ES2586765T3

ES2586765T3 - Control temporal in vivo de enzimas activables que degradan matriz

Info

Publication number: ES2586765T3
Application number: ES09716286.1T
Authority: ES
Inventors: Gilbert A. Keller; Gregory I. Frost
Original assignee: Halozyme Inc
Current assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2008-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2016-10-18
Anticipated expiration: 2029-03-06
Also published as: KR20100135779A; KR20130106893A; JP2014043449A; US20140271609A1; AU2009220094B2; IL207293A; KR101647933B1; US20100003237A1; AU2009220094A1; AR076627A1; US9775889B2; BRPI0909622A2; KR20160073346A; EP2274004B1; CL2013002070A1; WO2009111083A2; TWI395593B; EP2274004A2; US9833498B2; CA2718549C

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por colágeno, que comprende catepsina L en un portador farmacéuticamente aceptable a un pH de 3,5 a 6, en donde: la composición se formula para administración subepidérmica; y la enfermedad o afección mediada por colágeno se selecciona entre la enfermedad de Dupuytren, la enfermedad de Peyronie, la fibrosis de Ledderhose, la rigidez de las articulaciones, esclerodermia, linfedema y colitis colagenosa.

Description

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Esquema

A.: Definiciones

B.: La matriz extracelular

imagen6: 1. Los componentes de la MEC

imagen7: imagen8 a. Colágenos

imagen9: imagen10 b. Elastina

imagen11: imagen12 c. Fibronectina

imagen13: imagen14 d. Glicosaminoglicanos (GAG)

imagen15: imagen16 imagen17 i. Proteoglicanos

imagen18: imagen19 imagen20 ii. Ácido Hialurónico

imagen21: 2. Histología de la piel

imagen22: imagen23 a. La epidermis

imagen24: imagen25 b. La dermis

imagen26: imagen27 c. La hipodermis

imagen28: 3. Enfermedades de la MEC

C.: Enzimas que Degradan la matriz

imagen29: 1. Activación de Enzimas

imagen30: imagen31 a. Serina Proteasas

imagen32: imagen33 b. Cisteína Proteasas

imagen34: imagen35 imagen36 i. Catepsinas

imagen37: imagen38 imagen39 imagen40 Catepsina L

imagen41: imagen42 imagen43 ii. Calpaína

imagen44: imagen45 c. Aspártico Proteasas

imagen46: imagen47 d. Metaloproteasas

imagen48: imagen49 e. Heparanasa

D.: Enzimas Activables que Degradan la Matriz (EADM)

imagen50: 1. Condiciones de activación y Métodos de Activación de Enzimas que Degradan la Matriz

imagen51: imagen52 a. Condición de Activación -pH Ácido

imagen53: imagen54 b. Condición de Activación -Concentración de Cationes de Metales

imagen55: imagen56 c. Condición de Activación -Agente Reductor

imagen57: imagen58 d. Condición de Activación -Temperatura

imagen59: imagen60 imagen61 i. Mutantes de Metaloproteasas de la Matriz Sensibles a la Temperatura

imagen62: imagen63 imagen64 imagen65 1) Modificaciones de tsMPM-1 Ilustrativas

imagen66: imagen67 imagen68 imagen69 2) Combinaciones

imagen70: imagen71 imagen72 imagen73 3) Modificaciones adicionales

imagen74: imagen75 imagen76 imagen77 4) Otras MPM

E.: 2. Combinaciones de Enzimas que Degradan la Matriz y Activador Métodos de Producción de Ácidos Nucleicos que Codifican Enzimas que Degradan la Matriz, y Polipéptidos de los Mismos

imagen78: 1. Vectores y células

imagen79: 2. Expresión

Esquema

imagen80: imagen81 a. Células Procariotas

imagen82: imagen83 b. Células de Levadura

imagen84: imagen85 c. Células de Insecto

imagen86: imagen87 d. Células de Mamífero

imagen88: imagen89 e. Plantas

imagen90: 3. Técnicas de Purificación

F.: Preparación, Formulación y Administración de Enzimas Activables que Degradan la Matriz

imagen91: 1. Inyectables, soluciones y emulsiones

imagen92: imagen93 Polvos Liofilizados

imagen94: 2. Administración Tópica

imagen95: 3. Composiciones para otras vías de administración

imagen96: 4. Terapias Combinadas

imagen97: imagen98 a. Enzimas que Degradan Hialuronano

imagen99: imagen100 imagen101 i. Hialuronidasas

imagen102: imagen103 imagen104 imagen105 1) Hialuronidasas de tipo mamífero

imagen106: imagen107 imagen108 imagen109 2) Hialuronidasas Bacterianas

imagen110: imagen111 imagen112 imagen113 3) Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos

imagen114: imagen115 imagen116 ii. Otras enzimas que degradan hialuronano

imagen117: imagen118 imagen119 iii. Enzimas solubles que degradan hialuronano

imagen120: imagen121 imagen122 imagen123 1) PH20 Humana Soluble

imagen124: imagen125 imagen126 imagen127 2) rHuPH20

imagen128: imagen129 imagen130 iv. Modificaciones de enzimas que degradan hialuronano para mejorar sus propiedades farmacocinéticas

G.: Empaquetado y Artículos de Fabricación de Enzimas Activables que Degradan la Matriz

imagen131: 1. Aparato de una cámara

imagen132: 2. Aparato de Doble Cámara

imagen133: 3. Kits

H.: Métodos de Evaluación de la Actividad de las Enzimas que Degradan la Matriz

imagen134: 1. Métodos de evaluación de la actividad enzimática

imagen135: 2. Métodos de evaluación de la degradación de MEC

imagen136: imagen137 a. En ensayos in vitro

imagen138: imagen139 b. Los ensayos in vivo

I.: c. Los modelos animales no humanos Ejemplos de Métodos para Tratar Enfermedades o Efectos de Enfermedades o Afecciones Mediadas por Colágeno de la MEC

imagen140: imagen141 a. Celulitis

imagen142: imagen143 b. Enfermedad de Dupuytren

imagen144: imagen145 c. Enfermedad de Peyronie

imagen146: imagen147 d. Fibrosis de Ledderhose

imagen148: imagen149 e. Rigidez en las articulaciones

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para que se produzca actividad. La activación puede dar como resultado la producción de formas multi-cadena de las proteasas, por ejemplo, las formas de dos cadenas. En algunos casos, las formas de cadena sencilla de la proteasa pueden exhibir actividad proteolítica como una sola cadena.

Según se utiliza en la presente memoria, un cofactor se refiere a una condición o factor que se requiere para la actividad de una enzima. Los cofactores incluyen algo necesario para la actividad enzimática. Los ejemplos de los cofactores incluyen, pero sin limitarse a, pH, fuerza iónica, iones metálicos o temperatura. Con referencia a la administración in vivo de una enzima, los cofactores incluyen factores presentes endógenamente y factores proporcionados exógenamente.

Según se utiliza en la presente memoria, una condición de activación se refiere a cualquier condición física o combinación de condiciones que se requiere para la actividad de una enzima. Para los propósitos de la presente memoria, una condición de activación para una enzima activable que degrada la matriz (EADM) incluye aquellas que no están presentes en el sitio de administración, por ejemplo, no están presentes en la matriz extracelular, en cantidades (es decir, cantidad, grado, nivel u otra medida física) necesarias para la activación de la enzima. Los ejemplos de condiciones de activación incluyen, pero sin limitarse a, pH, iones metálicos, agentes oxidantes o reductores, temperatura y fuerza iónica. Por ejemplo, en el caso de las enzimas que degradan la matriz lisosomal que son activas en condiciones de pH bajo pero inactivas a pH neutro, la exposición de la enzima inactiva a una condición de activación que es el pH ácido da como resultado la activación de la enzima. En virtud del hecho de que la condición de activación no está presente en el sitio de administración de la enzima, pero se debe añadir de forma exógena, la condición de activación se disipará y/o se neutralizará a lo largo del tiempo, de tal manera que la condición de activación ya no está presente para activar la enzima. Por lo tanto, la enzima se activa durante un tiempo limitado o predeterminado tras la administración.

Según se utiliza en la presente memoria, un activador se refiere a cualquier composición que proporciona una condición de activación para una enzima activable que degrada la matriz. Los ejemplos de los activadores incluyen, pero sin limitarse a un tampón de pH ácido, un tampón frío, o un tampón de calcio.

Según se utiliza en la presente memoria, una "enzima activable que degrada la matriz (EADM)" se refiere a una enzima que degrada la matriz que requiere una condición de activación con el fin de ser activa. Para los fines de la presente memoria, por ejemplo, una EADM es sustancialmente inactiva en la MEC a no ser que se exponga a activadores antes, durante o después de la administración de la EADM, proporcionando de ese modo una condición de activación para la enzima. Por lo tanto, la activación de las enzimas activables se controla por las condiciones exógenas de modo que el período de tiempo en un locus o sitio in vivo en el que la enzima es activa se pueden predeterminar y/o controlar como resultado de la disipación y/o neutralización de la condición de activación (es decir, temporalmente controlable o controlada en el tiempo). Por lo tanto, en virtud de la exposición a una condición de activación, las enzimas son activas durante un tiempo limitado y/o de forma limitada en la MEC (es decir, son condicionalmente activas). El grado y el tiempo de activación pueden ser controlados mediante la selección del activador o las condiciones de activación, y pueden ser durante un tiempo predeterminado. Por ejemplo, una enzima lisosomal, tales como la catepsina L, es activable ya que puede ser activada por la exposición a la condición de activación de pH, tal como la proporcionada por una solución tamponada ácida. Tras la administración de la enzima activada al entorno de pH neutro de la MEC, el entorno de pH volverá a la neutralidad en un período de tiempo que se puede predeterminar basándose en la capacidad tamponadora del tampón ácido, de manera que la enzima se convertirá en inactiva.

Según se utiliza en la presente memoria, "cantidad de un activador" se refiere a la cantidad, grado o nivel de un activador. La cantidad de un activador puede ser una concentración o cantidad absoluta, o una temperatura o pH concretos. Para los fines de la presente memoria, la cantidad de activador es típicamente una cantidad que es suficiente para dar lugar a la activación condicional de una enzima. La cantidad se puede ajustar para modificar la duración de la activación de manera que la activación pueda ser durante un tiempo limitado o predeterminado.

Según se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico.

Según se utiliza en la presente memoria, una enzima que es activa durante un tiempo limitado o de duración limitada se refiere a una enzima activa que tiene actividad que se disipa y/o se neutraliza a lo largo del tiempo. Por lo tanto, en virtud de la ausencia de una condición de activación, la enzima se vuelve inactiva.

Según se utiliza en la presente memoria, tiempo predeterminado significa un tiempo limitado que se sabe de antemano y se puede controlar. La disipación y/o neutralización de una condición de activación necesaria para la actividad de una enzima se pueden valorar de manera que el tiempo requerido para que una enzima activa se convierta en inactiva es conocido. Por ejemplo, una enzima activada por ácido que se administra en medio ácido y se expone a un entorno in vivo que tiene un pH neutro (es decir, la MEC), con el tiempo, se expondrá a un aumento

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Según se utiliza en la presente memoria, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos peptidonucleicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están marcados opcionalmente, tal como con un marcador detectable, tal como en forma de una marca fluorescente o una radiomarca, se contemplan

5 las moléculas de hebra sencilla. Dichas moléculas tienen típicamente una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de la secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden tener 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.

10 Según se utiliza en la presente memoria, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene de 2 a 40 aminoácidos de longitud.

Según se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos

15 proporcionadas en la presente memoria se identifican de acuerdo con sus abreviaturas de tres letras o de una letra conocidas (Tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las denominaciones de una sola letra convencionales utilizadas rutinariamente en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y

20 un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los fines en la presente memoria, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, los aminoácidos en los que el carbono α tiene una cadena lateral).

Según se utiliza en la presente memoria, "residuo de aminoácido" se refiere a un aminoácido formado tras la

25 digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los residuos de aminoácidos descritos en la presente memoria tienen la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", que se designan de ese modo, pueden ser sustituidos por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo

30 terminal de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos convencional descrito en J. Biol. Chem.,

243: 3552-3559 (1969), y adoptada en 37 C.F.R., §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1 -Tabla de Correspondencia

SÍMBOLO: imagen155

1 Letra: 3 Letras AMINOÁCIDOS

Y: Tyr Tirosina

G: Gly Glicina

F: Phe Fenilalanina

M: Met Metionina

A: Ala Alanina

S: Ser Serina

I: Ile Isoleucina

L: Leu Leucina

T: Thr Treonina

V: Val Valina

P: Pro Prolina

K: Lys Lisina

H: His Histidina

Q: Gln Glutamina

E: Glu Ácido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gln

W: Trp Triptófano

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1 Letra: 3 Letras AMINOÁCIDOS

R: Arg Arginina

D: Asp Ácido aspártico

N: Asn Asparragina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Cabe señalar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en la presente memoria mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino terminal al extremo carboxilo-terminal. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822. Además, debe tenerse en cuenta que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico hacia una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácidos de origen natural" se refieren a los 20 L-aminoácidos que aparecen en los polipéptidos.

Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural, pero que ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen de este modo, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitarse a, los D-isostereómeros de aminoácidos. Los aminoácidos no naturales ilustrativos se describen en la presente memoria y son conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, un constructo de ADN es una molécula de ADN de hebra sencilla o doble, lineal o circular que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Existen constructos de ADN como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Según se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee desde la dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado .

Según se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero de hebra sencilla o doble de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviados "nt") o pares de bases (abreviados "pb"). El término nucleótidos se utiliza para las moléculas de hebra sencilla o doble cuando el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, éste se utiliza para denotar la longitud completa y se entenderá que es equivalente al término pares de bases. Los expertos en la técnica reconocerán que las dos hebras de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente de longitud y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados; así, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble cadena pueden no estar emparejados. Tales extremos desemparejados no excederán, en general, de 20 nucleótidos de longitud.

Según se utiliza en la presente memoria, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de los residuos y los residuos allí contenidos. Los métodos para evaluar el grado de similitud entre las proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado en el que las secuencias de aminoácido o nucleótidos son invariables. El alineamiento de secuencias de aminoácidos, y en cierta medida de secuencias de nucleótidos, también puede tener en cuenta las diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Las

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diferencias conservativas son aquellas que preservan las propiedades físico-químicas de los residuos que participan. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas en toda la longitud de las secuencias y que incluye todos los residuos) o locales (el alineamiento de una porción de las secuencias que incluye sólo la región o regiones más similares).

"Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. (Véanse, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Si bien existen diversos métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la técnica (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math 48:1073 (1988)).

Según se utiliza en la presente memoria, homólogo (con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos y/o aminoácidos) significa aproximadamente mayor que o igual a 25% de homología de secuencia, típicamente mayor que o igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de homología de secuencia; el porcentaje preciso se puede especificar si fuera necesario. Para los fines de la presente memoria, los términos "homología" e "identidad" se utilizan indistintamente, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, las secuencias se alinean de manera que se obtenga el emparejamiento de orden máximo (véase, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Mediante homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina mediante programas de algoritmos de alineamiento convencionales, y se puede utilizar con penalizaciones por hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas se hibridan típicamente con rigurosidad moderada o alta rigurosidad a lo largo de la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico que se hibrida.

El que cualquiera de las dos moléculas tenga secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homólogas" puede determinarse utilizando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FASTA", utilizando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:2444 (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol. 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología se puede utilizar para determinar la identidad. Otros programas comercialmente o públicamente disponibles incluyen, el programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) y el programa "Gap" del Genetics Computer Group (UWG) de la Universidad de Wisconsin (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico se pueden determinar, por ejemplo, comparando la información de secuencia utilizando un programa de ordenador GAP (p. ej., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, revisado por Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Brevemente, el programa GAP define similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos finales.

Por lo tanto, según se utiliza en la presente memoria, los términos "identidad" u "homología" representan una comparación entre una prueba y un polipéptido o polinucleótido de referencia. Según se utiliza en la presente memoria, el término al menos "90% idéntica a" se refiere a porcentajes de identidad de 90 a 99,99 con respecto a la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de referencia del polipéptido. La identidad a un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo que se comparan a título ilustrativo un ensayo y una longitud de polipéptido referencia de 100 aminoácidos, no más de 10% (es decir, de 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difiere del polipéptido de referencia. Se pueden realizar comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Tales diferencias pueden ser representadas como mutaciones puntuales distribuidas al azar sobre toda la longitud de un polipéptido o pueden ser agrupadas en una o más localizaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, p. ej., 10/100 de diferencia de aminoácidos (identidad de

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Tabla 2: Tipos de colágenos

Tipo: Composición de la molécula tejido representativo

Colágenos Fibrilares

I: [α1(I)]2 [Α2 (I)] Piel, huesos, tendón, ligamentos, dentina, tejidos intersticiales

II: [α1(II)]3 Cartílago, humor vítreo

III: [α1(III)]3 Piel, músculos, vasos sanguíneos; con frecuencia asociado con el tipo I

V: [α1(V)][α2(v)][α3(V)] Similar al Tipo I, también los cultivos celulares, tejidos fetales; asociados con el tipo I

XI: [α1(XI)][α2(XI)][α3(XI)] Cartílago, cartílago intervertebral y esmalte de los huesos

Colágenos no fibrilares

IV: [α1(IV)]2[α2(IV)] Membrana basal

VI: [α1(VI)][α2(VI)][α3(VI)] Mayoría de los tejidos intersticiales; asociados con el tipo I

VII: [α1(VII)]3 epitelios

VIII: [α1(VIII)]3 Desconocido, algunas células endoteliales

IX: [α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)] Cartílago; asociados con el Tipo II

X: [α1(X)]3 Cartílago heterotrófico y de mineralización

XII: [α1(XII)]3 Ligamentos, tendones y esmalte de los dientes; interactúa con los tipos I y III

b. Elastina

5 Una red de fibras elásticas en la MEC proporciona flexibilidad a los tejidos que requieren resistencia al retroceso después del estiramiento, tales como la piel, las arterias y los pulmones. El componente principal de las fibras elásticas es la molécula de elastina, que crea enlaces cruzados con moléculas de elastina adyacentes. Estas moléculas forman un núcleo de fibras elásticas y están cubiertas por fibrilina, una glicoproteína grande que se une a la elastina y es importante para la integridad de las fibras elásticas.

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c. Fibronectina

La fibronectina es una glicoproteína que existe en forma de un par de dos grandes subunidades unidas por un par de enlaces disulfuro cerca de los extremos carboxilo. Cada subunidad contiene dominios específicos funcionalmente 15 distintos para otras macromoléculas de la matriz y los receptores en la superficie de las células. Por ejemplo, los dominios distintos sobre el colágeno se unen a fibronectina (dominios separados para los tipos I, II y III), heparina, fibrina y receptores de la superficie celular tales como las integrinas. La fibronectina está presente en plasma y tejidos. En el tejido, la fibronectina funciona conectando diferentes tipos de moléculas de la MEC y las células. También contiene un importante dominio de unión a células formado por los tres aminoácidos, Arg-Gly-Asp (RGD),

20 que es reconocido por receptores de integrina en las membranas plasmáticas de las células. La unión de las moléculas de fibronectina a los receptores de integrina en las células conduce a la estimulación de las rutas que promueven la unión, la migración y la diferenciación celulares. Estas características permiten que la fibronectina desempeñe un papel importante en la adherencia celular y comunique señales entre las células y los componentes de la MEC.

25

d. Glicosaminoglicanos (GAG)

Los GAG son cadenas de polisacáridos no ramificadas elaboradas de unidades repetitivas de disacáridos que son fuertemente hidrófilas. Los GAG están sumamente cargados negativamente y por lo tanto atraen Na+ osmóticamente 30 activo, haciendo que se atraigan grandes cantidades de agua a su estructura para mantener la MEC hidratada. Los GAG, tales como el sulfato de dermatán, típicamente contienen múltiples cadenas de glicosaminoglicanos de 70-200 azúcares de longitud (formados a partir de unidades repetitivas de disacáridos) que se ramifican a partir de un núcleo de proteína lineal. Esto da como resultado GAG que ocupan un volumen enorme con respecto a su masa y forman geles a concentraciones muy bajas. La naturaleza hidrófila de los GAG provoca una presión de hichamiento,

35 o turgencia, que permite que la MEC resista fuerzas de compresión.

En la MEC, los GAG se anclan a proteínas de la MEC para formar proteoglicanos o, en el caso del ácido hialurónico

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técnica incluyendo el aislamiento de fuentes naturales, el aislamiento de proteínas producidas de forma recombinante en células, tejidos y organismos y por métodos recombinantes y por métodos que incluyen etapas in silico, métodos sintéticos y métodos cualesquiera conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, las enzimas se producen o aíslan en una forma inactiva. La activación condicional se puede lograr como se describe a continuación.

TABLA 3: Matriz de enzimas de degradación

Proteasa: Sustrato Código de acceso a la base de datos de enzimas (EC) www.exp asy.ch/sp rot/me Enzy.html Núm. GenBank SEQ ID NO

Precursora: Madura

nt: aa (aa de la secuencia señal (ss); aa del propéptido (pp) aa

Serina Proteasa

Elastasa pancreática (PE1; Elastasa-1): elastina 3.4.21.36 Q9UNI1; NM_00197 1 19 20 (aa ss 1-8; aa pp 918) 21

Elastasa-2A: elastina 3.4.21.71 P08217; NM_03344 0 22 23 (aa ss 1-16; aa pp 17-28) 24

Elastasa-2B: elastina 3.4.21.71 P08218; NM_01584 9 25 26 (aa aa 1-16; aa pp 17-28) 27

Elastasa de neutrófilos (EN; elastasa de leucocitos; elastasa-2): Elastina, fibronectina, laminina, colágeno de tipo II, IV, VI, proteoglicano 3.4.21.37 P08246 NM_00197 2 28 29 (aa ss 1-17; aa pp 28-29) 30

Proteinasa-3 (PR-3; mieloblastina): elastina, fibronectina, laminina, vitronectina, colágeno tipo 3.4.21.76 P24158 NM_00277 7 31 32 (aa ss 1-25; aa pp 26-27, 249-256) 33

imagen167: IV imagen168 imagen169 imagen170 imagen171 imagen172

Elastasa endógena vascular (EVE; elastasa tisular; factor D de complemento): elastina 3.4.21.46 S73894 (Rattus sp.) 34 35 (aa ss 1-20; aa pp 21-25) 36

Catepsina G: colágeno tipo IV, laminina, fibronectina, proteoglicano, elastina EC 3.4.21.20 P08311 NM_00191 1 37 38 (aa ss 1-18; aa pp 19-20) 39

Quimasa de mastocitos: colágeno tipo IV, laminina, fibronectina, proteoglicano 3.4.21.39 P23946 NM_00183 6 40 41 (aa ss 1-19; aa pp 20-21) 42

Triptasa de mastocitos: fibronectina, fibrinógeno, colágeno tipo IV, proteoglicano 3.4.21.59 Q9BZJ3 NM_01221 7 43 44 (aa ss 1-18; aa pp 19-30) 45

Plasmina: Proteoglicanos, fibronectina, laminina 3.4.21.7 P00747 NM_00030 1 46 47 (aa ss 1-19; aa pp 20-97) 48

TABLA 3: Matriz de enzimas de degradación

Precursora: Madura

nt: aa (aa de la secuencia señal (ss); aa del propéptido (pp) aa

Serina Proteasa

Trombina: proteoglicano 3.4.21.5 P00734 NM_00050 6 49 50 (aa ss 1-24; aa pp 25-43) 51

Granzima B: proteoglicano 3.4.21.79 P10144 NM_00413 1 52 53 (aa ss 1-18; aa pp 19-20) 54

Cisteína Proteasa

Catepsina S: Elastina, colágeno EC 3.4.22.27 P25774 NM_00407 9 55 56 (Ss 116; pp 17114) 57

Catepsina K: elastina, colágeno I y III EC 3.4.22.38 P43235 NM_00039 6 58 59 (aa ss 1-15; aa pp 16114). 60

Catepsina L: elastina, colágeno I y IV EC 3.4.22.15 P07711 61 62 (aa ss 17; aa pp 18-113) 1

Catepsina B: Colágeno IV, laminina, fibronectina EC 3.4.22.1 P07858 NM_00190 8 63 64 (aa ss 1-17; aa pp 18-79) 65

Catepsina C: Proteoglicanos (decorina) EC 3.4.14.1 P53634 NM_00181 4 178 179 (aa ss 1-24; aa pp 135230) 180

Catepsina H: fibronectina EC 3.4.22.16 X16832 P09668 66 67 (aa ss 1-22; aa pp 23-97) 68

Catepsina F: fragmentos de colágeno EC 3.4.22.41 Q9R013 NM_01986 1 (Mus musculus) 69 70 (aa ss 1-19; aa pp 20-248) 71

Catepsina F: fragmentos de colágeno EC 3.4.22.41 Q9UBX1 NM_00379 3 181 182 (aa ss 1-19; pp 20-270) 183

Catepsina O: fibrinógeno EC 3.4.22.42 Q8BM88 NM_17766 2 (Mus musculus) 72 73 (aa aa1-23; aa pp 24-98) 74

Catepsina O: fibrinógeno EC 3.4.22.42 P43234 NM_00133 4 184 185 (aa ss 1-23; aa pp 24-107) 186

Catepsina R: imagen173 EC3.4.22. - Q9JIA9 NM_02028 4 (Mus musculus) 75 76 (aa ss 1-17; aa pp 18-114) 77

Catepsina V. (Catepsina L2): colágeno EC 3.4.22.43 060911 NM_00133 3 187 188 (aa ss 1-17; aa pp 18-113) 189

TABLA 3: Matriz de enzimas de degradación

Precursora: Madura

nt: aa (aa de la secuencia señal (ss); aa del propéptido (pp) aa

Serina Proteasa

Catepsina W: imagen174 EC 3.4.22.- P56202 NM_00133 5 78 79 (aa ss 1-21; aa pp 22-127) 80

Calpaína 1: fibronectina, vitronectina, proteoglicano EC 3.4.22.52 Subunidad grande de calpaina: P07384 NM_00518 6 81 imagen175 82

Calpaína 2: fibronectina, vitronectina, proteoglicano EC 3.4.22. 53 Subunidad grande de calpaína 2: P17655 NM_00174 8 83 84 (aa 1 metionina de iniciación) 85

imagen176: imagen177 Subunidad pequeña de calpaina 1 (asociada con las subunidades grandes de calpaína 1 y 2) P04632 NM_001749 86 imagen178 87

Legumaína: imagen179 EC 3.4.22.34 Q99538 NM_00560 6 190 191 (aa ss 1-17; aa pp 324433) 192

Catepsina Z (catepsina X): imagen180 EC 3.4.22.- Q9UBR2 NM_00133 6 193 194 (aa ss 1-23; aa pp 24-61) 195

Aspártico proteasa

Catepsina D: proteoglicanos EC 3.4.23.5 P07339 NM_00190 9 88 89 (aa ss 118; aa pp 1964) 90

Catepsina E: proteoglicanos EC 3.4.23.34 P14091 la isoforma a NM_00191 0 91 92 (aa ss 117; aa pp 1853) 93

imagen181: imagen182 imagen183 Isoforma b NM_14896 4 94 95 (aa ss 117; aa pp 1853) 96

Metalo-Proteasa

MPM-1 (colagenasa -1): colágeno I, II, III, VII, VIII, X, XI, gelatina, proteoglicanos, fibronectina, glicoproteína 3.4.24.7 P03956, NM_00242 1 97 98 (aa ss 1-19; aa pp 20-99) 99

MPM-8 (colagenasa2): colágeno I, II, III, agrecano 3.4.24.34 P22894 NM_00242 4 100 101 (aa ss 1-20; aa pp 21100) 102

MPM-13 (colagenasa -3): colágeno I, II, III, IV, VI, IX, X, XIV, gelatina, proteoglicanos, fibronectina, glicoproteína 3.4.24.- P45452 NM_00242 7 103 104 (aa ss 1-19; aa pp 20103) 105

MPM-18: colágeno I 3.4.24.- Xenopus laevis 106 107 (aa 108

Aspártico proteasa

(colagenasa-4): imagen184 imagen185 013065 imagen186 ss 1-17; aa pp 1899) imagen187

MPM-2 (gelatinasa A): gelatinas, colágeno I, II, III, IV, V, VII, X, XI, elastina, fibronectina, laminina, proteoglicano, glicoproteína 3.4.24.24 P08253 NM_00453 0 109 110 (aa ss 1-29; pp 30109) 111

MPM-9 (gelatinasa B): gelatina, colágeno IV, V, VI, XIV, elastina, laminina, proteoglicano, glicoproteína 3.4.24.35 P14780 NM_00499 4 112 113 (aa ss 1-19; aa pp 2093) 114

MPM-3 (estromelisina-1): fibronectina, elastina, laminina, gelatina, proteoglicano, glicoproteína, colágeno III, IV, V, VII, IX, X, XI 3.4.24.17 P08254 NM_00242 2 115 116 (aa ss 1-17; aa pp 1899) 117

MPM-10 (estromelisina-2): colágeno III, IV, V, elastina, gelatina, fibronectina, agrecano 3.4.24.22 P09238 NM_00242 5 118 119 (aa ss 1-17; aa pp 1898) 120

MPM-11 (estromelisina-3): Gelatina, fibronectina, laminina, colágeno IV 3.4.24.- X57766 P24347 121 122 (aa ss 1-31; aa pp 3297) 123

MPM-7 (matrilisina): fibronectina, laminina, elastina, gelatina, colágeno I, IV, proteoglicano, glicoproteína 3.4.24.23 P09237 NM_00242 3 124 125 (aa ss 1-17; aa pp 1894) 126

MPM-26 (matrilisina2): colágeno IV, fibronectina, gelatina, proteoglicano 3.4.24.- Q9NRE1 NM_02180 1 127 128 (aa ss 1-17; aa pp 1889) 129

MPM-12 (metaloelastasa): elastina, fibronectina, laminina, colágeno I, IV, V, gelatina, proteoglicano, glicoproteína 3.4.24.65 P39900 NM_00242 6 130 131 (aa ss 1-16; aa pp 17105) 132

MPM-14 (MT1-MPM): Colágeno I, II, III, gelatina, agrecano, fibronectina, laminina, proteoglicano, glicoproteína 3.4.24.80 P50281 NM_00499 5 133 134 (aa ss 1-20; aa pp 21111) 135

MPM-15 (MT2-MPM): agrecano, fibronectina, laminina, glicoproteína EC 3.4.24.- P51511 NM_00242 8 136 137 (aa ss 1-41; aa pp 42131) 138

MPM-16 (MT3-MPM): Colágeno III, fibronectina, laminina, gelatina, proteoglicano EC 3.4.24.- P51512 NM_00594 1 139 140 (aa ss 1-31; aa pp 32119) 141

MPM-17 (MT4-MPM): Gelatina EC 3.4.24.- Q9ULZ9 AB021225 142 143 (aa ss 1-38; aa pp 39128) 144

MPM-24 (MT5-MPM) Transmembrana: fibronectina, gelatina, proteoglicano EC 3.4.24.- Q9Y5R2 NM_00669 0 309 310 (aa ss 1-52; aa pp 53 311

Aspártico proteasa

imagen188: imagen189 imagen190 imagen191 imagen192 155) imagen193

MPM-25 (MT6-MPM) ancla de GPI: colágeno IV, gelatina, fibronectina, proteoglicano EC 3.4.24.- Q9NPA2 NM_0224 68 312 313 (aa ss 1-21; aa pp 22107) 314

MPM-19: colágeno IV, gelatina, laminina, agrecano, fibronectina, glicoproteína EC 3.4.24.- Q99542 NM_00242 9 145 146 (aa ss 1-18; aa pp 1997) 147

MPM-20 (enamelisina): agrecano EC 3.4.24. 060882 Y12779 148 149 (aa ss 1-22; aa pp 23107) 150

MPM-x (MPM-21) (XMPM): Sin sustratos definidos EC 3.4.24. 093470 NM_00108 5816 (Xenopus) 151 152 (aa ss 1-22; aa pp 23180) 153

MPM-21: gelatina EC 3.4.24.- Q8N119 NM_14719 1 315 316 (aa ss 1-24; aa pp 25144) 317

MPM-23 CA-MPM: gelatina EC 3.4.24. 075900 AJ005256 318 319 320

MPM-27 CMPM: gelatina EC 3.4.24.- Q9H306 NM_02212 2 321 322 (aa ss 1-17; aa pp 1898) 323

MPM-28 (epilisina): imagen194 EC 3.4.24.- Q9H239 NM_02430 2 324 325 (aa ss 1-22; aa pp 23122) 326

ADAMTS-1: agrecano EC 3.4.24. Q9UHI8 NM_00698 8 157 158 (aa ss 1-49; aa pp 50252) 159

ADAMTS-2: Procolágeno I, procolágeno II EC 3.4.24. 095450 AJ003125 160 161 (aa ss 1-29; aa pp 30253) 162

ADAMTS-3: Procolágeno II EC 3.4.24.14 015072 NM_01424 3 163 164 (aa 1-229) 165

ADAMTS-4 (agrecanasa-1): agrecano EC 3.4.24.82 075173 NM_00509 9 166 167 (aa ss 1-51; aa pp 52212) 168

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TABLA 3: Matriz de enzimas de degradación

Proteasa: Sustrato Código de acceso a base de datos de enzimas (EC) www.exp asy.ch/sp rot/Enzyme.html Núm. GenBank SEQ ID NO

Precursora: Madura

nt: imagen195 aa (a de la secuencia señal (ss); aa del propéptido (pp) aa

ADAMTS-5 (agrecanasa2): agrecano EC 3.4.24. Q9UNA0 NM_00703 8 169 imagen196 170 (aa ss 1-16; aa pp 17-261) 171

ADAMTS-14: Procolágeno I EC 3.4.24. Q8WXS8 Isoforma a NM_13915 5 172 imagen197 173 (aa ss 1-22; aa pp 23-252) 174

imagen198: imagen199 imagen200 Isoforma a NM_08072 2 175 imagen201 176 (aa ss 1-22; aa pp 23-252) 177

Otra

Heparanasa: Proteoglicano EC 3.2.-.- Q9Y251 AF152376 154 imagen202 155 (aa ss 1-35; aa pp 110-157) 156

1. Activación de enzimas

La mayoría de las proteasas se sintetizan y secretan como formas inactivas y requieren procesamiento adicional para convertirse en activa. La activación se logra típicamente mediante cambios conformacionales, estéricos u otros que revelan el sitio activo de las enzimas. Con la excepción de las calpaínas, todas las enzimas proteasas se sintetizan típicamente en forma de zimógenos. La activación del zimógeno evita la degradación de proteínas no deseadas que podría ocurrir si las proteasas siempre estuvieran presentes en una forma activa. En general, los zimógenos contienen porciones N-terminales (o prosegmentos o proregiones) que bloquean estéricamente el sitio activo de la proteasa y evitan el acceso de sustratos al sitio activo de la proteasa. Los prosegmentos de los zimógenos varían de tamaño desde dos residuos a 150 residuos. Tras la secreción a partir de una forma de preproenzima, la proenzima (que contiene el prosegmento) está inactiva.

Tras la eliminación proteolítica del prosegmento del zimógeno, ya sea autocatalítica o por otras proteasas, se expone el sitio activo de la enzima lo que da como resultado una proteasa madura, y por lo general, la activación. En algunos casos, sin embargo, son necesarios cofactores adicionales también para la activación completa. Por ejemplo, el cambio de pH provoca la activación de las enzimas de las familias de cisteína, aspártico y metaloproteasas. El pH bajo actúa aumentando la susceptibilidad del prosegmento como sustrato durante la conversión del zimógeno o causa un cambio conformacional en el prosegmento o enzima (Jerala et al. (1998) J Biol. Chem., 273:11498-11504). Las enzimas lisosomales, tales como las catepsinas de las familias de cisteína y aspártico proteasas, requieren condiciones ácidas antes de conseguir la activación completa. Además del pH, otros cofactores incluyen, pero sin limitarse a, la concentración de sal, agentes reductores tales como cisteína, DTT y TCEP, iones metálicos tales como calcio, calor o temperatura. Por lo tanto, existen diversos mecanismos de conversión de zimógeno y varían entre las familias de proteasas (véase, p. ej., Khan et al. (1998) Protein Science, 7:815-836; Khan et al. (1999) PNAS, 96:10968-10975). Por ejemplo, la conversión de zimógeno en la enzima activa a menudo se produce como resultado de la proteolisis por autocatálisis o acciones de otras proteasas, cambios en el pH, o la participación de moléculas o iones accesorios, o una combinación o una o más de las condiciones anteriores. Se logra a menudo un control adicional sobre el momento y el lugar de la acción mediante inhibidores de proteína (Stroud et al. (1977) Ana. Rdo. Biophys. Bioeng., 6:177-93).

a. Serina Proteasas

Las serina proteasas (PE), que incluyen las enzimas secretadas y las enzimas secuestradas en los orgánulos citoplasmáticos de almacenamiento, tienen una variedad de funciones fisiológicas, incluyendo la coagulación de la sangre, la cicatrización de heridas, la digestión, la respuesta inmunológica y la invasión tumoral y la metástasis. Muchas serina proteasas degradan componentes de la matriz extracelular (véase la Tabla 2 más arriba). Por ejemplo, las proteasas implicadas en la degradación y remodelación de la matriz extracelular (MEC) contribuyen a la remodelación de tejidos, y son necesarias para la invasión del cáncer y la metástasis.

La actividad de las proteasas de la familia de serina proteasa depende de un conjunto de residuos de aminoácidos

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pueden estar en un polipéptido de MPM que carece de uno o más dominios, siempre que el polipéptido de MPM sea sensible a la temperatura (es decir, contenga la modificación) y conserve la actividad enzimática. Por ejemplo, las modificaciones pueden estar en un polipéptido de MPM que incluye sólo el dominio catalítico (p. ej., en MPM-1 correspondiente a los aminoácidos 81-242 polipéptido de MPM-1 proenzimático que se define en el SEC ID NO: 327). Las modificaciones también se pueden realizar en un polipéptido de MPM que carece de toda o una porción del conector rico en prolina (p. ej., en MPM-1 correspondiente a los aminoácidos 243-258 del polipéptido de MPM-1 proenzimático que se define en el SEC ID NO: 327) y/o que carece de toda o una porción del dominio de unión de hemopexina (p. ej. en MPM-1 correspondiente a los aminoácidos 259 a 450 del polipéptido de MPM-1 proenzimático expuesto en el SEC ID NO: 327). Las variantes alélicas de los polipéptidos de MPM-1 incluyen, pero sin limitarse a, cualquiera de los polipéptidos de MPM-1 que contiene una o más variantes cualesquiera de aminoácido expuestas en el SEC ID NO: 537. Las variantes de especies ilustrativas para la modificación de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, cerdo, conejo, bóvido, caballo, rata, y ratón, por ejemplo, se exponen en cualquiera de los SEC ID NO: 527-532. Las modificaciones en un polipéptido de MPM proporcionado en la presente memoria para conferir sensibilidad a la temperatura se pueden llevar a cabo en un polipéptido de MPM que también contenga otras modificaciones, tales como las descritas en la técnica, incluyendo modificación de la secuencia primaria y modificaciones que no son de la secuencia primaria del polipéptido. Se entiende que las modificaciones en una variante alélica o de especie u otra variante incluyen la modificación en cualquier forma de la misma tal como una forma activa o inactiva, una forma que incluye sólo el dominio catalítico, o una forma que carece de toda o una porción del conector rico en prolina o el dominio de unión de hemopexina, siempre que la forma modificada contenga la modificación sensible a la temperatura y sea sensible a la temperatura. Como se comenta en la presente memoria a continuación, las correspondientes modificaciones de MPM-1 se pueden realizar en formas similares de otros polipéptidos de MPM.

Por lo tanto, los polipéptidos de MPM modificados resultantes incluyen aquellos que son proenzimas zimógenos inactivos y los que son polipéptidos activos. Por ejemplo, cualquier polipéptido modificado proporcionado en la presente memoria que es una proenzima zimógeno puede ser activado por un agente de procesamiento para generar un polipéptido de MPM activo. Los agentes de procesamiento incluyen, pero sin limitarse a, cualquiera de los expuestos en la Tabla 3A a continuación. La activación de los polipéptidos de MPM-1 se exhibe típicamente en su forma activa después de la escisión del propéptido y/o procesamiento intermolecular e intramolecular de la enzima para separar el propéptido (véanse, por ejemplo Visse et al. (2003) Cir. Res., 92:827-839; Khan et al. (1998) Protein Science, 7:815-836; Okada et al. (1988) Biochem J., 254:731-741; Okada & Nakanashi (1989) FEBS Lett., 249:353-356; Nagase et al. (1990) Biochemistry, 29:5783-5789; Koklitis et al. (1991) Biochem J., 276:217-221; Springman et al. (1990) PNAS, 87:364-8; Murphy et al. (1997) Matrix Biol., 15:511-8).

Tabla 3A. Activadores de zimógeno

Compuestos proteolíticos

Proteasas: Plasmina

imagen217: Calicreína plasmática

imagen218: Tripsina-1 (Tripsina I)

imagen219: Tripsina-2 (Tripsina II)

imagen220: Elastasa de neutrófilos

imagen221: Catepsina G

imagen222: Triptasa

imagen223: Quimasa

imagen224: Proteinasa-3

imagen225: Furina

imagen226: uPA

imagen227: MPMs, incluyendo MPM-1, MPM-2, MPM-3, MPM-7, MPM-10, MPM-26, y MT1-MPM

Compuestos No Proteolíticos

Agentes modificadores de tiol: Acetato 4-aminofenilmercúrico (AMPA)

imagen228: HgCl2

imagen229: N-etilmaleimida

Perturbantes conformacionales: Dodecilsulfato de sodio (SDS)

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Tampón: Fuerza iónica (mM) pH Tiempo hasta la neutralización (minutos) DT

MES: 50 5,0 7,3 1,25

MES: 100 5,0 7,8 2,1

DT: desviación típica

Por lo tanto, mediante la inyección intradérmica de indicadores de pH a fuerzas de tampón crecientes (MES de 10 a 100 mM de pH 5,0), se estableció que podría obtenerse un entorno extracelular temporal-espacial ácido de 1-20 minutos/inyección de 100 mm2.

5 Ejemplo 8

Modificación mediante ingeniería genética de catepsina L hepática humana recombinante

10 Se amplificó mediante PCR ADNc de Cat-L humana del SEQ ID NO: 9 (codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en el SEC ID NO: 10) y el ADNc de Cat-L-His del SEQ ID NO: 12 (codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en el SEC ID NO: 13), a partir de ADNc de hígado humano (Clonetech QUICK-Clone cDNA 637205) utilizando cebadores que fueron diseñados de acuerdo con los datos de secuencias publicadas para ADNc de procatepsina-L de riñón humano. Se añadieron sitios de restricción 5 'NheI y 3' BamHI como parte de la síntesis

15 de cebadores de PCR. Los cebadores utilizados en la amplificación se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5: Cebadores

imagen270: Cebador Secuencia SEQ ID NO Tm Longitud Longitud del emparejamiento

Cat-L humana: 5' imagen271 16 64°C 42 unidades 22

imagen272: 3' (con dos codones de parada) imagen273 17 65°C 35 unidades 20

Cat-L-His: 5' imagen274 16 64°C 42 unidades 22

imagen275: 3' (con la etiqueta 6xHis) imagen276 18 57°C 49 unidades 16

Ambos constructos a base de ADNc tienen el segundo aminoácido del péptido líder secretor de Cat-L nativa mutado en una sola base para formar una secuencia consenso de Kozak, cambiando de este modo el segundo aminoácido

20 de N a D (como se expone en los SEQ ID NO: 9 y 12). La identidad de los clones se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa convencional y análisis de secuenciación de ADN

El producto amplificado resultante se introdujo para su clonación en el vector de expresión HZ24 (b/s). El vector de expresión es un casete bicistrónico basado en CMV para la expresión tanto de la proteína catepsina L como del gen

25 de DHFR murino separados por un sitio interno de entrada ribosomal (IRES) del virus de la encefalomiocarditis. La secuencia resultante del vector de expresión HZ24-Cat-L se expone en el SEC ID NO: 11. La secuencia resultante del vector de expresión HZ24-Cat-L-His se expone en el SEC ID NO: 14.

Ambos plásmidos de expresión Cat-L y Cat-L-His se introdujeron en células CHO-S (células CHO-K1 adaptadas al

30 cultivo en suspensión libre de suero, Invitrogen, Carlsbad, CA, Núm. de cat. 11619-012) mediante transfección utilizando reactivo de transfección GeneJuice (EMD Biosciences, San Diego, CA, Núm. de cat. 70967). Los

imagen277

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imagen280

imagen281

Tabla 7c.

Clon Primario: Subclones con metotrexato 50 nM Subclones con metotrexato 200 nM Subclones con metotrexato 1000 nM

9E12: 9E12-1 1-3D3 1F5

9E12: 9E12-1 1-3D3 1E2

9E12: 9E12-1 1-3D3 2D4

9E12: 9E12-1 1-3D3 2G8

9E12: 9E12-1 1-3D3 3E3

9E12: 9E12-1 1-3D3 3G2

9E12: 9E12-1 1-3D3 4D4

9E12: 9E12-1 1-3D3 4F3

9E12: 9E12-1 1-3D3 5D2

9E12: 9E12-1 1-3D3 5F2

1C5: 1C5-3 3-2F5 1D4

1C5: 1C5-3 3-2F5 1G2

1C5: 1C5-3 3-2F5 2E2

1C5: 1C5-3 3-2F5 2E3

1C5: 1C5-3 3-2F5 3D6

1C5: 1C5-3 3-2F5 3G3

1C5: 1C5-3 3-2F5 4E4

1C5: 1C5-3 3-2F5 4G2

1C5: 1C5-3 3-2F5 5F4

1C5: 1C5-3 3-2F5 5G5

B. Producción a gran escala y purificación de la catepsina L

5 Para purificar la catepsina L sintética en grandes cantidades, el sobrenadante de cultivo celular de pro-catepsina L no activado de la línea celular 9E12-1-3D3, producido como se describió anteriormente, se cultivó en un biorreactor de 36 L. Después de la incubación en el biorreactor, el cultivo celular se aclaró mediante filtros de cosecha, se concentró y se cambió de tampón usando filtración de flujo tangencial, se inactivaron los virus con disolvente/detergente, y a continuación se purificó mediante cromatografía secuencial sobre Q Sepharose Fast Flow

10 (GE Healthcare), cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de hidroxiapatita cerámica (BioRad, Richmond, CA). Después del tratamiento a pH reducido (pH 4,5), la Catepsina L activada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico en SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), filtración viral y filtración de flujo tangencial.

15 La línea celular 9E12-1-3D3 se expandió primero a través de una serie de matraces. En pocas palabras, 35 mL de cultivo del pase 6, con 6 x 105 células/mL y una viabilidad de 73% se expandieron hasta 200 mL con medio CD CHO (Invitrogen) con un suplemento de 40 mL/L de GlutaMAX™-I (Invitrogen; solución de partida 200 mM) y metotrexato

5

10

15

20

25

30

200 nM. A los cuatro días, se expandió hasta 1200 mL en un matraz de agitación de 6L purgado utilizando CD CHO con un suplemento de 40 mL/L de GlutaMAX™-I. En el matraz de agitación de 6L, el cultivo se expandió a continuación hasta 2200 mL el día 11, a 3500 mL el día 15, y finalmente a 5000 mL el día 18, utilizando cada vez medio CD CHO con un suplemento de 40 mL/L de GlutaMAX™-I.

El biorreactor de 36 L, que contenía 20 L de medio CD CHO con un suplemento de 800 mL de GlutaMAX™-1, 100 mg de insulina humana recombinante (rHulnsulin), y 30 mL de Gentamicina, se inoculó con una densidad inicial de siembra de 4,6 x 105 células/mL. Para proporcionar un mezclado suave y un ligero vórtice al cultivo, el punto de ajuste de la agitación fue de 80 RPM, el punto de ajuste de la temperatura fue de 37°C, el punto de ajuste de pH fue pH 7,15, y el punto de ajuste de oxígeno disuelto fue del 25%. La vasija del biorreactor recibió superposición de aire filtrado y burbujeo de aire/oxígeno/CO2, controlado por un controlador Applikon ADI 1030. Se proporcionó un burbujeo de aire constante de 0,1 a 0,2 litros patrón por minuto (slpm), con la válvula de solenoide de O2 como esclavo del controlador de DO, de manera que el flujo O2 complementó automáticamente el burbujeo de aire constante según fuera necesario.

Durante el funcionamiento del biorreactor, el cultivo se complementó con medio de alimentación a varios intervalos para complementar los nutrientes y la glucosa a través del funcionamiento del biorreactor, así como para proporcionar producto concentrado de medio basal y GlutaMAX™-I adicionales en fase de crecimiento temprana de las células, con el fin para maximizar la tasa de crecimiento y la densidad máxima de las células. Se añadieron producto digerido de proteína adicional (Yeastolate Utlrafiltrate 50x (200 g/L); Invitrogen) y butirato de sodio en la fase de producción tardía del funcionamiento del biorreactor para maximizar la expresión y la secreción de producto. El medio de alimentación se añadió mediante filtración en condiciones estériles al biorreactor mediante una bomba peristáltica. Los días 7, 10, 12, 13, 14 y 16, se añadieron 500 mL de Alimentación Núm. 1-6, respectivamente, al curado de células del biorreactor. La Alimentación Núm. 1 y la Alimentación Núm. 2 contenían 48,6 g/L de medio CD CHO AGT™ en polvo, 200 mL/L de GlutaMAX™-I (concentración final 8 mM), 200 mL/L de Yeastolate Utlrafiltrate 50x (concentración final 8 g/L), 50 g de D-glucosa (dextrosa; Invitrogen), y 1,1 g de butirato de sodio. La Alimentación Núm. 3 a la Alimentación Núm. 6 contenían 48,6 g/L de medio CD CHO AGT™ en polvo, 100 mL/L de GlutaMAX™-I (concentración final 4 mM), 300 mL/L de Yeastolate Utlrafiltrate 50x (concentración final de 12 g/L), 40 g de D-glucosa (dextrosa; Invitrogen), y 1,6 g de butirato de sodio. Se tomaron muestras del cultivo celular antes de cada alimentación y antes de la cosecha (día 19) para someter a ensayo la densidad celular viable (DCV) y el % de viabilidad mediante un hemocitómetro con tinción de Azul de Tripan, y glucosa residual. La Tabla 8 muestra los resultados de las pruebas.

Tabla 7d,

Horas postinoculación: DCV x 105 células/mL % Viabilidad Volumen de cultivo celular (L) Glucosa Alimentación

0: 4,6 87 26 8280 imagen282

72: 16,3 93 26 4690 imagen283

115: 37,6 93 26 4230 imagen284

165: 43,1 83 26 1830 Alimentación Num. 1

234: 45,7 78 26,5 1040 Alimentación Num. 2

264: 49,7 78 27 1320 imagen285

287: 42,2 78 27 800 Alimentación Num. 3

312: 39,8 74 27,5 1180 Alimentación Num. 4

336: 39,1 73 27,5 1390 Alimentación Num. 5

386: 28,3 58 28 1360 Alimentación Num. 6

409: 24,5 50 28,5 1810 imagen286

432: 20,5 36 28,5 1530 imagen287

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5

10

15

20

25

30

35

mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. La proteína purificada con aminofenilboronato se complementó hasta concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl2 0,1 mM y se cargó en la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La columna se lavó a continuación con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La proteína se hizo eluir con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se hizo pasar a través de un filtro estéril de 0,22 μm a una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a ensayo para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.

A continuación, la proteína purificada con HAP se hizo pasar por un filtro de eliminación viral. El filtro Viosart esterilizado (Sartorius) se preparó primero lavando con 2 L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Antes del uso, se tomaron muestras del tampón de filtrado para determinar el pH y la conductividad. La proteína purificada con HAP se bombeó por medio de una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación viral 20 nM. La proteína se filtró en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 se hizo pasar a través de un filtro final de 0,22 µm a una bolsa estéril. La muestra filtrada a través del filtro viral se sometió a ensayo para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, los oligosacáridos, los monosacáridos y el perfil de ácido siálico. La muestra también se sometió a ensayo para determinar las impurezas relacionadas con el procedimiento.

A continuación, la proteína del producto filtrado se concentró a 10 mg/mL utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice con un corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD (Sartorius). El filtro se preparó primero mediante lavado con histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0 y se tomaron muestras del producto que había penetrado para determinar el pH y la conductividad. Después de la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a ensayo para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se llevó a cabo un intercambio de tampón 6x en la proteína concentrada en el tampón final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. Tras el intercambio de tampón, la proteína concentrada se hizo pasar a través de un filtro de 0,22 µm a una bolsa estéril de almacenamiento de 20 L. Se tomaron muestras de la proteína y se sometieron a ensayo para determinar la concentración de proteínas, la actividad enzimática, los grupos sulfhidrilo libres, los perfiles de oligosacáridos y la osmolalidad.

La proteína en masa filtrada en condiciones estériles se dispensó a continuación asépticamente a 20 mL en viales de 30 mL de Teflón estériles (Nalgene). Los viales se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -20 ± 5°C.

C. Comparación de la producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen1 y rHuPH20 soluble de Gen2

La producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen2 en un cultivo celular en biorreactor de 300L contenían algunos cambios en los protocolos respecto a la producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen1 en un cultivo celular en biorreactor de 100L (descrito en el Ejemplo 13.B). La Tabla 18 expone las diferencias ilustrativas, además de simples cambios de aumento a escala, entre los métodos.

Tabla 18: imagen297 imagen298

Diferencia de procedimiento: rHuPH20 soluble de Gen1 rHuPH20 soluble de Gen2

Línea celular: 3D35M 2B2

Medio utilizado para expandir el inóculo celular: Contiene metotrexato 0,10 µM (0,045 mg/L) Contiene metotrexato 20 µM (9 mg/L)

Medio en cultivos de 6L progresivo: Contiene metotrexato 0,10 µM No contiene metotrexato

Matraz de agitación de 36 L: Sin instrumental Equipado con instrumental que supervisa y controla pH, oxígeno disuelto, burbujeo y velocidad de flujo de gas de superposición.

imagen299: Volumen de funcionamiento 20 L. Volumen de funcionamiento 32 L

Volumen de funcionamiento final en el biorreactor: Aprox. 100 L en un biorreactor de 125 L (volumen de cultivo inicial + 65 L) Aprox. 300L en un biorreactor de 400L (volumen de cultivo inicial + 260L)

Medio de cultivo en Medio de cultivo en el biorreactor final: Sin rHulnsulina 5,0 mg/L de rHuInsulina

Volumen de alimentación de medio: Aumento a escala de 4% del volumen de cultivo de células del Aumento a escala de 4% del volumen de cultivo de células del biorreactor, es decir, 10,4, 10,8, 11,2 y

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sangrado moderado en el lugar de la inyección tratado con dosis de 25 µg/mL y superiores. Solamente se observó rabdomiolisis en la zona de los sitios de inyección a las altas dosis de 500 µg/mL y 1000 µg/mL de catepsina L recombinante.

5 Ejemplo 25

Efecto de las condiciones reductoras sobre la actividad enzimática de la Catepsina L para un sustrato fluorogénico

Se sometió a ensayo el efecto de los agentes reductores sobre la actividad enzimática de la catepsina L utilizando

10 un sustrato fluorogénico fabricado a la medida, designado Z-His-Tyr-Arg-Arg-AMC (SEQ ID NO: 536; Z =: Ncarbobenciloxi; AMC: 7-Amino-4-metil cumarina) (Biomatik Corp., Wilmington, DE). Se determinó la actividad de la catepsina L en UFR/seg en presencia de cisteína (Spectrum Chemical, Gardena, CA; Núm. de Catálogo C1473) o TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO Núm. de Cat. C4706).

15 Se utilizó catepsina L activada a una concentración de partida de 7,85 mg/mL que contenía cisteína 5 mM. Se incubaron 2 ng/mL de catepsina L con sustrato de péptido fluorogénico 20 mM Z-His-Arg-Tyr-Arg-AMC a 37°C durante 30 minutos a 37°C en un volumen total de 200 µl de tampón citrato de sodio 50 mM pH 6,5, DMSO al 2%, Brij-35 al 0,01% que contenía la concentración apropiada de cisteína o TCEP como se indica en la Tabla 19A. Las incubaciones se llevaron a cabo en una microplaca de fondo opaco. La fluorescencia resultante se leyó a la emisión

20 de excitación óptima de 360 nm -460 nm para el sustrato en un lector de placas fluorescente (Molecular Devices, Spectramax M5, Sunnyvale, CA). Después de ajustar la respuesta a la dosis sigmoidea en el soporte lógico GraphPad Prizm (GraphPad Software, La Jolla, CA), los ajustes de la curva tenían R2 valores> 0,998. Los resultados mostrados en la Tabla 19A a continuación indican que la presencia de un agente reductor aumenta la actividad de la catepsina L

25

TABLA 19A: Efecto de agentes reductores sobre la actividad de la catepsina L

Reductor µM (Cisteína) Actividad UFR/segundo: Actividad max %

10000 413,577: 99,7%

3333 414,853: 100,0%

1111 303,383: 73,1%

370 101,905: 24,6%

123 17,821: 4,3%

41 3,310: 0,8%

14 1,384: 0,3%

Reductor µM (TCEP) Actividad UFR/segundo: Actividad max %

10000 358,5: 88,4%

3333 405,4: 100,0%

1111 399,5: 98,5%

370 385,1: 95,0%

123 388,9: 95,9%

41 331,9: 81,9%

14 172,1: 42,5%

4,6 26,7: 6,6%

1,5: 0,7 0,2%

Ejemplo 26

Actividad enzimática de la catepsina L sobre sustratos

Se incubó catepsina L a una concentración de 0,25 mg/mL con una de los siguientes tres proteínas (Colágeno de tipo I a 0,5 mg/mL; HSA a 0,25 mg/mL; y PH20 en 0,25 mg/mL) o en forma de una mezcla de dos o tres a 37°C durante un máximo de 16 horas en un tampón que contenía acetato de sodio 50 mM pH 5, acetato de sodio 50 mM pH 6 o Hepes 50 mM pH 7. En varios puntos temporales (0, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min, y durante la

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Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

Y97: D; E; H; K; R; N; Q; T; S; G; W; V; L; A; P

R98: D; E; H; K; C; Y; S; G; F; M; W; V; L; A; P

199: E; H; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; W; V; L; A; P

E100: D; H; R; N; T; Y; S; G; F; M; W; I; V; L;P

N101: D; H; K; R; C; T; Y; S; F; M; W; V; L; A; P

Y102: D; E; K; R; C; N; Q; S; G; F; M; V; L; A; P

T103: D; E; K; R; C; N; Q; Y; S; G; W; V; L; A; P

P104: D; E; H; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; V; L; A

D105: E; R; C; N; T; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

L106: D; H; R; C; N; T; Y; S; G; F; M; I; V; A; P

P107: D; K; R; C; T; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A

R108: E; K; C; N; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; A; P

A109: D; E; H; R; N; Q; T; Y; S; G; M; W; I; V; L;

D110: H; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; I; V; L; A; P

V111: D; E; K; R; C; Q; T; Y; S; G; W; I; L; A; P

D112: H; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

H113: D; E; R; N; T; Y; S; G; F; M; W; V; L; A; P

A114: E; R; C; N; Q; T; S; G; F; M; W; I; V; L; P

I115: D; E; H; K; R; C; Q; T; S; G; F; W; V; L; P

E116: D; H; K; R; C; N; Q; S; G; F; M; I; L; A; P

K117: D; E; H; R; N; Q; T; Y; S; G; F; W; L; A; P

A118: D; E; H; K; R; Q; T; S; G; F; W; I; V; L; P

F119: E; H; K; R; C; N; T; Y; S; G; W; V; L; A; P

Q120: D; E; H; K; R; C; N; T; Y; G; M; W; V; A; P

L121: E; H; K; R; C; N; Q; T; S; G; F; I; V; A; P

W122: E; H; K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; V; L; A; P

S123: D; H; K; R; C; N; Q; T; Y; G; F; M; W; I; V; L; A; P

N124: D; K; R; C; T; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

V125: D; E; H; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; W; A; P

T126: E; H; K; R; N; Q; S; G; F; M; W; V; L; A; P

P127: E; H; K; R; C; Q; T; S; F; M; W; I; V; L; A

L128: D; K; R; C; Q; T; S; G; F; M; W; I; V; A; P

T129: E; H; K; R; C; Y; S; G; F; M; I; V; L; A; P

F130: E; H; K; R; C; N; T; Y; S; G; I; V; L; A; P

T131: D; E; H; R; C; Q; Y; S; G; F; M; I; L; A; P

K132: D; E; H; R; T; Y; S; G; F; M; I; V; L; A; P

V133: D; E; H; K; R; C; N; T; S; G; M; W; L; A; P

S134: D; E; H; K; R; C; N; Q; T; Y; G; V; L; A; P

E135: D; H; R; N; Q; T; S; F; M; W; I; V; L; A; P

G136: D; E; H; R; C; N; T; S; M; W; I; V; L; A; P

Q137: E; H; K; R; C; N; T; Y; S; G; F; W; L; A; P

A138: D; E; H; R; C; Q; T; S; G; M; W; I; V; L;P

D139: E; H; R; C; N; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

I140: D; E; H; K; R; C; T; Y; G; F; M; W; V; L; A

M141: D; E; H; R; C; N; T; Y; S; G; W; I; L; A; P

I142: K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; M; W; V; L; A; P

S143: E; H; R; C; N; Q; T; Y; G; M; W; I; L; A; P

F144: E; H; K; R; C; N; Q; T; S; G; M; W; V; L; P

V145: D; E; H; K; R; C; N; Q; T; S; G; W; L; A; P

R146: D; E; H; K; C; N; Q; T; Y; S; F; V; L; A; P

G147: E; H; R; C; Q; T; S; F; M; W; I; V; L; A; P

D148: E; K; R; C; N; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

H149: E; R; C; N; Q; T; Y; S; G; W; I; V; L; A; P

R150: D; E; H; K; N; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

D151: K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; M; W; V; L; A; P

N152: D; H; K; R; C; T; Y; S; G; F; W; I; L; A; P

Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

S153: D; H; K; R; C; Q; T; Y; G; F; I; V; L; A; P

P154: H; K; R; C; N; Q; T; Y; S; F; W; I; V; L; A

F155: E; H; R; N; Q; T; Y; S; G; M; W; V; L; A; P

D156: E; H; K; R; C; T; Y; S; G; M; W; V; L; A; P

G157: D; H; K; R; N; Q; T; Y; S; F; M; V; L; A; P

P158: D; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; A

G159: E; K; R; C; Q; T; Y; S; M; W; I; V; L; A; P

G160: E; H; R; C; N; Q; T; S; M; W; I; V; L; A; P

N161: E; H; R; C; Q; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; P

L162: D; E; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; W; I; A; P

A163: E; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; I; V; L; P

H164: E; K; R; C; N; Q; Y; S; G; F; M; V; L; A; P

A165: D; H; K; R; N; Q; T; S; G; F; M; W; V; L; P

F166: E; H; K; R; C; N; S; G; M; W; I; V; L; A; P

Q167: D; E; K; R; N; T; Y; S; G; F; M; V; L; A; P

P168: D; H; R; C; N; T; S; G; F; M; W; I; V; L; A

G169: D; E; H; R; C; Q; T; S; M; W; I; V; L; A; P

P170: D; H; K; R; C; Q; T; S; G; F; M; W; I; L; A

G171: D; E; H; K; R; C; N; Q; Y; S; M; W; L; A; P

I172: D; E; R; C; N; Q; T; Y; G; M; W; V; L; A; P

G173: D; K; R; C; N; T; Y; S; F; M; W; V; L; A; P

G174: D; E; H; R; N; T; Y; S; F; M; W; V; L; A; P

D175: E; H; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; I; V; L; A; P

A176: D; E; K; R; C; N; Q; T; S; G; F; W; V; L; P

H177: D; R; C; N; Q; T; Y; S; G; W; I; V; L; A; P

F178: E; H; K; R; C; Q; T; Y; S; G; W; I; V; L; A; P

D179: E; K; R; C; N; Q; T; S; G; W; I; V; L; A; P

E180: D; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; M; I; A; P

Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

D181: E; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; V; L; A; P

E182: D; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; W; I; L; A; P

R183: E; H; K; C; N; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

W184: E; H; R; N; Q; T; S; G; F; M; I; V; L; A; P

T185: D; E; H; R; C; N; Q; Y; S; G; W; V; L; A; P

N186: D; E; H; R; C; Q; T; Y; S; G; F; V; L; A; P

N187: D; H; K; R; C; T; S; G; F; M; W; I; L; A; P

F188: D; E; H; K; R; N; Q; S; G; W; I; V; L; A; P

R189: D; E; H; K; C; N; Q; T; Y; G; W; V; L; A; P

E190: D; H; K; R; C; T; Y; S; G; M; I; V; L; A; P

Y191: D; E; H; K; R; C; Q; T; S; G; W; V; L; A; P

N192: D; H; K; R; C; Q; T; S; G; M; W; V; L; A; P

L193: D; E; K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; W; I; A; P

H194: E; K; Q; T; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

R195: D; E; K; C; Q; T; Y; S; G; F; W; V; L; A; P

V196: D; E; H; K; R; Q; T; Y; S; G; M; I; L; A; P

A197: E; H; R; C; N; Q; T; Y; S; G; W; I; V; L; P

A198: D; E; H; K; R; T; Y; S; G; F; M; W; V; L;P

H199: E; K; R; C; N; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

E200: D; R; C; N; T; Y; S; G; F; M; W; I; V; A; P

L201: D; E; K; R; N; Q; T; S; G; M; W; I; V; A; P

G202: D; E; H; K; R; C; T; Y; S; M; I; V; L; A; P

H203: D; E; R; C; N; Q; T; Y; S; G; I; V; L; A; P

S204: D; H; K; R; N; Q; T; Y; G; W; I; V; L; A; P

L205: D; E; R; C; N; Q; T; S; G; M; W; I; V; A; P

G206: D; E; H; R; C; Q; T; S; M; W; I; V; L; A; P

L207: D; H; K; R; N; Q; Y; S; G; M; W; I; V; A; P

S208: D; E; K; R; C; N; Q; T; G; F; W; V; L; , A; P

Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

H209: D; R; C; N; Q; T; Y; S; G; F; W; V; L; A; P

S210: H; K; R; C; N; Q; T; G; F; W; I; V; L; A; P

T211: D; H; K; R; N; Q; S; G; F; M; W; V; L; A; P

D212: E; H; K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; V; L; A; P

I213: D; E; H; K; R; C; N; Q; T; S; G; F; M; V; L; A; P

G214: D; E; R; C; Q; T; Y; S; F; M; I; V; L; A; P

A215: D; H; K; R; C; N; Q; T; S; G; M; W; I; V; L; P

L216: D; E; K; R; C; Q; T; S; G; M; W; I; V; A; P

M217: D; H; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; I; L; A; P

Y218: D; E; R; C; N; Q; S; G; F; W; I; V; L; A; P

P219: D; E; H; K; R; C; Q; T; S; G; F; W; V; L; A

S220: E; H; K; R; N; Q; T; G; F; M; I; V; L; A; P

Y221: E; K; R; C; N; Q; T; S; G; M; W; V; L; A; P

T222: D; H; R; C; N; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

F223: E; H; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; M; L; A; P

S224: D; H; K; R; C; Q; T; G; M; W; I; V; L; A; P

G225: D; E; H; K; R; C; N; Q; T; S; M; W; V; A; P

D226: E; H; R; C; N; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

V227: D; E; H; K; R; C; Q; T; Y; S; G; W; L; A; P

Q228: D; E; H; K; R; N; T; Y; S; G; M; W; L; A; P

L229: D; E; H; R; C; Q; T; Y; G; M; W; I; V; A; P

A230: D; H; R; C; N; T; Y; S; G; M; W; I; V; L; P

Q231: D; H; R; C; Y; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

D232: E; H; K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; W; V; L; P

D233: E; K; R; N; Q; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

I234: D; E; H; C; N; Q; T; Y; G; M; W; V; L; A; P

D235: E; H; R; C; N; Q; T; Y; S; G; I; V; L; A; P

G236: D; E; K; R; C; N; T; Y; S; F; M; I; V; L; P

Tabla 20: Biblioteca de hMMP-1

Aminoácido: Sustituciones de Aminoácidos

I237: D; E; K; R; C; N; Q; T; Y; S; G; W; L; A; P

Q238: E; H; K; R; C; N; T; Y; S; G; F; W; I; L; P

A239: D; H; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; P

I240: D; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; V; L; A; P

Y241: D; H; R; N; Q; T; S; G; M; W; I; V; L; A; P

G242: E; H; K; R; N; T; Y; S; F; W; I; V; L; A; P

R243: D; H; K; C; N; Q; T; Y; S; G; I; V; L; A; P

S244: D; E; H; R; Q; T; Y; G; F; M; W; V; L; A; P

Q245: E; H; K; R; C; T; S; G; F; M; W; I; V; L; P

N246: D; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; A; P

P247: D; E; H; K; R; N; Q; T; S; G; F; I; V; L; A

V248: E; H; K; R; C; Q; T; Y; S; G; F; M; W; I; L; A

Q249: E; H; K; R; C; N; T; Y; G; W; I; V; L; A; P

P250: D; K; R; N; Q; T; Y; S; G; F; M; W; V; L; A

I251: D; E; K; R; C; Q; T; Y; S; G; W; V; L; A; P

G252: D; E; H; K; R; C; T; S; F; M; W; I; V; L; A; P

P253: E; K; R; C; N; Q; T; Y; G; M; W; I; V; L; A

Q254: D; E; R; C; T; Y; S; G; F; W; I; V; L; A; P

T255: E; H; K; R; C; N; Q; S; G; F; I; V; L; A; P

P256: E; K; R; C; N; Q; Y; S; G; F; M; I; V; L; A

K257: E; R; C; N; T; S; G; F; M; W; I; V; L; A; P

A258: D; E; R; N; Q; T; Y; G; F; M; W; I; V; L; P

Los ADNc que codifican cada mutante de hMPM-1 individual se generó cambiando el codón de tipo salvaje, que codifica cada uno de las 178 posiciones de aminoácidos identificadas en la Tabla 21 siguiente, por un codón que codifica la sustitución de aminoácido deseada. Los codones de tipo salvaje se exponen en el SEQ ID NO:534. El SEQ ID NO: 534 también representa los aminoácidos codificados. Las sustituciones de aminoácidos y los correspondientes codones mutados se enumeran en la Tabla 21, a continuación.

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

F81C: TGT T84L TTG N87S AGT W90H CAT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

F81E: GAG T84D GAT N87I ATT W90M ATG

F81I: ATT T84R CGG N87C TGT W90R CGG

F81L: CTG T84I ATT N87A GCG W90E GAG

F81P: CCT T84S TCT N87G GGT W90N AAT

F81S: TCT T84G GGT N87Y TAT W90Q CAG

F81A: GCG T84Q CAG N87E GAG E91N AAT

F81M: ATG T84P CCT N87H CAT E91R CGG

F81G: GGG T84A GCG N87Q CAG E91W TGG

F81T: ACG T84C TGT P88C TGT E91G GGG

F81Q: CAG T84Y TAT P88K AAG E91V GTG

F81R: CGT T84F TTT P88W TGG E91Y TAT

F81W: TGG E85L CTG P88G GGG E91C TGT

F81H: CAT E85Q CAG P88L CTG E91H CAT

F81V: GTG E85P CCT P88Q CAG E91T ACG

V82I: ATT E85T ACT P88A GCG E91S AGT

V82C: TGT E85K AAG P88T ACG E91A GCG

V82A: GCG E85M ATG P88Y TAT E91I ATT

V82P: CCG E85G GGT P88R CGG E91D GAT

V82Y: TAT E85R CGT P88H CAT E91F TTT

V82M: ATG E85S TCT P88I ATT E91L TTG

V82Q: CAG E85C TGT P88V GTG Q92V GTT

V82F: TTT E85Y TAT P88E GAG Q92Y TAT

V82W: TGG E85A GCG P88D GAT Q92L CTG

V82N: AAT E85N AAT R89V GTG Q92N AAT

V82R: CGT E85V GTG R89W TGG Q92E GAG

V82G: GGT E85F TTT R89M ATG Q92I ATT

V82S: TCG G86L CTT R89A GCG Q92T ACT

V82L: TTG G86P CCG R89T ACG Q92G GGT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

V82T: ACT G86I ATT R89G GGG Q92P CCG

L83A: GCG G86T ACT R89S TCT Q92W TGG

L83C: TGT G86H CAT R89K AAG Q92F TTT

L83D: GAT G86D GAT R89F TTT Q92S TCG

L83E: GAG G86N AAT R89Y TAT Q92R CGG

L83G: GGT G86S AGT R89N AAT Q92K AAG

L83H: CAT G86K AAG R89H CAT Q92A GCT

L83I: ATT G86W TGG R89L TTG T93A GCG

L83M: ATG G86Y TAT R89E GAG T93L CTT

L83P: CCG G86V GTT R89P CCT T93M ATG

L83Q: CAG G86C TGT W90L TTG T93N AAT

L83R: CGG G86M ATG W90G GGG T93V GTG

L83S: AGT G86F TTT W90P CCG T93I ATT

L83T: ACG N87M ATG W90T ACT T93D GAT

L83W: TGG N87L CTG W90S TCG T93S TCG

L83Y: TAT N87P CCG W90V GTG T93R CGG

T84V: GTT N87V GTT W90I ATT T93W TGG

T84E: GAG N87R CGT W90A GCT T93F TTT

T84H: CAT N87F TTT W90F TTT T93P CCT

T93G: GGG Y97R CGT E100L CTG T103R CGG

T93K: AAG Y97V GTG E100H CAT T103Y TAT

T93E: GAG Y97A GCT E100D GAT T103N AAT

H94L: CTG Y97P CCT E100M ATG T103C TGT

H94S: TCG Y97L CTT E100G GGT T103Q CAG

H94M: ATG Y97T ACG E100W TGG T103W TGG

H94R: CGG Y97K AAG E100Y TAT T103P CCG

H94E: GAG Y97W TGG E100R CGT T103A GCG

H94I: ATT Y97H CAT E100S TCT T103G GGG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

H94D: GAT Y97S TCG E100T ACG T103K AAG

H94P: CCG Y97E GAG E100F TTT P104G GGG

H94A: GCG Y97D GAT E100I ATT P104E GAG

H94N: AAT Y97N AAT E100N AAT P104T ACT

H94F: TTT Y97G GGT N101M ATG P104F TTT

H94G: GGG Y97Q CAG N101F TTT P104R CGT

H94T: ACT R98H CAT N101L TTG P104D GAT

H94V: GTG R98K AAG N101V GTG P104C TGT

H94W: TGG R98C TGT N101H CAT P104Q CAG

L95E: GAG R98L CTG N101R CGG P104V GTG

L95Y: TAT R98M ATG N101C TGT P104Y TAT

L95R: CGG R98F TTT N101T ACT P104H CAT

L95A: GCT R98W TGG N101P CCT P104L TTG

L95G: GGG R98Y TAT N101W TGG P104S TCG

L95K: AAG R98P CCT N101K AAG P104A GCG

L95S: AGT R98E GAG N101S TCG P104M ATG

L95T: ACG R98A GCG N101D GAT D105A GCT

L95H: CAT R98G GGG N101A GCG D105C TGT

L95W: TGG R98V GTT N101Y TAT D105F TTT

L95V: GTG R98S TCG Y102R CGT D105G GGT

L95C: TGT R98D GAT Y102K AAG D105I ATT

L95P: CCT I99C TGT Y102V GTG D105L CTG

L95D: GAT I99E GAG Y102M ATG D105M ATG

L95I: ATT I99G GGG Y102P CCG D105N AAT

T96E: GAG I99H CAT Y102N AAT D105P CCT

T96R: CGG I99N AAT Y102G GGG D105R CGG

T96P: CCG I99P CCT Y102L CTG D105S TCG

T96S: TCG I99T ACG Y102D GAT D105T ACG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

T96A: GCG I99V GTT Y102S TCG D105V GTT

T96L: TTG I99A GCG Y102F TTT D105W TGG

T96W: TGG I99F TTT Y102A GCT D105E GAG

T96N: AAT I99L CTG Y102E GAG L106P CCG

T96G: GGT I99R CGT Y102Q CAG L106D GAT

T96F: TTT I99S TCG Y102C TGT L106N AAT

T96Q: CAG I99Q CAG T103E GAG L106G GGT

T96H: CAT I99W TGG T103D GAT L106M ATG

T96V: GTT I99Y TAT T103S AGT L106A GCT

T96I: ATT E100V GTT T103L CTG L106R CGG

T96C: TGT E100P CCG T103V GTT L106Y TAT

L106T: ACG A109V GTT D112I ATT E116A GCG

L106V: GTG A109E GAG D112Y TAT E116C TGT

L106H: CAT A109L CTT D112L TTG E116D GAT

L106F: TTT A109H CAT H113T ACT E116F TTT

L106I: ATT D110P CCT H113L CTG E116G GGT

L106C: TGT D110F TTT H113M ATG E116H CAT

L106S: TCT D110Q CAG H113S TCG E116I ATT

P107L: TTG D110R CGG H113N AAT E116K AAG

P107W: TGG D110M ATG H113R AGG E116L CTG

P107T: ACT D110H CAT H113A GCT E116M ATG

P107S: TCG D110I ATT H113E GAG E116N AAT

P107R: CGG D110L CTT H113V GTG E116P CCG

P107Y: TAT D110V GTG H113Y TAT E116Q CAG

P107M: ATG D110T ACG H113F TTT E116R AGG

P107V: GTG D110S TCG H113D GAT E116S TCT

P107D: GAT D110Y TAT H113W TGG K117H CAT

P107A: GCG D110G GGT H113G GGG K117T ACG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

P107C: TGT D110C TGT H113P CCG K117Q CAG

P107K: AAG D110A GCG A114E GAG K117E GAG

P107F: TTT V111E GAG A114S TCG K117A GCG

P107I: ATT V111A GCT A114I ATT K117F TTT

P107G: GGT V111S TCT A114P CCT K117D GAT

R108P: CCT V111W TGG A114N AAT K117N AAT

R108G: GGT V111G GGT A114L CTT K117G GGT

R108T: ACG V111Y TAT A114T ACT K117W TGG

R108E: GAG V111P CCG A114F TTT K117Y TAT

R108A: GCG V111L CTG A114V GTT K117L TTG

R108Y: TAT V111D GAT A114G GGT K117S AGT

R108K: AAG V111K AAG A114C TGT K117P CCG

R108C: TGT V111T ACT A114M ATG K117R AGG

R108S: TCT V111Q CAG A114R AGG A118G GGG

R108F: TTT V111I ATT A114W TGG A118R CGT

R108W: TGG V111C TGT A114Q CAG A118W TGG

R108I: ATT V111R CGT I115F TTT A118K AAG

R108L: CTT D112A GCG I115T ACT A118P CCT

R108N: AAT D112M ATG I115H CAT A118V GTG

R108V: GTT D112V GTT I115G GGT A118L TTG

A109S: TCG D112R CGG I115K AAG A118D GAT

A109R: CGG D112K AAG I115E GAG A118S AGT

A109T: ACG D112P CCT I115S AGT A118F TTT

A109W: TGG D112Q CAG I115P CCT A118I ATT

A109I: ATT D112F TTT I115C TGT A118H CAT

A109Q: CAG D112G GGG I115L CTT A118E GAG

A109N: AAT D112C TGT I115Q CAG A118Q CAG

A109Y: TAT D112W TGG I115R CGG A118T ACT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

A109G: GGG D112T ACT I115W TGG F119G GGG

A109M: ATG D112H CAT I115V GTT F119T ACT

A109D: GAT D112S TCT I115D GAT F119R CGG

F119L: TTG W122G GGG V125T ACG L128A GCG

F119N: AAT W122S TCG V125A GCT L128D GAT

F119S: AGT W122V GTT V125C TGT L128V GTG

F119C: TGT W122H CAT V125D GAT L128W TGG

F119P: CCG W122F TTT V125W TGG L128C TGT

F119W: TGG W122Y TAT V125R CGG L128K AAG

F119K: AAG W122K AAG V125E GAA T129G GGT

F119H: CAT W122Q CAG V125F TTT T129A GCT

F119A: GCG W122E GAG V125H CAT T129C TGT

F119V: GTT S123D GAT T126K AAG T129K AAG

F119Y: TAT S123L TTG T126V GTG T129F TTT

F119E: GAG S123A GCT T126G GGG T129Y TAT

Q120K: AAG S123C TGT T126R CGG T129S TCG

Q120N: AAT S123I ATT T126L TTG T129R CGG

Q120A: GCG S123K AAG T126H CAT T129V GTT

Q120V: GTG S123N AAT T126M ATG T129L CTT

Q120D: GAT S123F TTT T126P CCG T129H CAT

Q120R: CGG S123Y TAT T126A GCG T129P CCT

Q120P: CCT S123M ATG T126N AAT T129E GAG

Q120W: TGG S123H CAT T126E GAG T129I ATT

Q120Y: TAT S123R CGG T126F TTT T129M ATG

Q120C: TGT S123W TGG T126W TGG F130L CTG

Q120H: CAT S123T ACG T126Q CAG F130P CCT

Q120T: ACT S123P CCT T126S AGT F130C TGT

Q120M: ATG S123G GGG P127C TGT F130R CGG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

Q120E: GAG S123Q CAG P127F TTT F130Y TAT

Q120G: GGT S123V GTT P127T ACG F130H CAT

L121E: GAG N124G GGT P127E GAG F130I ATT

L121Q: CAG N124C TGT P127W TGG F130V GTT

L121P: CCT N124V GTG P127A GCT F130K AAG

L121R: CGG N124L CTT P127S AGT F130T ACT

L121C: TGT N124T ACG P127H CAT F130E GAG

L121G: GGG N124R CGT P127Q CAG F130A GCG

L121K: AAG N124M ATG P127K AAG F130N AAT

L121F: TTT N124S TCG P127R CGG F130G GGT

L121I: ATT N124P CCT P127I ATT F130S AGT

L121S: TCG N124A GCG P127V GTG T131F TTT

L121V: GTT N124K AAG P127L CTG T131P CCG

L121H: CAT N124F TTT P127M ATG T131A GCG

L121T: ACT N124W TGG L128F TTT T131S TCT

L121A: GCT N124I ATT L128M ATG T131G GGT

L121N: AAT N124D GAT L128T ACT T131I ATT

W122R: CGT V125G GGG L128R CGT T131L CTT

W122A: GCG V125Q CAG L128S TCG T131H CAT

W122N: AAT V125S TCG L128G GGT T131Q CAG

W122P: CCG V125P CCG L128I ATT T131D GAT

W122T: ACG V125M ATG L128Q CAG T131E GAG

W122L: CTT V125Y TAT L128P CCT T131C TGT

T131R: CGT E135V GTT A138C TGT M141S AGT

T131Y: TAT E135M ATG A138T ACG M141C TGT

T131M: ATG E135S TCG A138S TCT M141L CTG

K132G: GGT E135D GAT A138R CGT M141A GCG

K132V: GTG E135T ACG A138G GGG M141D GAT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

K132L: TTG E135L CTG A138E GAG M141W TGG

K132A: GCT E135A GCG A138H CAT M141G GGT

K132P: CCG E135W TGG A138M ATG M141H CAT

K132F: TTT E135F TTT A138Q CAG M141Y TAT

K132R: CGG E135P CCG A138I ATT M141N AAT

K132I: ATT E135R CGG A138D GAT I142L CTG

K132H: CAT E135N AAT A138W TGG I142M ATG

K132S: TCT E135H CAT D139R CGT I142G GGT

K132M: ATG E135Q CAG D139V GTT I142K AAG

K132D: GAT E135I ATT D139M ATG I142A GCT

K132T: ACT G136V GTG D139C TGT I142N AAT

K132Y: TAT G136W TGG D139P CCT I142W TGG

K132E: GAG G136D GAT D139S TCT I142P CCG

V133G: GGG G136M ATG D139L CTT I142Q CAG

V133E: GAG G136N AAT D139I ATT I142Y TAT

V133T: ACT G136A GCG D139H CAT I142V GTG

V133N: AAT G136L TTG D139A GCG I142T ACT

V133A: GCG G136C TGT D139G GGG I142R CGG

V133H: CAT G136P CCG D139F TTT I142S AGT

V133P: CCG G136T ACG D139N AAT I142F TTT

V133K: AAG G136R CGT D139W TGG S143P CCG

V133R: CGG G136S TCG D139Y TAT S143C TGT

V133L: CTT G136I ATT D139E GAG S143E GAG

V133W: TGG G136H CAT I140D GAT S143G GGT

V133C: TGT G136E GAG I140K AAG S143H CAT

V133D: GAT Q137A GCT I140A GCT S143R CGT

V133M: ATG Q137R CGG I140G GGG S143L TTG

V133S: AGT Q137G GGG I140C TGT S143Q CAG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

S134V: GTT Q137K AAG I140Y TAT S143N AAT

S134H: CAT Q137H CAT I140V GTT S143W TGG

S134P: CCT Q137P CCT I140W TGG S143A GCT

S134G: GGG Q137S TCG I140F TTT S143T ACT

S134N: AAT Q137L CTG I140H CAT S143Y TAT

S134R: CGT Q137W TGG I140L CTG S143M ATG

S134L: CTG Q137F TTT I140R CGG S143I ATT

S134Q: CAG Q137T ACG I140E GAG F144K AAG

S134E: GAG Q137C TGT I140M ATG F144M ATG

S134Y: TAT Q137Y TAT I140T ACT F144E GAG

S134A: GCG Q137N AAT M141E GAG F144S AGT

S134K: AAG Q137E GAG M141I ATT F144L CTG

S134D: GAT A138V GTT M141R CGG F144W TGG

S134T: ACG A138L CTT M141T ACG F144P CCG

S134C: TGT A138P CCG M141P CCG F144R CGG

F144N: AAT G147V GTT R150H CAT P154L CTT

F144C: TGT G147Q CAG D151R CGT P154C TGT

F144G: GGT G147M ATG D151F TTT P154S TCT

F144T: ACT G147P CCT D151P CCG P154K AAG

F144Q: CAG D148R CGG D151W TGG P154I ATT

F144H: CAT D148I ATT D151Q CAG P154A GCT

F144V: GTG D148T ACG D151L CTT P154T ACG

V145A: GCG D148G GGT D151S TCG P154H CAT

V145T: ACG D148L CTG D151G GGT P154Y TAT

V145L: CTG D148V GTT D151A GCT P154N AAT

V145P: CCG D148A GCG D151N AAT P154F TTT

V145K: AAG D148W TGG D151K AAG P154R CGT

V145N: AAT D148P CCG D151Y TAT P154Q CAG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

V145D: GAT D148S TCG D151V GTT F155S TCT

V145H: CAT D148K AAG D151T ACT F155T ACT

V145R: CGG D148E GAG D151M ATG F155G GGT

V145Q: CAG D148M ATG N152G GGG F155N AAT

V145S: TCT D148N AAT N152C TGT F155R CGG

V145G: GGG D148C TGT N152F TTT F155W TGG

V145W: TGG H149W TGG N152L TTG F155L CTG

V145C: TGT H149A GCG N152P CCG F155Q CAG

V145E: GAG H149L TTG N152R CGG F155M ATG

R146T: ACG H149C TGT N152H CAT F155E GAG

R146L: CTG H149Q CAG N152T ACG F155A GCG

R146N: AAT H149T ACT N152Y TAT F155P CCT

R146H: CAT H149Y TAT N152K AAG F155V GTT

R146Q: CAG H149P CCG N152D GAT F155H CAT

R146K: AAG H149V GTT N152W TGG F155Y TAT

R146C: TGT H149R CGG N152I ATT D156H CAT

R146S: AGT H149G GGT N152A GCG D156L CTT

R146D: GAT H149E GAG N152S TCT D156E GAG

R146A: GCT H149S AGT S153I ATT D156A GCT

R146Y: TAT H149I ATT S153R CGG D156W TGG

R146P: CCT H149N AAT S153K AAG D156C TGT

R146V: GTT R150S TCG S153C TGT D156P CCT

R146E: GAG R150E GAG S153G GGG D156V GTT

R146F: TTT R150G GGG S153H CAT D156K AAG

G147R: CGT R150M ATG S153L CTT D156S TCT

G147F: TTT R150P CCG S153V GTT D156G GGG

G147I: ATT R150T ACG S153T ACG D156T ACT

G147L: CTG R150W TGG S153P CCT D156Y TAT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

G147A: GCG R150A GCG S153A GCG D156R CGT

G147E: GAG R150N AAT S153F TTT D156M ATG

G147H: CAT R150K AAG S153D GAT G157K AAG

G147W: TGG R150L TTG S153Q CAG G157D GAT

G147T: ACG R150V GTT S153Y TAT G157F TTT

G147C: TGT R150D GAT P154V GTT G157R CGT

G147S: TCT R150I ATT P154W TGG G157H CAT

G157L: TTG G160M ATG A163E GAG F166C TGT

G157N: AAT G160C TGT A163T ACG F166E GAG

G157Y: TAT G160Q CAG A163Q CAG Q167D GAT

G157S: TCG G160V GTT A163I ATT Q167R CGG

G157T: ACG G160S AGT A163N AAT Q167A GCG

G157A: GCT G160E GAG H164L CTT Q167S AGT

G157Q: CAG G160L CTT H164M ATG Q167F TTT

G157P: CCG G160T ACG H164K AAG Q167Y TAT

G157V: GTG N161S AGT H164P CCG Q167P CCG

G157M: ATG N161C TGT H164C TGT Q167T ACT

P158S: TCT N161L TTG H164R CGT Q167V GTG

P158Y: TAT N161R CGT H164A GCG Q167L CTG

P158R: CGG N161G GGT H164V GTG Q167M ATG

P158L: CTT N161W TGG H164S TCG Q167N AAT

P158V: GTG N161Y TAT H164N AAT Q167G GGG

P158C: TGT N161E GAG H164G GGG Q167K AAG

P158A: GCG N161P CCT H164F TTT Q167E GAG

P158W: TGG N161T ACG H164Y TAT P168N AAT

P158I: ATT N161H CAT H164Q CAG P168F TTT

P158F: TTT N161I ATT H164E GAG P168R CGG

P158Q: CAG N161V GTG A165W TGG P168W TGG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

P158T: ACT N161F TTT A165V GTT P168A GCT

P158G: GGT N161Q CAG A165G GGG P168T ACG

P158K: AAG L162A GCT A165K AAG P168V GTT

P158N: AAT L162G GGG A165L TTG P168G GGG

P158D: GAT L162C TGT A165P CCT P168C TGT

G159R: CGG L162P CCG A165Q CAG P168M ATG

G159S: AGT L162R CGG A165D GAT P168H CAT

G159Q: CAG L162I ATT A165H CAT P168L CTT

G159P: CCT L162S TCT A165F TTT P168S AGT

G159V: GTG L162D GAT A165S AGT P168I ATT

G159K: AAG L162M ATG A165T ACT P168D GAT

G159A: GCG L162E GAG A165R CGG G169H CAT

G159Y: TAT L162T ACT A165N AAT G169A GCG

G159E: GAG L162Y TAT A165M ATG G169E GAG

G159T: ACG L162F TTG F166G GGG G169C TGT

G159M: ATG L162W TGG F166S TCG G169S TCG

G159I: ATT L162Q CAG F166L CTT G169L CTG

G159W: TGG A163R CGT F166V GTG G169V GTT

G159L: CTG A163G GGG F166P CCT G169T ACG

G159C: TGT A163Y TAT F166N AAT G169R CGG

G160A: GCG A163P CCT F166R CGT G169W TGG

G160H: CAT A163S AGT F166A GCG G169M ATG

G160N: AAT A163L CTT F166K AAG G169I ATT

G160W: TGG A163C TGT F166H CAT G169P CCG

G160R: CGG A163K AAG F166W TGG G169D GAT

G160P: CCG A163V GTG F166I ATT G169Q CAG

G160I: ATT A163F TTT F166M ATG P170L CTT

P170R: CGG G173S AGT A176L CTG D179I ATT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

P170I: ATT G173A GCG A176P CCT D179R CGT

P170T: ACG G173R AGG A176N AAT D179N AAT

P170F: TTT G173N AAT A176G GGT D179W TGG

P170Q: CAG G173T ACG A176S TCT D179Q CAG

P170G: GGG G173D GAT A176R CGT D179V GTG

P170S: TCT G173V GTT A176K AAG D179C TGT

P170H: CAT G173F TTT A176D GAT E180M ATG

P170C: TGT G173M ATG A176W TGG E180P CCT

P170M: ATG G173Y TAT H177T ACG E180K AAG

P170K: AAG G173P CCG H177P CCG E180Y TAT

P170W: TGG G174R CGT H177Q CAG E180Q CAG

P170D: GAT G174A GCG H177A GCG E180R CGG

P170A: GCG G174E GAG H177S TCG E180A GCG

G171S: TCT G174F TTT H177G GGG E180T ACT

G171M: ATG G174H CAT H177W TGG E180I ATT

G171N: AAT G174T ACT H177L CTG E180F TTT

G171P: CCT G174D GAT H177V GTT E180C TGT

G171R: CGG G174S AGT H177I ATT E180G GGG

G171Y: TAT G174P CCG H177R CGG E180S TCG

G171A: GCT G174W TGG H177N AAT E180N AAT

G171Q: CAG G174V GTT H177Y TAT E180D GAT

G171H: CAT G174N AAT H177C TGT D181S TCG

G171L: CTT G174Y TAT H177D GAT D181Q CAG

G171W: TGG G174M ATG F178G GGT D181P CCT

G171C: TGT G174L CTT F178C TGT D181Y TAT

G171K: AAG D175I ATT F178W TGG D181R CGT

G171E: GAG D175T ACG F178R CGG D181V GTT

G171D: GAT D175N AAT F178K AAG D181F TTT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

I172Y: TAT D175V GTT F178S AGT D181A GCT

I172T: ACG D175S TCG F178H CAT D181T ACG

I172P: CCT D175R CGG F178P CCT D181L TTG

I172A: GCG D175G GGG F178V GTT D181E GAG

I172L: CTT D175A GCG F178A GCT D181K AAG

I172Q: CAG D175F TTT F178Q CAG D181M ATG

I172E: GAG D175C TGT F178Y TAT D181C TGT

I172C: TGT D175Q CAG F178I ATT D181G GGT

I172M: ATG D175Y TAT F178T ACT E182C TGT

I172D: GAT D175L CTG F178L CTG E182P CCT

I172V: GTT D175H CAT F178E GAG E182S AGT

I172R: CGT D175P CCG D179P CCT E182T ACG

I172G: GGG D175E GAG D179L TTG E182R CGG

I172W: TGG A176F TTT D179E GAG E182D GAT

I172N: AAT A176Q CAG D179G GGG E182A GCT

G173C: TGT A176V GTG D179S AGT E182F TTT

G173L: CTG A176E GAG D179A GCT E182L CTT

G173K: AAG A176T ACT D179K AAG E182I ATT

G173W: TGG A176C TGT D179T ACT E182Y TAT

E182Q: CAG T185D GAT R189K AAG N192S TCG

E182W: TGG N186G GGG R189P CCG N192W TGG

E182M: ATG N186A GCT R189E GAG N192G GGG

E182G: GGT N186T ACT R189V GTT N192D GAT

R183P: CCT N186R CGT R189D GAT N192V GTG

R183K: AAG N186L TTG R189Y TAT N192A GCT

R183W: TGG N186P CCG R189C TGT N192T ACT

R183E: GAG N186S AGT R189A GCT N192K AAG

R183A: GCT N186V GTG R189H CAT N192C TGT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

R183T: ACG N186Q CAG R189W TGG N192M ATG

R183L: CTT N186H CAT R189N AAT L193P CCG

R183N: AAT N186C TGT R189T ACT L193G GGG

R183H: CAT N186E GAG R189Q CAG L193F TTT

R183V: GTG N186F TTT E190A GCG L193S TCG

R183C: TGT N186Y TAT E190H CAT L193W TGG

R183M: ATG N186D GAT E190V GTG L193A GCT

R183I: ATT N187R CGG E190P CCG L193R CGT

R183G: GGT N187M ATG E190C TGT L193Q CAG

R183S: TCT N187S TCT E190G GGT L193E GAG

W184G: GGG N187T ACG E190R CGG L193K AAG

W184H: CAT N187L CTG E190I ATT L193N AAT

W184L: CTG N187W TGG E190S TCG L193I ATT

W184E: GAG N187F TTT E190T ACT L193T ACT

W184P: CCT N187K AAG E190M ATG L193D GAT

W184N: AAT N187I ATT E190L TTG L193Y TAT

W184A: GCG N187A GCT E190K AAG H194S AGT

W184T: ACT N187P CCG E190Y TAT H194E GAG

W184R: CGG N187D GAT E190D GAT H194K AAG

W184Q: CAG N187G GGG Y191T ACT H194Q CAG

W184V: GTG N187C TGT Y191H CAT H194V GTT

W184S: TCT N187H CAT Y191G GGG H194T ACT

W184M: ATG F188P CCG Y191L TTG H194L CTG

W184I: ATT F188I ATT Y191P CCT H194Y TAT

W184F: TTT F188N AAT Y191Q CAG H194F TTT

T185R: CGT F188S AGT Y191K AAG H194G GGT

T185Y: TAT F188Q CAG Y191D GAT H194I ATT

T185W: TGG F188K AAG Y191A GCG H194W TGG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

T185H: CAT F188G GGG Y191W TGG H194M ATG

T185G: GGG F188W TGG Y191S TCT H194A GCT

T185P: CCT F188E GAG Y191V GTT H194P CCT

T185S: TCG F188H CAT Y191E GAG R195C TGT

T185V: GTT F188D GAT Y191R CGT R195F TTT

T185Q: CAG F188A GCG Y191C TGT R195W TGG

T185N: AAT F188L CTT N192R CGG R195T ACT

T185C: TGT F188R CGT N192L CTG R195L CTG

T185L: CTT F188V GTT N192Q CAG R195G GGT

T185A: GCG R189L TTG N192P CCT R195Q CAG

T185E: GAG R189G GGG N192H CAT R195K AAG

R195S: TCT A198F TTT L201N AAT L205S TCT

R195A: GCT A198W TGG G202T ACG L205G GGT

R195D: GAT A198Y TAT G202Y TAT L205P CCT

R195P: CCT A198D GAT G202E GAG L205E GAG

R195Y: TAT H199I ATT G202V GTG L205V GTG

R195E: GAG H199P CCG G202S TCT L205M ATG

R195V: GTG H199G GGT G202L CTG L205N AAT

V196T: ACG H199N AAT G202I ATT L205C TGT

V196D: GAT H199S TCG G202M ATG L205I ATT

V196G: GGG H199L TTG G202H CAT L205A GCG

V196E: GAG H199M ATG G202C TGT L205R CGG

V196A: GCG H199A GCG G202R CGT L205W TGG

V196S: AGT H199C TGT G202P CCT L205Q CAG

V196Q: CAG H199K AAG G202A GCT G206I ATT

V196P: CCG H199R CGT G202K AAG G206V GTG

V196R: CGT H199V GTG G202D GAT G206A GCG

V196H: CAT H199W TGG H203Y TAT G206C TGT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

V196Y: TAT H199T ACT H203E GAG G206S TCG

V196I: ATT H199E GAG H203R CGG G206P CCG

V196L: CTG E200P CCG H203Q CAG G206L TTG

V196K: AAG E200G GGG H203P CCG G206D GAT

V196M: ATG E200A GCT H203G GGG G206M ATG

A197G: GGT E200T ACG H203T ACT G206R CGG

A197S: AGT E200I ATT H203D GAT G206Q CAG

A197L: CTT E200W TGG H203L TTG G206E GAG

A197P: CCG E200R CGG H203N AAT G206H CAT

A197V: GTG E200F TTT H203A GCT G206T ACG

A197Y: TAT E200M ATG H203S TCT G206W TGG

A197Q: CAG E200D GAT H203V GTT L207S TCT

A197R: CGG E200V GTG H203I ATT L207Y TAT

A197T: ACT E200C TGT H203C TGT L207A GCG

A197I: ATT E200S TCT S204R CGG L207R CGT

A197H: CAT E200Y TAT S204N AAT L207P CCG

A197E: GAG E200N AAT S204A GCG L207Q CAG

A197W: TGG L201A GCG S204T ACT L207N AAT

A197N: AAT L201R CGG S204Y TAT L207K AAG

A197C: TGT L201E GAG S204V GTG L207M ATG

A198T: ACG L201P CCT S204L CTT L207W TGG

A198K: AAG L201G GGT S204H CAT L207H CAT

A198S: TCG L201V GTT S204D GAT L207D GAT

A198H: CAT L201T ACG S204Q CAG L207V GTT

A198G: GGT L201I ATT S204G GGG L207I ATT

A198E: GAG L201S TCT S204W TGG L207G GGT

A198P: CCG L201W TGG S204I ATT S208D GAT

A198L: TTG L201Q CAG S204K AAG S208V GTT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

A198R: CGT L201D GAT S204P CCT S208P CCT

A198V: GTT L201M ATG L205T ACG S208G GGT

A198M: ATG L201K AAG L205D GAT S208A GCG

S208K: AAG T211Q CAG G214A GCT M217A GCG

S208N: AAT T211S TCG G214D GAT M217H CAT

S208F: TTT T211A GCG G214F TTT M217I ATT

S208Q: CAG T211F TTT G214Y TAT M217D GAT

S208W: TGG T211D GAT G214M ATG Y218C TGT

S208T: ACG T211W TGG G214C TGT Y218F TTT

S208E: GAG T211L CTG A215L CTG Y218W TGG

S208C: TGT D212E GAG A215Q CAG Y218L CTG

S208R: CGT D212A GCG A215M ATG Y218A GCG

S208L: CTT D212K AAG A215G GGT Y218P CCG

H209T: ACG D212R CGG A215W TGG Y218R CGG

H209Y: TAT D212T ACG A215S AGT Y218N AAT

H209R: CGG D212N AAT A215T ACG Y218V GTG

H209Q: CAG D212G GGG A215V GTT Y218Q CAG

H209A: GCT D212S TCT A215N AAT Y218I ATT

H209G: GGG D212P CCG A215P CCG Y218D GAT

H209N: AAT D212Q CAG A215H CAT Y218S TCG

H209P: CCT D212V GTT A215K AAG Y218G GGG

H209W: TGG D212L TTG A215I ATT Y218E GAG

H209V: GTT D212F TTT A215R CGT P219L TTG

H209D: GAT D212H CAT A215C TGT P219C TGT

H209S: AGT D212Y TAT A215D GAT P219V GTG

H209F: TTT I213Q CAG L216A GCT P219D GAT

H209L: CTG I213T ACT L216C TGT P219F TTT

H209C: TGT I213C TGT L216D GAT P219A GCG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

S210C: TGT I213P CCT L216E GAG P219T ACT

S210G: GGT I213H CAT L216G GGG P219E GAG

S210I: ATT I213A GCG L216I ATT P219Q CAG

S210R: CGT I213V GTT L216K AAG P219R CGG

S210L: CTG I213G GGG L216M ATG P219H CAT

S210V: GTG I213N AAT L216P CCT P219G GGG

S210H: CAT I213L CTT L216Q CAG P219K AAG

S210N: AAT I213S AGT L216R CGG P219S TCG

S210F: TTT I213M ATG L216S TCT P219W TGG

S210P: CCG I213R CGG L216T ACT S220R CGT

S210W: TGG I213K AAG L216V GTG S220A GCG

S210Q: CAG I213F TTT L216W TGG S220Q CAG

S210T: ACG I213D GAT M217P CCT S220T ACT

S210K: AAG I213E GAG M217Y TAT S220L CTT

S210A: GCG G214L TTG M217T ACG S220K AAG

T211P: CCG G214Q CAG M217C TGT S220G GGG

T211R: CGT G214S TCT M217S AGT S220H CAT

T211K: AAG G214T ACT M217L CTG S220E GAG

T211G: GGG G214V GTG M217N AAT S220M ATG

T211M: ATG G214I ATT M217R CGG S220V GTT

T211N: AAT G214R CGT M217Q CAG S220P CCG

T211V: GTG G214P CCG M217K AAG S220I ATT

T211H: CAT G214E GAG M217G GGG S220F TTT

S220N: AAT S224T ACG V227K AAG A230S TCG

Y221W: TGG S224Q CAG V227L CTG A230C TGT

Y221K: AAG S224R CGG V227P CCT A230V GTT

Y221Q: CAG S224P CCG V227S TCT A230T ACT

Y221C: TGT S224I ATT V227T ACT A230Y TAT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

Y221N: AAT S224V GTT V227W TGG A230M ATG

Y221P: CCT S224L TTG V227Y TAT A230N AAT

Y221V: GTT S224C TGT V227G GGG A230H CAT

Y221A: GCG S224K AAG V227H CAT Q231I ATT

Y221G: GGG S224D GAT V227Q CAG Q231A GCT

Y221R: CGG S224H CAT V227R CGT Q231F TTT

Y221S: TCG S224M ATG Q228A GCT Q231P CCT

Y221M: ATG S224A GCT Q228D GAT Q231Y TAT

Y221T: ACG S224W TGG Q228E GAG Q231R CGT

Y221L: CTT G225D GAT Q228G GGT Q231L CTG

Y221E: GAG G225R CGT Q228H CAT Q231D GAT

T222L: TTG G225Q CAG Q228K AAG Q231G GGT

T222Y: TAT G225M ATG Q228L CTG Q231V GTT

T222R: CGT G225P CCT Q228M ATG Q231W TGG

T222V: GTT G225W TGG Q228N AAT Q231S AGT

T222P: CCT G225S TCT Q228P CCG Q231H CAT

T222S: AGT G225E GAG Q228R CGG Q231C TGT

T222A: GCT G225V GTT Q228S TCT Q231M ATG

T222H: CAT G225T ACG Q228T ACG D232H CAT

T222G: GGG G225K AAG Q228W TGG D232G GGG

T222M: ATG G225N AAT Q228Y TAT D232R CGT

T222F: TTT G225C TGT L229R CGG D232P CCT

T222C: TGT G225H CAT L229A GCG D232Y TAT

T222I: ATT G225A GCG L229T ACG D232N AAT

T222N: AAT D226S TCT L229Q CAG D232S TCG

T222W: TGG D226W TGG L229P CCT D232F TTT

T222D: GAT D226R CGG L229E GAG D232V GTG

F223L: TTG D226A GCT L229W TGG D232K AAG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

F223T: ACG D226N AAT L229M ATG D232W TGG

F223C: TGT D226T ACT L229I ATT D232Q CAG

F223R: CGT D226E GAG L229G GGT D232E GAG

F223N: AAT D226L CTT L229C TGT D232T ACT

F223P: CCT D226P CCT L229Y TAT D232L CTG

F223E: GAG D226H CAT L229D GAT D233Q CAG

F223G: GGG D226G GGT L229H CAT D233P CCG

F223Q: CAG D226I ATT L229V GTG D233S TCT

F223A: GCG D226M ATG A230L TTG D233T ACG

F223S: TCT D226V GTG A230G GGT D233A GCG

F223Y: TAT D226C TGT A230W TGG D233W TGG

F223H: CAT V227A GCT A230P CCG D233G GGT

F223K: AAG V227C TGT A230D GAT D233R CGT

F223M: ATG V227D GAT A230R CGT D233E GAG

S224G: GGG V227E GAG A230I ATT D233N AAT

D233V: GTG G236N AAT I240G GGG R243L CTT

D233M: ATG G236F TTT I240Q CAG R243A GCG

D233L: CTG I237S TCG I240P CCG R243H CAT

D233K: AAG I237L CTG I240R CGG R243Q CAG

D233I: ATT I237R CGT I240S TCG R243S AGT

I234A: GCT I237Q CAG I240K AAG R243I ATT

I234T: ACG I237K AAG I240V GTG R243C TGT

I234V: GTT I237D GAT I240D GAT R243N AAT

I234W: TGG I237A GCG I240A GCG R243Y TAT

I234E: GAG I237T ACG I240C TGT R243G GGG

I234G: GGT I237E GAG I240L CTT R243D GAT

I234L: CTT I237C TGT I240F TTT R243V GTG

I234H: CAT I237G GGG I240Y TAT S244P CCG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

I234M: ATG I237P CCT I240M ATG S244L CTT

I234N: AAT I237Y TAT I240T ACG S244W TGG

I234Y: TAT I237W TGG Y241V GTT S244M ATG

I234P: CCT I237N AAT Y241A GCT S244V GTT

I234D: GAT Q238G GGG Y241G GGG S244Q CAG

I234Q: CAG Q238H CAT Y241H CAT S244D GAT

I234C: TGT Q238S TCG Y241R CGG S244E GAG

D235H: CAT Q238Y TAT Y241P CCG S244T ACG

D235G: GGG Q238F TTT Y241Q CAG S244H CAT

D235A: GCG Q238E GAG Y241L TTG S244G GGT

D235P: CCG Q238L TTG Y241T ACG S244A GCT

D235L: CTT Q238W TGG Y241S AGT S244F TTT

D235V: GTG Q238P CCG Y241W TGG S244Y TAT

D235E: GAG Q238R AGG Y241N AAT S244R CGT

D235R: CGT Q238C TGT Y241M ATG Q245P CCT

D235Q: CAG Q238N AAT Y241I ATT Q245I ATT

D235T: ACG Q238I ATT Y241D GAT Q245F TTT

D235C: TGT Q238T ACG G242A GCG Q245V GTT

D235S: TCG Q238K AAG G242F TTT Q245M ATG

D235N: AAT A239S TCT G242L CTT Q245T ACT

D235Y: TAT A239Q CAG G242N AAT Q245E GAG

D235I: ATT A239T ACG G242P CCT Q245S TCG

G236M: ATG A239P CCT G242W TGG Q245R CGG

G236R: CGG A239V GTG G242T ACG Q245G GGT

G236D: GAT A239L CTG G242R CGT Q245H CAT

G236S: TCT A239Y TAT G242V GTT Q245L CTT

G236T: ACT A239I ATT G242S TCG Q245K AAG

G236C: TGT A239C TGT G242I ATT Q245W TGG

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

G236K: AAG A239G GGG G242Y TAT Q245C TGT

G236E: GAG A239W TGG G242H CAT N246W TGG

G236P: CCG A239F TTT G242E GAG N246R CGG

G236I: ATT A239K AAG G242K AAG N246A GCG

G236Y: TAT A239H CAT R243P CCG N246F TTT

G236L: CTG A239R CGT R243K AAG N246G GGT

G236V: GTT A239D GAT R243T ACG N246P CCT

N246V: GTT Q249G GGT G252P CCT T255L TTG

N246Q: CAG Q249N AAT G252H CAT T255H CAT

N246Y: TAT Q249K AAG G252C TGT P256S AGT

N246C: TGT Q249I ATT G252V GTT P256V GTG

N246I: ATT Q249Y TAT G252I ATT P256F TTT

N246L: TTG Q249V GTG P253C TGT P256Y TAT

N246S: TCT Q249L TTG P253G GGT P256I ATT

N246T: ACT Q249H CAT P253Q CAG P256A GCT

N246K: AAG P250L CTG P253I ATT P256L CTT

N246D: GAT P250S TCG P253L CTG P256G GGT

P247A: GCG P250R CGG P253R CGG P256N AAT

P247D: GAT P250Y TAT P253A GCT P256R CGG

P247E: GAG P250M ATG P253E GAG P256Q CAG

P247F: TTT P250F TTT P253Y TAT P256E GAG

P247G: GGG P250A GCT P253W TGG P256K AAG

P247H: CAT P250K AAG P253M ATG P256M ATG

P247I: ATT P250G GGT P253V GTG P256C TGT

P247K: AAG P250N AAT P253T ACT K257C TGT

P247L: CTG P250T ACT P253K AAG K257M ATG

P247N: AAT P250W TGG P253N AAT K257V GTT

P247Q: CAG P250D GAT Q254R CGT K257A GCT

Tabla 21. Codones que codifican cada sustitución de aminoácido

Mutación: Codón Mutación Codón Mutación Codón Mutación Codón

P247R: CGT P250V GTG Q254G GGG K257E GAG

P247S: TCG P250Q CAG Q254W TGG K257S TCT

P247T: ACG I251A GCG Q254T ACT K257L CTT

P247V: GTT I251Q CAG Q254A GCT K257I ATT

V248W: TGG I251G GGG Q254F TTT K257G GGG

V248L: CTG I251L CTG Q254D GAT K257N AAT

V248Q: CAG I251K AAG Q254P CCG K257F TTT

V248M: ATG I251R CGT Q254L CTG K257W TGG

V248Y: TAT I251E GAG Q254C TGT K257R CGG

V248G: GGG I251D GAT Q254Y TAT K257P CCG

V248C: TGT I251T ACG Q254I ATT K257T ACT

V248R: CGG I251C TGT Q254E GAG A258Q CAG

V248A: GCG I251Y TAT Q254V GTG A258Y TAT

V248H: CAT I251P CCT Q254S TCT A258W TGG

V248I: ATT I251S TCT T255I ATT A258G GGG

V248T: ACT I251W TGG T255Q CAG A258L TTG

V248K: AAG I251V GTT T255P CCG A258F TTT

V248S: TCG G252F TTT T255R CGT A258M ATG

V248F: TTT G252W TGG T255C TGT A258N AAT

V248E: GAG G252A GCG T255N AAT A258V GTG

Q249T: ACT G252R CGG T255S AGT A258T ACG

Q249W: TGG G252L CTT T255V GTG A258I ATT

Q249R: CGG G252E GAG T255E GAG A258D GAT

Q249E: GAG G252D GAT T255G GGG A258R CGT

Q249A: GCT G252K AAG T255K AAG A258E GAG

Q249P: CCG G252S TCG T255A GCT A258P CCG

Q249C: TGT G252T ACG T255F TTT T255L TTG

El ADN que codificaba cada miembro de la biblioteca individual se generó de acuerdo con los protocolos de síntesis de ADN convencionales y se expresó utilizando técnicas de biología molecular de rutina. En resumen, el ADN se ligó al vector pET303CTHis (Invitrogen, SEC ID NO: 533) utilizando técnicas de biología molecular de rutina. El plásmido 143

imagen306

Tabla 22) con una actividad reducida a 37°C. Estos mutantes de hMPM-1 se volvieron a escrutar, utilizando el mismo análisis, y se confirmaron 104 éxitos primarios (véase la Tabla 23, a continuación). Se consideró que los mutantes de hMPM-1 que eran activos a 25°C y que tenían al menos una disminución de la actividad de 16% a 37°C

(p. ej., la razón de las actividades a 25°C o 37°C (25°C/37°C) es mayor o igual a 1,2) eran éxitos sensibles a la

5 temperatura primarios confirmados. La Tabla 22, a continuación, enumera la mutación hMPM-1, la UFR media a 25°C y 37°C, y la razón de actividades (25°C/37°C). La tabla también muestra el fenotipo de temperatura: DISMINUYE, indica que la razón (25°C/37°C) de actividad del mutante se reduce en comparación con la razón (25°C/37°C) de actividad del tipo salvaje, es decir, disminución mayor de 16% de la actividad del tipo salvaje; NEUTRO, indica que la razón (25°C/37°C) de actividad del mutante es similar a la razón (25°C/37°C) de actividad

10 del tipo salvaje, es decir, dentro de 16% de la actividad del tipo salvaje; y AUMENTA, indica que la razón (25°C/37°C) de actividad del mutante aumenta en comparación con la razón (25°C/37°C) de actividad del tipo salvaje, es decir, aumento de más de 16% de la actividad del tipo salvaje.

La Tabla 22, a continuación, también enumera las actividades residuales a 25°C y 37°C, en comparación con

15 hMPM-1 de tipo salvaje. La actividad residual es la razón de actividad del mutante de hMPM-frente a la actividad de hMPM-1 de tipo salvaje a la temperatura indicada, 25°C o 37°C. Algunos de los mutantes de hMPM-1 tuvieron actividades que fueron comparables a, o mayores que, hMPM-1 de tipo salvaje a 25°C a la vez que exhibieron disminución de actividad a 37°C, volviendo a confirmar por lo tanto su menor actividad a temperaturas elevadas.

Tabla 22. Resultados del Escrutinio Inicial para los mutantes de hMPM-1 sensibles a la Temperatura

Fenotipo de Temp.: Mutación de hMMP-1 SEQ ID NO UFR media a 25°C UFR media a 37°C Razón 25°C/37°C Act. Res. Mut/wt a 25°C Act. Res. Mut/wt a 37°C

Neutro: T84F 479 6312,72 6453,46 0,98 1,10 1,27

Neutro: E85F 480 6092,47 6362,37 0,96 1,06 1,26

Aumenta: L95K 328 1333,28 1191,46 1,12 0,15 0,14

Disminuye: L95I 329 1707,98 2294,02 0,74 0,30 0,45

Disminuye: R98D 481 2905,96 3867,31 0,75 0,33 0,47

Disminuye: I99Q 482 3318,21 4623,91 0,72 0,37 0,56

Disminuye: E100V 457 3980,72 5009,20 0,79 1,26 1,01

Neutro: E100R 451 7410,11 7964,52 0,93 0,83 0,96

Neutro: E100S 454 3768,09 4664,58 0,81 0,42 0,56

Neutro: E100T 453 6985,28 7478,12 0,93 0,79 0,90

Neutro: E100F 455 6709,27 7436,60 0,90 0,75 0,90

Neutro: E100I 456 8824,19 8458,79 1,04 0,99 1,02

Neutro: E100N 452 8809,68 8215,63 1,07 0,99 0,99

Neutro: T103Y 458 1181,09 1423,76 0,83 0,37 0,29

Neutro: P104A 484 8861,30 8360,82 1,06 1,00 1,01

Aumenta: P104M 483 6709,44 7118,65 0,94 0,88 0,75

Aumenta: D105A 340 2674,16 1227,06 2,18 0,65 0,24

Aumenta: D105F 336 2009,56 1221,58 1,65 0,49 0,24

Aumenta: D105G 335 2407,89 1686,68 1,43 0,58 0,34

Aumenta: D105I 338 1732,38 1105,99 1,57 0,42 0,22

Aumenta: D105L 339 1563,61 859,56 1,82 0,38 0,17

Aumenta: D105N 332 3766,72 1475,08 2,55 0,91 0,29

Aumenta: D105R 331 3892,02 2016,90 1,93 0,94 0,40

Aumenta: D105S 334 3646,49 2727,22 1,34 0,88 0,54

Aumenta: D105T 333 2513,64 1729,46 1,45 0,61 0,34

Aumenta: D105W 337 2565,93 1855,05 1,38 0,62 0,37

Neutro: D105E 330 4000,92 3366,64 1,19 0,59 0,45

Neutro: L106C 485 2995,56 3678,33 0,81 0,34 0,44

Neutro: L106S 486 2730,64 2899,36 0,94 0,31 0,35

Neutro: A109H 487 7206,01 7536,96 0,96 0,81 0,91

Neutro: D110A 488 4179,59 5112,44 0,82 0,47 0,62

Neutro: V111R 489 2401,69 2925,16 0,82 0,27 0,35

Neutro: D112S 490 7203,69 7600,93 0,95 0,81 0,92

Neutro: A118T 491 745,83 665,63 1,12 0,13 0,13

Disminuye: S123V 492 3220,29 4504,25 0,71 0,41 0,60

Neutro: N124D 493 6218,73 6620,92 0,94 0,92 0,88

Neutro: T126S 494 7114,42 6856,69 1,04 1,06 0,91

Aumenta: G147P 495 494,94 392,93 1,26 0,07 0,05

Aumenta: R150P 345 2291,14 828,28 2,77 0,31 0,12

Neutro: R150V 344 6869,28 6604,61 1,04 1,20 1,30

Neutro: R150D 341 7230,41 6033,28 1,20 1,26 1,19

Disminuye: R150I 343 3120,05 4082,34 0,76 0,39 0,55

Neutro: R150H 342 8281,04 8056,17 1,03 1,05 1,08

Aumenta: D151G 346 1073,32 733,89 1,46 0,20 0,11

Neutro: N152A 497 6669,94 5660,16 1,18 1,17 1,12

Disminuye: N152S 496 4607,85 8096,31 0,57 0,58 1,08

Neutro: S153T 459 10530,07 8798,72 1,20 1,44 1,24

Aumenta: F155L 347 1322,13 864,19 1,53 0,25 0,13

Aumenta: F155A 348 1250,93 760,12 1,65 0,23 0,11

Aumenta: D156H 349 2722,09 2081,55 1,31 0,51 0,31

Aumenta: D156L 356 2548,30 1597,53 1,60 0,48 0,24

Aumenta: D156A 357 2679,29 1734,45 1,54 0,50 0,26

Aumenta: D156W 354 1575,39 1268,36 1,24 0,30 0,19

Aumenta: D156V 355 1400,88 766,80 1,83 0,26 0,11

Aumenta: D156K 350 1292,89 966,62 1,34 0,24 0,14

Aumenta: D156T 352 2871,09 1843,03 1,56 0,54 0,27

Aumenta: D156R 351 2431,23 1545,89 1,57 0,46 0,23

Aumenta: D156M 353 817,96 502,82 1,63 0,12 0,07

Neutro: P158T 500 4204,23 3507,76 1,20 0,53 0,47

Neutro: P158G 501 6277,86 5496,27 1,14 0,79 0,73

Neutro: P158K 498 6860,82 6680,30 1,03 0,87 0,89

Neutro: P158N 499 3656,04 3874,48 0,94 0,46 0,52

Aumenta: G159V 363 2453,98 732,46 3,35 0,34 0,10

Aumenta: G159T 359 5059,91 1734,12 2,92 0,69 0,24

Aumenta: G159M 360 5905,06 4874,00 1,21 0,75 0,65

Neutro: G159I 362 5725,99 5357,20 1,07 0,72 0,72

Neutro: G159W 361 6787,40 6287,71 1,08 0,86 0,84

Neutro: G159L 364 8231,62 7638,64 1,08 1,04 1,02

Neutro: G159C 358 2897,77 3053,86 0,95 0,37 0,41

Neutro: P170D 502 1434,38 1462,91 0,98 0,25 0,29

Neutro: P170A 503 2733,72 2793,24 0,98 0,48 0,55

Aumenta: G171P 462 1570,74 1204,39 1,30 0,27 0,17

Neutro: G171E 461 1154,96 1199,65 0,96 0,20 0,24

Neutro: G171D 460 791,81 690,33 1,15 0,14 0,14

Aumenta: A176F 365 10486,82 6516,31 1,61 1,31 0,78

Neutro: A176W 366 482,38 414,85 1,16 0,06 0,06

Neutro: F178T 504 560,54 487,01 1,15 0,10 0,10

Aumenta: F178L 505 1788,95 1314,38 1,36 0,31 0,26

Aumenta: D179N 368 2433,73 812,01 3,00 0,26 0,10

Aumenta: D179V 369 604,63 490,35 1,23 0,11 0,10

Aumenta: D179C 367 613,81 503,76 1,22 0,11 0,10

Aumenta: E180Y 374 6655,19 5379,42 1,24 0,72 0,63

Neutro: E180R 371 6932,51 6309,81 1,10 0,75 0,74

Aumenta: E180T 373 3718,16 2425,13 1,53 0,40 0,29

Aumenta: E180F 377 7014,78 5382,78 1,30 0,76 0,63

Aumenta: E180G 376 5952,65 4547,28 1,31 1,04 0,90

Aumenta: E180S 375 5217,80 3977,60 1,31 0,91 0,78

Aumenta: E180N 372 6534,65 4843,84 1,35 1,14 0,96

Aumenta: E180D 370 7738,70 6277,22 1,23 1,35 1,24

Neutro: D181T 380 6867,00 6057,09 1,13 0,74 0,71

Aumenta: D181L 382 1727,20 1274,09 1,36 0,19 0,15

Aumenta: D181K 378 1087,36 696,83 1,56 0,12 0,08

Aumenta: D181C 379 549,29 447,40 1,23 0,10 0,09

Aumenta: D181G 381 2764,20 2056,56 1,34 0,48 0,41

Aumenta: E182T 384 2995,97 1779,42 1,68 0,32 0,21

Aumenta: E182Q 383 1393,28 804,84 1,73 0,15 0,09

Aumenta: E182M 386 649,73 524,43 1,24 0,11 0,10

Neutro: E182G 385 604,92 543,78 1,11 0,11 0,11

Aumenta: R183G 507 7326,36 6021,39 1,22 1,28 1,19

Aumenta: R183S 506 7896,17 6240,74 1,27 1,38 1,23

Aumenta: T185R 390 1728,04 851,07 2,03 0,20 0,10

Aumenta: T185Y 392 937,75 540,66 1,73 0,11 0,07

Aumenta: T185H 389 1448,04 783,89 1,85 0,17 0,10

Aumenta: T185G 393 3922,30 1990,15 1,97 0,46 0,24

Aumenta: T185V 394 1648,14 897,66 1,84 0,19 0,11

Aumenta: T185Q 391 1594,81 583,93 2,73 0,19 0,07

Aumenta: T185A 395 1599,64 711,08 2,25 0,19 0,09

Aumenta: T185E 388 1324,02 703,76 1,88 0,16 0,09

Neutro: T185D 387 485,86 418,67 1,16 0,06 0,06

Aumenta: N187R 398 1042,36 709,74 1,47 0,12 0,09

Aumenta: N187M 402 1731,67 995,07 1,74 0,20 0,12

Neutro: N187W 403 1694,86 1425,68 1,19 0,20 0,17

Aumenta: N187F 401 1240,41 731,98 1,69 0,15 0,09

Aumenta: N187K 397 2331,93 1140,19 2,05 0,27 0,14

Aumenta: N187I 404 1444,98 683,03 2,12 0,17 0,08

Aumenta: N187A 405 4379,80 2616,49 1,67 0,52 0,32

Neutro: N187G 400 535,06 514,10 1,04 0,07 0,07

Neutro: N187C 399 1804,28 1860,67 0,97 0,23 0,25

Neutro: N187H 396 1143,07 1071,67 1,07 0,14 0,14

Aumenta: F188V 508 7116,29 5860,00 1,21 1,24 1,16

Neutro: R189N 509 7842,39 6675,36 1,17 1,37 1,32

Neutro: R189T 511 7610,10 6459,94 1,18 1,33 1,27

Neutro: R189Q 510 7465,37 6396,79 1,17 1,30 1,26

Aumenta: E190G 465 5313,99 4365,93 1,22 0,75 0,48

Aumenta: E190Y 464 7243,54 5742,33 1,26 1,27 1,13

Aumenta: E190D 463 7910,21 6468,78 1,22 1,38 1,28

Aumenta: Y191V 466 1553,58 1254,11 1,24 0,19 0,14

Aumenta: N192H 468 2274,24 1058,80 2,15 0,32 0,12

Aumenta: N192S 470 2043,65 1630,74 1,25 0,29 0,18

Aumenta: N192D 467 4213,33 2216,40 1,90 0,59 0,24

Aumenta: N192C 469 1310,46 987,31 1,33 0,18 0,11

Neutro: H194P 471 5264,79 5058,19 1,04 0,74 0,56

Aumenta: R195C 407 4231,32 1853,20 2,28 0,60 0,20

Neutro: R195W 410 5099,23 4524,84 1,13 0,72 0,50

Neutro: R195L 412 5073,57 4520,73 1,12 0,72 0,50

Aumenta: R195G 409 5269,21 3025,93 1,74 0,74 0,33

Aumenta: R195Q 408 1958,69 1361,83 1,44 0,28 0,15

Aumenta: R195A 413 5605,90 3852,81 1,46 0,79 0,42

Aumenta: R195D 406 2724,53 1907,81 1,43 0,38 0,21

Aumenta: R195V 411 1711,48 1037,62 1,65 0,24 0,11

Aumenta: A197C 512 4012,80 3140,52 1,28 0,70 0,62

Neutro: A198G 414 2610,82 2368,26 1,10 0,37 0,26

Aumenta: A198L 416 1339,94 726,74 1,84 0,19 0,08

Aumenta: A198M 415 1384,46 999,55 1,39 0,20 0,11

Aumenta: G206A 418 4554,61 2702,11 1,69 0,47 0,30

Aumenta: G206S 417 1226,37 919,66 1,33 0,13 0,10

Aumenta: L207R 472 3476,88 1332,44 2,61 0,36 0,15

Neutro: L207V 475 656,95 550,54 1,19 0,08 0,07

Neutro: L207I 474 645,37 550,32 1,17 0,08 0,07

Aumenta: L207G 473 610,01 484,35 1,26 0,08 0,06

Neutro: S208R 513 7639,06 6465,10 1,18 1,34 1,28

Aumenta: S208L 514 7811,78 6354,14 1,23 1,37 1,25

Aumenta: S210V 419 1190,35 856,63 1,39 0,29 0,17

Neutro: S210A 420 1682,05 1546,97 1,09 0,25 0,21

Neutro: T211L 515 2376,23 2102,07 1,13 0,35 0,28

Aumenta: D212G 477 1011,62 657,28 1,54 0,24 0,13

Neutro: D212H 476 4696,49 4001,41 1,17 0,70 0,53

Aumenta: Y218S 421 3702,49 3099,73 1,19 0,58 0,43

Aumenta: F223C 424 3115,11 2488,91 1,25 0,53 0,35

Aumenta: F223E 422 7194,34 5884,03 1,22 1,22 0,83

Aumenta: F223G 426 3236,56 2599,04 1,25 0,55 0,36

Aumenta: F223A 428 5226,86 3982,92 1,31 0,89 0,56

Aumenta: F223S 425 6006,80 4916,07 1,22 1,02 0,69

Neutro: F223K 423 4021,97 3712,91 1,08 0,60 0,49

Neutro: F223M 427 525,66 441,29 1,19 0,08 0,06

Aumenta: V227C 433 4040,96 3278,65 1,23 0,68 0,46

Aumenta: V227D 429 1190,09 731,34 1,63 0,20 0,10

Aumenta: V227E 430 5381,63 2605,20 2,07 0,91 0,37

Aumenta: V227L 438 4883,98 4000,68 1,22 0,83 0,56

Aumenta: V227S 435 3863,33 3131,47 1,23 0,65 0,44

Aumenta: V227W 437 1845,46 1374,06 1,34 0,31 0,19

Neutro: V227G 436 1040,74 883,01 1,18 0,15 0,12

Aumenta: V227H 431 689,20 504,65 1,37 0,10 0,07

Aumenta: V227Q 434 696,97 506,11 1,38 0,10 0,07

Neutro: V227R 432 664,31 561,06 1,18 0,10 0,07

Aumenta: Q228P 439 2862,74 1291,55 2,22 1,33 0,44

Aumenta: L229A 442 2627,78 2118,07 1,24 1,22 0,72

Aumenta: L229T 440 3780,54 1464,25 2,58 1,75 0,50

Aumenta: L229I 441 1158,56 828,94 1,40 0,54 0,28

Aumenta: A230V 478 5030,94 3433,18 1,47 2,33 1,17

Aumenta: D233E 443 2881,17 1918,57 1,50 1,33 0,65

Aumenta: I234A 447 1458,10 1018,50 1,43 0,31 0,18

Aumenta: I234T 446 1451,51 1188,67 1,22 0,31 0,21

Aumenta: I234E 444 1301,06 840,09 1,55 0,27 0,15

Aumenta: I234Q 445 1095,18 837,53 1,31 0,23 0,15

Aumenta: I237L 518 2880,14 2240,61 1,29 0,61 0,39

Disminuye: I237W 517 4188,38 5663,94 0,74 0,62 0,75

Neutro: I237N 516 5368,49 6271,59 0,86 0,80 0,83

Aumenta: I240S 449 2033,91 1204,66 1,69 0,32 0,15

Neutro: I240A 450 2099,13 1776,41 1,18 0,33 0,23

Aumenta: I240C 448 970,78 650,04 1,49 0,15 0,08

Neutro: I251S 519 8445,88 7160,96 1,18 1,07 0,96

Neutro: I251W 520 7305,95 6974,26 1,05 0,92 0,93

Neutro: Q254S 521 7768,13 8801,19 0,88 1,15 1,17

Neutro: T255H 522 8243,01 7352,60 1,12 1,22 0,98

Neutro: P256C 523 4674,45 4633,67 1,01 0,69 0,62

Neutro: K257P 525 8039,60 7464,88 1,08 1,19 0,99

Neutro: K257T 524 9346,88 8849,42 1,06 1,39 1,18

Neutro: A258P 526 10414,06 9178,82 1,13 1,55 1,22

Tabla 23: Éxitos reconfirmados

Fenotipo de Temperatura: Mutación de hMMP-1 SEQ ID NO

Aumenta: L95K 328

Disminuye: E100V 457

Neutro: T103Y 458

Aumenta: D105A 340

Aumenta: D105F 336

Tabla 23: Éxitos reconfirmados

Fenotipo de Temperatura: Mutación de hMMP-1 SEQ ID NO

Aumenta: D105G 335

Aumenta: D105I 338

Aumenta: D105L 339

Aumenta: D105N 332

Aumenta: D105R 331

Aumenta: D105S 334

Aumenta: D105T 333

Aumenta: D105W 337

Aumenta: R150P 345

Aumenta: D151G 346

Neutro: S153T 459

Aumenta: F155L 347

Aumenta: F155A 348

Aumenta: D156H 349

Aumenta: D156L 356

Aumenta: D156A 357

Aumenta: D156W 354

Aumenta: D156V 355

Aumenta: D156K 350

Aumenta: D156T 352

Aumenta: D156R 351

Aumenta: G159V 363

Aumenta: G159T 359

Aumenta: G171P 462

Aumenta: A176F 365

Aumenta: D179N 368

Aumenta: E180Y 374

Neutro: E180R 371

Tabla 23: Éxitos reconfirmados

Fenotipo de Temperatura: Mutación de hMMP-1 SEQ ID NO

Aumenta: E180T 373

Aumenta: E180F 377

Neutro: D181T 380

Aumenta: D181L 382

Aumenta: D181K 378

Aumenta: E182T 384

Aumenta: E182Q 383

Aumenta: T185R 390

Aumenta: T185Y 392

Aumenta: T185H 389

Aumenta: T185G 393

Aumenta: T185V 394

Aumenta: T185Q 391

Aumenta: T185A 395

Aumenta: T185E 388

Aumenta: N187R 398

Aumenta: N187M 402

Neutro: N187W 403

Aumenta: N187F 401

Aumenta: N187K 397

Aumenta: N187I 404

Aumenta: N187A 405

Aumenta: E190G 465

Aumenta: Y191V 466

Aumenta: N192H 468

Aumenta: N192S 470

Aumenta: N192D 467

Aumenta: N192C 469

Tabla 23: Éxitos reconfirmados

Fenotipo de Temperatura: Mutación de hMMP-1 SEQ ID NO

Neutro: H194P 471

Aumenta: R195C 407

Neutro: R195W 410

Neutro: R195L 412

Aumenta: R195G 409

Aumenta: R195Q 408

Aumenta: R195A 413

Aumenta: R195D 406

Aumenta: R195V 411

Neutro: A198G 414

Aumenta: A198L 416

Aumenta: A198M 415

Aumenta: G206A 418

Aumenta: G206S 417

Aumenta: L207R 472

Aumenta: S210V 419

Aumenta: D212G 477

Aumenta: Y218S 421

Aumenta: F223C 424

Aumenta: F223E 422

Aumenta: F223G 426

Aumenta: F223A 428

Aumenta: F223S 425

Aumenta: V227C 433

Aumenta: V227D 429

Aumenta: V227E 430

Aumenta: V227L 438

Aumenta: V227S 435

imagen307

a 37°C después de una incubación durante la noche (véase, por ejemplo la Tabla 24C). Además, aunque los niveles de expresión, y por lo tanto los valores globales de UFR, variaron en diferentes experimentos, las razones de las actividades seguían siendo las mismas. Por ejemplo, el mutante D156T se sometió a ensayo dos veces (véase la Tabla 24C a continuación) y, aunque cada ensayo produjo diferentes datos para los valores de UFR, la razón de los valores fue similar y compatible en el parámetro de la razón de 1,5.

Tabla 24A. Mutantes de hMPM-1 Sensibles a la Temperatura, 1 hora de incubación

Mutación hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 34°C UFR 37°C Razón 25°C/34°C Razón 25°C/37°C

L95K: 328 2677,64 553,00 572,70 4,84 4,68

D105A: 340 3496,48 697,79 1119,92 5,01 3,12

D105F: 336 1749,85 554,69 685,49 3,15 2,55

D105G: 335 7450,35 2196,32 3514,50 3,39 2,12

D105I: 338 4720,96 638,42 943,44 7,39 5,00

D105L: 339 2636,80 490,04 552,90 5,38 4,77

D105N: 332 7487,95 776,33 1513,73 9,65 4,95

D105R: 331 1732,70 641,23 736,92 2,70 2,35

D105S: 334 8637,40 3782,36 6510,05 2,28 1,33

D105W: 337 4263,51 1321,69 2422,77 3,23 1,76

D105T: 333 2666,45 770,72 1685,33 3,46 1,58

R150P: 345 7568,19 1678,59 2010,33 4,51 3,76

D151G: 346 973,47 517,98 595,63 1,88 1,63

F155A: 348 1800,92 592,07 596,31 3,04 3,02

D156K: 350 8718,91 1733,90 1839,60 5,03 4,74

D156T: 352 8034,06 2216,02 2255,25 3,63 3,56

D156L: 356 1825,01 528,43 619,10 3,45 2,95

D156A: 357 1495,21 450,17 496,04 3,32 3,01

D156W: 354 1006,97 463,48 493,84 2,17 2,04

D156V: 355 1140,60 484,30 504,38 2,36 2,26

D156T: 352 2796,00 581,90 743,53 4,80 3,76

D156H: 349 3489,60 578,59 711,59 6,03 4,90

D156R: 351 4983,67 678,23 734,95 7,35 6,78

G159V: 363 3416,77 705,80 739,87 4,84 4,62

G159T: 359 4081,99 1732,63 1865,15 2,36 2,19

A176F: 365 967,31 539,31 517,16 1,79 1,87

D179N: 368 4105,85 492,00 513,37 8,35 8,00

E180Y: 374 8803,90 3904,31 5268,18 2,25 1,67

E180T: 373 5957,38 1155,89 1430,72 5,15 4,16

E180F: 377 7484,41 2677,89 3141,69 2,79 2,38

D181L: 382 1629,22 559,04 549,09 2,91 2,97

D181K: 378 844,40 570,98 569,44 1,48 1,48

E182T: 384 2244,96 653,93 668,01 3,43 3,36

E182Q: 383 1066,68 583,87 582,84 1,83 1,83

T185R: 390 1599,19 867,00 872,66 1,84 1,83

T185H: 389 3616,30 1601,20 1842,01 2,26 1,96

T185Q: 391 4365,21 1512,02 1899,46 2,89 2,30

T185A: 395 1374,00 567,04 608,05 2,42 2,26

T185E: 388 2145,28 1263,20 1399,76 1,70 1,53

N187R: 398 1659,90 955,75 1054,91 1,74 1,57

N187M: 402 2842,50 1343,95 1464,36 2,12 1,94

N187F: 401 1846,10 716,62 786,07 2,58 2,35

N187K: 397 2428,31 1703,73 1914,84 1,43 1,27

N187I: 404 2455,44 717,51 773,59 3,42 3,17

R195V: 411 3121,02 1947,80 2132,94 1,60 1,46

A198L: 416 4547,61 1570,19 2061,87 2,90 2,21

A198M: 415 1948,92 1101,86 1535,22 1,77 1,27

G206A: 418 667,50 543,90 540,79 1,23 1,23

G206S: 417 608,46 427,44 412,07 1,42 1,48

S210V: 419 1952,12 961,54 1791,55 2,03 1,09

Y218S: 421 1674,47 1531,03 1573,00 1,09 1,06

F223E: 422 5837,16 2747,99 4955,08 2,12 1,18

V227C: 433 1138,96 684,05 722,68 1,67 1,58

V227E: 430 5892,76 653,81 803,12 9,01 7,34

V227W: 437 716,50 607,92 646,75 1,18 1,11

Q228P: 439 676,11 488,99 495,88 1,38 1,36

L229T: 440 768,59 492,66 491,49 1,56 1,56

L229I: 441 1470,04 753,87 1231,17 1,95 1,19

D233E: 443 1195,07 959,25 1056,45 1,25 1,13

I234A: 447 1402,15 1014,61 1127,63 1,38 1,24

I234T: 446 857,79 644,52 712,49 1,33 1,20

I234E: 444 2281,82 591,10 762,52 3,86 2,99

I240S: 449 2678,36 776,88 1314,40 3,45 2,04

I240C: 448 1540,91 474,82 666,63 3,25 2,31

Tabla 24B. Mutantes de hMMP-1 sensibles a la temperatura, 2 horas de incubación

Mutación de hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 34°C UFR 37°C Razón 25°C/34°C Razón 25°C/37°C

L95K: 328 4650,42 748,29 746,89 6,21 6,23

D105A: 340 5669,31 824,07 1336,14 6,88 4,24

D105F: 336 2980,00 623,89 818,63 4,78 3,64

D105G: 335 8821,81 2759,24 4313,40 3,20 2,05

D105I: 338 6832,34 780,32 1110,07 8,76 6,15

D105L: 339 4206,38 534,24 607,46 7,87 6,92

D105N: 332 8920,05 918,13 1727,44 9,72 5,16

D105R: 331 2821,20 722,46 813,68 3,90 3,47

D105S: 334 9355,63 4607,18 7274,97 2,03 1,29

D105W: 337 6663,80 1690,93 3081,59 3,94 2,16

D105T: 333 4457,16 974,63 2220,03 4,57 2,01

R150P: 345 8750,30 2315,11 2497,86 3,78 3,50

D151G: 346 1264,62 589,27 616,51 2,15 2,05

F155A: 348 2824,01 779,72 746,59 3,62 3,78

D156K: 350 8576,47 2210,63 2310,30 3,88 3,71

D156T: 352 8727,27 2679,17 2752,35 3,26 3,17

D156L: 356 2916,24 576,84 688,08 5,06 4,24

D156A: 357 2299,63 533,68 554,21 4,31 4,15

D156W: 354 1502,86 539,74 575,12 2,78 2,61

D156V: 355 1593,06 534,71 542,36 2,98 2,94

D156T: 352 4469,68 690,87 848,14 6,47 5,27

D156H: 349 5387,79 698,77 819,82 7,71 6,57

D156R: 351 7020,81 793,83 872,40 8,84 8,05

G159V: 363 4673,44 856,78 838,46 5,45 5,57

G159T: 359 6704,95 2294,40 2347,74 2,92 2,86

A176F: 365 1609,85 654,43 618,72 2,46 2,60

D179N: 368 5660,69 644,51 656,31 8,78 8,63

E180Y: 374 8557,09 4979,24 6079,36 1,72 1,41

E180T: 373 7870,99 1532,35 1794,15 5,14 4,39

E180F: 377 8508,13 3597,75 3975,22 2,36 2,14

D181L: 382 2710,97 619,39 611,92 4,38 4,43

D181K: 378 1130,63 625,01 608,68 1,81 1,86

E182T: 384 3702,08 791,23 826,28 4,68 4,48

E182Q: 383 1331,50 639,84 623,11 2,08 2,14

T185R: 390 2637,31 1187,63 1183,37 2,22 2,23

T185H: 389 5593,77 2278,26 2534,15 2,46 2,21

T185Q: 391 7006,87 2250,58 2642,74 3,11 2,65

T185A: 395 2474,96 663,82 707,09 3,73 3,50

T185E: 388 3948,43 2088,15 2091,32 1,89 1,89

N187R: 398 3006,08 1352,97 1421,87 2,22 2,11

N187M: 402 4934,44 1811,35 1893,07 2,72 2,61

N187F: 401 3227,96 877,21 931,04 3,68 3,47

N187K: 397 4182,49 2425,34 2652,79 1,72 1,58

N187I: 404 4218,55 849,11 887,80 4,97 4,75

R195V: 411 4847,81 2724,92 2984,10 1,78 1,62

A198L: 416 6756,76 2056,50 2642,76 3,29 2,56

A198M: 415 3777,50 1708,61 2155,58 2,21 1,75

G206A: 418 872,27 603,01 586,57 1,45 1,49

G206S: 417 932,69 492,65 463,60 1,89 2,01

S210V: 419 3349,95 1249,47 2314,86 2,68 1,45

Y218S: 421 2878,50 2373,98 2350,27 1,21 1,22

F223E: 422 8318,70 3685,68 6209,93 2,26 1,34

V227C: 433 1998,67 950,01 992,19 2,10 2,01

V227E: 430 7904,54 839,00 1015,12 9,42 7,79

V227W: 437 996,55 729,20 787,87 1,37 1,26

Q228P: 439 1082,56 607,78 586,63 1,78 1,85

L229T: 440 1221,05 580,15 564,49 2,10 2,16

L229I: 441 2790,27 1050,86 1803,44 2,66 1,55

D233E: 443 2195,02 1393,95 1454,71 1,57 1,51

I234A: 447 2375,42 1473,70 1594,08 1,61 1,49

I234T: 446 1199,18 713,83 796,81 1,68 1,50

I234E: 444 3920,02 705,86 923,57 5,55 4,24

I240S: 449 3867,71 973,97 1575,05 3,97 2,46

I240C: 448 2688,75 561,91 853,66 4,78 3,15

Tabla 24C. Mutantes de hMPM-1 Sensibles a la Temperatura, Incubación durante la noche

L95K: 328 7744,34 1803,12 1677,96 4,29 4,62

D105A: 340 8466,62 1302,84 1931,17 6,50 4,38

D105F: 336 6725,59 938,60 1173,23 7,17 5,73

D105G: 335 8940,06 3560,75 5390,32 2,51 1,66

D105I: 338 8394,32 1614,57 1958,96 5,20 4,29

D105L: 339 6546,78 957,95 1070,51 6,83 6,12

D105N: 332 9119,04 1459,16 2347,74 6,25 3,88

D105R: 331 5775,25 1407,06 1499,57 4,10 3,85

D105S: 334 9300,85 5584,70 8234,95 1,67 1,13

D105W: 337 8617,36 2851,22 4593,06 3,02 1,88

D105T: 333 7910,47 1899,25 3292,01 4,17 2,40

R150P: 345 9011,11 3533,16 3559,66 2,55 2,53

D151G: 346 1956,65 959,80 1097,68 2,04 1,78

F155A: 348 4891,89 2016,76 1843,31 2,43 2,65

D156K: 350 8696,27 3968,92 3858,90 2,19 2,25

D156T: 352 8972,20 3971,43 3854,84 2,26 2,33

D156L: 356 5254,55 972,64 1232,94 5,40 4,26

D156A: 357 3585,37 1098,25 1110,73 3,26 3,23

D156W: 354 2570,24 1091,27 1206,22 2,36 2,13

D156V: 355 2208,99 954,21 997,64 2,31 2,21

D156T: 352 7229,28 1256,02 1540,11 5,76 4,69

D156H: 349 7587,19 1451,49 1763,27 5,23 4,30

D156R: 351 8622,23 1735,02 1846,71 4,97 4,67

G159V: 363 6555,27 1821,53 1683,20 3,60 3,89

G159T: 359 9105,95 3210,57 3160,07 2,84 2,88

A176F: 365 4191,69 1414,21 1336,32 2,96 3,14

D179N: 368 7317,57 1504,84 1485,28 4,86 4,93

E180Y: 374 9281,77 6080,89 6894,61 1,53 1,35

E180T: 373 8475,04 2585,89 2809,15 3,28 3,02

E180F: 377 9360,74 5183,25 5335,15 1,81 1,75

D181L: 382 4534,34 1078,98 1000,80 4,20 4,53

D181K: 378 1869,47 946,27 928,55 1,98 2,01

E182T: 384 6752,25 1483,52 1496,55 4,55 4,51

E182Q: 383 2212,75 1065,07 1035,24 2,08 2,14

T185R: 390 6281,97 2425,71 2300,61 2,59 2,73

T185H: 389 8531,85 3164,69 3515,59 2,70 2,43

T185Q: 391 9044,23 3639,00 4012,93 2,49 2,25

T185A: 395 6156,97 1110,68 1059,61 5,54 5,81

T185E: 388 8479,18 3868,06 3892,33 2,19 2,18

N187R: 398 7593,11 2415,63 2370,01 3,14 3,20

N187M: 402 8605,76 2769,52 2720,28 3,11 3,16

N187F: 401 7352,85 1612,23 1704,23 4,56 4,31

N187K: 397 8667,36 3458,94 3709,62 2,51 2,34

N187I: 404 8306,40 1459,25 1465,77 5,69 5,67

R195V: 411 8634,05 4648,03 4960,91 1,86 1,74

A198L: 416 8795,36 3469,36 4181,78 2,54 2,10

A198M: 415 8352,73 3215,69 3637,79 2,60 2,30

G206A: 418 2492,53 1038,14 974,96 2,40 2,56

G206S: 417 2845,84 908,82 808,42 3,13 3,52

S210V: 419 7104,17 2441,96 3939,90 2,91 1,80

Y218S: 421 7740,61 4057,37 4093,29 1,91 1,89

F223E: 422 9650,44 4849,58 7645,34 1,99 1,26

V227C: 433 5833,84 2207,20 2432,82 2,64 2,40

V227E: 430 8630,90 2283,07 2152,81 3,78 4,01

V227W: 437 3070,92 1370,13 1456,45 2,24 2,11

Q228P: 439 3673,33 1162,95 1081,32 3,16 3,40

L229T: 440 3543,75 1103,34 1030,05 3,21 3,44

L229I: 441 7333,92 1832,18 3268,93 4,00 2,24

D233E: 443 6694,93 2570,71 2661,43 2,60 2,52

I234A: 447 6250,56 3890,90 4043,80 1,61 1,55

I234T: 446 3507,08 1099,58 1228,23 3,19 2,86

I234E: 444 7541,73 1365,08 1901,96 5,52 3,97

I240S: 449 4376,99 2108,15 2592,19 2,08 1,69

I240C: 448 6170,51 1174,96 2223,23 5,25 2,78

La Tabla 25 a continuación muestra la actividad residual (la razón de UFR de hMPM-1 mutante/UFR de hMPM-1 wt) de los mutantes de hMPM-1 después de la incubación durante la noche con el péptido fluorescente. La actividad de los mutantes a 25°C, 34°C, o 37°C se comparó con la actividad de hMPM-1 de tipo salvaje a las respectivas

5 temperaturas. A 25°C, cinco hMPM-1 mutantes (E180F, E180Y, D156T, D156K, R150P) eran más activos que hMPM-1 de tipo salvaje como se indica por una actividad residual > 1. A temperaturas elevadas, todos los mutantes de hMPM-1 mostraron una disminución general de la actividad en comparación con las hMPM-1 de tipo salvaje a la misma temperatura, lo que confirma el fenotipo de los mutantes de hMPM-1 como mutantes sensibles a la temperatura.

10

Tabla 25. Actividad Residual de Mutantes de hMPM-1 Sensibles a la Temperatura, incubación durante la noche

Mutación hMPM-1: SEQ ID NO Actividad Residual a 25°C Actividad Residual a 34°C Actividad residual a 37°C

L95K: 328 0,80 0,20 0,20

D105A: 340 0,93 0,15 0,22

D105F: 336 0,74 0,11 0,13

D105G: 335 0,99 0,42 0,60

D105I: 338 0,93 0,19 0,22

D105L: 339 0,72 0,11 0,12

D105N: 332 1,01 0,17 0,26

D105R: 331 0,64 0,16 0,17

D105S: 334 1,03 0,65 0,92

D105W: 337 0,95 0,33 0,51

D105T: 333 0,87 0,22 0,37

R150P: 345 0,99 0,41 0,44

D151G: 346 0,22 0,11 0,12

F155A: 348 0,51 0,22 0,22

imagen308

F223E: 422 1,07 0,57 0,86

V227C: 433 0,64 0,26 0,27

V227E: 430 0,95 0,27 0,24

V227W: 437 0,34 0,16 0,16

Q228P: 439 0,38 0,13 0,13

L229T: 440 0,37 0,12 0,12

L229I: 441 0,76 0,20 0,38

D233E: 443 0,69 0,28 0,31

I234A: 447 0,69 0,45 0,45

I234T: 446 0,39 0,13 0,14

I234E: 444 0,83 0,16 0,21

I240S: 449 0,48 0,25 0,29

I240C: 448 0,68 0,14 0,25

C. Mayores éxitos de mutantes de hMPM-1:

Se identificaron 14 posiciones en las posiciones de mayor éxito: 95, 105, 150, 156, 159, 179, 180, 182, 185, 187,

5 198, 227, 234 y 240. Se seleccionaron 23 mutantes de hMPM-1 en 14 posiciones como los mayores éxitos basándose en dos criterios, incluyendo: 1) la razón de las actividades (25°C a 37°C y 25°C a 34°C); y 2) la actividad (en UFR). Todos los mutantes enumerados en la Tabla 26 a continuación tenían una actividad superior a 2.000 yuna razón de 25°C a 37°C mayor que 2. Los once Éxitos identificados con ** son los Éxitos clasificados más arriba tanto para la razón o las actividades como para el nivel de actividad, y se utilizaron para desarrollar una biblioteca

10 combinatoria como se describe en el Ejemplo 29.

Tabla 26: Mayores Éxitos

L95K**: D105I D105N** D105L

D105A: D105G R150P** D156R

D156H: D156K** D156T** G159V**

G159T: D179N** E180T** E180F

E182T: T185Q N187I A198L**

V227E**: I234E I240S** imagen309

Ejemplo 29

15 Biblioteca combinatoria de variantes de hMPM-1

En este ejemplo, se generó una biblioteca combinatoria de variantes de hMPM-1 a partir de los mutantes seleccionados en el Ejemplo 28C y se muestra en la Tabla 26 con un doble asterisco (**). Los mutantes en las posiciones 182, 185 y 187 fueron excluidos en la generación de la biblioteca combinatoria debido a la importancia de 20 estas posiciones para la actividad catalítica de hMPM-1. La biblioteca contenía todas las combinaciones posibles de aminoácidos variantes para cada uno de los mutantes seleccionados. La Tabla 27 representa todas las combinaciones de mutantes contenidas en la biblioteca. Las posiciones indicadas son con respecto a las posiciones correspondientes a los residuos de aminoácidos de hMPM-1 expuestos en el SEC ID NO: 327. Cada fila y columna indica un polipéptido que contiene las mutaciones indicadas. Por ejemplo, 156K 179N 227E, se refiere a un 25 polipéptido que contiene tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones expuestas en el SEC ID NO: 327: D por K en la posición 156, D por N en la posición 179 y V por E en la posición

227. La biblioteca se generó y se expresó como se describe en el Ejemplo 27.

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Tabla 29. Mutantes de hMPM-1 parcialmente reversibles (2 Horas, 34°C)

Mutación de hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 34°C UFR 3425°C Razón 25°C/34°C Razón 25°C/34 a 25°C

G159T: 359 6704,95 2294,40 2344,57 2,92 2,86

E180Y: 374 8557,09 4979,24 6224,87 1,72 1,37

E180T: 373 7870,99 1532,35 1852,46 5,14 4,25

E180F: 377 8508,13 3597,75 3915,71 2,36 2,17

T185H: 389 5593,77 2278,26 2429,05 2,46 2,30

T185Q: 391 7006,87 2250,58 2397,60 3,11 2,92

T185A: 395 2474,96 663,82 822,83 3,73 3,01

T185E: 388 3948,43 2088,15 1862,83 1,89 2,12

N187R: 398 3006,08 1352,97 1343,94 2,22 2,24

N187M: 402 4934,44 1811,35 1793,14 2,72 2,75

N187K: 397 4182,49 2425,34 2415,57 1,72 1,73

R195V: 411 4847,81 2724,92 2517,49 1,78 1,93

A198L: 416 6756,76 2056,50 2046,15 3,29 3,30

A198M: 415 3777,50 1708,61 1725,14 2,21 2,19

S210V: 419 3349,95 1249,47 1622,57 2,68 2,06

Y218S: 421 2878,50 2373,98 2187,48 1,21 1,32

F223E: 422 8318,70 3685,68 5283,08 2,26 1,57

V227W: 437 996,55 729,20 834,38 1,37 1,19

L229I: 441 2790,27 1050,86 1738,46 2,66 1,61

I240C: 448 2688,75 561,91 884,15 4,78 3,04

Tabla 30. Mutantes de hMPM-1 parcialmente reversibles (2 Horas, 37°C)

Mutación hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 37°C UFR 3725°C Razón 25°C/37°C Razón 25°C/37 a 25°C

D105A: 340 5669,31 1336,14 1509,52 4,24 3,76

D105F: 336 2980,00 818,63 1004,23 3,64 2,97

D105G: 335 8821,81 4313,40 4643,53 2,05 1,90

D105S: 334 9355,63 7274,97 7453,42 1,29 1,26

D105T: 333 4457,16 2220,03 2177,84 2,01 2,05

R150P: 345 8750,30 2497,86 3115,73 3,50 2,81

G159T: 359 6704,95 2347,74 2530,78 2,86 2,65

E180Y: 374 8557,09 6079,36 6421,56 1,41 1,33

E180T: 373 7870,99 1794,15 1824,99 4,39 4,31

E180F: 377 8508,13 3975,22 3981,79 2,14 2,14

T185H: 389 5593,77 2534,15 2693,25 2,21 2,08

T185Q: 391 7006,87 2642,74 2589,77 2,65 2,71

T185A: 395 2474,96 707,09 730,58 3,50 3,39

T185E: 388 3948,43 2091,32 2106,55 1,89 1,87

Tabla 30. Mutantes de hMPM-1 parcialmente reversibles (2 Horas, 37°C)

N187R: 398 3006,08 1421,87 1476,42 2,11 2,04

N187M: 402 4934,44 1893,07 1998,97 2,61 2,47

N187K: 397 4182,49 2652,79 2902,79 1,58 1,44

R195V: 411 4847,81 2984,10 3555,03 1,62 1,36

A198L: 416 6756,76 2642,76 2540,07 2,56 2,66

A198M: 415 3777,50 2155,58 2802,78 1,75 1,35

S210V: 419 3349,95 2314,86 2277,32 1,45 1,47

Y218S: 421 2878,50 2350,27 2383,67 1,22 1,21

F223E: 422 8318,70 6209,93 7415,02 1,34 1,12

V227W: 437 996,55 787,87 850,67 1,26 1,17

L229I: 441 2790,27 1803,44 2453,07 1,55 1,14

I240C: 448 2688,75 853,66 872,62 3,15 3,08

Tabla 31. Mutantes de hMPM-1 parcialmente reversibles (durante la noche, 34°C)

D105A: 340 8466,62 1302,84 1532,38 6,50 5,53

D105F: 336 6725,59 938,60 1172,86 7,17 5,73

D105G: 335 8940,06 3560,75 5314,44 2,51 1,68

D105S: 334 9300,85 5584,70 9413,56 1,67 0,99

D105T: 333 7910,47 1899,25 3254,16 4,17 2,43

R150P: 345 9011,11 3533,16 4443,96 2,55 2,03

G159T: 359 9105,95 3210,57 4179,05 2,84 2,18

E180Y: 374 9281,77 6080,89 8570,48 1,53 1,08

E180T: 373 8475,04 2585,89 3901,87 3,28 2,17

E180F: 377 9360,74 5183,25 7022,64 1,81 1,33

T185H: 389 8531,85 3164,69 5520,76 2,70 1,55

T185Q: 391 9044,23 3639,00 5467,27 2,49 1,65

T185A: 395 6156,97 1110,68 1585,53 5,54 3,88

T185E: 388 8479,18 3868,06 4836,97 2,19 1,75

N187R: 398 7593,11 2415,63 3156,74 3,14 2,41

N187M: 402 8605,76 2769,52 4008,68 3,11 2,15

N187K: 397 8667,36 3458,94 5465,35 2,51 1,59

R195V: 411 8634,05 4648,03 5966,81 1,86 1,45

A198L: 416 8795,36 3469,36 5027,30 2,54 1,75

A198M: 415 8352,73 3215,69 4220,51 2,60 1,98

S210V: 419 7104,17 2441,96 3664,23 2,91 1,94

Y218S: 421 7740,61 4057,37 5769,79 1,91 1,34

F223E: 422 9650,44 4849,58 9311,40 1,99 1,04

V227W: 437 3070,92 1370,13 1632,51 2,24 1,88

L229I: 441 7333,92 1832,18 4427,24 4,00 1,66

I240C: 448 6170,51 1174,96 2389,06 5,25 2,58

Tabla 32. Mutantes de hMPM1 parcialmente reversibles (Durante la noche, 37°C)

Mutación de hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 37°C UFR 37 a 25°C Razón 25°C/ 37°C Razón 25°C/ 37 a 25°C

D105A: 340 8466,62 1931,17 2589,08 4,38 3,27

D105F: 336 6725,59 1173,23 1759,31 5,73 3,82

D105G: 335 8940,06 5390,32 7139,57 1,66 1,25

D105S: 334 9300,85 8234,95 8615,33 1,13 1,08

D105T: 333 7910,47 3292,01 4482,74 2,40 1,76

R150P: 345 9011,11 3559,66 5181,30 2,53 1,74

G159T: 359 9105,95 3160,07 4338,35 2,88 2,10

E180Y: 374 9281,77 6894,61 8986,47 1,35 1,03

E180T: 373 8475,04 2809,15 3649,72 3,02 2,32

E180F: 377 9360,74 5335,15 7183,36 1,75 1,30

T185H: 389 8531,85 3515,59 6101,91 2,43 1,40

T185Q: 391 9044,23 4012,93 5623,60 2,25 1,61

T185A: 395 6156,97 1059,61 1315,46 5,81 4,68

T185E: 388 8479,18 3892,33 5330,81 2,18 1,59

N187R: 398 7593,11 2370,01 3425,18 3,20 2,22

N187M: 402 8605,76 2720,28 4400,27 3,16 1,96

N187K: 397 8667,36 3709,62 6374,32 2,34 1,36

R195V: 411 8634,05 4960,91 7212,05 1,74 1,20

A198L: 416 8795,36 4181,78 5395,22 2,10 1,63

A198M: 415 8352,73 3637,79 5914,49 2,30 1,41

S210V: 419 7104,17 3939,90 4626,58 1,80 1,54

Y218S: 421 7740,61 4093,29 6181,92 1,89 1,25

F223E: 422 9650,44 7645,34 9149,09 1,26 1,05

V227W: 437 3070,92 1456,45 1695,81 2,11 1,81

L229I: 441 7333,92 3268,93 5729,00 2,24 1,28

I240C: 448 6170,51 2223,23 2050,31 2,78 3,01

C. Resultados: Mutantes de hMPM-1 non reversibles

Se determinó que 38 mutantes de hMMP-1 no eran reversibles. La actividad de estos mutantes a 34°C o 37°C, que se redujo en comparación con la actividad a 25°C, se mantuvo reducida cuando se bajaron a 25°C. Los resultados se muestran en las Tablas 33-36 a continuación, que enumeran las actividades (en UFR) y las razones de las actividades. Las Tablas 33 y 34 resumen los resultados a 34°C o 37°C, respectivamente, de los mutantes de hMMP1 irreversibles bajo la condición de dos horas. Las Tablas 35 y 36 resumen los resultados de la reversibilidad a 34°C

o 37°C, respectivamente, de los mutantes de hMMP-1 irreversibles bajo la condición de durante la noche. Los resultados son similares en todas las condiciones de reacción, temperatura y tiempo. La actividad a 34°C o 37°C durante la noche es la misma o similar a la actividad cuando se incuba a 34°C o 37°C durante una hora y a continuación a 25°C durante la noche. Por ejemplo, la actividad de D105R a 34°C es de 1407 UFR y su actividad a 34°C durante la noche a 25°C es de 1424 UFR (véase la Tabla 35, más abajo).

Tabla 33. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (2 Horas, 34°C)

Mutación de hMPM1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 34°C UFR 34 a 25°C Razón 25°C/ 34°C Razón 25°C/ 34 a 25°C

L95K: 328 4650,42 748,29 833,29 6,21 5,58

D105I: 338 6832,34 780,32 908,39 8,76 7,52

D105L: 339 4206,38 534,24 630,66 7,87 6,67

D105N: 332 8920,05 918,13 1128,03 9,72 7,91

D105R: 331 2821,20 722,46 843,19 3,90 3,35

D105W: 337 6663,80 1690,93 2266,26 3,94 2,94

D151G: 346 1264,62 589,27 664,86 2,15 1,90

F155A: 348 2824,01 779,72 735,02 3,62 3,84

D156K: 350 8576,47 2210,63 2318,28 3,88 3,70

D156T: 352 8727,27 2679,17 2770,95 3,26 3,15

D156L: 356 2916,24 576,84 655,46 5,06 4,45

D156A: 357 2299,63 533,68 635,67 4,31 3,62

D156W: 354 1502,86 539,74 637,12 2,78 2,36

D156V: 355 1593,06 534,71 634,83 2,98 2,51

D156H: 349 5387,79 698,77 784,55 7,71 6,87

D156R: 351 7020,81 793,83 881,39 8,84 7,97

G159V: 363 4673,44 856,78 789,92 5,45 5,92

A176F: 365 1609,85 654,43 633,13 2,46 2,54

D179N: 368 5660,69 644,51 644,98 8,78 8,78

D181L: 382 2710,97 619,39 645,65 4,38 4,20

D181K: 378 1130,63 625,01 609,58 1,81 1,85

E182T: 384 3702,08 791,23 805,48 4,68 4,60

E182Q: 383 1331,50 639,84 623,88 2,08 2,13

T185R: 390 2637,31 1187,63 1158,47 2,22 2,28

N187F: 401 3227,96 877,21 823,16 3,68 3,92

N187I: 404 4218,55 849,11 869,19 4,97 4,85

G206A: 418 872,27 603,01 592,13 1,45 1,47

G206S: 417 932,69 492,65 507,75 1,89 1,84

V227C: 433 1998,67 950,01 1115,17 2,10 1,79

V227E: 430 7904,54 839,00 906,06 9,42 8,72

Q228P: 439 1082,56 607,78 617,33 1,78 1,75

L229T: 440 1221,05 580,15 605,83 2,10 2,02

D233E: 443 2195,02 1393,95 1332,07 1,57 1,65

Tabla 33. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (2 Horas, 34°C)

I234A: 447 2375,42 1473,70 1456,58 1,61 1,63

I234T: 446 1199,18 713,83 775,40 1,68 1,55

I234E: 444 3920,02 705,86 829,15 5,55 4,73

I240S: 449 3867,71 973,97 1027,84 3,97 3,76

Tabla 34. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (2 Horas, 37°C)

Mutación de hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 37°C UFR 37 a 25°C Razón 25°C/ 37°C Razón 25°C/37 a 25°C

L95K: 328 4650,42 746,89 1092,61 6,23 4,26

D105I: 338 6832,34 1110,07 1104,96 6,15 6,18

D105L: 339 4206,38 607,46 624,88 6,92 6,73

D105N: 332 8920,05 1727,44 1820,97 5,16 4,90

D105R: 331 2821,20 813,68 846,09 3,47 3,33

D105W: 337 6663,80 3081,59 3123,49 2,16 2,13

D151G: 346 1264,62 616,51 628,65 2,05 2,01

F155A: 348 2824,01 746,59 867,76 3,78 3,25

D156K: 350 8576,47 2310,30 2080,22 3,71 4,12

D156T: 352 8727,27 2752,35 2251,21 3,17 3,88

D156L: 356 2916,24 688,08 652,06 4,24 4,47

D156A: 357 2299,63 554,21 606,45 4,15 3,79

D156W: 354 1502,86 575,12 582,43 2,61 2,58

D156V: 355 1593,06 542,36 544,49 2,94 2,93

D156H: 349 5387,79 819,82 881,23 6,57 6,11

D156R: 351 7020,81 872,40 944,17 8,05 7,44

G159V: 363 4673,44 838,46 932,14 5,57 5,01

A176F: 365 1609,85 618,72 741,21 2,60 2,17

D179N: 368 5660,69 656,31 636,18 8,63 8,90

D181L: 382 2710,97 611,92 668,31 4,43 4,06

D181K: 378 1130,63 608,68 646,77 1,86 1,75

E182T: 384 3702,08 826,28 746,25 4,48 4,96

E182Q: 383 1331,50 623,11 629,01 2,14 2,12

T185R: 390 2637,31 1183,37 1158,87 2,23 2,28

N187F: 401 3227,96 931,04 856,03 3,47 3,77

N187I: 404 4218,55 887,80 879,78 4,75 4,80

G206A: 418 872,27 586,57 654,37 1,49 1,33

G206S: 417 932,69 463,60 552,97 2,01 1,69

V227C: 433 1998,67 992,19 1130,51 2,01 1,77

V227E: 430 7904,54 1015,12 1127,74 7,79 7,01

Tabla 34. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (2 Horas, 37°C)

Q228P: 439 1082,56 586,63 777,28 1,85 1,39

L229T: 440 1221,05 564,49 747,87 2,16 1,63

D233E: 443 2195,02 1454,71 1976,42 1,51 1,11

I234A: 447 2375,42 1594,08 1460,23 1,49 1,63

I234T: 446 1199,18 796,81 833,55 1,50 1,44

I234E: 444 3920,02 923,57 867,78 4,24 4,52

I240S: 449 3867,71 1575,05 1594,10 2,46 2,43

Tabla 35. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (Durante la noche, 34°C)

Mutación de hMPM-1: SEQ ID NO UFR 25°C UFR 34°C UFR 34 a 25°C Razón 25°C/ 34°C Razón 25°C/ 34 a 25°C

L95K: 328 7744,34 1803,12 1892,59 4,29 4,09

D105I: 338 8394,32 1614,57 1736,52 5,20 4,83

D105L: 339 6546,78 957,95 988,23 6,83 6,62

D105N: 332 9119,04 1459,16 1822,40 6,25 5,00

D105R: 331 5775,25 1407,06 1424,59 4,10 4,05

D105W: 337 8617,36 2851,22 4709,94 3,02 1,83

D151G: 346 1956,65 959,80 1013,03 2,04 1,93

F155A: 348 4891,89 2016,76 1493,70 2,43 3,28

D156K: 350 8696,27 3968,92 4371,25 2,19 1,99

D156T: 352 8972,20 3971,43 4480,62 2,26 2,00

D156L: 356 5254,55 972,64 1011,27 5,40 5,20

D156A: 357 3585,37 1098,25 1057,84 3,26 3,39

D156W: 354 2570,24 1091,27 1126,01 2,36 2,28

D156V: 355 2208,99 954,21 954,54 2,31 2,31

D156H: 349 7587,19 1451,49 1440,25 5,23 5,27

D156R: 351 8622,23 1735,02 1760,60 4,97 4,90

G159V: 363 6555,27 1821,53 1524,05 3,60 4,30

A176F: 365 4191,69 1414,21 1181,99 2,96 3,55

D179N: 368 7317,57 1504,84 1458,70 4,86 5,02

D181L: 382 4534,34 1078,98 984,43 4,20 4,61

D181K: 378 1869,47 946,27 841,77 1,98 2,22

E182T: 384 6752,25 1483,52 1570,77 4,55 4,30

E182Q: 383 2212,75 1065,07 929,49 2,08 2,38

T185R: 390 6281,97 2425,71 2808,30 2,59 2,24

N187F: 401 7352,85 1612,23 1533,32 4,56 4,80

N187I: 404 8306,40 1459,25 1598,90 5,69 5,20

G206A: 418 2492,53 1038,14 906,63 2,40 2,75

Tabla 35. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (Durante la noche, 34°C)

G206S: 417 2845,84 908,82 816,00 3,13 3,49

V227C: 433 5833,84 2207,20 2739,65 2,64 2,13

V227E: 430 8630,90 2283,07 2096,30 3,78 4,12

Q228P: 439 3673,33 1162,95 1213,48 3,16 3,03

L229T: 440 3543,75 1103,34 1105,90 3,21 3,20

D233E: 443 6694,93 2570,71 3171,20 2,60 2,11

I234A: 447 6250,56 3890,90 3608,10 1,61 1,73

I234T: 446 3507,08 1099,58 1194,99 3,19 2,93

I234E: 444 7541,73 1365,08 1817,16 5,52 4,15

I240S: 449 4376,99 2108,15 2290,56 2,08 1,91

Tabla 36. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (Durante la noche, 37°C)

L95K: 328 7744,34 1677,96 2463,18 4,62 3,14

D105I: 338 8394,32 1958,96 1925,73 4,29 4,36

D105L: 339 6546,78 1070,51 939,53 6,12 6,97

D105N: 332 9119,04 2347,74 2813,87 3,88 3,24

D105R: 331 5775,25 1499,57 1312,01 3,85 4,40

D105W: 337 8617,36 4593,06 5698,08 1,88 1,51

D151G: 346 1956,65 1097,68 900,59 1,78 2,17

F155A: 348 4891,89 1843,31 1882,95 2,65 2,60

D156K: 350 8696,27 3858,90 4126,13 2,25 2,11

D156T: 352 8972,20 3854,84 3990,29 2,33 2,25

D156L: 356 5254,55 1232,94 1008,08 4,26 5,21

D156A: 357 3585,37 1110,73 940,62 3,23 3,81

D156W: 354 2570,24 1206,22 997,15 2,13 2,58

D156V: 355 2208,99 997,64 777,35 2,21 2,84

D156H: 349 7587,19 1763,27 1536,01 4,30 4,94

D156R: 351 8622,23 1846,71 1764,13 4,67 4,89

G159V: 363 6555,27 1683,20 1842,91 3,89 3,56

A176F: 365 4191,69 1336,32 1553,01 3,14 2,70

D179N: 368 7317,57 1485,28 1378,59 4,93 5,31

D181L: 382 4534,34 1000,80 1020,08 4,53 4,45

D181K: 378 1869,47 928,55 895,45 2,01 2,09

E182T: 384 6752,25 1496,55 1319,53 4,51 5,12

E182Q: 383 2212,75 1035,24 916,32 2,14 2,41

T185R: 390 6281,97 2300,61 2829,34 2,73 2,22

Tabla 36. Mutantes de hMPM-1 no reversibles (Durante la noche, 37°C)

N187F: 401 7352,85 1704,23 1533,08 4,31 4,80

N187I: 404 8306,40 1465,77 1560,83 5,67 5,32

G206A: 418 2492,53 974,96 1057,32 2,56 2,36

G206S: 417 2845,84 808,42 908,44 3,52 3,13

V227C: 433 5833,84 2432,82 2707,71 2,40 2,15

V227E: 430 8630,90 2152,81 2615,26 4,01 3,30

Q228P: 439 3673,33 1081,32 1681,57 3,40 2,18

L229T: 440 3543,75 1030,05 1488,58 3,44 2,38

D233E: 443 6694,93 2661,43 4531,45 2,52 1,48

I234A: 447 6250,56 4043,80 3433,03 1,55 1,82

I234T: 446 3507,08 1228,23 1397,18 2,86 2,51

I234E: 444 7541,73 1901,96 1783,16 3,97 4,23

I240S: 449 4376,99 2592,19 3417,53 1,69 1,28

5

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Ejemplo 31

Actividad proteolítica de hMMP-1 sobre colágeno insoluble

En este ejemplo, se evaluó la actividad colagenasa de hMMP-1 para el colágeno sustrato de la proteína utilizando análisis de SDS-PAGE. La hMMP-1 de tipo salvaje escinde el colágeno insoluble (cadenas α1(I) y α2 (I)) en productos de la digestión de tres cuartos y un cuarto de longitud. En este análisis, se utilizó un colágeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) como sustrato y la reacción se controló mediante SDS-PAGE de los productos de reacción. La escisión de las cadenas de colágeno α1(I) y α2(I) da como resultado productos de la digestión de tres cuartos y un cuarto de longitud que son distinguibles del colágeno completo mediante separación en geles de poliacrilamida SDS. Alternativamente, la escisión se determinó mediante análisis fluorimétrico. Se puede utilizar un análisis similar para evaluar la actividad de las hMMP mutantes para determinar la actividad de escisión a 25°C frente a 34°C o 37°C.

A. Análisis SDS-PAGE

En resumen, se diluyeron 2 µg de hMMP-1 (adquirida de R & D Systems, Núm. 901-MP, o BAP006_2 y BAP006_10 purificada como se describe en el Ejemplo 27) en TCNB que contenía AMPA 1 mM y se incubaron a la temperatura de reacción (25°C o 37°C) durante 2 horas. Esta etapa de activación escinde el pro-péptido y genera hMMP-1 madura. Posteriormente, se añadieron 6 µg de colágeno insoluble conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Anaspec Núm. 851 11 o colágeno Sigma Núm. C4361) en 20 µl TCNB a cada alícuota de hMMP-1 activada y la mezcla se incubó a 25°C o 37°C durante 24 horas o 6 días.

La escisión del colágeno insoluble se observó mediante SDS/PAGE. La mezcla de reacción se separó en un gel de poliacrilamida SDS al 7,5% y se visualizó mediante tinción con colorante Azul de Coomassie. Los resultados de SDS/PAGE muestran que después de 24 horas de incubación a 25°C o 37°C, la hMMP-1 escindió parcialmente las cadenas de colágeno α1(I) y α2(I) a productos de la digestión de 3/4 y 1/4 de longitud para todas proteínas hMMP-1 sometidas a ensayo. Después de 6 días a 25°C, se observó la escisión completa en productos de la digestión 3/4 y 1/4 de longitud. Después de 6 días a 37°C, el colágeno se digirió por completo. Los productos de la digestión del colágeno de 3/4 y 1/4 de longitud son térmicamente inestables a la temperatura corporal.

B. Análisis Fluorimétrico

Alternativamente, se midió la actividad de colagenasa utilizando un ensayo de fluorescencia. Se diluyeron 5 µg de hMMP-1 (adquirida de R & D Systems, # 901-MP, o BAP006_2 y BAP006_10 purificada como se describe en el Ejemplo 27) en TCNB que contenía AMPA 1 mM a una concentración final y se incubó a 37°C durante 2 horas. La actividad de hMMP-1 para el colágeno marcado con FITC (Sigma Núm. C4361 o elastina Nú. CF308) se evaluó utilizando un protocolo adaptado de Baici A et al. (1980) Anal. Biochem., 108: 230-232). En resumen, la hMMP-1 se

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Claims

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