（例えばマトリックス分解酵素）、核酸および遺伝子治療用ベクターおよびサイズが約５００ｎｍ未満の他の分子の拡散を促すのに使用され得る。さらに、上記チャンネルの形成により、間質空間内でのバルク流体の流動が促され得、その結果、「対流輸送」または単に対流と称されることもあるプロセスにおいて流体により効果的に運ばれる溶質（例えば、検出可能な分子または他の診断剤、麻酔薬または他の組織修飾剤、薬理学的または医薬有効成分、または化粧品または他の美容品）の分散または運動が促進され得ると考えられる。上記の対流輸送は、分子拡散の速度および蓄積効果を実質的に超え得るため、治療薬または他の投与された分子を迅速かつ効果的に組織中において灌流させ得る。さらに、薬剤、例えばマトリックス分解酵素、麻酔薬または他の薬剤を、グリコサミノグリカナーゼと共に処方または投与し、両方とも比較的限られた局所部位、例えば非静脈内非経口投与部位（例、皮内、皮下、筋肉内、または他の組織、器官中またはその周囲または体内の他の比較的限られた空間）へ注射するとき、投与薬剤と会合した流体は、局所推進力（すなわち、静水圧）を与え、かつ流動に対するインピーダンス（間質マトリックス内におけるチャンネル開口により）を低下させることができ、それらは両方とも流体の流動性を増加させ、流体内に含まれる治療剤または他の分子の対流輸送を促進し得る。その結果、グリコサミノグリカナーゼの使用は、生物学的利用能を改善し、また例えばマトリックス分解酵素など共に処方または共投与される薬剤の他の薬物動態的および／または薬力学的特性を操作するのにかなり有用であり得る。
ａ．ヒアルロナン分解酵素
グリコサミノグリカナーゼの典型例は、ヒアルロナン分解酵素である。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンを分解する酵素を包含する。典型的ヒアルロナン分解酵素には、限定されるわけではないが、ヒアルロニダーゼおよびヒアルロナン開裂能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼがある。本発明による組成物、組み合わせおよび方法におけるヒアルロナン分解酵素の典型例は、可溶性ヒアルロナン分解酵素である。例えば、グリコサミノグリカナーゼの典型例はヒアルロニダーゼである。ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素の一群である。間質バリアの主要構成成分、ヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の粘稠度を低下させ、それによって組織透過性を高める。
ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれるヒアルロナンは、結合、上皮および神経組織全体に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの必須成分および間質バリアの主要構成成分である。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンの粘稠度を低下させ、それによって、組織透過性を高め、非経口投与された流体の吸収速度を高める。ヒアルロナン分解酵素それ自体、例えばヒアルロニダーゼは、例えば、分散および送達を促進するため他の薬剤、薬物およびタンパク質と連係的に拡散または分散剤として使用されている。
ヒアルロナン分解酵素は、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合を介して結合された、反復ジサッカリド単位、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）で構成される、ヒアルロナンポリマーを開裂することにより、ヒアルロナンを分解する作用を呈する。ヒアルロナン鎖は、約２５０００ジサッカリド反復またはそれより長い鎖長に達し得、ヒアルロナンのポリマーは、サイズがインビボで約５０００〜２０００００００Ｄａの範囲であり得る。したがって、本発明による使用および方法で用いられるヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンジサッカリド鎖またはポリマーの開裂を触媒する能力を有する酵素を包含する。例によっては、ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→４グリコシド結合を開裂する場合がある。他方、ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→３グリコシド結合を開裂する場合もある。
ｉ．ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、大きく３クラスに分類される：主要最終生成物としてテトラサッカリドおよびヘキササッカリドをもつエンド−ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼである哺乳類型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）、主としてジサッカリド最終生成物を生じるベータ排除反応により機能するエンド−ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼである、ヒアルロナンおよび、程度は様々であるが、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）およびデルマタン硫酸（ＤＳ）を分解する細菌性ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．９９．１）、β−１−３結合の加水分解を通してテトラサッカリドおよびヘキササッカリド最終生成物を生じるエンド−ベータ−グルクロニダーゼである、ヒル、他の寄生生物および甲殻類からのヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）。
１）哺乳類型ヒアルロニダーゼ
哺乳類型ヒアルロニダーゼは、加水分解およびトランスグリコシダーゼの両活性を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、一般的にはＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解し得る。このタイプのヒアルロニダーゼには、限定されるわけではないが、ウシ（ウシ亜科）（配列番号２３７、２６６および２７２およびＢＨ５５（米国特許第５７４７０２７および５８２７７２１号））、ヒツジ（オビス・アリエス）（配列番号２５２、２６７、２７１および２７２）、スズメバチ（配列番号２３８および２３９）、ミツバチ（配列番号２４０）、クロスズメバチ（配列番号２４１）、アシナガバチ（配列番号２４２）、マウス（配列番号２４３〜２４５、２５７）、ブタ（配列番号２４６、２４７）、ラット（配列番号２４８〜２５０、２５６）、ウサギ（配列番号２５１）、オランウータン（配列番号２５３）、カニクイザル（配列番号２５４）、モルモット（配列番号２５５）からのヒアルロニダーゼ、およびヒトヒアルロニダーゼがある。本発明による組成物、組み合わせおよび方法におけるヒアルロニダーゼの典型例は、可溶性ヒアルロニダーゼである。
ヒトゲノムには６種のヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１（配列番号２６２）、ＨＹＡＬ２（配列番号２６３）、ＨＹＡＬ３（配列番号２６４）、ＨＹＡＬ４（配列番号２６５）およびＰＨ２０／ＳＰＡＭ１（配列番号２３２）がある。ヒアルロニダーゼの中で、ＰＨ２０は、始原型中性活性酵素であり、その他は、ヒアルロナンまたは既知基質に対して触媒活性を呈さないか、または特定ｐＨ条件下でのみ活性を示す。ヒアルロニダーゼ様酵素はまた、例えばヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０など、一般的にグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して原形質膜にロックされているもの（Ｄａｎｉｌｋｏｖｉｔｃｈ−Ｍｉａｇｋｏｖａ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １００（８）：４５８０−５）、および例えばヒトＨＹＡＬ１など、一般的に可溶性であるもの（Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ， （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２３６（１）：１０−５）を特徴とし得る。一部のヒアルロニダーゼのＮ−結合グリコシル化は、その触媒活性および安定性にとって非常に重要であり得る。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプの改変は、タンパク質の抗原性、構造的折りたたみ、溶解度および安定性に対して劇的な影響を及ぼし得るため、多くの酵素は、最適な酵素活性にとってグリコシル化を必要とするとは考えられない。したがって、ヒアルロニダーゼは、この点、Ｎ−結合グリコシル化の除去により、ヒアルロニダーゼ活性がほぼ完全に不活化され得るということで独特である。上記ヒアルロニダーゼの場合、Ｎ−結合グリカンの存在は、活性酵素の生成にとって重大である。
したがって、哺乳類ヒアルロニダーゼは、主として精巣抽出物で見出される中性活性のもの、および主として肝臓などの臓器で見出される酸性活性であるものにさらに分類され得る。典型的な中性活性ヒアルロニダーゼには、ＰＨ２０、例えば、限定されるわけではないが、例えばヒツジ（配列番号２６７）、ウシ（配列番号２６６）およびヒト（配列番号２３２）など異なる種に由来するＰＨ２０がある。
ヒトＰＨ２０（精液表面タンパク質ＰＨ２０としても知られている）は、当然精子−卵子付着に関与しており、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層の精子による貫通を助ける。ＰＨ２０ｍＲＮＡ転写物（配列番号２２４に示した配列のヌクレオチド１０５８〜２５０３に対応）は、通常翻訳されることにより、Ｎ−末端に３５アミノ酸シグナル配列（アミノ酸残基１〜３５位）およびＣ−末端に１９アミノ酸ＧＰＩアンカー（アミノ酸残基４９１〜５０９に対応）を含む５０９アミノ酸前駆体タンパク質を生成する。前駆体配列を配列番号２３２に示す。また、配列番号２２４に示したアミノ酸配列のヌクレオチド２１８８位におけるＣからＴへの突然変異を含むｍＲＮＡ転写物が存在するが、これは配列番号２３２に示した翻訳産物を生じるサイレント突然変異である。したがって、成熟ＰＨ２０は、配列番号２３３に示した４７４アミノ酸ポリペプチドである。配列番号２３２に例示したヒトＰＨ２０のＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０にはヒアルロニダーゼ活性に必要とされる潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位がある。ジスルフィド結合は、システイン残基Ｃ６０およびＣ３５１間およびＣ２２４およびＣ２３８間で形成され（配列番号２３２に示したアミノ酸に対応する）、コアヒアルロニダーゼドメインを形成する。しかしながら、配列番号２３２のアミノ酸３６〜４６４が最小限の活性ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼドメインを含むように、中性酵素触媒活性については追加のシステインがカルボキシ末端に必要とされる。
ウシＰＨ２０は、５５３アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号２６６）である。ウシＰＨ２０とヒトＰＨ２０のアラインメントは、弱い相同性しか示さず、ウシポリペプチドにはＧＰＩアンカーが存在しないため、多数のギャップがアミノ酸４７０から各カルボキシ末端までに存在する（例、Ｆｒｏｓｔ ＧＩ （２００７） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． ４： ４２７−４４０参照）。ヒト以外の他のＰＨ２０種においても、明確なＧＰＩアンカーは予測されていない。例えば、ヒツジおよびウシから製造されたＰＨ２０ポリペプチドは、可溶性形態として存在する。ウシＰＨ２０は原形質膜に非常に緩やかに結合した形で存在するが、それは、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して繋ぎとめられているわけではない（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ． ６５（２）：６２８−３６）。ウシヒアルロニダーゼのこのユニークな特徴により、可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素が臨床用抽出物（Ｗｙｄａｓｅ（登録商標）、Ｈｙａｌａｓｅ（登録商標））として使用されてきた。
２）細菌性ヒアルロニダーゼ
細菌性ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１またはＥＣ４．２．９９．１）は、ヒアルロナン、および程度は様々であるが、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。細菌から単離されたヒアルロナンリアーゼは、ヒアルロニダーゼ（他の供給源から、例、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ＥＣ３．２．１．３５）とは作用方式が異なる。それらは、ヒアルロナンにおけるＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸残基間のβ１→４−グリコシド結合の加水分解ではなく、排除反応を触媒するエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであり、３−（４−デオキシ−β−Ｄ−ｇｌｕｃ−４−エヌロノシル）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンテトラ−およびヘキササッカリド、およびジサッカリド最終生成物をもたらす。反応の結果、その非還元末端に不飽和ヘキスロン酸残基を伴うオリゴ糖が形成される。
本発明による組成物、組み合わせおよび方法で使用される細菌由来の典型的ヒアルロニダーゼには、限定されるわけではないが、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株を含む、微生物におけるヒアルロナン分解酵素がある。上記酵素の特定例としては、限定されるわけではないが、アルトロバクター類（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（ＦＢ２４株）（配列番号２７５）、ブデロビブリオ・バクテリオボルス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）（配列番号２７６）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）（配列番号２７７）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（配列番号２７８）、１８ＲＳ２１（配列番号２７９）、血清型Ｉａ（配列番号２８０）、血清型ＩＩＩ（配列番号２８１）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＣＯＬ株、配列番号２８２）、ＭＲＳＡ２５２株（配列番号２８３および２８４）、ＭＳＳＡ４７６株（配列番号２８５）、ＮＣＴＣ８３２５株（配列番号２８６）、ウシＲＦ１２２株（配列番号２８７および２８８）、ＵＳＡ３００株（配列番号２８９）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（配列番号２９０）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２５５／Ｒ６株（配列番号２９１）、血清型２、Ｄ３９／ＮＣＴＣ７４６６株（配列番号２９２）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（血清型Ｍ１）（配列番号２９３）、血清型Ｍ２、ＭＧＡＳ１０２７０株（配列番号２９４）、血清型Ｍ４、ＭＧＡＳ１０７５０株（配列番号２９５）、血清型Ｍ６（配列番号２９６）、血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ２０９６株（配列番号２９７および２９８）、血清型Ｍ１２、ＭＧＡＳ９４２９株（配列番号２９９）、血清型Ｍ２８（配列番号３００）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）（配列番号３０１〜３０３）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）（ＡＴＣＣ７００６０１／ＥＳ１１４株（配列番号３０４））、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を開裂しないストレプトマイシス・ヒアルロノリティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ヒアルロニダーゼ酵素がある（Ｏｈｙａ， Ｔ． および Ｋａｎｅｋｏ， Ｙ． （１９７０） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９８：６０７）。
３）ヒル、他の寄生生物および甲殻類からのヒアルロニダーゼ
ヒル、他の寄生生物および甲殻類からのヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）は、テトラ−およびヘキササッカリド最終生成物を生成するエンド−β−グルクロニダーゼである。これらの酵素は、ヒアルロネートにおけるβ−Ｄ−グルクロネートおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間のβ１→３結合の加水分解を触媒する。ヒル由来の典型的ヒアルロニダーゼには、限定されるわけではないが、ヒルド科（Ｈｉｒｕｄｉｎｉｄａｅ）（例、ヒルド・メジシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ））、イシビル科（Ｅｒｐｏｂｄｅｌｌｉｄａｅ）（例、ネフェロプシス・オブスクラ（Ｎｅｐｈｅｌｏｐｓｉｓ ｏｂｓｃｕｒａ）およびエルポブデラ・プンクタタ（Ｅｒｐｏｂｄｅｌｌａ ｐｕｎｃｔａｔａ））、グロシフォニ科（Ｇｌｏｓｓｉｐｈｏｎｉｉｄａｅ）（例、デッセロブデラ・ピクタ（Ｄｅｓｓｅｒｏｂｄｅｌｌａ ｐｉｃｔａ）、ヘロブデラ・スタグナリス（Ｈｅｌｏｂｄｅｌｌａ ｓｔａｇｎａｌｉｓ）、グロッシホニア・コンプラナタ（Ｇｌｏｓｓｉｐｈｏｎｉａ ｃｏｍｐｌａｎａｔａ）、プラコブデラ・オルナタ（Ｐｌａｃｏｂｄｅｌｌａ ｏｒｎａｔａ）およびテロミゾン類（Ｔｈｅｒｏｍｙｚｏｎ ｓｐ．））およびヘモピ科（Ｈａｅｍｏｐｉｄａｅ）（ヘモピス・マルモラタ（Ｈａｅｍｏｐｉｓ ｍａｒｍｏｒａｔａ））由来のヒアルロニダーゼがある（Ｈｏｖｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １２４（３）：３１９−２６）。ヒルヒアルロニダーゼと同じ作用機構を有する細菌由来の典型的ヒアルロニダーゼは、シアノバクテリア、シネココッカス類（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（ＲＣＣ３０７株、配列番号３０５）由来のものである。
ｉｉ．他のヒアルロナン分解酵素
ヒアルロニダーゼファミリーに加えて、他のヒアルロナン分解酵素も、本発明による組成物、組み合わせおよび方法において可活性化型マトリックス分解酵素と連係的に使用され得る。例えば、特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼを含む、ヒアルロナン開裂能力を有する酵素が使用され得る。ヒアルロナンを分解し得る典型的コンドロイチナーゼには、限定されるわけではないが、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られている）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られている）およびコンドロイチンＣリアーゼがある。本発明による組成物、組み合わせおよび方法で使用される上記酵素の製造および精製方法は、当業界では周知である（例、米国特許第６０５４５６９号、Ｙａｍａｇａｔａ， ｅｔ ａｌ． （１９６８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４３（７）：１５２３−１５３５； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １６０（３０）：１８４９−１８５７参照）。
コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２酵素、コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２０）およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ４．２．２．２１）（Ｈａｍａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２（１４）：９１２３−３０）を含み、それらは、コンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸タイプの様々なグリコサミノグリカンを分解する。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン−硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸は、コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼにとっては好ましい基質であるが、この酵素はまた低率でヒアルロナンに対して作用し得る。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは、コンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸タイプの様々なグリコサミノグリカンを分解し、最終的にΔ４−不飽和テトラ−およびジサッカリドに分解される異なるサイズのΔ４−不飽和オリゴ糖の混合物を生成する。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼは、同じ基質特異性を有するが、ポリマー性コンドロイチン硫酸およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼにより生成されるそれらのオリゴ糖フラグメントの両方の非還元末端からジサッカリド残基を除去する（Ｈａｍａｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：９１２３−９１３０）。典型的なコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼおよびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼには、限定されるわけではないが、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびフラボバクテリウム・ヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）由来のものがある（プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは配列番号３０６に示されている）（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１（１）：３９−４６）。
コンドロイチンＡＣリアーゼ（ＥＣ４．２．２．５）は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、コンドロイチンおよびヒアルロン酸に対して活性を示すが、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）に対しては活性を示さない。細菌由来の典型的なコンドロイチナーゼＡＣ酵素には、限定されるわけではないが、それぞれ配列番号３０７および３０８に示されたフラボバクテリウム・ヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）およびビクチバリス・バデンシス（Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ ｖａｄｅｎｓｉｓ）、およびアルトロバクター・アウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）由来のものがある（Ｔｋａｌｅｃ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６（１）：２９−３５； Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０（５）：３８７−４４４）。
コンドロイチナーゼＣは、コンドロイチン硫酸Ｃを開裂して、テトラサッカリドと不飽和６−硫酸化ジサッカリド（デルタＤｉ−６Ｓ）を生じる。それはまた、ヒアルロン酸を開裂して、不飽和非硫酸化ジサッカリド（デルタＤｉ−ＯＳ）を生じる。細菌由来の典型的なコンドロイチナーゼＣ酵素には、限定されるわけではないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のものがある（Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＦＥＭＳ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ−Ｌｅｔｔ． ４８（２）：１２１−４； Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９７６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５１：１１５４−８； Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６２：１２７−１３３）。
ｉｉｉ．可溶性ヒアルロナン分解酵素
可溶性ヒアルロニダーゼを含む可溶性ヒアルロナン分解酵素は、マトリックス分解酵素、活性化因子、麻酔薬、血管収縮薬、他の薬剤または治療剤、またはそれらの組み合わせとの共投与または処方により組織中へ拡散させることを目的とする、本発明による方法、組み合わせまたは組成物で使用され得る。可溶性ヒアルロナン分解酵素は、可溶性形態で存在するヒアルロナン分解酵素を全て包含するもので、限定されるわけではないが、ヒアルロニダーゼ、例えばウシＰＨ２０およびヒツジＰＨ２０、その対立遺伝子変異型および他の変異型が含まれる。また、可溶性になるように修飾が加えられたヒアルロナン分解酵素も、可溶性ヒアルロナン分解酵素に含まれる。例えば、ＧＰＩアンカーを含むヒアルロナン分解酵素は、ＧＰＩアンカーの全部または一部分の先端切除および除去により可溶性にされ得る。一例では、通常ＧＰＩアンカーを介して膜に繋ぎとめられているヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０は、Ｃ−末端におけるＧＰＩアンカーの全部または一部分の先端切除および除去により可溶性にされ得る。
また、可溶性ヒアルロナン分解酵素は、中性活性および酸性活性ヒアルロニダーゼも含む。限定されるわけではないが、投与後の酵素の目的活性レベルおよび／または投与部位などの因子によって、中性活性および酸性活性ヒアルロニダーゼは選択され得る。特定の例では、本組成物、組み合わせおよび方法で使用されるヒアルロナン分解酵素は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼである。
可溶性ヒアルロニダーゼの典型例は、ヒアルロニダーゼが可溶性であり、ヒアルロニダーゼ活性を保持しておりさえすれば、任意の種由来のＰＨ２０、例えば配列番号２３２、２３３、２６６、２５１、２６７、２５５、２５７、２７１〜２７４に示したもの、またはＣ−末端ＧＰＩアンカーの全部または一部分を欠くその先端切除形態であり得る。また、配列番号２３２、２３３、２６６、２５１、２６７、２５５、２５７、２７１〜２７４のいずれか、またはその先端切除形態の対立遺伝子変異型または他の変異型も可溶性ヒアルロニダーゼに含まれる。対立遺伝子変異型および他の変異型は、当業者には周知であり、配列番号２３２、２３３、２６６、２５１、２６７、２５５、２５７、２７１〜２７４のいずれか、またはその先端切除形態と６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれより高い配列相同性を有するポリペプチドが含まれる。
典型的には、本発明による組成物、組み合わせおよび方法での使用については、可溶性ヒトＰＨ２０が使用される。他の動物由来のＰＨ２０も利用され得るが、上記調製物は動物タンパク質であるため、それらは潜在的に免疫原性である。例えば、著しい比率の患者が、消化された食物にとって二次的な前感作を示し、これらは動物タンパク質であるため、患者らは全て後続の感作の危険性を有する。すなわち、非ヒト調製物は、長期間の使用には不適切であり得る。非ヒト調製物が所望される場合、上記ポリペプチドは、免疫原性を低下させるように製造され得るものとする。上記修飾は、当業者の技能レベルの範囲内であり、例えば、分子上の１または複数の抗原性エピトープの除去および／または置換が含まれ得る。
本発明方法で使用される、ヒアルロニダーゼ（例、ＰＨ２０）を含むヒアルロナン分解酵素は、遺伝子組換えにより製造され得るか、または天然供給源から、例えば精巣抽出物から精製または部分精製され得る。組換えヒアルロナン分解酵素を含む組換えタンパク質の製造方法については、本明細書の他の箇所に記載しており、当業界では周知である。
１）可溶性ヒトＰＨ２０
例えば、組換えヒトＰＨ２０の可溶性形態は、既に製造されており、マトリックス分解酵素、活性化因子、麻酔薬、血管収縮薬、他の薬剤または治療剤、またはそれらの組み合わせとの共投与または処方により組織中へ拡散させることを目的とする本明細書記載の方法で使用され得る。ＰＨ２０の上記可溶性形態の製造は、関連出願第１１／０６５７１６および１１／２３８１７１号、および下記実施例１２〜１５に記載されている。可溶性形態には、限定されるわけではないが、Ｃ−末端切頭化により、配列番号２３２に示したアミノ酸配列のアミノ酸１〜アミノ酸３４７、３７２、３９４、４１３、４３０、４４７、４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３を含むポリペプチドを生成させるものが含まれる。哺乳類細胞での発現時、３５アミノ酸Ｎ−末端シグナル配列は、プロセッシング中に開裂され、タンパク質の成熟形態が分泌される。すなわち、成熟可溶性ポリペプチドは、配列番号２３２のアミノ酸３６〜３４７、３７２、３９４、４１３、４３０、４４７、４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３を含む。アミノ酸４７７〜４８３位で終わる欠失突然変異体（配列番号２３２に示した前駆体ポリペプチドに対応する）は、完全長ＧＰＩ−アンカー形態よりも高い分泌ヒアルロニダーゼ活性を呈する。したがって、可溶性形態には、限定されるわけではないが、Ｃ−末端切頭化により、それぞれ配列番号２２６〜２３１のいずれかに示したアミノ酸配列のアミノ酸１〜アミノ酸４４２、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７を含むポリペプチド、またはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型を生成させるものが含まれる。一般的に、グリコシル化は、ヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性にとって重要であるため、ＰＨ２０の可溶性形態は、正確なＮ−グリコシル化を促進して、ポリペプチドの活性保持を確実なものにするタンパク質発現系を用いて製造される。上記細胞には、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞）がある。
２）ｒＨｕＰＨ２０
ヒトＰＨ２０の組換え可溶性形態は、既に生成されており、本明細書記載の方法を用いて製造および精製され得る。組換えヒトＰＨ２０の上記可溶性形態の生成は、関連出願第１１／０６５７１６および１１／２３８１７１号、および下記実施例１２〜１５に記載されている。かかるポリペプチドの典型例は、配列番号２２５に示したアミノ酸１〜４８２をコードする核酸分子から生成されたものである。このＰＨ２０の生成、製造および精製については、下記実施例１２〜１５に記載している。製造および精製時にペプチダーゼが培養培地に存在するため、得られた精製ｒＨｕＰＨ２０は不均質であり得る。培養培地から製造されたとき、Ｃ−末端が不均質な状態であるため、ｒＨｕＰＨ２０と呼ばれる生成物は、配列番号２２６〜２３１のいずれか１つまたはそれ以上を様々な存在量で含み得る種類の混合物を含むことになる。一般的に、グリコシル化は、ヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性にとって重要であるため、ＰＨ２０の可溶性形態、例えばｒＨｕＰＨ２０は、正確なＮ−グリコシル化を促進して、ポリペプチドの活性保持を確実なものにするタンパク質発現系を用いて製造される。上記細胞には、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞）がある。
ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、特にｒＨｕＰＨ２０などの可溶性ＰＨ２０は、本明細書の他の箇所に記載した適切な経路により投与され得る。典型的には、投与は、非経口投与、例えば皮内、筋肉内、皮下または血管内投与によるものである。本発明による化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、保存剤が添加された単位用量形態、例えばアンプルまたは多用量容器で提供され得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、調剤に必要な薬剤、例えば懸濁、安定および／または分散剤を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に、適切な賦形剤、例えば発熱物質不含有滅菌水または他の溶媒により再構成される粉末形態であり得る。例えば、本発明は、安定した溶液または懸濁液中に有効量の可溶性ＰＨ２０、例えば１０単位〜５０００００単位、１００単位〜１０００００単位、５００単位〜５００００単位、１０００単位〜１００００単位、５０００単位〜７５００単位、５０００単位〜５００００単位または１０００単位〜１００００単位、一般的には１００００〜５００００単位を含有する非経口製剤またはそこから凍結乾燥したものを提供する。処方物は、単位用量形態、例えば、限定されるわけではないが、アンプル、注射器および個別包装した錠剤またはカプセル剤で提供され得る。分散剤は、１〜１００ｍｌ、１〜５０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、１０〜３０ｍｌ、１〜２０ｍｌまたは１〜１０ｍｌ、典型的には１０〜５０ｍｌの総量中で単独または他の薬理学的有効薬剤と共に投与され得る。
併用療法の一例では、麻酔薬、血管収縮薬および分散剤を、それらと逐次的、同時または断続的に投与されるべき可活性化型マトリックス分解酵素および／または活性化因子と共投与または処方することが考えられる。典型的な製剤は、リドカイン、エピネフリンおよび可溶性ＰＨ２０、例えば、配列番号２２６に示した可溶性ＰＨ２０を含むものである。可溶性ＰＨ２０は、リドカイン（キシロカイン）および所望によるエピネフリンと直接混合され得る。処方物は、単位用量形態、例えば注射器で製造され得る。例えば、リドカイン／エピネフリン／可溶性ＰＨ２０製剤は、使用される注射器に予め包装された状態で、例えば１〜１００ｍｌ、１〜５０ｍｌ、１０〜５０ｍｌ、１０〜３０ｍｌ、１〜２０ｍｌまたは１〜１０ｍｌ、典型的には１０〜５０ｍｌの量で提供され得る。
併用療法では、他の薬剤、例えばリドカイン／エピネフリン／可溶性ＰＨ２０製剤は、可活性化型マトリックス分解酵素（および活性化因子）の投与と同時または時間的に接近して併用投与され得る。典型的には、好ましくは、麻酔薬および／または分散剤は、薬剤投与の直前（例、５〜６０分前）または、最も好都合には一緒に投与される。当業者にとって、併用投与をどの程度接近して実施するのが望ましいかは、かなりの部分、個々の組織設定における薬剤の有効半減期および処置されている個々の疾患に左右され、適切なモデルにおいて、例えば適切な動物モデルにおいて、様々な時点での薬剤投与の効果を試験することにより容易に最適化され得ることは明らかなことである。
ｉｖ．薬物動態特性を改善するためのヒアルロナン分解酵素の修飾
ヒアルロナン分解酵素に修飾を加えることにより、それらの薬物動態特性を改善し得、例えば、それらのインビボ半減期および／または活性を増加させることができる。本発明による組成物、組み合わせおよび／または方法で使用されるヒアルロナン分解酵素の修飾では、例えば、リンカーを介して直接的または間接的に、例えば共有結合的または他の安定した結合により、ポリマー、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール（ペグ化（ＰＥＧ））またはシアリル部分、または他の上記ポリマー、例えば天然または糖ポリマーを結合させ得る。
治療薬のペグ化は、タンパク質加水分解に対する抵抗性を増し、血漿半減期を延ばし、抗原性および免疫原性を減少させることが知られている。したがって、ヒアルロナン分解酵素へのポリマー分子、例えばポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）の共有結合または他の安定した結合（共役）は、生成する酵素−ポリマー組成物に有益な特性を付与し得る。上記特性としては、改善された生物適合性、血液、細胞および／または対象内の他の組織におけるタンパク質（および酵素活性）半減期の伸長、プロテアーゼおよび加水分解からのタンパク質の効果的な保護、改善された生体分布、高い薬物動態および／または薬力学的特性、水に対する高い溶解度が挙げられる。
ヒアルロナン分解酵素に結合され得る典型的ポリマーには、天然および合成ホモポリマー、例えばポリオール類（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン類（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボキシル酸類（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）、およびさらなるヘテロポリマー、すなわち１個または複数個の異なるカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーがある。適切なポリマー分子の例には、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えばポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、例えばポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）分枝状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン、ヘパリン、相同性アルブミン、セルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの加水分解物、澱粉、例えばヒドロキシエチル−澱粉およびヒドロキシプロピル−澱粉、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアールガム、プルラン、イヌリン、キサン、カラゲーニン、ペクチン、アルギン酸加水分解物および生体高分子から選択されるポリマー分子がある。
典型的には、ポリマーは、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えばポリエチレンオキシド、例えばＰＥＧ、典型的にはｍＰＥＧであり、デキストラン、プルランなどの多糖類と比べると、架橋し得る反応基を僅かしかもたない。典型的には、ポリマーは、比較的単純な化学作用を用いてヒアルロナン分解酵素に（例、タンパク質表面上の結合基に）共有結合され得る非毒性ポリマー分子、例えば（ｍ）ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
ヒアルロナン分解酵素への結合に適切なポリマー分子には、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ誘導体、例えばメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分枝状ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）がある（例、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ ２００２， ５４： ４５９−４７６； Ｈａｒｒｉｓ および Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｓ（編） “Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙ１ｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０， １９９７； Ｍｅｈｖａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｓｃｉ．， ３（１）：１２５−１３６， ２０００； Ｈａｒｒｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２：２１５ および次参照 （２００３）； および Ｔｓｕｂｅｒｙ， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７９（３７）：３８１１８−２４， ２００４参照）。ポリマー分子は、典型的には約３ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。一部の実施態様では、ｒＨｕＰＨ２０などのタンパク質に結合され得るポリマー分子は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６０ｋＤａを超える分子量を有する。
ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体の共有結合（コンジュゲーション）によるポリペプチドの様々な修飾方法（すなわち、「ＰＥＧ化」）は、当業界では周知である（例、米国特許第５６７２６６２号および同第６７３７５０５号および米国特許公開第２００６／０１０４９６８および２００４／０２３５７３４号参照）。ＰＥＧ化技術には、限定されるわけではないが、特定化リンカーおよびカップリング化学作用（例、Ｈａｒｒｉｓ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５４：４５９−４７６， ２００２参照）、単一コンジュゲーション部位への多ＰＥＧ部分の結合（例えば、分枝状ＰＥＧ部分の使用による；例、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １２：１７７−１８０， ２００２参照）、部位特異的ＰＥＧ化および／またはモノＰＥＧ化（例、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：７８０−７８３， １９９９参照）および位置指定酵素的ＰＥＧ化（例、Ｓａｔｏ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５４：４８７−５０４， ２００２参照）がある（また、例えば、Ｌｕ および Ｆｅｌｉｘ （１９９４） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４３：１２７−１３８； Ｌｕ および Ｆｅｌｉｘ （１９９３） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ６：１４２−６， １９９３； Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ４６：２５３−６４； Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３３９８−４０４； Ｂｒｕｍｅａｎｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：３０８８−９５参照； また、Ｃａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５５（１０）：１２６１−７７およびＭｏｌｉｎｅｕｘ （２００３） Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２３ （８ Ｐｔ ２）：３Ｓ−８Ｓも参照）。当業界で報告された方法および技術は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多いＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体が単一タンパク質分子に結合したタンパク質を生成し得る（例、米国特許公開第２００６／０１０４９６８号参照）。
多数のＰＥＧ化用試薬が当業界では報告されている。上記試薬には、限定されるわけではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル・３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ２官能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分枝状ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーレス」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳ、およびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳがある（例、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：６２−６９， １９９５； Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １２：１９７−２０７， １９９７； 米国特許第５，６７２，６６２号； 米国特許第５，９３２，４６２号； 米国特許第６，４９５，６５９号； 米国特許第６，７３７，５０５号； 米国特許第４，００２，５３１号； 米国特許第４，１７９，３３７号； 米国特許第５，１２２，６１４号； 米国特許第５，１８３，５５０号； 米国特許第５，３２４， ８４４号； 米国特許第５，４４６，０９０号； 米国特許第５，６１２，４６０号； 米国特許第５，６４３，５７５号； 米国特許第５，７６６，５８１号； 米国特許第 ５，７９５，５６９号； 米国特許第５，８０８，０９６号； 米国特許第５，９００，４６１号； 米国特許第５，９１９，４５５号； 米国特許第５，９８５，２６３号； 米国特許第５，９９０，２３７号； 米国特許第６，１１３，９０６号； 米国特許第６，２１４，９６６号； 米国特許第６，２５８，３５１号； 米国特許第６，３４０，７４２号； 米国特許第６，４１３，５０７号； 米国特許第６，４２０，３３９号； 米国特許第６，４３７，０２５号； 米国特許第６，４４８，３６９号； 米国特許第６，４６１，８０２号； 米国特許第６，８２８，４０１号； 米国特許第６，８５８，７３６号； 米国特許公開第２００１／００２１７６３号； 米国特許公開第２００１／００４４５２６号； 米国特許公開第２００１／００４６４８１号； 米国特許公開第２００２／００５２４３０号； 米国特許公開第２００２／００７２５７３号； 米国特許公開第２００２／０１５６０４７号； 米国特許公開第２００３／０１１４６４７号； 米国特許公開第２００３／０１４３５９６号； 米国特許公開第２００３／０１５８３３３号； 米国特許公開第２００３／０２２０４４７号； 米国特許公開第２００４／００１３６３７号； 米国特許公開第２００４／０２３５７３４号； 米国特許公開第２００５／０００３６０号； 米国特許公開第２００５／０１１４０３７号； 米国特許公開第２００５／０１７１３２８号； 米国特許公開第２００５／０２０９４１６号； 欧州特許第０１０６４９５１号； 欧州特許第０８２２１９９号； 国際公開第００１７６６４０号； 国際公開第０００２０１７号； 国際公開第０２４９６７３号； 国際公開第９４２８０２４号； および国際公開第０１８７９２５号参照）。
一例において、本発明方法、組成物および組み合わせで使用されるヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化された可溶性ヒアルロニダーゼである。一特定例では、可溶性ヒアルロニダーゼはＰＥＧ化ＰＨ２０ヒアルロニダーゼである。別の特定例では、可溶性ヒアルロニダーゼはＰＥＧ化ｒＨｕＰＨ２０である。
Ｇ．可活性化型マトリックス分解酵素の包装および製造物品
選択されたマトリックス分解酵素または選択されたマトリックス分解酵素をコードする核酸、またはその誘導体または変異型の医薬化合物は、包装材、疾患または障害の処置に有効な医薬組成物、および選択されたマトリックス分解酵素または核酸分子が疾患または障害の処置に使用されることを示すラベルを含む製造物品として包装され得る。選択されたマトリックス分解酵素またはその誘導体または変異型および活性化因子の組み合わせも製造物品中に包装され得る。
本発明が提供する製造物品は、包装材を含む。医薬品の包装に使用される包装材は当業界では周知である。例えば、米国特許第５３２３９０７、５０５２５５８および５０３３２５２号参照、それぞれについて、出典明示により援用する。医薬包装材の例としては、限定されるわけではないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、注射器、ボトル、および選択された製剤および意図された投与および処置方式に適切な包装材が挙げられる。製造物品は、局所注射目的の場合に投与（例、表皮下投与）し易くするため針または他の注入装置を含み得る。本発明化合物および組成物の広範な一連の製剤は、ＥＣＭ介在疾患または障害に対する様々な治療薬であるものとして考えられる。
包装の選択は、マトリックス分解酵素および活性化因子、および上記組成物が一緒に包装されるか別々に包装されるかにより変わってくる。一般に、可活性化型マトリックス分解酵素の活性化が活性化因子の添加前に起こらないように、包装材はそこに含まれる組成物とは非反応性である。一例では、可活性化型マトリックス分解酵素は、活性化因子との混合物として包装され得る。すなわち、例えば、活性化に低ｐＨを必要とするリソソーム酵素（例、カテプシンＬ）は、緩衝酸性溶液との混合物としてパッケージされ得る。
別の例では、成分は、混合することにより、マトリックス分解酵素を活性化させる別々の組成物として包装され得る。例えば、マトリックス分解酵素を含む組成物を、活性化因子を含む組成物、例えば緩衝酸性溶液と別々に提供し、一緒に使用し得る。したがって、上記の例では、可活性化型マトリックス分解酵素を、活性化因子とは別の容器中にパッケージし、使用時に活性化因子に暴露することにより活性化を達成する。活性化因子への暴露は、投与に先行するいずれかの時点で酵素に活性化因子を暴露することにより行われ得る。例えば、容器は、マトリックス分解酵素を含み、例えば区画における開口部を通して、使用者が活性化因子を添加し易いような形をとる単一区画を有し得る。マトリックス分解酵素を封入するための限定された空間を有し、簡単な操作で活性化に必要な最終成分を添加し得る形をとる容器または他の製造物品は全て、本発明に含まれるものとする。使用前に、活性化因子を添加する。また、活性化因子への暴露は、間質への投与後に行われ得る。例えば、熱が活性化因子である場合、マトリックス分解酵素を投与し、局所注射部位を熱に暴露させ得る。これに代わる例では、酸性緩衝液を間質に投与後、マトリックス分解酵素、例えば活性化に酸性ｐＨを必要とするもの、例えばカテプシンを投与し得る。
他の例では、使用者が意のままに容器中でマトリックス分解酵素を活性化できるように、可活性化型マトリックス分解酵素を活性化因子と共に容器にパッケージする。一般的に、上記容器の例には、マトリックス分解酵素を含む密閉された限定空間、および活性化因子を含む別の密閉された限定空間を有するものがあり、この場合、２空間は、除去されることにより、成分が混合されて反応が起こり、その結果プロテアーゼの活性化を誘発し得る容易に除去可能な膜により分離された形をとる。マトリックス分解酵素が活性化因子と分離されておりさえすれば、本発明はいかなる容器または他の製造物品でも包含するものとする。マトリックス分解酵素への活性化因子の暴露は使用前に行う。例えば、物理的分離手段は、使用者により容易に除去されることにより、成分を混合させて酵素の活性化をもたらすものである。例えば、製造物品は、１区画にマトリックス分解酵素および隣接区画に活性化因子を含み得る。区画は、分割材、例えば膜により分離されており、製造物品に圧力を加えてこれを破裂させることにより、分離されていた成分を混合させ得る。適切な実施態様については、例えば、米国特許第３５３９７９４および５１７１０８１号記載の容器参照。
以下、可活性化型マトリックス分解酵素の様々な最終用途の包装必要条件の若干の例を示す。これらは単なる例に過ぎず、いかなる意味にせよ、限定を意図したものではない。
１．単一チャンバー装置
本発明による最も単純な実例としては、装置が単一チャンバーまたは容器および必要ならば射出手段を含むものがある。単一チャンバーハウジングまたは容器は、マトリックス分解酵素が容器に含まれるアイテムを包含する。マトリックス分解酵素は、液相中または粉末または他のペーストまたは他の好都合な組成物として容器に収容される。使用直前に活性化因子成分を導入する。使用前に、典型的には緩衝液として提供される活性化因子を加え、マトリックス分解酵素と接触させることにより、マトリックス分解酵素を混合および／または再構成させ得る。例えば、所望時およびマトリックス分解酵素によっては、適切な緩衝液または酸性緩衝液または活性化条件を含む他の溶液中にＣａ２＋を含む液体、例えばＣａ２＋を含む混合物を容器に加える。また本発明は、上記アイテムおよび活性化因子を含むキットも提供する。
２．２区画チャンバー装置
本発明で使用される装置の一例は、２区画チャンバー容器である。一般に、この装置は、２つのチャンバーまたは区画を有することにより、活性化が所望されるまで活性化因子からマトリックス分解酵素を離した状態で維持する。この装置は、装置から分配する前に成分を混合させ得る混合チャンバーを含み得る。別法として、第１チャンバーから、可活性化型マトリックス分解酵素を含む第２チャンバーへの活性化因子の射出によりそれらを混合させ得る。例えば、可活性化型マトリックス分解酵素を凍結乾燥形態で提供し、第１チャンバーから、凍結乾燥酵素を含む第２チャンバーへ活性化因子、例えば酸性緩衝液を射出することにより再構成を達成させ得る。
一実施態様では、２区画チャンバー装置は、その中で稼働する機械的ポンプ機構を採用している。かかる一例では、分注装置は、成分を別々のチャンバーで維持する。ポンプ機構は、各チャンバーから混合チャンバーへ、または第１チャンバーから第２チャンバーへ内容物を引き出すように操作される。混合時、チャンバー中における成分の反応により混合組成物は活性化される。ポンプ機構は手動により、例えばプランジャーにより操作され得る。上記の２区画チャンバー装置の例には、２区画チャンバー注射器も含まれる（例、米国特許第６，９７２，００５、６，６９２，４６８、５，９７１，９５３、４，５２９，４０３、４，２０２，３１４、４，２１４，５８４、４，９８３，１６４、５，７８８，６７０、５，３９５，３２６号および国際特許出願第ＷＯ２００７００６０３０およびＷＯ２００１０４７５８４号参照）。
本発明で使用される２区画チャンバー流体分注装置の別の実施態様は、圧縮可能なボトルまたはチューブまたは他の同様の装置の形態をとる。この装置は、内部に成分を分離させた状態に保つ２区画を有する。装置のキャップは、混合チャンバーとしての役割を果たし得、混合チャンバーは、２チャンバーとキャップの間に配置され得るか、またはチャンバーのうちの一つの中で混合を行わせ得る。別々の区画から混合チャンバーへ圧縮することにより、成分を押し出す。次いで、それらを混合チャンバーから分注させる。例えば、プランジャー／注射装置をディスペンサーの端に取り付け、内容物をそこから引き出すことにより、混合された内容物を装置から取り出し得る。上記装置は当業界では公知である（例、国際特許出願第ＷＯ１９９４０１５８４８号参照）。
３．キット
選択されたマトリックス分解酵素、活性化因子および／またはその製造物品はまた、キットとしても提供され得る。キットは、本明細書記載の医薬組成物および製造物品として提供される投与用アイテムを含み得る。例えば、選択されたマトリックス分解酵素は、投与用装置、例えば注射器、吸入器、投薬用カップ、スポイトまたはアプリケーターにより供給され得る。組成物は、投与用アイテムに含まれ得るか、または別々に提供されて後で添加され得る。一般的に、キットは、マトリックス分解酵素を伴うアイテム、および活性化条件を含む活性化因子組成物を含む。キットは、所望により、投薬量、投薬レジメンを含む適用に関する指示書および投与方式についての指示書を含み得る。キットはまた、本明細書記載の医薬組成物および診断用アイテムを含み得る。例えば、上記キットは、対象における選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性測定用アイテムを含み得る。
Ｈ．マトリックス分解酵素の活性の評価方法
１．酵素活性の評価方法
可活性化型マトリックス分解酵素は、既知基質に対するそれらの酵素活性について試験され得る。活性評価は、活性化因子の存在下または非存在下で実施され得る。また活性評価は、様々な条件下で、例えば活性化に使用される活性化因子の量を変えることにより実施され得る。一例では、ｐＨプロファイリングを実施することにより、様々なｐＨ条件下での酵素の相対活性を測定し得る（例、Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４：９３−９８参照）。活性評価は、条件培地または他の上清で、または精製タンパク質で実施され得る。
酵素活性は、酵素の既知基質を用いて基質開裂について検定することにより評価され得る。基質は、精製タンパク質の形態であるか、またはペプチド基質として提供され得る。例えば、カテプシンＬの酵素活性は、アゾカゼイン、コラーゲン、エラスチン、ヒト血清アルブミンおよびｒＨｕＰＨ２０などの精製タンパク質を個々にＡＤＭＥと、または２種またはそれ以上の精製タンパク質の混合物としてインキュベーションすることによるそれらのタンパク質の開裂により評価され得る。酵素による精製タンパク質の開裂は、限定されるわけではないが、ＨＰＬＣ、ＣＥ、質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、免疫組織化学法、免疫沈降法、ＮＨ２−末端配列決定法およびタンパク質標識法を含む任意のタンパク質検出方法を用いて評価され得る。
基質における発蛍光基の使用により、開裂が検出し易くなる。例えば、基質は、ＡＣＣ−または７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）−テトラペプチドなどのペプチド基質の発蛍光標識テトラペプチドとして提供され得る。他の発蛍光基も知られており、タンパク質またはペプチド基質へのカップリングに使用され得る。これらの例としては、７−アミノ−４−メチル−２−キノリノン（ＡＭｅｑ）、２−ナフチルアミン（ＮＨＮａｐ）および７−アミノ−４−メチルクマリン（ＮＨＭｅｃ）およびフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）がある（Ｓａｒａｔｈ ｅｔ ａｌ． “Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ” 、 Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ． Ｂｅｙｎｏｎ および Ｊｕｄｉｔｈ Ｓ． Ｂｏｎｄ 編． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１、４５−７６頁）。典型的な発蛍光性ペプチド基質があるなど、ペプチド基質は当業者には周知である。例えば、カテプシンＢについての典型的基質には、Ｎ−αＢＺ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ、ＤＮＡ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎｐｈ−Ｌｅｕ、Ｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｆ３ＭＣＡ、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＢＮＡ、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃ、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃおよびＺ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣおよび例えば異なる発蛍光基を有するその変異型がある。別の例では、カテプシンＬについての典型的基質には、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃおよびＺ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、およびＺ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、および例えば異なる発蛍光基を有するその変異型がある。すなわち、カテプシンＢおよびカテプシンＬは同じ基質、例えばＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃおよびＺ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣを共有するため、カテプシンＬの活性評価はカテプシンＢに対する特異的阻害剤の存在下で実施され得る。上記阻害剤の典型例はＣＡ−０７４である。これについては本明細書実施例９で具体的に示している。蛍光強度により酵素活性を測定する酵素検定法は、標準的であり、典型的には酵素と基質のインキュベーション時間の関数として実施される（例、Ｄｅｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２４：９３−９８； Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ８０：５３６−５６１参照）。
発蛍光性化合物の検出は蛍光計を用いて達成され得、検出は当業者に周知の様々な他の方法により達成され得る。すなわち、例えば、発蛍光団が可視波長で放射するとき、検出は、光源による励起に応答した蛍光を目視検査するだけでよい。また検出は、デジタイザーまたは他の画像取得システムにインターフェースで連結されたビデオカメラを用いる画像解析手段によるものであり得る。検出はまた、蛍光顕微鏡下におけるフィルターを通した視覚化により行われ得る。顕微鏡は、操作者により簡単に視覚化されるシグナルを提供し得る。別法として、シグナルは、写真フィルムまたはビデオ解析システムを用いて記録され得る。またシグナルは、画像解析システムまたは光度計を用いてリアルタイムで簡単に定量され得る。
すなわち、例えば、試料の酵素活性に関する基本的検定法では、試料を緩衝液（検定されている特定プロテアーゼの最適ｐＨおよびイオン強度で）に懸濁または溶解し、緩衝液に発蛍光性酵素ペプチドインジケーターを添加し、例えばＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２７３６４に示された要領で、特定インキュベーション温度で分光蛍光計を用いることにより生じた蛍光変化をモニターする。分光光度計を、発蛍光団の励起波長で発蛍光団を励起し、発蛍光団の放射波長でシグナルを検出するように設定する。発蛍光性酵素インジケーターは、プロテアーゼによるインジケーターの開裂により蛍光が変化する酵素の（例、プロテアーゼの）基質配列である。酵素活性は、典型的には、様々な濃度の発蛍光性基質により作成された標準曲線に基づいた標準単位／ｍｌとして表され、比活性は単位／ｍｇ（タンパク質）として表される。
２．ＥＣＭ分解の評価方法
限定されるわけではないが、上記のもの、例えばカテプシンＬを含む、マトリックス分解酵素による細胞外マトリックスタンパク質の分解は、インビトロまたはインビボで評価され得る。上記評価についての検定法は当業者には周知であり、限定されるわけではないが、コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびプロテオグリカンを含む様々な細胞外マトリックスタンパク質に対する様々なマトリックス分解酵素の活性を試験するのに使用され得る。
ａ．インビトロ検定法
典型的なインビトロ検定法には、マトリックス分解酵素とのインキュベーション後における細胞外マトリックスタンパク質の分解産物を評価する検定法がある。一部の例では、検定法により、単一の特異的分解産物を検出する。他方、検定法により、多数の分解産物を検出する場合もあり、その同一性が判明している場合も判明していない場合もあり得る。分解産物の評価は、限定されるわけではないが、ＨＰＬＣ、ＣＥ、質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、免疫組織化学法、免疫沈降法、ＮＨ２−末端配列決定法およびタンパク質標識法を含む当業界で周知の方法を用いて実施され得る。細胞外マトリックス分解産物は、例えば、適温で適量の時間マトリックス分解酵素とインキュベーションした後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により視覚化され得る。例えば、コラーゲンを活性化カテプシンＬとインキュベーションし、例えば４〜２０％トリス／グリシンゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることにより、生成物を分離することができる。ゲルのクーマシー染色により、無傷のコラーゲンと比べて小さな分解産物でも、またはコラーゲンバンドの消失でも容易に視覚化される。例えば、細胞外マトリックスタンパク質に特異的なポリクローナルＩｇを用いる免疫ブロッティングも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後の分解産物の視覚化に使用され得る。
また、細胞外マトリックスタンパク質の分解後の単一生成物を特異的に検出する検定法は、当業界では周知であり、細胞外マトリックスタンパク質に対するマトリックス分解酵素の分解能力の評価に使用され得る。例えば、ヒドロキシプロリン（ＨＰ）検定法は、コラーゲンの分解の測定に使用され得る。４−ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの重量の約１２％を構成する修飾イミノ酸である。ＨＰ検定法は、マトリックス分解酵素、例えば活性化カテプシンＬとのインキュベーション後の上清におけるＨＰの量を測定することにより可溶化コラーゲンの量を決定する（例、下記実施例２、および Ｒｅｄｄｙ および Ｅｎｗｅｍｅｋａ （１９９６） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：２２５−２２９参照）。ＨＰの測定は、例えば、比色分析法、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法および酵素的方法により実施され得る（例、Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １０４：１６１−１６７； Ｇｒｅｅｎ （１９９２） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１：２６５−２６９； Ｔｒｅｄｇｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９０：２５９−２６５； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５１：５１０−５１４； Ｇａｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７３：３２３４７−３２３５２ 参照）。
上記インビトロ検定法で使用されるコラーゲン供給源には、限定されるわけではないが、市販されている精製コラーゲン、骨粒、皮膚、軟骨およびラット尾腱が含まれ得る。カテプシンＬなどのマトリックス分解酵素のコラーゲン分解活性は、活性化酵素を不溶性コラーゲン懸濁液とインキュベーションした後、例えばＨＣｌなどで加水分解することにより評価され得る。可溶化（分解された）コラーゲンから誘導されたヒドロキシプロリンの量は、例えばエールリッヒ試薬とのインキュベーション後に５５０ｎｍでの吸光度を測定する分光測光法により測定され得る。一部の例では、コラーゲン供給源は、麻酔した動物から外科的に切除し、次いでまず酸性溶液、次いでマトリックス分解酵素、例えばカテプシンＬで灌流したラットまたはブタの皮膚外植片である（例、下記実施例３〜４参照）。次いで、灌流液中のＨＰレベルを評価し得る。この方法の修正法では、外植片における線維性中隔に対する例えばカテプシンＬの効果を評価し得る（例、実施例５参照）。簡単に述べると、マトリックス分解酵素での灌流後、外植片を小片に切断し、パラフィンに埋封し、コラーゲンを視覚化するためのマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）トリクローム染色後、顕微鏡により分析する。コラーゲン線維性中隔の数は、視覚化され、マトリックス分解酵素で処置されなかった組織と比較され得る。
特異的コラーゲン分解の検出検定法もまた当業界では周知である。上記検定法では、免疫学的方法を用いることにより、特異的コラーゲンに特有な分解産物を検出することができる。例えば、マトリックス分解酵素によるコラーゲンＩの分解により、免疫検定法を用いて検出され得る異なるエピトープをもつテロペプチドが放出される。上記検定法は、それぞれ特有のエピトープを含む、架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴｘ）および架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴｘおよびＩＣＴＰ）を検出する。典型的には、ＣＴｘ検定法は、α１鎖のＣ−末端テロペプチド領域において、アスパラギン酸がβ−異性体化立体配置をとっている８アミノ酸配列ＥＫＡＨＤ−β−ＧＧＲオクタペプチドを認識する ＣｒｏｓｓＬａｐｓ（Ｎｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を利用する（Ｅａｓｔｅｌｌ （２００１） Ｂｏｎｅ Ｍａｒｋｅｒｓ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ， ４０頁）。また、ＩＣＴＰを検出する免疫検定法も当業界では周知であり、コラーゲンＩ分解の検出に使用され得る（米国特許第５５３８８５３号）。他の例では、免疫検定法、例えばＥＬＩＳＡを用いることにより、コラーゲンＩ型とプロテアーゼ、例えばカテプシンＫ、Ｓ、ＬおよびＢとのインキュベーション後にＮＴｘが検出され得る（Ａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｂｏｎｅ， ２６：２４１−２４７）。分解したコラーゲンに特異的な他の抗体および検定法も当業界では周知であり、マトリックス分解酵素による分解の検出に使用され得る。これらは、分解されたコラーゲンＩ（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３６：４２１−４２６）、コラーゲンＩＩ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：１７２２−１７３２）、コラーゲンＩＩＩ（米国特許第５３４２７５６号）およびコラーゲンＩＶ（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８５：２９４−６）に特異的な抗体および検定法を含む。
ｂ．インビボ検定法
ＥＣＭのインビボ分解を検出する検定法もまた、当業界では周知である。上記検定法では、上記方法を利用することにより、例えば、尿、血液、血清および組織などの生物試料中におけるヒドロキシプロリンおよびＮ−およびＣ−テロペプチドおよび分解されたコラーゲンまたは他のＥＣＭを検出することができる。分解されたＥＣＭの検出は、１種またはそれ以上のマトリックス分解酵素を患者へ投与した後に実施され得る。また、ピリジノリン（ＰＹＤ）およびデオキシピリジノリン（ＤＰＹＤ）の検出を用いることにより、コラーゲンの分解を評価することができる。それぞれヒドロキシリシルピリジノリンおよびリシルピリジノリンとしても知られているＰＹＤおよびＤＰＹＤは、Ｉ型コラーゲン鎖を安定させる２つの非還元性３価架橋であり、成熟コラーゲン原線維の分解中に放出される。ピリジノリンは、骨および軟骨に多く存在し、デオキシピリジノリンは、ほぼ骨に限られている。ＩＩＩ型コラーゲンはまた、アミノ末端にピリジノリン架橋を含む。全ＰＹＤおよびＤＰＹＤは、例えば、逆相ＨＰＬＣ後の蛍光計検出により加水分解尿試料または血清中で測定され得る（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍｉｃａ． Ａｃｔａ． ２３５：２２１−２２７）。
ｃ．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルを用いることにより、マトリックス分解酵素の活性を評価し得る。例えば、非ヒト動物は、ある疾患または状態についてのモデルとして使用され得る。非ヒト動物には、マトリックス分解酵素投与前に病気および／または表現型誘導物質が注射され得る。遺伝モデルも有用である。１または複数遺伝子の過剰発現、発現不足またはノックアウトにより病気または状態を模倣する動物、例えばマウスが作製され得る。例えば、限定されるわけではないが、ペーロニー病（Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ７１：１５６８−１５７７）、腱症（Ｗａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｂｒ． Ｊ． Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． ４１：２３２−２４０）および硬皮症（Ｙａｍａｍｏｔｏ （２００５） Ｃｕｒ． Ｒｈｅｕｍ． Ｒｅｖ． １：１０５−１０９）を含む状態に関する動物モデルが当業界では知られている。
また、非ヒト動物を用いることにより、非罹患動物でマトリックス分解酵素のインビボ活性が試験され得る。例えば、マトリックス分解酵素は、非ヒト動物、例えばマウス、ラットまたはブタに投与され得、ＥＣＭ分解レベルが測定され得る。若干の例では、動物を用いて、例えば上記および下記実施例３〜５記載のものなど、ＥＣＭ分解のエクスビボ評価用の外植片を得る。他の例では、ＥＣＭ分解をインビボで評価する。一例では、麻酔ラットの皮膚のコラーゲン分解を評価する（例、下記実施例６参照）。簡単に述べると、ｐＨ５の緩衝液中のマトリックス分解酵素、例えばカテプシンＬを、針の挿入により尾の皮膚の真皮層へ灌流させる。灌流液フラクションを尾の皮膚から集め、ヒドロキシプロリン分析によりコラーゲン分解について分析する。限定されるわけではないが、上記検定法のいずれか、例えば特異的分解産物を検出する免疫検定法を含め、他の方法も分解の検出に使用され得る。皮膚への最適活性を促す酸性溶液、例えばカテプシンＬ含有緩衝液投与の効果は、非ヒト動物モデルで評価され得る（例、実施例７参照）。ｐＨ変化に敏感な染料、例えばフェノールレッドはこれらの目的に使用され得る。
Ｉ．ＥＣＭ疾患または欠損の典型的処置方法
本発明による可活性化型マトリックス分解酵素は、いずれか１つまたはそれ以上のＥＣＭ成分が介在する状態の処置に使用され得る。この項では、可活性化型マトリックス分解酵素の典型的な使用および投与方法について説明する。記載したこれらの治療法は典型的なものであり、酵素の適用を制限するものではない。上記方法には、限定されるわけではないが、いずれか１つまたはそれ以上のＥＣＭ成分の過剰、異所的または蓄積発現により誘発されるＥＣＭ状態または疾患の処置方法が含まれる。処置される疾患または状態の典型例は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンまたはグリコサミノグリカン、例えばプロテオグリカンが介在するものである。例えば、コラーゲン介在疾患または状態の典型例には、限定されるわけではないが、セルライト、デュピュイトラン症候群（デュピュイトラン拘縮とも呼ばれる）、ペーロニー病、有痛性肩拘縮症、慢性腱症または腱の瘢痕組織、限局型硬皮症およびリンパ水腫がある。担当医であれば、上記疾患または状態を識別できるはずである。
処置される特定の疾患または状態により、選択される可活性化型マトリックス分解酵素は必然的に決まる。例えば、コラーゲン介在疾患または障害の処置は、コラーゲンを開裂するマトリックス分解酵素の投与により実施され得る。上記マトリックス分解酵素は、上記表３に列挙されており、そして／または当業者には周知である。可活性化型マトリックス分解酵素、および活性化システムおよび方法は、特定の疾患または状態の処置に応じて選択され得る。例えば、システインおよびアスパラギン酸ファミリーのカテプシンは、上記酸性ｐＨ条件により一時的に活性化され得る。すなわち、一例において、コラーゲンを開裂するカテプシン、例えばカテプシンＬを、例えば酸性ｐＨなどの活性化条件の存在下で投与することにより、コラーゲン介在疾患または状態が処置され得る。
可活性化型マトリックス分解酵素による疾患および状態の処置は、限定されるわけではないが、皮下注射、筋肉内、内皮、経口および局所および経皮投与を含む本明細書記載の適切な処方物を用いた適切な投与経路により実施され得る。上記のとおり、典型的には可活性化型マトリックス分解酵素の投与経路は、直接的な患部への皮膚下投与をもたらすものが選択される。上記投与経路の典型例には、限定されるわけではないが、皮下、筋肉内または皮内経路がある。
必要な場合、特定の投薬量および持続時間および処置プロトコルは、経験的に決定または補外され得る。例えば、組換えおよび天然活性マトリックス分解酵素または可活性化型マトリックス分解酵素の具体例としての用量は、適切な用量を決定するための出発点として使用され得る。用量レベルは、例えば個体の体重、全般的健康状態、年齢、使用される特定化合物の活性、性別、食餌療法、投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および経過、および患者の病気に対する素因および担当医の判断などの様々な因子に基づいて決定され得る。担体物質との組み合わせにより単一用量形態を形成し得る有効成分の量は、特定のマトリックス分解酵素、処置される主、特定の投与方式および活性化に必要とされる活性化条件、および／または活性化が望まれる予め定められた時間またはその長さにより変化する。医薬組成物は、典型的には、約１μｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌに用量を提供するべきである。一般的に、投薬量は、１回用量投与につき約１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ、典型的には約１００μｇ／ｍｌである。投与すべき量は、可活性化型マトリックス分解酵素と選択された活性化条件、処置される適応症および耐容性がある起こり得る副作用の相関的な要素である。投薬量は、各疾患について認められたモデルを用いて経験的に決定され得る。また、本明細書の他の箇所に記載したとおり、可活性化型マトリックス分解酵素は、逐次的、同時または断続的に他の薬剤と組み合わせて投与され得る。上記薬剤の典型例には、限定されるわけではないが、リドカイン、エピネフリン、分散剤、例えばヒアルロニダーゼおよびそれらの組み合わせがある。
患者の状態が改善されたとき、化合物または組成物の維持用量が投与され得、必要ならば、投薬量、投薬形態または投与頻度またはその組み合わせに修正が加えられ得る。場合によっては、対象が、病気の症状の再発時に長期体制で断続的処置を必要とすることもあり得る。
コラーゲン介在疾患または状態へのコラーゲンの関与について、多様な疾患および状態におけるＥＣＭ成分の役割の一例を挙げて下記で説明する。上記説明は、典型例に過ぎず、特定の可活性化型マトリックス分解酵素または特定のＥＣＭ介在疾患または状態に限定されるものではない。当業者であれば、可活性化型マトリックス分解酵素およびその活性化に要する活性化条件を選択することにより、特定疾患または状態に関与するＥＣＭ成分に対する特定酵素の開裂または分解能力に基づき、所望のＥＣＭ介在疾患の処置に使用できるはずである。個々の処置および投薬量は、当業者により決定され得る。処置を評価する際に考慮すべきことは、例えば、処置される疾患、疾患に関与するＥＣＭ成分、病気の重症度および経過、可活性化型マトリックス分解酵素が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのかということ、治療歴、患者の臨床歴および治療に対する応答、および担当医の裁量である。
１．コラーゲン介在疾患または状態
コラーゲンは、哺乳類生物体の主要構造成分であり、動物体の皮膚および他の部分の全タンパク質含有量の大部分を構成する。非常に多くの疾患および状態が、例えば、コラーゲンまたは他の原因物質に富む線維性組織の異常な蓄積に起因する、過剰なコラーゲン沈着と関連している。コラーゲン介在疾患または状態（線維症性組織疾患とも称す）は、当業者には周知である（例、米国出願公開第２００７０２２４１８３号、米国特許第６，３５３，０２８； ６，０６０，４７４； ６，５６６，３３１； ６，２９４，３５０号参照）。過剰のコラーゲンは、限定されるわけではないが、瘢痕形成をもたらす線維症性疾患または状態、セルライト、デュピュイトラン症候群、ペーロニー病、有痛性肩拘縮症、限局型硬皮症、リンパ水腫、間質性膀胱炎（ＩＣ）、毛細管拡張症（Ｔｅｌａｎｇｒｅｃｔａｓｅ）、バレット化生、腸壁嚢胞状気腫、コラーゲン蓄積大腸炎などの疾患および状態と関連している。例えば、しわ、セルライト形成および腫瘍性線維症などの皮膚の美観を損なう状態は、過度のコラーゲン沈着から生じるもので、正常組織構造の望ましくない結合および湾曲をもたらす。
限定されるわけではないが、カテプシンＬを含む本明細書記載の可活性化型マトリックス分解酵素は、コラーゲン介在疾患または状態の処置に使用され得る。本明細書記載の疾患および状態を処置するための可活性化型マトリックス分解酵素の典型例は、中性ｐＨで活性を呈し、活性に関して持続的酸性条件を必要とするものである。例えば、細胞外マトリックス、例えば皮膚間質の一時的酸性化は、緩衝酸性溶液を直接患部に注入することにより達成され得る。一例では、緩衝酸性溶液は、ＥＣＭ成分が存在し、蓄積している部位で投与が直接行われるように、上皮下投与により、すなわち皮膚下投与され得る。他の活性化方法も使用され得、本明細書の記載からしても当業者には周知である。
ａ．セルライト
可活性化型マトリックス分解酵素、例えばカテプシンＬを含む本明細書記載のものは、セルライトの処置に使用され得る。正常な脂肪組織では、血管およびリンパ管の細かい網状組織が、組織に必要な栄養分および酸素を供給し、代謝産物の除去処理をしている。例えば、トリグリセリドは、毛細管に富む小葉にグループ分けされる個々の脂肪細胞に貯蔵される。各脂肪小葉は、脂肪細胞により構成される。線維性中隔と呼ばれるコラーゲン線維の垂直鎖は、脂肪小葉を仕切り、上に重なる浅在筋膜を下にある筋肉に繋ぎとめる。
セルライトは、典型的には、血管完全性の破損および皮膚の真皮および皮下レベルにおける毛細管網状組織の喪失による皮膚の劣化を特徴とする。脈管の劣化は、皮膚代謝を低下させる傾向がある。この代謝の低下により、タンパク質合成および修復過程が妨げられ、皮膚は薄くなる。さらにこの状態は、脂肪細胞が脂質により充溢し、膨張し、凝集していること、および過剰の流体が皮膚の真皮および皮下領域に停留していることを特徴とする。脂肪小球または脂肪細胞の蓄積により、追加の滋養分を供給するためのさらに多くの血液供給が必要となる。血液を組織に供給するため、新たな毛細血管が形成され、さらなる濾液が放出されることにより、間質液で組織は飽和状態となり、脂肪組織に浮腫の形成が誘発される。間質組織における多量の細網線維は、凝集した脂肪細胞の周囲で蓄積および肥厚化する。それらは被膜または中隔を形成し、徐々にコラーゲン線維に変換され、小結節の感触を呈する。さらにこれらの中隔の形成により、脂肪細胞は閉塞される。また、コラーゲン線維は間質組織空間に沈着し、結合組織を硬化（硬く）させる。
したがって、この状態がさらに進行すると、脂肪細胞の硬い小結節および中隔により囲まれた脂肪塊が真皮領域に形成される。この結果、皮膚表面は、かなりの不均質性を呈し、「コテージチーズ」または「オレンジ皮」様の外観を特徴とする状態になる。皮膚を真皮および深部組織層へ結合する線維性中隔が堅くなり、皮膚に引っ張りこまれると、くぼみが生じる。すなわち、セルライトの「オレンジ皮」様の外観は、脂肪組織に対して外向きの力がはたらいたことによる、脂肪小葉の変形に起因する。脂肪小葉は大きく、例えば１ｃｍ以下の幅であり、上に重なる真皮中へ容易に突出し得るため、皮膚表面上に目に見える変形を誘発する。最終的に、脂肪が上方へ押すにつれて外側の皮膚は起伏のある外観を呈することになる。結合性中隔はこれらの外向きの力と同一方向で走るため、それらは脂肪が真皮中へ突出しないようにする対抗力を与えることができない。
セルライトは、圧倒的に男性より女性で多く見られる。セルライトの罹患率は、女性集団の６０％〜８０％であると推定され、その重症度は肥満を伴って悪化する傾向がある。最近発表された試験は、インビボ磁気共鳴イメージングにより、セルライトがある女性はセルライトの無い女性または男性より垂直線維性中隔のパーセンテージが高いことを示した（Ｑｕｅｒｌｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：１１８−１２４）。セルライトは、臀部、大腿部および上腕で最も多く生じる。例えば、閉経期前の女性は、皮下、主としてセルライトが最もありがちな臀部／大腿部領域に脂肪を蓄積する傾向がある。臨床的に、セルライトは、表皮の薄化、流体の皮下蓄積に至る微細脈管構造の縮小および破損、および脂肪組織の皮下凝集を含む症状を伴う。
ｂ．デュピュイトラン病
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、デュピュイトラン症候群（デュピュイトラン拘縮とも呼ばれる）の処置に使用され得る。デュピュイトラン拘縮（デュピュイトラン病としても知られている）は、指が掌に向って曲り、完全に伸ばすことができない手の固定的な屈曲拘縮である。似た病変は足に起こることもある。手の内部の結合組織が異常に肥厚し、線維芽細胞およびコラーゲン、特にＩＩＩ型コラーゲンを含む小結節の存在を伴う。コラーゲンの線維組織帯には、多くの場合脂肪組織の中隔様配置が散在している。これらは臨床的に様々なサイズのマットレス型「塊」として存在し、デュピュイトラン病では小結節と呼ばれる。これが指を曲らせる原因であり得、指、特に小指および薬指の機能を損なわせる原因であり得る。デュピュイトラン病は、圧倒的に男性に多い。一般的に、中高年層、北欧系およびある種の慢性病、例えば糖尿病、アルコール中毒および喫煙者で見出される。
デュピュイトラン病は、指の中手指節関節（ＭＰ）および近位指節間（ＰＩＰ）関節において固定的な屈曲変形を誘発する何年もかけて起こるゆっくり進行する疾患である。小指および薬指が最も多く罹患する。この疾患は、３段階を通して進行する（Ｌｕｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９５９） Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．， ４１Ａ：６３５−６６４）。最初の増殖段階は、筋線維芽細胞として知られている細胞が出現し、増殖し始める手掌腱膜における小結節形成を特徴とする。退化または中間病期は、筋線維芽細胞増殖および活性ＩＩＩ型コラーゲン形成を伴う。最終または後遺症期では、小結節は焼失し、無細胞組織およびコラーゲンの肥厚帯が残る。Ｉ型コラーゲンに対するＩＩＩ型コラーゲンの比率は増加する。可活性化型マトリックス分解酵素によるデュピュイトラン病の処置は、典型的には中間病期および後遺症期に行われる。
ｃ．ペーロニー病
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、ペーロニー病の処置に使用され得る。ペーロニー病は、１〜４％もの男性が罹患している、陰茎の軟組織における線維性プラークの増殖を伴う結合組織疾患である。コラーゲンは、ペーロニー病におけるプラークの主要構成成分である。詳しくは、線維組織形成過程は、陰茎海綿体を囲む線維被膜である、白膜で起こる。ペーロニー病に随伴する疼痛および損傷は、２つの勃起性杆状体、すなわち陰茎海綿体と呼ばれる、尿が膀胱から流れる導管（尿道）、および陰茎の皮膚の外層から海綿体を分離する膜が見出される陰茎の物理的構造と関連している。ペーロニー病を呈する者では、皮膚の膜およびこれらの外層間（本願では「皮下」と称す）にプラークまたは瘢痕組織が形成（複数も可）されることになる。膜の瘢痕形成またはプラーク蓄積により、その弾性が低下するため、患部領域では周囲の非罹患組織と（あったとしても）同程度には伸びなくなる。すなわち、勃起した陰茎は瘢痕またはプラーク蓄積方向に曲り、ある程度の疼痛を伴うことが多い。ごく少数を除き、全てのペーロニー病の症状発現では、患者はある程度の性機能障害を呈する。さらに重症の症例では、性交渉は不可能であるかまたは痛みが酷いため事実上妨げられる。
経験的証拠は、男性集団の約１パーセントにおけるペーロニー病の発生を示す。この疾患はほとんどの場合中年男性に起こるが、若年および高齢男性でも罹る可能性はある。また、ペーロニー病に罹患した男性の約３０％は、身体の他の弾性組織、例えば手または足において線維症（硬化細胞）を発症する。同様の他の状態の一般的な例には、手のデュピュイトラン拘縮および足のレッダーホース（Ｌｅｄｄｅｒｈｏｓｅ）線維症がある。
ｄ．レッダーホース（Ｌｅｄｄｅｒｈｏｓｅ）線維症（足底線維腫症）
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、レッダーホース線維症の処置に使用され得る。レッダーホース線維症は、線維芽細胞増殖およびコラーゲン沈着に起因する線維症が足に発生すること以外は、デュピュイトラン病と類似している。レッダーホース病は、足底中間部における足底線維症を特徴とし、足底線維症と称されることもある。
ｅ．関節硬着
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、関節硬着、例えば有痛性肩拘縮症の処置に使用され得る。有痛性肩拘縮症（癒着性関節包炎）は、肩における疼痛および運動性喪失または硬着を特徴とする関節包の慢性的線維組織形成状態である。一般的集団の約２％がこれに罹患している。有痛性肩拘縮症は、線維芽細胞マトリックス合成の増加により起こる。この合成は、サイトカインおよび成長因子の過剰生産をもたらす過度の炎症応答により誘発される。線維芽細胞および筋線維芽細胞は、肩の関節包内にコラーゲン、特にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの稠密なマトリックスを沈積させる。この結果、肩関節包は瘢痕のある拘縮した状態となり、関節硬着が誘発される。
関節硬着の他の例には、限定されるわけではないが、筋骨格手術により生じる被膜拘縮、癒着性関節包炎および関節線維症により誘発されるものがある。上記関節硬着は、例えば膝、肩、肘、足首および臀部の関節を含む関節で起こり得る。有痛性肩拘縮症と同様、上記関節疾患は、マトリックス合成の増加および瘢痕形成により誘発される。関節硬着により、不可避的に異常に激しい力が患部領域の関節の軟骨へ伝達され得る。時間経過とともに、これらの力は変性関節疾患および関節炎の発症を誘発する。例えば、関節線維症および被膜拘縮では、線維芽細胞が、脱臼などの局所的外傷に応答して過剰量のマトリックスを形成する。
ｆ．既存の瘢痕
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、既存の瘢痕の処置に使用され得る。コラーゲンは、創傷治癒過程および自然な加齢過程において特に重要であり、その過程で線維芽細胞により産生される。しかしながら、場合によっては、過度の治癒応答が、おびただしい量の瘢痕組織とも呼ばれる治癒組織（細胞間質）の生成を誘発することもあり得る。例えば、火傷、手術、感染、創傷および事故など様々な皮膚の外傷は、コラーゲンに富む線維組織の異常な蓄積を特徴とすることが多い。また、プロテオグリカン含有量も増加している。損傷を受けたか破壊された正常組織と置き換わることに加えて、新たな組織の過剰で見苦しい沈積は治癒過程中に形成されることもある。過剰のコラーゲン沈積は、コラーゲン合成とコラーゲン分解間の均衡の乱れに起因すると考えられている。例えば、慢性腱症または腱の瘢痕組織、外科的癒着、ケロイド、過形成性瘢痕および陥没瘢痕も瘢痕に含まれる。
ｉ．外科的癒着
外科的癒着は、瘢痕形成を通して器官または組織が互いに接着することであり、深刻な臨床上の問題を引き起こし得る。手術または組織損傷後のある程度の瘢痕組織の形成は正常なことである。しかしながら、場合によっては、瘢痕組織が創傷領域を越えて成長し、外科的癒着を生じることもあり、そのため罹患した身体部分の正常な運動性および機能が制限される傾向がある。特に、かかる軟組織損傷後には、線維芽細胞増殖およびマトリックス合成が局所的に増加する。次いで、身体が治癒応答の誘導により組織を修復しようとするときに、癒着が形成する。例えば、この治癒過程は、他の点では健康な２またはそれより多い別々の構造間（例えば、腹部手術後の腸のループ間）で起こり得る。別の例では、末梢神経への局所的外傷後、線維性癒着が形成し、通常の動きの際に激痛を誘発し得る。
ｉｉ．ケロイド
ケロイドは、最も多くは外傷後に、真皮および隣接皮下組織に生じる過形成塊を含む結合組織の瘢痕である。ケロイドは、一般的に色がピンクまたは赤色から暗褐色に変わり得る線維性小結節である。ケロイドは、創傷修復に関与するコラーゲンの過剰成長の結果として瘢痕組織で生じる。局所的皮膚線維芽細胞が局所刺激因子に応答して激しい過形成および増殖を経験したとき、ケロイド病変が形成される。生じた病変は、元の瘢痕より何倍も大きい塊を形成させ得る。創傷または他の外傷の結果として起こる場合に加えて、ケロイドはまた、刺し傷、面ぼう、かき傷、重症のにきび（アクネ）、水痘瘢痕形成、創傷部位での感染、一定領域への反復外傷、または創傷閉鎖中における過剰な皮膚の緊張からも生じ得る。
ｉｉｉ．過形成性瘢痕
過形成性瘢痕は、創傷部位で生じる隆起性瘢痕である。一般的に、それらは元の創傷の境界を越えて成長することはない。ケロイド瘢痕と同様、過形成性瘢痕は、身体によるコラーゲンの過剰生産の結果である。
ｉｖ．陥没瘢痕
陥没瘢痕は、一般的に炎症性エピソードから生じ、皮膚の拘縮を特徴としており、美容上不愉快で永久的な瘢痕を残す。最もよくある例は、炎症性のにきび後に起こる瘢痕形成である。陥没は、創傷治癒の正常な結果として起こるもので、陥没を誘発する瘢痕組織は、線維芽細胞増殖および代謝から生じるコラーゲンにより主に構成される。
ｇ．硬皮症
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、硬皮症の処置に使用され得る。硬皮症は、コラーゲンの肥厚化を特徴とする。この疾患の一般的な形態、限局型硬皮症は、通常数か所だけ、時には顔面の皮膚でのみ発症する。硬皮症は、ＣＲＥＳＴ症候群と称されることもある。症状としては、皮膚の硬化および随伴する瘢痕がある。皮膚はまた、赤みを帯びるかうろこ状に見え、血管が目につきやすくなり得る。さらに深刻な症例では、硬皮症は、血管および内部器官を侵し得る。広範性硬皮症は、筋骨格、肺、胃腸、腎臓および他の合併症に起因する心臓、腎臓、肺または腸損傷の結果として致命的であり得る。
この状態は、弾性の喪失をまねくコラーゲン蓄積を特徴とする。コラーゲンの過剰生産は、自己免疫機能不全に起因すると考えられており、Ｔ細胞の蓄積および線維芽細胞からのコラーゲン沈着を刺激するサイトカインおよび他のタンパク質の産生をもたらす。
ｈ．リンパ水腫
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、リンパ水腫の処置に使用され得る。リンパ水腫は、手足の腫脹を誘発するリンパ液の蓄積である。リンパ水腫、例えば、リンパうっ帯性線維症、硬化症および乳頭腫（良性皮膚腫瘍）および腫脹などの皮膚変化を含む段階へ進行し得る。リンパ水腫に伴う組織変化には、結合組織細胞、例えば線維芽細胞の増殖、コラーゲン線維の生成、脂肪沈着物の増加および線維症性変化がある。これらの変化は、まず下肢末端部、すなわち指および爪先で起こる。リンパ水腫は、末端部の腫脹程度に基づいて識別され得る。例えば、リンパ水腫の一評価方法は、病変および非病変末端部の４比較点間における２ｃｍまたは３ｃｍの差異の識別に基づいている。
ｉ．コラーゲン蓄積大腸炎
可活性化型マトリックス分解酵素、例えば本明細書記載のものは、コラーゲン蓄積大腸炎の処置に使用され得る。コラーゲン蓄積大腸炎は、最初は慢性水様性下痢として報告されていた（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｐａｔｈｏｌ． Ｅｕｒ．、１１：８７−８９）。コラーゲン蓄積大腸炎は、粘膜線維芽細胞によるコラーゲン産生とコラーゲン分解間の不均衡により生じると思われる、コラーゲン沈着を特徴とする。これは、結果的に分泌性下痢を誘発する。コラーゲン蓄積大腸炎の発生数は、原発性胆汁性肝硬変と類似している。この疾患は、１０００００人当たり１．８人の年間発生数および１０００００人当たり１５．７人の有病割合を有し、原発性胆汁性肝硬変（１０００００人当たり１２．８人）と類似しており、また潰瘍性大腸炎（１０００００人当たり２３４人）、クローン病（１０００００人当たり１４６人）またはセリアック病（１０００００人当たり５人）よりは低い。慢性下痢患者では、約０．３〜５％がコラーゲン蓄積大腸炎を有する。コラーゲン蓄積大腸炎は、線維芽細胞の増殖を刺激するサイトカインおよび他の作用物質の産生を増加させることにより、コラーゲン蓄積の増加をもたらす炎症性疾患である。
２．脊髄病状
また、ＥＣＭ疾患またはＥＣＭを巻き込む疾患は、本発明方法を用いて処置され得る、一般的には椎間板ヘルニアまたは椎間板膨隆と称される脊髄病状を含む。これらは、脱出および突出椎間板を含む。脱出椎間板は、無傷ではあるが、膨隆しているものである。突出椎間板では、線維輪は破れ、髄核（ＮＰ）はしみ出ているが、まだ椎間板に連結されている。ＮＰはヘルニア形成の原因ではないが、ＮＰは神経を圧迫する一因であり、痛みを誘発する。ＮＰは、ヒアルロン酸、軟骨細胞、コラーゲン原線維、および水を誘引するヒアルロン酸長鎖を有するプロテオグリカンアグリカンを含む。コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の側鎖は、各ヒアルロン酸鎖に結合している。
椎間板ヘルニアは、典型的には椎間板への薬剤の局所導入により、キモパパインおよびコラゲナーゼなどの化学的髄核融解薬剤で処置されてきた。化学的髄核融解薬剤は、ＮＰの１または複数成分を分解することにより、圧力を軽減する。化学的髄核融解法は、脱出および突出椎間板に有効である。化学的髄核融解法は、腰椎（下）脊柱および頸椎（上脊柱）ヘルニアの処置に使用されてきた。本発明方法の場合、ＮＰの成分を分解し、条件付きで活性化される酵素が投与され得る。これらの酵素には、カテプシンＬが含まれる。さらに、条件付き可活性化型ではないヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼのいずれかに修飾を加えることにより、それらを条件付き可活性型にし得る。例えば、修飾ＭＭＰ、例えば本明細書記載の要領で修飾されたＭＭＰ−１を含む、本明細書記載の温度感受性酵素は、本発明方法で使用され得る。
Ｊ．実施例
以下の実施例は、説明を目的としているのであり、本発明の範囲に制限をもうける意図はないものとする。
実施例１
活性化組換えカテプシンＬの製造
ヒスチジン（Ｈｉｓ）−標識精製組換えヒトカテプシン−Ｌを、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ、カタログ番号９５２−ＣＹ）から購入し、５０ｍＭの酢酸、ｐＨ４．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で調剤した。５００μＬのアリコートを、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
使用前、貯蔵しておいたアリコートに対し濃縮および緩衝液交換を行った。簡単に述べると、２ｍＬの０．９ｍｇ／ｍＬのカテプシンＬを、氷上で解凍し、３０ＫＤａカットオフを有する４本の ｍｉｃｒｏｃｏｎ 遠心式限外ろ過膜チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ベッドフォード、マサチューセッツ、カタログ番号４２４１０）に移した。ｍｉｃｒｏｃｏｎ チューブを５分間９０００ｒｐｍで回転させることにより、最終量が５０μｌとなった。冷濃縮緩衝液（１００ｍＭのＮａ−蟻酸ｐＨ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）４５０μＬを、各 ｍｉｃｒｏ（ｃｏ）ｎ チューブに加えた。処理している間に５ｍＭのＤＴＴを添加することにより、カテプシンＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの評価による約３６ｋＤａの単鎖タンパク質に変換される。濃縮および緩衝液交換段階により、阻害性１０〜１６ｋＤａプロペプチドを除去する。さらに、濃縮および緩衝液交換中に添加したＤＴＴおよびＥＤＴＡにより、カテプシンＬのタンパク質加水分解的分解は最小限となる。遠心分離手順を３回反復した。カテプシンＬは温度感受性であるため、チューブおよび濃縮液を冷蔵することにより、分解を最小限に抑えた。最終回転後、ｍｉｃｒｏｃｏｎ チューブを逆さにし、５分間５０００ｒｐｍでの遠心分離により、液体を透過残物用カップに集めた。回収された最終量は４００μＬであり、５倍濃縮されていた。濃縮カテプシンＬを、約３００μｇの活性化酵素を含む、６７μＬ分量のアリコートに分けた。アリコートを−８０℃で貯蔵し、使用前に氷上で解凍した。
使用前、１アリコートを３ｍＬのＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ｐＨ５）に加えることにより、カテプシンＬをその最適ｐＨ５で処方し、最終濃度１００μｇ／ｍＬの活性化カテプシンＬを得た。対照として、酵素の活性が最小限となるｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液中でカテプシンＬを処方した。
実施例２
ヒドロキシプロリン検定法
ヒドロキシプロリン検定法を用いて、カテプシンＬでの灌流後の皮膚試料中におけるコラーゲン含有量の変化を測定した。他のタンパク質のヒドロキシプロリン含有量は無視できる程度であり、コラーゲンは、８％濃度のヒドロキシプロリンを含む（ＴＶ． Ｂｕｒｊａｎａｄｚｅ， Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １８： ４９３１−４９３８ （２００２））。使用したヒドロキシプロリン（ＨＰ）検定法は、ＲｅｄｄｙおよびＥｎｗｅｍｅｋａ （Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：２２５−２２９ （１９９６））の手順の修正法であった。
特に、標準サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｆｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ、ウエストベリー、ニューヨーク）における８ウェルの０．２ｍＬストリップ管（Ｂｒａｎｄｔｅｃｈ、エセックス、コネティカット）での反応を完了させるため、試薬の量を修正した。加水分解、酸性化および検出を含む全工程を、０．２ｍＬ管で実施した。化学物質は全てＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ）から購入した。簡単に述べると、灌流実験からの灌流液試料を、５倍量の２００プルーフのエタノールでの沈殿により抽出し、遠心分離にかけた。１ｍＬまたは２００μＬピペットを用いて、集めた灌流液の量を測定した。ラベルを貼った１５ｍＬ円錐型遠心管に灌流液を移した。エタノール灌流液混合物を、−８０℃の冷凍庫で３０分間貯蔵した後、エッペンドルフ・スイングバケット遠心機において１０分間３０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。遠心分離後、沈殿物を、ペレットのサイズに応じて１５０〜４００μＬの２Ｎ ＮａＯＨに溶かした。上清を凍結乾燥機で乾燥し、１５０〜２００μＬの２Ｎ ＮａＯＨに溶かした。ＮａＯＨに溶解後、試料を１管当たり２００μＬまたはそれ未満の量で８ウェルのストリップ管に移し入れ、サーモサイクラーにおいて９９℃で１２時間加水分解することにより、コラーゲンを完全に加水分解し、ヒドロキシプロリンを放出させた。試料を濃ＨＣｌ（加水分解試料２５μＬごとに５．２μＬのＨＣｌ）で酸性化した。６０μＬのクロラミン−Ｔ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ９８８７）を等量の酸性化加水分解物に加えることにより、ヒドロキシプロリンの酸化を完了させた。完全な酸化後、１２０μＬのエールリッヒ試薬（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号３９０７０（Ｆｌｕｋａ））を加え、６５℃で２５分間インキュベーションすると、紫色となった。着色強度は、灌流液で放出されたコラーゲンから誘導されたヒドロキシプロリンの量に左右される。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ２Ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア）において、５５０ｎｍでの可視範囲で試料を読み取った。精製ヒドロキシプロリン溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号Ｈ５４４０９）を用いて標準曲線を確立し、皮膚試料中におけるヒドロキシプロリン含有量を標準曲線から測定した。
実施例３
活性化カテプシンＬでのエクスビボラット皮膚外植片の灌流によるコラーゲンの分解
２％イソフルオランで麻酔した３か月齢雄スプラーグ−ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、インディアナポリス、インディアナ）の背面部位から、皮膚外植片（２ｃｍ×２ｃｍ）を手術により取り出した。外植片を、１００ｍｍペトリ皿に接着させた Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ パッドに針で留め、加熱パッドで３７℃に保った。注入ポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｉｏｎ、Ｍ３６１モデル、ボストン、マサチューセッツ）を用いて、ｐＨ５のＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸））および２５００単位／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０ Ｈａｌｏｚｙｍｅ 内部製造ロット＃０５６−１００；比活性：１２４０００Ｕ／ｍＬおよび１．０５ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量）を含む溶液６ｍＬを、まず３５分間外植片の真皮層に挿入した２７ゲージのバタフライ針を介して皮膚外植片に灌流した。酸性灌流の完了後、皮膚外植片を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）中の１００μｇ／ｍＬの活性化カテプシンＬまたはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の対照カテプシンＬを用いて、または用いずに約３０分間灌流した。２００μＬのマイクロピペットで吸引し、全灌流手順中５〜１０分の間隔で１．５ｍＬエッペンドルフ管中の内容物を集めることにより、フラクションを集めた。フラクションをエッペンドルフ管にプールし、急速冷凍した後、ヒドロキシプロリン（ＨＰ）分析を実施例２記載の要領で実施した。
異なる３実験の結果は、ＨＰレベルが、最適ｐＨ５の活性化カテプシンＬで灌流した試料でのみ著しく増加していたことを示す。平均（ｎ＝３）ＨＰレベルは、約６分時点の灌流液の１μｇ／ｍＬ未満から約３０分時点の灌流液の３０μｇ／ｍＬを超えるレベルまで増加した。ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）のみ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみ、および対照カテプシンＬ（ｐＨ７．４）による注入からの灌流液では、ＨＰは全くまたはほとんど測定されなかった。
実施例４
活性化カテプシンＬでのエクスビボブタ皮膚外植片の灌流によるコラーゲンの分解
３か月齢のメスヨークシャーブタ（Ｓ ａｎｄ Ｓ Ｆａｒｍ、ラモナ、カリフォルニア）を一晩絶食させ、ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）およびアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔をかけた。次いで、動物に挿管し、酸素（Ａｉｒｇａｓ、サンディエゴ、カリフォルニア）中２％吸入イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ）により麻酔を維持した。皮膚外植片全体（５ｃｍ×５ｃｍ）を、動物の背中から外科的に取り出し、４℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に入れ、切除後２時間以内に使用した。外植片の灌流およびヒドロキシプロリン分析を、本質的には実施例３記載の要領で実施したが、ただし、ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５、またはＰＨ２０の非存在下１００μｇ／ｍｌのカテプシンＬを含むＭＥＳ緩衝液ｐＨ５によりブタの皮膚外植片を灌流した。最初、外植片を約３０分間６ｍＬのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５により灌流し、５〜１０分ごとにフラクションを集めた。その後、約２５分間５分ごとに集めた３ｍＬのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５中１００μｇ／ｍｌのカテプシンＬまたは対照として緩衝液単独により、外植片を灌流した。ＨＰ分析は、カテプシンＬで灌流した試料においてＨＰレベルの時間依存的増加を示した。カテプシンＬを含まないＭＥＳ緩衝液ｐＨ５で灌流した試料では、検出可能なＨＰは測定され得なかった。最高レベルのＨＰは１５分時点で測定された。２５分時点で測定されたＨＰレベルは、１５分時点で測定されたＨＰレベルと類似していた。
実施例５
活性化カテプシンＬでのブタ外植片の灌流による皮下空間における線維性中隔の減少
ブタ皮膚外植片を、３０分間分速０．１７ｍＬで、２５００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含むＭＥＳ緩衝液ｐＨ５により灌流し、次いで２５分間０．１２ｍＬ／分でｒＨｕＰＨ２０不含有のＭＥＳ緩衝液ｐＨ５中１００μｇ／ｍｌのカテプシンＬ３ｍＬで灌流することにより、本質的には実施例４記載の要領で処理した。カテプシンＬによる注入後、外植片を小片に切り揃え、一晩４％緩衝ホルマリンに固定した。対照未処理ブタ外植片を同様に処理した。組織をＰＢＳ中で洗浄し、等級化エタノールおよびキシレン溶液中で脱水し、パラフィンに包埋した。ブロックを４μｍの薄片に切断し、顕微鏡スライドに移し、コラーゲン可視化用にマッソンのトリクローム染料で染色した。簡単に述べると、薄片を脱パラフィン化し、蒸留水中で水和し、５６℃で１５〜３０分間、ブアン固定液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＴ１０−１３２）中で媒染剤処理した。薄片を冷却し、黄色が消えるまで流水で洗浄し、蒸留水ですすいだ。次いで、薄片を５分間ワイゲルト（Ｗｅｉｇｅｒｔ）鉄ヘマトキシリン使用液（Ｓｉｇｍａ カタログ番号ＨＴ１０７およびＨＴ１０９）中で染色し、流水で１０分間洗浄した。薄片を脱イオン水で５分間すすぎ、ビーブリッヒ（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ）スカーレット−酸フクシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＴ１５１）中に５分間置いた。薄片をリンタングステン／リンモリブデン酸使用液（Ｓｉｇｍａ カタログ番号ＨＴ１５２およびＨＴ１５３）中に移し、最後に５分間アニリンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ カタログ番号ＨＴ１５４）で染色し、２分間１％酢酸中で区別をつけた。薄片を蒸留水中ですすぎ、９５％エタノールおよび無水アルコールで脱水し、２交換でのキシレンで透明にした。薄片を Ｎｉｋｏｎ 倒立型顕微鏡に載せ、観察した。ＳＰＯＴアドバンスイメージングプログラムを含むカメラスキャナー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、スターリング・ハイツ、ミシガン）に連結したＮｉｋｏｎ 蛍光顕微鏡において２０ｘ対物レンズを用いて画像を得た。
皮下組織は、主に脂肪組織を含む。コラーゲン線維性中隔でできた稠密な結合組織鎖は、真皮深部から皮下組織へと伸び、下にある構造に皮膚を繋ぎとめている。組織学的結果は、脂肪細胞小室を分けている線維性中隔が、非処理試料では皮下組織全体にわたって見えることを示している。ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）中のカテプシンＬで処理後、コラーゲン線維性中隔の数は、非処理試料の場合よりもかなり低いことから、カテプシンＬでの処理により、皮下組織におけるコラーゲン網状組織は劇的に改変されることが分かる。
実施例６
Ａ．生体麻酔ラットの皮膚におけるコラーゲン分解
２％イソフルラン麻酔下にある３か月齢雄スプラーグ−ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ）において、灌流実験を実施した。ｐＨ５でのカテプシンＬを用い、また特異性に関する対照として、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で灌流実験を実施した。簡単に述べると、注入ポンプを用いて、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）または２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）および２５００単位／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０（Ｈａｌｏｚｙｍｅ 内部製造ロット＃０５６−１００；比活性：１２４０００Ｕ／ｍＬおよび１．０５ｍｇ／ｍＬのタンパク質含有量）を含む溶液約１５ｍＬを、皮膚の真皮層中に挿入した２７ゲージのバタフライ針を用いて尾部の皮膚から約６０分間灌流した。その後、カテプシンＬまたは緩衝液対照を含む３ｍＬ溶液を、２５分間灌流した。カテプシンＬ含有灌流液は、５ｍＭのＭＥＳ中におけるその最適ｐＨ５、または２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中における７．４の対照ｐＨで１００μｇ／ｍＬの活性化カテプシンＬを含んでいた。ｐＨ５緩衝液のイオン強度を２５ｍＭから５ｍＭへ低下させて、局所組織環境によるｐＨの中和を促すことにより、活性酵素の拡散を制限した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のカテプシンＬの場合、少なくとも２０ｍＭのイオン強度を維持することにより、確実に、高イオン強度緩衝液（ｐＨ４）中で活性化および製剤化したカテプシンＬの添加によりＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のｐＨが実質的に改変されることのないようにした。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に加えたカテプシンＬの小アリコートを、ｐＨ紙でチェックすることにより、確実に、カテプシンＬ添加後に生成した溶液のｐＨが実際にｐＨ７．４に近くなるようにした。灌流に使用した対照緩衝液は、５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）または２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）であり、酵素は添加しなかった。灌流液フラクションを一定の時間間隔、すなわち最初の灌流中における２０、４０および６０分時点およびカテプシンＬでの灌流中における８および２５分時点で尾部皮膚から集めた。フラクションをエッペンドルフ管にプールし、急速冷凍することにより、さらなる酵素作用を封じた。ヒドロキシプロリン分析を実施例２記載の要領で実施した。結果は、ＨＰが、活性化カテプシンＬで灌流した試料でのみ測定され得ることを示している。最高レベルのＨＰは、２５分灌流液試料で測定された。ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）のみ、またはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）のみ、またはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のカテプシンＬで灌流した試料に検出可能なＨＰは認められなかった。
Ｂ．カテプシンＬ処理は、インビトロでｐＨ依存的コラーゲン分解をまねく
ｐＨ５．０およびｐＨ８．０でのラットコラーゲンに対する分解について、カテプシンＢ、Ｄ、ＬおよびＳ並びに細菌性コラゲナーゼを評価した。カテプシンＢ、Ｄ、ＬおよびＳを、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ から購入し、酵素メーカーからの個々の仕様書に基づいて各酵素を活性化した。Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ から購入した細菌性コラゲナーゼは、活性化を必要としない。可溶性ラット尾部コラーゲンＩ型を、メーカー指定の緩衝液中、またはトリス（ｐＨ８．０）緩衝食塩水中における、活性化カテプシンＢ、Ｄ、ＬまたはＳまたは細菌性コラゲナーゼとのインキュベーションにより３７℃で１時間消化し、次いでＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルおよびクーマシーブルー染色にかけた。他のカテプシンについては、ｐＨ５ではなく、メーカー指定のｐＨおよび緩衝液で試験した。結果は、カテプシンＬが、ｐＨ８．０ではなくｐＨ５．０で活性を呈する唯一の酵素であったことを示している。カテプシンＢ、ＤおよびＳは、メーカー指定ｐＨではラットコラーゲンの軽微な分解を示し、ｐＨ８．０ではラットコラーゲンの分解を示さず、細菌性コラゲナーゼは、ｐＨ５．０およびｐＨ８．０の両方でラットコラーゲンを分解した。
実施例７
Ａ．生体ラットにおける皮膚の酸性化後における中性への回帰
希酸性水溶液を皮膚間質に注射したとき、ｐＨの変化は一時的なものであり、中性皮膚ｐＨは、間質の顕著な緩衝能力故に急速に元に戻される。フェノールレッドを間質ｐＨの視覚的指示薬として使用した。フェノールレッドのナトリウム塩は、中性から酸性ｐＨへの変化を識別するために細胞培養培地で広範に使用されている。フェノールレッド溶液は、６．４またはそれ未満のｐＨでは黄色、ｐＨ７．０ではオレンジ色、ｐＨ７．４以上では赤色、およびｐＨ７．８では紫色を呈する。
３か月齢雄スプラーグ−ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、インディアナポリス、インディアナ）を２％イソフルラン麻酔下においた。皮膚の毛を剃ってフェノールレッド染料を見易くした。５００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０を含む２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）２〜２．５ｍＬを、真皮層へ挿入した２７ゲージのバタフライ針により尾部皮膚へ灌流させた。これに続いて、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）中の０．０５％フェノールレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号Ｐ０２９０）の溶液１〜１．５ｍＬを灌流させた。ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸）、Ｃ１６Ｈ１３ＮＯ４Ａ）は、１９５．２の分子量を有する。フェノールレッド溶液にｒＨｕＰＨ２０は含まれなかった。マイクロカリパスを用いて、フェノールレッド最前線を異なる時点において２次元で測定し、式：面積＝（Ｄ１×Ｄ２）×π／４を用いて面積を計算した。色の変化を観察し、中性に戻るまでの時間を記録した。表４Ａの結果は、中性に戻るまでの平均時間（分）を要約しており、中性への回帰は緩衝液のイオン強度により調節されることを示している。
Figure 2014043449
Ｂ．マウス皮膚の酸性化後における中性までの回帰
中和状態に戻るまでの時間および後続のカテプシンＬの不活化は、注入した緩衝液の濃度に左右される。ヌードマウスにおいて緩衝液濃度を増加させながら（１０〜１００ｍＭのＭＥＳ）染料としてｐＨ５.０でのフェノールレッド指示薬を用いて中和状態に戻るまでの時間を測定することにより、間質の内在的緩衝能力を評価した。麻酔したヌードマウスに、フェノールレッドを含むｐＨ５のＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ〜１００ｍＭ）０.１２５ｍＬを注射した。真皮におけるフェノールレッド中和までの時間を視覚的に測定した。結果を下表４Ｂに示す。
Figure 2014043449
したがって、増加緩衝液濃度（１０〜１００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０）におけるｐＨ指示薬の皮内注射により、１〜２０分／１００ｍｍ２注射により酸性一時的−空間的細胞外環境が得られることが確立された。
実施例８
組換えヒト肝臓カテプシンＬの遺伝子操作
ヒトＣａｔ−Ｌ ｃＤＮＡ配列番号９（配列番号１０に示したヌクレオチド配列によりコードされる）およびＣａｔ−Ｌ−Ｈｉｓ ｃＤＮＡ配列番号１２（配列番号１３に示したヌクレオチド配列よりコードされる）を、ヒト腎臓プロカテプシン−Ｌ ｃＤＮＡに関する公開配列データに従って設計されたプライマーを用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ ６３７２０５）からＰＣＲ増幅した。５’ＮｈｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位を、ＰＣＲプライマー合成の一部として付加した。増幅に使用したプライマーを表５に示す。
Figure 2014043449
ｃＤＮＡに基づく両構築物では、天然Ｃａｔ−Ｌ分泌リーダーペプチドの第２アミノ酸に対し単一塩基による突然変異が導入されて共通コザック配列を形成していることにより、第２アミノ酸がＮからＤへ変化している（配列番号９および１２に示す）。標準アガロースゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定解析により、クローンの同一性を確認した。
生成した増幅産物を導入して、ＨＺ２４（ｂ／ｓ）発現ベクターへクローニングした。発現ベクターは、カテプシンＬタンパク質および脳心筋炎ウイルスからの内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）により分離されたネズミＤＨＦＲ遺伝子の両方を発現させるためのＣＭＶに基づくバイ−シストロンカセットである。生成したＨＺ２４−Ｃａｔ−Ｌ発現ベクターの配列を配列番号１１に示す。ＨＺ２４−Ｃａｔ−Ｌ−Ｈｉｓ発現ベクターの生成した配列を配列番号１４に示す。
Ｃａｔ−ＬおよびＣａｔ−Ｌ−Ｈｉｓの両発現プラスミドを、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア、カタログ番号７０９６７）を用いたトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｓ細胞（血清不含有懸濁培養に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア、カタログ番号１１６１９−０１２）に導入した。また、電気穿孔により化学的に特定された動物生成物不含有培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０７４３−０２９）における懸濁培養で成長するように適合させたＤＧ４４ＣＨＯ細胞（コロンビア大学のＤｒ． Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ からの許可により入手）へ発現プラスミドを導入した。電気穿孔のため、１００μｇを超えるＣｌａＩ線状化プラスミドを、各プラスミドの各電気穿孔用に使用した。３５０ボルトの定常圧で、電気穿孔１回に対し２０００万のＤＧ４４ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。電気穿孔緩衝液は、２ＸＨｅＢＳ（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；２７４ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＫＣｌ；１．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；１２ｍＭのデキストロース）を含んでいた。トランスフェクションした細胞を、ナトリウムヒポキサンチンおよびチミジンを含まない標準ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２６１０−０１０）において電気穿孔の７２時間後に限界希釈によりクローニングし、ＤＨＦＲプラスミドをもつ細胞について選択した。ナトリウムヒポキサンチンおよびチミジンの非存在下で成長している選択されたクローンを、さらにサブクローニングし、メトトレキサートを用いて増幅することにより、挿入体コピー数を増やした。擬似トランスフェクションは、陰性対照としての役割を果たした。
トランスフェクションの７２時間後上清を採取し、１５００ｒｐｍで５分間回転させた。ｈｉｓ−Ｃａｔ−Ｌ、Ｃａｔ−Ｌおよび擬似物質でトランスフェクションしたＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からの細胞不含有上清を、１０ｋＤａカットオフ ｍｉｃｒｏｎ 遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ、カタログ番号４２４０７）に適用し、４℃、１２０００ｒｐｍでの遠心分離により約１０倍に濃縮した。組織培養上清へ分泌された組換えヒトカテプシンＬを、捕捉ＥＬＩＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カテプシン−Ｌ ＥＬＩＳＡキット＃ＱＩＡ９４）、実施例１０記載のモノクローナルＭａｂ３３／１（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア）を用いたウエスタン・ブロット分析によりスクリーニングし、酵素活性については実施例９記載の蛍光性ペプチド基質（Ｚ−Ｌ−Ｒ−ＡＭＣ）を用いた。
実施例９
蛍光性ペプチド基質を用いたカテプシンＬの酵素活性の測定
Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｚ＝：Ｎ−カルボベンジルオキシ；ＡＭＣ：７−アミノ−４−メチルクマリン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ、カタログ番号ＥＳ００８）と称される市販の蛍光性基質を用いて、カテプシンＬの酵素活性を検定した。ペプチド基質は、そのアミノ基およびＡｒｇ残基のカルボキシル基間に形成されるアミド結合によりクエンチングされる高蛍光性７−アミノ−４−メチルクマリン基（ＡＭＣ）を含む。活性化カテプシンＬがこのアミド結合を開裂することにより、放出される蛍光は増加する。ペプチド基質は他のカテプシンにより開裂され得、カテプシンＢが顕著であるが、カテプシンＢに適切な特異的阻害剤を用い、阻害剤の存在および非存在下で活性を測定することにより、カテプシンＬ活性を詳しく測定した。具体的には、選択性カテプシンＢ阻害剤ＣＡ−０７４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア、カタログ番号２０５５３０）を１μＭの最終濃度で使用し、試料をＣＡ−０７４の存在下および非存在下で検定した。ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション７２時間後からの細胞培養上清を、ｐＨ５の濃縮ＭＥＳ緩衝液を加えることによりｐＨ５に調節し、氷上で３０分間インキュベーションした。この酸活性化段階では、プロペプチドを開裂し、成熟カテプシンＬを生成する。カテプシンＬ酵素活性の強力な阻害剤であるプロペプチドフラグメントを希釈するため（Ｃａｒｍｏｎａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ−Ｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ８１４９−８１５７ （１９９６））、試料を濃縮し、緩衝液を、３回３０ＫＤａの ｍｉｃｒｏｃｏｎ チューブで５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５と交換した。次いで、Ｚ−ＡＭＣ基質に関する蛍光性ペプチド基質検定法により、酵素活性について試料を検定した。
カテプシン−Ｌの市販品（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９５２−ＣＹ）を、試料の場合と同様にして活性化し、系列希釈による標準物質として使用した。活性化後、試料および標準物質を、オペーク底マイクロプレートにおいて、５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５中で系列希釈し、３７℃で３０分間蛍光性ペプチド基質Ｚ−ＡＭＣとインキュベーションした。Ｚ−ＡＭＣ基質を、試料または標準物質と合わせたとき、総量２００μＬ中１０μＭの最終濃度で使用した。
蛍光プレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３、サニーベール、カリフォルニア）において基質についての推奨最適励起−放射（３８０ｎｍ〜４６０ｎｍ）バンドで生じた蛍光を読み取った。標準物質の系列希釈から得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）値から描いた標準曲線から試料の値を誘導した。Ｓｏｆｔｍａｘ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３、サニーベール、カリフォルニア）による４−パラメーターフィット後、標準曲線は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲間において擬線状であった。結果を下表６に示す。ＣＨＯ−Ｓトランスフェクション細胞からのカテプシンＬの活性は、選択性カテプシンＢ阻害剤ＣＡ−０７４の存在下での検定によると、擬似物質トランスフェクション宿主細胞からのバックグラウンド活性よりも少なくとも１０〜２０倍高かった。したがって、カテプシンＬトランスフェクション組織培養培地における高い酵素活性は、Ｃａｔ−Ｌ特異的活性に起因するとみなされ得る。
Figure 2014043449
実施例１０
発現されたヒト組換えカテプシンＬのウエスタン・ブロット分析
実施例８記載の無細胞上清の発現および濃縮後、ウエスタン・ブロット分析を実施することにより、発現を確認した。簡単に述べると、異なる６試料（ＣＨＯ−ＳまたはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のそれぞれからのｃａｔ−Ｌ、ｃａｔ−Ｌ−Ｈｉｓおよび擬似物質）のそれぞれについて、濃縮上清３０μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の４Ｘ（ゲル負荷試料緩衝液の代わり）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、カリフォルニア）１０μＬおよび２μＬの１００ｍＭ ＤＴＴと混合し、８０℃で２０分間インキュベーションした。陽性対照として、１ＸＰＢＳ３０μＬ中の市販の精製組換えカテプシンＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）７５０ｎｇを含ませ、同一処理した。試料の総量（４２μＬ）を４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア、カタログ番号ＥＣ６０２８ＢＯＸ）へローディングし、着色済み分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ５９２５）の着色最前線がゲルの下部に達するまで電気泳動をトリス−グリシンＳＤＳ泳動用緩衝液中で実施した。製造業者の使用説明書にしたがって、Ｉ−Ｂｌｏｔ セミドライブロッティング装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＩＢ１００１）によりタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転移させた。ゲル上の着色済みマーカーバンドの色がほぼ完全に存在しないことにより転移は確認された。室温で２時間、ＰＢＳ中５％脱脂粉乳から成るブロッカー緩衝液で膜を遮断した。ブロッカー中１μｇ／ｍＬ最終濃度で使用し、４℃で一晩インキュベーションしたヒトカテプシンＬ（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア、カタログ番号ＢＭＳ１６６）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ３３／１）、次いで室温で１時間ブロッカー中３３ｎｇ／ｍＬの濃度で使用したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア、カタログ番号ＤＣ０２Ｌ）によりカテプシンＬが検出された。ＴＭＢ Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号６１３５４８）膜展開溶液によりＨＲＰシグナルを展開し、室温で３０分後に反応を止めた。
ウエスタン・ブロット分析は、Ｃａｔ−Ｌに特異的なタンパク質バンドを示した。擬似物質トランスフェクション細胞からは特異的バンドは検出されなかった。Ｃａｔ−ＬおよびＨｉｓ−Ｃａｔ−Ｌの発現レベルは、恐らくは２セルラインにおけるトランスフェクション効率故に、ＤＧ４４細胞の場合よりもＣＨＯ−Ｓ細胞における方が高いと思われた。ウエスタン・ブロット分析結果は、実施例９記載の蛍光性ペプチド基質Ｚ−ＡＭＣによる酵素活性検定法を用いた結果と一致していた。ＣＨＯ−ＳおよびＤＧ４４で発現されたカテプシンＬの分子量は、４４〜４５ＫＤａであり、まだプロペプチドを含んでいるタンパク質の予測サイズと対応している。陽性対照として使用した市販カテプシン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の分子量は、成熟カテプシンＬについては３６ＫＤａであった。トランスフェクションＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞で発現されたタンパク質および市販カテプシンＬ間のサイズの差異は、異なる宿主細胞特異的グリコシル化または市販Ｃａｔ−Ｌからのプロペプチドの除去に起因し得る。
実施例１１
Ａ．合成カテプシン−Ｌおよびカテプシン−Ｌ−Ｈｉｓの生成
成熟ヒトカテプシンＬをコードするＤＮＡ構築物、（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号ＥＡＷ６２７３６のアミノ酸１８〜３３３；配列番号１）を、ＣＨＯ細胞に関するコドン最適化を用いて合成した。コドン最適化は、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ）により列挙された、チャイニーズ・ハムスター（クリセツルス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））についてのコドン最適化表に基づいていた。ヒトカッパＩｇＧ遺伝子ファミリーから設計された異種シグナルペプチド（配列番号２）を含むように構築物を合成することにより、組換えタンパク質を組織培養上清中に分泌させた。最適化カテプシンＬ構築物のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されており、配列番号４に示されたポリペプチドをコードする。５’ＮｈｅＩ制限部位および３’ＢａｍＨＩ制限部位を、構築物合成の一部として組み込んだ。次いで、合成した構築物を、実施例８記載の要領でＨＺ２４（ｂ／ｓ）発現ベクターに導入した。合成Ｃａｔ−Ｌ発現ベクターを、ＨＺ２４（Ｂ／Ｓ）−ＣＡＴ−Ｌと命名し、配列番号５に示す。また、リンカー（ＧＧＧＧＳＧ；配列番号１５）により分離されたＣ−末端６ヒスチジン標識を含む別のＣａｔ−Ｌ構築物も合成した。合成されたＣａｔ−Ｌ−Ｈｉｓ構築物のヌクレオチド配列は、配列番号６に示されており、配列番号７に示されたポリペプチドをコードする。この構築物はまた、構築物合成の一部として組み込まれた、５’ＮｈｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位を含んでおり、ＨＺ２４（ｂ／ｓ）発現ベクターへ導入された。合成Ｃａｔ−Ｌ−Ｈｉｓ発現ベクターを、ＨＺ２４（Ｂ／Ｓ）−ＣＡＴ−Ｌ−Ｈｉｓと命名し、配列番号８に示す。
配列番号５に示した合成Ｃａｔ−Ｌ発現ベクターおよび配列番号８に示した合成Ｃａｔ−Ｌ−Ｈｉｓ発現ベクターを、実施例８記載の要領で電気穿孔法によりＣＨＯ−ＤＧ４４細胞へトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間上清を採取し、実施例８記載の要領で（ｐＨ調節はせず）処理することにより、非活性化カテプシンＬを生成した。
また、組織培養上清を処理することにより、カテプシンＬを活性化させた。これは低ｐＨを用いて達成され、カテプシンＬのプロペプチドを開裂することにより、酵素の活性化を誘発した。合成構築物でトランスフェクションした細胞および非トランスフェクション対照細胞からの上清について、濃縮酸性緩衝液（１０００ｍＭ蟻酸ｐＨ４、１０００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのＥＤＴＡ）を上清にそれぞれ１：１０の比率で加えることによりｐＨ４に調節した。上清を氷上で３０分間インキュベーションすることにより、完全に活性化した。次いで、成熟タンパク質（予測サイズ約３６〜４０ｋＤａ）を保持しながら開裂されたプロペプチド（予測サイズ約１２〜１４ＫＤａ）を通過させ得る、３０ＫＤａ分子量カットオフ遠心濃縮装置（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ、カタログ番号４２４１０）による遠心分離によりそれらを濃縮した。濃縮後、活性化および非活性化上清を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、次いで実施例１０記載のモノクローナルＭａｂ３３／１を用いるウエスタン・ブロットにより分析した。合成カテプシン−ＬおよびＣａｔ−Ｌ−Ｈｉｓは、類似レベルでトランスフェクション細胞の組織培養上清から検出された。非活性化上清におけるカテプシン−ＬおよびＣａｔ−Ｌ−Ｈｉｓの分子量は、プロペプチドが存在しないため、活性化上清における約３６〜４０ｋＤａと比べて約４４ｋＤａであった。
また、実施例９記載の蛍光性ペプチド基質（Ｚ−Ｌ−Ｒ−ＡＭＣ）を用いることにより、カテプシン−Ｌ酵素活性について活性化上清をスクリーニングした。トランスフェクション７２時間後のトランスフェクションＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるＺ−ＡＭＣ検定法により、Ｃａｔ−Ｌ酵素活性をカテプシン−Ｂ阻害剤（宿主カテプシン−Ｂ様酵素活性を遮断するため）の存在下で測定した。結果を下表７に示す。トランスフェクション７２時間後のＣＨＯ−ＤＧ４４トランスフェクション細胞からのカテプシン−Ｌの活性は、擬似物質トランスフェクション宿主細胞からのバックグラウンド活性との比較において約６〜１７倍高かった。選択性カテプシン−Ｂ阻害剤ＣＡ−０７４の存在下で検定することにより、宿主カテプシン−Ｂ様酵素活性の関与は遮断された。したがって、カテプシン−Ｌトランスフェクション組織培養培地における高い酵素活性は、トランスフェクションＣａｔ−Ｌクローンから発現されたＣａｔ−Ｌ特異的活性に起因し得る。
Figure 2014043449
Ｂ．メトトレキサートにおける合成カテプシン−Ｌクローンの選択
上記Ａ項記載の要領で製造した合成カテプシン−Ｌ細胞を、ナトリウムヒポキサンチンおよびチミジンを含まない標準ＣＤ−ＣＨＯ培地において電気穿孔後の限界希釈によりクローニングし、ＤＨＦＲ遺伝子をもつプラスミドをもつ細胞について選択し、次いで、さらにサブクローニングし、５０ｍＭのメトトレキサートの存在下で増殖させることにより、挿入体コピー数を増やした。次いで、２００ｍＭおよび１０００ｍＭでの後続ラウンドのサブクローニングおよび増殖を実施することにより、カテプシンＬの大規模生産での使用に適切なメトトレキサート増幅セルラインを同定した。
１．メトトレキサート非存在下におけるＣａｔ−Ｌ細胞クローンのクローニングおよび同定
メトトレキサートの非存在下で成長する細胞を選択し、Ｃａｔ−Ｌ細胞クローンを同定するため、上記トランスフェクションからの細胞を集め、５００ｘｇでの短い遠心分離により、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（ＧＩＢＣＯ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含み、ヒポキサンチンおよびチミジン補給物を含まない標準ＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄した。最終洗浄後、細胞を計数し、１ｍＬ当たり１００００〜２００００生細胞に希釈した。細胞懸濁液の０．１ｍＬアリコートを、１０個の９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移し入れた。全プレートに追加の０．１ｍＬの同物質を補充した。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。
ヒポキサンチンおよびチミジン非存在下で選択された細胞の成長中のコロニーを含むウェルを、カテプシン−Ｌ酵素検定法と培養ウェルにおける細胞成長の視覚的様相の組み合わせにより同定した。各ウェルの組織培養上清における酵素活性を実施例９記載の要領で評価した。２０クローンが同定された（表７ａ）。
Figure 2014043449
同定されたクローンを、ヒポキサンチンおよびチミジン不含有で１ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地および４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを含む、２４ウェル組織培養プレートの個々のウェルへ増殖させた。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。さらに、細胞を、同培地中におけるＴ−７５組織培養フラスコへ増殖させた。各クローンの３バイアルを、１０％ＤＭＳＯ、４５％条件培地中で冷凍することにより保管した。
２．５０ｎＭメトトレキサートにおける細胞のクローニングおよび同定
細胞をプレート横方向へ１対３およびプレート下方向へ１対２の割合で希釈する二次元無限希釈戦略を用いて、Ｃａｔ−Ｌ酵素活性の増殖および発現を示す２０セルラインサブクローンを、２４ウェルプレートから９６ウェル丸底組織培養プレートへサブクローニングした。希釈したサブクローンを、１ウェル当たり５００の非トランスフェクションＤＧ４４ＣＨＯ細胞のバックグラウンドで成長させることにより、培養における初めの数日に必要な成長因子を供給した。１サブクローンにつき、ヒポキサンチンおよびチミジン不含有で、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地中５０ｎＭのメトトレキサートの最終濃度を含む５プレートを作製した。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。
実施例９記載の要領でＣａｔ−Ｌ酵素活性を測定することにより、組換えヒト（合成）Ｃａｔ−Ｌを発現する、５０ｎＭメトトレキサート中で成長しているサブクローンが同定された。実質的に高い酵素活性を示すウェルを、近隣のウェルと顕微鏡で比較し、高発現性アウトライヤークローンを増殖用に選択した。合計９６の個々のクローンを、ヒポキサンチンおよびチミジン不含有で、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地中５０ｎＭのメトトレキサートの最終濃度を含む１２ウェル組織培養プレートへ増殖させた。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。
７日間あけた異なる２時点で、実施例９記載の分泌されたＣａｔ−Ｌ酵素活性について、これらの９６サブクローンを試験した。７日間にわたってＣａｔ−Ｌ酵素活性の最大増加および顕微鏡下での健康な様相を示すサブクローンを、増殖用に選択した。増殖される７サブクローンは、９Ｅ１２（＃１６）、７Ｇ９（＃５０）、１Ｃ５（＃６９）、４Ｆ４（＃７６）、１Ｆ６（＃７７）、５Ｂ１０（＃９０）および２Ｆ２（＃９２）を含んでいた。これらのサブクローンを、５０ｎＭメトトレキサートの存在下、Ｔ−２５およびＴ−７５フラスコへ増殖させ、冷凍により保管した。
３．２００ｎＭメトトレキサートにおける細胞のクローニングおよび同定
次いで、サブクローン９Ｅ１２（＃１６）、７Ｇ９（＃５０）、１Ｃ５（＃６９）、４Ｆ４（＃７６）、１Ｆ６（＃７７）、５Ｂ１０（＃９０）および２Ｆ２（＃９２）を、２００ｎＭメトトレキサート含有培地中へサブクローニングした。７サブクローンのそれぞれにつき２次元無限希釈戦略を用いて、５個の９６ウェル丸底組織培養プレートをセットアップした。希釈したサブクローンを、２００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（ヒポキサンチンおよびチミジン不含有）中１ウェル当たり５００の非トランスフェクションＤＧ４４ＣＨＯ細胞のバックグラウンドにおいて成長させた。３５プレートを、加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。
実施例９記載の要領で、細胞培養上清においてＣａｔ−Ｌ酵素活性を測定することにより、２００ｎＭメトトレキサート中で培養されながら高レベルのｒＨｕＣａｔ−Ｌを発現するサブクローンが同定された。合計３５のサブクローン（９Ｅ１２（＃１６）、７Ｇ９（＃５０）、１Ｃ５（＃６９）、４Ｆ４（＃７６）、１Ｆ６（＃７７）、５Ｂ１０（＃９０）および２Ｆ２（＃９２）のそれぞれから５）を選択し、２００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（ヒポキサンチンおよびチミジン不含有）中で２４ウェル組織培養プレートへ増殖させた。サブクローンを加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。
３５サブクローンをＣａｔ−Ｌ活性について検定し、最高レベルの分泌酵素活性を発現する１０サブクローンを６ウェル組織培養プレートへ増殖させた。１０クローンおよびそれらのサブクローンを表７ｂに示す。それに続いて、これらの１０サブクローンを、２００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（ヒポキサンチンおよびチミジン不含有）中でＴ７５組織培養フラスコ、次いで振とうフラスコへと増殖させた。サブクローンを成長させている振とうフラスコを増殖させ、細胞を冷凍により保管した。
７を超える継代について小さい振とうフラスコで早期に急速な細胞増殖（短い倍加時間）を示す４つのサブクローン、９Ｅ１２−３Ｄ３および７Ｇ９−２Ｆ２、７Ｇ９−３Ｆ１および７Ｇ９−５Ｆ２を、比較発現および製造試験用の４×１０Ｌ制御式バイオリアクターの接種用に増殖させた。また、４サブクローンを、２００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを補ったＣＤ−ＣＨＯ培地を含む１Ｌ振とうフラスコで連続的に増殖および継代させた。細胞密度および生存能を１日おきに測定し、無細胞保留物を、後日の酵素活性評価用に４℃で貯蔵した。
Figure 2014043449
４．１０００ｎＭメトトレキサートにおける細胞のクローニングおよび同定
９Ｅ１２−１−３Ｄ３および１Ｃ５−３−２Ｆ２について、２００８年７月１日に１０００ｎＭメトトレキサート含有培地中への３回目のサブクローニングを実施した。２サブクローンのそれぞれに対し２次元無限希釈戦略を用いることにより、５つの９６ウェル丸底組織培養プレートをセットアップした。希釈したサブクローンを、加湿インキュベーターでの１０００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ含有（ヒポキサンチンおよびチミジン不含有）ＣＤ−ＣＨＯ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で１ウェル当たり５００の非トランスフェクションＤＧ４４ＣＨＯ細胞のバックグラウンドにおいて成長させた。
１０００ｎＭメトトレキサート中で成長しているサブクローンを含むウェルが、視覚的および顕微鏡検査により同定された。次いで、９Ｅ１２−１−３Ｄ３および１Ｃ５−３−２Ｆ２サブクローンから希釈した成長中の細胞を含む２０のウェル（１サブクローンにつき１０ウェル）を、ウエスタン・ブロットによりｒＨｕＣａｔ−Ｌ発現について検定した。全２０サブクローンを、１０００ｎＭのメトトレキサートおよび４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ含有（ヒポキサンチンおよびチミジン不含有）ＣＤ−ＣＨＯ培地中で１２ウェル組織培養プレートに増殖させ、加湿インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。表７ｃは、２０サブクローン、およびそれらのサブクローンを示す。次いで、１０００ｎＭメトトレキサート中で成長し得るクローンを増殖させ、Ｃａｔ−Ｌ酵素活性について検定し、液体窒素中で冷凍することにより保管した。
Figure 2014043449
Ｂ．カテプシンＬの大規模生産および精製
合成カテプシンＬを大量に精製するため、上記要領で製造したセルライン９Ｅ１２−１−３Ｄ３からの不活化プロカテプシンＬ細胞培養上清を、３６Ｌバイオリアクター中で培養した。バイオリアクター中でインキュベーション後、細胞培養を収集フィルターにより清澄化し、十字流ろ過を用いて濃縮および緩衝液交換し、溶媒／デタージェントによりウイルス不活化し、次いで、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換クロマトグラフィーおよびセラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Ｂｉｏｒａｄ、リッチモンド、カリフォルニア）での連続クロマトグラフィーにより精製した。低ｐＨ（ｐＨ４．５）で処理後、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カチオン交換クロマトグラフィー、ウイルスろ過および十字流ろ過により活性化カテプシンＬをさらに精製した。
まず、一連のフラスコを通して９Ｅ１２−１−３Ｄ３セルラインを増殖させた。簡単に述べると、６×１０５細胞／ｍＬおよび生存率７３％の６継代目の培養物３５ｍＬを、４０ｍＬ／Ｌの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；原液２００ｍＭ）および２００ｎＭのメトトレキサート含有ＣＤ ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により２００ｍＬに拡大させた。４日目、４０ｍＬ／Ｌの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを加えたＣＤ ＣＨＯ培地を用い、６Ｌスパージャー型スピナーにおいて、それを１２００ｍＬに拡大させた。次いで、６Ｌスピナーで、毎回４０ｍＬ／Ｌの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを加えたＣＤ ＣＨＯ培地を用いて、培養物を１１日目には２２００ｍＬ、１５日目には３５００ｍＬおよび最後の１８日目には５０００ｍＬに拡大させた。
８００ｍＬの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ、１００ｍｇの組換えヒトインスリン（ｒＨｕＩｎｓｕｌｉｎ）および３０ｍＬのゲンタマイシンを補ったＣＤ ＣＨＯ培地２０Ｌを含む、３６Ｌバイオリアクターにおいて、４．６×１０５細胞／ｍＬの初回播種密度で接種を行った。培養物を静かに軽く撹拌混合するため、撹拌設定値は８０ＲＰＭ、温度設定値は３７℃、ｐＨ設定値はｐＨ７．１５、および溶解酸素設定値は２５％とした。バイオリアクター容器は、Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＡＤＩ １０３０ コントローラーにより制御される形でろ過空気オーバーレイおよび空気／酸素／ＣＯ２圧入（スパージ）を受けた。Ｏ２気流が必要に応じて一定空気スパージを自動的に補うように、ＤＯコントローラーへの従属装置としてＯ２ソレノイドバルブを用いて、０．１〜０．２ｓｌｐｍの一定空気圧入を与えた。
バイオリアクター稼働中、培養物に様々な間隔でフィード培地を補充することにより、バイオリアクター稼働中、終始栄養分およびグルコースを補い、また、細胞の初期成長相において追加の基本培地濃縮物および ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉを供給することにより、成長速度およびピーク細胞密度を最大にした。追加のタンパク質消化物（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｔｌｒａｆｉｌｔｒａｔｅ ５０ｘ （２００ｇ／Ｌ）； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および酪酸ナトリウムを、バイオリアクター稼働の後期製造相で加え、生成物の発現および分泌を最大にした。蠕動ポンプを介してフィード培地をバイオリアクター中へ滅菌ろ過した。７、１０、１２、１３、１４および１６日目、それぞれ５００ｍＬのフィード＃１〜６を、バイオリアクター細胞キュアへ添加した。フィード＃１およびフィード＃２は、４８．６ｇ／Ｌの粉末状 ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（登録商標）培地、２００ｍＬ／Ｌの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（最終濃度８ｍＭ）、２００ｍＬ／Ｌの Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｔｌｒａｆｉｌｔｒａｔｅ５０ｘ（最終濃度８ｇ／Ｌ）、５０ｇのＤ−グルコース（デキストロース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．１ｇの酪酸ナトリウムを含んでいた。フィード＃３〜フィード＃６は、４８．６ｇ／Ｌの粉末状ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（登録商標）培地、１００ｍＬ／Ｌの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（最終濃度４ｍＭ）、３００ｍＬ／Ｌの Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｔｌｒａｆｉｌｔｒａｔｅ５０ｘ（最終濃度１２ｇ／Ｌ）、４０ｇのＤ−グルコース（デキストロース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．６ｇの酪酸ナトリウムを含んでいた。トリパンブルー染色での血球計により生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率％、および残留グルコースについて試験するため、各フィード供給前および採取（１９日目）前に細胞培養物から試料を採取した。表８は、試験の結果を示す。
Figure 2014043449
１９日目にバイオリアクターを収集し、細胞培養物（約２８．５Ｌ）をろ過により清澄化して、細胞および細胞屑を除去した。細胞除去および清澄化ろ過工程は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｏｄ フィルターＤ０ＨＣ（０．５ｍ２）およびＡ１ＨＣ（０．１ｍ２）により構成された。まず、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｏｄ を注射用水（ＷＦＩ）で洗い流し、ＰＢＳで平衡状態にした後採取物を加えた。清澄化後、小型カプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ３００， ０．４５ μｍ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を介して、採取した細胞培養流体（ＨＣＣＦ）を貯蔵バッグ中へろ過した。ＨＣＣＦ（３１．６Ｌ、培養上清２８．５ＬおよびＰＢＳ水洗量３．１Ｌから成る）を補充して、５０ｍＭのトリスを得、２〜８℃で貯蔵した。
次いで、ＨＣＣＦを濃縮し、３０ｋＤａ分子量カットオフのＰＥＳ膜５ｘ１ｆｔ２から成る十字流ろ過（ＴＦＦ）によりダイアフィルトレーションにかけた。まず、膜を２０ｍＭのＢｉｓ−トリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で平衡状態にした。３１．６ＬのＨＣＣＦを、３Ｌに１０ｘ濃縮したＴＦＦ系に加え、次いで２８Ｌの２０ｍＭのＢｉｓ−トリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０によるダイアフィルトレーションにかけた。濃縮ＨＣＣＦを、０．２μｍフィルターでろ過することにより、３Ｌの最終量を得た。室温で９０分間、濃縮／緩衝液交換採取物を１％トリトンＸ−１００および０．３％トリ−ｎ−ブチルリン酸で処理することにより、ウイルス不活化を実施した。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換カラムを調製した。無菌化、負荷および中和後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭのＢｉｓ−トリス（ｐＨ７．０）で平衡状態にした。ウイルス不活化後、濃縮した緩衝液交換採取物を、全段階について５分の滞留時間を用いてＱカラムにローディングした（４０７ｃｍ／時）。カラムを、５カラム容量の２０ｍＭのＢｉｓ−トリス（ｐＨ７．０）および５カラム容量の２０ｍＭのＢｉｓ−トリス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で連続洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのＢｉｓ−トリス、１６０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で溶離した。
セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラム（ＢｉｏＲａｄ）を、無菌化、負荷および中和後５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡状態にした。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 精製タンパク質を、全段階について５分の滞留時間を用いてＣＨＴカラムにローディングした（２５７ｃｍ／時）。カラムを、５カラム容量の５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および５カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で連続洗浄した。タンパク質を７０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で溶離した。
次いで、０．５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）でｐＨを４．５に調節することにより、プロカテプシンＬをカテプシンＬに活性化した。活性化後、カテプシンＬを ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）イオン交換カラムを調製し、無菌化、負荷および中和後、５カラム容量の５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡状態にした。ローディング前、活性化カテプシンＬを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で２倍に希釈した。活性化カテプシンＬを、全段階について５分の滞留時間を用いてＳＰＦＦカラムにローディングした（２５３ｃｍ／時）。カラムを５カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５により洗浄した。タンパク質を５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０で溶離した。次いで、精製タンパク質をろ過することにより、ウイルスを除去し、例えば１〜２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
実施例１２
可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）発現セルラインの生成
ＨＺ２４プラスミド（配列番号２２４に示す）を用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションした。可溶性ｒＨｕＰＨ２０構築物をコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの天然シグナルリーダーのアミノ酸１位にあるメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位およびコザック共通配列、およびヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸４８２位にあるチロシンをコードするＤＮＡの後に停止コドン、次いでＢａｍＨＩ制限部位を含む。従って、構築物ｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ（ＨＺ−２４）は、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）により分けられた、ＰＨ２０のアミノ酸１〜４８２（配列番号２２５に示す）およびジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸１〜１８７（配列番号２６１に示す）をコードするＣＭＶプロモーターにより駆動された単一ｍＲＮＡ種をもたらす。
非トランスフェクションＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）および１８ｍｌのプルロニックＦ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤＨＦＲ（−）細胞用のＧＩＢＣＯ 改変ＣＤ−ＣＨＯ培地で増殖させ、トランスフェクションに備えた振とうフラスコ中０．５×１０６細胞／ｍｌで播種した。細胞を、１２０ｒｐｍで振とうしながら、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。指数的に増殖している非トランスフェクションＤＧ４４ ＣＨＯ細胞を、トランスフェクション前に生存能について試験した。
非トランスフェクションＤ４４ ＣＨＯ細胞培養の６０００万の生細胞を、沈降させ、０．７ｍＬの２×トランスフェクション緩衝液（２×ＨｅＢＳ：４０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．０、２７４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭのデキストロース）に再懸濁し、２×１０７細胞の密度とした。再懸濁細胞の各アリコートに、０．０９ｍＬ（２５０μｇ）の線状ＨＺ２４プラスミド（ＣｌａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）での一晩消化により線状化した；線状ＨＺ２４プラスミドを配列番号１９に示す）を加え、細胞／ＤＮＡ溶液を、室温で０．４ｃｍギャップＢＴＸ（Ｇｅｎｔｒｏｎｉｃｓ）電気穿孔用キュベット中へ移した。細胞と混合されるプラスミドＤＮＡが無い形で陰性対照電気穿孔を実施した。細胞／プラスミド混合物を、３３０Ｖおよび９６０μＦまたは３５０Ｖおよび９６０μＦのコンデンサ放電により電気穿孔した。
電気穿孔後、細胞をキュベットから取り出し、４ｍＭのグルタミンおよび１８ｍｌのプルロニックＦ６８／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤＨＦＲ（−）細胞用の改変ＣＤ−ＣＨＯ培地５ｍＬ中に移し、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２中３７℃で２日間、選択せずに６ウェル組織培養プレートの１ウェルで増殖させた。
電気穿孔の２日後、０．５ｍＬの組織培養培地を各ウェルから取り出し、ヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した（実施例１６参照）。結果を下表８に示す。
Figure 2014043449
トランスフェクション２（３５０Ｖ）からの細胞を、組織培養ウェルから集め、計数し、１ｍＬ当たり１×１０４〜２×１０４生細胞に希釈した。細胞懸濁液の０．１ｍＬアリコートを、５個の９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移し入れた。ヒポキサンチンおよびチミジン補給物不含有で、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−１補給物（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）１００マイクロリットルを、細胞を含む各ウェルに加えた（最終量０．２ｍＬ）。
メトトレキサートの非存在下で成長させた５プレートから１０クローンが同定された（表９参照）。
Figure 2014043449
６個のＨＺ２４クローンを、培養で増殖させ、単一細胞懸濁液として振とうフラスコ中へ移した。上方左手ウェルにある５０００細胞から出発してプレート下方向へ１：２およびプレート横方向へ１：３に細胞を希釈する２次元無限希釈戦略を用いて、クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１および４Ｄ１０を、９６ウェル丸底組織培養プレート中へ平板培養した。希釈したクローンを、１ウェル当たり５００の非トランスフェクションＤＧ４４ ＣＨＯ細胞のバックグラウンドで増殖させることにより、培養の始めの数日間に必要な成長因子を供給した。１サブクローンにつき１０プレートを調製し、５プレートは５０ｎＭのメトトレキサートを含み、５プレートはメトトレキサートを含まないものとした。
クローン３Ｄ３は、目に見える２４のサブクローン（メトトレキサート処理をしなかったものから１３および５０ｎＭメトトレキサート処理をしたものから１１）を生じた。２４サブクローンのうち８からの上清で顕著なヒアルロニダーゼ活性が測定され（＞５０単位／ｍＬ）、これらの８クローンを、適切な場合５０ｎＭのメトトレキサートの存在下、Ｔ−２５組織培養フラスコ中へ増殖させた。さらにクローン３Ｄ３（５０ｎＭ）を５００ｎＭのメトトレキサート中で増殖させることにより、振とうフラスコ中で１０００単位／ｍｌより多く生産するクローンが生じた（クローン３Ｄ３５Ｍ；世代１またはＧｅｎ１ ３Ｄ３５Ｍ）。
実施例１３
Ｇｅｎ１ヒトｓＰＨ２０の製造および精製
Ａ．５Ｌバイオリアクター過程
３Ｄ３５Ｍのバイアルを解凍し、１００ｎＭのメトトレキサートおよび ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中振とうフラスコから１Ｌスピナーフラスコ中へ増殖させた。細胞を、スピナーフラスコから５Ｌバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）へ４×１０５生細胞／ｍｌの接種密度で導入した。パラメーターは、温度設定値３７℃、ｐＨ７．２（出発設定値）、溶解酸素設定値２５％および空気オーバーレイ０〜１００ｃｃ／分であった。１６８時間後、フィード＃１培地（５０ｇ／Ｌグルコースを含むＣＤ ＣＨＯ）２５０ｍｌを加えた。２１６時間後、フィード＃２培地（５０ｇ／Ｌグルコースおよび１０ｍＭの酪酸ナトリウムを含むＣＤ ＣＨＯ）２５０ｍｌを加え、２６４時間後、２５０ｍｌのフィード＃２培地を加えた。この過程は、１ｍｌ当たり１６００単位の最終生産性をもたらし、最大細胞密度は６×１０６細胞／ｍｌであった。酪酸ナトリウムの添加は、最終製造段階における可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産性を劇的に向上させるものであった。
３Ｄ３５Ｍクローンからの条件培地を、深層ろ過および１０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．０）への十字流ダイアフィルトレーションにより清澄化した。次いで、可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換での連続クロマトグラフィー、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、フェニルボロン酸（Ｐｒｏｍｅｔｉｃｓ）およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Ｂｉｏｒａｄ、リッチモンド、カリフォルニア）により精製した。
可溶性ｒＨｕＰＨ２０はＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合し、同緩衝液中において４００ｍＭのＮａＣｌで溶離した。溶離液を２Ｍ硫酸アンモニウムにより５００ｍＭ硫酸アンモニウムの最終濃度に希釈し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（低サブ）カラムに通し、次いで同一条件下でフェニルボロン酸樹脂に結合させた。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、硫酸アンモニウム不含有の５０ｍＭビシン中ｐＨ９．０で洗浄後、ヘペス（ｐＨ６．９）中のフェニルセファロース樹脂から溶離した。溶離液を、５ｍＭリン酸カリウムおよび１ｍＭのＣａＣｌ２中のセラミックハイドロキシアパタイト樹脂（ｐＨ６．９）へローディングし、８０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭのＣａＣｌ２で溶離した。
生成した精製可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、ＵＳＰリファレンス標準を用いる微濁度検定法（実施例１６）によると、６５０００ＵＳＰ単位／ｍｇ（タンパク質）を超える比活性を有していた。精製ｓＰＨ２０は、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏおよび０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％Ｈ２Ｏ間の勾配でＰｈａｒｍａｃｉａ５ＲＰＣスチレンジビニルベンゼンカラムから２４〜２６分までの単一ピークとして溶離し、ＳＤＳ電気泳動により単一の広い６１ｋＤａバンドとして分割され、ＰＮＧＡＳＥ−Ｆ処理後、鋭い５１ｋＤａバンドに縮小した。Ｎ−末端アミノ酸配列決定は、リーダーペプチドが有効に除去されたことを示していた。
Ｂ．１００Ｌバイオリアクター細胞培養への上流細胞培養拡大製法
拡大製法を用いることにより、３Ｄ３５Ｍ細胞の異なる４バイアルから可溶性ｒＨｕＰＨ２０を別々に精製し、ｓＨｕＰＨ２０の別々の４バッチ、ＨＵＡ０４０６Ｃ、ＨＵＡ０４１０Ｃ、ＨＵＡ０４１５ＣおよびＨＵＡ０４２０Ｃを製造した。各バイアルを別々に拡大させ、１２５Ｌバイオリアクターを通して培養し、次いで、カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。本製法全体を通して試料を採取し、酵素が生じると上記パラメーターについて評価した。下記で提供している製法の説明は、バイオリアクター開始およびフィード培地量、導入細胞密度、および洗浄および溶離量などの物事に関する代表的な明細を示す。正確な数はバッチごとに僅かに変化し、表３〜１０で詳述されている。
４バイアルの３Ｄ３５Ｍ細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１０ｎＭのメトトレキサートおよび４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含むＣＤ ＣＨＯを加え、細胞を遠心分離にかけた。細胞を、２０ｍＬの新鮮な培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコ中で再懸濁し、３７℃、７％ＣＯ２インキュベーター中に入れた。１２５ｍＬ振とうフラスコ中で細胞を４０ｍＬに拡大させた。細胞密度が１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養物を１００ｍＬ培養量で１２５ｍＬスピナーフラスコへ拡大させた。フラスコを、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養物を２００ｍＬ培養量で２５０ｍＬスピナーフラスコへ拡大させ、フラスコを３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養物を８００ｍＬ培養量で１Ｌスピナーフラスコへ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養物を５Ｌ培養量で６Ｌスピナーフラスコへ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、培養物を２０Ｌ培養量で３６Ｌスピナーフラスコへ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。
１２５Ｌリアクターを１２１℃で蒸気により滅菌し、２０ＰＳＩおよび６５ＬのＣＤ ＣＨＯ培地を加えた。使用前、リアクターを汚染についてチェックした。３６Ｌスピナーフラスコ中の細胞密度が１．８〜２．５×１０６細胞／ｍＬに達したとき、２０Ｌの細胞培養物を、３６Ｌスピナーフラスコから１２５Ｌのバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）へ、最終量８５Ｌおよび播種密度約４×１０５細胞／ｍＬで移した。パラメーターは、温度設定値、３７℃；ｐＨ：７．２；溶解酸素：２５％±１０％；インペラー速度５０ｒｐｍ；容器圧３ｐｓｉ；空気スパージ１Ｌ／分；空気オーバーレイ：１Ｌ／分であった。細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質生産および保持を調べるため、毎日リアクターから試料を採取した。実施中、栄養飼料を加えた。６日目、３．４Ｌのフィード＃１培地（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−１）を加え、培養温度を３６．５℃に変えた。９日目、３．５Ｌのフィード＃２（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−１＋１．１ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変えた。１１日目、３．７Ｌのフィード＃３（ＣＤ ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋４０ｍＬ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−１＋１．１ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変えた。１４日目または細胞の生存率が５０％未満に低下したとき、リアクターを収集した。この過程の結果、酵素活性が１６００単位／ｍｌおよび最大細胞密度が８００万細胞／ｍＬである可溶性ｒＨｕＰＨ２０が製造された。採取時、マイコプラズマ、バイオバーデン、内毒素、およびインビトロおよびインビボでのウイルス、ウイルス粒子に関する透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）および酵素活性について調べるため培養物から試料を採取した。
１００リットルのバイオリアクター細胞培養収集物を、ポリエーテルスルホン材質（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を有する一連の使い捨てカプセルフィルター：最初８．０μｍ深さのカプセル、０．６５μｍ深さのカプセル、０．２２μｍカプセルに通し、最後に０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２０００ｃｍ２フィルターに通し、１００Ｌの無菌貯蔵バッグ中へろ過した。スパイラルポリエーテルスルホン３０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターによる２ＴＦＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて培養物を１０×濃縮し、次いで１０ｍＭのヘペス、２５ｍＭのＮａ２ＳＯ４（ｐＨ７．０）により６×緩衝液交換を実施し、０．２２μｍ最終フィルターに通して２０Ｌ無菌貯蔵バッグ中へろ過した。表１０は、細胞培養、収集、濃縮および緩衝液交換段階に関連したモニタリングデータを示す。
Figure 2014043449
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラム（３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を調製した。ｐＨ、伝導性の測定および内毒素（ＬＡＬ）検定用に洗浄試料を採取した。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４（ｐＨ７．５）により平衡状態にした。濃縮し、ダイアフィルトレーションにかけた収集物を、１００ｃｍ／時の流速でＱカラムにローディングした。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄した。タンパク質を１０ｍＭのヘペス、４００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で溶離し、０．２２μｍの最終フィルターに通して滅菌バッグへろ過した。
次に、フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（９．１Ｌ樹脂、高さ＝２９ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）を調製した。カラムを、５カラム容量の５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０により平衡状態にした。上記によるタンパク質溶離液に、２Ｍの硫酸アンモニウム、１Ｍのリン酸カリウムおよび１ＭのＣａＣｌ２保存用標準溶液を補充して、それぞれ５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度とした。タンパク質を１００ｃｍ／時の流速でＰＳカラムにローディングした。５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を１００ｃｍ／時の流速で加えた。フロースルーを０．２２μｍ最終フィルターに通して滅菌バッグ中へろ過した。
ＰＳ精製タンパク質を、５カラム容量の５ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムで平衡状態にしておいたアミノフェニルボロン酸カラム（ＰｒｏＭｅｄｉｃｓ）（６．３Ｌ樹脂、高さ＝２０ｃｍ、直径＝２０ｃｍ）へローディングした。タンパク質を１００ｃｍ／時の流速でカラムに通し、カラムを５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で洗浄した。次いで、カラムを２０ｍＭのビシン、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０で洗浄し、タンパク質を、５０ｍＭのヘペス、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．９）で滅菌フィルターから２０Ｌ滅菌バッグへ溶離した。溶離液をバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（ＢｉｏＲａｄ）（１．６Ｌ樹脂、高さ＝１０ｃｍ、直径＝１４ｃｍ）を、５ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０により平衡状態にした。洗浄試料を収集し、ｐＨ、伝導性および内毒素（ＬＡＬ検定法）について試験した。アミノフェニルボロン酸精製タンパク質に、リン酸カリウムおよびＣａＣｌ２を補い、５ｍＭリン酸カリウムおよび０．１ｍＭＣａＣｌ２の最終濃度とし、１００ｃｍ／時の流速でＨＡＰカラムへローディングした。カラムを５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、次いで１０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ）により洗浄した。タンパク質を７０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）で溶離し、０．２２μｍフィルターに通して５Ｌ滅菌貯蔵バッグ中へろ過した。溶離液を、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
次いで、ＨＡＰ精製タンパク質を、圧力タンクを介し、２０ｎＭウイルス除去フィルターに通してポンプで輸送した。タンパク質をＤＶ２０圧力タンクおよびフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に添加し、２０ｎｍ孔のＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ２０フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に通し、無菌２０Ｌ貯蔵バッグへ導入した。濾液をタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロファイリング、および製造過程に関連した不純物について試験した。次いで、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ 十字流ろ過（ＴＦＦ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、濾液中のタンパク質を１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。まず、ヘペス／食塩水溶液（１０ｍＭのヘペス、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄することにより、フィルターを準備し、ｐＨおよび伝導性を調べるため透過物から試料を採取した。濃縮後、濃縮タンパク質の試料を採取し、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮タンパク質に対し、最終緩衝液：１０ｍＭのヘペス、１３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）まで６×緩衝液交換を実施した。濃縮タンパク質を０．２２μｍフィルターに通して２０Ｌ無菌貯蔵バッグへ導入した。タンパク質から試料を採取し、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリンおよび容量オスモル濃度について試験した。
表１１〜１７は、各３Ｄ３５Ｍ細胞ロットについての上記精製段階のそれぞれに関連したモニタリングデータを示す。
Figure 2014043449
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精製および濃縮した可溶性ｒＨｕＰＨ２０タンパク質を、５ｍＬおよび１ｍＬ充填容量の滅菌バイアル中へ無菌充填した。０．２２μｍフィルターを介して、タンパク質をオペレーター制御ポンプへ通し、それを用いることにより、重量測定読出し装置を用いてバイアルを充填した。バイアルをストッパーで閉じ、クリンプキャップで固定した。閉じたバイアルを外来粒子について目視検査し、次いでラベルを貼った。ラベル貼付後、バイアルを１分以内の間液体窒素中に沈めて急速冷凍し、−１５℃以下（−２０±５℃）で貯蔵した。
実施例１４
可溶性ヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を含むＧｅｎ２細胞の製造
実施例１２記載のＧｅｎ１ ３Ｄ３５Ｍセルラインを、さらに高レベルのメトトレキサートに適合化させることにより、世代２（Ｇｅｎ２）クローンを製造した。３Ｄ３５Ｍ細胞を、確立されたメトトレキサート含有培養物から４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）および１．０μＭメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地へ播種した。細胞を３７℃、７％ＣＯ２加湿インキュベーター中４６日間にわたって成長させ、９回継代することにより、細胞をさらに高レベルのメトトレキサートに適合化させた。２．０μＭメトトレキサート含有培地を含む９６ウェル組織培養プレート中で限界希釈することにより、細胞の増幅集団をクローニングした。約４週間後、クローンが同定され、クローン３Ｅ１０Ｂを拡大用に選択した。２０継代用に、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）および２．０μＭメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地で３Ｅ１０Ｂ細胞を成長させた。３Ｅ１０Ｂセルラインのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製し、冷凍し、後続の試験に使用した。
４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）および４．０μＭメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地で３Ｅ１０Ｂ細胞を培養することにより、セルラインの増幅を続行した。第１２継代後、細胞を、リサーチ細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で冷凍した。ＲＣＢの１バイアルを解凍し、８．０μＭメトトレキサート含有培地中で培養した。５日後、培地中のメトトレキサート濃度は、１６．０μＭに増加し、１８日後には２０．０μＭに増加した。２０．０μＭメトトレキサート含有培地中の第８継代からの細胞を、４ｍＭの ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）および２０．０μＭメトトレキサートを含むＣＤ ＣＨＯ培地を含む９６ウェル組織培養プレートでの限界希釈によりクローニングした。５〜６週間後、クローンが同定され、クローン２Ｂ２を、２０．０μＭメトトレキサート含有培地での拡大用に選択した。第１１継代後、２Ｂ２細胞を、リサーチ細胞バンク（ＲＣＢ）としてバイアル中で冷凍した。
生成した２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を発現するジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ｄｈｆｒ−）ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は、約２０６コピー／細胞のコピー数で２Ｂ２細胞に存在する。ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを用いるＳｐｅＩ−、ＸｂａＩ−およびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−消化ゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡのサザーン・ブロット分析は、以下の制限消化プロフィールを明らかにした：ＳｐｅＩで消化されたＤＮＡにより観察された〜７．７ｋｂの１つの主たるハイブリダイゼーションバンドおよび４つの小ハイブリダイゼーションバンド（〜１３．９、〜６．６、〜５．７および〜４．６ｋｂ）；ＸｂａＩで消化されたＤＮＡにより観察された〜５．０ｋｂの１つの主たるハイブリダイゼーションバンドおよび２つの小ハイブリダイゼーションバンド（〜１３．９および〜６．５ｋｂ）；およびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された２Ｂ２ＤＮＡを用いて観察された〜１．４ｋｂの１つの単ハイブリダイゼーションバンド。
実施例１５
Ａ．３００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造
ＨＺ２４−２Ｂ２のバイアルを解凍し、２０μＭのメトトレキサートおよびＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中振とうフラスコから３６Ｌスピナーフラスコ中へ拡大させた。簡単に述べると、細胞のバイアルを、３７℃水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離にかけた。２０ｍＬの新鮮な培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコ中で細胞を再懸濁し、３７℃、７％ＣＯ２インキュベーター中に入れた。１２５ｍＬ振とうフラスコ中で細胞を４０ｍＬまで拡大させた。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培養物を１００ｍＬ培養量で１２５ｍＬスピナーフラスコ中へ拡大させた。フラスコを、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培養物を２００ｍＬ培養量で２５０ｍＬスピナーフラスコ中へ拡大させ、フラスコを３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培養物を８００ｍＬ培養量で１Ｌスピナーフラスコ中へ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培養物を５０００ｍＬ培養量で６Ｌスピナーフラスコ中へ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞密度が１．５×１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培養物を３２Ｌ培養量で３６Ｌスピナーフラスコ中へ拡大させ、３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。
４００Ｌリアクターを滅菌し、２３０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を加えた。使用前、リアクターを汚染についてチェックした。約３０Ｌの細胞を、１ｍｌ当たり約４×１０５生細胞の接種密度および総量２６０Ｌで３６Ｌスピナーフラスコから４００Ｌのバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ）へ移した。パラメーターは、温度設定値、３７℃；インペラー速度４０〜５５ＲＰＭ；容器圧３ｐｓｉ；空気スパージ０．５〜１．５Ｌ／分；空気オーバーレイ：３Ｌ／分であった。細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質生産および保持を調べるため、毎日リアクターから試料を採取した。また実施中、栄養飼料を加えた。１２０時間（５日）目、１０．４Ｌのフィード＃１培地（４×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋１６０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）＋８３ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋３３ｍｇ／ＬのｒＨｕＩｎｓｕｌｉｎ）を加えた。１６８時間（７日）目、１０．８Ｌのフィード＃２（２×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌのグルコース＋８０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）＋１６７ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６．５℃に変えた。２１６時間（９日）目、１０．８Ｌのフィード＃３（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋５０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）＋２５０ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋１．８０ｇ／Ｌの酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変えた。２６４時間（１１日）目、１０．８Ｌのフィード＃４（１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋３３ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（登録商標）＋２５０ｍＬ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ＋０．９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５．５℃に変えた。フィード培地の添加は、最終製造段階における可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産性を劇的に向上させることが観察された。１４または１５日目または細胞の生存率が４０％未満に低下したとき、リアクターを収集した。この過程の結果、１２００万細胞／ｍＬの最大細胞密度で１ｍｌ当たり１７０００単位の最終生産性が達成された。採取時、マイコプラズマ、バイオバーデン、内毒素およびインビトロおよびインビボでのウイルス、透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）および酵素活性について調べるため培養物から試料を採取した。
培養物を蠕動ポンプにより送り出し、まずそれぞれ４〜８μｍ浄化度の珪藻土層および１．４〜１．１μｍ浄化度の珪藻土層、次いでセルロース膜を含む、並行した４つの Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ろ過システムモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、次いで０．４〜０．１１μｍ浄化度の珪藻土層および０．１μｍ未満浄化度の珪藻土層、次いでセルロース膜を含む第２の単一Ｍｉｌｌｉｓｔａｋろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、次いで０．２２μｍ最終フィルターに通して、３５０Ｌ収容力の滅菌単回使用可撓性バッグへ導入した。収集した細胞培養液に、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのトリスを補ってｐＨ７．５とした。４つのＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ十字流ろ過（ＴＦＦ）３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）を用いるＴＦＦ装置で培養物を１０×濃縮し、次いで１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５により１０×緩衝液交換を実施し、０．２２μｍ最終フィルターに通して５０Ｌ滅菌貯蔵バッグへ導入した。
濃縮した、ダイアフィルトレーション収集物をウイルスについて不活化した。ウイルス不活化前、１０％トリトンＸ−１００、３％トリ（ｎ−ブチル）リン酸（ＴＮＢＰ）の溶液を調製した。濃縮した、ダイアフィルトレーション収集物を、Ｑカラムでの精製直前に３６Ｌガラス反応容器中で１％トリトンＸ−１００、０．３％ＴＮＢＰに１時間暴露した。
Ｂ．Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラム（９Ｌ樹脂、Ｈ＝２９ｃｍ、Ｄ＝２０ｃｍ）を準備した。洗浄試料を、ｐＨ、伝導性測定および内毒素（ＬＡＬ）検定用に収集した。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭトリス、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５で平衡状態にした。ウイルス不活化後、濃縮した、ダイアフィルトレーション収集物を、１００ｃｍ／時の流速でＱカラムにローディングした。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５および１０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。タンパク質を、１０ｍＭのヘペス、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で０．２２μｍ最終フィルターに通して溶離し、滅菌バッグに導入した。溶離液試料を、バイオバーデン、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について試験した。交換の最初と最後にＡ２８０吸光度読取を行った。
次に、フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。フェニル−セファロース（ＰＳ）カラム（１９〜２１Ｌ樹脂、高さ＝２９ｃｍ、直径＝３０ｃｍ）を準備した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導性および内毒素（ＬＡＬ検定法）を調べるために試料を採取した。カラムを、５カラム容量の５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０により平衡状態にした。Ｑセファロースカラムからのタンパク質溶離液に、２Ｍの硫酸アンモニウム、１Ｍのリン酸カリウムおよび１ＭのＣａＣｌ２保存用標準溶液を添加して、それぞれ５ｍＭ、０．５Ｍおよび０．１ｍＭの最終濃度とした。タンパク質を１００ｃｍ／時の流速でＰＳカラムにローディングし、カラムのフロースルーを集めた。カラムを、１００ｃｍ／時で５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０により洗浄し、集めたフロースルーに洗浄液を加えた。フロースルーをカラム洗浄液と合わせ、０．２２μｍ最終フィルターに通して滅菌バッグ中へろ過した。バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性を調べるためフロースルーから試料を採取した。
アミノフェニルボロン酸カラム（Ｐｒｏｍｔｉｃｓ）を準備した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導性および内毒素（ＬＡＬ検定法）を調べるために試料を採取した。カラムを、５カラム容量の５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウムにより平衡状態にした。精製タンパク質を含むＰＳフロースルーを、１００ｃｍ／時の流速でアミノフェニルボロン酸カラムへローディングした。カラムを、５ｍＭのリン酸カリウム、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭのビシン、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ９．０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭのビシン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ９．０で洗浄した。タンパク質を５０ｍＭのヘペス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９で溶離し、滅菌フィルターに通して滅菌バッグへ注入した。溶離試料を、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を準備した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導性および内毒素（ＬＡＬ検定法）について試験した。カラムを、５ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０により平衡状態にした。アミノフェニルボロン酸精製タンパク質を添加して５ｍＭのリン酸カリウムおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２の最終濃度とし、１００ｃｍ／時の流速でＨＡＰカラムにローディングした。カラムを、５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２により洗浄した。次に、カラムを、１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２により洗浄した。タンパク質を、７０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７で溶離し、０．２２μｍ滅菌フィルターに通して滅菌バッグへ注入した。溶離試料を、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。
次いで、ＨＡＰ精製タンパク質を、ウイルス除去フィルターに通した。まず、２Ｌの７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で洗浄することにより、滅菌Ｖｉｏｓａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を調製した。使用前、ｐＨおよび伝導性を調べるためろ過した緩衝液から試料を採取した。ＨＡＰ精製タンパク質を、蠕動ポンプにより２０ｎＭウイルス除去フィルターに通した。７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０中のろ過したタンパク質を、０．２２μｍ最終フィルターに通して滅菌バッグへ導入した。ウイルスろ過した試料を、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロファイリングについて試験した。また、試料を製造過程に関連した不純物について試験した。
次いで、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ十字流ろ過（ＴＦＦ）システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、濾液中のタンパク質を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。まず、１０ｍＭのヒスチジン、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で洗浄することによりフィルターを準備し、ｐＨおよび伝導性を調べるため、透過物から試料を採取した。濃縮後、濃縮タンパク質から試料を採取し、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮タンパク質に対し、最終緩衝液：１０ｍＭのヒスチジン、１３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０への６×緩衝液交換を実施した。緩衝液交換後、濃縮タンパク質を、０．２２μｍフィルターに通して２０Ｌ滅菌貯蔵バッグへ導入した。タンパク質から試料を採取し、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよびオスモル濃度について試験した。
次いで、滅菌ろ過したバルクタンパク質を、３０ｍＬの滅菌テフロン製バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中へ２０ｍＬで無菌分注した。次いで、バイアルを急速冷凍し、−２０±５℃で貯蔵した。
Ｃ．Ｇｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０およびＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製の比較
３００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製は、１００Ｌバイオリアクター細胞培養におけるＧｅｎ１可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製（実施例１３．Ｂに記載）と比べてプロトコルに若干の変更を含んでいた。表１８は、これらの方法間における単純な拡大変化に加えて具体例としての差異を示す。
Figure 2014043449
Figure 2014043449
実施例１６
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の測定
ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときの不溶性沈殿物の形成に基づく比濁分析検定法を用いて、細胞培養物、精製フラクションおよび精製溶液などの試料中における可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を測定した。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と一定の設定期間（１０分）インキュベーションし、次いで酸性化血清アルブミンを加えて未消化ヒアルロン酸ナトリウムを沈降させることにより、活性を測定する。３０分の展開期間後、生成した試料の濁度を６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対する酵素活性に起因する濁度の減少は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０酵素活性の尺度である。可溶性ｒＨｕＰＨ２０検定実用参照標準物質の希釈液で作成した検量線を用いて、この方法を実施し、この検量線に対応させて試料活性測定を実施する。
試料の希釈液を、酵素希釈液で調製した。５０ｍＭのＰＩＰＥＳ反応緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ５．５）２５．０ｍＬおよびＳＷＦＩ２５．０ｍＬに３３．０±０．０５ｍｇの加水分解ゼラチンを溶解し、０．２ｍＬの２５％ブミネート溶液を混合物中へ希釈し、３０秒間ボルテックスすることにより、酵素希釈液を調製した。使用前２時間以内にこれを実施し、必要時まで氷上で貯蔵した。試料を推定１〜２Ｕ／ｍＬに希釈した。一般的に、１段階当たりの最大希釈率が１：１００を超えることはなく、初回希釈に関する最初の試料サイズは、２０μＬ以上であった。検定法の実施に必要とされる最小試料量は、製造過程の試料、ＦＰＬＣフラクション：８０μＬ；組織培養上清：１ｍＬ；濃縮材料８０μＬ；精製または最終段階材料：８０μＬであった。低タンパク質結合９６ウェルプレートにおいて希釈液をトリプリケイトで作製し、それぞれの希釈液３０μＬを、Ｏｐｔｉｌｕｘ 黒色／透明底プレート（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。
２．５Ｕ／ｍＬ濃度の既知可溶性ｒＨｕＰＨ２０の希釈液を、酵素希釈液で調製して標準曲線を作成し、トリプリケイトで Ｏｐｔｉｌｕｘ プレートに加えた。希釈液は、０Ｕ／ｍＬ、０．２５Ｕ／ｍＬ、０．５Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬ、２．０Ｕ／ｍＬおよび２．５Ｕ／ｍＬを含んでいた。６０μＬの酵素希釈液を含む「試薬ブランク」ウェルを陰性対照としてプレートに含ませた。次いで、プレートをカバーし、３７℃で５分間、加熱ブロックで温めた。カバーを取り除き、プレートを１０秒間振とうした。振とう後、プレートを加熱ブロックに戻し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ ３８４ 液体操作装置に、ＳＷＦＩ２０．０ｍＬ中の０．２５ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸ナトリウム溶液（１００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＣｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）をＳＷＦＩ２０．０ｍＬに溶解することにより調製）を注入した。これを、２〜８℃で２〜４時間、または完全に溶解するまで静かに回転させ、および／または揺らすことにより混合した。反応プレートを ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４ に移し入れ、開始キーを押して３０μＬのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルへ分注することにより反応を開始させた。次いで、プレートを ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４ から取り出し、１０秒間振とうした後、プレートカバーをかけた加熱ブロックに移した。プレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。
ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４を準備し、機械に血清使用溶液を注入し、容量設定を２４０μＬに変えることにより反応を停止させた。（５００ｍＭの酢酸緩衝液７５ｍＬ中の２５ｍＬの血清保存用標準溶液［１容量のウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を、９容量の５００ｍＭ酢酸緩衝液で希釈し、ｐＨを塩酸で３．１に調節した］）。プレートを加熱ブロックから取り出し、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ３８４へ設置し、２４０μＬの血清使用溶液をウェルに分配した。プレートを取り出し、プレート読取装置上で１０秒間振とうした。さらに１５分後、試料の濁度を６４０ｎｍで測定し、標準曲線にあてはめることにより各試料の酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を測定した。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）で割ることにより、比活性（Ｕ／ｍｇ）を計算した。
実施例１７
カテプシン−Ｌは、ズカーラットの皮下空間における線維性中隔を切断する
ズカーラットを、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）中の９０μｇ／ｍｌのカテプシン−Ｌの投与により処理し、皮膚断片で組織検査を実施することにより、線維性中隔を視覚化した。対照として、ラットをＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）のみで処理した。実施例５記載の要領で、断片を固定し、マッソンのトリクローム染料で染色し、コラーゲンを視覚化した。また、断片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。簡単に述べると、断片を脱パラフィン処理し、水を用いて水和させた。断片をツェンカー固定した場合、塩化水銀結晶をヨウ素で除去し、チオ硫酸ナトリウムで清澄化した。試料を１５分間マイヤーのヘマトキシリンで染色し、次いで２０分間水道水で洗浄した。エオシンの鮮度、および所望の対比染色の深さによって１５秒〜２分間、断片をエオシンで対比染色した。一様な染色結果を得るため、スライドを数回浸した後、それらをエオシン中に設置した。過剰のエオシンが除去されるまで、断片を９５％および無水アルコール中でそれぞれ２分ずつ２回交換しながら脱水した。スライドを顕微鏡下でチェックした後、キシレンでそれぞれ２分ずつ２回交換しながら清澄化した。断片をＰｅｒｍｏｕｎｔまたはＨｉｓｔｏｃｌａｄで封入した。結果は、酸性緩衝液のみで処理した対照動物では、皮下脂肪組織小葉が皮膚表面へ垂直に伸びるコラーゲン線維性中隔の複雑な網状組織により分断されたことを示す。ラットをカテプシン−Ｌで処理することにより、皮下組織線維性中隔の分解が誘発された。
線維性中隔の構成を、カテプシン−Ｌ不含有、９０μｇ／ｍｌカテプシン−Ｌ含有のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）または５０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中の９０μｇ／ｍｌ細菌性コラゲナーゼで処理した後、ウサギ抗コラーゲン抗体によりさらに視覚化した。結果は、酸性ＭＥＳ緩衝液のみで処理した対照ラットでは通常のコラーゲン分布を示す。カテプシン−Ｌでのラットの処理により、コラーゲン分解を証明するコラーゲンについての染色が減少を示した。しかしながら、コラーゲン分解は、細菌性コラゲナーゼで処理したラットでは非常に顕著であった。これらの結果は、カテプシン−Ｌが、細菌性コラゲナーゼと比べて高い一時的コラーゲン分解制御力を有することを立証している。
実施例１８
ズカーラット真皮におけるカテプシン−Ｌの酵素作用の持続時間
ウエスタン・ブロットおよび酵素活性の補完的２方法を用いて、カテプシン−Ｌの酵素作用の持続時間を、ズカーラットの真皮で評価した。ラットの真皮に、エピネフリン（２．５μｇ／ｍＬ）を含む１２００単位／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０（ｐＨ５．３）１ｍＬの注射を行うことにより、血管収縮を誘発した。この直後に、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中１００μｇ／ｍＬの組換えカテプシン−Ｌ（ｐＨ５．３）１ｍＬの注射を行った。注射部位に切り込みを入れ、注射の３〜７０分後、２０μＬおよび２００μＬのエッペンドルフピペットで間質灌流液を収集した。流体を実施例１０記載の要領でコラーゲン分解に関するウエスタン・ブロット分析により分析し、実施例９記載の要領で１時間にわたって、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣと称される市販の蛍光性基質の加水分解速度から決定されるカテプシン−Ｌの酵素活性（活性は相対蛍光単位（ＲＦＵ）／分として表される）を測定した。ｐＨインジケーターストリップ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、ギブスタウン、ニュージャージー、カタログ番号９５８８）を用いて、間質液灌流液のｐＨ値を記録した。データを表１９に示す。
処理後１０分以内に最大酵素活性を測定した。活性は、真皮での投与後３０分時点で約５０％減少し、６０分時点で約７０％減少した。
Figure 2014043449
実施例１９
ズカーラット真皮におけるコラーゲン分解に対するカテプシン−Ｌの用量応答効果
ズカーラットの真皮における１２００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０（ｐＨ５．３）１ｍｌの投与後、１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲のカテプシン−Ｌ用量１ｍｌを、ズカーラットの真皮に投与した。注射の２０分後、生検を集め、ブアン固定液で固定し、組織検査用に加工処理した。実施例５記載の要領でコラーゲンを視覚化するため、断片をヘマトキシリンおよびエオシン、およびマッソンのトリクロームにより染色した。注射部位にメスで切り込みを入れ、間質液を集めた。
処理した皮膚の組織学的分析および灌流液のウエスタン・ブロット分析を、それぞれ実施例５および１０記載の要領で実施した。間質液の２５μＬのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の６Ｘゲルローディング試料緩衝液５μＬと混合した。試料の総量を、４〜１２％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア、カタログ番号ＥＣ６０３８）へローディングし、着色済み分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ５９２５）の着色最前線がゲルの底部に達するまで、電気泳動をトリス−グリシンＳＤＳ泳動用緩衝液中で実施した。２０％メタノール、２５ｍＭのトリス、および２２０ｍＭのグリシンの緩衝液中、４℃で１．５時間、２０ＶでのＸＣｅｌｌ ＩＩブロットモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＩＢ１００１）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ２００１）へ転移させた。ゲル上における着色済みマーカーバンドの色のほぼ完全な消失により転移は証明された。室温で３０分間、ＰＢＳＴ（ＥＬＩＳＡにおいて洗浄緩衝液および希釈剤として使用されるデタージェントＴｗｅｅｎ２０（０．０５％ｖ／ｖ）を含む、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４））中２％の脱脂粉乳から成る緩衝液中で膜を遮断した。室温で１時間、ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬ最終濃度で使用されるヒトコラーゲンＩに対するウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ、カタログ番号ａｂ３４７１０）と、次いで室温で１時間、ＰＢＳＴ中３３ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されるＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア、カタログ番号ＤＣ０３Ｌ）とインキュベーションすることにより、コラーゲンＩが検出された。ＴＭＢ Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号６１３５４８）膜展開溶液によりＨＲＰシグナルを展開し、室温で５〜１０分後、ｄｄＨ２Ｏ中ですすぐことにより反応を停止させた。
組織学的およびウエスタン・ブロット分析は、カテプシン−Ｌの用量増加により、用量依存的にコラーゲンが分解されることを示した。ウエスタン・ブロット分析は、１００μｇ／ｍＬで処理した試料中における多数の低分子量バンドの存在から判断されるように、カテプシン−Ｌの濃度が高いときには、コラーゲン分解が広範に及ぶことを示した。
実施例２０
線維性中隔破壊に対するカテプシン−Ｌの用量依存的効果
５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中の１２００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０、１ｍＬの投与後、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）中１、１０、５０、１００、２５０および５００μｇ／ｍＬの範囲のヒト組換えカテプシン−Ｌ１ｍＬ用量をズカーラットの真皮に投与した。対照として、ラットをＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．３単独で処理した。注射の２０分後、実施例１８記載の要領で間質灌流液を注射部位から収集した。皮膚生検を集め、ブアン固定液で固定し、組織検査用に加工処理した。実施例５記載の要領でコラーゲンを視覚化するため、脱パラフィンした断片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、およびマッソンのトリクロームにより染色した。ウエスタン・ブロットを実施例１０記載の要領で実施した。
組織検査およびウエスタン・ブロット分析からの結果は、ズカーラットにおけるコラーゲンの組換えカテプシン−Ｌ分解が用量依存的であることを示していた。線維性中隔の破壊は、１０μｇ／ｍＬのカテプシン−Ｌで処理した皮膚において明らかに目に見えるものであった。
実施例２１
ズカーラット真皮におけるカテプシン−Ｌの効果に対するイオン強度の影響
真皮に注入されたカテプシン−Ｌ酵素活性の時間を、緩衝液およびエピネフリンのイオン強度の関数として試験した。
ズカーラットに対し、１ｍＬの１２００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０、次いで１、５、１０および５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中２５μｇ／ｍＬのカテプシン−Ｌ、１ｍＬの注射を行った。間質灌流液を投与の２０分後に収集した。間質液灌流液のｐＨ値を、ｐＨインジケーターストリップ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、ギブスタウン、ニュージャージー、カタログ番号９５８８）を用いて記録し、真皮におけるカテプシン−Ｌ酵素活性を実施例９記載の要領で測定した。真皮灌流液のｐＨ値は、低イオン緩衝液強度（１、５および１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．３）の場合７．５であった。カテプシン−Ｌを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．３）中で送達したとき真皮灌流液のｐＨ値は６．５であった。カテプシン−Ｌを低イオン緩衝液強度（１、５および１０ｍＭのＭＥＳ）中で送達したとき、測定可能な酵素活性は検出されなかった。５０ｍＭのＭＥＳ中で処方したカテプシン−Ｌを投与した注射部位の灌流液では、強力な酵素活性が検出された。これらの結果は、カテプシン−Ｌの酵素活性が緩衝液のイオン強度により堅固にモジュレーションされ得ることを示していた。
実施例２２
ズカーラットに皮下注入されたカテプシン−Ｌによる線維性中隔の破壊
５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中の１２００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０の投与後、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中１０または１００μｇ／ｍＬのカテプシン−Ｌで処理した２２匹の雄ズカーラットにおいて、ズカーラットに皮下注射された単一用量のカテプシン−Ｌの効果を評価した。２０週の期間、週に１回生検を採取し、実施例５記載の要領で組織学的に分析した。１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ用量のカテプシン−Ｌで単一処理することにより、実施例１７記載の通り線維性中隔が急速に破壊された。４週間目に採取した生検の組織学的分析は、処理領域における線維性中隔の数が非処理領域での数よりも少ないことを示していた。２０週目以降、線維性中隔の定型的垂直配向が処理領域では認められなかった。皮下組織におけるコラーゲンの配向は皮膚表面に対し水平かつ平行であり、組織モデリングと一致していた。
実施例２３
カテプシン−Ｌの投与は有害な作用との因果関係を示さない
脈管内注射したカテプシン−Ｌの安全性試験は、明白な有害な作用を示すものではなかった。２５ｇの雄ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）および２００ｇの雄スプラーグドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対し、尾部静脈において１２ｍｇ／ｋｇ以下の濃度で５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中の組換えカテプシンＬを投与した。動物を有害な作用について１週間観察した。ケージ側からの観察によると、有害な作用は記録されなかった。
実施例２４
カテプシン−Ｌは、ブタ皮下組織における線維性中隔微小構造の構成を改変する
麻酔したヨークシャー種のブタ（ＳＮＳ ｆａｒｍｓ、ラモナ、カリフォルニア）に、脇腹の皮下組織へ挿入した２３ゲージのバタフライ針（Ｔｅｒｕｍｏ、ルーベン、ベルギー国、カタログ番号ＣＥ０１９７）により１２００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．３）５ｍＬを与え、直後にｉ）５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．３）中５０μｇ／ｍｌのカテプシン−Ｌ５ｍＬ、またはｉｉ）５０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中の５０μｇの細菌性コラゲナーゼを投与した。対照は、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）、ｒＨｕＰＨ２０単独（ｐＨ５．３）およびカテプシン−Ｌ（ｐＨ７．４）であった。処理の２時間、２４時間および７日後に、十分な厚さの生検を採取し、ブアン固定液に固定した。６ｍｍの組織検査用断片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはマッソン・トリクロームコラーゲン染料で染色した。非常に濃い褐色の変色を特徴とする肉眼で見える変化がコラゲナーゼ注射部位で観察されたが、カテプシン−Ｌ処理部位ではその度合いはかなり低かった。対照を注射した部位または非処理皮膚では、肉眼で見える変化は認められなかった。これらの結果は、細菌性コラゲナーゼ注射の場合と比べて、カテプシン−Ｌ処理では、最小限の出血を伴うのに過ぎないことを示している。
肉眼で見える変化は、典型的にはコラゲナーゼに伴うかなりの皮下注射部位出血の組織学的発見と相関関係を示すが、カテプシン−Ｌについては最小限の出血に止まっている。線維性中隔の微小構造は、ＭＥＳ緩衝液のみで処理した皮膚での稠密に詰まったコラーゲン中隔とは対照的に、カテプシン−Ｌおよび細菌性コラゲナーゼを注射した皮膚の場合コラーゲン線維の縦分裂、崩壊および角形成を特徴としている。しかしながら、組織検査結果は、カテプシン−Ｌ処理部位とは対照的に、コラゲナーゼ処理部位については、出血結果と一致する、中隔の微小構造における深刻な変化を実際に示していた。さらに、５μｇ／ｍＬ程度の低用量の細菌性コラゲナーゼによる処理でも、深刻な横紋筋融解症を誘発した。これらの結果は、カテプシン−Ｌは生理学的ｐＨで急速に不活化されるが、コラゲナーゼは生理学的ｐＨで長期間活性を呈することから、カテプシン−Ｌがコラーゲンを分解し、線維性中隔の構造を改変しながらも、その効果は細菌性コラゲナーゼよりも制御されていることを立証している。
別の試験では、ブタに、５ｍＬの１２０／ｍｌ Ｕ ｒＨｕＰＨ２０（ｐＨ５．３）、次いで５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．３）中５〜１０００μｇ／ｍＬの範囲（５、２５、５０、１００、２００、５００および１０００μｇ／ｍＬ）の用量で組換えカテプシン−Ｌ５ｍＬを与えた。十分な厚さの皮膚生検を、処理の２および２４時間後に採取し、ブアン固定液に固定し、実施例５記載の要領でＨ＆Ｅまたはコラーゲン用マッソンのトリクローム染色用に加工処理した。注射の２時間および２４時間後に切除した皮膚の目視検査は、２５μｇ／ｍＬおよびそれより高用量で処理した注射部位に中程度の出血があることを示した。組換えカテプシン−Ｌの５００μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬの高用量による注射部位領域でのみ横紋筋融解症が観察された。
実施例２５
蛍光性基質に関するカテプシン−Ｌの酵素活性に対する還元条件の作用
Ｚ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（配列番号：５３６；Ｚ＝Ｎ−カルボベンジルオキシ；ＡＭＣ：７−アミノ−４−メチルクマリン）（Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐ．、ウィルミントン、デラウエア）と称される特注製造の蛍光性基質を用いて、カテプシン−Ｌの酵素活性に対する還元剤の作用を検定した。ＲＦＵ／秒でのカテプシン−Ｌ活性を、システイン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ガーデナ、カリフォルニア、カタログ番号Ｃ１４７３）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号Ｃ４７０６）の存在下で測定した。
５ｍＭのシステインを含む７．８５ｍｇ／ｍＬの貯蔵濃度での活性化カテプシン−Ｌを使用した。２ｎｇ／ｍｌのカテプシン−Ｌを、３７℃で３０分間、表１９Ａに示した適切な濃度のシステインまたはＴＣＥＰを含む５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２％ＤＭＳＯ、０．０１％ブリージ−３５の総量２００μｌ中で２０μＭの蛍光性ペプチド基質Ｚ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＡＭＣとインキュベーションした。インキュベーションを不透明底マイクロプレートで実施した。生じた蛍光を、蛍光プレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５、サニーベール、カリフォルニア）において基質に最適な励起放射線３６０ｎｍ〜４６０ｎｍで読み取った。Ｓ字状用量応答をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラジョラ、カリフォルニア）でフィットさせた後、カーブフィッティングはＲ２値＞０．９９８を有していた。下表１９Ａに示した結果は、還元剤の存在によりカテプシン−Ｌの活性が増加することを示している。
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実施例２６
基質に対するカテプシン−Ｌの酵素活性
０．２５ｍｇ／ｍｌ濃度のカテプシン−Ｌを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）または５０ｍＭのヘペス（ｐＨ７）を含む緩衝液中で以下の３タンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型；０．２５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡおよび０．２５ｍｇ／ｍｌのＰＨ２０）の１つまたはその２または３の混合物と３７℃で１６時間までの間インキュベーションした。様々な時点（０、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分および一晩）で、試料のアリコートを採取し、青色染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。カテプシン−Ｌによるタンパク質分解は、用量依存的であり、無傷タンパク質の強度の視覚的減少により試験した基質のそれぞれについて観察された。カテプシンＬによるコラーゲンＩ型、ＨＡＳおよびＰＨ２０の分解は、ｐＨ５でより完全となった。ｐＨ６およびそれより高ｐＨでは、分解は縮小した。中性ｐＨでは、カテプシンＬによるコラーゲンＩ型、ＨＡＳおよびＰＨ２０の分解は最小であった。カテプシンＬはｐＨ５で安定しているため、緩衝液に還元剤を加えても、ｐＨ５ではカテプシンＬによるコラーゲン、ＨＡＳおよびＰＨ２０の分解にはほとんどまたは全く影響は無かった。ｐＨが中性まで増加すると、カテプシンＬでは自己触媒作用が起こるため、中性ｐＨで還元剤を加えると、カテプシンＬの自己触媒作用が減少することにより、コラーゲン、ＨＡＳおよびＰＨ２０の分解は増加した。
実施例２７
ｈＭＭＰ−１のクローニングおよび発現
Ａ．ｈＭＭＰ−１ライブラリーのクローニングおよびハイスループット発現
この実施例では、ヒトマトリックス金属プロテアーゼ−１をコードするＤＮＡをプラスミドへクローニングし、次いで形質転換およびタンパク質成長／単離を実施することにより、ヒトマトリックス金属プロテアーゼ１（ｈＭＭＰ−１）ライブラリーを作製した。不活性チモーゲンプロＭＭＰ−１（配列番号３２７に示す）をコードする、配列番号５３４に示したヌクレオチド配列を有する親ヒトＭＭＰ−１ ＤＮＡ配列において突然変異を導入し、ポリペプチドの触媒ドメインおよび高プロリンリンカードメインにまたがるＭＭＰ−１の単一アミノ酸変異型を生成することにより、ライブラリーを作製した。ヒトＭＭＰ−１の触媒ドメイン（配列番号３２７のアミノ酸８１〜２４２）およびリンカー領域（配列番号３２７のアミノ酸２４３〜２５８）内の１７８アミノ酸位置のそれぞれに少なくとも１５のアミノ酸変異型を含むようにｈＭＭＰ−１ライブラリーを設計した（下記表２０参照）。
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下表２１に示した１７８アミノ酸位置のそれぞれをコードする、野生型コドンを、所望のアミノ酸置換をコードするコドンに変えることにより、各個のｈＭＭＰ−１突然変異体をコードするｃＤＮＡを作製した。野生型コドンを配列番号５３４に示す。配列番号５３４はまた、コード化アミノ酸を示している。アミノ酸置換および対応する突然変異コドンを下表２１に列挙する。
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標準ＤＮＡ合成プロトコルに従って、各個のライブラリー要員をコードするＤＮＡを作製し、常用の分子生物学的技術を用いて発現させた。簡単に述べると、常用の分子生物学的技術を用いて、ＤＮＡをベクターｐＥＴ３０３ＣＴＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号５３３）にライゲーションした。１個のｈＭＭＰ−１突然変異体を含むプラスミドを、製造業者の勧告を用いてＢＬ２１（ＤＥ３）エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔｉｇｅｎ、北京、中国）に形質転換した。全ライブラリー要員についてこのプロセスを反復した。形質転換培養物を用いて、アンピシリン添加剤を含むＬＢ培地１ｍＬに接種を行った。培養物を振とうしながら１６時間３７℃で成長させた。１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、タンパク質発現を誘導し、培養物を２５℃で振とうしながらインキュベーションした。６時間後、１０分間６０００ｇでの遠心分離により細胞を沈降させ、上清を除去した。２５℃で１０分間、４μｌのデオキシリボヌクレアーゼ（１０μｇ／ｍｌ）、４μｌのリボヌクレアーゼ（１０μｇ／ｍｌ）および４μｌのリソザイム（１０μｇ／ｍｌ）を含むＯＳ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣＶ、ｐＨ７．５、２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）５０μｌ中で細胞をインキュベーションすることにより、周辺タンパク質を強化した。水５０μｌを各ウェルに加え、次いで６０００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞屑を除去した。ｈＭＭＰ−１タンパク質を含む上清を、−２０℃で貯蔵した。以下の実施例に記載した要領で上清の活性をスクリーニングした。
Ｂ．野生型ｈＭＭＰ−１のクローニングおよび発現
この実施例では、野生型ｈＭＭＰ−１を、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＣＨＯ−Ｓ細胞の両方で個々に発現させた。
１．エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現
野生型ｈＭＭＰ−１（配列番号５３４に示したヌクレオチド配列を有する、クローンＢＡＰ００６＿１０）を、ベクターｐＥＴ３０３ＣＴＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号５３３）にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で成長させた。ｐＥＴ３０３ＣＴＨｉｓベクターは、Ｃ−末端Ｈｉｓ標識（配列番号２３５）を含んでいた。上記と同様、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、タンパク質発現を誘導した。発現後、実施例２７Ａの記載と同様にしてタンパク質を強化し、それに続いて、標準分子生物学的プロトコルに従って、ＨｉＴｒａｐ Ｎｉ２＋カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット分析により発現および精製をモニターした。
２．ＣＨＯ−Ｓ細胞での発現
野生型ｈＭＭＰ−１（配列番号５３４に示したヌクレオチド配列を有する、クローンＢＡＰ００６＿２）をＣＨＯ−Ｓ細胞で発現させ、培地中へ分泌させた。標準分子生物学的プロトコルに従って、ＨｉＴｒａｐ Ｎｉ２＋カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることにより、野生型ｈＭＭＰ−１タンパク質を精製した。
実施例２８
蛍光性ペプチド基質を用いたｈＭＭＰ−１突然変異体の酵素活性の測定
この実施例では、ハイスループット蛍光活性検定法を用いて、実施例２７で作製したｈＭＭＰ−１突然変異体ライブラリーをスクリーニングにかけることにより、温度感受性ｈＭＭＰ−１突然変異体を同定した。一時的感受性ｈＭＭＰ−１突然変異体についてスクリーニングするため、市販の蛍光性基質、Ｍｃａ−Ｋ−Ｐ―Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｄｐａ−Ａ−Ｒ−ＮＨ２（配列番号５３５；Ｍｃａ＝（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル；Ｄｐａ＝Ｎ−３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニル；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ、カタログ番号ＥＳ０１０）と称されるペプチドＩＸを用いて、各個の突然変異体の酵素活性を２５℃および３７℃および／または３４℃で測定した。ペプチド基質は、共鳴エネルギー転移により２，４−ジニトロフェニル基にクエンチングされる高蛍光性７−メトキシクマリン基を含む。活性化ｈＭＭＰ−１は、グリシンおよびロイシン間のアミド結合を開裂することにより、放出される蛍光の増加をもたらす。反応を最初は９６ウェル検定法で実施し、１４ｍｌのチューブ方式を用いて確認した。
Ａ．９６ウェル検定法
上清の活性を評価する前に、上清をプロセッシング剤で処理することにより、不活性チモーゲン形態を活性酵素へと活性化した。簡単に述べると、実施例２７で生成した各ｈＭＭＰ−１突然変異体上清４μｌを、９６ウェルプレートにおいて１ｍＭのプロセッシング剤酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を含むＴＣＮＢ（５０ｎＭのトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のブリージ３５、ｐＨ７．５）１００μｌに加えた。溶液を反応温度（２５℃または３７℃）で２時間インキュベーションした。この活性化段階では、プロペプチドを開裂し、成熟ｈＭＭＰ−１を生成する。
活性化後、６２０μＭのＭｃａ−Ｋ−Ｐ―Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｄｐａ−Ａ−Ｒ−ＮＨ２蛍光基質を含むＴＣＮＢ１．６μｌを、指示反応温度（２５℃または３７℃）で１時間、各ウェルに加え、最終濃度１０μＭとした。蛍光プレート読取装置において３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ放射で蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。野生型ｈＭＭＰ−１およびプラスミド／ベクター形質転換細胞からの上清を、陽性および陰性対照として使用した。デュプリケイト反応を各試料、反応温度、および陽性および陰性対照について実施した。
２６８７のｈＭＭＰ−１突然変異体の初回スクリーニングから、３７℃で活性が低下した１９９の推定１次ヒットが同定された（表２２参照）。同じ検定法を用いて、これらのｈＭＭＰ−１突然変異体を再スクリーニングし、１０４の１次ヒットを確認した（下表２３参照）。２５℃で活性を呈し、３７℃で活性が少なくとも１６％減少していた（例、２５℃または３７℃での活性比（２５℃／３７℃）が１．２より大またはそれと同等である）ｈＭＭＰ−１突然変異体は、確認された１次温度感受性ヒットであるとみなされた。下表２２は、ｈＭＭＰ−１突然変異、２５℃および３７℃での平均ＲＦＵ、および活性比（２５℃／３７℃）を列挙している。この表はまた温度表現型を列挙している：「ダウン」は、突然変異体の活性比（２５℃／３７℃）が野生型の活性比（２５℃／３７℃）と比べて減少している、すなわち野生型の活性の１６％より大きい率で減少していることを示し、「ニュートラル」は、突然変異体の活性比（２５℃／３７℃）が野生型の活性比（２５℃／３７℃）と類似している、すなわち、野生型の活性の１６％以内であることを示し、「アップ」は、突然変異体の活性比（２５℃／３７℃）が野生型の活性比（２５℃／３７℃）と比べて増加している、すなわち野生型の活性の１６％より大きい率で増加していることを示す。
下表２２はまた、野生型ｈＭＭＰ−１と比較した、２５℃および３７℃での残留活性を列挙している。残留活性は、指示温度、２５℃または３７℃でのｈＭＭＰ−１突然変異体対野生型ｈＭＭＰ−１活性の比である。ｈＭＭＰ−１突然変異体の幾つかは、２５℃で野生型ｈＭＭＰ−１と同等またはそれより大きい活性を有しており、それらは全て３７℃では活性の減少を呈することから、高温ではそれらの活性が減少することが再確認された。
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Ｂ．１４ｍＬタンパク質発現
この実施例では、実施例２８Ａにおいて温度感受性１次ヒットとして同定されたｈＭＭＰ−１突然変異体を、１４ｍｌ培養管で発現させ、それらの酵素活性を２５℃、３４℃および３７℃で１時間、２時間または一晩測定することにより、高温で活性が低下する所望の表現型を立証した。発現を９６ウェルプレートではなく１４ｍｌ管で実施すること以外は、実施例２７の記載と同じ要領でタンパク質を発現および精製した。
各ｈＭＭＰ−１突然変異体上清４μｌを、９６ウェルマイクロプレートに移した。上記実施例２８Ａの記載と同様にして上清をＡＰＭＡにより活性化したが、ただし、溶液を２時間２５℃、３４℃または３７℃の反応温度でインキュベーションした。上記と同様、活性化後、１０μＭのＭｃａ−Ｋ−Ｐ―Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｄｐａ−Ａ−Ｒ−ＮＨ２蛍光基質を含むＴＣＮＢ１００μｌを、指示反応温度（２５℃、３４℃または３７℃）で１時間、各管に加えた。野生型ｈＭＭＰ−１を陽性対照として使用し、ベクターで形質転換した細胞からの上清を陰性対照として使用した。蛍光プレート読取装置において３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ放射で蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。デュプリケイト反応を各試料、反応温度、および陽性および陰性対照について実施した。
データを下記の表２４Ａ（１時間インキュベーション）、表２４Ｂ（２時間インキュベーション）および表２４Ｃ（一晩インキュベーション）に示す。２５℃では活性を示すが、３４℃または３７℃では少なくとも３３％の活性の減少を示す（すなわち、２５℃および３４℃での活性比または２５℃および３７℃での活性比が、いずれかの時点での試験条件下で１．５と同等またはそれより大きい）突然変異体を、温度感受性ヒットとして同定した。下表２４Ａ〜２４Ｃは、ｈＭＭＰ−１突然変異、２５℃、３４℃および３７℃でのＲＦＵ、および高温で酵素活性の減少が確認された６４のｈＭＭＰ−１突然変異体の活性比（２５℃／３４℃および２５℃／３７℃の両方で）を列挙している。ｈＭＭＰ−１突然変異体の中には、高温の場合よりも２５℃で著しく高い活性を示すものもあった。例えば、ｈＭＭＰ−１突然変異体Ｄ１７９Ｎ（配列番号３６８）は、一晩インキュベーション後に３７℃より２５℃での方が、８７．５％活性が高かった（例えば、表２４Ｃ参照）。さらに、発現レベル、従って全体的ＲＦＵ値は実験ごとに異なるが、活性比は同一のままであった。例えば、突然変異体Ｄ１５６Ｔを２回試験したところ（下記実施例２４Ｃ参照）、各試験は異なるデータＲＦＵ値を与えるが、値の比率は、１．５比率のパラメーター範囲内で類似および一貫していた。
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下表２５は、蛍光性ペプチドと一晩インキュベーションした後のｈＭＭＰ−１突然変異体の残留活性（ｈＭＭＰ−１突然変異体のＲＦＵ／野生型ｈＭＭＰ−１のＲＦＵの比）を示す。２５℃、３４℃または３７℃での突然変異体の活性を、それぞれの温度での野生型ｈＭＭＰ−１の活性と比較した。２５℃では、５つのｈＭＭＰ−１突然変異体（Ｅ１８０Ｆ、Ｅ１８０Ｙ、Ｄ１５６Ｔ、Ｄ１５６Ｋ、Ｒ１５０Ｐ）は、残留活性＞１が示す通り、野生型ｈＭＭＰ−１よりも高い活性を示した。高温では、ｈＭＭＰ−１突然変異体の全てが、同温度での野生型ｈＭＭＰ−１と比較したときに活性の全体的減少を呈することから、ｈＭＭＰ−１突然変異型の表現型は温度感受性突然変異体であるものとして確認された。
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Ｃ．ｈＭＭＰ−１ トップ突然変異体ヒット
１４の位置が、トップヒット位置：９５、１０５、１５０、１５６、１５９、１７９、１８０、１８２、１８５、１８７、１９８、２２７、２３４および２４０で同定された。１４の位置にある２３のｈＭＭＰ−１突然変異体を、２つの基準：１）活性比率（２５℃対３７℃および２５℃対３４℃）および２）活性（ＲＦＵで）に基づいてトップヒットとして選択した。下表２６で列挙している突然変異体は全て、活性が２０００より大きく、２５℃対３７℃の比率が２より大きかった。＊＊で識別している１１のヒットは、活性比率および活性レベルの両方について高位にランク付けされたヒットであり、これらを用いて、実施例２９記載のコンビナトリアルライブラリーを展開した。
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実施例２９
コンビナトリアルｈＭＭＰ−１突然変異体ライブラリー
この実施例では、実施例２８Ｃで選択され、２個の星印（＊＊）付きで表２６に示されている突然変異体からコンビナトリアルｈＭＭＰ−１変異型ライブラリーを作製した。１８２、１８５および１８７位にある突然変異体については、ｈＭＭＰ−１触媒活性にとってこれらの位置は重要であるため、コンビナトリアルライブラリーの作製の際に除外した。ライブラリーは、選択された突然変異体のそれぞれにとって可能なアミノ酸変異型のあらゆる組み合わせを含んでいた。表２７は、ライブラリーに含まれる突然変異体の全組み合わせを示す。示された位置は、配列番号３２７に示されたｈＭＭＰ−１のアミノ酸残基に対応する位置に関するものである。各横行および縦列は、示された突然変異を含む一ポリペプチドを示す。例えば、１５６Ｋ １７９Ｎ ２２７Ｅは、配列番号３２７に示された位置に対応する位置に３つのアミノ酸置換：１５６位におけるＫによるＤの置換、１７９位におけるＮによるＤの置換および２２７位におけるＥによるＶの置換を含むポリペプチドを指す。実施例２７記載の要領でライブラリーを作製し、発現させた。
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実施例３０
温度低下後の酵素活性の可逆性
この実施例では、実施例２８Ｂで確認された温度感受性ｈＭＭＰ−１突然変異体をさらに検定にかけることにより、２５℃での酵素活性が、後続の高温への暴露後に２５℃に戻した場合に、可逆性または不可逆性のいずれであるかを測定した。実施例２８Ｂ記載の要領で、ｈＭＭＰ−１突然変異体を１４ｍｌ培養管で発現させた。推定的ヒットを、５条件下：２５℃、３４℃または３７℃、および３４℃または３７℃で、それに続いて２５℃の必要温度に再暴露した場合のそれらの活性について試験した（反応条件については表１６参照）。２５℃で活性を示し、３４℃または３７℃に上昇させたときに活性の減少を示し（すなわち、２５℃／３４℃または２５℃／３７℃での活性比が１．５またはそれより大きい）、再び２５℃に低下させたときにベースライン活性を呈する突然変異体を、「可逆性ヒット」として評価した。２５℃で活性を示し、３４℃または３７℃に上昇させたときに活性の減少を示し（すなわち、２５℃／３４℃または２５℃／３７℃での活性比が１．５またはそれより大きい）、再び２５℃に低下させたときに同量の活性の減少を呈する突然変異体を、「不可逆性ヒット」として評価した。
Ａ．反応条件
以前に記載した蛍光検定法に修正を加えた方法を用いて、各ｈＭＭＰ−１突然変異体の酵素活性の可逆性を測定した。要するに、各ｈＭＭＰ−１突然変異体の上清４μｌを、ＴＣＮＢ中で１ｍＭのＡＰＭＡにより希釈し、９６ウェルプレートに移した。５つの異なるウェルを、表１６に示した通り各ｈＭＭＰ−１突然変異体用に準備した。溶液を最初の反応温度（２５℃、３４℃または３７℃）で２時間インキュベーションした。この活性化段階では、プロペプチドを開裂し、成熟ｈＭＭＰ−１を生成した。
活性化後、１０μＭのＭｃａ−Ｋ−Ｐ―Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｄｐａ−Ａ−Ｒ−ＮＨ２蛍光基質を含むＴＣＮＢ１００μｌを、各ウェルに添加し、反応条件を下表２８で要約した通りにした。簡単に述べると、各ｈＭＭＰ−１突然変異体を、初回温度で１時間、蛍光性基質の存在下におけるｈＭＭＰ−１突然変異体のインキュベーションにより５反応条件のそれぞれに暴露した。各突然変異体について、さらに１時間（２時間条件）または一晩（一晩条件）基質とインキュベーションし、次いで蛍光測定することにより、２５℃、３４℃または３７℃でのベースライン活性を評価した。活性の可逆性／不可逆性を評価するため、最初の１時間３４℃または３７℃でインキュベーションした試料を２５℃まで下げ、そのまま１時間（２時間条件）または１６時間（一晩条件）インキュベーションし、次いで蛍光を測定した。野生型ｈＭＭＰ−１を陽性対照として使用し、ベクターのみで形質転換した細胞からの上清を陰性対照として使用した。蛍光プレート読取装置において３２０ｎｍ励起／４０５ｎｍ放射で蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。デュプリケイト反応を各試料、反応温度、および陽性および陰性対照について実施した。
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Ｂ．結果：部分的可逆性ｈＭＭＰ−１突然変異体
２６のｈＭＭＰ−１突然変異体は、部分的可逆性であることが測定された。活性（ＲＦＵで）は、２５℃で観察されるベースライン活性には戻らなかったが、３４℃または３７℃での活性と比べた場合温度を２５℃に戻したときには活性の全体的増加が観察された。結果は、活性（ＲＦＵで）および活性比を列挙している下表２９〜３２に示されている。表２９および３０は、２時間条件下におけるｈＭＭＰ−１部分的可逆性突然変異体の３４℃または３７℃でのそれぞれの可逆性の結果を要約している。表３１および３２は、一晩条件下における部分的可逆性ｈＭＭＰ−１突然変異体の３４℃または３７℃でのそれぞれの可逆性の結果を要約している。結果は全反応条件、温度および時間のもとで類似している。一晩３４℃または３７℃での活性は、１時間３４℃または３７℃、次いで一晩２５℃でインキュベーションしたときの活性より低い。例えば、３４℃でのＥ１８０Ｙの活性は６０８０ＲＦＵであるが、３４℃、次いで一晩２５℃でインキュベーションした場合のその活性は８５７０ＲＦＵに増加した（下表３１参照）。
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Ｃ．結果：不可逆性ｈＭＭＰ−１突然変異体
３８のｈＭＭＰ−１突然変異体は、不可逆性であることが測定された。３４℃または３７℃でのこれらの突然変異体の活性は、２５℃での活性と比べると減少しており、２５℃に下げたときも減少したままであった。結果は、活性（ＲＦＵで）および活性比率を列挙している下表３３〜３６に示されている。表３３および３４は、２時間条件下におけるｈＭＭＰ−１不可逆性突然変異体の３４℃または３７℃での結果をそれぞれ要約している。表３５および３６は、一晩条件下における不可逆性ｈＭＭＰ−１突然変異体の３４℃または３７℃での可逆性の結果をそれぞれ要約している。結果は、全反応条件、温度および時間のもとで類似している。一晩３４℃または３７℃での活性は、３４℃または３７℃で１時間、次いで２５℃で一晩インキュベーションした場合の活性と同じかまたは類似している。例えば、３４℃でのＤ１０５Ｒの活性は１４０７ＲＦＵであり、３４℃、次いで一晩２５℃でインキュベーションした場合のその活性は１４２４ＲＦＵである（下表３５参照）。
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実施例３１
不溶性コラーゲンに対するｈＭＭＰ−１のタンパク質加水分解活性
この実施例では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いることにより、ｈＭＭＰ−１のコラゲナーゼ活性を、タンパク質基質コラーゲンについて評価した。野生型ｈＭＭＰ−１は、不溶性コラーゲン（α１（Ｉ）およびα２（Ｉ）鎖）を４分の３および４分の１の長さの消化生成物に開裂する。この検定法では、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合コラーゲンを、基質として使用し、反応を反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。α１（Ｉ）およびα２（Ｉ）コラーゲン鎖が開裂されると、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの分離により完全長コラーゲンとは区別され得る４分の３および４分の１の長さの消化生成物が生じる。別法として、蛍光定量分析法により開裂を評価した。類似した検定法を用いることにより、２５℃対３４℃または３７℃での開裂活性について突然変異体ｈＭＭＰ類の活性を評価することも可能である。
Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
要するに、ｈＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入、＃９０１−ＭＰ、または実施例２７記載の要領で精製されたＢＡＰ００６＿２およびＢＡＰ００６＿１０）２μｇを、１ｍＭ ＡＭＰＡ含有ＴＣＮＢ中で希釈し、２時間反応温度（２５℃または３７℃）でインキュベーションした。この活性化段階では、プロペプチドを開裂し、成熟ｈＭＭＰ−１を生成する。それに続いて、ＴＣＮＢ２０μｌ中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた不溶性コラーゲン（Ａｎａｓｐｅｃ ＃８５１１１またはＳｉｇｍａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＃Ｃ４３６１）６μｇを、各活性化ｈＭＭＰ−１アリコートに加え、混合物を２５℃または３７℃で２４時間または６日間インキュベーションした。
不溶性コラーゲンの開裂を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより観察した。反応混合物を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブルー染料で着色することにより可視化した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ結果は、２５℃または３７℃で２４時間インキュベーション後、ｈＭＭＰ−１は、α１（Ｉ）およびα２（Ｉ）コラーゲン鎖を、試験した全ｈＭＭＰ−１タンパク質について３／４および１／４長の消化生成物に部分的に開裂したことを示す。２５℃で６日後、３／４および１／４長消化生成物への完全開裂が観察された。３７℃で６日後、コラーゲンは完全に消化された。３／４および１／４長コラーゲン消化生成物は、体温では熱不安定性を示す。
Ｂ．蛍光定量分析
別法として、蛍光検定法を用いることによりコラゲナーゼ活性を測定した。ｈＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入、＃９０１−ＭＰ、または実施例２７記載の要領で精製されたＢＡＰ００６＿２およびＢＡＰ００６＿１０）５μｇを、１ｍＭ ＡＭＰＡ含有ＴＣＮＢ中で最終濃度に希釈し、３７℃で２時間インキュベーションした。Ｂａｉｃｉ Ａ ｅｔ ａｌ．、（１９８０）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０８：２３０−２３２ から適合化したプロトコルを用いて、ＦＩＴＣ標識コラーゲン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｃ４３６１またはＥｌａｓｔｉｎ ＃ＣＦ３０８）についてのｈＭＭＰ−１の活性を評価した。簡単に述べると、ｈＭＭＰ−１を３７℃で１４４時間基質とインキュベーションした。陰性対照として、基質を緩衝液のみとインキュベーションした。インキュベーション後、まず反応混合物を遠心分離にかけることにより、不溶性粒子を除去した。蛍光プレート読取装置において４９５ｎｍ励起／５２０ｎｍ放射で蛍光を測定することにより、上清の蛍光を検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。各試料についてデュプリケイト反応を実施した。
結果（下表３７および３８参照）は、３７℃で１４４時間野生型ｈＭＭＰ−１と不溶性コラーゲンをインキュベーションすることにより、緩衝液のみの対照の場合と比べて高いＲＦＵ値により示される通りコラーゲンが開裂されたことを示している。例えば、Ｓｉｇｍａからのコラーゲンの開裂の場合、試験した全ｈＭＭＰは、ＲＦＵ値が約４００．００である緩衝液のみの場合と比べて約１０００．００〜１２００．００ものＲＦＵを有していた。Ｓｉｇｍａ 不溶性コラーゲンの開裂に関するＣＨＯ−Ｓ（ＢＡＰ００６＿２）およびＢＬ２１細胞（ＢＡＰ００６＿１０）からの精製コラーゲンの活性は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ から購入したｈＭＭＰ−１に匹敵するものであった。Ｅｌａｓｔｉｎ コラーゲンの開裂については、Ｒ＆Ｄ から購入した組換えｈＭＭＰ−１およびＢＡＰ００６＿１０の活性は約３０００．００ＲＦＵであり、ＢＡＰ００６＿２の活性は約２０００．００ＲＦＵであった。緩衝液のみの場合は、約１５００．００ＲＦＵのＥｌａｓｔｉｎ コラーゲン開裂に関するバックグラウンド蛍光を呈した。
Figure 2014043449
Figure 2014043449
当業者にとって、修正は容易に想到できるものであるため、本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限されるものとする。

Claims (146)

  1. ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量で皮下投与される医薬の製造を目的とする、不活性形態で処方される可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）の使用。
  2. ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量の可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）を含む、ＥＣＭの疾患または状態の処置で使用される皮下投与用に製剤化された医薬組成物であって、ＡＭＤＥが不活性形態で処方される組成物。
  3. ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量で皮下投与される医薬の処方を目的とする、活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性である可活性化型分解酵素（ＡＭＤＥ）およびＡＭＤＥが活性を呈するようにＡＭＤＥに活性化条件を提供する活性化因子の使用。
  4. ＥＣＭの疾患または状態の処置で使用される皮下投与用に製剤化された医薬組成物であって、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量で、活性化因子の非存在下ではＥＣＭにおいて不活性である可活性化型分解酵素（ＡＭＤＥ）およびＡＭＤＥが活性を呈するようにＡＭＤＥに活性化条件を提供する活性化因子を含む組成物。
  5. 処方物または組成物が、単用量投与用であり、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇの量のＡＭＤＥを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用または組成物。
  6. 酵素が中性ｐＨで実質的に不活性である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用または組成物。
  7. 皮下投与、筋肉内投与、病変部内投与または皮内投与用に処方された、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または組成物。
  8. 活性化因子が、ＡＭＤＥと同一組成物中または別々の組成物中で処方されている、請求項３〜７のいずれかに記載の使用または組成物。
  9. 活性化条件が、ｐＨ、イオン強度、温度および金属イオンから選択される、請求項３〜８のいずれかに記載の使用または組成物。
  10. 活性化条件が金属イオンであり、金属イオンがＣａ２＋である、請求項９記載の使用または組成物。
  11. 活性化条件が温度であり、温度が、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃である、請求項９記載の使用または組成物。
  12. ＡＭＤＥが活性について複数の活性化条件を必要とする、請求項９記載の使用または組成物。
  13. 活性化条件がｐＨである、請求項９記載の使用または組成物。
  14. 活性化条件が酸性ｐＨである、請求項９記載の使用または組成物。
  15. ＡＭＤＥが、カテプシン、カルパインおよびヘパラナーゼから選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用または組成物。
  16. ＡＭＤＥがカテプシンであり、カテプシンが、システインプロテアーゼまたはアスパラギン酸プロテアーゼである、請求項１５記載の使用または組成物。
  17. カテプシンが、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カテプシンＤおよびカテプシンＥから選択される、請求項１６記載の使用または組成物。
  18. カテプシンがカテプシンＬである、請求項１７記載の使用または組成物。
  19. カテプシンが、配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかの対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項１６または請求項１７記載の使用または組成物。
  20. 可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）が中性ｐＨでは不活性であり、活性化因子が酸性ｐＨ活性化条件を提供することにより酵素を活性化し、ＡＭＤＥがｐＨ５.５では実質的に活性を呈する、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量での医薬の製剤化についてのＡＭＤＥおよび活性化因子の使用。
  21. 可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）が中性ｐＨでは不活性であり、活性化因子が酸性ｐＨ活性化条件を提供することにより酵素を活性化し、ＡＭＤＥがｐＨ５.５では実質的に活性を呈する、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量でＡＭＤＥおよび活性化因子を含む、ＥＣＭの疾患または状態の処置に使用される医薬組成物。
  22. 処方物または組成物が、単用量投与用であり、前後を含め、約１０μｇ〜１００ｍｇ、５０μｇ〜７５ｍｇ、１００μｇ〜５０ｍｇ、２５０μｇ〜２５ｍｇ、５００μｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは２ｍｇ〜４ｍｇの量のＡＭＤＥを含む、請求項２０または請求項２１記載の使用または組成物。
  23. 活性化因子が、ＡＭＤＥと同一組成物中または別々の組成物中で提供されている、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用または組成物。
  24. 皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口または直腸投与用に処方された、請求項２０〜２３のいずれかに記載の使用または組成物。
  25. ｐＨが、３〜６.５、または３.５〜６、または３〜５.５、または３〜４.５、または４〜６、または４〜５.５、または４.５〜５、または５〜６およびそれぞれの前後を含めた範囲に含まれる酸性ｐＨである、請求項１３〜２４のいずれかに記載の使用または組成物。
  26. ｐＨが、約３、３.５、４、４.５、５、５.５、６または６.５である、請求項２５記載の使用または組成物。
  27. 活性化因子が、酸性ｐＨ活性化条件をそのｐＨでの緩衝液の形で提供する、請求項１４〜２６のいずれかに記載の使用または組成物。
  28. 緩衝液が、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、クエン酸リン酸およびヒスチジンから選択される酸を含む、請求項２７記載の使用または組成物。
  29. ＡＭＤＥが中性ｐＨで予め定められた時間活性を呈するように緩衝液のイオン強度が選択される、請求項２７または請求項２８記載の使用または組成物。
  30. 予め定められた時間が、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間または４時間である、請求項２９記載の使用または組成物。
  31. ＡＭＤＥがリソソーム酵素である、請求項２０〜３０のいずれかに記載の使用または組成物。
  32. ＡＭＤＥがカテプシンまたはヘパラナーゼである、請求項２０〜３１のいずれかに記載の使用または組成物。
  33. ＡＭＤＥがカテプシンであり、カテプシンがシステインプロテアーゼまたはアスパラギン酸プロテアーゼである、請求項３２記載の使用または組成物。
  34. カテプシンが、カテプシンＢ、カテプシンＦ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＶおよびカテプシンＤから選択される、請求項３３記載の使用または組成物。
  35. カテプシンが、配列番号６５、７１、１８３、６８、６０、１、１８９および９０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号６５、７１、１８３、６８、６０、１、１８９および９０のいずれかの対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項３３または請求項３４記載の使用または組成物。
  36. カテプシンがカテプシンＬである、請求項３３〜３５のいずれかに記載の使用または組成物。
  37. ＡＭＤＥがチモーゲンである、請求項１〜３６のいずれかに記載の使用または組成物。
  38. ＡＭＤＥが、１本鎖または２本鎖形態の成熟タンパク質である、請求項１〜３６のいずれかに記載の使用または組成物。
  39. 可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）が活性化因子の非存在下では不活性であり、ＡＭＤＥが活性を呈するように、活性化因子が酵素に活性化条件を提供し、活性化因子が、金属イオン、温度およびイオン強度から選択される、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量での医薬の製剤化を目的とするＡＭＤＥおよび活性化因子の使用。
  40. 可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）が活性化因子の非存在下では不活性であり、ＡＭＤＥが活性を呈するように、活性化因子が酵素に活性化条件を提供し、活性化因子が、金属イオン、温度およびイオン強度から選択される、ＥＣＭの１または複数成分を分解するのに十分な量でＡＭＤＥおよび活性化因子を含む、ＥＣＭの疾患または状態の処置に使用される医薬組成物。
  41. 温度感受性となるようにＡＭＤＥに修飾を加え、ＡＭＤＥが３７℃では不活性である、請求項３９または請求項４０記載の使用または医薬組成物。
  42. 活性化条件が温度であり、温度が、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃である、請求項４１記載の使用または組成物。
  43. ＡＭＤＥが、膵臓エラスターゼ、エラスターゼ−２Ａ、エラスターゼ−２Ｂ、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、内在性血管エラスターゼ、カテプシンＧ、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、プラスミン、トロンビン、グランザイムＢ、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カルパイン１、カルパイン２、レグマイン、カテプシンＺ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−２、ＡＤＡＭＴＳ−３、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−１４およびヘパラナーゼまたはそれらの対立遺伝子または種変異型または他の変異型から選択される、請求項３９〜４２のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  44. 活性化因子が冷緩衝液である、請求項３９〜４３のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  45. 活性化因子が、ＡＭＤＥと同じ組成物中で、または別々の組成物中で提供される、請求項３９〜４４のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  46. 皮下、筋肉内、病変部内、皮内、局所、経皮、静脈内、経口または直腸投与用に処方された、請求項３９〜４５のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  47. １または複数のＥＣＭ成分が、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンまたはプロテオグリカンから選択される、請求項１〜４６のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  48. ＥＣＭ成分がコラーゲンであり、コラーゲンがＩ型、II型、III型またはIV型コラーゲンから選択される、請求項４７記載の使用または医薬組成物。
  49. ＡＭＤＥが、IV型コラーゲンよりもＩ型コラーゲンについて高い基質特異性を示す、請求項４８記載の使用または医薬組成物。
  50. ＥＣＭの疾患または状態が、コラーゲン介在疾患または状態である、請求項１〜４９のいずれかに記載の使用または医薬組成物。
  51. コラーゲン介在疾患または状態が、セルライト、デュピュイトラン病、ペーロニー病、Ｌｅｄｄｅｒｈｏｓｅ線維症（足底線維腫症）、関節硬着、既存の瘢痕、硬皮症、リンパ水腫およびコラーゲン蓄積大腸炎から選択される、請求項５０記載の使用または医薬組成物。
  52. コラーゲン介在疾患または状態が、有痛性肩拘縮症である関節硬着である、請求項５１記載の使用または医薬組成物。
  53. コラーゲン介在疾患または状態が、外科的癒着、ケロイド、過形成性瘢痕および陥没瘢痕から選択される既存の瘢痕である、請求項５１記載の使用または医薬組成物。
  54. 可活性化型カテプシンＬが活性化因子の非存在下では不活性であり、可活性化型カテプシンＬが活性を呈するように、活性化因子が酵素に活性化条件を提供し、活性化条件が酸性ｐＨである、ＥＣＭの１または複数のコラーゲン成分を分解するのに十分な量での医薬の製剤化を目的とする可活性化型カテプシンＬおよび活性化因子の使用。
  55. 可活性化型カテプシンＬが活性化因子の非存在下では不活性であり、可活性化型カテプシンＬが活性を呈するように、活性化因子が酵素に活性化条件を提供し、活性化条件が酸性ｐＨである、ＥＣＭの１または複数のコラーゲン成分を分解するのに十分な量で可活性化型カテプシンＬおよび活性化因子を含む、コラーゲン介在疾患または状態の処置に使用される医薬組成物。
  56. カテプシンＬが、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するか、またはその対立遺伝子、種または他の変異型である、請求項５４および請求項５５記載の使用または医薬組成物。
  57. 可活性化型マトリックス分解酵素、活性化因子、および他の生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬から選択される１種以上の他の薬剤を含み、
    ＡＭＤＥが活性化因子の非存在下では不活性であり、ＡＭＤＥが活性を呈するように、活性化因子がＡＭＤＥに活性化条件を提供する、組み合わせ。
  58. 活性化因子が、ｐＨ、金属イオン、温度およびイオン強度から選択される活性化条件を提供する、請求項５７記載の組み合わせ。
  59. ＡＭＤＥが、膵臓エラスターゼ、エラスターゼ−２Ａ、エラスターゼ−２Ｂ、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、内在性血管エラスターゼ、カテプシンＧ、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、プラスミン、トロンビン、グランザイムＢ、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カルパイン１、カルパイン２、レグマイン、カテプシンＺ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−２、ＡＤＡＭＴＳ−３、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−１４およびヘパラナーゼまたはそれらの対立遺伝子または種変異型または他の変異型から選択される、請求項５７または請求項５８記載の組み合わせ。
  60. 組み合わせ中のＡＭＤＥが、単用量投与用であり、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇの量のＡＭＤＥを含む、請求項５７〜５９のいずれかに記載の組み合わせ。
  61. 他の薬剤が、ヒアルロニダーゼである分散剤である、請求項５７〜６０のいずれかに記載の組み合わせ。
  62. ヒアルロニダーゼがグリコシル化されている、請求項６１記載の組み合わせ。
  63. ヒアルロニダーゼが、ＰＨ２０またはその先端切除気体である、請求項６１または請求項６２記載の組み合わせ。
  64. ＰＨ２０が、ヒツジ、ウシまたはヒトＰＨ２０から選択される、請求項６３記載の組み合わせ。
  65. ヒアルロニダーゼが可溶性である、請求項６１〜６４のいずれかに記載の組み合わせ。
  66. ヒアルロニダーゼが、配列番号２２６〜２３１に示されたアミノ酸配列を有するか、またはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項６５記載の組み合わせ。
  67. ヒアルロニダーゼが、ｒＨｕＰＨ２０と称する組成物として提供された可溶性ヒアルロニダーゼである、請求項６１〜６６のいずれかに記載の組み合わせ。
  68. 組み合わせ中のヒアルロニダーゼが、単用量投与用であり、約１０単位〜５０００００単位、約１００単位〜１０００００単位、約５００単位〜５００００単位、約１０００単位〜１００００単位、約５０００単位〜７５００単位、約５０００単位〜５００００単位または約１０００単位〜１００００単位の量のヒアルロニダーゼを含む、請求項６１〜６７のいずれかに記載の組み合わせ。
  69. 他の薬剤が、リドカインである麻酔薬である、請求項５７〜６８のいずれかに記載の組み合わせ。
  70. 組み合わせ中のリドカインが、単用量投与用であり、約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜４００ｍｇ、約２０ｍｇ〜６０ｍｇまたは約３０ｍｇ〜５０ｍｇの量のリドカインを含む、請求項６９記載の組み合わせ。
  71. 他の薬剤が、アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストである血管収縮薬である、請求項５７〜７０のいずれかに記載の組み合わせ。
  72. アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストが、レボノルデフリン、エピネフリン（ephinephrine）およびノルエピネフリンから選択される、請求項７１記載の組み合わせ。
  73. アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストが、血管収縮させる量のエピネフリンである、請求項７１記載の組み合わせ。
  74. 組み合わせ中のエピネフリンが、単用量投与用であり、約１０μｇ〜５ｍｇ、約５０μｇ〜１ｍｇ、約５０μｇ〜５００μｇ、約５０μｇ〜２５０μｇ、約１００μｇ〜５００μｇ、約２００μｇ〜４００μｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇの量のエピネフリンを含む、請求項７３記載の組み合わせ。
  75. ＥＣＭの疾患または状態を処置するのに使用される、請求項５７〜７４のいずれかに記載の組み合わせ。
  76. ＡＭＤＥがカテプシンＬであり、ＥＣＭの疾患または状態がセルライトである、請求項７５記載の組み合わせ。
  77. 酸性緩衝液と同時または逐次投与された時にＥＣＭ介在疾患または状態を処置する量のカテプシンＬを含む医薬組成物であって、単用量投与用に処方された組成物であり、緩衝液がカテプシンＬを活性化するｐＨを有するものである、組成物。
  78. 組成物中のカテプシンＬの量が、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇである、請求項７７記載の組成物。
  79. さらにリドカイン、エピネフリンおよびヒアルロニダーゼのうちの１つ以上を含む、請求項７７または請求項７８記載の組成物。
  80. 可活性化型カテプシンＬおよびヒアルロニダーゼを含む組み合わせ。
  81. ヒアルロニダーゼが、ｒＨｕＰＨ２０と称される組成物である、請求項８０記載の組み合わせ。
  82. カテプシンＬおよびヒアルロニダーゼが、別々の組成物中に含まれるか、または単一組成物中に含まれる、請求項８０または請求項８１記載の組み合わせ。
  83. さらにカテプシンＬを活性化する酸性緩衝液を含む、請求項８０〜８２のいずれかに記載の組み合わせ。
  84. カテプシンＬおよびヒアルロニダーゼが、医薬組成物として製剤化された単一組成物中に含まれる、請求項８０または請求項８１記載の組み合わせ。
  85. 請求項５７〜７４および８０〜８４のいずれかに記載の組み合わせを含み、所望により使用説明書を含んでいてもよいキット。
  86. 第１区画が治療有効量の可活性化型マトリックス分解酵素（ＡＭＤＥ）を含み、その量は単一投薬量または複数投薬量に関するもので、単一投薬量はＥＣＭの疾患または状態の処置に有効であるものとし、第２区画が活性化因子を含み、その活性化因子はＡＭＤＥを活性化するものである、２区画を含む容器。
  87. 酵素がｐＨ５.５で実質的に活性である、請求項８６記載の容器。
  88. 酵素が中性ｐＨでは実質的に不活性である、請求項８６および８７記載の容器。
  89. さらに混合区画を含む、請求項８６〜８８のいずれかに記載の容器。
  90. チューブまたはボトルである、請求項８６〜８９のいずれかに記載の容器。
  91. 注射器である、請求項８６〜８９のいずれかに記載の容器。
  92. さらに注射用針を含む、請求項８６〜９１のいずれかに記載の容器。
  93. 活性化因子が、ｐＨ、金属イオンまたはイオン強度から選択される活性化条件を提供し、活性化因子が、液状溶液または懸濁液で提供される、請求項８６〜９２のいずれかに記載の容器。
  94. 液状溶液が緩衝液である、請求項９３記載の容器。
  95. ｐＨが酸性である、請求項９３または請求項９４記載の容器。
  96. ｐＨが、３〜６.５、または３.５〜６、または３〜５.５、または３〜４.５、または４〜６、または４〜５.５、または４.５〜５、または５〜６およびそれぞれの前後を含めた範囲に含まれる、請求項９５記載の容器。
  97. ｐＨが、約３、３.５、４、４.５、５、５.５、６または６.５である、請求項９５記載の容器。
  98. 活性化因子が酸性緩衝溶液である、請求項９４〜９７のいずれかに記載の容器。
  99. 緩衝液が、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、クエン酸リン酸およびヒスチジンから選択される酸を含む、請求項９８記載の容器。
  100. ＡＭＤＥが投与後予め定められた期間活性を呈するように緩衝液のイオン強度が選択される、請求項９９記載の容器。
  101. 活性化条件が金属イオンであり、金属イオンがＣａ２＋である、請求項９３記載の容器。
  102. ＡＭＤＥが、膵臓エラスターゼ、エラスターゼ−２Ａ、エラスターゼ−２Ｂ、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、内在性血管エラスターゼ、カテプシンＧ、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、プラスミン、トロンビン、グランザイムＢ、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カルパイン１、カルパイン２、レグマイン、カテプシンＺ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−２、ＡＤＡＭＴＳ−３、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−１４およびヘパラナーゼまたはそれらの対立遺伝子または種変異型または他の変異型から選択される、請求項８６〜１０１のいずれかに記載の容器。
  103. ＡＭＤＥが、カテプシン、カルパインおよびヘパラナーゼから選択される、請求項８６〜１０１のいずれかに記載の容器。
  104. ＡＭＤＥがリソソーム酵素である、請求項８６〜１０１のいずれかに記載の容器。
  105. ＡＭＤＥがチモーゲンである、請求項８６〜１０４のいずれかに記載の容器。
  106. ＡＭＤＥが、１本鎖または２本鎖形態の成熟タンパク質である、請求項８６〜１０４のいずれかに記載の容器。
  107. ＡＭＤＥがカテプシンであり、カテプシンがシステインプロテアーゼまたはアスパラギン酸プロテアーゼである、請求項１０３〜１０６のいずれかに記載の容器。
  108. カテプシンが、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＨ、カテプシンＦ、カテプシンＯ、カテプシンＲ、カテプシンＶ、カテプシンＷ、カテプシンＤおよびカテプシンＥから選択される、請求項１０７記載の容器。
  109. カテプシンが、配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号５７、６０、１、６５、１８０、６８、７１、７４、７７、１８３、１８６、１８９、８０、１９５、９０、９３および９６のいずれかの対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項１０８記載の容器。
  110. ＡＭＤＥおよび活性化因子が、多回用量投与用の量で提供される、請求項８６〜１０９のいずれかに記載の容器。
  111. ＡＭＤＥおよび活性化因子が、単一単位用量で提供される、請求項８６〜１０９のいずれかに記載の容器。
  112. 容器中のＡＭＤＥが、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇである、請求項１１１記載の容器。
  113. 容器中の液体の総量が、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌまたは約１〜１０ｍｌである、請求項８６〜１１２のいずれかに記載の容器。
  114. ＡＭＤＥが、溶液または懸濁液中に含まれる、請求項８６〜１１３のいずれかに記載の容器。
  115. ＡＭＤＥが凍結乾燥されている、請求項８６〜１１３のいずれかに記載の容器。
  116. 第１区画が治療有効量の可活性化型カテプシンＬを含み、その量は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の疾患または状態の処置に有効であるものとし、第２区画がカテプシンＬを活性化するものである酸性緩衝液を含む、２区画を含む容器。
  117. 酸性緩衝液のｐＨが約４.５〜６の範囲に含まれる、請求項１１６記載の容器。
  118. 酸性緩衝液のｐＨが約４.５、５、５.５または６である、請求項１１６または請求項１１７記載の容器。
  119. 緩衝液が、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、クエン酸、クエン酸リン酸およびヒスチジンから選択される酸を含む、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の容器。
  120. ＡＭＤＥが投与後予め定められた期間活性を呈するように緩衝液のイオン強度が選択される、請求項１１９記載の容器。
  121. カテプシンＬが、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するか、または配列番号１の対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項１１６〜１２０のいずれかに記載の容器。
  122. 可活性化型カテプシンＬが凍結乾燥されている、請求項１１６〜１２１のいずれかに記載の容器。
  123. 容器中のカテプシンＬが、単用量投与用であり、約１０μｇ〜１００ｍｇ、約５０μｇ〜７５ｍｇ、約１００μｇ〜５０ｍｇ、約２５０μｇ〜２５ｍｇ、約５００μｇ〜１０ｍｇ、約１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇである量のカテプシンＬを含む、請求項１１６〜１２２のいずれかに記載の容器。
  124. 容器中の総量が、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌまたは約１〜１０ｍｌである、請求項１１６〜１２３のいずれかに記載の容器。
  125. ＥＣＭの疾患または状態が、セルライト、デュピュイトラン病、ペーロニー病、Ledderhose線維症（足底線維腫症）、関節硬着、既存の瘢痕、硬皮症、リンパ水腫およびコラーゲン蓄積大腸炎から選択されるコラーゲン介在疾患または状態である、請求項１１６〜１２４のいずれかに記載の容器。
  126. ＥＣＭの疾患または状態がセルライトである、請求項１１６〜１２４のいずれかに記載の容器。
  127. 請求項８６〜１２６のいずれかに記載の容器、および生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬およびその組み合わせから選択される別の薬理有効製剤を含む１個以上の追加容器を含む組み合わせ。
  128. 医薬上有効な薬剤が、ヒアルロニダーゼである分散剤である、請求項１２７記載の組み合わせ。
  129. ヒアルロニダーゼがＰＨ２０である、請求項１２８記載の組み合わせ。
  130. ヒアルロニダーゼが可溶性である、請求項１２８または請求項１２９記載の組み合わせ。
  131. ヒアルロニダーゼが、配列番号２２６に示したアミノ酸配列を有するか、またはその対立遺伝子または種変異型または他の変異型である、請求項１３０記載の組み合わせ。
  132. ヒアルロニダーゼがグリコシル化されている、請求項１２８〜１３１のいずれかに記載の組み合わせ。
  133. 容器中のヒアルロニダーゼが、単用量投与用であり、約１０単位〜５０００００単位、約１００単位〜１０００００単位、約５００単位〜５００００単位、約１０００単位〜１００００単位、約５０００単位〜７５００単位、約５０００単位〜５００００単位または約１０００単位〜１００００単位の量のヒアルロニダーゼを含む、請求項１２８〜１３２のいずれかに記載の組み合わせ。
  134. 医薬上有効な薬剤がリドカインである麻酔薬であり、容器中のリドカインが、単用量投与用であり、約１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜４００ｍｇ、約２０ｍｇ〜６０ｍｇまたは約３０ｍｇ〜５０ｍｇの量のリドカインを含む、請求項１２７記載の組み合わせ。
  135. 医薬上有効な薬剤が、アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストである血管収縮薬である、請求項１２７記載の組み合わせ。
  136. アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストが、レボノルデフリン、エピネフリンおよびノルエピネフリンから選択される、請求項１３５記載の組み合わせ。
  137. アルファアドレナリン作用性受容体アゴニストが、血管収縮させる量のエピネフリンである、請求項１３６記載の組み合わせ。
  138. 容器中のエピネフリンが、単用量投与用であり、エピネフリンの量が、約１０μｇ〜５ｍｇ、約５０μｇ〜１ｍｇ、約５０μｇ〜５００μｇ、約５０μｇ〜２５０μｇ、約１００μｇ〜５００μｇ、約２００μｇ〜４００μｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは約２ｍｇ〜４ｍｇである、請求項１３７記載の組み合わせ。
  139. 薬理学的有効薬剤が、別々の容器で提供される、請求項１２７〜１３８のいずれかに記載の組み合わせ。
  140. 追加の容器が少なくとも２種の薬理学的有効薬剤を含み、その薬剤が互いに分離された個別組成物として提供される、請求項１２７〜１３９のいずれかに記載の組み合わせ。
  141. 薬理学的有効薬剤が、同一容器中の同一組成物中で提供される、請求項１２７〜１３９のいずれかに記載の組み合わせ。
  142. 追加の容器がヒアルロニダーゼ、リドカインおよびエピネフリンを含む、請求項１２７〜１４１のいずれかに記載の組み合わせ。
  143. 追加の容器（複数も可）が注射器である、請求項１２７〜１４２のいずれかに記載の組み合わせ。
  144. 追加の容器（複数も可）中の総量が、約１〜１００ｍｌ、約１〜５０ｍｌ、約１０〜５０ｍｌ、約１０〜３０ｍｌ、約１〜２０ｍｌまたは約１〜１０ｍｌである、請求項１２７〜１４３のいずれかに記載の組み合わせ。
  145. 請求項８６〜１２６のいずれかに記載の容器、投与装置を含み、所望により投与指示書を含んでいてもよいキット。
  146. 請求項１２７〜１４４のいずれかに記載の組み合わせ、投与装置を含み、所望により投与指示書を含んでいてもよいキット。
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