ES2577055T3 - Polipéptidos de factor VII que se modifican y usos de los mismos - Google Patents

Polipéptidos de factor VII que se modifican y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende una modificación en un polipéptido de FVII, donde: la modificación está en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en un resto correspondiente en un locus alineado en un polipéptido de FVII; la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con Arg (R); el polipéptido de FVII modificado, cuando se activa, muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII que no tiene la modificación en la posición 286; el polipéptido de FVII modificado comprende solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido no modificado y, opcionalmente, contiene un dominio Gla heterólogo o una parte del mismo; y el polipéptido de FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3.

Description

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DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de factor VII que se modifican y usos de los mismos
5 Campo de la invención
Se proporcionan proteínas terapéuticas modificadas. En particular se proporcionan polipéptidos del Factor VII modificados particulares, que incluyen el Factor VIIa y otras formas del Factor VII.
Antecedentes
La hemostasia es el proceso fisiológico complejo que conduce al cese del sangrado. Las plaquetas, las proteínas del plasma y los vasos sanguíneos y células endoteliales son los tres componentes de este proceso que desempeñan cada uno un papel importante en los acontecimientos que siguen inmediatamente a la lesión tisular y que, en
15 circunstancias normales, dan como resultado la rápida formación de un coágulo. Es central a esto la cascada de coagulación, una serie de acontecimientos proteolíticos en los que ciertas proteínas del plasma (o factores de coagulación) se activan secuencialmente en una “cascada” por otro factor de coagulación previamente activado, lo que conduce a la rápida generación de trombina. Las grandes cantidades de trombina producidas en esta cascada actúan después para escindir el fibrinógeno en los péptidos de fibrina que se requiere para formación de coágulos.
Los factores de coagulación circulan como zimógenos monocatenarios inactivos, y se activan por escisión en una o más posiciones para generar una forma activada bicatenaria de la proteína. El Factor VII (FVII), una proteína del plasma dependiente de vitamina K, circula inicialmente en la sangre como un zimógeno. El zimógeno de FVII se activa por escisión proteolítica en un único sitio, Arg152-Ile153, dando como resultado una proteasa bicatenaria ligada
25 a un único enlace disulfuro (FVIIa). FVIIa se une con su cofactor, el factor tisular (FT), para formar un complejo en el que FVIIa puede activar eficazmente el factor X (FX) a FXa, iniciando de este modo la serie de acontecimientos que dan como resultado la formación de fibrina y hemostasia.
Aunque se consigue hemostasia normal en la mayoría de los casos, los defectos en el proceso pueden conducir a trastornos hemorrágicos en los que se prolonga el tiempo que se tarda en la formación del coágulo. Dichos trastornos pueden ser congénitos o adquiridos. Por ejemplo, la hemofilia A y B son enfermedades heredadas caracterizadas por deficiencias en el factor VIII (FVIII) y el factor IX (FIX), respectivamente. La terapia de reemplazo es el tratamiento tradicional para la hemofilia A y B, e implica la administración intravenosa de FVIII o FIX, bien preparada a partir de plasma humano o bien como proteínas recombinantes. En muchos casos, sin embargo, los 35 pacientes desarrollan anticuerpos (también conocidos como inhibidores) contra las proteínas infundidas, que reduce
o niega la eficacia del tratamiento. Se ha aprobado FVIIa recombinante (Novoseven® (Factor VIIa de Coagulación (Recombinante))) para el tratamiento de pacientes de hemofilia A o B que tienen inhibidores para FVIII o FIX, y también se usa para detener episodios de sangrado o evitar el sangrado asociado con traumatismo y/o cirugía. El FVIIa recombinante también se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con deficiencia en FVII congénita, y se están utilizando crecientemente en usos extraoficiales, tales como el tratamiento de sangrado asociado con otros trastornos de sangrado congénitos o adquiridos, traumatismo, y cirugía en pacientes no hemofílicos.
El uso de FVIIa recombinante para promover la formación de coagulación subraya su importancia creciente como un agente terapéutico. La terapia con FVIIa deja necesidades médicas significativas no satisfechas. Por ejemplo,
45 basándose en los datos de ensayos clínicos, se requiere un promedio de tres dosis de FVIIa durante un periodo de tiempo de 6 horas o más para controlar episodios de hemorragia aguda en pacientes con hemofilia. Son necesarias variantes más eficaces de FVIIa para reducir estos requisitos. Por lo tanto, entre los objetos del presente documento, es un objeto proporcionar polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para tener propiedades terapéuticas mejoradas.
Bjelke et al. (A loop of coagulation factor VIIa influencing macromolecular substrate specificity. FEBS LETTERS, 2007, vol. 581, n.º. 1. páginas 71-76) describen un polipéptido quimérico FVII-FX modificado, designado FVIIaFXLOOP, en el que el bucle Gly283-Met298 de FVII se reemplaza con el bucle correspondiente del Factor X (FX) para introducir una lisina en la posición correspondiente a 298. El bucle introduce 12 reemplazos de
55 aminoácidos. En virtud de la introducción del bucle, el polipéptido quimérico contiene Q286R, que Bjelke et al. indica que es deletéreo. Para compensar la introducción de la mutación Q286R deletérea, así como otras, Bjelke et al. describe mutaciones de reparación adicionales fuera del bucle intercambiado en las posiciones 158, 176 y 341. El polipéptido quimérico FVII-FX contiene, por lo tanto, 15 remplazos de aminoácidos.
La solicitud de patente internacional WO2007/031559 que describe polipéptidos del Factor VII (FVII) modificados, enumera 40 posiciones en FVII que pueden reemplazarse e indica que cada posición enumerada puede reemplazarse con cualquier aminoácido.
El documento WO2007/031559, por lo tanto, proporciona miles de modificaciones posibles. El único polipéptido de
65 FVII con un reemplazo en 286 que se desvela en el documento WO2007/031559 es un polipéptido con el reemplazo Q286A, que el documento WO2007/031559 describe como no deseable.
imagen2
Sumario
La presente invención proporciona un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende una modificación en un polipéptido de FVII, donde:
5 la modificación están en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en un resto correspondiente en un locus alineado en un polipéptido de FVII;
la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con una Arg (R);
el polipéptido FVII modificado, cuando se activa, muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII que no tiene la modificación en la posición 286; el polipéptido FVII modificado comprende solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido no modificado y,
15 opcionalmente, contiene un dominio Gla heterólogo o una parte del mismo; y el polipéptido FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3.
Se proporciona en el presente documento polipéptidos del Factor VII (FVII) modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones. En particular, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividades procoagulantes. Los polipéptidos de FVII de acuerdo con las presentes reivindicaciones se modifican en secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Se describen además en el presente documento polipéptidos de FVII modificados incluyendo polipéptidos FVII que muestran los que tienen resistencia aumentada a inhibidores tales como antitrombina III (AT-III) e inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), los que 25 tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, los que tienen actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, los que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, los que tienen unión y/o afinidad aumentadas para la superficie de plaquetas, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y los que tienen unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener cualquier combinación de modificaciones descritas en el presente documento, por lo que una o más actividades o propiedades del polipéptido se alteran en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Típicamente, el polipéptido de FVII modificado conserva la actividad procoagulante. También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico, vectores y células que codifican/expresan polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Las composiciones farmacéuticas y polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las reivindicaciones para su
35 uso en métodos de tratamiento también se proporcionan en el presente documento. Los polipéptidos de FVII incluyen variantes alélicas y de especie y polipéptidos y otras variantes que tienen modificaciones que afectan a otras actividades y/o propiedades. También se describen fragmentos activos de los polipéptidos de FVII que incluyen una modificación proporcionada en el presente documento. Son ejemplos de polipéptidos de FVII los que incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, así como variantes de los mismos que tienen 60 %, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la misma.
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de factor VII (FVII) modificados que contienen una modificación en un polipéptido de FVII en la posición Q286 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de
45 aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. La modificación es un reemplazo de aminoácidos con Arg (R). La modificación puede realizarse en un polipéptido de FVII no modificado que contiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, o una variante alélilca o de especie de la misma.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento contienen un reemplazo de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en un resto correspondiente en un polipéptido de FVII, en el que la modificación es reemplazo en la posición 286 por el aminoácido básico Arg(R) que da como resultado un polipéptido de FVII modificado que muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII que no
55 tiene la modificación en la posición 286. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede contener un reemplazo de Gln (Q) con Arg (R) en la posición 286.
En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados tienen solamente la modificación individual en la posición
286. En otros ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados también contienen una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido de FVII. La modificación adicional puede ser un reemplazo, una inserción o una deleción de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación adicional puede ser un reemplazo de aminoácidos en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, A175, D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, L287, R290 A292, A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395
65 y R396. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E,
imagen3
G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, 5 L287T, M298Q, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Intercambio de Gla FIX, {Intercambio de Gla FIX/E40L}, {Intercambio de Gla FIX/K43I}, {Intercambio de Gla FIX/Q44S}, {Intercambio de Gla FIX/M19K}, {Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Intercambio de Gla FX, Intercambio de Gla Prot C, Intercambio de Gla Prot S, Intercambio de Gla Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S111delinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED,
15 T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICL-PRWGCLWED, P406insGGSDICLPRWGCLWED, S103S111delinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, E296V, M298K y M298Q.
Son ejemplos de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento los que contienen modificaciones Q286R/M298Q, Q286R/Intercambio de Gla FIX, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/H257A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/S222A/H257A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/M298Q/K341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Intercambio de Gla FIX, Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A294S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, 25 S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V, S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/H373A, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D, Q286R/Q366N, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R1M298Q, {Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q, Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R, Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A1S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/H373F/, 35 S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R, Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Intercambio de Gla FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/H373F, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R, Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Intercambio de Gla FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/H373F, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/H373F, Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q, Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q, Intercambio de Gla FIX/S222A/H257S/Q286R/, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R, A122N/G124S/A175S/Q286R, Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R, Intercambio de Gla
45 FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A75S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A75S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A75S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, {Intercambio de Gla FIX /K431}/T28N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q o T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.
55 Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones que contienen dos o más modificaciones en un polipéptido de FVII, variante alélica o de especie del mismo o fragmentos activos del mismo. Al menos una de las modificaciones en dichos polipéptidos está en una posición correspondiente a la posición Q286 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII, siempre que la modificación en la posición Q286, sola o en combinación con cualquier otra modificación, no dé como resultado la introducción de un nuevo sitio de glucosilación en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. La modificación es Q286R. La
o las otras modificaciones pueden seleccionarse de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E,
65 G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS,
imagen4
G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, 5 S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Intercambio de Gla FIX, {Intercambio de Gla FIX/E40L}, {Intercambio de Gla FIX/K43I}, {Intercambio de Gla FIX/Q44S}, {Intercambio de Gla FLX/M19K}, {Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Intercambio de Gla FX, Intercambio de Gla Prot C, Intercambio de Gla Prot S, Intercambio de Gla Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S111delinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED,
15 S103S111delinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T E296V, M298K y M298Q.
En algunos ejemplos descritos en el presente documento, los polipéptidos de FVII modificados contienen una modificación en una posición correspondiente P54, Q66, L121, A122, P129 o E132 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. Las modificaciones ejemplares incluyen P54S, Q66N, L121S, A122N, P129A y E132S. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación en una posición correspondiente P54, Q66, L121, A122, P129 o E132 también contienen una o más modificaciones adicionales, incluyendo reemplazos, inserciones o deleciones de aminoácidos en otra posición en el polipéptido de FVII. Dichas modificaciones incluyen
25 P54S, S52N, Y58S, S119N, G124S, T128N, T130N, V158D, A175S, S222A, G241S, E296V, M298Q, E394N, P395A, R396S, G318N y Q366V. Por lo tanto, son ejemplos de las modificaciones de combinación en un polipéptido de FVII descrito en el presente documento S119N/L121S, T128N/P129A, A122N/G124S, A122N/G124S/A175S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S, S119N/L121S/A175S, T128N/P129A/A175S, T130N/E132S, Q66N/Y68S, T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q, T128N/P129A/S222A, T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V, T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G124S/A175S/S222A, T128N/P129A/M298Q y T128N/P129A/M298Q/H373F.
También se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación
35 correspondiente a T239S, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366N, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161V, H216S, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E o H257S en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. Además, dichos polipéptidos de FVII modificados también pueden contener una o más modificaciones adicionales en otra posición, tal como la posición de aminoácido A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, A175, D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, Q286, L287, R290 A292, A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395 y R396. Las modificaciones ejemplares en estas posiciones incluyen Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E,
45 K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Intercambio de Gla FIX, Intercambio de Gla FX, Intercambio de Gla Prot C, Intercambio de Gla Prot S, Intercambio de Gla Trombina, Intercambio de Gla FIX, {Intercambio de Gla FIX/E40L}, {Intercambio de Gla FIX/K43I}, {Intercambio de Gla FIX/Q44S}, {Intercambio de Gla FIX/M19K}, {Intercambio de Gla
55 FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S111delinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S111delinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, M298K y M298Q. Las modificaciones de combinación resultantes pueden incluir Q366D/H373E, Q366V/H373V, Q366V/H373L,
65 Q366V/H373I, S222K/H257A, H216A/S222A, S222S/Intercambio de Gla FIX, S222A/H257A/Intercambio de Gla FIX, S222A/M298Q, S222A/H257A/M298Q, S222A/A292N/A294S/Q366V, A175S/S222A/Q366V, S222A/Q366V, H257S/Q366V, S222A/H373A, M298Q/H373F, S52A/S60A/S222A, S222A/T239V, V158D/T239V/E296V/M298Q, S222A/T239I, V158D/E296V/M298Q/H373F, Intercambio de Gla FIX/Q366V, M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F y T239I/M298Q/H373F.
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5 Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones en un polipéptido de FVII, variante alélicas y de especie del mismo o fragmentos activos del mismo, en el que las dos o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan de entre modificaciones de aminoácidos correspondientes a H216A, H257A, E394N, P395A, R396S, K109N, A292N, A175S, H257A e Intercambio de Gla FIX. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento incluyen los que tienen modificaciones seleccionadas de entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S y K109N/A175S. Además, también puede incluirse una modificación correspondiente a M298Q o A294S. Por lo tanto, también se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen modificaciones seleccionadas de entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S y K109N/A175S. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados también contienen una modificación correspondiente a M298Q o A294S. Esto puede dar como resultado, por ejemplo, un polipéptido de
15 FVII modificado que contiene las modificaciones H257A/M298Q o K109N/A292N/A294S. También se describen polipéptidos de FVII modificados que contienen modificaciones correspondientes a S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q o V158D/T239I/E296V/M298.
En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento contienen una secuencia de unión a albúmina de suero, tal como una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 103-109, o una parte suficiente de la misma para efectuar unión a albúmina de suero. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar afinidad por o unión con albúmina de suero aumentada en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a albúmina de suero pueden mostrar al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %,
25 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más afinidad por o unión con albúmina de suero aumentada. La secuencia de unión a albúmina de suero puede reemplazar una secuencia contigua de restos de aminoácidos del polipéptido de FVII no modificado. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a albúmina de suero pueden contener una modificación seleccionada de entre S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S1035111delinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S111delinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED y P406insGGGSDICLPRWGCLWED.
35 También se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar afinidad por unión con integrina de plaquetas IIb3 aumentada en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 pueden mostrar al menos aproximadamente o 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500 % o más afinidad por o unión con integrina de plaquetas IIb3 aumentada en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Los ejemplos de secuencias de unión a albúmina de suero incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de SEQ ID NO: 110-112, o una parte suficiente de las mismas para efectuar
45 unión a integrina de plaquetas IIb3, lo que puede reemplazar una secuencia contigua de restos de aminoácidos del polipéptido de FVII no modificado. Los polipéptidos de FVII modificados contienen una modificación seleccionada de entre S103S111delinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC y P406insGGGSCSFGRGDIRNVC.
Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una albúmina de suero o secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 también pueden contener una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido de FVII, tal como reemplazo de aminoácidos en una posición correspondiente a una posición G237V. También se describen por lo tanto en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación seleccionada de entre S1035111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103S111delinsDICLPRWGCLWED/G237V,
55 H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V y T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden contener 2, 3, 4, 5, 6 o 7 modificaciones. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden contener un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos. Dichos polipéptidos pueden mostrar afinidad aumentada por o unión con fosfolípidos en comparación con el polipéptido de FVII no modificado, tal como al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 65 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%,
300 %, 400 %, 500 % o más afinidad aumentada por o unión con fosfolípidos. El dominio Gla heterólogo puede seleccionarse de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de detención del crecimiento (Gas6) y proteína Z y, en algunos ejemplos, puede tener una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 83-91, 93 y
5 94, o una parte suficiente de la misma para efectuar unión a fosfolípidos. Todo o una parte contigua del dominio Gla de FVII nativo, que puede incluir los aminoácidos 1-45 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII, puede retirarse o reemplazarse con el dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar resistencia aumentada a antitrombina III en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Dicho polipéptido de FVII modificado puede mostrar al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300 %, 400 %, 500 % o más resistencia a antitrombina III en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. 15 Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también pueden mostrar actividad catalítica o coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII no modificado, tal como un aumento de al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Además, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar resistencia aumentada a IRFT en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden ser de al menos o aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistentes a IRFT en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Los polipéptidos de FVII modificados
25 proporcionados en el presente documento también pueden mostrar resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede ser al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 % o más resistente a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con un polipéptido de FVII no modificado.
En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento contienen una
o más modificaciones que introducen y/o eliminan uno o más sitios de glucosilación en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, pueden introducirse o eliminarse 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más sitios de
35 glucosilación. Los sitios de glucosilación que pueden introducirse o eliminarse incluyen sitios de N-glucosilación y sitios de O-glucosilación. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden contener una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III, aumentan la unión y/o afinidad para fosfolípidos, aumentan la afinidad por el factor tisular, aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad dependiente de FT, aumentan la actividad coagulante, alteran la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activas y menos activas en favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos. En algunos ejemplos, la zimogenicidad alterada confiere una forma más de tipo zimógeno o una forma menos de tipo zimógeno.
45 En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento contienen una
o más modificaciones de aminoácidos adicionales seleccionadas de entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserción de una tirosina en la posición 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, 55 G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D,
65 G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V,
imagen6
M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, 5 S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, 15 F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, 25 L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/ R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados también contienen una sustitución de posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina y FX, o sustituciones de las posiciones 310-329, 311-322 o 233
35 329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
Son ejemplos de polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 113-273. En algunos ejemplos, las modificaciones se realizan en un polipéptido de FVII no modificado que es una variante alélicas o de especie del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. La variante alélica o de especie u otra puede tener 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3, excluyendo la modificación o las modificaciones de aminoácidos. El polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento puede ser un polipéptido humano, un polipéptido no humano y/o un polipéptido maduro. En algunos ejemplos, solamente se modifica la secuencia primaria. En otros ejemplos, también se incluye una
45 modificación química o una modificación postraduccional. Por ejemplo, el polipéptido de FVII modificado puede estar glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol (PEG).
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser polipéptidos monocatenarios, un polipéptido bicatenario y/o activos o activados. La activación puede efectuarse por escisión proteolítica por autoactivación, escisión por el Factor IX (FIXa), escisión por el Factor X (FXa), escisión por el Factor XII (FXIIa) o escisión por trombina.
Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden conservar una o más actividades
55 del polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden contener modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos siempre que el polipéptido conserve al menos una actividad de FVII del polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden conservar al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de una actividad del polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, se seleccionan una o más actividades de entre la unión a factor tisular (FT), activación de factor X (FX), activación de Factor IX (FIX), unión a fosfolípidos y actividad de coagulación. Además, las actividades que se conservan pueden aumentarse o reducirse en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, la actividad de coagulación se aumenta en comparación con el polipéptido de FVII no modificado, tal como al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %,
65 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado. Las actividades pueden medirse in vitro, ex vivo o in vivo.
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Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. También se
5 proporcionan vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico, incluyendo vectores procariotas, vectores virales o vectores eucariotas, tales como un vector de mamífero. Los vectores virales pueden seleccionarse de entre un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus. Se proporcionan en el presente documento células que contienen estos vectores, incluyendo células eucariotas, tales como células de mamífero. Son ejemplos de células de mamífero células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 o células CHO. En algunos ejemplos, las células expresan el polipéptido de FVII modificado. Por lo tanto, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se producen por estas células.
Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen una concentración o
15 cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier polipéptido de FVII modificado de acuerdo con las presentes reivindicaciones, molécula de ácido nucleico, vector o célula proporcionada en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se formula para administración local, sistémica o tópica, tal como administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse para administración de liberación controlada y/o dosificación individual.
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en métodos para tratar a un sujeto administrando una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, en los que el sujeto tiene una enfermedad o afección que se trata por la
25 administración de FVII o un procoagulante, tal como por la administración de FVII activo (FVIIa). En algunos ejemplos, el tratamiento con la composición farmacéutica alivia o mejora los síntomas asociados con la enfermedad
o afección. En ejemplos adicionales, los métodos descritos en el presente documento también incluyen controlar al sujeto con respecto a cambios en los síntomas asociados con enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. La enfermedad o afección para tratar usando los métodos proporcionados en el presente documento puede seleccionarse de entre trastornos de la coagulación sanguínea, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilia, (tal como hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C, hemofilia congénita o adquirida), deficiencia del factor VII y trastornos de sangrado, incluyendo complicación de sangrado debido a cirugía (tal como cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos) o traumatismo. En
35 algunos ejemplos, el sangrado se manifiesta como hemartrosis aguda, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales o hemorragia cerebral. En ejemplos adicionales, el sangrado se debe a extracción dental. La cirugía de trasplante puede seleccionarse de entre trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas e hígado.
En algunos ejemplos, el método descrito en el presente documento puede usarse para tratar a un sujeto que tiene autoanticuerpos para el factor VIII o factor IX. Los métodos descritos en el presente documento también pueden incluir administrar uno o más factores de coagulación adicionales, tales como factores de coagulación recombinantes o purificados de plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides, o tratamientos.
45 También se describen en el presente documento artículos de fabricación que contienen material de envasado y una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento contenida dentro del material de envasado. En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado en la composición farmacéutica es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII, y el material envasado incluye un marcador que indica que el polipéptido de FVII modificado se usa para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII. También se describen en el presente documento kits, que comprenden una composición farmacéutica descrita en el presente documento, un dispositivo para administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para su administración.
55 Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la cascada de coagulación. La figura muestra la ruta intrínseca y la ruta extrínseca de coagulación para la producción independiente de FXa y convergencia de las rutas a una ruta común para generar trombina y fibrina para la formación de un coágulo. Estas rutas están interconectadas. La figura representa el orden de las moléculas implicadas en la cascada de activación en la que un zimógeno se convierte en una proteasa activada por escisión de uno o más enlaces peptídicos. La proteasa activada actúa después como la proteasa de activación para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, dando como resultado en última instancia formación de coágulos. La Figura 2 representa el modelo de coagulación basado en células (véase, por ejemplo, Hoffman et al. (2001)
65 Thromb Haemost 85: 958-965). La figura representa los acontecimientos de coagulación como separados en tres fases, en las que el inicio de coagulación se efectúa por la activación de FX a FXa por el complejo de FT/FVIIa en la célula portadora de FT, dando como resultado la generación de una cantidad pequeña de trombina después de la activación por FXa/FVa. La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con y activa las plaquetas, e inicia la activación de suficientes cantidades de los factores de coagulación apropiados para formar los complejos de FVIIIa/FIXa y FVa/FXa. Se produce propagación de la coagulación en la superficie de grandes
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5 cantidades de plaquetas activadas en el sitio de lesión, dando como resultado un estallido de generación de trombina que es suficientemente grande para generar suficiente fibrina a partir de fibrinógeno para establecer un coágulo en el sitio de lesión. La Figura 3 representa los mecanismos por los que FVIIa puede iniciar la formación de trombina. La figura ilustra la ruta dependiente de FT de generación de trombina por FVIIa, que actúa en la superficie de una célula portadora de FT e implica formación de complejo de FVIIa con FT antes de la activación de FX a FXa. La figura también representa la ruta independiente de FT de la generación de trombina por FVIIa, durante la que FVIIa se une con fosfolípidos en la plaqueta activada y activa FX a FXa, que a su vez forma complejos con FVa para escindir la protrombina a trombina.
15 Descripción detallada
Esquema
A. Definiciones
B. Visión de conjunto de Hemostasia
1.
Adhesión y agregación de plaquetas
2.
Cascada de coagulación
25 a. Inicio
b.
Amplificación
c.
Propagación
3. Regulación de la Coagulación
C. Factor VII (FVII)
1.
Estructura y organización de FVII
2.
Modificaciones Postraduccionales
35 3. Procesamiento de FVII
4.
Activación de FVII
5.
Función de FVII
a.
Actividad de FVIIa dependiente de factor tisular
b.
Actividad de FVIIa independiente de factor tisular
6.
FVII como un producto biofarmacéutico
D. Polipéptidos de FVII modificados
45
1. Actividad catalítica aumentada
a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica
i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición 286
ii. Otras mutaciones en la posición 286
2. Resistencia aumentada a AT-III Modificaciones ejemplares para efectuar resistencia aumentada a AT-III
55 3. Resistencia aumentada a la inhibición por Zn2+ Modificaciones ejemplares para aumentar la resistencia a la inhibición por Zn2+
4.
Glucosilación alterada Modificaciones ejemplares para alterar la glucosilación
5.
Unión aumentada a albúmina de suero y/o integrina de plaqueta IIb3
a.
Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a albúmina de suero
b.
Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a integrina de plaqueta IIb3
6.
Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo
65 7. Combinaciones y modificaciones adicionales
a.
Modificaciones que aumentan la resistencia a IRFT
b.
Modificaciones que aumentan la actividad intrínseca
c.
Modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas
d.
Modificaciones que aumentan la afinidad para fosfolípidos
e.
Modificaciones que alteran la glucosilación5 f. Modificaciones que facilitan el enlace de grupos químicos
g. Mutaciones de combinación ejemplares
E. Producción de polipéptidos de FVII
1.
Vectores y células
2.
Sistemas de expresión
a. Expresión procariota
b.
Levadura 15 c. Insectos y células de insectos
d.
Células de mamífero
e.
Plantas
2.
Purificación
3.
Proteínas de fusión
4.
Modificaciones de polipéptidos
5.
Secuencias de nucleótidos
F. Evaluación de las actividades de polipéptidos de FVII modificados
1. Ensayos in vitro
a.
Modificación postraduccional
b.
Actividad proteolítica
c.
Actividad de coagulación
d.
Unión con y/o inhibición por otras proteínas
e.
Unión con fosfolípidos
2. Modelos animales no humanos
35 3. Ensayos clínicos
G. Formulación y administración
1. Formulaciones
a.
Dosificaciones
b.
Formas de dosificación
2. Administración de polipéptidos de FVII modificados
45 3. Administración de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de FVII modificados (terapia génica)
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25
H. Usos Terapéuticos
1. Trastornos de sangrado congénitos
a.
Hemofilia
b.
Deficiencia en FVII
c.
Otros
55
2. Trastornos de sangrado adquiridos
a.
Trombocitopenia adquirida por quimioterapia
b.
Otras coagulopatías
c.
Sangrado adquirido por trasplante
d.
Sangrado inducido por terapia anticoagulante
e.
Hemofilia adquirida
3. Traumatismo y sangrado quirúrgico
65
I. Terapias de Combinación
J. Artículos de fabricación y kits
K. Ejemplos
A. Definiciones
5 A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención o las invenciones. En caso de que haya una pluralidad de definiciones para términos del presente documento, prevalecerán los de la presente sección. Cuando se haga referencia a una URL u otro identificador u otra dirección tal, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y la información particular en Internet puede aparecer y desaparecer, pero puede encontrarse información equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma demuestra la disponibilidad y difusión pública de dicha información.
Como se usa en el presente documento, la ruta de coagulación o cascada de coagulación se refiere a la serie de
15 acontecimientos de activación que conduce a la formación de un coágulo de fibrina insoluble. En la cascada o la ruta de coagulación, una proteína inactiva de una serina proteasa (también denominada un zimógeno) se convierte en una proteasa activa por escisión de uno o más enlaces peptídicos, que actúan después como la proteasa activadora para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada. En la etapa proteolítica final de la cascada, el fibrinógeno se escinde de forma proteolítica por trombina a fibrina, que después se reticula en el sitio de lesión para formar un coágulo.
Como se usa en el presente documento, “hemostasia” se refiere a la detención del sangrado o flujo sanguíneo en un órgano o parte del cuerpo. El término hemostasia puede abarcar el proceso completo de coagulación sanguínea para evitar pérdida de sangre después de lesión de los vasos sanguíneos hasta la disolución posterior del coágulo
25 sanguíneo después de reparación tisular.
Como se usa en el presente documento, “coagulación” se refiere a la formación de un coágulo de fibrina insoluble, o al proceso por el que los factores de coagulación de la sangre interaccionan en la cascada de coagulación, dando como resultado en última instancia la formación de un coágulo de fibrina insoluble.
Como se usa en el presente documento, una “proteasa” es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes. Estas designaciones incluyen formas de zimógenos y formas activadas monocatenarias, bicatenarias y multicatenarias de las mismas. Para mayor claridad, la referencia a proteasas se refiere a todas las formas. Las proteasas incluyen, por ejemplo, serina proteasas, cisteína proteasas, proteasas aspárticas, treonina y
35 metaloproteasas dependiendo de la actividad catalítica de su sitio activo y el mecanismo de escisión de enlaces peptídicos de un sustrato diana.
Como se usa en el presente documento, las serina proteasas o serina endopeptidasas se refieren a una clase de peptidasas que se caracterizan por la presencia de un resto de serina en el sitio activo de la enzima. Las serina proteasas participan en una amplia serie de funciones en el cuerpo, incluyendo coagulación sanguínea e inflamación, así como actuar como enzimas digestivas en procariotas y eucariotas. El mecanismo de escisión por serina proteasa se basa en el ataque nucleófilo de un enlace peptídico diana por una serina. La cisteína, treonina o moléculas de agua asociadas con aspartato o metales también pueden desempeñar este papel. Las cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato forman una tríada catalítica habitual para la mayoría de serina
45 proteasas. El sitio activo de serina proteasas se moldea como una hendidura en la que se une el sustrato polipeptídico.
Como se usa en el presente documento, Factor VII (FVII, F7; también denominado Factor 7, factor de coagulación VII, factor de suero VII, acelerador de la conversión de protrombina en suero, SPCA, proconvertina y eptacog alfa) se refiere a una serina proteasa que es parte de la cascada de coagulación. FVII incluye un dominio Gla, dos dominios EGF (EGF-1 y EGF-2), y un dominio de serina proteasa (o dominio de peptidasa S1) que está altamente conservado entre todos los miembros de la familia de peptidasa S1 de serina proteasas, tal como por ejemplo con quimotripsina. La secuencia de un precursor ejemplar FVII que tiene un péptido señal y propéptido se expone en SEQ ID NO: 1. Se expone un polipéptido de FVII maduro ejemplar en SEQ ID NO: 3. FVII aparece como un
55 zimógeno monocatenario, un polipéptido bicatenario de tipo zimógeno y una forma bicatenaria completamente activada. Se produce activación completa, que sucede tras el cambio conformacional de una forma de tipo zimógeno, tras la unión con su cofactor factor tisular. Además, pueden introducirse mutaciones que den como resultado el cambio conformacional en ausencia de factor tisular. Por lo tanto, la referencia a FVII incluye formas monocatenarias y bicatenarias del mismo, incluyendo formas de tipo zimógeno y bicatenarias completamente activadas.
La referencia al polipéptido de FVII también incluye polipéptidos precursores y polipéptidos de FVII maduros en formas monocatenarias o bicatenarias, formas truncadas de los mismos que tienen actividad e incluyen variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes, incluyendo 65 polipéptidos que tienen al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 o la forma madura del mismo. Se incluyen polipéptidos de FVII modificados, tales como los de SEQ ID NO: 113 y 273 y variantes de los mismos. También se incluyen los que conservan al menos una actividad de un FVII, tal como unión a FT, unión a factor X, unión a fosfolípido y/o actividad coagulante de un FVII. Conservando la actividad, la actividad puede alterarse, tal como reducirse o aumentarse, en comparación con un FVII de tipo silvestre siempre que el nivel de 5 actividad conservado sea suficiente para producir un efecto detectable. Los polipéptidos de FVII incluyen, pero sin limitación, isoformas específicas de tejido y variantes alélicas de las mismas, moléculas sintéticas preparadas por traducción de ácidos nucleicos, proteínas generadas por síntesis química, tal como síntesis que incluyen ligamiento de polipéptidos más cortos, mediante métodos recombinantes, proteínas aisladas de tejido y células humanos y no humanos, polipéptidos de FVII quiméricos y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos de FVII también incluyen fragmentos o partes de FVII que son de suficiente longitud o incluyen regiones apropiadas para conservar al menos una actividad (tras la activación si es necesario) de un polipéptido maduro de longitud completa. Los polipéptidos de FVII también incluyen los que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y los que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, pegilación, albuminación, glucosilación, farnisilacion, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones
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15 de polipéptidos conocidas en la técnica.
Son polipéptidos de FVII ejemplares los de origen de mamífero, incluyendo humano. Se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares de FVII de origen humano en SEQ ID NO: 1, 2 y 3. Las variantes ejemplares de dicho polipéptido de FVII humano incluyen cualquiera de los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 18-74. Los polipéptidos de FVII también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, polipéptidos de factor VII murinos, caninos, felinos, leporinos, aviares, bovinos, ovinos, porcinos, equinos, ictícolas, anfibios y de otros primates. Los polipéptidos de FVII ejemplares de origen no humano incluyen, por ejemplo, vaca (Bos taurus, SEQ ID NO: 4), ratón (Mus musculus, SEQ ID NO: 5), chimpancé pigmeo (Pan paniscus, SEQ ID NO: 6), chimpancé (Pan troglodytes, SEQ ID NO: 7), conejo (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO: 8), rata (Rattus
25 norvegicus, SEQ ID NO: 9), macaco rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO: 10), cerdo (Sus scrofa, SEQ ID NO: 11), perro (Canis familiaris, SEQ ID NO: 12), pez cebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO: 13), pez globo Japonés (Fugu rubripes, SEQ ID NO: 14), pollo (Gallus gallus, SEQ ID NO: 15), orangután (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) y gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO: 17).
Un experto en la materia reconoce que las posiciones referidas del polipéptido del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) difieren en 60 restos de aminoácidos en comparación con la isoforma de un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, que es la isoforma de un polipéptido de factor VII que contienen el péptido señal y secuencias propeptídicas. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEQ ID NO: 3 “corresponde a” el sexagésimo primer (61º) resto de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Un experto en la materia también reconoce que las posiciones referidas
35 del polipéptido del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) difieren en 38 restos de aminoácidos en comparación con el polipéptido de FVII precursor expuesto en SEQ ID NO: 2, que es el polipéptido del factor VII de isoforma b que contiene las secuencias del péptido y propéptido señal. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEQ ID NO: 3 “corresponde a” el trigésimo noveno (39º) resto de aminoácido de SEQ ID NO: 2.
Como se usa en el presente documento, los restos correspondientes se refieren a restos que aparecen en loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Dichos métodos típicamente maximizan las coincidencias, e incluyen métodos tales como el uso de alineamientos manuales y el uso de los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Alineando las secuencias de polipéptidos, un experto en la materia 45 puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados idénticos como guías. Por ejemplo, alineando las secuencias de polipéptidos de factor VII, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por ejemplo, la alanina en la posición de aminoácido 1 (A1) de SEQ ID NO: 3 (factor maduro VII) corresponde a la alanina en la posición de aminoácido 61 (A61) de SEQ ID NO: 1, y la alanina en la posición de aminoácido 39 (A39) de SEQ ID NO: 2. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes. Por ejemplo, el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos A1 a F45 de SEQ ID NO: 3, a las posiciones de aminoácidos A61 hasta S105 de SEQ ID NO: 1 y a las posiciones de aminoácidos A39 a S83 de SEQ ID NO: 2. Un experto en la materia también puede emplear restos de aminoácidos conservados como guías para encontrar restos de aminoácidos correspondientes entre y dentro de secuencias humanas y no humanas. Por ejemplo, los restos de aminoácidos S43 y E163 de SEQ
55 ID NO: 3 (humana) corresponden a S83 y E203 de SEQ ID NO: 4 (bovina). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes.
Como se usa en el presente documento, una “prorregión”, un “propéptido” o una “prosecuencia” se refieren a una región o un segmento que se escinde para producir una proteína madura. Esto puede incluir segmentos que actúan para suprimir la actividad proteolítica enmascarando la maquinaria catalítica y evitando por lo tanto la formación del intermedio catalítico (es decir, ocluyendo de forma estérica el sitio de unión a sustrato). Una prorregión es una secuencia de aminoácidos situada en el extremo amino terminal de un polipéptido biológicamente activo maduro y puede ser tan poco como algunos aminoácidos o puede ser una estructura multidominio.
65 Como se usa en el presente documento, “factor VII maduro” se refiere a un polipéptido de FVII que carece de una
secuencia señal y una secuencia propeptídica. Típicamente, una secuencia señal se dirige a una proteína para secreción a través de la ruta del retículo endoplásmico (RE)-golgi y se escinde después de la inserción en el RE durante la traducción. Una secuencia propeptídica típicamente actúa en modificación postraduccional de la proteína y se escinde antes de la secreción de la proteína de la célula. Por lo tanto, un polipéptido de FVII maduro es
5 típicamente una proteína secretada. En un ejemplo, un polipéptido de FVII humano maduro se expone en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 difiere de la de los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 1 y 2 en que SEQ ID NO: 3 carece de la secuencia señal, que corresponde a los restos de aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 1 y 2; y también carece de la secuencia propeptídica, que corresponde a los restos de aminoácidos 21-60 de SEQ ID NO: 1 y los restos de aminoácidos 21-38 de SEQ ID NO: 2. La referencia a un polipéptido de FVII maduro abarca la forma de zimógeno monocatenaria y la forma bicatenaria.
Como se usa en el presente documento, “de tipo silvestre” o “nativo” con referencia a FVII se refiere a un polipéptido de FVII codificado por un gen de FVII de origen natural o nativo, incluyendo variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo un ser humano y otros animales, en la naturaleza. Se pretende que la referencia a factor 15 VII de tipo silvestre sin referencia a una especie abarque cualquier especie de un factor VII de tipo silvestre. Se incluyen entre polipéptidos de FVII de tipo silvestre el polipéptido precursor codificado, fragmentos del mismo, y formas procesadas de los mismos, tales como una forma madura que carece del péptido señal así como cualquier forma procesada o modificada pre o postraduccionalmente del mismo. También se incluyen entre polipéptidos de FVII nativos los que se modifican postraduccionalmente, incluyendo, pero sin limitación, modificación por glucosilación, carboxilación e hidroxilación. Los polipéptidos de FVII nativos también incluyen formas monocatenarias y bicatenarias. Por ejemplo, los seres humanos expresan FVII nativo. La secuencia de aminoácidos de FVII humano de tipo silvestre ejemplar se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 3 y variantes alélicas expuestas en SEQ ID NO: 44-100 y las formas maduras de las mismas. Otros animales producen FVII nativo, incluyendo, pero sin limitación, vaca (Bos taurus, SEQ ID NO: 4), ratón (Mus musculus, SEQ ID NO: 5), chimpancé pigmeo (Pan
25 paniscus, SEQ ID NO: 6), chimpancé (Pan troglodytes, SEQ ID NO: 7), conejo (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO: 8), rata (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), macaco rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO: 10), cerdo (Sus scrofa, SEQ ID NO: 11), perro (Canis familiaris, SEQ ID NO: 12), pez cebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO: 13), pez globo Japonés (Fugu rubripes, SEQ ID NO: 14), pollo (Gallus gallus, SEQ ID NO: 15), orangután (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) y gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO: 17).
Como se usa en el presente documento, las variantes de especies se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamífero, tales como ratón y ser humano.
Como se usa en el presente documento, las variantes alélicas se refieren a variaciones en las proteínas entre 35 miembros de la misma especie.
Como se usa en el presente documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Como se usa en el presente documento, un zimógeno se refiere a una proteasa que se activa por escisión proteolítica, incluyendo escisión de maduración, tal como escisión de activación y/o formación de complejos con otra proteína u otras proteínas y/u otro cofactor u otros cofactores. Un zimógeno es un precursor inactivo de una enzima proteolítica. Dichos precursores son generalmente mayores, aunque no necesariamente mayores, que la forma 45 activa. Con referencia a serina proteasas, se convierten zimógenos en enzimas activas por escisión específica, incluyendo escisión catalítica y autocatalítica, o mediante unión de un cofactor activador que genera una enzima activa. Por ejemplo, en general, los zimógenos están presentes en una forma monocatenaria. Los zimógenos, en general, están inactivos y pueden convertirse en polipéptidos activos maduros por escisión catalítica o autocatalítica en uno o más sitios proteolíticos para generar un polipéptido multicatenario, tal como uno bicatenario. Un zimógeno, por lo tanto, es una proteína enzimáticamente inactiva que se convierte en una enzima proteolítica mediante la acción de un activador. La escisión puede efectuarse por autoactivación. Varias proteínas de coagulación son zimógenos; están inactivas, pero se escinden y se activan tras el inicio del sistema de coagulación después del daño vascular. En referencia a FVII, los polipéptidos de FVII existen en el plasma sanguíneo como zimógenos hasta la escisión por aproteasas, tales como por ejemplo, factor IX activado (FIXa), factor X activado (FXa), factor XII
55 activado (FXIIa), trombina o por autoactivación para producir una forma bicatenaria de tipo zimógeno, que después requiere un cambio conformacional adicional para su actividad completa.
Como se usa en el presente documento, una proteína o un polipéptido “de tipo zimógeno” se refiere a una proteína que se ha activado por escisión proteolítica, pero aún muestra propiedades que están asociadas con un zimógeno, tales como, por ejemplo, actividad baja o ausente, o una conformación que se asemeja a la conformación de la forma de zimógeno de la proteína. Por ejemplo, cuando no está unida al factor tisular, la forma activada bicatenaria de FVII es una proteína de tipo zimógeno; conserva una conformación similar al zimógeno FVII no escindido, y, por lo tanto, muestra muy baja actividad. Tras la unión con el factor tisular, la forma activada bicatenaria de FVII experimenta un cambio conformacional y adquiere su actividad completa como un factor de coagulación.
65 Como se usa en el presente documento, una secuencia de activación se refiere a una secuencia de aminoácidos en un zimógeno que era el sitio requerido para escisión de activación o escisión de maduración para formar una proteasa activa. La escisión de una secuencia de activación puede catalizarse de forma autocatalítica o por compañeros de activación.
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5 Como se usa en el presente documento, la escisión de activación es un tipo de escisión de maduración que induce un cambio conformacional que se requiere para el desarrollo de la actividad enzimática completa. Esta es una ruta de activación clásica, por ejemplo, para serina proteasas en la que una escisión genera un nuevo extremo N terminal que interacciona con las regiones conservadas de la proteasa, tales como Asp194 en quimotripsina, para inducir cambios conformacionales requeridos para la actividad. La activación puede dar como resultado producción de formas multicatenarias de las proteasas. En algunos casos, formas monocatenarias de la proteasa pueden mostrar actividad proteolítica.
Como se usa en el presente documento, “Factor VII activado” o “FVIIa” se refiere a cualquier forma bicatenaria de un polipéptido de FVII. Una forma bicatenaria típicamente resulta de la escisión proteolítica, pero puede producirse de
15 forma sintética. El Factor VII activado, por lo tanto, incluye la forma bicatenaria de tipo zimógeno con baja actividad coagulante, una forma completamente activada (aproximadamente 1000 veces más actividad) que aparece tras la unión con el factor tisular, y formas mutadas que existen en una forma bicatenaria completamente activada o experimentan cambio conformacional a una forma completamente activada. Por ejemplo, una forma monocatenaria del polipéptido de FVII (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 3) se escinde proteolíticamente entre los restos de aminoácidos R152 e I153 del polipéptido de FVII maduro. Los productos de escisión, cadena pesada de FVII y cadena ligera de FVII, que se mantienen juntos por un enlace disulfuro (entre los restos de aminoácidos C135 y C262 en el FVII de SEQ ID NO: 3), forman la enzima de FVII activada bicatenaria. Puede llevarse a cabo escisión proteolítica, por ejemplo, por factor IX activado (FIXa), factor X activado (FXa), factor XII activado (FXIIa), trombina o por autoactivación.
25 Como se usa en el presente documento, una “propiedad” de un polipéptido de FVII se refiere a una propiedad física
o estructural, tal como estructura tridimensional, pI, semivida, conformación y otras características físicas tales.
Como se usa en el presente documento, una “actividad” de un polipéptido de FVII se refiere a cualquier actividad mostrada por un polipéptido de factor VII. Dichas actividades pueden ensayarse in vitro y/o in vivo e incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante, actividad procoagulante, actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; y/o capacidad para unirse con fosfolípidos. La actividad puede evaluarse in vitro o in vivo usando 35 ensayos reconocidos, por ejemplo, midiendo la coagulación in vitro o in vivo. Los resultados de dichos ensayos indican que un polipéptido muestra una actividad que puede correlacionarse con la actividad del polipéptido in vivo, en el que la actividad in vivo puede denominarse actividad biológica. Se conocen por los expertos en la materia ensayos para determinar la funcionalidad o actividad de formas modificadas de FVII. Los ensayos ejemplares para evaluar la actividad de un polipéptido de FVII incluyen ensayo de tiempo de protromboplastina (PT) o el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) para evaluar la actividad coagulante, o ensayos cromogénicos usando sustratos sintéticos, tales como los descritos en los ejemplos posteriores, para evaluar la actividad catalítica
o proteolítica.
Como se usa en el presente documento, “muestra al menos una actividad” o “conserva al menos una actividad” se
45 refieren a la actividad mostrada por un polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma y en las mismas condiciones. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado en una forma bicatenaria se compara con un polipéptido de FVII no modificado en una forma bicatenaria, en las mismas condiciones experimentales, siendo la única diferencia entre los dos polipéptidos la modificación que se estudia. En otro ejemplo, un polipéptido de FVII modificado en una forma monocatenaria se compara con un polipéptido de FVII no modificado en una forma monocatenaria, en las mismas condiciones experimentales, siendo la única diferencia entre los dos polipéptidos la modificación que se estudia. Típicamente, un polipéptido de FVII modificado que conserva o muestra al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma conserva una cantidad suficiente de la actividad de modo que, cuando se administra in vivo, el polipéptido de FVII modificado es terapéuticamente eficaz como un producto terapéutico procoagulante. En general, para que un polipéptido de
55 FVII modificado conserve la eficacia terapéutica como un procoagulante, la cantidad de actividad que se conserva es exactamente o es aproximadamente 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 % o más de la actividad de un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma que presenta eficacia terapéutica como un procoagulante. La cantidad de actividad que se requiere para mantener la eficacia terapéutica como un procoagulante puede determinarse de forma empírica, si es necesario. Típicamente, una conservación del 0,5 % al 20 %, del 0,5 % al 10 %, del 0,5 % al 5 % de una actividad es suficiente para conservar la eficacia terapéutica como un procoagulante in vivo.
Se entiende que la actividad que se muestra o se conserva por un polipéptido de FVII modificado puede ser
65 cualquiera actividad, incluyendo, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante, actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX),
antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; y/o capacidad para unirse con fosfolípidos. En algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una actividad que aumenta en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. En algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una 5 actividad que se traduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La actividad de un polipéptido de FVII modificado puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado, donde ambos polipéptidos están en la misma forma, incluyendo pero sin limitación, 1 % de actividad, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500 %, o más actividad en comparación con el polipéptido que no contiene la modificación en cuestión. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede mostrar actividad aumentada o reducida en comparación con el polipéptido de FVII no modificado en la misma forma. Por ejemplo, puede conservar al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % o al menos 99 % de la actividad del polipéptido de FVII no modificado. En otros ejemplos, el cambio de actividad es al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10
15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, o más veces mayor que FVII no modificado. El nivel particular para conservar está en función del uso pretendido del polipéptido y puede determinarse de forma empírica. La actividad puede medirse, por ejemplo, usando ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en el presente documento o en los ejemplos posteriores.
Como se usa en el presente documento, “actividad de coagulación”, “actividad coagulante” o “actividad procoagulante” se refieren a la capacidad de un polipéptido para efectuar coagulación. Los expertos en la materia conocen ensayos para evaluar la actividad coagulante, e incluyen ensayo de tiempo de protromboplastina (PT) o el ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT).
25 Como se usa en el presente documento, “actividad catalítica” o “actividad proteolítica” en referencia a FVII se refiere a la capacidad de una proteína FVII para catalizar la escisión proteolítica de un sustrato, y se usan indistintamente. Se conocen en la técnica ensayos para evaluar dichas actividades. Por ejemplo, la actividad proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como FVIIa Spectrozyme (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA), en el que la escisión de un sustrato se controla por la absorbancia y la tasa de hidrólisis de sustrato determinada por regresión lineal.
Como se usa en el presente documento, “actividad intrínseca” con referencia a FVII se refiere a la actividad catalítica, proteolítica y/o coagulante de una proteína de FVII en ausencia de factor tisular.
35 Como se usa en el presente documento, el dominio (típicamente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos) se refiere a una parte de una molécula, tal como proteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que es estructuralmente y/o funcionalmente distinta de otras partes de la molécula y es identificable. Por ejemplo, los dominios incluyen las partes de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada de forma independiente dentro de una proteína compuesta de uno o más motivos estructurales y/o que se reconoce en virtud de una actividad funcional, tal como actividad proteolítica. Una proteína puede tener un, o más de un, dominios distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por la homología de la secuencia en el mismo con miembros de la familia relacionados, tal como homología con motivos que definen un dominio de proteasa o un dominio Gla. En otro ejemplo, un dominio puede distinguirse por su función, tal como por actividad
45 proteolítica, o una capacidad para interaccionar con una biomolécula, tal como unión a ADN, unión a ligando y dimerización. Un dominio de forma independiente puede mostrar una función o actividad biológica de modo que el dominio de forma independiente o fusionado con otra molécula pueda realizar una actividad, tal como, por ejemplo, actividad proteolítica o unión a ligando. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Dichos dominios se conocen, y pueden identificarse por los expertos en la materia. Para ejemplificación en el presente documento, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está dentro de la experiencia de la técnica reconocer dominios particulares por nombre. Si es necesario puede emplearse el software apropiado para identificar dominios.
Como se usa en el presente documento, un dominio de proteasa es la parte catalíticamente activa de una proteasa.
55 La referencia a un dominio de proteasa de una proteasa incluye las formas monocatenaria, bicatenaria y multicatenaria de cualquiera de estas proteínas. Un dominio de proteasa de una proteína contiene todas las propiedades requeridas de esa proteína requeridas para su actividad proteolítica, tal como por ejemplo, el centro catalítico. En referencia a FVII, el dominio de proteasa comparte homología y característica estructural con los dominios de proteasa de la familia de quimotripsina/tripsina, incluyendo la tríada catalítica. Por ejemplo, en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, el dominio de proteasa corresponde a las posiciones de aminoácidos 153 a 392.
Como se usa en el presente documento, un dominio de gamma-carboxiglutamato (Gla) se refiere a la parte de una proteína, por ejemplo una proteína dependiente de vitamina K, que contiene modificaciones postraduccionales de
65 restos de glutamato, generalmente la mayoría, pero no todos, de los restos de glutamato, por carboxilación dependiente de vitamina K para formar Gla. El dominio Gla es responsable de la unión de alta afinidad de iones de
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calcio y unión con fosfolípidos con carga negativa. Típicamente, el dominio Gla comienza en el extremo N terminal de la forma madura de las proteínas dependientes de vitamina K y termina con un resto aromático conservado. En un polipéptido de FVII maduro el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos 1 a 45 del polipéptido ejemplar expuesto en SEQ ID NO: 3. Se conocen bien dominios Gla y su locus puede identificarse en polipéptidos 5 particulares. Los dominios Gla de las diversas proteínas dependientes de vitamina K comparten secuencia, homología estructural y funcional, incluyendo el agrupamiento de restos hidrófobos N terminales en un parche hidrófobo que media en la interacción con fosfolípidos con carga negativa en la membrana de superficie celular. Otros polipéptidos que contienen Gla ejemplares incluyen, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEQ ID NO: 83-94.
Como se usa en el presente documento, “nativo” o “endógeno” en referencia a un dominio Gla se refiere al dominio Gla de origen natural asociado con todo o parte de un polipéptido que tiene un dominio Gla. Para fines del presente documento, un dominio Gla nativo es en referencia a un polipéptido de FVII. Por ejemplo, el dominio Gla nativo de
15 FVII, expuesto en SEQ ID NO: 92, corresponde a los aminoácidos 1-45 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Como se usa en el presente documento, un dominio Gla heterólogo se refiere al dominio Gla de un polipéptido, de la misma o diferentes especies, que no es un dominio Gla de FVII. Son ejemplos de dominios Gla heterólogos los dominios Gla de polipéptidos que contienen Gla incluyendo, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEQ ID NO: 83-91, 93 y 94.
25 Como se usa en el presente documento, una parte contigua de un dominio Gla se refiere a al menos dos o más aminoácidos adyacentes, típicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 o más hasta todos los aminoácidos que componen un dominio Gla.
Como se usa en el presente documento, “una parte suficiente de un dominio Gla para efectuar unión a fosfolípidos” incluye al menos un aminoácido, típicamente, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 o más aminoácidos del dominio, pero menos de todos los aminoácidos que componen el dominio siempre que el polipéptido que contiene dicha parte muestre unión a fosfolípidos.
Como se usa en el presente documento, “reemplazar” con respecto a un dominio Gla o “intercambio de dominio Gla”
35 se refiere al proceso por el que el dominio Gla endógeno de una proteína se reemplaza, usando métodos recombinantes, sintéticos u otros, con el dominio Gla de otra proteína. En el contexto de un “intercambio de dominio Gla”, un “dominio Gla” es cualquier selección de aminoácidos de un dominio Gla y regiones adyacentes que es suficiente para conservar la actividad de unión a fosfolípidos. Típicamente, un intercambio de dominio Gla implicará el reemplazo de entre 40 y 50 aminoácidos de la proteína endógena con entre 40 y 50 aminoácidos de otra proteína, pero puede implicar menos o más aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, un dominio del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGF-1 o EGF-2) se refiere a la parte de una proteína que comparte homología de secuencia con una parte de 30 a 40 aminoácidos específica de la secuencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). El dominio EGF incluye seis restos de
45 cisteína que se ha mostrado (en EGF) que están implicados en enlaces disulfuro. La estructura principal de un dominio EGF es una lámina beta de dos cadenas seguida de un bucle para una lámina de dos cadenas corta C terminal. FVII contiene los dominios EGF: EGF-1 y EGF-2. Estos dominios corresponden a las posiciones de aminoácidos 46-82 y 87-128, respectivamente, del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
Como se usa en el presente documento, “polipéptido no modificado” o “FVII no modificado” y variaciones gramaticales de los mismos se refieren a un polipéptido de partida que se selecciona para modificación como se proporciona en el presente documento. El polipéptido de partida puede ser una forma de origen natural, de tipo silvestre, de un polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede alterarse o mutarse, de modo que difiera de una isoforma de tipo silvestre nativa pero se denomina no obstante en el presente documento polipéptido no modificado 55 de partida en relación con los polipéptidos modificados posteriormente producidos en el presente documento. Por lo tanto, pueden seleccionarse proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para que tengan un aumento o una reducción deseada en una actividad o propiedad particular en comparación con una proteína de referencia no modificada y usarse como el polipéptido no modificado de partida. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado desde su forma nativa en uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee bien un aumento o bien una reducción en una propiedad deseada, tal como un cambio en un resto o restos de aminoácidos para alterar la glucosilación, puede ser una proteína diana, denominada en el presente documento no modificada, para modificación adicional de la misma o una propiedad diferente. Los polipéptidos de FVII modificados ejemplares conocidos en la técnica incluyen cualquier polipéptido de FVII descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.º 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 y 6806063, Publicaciones de Patente de Estados Unidos n.º 65 20030100506 y 20040220106 y Publicaciones de Patente Internacional n.º WO1988010295, WO200183725, WO2003093465, WO200338162, WO2004083361, WO2004108763, WO2004029090, WO2004029091,
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WO200411124 y WO2005123916.
Como se usa en el presente documento, “polipéptidos de factor VII modificados” y “factor VII modificado” se refieren a un polipéptido de FVII que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de
5 factor VII no modificado. La o las diferencias de aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos tales como uno o más reemplazos de aminoácidos (sustituciones), inserciones o deleciones, o pueden ser inserciones o deleciones de dominios completos, y cualquier combinación de los mismos. Típicamente, un polipéptido de FVII modificado tiene una o más modificaciones en secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Se contempla cualquier modificación siempre que el polipéptido resultante muestre al menos una actividad de FVII asociada con un polipéptido de FVII nativo, tal como, por ejemplo, actividad catalítica, actividad proteolítica, la capacidad de unirse con FT o la capacidad de unirse con plaquetas activadas.
15 Como se usa en el presente documento, “inhibidores de la coagulación” se refiere a proteínas o moléculas que actúan para inhibir o prevenir la coagulación o formación de coágulos. La inhibición o prevención de coagulación puede observarse in vivo o in vitro, y puede ensayarse usando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, ensayos de tiempo de protromboplastina (PT) o el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT).
Como se usa en el presente documento, el inhibidor de ruta de factor tisular (IRFT, también denominado IRFT-1) es un inhibidor de tipo Kunitz que está implicado en la formación de un complejo inhibidor de FT/FVIIa/IRFT/FXa cuaternario en el que la actividad de FVIIa está inhibida. IRFT se expresa como dos formas precursoras diferentes después de corte y empalme alternativo, precursores de IRFTa (SEQ ID NO: 75) y IRFT (SEQ ID NO: 77), que se
25 escinden durante la secreción para generar una proteína madura de 276 aminoácidos (SEQ ID NO: 76) y una de 223 aminoácidos (SEQ ID NO: 78), respectivamente. IRFT contiene 3 dominios Kunitz, de los que el dominio Kunitz-1 es responsable de la unión e inhibición de FVIIa.
Como se usa en el presente documento, IRFT-2 (también conocido como proteína placentaria 5 (PP5) e inhibidor de serina proteasa asociada a matriz (MSPI)) se refiere a un homólogo de IRFT. La proteína IRFT-2 madura de 213 aminoácidos (SEQ ID NO: 79) contiene tres dominios de tipo Kunitz que muestran 43 %, 35 % y 53 % de identidad de secuencia primaria con dominios de tipo Kunitz de IRFT-1 1, 2 y 3, respectivamente. IRFT-2 desempeña un papel en la regulación de la digestión y remodelación de la matriz extracelular, y no se cree que sea un factor importante en la ruta de coagulación.
35 Como se usa en el presente documento, la antitrombina III (AT-III) es un inhibidor de serina proteasa (serpina). AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEQ ID NO: 95) que se escinde durante la secreción para liberar una antitrombina madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO: 96).
Como se usa en el presente documento, los cofactores se refieren a proteínas o moléculas que se unen con otras proteínas o moléculas específicas para formar un complejo activo. En algunos ejemplos, se requiere unión con un cofactor para actividad proteolítica óptima. Por ejemplo, el factor tisular (FT) es un cofactor de FVIIa. La unión de FVIIa con FT induce cambios conformacionales que dan como resultado actividad proteolítica aumentada de FVII por sus sustratos, FX y FIX.
45 Como se usa en el presente documento, el factor tisular (FT) se refiere a una glucoproteína transmembrana de 263 aminoácidos (SEQ ID NO: 97) que actúa como un cofactor para FVIIa. Se expresa de forma constitutiva por células del músculo liso y fibroblastos, y ayuda a iniciar la coagulación uniéndose con FVII y FVIIa cuando estas células entran en contacto con el torrente sanguíneo después de lesión tisular.
Como se usa en el presente documento, la plaqueta activada se refiere a una plaqueta que se ha desencadenado por la unión de moléculas tales como colágeno, tromboxano A2, ADP y trombina para experimentar diversos cambios en morfología, fenotipo y función que en última instancia promueven la coagulación. Por ejemplo, una plaqueta activada cambia de forma a una forma más amorfa con dedos que se proyectan. Las plaquetas activadas
55 también experimentan una “inversión” de la membrana celular de modo que la fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa que normalmente están presentes en la hoja interna de la membrana celular se translocan a la superficie externa, orientada al plasma. Estas membranas de las plaquetas activadas proporcionan la superficie en la que se efectúan muchas de las reacciones de la cascada de coagulación. Las plaquetas activadas también secretan vesículas que contienen factores procoagulantes tales como vWF, FV, trombina, ADP y tromboxano A2, y se adhieren entre sí para formar un tapón plaquetario que se estabiliza por fibrina para convertirse en un coágulo.
Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad con plaquetas activadas, y cualquier variación gramatical de los mismos, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteína, por ejemplo un polipéptido de FVII, para unirse con la superficie de una plaqueta activada, en comparación con un polipéptido o 65 una proteína de referencia. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para unirse con plaquetas activadas puede ser mayor que la capacidad de un polipéptido de FVII no modificado para unirse con
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plaquetas activadas. La unión y/o afinidad de un polipéptido por plaquetas activadas puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la unión y/o afinidad de un polipéptido para plaquetas
5 activadas. La unión de un polipéptido de FVII con plaquetas activadas está mediada mediante la interacción de aminoácidos en el dominio Gla del polipéptido de FVII y fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilserina, en la plaqueta activada. Como tales, los métodos para ensayar con respecto a la unión de polipéptidos, tales como polipéptido de FVII, con plaquetas activadas usan membranas y vesículas que contienen fosfolípidos, tales como fosfatidilserina. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse con una plaqueta activada se refleja por la capacidad del polipéptido para unirse con vesículas fosfolipídicas que pueden medirse por técnicas de dispersión de la luz.
Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad con fosfolípidos, y cualquier variación gramatical del mismo, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o una proteína para unirse con
15 fosfolípidos en comparación con un polipéptido o una proteína de referencia. Los fosfolípidos pueden incluir cualquier fosfolípido, pero particularmente incluyen fosfatidilserina. La unión y/o afinidad de un polipéptido por fosfolípidos puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la afinidad y/o unión de un polipéptido por fosfolípidos. Por ejemplo, la unión del polipéptido de FVII con vesículas fosfolipídicas puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90º de la luz incidente. La intensidad de la dispersión de la luz con las vesículas fosfolipídicas solas y con vesículas fosfolipídicas con FVII se mide para determinar la constante de disociación. También puede usarse resonancia de plasma superficial, tal como en un instrumento biosensor BIAcore, para medir la afinidad de polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas.
25 Como se usa en el presente documento, la resistencia aumentada a inhibidores o “resistencia aumenta a AT-III” o “resistencia aumentada a IRFT” se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad reducida de un polipéptido a los efectos inhibidores de un inhibidor, tal como AT-III o IRFT, en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como AT-III, puede ensayarse evaluando la unión de un polipéptido de FVII modificado con un inhibidor. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como AT-III, también puede ensayarse midiendo la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido de FVII en presencia de AT-III. Se conocen en la técnica ensayos para determinar la unión de un polipéptido con un inhibidor. Para inhibidores covalentes, tales como, por ejemplo, AT-III, puede medirse una constante de velocidad de segundo orden para inhibición. Para inhibidores no covalentes, tales como, por ejemplo,
35 IRFT, puede medirse una ki. Además, también puede usarse resonancia en plasma superficial, tal como en un instrumento biosensor BIAcore, para medir la unión de polipéptidos de FVII con AT-III y otros inhibidores. Sin embargo, para inhibidores covalentes tales como AT-III, solamente puede medirse una tasa de asociación usando BIAcore. También se conocen en la técnica ensayos para determinar el efecto inhibidor de, por ejemplo, AT-III en la actividad coagulante o actividad intrínseca de FVII. Por ejemplo, puede medirse la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de AT-III, y determinarse el grado en que AT-III inhibe la reacción. Esto puede compararse con la capacidad de un polipéptido de FVII no modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de AT-III. Un polipéptido modificado que muestra resistencia aumentada a un inhibidor muestra, por ejemplo, un aumento de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%,
45 300 %, 400 %, 500 % o más resistencia a los efectos de un inhibidor en comparación con un polipéptido no modificado.
Como se usa en el presente documento, “resistencia aumentada a inhibición por Zn2+”, “resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+” o “resistencia aumentada a Zn2+” se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad reducida de un polipéptido a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a Zn2+ puede ensayarse, por ejemplo, midiendo la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido de FVII en presencia de Zn2+, tal como se describe en el Ejemplo 11. La resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ puede ser el resultado de la unión reducida a Zn2+. La unión reducida a Zn2+ puede ensayarse midiendo la cantidad de Zn2+ unido por molécula de FVIIa o
55 midiendo la afinidad de la unión de Zn2+ con FVIIa o midiendo una CI50 para la inhibición de una actividad de FVIIa por cinc. Un polipéptido modificado que muestra resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ muestra, por ejemplo, un aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistencia a los efectos de Zn2+ en comparación con un polipéptido no modificado.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de unión a albúmina de suero se refiere a una secuencia de restos de aminoácidos que puede efectuar unión con albúmina de suero. Por lo tanto, cuando se inserta en un polipéptido de FVII, la secuencia de unión a albúmina de suero puede potenciar la afinidad por o unión con albúmina de suero del polipéptido de FVII. La capacidad del polipéptido de FVII modificado que contiene la secuencia de unión 65 a albúmina de suero puede mostrar por lo tanto unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero. Un polipéptido modificado que muestra unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero muestra, por ejemplo, un aumento de
imagen15
1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Típicamente, las secuencias de unión a albúmina de suero contienen al menos 10 o más aminoácidos, típicamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 o más aminoácidos. Son
5 secuencias de unión a albúmina de suero ejemplares las expuestas en SEQ ID NO: 103-109.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 se refiere a una secuencia de restos de aminoácidos que pueden efectuar unión con integrina de plaquetas IIb3. Por lo tanto, cuando se inserta en un polipéptido de FVII, la secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 puede potenciar la 10 capacidad del polipéptido de FVII para unirse con la integrina de plaquetas IIb3 y, por lo tanto, las plaquetas, incluyendo plaquetas activadas. La capacidad del polipéptido de FVII modificado que contiene la secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 puede mostrar por lo tanto unión y/o afinidad aumentada con la integrina de plaquetas IIb3 y/o plaquetas. Un polipéptido modificado que muestra unión y/o afinidad aumentada con la integrina de plaquetas IIb3 muestra, por ejemplo, un aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%,
15 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300 %, 400 %, 500 % o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Típicamente, las secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 contienen al menos 5 o más aminoácidos, típicamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 o más aminoácidos. Son secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 ejemplares las expuestas en SEQ ID NO: 110-112.
20 Como se usa en el presente documento, un sitio de glucosilación se refiere a una posición de amino en un polipéptido con el que puede unirse un resto de carbohidrato. Típicamente, una proteína glucosilada contiene uno o más restos de aminoácidos, tales como asparagina o serina para la unión de los restos de carbohidratos.
25 Como se usa en el presente documento, un sitio de glucosilación nativo se refiere a una posición de amino con la que se une un resto de carbohidrato en un polipéptido de tipo silvestre. Hay cuatro sitios de glucosilación nativos en FVII; dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de O-glucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
30 Como se usa en el presente documento, un sitio de glucosilación no nativo se refiere a una posición amino con la que se une un resto de carbohidrato en un polipéptido modificado que no está presente en un polipéptido de tipo silvestre. Pueden introducirse sitios de glucosilación no nativos en un polipéptido de FVII por reemplazo de aminoácidos. Pueden crearse sitios de O-glucosilación, por ejemplo, por reemplazo de aminoácidos de un resto nativo con una serina o treonina. Pueden crearse sitios de N-glucosilación, por ejemplo, estableciendo el motivo
35 Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde Xaa no es prolina. La creación de esta secuencia consenso por modificación de aminoácidos puede implicar, por ejemplo, un reemplazo de un único aminoácido de un resto de aminoácido nativo con una asparagina, un reemplazo de un único aminoácido de un resto de aminoácido nativo con una serina, treonina o cisteína o un reemplazo de aminoácido doble que implica un primer reemplazo de aminoácido de un resto nativo con una asparagina y un segundo reemplazo de aminoácido de un resto nativo con una serina, treonina o
40 cisteína.
Como se usa en el presente documento, “actividad biológica” se refiere a actividades in vivo de un compuesto o respuestas fisiológicas que resultan tras la administración in vivo de un compuesto, una composición u otra mezcla. La actividad biológica, por lo tanto, abarca efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de dichos compuestos,
45 dichas composiciones y dichas mezclas. Las actividades biológicas pueden observarse en sistemas in vitro diseñados para ensayar o usar dichas actividades. Por lo tanto, para fines del presente documento una actividad biológica de un polipéptido de FVII abarca la actividad coagulante.
Como se usa en el presente documento, se entiende que el término “evaluar”, y variaciones gramaticales del mismo,
50 incluye determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de un polipéptido, y también de obtener un índice, una relación, un porcentaje, visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la detección de escisión de un sustrato por un polipéptido puede ser por medición directa del producto, o puede medirse indirectamente determinando la actividad resultante del sustrato escindido.
55 Como se usa en el presente documento, “numeración de quimotripsina” se refiere a la numeración de aminoácidos de un polipéptido de quimotripsina maduro de SEQ ID NO: 80. El alineamiento de un dominio de proteasa de otra proteasa, tal como por ejemplo el dominio de proteasa del factor VII, puede realizarse con quimotripsina. En dicho caso, se proporciona a los aminoácidos del factor VII que corresponden a aminoácidos de quimotripsina la
60 numeración de los aminoácidos de quimotripsina. Pueden determinarse posiciones correspondientes por dicho alineamiento por un experto en la materia usando alineamientos manuales o usando los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. La relación de que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a aminoácidos en una secuencia desvelada se
65 refiere a aminoácidos identificados tras el alineamiento del polipéptido con la secuencia desvelada para maximizar la
imagen16
identidad u homología (cuando se alinean aminoácidos conservados) usando un algoritmo de alineamiento convencional, tal como el algoritmo GAP. Los números de quimotripsina correspondientes de las posiciones de aminoácidos 1 a 406 del polipéptido de FVII expuesto en SEQ ID NO: 3 se proporcionan en la Tabla 1. Las posiciones de aminoácidos relativas a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 están en fuente normal, los restos de 5 aminoácidos en esas posiciones están en negrita, y los números de quimotripsina correspondientes están en cursiva. Por ejemplo, tras el alineamiento del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) con quimotripsina madura (SEQ ID NO: 80), se proporciona a la isoleucina (I) en la posición de aminoácido 153 en el factor VII la numeración de quimotripsina de I16. Los aminoácidos posteriores se numeran en consecuencia. En un ejemplo, un ácido glutámico
(E) en la posición de aminoácido 210 del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) corresponde a la posición de aminoácido
10 de E70 basada en la numeración de quimotripsina. Cuando existe un resto en una proteasa, pero no está presente en quimotripsina, se proporciona al resto de aminoácido una notación de una letra. Por ejemplo, los restos en quimotripsina que son parte de un bucle con el aminoácido 60 basándose en la numeración de quimotripsina, pero se insertan en la secuencia del factor VII en comparación con quimotripsina, se denominan por ejemplo K60a, I60b, K60c o N60d. Estos restos corresponden a K197, I198, K199 y N200, respectivamente, por numeración relativa a la
15 secuencia del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3).
Tabla 1. Numeración de quimotripsina en el factor VII
153
154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167
I
V G G K V C P K G E C P W Q
16
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
168
169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182
V
L L L V N G A Q L C G G T L
31
32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
183
184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197
I
N T I W V V S A A H C F D K
47
48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 60A
198
199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212
I
K N W R N L I A V L G E H D
60B
60C 60D 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
213
214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227
L
S E H D G D E Q S R R V A Q
73
74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
228
229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242
V
I I P S T Y V P G T T N H D
88
89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
243
244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
I
A L L R L H Q P V V L T D H
103
104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117
258
259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272
V
V
P L C L P E R T F S E R T
118
119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 129A 129B 129C
273
274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287
L
A F V R F S L V S G W G Q
L
129D
129E 129F 129G 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144
288
289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302
L
D R G A T A L E L M V L N V
145
146 147 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
303
304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317
P
R L M T Q D C L Q Q S R K V
161
162 163 164 165 166 167 168 169 170 170A 170B 170C 170D 170E
318
319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332
imagen17
G
D S P N I T E Y M F C A G Y
170F
170G 170H 170I 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184A 184
333
334 335 336 337 338 339 340 341 342 344 345 346 347
S
D G S K D S C K G D S G G P
185
186 187 188A 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198
348
349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362
H
A T H Y R G T W Y L T G I V
199
200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213
363
364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377
S
W G Q G C A T V G H F G V Y
214
215 216 217 219 220 221A 221 222 223 224 225 226 227 228
378
379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392
T
R V S Q Y I E W L Q K L M R
229
230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243
393
394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406
S
E P R P G V L L R A P F P
244
245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
Como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente 5 marcados, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas son típicamente de una longitud tal que su diana sea estadísticamente única o de un número de copias bajo (típicamente menor de 5, generalmente menor de 3) para explorar o aplicar un cebador a una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores
10 pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.
Como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que es de 2 a 40 aminoácidos de longitud.
15 Como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento se identifican de acuerdo con sus abreviaturas de tres letras o una letra conocidas (Tabla 2). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones de una única letra convencionales usadas habitualmente en este campo.
20 Como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para fines del presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en los que el carbono  tiene una cadena lateral).
25 De conformidad con la nomenclatura de polipéptidos convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), y adoptada en 37 C.F.R..§§ 1.821-1.822, se muestran abreviaturas para los restos de aminoácidos en la Tabla 2:
Tabla 2 -Tabla de correspondencia
SÍMBOLO
1 Letra
3 Letras AMINOÁCIDO
Y
Tyr Tirosina
G
Gly Glicina
F
Phe Fenilalanina
M
Met Metionina
A
Ala Alanina
S
Ser Serina
SÍMBOLO
1 Letra
3 Letras AMINOÁCIDO
I
Ile Isoleucina
L
Leu Leucina
T
Thr Treonina
V
Val Valina
P
Pro prolina
K
Lys Lisina
H
His Histidina
Q
Gln Glutamina
E
Glu ácido glutámico
Z
Glx Glu y/o Gin
W
Trp Triptófano
R
Arg Arginina
D
Asp ácido aspártico
N
Asn asparagina
B
Asx Asn y/o Asp
C
Cys Cisteína
X
Xaa Desconocido u otro
Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de amino terminal a carboxilo terminal. Además, se define en general que la expresión “resto de aminoácido” incluye los aminoácidos
5 enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 2) y aminoácidos modificados y poco habituales, tales como los referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en el presente documento por referencia. Además, debería observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.
10 Como se usa en el presente documento, un “aminoácido hidrófobo” incluye uno cualquiera de los aminoácidos que se ha determinado que son hidrófobos usando la escala de consenso de hidrofobicidad de Eisenberg. Son ejemplos los aminoácidos hidrófobos de origen natural, tales como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptófano, metionina, alanina, glicina, cisteína y tirosina (Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120).
15 También se incluyen aminoácidos hidrófobos de origen no natural.
Como se usa en el presente documento, un “aminoácido ácido” incluye entre los aminoácidos de origen natural restos de ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen aminoácidos ácidos de origen no natural.
20 Como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que aparecen en polipéptidos.
Como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico que no es uno de los aminoácidos de origen natural enumerados en
25 la Tabla 2. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por lo tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-isoestereómeros de aminoácidos. Se conocen por los expertos en la materia aminoácidos no naturales ejemplares y pueden incluirse en un polipéptido de factor VII modificado.
30 Como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, que contienen segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
imagen18
Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento plasmídico que, cuando se lee en la dirección de
5 5’ a 3’, codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.
Como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizadas in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente documento con respecto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótidos se usa para moléculas mono y bicatenarias cuando el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para indicar longitud global y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Se reconocerá por los expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir
15 ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden ser escalonados; por lo tanto todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria no pueden emparejarse. Dichos extremos no emparejados, en general, no superarán los 20 nucleótidos de longitud.
Como se usa en el presente documento, la “secuencia primaria” se refiere a la secuencia de restos de aminoácidos en un polipéptido.
Como se usa en el presente documento, la “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de secuencias de restos y los restos contenidos en
25 las mismas. Se conocen por los expertos en la materia métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos de manera que produzcan un nivel máximo de identidad entre las secuencias. La “identidad” se refiere al grado en que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. El alineamiento de secuencias de aminoácidos y en algún grado secuencias de nucleótidos, también puede tener en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son las que conservan las propiedades físico-químicas de los restos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias e incluyendo todos los restos) o locales (el alineamiento de una parte de las secuencias que incluye solamente la región o las regiones más similares).
35 Como se usa en el presente documento, los términos “homología” e “identidad” se usan indistintamente, pero la homología para proteínas puede incluir cambios de aminoácidos conservativos. En general para identificar posiciones correspondientes las secuencias de aminoácidos se alinean de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
45 Como se usa en el presente documento, la “identidad de secuencia” se refiere al número de aminoácidos idénticos (o bases de nucleótidos) en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Los polipéptidos homólogos se refieren a un número predeterminado de restos de aminoácidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones de aminoácidos conservativas así como restos idénticos. La identidad de secuencia puede determinarse por programas de algoritmos de alineamiento convencionales usados con penalizaciones de hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico homólogas se refieren a un número predeterminado de nucleótidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones que no cambian el aminoácido codificado (es decir, “sustituciones silenciosas”) así como restos idénticos. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridan típicamente a rigurosidad moderada
55 o a alta rigurosidad a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico o a lo largo de al menos aproximadamente 70 %, 80 % o 90 % de la molécula de interés de ácido nucleico de longitud completa. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degradados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico de hibridación (para determinación de la homología de proteínas, pueden alinearse aminoácidos conservativos así como aminoácidos idénticos; en este caso, el porcentaje de identidad y el porcentaje de homología varían). Si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos (o dos polipéptidos cualesquiera tienen secuencias de aminoácidos) que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % “idénticas” puede determinarse usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa “FAST A”, usando por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP,
65 BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), y Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica puede usarse para determinar la identidad. Otros programas disponibles en el mercado o públicamente incluyen el programa “MegAlign” de DNAStar (Madison, WI), y el programa “Gap” del Grupo de Informática Genética de la Universidad de Wisconsin (UWG) (Madison WI)). Puede determinarse el porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de
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5 ácido nucleico, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando un programa informático GAP (por ejemplo, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), como se revisó en Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Brevemente, un programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos en los extremos.
15 Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término “identidad” representa una comparación entre un polipéptido o un polinucleótido de ensayo y uno de referencia. En un ejemplo no limitante, “al menos 90 % idéntico a” se refiere a porcentajes de identidad del 90 al 100 % en relación con los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo para fines de ejemplificación que se compara una longitud de polinucleótido de ensayo y referencia de 100 aminoácidos, no más del 10 % (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difiere de los de los polipéptidos de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Dichas diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de una secuencia de aminoácidos o pueden agruparse en una o más localizaciones de diversa longitud hasta el máximo permisible, por
25 ejemplo, 10/100 aminoácidos de diferencia (aproximadamente 90 % de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácido nucleico o aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente el 85-90 %, el resultado debería ser independiente del programa y los parámetros de hueco establecidos; dichos altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, con frecuencia sin basarse en software.
Como se usa en el presente documento, también se entiende que las expresiones “sustancialmente idéntico” o “similar” varían con el contexto como se entiende por los expertos en la técnica relevante, pero que los expertos en la materia pueden evaluarlos.
35 Como se usa en el presente documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas en 50 % o más de identidad. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y pueden incluir alinear secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con secuencia de ADN genómica.
Como se usa en el presente documento, “hibrida específicamente” se refiere a hibridar, por formación de pares de bases complementarias, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) con una molécula de ácido nucleico diana. Los expertos en la materia están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan a
45 la hibridación específica, tales como una longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes para hibridación in vitro incluyen además temperatura de hibridación y lavado, composición de tampón y concentración salina. Son condiciones de lavado ejemplares para retirar moléculas de ácido nucleico no unidas específicamente a alta rigurosidad SSPE 0,1 x, SDS 0,1 %, 65 ºC, y a rigurosidad media son SSPE 0,2 x, SDS 0,1 %, 50 ºC. Se conocen en la técnica condiciones de rigurosidad equivalentes. Los expertos en la materia pueden ajustar fácilmente estos parámetros para conseguir hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para una aplicación particular.
Como se usa en el presente documento, un polipéptido o una proteína aislado o purificado o parte biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o el
55 tejido del que deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente puras de modo que la purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades proteolíticas y biológicas, de la sustancia. Se conocen por los expertos en la materia métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
65 La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. En un ejemplo, la expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas de proteasa que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de proteínas no proteasa (también denominadas en el presente documento una proteína contaminante), generalmente menos de aproximadamente el 20 % de proteínas
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5 no proteasa o 10 % de proteínas no proteasa o menos de aproximadamente el 5 % de proteínas no proteasa. Cuando la proteína proteasa o parte activa de la misma se produce de forma recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de, aproximadamente, o igual a 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína proteasa.
Como se usa en el presente documento, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas de proteasa en las que la proteína se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. La expresión incluye preparaciones de proteínas de proteasa que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco), 20 %, 10 %, 5 % o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes distintos de proteasa.
15 Como se usa en el presente documento, la producción por métodos recombinantes usando métodos de ADN recombinante se refiere al uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Como se usa en el presente documento, el vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ácido nucleico heterólogo en células para expresión o replicación del mismo. Los vectores permanecen típicamente episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. Se
25 conoce bien por los expertos en la materia la selección y el uso de dichos vehículos.
Como se usa en el presente documento, la expresión se refiere al proceso por el que se transcribe ácido nucleico a ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona una célula o un organismo hospedador eucariota apropiado, incluir procesamiento, tal como corte y empalme del ARNm.
Como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que se une operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y
35 terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión derivan en general de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, tras su introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Se conocen bien por los expertos en la materia vectores de expresión apropiados e incluyen los que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episómicos o los que se integran en el genoma de células hospedadoras.
Como se usa en el presente documento, el vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Los
45 vectores virales son virus modificados técnicamente que se unen operativamente con genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a células.
Como se usa en el presente documento, un adenovirus se refiere a cualquiera de un grupo de virus que contienen ADN que provocan conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en seres humanos.
Como se usa en el presente documento, ADN desnudo se refiere a ADN sin histonas que puede usarse para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se pasa de célula a célula durante un proceso de transferencia génica denominado transformación o transfección. En la transformación o transfección, el ADN purificado o desnudo que se capta por la célula receptora proporcionará a la célula receptora una nueva
55 característica o un nuevo fenotipo.
Como se usa en el presente documento, unido operativamente cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos se disponen de modo que actúen en concierto para sus fines pretendidos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.
Como se usa en el presente documento, un agente que modula la actividad de una proteína o la expresión de un gen o ácido nucleico reduce o aumenta o altera de otro modo la actividad de la proteína o, de alguna manera, regula positiva o negativamente o altera de otro modo la expresión del ácido nucleico en una célula.
65 Como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido unido operativamente con un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión proporcionada en el presente documento puede incluir uno o más polipéptidos de FVII, o una parte de los mismos, y uno o más polipéptidos adicionales para una cualquiera o más de una señal de control de la transcripción/traducción, secuencias señal, un marcador para localización, un marcador para purificación, parte de un dominio de una imunoglobulina G y/o un agente de dirección. Un polipéptido de FVII quimérico también incluye los que tienen sus dominios o regiones
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5 endógenos del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen las producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, las producidas por medios químicos, tales como por acoplamiento químico, mediante, por ejemplo, acoplamiento con grupos sulfihidrilo, y las producidas por cualquier otro método por el que al menos un polipéptido (es decir FVII), o una parte del mismo, se une, directa o indirectamente mediante enlazador o enlazadores con otro polipéptido.
Como se usa en el presente documento, unido operativamente cuando hace referencia a una proteína de fusión se refiere a un polipéptido de proteasa y un polipéptido no de proteasa que se fusionan en fase entre sí. El polipéptido no de proteasa puede fusionarse con el extremo N terminal o C terminal del polipéptido de proteasa.
15 Como se usa en el presente documento, un agente de dirección es cualquier resto, tal como una proteína o parte eficaz de la misma, que proporciona unión específica con una molécula de superficie celular, tal como un receptor de superficie celular, que en algunos casos puede internalizar un conjugado unido o parte del mismo. Un agente de dirección también puede ser uno que promueva o facilite, por ejemplo, el aislamiento de afinidad o la purificación del conjugado; unión del conjugado con una superficie; o detección del conjugado o complejos que contienen el conjugado.
Como se usa en el presente documento, derivado o análogo de una molécula se refiere a una parte derivada de o una versión modificada de la molécula.
25 Como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a una afección patológica en un organismo resultante de causa o afección incluyendo, pero sin limitación, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas y caracterizadas por síntomas identificables. Las enfermedades y trastornos de interés del presente documento son los que implican coagulación, incluyendo los mediados por proteínas de coagulación y en los que las proteínas de coagulación desempeñan un papel en la etiología o patología. Las enfermedades y los trastornos también incluyen los que están provocados por la ausencia de una proteína tal como en hemofilia, y son de particular interés los trastornos en los que la coagulación no se produce debido a una deficiencia o defecto en una proteína de coagulación.
Como se usa en el presente documento, “procoagulante” se refiere a cualquier sustancia que promueva la 35 coagulación sanguínea.
Como se usa en el presente documento, “anticoagulante” se refiere a cualquier sustancia que inhiba la coagulación sanguínea.
Como se usa en el presente documento, “hemofilia” se refiere a un trastorno de sangrado provocado por una deficiencia en un factor de coagulación sanguínea. La hemofilia puede ser el resultado, por ejemplo, de la ausencia, expresión reducida, o función reducida de un factor de coagulación. El tipo más común de hemofilia es la hemofilia A, que resulta de una deficiencia en el factor VIII. El segundo tipo más común de hemofilia es la hemofilia B, que resulta de una deficiencia en el factor IX. La hemofilia C también denominada deficiencia de FXI, es una forma más
45 leve y menos común de la hemofilia.
Como se usa en el presente documento, “hemofilia congénita” se refiere a tipos de hemofilia que son heredadas. La hemofilia congénita resulta de la mutación, deleción, inserción y otra modificación de un gen de factor de coagulación en el que la producción del factor de coagulación está ausente, reducida o no funcional. Por ejemplo, las mutaciones hereditarias en genes del factor de coagulación, tales como factor VIII y factor IX dan como resultado las hemofilias congénitas, hemofilia A y B, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, “hemofilia adquirida” se refiere a un tipo de hemofilia que se desarrolla en la adultez a partir de la producción de autoanticuerpos que inactivan FVIII.
55 Como se usa en el presente documento, “trastorno de sangrado” se refiere a una afección en la que el sujeto tiene una capacidad reducida de controlar el sangrado. Lo trastornos del sangrado pueden heredarse o adquirirse, y pueden resultar de, por ejemplo, defectos o deficiencias en la ruta de coagulación, defectos o deficiencias en la actividad plaquetaria, o defectos vasculares.
Como se usa en el presente documento, “trastorno de sangrado adquirido” se refiere a trastornos de sangrado que resultan de deficiencias de coagulación provocadas por afecciones tales como enfermedad hepática, deficiencia de vitamina K, o coumadina (warfarina) u otra terapia anticoagulante.
65 Como se usa en el presente documento, “tratar” a un sujeto que tiene una enfermedad o afección significa que un polipéptido, una composición u otro producto proporcionado en el presente documento se administra al sujeto.
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Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o producto quimioterapéutico significa fármacos convencionales y terapias farmacológicas, incluyendo vacunas, que se conocen por los expertos en la materia. Se conocen bien en la técnica agentes radioterapéuticos.
5 Como se usan en el presente documento, los tratamientos significan cualquier manera en que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad se alivien o se alteren de otra forma beneficiosamente. Por lo tanto el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de las composiciones del presente documento. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un FVII modificado y composiciones proporcionados en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el alivio de los síntomas de una enfermedad o un trastorno particular por un tratamiento, tal como por administración de una composición farmacéutica u otro producto terapéutico, se refiere a cualquier reducción, bien permanente o bien temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que puede atribuirse a
o asociarse con administración de la composición o el producto terapéutico.
15 Como se usa en el presente documento, la prevención o profilaxis se refiere a métodos en los que el riesgo de desarrollar la enfermedad o afección se reduce. La profilaxis incluye reducción en el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección y/o prevención del empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad o reducción en el riesgo de empeoramiento de los síntomas o progresión de una enfermedad.
Como se usa en el presente documento una cantidad eficaz de un compuesto o composición para tratar una enfermedad particular es una cantidad que es suficiente para aliviar, o de alguna manera reducir los síntomas asociados con la enfermedad. Dicha cantidad puede administrarse como una única dosificación o puede administrarse de acuerdo con un régimen, por el que es eficaz. La cantidad puede curar la enfermedad pero,
25 típicamente, se administra para aliviar los síntomas de la enfermedad. Típicamente, se requiere la administración repetida para conseguir un alivio deseado de los síntomas.
Como se usa en el presente documento, “cantidad terapéuticamente eficaz” o “dosis terapéuticamente eficaz” se refiere a un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Una cantidad eficaz es la cantidad de un agente terapéutico necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o un trastorno.
Como se usa en el presente documento, el “paciente” o “sujeto” para tratar incluye seres humanos y/o animales no humanos, incluyendo mamíferos. Los mamíferos incluyen primates, tales como seres humanos, chimpancés, gorilas
35 y monos; animales domesticados, tales como perros, caballos, gatos, cerdos, cabras, vacas; y roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y gerbos.
Como se usa en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. La asociación puede ser espacial o referirse al uso de los dos o más artículos para un fin común.
Como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos (por ejemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, formulaciones acuosas o no acuosas o cualquier combinación de los mismos.
45 Como se usa en el presente documento, un “artículo de fabricación” es un producto que se prepara y se vende. Como se usa a lo largo de la presente solicitud, se entiende que el término abarca polipéptidos de proteasa modificados y ácidos nucleicos contenidos en artículos de empaquetamiento.
Como se usa en el presente documento, el fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Los fluidos abarcan por lo tanto composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de dichas composiciones.
Como se usa en el presente documento, un “kit” se refiere a una combinación empaquetada, opcionalmente incluyendo reactivos y otros productos y/o componentes para practicar métodos usando los elementos de la
55 combinación. Por ejemplo, se proporcionan kits que contienen un polipéptido de proteasa modificado o molécula de ácido nucleico proporcionado en el presente documento y otro artículo para un fin incluyendo, pero sin limitación, administración, diagnóstico y evaluación de una actividad o propiedad biológica. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para su uso.
Como se usa en el presente documento, el anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, que están compuestos de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada.
Como se usa en el presente documento, un receptor se refiere a una molécula que tienen una afinidad por un ligando particular. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores también
65 pueden denominarse en la técnica anti ligandos.
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Como se usa en el presente documento, el animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitación: primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos, tales como cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como el animal contemplado. Las proteasas proporcionadas en el presente
5 documento son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariota y fúngica.
Como se usa en el presente documento, la terapia génica implica la transferencia de ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, a ciertas células, células diana, de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afección para el que se busca dicha terapia. El ácido nucleico, tal como ADN, se introduce en las células diana seleccionadas, tal como directamente o en un vector u otro vehículo de suministro, de tal manera que el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, se exprese y se produzca un producto terapéutico codificado por el mismo. Como alternativa, el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, puede mediar de alguna manera en la expresión de ADN que codifica el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o indirectamente, en la expresión de un producto terapéutico. La terapia genética también
15 puede usarse para suministrar ácido nucleico que codifica un producto génico que reemplaza un gen defectuoso o complementa un producto génico producido por el mamífero o la célula en la que se introduce. El ácido nucleico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como una proteasa o proteasa modificada, que no se produce normalmente en el hospedador mamífero o que no se produce en cantidades terapéuticamente eficaces o en un tiempo terapéuticamente útil. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes de la introducción en las células del hospedador aquejado para potenciar o alterar de otro modo el producto o la expresión del mismo. La terapia génica también puede implicar el suministro de un inhibidor o represor u otro modulador de la expresión génica.
Como se usa en el presente documento, el ácido nucleico heterólogo es ácido nucleico que no se produce 25 normalmente in vivo por la célula en la que se expresa o que se produce por la célula pero está en un locus diferente
o se expresa de forma diferente o que media en o codifica mediadores que alteran la expresión de ácido nucleico endógeno, tal como ADN, afectando a la transcripción, traducción u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterólogo generalmente no es endógeno para la célula en la que se introduce, pero se ha obtenido de otra célula o se ha preparado de forma sintética. El ácido nucleico heterólogo puede ser endógeno, pero es ácido nucleico que se expresa a partir de un locus diferente o se altera en su expresión. Generalmente, aunque no necesariamente, dicho ácido nucleico codifica ARN y proteínas que no se producen normalmente por la célula o de la misma manera en la célula en la que se expresan. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, también puede denominarse ácido nucleico ajeno, tal como ADN. Por lo tanto, el ácido nucleico heterólogo o ácido nucleico ajeno incluye una molécula de ácido nucleico no presente en la orientación o posición exacta ya que la molécula de ácido
35 nucleico homóloga, tal como ADN, se encuentran en un genoma. También puede referirse a una molécula de ácido nucleico de otro organismo u otra especie (es decir, exógeno).
Cualquier ácido nucleico, tal como ADN, que un experto en la materia reconocería o consideraría heterólogo o ajeno a la célula en la que se expresa el ácido nucleico está abarcado en el presente documento por ácido nucleico heterólogo; el ácido nucleico heterólogo incluye ácido nucleico añadido de forma exógena que también se expresa de forma endógena. Los ejemplos de ácido nucleico heterólogo incluyen, pero sin limitación, ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreables, tales como una proteína que confiere resistencia a fármacos, ácido nucleico que codifica sustancias terapéuticamente eficaces, tales como agentes antineoplásicos, enzimas y hormonas, y ácido nucleico, tal como ADN, que codifica otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los
45 anticuerpos que se codifican por ácido nucleico heterólogo pueden secretarse o expresarse en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.
Como se usa en el presente documento, un producto terapéuticamente eficaz para terapia génica es un producto que está codificado por ácido nucleico heterólogo, típicamente ADN, que, tras la introducción del ácido nucleico en un hospedador, se expresa un producto que alivia o elimina los síntomas, manifestaciones de una enfermedad heredada o adquirida o que cura la enfermedad. También se incluyen moléculas de ácido nucleico biológicamente activas, tales como ARNi y antisentido.
Como se usa en el presente documento, la indicación de que un polipéptido “consiste esencialmente” en una
55 secuencia enumerada de aminoácidos significa que solamente la parte enumerada, o un fragmento de la misma, del polipéptido de longitud completa está presente. El polipéptido puede opcionalmente incluir, y generalmente incluirá, aminoácidos adicionales de otra fuente o puede insertarse en otro polipéptido.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un compuesto, que comprende “un dominio extracelular” incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Como se usa en el presente documento, los intervalos y las cantidades pueden expresarse como “aproximadamente” un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto
65 “aproximadamente 5 bases” significa “aproximadamente 5 bases” y también “5 bases”.
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Como se usa en el presente documento, “opcional” u “opcionalmente” significa que el acontecimiento o la circunstancia descrito a continuación sucede o no sucede, y que la descripción incluye casos en los que dicho acontecimiento o dicha circunstancia sucede y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sustituido o no está sustituido.
5 Como se usa en el presente documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido y otros compuestos son, a no ser que se indique de otro modo, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión sobre Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11: 1726).
B. Visión de conjunto de la hemostasia
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de Factor VII (FVII) modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Dichos polipéptidos de FVII se diseñan para tener actividad coagulante aumentada. En consecuencia, estos polipéptidos tienen una diversidad de usos y aplicaciones, por ejemplo, como productos
15 terapéuticos para modular la hemostasia, y otros procesos biológicos relacionados. Para apreciar las modificaciones proporcionadas en el presente documento y el uso de dichas moléculas de FVII modificadas, es ventajoso un entendimiento del sistema hemostático y la cascada de coagulación sanguínea. El siguiente análisis proporciona dicho fondo, previo a un análisis del factor VII, y modificaciones del mismo.
La hemostasia es el mecanismo fisiológico que surge del sangrado que resulta de lesión a la vasculatura. La hemostasia normal depende de componentes celulares y proteínas de plasma solubles, e implica una serie de acontecimientos de señalización que en última instancia conducen a la formación de un coágulo sanguíneo. La coagulación se inicia rápidamente después de producirse una lesión en el vaso sanguíneo y dañarse células endoteliales. En la fase primaria de coagulación, las plaquetas se activan para formar un tapón hemostático en el
25 sitio de lesión. Continúa la hemostasia secundaria que implica factores de coagulación de plasma, que actúan en una cascada proteolítica que da como resultado la formación de cadenas de fibrina que refuerzan el tapón plaquetario. Tras la lesión de los vasos, el flujo sanguíneo al área lesionada inmediata se restringe por constricción vascular lo que permite que las plaquetas se adhieran al colágeno fibrilar recién expuesto en el tejido conectivo subendotelial. Esta adhesión depende del factor de von Willebrand (vWF), que se une con el endotelio en tres segundos desde la lesión, facilitando de este modo la adhesión y agregación de plaquetas. La activación de las plaquetas agregadas da como resultado la secreción de una diversidad de factores, incluyendo ADP, ATP, tromboxano y serotonina. También se liberan moléculas de adhesión, fibrinógeno, vWF, trombospondina y fibronectina. Dicha secreción promueve la adhesión y agregación adicional de plaquetas, activación de plaquetas aumentada y constricción de
35 vasos sanguíneos, y exposición de fosfolípidos aniónicos en la superficie de plaquetas que actúan como plataformas para el ensamblaje de complejos enzimáticos de coagulación sanguínea. Las plaquetas cambian de forma lo que conduce a formación de seudópodos, lo que facilita adicionalmente la agregación con otras plaquetas dando como resultado un tapón plaquetario suelto.
Se inicia simultáneamente una cascada de coagulación de peptidasas (la cascada de coagulación). La cascada de coagulación implica una serie de acontecimientos de activación que implican la escisión proteolítica. En dicha cascada, una proteína inactiva de una serina proteasa (también denominada un zimógeno) se convierte en una proteasa activa por la escisión de uno o más enlaces peptídicos, que después actúa como la proteasa activadora para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, dando como resultado en último instancia formación de
45 coágulo por la reticulación de fibrina. Por ejemplo, la cascada genera moléculas activadas tales como trombina (a partir de escisión de protrombina), que activa adicionalmente plaquetas, y también genera fibrina a partir de escisión de fibrinógeno. La fibrina forma después un polímero reticulado alrededor del tapón plaquetario para estabilizar el coágulo. Tras la reparación de la lesión, la fibrina se digiere por el sistema fibrinolítico, cuyos componentes principales son el plasminógeno y el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA). Ambas de estas proteínas se incorporan en fibrina de polimerización, donde interaccionan para generar plasmina, que, a su vez, actúa en la fibrina para disolver el coágulo preformado. Durante la formación de coágulo, también circulan inhibidores del factor de coagulación a través de la sangre para prevenir la formación de coágulos más allá del sitio de lesión.
La interacción del sistema, desde la lesión a la formación del coágulo y la fibrinolisis posterior, se describe a 55 continuación.
1. Adhesión y agregación de plaquetas
La coagulación de la sangre se evita activamente en condiciones normales. El endotelio vascular soporta vasodilatación, inhibe la adhesión y activación de plaquetas, suprime la coagulación, potencia la escisión de fibrina y es de carácter antiinflamatorio. Las células endoteliales vasculares secretan moléculas tales como óxido nitroso (NO) y prostaciclina, que inhiben la agregación de plaquetas y dilatan los vasos sanguíneos. La liberación de estas moléculas activa guanilato ciclasas solubles (sGC) y proteína quinasa dependiente de cGMP I (cGKI) y aumenta los niveles de guanosin monofosfato cíclico (cGMP), lo que provoca relajación del músculo liso en la pared vascular.
65 Además, las células endoteliales expresan ADPasas de superficie celular, tales como CD39, que controlan la activación y agregación de plaquetas convirtiendo ADP liberado de plaquetas en inhibidores de plaquetas de nucleótido adenina. El endotelio también desempeña un papel importante en la regulación de las enzimas en la cascada fibrinolítica. Las células endoteliales promueven directamente la generación de plasmina a través de la expresión de receptores de plasminógeno (anexina II) y uroquinasa, así como la secreción de activadores de plasminógeno de tipo tisular y uroquinasa, todos los cuales promueven la eliminación de coágulos. En una capa final
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5 de regulación protrombótica, las células endoteliales desempeñan un papel activo en la inhibición de la cascada de coagulación produciendo heparán sulfato, lo que aumenta la cinética de la inhibición de antitrombina III de trombina y otros factores de coagulación.
Con traumatismo vascular agudo, sin embargo, predominan los mecanismos vasoconstrictores y el endotelio se hace de naturaleza protrombótica, procoagulatoria y proinflamatoria. Esto se consigue por una reducción de agentes de dilatación endotelial: adenosina, NO y prostaciclina; y la acción directa de ADP, serotonina y tromboxano en células del músculo liso vascular para inducir su contracción (Becker, Heindl et al., 2000). El desencadenante principal para el cambio en la función endotelial que conduce a la formación de trombo hemostático es la pérdida de la barrera celular endotelial entre la sangre y los componentes de la matriz extracelular (ECM) (Ruggeri (2002) Nat
15 Med 8: 1227-1234). Las plaquetas en circulación identifican y diferencian áreas de lesiones endoteliales y se adhieren al subendotelio expuesto. Su interacción con los diversos sustratos trombogénicos y agonistas liberados o generados localmente da como resultado activación de plaquetas. Se describe que este proceso posee dos estadios, 1) adhesión: la unión inicial a una superficie y 2) agregación: la cohesión plaqueta-plaqueta (Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8: 270-276).
La adhesión plaquetaria se inicia cuando las plaquetas en circulación se unen con colágeno expuesto mediante interacción con proteínas de unión a colágeno en la superficie celular, y mediante interacción con vWF, también presente en el endotelio. La proteína vWF es una estructura multimérica de tamaño variable, secretada en dos direcciones por el endotelio; basolateralmente y en el torrente sanguíneo. vWF también se une con el factor VIII, que
25 es importante en la estabilización del factor VIII y su supervivencia en la circulación.
Se consigue adhesión y posterior activación de plaquetas cuando vWF se une mediante su dominio A1 con GPIb (parte del complejo de receptor de glucoproteína de plaquetas GPIb-IX-V). La interacción entre vWF y GPIb está regulada por fuerza de corte de modo que un aumento en el esfuerzo cortante dé como resultado un aumento correspondiente en la afinidad de vWF por GPIb. La integrina 12, también conocida en leucocitos como VLA-2, es el receptor de colágeno principal en plaquetas, y la interacción mediante este receptor genera las señales intracelulares que contribuyen a la activación de plaquetas. La unión mediante 12 facilita la interacción del receptor de colágeno de menos afinidad, GP VI. Este es parte de la superfamilia de inmunoglobulina y es el receptor que genera las señales intracelulares más potentes para activación de plaquetas. La activación de plaquetas da
35 como resultado la liberación de adenosin difosfato (ADP), que se convierte en tromboxano A2.
La activación de plaquetas también da como resultado expresión en superficie de receptores de glucoproteína de plaquetas IIb-IIIa (GP IIb-IIIa), también conocidos como integrina de plaquetas IIb3. Los receptores de GP IIb-IIIa permiten la adherencia de plaquetas entre sí (es decir agregación) en virtud de moléculas de fibrinógeno que unen las plaquetas a través de estos receptores. Esto da como resultado la formación de un tapón plaquetario en el sitio de lesión para ayudar a prevenir pérdida de sangre adicional, mientras que el tejido vascular dañado libera factores que inician la cascada de coagulación y la información de una red de fibrina estabilizante alrededor del tapón plaquetario.
45 2. Cascada de coagulación
La ruta de coagulación es una ruta proteolítica donde cada enzima está presente en el plasma como un zimógeno, o una forma inactiva. La escisión del zimógeno está regulada para liberar la forma activa de la molécula precursora. Los cofactores de las proteasas activadas, tales como las glucoproteínas FVIII y FV, también están activados en la reacción de cascada y desempeña un papel en la formación de coágulos. La ruta actúa como una serie de bucles de retroalimentación positiva y negativa que controlan el proceso de activación, donde el objetivo último es producir trombina, que después puede convertir fibrinógeno soluble en fibrina para formar un coágulo. Se proporciona típicamente a los factores en la coagulación un número romano, con una “a” en minúscula adjunta para indicar una forma activada. La Tabla 3 a continuación expone una lista ejemplar de los factores, incluyendo su nombre común, y
55 su papel en la cascada de coagulación. En general, estas proteínas participan en la coagulación sanguínea a través de una o más de las rutas de coagulación intrínseca, extrínseca o común (véase Figura 1). Como se analiza posteriormente, estas rutas están interconectadas, y se cree que la coagulación sanguínea se produce a través de un modelo basado en células de activación siendo el Factor VII (FVII) el iniciador primario de la coagulación.
Tabla 3
Factores de Coagulación
Factor
Nombre Común Ruta Característica
I
Fibrinógeno Ambas -
II
Protrombina Ambas Contiene dominio Gla N terminal
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Factores de Coagulación
Factor
Nombre Común Ruta Característica
III
Factor Tisular Extrínseca -
IV
Calcio Ambas -
V
Proaccelerina, factor lábil, globulina Acelerante Ambas Cofactor proteico
VI (Va)
Accelerina - (Redundante para factor V)
VII
Proconvertina, cotromboplastina aceleradora de conversión de protrombina en suero (SPCA) Extrínseca Endopeptidasa con dominio Gla
VIII
Factor antihemofílico A, globulina antihemofílica (AHG) Intrínseca Cofactor proteico
IX
Factor Christmas, factor antihemofílico B, componente de tromboplastina en plasma (PTC) Intrínseca Endopeptidasa con dominio Gla
X
Factor de Stuart-prower Ambas Endopeptidasa con dominio Gla
XI
Antecedente de tromboplastina en plasma (PTA) Intrínseca Endopeptidasa
XII
Factor de Hageman Intrínseca Endopeptidasa
XIII
Protransglutamidasa, factor estabilizante de fibrina (FSF), fibrinoligasa Ambas Transpeptidasa
*Tabla adaptada de M. W. King (2006) en med.unibs.it/marchesi/blood.html
La generación de trombina se ha dividido históricamente en tres rutas, la ruta intrínseca (que sugiere que todos los componentes de la ruta son intrínsecos al plasma) y la extrínseca (que sugiere que uno o más componentes de la ruta son extrínsecos al plasma) que proporcionan vías alternativas para la generación de factor X activado (FXa), y 5 la ruta común final que da como resultado formación de trombina (Figura 1). Estas rutas participan juntas en un proceso interconectado e interdependiente para efectuar coagulación. Se desarrolló un modelo de coagulación basado en células que describe estas rutas (Figura 2) (Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). En este modelo, las rutas “extrínseca” e “intrínseca” se efectúan en superficies celulares diferentes, la célula portadora de factor tisular (FT) y la plaqueta, respectivamente. El proceso de coagulación se separa en fases distintas, inicio,
10 amplificación y propagación, durante las que las rutas extrínseca e intrínseca actúan en diversos estadios para producir el gran estallido de trombina requerido para convertir suficientes cantidades de fibrinógeno en fibrina para la formación de coágulos.
a. Inicio
15 Se considera que FVII es el factor de coagulación responsable del inicio de la cascada de coagulación, cuyo inicio depende de su interacción con FT. FT es una glucoproteína transmembrana expresada por una diversidad de células tales como células de músculo liso, fibroblastos, monocitos, linfocitos, granulocitos, plaquetas y células endoteliales. Las células mieloides y células endoteliales solamente expresan FT cuando se estimulan, tal como por
20 citocinas proinflamatorias. Las células y fibroblastos de músculo liso, sin embargo, expresan FT de forma constitutiva. En consecuencia, una vez que estas células entran en contacto con el torrente sanguíneo después de la lesión tisular, la cascada de coagulación se inicia rápidamente por la unión de FT con el factor VII o FVIIa en el plasma.
25 Como se analiza posteriormente, la mayoría de FVII en la sangre está en la forma de zimógeno con una cantidad pequeña, aproximadamente 1 %, presente como FVIIa. En ausencia de la unión con FT, sin embargo, incluso FVIIa tiene características de tipo zimógeno y no presenta actividad significativa hasta que forma complejo con FT. Por lo tanto, FVII en plasma requiere activación por escisión proteolítica, y cambio conformacional adicional mediante interacción con FT, para actividad completa. Se ha mostrado que una serie de proteasas, incluyendo los factores
30 IXa, Xa, XIIa y trombina, tienen capacidad de escisión de FVII in vitro, un proceso que se acelera en presencia de FT. FVIIa en sí mismo también puede activar FVII en presencia de FT, un proceso denominado autoactivación. Las cantidades pequeñas de FVIIa en la sangre probablemente se deban a la activación por FXa y/o FIXa (Wildgoose et al. (1992) Blood 80: 25-28, y Butenas et al. (1996) Biochemistry 35: 1904-1910). Pueden por lo tanto formarse complejos de FT/FVIIa por la unión directa de FVIIa con FT, o por la unión de FVII con FT y después la activación
35 posterior de FVII a FVIIa por una proteasa de plasma, tal como FXa, FIXa, FXIIa o FVIIa en sí mismo. El complejo de FT/FVIIa permanece anclado a la célula portadora de FT donde activa cantidades pequeñas de FX a FXa en lo que se conoce como la “ruta extrínseca” de coagulación.
El complejo de FT/FVIIa también escinde cantidades pequeñas de FIX a FIXa. FXa se asocia con su cofactor FVa
40 para formar también un complejo en la célula portadora de FT que puede convertir después protrombina en trombina. La cantidad pequeña de trombina producida es, por ejemplo, inadecuada para apoyar la formación de fibrina requerida para coagulación completa. Adicionalmente, se inhiben cualquier FXa y FIXa activo en la circulación por antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, lo que se analiza en más detalle posteriormente. Esto evitaría normalmente la formación de coágulos en la circulación. En presencia de lesión, sin embargo, el daño a la
45 vasculatura da como resultado agregación y activación de plaquetas en este sitio de formación de trombina, permitiendo de este modo la amplificación de la señal de coagulación.
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b. Amplificación
La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con y activa las plaquetas. Las plaquetas activadas liberan FV desde sus gránulos alfa que se activa por trombina a FVa. La trombina también libera y activa FVIII del complejo
5 de FVIII/vWF en la membrana de plaquetas y escinde FXI a FXIa. Estas reacciones generan plaquetas activadas que tienen FVa, FVIIIa y FIXa en su superficie, que sientan las bases para un gran estallido de generación de trombina durante el estadio de propagación.
c. Propagación
La propagación de la coagulación se produce en la superficie de grandes números de plaquetas en el sitio de lesión. Como se ha descrito anteriormente, las plaquetas activadas tienen FXIa, FVIIIa y FVa en su superficie. Es aquí donde se efectúa la ruta extrínseca. FXIa activa FIX a FIXa, que después puede unirse con FVIIIa. Este proceso, además de las cantidades pequeñas de FIXa que se generan por escisión de FIX por el complejo de FT/FVIIa en la
15 célula portadora de FT, genera grandes números de complejos FXIa/FVIIIa que a su vez pueden activar cantidades significativas de FX a FXa. Las moléculas de FXa se unen con FVa para generar los complejos de protrombinasa que activan protrombina a trombina. La trombina actúa en un bucle de retroalimentación positiva para activar aún más plaquetas e inicia de nuevo los procesos descritos para la fase de amplificación.
Muy brevemente, hay suficientes números de plaquetas activas con los complejos apropiados para generar el estallido de trombina que es suficientemente grande para generar suficientes cantidades de fibrina a partir de fibrinógeno para formar un coágulo de fibrina hemostático. El fibrinógeno es un dímero soluble en plasma que, cuando se escinde por trombina, libera fibrinopéptido A y fibrinopéptido B. El fibrinopéptido B se escinde después por trombina y los monómeros de fibrina formados por esta segunda escisión proteolítica forman espontáneamente
25 un gel insoluble. La fibrina polimerizada se mantiene unida por fuerzas no covalentes y electroestáticas y se estabiliza por la enzima de transamidación Factor XIIIa (FXIIIa), producida por la escisión de FVIII por trombina. La trombina también activa TAFI, que inhibe la fibrinolisis produciendo la generación de plasmina en la superficie del coágulo. Adicionalmente, la trombina en sí misma se incorpora en la estructura del coágulo para estabilización adicional. Estos agregados de fibrina insoluble (coágulos), junto con plaquetas agregadas (trombos), bloquean el vaso sanguíneo dañado y evitan sangrado adicional.
3. Regulación de la coagulación
Durante la coagulación, la cascada se regula por procesos constitutivos y estimulados para inhibir la formación de
35 coágulo adicional. Hay varias razones para dichos mecanismos reguladores. En primer lugar, se requiere la regulación para limitar la isquemia de tejidos por formación de coágulos de fibrina. En segundo lugar, la regulación evita la trombosis generalizada localizando la formación de coágulos solamente en el sitio de lesión tisular.
Se consigue regulación mediante los cationes de varias moléculas inhibidoras. Por ejemplo, la antitrombina III (AT-III) y el inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) actúan de forma constitutiva para inhibir factores en la cascada de coagulación. AT-III inhibe la trombina, FIXa y FXa, mientras que IRFT inhibe FXa y el complejo FVIIa/FT. Un factor adicional, Proteína C, que se estimula mediante activación de plaquetas, regula la coagulación por escisión proteolítica e inactivación de FVa y FVIIIa. La Proteína S potencia la actividad de la Proteína C. Además, otro factor que contribuye a la inhibición de la coagulación es la proteína integral de membrana trombomodulina, que se
45 produce por células endoteliales vasculares y actúa como un receptor para trombina. El enlace de trombina con trombomodulina inhibe las actividades procoagulantes de trombina y también contribuye a la activación de la proteína C.
La fibrinolisis, la degradación del coágulo de fibrina, también proporciona un mecanismo para regular la coagulación. Los multímeros de fibrina reticulados en un coágulo se degradan en polipéptidos solubles por plasmina, una serina proteasa. La plasmina puede generarse a partir de su plasminógeno precursor inactivo y reclutarse al sitio de un coágulo de fibrina de dos maneras: mediante interacción con el activador de plasminógeno tisular (tPA) en la superficie de un coágulo de fibrina, y mediante interacción con activador de plasminógeno de uroquinasa (uPA) en una superficie celular. El primer mecanismo parece ser el principal responsable de la disolución de coágulos en los
55 vasos sanguíneos. El segundo, aunque es capaz de mediar en la disolución de coágulos, puede desempeñar un papel importante en la remodelación tisular, migración celular e inflamación.
La disolución de coágulos se regula de dos maneras. En primer lugar, la activación de plasmina eficaz y fibrinolisis se producen solamente en complejos formados en la superficie del coágulo o en una membrana celular, mientras que las proteínas libres en la sangre son catalizadores ineficaces y se inactivan rápidamente. En segundo lugar, se inactivan activadores de plasminógeno y plasmina por moléculas tales como inhibidor de activador de plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y PAI-2 que actúan en los activadores de plasminógeno, y antiplasmina 2 y macroglobulina 2 que inactivan la plasmina. En circunstancias normales, el equilibrio oportuno entre la coagulación y la fibrinolisis da como resultado la formación eficaz y eliminación de coágulos después de lesión vascular, mientras se evitan
65 simultáneamente episodios trombóticos o de sangrado no deseados.
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Se expone en la Tabla 4 a continuación un sumario de factores de coagulación, cofactores y proteínas reguladoras ejemplares, y sus actividades.
Tabla 4
Zimógenos de Factor de Coagulación y Cofactores
Nombre del Factor
Actividad
Zimógenos de Serina Proteasas
Factor XII
Se une con colágeno expuesto en el sitio de lesión de la pared vascular, activado por quininógeno de alto PM y calicreína
Factor XI
Activado por factor XIIa
Factor IX
Activado por factor XIa + Ca2+
Factor VII
Activado por trombina, factor X, factor IXa o factor XIIa + Ca2+ , o autoactivación
Factor X
Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de tenasa (FDCa/FVIIIa); También activado por factor VIIa + factor tisular + Ca2+, o factor VIIa + Ca2+
Factor II
Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de protrombinasa (FXa/FVa)
Cofactores
Factor VIII
Activado por trombina; el factor VIIIa actúa como cofactor para el factor IXa en la activación del factor X
Factor V
Activado por trombina; el factor Va actúa como cofactor para el factor Xa en la activación de protrombina
Factor III (factor Tisular)
Actúa como cofactor para el factor VIIa
Fibrinógeno
Factor I (Fibrinógeno)
Escindido por trombina para formar fibrina
Transglutaminasa
Factor XIII
Activado por trombina + Ca2+; promueve la reticulación covalente de fibrina
Proteínas reguladoras y otras
Factor de von Willebrand (vWF)
Actúa como enlace entre el complejo de GPIb-V-IX y colágeno
Proteína C
Activado por trombina unida a trombomodulina; Ca degrada los factores VIIIa y Va
Proteína S
Actúa como cofactor de la proteína C
Trombomodulina
Proteína de superficie celular endotelial; se une con trombina, que activa la proteína C
Antitrombina III
Inhibidor de coagulación, principalmente de trombina y factor Xa, pero también factores IXa, XIa, y XIIa, y el factor VIIa en complejo con FT
Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (IRFT)
Se une con FXa y después forma una estructura cuaternaria con FT/FVIIa para inhibir la actividad de FT/FVIIa
*Tabla adaptada de M. W. King (2006) med.unibs.it/marchesi/blood.html
5
C. Factor VII (FVII)
El factor VII es una glucoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina K que se sintetiza en animales, incluyendo mamíferos, como un zimógeno monocatenario en el hígado y se secreta el torrente sanguíneo. Como se 10 ha descrito anteriormente, FVII es la proteasa de coagulación responsable de iniciar la cascada de acontecimientos proteolíticos que conducen a generación de trombina y deposición de fibrina. Es parte de la ruta extrínseca, aunque los efectos corriente abajo de su actividad también influyen en gran medida en la ruta intrínseca. Este papel integral en la función de coágulos ha atraído un interés significativo en FVII como una diana para terapias anticoagulantes y hemostáticas clínicas. Por ejemplo, se ha desarrollado FVII activado recombinante (rFVIIa) como un agente
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hemostático para su uso en sujetos hemófilos, y sujetos con otras afecciones de sangrado. Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para tener actividad de coagulación aumentada tras su activación, y que pueden actuar como productores terapéuticos mejorados para tratar enfermedades y afecciones susceptibles a terapia de factor VII.
5
1. Estructura y organización de FVII
El gen de FVII humano (F7) se localiza en el cromosoma 13 en 13q34 y es de 12,8 kb de longitud con 9 exones. El gen de FVII comparte similitud de organización significativa con genes que codifican otras proteínas dependientes de vitamina K, tales como protrombina, factor IX, factor X y proteína C. El ARNm para FVII experimenta corte y empalme alternativo para producir dos transcritos: variante 1 (n.º de Referencia de Genbank NM_000131, expuesto en SEQ ID NO: 81) y variante 2 (n.º de Referencia de Genbank NM_019616, expuesto en SEQ ID NO: 82). La variante de transcrito 2, que es la forma más abundante en el hígado, no incluye el exón 1b y por lo tanto codifica un polipéptido precursor más corto de 444 aminoácidos (precursor de isoforma b de FVII; SEQ ID NO: 2), en
15 comparación con el polipéptido precursor de 466 aminoácidos codificado por la variante de transcrito 1 (precursor de isoforma a de FVII; SEQ ID NO: 1). Los aminoácidos que no están presentes en el polipéptido de precursor de isoforma b de FVII corresponden a los aminoácidos 22 a 43 del precursor de isoforma a de FVII. Estos aminoácidos son parte de la secuencia propeptídica, que da como resultado propéptido de isoforma b de FVII truncado. Los polipéptidos precursores están compuestos de los siguientes segmentos y dominios: un péptido señal hidrófobo (aa 1-20 de SEQ ID NO: 1 y 2), un propéptido (aa 21-60 de SEQ ID NO: 1, y aa 21-38 de SEQ ID NO: 2), un dominio Gla (aa 39-83 de SEQ ID NO: 2, y aa 61-105 de SEQ ID NO: 1), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo B (tipo EGF 1, aa 84-120 de SEQ ID NO: 2, y aa 106-142 de SEQ ID NO: 1), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo A (tipo EGF 2, aa 125-166 de SEQ ID NO: 2; y aa 147-188 de SEQ ID NO: 1), y un dominio de serina proteasa (aa 191-430 de SEQ ID NO: 2, y aa 213-452 de SEQ ID NO: 1).
25 La forma madura de 406 aminoácidos del polipéptido de FVII (SEQ ID NO: 3) carece de las secuencias de péptido y propéptido señal, y es idéntica en su longitud y secuencia independientemente del precursor de isoforma del que se originó. En la forma madura del polipéptido de FVII las posiciones de aminoácidos correspondientes para los dominios anteriormente mencionados son las siguientes: dominio Gla (aa 1-45 de SEQ ID NO: 3), tipo EGF 1 (aa 4682 de SEQ ID NO: 3), tipo EGF 2 (aa 87-128 de SEQ ID NO: 3), y dominio de serina proteasa (aa 153-392 de SEQ ID NO: 3).
El dominio Gla de FVII es un motivo de unión a membrana que, en presencia de iones de calcio, interacciona con membranas fosfolipídicas que incluyen fosfatidilserina. El dominio Gla también desempeña un papel en la unión con
35 el cofactor de FVIIa, el factor tisular (FT). En complejo con FT, el dominio Gla de FVIIa se carga con siete iones Ca2+, proyecta tres cadenas laterales hidrófobas en la dirección de la membrana celular para interacción con fosfolípidos en la superficie celular, y tiene un contacto significativo con el dominio C-terminal de FT. El dominio Gla está conservado entre proteínas dependientes de vitamina K, tales como protrombina, factores de coagulación VII, IX y X, proteínas C, S y Z. Estas proteínas requieren vitamina K para la síntesis postraduccional de ácido carboxiglutámico, un aminoácido agrupado en el dominio Gla N terminal de esta proteínas. Todos los restos glutámicos presentes en el dominio son sitios de carboxilación potenciales y muchos de ellos se modifican por lo tanto por carboxilación.
Además del dominio Gla, la proteína FVII madura también contiene dos dominios de tipo EGF. El primer dominio de
45 tipo EGF (tipo EGF 1 o EGF1) es un dominio de EGF de unión a calcio, en el que seis cisteínas centrales conservadas forman tres enlaces disulfuro. El dominio de EGF1 de FVII se une con solamente un ión Ca2+, pero con afinidad significativamente mayor que la observada con el dominio Gla (Banner et al. (1996) Nature 380: 41-46). Este ión Ca2+ unido promueve la fuerte interacción entre el dominio de EGF1 de FVII y FT (Osterlund et al. (2000) Eur J Biochem 267: 6204-6211). El segundo dominio de tipo EGF (tipo EGF 2 o EGF2) no es un dominio de unión a calcio, pero también forma 3 enlaces disulfuro. Como los otros dominios en FVII, el dominio de EGF2 interacciona con FT. También se une por enlace disulfuro con el dominio de proteasa, con el que comparte una gran interfaz de contacto.
Finalmente, el dominio de serina proteasa de FVII es el dominio responsable de la actividad proteolítica de FVIIa. La
55 secuencia de aminoácidos de FVII en su dominio catalítico presenta alta identidad de secuencia y similitud de estructura terciaria con otras serina proteasas tales como tripsina y quimotripsina (Jin et al. (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). Por ejemplo, estas serina proteasas comparten una triada catalítica común H57, D102, S195, basándose en la numeración de quimotripsina. A diferencia de otras serina proteasas, sin embargo, la escisión de FVIIa no es suficiente para completar la conversión del zimógeno en una enzima completamente activa. En su lugar, como se analiza posteriormente, FVIIa se activa de forma alostérica en su función catalítica mediante la unión con el receptor de superficie celular FT, que induce un cambio conformacional en el dominio de proteasa de FVIIa cambiándolo de un estado inactivo de tipo zimógeno a una enzima catalíticamente activa. Una región de bucle de hélice entre el sitio de unión a cofactor y el sitio activo (es decir las posiciones de restos de aminoácidos 305-321, correspondientes a los restos 163-170i basándose en la numeración de quimotripsina) de FVIIa es importante para
65 la alostericidad y zimogenicidad de FVIIa (Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503). Esta región está compuesta por una hélice  corta (posiciones de restos de aminoácidos 307 a 312) seguida de un bucle. La parte N terminal de la hélice forma parte de la interfaz entre el dominio de proteasa y FT, y contiene varios restos que son importantes para la función proteolítica y la unión óptima con FT. Una comparación de la estructura cristalina de FVIIa solamente y FVIIa en complejo con FT indica que la hélice a experimenta un cambio conformacional significativo cuando FVIIa se une con FT. La hélice a de FVIIa solamente aparece distorsionada, acortada y
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5 orientada de forma diferente. Esto afecta a las estructuras en bucle adyacentes, alejándolas del sitio activo. Por el contrario, la hélice  de FVIIa cuando está en complejo con FT está estabilizada, y los bucles adyacentes se sitúan más cercanos al sitio activo. Esta estabilización se efectúa mediante mecanismos que implican al menos la metionina en la posición de aminoácido 306 (resto de aminoácido Met164 por numeración de quimotripsina) de FVII (Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930).
2. Modificaciones postraduccionales
El polipéptido precursor de FVII (una de las isoformas del gen del Factor VII) se dirige a la ruta secretora celular por el péptido señal hidrófobo, que se inserta en el retículo endoplásmico (RE) para iniciar la translocación a través de la
15 membrana. Aunque la proteína se transloca a través de la membrana del RE, el péptido señal de 20 aminoácidos se escinde por una peptidasa señal dentro del lumen de RE, después de lo cual el polipéptido experimenta modificaciones postraduccionales adicionales, incluyendo N y O-glucosilación, carboxilación dependiente de vitamina K de los ácidos glutámicos N terminales a ácidos -carboxiglutámicos, e hidroxilación de ácido aspártico a ácido -hidroxiaspártico.
El propéptido proporciona un sitio de unión para una carboxilasa dependiente de vitamina K que reconoce una hélice  anfipática de 10 restos en el propéptido de FVII. Después de la unión, la carboxilasa carboxila en  10 restos de ácido glutámico dentro del dominio Gla del polipéptido de FVII, produciendo restos de -carboxiglutamilo en las posiciones E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 y E95 en relación con la secuencia de aminoácidos
25 precursora de FVII expuesta en SEQ ID NO: 2. Estas posiciones corresponden a las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. Para actividad óptima, la molécula de FVII requiere calcio, que se une con el polipéptido y facilita los cambios conformacionales necesarios para unión de FVIIa con FT y lípidos. El dominio Gla -carboxilado se une con siete iones Ca2+ con afinidad variable, lo que induce el cambio conformacional que permite que el dominio Gla interaccione con el dominio de C terminal de FT, y también fosfatidilserinas y otros fosfolípidos con carga negativa en la membrana de plaquetas.
Se lleva a cabo glucosilación ligada a N por transferencia de Glc3Man9 (GlcNAc) a dos restos de asparagina en el polipéptido de FVII, en posiciones que corresponden a los restos de aminoácidos 145 y 322 de la proteína madura (SEQ ID NO: 3). Se produce glucosilación ligada a O en los restos de aminoácidos 52 y 60 del polipéptido maduro, y
35 se produce hidroxilación a un ácido -hidroxiaspártico en el resto de ácido aspártico en la posición 63. Estos restos de serina O-glucosilados y el resto de ácido aspártico -hidroxilado están en el dominio EGF-1 de FVII. Estas modificaciones se efectúan en el RE y el complejo de Golgi antes del procesamiento final del polipéptido a su forma madura.
3. Procesamiento de FVII
El polipéptido pro FVII modificado se transporta a través del lumen del Golgi al compartimento trans Golgi donde el propéptido se escinde por una propeptidasa justo antes de la secreción de la proteína de la célula. PACE/furina (donde PACE es un acrónimo para Enzima de Escisión de Aminoácidos Básicos Emparejados) es una
45 endopeptidasa localizada en la membrana del Golgi que escinde muchas proteínas en el extremo carboxilo terminal del motivo de secuencia Arg-[cualquier resto]-(Lys o Arg)-Arg. Esta propeptidasa escinde glucoproteínas dependientes de vitamina K tales como los polipéptidos de profactor IX y pro-vWF (Himmelspach et al. (2000) Thromb Research 97; 51-67), liberando el propéptido de la proteína madura. La inclusión de un sitio de reconocimiento de PACE/furina apropiado en precursores del factor VII recombinantes facilita el procesamiento y la secreción correctos del polipéptido recombinante (Margaritas et al. (2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031). PACE/furina, u otra enzima propeptidasa de tipo subtilisina, es probablemente responsable del procesamiento proteolítico de pro FVII a FVII. Puede reconocer y unirse con el motivo consenso -Arg-Arg-Arg-Arg-en las posiciones de aminoácidos 35-38 de las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1, y las posiciones 57-60 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2, escindiendo el propéptido y liberando la proteína madura para secreción.
55
4. Activación de FVII
La amplia mayoría de FVII en sangre está en forma de un zimógeno monocatenario inactivado, aunque una pequeña cantidad está presente en una forma activada bicatenaria. La activación de FVII sucede tras la escisión proteolítica del enlace Arg152-Ile153 (posiciones relativas al polipéptido de FVII maduro, expuesto en SEQ ID NO: 3), dando lugar a un polipéptido bicatenario que contiene una cadena ligera de 152 aminoácidos (aproximadamente 20 kDa) unida por un enlace disulfuro a una cadena pesada de 254 aminoácidos (aproximadamente 30 kDa). La cadena ligera de FVIIa contiene el dominio Gla y dominios de tipo EGF, mientras que la cadena pesada contiene la parte catalítica o de serina proteasa de la molécula. La conversión del FVII monocatenario al FVIIa bicatenario está mediada por 65 escisión por FIXa, FXa, FXIIa, trombina, o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno (Butenas et al. (1996)
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Biochem 35: 1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30: 10819-10824). La cantidad traza de FVIIa que aparece en circulación probablemente surja de la acción de FXa y FIXa.
Como se ha analizado anteriormente, la escisión de FVII de su forma de zimógeno a FVIIa no es suficiente para la 5 actividad completa. FVIIa requiere la asociación con FT para actividad completa (Higashi et al. (1996) J Biol Chem
271: 26569-26574). Debido a este requisito, se han atribuido a FVIIa solamente características de tipo zimógeno, que presentan plegamiento y forma de zimógeno, y que muestran actividad relativamente baja. Esta característica de tipo zimógeno de FVIIa en ausencia de su asociación con FT lo hace relativamente resistente a antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, que generalmente actúan principalmente en las formas activas de serina proteasas en lugar
10 de la forma de zimógeno. Además, IRFT, el principal inhibidor de la actividad de FT/FVIIa, tampoco se une eficazmente con la forma “inactiva” no en complejo de FVIIa.
Tras la formación del complejo con FT, FVIIa experimenta un cambio conformacional que permite la actividad completa de la molécula. Todos los dominios de FVII están implicados en la interacción con FT, pero los cambios
15 conformacionales que aparecen están localizados en el dominio de proteasa de FVIIa. Por ejemplo, los cambios conformacionales que aparecen tras la interacción alostérica de FVIIa y FT incluyen la creación de un exositio de unión a sustrato macromolecular extendido. Este sitio de unión extendido potencia en gran medida la activación proteolíticamente mediada por FVII del factor X.
20 La actividad de FVIIa se aumenta adicionalmente (es decir mil veces) cuando la interacción de FVIIa es con FT expresado en superficie celular. Esto se debe a que las membranas fosfolipídicas que contienen fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilserina, son un sitio de interacción de otros factores de coagulación dependientes de vitamina K tales como FIX y FX, que se unen mediante sus dominios Gla. Por lo tanto, la concentración local de estas proteínas dependientes de vitamina K es alta en la superficie celular, lo que promueve su interacción con el
25 complejo de FT/FVIIa.
5. Función de FVII
Aunque FVIIa muestra actividad aumentada después de la activación alostérica por FT, hay pruebas de que existen
30 mecanismos en los que FVIIa solo puede iniciar la coagulación. Por lo tanto, FVII puede actuar de una manera dependiente de FT y una independiente de FT. Esta última ruta puede desempeñar un papel mucho más pequeño en la hemostasia normal, aunque su importancia podría aumentar cuando se considera en el contexto de trastornos de sangrado, y el tratamiento de los mismos.
35 a. Actividad de FVIIa dependiente del factor tisular
FVII en circulación se une con FT en superficie celular y se activa por FIXa, FXa, trombina o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la cantidad muy pequeña de FVIIa en circulación puede unirse directamente con FT. El complejo de FT/FVIIa se une después con una fracción 40 pequeña de FX en plasma y el dominio catalítico de FVIIa escinde FX para producir FXa. Se forma por lo tanto trombina a través de la ruta extrínseca en la superficie de la célula portadora de FT, cuando FXa forma complejo con FVa y activa protrombina a trombina (Figura 3). FIX también se activa por el complejo de FT/FVIIa, proporcionando un enlace con la ruta intrínseca que actúa en la superficie de la plaqueta activada. Los sistemas de retroalimentación positiva en la cascada de coagulación descrita anteriormente proporcionan el medio por el que se producen grandes
45 cantidades de trombina, que escinde fibrinógeno a fibrina para formar un coágulo.
b. Actividad de FVIIa independiente de factor tisular
Además del mecanismo dependiente de FT para la activación de FX a FXa, existen pruebas de que FVIIa también
50 puede activar FX en ausencia de FT. Las plaquetas activadas traslocan fosfatidilserinas y otros fosfolípidos con carga negativa a la superficie externa, orientada al plasma (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9: 303-317). Estos proporcionan “receptores” alternativos a través de los que FVIIa puede unirse, aunque con una afinidad relativamente baja que es 1000 veces menor que la afinidad de unión de FVIIa con FT (Monroe et al. (1997) Br J Haematol 99: 542-7). Esta interacción está mediada mediante restos en el dominio Gla (Harvey et al. (2003) 278:
55 8363-8369). FVIIa puede convertir después FX a FXa y FIX a FIXa en la superficie de plaquetas activadas (Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9: S61-S65). El FXa permanece asociado con la superficie de plaquetas, donde puede unirse con FVa y generar suficiente trombina a partir de protrombina, mientras que el FIXa de nueva formación se ensambla con FVIIIa para catalizar la activación de más FX a FXa (Figura 3). La hemostasia en ausencia de FT puede conseguirse entonces mediante los mecanismos de retroalimentación positiva y propagación
60 descritos anteriormente. Es notable, sin embargo, que aunque FVIIIa puede contribuir al proceso de coagulación en la plaqueta activada, su presencia no se requiere para la generación de trombina en el mecanismo independiente de FT (Figura 3). Por lo tanto, en ausencia de FVIII, tal como en pacientes con hemofilia, existen pruebas de que FVIIa puede iniciar y/o amplificar la generación de trombina a través de este mecanismo secundario, y efectuar formación de coágulos.
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6. FVII como un producto biofarmacéutico
FVII actúa para iniciar la coagulación sanguínea. FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) está aprobado para el tratamiento de episodios de sangrado o prevención de sangrado en procedimientos quirúrgicos o invasivos en
5 pacientes que tienen hemofilia A o B con inhibidores para el Factor VIII o el Factor IX, y en pacientes con deficiencia del Factor VII congénita. Novoseven® es una preparación obtenida por ingeniería genética del factor VIIa que se produce en un sistema de expresión de mamíferos usando células de riñón de cría de hámster (BHK). El agente es casi idéntico al factor derivado de plasma VIIa en su estructura y función (Ratko et al 
Se ha mostrado que la administración de FVIIa recombinante (rFVIIa) promueve la coagulación sanguínea en pacientes que padecen hemofilia, y se ha descubierto que el tratamiento con dosis de FVIIa es seguro y está bien tolerado en sujetos humanos. Típicamente, el uso de rFVIIa ha sido en pacientes que han desarrollado inhibidores (es decir aloanticuerpos) para el Factor VIII o el Factor IX. El uso de rFVIIa como un coagulante se ha extendido al tratamiento de otros trastornos hemorrágicos, por ejemplo trombastenia de Glanzmann; otros acontecimientos
15 asociados con sangrado extensivo, tales como el resultado de traumatismo o cirugía incluyendo, pero sin limitación, trasplantes de hígado, cirugía de próstata y traumatismo hemorrágico; coagulopatías neonatales, enfermedad hepática grave; trasplante de médula ósea, trombocitopenias y trastornos de función plaquetaria; inversión urgente de la anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X y XI; y enfermedad de von Willebrand con inhibidores para el factor de von Willebrand.
Se requiere una alta dosis de rFVII para conseguir un efecto terapéutico. La dosis y el régimen de dosificación requeridos para administración de rFVII varía dependiendo de la indicación clínica. Por ejemplo, la dosificación típica de rFVII para episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o hemofilia B que tienen aloanticuerpos es de 90 g/kg administrado por inyección intravenosa (IV). Ya que rFVII tiene una semivida de 2 horas, se requiere
25 dosificación repetida. Puede proporcionarse dosificación adicional cada dos horas hasta que se consiga la hemostasia. El intervalo de dosis puede alterarse dependiendo de la gravedad de la afección. Por ejemplo, han sido eficaces dosis que varían de 35 a 120 g/kg. Además, la dosis y el régimen de dosificación pueden variar con otras indicaciones. Por ejemplo, puede administrarse a pacientes con hemofilia A o hemofilia B que se someten a cirugía una dosis inicial de 90 g/kg inmediatamente antes de la cirugía, proporcionando dosificación repetida cada dos horas durante y después de la cirugía. Dependiendo de la gravedad de la cirugía y el episodio de sangrado, la infusión IV de embolada puede continuar cada dos a seis horas hasta que se consiga la curación. En pacientes deficientes en FVII congénitos, el rFVII se administra típicamente para evitar el sangrado en cirugía u otros procedimientos invasivos a 15 -30 g/kg cada 4-6 horas hasta que se consiga la hemostasia.
35 El mecanismo de acción de rFVIIa para iniciar la hemostasia explica el requisito de alta dosis. Los pacientes con hemofilia tienen una fase de coagulación de inicio normal, donde el complejo de FT/FVIIa activa FX a FXa y conduce a la producción de trombina en el sitio de la célula portadora de FT. A continuación, sin embargo, el proceso de coagulación fracasa ya que los pacientes con hemofilia carecen de FVIII (hemofilia A) o FIX (hemofilia B), y son por lo tanto incapaces de formar los complejos de FVIIIa/FIXa en la superficie de la plaqueta activada, lo que normalmente sirve para activar grandes cantidades de FX a FXa en las fases de amplificación y propagación descritas anteriormente. Debido a la presencia de inhibidores, tales como IRFT y AT-III, el FXa que se produce en la célula portadora de FT después de escisión por FT/FVIIIa es incapaz de difundir fácilmente entre superficies celulares. Como resultado, no se produce generación de trombina a gran escala en la superficie de la plaqueta activada, y no se forma un coágulo.
45 Hay pruebas de que el efecto hemostático de altas dosis de rFVIIIa puede conseguirse usando generación dependiente de FT y/o independiente de FT de FXa por rFVIIa en las plaquetas activadas (Figura 3). La generación de trombina dependiente de FT puede maximizarse muy rápidamente con la saturación de moléculas de FT con FVIIa y rFVIIa endógenos. En algunos casos, el rFVIIa de alta dosis puede unirse con plaquetas activadas y convertir FX en FXa. El FXa asociado a superficie activa FVa para generar suficiente trombina para hemostasia. Ya que rFVII se une con la superficie de plaqueta con baja afinidad, puede requerirse una mayor dosis de rFVII para generación de trombina. La activación de FXa en plaquetas activadas asegura que la hemostasia mediada por rFVIIa está localizada en el sitio de lesión.
55 Un medio para conseguir dosificación reducida de rFVII puede mejorar su utilidad y eficacia como un fármaco. Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados. Entre estos están polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a AT-III y actividad catalítica en presencia y/o ausencia de FT. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también pueden mostrar resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, unión y/o afinidad con plaquetas activadas aumentada, unión y/o afinidad con la bobina de suero aumentada y/o unión y/o afinidad con integrina de plaquetas IIb3 aumentada. Estos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar actividad coagulante aumentada. Los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento pueden usarse en tratamientos para iniciar la hemostasia en un mecanismo dependiente de FT y/o independiente de FT de modo que se produce FXa y se genera trombina.
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D. Polipéptidos de FVII modificados
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Los polipéptidos de FVII muestran alteraciones en una o más actividades o propiedades en 5 comparación con un polipéptido de FVII que no esté modificado de este modo. Las actividades o propiedades que pueden alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; capacidad para unirse con fosfolípidos; semivida; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad procoagulante. Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividad coagulante aumentada tras la activación de su forma de zimógeno monocatenaria. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en el tratamiento de trastornos o acontecimientos de sangrado, tales como hemofilias o lesión, donde los polipéptidos de FVII pueden actuar para 15 promover la coagulación sanguínea. Se incluyen entre dichos polipéptidos de FVII modificados los que tienen resistencia aumentada a inhibidores tales como antitrombina III (AT-III) e inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), los que tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, los que tienen actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, los que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con la superficie de plaquetas, los que tienen unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y los que tienen unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. En particular, dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en enfermedades o afecciones para proporcionar actividad coagulante evitando al mismo tiempo los requisitos para FVIIIa y FIXa. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en pacientes hemofílicos que tienen autoanticuerpos para FVIIIa y FIXa. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados
25 proporcionados en el presente documento ofrecen ventajas incluyendo una reducción en la cantidad de FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para hemostasia. Esto puede conducir, por ejemplo a dosis y/o frecuencia de dosificación menores necesarios para conseguir efectos biológicos comparables, mayor comodidad y aceptación por los sujetos, y atenuación de los efectos secundarios.
Las modificaciones en un polipéptido de FVII pueden realizarse a cualquier forma de un polipéptido de FVII, incluyendo variantes alélicas y de especie, variantes de corte y empalme, variantes conocidas en la técnica, o moléculas de FVII híbridas o quiméricas. Por ejemplo, las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden realizarse en un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro 35 expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquier especie, variante alélica o modificada y fragmentos activos de las mismas, que tiene 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en la SEQ ID NO: 1-3. Las variantes alélicas de FVII incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los polipéptidos precursores que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 18-74. Las variantes de especies ejemplares para modificación en el presente documento incluyen, pero sin limitación, polipéptidos humanos y no humanos, incluyendo polipéptidos de FVII de polipéptidos de FVII de vaca, ratón, chimpancé pigmeo, chimpancé, conejo, rata, macaco resus, cerdo, perro, pez cebra, pez globo, pollo, orangután y gorila, cuyas secuencias se exponen en SEQ ID NO: 4-17, respectivamente. Pueden realizarse modificaciones en un polipéptido de FVII a un polipéptido de FVII que también contiene otras modificaciones, tales como las descritas en la técnica, incluyendo modificaciones de la secuencia
45 primaria y modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido.
La modificación de polipéptidos de FVII también incluye modificación de polipéptidos que son híbridos de diferentes polipéptidos de FVII y también polipéptidos de FVII sintéticos preparados de forma recombinante o sintetizados o construidos por otros métodos conocidos en la técnica basándose en la secuencia de polipéptidos conocidos. Por ejemplo, basándose en el alineamiento de FVII con otros miembros de la familia de factores de coagulación, tales como factor IX (FIX) o factor X (FX), se identifican fácilmente dominios homólogos entre los miembros de la familia. Pueden construirse variantes quiméricas de polipéptidos de FVII donde uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII usando la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia correspondiente. Adicionalmente, los polipéptidos de FVII quiméricos incluyen en los que uno o más 55 aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII humana usando la secuencia de aminoácidos de una especie diferente (véase, por ejemplo, Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost
3: 1250-6). Dichas proteínas quiméricas pueden usarse como el polipéptido de FVII no modificado, de partida, en el presente documento.
Las modificaciones proporcionadas en el presente documento de un polipéptido de referencia de partida, no modificado, incluyen reemplazos de aminoácidos o sustitución, adiciones o deleciones de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Los polipéptidos de FVII de acuerdo con la presente invención incluyen los que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 posiciones modificadas. Cualquier modificación proporcionada en el presente documento puede combinarse con cualquier otra modificación conocida por un experto en la materia siempre que el polipéptido de FVII 65 modificado resultante muestre actividad de coagulación aumentada cuando esté en su forma bicatenaria. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad coagulante aumentada. Las actividades o
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propiedades que puedan alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor inhibidor de factor tisular
5 (IRFT), antitrombina III, factor X o factor IX; capacidad para unirse con fosfolípidos, albúmina de suero o integrina de plaquetas IIb3; semivida en suero; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Se incluyen entre los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento los que tienen resistencia aumentada a antitrombina III (AT-III), actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, resistencia aumentada a inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, actividad intrínseca aumentada, glucosilación alterada, afinidad y/o unión aumentada para albúmina de suero, afinidad y/o unión aumentada para integrina de plaquetas IIb3, y/o afinidad y/o unión aumentada para plaquetas activadas.
En algunos ejemplos, una modificación puede afectar a dos o más propiedades o actividades de un polipéptido de
15 FVII. Por ejemplo, una modificación puede dar como resultado resistencia a AT-III aumentada y actividad catalítica aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ensayarse para cada propiedad y actividad para identificar el rango de efectos de una modificación. Dichos ensayos se conocen en la técnica y se describen posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen polipéptidos de FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria biocelular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glucosilados, -carboxilados y -hidroxilados.
Las modificaciones proporcionadas en el presente documento a un polipéptido de FVII se realizan para aumentar la resistencia a AT-III, aumentar la resistencia a IRFT, aumentar la resistencia a los efectos inhibidores de Zn2+, 25 mejorar las propiedades farmacocinéticas, tales como aumentar la semivida en suero, aumentar la actividad catalítica en presencia y/o ausencia de FT, aumentar la unión con plaquetas activadas, alterar la glucosilación, aumentar la afinidad y/o unión con integrina de plaquetas IIb3, aumentar la afinidad y/o unión con albúmina de suero, y/o aumentar la afinidad y/o unión para plaquetas activadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede incluir una modificación o modificaciones que aumentan una o ambas de la actividad catalítica y la unión con plaquetas. En otros ejemplos, cualquier modificación proporcionada en el presente documento puede combinarse con cualquier otra modificación conocida por un experto en la materia siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante muestre actividad de coagulación aumentada cuando esté en su forma bicatenaria. Típicamente, dicha actividad de coagulación aumentada se debe a resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en 35 suero aumentada, resistencia aumentada a IRFT, glucosilación alterada, unión y/o afinidad aumentada con fosfolípidos, unión y/o afinidad con albúmina de suero aumentada, y/o unión y/o afinidad con integrina de plaquetas IIb3 aumentada. En algunos ejemplos, las modificaciones que se introducen en un polipéptido de FVII para alterar una actividad o propiedad específica también, o en su lugar, pueden afectar a otra actividad o propiedad. Por lo tanto, las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden afectar a la propiedad o actividad que se diseñaron para afectar y una o más propiedades o actividades adicionales. Por ejemplo, las modificaciones realizadas a un polipéptido de FVII para aumentar la actividad catalítica también pueden aumentar la resistencia a AT-III. En algunos ejemplos, una modificación individual, tal como sustitución de un único aminoácido, altera 2, 3, 4 o más propiedades o actividades de un polipéptido de FVII. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ensayarse para cada propiedad y actividad para identificar el rango de efectos de una
45 modificación. Dichos ensayos se conocen en la técnica y se describen posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen polipéptidos de FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria celular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glucosilados, -carboxilados y hidroxilados.
Las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden realizarse por técnicas de ADN recombinante convencionales tales como las rutinarias para un experto en la materia. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para efectuar mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida convencional (usando por ejemplo un kit, tal como un kit tal como QuikChange disponible de Stratagene) de moléculas de ácido nucleico codificantes, o por métodos de síntesis de polipéptidos de
55 fase sólida. Además, pueden generarse proteínas quiméricas modificadas proporcionadas en el presente documento (es decir intercambio de dominio Gla) por técnicas de ADN recombinante rutinarias. Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos quiméricos usando enzimas de restricción y metodologías de clonación para subclonación rutinaria de los componentes polipeptídicos quiméricos deseados.
Otras modificaciones que están o no están en la secuencia primaria del polipéptido también pueden incluirse en un polipéptido de FVII modificado, o conjugado del mismo, incluyendo, pero sin limitación, la adición de un resto de carbohidrato, la adición de un resto de polietilenglicol (PEG), la adición de un dominio Fc, etc. Por ejemplo, dichas modificaciones adicionales pueden realizarse para aumentar la estabilidad o semivida de la proteína.
65 Los polipéptidos de FVII modificados resultantes incluyen los que son polipéptidos de zimógenos monocatenarios o los que son polipéptidos de tipo zimógeno bicatenarios. Por ejemplo, cualquier polipéptido modificado proporcionado en el presente documento que es un polipéptido monocatenario puede autoactivarse o activarse por otros factores de coagulación para generar un FVII modificado que es una forma bicatenaria (es decir FVIIa). Las actividades de un polipéptido de FVII modificado se muestran típicamente en su forma de dos cadenas.
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5 Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar resistencia a AT-III aumentada, actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia a IRFT aumentada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, glucosilación alterada, unión y/o afinidad aumentada con fosfolípidos, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb 3. Típicamente, dichas propiedades y/o actividades de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se realizan conservando al mismo tiempo otras actividades o propiedades de FVII, tales como, pero sin limitación, unión con FT y/o unión y activación de FX. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento conservan la unión a FT y/o unión y activación de FX en comparación con
15 una forma de tipo silvestre o de partida del polipéptido de FVII. Típicamente, dicha actividad está sustancialmente sin cambios (menos del 1 %, 5 % o 10 % de cambio) en comparación con una proteína de tipo silvestre o de partida. En otros ejemplos, la actividad de un polipéptido de FVII modificado está aumentada o reducida en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre o de partida. La actividad puede evaluarse in vitro o in vivo y puede compararse con el polipéptido de FVII no modificado, tal como, por ejemplo, el polipéptido de FVII maduro, nativo de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3), el polipéptido de FVII precursor de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 o 2) o cualquier otro polipéptido de FVII conocido por un experto en la materia que se usa como material de partida.
Por lo tanto, en virtud de las modificaciones proporcionadas en el presente documento, los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada, y/o
25 un índice terapéutico potenciado. Esto puede observarse de una manera dependiente de FT y/o independiente de FT. Típicamente, la actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden observarse in vitro o ex vivo en ensayos apropiados, o in vivo, tal como tras la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano o no humano. La actividad aumentada de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180 %, 190%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad del polipéptido de FVIIa de partida o no modificado.
1. Actividad catalítica aumentada
35 FVII contiene un resto de serina (posición 195 en la numeración de quimotripsina (quimotripsinógeno) convencional) en su centro activo que actúa como un nucleófilo durante la reacción de escisión. La triada catalítica de serina proteasas también incluye dos restos adicionales: H57 y D102 (numeración de quimotripsina). La triada catalítica de FVIIa humano corresponde a H193, D242 y S344 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. Estos tres aminoácidos clave desempeñan cada uno un papel esencial en la actividad catalítica de las proteasas. Las serina proteasas hidrolizan enlaces peptídicos mediante la formación de estados de transición tetraédricos e intermedios de acil-enzima. La ruta de reacción comienza con unión no covalente del sustrato en un surco en la superficie de la proteasa (es decir, la hendidura del sitio activo) que contiene H57 y S195 para formar un “complejo de Michaelis-Menten”. El progreso productivo a lo largo de la ruta de reacción requiere posterior ataque nucleófilo de
45 un resto de carbonilo PI del sustrato por el O-gamma de la serina del sitio activo (es decir, serina 195) de la enzima para formar un estado de transición tetraédrico que se convierte rápidamente en un intermedio de acil-enzima. Una estructura dentro de la hendidura del sitio activo que incluye los restos glicina 193 y serina 195 (correspondientes a G342 y S344 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y se conoce como el orificio de oxianión promueve la catálisis eficaz estabilizando el estado de transición. Específicamente, los hidrógenos de amida de cadena principal de estos dos restos forman enlaces de hidrógeno estabilizantes con el oxianión (es decir, el oxígeno carbonilo del resto P1) que se crea en el estado de transición tetraédrico. Además de esta estabilización, la unión del sustrato dentro del orificio de oxianión sitúa el enlace escindible apropiadamente para las reacciones de acilación y desacilación productivas que dan como resultado escisión del enlace. La importancia del orificio de oxianión en la actividad de FVII se destaca por la observación de que las mutaciones en la posición de aminoácido
55 342 (correspondiente a 193 por numeración de quimotripsina) puede dar como resultado deficiencia del FVII (véase por ejemplo Bernardi et al., (1994) Br. J. Haematol. 86: 610-618 y Bemardi et al., (1996) Human Mut. 8: 108-115).
a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran actividad coagulante aumentada. Dichos polipéptidos de FVII pueden generarse por sustitución de aminoácidos de uno o más restos que pueden afectar a la conformación del orificio de oxianión. La introducción de diferentes restos de aminoácidos en posiciones particulares (por ejemplo, la posición 143 por numeración de quimotripsina o 286 por numeración de FVII maduro) puede alterar la conformación del polipéptido de FVII modificado de modo que el orificio de oxianión es más
65 eficaz durante la catálisis. Esto puede dar como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad catalítica aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Los cambios en la actividad catalítica debido a mutaciones que afectan al orificio de oxianión pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada. Los aumentos en la actividad catalítica y coagulante de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden observarse en presencia y/o ausencia de factor tisular (es decir pueden ser dependientes de FT y/o independientes de FT). Por lo tanto, cuando se evalúe en un ensayo in vitro, in vivo o ex
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5 vivo  
La conformación del orificio de oxianión puede alterarse para inducir una conformación más eficaz por modificación de uno o más restos de aminoácidos que están implicados en la formación de, o están próximos a, el orificio de oxianión. Como se proporciona en el presente documento, un ejemplo de dichos restos de aminoácidos es Q286 (numeración correspondiente a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3), que corresponde a Q143 por numeración de quimotripsina. Q286 puede modificarse, por ejemplo, por sustitución, deleción o inserción de aminoácidos. Cuando la modificación se efectúa por sustitución de aminoácidos, el resto de glutamina en la posición
15 286 puede reemplazarse con cualquier otro resto de aminoácido.
Q286 se localiza adyacente a y en contacto con restos que forman regiones del sitio activo y la hendidura del sitio activo del polipéptido de FVII. Como tal, se ha indicado que la modificación en esta posición daría como resultado actividad catalítica reducida (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.º 6806063). Esto se ha demostrado en estudios previos (véase, por ejemplo, Publicación de Patente Internacional n.º WO2007031559), donde el resto de glutamina se reemplazó con una alanina (Q286A). El polipéptido de FVIIa modificado resultante muestra una capacidad reducida para activar el Factor X en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. En otros estudios, la misma mutación esencialmente no tuvo ningún efecto en la actividad catalítica del mutante de FVIIa para el Factor X (Dickinson et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 93: 14379-14384) o un sustrato sintético (Publicación de Patente
25 Internacional n.º WO2007031559).
Como se demuestra en el presente documento (véase Ejemplo 4 y posterior), sin embargo, la modificación del polipéptido de FVII en la posición 286 (numeración correspondiente a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; correspondiente a la posición 143 por numeración de quimotripsina), particularmente con un resto básico, tal como arginina (Arg, R), da como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad catalítica y coagulante aumentada.
Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen un reemplazo de aminoácidos en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 286 de un
35 polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (posición de aminoácido 143 por numeración de quimotripsina). La modificación proporcionada en el presente documento en la posición de aminoácido 286 puede realizarse en cualquier polipéptido de FVII, incluyendo un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquier especie, variante alélicas o modificadas y fragmentos activos del mismo, que tiene 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en SEQ ID NO: 1-3.
La modificación de un polipéptido de FVII en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro (correspondiente al aminoácido 143 por numeración de quimotripsina) puede alterar la conformación del orificio de
45 oxianión a una conformación que facilita la catálisis más eficaz de un sustrato. La actividad catalítica aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrarse en presencia y/o ausencia de factor tisular, y puede evaluarse usando ensayos in vitro tales como los descritos en los Ejemplos 4 y 7, posteriores. Además de mostrar actividad catalítica aumentada, los polipéptidos de FVII que se han modificado en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro también pueden mostrar resistencia aumentada a AT-III. Esto puede deberse a, por ejemplo, unión reducida del polipéptido de FVII modificado con AT-III en condiciones específicas (por ejemplo, después de inyección en un paciente) o una tasa reducida de inactivación por AT-III (es decir, una constante de velocidad de segundo orden reducida para inhibición), que puede manifestarse como actividad coagulante aumentada en presencia de AT-III en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a AT-III puede evaluarse usando ensayos in vitro tales como el descrito en el Ejemplo 5.
55 El resto de aminoácido Q286 por numeración de FVII maduro (correspondiente a Q143 por numeración de quimotripsina) puede modificarse por deleción de aminoácidos o reemplazo o sustitución con cualquier otro aminoácido. Como alternativa, un aminoácido puede insertarse inmediatamente antes o después para alterar la conformación en las cercanías del resto de aminoácidos Q286. Además, un polipéptido de FVII que contiene una modificación de Q286 también puede contener una o más modificaciones adicionales, incluyendo inserciones, deleciones, sustituciones o reemplazos de aminoácidos, y modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido, tales como la adición de un resto de carbohidrato, la adición de un resto de polietilenglicol (PEG), la adición de un dominio Fc, etc., o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, un polipéptido de FVII que contiene una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro puede contener 2, 3, 4,
65 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más posiciones modificadas. Dichos polipéptidos conservan al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado. Típicamente, el polipéptido de FVII
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modificado muestra actividad coagulante aumentada.
Estos cambios en las actividades pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada, aparición de beneficio terapéutico aumentado, aparición de actividad coagulante 5 aumentada y/o un índice terapéutico potenciado. Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro que muestran actividad de coagulación aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en el tratamiento de trastornos o acontecimientos de sangrado, tales como hemofilia, cirugía, traumatismo y lesión, donde los polipéptidos de FVII pueden actuar para promover la coagulación sanguínea. Debido a una actividad coagulante aumentada, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento que contienen una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro ofrecen ventajas sobre el tratamiento con un polipéptido de FVII de tipo silvestre, tal como Factor VII NovoSeven®, incluyendo una reducción en la cantidad de FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para
15 hemostasia. Esto puede conducir, por ejemplo, a dosis y/o frecuencia de dosificación menores necesarios para conseguir efectos biológicos comparables, aparición más rápida del beneficio terapéutico, duración de acción más larga, mayor comodidad y aceptación por los sujetos y/o atenuación de los efectos secundarios no deseados.
i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición 286
Se proporcionan polipéptidos de FVII modificados en los que la glutamina en la posición 286 (numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; correspondiente a la posición 143 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con arginina (Arg, R), (es decir Q286R, correspondiente a Q143R por numeración de quimotripsina). Los estudios de modelización indican que la sustitución de la glutamina con una 25 arginina da como resultado la pérdida de dos interacciones clave que estabilizan una conformación inactiva del orificio de oxianión de FVIIa en FVII de tipo silvestre o no modificado. Las interacciones desestabilizantes en el polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado incluyen la interacción entre la cadena lateral de Q286 (correspondiente a Q143 por numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de G342 (correspondiente a G193 por numeración de quimotripsina) y la interacción entre el carbonilo de cadena principal de K341 (correspondiente a K1 por numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de S195 (correspondiente a S344 por numeración de quimotripsina). Sustituyendo la glutamina de tipo silvestre con una arginina en la posición 286, sin embargo, no solamente se pierden estas interacciones, sino que se crean dos interacciones nuevas importantes. Estas incluyen la creación de un enlace salino entre la cadena lateral básica del aminoácido modificado R286 (R143 por numeración de quimotripsina) y la cadena lateral ácida del D289 nativo (D146 por numeración de 35 quimotripsina), y una interacción de la amida de cadena principal del aminoácido modificado R286 y el carbonilo de cadena principal de K341 que estabilizan una conformación activa del polipéptido de FVIIa modificado. Adicionalmente, se espera que el nuevo enlace salino entre los aminoácidos modificados R286 y D289 alteren la conformación y/o flexibilidad del “bucle de autolisis”, que forma parte de la hendidura de sitio activo. El bucle de autolisis está implicado en la determinación del sustrato macromolecular y especificidad inhibidora de proteasas de coagulación. Por lo tanto, una conformación y/o flexibilidad alteradas de este bucle pueden dar como resultado, por ejemplo, actividad catalítica aumentada para el sustrato (por ejemplo factor X y/o factor IX) y resistencia aumentada a inhibidores (por ejemplo IRFT y/o AT-III). Por lo tanto, la modificación de la glutamina en la posición 286 con un aminoácido básico, tal como arginina (Arg, R), puede dar como resultado actividad catalítica y coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVIII de tipo silvestre. Por lo tanto, se proporcionan en el presente
45 documento polipéptidos de FVII que contienen una mutación Q286R por numeración de FVII maduro (correspondiente a Q143R por numeración de quimotripsina). Un ejemplo de dicho polipéptido es el que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 118.
Puede realizarse reemplazo de aminoácidos de la glutamina (Gln, Q) con una arginina (Arg, R), en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 286 de un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 en cualquier polipéptido de FVII, incluyendo un polipéptido de FVII precursor con una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquier variante de especie, alélica y modificada, tal como las descritas en la técnica, y fragmentos activos de los mismos, que tiene 40 %, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o 99% de identidad de secuencia con 55 cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en SEQ ID NO: 1-3. Por ejemplo, la mutación Q286R puede incorporarse en cualquier polipéptido de FVII modificado descrito en la técnica, incluyendo cualquiera de los descritos en otra parte en el presente documento. Dichos polipéptidos de FVII modificados incluyen, pero sin limitación, un polipéptido de FVII modificado que contiene la mutación o las mutaciones M298Q (SEQ ID NO: 158), véase por ejemplo Persson et al., (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:13583-13588), E296V/M298Q (SEQ ID NO: 343), V158E (SEQ ID NO: 344), E296R/M298K (SEQ ID NO: 345), K337A (SEQ ID NO: 346), V158D/E296V/M298Q (SEQ ID NO: 98; NN1731; véase por ejemplo, Persson et al., (2007) Art. Thromb. Vasc. Biol. 27(3): 683-689), V158D/E296V/M298Q/K337A (SEQ ID NO: 347; véase por ejemplo Lisman et al., (2003) J. Thromb. Haem. 1:21752178), V253N (SEQ ID NO: 348; véase por ejemplo US7427592), T106N (SEQ ID NO: 349; véase por ejemplo US7427592), T106N/V253N (SEQ ID NO: 350; véase por ejemplo US7427592), K143N/N145T (SEQ ID NO: 351; 65 US7442524), R315N/V317T (SEQ ID NO: 352; US7442524) o K143N/N145T/R315N/V317T (SEQ ID NO: 353; US7442524). La mutación Q286R también puede incorporarse en polipéptidos de FVII quiméricos o polipéptidos de
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fusión de FVII, o polipéptidos de FVII que están modificados de otro modo, tal como por glucoPEGilación (véase por ejemplo documento WO2007022512, Ghosh et al., (2007) transcript of presentation at the Am. Society. Hematol. Meeting, 10 de diciembre de 2007). En un ejemplo, el reemplazo de aminoácidos de la glutamina con una arginina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 286 de un polipéptido de FVII maduro
5 expuesto en SEQ ID NO: 3 da como resultado un polipéptido de FVII con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 118.
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen la sustitución de aminoácidos Q286R por numeración de FVII maduro (correspondiente a Q143R por numeración de quimotripsina), donde los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad coagulante aumentada. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 posiciones modificadas, donde una de las posiciones modificadas es la posición de aminoácido 286. Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones, donde una modificación es la sustitución de aminoácido Q286R (por numeración de FVII maduro) y el polipéptido de FVII modificado muestra actividad coagulante 15 aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La mutación Q286R puede combinarse con cualquier otra mutación descrita en el presente documento o conocida en la técnica. Típicamente, el polipéptido modificado resultante presenta actividad coagulante aumentada. Un experto en la materia puede determinar la actividad coagulante de un polipéptido de FVII que contiene la modificación Q286R usando ensayos in vitro e in vivo bien conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento incluyen los que contiene la mutación Q286R y también contienen una o más mutaciones que, por ejemplo, aumentan la resistencia a antitrombina III, aumentan la activación de FX, aumentan la activación de FIX, aumentan la unión y/o afinidad con fosfolípidos, aumentan la afinidad por el factor tisular, aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad dependiente de FT, alteran la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante, tal como desplazando el
25 equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activas y menos activas a favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos.
La actividad coagulante aumentada de polipéptidos de FVII modificados que contienen la sustitución de aminoácidos Q286R puede ser un resultado de un aumento de la actividad catalítica. La actividad catalítica aumentada puede observarse en presencia y/o ausencia de factor tisular (FT). Por lo tanto, la actividad catalítica aumentada puede ser dependiente de FT y/o independiente de FT. La actividad catalítica de un polipéptido de FVII modificado que contiene la mutación Q286R puede evaluarse usando ensayos in vitro, tales como los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 7. Dichos ensayos pueden determinar la actividad catalítica de un polipéptido de FVII modificado para 35 un sustrato, tal como factor X, en presencia o ausencia del factor tisular. Los polipéptidos FVII modificados que contienen las mutaciones Q286R pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en presencia y/o ausencia de factor tisular en comparación con la actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 4, un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) como la única modificación puede mostrar actividad catalítica para FX en presencia o ausencia de FT que es aproximadamente de dos a cuatro veces mayor que la actividad catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre. En otros ejemplos, un polipéptido de FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q puede mostrar actividad catalítica para FX en presencia de FT que es aproximadamente de tres a cuatro veces mayor que la actividad
45 catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre, y puede mostrar actividad catalítica para FX en ausencia de FT que es aproximadamente de siete a veintiséis veces mayor que la actividad catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre.
Se exponen ejemplos no limitantes de polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones, donde una modificación es la sustitución de aminoácido Q286R (por numeración de FVII maduro) y el polipéptido de FVII modificado muestra actividad catalítica aumentada hacia FX en presencia y/o ausencia de factor tisular en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, en la Tabla 5 y en el Ejemplo 4, posteriormente. Se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. Como se analiza en más detalle en la sección D.6, posteriormente, la modificación “intercambio de Gla FIX” implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de 55 aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83. En algunos ejemplos, el dominio Gla de FIX heterólogo en el polipéptido de FVII modificado por “intercambio de Gla FIX” contiene una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes a M19, E40, K43 y/o Q44 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83. Dichas sustituciones se indican por llaves (por ejemplo {intercambio de Gla FIX/Q44S}). En ejemplos en los que una posición de aminoácido modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no está expuesto en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre corchetes usando numeración de FVII maduro. Por ejemplo, T158N no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como T[158]N
65 cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina.
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Tabla 5.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
Intercambio de Gla FIX/Q286R
Intercambio de Gla FIX/Q143R 131
Q286R/H257A
H117A/Q143R 132
S222A/Q286R
S82A/Q143R 133
Q286R/S222A/H257A
S82A/H117A/Q143R 134
Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R
S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135
Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R
H117A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 136
Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/Q286R
Q143R/S82A/H117A/Intercambio de Gla FIX 137
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 138
Q286R/M298Q/K341Q
Q143R/M156Q/K192Q 139
Q286R/M298Q/K199E
Q143R/M156Q/K60cE 140
S222A/H257A/Q286R/M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 150
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 144
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 145
H257S/Q286R
H117S/Q143R 146
H257S/Q286R/Q366V
H117S/Q143R/Q217V 147
S222A/H257A/Q286R/Q366V
S82A/H117A/Q143R/Q217V 148
Q286R/H373A
Q143R/H224A 149
Q286R/K341D
Q143R/K192D 151
Q286R/Q366D
Q143R/Q217D 152
Q286R/Q366N
Q143R/Q217N 153
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 155
Q286R/H373F
Q143R/H224F 156
Q286R/M298Q/H373F
Q143R/M156Q/H224F 157
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 138
T128N/P129A/Q286R
T[128]N/P[129]A/Q143R 279
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/ S82A/Q143R 285
Intercambio de Gla FIX/ S52A/S60A/S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/ S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R 292
Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141
T128N/P129A/Q286R/ M298Q
T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q 286
{Intercambio de Gla FIX/E40L}/ Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q143R/M156Q 274
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q143R/M156Q 275
{Intercambio de Gla FIX/Q44S}/ Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q143R/M156Q 276
{Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q143R/M156Q 277
S52A/S60A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 287
imagen40
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R /M156Q 298
T128N/P129A/Q286R/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281
S52A/S60A/ Q286R/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H 224F 288
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H22 4F 297
V21D/Q143R/E154V/M156Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q
282
Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R 301
T239V/Q286R/M298Q
T99V/Q143R/M156Q 302
Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/ T99V/Q143R/M156Q 304
S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q
S82A/T99V/H117A/Q143R/M156Q 303
T239V/Q286R/H373F
T99V/Q143R/H224F 305
T239V/Q286R/M298Q/H373F
T99V/Q143R/M156Q/H224F 306
T239I/Q286R
T99I/Q143R 308
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99I/Q143R 310
T239I/Q286R/M298Q
T99I/Q143R/M156Q 311
Intercambio de Gla FIX /T239I/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX /T99I/Q143R/M156Q 313
S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q
S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312
T239I/Q286R/H373F
T99I/Q143R/H224F 314
T239V/Q286R
T99V/Q143R 299
T239I/Q286R/M298Q/ H373F
T99I/Q143R/M156Q/H224F 315
H257S/Q286R/M298Q
H117S/Q143R/M156Q 322
Intercambio de Gla FIX /Q286R/S222A/H257S
Intercambio de Gla FIX/Q4143R/S82A/H117S 321
S222A/H257S/Q286R/M298Q
S82A/H117S/Q143R/M156Q 324
H257S/Q286R/M298Q/ H373F
H117S/Q143R/M156Q/H224F 325
S222A/Q286R/M298Q/ H373F
S82A/Q143R/M156Q/H224F 326
Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F
Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q/H224F 318
S222A/Q286R/M298Q
S82A/Q143R/M156Q 328
Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q 317
Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/H373F
Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R/H224F 316
H257A/Q286R/M298Q
H117A/Q143R/M156Q 321
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q 337
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q 338
T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 339
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 340
T128N/P129A/A75S/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q/H224F 341
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q/H224F 342
imagen41
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F
V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224 F 320
{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N 356
{Intercambio de Gla FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156QQ217N 357
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ2 17N 358
V 158D/Q286R/E296V/M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 360
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N/H224F 364
T239V/Q286R/M298Q/Q366N
T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365
T239T/Q286R/M298Q/Q366N
T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q 367
T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117 A/Q143R/M156Q 368
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q/H224F 369
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q 370
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q/H224F 371
Un polipéptido de FVII que contiene la mutación Q286R por numeración de FVII maduro también puede mostrar resistencia aumentada a AT-III. La resistencia aumentada a AT-III puede ser el resultado de una tasa de inhibición reducida por AT-III o unión reducida a AT-III en condiciones específicas, tal como después de la inyección en un 5 animal o paciente. La resistencia a AT-III puede demostrarse midiendo la constante de velocidad de segundo orden para inhibición de polipéptidos de FVIIa de tipo silvestre y variantes. Otros métodos in vitro, tales como ensayos de BIAcore®, también pueden usarse. Los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar resistencia aumentada a los efectos inhibidores de AT-III en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, que puede evaluarse en ensayos in vitro tales como los descritos en el Ejemplo 5. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen las 10 mutaciones Q286R pueden mostrar resistencia aumentada a AT-III de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,
o más en comparación con la resistencia a AT-III de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo
o bien in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 5 posterior, un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) puede mostrar actividad catalítica para FX en presencia
15 de AT-III y ausencia de FT que es de dos a cuatro veces o más mayor que la actividad catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre. Por lo tanto, el polipéptido de FVII Q286R modificado puede mostrar un aumento en la resistencia a AT-III de aproximadamente 200 % a 400 % de la de un polipéptido de FVII no modificado.
La actividad catalítica aumentada y resistencia aumentada a AT-III pueden manifestarse como actividad coagulante
20 aumentada en presencia y/o ausencia de FT. Dichas actividades pueden evaluarse in vitro, ex vivo o in vivo, tal como mediante administración a un sujeto humano o animal. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados que contienen la mutación Q286R puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación de polipéptido de FVII no modificado o de tipo
25 silvestre bien in vivo o bien in vitro. Por ejemplo, el Ejemplo 6.B.2 demuestra que un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) muestra actividad de coagulación en un modelo de sangrado de ratón que es mayor (aproximadamente 2 veces) que la actividad de coagulación mostrada por un polipéptido de FVII de tipo silvestre (por ejemplo FVII NovoSeven®). El polipéptido de FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q (Q143R y M156Q, respectivamente, por numeración de quimotripsina) muestra
30 actividad de coagulación aún mayor.
ii. Otras mutaciones en la posición 286
Como se describe en el presente documento, la glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la
35 posición 286 del polipéptido de FVII expuesto en SEQ ID NO: 3 puede reemplazarse con un aminoácido distinto de un aminoácido básico (es decir distinto de arginina, histidina o lisina). Dichas sustituciones pueden alterar la conformación del orificio de oxianión, por ejemplo, dando como resultado una conformación que aumenta la actividad catalítica del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre.
imagen42
Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se miden usando ensayos in vivo,
5 ex vivo,o in vitro.
La Tabla 6 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en Q286 distintos de reemplazo con arginina, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para cambiar la 10 conformación del orificio de oxianión a una conformación más eficaz, y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación
15 también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 6 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. Tabla 6.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
Q286N
Q143N 113
Q286E
Q143E 114
Q286D
Q143D 115
Q286S
Q143S 116
Q286T
Q143T 117
Q286A
Q143A 120
Q286V
Q143V 121
Q286M
Q143M 122
Q286L
Q143L 123
Q286Y
Q143Y 124
Q286G
Q143G 125
Q286F
Q143F 126
Q286I
Q143I 127
Q286P
Q143P 128
Q286W
Q143W 130
20 Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se mide usando ensayos in vivo, ex vivo o in vitro. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio
25 de oxianión alterado también pueden mostrar resistencia aumentada a inhibidores de proteasa endógena (es decir, tasa reducida de inhibición por o afinidad reducida para inhibidores) tales como IRFT o AT-III en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la tasa de inhibición por o afinidad por inhibidores endógenos mostrada por polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro.
30 La actividad catalítica y/o resistencia aumentada a inhibidores endógenos tales como resistencia a AT-III de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad coagulante, inicio de la actividad coagulante más rápido y/o índice terapéutico potenciado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,
35 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro.
imagen43
2. Resistencia aumentada a AT-III
La antitrombina III (también conocida como antitrombina o AT-III) es una serpina anticoagulante importante (inhibidor de serina proteasa). AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEQ
5 ID NO: 122). Durante el transcurso de la secreción se escinde un péptido señal de 32 restos para generar una antitrombina humana madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO: 123). La glucoproteína de AT-III de 58 kDa circula en la sangre y actúa como un inhibidor de serina proteasa (serpina) para inhibir un gran número de serina proteasas del sistema de coagulación. Las principales dianas de AT-III son trombina y el factor Xa, aunque también se ha mostrado que AT-III inhibe las actividades de FIXa, FXIa, FXIIa y, en menor grado, FVIIa. La acción de AT-III está potenciada en gran medida por glucosaminoglucanos, tales como el heparán sulfato de origen natural o las diversas heparinas derivadas de tejido que se usan ampliamente como anticoagulantes en la práctica clínica. AT-III se une de una manera altamente específica con una secuencia de pentasacárido única en heparina que induce un cambio conformacional en el bucle de centro reactivo. En dicha conformación, el bucle de centro reactivo de AT-III puede interaccionar más eficazmente con el sitio reactivo de la serina proteasa, y efectuar inhibición.
15 AT-III no es normalmente inhibidora para FVIIa en plasma libre, incluso en presencia de heparina, probablemente debido a la conformación de tipo zimógeno de FVIIa que evita la interacción eficaz con AT-III. Los efectos inhibidores de AT-III aumentan, sin embargo, una vez que FVIIa forma complejo con FT. La unión de AT-III con el complejo de FT/FVIIa puede liberar FVIIa de FT y lo mantiene en un complejo inactivo con AT-III. La afinidad aumentada de AT-III por FVIIa unido a FT en comparación con FVIIa solo supuestamente refleja la maduración del sitio activo de FVIIa cuando está en complejo con FT, haciéndolo por lo tanto susceptible de unión con AT-III (Rao et al. (1993) Blood 81: 2600-2607). Por lo tanto, la influencia de AT-III en FVIIa es proporcional a la actividad intrínseca de la molécula de FVIIa en sí misma, a no ser que se hayan añadido mutaciones al polipéptido de FVIIa que medien en la resistencia a AT-III. Aunque FVIIa conserva su conformación de tipo zimógeno, AT-III tiene poco efecto. Si, sin embargo, FVIIa
25 cambia su conformación a una forma más activa, tal como por unión con FT, o por modificaciones in vitro específicas, la inhibición de AT-III aumenta significativamente. Los polipéptidos de FVIIa que se modifican para tener actividad intrínseca aumentada presentan con frecuencia aumentos simultáneos en la susceptibilidad a inhibición de AT-III. Por ejemplo, la modificación de uno o más aminoácidos en el bolsillo de activación de FVIIa, tal como mediante reemplazos de aminoácidos correspondientes a sustituciones K337A, L305V, M298Q, V158D y E296V (en relación con la secuencia de FVII madura expuesta en SEQ ID NO: 3), da como resultado sensibilidad aumentada del polipéptido de FVIIa a AT-III, inhibiendo de este modo la actividad de FVIIa en hasta 90 % (Persson et al. (2001) PNAS 98: 13583-13588). En otro ejemplo, la inducción de una conformación más de tipo zimógeno por modificación de aminoácidos implicados en la hélice  de FVIIa, aunque aumenta la actividad de la proteína FVIIa modificada, también aumenta su susceptibilidad a AT-III (Persson et al. (2004) Biochem J 379: 497-503).
35
Modificaciones ejemplares para efectuar resistencia aumentada a AT-III
Pueden realizarse modificaciones a un polipéptido de FVII que aumenta su resistencia a AT-III. En general, dichos polipéptidos de FVII modificados conservan al menos una actividad de un polipéptido de FVII. Típicamente, dichas modificaciones incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en cualquier posición del polipéptido de FVII que están implicadas en la interacción de FVIIa con AT-III. Dichas modificaciones pueden, por ejemplo, dar como resultado unión reducida del FVII modificado a AT-III. Los polipéptidos de FVII modificados son por lo tanto resistentes a los efectos inhibidores de forma natural de AT-III con respecto al inicio de la coagulación. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro  in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un
45 producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII resistentes a AT-III modificados presentan actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.
Como se describe posteriormente en el presente documento, un experto en la materia puede diseñar empírica o racionalmente polipéptidos de FVII modificados que presentan resistencia aumentada a AT-III. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse en ensayos conocidos por un experto en la materia para determinar si dichos polipéptidos de FVII modificados presentan resistencia aumentada a AT-III. Por ejemplo, dichos polipéptidos de AT-III modificados pueden ensayarse con respecto a unión con AT-III. En general, un polipéptido de FVII modificado que tiene resistencia aumentada a AT-III mostrará unión reducida y/o afinidad reducida con AT-III. Típicamente, dichos ensayos se realizan en una forma bicatenaria de FVII, tal como la forma activada de FVII (FVIIa). Además, se
55 realizan en general ensayos para determinar los efectos de AT-III en presencia de heparina y en presencia de factor tisular, aunque dichos ensayos también pueden realizarse en ausencia de uno o ambos cofactores.
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a AT-III. La resistencia a inhibición por AT-III es relevante tanto en presencia como en ausencia de FT. Se han modificado variantes de polipéptidos de FVII proporcionadas en el presente documento en una o más de las posiciones de aminoácidos 239, 931, 366 y 373 (correspondientes a las posiciones de aminoácidos 99, 170i, 217 y 224, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Estos restos de aminoácidos pueden modificarse tal como por reemplazo, deleción o sustitución de aminoácidos. Los restos identificados pueden reemplazarse o sustituirse con cualquier otro aminoácido. Como alternativa, pueden usarse inserciones de aminoácidos para alterar la
65 conformación de un resto de aminoácido diana o la estructura proteica en las cercanías de un resto de aminoácido diana.
imagen44
El resto de aminoácido endógeno puede sustituirse por cualquier resto de aminoácido en las posiciones identificadas. Típicamente, el aminoácido de reemplazo se elige de modo que interfiera con la interacción entre FVII y AT-III. En algunos ejemplos, el resto de treonina en la posición 239 (correspondiente a la posición 99 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una serina (Ser, S), asparagina (Asn, N), glutamina (Gin, Q), valina 5 (Val, V), leucina (Leu, L), histidina (His, H), o isoleucina (Ile, I). En otros ejemplos, la prolina en la posición 321 (correspondiente a la posición 170i por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una lisina (Lys, K), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), o tirosina (Tyr, Y). En ejemplos adicionales, la glutamina en la posición 366 (correspondiente a la posición 217 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), lisina (Lys, K), o valina (Val, V). 10 En otros ejemplos, la histidina en la posición 373 (correspondiente a la posición 224 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con un ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) o alanina (Ala, A). En un ejemplo adicional, pueden generarse mutantes de combinación. Se incluyen entre dichos mutantes de combinación los que tienen dos o más mutaciones de los restos T239, P321, Q366 y H373 (correspondientes a T99, P170i, Q217 y H224, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un 15 polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4 o 5 de las posiciones identificadas. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones que pueden dar como resultado resistencia aumentada del polipéptido de FVII modificado a los efectos inhibidores de AT-III. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede modificarse en la posición de aminoácido 366 y la posición de aminoácidos 373. En algunos ejemplos, las posiciones se modifican por reemplazo de aminoácidos, tal como, por ejemplo, reemplazo de
20 la glutamina en la posición 366 con un ácido aspártico, y reemplazo de la histidina en la posición 373 con un ácido glutámico.
La Tabla 7 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEQ ID 25 NO: 3. Se incluyen entre estas mutaciones de combinación ejemplares. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para aumentar la resistencia a AT-III y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que
30 reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 7 a continuación, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.
35 Tabla 7.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
T239S
T99S 159
T239N
T99N 160
T239Q
T99Q 161
T239V
T99V 162
T239L
T99L 163
T239H
T99H 164
T239I
T99I 165
P321K
P170iK 166
P321E
P170iE 167
P321Y
P170iY 168
P321S
P170iS 169
Q366D
Q217D 170
Q366E
Q217E 171
Q366N
Q217N 172
Q366T
Q217T 173
Q366S
Q217S 174
imagen45
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
Q366V
Q217V 175
Q366I
Q217I 176
Q366L
Q217L 177
Q366M
Q217M 178
H373D
H224D 179
H373E
H224E 180
H373S
H224S 181
H373F
H224F 182
H373A
H224A 183
Q366D/H373E
Q217D/H224E 184
Q366V/H373V
Q217V/H224V 185
Q366V/H373L
Q217V/H224L 186
Q366V/H373I
Q217V/H224I 187
Los polipéptidos de FVII modificados que tienen resistencia aumentada para AT-III pueden mostrar una reducción en el grado de inhibición en condiciones específicas o en la constante de velocidad de segundo orden para inhibición por AT-III en al menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 5 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más en comparación con el grado de inhibición o la constante de velocidad de segundo orden para la inhibición de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar resistencia aumentada a AT-III que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la resistencia mostrada 10 por un polipéptido de FVII no modificado. La resistencia aumentada a AT-III por dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico potenciado en presencia de AT-III. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados para AT-III puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más 15 en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo
o bien in vitro.
3. Resistencia aumentada a la inhibición por Zn2+
20 La actividad amidolítica de FVIIa está regulada por alteraciones alostéricas inducidas por unión de iones de calcio y factor tisular (FT). FVII libre existe típicamente en una conformación inactiva. La unión con Ca2+ y FT induce un cambio en la conformación y actividad amidolítica aumentada (Pederson et al., (1990) J Biol. Chem. 265: 1678616793). Por el contrario, se ha mostrado que la unión de iones de cinc con FVIIa tiene un efecto inhibidor en la actividad. La unión de Zn2+ con FVIIa da como resultado actividad amidolítica reducida y afinidad reducida para FT.
25 Los estudios indican que Ca2+ y Zn2+ compiten por la unión con FVIIa, de modo que en presencia de Ca2+, el efecto inhibidor de Zn2+ se reduce. Además, FVIIa unido a FT es menos susceptible de inhibición por cinc.
Además de los sitios de unión a Zn2+ en el dominio Gla, cuya unión no afecta a la actividad amidolítica de FVIIa, se han mapeado dos sitios de unión a Zn2+ en el dominio proteasa de FVII (Petersen et al., (2000) Protein Sci. 9: 859
30 866, Bajaj et al., (2006) J. Biol. Chem. 281: 24873-24888). El mapeo de estos sitios de unión en el dominio de proteasa indica que el primer sitio de unión a Zn2+ implica las cadenas laterales de restos de aminoácidos H216, E220 y S222 (H76, E80 y S82 por numeración de quimotripsina), y el segundo sitio de unión a Zn2+ implica las cadenas laterales de los restos de aminoácidos H257, D219 y K161 (H117, D79 y K24 por numeración de quimotripsina).
35 Zn2+ podría, por lo tanto, tener un papel fisiológico en la regulación de homeostasis como un inhibidor de FVII. Se ha postulado que estos efectos inhibidores aparecen como resultado de un aumento en la concentración de Zn2+ en el sitio del coágulo después de la activación de plaquetas (Bajaj et al., (2006) J. Biol. Chem. 281: 24873-24888). Las plaquetas se almacenan en grandes cantidades de Zn2+ en el citoplasma y gránulos , que se liberan tras la
40 activación de plaquetas. Esto podría aumentar la concentración local Zn2+ que a su vez podría inhibir la actividad de FVIIa y unión de FVIIa con FT.
imagen46
Modificaciones ejemplares para aumentar la resistencia a inhibición por Zn2+
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por mutación de uno o más restos en FVII
5 implicados en la interacción y unión con Zn2+ para reducir o evitar dicha unión, haciendo de este modo a los polipéptidos de FVII modificados resistentes a los efectos inhibidores de Zn2+ con respecto a la actividad catalítica y unión con FT. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII modificados pueden presentar actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que tienen una o más mutaciones en restos que pueden estar implicados en la unión con Zn2+ en el dominio de proteasa. Dichos restos incluyen, pero sin limitación, K161, H216, D219, E220, S222 y H257, con numeración relativa a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (correspondiente a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, 15 respectivamente, por numeración de quimotripsina). En algunos ejemplos, uno o más de los restos de aminoácidos H216, S222 y H257 (correspondientes a H76, S82 y H117, respectivamente, por numeración de quimotripsina) se modifican, tal como por reemplazo o deleción de aminoácidos. Cualquier resto de aminoácido puede usarse para reemplazar el resto endógeno en las posiciones identificadas. Por ejemplo, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados en los que la histidina en la posición de aminoácidos 216 se reemplaza con un resto de serina, alanina, lisina o arginina. En otro ejemplo, la serina en la posición de aminoácido 222 se reemplaza con un resto de alanina o lisina, o la histidina en la posición 257 se reemplaza con un resto de alanina o serina. En un ejemplo adicional, la lisina en la posición 161 se reemplaza con un resto de serina, alanina o valina. Las modificaciones también incluyen inserciones de aminoácidos en o cerca de las posiciones de aminoácidos identificadas como implicadas en la unión con Zn2+. Dichas inserciones pueden alterar el sitio de unión a Zn2+, dando
25 como resultado un polipéptido de FVII modificado con unión reducida a Zn2+.
También pueden generarse mutantes de combinación en los que se realizan reemplazos de aminoácidos en más de uno de los restos anteriormente identificados en un polipéptido de FVII. Entre dichos mutantes de combinación se incluyen los que tienen dos o más mutaciones de los restos K161, H216, D219, E220, S222 y H257 (correspondientes a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4, 5 o 6 de las posiciones identificadas. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones que pueden dar como resultado capacidad reducida del polipéptido de FVII modificado para unirse con Zn2+. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede modificarse por reemplazo de aminoácidos de la serina en la posición 222 con
35 una lisina, y la histidina en la posición 257 con un resto de alanina.
Los polipéptidos de FVII modificados que tienen resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+ pueden mostrar un aumento en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la resistencia del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Una reducción en la unión con Zn2+ y, por lo tanto, resistencia aumentada contra los efectos inhibidores de Zn2+, por dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada en presencia de Zn2+. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,
45 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.
La Tabla 8 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Se incluyen entre estos mutaciones de combinación ejemplares. Como se ha observado, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para mostrar capacidad reducida para unirse con Zn2+ y, por lo tanto, resistencia aumentada contra los efectos inhibidores de Zn2+. Por lo tanto, el polipéptido de FVII modificado puede tener actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido
55 de FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 8 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.
Tabla 8.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
K161S
K24S 188
K161A
K24A 189
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Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
K161V
K24V 190
H216S
H76S 191
H216A
H76A 192
H216K
H76K 193
H216R
H76R 194
S222A
S82A 195
S222K
S82K 196
S222V
S82V 197
S222N
S82N 198
S222E
S82E 199
S222D
S82D 200
H257A
H117A 201
H257S
H117S 202
S222K/H257A
S82K/H117A 203
H216A/H257A
H76A/H117A 204
H216A/S222A
H76A/S82A 205
4. Glucosilación alterada
Las propiedades y actividades de una proteína pueden alterarse modulando el grado, nivel y/o tipo de glucosilación.
5 Por ejemplo, la glucosilación puede aumentar la semivida en suero de polipéptidos aumentando la estabilidad, solubilidad y reduciendo la inmunogenicidad de una proteína. La glucosilación puede aumentar la estabilidad de proteínas reduciendo la proteólisis de la proteína y pueden proteger la proteína de degradación térmica, exposición a agentes desnaturalizantes, daño por radicales libres de oxígeno y cambios en el pH. La glucosilación también puede permitir que la proteína diana evada los mecanismos de eliminación que pueden implicar unión con otras proteínas,
10 incluyendo receptores de superficie celular. Los restos de carbohidratos que contienen ácido siálico pueden afectar a la solubilidad de una proteína. Los restos de ácido siálico son altamente hidrófilos y pueden proteger restos hidrófobos de la proteína diana. Esto reduce la agregación y precipitación de la proteína diana. La agregación reducida también ayuda en la prevención de la respuesta inmunitaria contra la proteína diana. Los carbohidratos pueden además proteger secuencias inmunogénicas del sistema inmunitario. El volumen de espacio ocupado por
15 los restos de carbohidratos puede reducir el área de superficie disponible que se vigila por el sistema inmunitario. Estas propiedades conducen a la reducción de inmunogenicidad de la proteína diana.
Los sitios de glucosilación proporcionan un sitio para unión de monosacáridos y oligosacáridos con un polipéptido mediante un enlace glucosídico, de modo que cuando se produce el polipéptido en una célula eucariota con 20 capacidad de glucosilación, está glucosilado. Los dos tipos principales de glucosilación son glucosilación ligada a N, donde las unidades de azúcares se unen mediante el nitrógeno de amida de un resto de asparagina, y glucosilación ligada a O, donde las unidades de azúcares se unen mediante el grupo hidroxilo de restos de serina, treonina, hidroxilisina o hidroxiprolina. Otras formas menores más de enlaces glucosídicos incluyen enlace S con cisteína y enlace C con triptófano. Se produce glucosilación ligada a N en asparaginas en la secuencia consenso -Asn-Xaa25 Ser/Thr/Cys donde Xaa no es prolina. No hay ningún motivo conocido para O-glucosilación, aunque la Oglucosilación es más probable en secuencias con una alta proporción de restos de serina, treonina y prolina. La presencia de un sitio de glucosilación potencial no asegura, sin embargo, que el sitio se glucosile durante el procesamiento postraduccional en el RE. Además, el nivel de glucosilación puede variar en un sitio dado, y un sitio puede tener muchas estructuras de glucano diferentes. Hay cuatro sitios de glucosilación de origen natural en FVII;
30 dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de O-glucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
Modificaciones ejemplares para alterar la glucosilación
35 Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII que se ha modificado alterando el nivel y/o tipo de glucosilación en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La glucosilación puede aumentarse o reducirse en comparación con el FVII no modificado. En algunos casos, el nivel de glucosilación se aumenta, dando como resultado un polipéptido de FVII hiperglucosilado. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de al menos un sitio de glucosilación no nativo no hallado en el polipéptido de FVII no modificado con el que se une un resto de carbohidrato. También pueden generarse polipéptidos de FVII hiperglucosilados por
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5 enlace de un resto de carbohidrato con al menos un sitio de glucosilación nativo hallado pero no glucosilado en el polipéptido de FVII no modificado. En otros ejemplos, el nivel de glucosilación en un polipéptido de FVII modificado se reduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Esto puede conseguirse eliminando uno o más sitios de glucosilación nativos, tal como por reemplazo o deleción de aminoácidos. Uno o más de los restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 52, 60, 145 y 322 que corresponden a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 pueden suprimirse o pueden reemplazarse con un resto de aminoácido que no puede unirse a restos de carbohidratos. Por ejemplo, los restos de serina en las posiciones 52 y/o 60 pueden reemplazarse con un resto de alanina, eliminando de este modo uno o ambos de los sitios de O-glucosilación nativos. Por lo tanto, los sitios de glucosilación en un polipéptido de FVII pueden introducirse, alterarse, eliminarse o reordenarse.
15 Un polipéptido de FVII puede modificarse en una o más posiciones para alterar la glucosilación del polipéptido. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento que tienen glucosilación alterada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden no tener glucosilación, tener glucosilación ligada a O, glucosilación ligada a N y/o una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, un polipéptido de FVII modificado incluye 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de carbohidrato, cada uno unido con sitios de glucosilación diferentes. Los sitios de glucosilación pueden ser un sitio de glucosilación nativo y/o un sitio de glucosilación no nativo. En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado está glucosilado en más de un sitio de glucosilación no nativo. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede modificarse para introducir 1, 2, 3, 4, 5 o más sitios de glucosilación no nativos.
Pueden introducirse sitios de glucosilación no nativos por reemplazo de aminoácidos. Pueden crearse sitios de O
25 glucosilación, por ejemplo, por reemplazo de aminoácidos de un resto nativo con una serina o treonina. Pueden crearse sitios de N-glucosilación estableciendo el motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde Xaa no es prolina. La creación de esta secuencia consenso por modificación de aminoácidos podría implicar el reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una asparagina, reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una serina, treonina o cisteína, o reemplazo de un resto de aminoácido nativo con una asparagina y reemplazo de aminoácidos de resto nativo con una serina, treonina o cisteína. Por ejemplo, la lisina en la posición 109 (basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) puede reemplazarse con una asparagina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en el dominio EGF1 y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de aminoácido 109. En otro ejemplo, la alanina en la posición 292 se reemplaza con una asparagina y la posición de alanina 294 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de
35 aminoácido 292. En un ejemplo adicional, la alanina en la posición 175 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en las posiciones de aminoácidos 173-175 basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y un nuevo sitio de N-glucosilación en la posición de aminoácido 173. Pueden crearse sitios de glucosilación no nativos en cualquier región en el polipéptido de FVII. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más sitios de glucosilación en el dominio EGF1, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 46-82 del polipéptido de FVII maduro en SEQ ID NO: 3. En otros ejemplos, se introducen sitios de glucosilación no nativos en la región de dominio de proteasa del polipéptido de FVII, o en posiciones que pueden asociarse con la región de dominio de proteasa tras el plegamiento proteico.
Pueden modificarse sitios de glucosilación nativos para prevenir la glucosilación o potenciar o reducir la
45 glucosilación, mientras que pueden modificarse otras posiciones en el polipéptido de FVII para introducir sitios de glucosilación no nativos. En algunos ejemplos, el contenido de carbohidratos del polipéptido de FVII puede modificarse. Por ejemplo, puede alterarse el número, la posición, la fuerza de unión, la estructura y la composición de los enlaces de carbohidratos (es decir, la estructura del carbohidrato basada en la naturaleza de los enlaces glucosídicos o las ramas del carbohidrato) de restos de carbohidratos añadidos al polipéptido de FVII.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento que tienen glucosilación alterada conservan al menos una actividad de FVII. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento que tienen glucosilación alterada muestran actividad coagulante aumentada en comparación con un FVII no modificado. En algunos ejemplos, el nivel de glucosilación de un polipéptido de FVII se aumenta. El 55 nivel de glucosilación puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre. En otros ejemplos, el nivel de glucosilación se reduce. El nivel de glucosilación puede reducirse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre. Los niveles de glucosilación alterada o cambios en el tipo de glucosilación presente en un polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden manifestarse como actividad de coagulación aumentada. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados con glucosilación alterada puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 65 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo
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silvestre bien in vivo o bien in vitro.
La Tabla 9 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3, que se incluyen en 5 un polipéptido de FVII modificado para alterar los niveles de glucosilación añadiendo o eliminando sitios de glucosilación. Los reemplazos de aminoácidos ejemplares pueden crear sitios de glucosilación no nativos o eliminar sitios de glucosilación nativos. En algunos casos, se requiere dos reemplazos de aminoácidos para crear un nuevo sitio de glucosilación. También se incluyen en la Tabla 9 mutaciones de combinación ejemplares que crean más de un sitio de glucosilación no nativo nuevo en el polipéptido de FVII. Como se ha observado anteriormente, los 10 cambios en los niveles de glucosilación pueden, por ejemplo, aumentar la semivida. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa 15 posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos donde una posición de aminoácido modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se ha expuesto en la Tabla 1, anteriormente), la posición se indica entre corchetes usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, A51N no
20 tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como A[51]N cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 9 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. También se identifican en la Tabla 9 cualquier sitio o sitios de glucosilación no nativos nuevos generados por la modificación o las modificaciones.
25
Tabla 9.
Modificación o modificacionesnumeración de FVII maduro
Modificación o modificacionesnumeración de quimotripsina Sitio de glucosilación nonativo (numeraciónde FVII maduro) Sitio de glucosilación nonativo (numeraciónde quimotripsina) SEQ ID NO
S52A
S[52]A ninguno ninguno 206
S60A
S[60]A ninguno ninguno 207
E394N/P395A/R396S
E245N/P246A/R247S N394 N245 208
R202S
R62S N200 N60d 209
A292N/A294S
A150N/A152S N292 N150 210
G318N
G170fN N318 N170f 211
A175S
A39S N173 N37 212
K109N
K[109]N N109 N[109] 213
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S N122 N[122] 214
A51N
A[51]N N51 N[51] 215
T130N/E132S
T[130]N/E[132]S N130 N[130] 216
A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S
A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S N122 y N394 N[122] y N245 217
A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S/ G318N
A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S/ G170fN N122, N394 y N318 N[122], N245 y N318 218
S52A/S60A
S[52]A/S[60]A ninguno ninguno 219
S52N/P54S
S[52]N/P[54]S N52 N[52] 220
S119N/L121S
S[119]N/L[121]S N119 N[119] 221
T128N/P129A
T[128]N/P[129]A N128 N[128] 222
Q66N/Y68S
Q[66]N/Y[68]S N66 N[66] 223
imagen50
Modificación o modificacionesnumeración de FVII maduro
Modificación o modificacionesnumeración de quimotripsina Sitio de glucosilación nonativo (numeraciónde FVII maduro) Sitio de glucosilación nonativo (numeraciónde quimotripsina) SEQ ID NO
S52N/P54S/A122N/G1 24S/E394N/P395A/R39 6S
S[52]N/P[54]S/A[122] N/G[124]S/E245N/P24 6A/R247S N52, N122 y N397 N[52], N[122] y N245 224
K109N/A292N/A294S
K[109]N/A150N/A152 S N109 y N292 N[109] y N150 225
K109N/A175S
K[109]N/A39S N109 y N173 N[109] y N37 226
S119N/L121S/A175S
S[119]N/L[121]S/A39S N119 y N173 N[119] y N37 271
T128N/P129A/A175S
T[128]N/P[129]A/A39 A N128 y N173 N[128] y N37 272
A122N/G124S/A175S
A[122]N/G[124]S/A39 S N122 y N173 N[122] y N37 273
5. Unión aumentada a albúmina de suero y/o integrina de plaquetas IIb3
El FVII no modificado recombinante tienen una semivida en suero de solamente 1,5-3 horas en seres humanos. El
5 aumento de la semivida en suero de un polipéptido de FVII puede reducir la cantidad y frecuencia de las dosificaciones requeridas para efecto terapéutico. Pueden emplearse varias estrategias para aumentar la semivida en suero incluyendo, pero sin limitación, aumentar la glucosilación, aumentar la resistencia a proteasa, PEGilación y conjugación o fusión con proteínas mayores, tales como albúmina de suero y la parte Fc de IgG. Dichas modificaciones pueden dar como resultado, por ejemplo, degradación reducida del polipéptido de FVII por proteasas
10 del suero, eliminación renal reducida, eliminación hepática reducida y neutralización o eliminación reducida por el sistema inmunitario. Otra estrategia que puede emplearse para aumentar la semivida en suero de un polipéptido de FVII implica el injerto de secuencias de unión en un polipéptido de FVII no modificado para establecer interacciones proteína-proteína nuevas o mejoradas que no se observan en un polipéptido de FVII no modificado.
15 Las secuencias de unión que se insertan en el polipéptido de FVII no modificado pueden contener aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o más restos de aminoácidos que facilitan la interacción con otra proteína. Las secuencias de unión pueden corresponder a una secuencia de unión presente de forma natural en una proteína nativa, o pueden ser una secuencia de unión sintética con poca o ninguna correlación de secuencia con secuencias de unión presentes de forma natural en una proteína nativa. Las secuencias de unión usadas para
20 modificar los polipéptidos de FVII del presente documento interaccionan específicamente con un sitio de unión en otra proteína, estableciendo una interacción proteína-proteína no covalente. En algunos ejemplos, la proteína para la que la secuencia de unión es específica es una proteína del suero, tal como, por ejemplo, albúmina de suero. Dichas secuencias se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo documentos US20030069395, US20040009534 y US20070202045). En otros ejemplos, la proteína reconocida por la secuencia de unión es un receptor o ligando de
25 superficie celular, tal como, por ejemplo, integrina de plaquetas IIb3 (Smith et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 3048630490). La afinidad con la que el polipéptido de FVII modificado se une con la proteína de suero o receptor de superficie celular se caracteriza típicamente por una constante de disociación, Kd, de 1 M, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM o menos. La unión del polipéptido de FVII modificado con la proteína del suero o el receptor de superficie celular mediante la secuencia de unión puede reducir, por ejemplo, la eliminación renal o eliminación
30 hepática del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, la unión del polipéptido de FVII modificado con un receptor de superficie celular también puede dirigir el polipéptido de FVII modificado a un tipo celular o tisular o región en el cuerpo deseados, de este modo “concentrando” ese polipéptido de FVII en un sitio particular, tal como, por ejemplo, un coágulo sanguíneo. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión injertadas pueden mostrar semivida
35 aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado.
a. Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a albúmina de suero
Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión a
40 albúmina de suero. Los polipéptidos de FVII modificados pueden unirse con albúmina de suero in vitro o in vivo, dando como resultado una semivida aumentada. Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados con semivida aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII modificados pueden presentar actividad coagulante
45 aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.
Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden contener secuencias de unión a albúmina de suero. Las secuencias de unión a albúmina de suero pueden insertarse dentro del polipéptido de FVII no modificado o pueden unirse con el extremo C o N terminal del polipéptido de FVII. Por ejemplo, la secuencia de
imagen51
unión a albúmina de suero puede extenderse desde el resto de prolina en la posición de aminoácido 406 en el extremo C terminal del polipéptido de FVII (correspondiente a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Si las secuencias de unión se insertan dentro del polipéptido de FVII, la inserción es en una posición tal que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve al menos una actividad de un polipéptido de FVII no 5 modificado. La secuencia de unión puede insertarse en el polipéptido de FVII sin retirar ningún resto de aminoácido en el polipéptido de FVII, o puede reemplazar uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de unión a albúmina de suero reemplaza los restos de aminoácidos S103 a S111 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) para generar un polipéptido de FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de unión a albúmina de suero reemplaza los restos de aminoácidos
10 H115 a S126, o T128 a P134 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Se exponen secuencias de unión a albúmina de suero ejemplares en las SEQ ID NO: 206-212.
La Tabla 10 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para insertar una secuencia de unión a albúmina de suero. Como se ha observado 15 anteriormente, la inclusión de una secuencia de unión a albúmina de suero puede aumentar la semivida de un polipéptido de FVII. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a las modificaciones enumeradas en la Tabla 10, los restos de aminoácidos en los que se inserta la secuencia de unión a albúmina de suero en el polipéptido de FVII, y la secuencia de la secuencia de unión, están ambos representados en la tabla. Por ejemplo, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los restos 20 de aminoácidos S103 a S111 de una numeración de longitud completa de un polipéptido de FVII no modificado (restos correspondientes a la secuencia del polipéptido de FVII maduro expuesta en SEQ ID NO: 3) se han suprimido y reemplazado con una secuencia de unión a albúmina de suero con la secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 206). La enumeración de solamente un resto de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de unión a albúmina de suero se inserta después de P406 y no se ha 25 suprimido ningún resto de aminoácido del polipéptido de FVII. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos en los que una posición de aminoácido modificada no tenga un número de quimotripsina correspondiente (es decir no esté dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se exponga en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre corchetes usando la numeración
30 de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene número de quimotripsina correspondiente y se expone como S[103] cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 10 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.
35 Tabla 10.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
S103S111 delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF
S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 227
H115S126delinsQR-LMEDICLPRWG CLWEDDF
H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 228
T128P134delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF
T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 229
S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE
S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLW E 230
H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE
H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCL WE 231
T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE
T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLW E 232
S103S11IdelinsDICLPRWGCLWED
S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE 233
S103S111delinsDICLPRWGCLWED
S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE D 233
H115S126delinsDICLPRWGCLWED
H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWE D 234
T128P134delinsDICLPRWGCLWED
T[128]P[134]delinsDICLPRWGCLWE D 235
P406insIEDICLPRWGCLW
P257insIEDICLPRWGCLW 236
P406insGGGSIEDICLPRWGCLW
P257insGGGSIEDICLPRWGCLW 237
P406insDICLPRWGCLWED
P257insDICLPRWGCLWED 238
P406insGGGSDICLPRWGCLWED
P257insGGGSDICLPRWGCLWED 239
Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a albúmina de suero pueden mostrar unión aumentada con albúmina de suero que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 20%. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en 40 comparación con la unión del polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado con albúmina de suero bien in vivo
imagen52
o bien  . Los polipéptidos de FVII modificados que pueden unirse con albúmina de suero pueden mostrar semivida en suero aumentada de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la semivida en suero del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La unión a
5 albúmina de suero aumentada y/o semivida en suero aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico potenciado. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado bien in vivo o bien in vitro.
b. Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3
Se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión a
15 integrina de plaquetas IIb3. La integrina de plaquetas IIb3 (también denominada glucoproteína (GP) IIb/IIIa) es el receptor de adhesión a plaquetas más abundante. Es un heterodímero dependiente de calcio que actúa como un receptor para proteínas incluyendo, pero sin limitación, fibrinógeno, fibronectina, vitronectina, factor de von Willebrand y trombospondina. La unión con ligandos de proteínas “afines” puede activar IIb3 e inducir la transducción de señales en el citoplasma mediante el dominio intercelular de la proteína. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3, por lo tanto, pueden unirse con plaquetas. Los polipéptidos de FVII modificados pueden unirse con integrina de plaquetas IIb3 (la forma activada y/o inactivada) in vitro o in vivo, dando como resultado una semivida aumentada. Las variantes de FVIIa que se unen selectivamente con IIb3 activada pueden, por lo tanto, dirigirse a plaquetas activadas y por lo tanto concentrarse en el sitio de un coágulo sanguíneo en evolución. Se esperaría que la dirección selectiva de FVIIa a coágulos
25 sanguíneos en evolución mejore la utilidad terapéutica de la variante mejorando tanto la eficacia como el índice terapéutico. Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de FVII modificados con semivida aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado y variantes que, además, se unen selectivamente con plaquetas activadas. Cuando se evalúen en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII modificados pueden presentar actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.
Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento contienen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3. Las secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 pueden insertarse con el polipéptido de 35 FVII no modificado o pueden unirse con el extremo C o N terminal del polipéptido de FVII. Por ejemplo, las secuencias de unión a IIb3 pueden extenderse desde el resto de prolina en la posición de aminoácido 406 en el extremo C terminal del polipéptido de FVII (correspondiente a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Si las secuencias de unión se insertan dentro del polipéptido de FVII, la inserción es en una posición tal que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado. La secuencia de unión puede insertarse en el polipéptido de FVII sin retirar ningún resto de aminoácido en el polipéptido de FVII, o puede reemplazar uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 reemplaza los restos de aminoácidos S103 a S111 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) para generar un polipéptido de FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de unión a IIb3 reemplaza los restos de aminoácidos H115 a
45 S126, o T128 a P134 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Se exponen secuencias de unión a integrina de plaquetas IIb3 ejemplares en SEQ ID NO: 213-215.
La Tabla 11 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para insertar una secuencia de unión de integrina de plaquetas IIb3. Como se ha indicado anteriormente, la inclusión de una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 puede aumentar la semivida en suero de un polipéptido de FVII y/o dirigir la proteína a un coágulo sanguíneo en evolución. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a las modificaciones enumeradas en la Tabla 11, los restos de aminoácidos en los que la secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 se inserta en el polipéptido de FVII, y la secuencia de la secuencia de unión, están ambos representados en la 55 tabla. Por ejemplo, H1115S126delins SFGRGDIRNV indica que los restos de aminoácidos H115 a S126 de la numeración de longitud completa de un polipéptido de FVII no modificado (restos correspondientes a la secuencia del polipéptido de FVII maduro expuesta en SEQ ID NO: 3) se han suprimido, y reemplazado con una secuencia de unión a IIb3 con la secuencia de aminoácidos SFGRGDIRNV (SEQ ID NO: 213). La enumeración de solamente un resto de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de unión a IIb3 se inserta después de P406 y no se ha suprimido ningún resto de aminoácido del polipéptido de FVII. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos en los que una posición de aminoácido modificada no tenga un número de quimotripsina correspondiente (es decir no esté dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se exponga en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre paréntesis usando la 65 numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone
imagen53
como S[103] cuando se hace referencia a numeración de quimotripsina. En la Tabla 11 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.
Tabla 11.
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
S103S111delinsSFGRGDIRNV
S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV 240
H115S126delinsSFGRGDIRNV
H[115]S[126]delinsSFGRGDIRNV 241
T128P134delinsSFGRGDIRNV
T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV 242
P406insCSFGRGDIRNVC
P257insCSFGRGDIRNVC 243
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC
P2S7insGGGSCSFGRGDIRNVC 244
Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a integrina de plaquetas IIb3 pueden mostrar unión aumentada con integrina de plaquetas IIb3 que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 10 500 %, o más en comparación con la unión del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre con integrina de plaquetas IIb3 in vivo. Los polipéptidos de FVII modificados que pueden unirse con plaquetas mediante integrina de plaquetas IIb3 pueden mostrar semivida aumentada de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con la semivida del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vitro, bien in 15 vivo o bien ex vivo. La semivida aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad coagulante y/o índice terapéutico potenciado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido
20 de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.
6. Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo
La interacción de restos en el dominio Gla -carboxilado de proteínas del plasma dependientes de vitamina K, tales
25 como FVII, FIX, FX, protrombina, proteína C y proteína S, y fosfolípidos con carga negativa en la superficie de membrana es importante para la hemostasia. Los dominios Gla de proteínas del plasma dependientes de vitamina K típicamente contienen aproximadamente 45 aminoácidos, de los que de 9 a 12 restos de aminoácidos se modifican postraduccionalmente por carboxilación dependiente de vitamina K para formar -carboxiglutamato (Gla). Los aminoácidos que forman el dominio Gla se sitúan inmediatamente después de los que forman el péptido y
30 propéptido señal de las proteínas, y se sitúan por lo tanto en el extremo N terminal después del procesamiento y escisión de los polipéptidos precursores a las proteínas maduras. Por ejemplo, los aminoácidos que forman el dominio Gla en FVII están en las posiciones 39-83 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, posiciones 61-105 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 2, y posiciones 1 a 45 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. De estos, los 10 restos de ácido glutámico en las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y
35 E35 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 se modifican por carboxilación para generar restos de -carboxiglutamato (Gla).
Debido a su afinidad de unión relativamente baja para plaquetas activadas, el dominio Gla de FVII es una diana para modificación, con el objetivo de potenciar la interacción entre el FVII modificado y la membrana fosfolipídica, 40 aumentando de este modo la actividad de coagulación. La modificación puede efectuarse por sustitución de aminoácidos específicos que están implicados en esta interacción (véase, por ejemplo, Shah et al. PNAS 95: 44294234, Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369). Como alternativa, puede efectuarse modificación por sustitución del dominio Gla completo con el dominio Gla de otra proteína dependiente de vitamina K es decir intercambio de dominio Gla. Este tipo de modificación da como resultado una proteína quimérica, tal como la que
45 resulta cuando el dominio Gla de la proteína C se reemplazó con el dominio Gla de FVII (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77: 926-933).
Típicamente, dicha modificación incluye la introducción, tal como por adición o sustitución, de un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión de fosfolípidos en una región del polipéptido de FVII 50 para generar un polipéptido de FVII modificado quimérico. En general, dicho polipéptido de FVII quimérico conserva al menos una actividad de FVII. La unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII modificados por Gla para plaquetas activadas puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La unión y/o 55 afinidad para plaquetas activadas por polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad
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de coagulación aumentada. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados por Gla puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro.
5 Un dominio Gla o parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos, tal como 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del dominio Gla heterólogo, contenido dentro de cualquier polipéptido puede usarse como una fuente de un dominio Gla heterólogo para introducción o reemplazo de una región de un polipéptido de FVII. Típicamente, dicho dominio Gla heterólogo muestra afinidad de unión por fosfolípidos, por ejemplo, fosfolípidos presentes en la superficie de una plaqueta activada. En general, la elección de un dominio Gla heterólogo es uno que muestra mayor afinidad por fosfolípidos en comparación con la afinidad del dominio Gla de FVII. El dominio Gla exacto, o parte suficiente del mismo, usado como un dominio heterólogo para modificación de un polipéptido de FVII puede determinarse de forma racional o empírica. Los ejemplos de otros polipéptidos que contienen Gla incluyen, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina,
15 proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína de Gla de matriz, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEQ ID NO: 83
91. Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o más aminoácidos contiguos, o el dominio Gla completo, de un dominio Gla heterólogo pueden introducirse en un polipéptido de FVII. Además, la introducción del dominio Gla en un polipéptido de FVII también puede incluir aminoácidos adicionales que no son parte del dominio Gla del polipéptido heterólogo siempre que los aminoácidos adicionales no debiliten significativamente la capacidad de unión a fosfolípidos del dominio Gla introducido.
En algunos ejemplos, la introducción es mediante adición del dominio Gla al polipéptido de FVII de modo que el dominio Gla heterólogo se inserte en el dominio Gla endógeno o en otra región o dominio del polipéptido de FVII 25 siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve al menos una actividad de FVII. En dichos ejemplos, el dominio Gla nativo del polipéptido de FVII está conservado en el polipéptido, aunque en algunos casos la secuencia de aminoácidos que compone el dominio Gla nativo está interrumpida. En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo,
o una parte suficiente del mismo, se inserta adyacente a, bien en el extremo N o bien en el extremo C terminal, del dominio Gla nativo de modo que el dominio Gla nativo no esté interrumpido. En un ejemplo adicional, el dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo, se inserta en otro dominio del polipéptido de FVII.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII de dominio Gla modificado donde todo o una parte contigua del dominio Gla endógeno de FVII se retira y se reemplaza con un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos, siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve 35 al menos una actividad de FVII. Dicha modificación también se denomina un intercambio de dominio Gla. Son ejemplos de modificaciones de intercambio de Gla aquellos en los que el dominio Gla endógeno se reemplaza con todo o una parte del dominio Gla de uno cualquiera de FIX (SEQ ID NO: 83), FX (SEQ ID NO: 84), trombina (SEQ ID NO: 85), Proteína C (SEQ ID NO: 86) o Proteína S (SEQ ID NO: 87). Dichas modificaciones se denominan “Intercambio de Gla FIX”, “Intercambio de Gla FX”, “Intercambio de Gla Trombina”, “Intercambio de Gla Prot C” e “Intercambio de Gla Prot S”, respectivamente. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar unión aumentada a plaquetas activadas, dando como resultado actividad coagulante aumentada. La modificación “Intercambio de Gla FIX” implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de 45 FIX expuesto en SEQ ID NO: 83. La modificación de Intercambio de Gla FX implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a A1 a Y44 del dominio Gla de FX expuesto en SEQ ID NO: 84. La modificación de Intercambio de Gla Trombina implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Trombina expuesto en SEQ ID NO: 85. La modificación de Intercambio de Gla Proteína C implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos A1 a H44 del dominio Gla de Proteína C expuesto en SEQ ID NO: 86. La modificación de intercambio de Gla Proteína S implica la deleción de los restos de
55 aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Proteína S expuesto en SEQ ID NO: 87.
En algunos ejemplos, se realizan modificaciones, incluyendo, pero sin limitación, sustituciones o reemplazos, inserciones y/o deleciones de aminoácidos, al dominio Gla heterólogo que se introduce en el polipéptido de FVII. Dichas modificaciones pueden efectuar, por ejemplo, unión aumentada a plaquetas activadas, debido a unión a fosfolípidos aumentada, en comparación con la unión observada con la forma de tipo silvestre del dominio Gla heterólogo. Por ejemplo, si el dominio Gla del Factor IX, o una parte de unión a fosfolípido del mismo, se introduce en un polipéptido de FVII para generar un polipéptido de FVII modificado, el dominio Gla del Factor IX puede 65 contener mutaciones de aminoácidos que confieren unión a fosfolípidos aumentada en comparación con el dominio Gla del Factor IX de tipo silvestre. El dominio Gla heterólogo contenido en los polipéptidos de FVII modificados
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proporcionados en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones, tales como sustituciones o reemplazos, inserciones y/o deleciones de aminoácidos.
En algunos ejemplos, la modificación o las modificaciones del dominio Gla heterólogo aumentan la unión a
5 fosfolípidos. En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo puede contener una o más mutaciones en comparación con la forma de tipo silvestre del dominio Gla heterólogo que confieren funciones de tipo FVII al dominio Gla heterólogo. Por ejemplo, como se ha observado anteriormente, R36 del dominio Gla de FVII expuesto en SEQ ID NO: 119 puede estar implicado en interacciones con FX. Por lo tanto, el dominio Gla heterólogo puede contener modificaciones adicionales, tales como cualquiera requerida para mantener una arginina en la posición 36 del polipéptido de FVII maduro, como se expone en SEQ ID NO: 3, o cualquier otra modificación requerida para mantener las propiedades de activación de FX del polipéptido de FVIIa modificado (Ruf et al. (1999) Biochem 38: 1957-1966). Por lo tanto, en algunos ejemplos, puede realizarse una mutación correspondiente a R36 en el dominio Gla heterólogo. La posición correspondiente puede determinarse por un experto en la materia, tal como por alineamiento de secuencias de aminoácidos.
15 Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una modificación de intercambio de Gla donde el dominio Gla heterólogo, o parte de unión a fosfolípido del mismo, contiene una o más mutaciones en comparación con el dominio Gla heterólogo de tipo silvestre, y se introduce en el polipéptido de FVII por reemplazo de parte de o todo el dominio Gla de FVII endógeno. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento contienen una modificación de “Intercambio de Gla FIX” que, como se ha descrito anteriormente, implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83. El dominio Gla de FIX usado en la modificación de intercambio de Gla puede
25 contener una o más mutaciones en comparación con la forma de tipo silvestre del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o más mutaciones, tales como sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, el dominio Gla de FIX heterólogo en el polipéptido de FVII modificado por “Intercambio de Gla FIX” puede contener una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones de aminoácidos correspondientes a M19, E40, K43 y/o Q44 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83.
En un ejemplo, el dominio Gla de FIX contiene una sustitución de aminoácidos M19K. Dicha modificación se indica por {Intercambio de Gla FIX/M19K} es decir la metionina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 19 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. En un ejemplo adicional, el dominio Gla de FIX heterólogo modificado en el polipéptido de FVII modificado contiene una sustitución
35 de aminoácido E40L, indicada por {Intercambio de Gla de FIX/E40L}, por la que el ácido glutámico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 40 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una leucina. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen una sustitución K43I (indicado por {Intercambio de Gla FIX/K43I}) donde la lisina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 43 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una isoleucina. En otro ejemplo, el dominio Gla de FIX heterólogo modificado en el polipéptido de FVII modificado contiene una sustitución de aminoácidos Q44S, indicada por {Intercambio de Gla FIX/Q44S}, por el que la glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 44 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una serina. En un ejemplo, el dominio Gla de FIX heterólogo contiene las sustituciones de aminoácidos M19K/E40L/K43I/Q44S.
45 Los polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo, tal como un dominio Gla heterólogo modificado, pueden mostrar actividad coagulante aumentada a dosificaciones menores en comparación con una molécula de FVII de tipo silvestre, tal como NovoSeven®, debido a unión y/o afinidad aumentadas con plaquetas activadas. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados con Gla pueden aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro.
7. Combinaciones y modificaciones adicionales
55 Una cualquiera o más de las modificaciones descritas anteriormente pueden combinarse con cualquier otra modificación o modificaciones descritas anteriormente o descritas en otra parte en la técnica. Por lo tanto, además de la modificación de polipéptidos de FVII para tener resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a la inhibición por Zn2+, glucosilación alterada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, unión y/o afinidad aumentada con fosfolípidos, o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas, IIb3, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen los que muestran más de una de las propiedades anteriormente indicadas. Típicamente, dichas modificaciones adicionales son las que en sí mismas dan como resultado una actividad coagulante aumentada del polipéptido modificado y/o estabilidad aumentada del polipéptido.
65 En consecuencia, los polipéptidos de FVII modificados resultantes muestran una actividad coagulante aumentada. Las modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, cualquier sustitución, deleción o inserción de aminoácidos conocida en la técnica, típicamente cualquiera que aumente la actividad coagulante y/o estabilidad del polipéptido de FVII. Cualquier polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más modificaciones de aminoácidos adicionales, siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve una actividad de FVII del polipéptido de tipo
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5 silvestre o no modificado.
En un ejemplo, la modificación adicional puede realizarse en la secuencia polipeptídica de FVII de modo que su interacción con otros factores, otras moléculas y otras proteínas se altere. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que están implicados en la interacción con el inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) pueden reemplazarse de modo que la afinidad y/o unión del polipéptido de FVII modificado con FT se reduzca. Otras modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificación de aminoácidos que están implicados en interacciones con el factor X, factor IX, factor tisular (FT) y fosfolípidos. En algunos ejemplos, la modificación realizada a la secuencia polipeptídica de FVII incluye inserción de aminoácidos que constituyen una secuencia de unión, tal como, por ejemplo, una secuencia de unión a albúmina de suero o una secuencia de unión a glucoproteína IIb-IIIa.
15 También pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento que alteran la conformación o el plegamiento del polipéptido. Estas incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más aminoácidos con una cisteína de modo que se forme un nuevo enlace disulfuro, o modificaciones que estabilicen una conformación de hélice , transmitiendo de este modo actividad aumentada al polipéptido de FVII modificado.
También pueden realizarse modificaciones adicionales al polipéptido de FVII para efectuar modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, el polipéptido puede modificarse para incluir sitios de glucosilación adicionales de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga glucosilación aumentada en comparación con un
25 polipéptido de FVII no modificado. También pueden realizarse modificaciones para introducir restos de aminoácidos que pueden unirse posteriormente a un resto químico, tal como uno que actúa para aumentar la estabilidad del polipéptido de FVII modificado. La estabilidad de un polipéptido de FVII también puede alterarse modificando sitios proteolíticos potenciales, aumentando de este modo la resistencia del polipéptido de FVII modificado a proteasas.
Adicionalmente, pueden realizarse sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en el dominio Gla endógeno de modo que el polipéptido de FVII modificado presente unión y/o afinidad aumentada con membranas fosfolipídicas. Dichas modificaciones pueden incluir sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos individuales, o pueden incluir sustitución, deleción o inserción de aminoácidos de múltiples aminoácidos. Por ejemplo, todo o parte del dominio Gla endógeno puede reemplazarse con todo o parte de un dominio Gla heterólogo.
35 En otros ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden presentar deleciones en el dominio Gla endógeno, o sustituciones en las posiciones que normalmente están gammacarboxiladas (documento US20070037746).
Las siguientes secciones describen ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica para efectuar estabilidad y/o actividad coagulante aumentadas de un polipéptido de FVII. Como se ha analizado anteriormente, dichas modificaciones también pueden incluirse adicionalmente en cualquier polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento y de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Las posiciones de aminoácidos a las que se hace referencia posteriormente corresponden al polipéptido de FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Pueden realizarse mutaciones correspondientes en otros polipéptidos de FVII,
45 tales como variantes alélicas, de especie o de corte y empalme del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
a. Modificaciones que aumentan la resistencia a IRFT
En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado que contiene una modificación en la posición de aminoácido 286 por numeración de FVII maduro que da como resultado resistencia aumentada a IRFT. Dicha resistencia a IRFT puede conseguirse, por ejemplo, por mutación de uno o más restos en FVII implicados en la interacción y unión con IRFT para reducir o prevenir dicha unión, haciendo de este modo a los polipéptidos de FVII modificados resistentes a los efectos inhibidores de forma natural de IRFT con respecto al inicio
55 de la coagulación. Por ejemplo, las modificaciones pueden realizarse en restos de aminoácidos que son restos de contacto de FVII/IRFT o restos en proximidad estrecha con la superficie de interacción.
Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden incluirse en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento para aumentar la resistencia a IRFT incluyen, pero sin limitación, los descritos en la Publicación de Patente Internacional n.º WO2004/083361, Neuenschwander et al., (1995) Biochemistry 34: 8701-8707, Chang et al., (1999) Biochemistry 38: 10940-10948, y Iakhiaev et al., (2001) Thromb. Haemost. 85: 458-463, y Solicitud de Estados Unidos relacionada n.º de Serie 12/082.662. Los ejemplos no limitantes de modificaciones de aminoácidos ejemplares descritos en la técnica que pueden dar como resultado resistencia aumentada a IRFT del polipéptido de FVII modificado incluyen uno cualquiera o más de Q176, D196K, 65 D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D,
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R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA y K197I198insS (donde, por ejemplo, G237T238insAS indica una modificación en la que se han insertado una alanina (A) y una
5 serina (S) entre la glicina en la posición 237 (G237) y la treonina en la posición 238).
b. Modificaciones que aumentan la actividad intrínseca
En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de factor VII modificado proporcionado en el presente documento que dan como resultado actividad catalítica aumentada hacia el factor X. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones a los aminoácidos que están implicados en la interacción con su cofactor, FT, de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga afinidad aumentada por FT, y de este modo presente actividad aumentada hacia FX. También pueden realizarse modificaciones al bolsillo de activación del polipéptido de FVII, de modo que la actividad intrínseca del polipéptido de FVII modificado hacia FX aumente en comparación con
15 la actividad del polipéptido no modificado. Otra estrategia de modificación que da como resultado actividad aumentada implica la modificación del polipéptido de FVII de modo que el plegamiento y la conformación de la proteína se alteren a una forma más activa. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos de modo que la región del bucle de hélice  (correspondiente a las posiciones 305 a 321 de la secuencia madura como se expone en SEQ ID NO: 3) del dominio de proteasa se estabilice y se pliegue más estrechamente al cuerpo del dominio de proteasa para conferir una forma más de tipo zimógeno en el polipéptido de FVII modificado. También puede conseguirse un polipéptido más activo por modificación de los aminoácidos implicados en las cadenas  del polipéptido de FVII. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos que introducen nuevos pares de cisteína que pueden formar nuevos enlaces disulfuro que pueden actuar para “bloquear” el polipéptido de FVII modificado en una forma más activa.
25 Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden incluirse en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento para aumentar la actividad intrínseca del polipéptido de FVII modificado incluyen, pero sin limitación, los descritos en Persson et al. (2004) Biochem J. 379: 497-503, Maun et al. (2005) Prot Sci 14: 1171-1180, Persson et al. (2001) PNAS 98: 13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269: 59505955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 276: 17229-17235, Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277: 49027-49035, documentos WO200183725, WO2002022776, WO2002038162, WO2003027147, WO200338162, WO2004029090, WO2004029091, WO2004108763 y WO2004111242. Los ejemplos no limitantes de modificaciones de aminoácidos ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado actividad intrínseca aumentada del polipéptido de FVII modificado incluyen una cualquiera o más de S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C,
35 S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116D, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D,
45 M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, y sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina
o FX, y sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
55 c. Modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también pueden contener modificaciones adicionales que dan como resultado resistencia aumentada del polipéptido a proteasas. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos que retiran uno o más sitios de escisión proteolítica potenciales. Los polipéptidos de FVII modificados pueden por lo tanto hacerse más resistentes a proteasas, aumentando de este modo la estabilidad y semivida del polipéptido modificado.
Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden incluirse en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento para aumentar resistencia a proteasas incluyen, pero sin limitación, los 65 descritos en la Patente de Estados Unidos n.º US5580560 o Solicitudes Publicadas Internacionales n.º WO1988010295 y WO2002038162. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica
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que pueden dar como resultado resistencia aumentada del polipéptido de FVII modificado a inhibidores y/o proteasas incluyen una cualquiera o más de K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S,
5 R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A y K341S.
d. Modificaciones que aumentan la afinidad por fosfolípidos
El polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento también puede contener una o más modificaciones adicionales para aumentar la afinidad por fosfolípidos. La actividad coagulante de FVII puede potenciarse aumentando la unión y/o afinidad del polipéptido con fosfolípidos, tales como los expresados en la superficie de plaquetas activadas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, modificando el dominio Gla de FVII endógeno. La modificación puede efectuarse por sustitución de aminoácidos en una o más posiciones en el dominio Gla de un polipéptido de FVII que da como resultado un polipéptido de FVII modificado con capacidad aumentada 15 para unirse con fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa. Los ejemplos de modificaciones adicionales para aumentar la unión y/o afinidad de fosfolípidos y que pueden realizarse a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento que contiene un dominio Gla de FVII endógeno incluyen, pero sin limitación, las descritas en Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369, documentos US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 y WO2004111242. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen una cualquiera o más de una inserción de una tirosina en la posición 4,
o modificación de una cualquiera o más de P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E y K38D.
e.
Modificaciones que alteran la glucosilación
25 La alteración del grado, nivel y/o tipo de glucosilación de una proteína se ha descrito en la técnica como un medio para reducir la inmunogenicidad, aumentar la estabilidad, reducir la frecuencia de administración y/o reducir los efectos secundarios adversos tales como inflamación. Normalmente, esto se efectúa aumentando los niveles de glucosilación. El sitio o los sitios de glucosilación proporcionan un sitio de unión para un resto de carbohidrato en el polipéptido, de modo que cuando el polipéptido se produce en una célula eucariota con capacidad de glucosilación, se glucosila.
Hay cuatro sitios de glucosilación nativos en FVII: dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de Oglucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro
35 expuesto en SEQ ID NO: 3. En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento de modo que se altere la glucosilación en los sitios anteriores. Esto puede dar como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad coagulante aumentada (véase, por ejemplo, documento WO2005123916). Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación reducida y actividad aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación, S52A, S60A, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W y N322C.
45 En otro ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento de modo que se introduzcan sitios de glucosilación adicionales, aumentando de este modo el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. El sitio de glucosilación puede ser un sitio de glucosilación ligado a N o ligado a O. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a un polipéptido de FVII que introducen uno o más nuevos sitios de glucosilación incluyen, pero sin limitación, las que se describen en los documentos US6806063 y WO200393465. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación, F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N,
55 A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, S52N/P54S, Q66N/Y68S, S119N/L121S, A122N/G124S, T128N/P129A, T130N/E132S, K143N/ N145S, K143N/ N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, A292N/A294S, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S,
65 A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/ R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, E394N/P395A/R396S, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T,
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5 L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.
f. Modificaciones para facilitar el enlace de grupo químico
También pueden realizarse modificaciones adicionales de un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento para facilitar el enlace posterior de un grupo químico. Pueden realizarse una o más sustituciones o inserciones de aminoácidos de modo que un grupo químico puede enlazarse con un polipéptido de FVII modificado mediante el aminoácido sustituido. Por ejemplo, puede introducirse una cisteína en un polipéptido de FVII modificado, al que puede unirse un resto de polietilenglicol (PEG) para conferir estabilidad y semivida en suero 15 aumentadas. Otros restos de unión incluyen restos de lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunos ejemplos, se reemplazan restos de aminoácidos para reducir el número de posiciones de enlace potenciales. Por ejemplo, el número de lisinas puede reducirse. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de FVII que pueden facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación, las que se describen en los documentos US20030096338, US20060019336, US6806063, WO200158935 y WO2002077218. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares de un polipéptido de FVII que pueden facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación: Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, 25 R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H,
35 K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H y K389H.
g. Mutaciones de combinación ejemplares
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que tienen dos o más modificaciones diseñadas para afectar a una o propiedades o actividades de un polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, las dos o más modificaciones alteran dos o más propiedades o actividades del polipéptido de FVII. Las modificaciones pueden realizarse a los polipéptidos de FVII de modo que se alteren una o más de actividad catalítica, resistencia a AT-III, resistencia a IRFT, resistencia a inhibición por Zn2+, actividad intrínseca, actividad amidolítica, unión y/o afinidad por fosfolípidos, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con
45 otros factores o moléculas, tales como FX, FIX, albúmina de suero e integrina de plaquetas IIb3. Típicamente, las dos o más modificaciones se combinan de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Las modificaciones pueden incluir sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. La actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado del polipéptido de FVII modificado que contiene dos o más modificaciones puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad del polipéptido de FVIIa de partida o no modificado.
55 Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones que se introducen en un polipéptido de FVII no modificado para alterar dos o más actividades o propiedades. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener 2, 3, 4, 5, 6 modificaciones. Además, cada modificación puede implicar uno o más restos de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones cada una de las cuales es una sustitución de un único aminoácido. En otro ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones, una de las cuales es una sustitución de un único aminoácido y la otra de las cuales implica la deleción de más de un resto de aminoácido y después inserción de más de un resto de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede contener la sustitución de aminoácidos S222A (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro
65 expuesto en SEQ ID NO: 3) para alterar la unión con Zn2+ y una modificación de Intercambio de Gla FIX, que implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83.
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5 Los polipéptidos de FVII modificados pueden tener dos o más modificaciones seleccionadas solamente de las expuestas en las Tablas 5 a 13. En otros ejemplos, el polipéptido de FVII modificado contiene dos o más modificaciones donde una o más modificaciones se seleccionan de las expuestas en las Tablas 5 a 13 y una o más modificaciones son modificaciones adicionales que no se exponen en las Tablas 5 a 13, tales como, por ejemplo, modificaciones descritas en la técnica. En algunos ejemplos, la o las modificaciones adicionales pueden seleccionarse de las expuestas en la Sección D.6.a-e, anterior. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener una modificación en uno o más de los restos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290
o K341 basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (correspondiente a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 y K192, respectivamente, basándose en la numeración de quimotripsina), que puede aumentar la resistencia a IRFT, y una modificación en uno o más restos de aminoácidos que afecta a la actividad
15 intrínseca, tal como, por ejemplo, V158 y M298, (V21 y M156, respectivamente, basándose en la numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos sustituciones de aminoácidos que aumentan la resistencia a IRFT, tales como K197E y G237V, y una sustitución de aminoácidos que aumenta la actividad intrínseca, tal como M298Q, que da como resultado un polipéptido de FVII con actividad coagulante aumentada.
Son ejemplos de las modificaciones de combinación proporcionadas en el presente documento las que incluyen al menos la mutación Q286R (numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; correspondiente a Q143R por numeración de quimotripsina). Los polipéptidos de FVII modificados que contienen la modificación Q286R pueden contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 modificaciones adicionales. Estas modificaciones adicionales
25 pueden incluirse, por ejemplo, para alterar la actividad catalítica, resistencia a AT-III, resistencia a IRFT, resistencia a la inhibición por Zn2+, actividad intrínseca, actividad amidolítica, unión y/o afinidad con fosfolípidos, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con otros factores o moléculas, tales como FX, FIX, albúmina de suero e integrina de plaquetas IIb3. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento que contienen dos o más modificaciones donde una modificación es la sustitución de aminoácidos Q286R, muestran actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII de tipo silvestre.
En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones, donde una es Q286R, muestran actividad catalítica y coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de tipo silvestre así 35 como en comparación con un polipéptido de FVII que contiene una cualquiera de las mutaciones sola. Por ejemplo, se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que contienen las sustituciones de aminoácidos tanto Q286R como M289Q (Q286R/M298Q con numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; correspondiente a Q143R/M156Q por numeración de quimotripsina). El mutante de FVII de combinación Q286R/M298Q muestra actividad catalítica aumentada para su sustrato, Factor X, en comparación con FVII de tipo silvestre, el mutante individual Q286R y el mutante individual M298Q (véase por ejemplo Ejemplo 4, posteriormente). Por ejemplo, en un estudio, el mutante M298Q mostró una actividad catalítica para FX, en presencia de FT, que era aproximadamente 1,8 a 2 veces mayor que la del polipéptido de tipo silvestre, la actividad catalítica del mutante Q286R fue aproximadamente 2,1 veces mayor que la del polipéptido de FVII de tipo silvestre, y el mutante Q286R/M298Q mostró una actividad catalítica para FX que era aproximadamente 3,6-4,4
45 veces la actividad catalítica del polipéptido de tipo silvestre para FX (véase la Tabla 15, posterior).
Se proporcionan modificaciones de combinación ejemplares no limitantes en la Tabla 12. Estas modificaciones de combinación ejemplares incluyen dos o más modificaciones que se diseñan para alterar dos o más actividades o propiedades de un polipéptido de FVII, incluyendo, pero sin limitación, resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, actividad intrínseca, actividad amidolítica, actividad catalítica, unión con Zn2+, unión y/o afinidad con fosfolípidos, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con otros factores o moléculas, tales como FX y FIX. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen dichas modificaciones de combinación pueden tener actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado. Las modificaciones expuestas en la Tabla 12 posterior usan los mismos sistemas de nomenclatura y numeración que se 55 han descrito en las Tablas 5 a 11, anteriores. Por ejemplo, la modificación de “Intercambio de Gla FIX” implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83, como se ha descrito anteriormente. En algunos ejemplos, la modificación de “Intercambio de Gla FIX” también contiene una o más sustituciones de aminoácidos en la parte de dominio Gla de FIX en comparación con un dominio Gla FIX de tipo silvestre, como se ha analizado anteriormente. Por ejemplo, la modificación de FIX de intercambio de Gla también puede incluir una sustitución de aminoácido M19K (numeración correspondiente a las posiciones de aminoácidos del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83). Dicha modificación se indica por {Intercambio de Gla FIX/M19K}, es decir el polipéptido de FVII modificado contiene un dominio Gla de FIX 65 heterólogo en el que la metionina en la posición correspondiente a la posición 19 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. Por lo tanto, se hace referencia a modificaciones realizadas a las
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partes de dominio Gla de FIX heterólogo usando posiciones de aminoácidos correspondientes a posiciones de aminoácidos del polipéptido de FIX de tipo silvestre maduro, o el dominio Gla de FIX de tipo silvestre expuesto en SEQ ID NO: 83. Se hace referencia a modificaciones realizadas a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII usando las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido 5 de FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3 y también se denomina por el esquema de numeración de quimotripsina. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado que contiene la modificación Q286R (numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3), y una modificación de Intercambio de Gla FIX, donde el dominio Gla de FIX contiene la sustitución de aminoácidos M19K (numeración correspondiente a las posiciones de aminoácidos del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83), se indica por {Intercambio de 10 Gla FIX/M19K}/Q286R. De forma similar, la modificación {Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q indica que el polipéptido de FVII contiene una modificación de intercambio de Gla FIX donde la glutamina en la posición de aminoácido correspondiente en la posición de aminoácido 44 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una serina, y también contiene las sustituciones de aminoácidos Q286R y M298Q, con numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. En la Tabla 12 posterior, se identifica el 15 identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.
Tabla 12
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
Intercambio de Gla FIX/Q286R
Intercambio de Gla FIX/Q143R 131
Q286R/H257A
H117A/Q143R 132
S222A/Q286R
S82A/Q143R 133
Q286R/S222A/H257A
S82A/H117A/Q143R 134
Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R
S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135
Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R
H117A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 136
Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/Q286R
Q143R/S82A/H117A/Intercambio de Gla FIX 137
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 138
Q286R/M298Q/K341Q
Q143R/M156Q/K192Q 139
K199E/Q286R/M298Q
K60cE/Q143R/M156Q 140
Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141
Q286R/Q366V
Q143R/Q217V 142
Q286R/A292N/A294S/Q366V
Q143R/A150N/A152S/Q217V 143
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 144
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 145
H257S/Q286R
H117S/Q143R 146
H257S/Q286R/Q366V
H117S/Q143R/Q217V 147
S222A/H257A/Q286R/Q366V
S82A/H117A/Q143R/Q217V 148
Q286R/H373A
Q143R/H224A 149
S222A/H257A/Q286R/M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 150
Q286R/K341D
Q143R/K192D 151
Q286R/Q366D
Q143R/Q2I7D 152
Q286R/Q366N
Q143R/Q217N 153
Q286R/M298Q/Q366D
Q143R/M156Q/Q217D 154
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 155
Q286R/H373F
Q143R/H224F 156
Q286R/M298Q/H373F
Q143R/M156Q/H224F 157
Intercambio de Gla FIX/S222A
Intercambio de Gla FIX/S82A 245
Intercambio de Gla FIX/H257A
Intercambio de GlaFIX/H117A 246
Intercambio de Gla FIX/S222A/H257A
Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247
S222A/M298Q
S82A/M156Q 248
H257A/M298Q
H117A/M156Q 249
S222A/H257A/M298Q
S82A/H117A/M156Q 250
S222A/A292N/A294S/Q366V
S82A/A150N/A152S/Q217V 251
A175S/S222A/0366V
A39S/S82A/0217V 252
S222A/Q366V
S82A/Q217V 253
H257S/Q366V
H117S/Q217V 254
S222A/H373A
S82A/H224A 255
imagen62
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
V158T/L287T/M298K
V21T/L144T/M156K 256
V158D/L287T/M298K
V21D/L144T/M156K 257
S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V
S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 258
S103S111delinsDiCLPRWGCLWED/G237V
S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 259
H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V
H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 260
H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V
H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 261
H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V
H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 262
T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V
T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 263
T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V
T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 264
S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V
S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 265
T128P134deIinsDICLPRWGCLWED/G237V
T[128]P[134]DICLPRWGCLWED/G97V 266
S103S111delinsSFGRGDIRNV/G237V
S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV/G97V 267
H115S126delinsSFGRGDIRNV/G237V
H[115]S[126]delinsSFGRGDIRNV/G97V 268
T128P134delinsSFGRGDIRNV/G237V
T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV/G97V 269
M298Q/H373F
M156Q/H224F 270
S119N/L121S/A175S
S[119]N/L[121]S/A39S 271
T128N/P129A/A175S
T[128]N/P[129]A/A39S 272
A122N/G124S/A175S
A[122]N/G[124]S/A39S 273
{Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX /E[40]L}/Q143R/M156Q 274
{Intercambio de Gla FIX/K431}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156Q 275
{Intercambio de Gla FIX/Q44SJ/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/Q1441S}/Q143R/M156Q 276
{Intercambio de Gla FEX/M19K}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FEX/M[19]K}/Q143R/M156Q 277
{Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q
{Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q143 R/M156Q 278
T128N/P129A/Q286R
T[128]N/P[129]A/Q143R 279
T128N/P129A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 280
T128N/P129A/Q286R/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281
V158D/Q286R/E296V/M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 282
T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q
T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M156Q 283
T128N/P129A/S222A
T[128]N/P[129]A/S82A 284
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222 A/Q286R
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S82A/Q143R 285
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 286
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q143R/M15 6Q 287
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H224F 288
S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q
S[52]A/S[60] A/V21D/E154V/M156Q 289
S52A/S60A/Q286R
S[52]A/S[60]A/Q143R 290
S52A/S60A/S222A
S[52]A/S[60]A/S82A 291
Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q2 86R
Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82 A/Q143R 292
S52A/S60A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293
Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 294
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R/M156Q 298
imagen63
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
S52A/S60A/Q286R/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H224F 297
V158D/T239V/E296V/M298Q
V21D/T99V/E154V/M156Q 298
T239V/Q286R
T99V/Q143R 299
S222A/T239V
S82A/T99V 300
Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R
Intercambio de Gla FIX/S82A/T99V/Q143R 301
T239V/Q286R/M298Q
T99V/Q143R/M156Q 302
S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q
S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 0 303
Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/T99V/Q 143R/M156Q 304
T239V/Q286R/H373F
T99V/Q143R/H224F 305
T239V/Q286R/M298Q/H373F
T99V/Q143R/M156Q/H224F 306
V158D/T239I/E296V/M298Q
V21D/T99I/E154V/M156Q 307
T239I/Q286R
T99I/Q143R 308
S222A/T239I
S82A/T99I 309
Intercambio de GlaFIX/S222A/T239I/Q286R
Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310
T239I/Q286R/M298Q
T99I/0143R/M156Q 311
S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q
S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312
Intercambio de GlaFIX/T239I/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313
T239I/Q286R/H373F
T99I/0143R/H224F 314
T239I/Q286R/M298Q/H373F
T991/Q143R/M156Q/H224F 315
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/H373F
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/H224F 316
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q 317
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q/ H373F
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q/H224F 318
V158D/E296V/M298Q/H373F
V21D/E154V/M156Q/H224F 319
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F
V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224F 320
H257A/Q286R/M298Q
H117A/Q143R/M156Q 321
H257S/Q286R/M298Q
H117S/0143R/M156Q 322
Intercambio de GlaFIX/S222A/H257S/Q286R
Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323
S222A/H257S/Q286R/M298Q
S82A/H117S/Q143R/M156Q 324
H257S/Q286R/M298Q/H373F
H117S/Q143R/M156Q/H224F 325
S222A/Q286R/M298Q/H373F
S82A/Q143R/M156Q/H224F 326
Intercambio de GlaFIX/Q366V
Intercambio de GlaFIX/Q217V 327
S222A/Q286R/M298Q
S82A/Q143R/M156Q 328
T128N/P129A/A175S/Q366V
T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329
A122N/G124S/A175S/Q366V
A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V 330
T128N/P129A/A175S/S222A
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331
A122N/G124S/A175S/S222A
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332
T128N/P129A/A175S/Q286R
T[128]N/P[129]A/A39S/0143R 333
A122N/G124S/A175S/Q286R
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/Q143 R 335
Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R
Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/Q143 R 336
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q 337
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q 338
T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 339
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 340
imagen64
Modificación -numeración de FVII maduro
Modificación -numeración de quimotripsina SEQ ID NO
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 341
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 342
T128N/P129A/M298Q
T[128]N/P[129]A/M156Q 354
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M 156QQ217N 357
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 N
{Intercambio de Gla FIX/K[43]l}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ217N 358
T128N/P129A/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/M156Q/H224F 359
V158D/Q286R/E296V/M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 360
M298Q/Q366N/H373F
M156Q/Q217N/H224F 361
T239V/M298Q/H373F
T99V/M156Q/H224F 362
T239I/M298Q/H373F
T99I/M156Q/H224F 363
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364
T239V/Q286R/M298Q/Q366N
T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365
T239I/Q286R/M298Q/Q366N
T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q 367
T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117A/Q143 R/M156Q 368
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q/H22 4F 369
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q 370
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q/H22 4F 371
E. Producción de polipéptidos de FVII
Pueden obtenerse polipéptidos de FVII, incluyendo polipéptidos de FVII modificados, o dominios de los mismos de
5 FVII u otro polipéptido de vitamina K, por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para identificación de ácidos nucleicos que codifiquen genes deseados. Puede usarse cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarca la región codificante completa) o clon de ADN genómico que codifica un polipéptido de FVII u otro polipéptido de vitamina K, tal como de una fuente celular o
10 tisular, tal como por ejemplo del hígado. Los polipéptidos de FVII modificados pueden modificarse técnicamente como se describe en el presente documento, tal como por mutagénesis dirigida.
FVII pude clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y exploración de
15 bibliotecas, incluyendo exploración de hibridación de ácidos nucleicos, exploración basada en anticuerpos y exploración basada en actividad.
Pueden usarse métodos para amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 20 Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como un material de partida a partir del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tisulares (por ejemplo de hígado), muestras de fluidos (por ejemplo sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en métodos de amplificación. También pueden usarse bibliotecas de ácido nucleico como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar una
25 molécula codificante de FVII. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse basándose en secuencias expresadas a partir de las que se genera un FVII. Los cebadores pueden diseñarse basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos de FVII. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse y puede confirmarse que codifican un polipéptido de FVII.
30 Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden unirse con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasas de restricción para el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican proteínas centrales. Además, secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden unirse operativamente con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas
imagen65
5 para facilitar la expresión de proteínas intracelulares y secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Secuencias de nucleótidos adicionales tales como secuencias que especifican regiones de unión a proteínas también pueden ligarse con moléculas de ácido nucleico que codifican FVII. Dichas regiones incluyen, pero sin limitación, secuencias para facilitar la captación de FVII en células diana específicas, o potenciar de otro modo la farmacocinética del gen sintético.
Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden después insertarse en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados 15 lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmidos pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos terminales cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos terminales del ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de proteína FVII puede modificarse por adición de colas homopoliméricas. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células
25 hospedadoras mediante, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.
En ejemplos específicos, la transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinantes que incorporan el gen de proteína de FVII aislado, ADNc o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.
1. Vectores y células
35 Para expresión recombinante de una o más de las proteínas de FVII, el ácido nucleico que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de FVII puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Es un ejemplo de dicho vector cualquier vector de expresión de mamífero tal como, por ejemplo, pCMV. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden proporcionarse por el promotor nativo para un gen de FVII, y/o sus regiones flanqueantes.
También se proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica el FVII o FVII modificado. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores
45 son cualquiera adecuado para su uso en las mismas.
Se proporcionan células procariotas y eucariotas, incluyendo células endoteliales, que contienen los vectores. Dichas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, arqueas, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo cultivando las células anteriormente descritas en condiciones por las que la proteína de FVII codificada se expresa por la célula, y recuperando la proteína de FVII expresada. Para fines del presente documento, el FVII puede secretarse al medio.
En un ejemplo, se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
55 que tiene actividad de FVII y contiene todo o una parte del polipéptido de FVII, o múltiples copias del mismo. Los vectores pueden seleccionarse para expresión del polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo en la célula o de modo que la proteína de FVII se exprese como una proteína secretada. Cuando el FVII se expresa el ácido nucleico se une a ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como la secuencia señal del factor de apareamiento  de Saccharomyces cerevisiae o una parte de la misma, o la secuencia señal nativa.
Puede usarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia codificante de proteínas. Estos incluyen pero sin limitación sistemas de células de mamíferos infectados con virus (por ejemplo virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas 65 con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador-vector usado, puede usarse uno cualquiera de
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varios elementos de transcripción y traducción adecuados.
Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control de 5 la transcripción/traducción apropiadas y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un hospedador transformado con la molécula o las moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse por cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En un ejemplo específico, el promotor no es nativo de los genes para una proteína de FVII. Los promotores que pueden usarse incluyen pero sin limitación el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22: 787-797 (1980)), el promotor de timidina quinasa del herpes 15 (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de -lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)); véase también “Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: en Scientific American 242: 79-94 (1980)); vectores de expresión vegetales que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) o el promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9: 2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor de Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol quinasa, el promotor de alcalina fosfatasa, y las siguientes regiones de control de la transcripción animales que muestran 25 especificidad tisular y se han usado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que está activa en células de acinos pancreáticos (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); región de control del gen de la insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)), región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495 (1986)), región de control del gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinckert et al., Genes and Devel. 1: 268-276 (1987)), región de control del gen de la fetoproteína alfa que está activa en hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235: 53-58 1987)), región de control del gen de 35 antitripsina alfa 1 que está activa en hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987)), región de control del gen de beta globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46: 89-94 (1986)), región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en célula oligodendrocíticas del cerebro (Readhead  ., Cell 48: 703-712 (1987)), región de control del gen de cadena ligera de miosina 2 que está activa en músculo esquelético (Shani, Nature 314: 283-286 (1985)), y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que está activa en gonadotropos del hipotálamo (Mason et al., Science
234: 1372-1378 (1986)).
En un ejemplo específico, se usa un vector que contiene un promotor unido operativamente con ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o un dominio, fragmento, derivado u 45 homólogo, del mismo, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores y sistemas de expresión de polipéptidos de FVII incluyen los vectores de Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, CA), particularmente los diseñados para secreción de las proteínas codificadas. Los vectores plasmídicos ejemplares para expresión en células de mamífero incluyen, por ejemplo, pCMV. Los vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor T5 de fagos (reconocido por ARN polimerasa de E. coli) y un módulo de represión de operador lac doble para proporcionar expresión de alto nivel, estrechamente regulada, de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión ribosómico sintético (RBS II) para traducción eficaz, una secuencia codificante de marcador His6X, 55 terminadores de la transcripción T1 y T0, origen de replicación ColE1, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de un marcador His6X en el extremo N o C terminal de la proteína recombinante. Dichos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para las tres fases de lectura y posibilitan la expresión de proteínas marcadas con His6x en el extremo N terminal. Otros vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión de pET (véase, patente de Estados Unidos 4.952.496; disponible de NOVAGEN, Madison, WI; véase también bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operador de lac de E. coli inducible, y el gen represor de lac; pET 12a-c, que contiene el promotor de T7, terminador de T7 y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), que contienen una secuencia líder
65 His-Tag™ para su uso en purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de purificación sobre la columna, la región promotora de lac de T7 y el terminador de T7.
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2. Sistemas de expresión
Pueden producirse polipéptidos de FVII (modificados y no modificados) por cualquier método conocido en la técnica para producción de proteínas incluyendo métodos in vitro e in vivo tales como, por ejemplo, la introducción de
5 moléculas de ácido nucleico que codifican FVII en una célula hospedadora, animal hospedador y expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican FVII in vitro. Pueden expresarse FVII y polipéptidos de FVII modificados en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y formas de un polipéptido de FVII necesario para administración y tratamiento. Los hospedadores de expresión incluyen organismos procariotas y eucariotas tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los hospedadores de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección de hospedador de expresión puede realizarse basándose en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costes de producción y la necesidad y los métodos de purificación.
15 La expresión en hospedadores eucariotas puede incluir expresión en levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, células de insecto tales como células de Drosophila y células de lepidópteros, plantas y células vegetales tales como tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucariotas para expresión también incluyen líneas celulares de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de riñón de cría de hámster (BHK). Los hospedadores de expresión eucariotas también incluyen producción en animales transgénicos, por ejemplo, incluyendo producción en suero, leche y huevos. Se conocen en la técnica animales transgénicos para la producción de polipéptidos de FVII de tipo silvestre (Publicaciones de Patente de Estados Unidos n.º 20020166130 y 20040133930) y pueden adaptarse para la producción de polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento.
25 Muchos vectores de expresión están disponibles y se conocen por los expertos en la materia para la expresión de FVII. La elección del vector de expresión está influida por la elección del sistema de expresión hospedador. Dicha selección está dentro del nivel de experiencia del experto en la materia. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores de la transcripción y opcionalmente potenciadores, señales de traducción, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión que se usan para transformación estable típicamente tienen un marcador seleccionable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias de los vectores en las células.
FVII o polipéptidos de FVII modificados también pueden utilizarse o expresarse como fusiones de proteínas. Por
35 ejemplo, una fusión puede generarse para añadir funcionalidad adicional a un polipéptido. Los ejemplos de proteínas de fusión incluyen, pero sin limitación, fusiones de una secuencia señal, o un marcador tal como para localización, por ejemplo un marcador de his6 o un marcador de myc, o un marcador para purificación, por ejemplo, una fusión de GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o asociación a membrana.
En un ejemplo, el polipéptido de FVII o polipéptidos FVII modificados pueden expresarse en una forma activa, por lo que se consigue activación por autoactivación del polipéptido después de secreción. En otro ejemplo, la proteasa se expresa en una forma de zimógeno, inactiva.
Los métodos de producción de polipéptidos de FVII pueden incluir coexpresión de uno o más polipéptidos
45 heterólogos adicionales que pueden ayudar en la generación de los polipéptidos de FVII. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden contribuir al procesamiento postraduccional de los polipéptidos de FVII. Los polipéptidos ejemplares incluyen, pero sin limitación, peptidasas que ayudan a escindir secuencias precursoras de FVII, tales como la secuencia de propéptido y enzimas que participan en la modificación del polipéptido de FVII, tal como por glucosilación, hidroxilación, carboxilación o fosforilación, por ejemplo. Una peptidasa ejemplar que puede coexpresarse con FVII es PACE/furina (o PACE-SOL), que ayuda en la escisión de la secuencia propeptídica de FVII. Una proteína ejemplar que ayuda en la carboxilación del polipéptido de FVII es la enzima sensible a warfarina vitamina K 2,3-epóxido reductasa (VKOR), que produce vitamina K reducida para su utilización como un cofactor por la -carboxilasa dependiente de vitamina K (Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607). Una subunidad de esta enzima, VKORC1, puede coexpresarse con el polipéptido de FVII modificado para aumentar la  -carboxilación.
55 El o los polipéptidos adicionales pueden expresarse a partir del mismo vector de expresión que el polipéptido de FVII
o de un vector diferente.
a.
Expresión de procariotas
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de FVII (véase, por ejemplo, Platis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; y Khalilzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69). La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la materia. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles que son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que muestran algo de toxicidad a las
65 células hospedadoras. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor de lac, el promotor de trp, el promotor de tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor de PL regulado por temperatura.
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FVII puede expresarse en el ambiente citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un ambiente reductor y para algunas moléculas esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol y -mercaptoetanol y desnaturalizantes (por ejemplo, tales como guanidina-HCl y urea) para resolubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de FVII en el espacio 5 periplásmico de bacterias lo que proporciona un ambiente oxidante e isomerasas de tipo chaperonina y disulfuro lo que conduce a la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona con la proteína para expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder se retira después por peptidasas señal al periplasma. Los ejemplos de secuencias líder de dirección periplásmica incluyen el líder pelB del gen de pectato liasa y el líder derivado del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la fuga de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan pueden obtenerse del periplasma por lisis osmótica. De forma similar a la expresión citoplasmática, en algunos casos las proteínas pueden hacerse insolubles y pueden usarse desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y solubilidad. Típicamente, se usan 15 temperaturas entre 25 ºC y 37 ºC. También pueden usarse mutaciones para aumentar la solubilidad de proteínas expresadas. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglucosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glucosilación para función, puede añadirse glucosilación in vitro después de la purificación de células hospedadoras.
b. Levadura
Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis,y Pichia pastoris son hospedadores de expresión útiles para FVII (véase por ejemplo, Skoko et al. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3): 257-65). La levadura puede transformarse con vectores de replicación episómicos o por integración cromosómica estable mediante recombinación homóloga. Típicamente, se usan 25 promotores inducibles para regular la expresión génica. Los ejemplos de dichos promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína tales como CUP1. Los vectores de expresión incluyen con frecuencia un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levadura son con frecuencia solubles y la coexpresión con chaperoninas, tales como Bip y proteína disulfuro isomerasa, pueden mejorar los niveles de expresión y solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse para secreción usando fusiones de péptido señal de secreción tales como la señal de secreción del factor alfa de tipo apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de apareamiento Aga2p
o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, la proteasa Kex-2) puede
modificarse técnicamente para retirar las secuencias fusionadas de los polipéptidos a medida que salen de la ruta de 35 secreción. La levadura también es capaz de glucosilar en motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Insectos y células de insectos
Los insectos y células de insectos, particularmente usando un sistema de expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como FVII o formas modificadas de los mismos (véase, por ejemplo, Muneta et al. (2003)
J. Vet. Med. Sci. 65(2): 219-23). Las células de insectos y larvas de insectos, incluyendo expresión en la hemolinfa, expresan altos niveles de proteína y tienen capacidad para la mayoría de las modificaciones postraduccionales usadas por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un intervalo de hospedadores restrictivo lo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariota. Típicamente, los vectores de
45 expresión usan un promotor tal como el promotor de la polihedrina de baculovirus para alto nivel de expresión. Los sistemas de baculovirus usados habitualmente incluyen baculovirus tales como virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insecto tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para expresión a alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula para expresar se fusiona inmediatamente cadena abajo del codón de inicio de la polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insecto y pueden usarse para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glucosilación similares a los sistemas de célula de mamífero.
55  Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus) para expresión. El promotor de metalotioneína de Drosophila puede usarse para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción de metales pesados con cadmio y cobre. Los vectores de expresión típicamente se mantienen mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
Pueden usarse sistemas de expresión de mamíferos para expresar polipéptidos de FVII. Las construcciones de expresión pueden transferirse a células de mamífero mediante infección viral tal como adenovirus o mediante 65 transferencia de ADN directa tales como liposomas, fosfato cálcico, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio
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terminal de ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. Dichos vectores incluyen con frecuencia promotores-potenciadores de la transcripción para expresión a alto nivel, por ejemplo el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV), y la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous (VSR). Estos promotores-potenciadores están
5 activos en muchos tipos celulares. Los promotores de tipo tisular y celular y regiones potenciadoras también pueden usarse para expresión. Las regiones promotoras/potenciadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación, las de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteína, alfa 1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina 2 y control por el gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Los marcadores seleccionables pueden usarse para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina quinasa. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR- y FcRI- puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.
15 Están disponibles muchas líneas celulares para expresión de mamíferos incluyendo células de ratón, de rata, de ser humano, de mono, de pollo y de hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen, pero sin limitación, BHK (es decir células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretora) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 y HKB. También están disponibles líneas celulares adaptadas para medio sin suero lo que facilita la purificación de proteínas secretadas desde el medio de cultivo celular. Un ejemplo tal es la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42). La expresión del polipéptido de FVII recombinante que muestra estructura y modificaciones postraduccionales similares al FVII derivado de plasma se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Jurlander et al. (2003) Semin Throm Haemost). Se conocen métodos
25 para optimizar la expresión de proteínas dependientes de vitamina K. Por ejemplo, la complementación de vitamina K en medio de cultivo o coexpresión de -carboxilasas dependientes de vitamina K (Wajih el al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) puede ayudar a la modificación postraduccional de proteínas dependientes de vitamina K, tales como polipéptidos de FVII.
e. Plantas
Pueden usarse células vegetales y plantas transgénicas para la expresión de FVII. Se transfieren típicamente construcciones de expresión a plantas usando transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por 35 agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y técnicas de transformación se dividen habitualmente entre hospedadores dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco y hospedadores monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales usados para expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Se usan con frecuencia marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de células transformadas. Las células vegetales transformadas pueden mantenerse en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse en plantas completas. Debido a que las plantas tienen patrones de glucosilación diferentes de las células de mamífero, esto puede influir en la elección para producir FVII
45 en estos hospedadores. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas técnicamente para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100: 438-442). Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glucosilación que las células de mamífero, esto puede influir en la elección de producir FVII en estos hospedadores.
2. Purificación
Los métodos para purificación de polipéptidos de FVII de células hospedadoras dependen de las células hospedadoras seleccionadas y los sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican en general a partir del medio de cultivo después de retirar las células. Para expresión intracelular, las células pueden
55 lisarse y las proteínas purificarse del extracto. Cuando se usan organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos para expresión, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto celular lisado. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que puede recogerse, y si es necesario además las proteínas pueden extraerse y purificarse adicionalmente usando métodos convencionales en la técnica.
FVII puede purificarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en este campo incluyendo pero sin limitación, SDS-PAGE, cromatografía de fracción por tamaño y exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de quelado y cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII pueden purificarse por cromatografía de intercambio aniónico. Un ejemplo de un método 65 para purificar polipéptidos de FVII es usando una columna de intercambio iónico que permite la unión de cualquier polipéptido que tenga una dominio Gla funcional, seguido de elución en presencia de calcio (véase por ejemplo,
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Ejemplo 2). También pueden usarse técnicas de purificación de afinidad para mejorar la eficacia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen con FVII en purificación de afinidad. En otro ejemplo, la purificación también puede potenciarse usando una columna de afinidad de FT soluble (FTs) (Maun et al. (2005) Prot Sci 14: 1171-1180). También pueden obtenerse técnicamente
5 construcciones de expresión para añadir un marcador de afinidad tal como un epítopo de myc, fusión de GST o His6 y purificarse por afinidad con anticuerpo de myc, resina de glutatión y resina Ni, respectivamente, con una proteína. La pureza puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel y tinción y técnicas espectrofotométricas.
La proteasa de FVII puede expresarse y purificarse para que esté en una forma inactiva (forma de zimógeno) o como alternativa la proteasa expresada puede purificarse en una forma activa, tal como por autocatálisis. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII que se han activado mediante escisión proteolítica del Arg152-Ile153 pueden prepararse in vitro (es decir FVIIa; forma de dos cadenas). Los polipéptidos de FVII pueden prepararse en primer lugar por cualquiera de los métodos de producción descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin
15 limitación, producción en células de mamífero seguido de purificación. La escisión de los polipéptidos de FVII en la forma de proteasa activa, FVIIa, puede conseguirse por varios medios. Por ejemplo, la autoactivación durante la incubación con vesículas fosfolipídicas en presencia de calcio puede conseguirse en 45 minutos (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276: 39825-31). Los polipéptidos de FVII también pueden activarse hasta su compleción por incubación con el factor Xa, factor XIIa o FT en presencia de calcio, con o sin fosfolípidos (véase por ejemplo, Ejemplo 2 y Broze et al. (1980) J Biol Chem 255: 1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271: 26569-26574, Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369).
3. Proteínas de fusión
25 También se proporcionan proteínas de fusión que contienen un polipéptido de FVII modificado y uno o más polipéptidos adicionales. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de fusión formuladas para administración por una vía adecuada. Las proteínas de fusión se forman uniendo en cualquier orden el polipéptido de FVII modificado y un agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando y otro agente tal para los fines de facilitar la purificación de un polipéptido de FVII, alterar las propiedades farmacodinámicas de un polipéptido de FVII dirigiendo, por ejemplo, el polipéptido a una célula o un tejido diana, y/o aumentando la expresión o secreción del polipéptido de FVII. Típicamente cualquier proteína de fusión de FVII conserva al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de actividad coagulante en comparación con un polipéptido de FVII no de fusión, incluyendo 96 %, 97 %, 98 %, 99 %
o más actividad coagulante en comparación con un polipéptido no de fusión.
35 El enlace de un polipéptido de FVII con otro polipéptido puede efectuarse directa o indirectamente mediante un enlazador. En un ejemplo, el enlace puede ser por enlace químico, tal como mediante agentes heterobifuncionales o enlaces de tiol u otros enlaces tales. La fusión también puede efectuarse por medios recombinantes. La fusión de un polipéptido de FVII con otro polipéptido puede ser con el extremo N o C terminal del polipéptido de FVII. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos que pueden usarse en proteínas de fusión con un polipéptido FVII proporcionado en el presente documento incluyen, por ejemplo, un polipéptido de GST (glutatión S-transferasa), dominio Fc de inmunoglobulina G, o una secuencia señal heteróloga. Las proteínas de fusión pueden contener componentes adicionales, tales como proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP) que ayuda en la captación de la proteína por células (véase, solicitud de PCT Internacional Nº WO 01/32711).
45 Una proteína de fusión puede producirse por técnicas recombinantes convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas pueden ligarse entre sí en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o extremos escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable, y ligamiento enzimático. En otro ejemplo, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por
55 ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica FVII puede clonarse en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión se una en fase con la proteína de proteasa.
4. Modificación de polipéptidos
Los polipéptidos de FVII modificados pueden prepararse como cadenas polipeptídicas desnudas o como un complejo. Para algunas aplicaciones, puede ser deseable preparar FVII modificado en una forma “desnuda” sin modificaciones postraduccionales u otras químicas. Pueden prepararse cadenas polipeptídicas desnudas en
65 hospedadores adecuados que no modifican postraduccionalmente FVII. Dichos polipéptidos también pueden prepararse en sistemas in vitro y usando síntesis de polipéptidos química. Para otras aplicaciones, pueden desearse modificaciones particulares incluyendo pegilación, albuminación, glucosilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación u otras modificaciones conocidas. Pueden realizarse modificaciones in vitro o, por ejemplo, produciendo el FVII modificado en un hospedador adecuado que produce dichas modificaciones.
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5 5. Secuencias de nucleótidos
Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de FVII o FVII modificados. Las moléculas de ácido nucleico incluyen variante alélicas o variantes de corte y empalme de cualquier polipéptido de FVII codificado. Son ejemplos de moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento cualquiera que codifique un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento, tal como cualquiera que codifique un polipéptido expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 113-273. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento tienen al menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 99 % de identidad de secuencia o hibridan en condiciones de rigurosidad media o alta a lo largo de al menos el 70 % de la longitud completa de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido de FVII
15 proporcionado en el presente documento. En otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede incluir las que tienen secuencias codónicas degradadas que codifican cualquiera de los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento.
F. Evaluación de actividades de polipéptidos de FVII modificados
Las actividades y propiedades de polipéptidos de FVII pueden evaluarse in vitro y/o in vivo. Los expertos en la materia conocen ensayos para dicha evaluación y se sabe que correlacionan actividades ensayadas y resultados con actividades terapéuticas e in vivo. En un ejemplo, las variantes de FVII pueden evaluarse en comparación con FVII no modificado y/o de tipo silvestre. En otro ejemplo, la actividad de polipéptidos de FVII modificados puede
25 evaluarse después de exposición in vitro o in vivo a AT-III y compararse con la de polipéptidos de FVII modificados que no se han expuesto a AT-III. Dichos ensayos pueden realizarse en presencia o ausencia de FT. Los ensayos in vitro incluyen cualquier ensayo de laboratorio conocido por un experto en la materia, tal como por ejemplo, ensayos basados en células incluyendo ensayos de coagulación, ensayos de unión, ensayos de proteínas y ensayos de biología molecular. Los ensayos in vivo incluyen ensayos de FVII en modelos animales así como administración a seres humanos. En algunos casos, la actividad de FVII in vivo puede determinarse evaluando la sangre, el suero u otro fluido corporal para determinantes de ensayo. Las variantes de FVII también pueden ensayarse in vivo para evaluar una actividad o propiedad, tal como efecto terapéutico.
Típicamente, los ensayos descritos en el presente documento son con respecto a la forma activada bicatenaria de
35 FVII, es decir FVIIa. Dichos ensayos también pueden realizarse con la forma monocatenaria, tal como para proporcionar un control negativo ya que dicha forma típicamente no contiene actividad proteolítica o catalítica requerida para la actividad de coagulación de FVII. Además, dichos ensayos también pueden realizarse en presencia de cofactores, tales como FT, lo que en algunos casos aumenta la actividad de FVII.
1. Ensayos in vitro
Los ensayos in vitro ejemplares incluyen ensayos para evaluar la modificación y actividad de polipéptidos. Las modificaciones pueden evaluarse usando ensayos in vitro que evalúan la -carboxilación y otras modificaciones postraduccionales, ensayos de proteínas y ensayos conformacionales conocidos en la técnica. Los ensayos para
45 actividad incluyen, pero sin limitación, medición de la interacción de FVII con otros factores de coagulación, tales como FT, factor X y factor IX, ensayos proteolíticos para determinar la actividad proteolítica de polipéptidos de FVII, ensayos para determinar la unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII para fosfatidilserinas y otros fosfolípidos, y ensayos basados en células para determinar el efecto de polipéptidos de FVII en la coagulación.
Las concentraciones de polipéptidos de FVII modificados pueden evaluarse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), SDS-PAGE; métodos de Bradford, Lowry, BCA; absorbancia UV y otros métodos de marcaje de proteínas cuantificables, tales como, pero sin limitación, métodos inmunológicos, radiactivos y fluorescentes y métodos relacionados.
55 La evaluación de productos de escisión de reacciones de proteólisis, incluyendo escisión de polipéptidos de FVII o productos producidos por actividad proteasa de FVII, puede realizarse usando métodos incluyendo, pero sin limitación, escisión de sustrato cromogénico, HPLC, análisis de SDS-PAGE, ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, secuenciación NH2-terminal y marcaje de proteínas.
También pueden evaluarse las propiedades estructurales de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, puede realizarse cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica (crio-EM) de polipéptidos de FVII modificados para evaluar la estructura tridimensional de los polipéptidos de FVII y/u otras propiedades de polipéptidos de FVII, tales como unión con Ca2+ o cofactor.
65 Adicionalmente, la presencia y el grado de degradación de FVII pueden medirse por técnicas convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y transferencia de Western de muestras que contienen FVII sometidas a electroforesis. Los polipéptidos de FVII que se han expuesto a proteasas también pueden someterse a secuenciación N terminal para determinar la localización o cambios en sitios de escisión de los polipéptidos de FVII modificados.
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5 a. Modificación postraduccional
Los polipéptidos de FVII también pueden evaluarse con respecto a la presencia de modificaciones postraduccionales. Dichos ensayos se conocen en la técnica e incluyen ensayos para medir la glucosilación, hidroxilación y carboxilación. En un ensayo ejemplar para glucosilación, puede realizarse análisis de carbohidratos, por ejemplo, con análisis de SDS page de polipéptidos de FVII expuestos a hidracinolisis o tratamiento con endoglucosidasa. La hidracinolisis libera glucanos ligados a N y O de glucoproteínas por incubación con hidracina anhídrida, mientras que la liberación de endoglucosidasa implica a PNGasa F, que libera la mayoría de N-glucanos de glucoproteínas. La hidracinolisis o el tratamiento con endoglucosidasa de polipéptidos de FVII genera un extremo reductor que puede marcarse con un marcador fluoróforo o cromóforo. Los polipéptidos de FVII marcados pueden 15 analizarse por electroforesis de carbohidratos asistidas por fluoróforo (FACE). El marcador fluorescente para glucanos también puede usarse para análisis de monosacáridos, realización de perfiles o identificación genética de patrones de glucosilación complejos por HPLC. Los ejemplos de métodos de HPLC incluyen cromatografía de interacción hidrófila, interacción electrónica, intercambio de iones, interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión por tamaño. Las sondas de glucanos ejemplares incluyen, pero sin limitación, 3-(acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) y ácido 2-aminobenzoico (2-AA). También pueden detectarse restos de carbohidratos mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen el polipéptido de FVII glucosilado. Un ensayo ejemplar para medir la hidroxilación comprende análisis de HPLC de fase inversa de polipéptidos de FVII que se ha sometido a hidrólisis alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84: 7856-7860). La carboxilación y -carboxilación de polipéptidos de FVII puede evaluarse usando espectrometría de masas con análisis de desorción e ionización por láser asistida por 25 matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), como se describe en la técnica (véase, por ejemplo Harvey et al. J Biol Chem
278:
8363-8369, Maun et al. Prot Sci 14: 1171-1180). La interacción de un polipéptido de FVII que contiene el propéptido (pro-FVII) con la carboxilasa responsable de la modificación de -carboxilato postraduccional también puede evaluarse. La constante de disociación (Kd) después de incubación de carboxilasa con polipéptidos pro FVII marcados con fluoresceína puede medirse determinando la cantidad de carboxilasa unida por anisotropía (Lin et al. (2004) J Biol Chem 279: 6560-6566).
b.
Actividad proteolítica
Los polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a actividad proteolítica. La actividad
35 proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como Cromozima t-PA (MeSO2-D-Phe-GlyArg-pNA), S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa y Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA). Los polipéptidos de FVII, solos o en presencia de FT, se incuban con diversas concentraciones de sustrato cromogénico. La escisión del sustrato puede controlarse por la absorbancia y la tasa de hidrólisis de sustrato determinada por regresión lineal usando software fácilmente disponible.
La activación de sustratos de factor de coagulación, tales como FX, por polipéptidos de FVII también puede evaluarse. Los polipéptidos de FVII, con o sin preincubación con FT, pueden incubarse con FX purificado (disponible en el mercado). La cantidad de FXa activo producido como consecuencia de incubación con polipéptidos de FVII se
45 mide como actividad de FXa para un sustrato cromogénico, tal como S-2222 o Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHAGly-Arg-AMC.AcOH), que se controla mediante cambios en la absorbancia (Harvey  . J Biol Chem 278: 83638369, véase también Ejemplo 4 posterior). También puede incluirse una fuente de fosfolípidos en la incubación de FVII y FX (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276: 39825-31).
c. Actividad de coagulación
Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a actividad de coagulación usando ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, algunos de los ensayos incluyen, pero sin limitación, un ensayo de coagulación de dos estadios (Liebman et al., (1985) PNAS 82: 3879-3883); el ensayo de tiempo de protrombina (PT, que puede medir la
55 actividad dependiente de FT de FVIIa en la ruta extrínseca); ensayos que son modificaciones del ensayo de PT; el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT, que puede medir la actividad independiente de FT de FVIIa); tiempo de coagulación activada (ACT); tiempo de coagulación activada recalcificada; el tiempo de Coagulación de Lee-White; o tromboelastografía (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9: S15-S24). Por ejemplo, la actividad de coagulación de un polipéptido de FVII modificado puede determinarse por un ensayo basado en PT donde FVII se diluye en plasma deficiente en FVII, y se mezcla con reactivo de tiempo de protrombina (FT recombinante con fosfolípidos y calcio), tal como el disponible como Innovin™ de Dade Behring. La formación de coágulos se detecta ópticamente y se determina el tiempo hasta la coagulación y se compara frente a plasma deficiente en FVII solamente.
65
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d. Unión con y/o inhibición por otras proteínas y moléculas
Los ensayos de inhibición pueden usarse para medir la resistencia de polipéptidos de FVII modificados a inhibidores de FVII, tales como, por ejemplo, AT-III e IRFT, o moléculas tales como Zn2+. La evaluación de inhibición para otros
5 inhibidores también puede ensayarse e incluye, pero sin limitación, otros inhibidores de serina proteasa, y anticuerpos específicos de FVII. La inhibición puede evaluarse mediante incubación de, por ejemplo, AT-III. IRFT o Zn2+ con polipéptidos de FVII que se han preincubado con y/o sin FT. La actividad de FVII puede después medirse usando uno cualquiera o más de los ensayos de actividad o coagulación descritos anteriormente, y la inhibición por AT-III, IRFT o Zn2+ puede evaluarse comparando la actividad de polipéptidos de FVII incubados con el inhibidor, con la actividad de polipéptidos de FVII que no se incubaron con el inhibidor.
Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a la unión con otros factores de coagulación e inhibidores. Por ejemplo, las interacciones directas e indirectas de FVII con cofactores, tales como FT, sustratos, tales como FX y FIX, e inhibidores, tales como antitrombina III, IRFT y heparina pueden evaluarse usando cualquier ensayo de
15 unión conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, inmunoprecipitación, purificación en columna, SDS-PAGE no reductor, ensayos de BIAcore®, resonancia de plasmón superficial (RPS), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), polarización de fluorescencia (FP), calorimetría de valoración isotérmica (ITC), dicroísmo circular (CD), ensayos de complementación de fragmentos proteicos (PCA), Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectroscopia, dispersión de la luz, equilibrio de sedimentación, cromatografía de filtración en gel de zona pequeña, retardo en gel, transferencia de western lejano, polarización de fluorescencia, identificación genética de proteínas con radicales hidroxilo, presentación en fagos y diversos sistemas de dos híbridos. En un ejemplo, la unión con Zn2+ se evalúa usando análisis de equilibrio (Petersen et al., (2000) Protein Science 9: 859866)
25 e. Afinidad de fosfolípidos
La unión y/o afinidad de polipéptido de FVII modificado con fosfatidilserina (PS) y otros fosfolípidos puede determinarse usando ensayos bien conocidos en la técnica. Pueden usarse fosfolípidos altamente puros (por ejemplo, concentraciones conocidas de PS bovina y fosfatidilcolina (PC) de huevo, que están disponibles en el mercado, tal como de Sigma, en disolvente orgánico para preparar vesículas fosfolipídicas unilamelares pequeñas. La unión del polipéptido de FVII con estas vesículas de PS/PC puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90º de la luz incidente. La intensidad de la dispersión de la luz con PC/PS solamente y con PC/PS/FVII se mide para determinar la constante de disociación (Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369). La resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento biosensor de BIAcore, también puede usarse para medir la afinidad de
35 polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas (Sun et al. Blood 101: 2277-2284).
2. Modelos animales no humanos
Pueden usarse modelos animales no humanos para evaluar la actividad, eficacia y seguridad de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, pueden usares animales no humanos como modelos para una enfermedad o afección. Pueden inyectarse a animales no humanos sustancias inductoras de enfermedad y/o fenotipo antes de la administración de variantes de FVII, tales como cualquier variante de FVII expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 113-273, para controlar los efectos en la progresión de enfermedad. También son útiles modelos genéticos. Pueden generarse animales, tales como ratones, que imitan una enfermedad o afección por la sobreexpresión,
45 infraexpresión o anulación de uno o más genes, tal como, por ejemplo, ratones con anulación del factor VIII que presentan hemofilia A (Bi et al. (1995) Nat Gen 10: 119-121). Dichos animales pueden generarse por técnicas de producción de animales transgénicos bien conocidas en este campo o usando cepas mutantes de origen natural o inducidas. Los ejemplos de modelos animales no humanos útiles de enfermedades asociadas con FVII incluyen, pero sin limitación, modelos de trastornos de sangrado, en particular hemofilia, o enfermedad trombótica. También pueden usarse modelos animales no humanos para lesión para evaluar una actividad, tal como la actividad de coagulación, de polipéptidos de FVII. Estos modelos animales no humanos pueden usarse para controlar la actividad de variantes de FVII en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre.
También pueden usarse modelos animales para controlar la estabilidad, semivida y eliminación de polipéptidos de
55 FVII modificados. Dichos ensayos son útiles para comparar polipéptidos de FVII modificados y para calcular dosis y regímenes de dosis para ensayos adicionales de animales no humanos y seres humanos. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado, tal como cualquier variante de FVII proporcionada en el presente documento incluyendo, por ejemplo, cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 113-273, puede inyectarse en la vena de la cola de ratones. Las muestras de sangre se toman después en puntos temporales después de la inyección (tales como minutos, horas y días después) y después se puede controlar el nivel de los polipéptidos de FVII modificados en muestras corporales incluyendo, pero sin limitación, suero o plasma en puntos temporales específicos por ejemplo por ELISA o radioinmunoensayo. También pueden ensayarse muestras de sangre de diversos puntos temporales después de inyección de los polipéptidos de FVII con respecto a actividad de coagulación usando diversos métodos, tales como se describen en el Ejemplo 9. Estos tipos de estudios farmacocinéticos pueden
65 proporcionar información con respecto a la semivida, eliminación y estabilidad de los polipéptidos de FVII, que pueden ayudar a determinar dosificaciones adecuadas para la administración como un procoagulante.
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Pueden ensayarse polipéptidos de FVII modificados, tales como cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 113-273, con respecto a eficacia terapéutica usando modelos animales para hemofilia. En un ejemplo no limitante, puede usarse un modelo animal tal como un ratón. Los modelos de ratón de hemofilia están disponibles en la técnica y pueden emplearse para ensayar polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, un modelo de ratón de 5 hemofilia A que se produce por inyección con anticuerpos anti FVIII pueden usarse para evaluar la actividad coagulante de polipéptidos de FVII (véase por ejemplo Ejemplo 6, y Tranholm et al. Blood (2003)102: 3615-3620). También puede usarse un modelo de ratón de hemofilia B para ensayar los polipéptidos de FVII (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). También existen modelos de trastorno de sangrado no de ratón. La actividad de polipéptidos de FVII puede evaluarse en ratas con sangrado inducido por warfarina o sangrado inducido por melagatrán (Diness et al. (1992) Thromb Res 67: 233-241, Elg et al. (2001) Thromb Res 101: 145-157) y conejos con sangrado inducido por heparina (Chan et al. (2003) J Thromb Haemost 1: 760-765). También pueden usarse perros endogámicos con hemofilia A, hemofilia B y enfermedad de von Willebrand que presentan sangrado grave en estudios animales no humanos con polipéptidos de FVII (Brinkhous et al. (1989) PNAS 86: 1382-1386). La actividad de polipéptidos de FVII también puede evaluarse en un modelo de conejo de sangrado en el que se induce
15 trombocitopenia por una combinación de irradiación gamma y el uso de anticuerpos de plaquetas (Tranholm et al. (2003) Thromb Res 109: 217-223).
Además de animales con trastornos de sangrado generalizado, también pueden usarse modelos de lesión y traumatismo para evaluar la actividad de polipéptidos de FVII, y su seguridad y eficacia como un producto terapéutico coagulante. Los ejemplos no limitantes de dichos modelos incluyen un modelo de estenosis coronaria de conejo (Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51: 672-679), un modelo de lesión de hígado de grado V en cerdos (Lynn et al. (2002) J Trauma 52: 703-707), un modelo de lesión de hígado de grado V en cerdos (Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50: 721-729) y un modelo de aortotomía de cerdos (Sondeen et al. (2004) Shock 22: 163-168).
25 3. Ensayos clínicos
Muchos ensayos están disponibles para evaluar la actividad de FVII para su uso clínico. Dichos ensayos pueden incluir la evaluación de la coagulación, estabilidad de proteínas y semivida in vivo, y ensayos fenotípicos. Los ensayos fenotípicos y ensayos para evaluar el efecto terapéutico del tratamiento con FVII incluyen la evaluación de los niveles de FVII en sangre (por ejemplo medición de FVII en suero antes de la administración y puntos temporales después de las administraciones incluyendo, después de la primera administración, inmediatamente después de la última administración y puntos temporales intermedios, corrigiendo con respecto al índice de masa corporal (IMC)), evaluación de la coagulación sanguínea in vitro usando los métodos descritos anteriormente después del tratamiento con FVII (por ejemplo ensayo de PT), y respuesta fenotípica al tratamiento con FVII incluyendo alivio de síntomas a
35 lo largo del tiempo en comparación con sujetos tratados con un FVII no modificado y/o de tipo silvestre o placebo. Los pacientes tratados con polipéptidos de FVII pueden controlarse con respecto a pérdida de sangre, requisitos de transfusión, y hemoglobina. Los pacientes pueden controlarse regularmente a lo largo de un periodo de tiempo para administraciones rutinarias o repetidas, o después de la administración en respuesta a acontecimientos agudos, tales como hemorragia, traumatismo o procedimientos quirúrgicos.
G. Formulación y administración
Se proporcionan en el presente documento composiciones para su uso en el tratamiento de trastornos de sangrado. Dichas composiciones contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido del factor VII como se
45 describe en el presente documento. Se mezclan concentraciones eficaces de polipéptidos de FVII o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos con un vehículo o transportador farmacéutico adecuado para administración sistémica, tópica o local. Se incluyen compuestos en una cantidad eficaz para tratar el trastorno seleccionado. La concentración del compuesto activo en la composición dependerá de las tasas de absorción, inactivación, secreción del compuesto activo, el programa de dosificación y la cantidad administrada así como otros factores conocidos por los expertos en la materia.
Los vehículos o transportadores farmacéuticos adecuados para administración de los compuestos proporcionados en el presente documento incluyen cualquiera de dichos vehículos que los expertos en la materia saben que es adecuado para el modo particular de administración. También pueden proporcionarse composiciones farmacéuticas 55 que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de FVII descrito en el presente documento como un polvo liofilizado que se reconstituye, tal como con agua estéril, inmediatamente antes de su administración.
1. Formulaciones
Pueden formularse composiciones farmacéuticas que contienen un FVII modificado de cualquier manera convencional mezclando una cantidad seleccionada del polipéptido con uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. La selección del vehículo o excipiente está dentro de la experiencia de la profesión de administración y puede depender de varios parámetros. Estos incluyen, por ejemplo, el modo de administración (es decir, modo sistémico, oral, nasal, pulmonar, local, tópico o cualquier otro) y el trastorno tratado. Las composiciones 65 farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse para administración de dosificación individual (directa) o para dilución u otra modificación. Las concentraciones de los compuestos en las formulaciones
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son eficaces para suministro de una cantidad, tras la administración, que es eficaz para el tratamiento pretendido. Típicamente, las composiciones se formulan para administración de una única dosificación. Para formular una composición, la fracción en peso de un compuesto o mezcla del mismo se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo que la afección tratada se alivie o
5 mejore.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse para administración a un sujeto como una proteína de FVIIa bicatenaria. Los polipéptidos de FVII modificados pueden activarse por cualquier método conocido en la técnica antes de la formulación. Por ejemplo, FVII puede experimentar autoactivación durante la purificación por cromatografía de intercambio iónico (Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27: 373-384). Los polipéptidos de FVII modificados también pueden activarse por incubación con FXa inmovilizado en perlas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273: 8516-8521), o cualquier otro método conocido en la técnica (véase también Ejemplo 2 posterior). La inclusión de calcio en estos procedimientos asegura la activación completa y el plegamiento correcto de la proteína de FVIIa modificada. Los polipéptidos de FVII
15 modificados proporcionados en el presente documento también pueden formularse para administración como una proteína monocatenaria. Los polipéptidos de FVII monocatenarios pueden purificarse de tal modo que eviten la escisión (véase, por ejemplo, documento US6677440). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse de modo que las formas monocatenaria y bicatenaria estén contenidas en la composición farmacéutica, en cualquier relación por selección apropiada del medio para eliminar o controlar la autoactivación.
El compuesto puede suspenderse en forma micronizada u otra adecuada o puede derivatizarse para producir un producto activo más soluble. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo el modo pretendido de administración y la solubilidad del compuesto en el vehículo o transportador seleccionado. Las
25 mezclas resultantes son soluciones, suspensiones, emulsiones y otras mezclas tales, y pueden formularse como una mezcla no acuosa o acuosa, cremas, geles, pomadas, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes o cualquier otra formulación adecuada para administración sistémica, tópica o local. Para administración interna local, tal como, administración intramuscular, parenteral o intraarticular, los polipéptidos pueden formularse como una suspensión de solución en un medio de base acuosa, tal como solución salina tamponada de forma isotónica o se combinan con un soporte o bioadhesivo biocompatible que se pretende usar para administración interna. La concentración eficaz es suficiente para aliviar la afección diana y puede determinarse de forma empírica. Para formular una composición, la fracción en peso del compuesto se disuelve, suspende, dispersa o se mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo que la afección diana se alivia o mejora.
35 En general, se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables a la vista de las aprobaciones para una agencia reguladora u otras preparadas de acuerdo con farmacopea reconocida en general para su uso en animales y en seres humanos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir transportadores tales como diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con los que se administra una isoforma. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceites de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un vehículo típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como vehículo líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un principio activo: un diluyente tal como lactosa,
45 sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato cálcico y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidona, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes tales conocidos por los expertos en la materia. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, glicerol monoestearato, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH, por ejemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina, sorbitán monolaurato, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes tales. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación
55 sostenida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo de un compuesto terapéutico y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Una composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y otros agentes tales. Las preparaciones para administración oral también pueden formularse convenientemente con inhibidores de proteasa, tales como inhibidor de Bowman-Birk, un inhibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina y camostat. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente de forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la
65 forma para administración apropiada a un sujeto o paciente.
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La formulación debería ajustarse al modo de administración. Por ejemplo, el FVII modificado puede formularse para administración parenteral por inyección (por ejemplo, por inyección de embolada o infusión continua). Las composiciones inyectables pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril
5 en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,4-butanodiol. Se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles, como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluyendo, pero sin limitación, mono o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (incluyendo ácido oleico), aceites vegetales de origen natural como aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y otros aceites, o vehículos grasos sintéticos como etil oleato. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y los ingredientes adecuados, según se requiera, o, como alternativa, pueden comprender la formulación.
Los polipéptidos pueden formularse como el único principio farmacéuticamente activo en la composición o pueden combinarse con otros principios activos. Los polipéptidos pueden dirigirse para suministro, tales como por 15 conjugación con un agente de dirección, tal como un anticuerpo. Las suspensiones liposómicas, incluyendo liposomas dirigidos a tejido, también pueden ser adecuadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse formulaciones de liposomas como se describe en la Patente de Estados Unidos n.º 4.522.811. El suministro liposómico también puede incluir formulaciones de liberación lenta, incluyendo matrices farmacéuticas tales como geles de colágeno y liposomas modificados con fibronectina (véase, por ejemplo, Weiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5). Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden contener además uno o más adyuvantes que facilitan el suministro, tal como, pero sin limitación, vehículos inertes o sistemas de dispersión coloidal. Pueden seleccionarse ejemplos representativos y no limitantes de dichos vehículos inertes de agua, alcohol isopropílico, fluorocarburos gaseosos, alcohol etílico, polivinilpirrolidona, propilenglicol, un material
25 productor de gel, alcohol estearílico, ácido esteárico, espermaceti, sorbitán monooleato, metilcelulosa, así como combinaciones adecuadas de dos o más de los mismos. El compuesto activo se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el sujeto tratado. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse de forma empírica ensayando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tales como los ensayos proporcionados en el presente documento.
a. Dosificaciones
La cantidad o dosis precisa del agente terapéutico administrado depende del polipéptido de FVII particular, la vía de
35 administración y otras consideraciones, tales como la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del sujeto. La administración local del agente terapéutico requerirá típicamente una dosificación menor que cualquier modo de administración sistémica, aunque la concentración local del agente terapéutico puede, en algunos casos, ser mayor después de la administración local que puede conseguirse con seguridad tras la administración sistémica. Si es necesario, una dosificación y duración particulares y protocolo de tratamiento pueden determinarse de forma empírica o extrapolarse. Por ejemplo, pueden usarse dosis ejemplares de polipéptidos de FVII recombinantes y nativos como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rFVIIa, Novoseven®, se ha administrado a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, que experimentan un episodio de sangrado, a una dosificación de 90 g/kg por infusión de embolada durante 2 a 5 minutos, consiguiendo un nivel en circulación efectivo de al menos 2 g/ml. La dosis se repite cada 2
45 horas hasta que se consigue la hemostasia. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden administrarse a una dosificación de 80 g/kg, 70 g/kg, 60 g/kg, 50 g/kg, 40 g/kg, 30 g/kg, 20 g/kg, 15 g/kg o menos. En algunos ejemplos, las dosificaciones pueden ser mayores, tales como 100 g/kg, 110 g/kg, 120 g/kg, o mayores. La duración del tratamiento y el intervalo entre inyecciones variarán con la gravedad del sangrado y la respuesta del paciente al tratamiento, y pueden ajustarse en consecuencia. Pueden tenerse en cuenta factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado cuando se realizan determinaciones de dosificación. Las dosificaciones y los regímenes particulares pueden determinarse de forma empírica.
55 En otro ejemplo, un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rFVIIa, Novoseven®, se ha administrado a pacientes con deficiencia de FVII congénita que experimentan un episodio de sangrado, a una dosificación de 15-30 g/kg por infusión de embolada durante 2 a 5 minutos. La dosis se repite cada 4-6 horas hasta que se consiga hemostasia. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden administrarse a una dosificación de 20 g/kg, 15 g/kg, 10 g/kg, 5 g/kg, 3 g/kg o menos. En algunos ejemplos, las dosificaciones pueden ser mayores, tales como 35 g/kg, 40  g/kg, 45 g/kg, o mayores. La duración del tratamiento y el intervalo entre inyecciones variarán con la gravedad del sangrado y la respuesta del paciente al tratamiento, y pueden
65 ajustarse en consecuencia. Pueden usarse factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado en la realización de determinaciones de dosificación. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado que muestra una semivida más larga que un polipéptido de FVII no modificado puede administrarse a dosis menores y/o menos frecuentemente que el polipéptido de FVII no modificado. De forma similar, las dosificaciones requeridas para efecto terapéutico usando un polipéptido de FVII modificado que presenta
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5 actividad coagulante aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden reducirse en frecuencia y cantidad. Un experto en la materia puede determinar de forma empírica dosificaciones y regímenes particulares.
b. Formas de dosificación
Los compuestos farmacéuticos terapéuticamente activos y derivados de los mismos típicamente se formulan y administran en formas de dosificación unitarias o formas de dosificación múltiples. Las formulaciones pueden proporcionarse para administración a seres humanos y animales en formas de dosificación que incluyen, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, 15 soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite en agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo, trasportador o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o cápsulas envasados individualmente. En algunos ejemplos, la dosis unitaria se proporciona como un polvo liofilizado que se reconstituye antes de su administración. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede proporcionarse como polvo liofilizado que se reconstituye con una solución adecuada para generar una solución de una única dosis para inyección. En algunos ejemplos, el polvo liofilizado puede contener el polipéptido de FVII y componentes adicionales, tales como sales, de modo que la reconstitución con agua destilada estéril dé como resultado un polipéptido de FVII en una solución tamponada o salina. Las formas de
25 dosis unitarias pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente para administrar en forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o frascos de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es una multitud de dosis unitarias que no se segregan en el envasado.
2. Administración de polipéptidos de FVII modificados
Los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento (es decir compuestos activos) pueden administrarse in vitro, ex vivo o in vivo poniendo en contacto una mezcla, tal como un fluido corporal u otra muestra 35 tisular, con un polipéptido de FVII. Por ejemplo, cuando se administra un compuesto ex vivo, una muestra de fluido o tejido corporal de un sujeto puede ponerse en contacto con los polipéptidos de FVII que recubren un tubo o un filtro, tal como, por ejemplo, un tubo o filtro en una máquina de derivación. Cuando se administran in vivo, los compuestos activos pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, por vía nasal, por vía pulmonar, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intraarticular, por vía intracisternal, por vía intraocular, por vía intraventricular, por vía intratecal, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intratraqueal o por vía tópica, así como por cualquier combinación de dos o más cualesquiera de las mismas, en forma líquida, semilíquida o sólida y se formulan de una manera adecuada para cada vía de administración. Los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse una vez o más de una vez, tal como dos veces, tres veces, cuatro veces o cualquier número de veces que se requieran para conseguir un efecto terapéutico.
45 Pueden efectuarse múltiples administraciones mediante cualquier vía o combinación de vías, y pueden administrarse cada hora, cada 2 horas, cada tres horas, cada cuatro horas o más.
La vía de administración más adecuada variará dependiendo de la patología para tratar, por ejemplo la localización del trastorno de sangrado. En general, los polipéptidos de FVII se administrarán por inyección de embolada intravenosa, con un tiempo de administración (infusión) de aproximadamente 2-5 minutos. En otros ejemplos, los niveles en sangre deseables de FVII pueden mantenerse por una infusión continua del agente activo como se determina por los niveles en plasma. Debería observarse que el médico a cargo sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia a menor dosificación debido a toxicidad, o disfunciones de médula ósea, hígado o riñón. Por el contrario, el médico a cargo también sabrá cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles mayores si la
55 respuesta clínica no es adecuada (evitando efectos secundarios tóxicos). En otros ejemplos, la localización del trastorno de sangrado podría indicar que la formulación FVII se administra mediante vías alternativas. Por ejemplo, la administración local, incluyendo administración al cerebro (por ejemplo, por vía intraventricular) podría realizarse cuando el paciente experimente sangrado en esta región. De forma similar, para el tratamiento de sangrado en las articulaciones, podría emplearse administración local por inyección del agente terapéutico en la articulación (es decir, por vía intraarticular, medio intravenoso o subcutáneo). En otros ejemplos, la administración tópica del agente terapéutico a la piel, por ejemplo formulado como una crema, gel o pomada o administración a los pulmones por inhalación o por vía intratraqueal, podría ser apropiada cuando el sangrado esté localizado en estas áreas.
En los casos donde los polipéptidos de FVII modificados se formulen como una preparación de liberación
65 prolongada, las formulaciones de acción larga pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos terapéuticos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
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5 Las composiciones, si se desea, pueden presentarse en un envase, en un kit o dispositivo dosificador, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El envase, por ejemplo, contiene papel metálico o plástico, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dosificador puede acompañarse de instrucciones para la administración. Las composiciones que contienen los agentes activos pueden envasarse como artículos de fabricación que contienen material de envasado, un agente proporcionado en el presente documento, y una etiqueta que indica el trastorno para el que se proporciona el agente.
3. Administración de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de FVII modificados (terapia génica)
También se proporcionan composiciones de moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de FVII
15 modificados y vectores de expresión que los codifican que son adecuados para terapia génica. En lugar de suministrar la proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo, tal como por vía sistémica o por otra vía, o ex vivo, tal como por retirada de células, incluyendo linfocitos, introducción del ácido nucleico en el mismo, y reintroducción en el hospedador o un receptor compatible.
Pueden suministrarse polipéptidos de FVII modificados a células y tejidos por expresión de moléculas de ácido nucleico. Pueden administrarse polipéptidos de FVII modificados como moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de FVII modificados, incluyendo técnicas ex vivo y expresión in vivo directa. Pueden suministrarse ácidos nucleicos a células y tejidos por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Las secuencias de ácido nucleico aisladas pueden incorporarse en vectores para manipulación adicional. Como se usa en el presente
25 documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ADN heterólogo en células para expresión o replicación del mismo. La selección y el uso de dichos vehículos están dentro de la experiencia de la técnica.
Los métodos para administrar polipéptidos de FVII modificados por expresión de moléculas de ácido nucleico codificantes incluyen administración de vectores recombinantes. El vector puede diseñarse para permanecer episómico, tal como mediante la inclusión de un origen de replicación o puede diseñarse para integrarse en un cromosoma en la célula. También pueden usarse polipéptidos de FVII modificados en terapia de expresión génica ex vivo usando vectores no virales. Por ejemplo, pueden modificarse técnicamente células para expresar un polipéptido de FVII modificado, tal como integrando un ácido nucleico que codifica polipéptido de FVII modificado en una
35 localización genómica, bien unido operativamente con secuencias reguladoras o de modo que se coloque unido operativamente con secuencias reguladoras en una localización genómica. Dichas células pueden administrarse después por vía local o sistémica a un sujeto, tal como un paciente que necesite tratamiento.
Los vectores virales incluyen, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), poxvirus, virus del herpes, retrovirus y otros diseñados para terapia génica. Los vectores pueden permanecer episómicos o pueden integrarse en cromosomas del sujeto tratado. Un polipéptido de FVII modificado puede expresarse por un virus, que se administra a un sujeto que necesite tratamiento. Los vectores virales adecuados para terapia génica incluyen adenovirus, virus adenoasociado (AAV), retrovirus, lentivirus, virus vaccinia y otros indicados anteriormente. Por ejemplo, la tecnología de expresión de adenovirus se conoce bien en la técnica y también se conocen bien métodos 45 de producción y administración de adenovirus. Están disponibles serotipos de adenovirus, por ejemplo, de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). Los adenovirus pueden usarse ex vivo, por ejemplo, se aíslan células de un paciente que necesite tratamiento, y se transducen con un vector de adenovirus que expresa el polipéptido de FVII modificado. Después de un periodo de cultivo adecuado, las células transducidas se administran a un sujeto, por vía local y/o por vía sistémica. Como alternativa, se aíslan partículas de adenovirus que expresan polipéptidos de FVII modificados y se formulan en un vehículo farmacéuticamente aceptable para suministro de una cantidad terapéuticamente eficaz para prevenir, tratar o aliviar una enfermedad o afección de un sujeto. Típicamente, se suministran partículas de adenovirus a una dosis que varía de 1 partícula a 1014 partículas por kilogramo de peso del sujeto, generalmente entre 106 o 108 partículas y 1012 partículas por kilogramo de peso del sujeto. En algunas situaciones, es deseable proporcionar una fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a
55 células, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o una célula diana, o un ligando para un receptor de una célula diana. FVII también puede dirigirse para suministro en tipos celulares específicos. Por ejemplo, pueden usarse vectores adenovirales que codifican polipéptidos de FVII para expresión estable en células no en división, tales como células del hígado (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113: 10251031). En otro ejemplo, pueden transducirse vectores virales o no virales que codifican polipéptidos de FVII en células aisladas para suministro posterior. Los tipos celulares adicionales para expresión y suministro de FVII podrían incluir, pero sin limitación, fibroblastos y células endoteliales.
Las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en cromosomas artificiales y otros vectores no virales. Pueden modificarse técnicamente cromosomas artificiales, tales como ACES (véase, Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids 65 Res. 32(21): e172) para codificar y expresar la isoforma. Brevemente, los cromosomas artificiales de mamífero (MAC) proporcionan un medio para introducir grandes cargas útiles de información genética en la célula en un
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formato de replicación autónoma, no integrado. De forma única entre los MAC, la Expresión de Cromosoma Artificial (ACE) basado en ADN de satélite de mamífero puede generarse de forma reproducible de novo en líneas celulares de especies diferentes y purificarse fácilmente a partir de los cromosomas de las células hospedadoras. Las ACE de mamífero purificadas pueden después reintroducirse en una diversidad de líneas celulares receptoras donde se han
5 mantenido de forma estable durante periodos prolongados en ausencia de presión selectiva usando un Sistema de ACE. Usando este enfoque, se ha conseguido la carga específica de una o dos dianas génicas en células LMTK(-) y CHO.
Otro método para introducir ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de FVII modificados es una técnica de reemplazo génico de dos etapas en levadura, comenzando con un genoma de adenovirus completo (Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190) clonado en un Cromosoma Artificial de Levadura (YAC) y un plásmido que contiene secuencias de adenovirus para dirigirse a una región específica en el clon de YAC, un casete de expresión para el gen de interés y un marcador seleccionable positivo y negativo. Los YAC son de particular interés porque permiten la incorporación de genes mayores. Este enfoque puede usarse para la construcción de vectores basados en
15 adenovirus que portan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos para transferencia génica a células de mamífero o animales completos.
Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en un vehículo, tal como un liposoma, o introducirse en una célula, tal como una célula bacteriana, particularmente una bacteria atenuada o introducirse en un vector viral. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteínas que se unen con una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis para dirección y/o para facilitar la captación, por ejemplo proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en ciclación, y proteínas que se dirigen a localización intracelular y potencian la semivida intracelular.
25 Para métodos ex vivo e in vivo, se introducen moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de FVII modificado en células que son de un donante adecuado o el sujeto para tratar. Las células en las que un ácido nucleico puede introducirse para fines de terapia incluyen, por ejemplo, cualquier tipo celular disponible, deseado, apropiado para la enfermedad o afección para tratar, incluyendo pero sin limitación células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre
o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tales como células madre obtenidas de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y otras fuentes de las mismas.
35 Para tratamiento ex vivo, se retiran células de un donante compatible con el sujeto para tratar o células del sujeto para tratar, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y se administran las células modificadas al sujeto. El tratamiento incluye administración directa, tal como, por ejemplo, encapsulado dentro de membranas porosas, que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 4.892.538 y 5.283.187). Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas y lípidos catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano y métodos de precipitación con fosfato cálcico. Pueden usarse métodos de suministro de ADN para expresar polipéptidos de FVII modificados in vivo. Dichos métodos incluyen suministro de liposomas de ácidos nucleicos y suministro de ADN desnudo, incluyendo un suministro local y sistémico tal como usando electroporación, ultrasonidos y suministro con fosfato cálcico. Otras técnicas incluyen microinyección, fusión celular,
45 transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas y fusión de esferoplastos.
La expresión in vivo de un polipéptido de FVII modificado puede ligarse a la expresión de moléculas adicionales. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido de FVII modificado puede ligarse a la expresión de un producto citotóxico tal como en un virus modificado técnicamente o expresado en un virus citotóxico. Dichos virus pueden dirigirse a un tipo celular particular que es una diana para un efecto terapéutico. El polipéptido de FVII modificado expresado puede usarse para potenciar la citotoxicidad del virus.
La expresión in vivo de un polipéptido de FVII modificado puede incluir unir operativamente un polipéptido de FVII
55 modificado que codifica una molécula de ácido nucleico a secuencias reguladoras específicas tales como un promotor específico de célula o específico de tejido. Los polipéptidos de FVII modificados también pueden expresarse a partir de vectores que infectan específicamente y/o se replican en tipos celulares y/o tejidos diana. Los promotores inducibles pueden usarse para regular selectivamente la expresión de polipéptidos de FVII modificados. Un sistema de expresión regulable ejemplar es el sistema de expresión de gen inducible por doxiciclina, que se ha usado para regular la expresión de FVII recombinante (Srour et al. (2003) Thromb Haemost. 90(3): 398-405).
Pueden administrarse al sujeto moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos desnudos o en vectores, cromosomas artificiales, liposomas y otros vehículos por administración sistémica, tópica, local y otras vías de administración. Cuando sea sistémica e in vivo, la molécula de ácido nucleico o vehículo que contiene la molécula
65 de ácido nucleico puede dirigirse a una célula.
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La administración también puede ser directa, tal como mediante administración de un vector o células que se dirigen típicamente a una célula o tejido. Por ejemplo, las células tumorales y en proliferación pueden ser células diana para expresión in vivo de polipéptidos de FVII modificados. Las células usadas para expresión in vivo de un polipéptido de FVII modificado también incluyen células autólogas del paciente. Dichas células pueden retirarse de un paciente,
5 introducirse ácidos nucleicos para expresión de un polipéptido de FVII modificado, y después administrarse a un paciente tal como mediante inyección o injerto.
H. Usos terapéuticos
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de cualquier afección para la que se emplee FVII recombinante. Típicamente, dichos tratamientos incluyen en los que se desee coagulación aumentada, tal como respuestas hemostáticas aumentadas. Los polipéptidos de FVII modificados tienen actividad terapéutica solos o en combinación con otros agentes. Los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento se diseñan para conservar la actividad terapéutica pero muestran
15 propiedades modificadas, particularmente resistencia aumentada a AT-III y actividad catalítica aumentada. Los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento también pueden mostrar resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Dichas propiedades modificadas, por ejemplo, pueden mejorar la eficacia terapéutica de los polipéptidos debido a actividad coagulante aumentada de los polipéptidos de FVII modificados. Esta sección proporciona usos ejemplares y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplares y no limitan las aplicaciones de polipéptidos de FVII modificados.
25 Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en diversos métodos terapéuticos así como de diagnóstico en los que se emplea FVII. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y enumeradas posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar mejora de las actividades in vivo y efectos terapéuticos en comparación con FVII de tipo silvestre, incluyendo dosificación menor para conseguir el mismo efecto, y otras mejoras en la administración y el tratamiento tales como menos administraciones y/o administraciones menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados. Aunque se entiende que los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse como un zimógeno de FVII (es decir forma monocatenaria), típicamente los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se administran en forma bicatenaria activada después de, por ejemplo, autoactivación o
35 activación por otros factores de coagulación, tales como durante la purificación.
En particular, se pretende que los polipéptidos de FVII modificados se usen en métodos terapéuticos en los que FVII se ha usado para el tratamiento. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos, tales como, pero sin limitación, trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, tales como hemofilia A, hemofilia B y deficiencia del factor VII, y trastornos sanguíneos adquiridos, tales como deficiencia del factor VII adquirida provocada por enfermedad hepática. También pueden usarse polipéptidos de FVII modificados en el tratamiento de enfermedades y trastornos de sangrado adicionales, tales como, pero sin limitación, trombocitopenia (por ejemplo, tal como debido a regímenes quimioterapéuticos), enfermedad de Von Willebrand, trastornos plaquetarios hereditarios (por ejemplo, enfermedad
45 de piscina de almacenamiento tal como síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción de tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico-urémico, Telangectasia Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.
En algunos ejemplos, los sangrados para tratar por polipéptidos de FVII aparecen en órganos tales como el cerebro, región interna del oído, ojos, hígado, pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal. En otros ejemplos, el sangrado es difuso, tal como en gastritis hemorrágica y sangrado uterino profuso. Los pacientes con trastornos de sangrado, tales como por ejemplo, hemofilia A y B, con frecuencia tienen riesgo de complicaciones de sangrado durante la cirugía o el traumatismo. Dicho sangrado puede manifestarse como hemartrosis aguda (sangrado en las 55 articulaciones), artropatía hemofílica crónica, hematomas (por ejemplo, muscular, retroperitoneal, sublingual y retrofaríngeo), hematuria (sangrado del tracto renal), sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales (por ejemplo, sangrados de UGI) y hemorragia cerebral, que también puede tratarse con polipéptidos de FVII modificados. Adicionalmente, puede tratarse cualquier sangrado asociado con la cirugía (por ejemplo, hepatectomía), o extracción dental con polipéptidos de FVII modificados. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para tratar episodios de sangrado debido a traumatismo o cirugía, o recuento o actividad reducidos de plaquetas, en un sujeto. Los métodos ejemplares para pacientes que se someten a cirugía incluyen tratamientos para evitar la hemorragia y tratamientos antes, durante o después de las cirugías tales como, pero sin limitación, cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos, incluyendo trasplante de médula ósea,
65 corazón, pulmón, páncreas o hígado.
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El tratamiento de enfermedades y afecciones con polipéptidos de FVII modificados puede efectuarse por cualquier vía adecuada de administración usando formulaciones adecuadas como se describen en el presente documento incluyendo, pero sin limitación, inyección, administración pulmonar, oral y transdérmica. El tratamiento se efectúa típicamente por administración de embolada intravenosa.
5 Si es necesario, una dosificación y duración y protocolo de tratamiento particulares pueden determinarse de forma empírica o extrapolarse. Por ejemplo, pueden usarse dosis ejemplares de polipéptidos de FVII recombinantes y nativos como un punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rfVIIa, Novoseven®, se ha administrado a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, que experimentan un episodio de sangrado, a una dosificación de 90 g/kg por infusión de embolada durante 2 a 5 minutos, consiguiendo un nivel en circulación eficaz de al menos 2 g/ml con una semivida media de 2,7 horas. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se consigue la hemostasia. Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una actividad coagulante aumentada, debido a, por ejemplo, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia aumentada a
15 IRFT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero, y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3, pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Las dosificaciones para polipéptidos de FVII de tipo silvestre o no modificados pueden usarse como orientación para determinar las dosificaciones para polipéptidos de FVII modificados. Pueden usarse factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado para tomar dicha determinación. Las dosificaciones y los regímenes particulares pueden determinarse de forma empírica.
Los niveles y regímenes de dosificación pueden determinarse basándose en dosificaciones y regímenes conocidos
25 y, si es necesario, pueden extrapolarse basándose en los cambios en las propiedades de los polipéptidos modificados y/o pueden determinarse de forma empírica basándose en una diversidad de factores. Dichos factores incluyen el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el momento de administración, la tasa de secreción, la combinación farmacológica, la gravedad y la evolución de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el criterio del médico tratante. El principio activo, el polipéptido, típicamente se combina con un vehículo farmacéuticamente eficaz. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una única forma de dosificación
o forma de dosificación múltiple puede variar dependiendo del hospedador tratado y el modo de administración particular.
35 El efecto de los polipéptidos de FVII en el tiempo de coagulación de la sangre puede controlarse usando cualquiera de los ensayos de coagulación conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, tiempo de protrombina de sangre completa (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), el tiempo de coagulación activada (ACT), el tiempo de coagulación activada recalcificada o el tiempo de Coagulación de Lee-White.
Tras la mejora de la condición de un paciente, puede administrarse una dosis de mantenimiento de un compuesto o composiciones, si es necesario; y la dosificación, la forma de dosificación, o la frecuencia de administración, o una combinación de las mismas puede modificarse. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente a largo plazo tras cualquier reaparición de síntomas de la enfermedad o basándose en dosificaciones programadas. En otros casos, pueden requerirse administraciones adicionales en respuesta a acontecimientos agudos tales como
45 hemorragia, traumatismo o procedimientos quirúrgicos.
Las siguientes son algunas condiciones ejemplares para las que se ha usado FVII (administrado como FVIIa) como un agente de tratamiento solo o en combinación con otros agentes.
1. Trastornos de sangrado congénitos
a. Hemofilia
La hemofilia congénita es un trastorno de la sangre recesivo en el que hay niveles reducidos de factores de
55 coagulación en plasma, lo que conduce a la alteración de la cascada de coagulación y aumento del tiempo de coagulación sanguíneo. La hemofilia A, que representa aproximadamente el 85 % de todos los casos de hemofilia, resulta de una mutación o mutaciones en el gen del factor FVIII en el cromosoma X, lo que conduce a una deficiencia o disfunción de la proteína FVIII. La hemofilia B está causada por una deficiencia o disfunción del factor de coagulación, FIX, generalmente resultante de mutaciones o deleciones puntuales en el gen de FIX en el cromosoma X. La incidencia global de la hemofilia A es de aproximadamente 1 caso por cada 5000 individuos masculinos, y 1 caso por cada 25000 hombres para hemofilia B. La hemofilia A y B se clasifica adicionalmente como leve, moderada o grave. Un nivel en plasma con 5 %-25 % de factor VIII o IX con funcionamiento normal se clasifica como leve, 1 %-5 % es moderada y menos de 1 % es grave. La hemofilia C, con frecuencia denominada deficiencia de FIX, es una enfermedad relativamente leve y poco habitual, que afecta a aproximadamente 1 de cada 100000
65 personas de una manera recesiva autosómica.
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La hemofilia A y B se manifiesta clínicamente de muchas maneras. Cortes menores y abrasiones no darán como resultado sangrado excesivo, pero los traumatismos y las cirugías sí. El paciente también tendrá numerosos sangrados de articulaciones y músculos y se magullará fácilmente. La hemartrosis o sangrado de las articulaciones es una de las complicaciones principales en la hemofilia, y puede aparecer espontáneamente o en respuesta a 5 traumatismo. Las articulaciones de bisagra, tales como la rodilla, el codo y el tobillo, se ven afectadas más frecuentemente. La cadera y el hombro se ven afectados mucho menos frecuentemente ya que la articulación de rótula tiene más musculatura alrededor, protegiéndola de este modo de la lesión. El sangrado puede provocar dolor agudo grave, movimiento restringido, y conducir a complicaciones secundarias incluyendo hipertrofia sinovial. Además, el sangrado recurrente de las articulaciones puede provocar sinovitis crónica, lo que puede provocar daño de las articulaciones, destruir el sinovio, el cartílago y el hueso. Las hemorragias con peligro para la vida, tales como una hemorragia intracraneal y sangrado en el sistema nervioso central, también afectan a sujetos hemofílicos. El sangrado intracraneal se produce en aproximadamente el 10 % de los pacientes con hemofilia grave, dando como resultado una tasa de mortalidad del 30 %. Por el contrario, la Hemofilia C es más leve. Apenas se ven sangrados espontáneos, y el sangrado en las articulaciones, tejidos blandos y músculos también es poco común. El sangrado
15 se trata en general con transfusión de plasma congelado nuevo (FFP), terapia de reemplazo de FXI o, para tratamiento tópico, dicho tratamiento de heridas externas o extracciones dentales, pegamento de fibrina.
El tratamiento más común para la hemofilia A o B es terapia de reemplazo, en la que se administra al paciente FVIII
o FIX. Las formulaciones están disponibles en el mercado como productos derivados de plasma o recombinantes, siendo ahora las proteínas recombinantes el tratamiento elegido en pacientes sin tratamiento previo. Aunque estas terapias pueden ser muy exitosas, surgen complicaciones si el paciente desarrolla inhibidores para el factor VIII o factor IX recién administrado. Son inhibidores anticuerpos IgG, principalmente de la subclase IgG4, que reaccionan con FVIII o FIX e interfieren con la función procoagulante. Los inhibidores afectan a aproximadamente 1 de cada 5 pacientes con hemofilia A grave. La mayoría de los sujetos desarrollan estos inhibidores poco después de la
25 administración de las primeras infusiones de factor VIII, que es con frecuencia en la infancia temprana, aunque algunos sujetos los desarrollan más tarde. Los inhibidores también afectan a aproximadamente 1 de cada 15 personas con hemofilia A leve o moderada. Estos inhibidores se desarrollan habitualmente durante la adultez y no solamente destruyen FVIII exógeno administrado, sino que también destruyen FVIII endógeno. Como resultado, los hemofílicos leves y moderados se vuelven graves. Clínicamente, los pacientes con hemofilia A con inhibidores se clasifican en respuesta alta y baja de acuerdo con la fuerza de la respuesta anamnésica que experimentan cuando se vuelven a exponer a FVIII. Los inhibidores afectan a 1 de cada 100 pacientes con hemofilia B. En la mayoría de los casos, los inhibidores se desarrollan después de las primeras infusiones de factor IX terapéutico y pueden acompañarse de reacciones alérgicas.
35 Los polipéptidos de FVII modificados presentados en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes con hemofilia, particularmente pacientes con hemofilia con inhibidores. Se ha aprobado y licenciado un producto de FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) para tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX y para la prevención del sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX. El tratamiento con rFVIIa potencia la generación de trombina evitando al mismo tiempo el requisito de FVIIIa y/o FIXa. La coagulación se inicia en el sitio de lesión por la interacción de rFVIIa con FT, dando como resultado activación de FX inicial, generación de trombina y activación de plaquetas. Puede efectuarse coagulación completa por rFVIIa por los mecanismos dependientes de FT e independiente de FT, donde algo de la trombina generada puede resultar de la activación directa de FX en plaquetas activadas por rFVIIa solamente, que se une en sí mismo con plaquetas
45 activadas mediante interacciones de baja afinidad con las membranas fosfolipídicas.
Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en terapias para hemofilia, incluyendo el tratamiento de episodios de sangrado y la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos. Los polipéptidos de FVII modificados en el presente documento pueden proporcionar resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia aumentada a IRFT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero, unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas, unión y/o afinidad aumentada con albúmina de suero y/o unión y/o afinidad aumentada con integrina de plaquetas IIb3. Los polipéptidos de FVII pueden presentar por lo tanto mayor actividad coagulante de una manera dependiente de FT (tal como mediante resistencia
55 aumentada a IRFT) y/o de una manera independiente de FT (tal como mediante unión y/o afinidad aumentada con plaquetas activadas). Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para suministrar más terapias activas para hemofilia. Los ejemplos de mejoras terapéuticas usando polipéptidos de FVII modificados incluyen por ejemplo, pero sin limitación, dosificaciones menores, menos administraciones y/o administraciones menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados.
Los polipéptidos de FVII modificados típicamente se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa). Los polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a eficacia terapéutica, por ejemplo, usando modelos animales. Por ejemplo pueden tratarse ratones hemofílicos inducidos por anticuerpo, o cualquier otro modelo de enfermedad conocido para hemofilia, con polipéptidos de FVII modificados. La progresión de los 65 síntomas y fenotipos de enfermedad se controla para evaluar los efectos de los polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII modificados también pueden administrarse a sujetos tales como en ensayos clínicos para
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evaluar las eficacias in vivo en comparación con controles de placebo y/o controles usando FVII no modificado.
b. Deficiencia de FVII
5 La deficiencia del factor VII es un trastorno de sangrado recesivo autosómico que afecta a aproximadamente 1 de cada 500000 personas. La deficiencia de FVII puede ser clínicamente leve, moderada o grave, caracterizándose la deficiencia leve a moderada por sangrado aumentado después de cirugía y traumatismo. Los pacientes con deficiencia de FVII grave (menos del 1 % de la actividad de FVII) experimentan síntomas similares a la hemofilia. Por ejemplo, los sujetos deficientes en FVII son propensos a sangrado de las articulaciones, sangrados nasales espontáneos, sangrado gastrointestinal, sangrado del tracto urinario. También se han presentado hemorragia intracerebral y sangrados musculares, mientras que las mujeres pueden experimentar menorragia grave (sangrado menstrual profuso). El tratamiento puede efectuarse por terapia de reemplazo. Un producto de FVIIa recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) se ha aprobado y licenciado para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con deficiencia de FVII congénita y para la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o
15 procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia de FVII congénita. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados en el presente documento pueden usarse de forma similar. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de episodios de sangrado y la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes deficientes en FVII. Por ejemplo, a un paciente neonatal que presente deficiencia de FVII grave con hemorragia intracraneal puede administrársele polipéptidos de FVII modificados por embolada intravenosa para efectuar coagulación y mantener la hemostasia. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
c. Otros
25 Otros trastornos de sangrado pueden tratarse con los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento para promover la coagulación. Las deficiencias congénitas de factores V y X también están presentes con tiempos de coagulación de sangre aumentados y pueden potencialmente tratarse con la administración de dosis terapéuticas de FVII. Por ejemplo, puede administrarse a un paciente con deficiencia de factor X rFVIIa para controlar el sangrado asociado con esplenectomía (Boggio et al. (2001) Br J Haematol 112: 1074-1075). Los episodios de sangrado espontáneos y asociados a cirugía asociados con enfermedad de von Willebrand (vWD) también pueden tratarse usando los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. VWD es un trastorno de sangrado provocado por un defecto o una deficiencia de la proteína de coagulación de la sangre, factor de von Willebrand (vWF), y se estima que se produce en del 1 % al 2 % de la población. Los sujetos con vWD sufren
35 magulladuras fácilmente, tienen sangrados nasales recurrentes, sangran después de extracción de dientes, tonsilectomía u otra cirugía, y las pacientes pueden tener sangrado menstrual aumentado. Pueden usarse polipéptidos de FVII modificados para aliviar el sangrado espontáneo y asociado a cirugía en pacientes con vWD (von Depka et al. (2006) Blood Coagul Fibrin 17: 311-316). Otros trastornos de sangrado relacionado con plaquetas, tales como por ejemplo, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Hermansky-Pudlak también se asocian con actividad de coagulación endógena reducida. El sangrado espontáneo o asociado a cirugía en exceso en pacientes con trastornos de sangrado relacionado con plaquetas también pueden controlarse por dosis terapéuticas de los polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, un paciente con trombastenia de Glanzmann que se somete a cirugía puede tratarse antes, durante y/o después de la cirugía con los polipéptidos de FVII modificados para prevenir pérdida de sangre importante (van Buuren et al. (2002) Dig Dis Sci 47: 2134-2136). En general, los polipéptidos de
45 FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
2. Trastornos de sangrado adquiridos
a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia
Los trastornos de sangrado pueden ser adquiridos, en lugar de congénitos. Por ejemplo, el tratamiento con quimioterapia, tal como para leucemia y otros cánceres, puede dar como resultado trombocitopenia. Esto se debe probablemente a una pérdida de producción de plaquetas en la médula ósea de pacientes que reciben quimioterapia, y típicamente sucede 6-10 días después de la medicación. El tratamiento de la trombocitopenia
55 adquirida es habitualmente por transfusión de plaquetas, glóbulos rojos o plasma, que sirve para evitar cualquier sangrado espontáneo anómalo que pueda resultar de deficiencia de plaquetas. El sangrado en pacientes con trombocitopenia inducida por quimioterapia, o cualquier otra trombocitopenia adquirida o congénita, también puede controlarse por la administración de cantidades terapéuticas de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede administrarse a un paciente trombocitopénico con sangrado incontrolado, tal como el del tracto gastrointestinal, una inyección de embolada intravenosa de una cantidad terapéutica de polipéptido de FVII para detener la hemorragia (Gerotziafas et al. (2002) Am J Hematol 69: 219-222). En general, los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
b. Otras coagulopatías
65 Otras coagulopatías adquiridas pueden tratarse usando los polipéptidos de FVII modificados presentados en el
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presente documento. La coagulopatía puede resultar de afecciones incluyendo, pero sin limitación, insuficiencia hepática fulminante (FHF; tal como provocada por fármacos hepatotóxicos, toxinas, enfermedades metabólicas, enfermedades infecciosas e isquemia), otra enfermedad hepática, incluyendo cirrosis y enfermedad asociada con enfermedad de Wilson, deficiencia de vitamina K (tal como provocada por tratamiento con antibióticos o dieta), 5 síndrome urémico hemolítico, trombocitopenia trombótica (TTC) y coagulopatía intravascular diseminada (DIC). El tratamiento convencional es generalmente por transfusión con plasma, glóbulos rojos (RBC), o plaquetas, pero puede no tener éxito. En un ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse a un paciente con FHF que se somete a procedimientos invasivos para evitar el sangrado. El tratamiento convencional con plasma congelado nuevo (FFP) con frecuencia no tiene éxito y puede requerir grandes cantidades de plasma, lo que produce una sobrecarga de volumen y anasarca (una infiltración generalizada de fluido de edema en tejido conectivo subcutáneo). El tratamiento con cantidades terapéuticas de polipéptidos de FVII modificados por embolada intravenosa durante, antes y/o después de la cirugía invasiva, tal como por ejemplo, biopsia de hígado o trasplante de hígado, puede evitar el sangrado y establecer hemostasia en pacientes con FHF. El paciente puede controlarse por PT de la sangre para determinar la eficacia del tratamiento (Shami et al. (2003) Liver Transpl 9: 138-143). En 15 otro ejemplo, puede administrarse FVII a un paciente con sangrado grave asociado con coagulopatía, tal como por ejemplo, sangrado intraabdominal postcesárea grave asociado con disfunción del hígado y DIC, que no respondió a infusiones de transfusiones convencionales (Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113: 174-176). Además, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para tratar coagulopatía en pacientes neonatales y pediátricos. En un ejemplo particular, los pacientes neonatales y pediátricos no responden al tratamiento convencional, tal como infusión de RBC y plaquetas. Por ejemplo, a neonatos con hemorragia pulmonar grave asociada con PT aumentados que no respondieron a transfusión de RBC y plaquetas se les puede administrar polipéptidos de FVII modificados para reducir PT y establecer la hemostasia (Olomu et al. (2002) J Perinatol 22: 672-674). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y pueden por lo tanto administrarse, por
25 ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente y con menos reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
c. Sangrado adquirido por trasplante
El sangrado grave después del trasplante de médula ósea (BMT) y trasplante de células madre (SCT) es una complicación relativamente común y con peligro para la vida asociada con estos procedimientos, debido a la reducción de plaquetas. Por ejemplo, la hemorragia alveolar difusa (DAH) es una complicación pulmonar de BMT con una incidencia estimada del 1-21 % en la población con trasplante, y una tasa de mortalidad del 60-100 %. El tratamiento convencional de dichos episodios de sangrado incluye tratamiento con corticosteroides y transfusión con
35 plasma, plaquetas y/o RBC, aunque estos en gran medida no tienen éxito con una tasa de mortalidad global de aproximadamente el 50 % (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). La administración de FVII por embolada intravenosa, con o sin tratamiento simultáneo con corticosteroides y/o infusión de plaquetas, puede realizarse para tratar la DAH y establecer hemostasia (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían administrarse, por lo tanto, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, durante una duración del tratamiento más corta, y con menos reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológica. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
45 d. Sangrado inducido por terapia anticoagulante
Los pacientes que se someten a terapias anticoagulantes para tratamiento de afecciones, tales como tromboembolia, pueden mostrar episodios de sangrado tras la administración aguda de anticoagulantes, tales como warfarina, heparina y fondaparinux, o desarrollar trastornos hemorrágicos como resultado del uso a largo plazo de dichas terapias. Los tratamientos para episodios de sangrado típicamente incluyen administración de procoagulantes, tales como vitamina K, plasma, FIX exógeno y protaminas para neutralizar heparina. También puede realizarse administración de FVII exógeno para neutralizar el efecto de los anticoagulantes, aumentar el PT, aPTT y/u otros marcadores de la coagulación y establecer la hemostasia (Deveras et al. (2002) Ann Inten Med 137: 884-888). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en
55 tratamientos para controlar episodios de sangrado en pacientes con trastornos de sangrado adquiridos debido a tratamientos con anticoagulantes. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
e. Hemofilia adquirida
Pueden desarrollarse espontáneamente inhibidores del factor VIII en individuos por lo demás sanos, dando como resultado una afección conocida como “hemofilia adquirida”. La hemofilia adquirida es una afección poco habitual, con una incidencia anual de 0,2-1,0 por millón de población. Los autoanticuerpos son principalmente anticuerpos IgG4, que, cuando se unen a FVIII, inhiben la actividad de FVIII interfiriendo con la escisión por trombina, interacción 65 con el factor de von Willebrand y/o unión a fosfolípidos. Esto da como resultado hemorragia con peligro para la vida en aproximadamente el 87 % de los pacientes afectados. Son sitios comunes de sangrado la piel, mucosa, músculos
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y retroperitoneo, en contrastes con pacientes con hemofilia hereditaria que sangran predominantemente en articulaciones y músculos. La hemofilia adquirida puede tratarse con un concentrado de complejo de protrombina activado o factor VII activado recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) para controlar episodios de sangrado. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación
5 potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y pueden por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, durante una duración de tratamiento más corta, y con menos reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológica. En general, los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
3. Sangrado por traumatismo y quirúrgico
Pueden usarse polipéptidos de FVII como terapia para tratar el sangrado asociado con pérdida de sangre perioperatoria y traumática en sujetos con sistemas de coagulación normales. Por ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de FVII a un paciente para promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre asociada con cirugía 15 y, además, reducir la necesidad de transfusión sanguínea. En un ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de FVII a sujetos que se someten a prostatectomía retropúbica. La prostatectomía retropúbica se asocia con frecuencia con pérdida de sangre importante y una necesidad posterior de transfusión. A sujetos que se someten a dicha cirugía o una similar se les puede proporcionar una embolada intravenosa de una cantidad terapéutica de FVII en la fase operatoria temprana para reducir la pérdida de sangre perioperatoria potenciando la coagulación en el sitio de cirugía. La reducción de pérdida de sangre da como resultado eliminación de la necesidad de transfusión sanguínea en estos pacientes (Friederich et al. (2003) Lancet 361: 201-205). Pueden administrarse polipéptidos de FVII a pacientes con coagulación normal que se someten a otros tipos de cirugía para efectuar hemostasia rápida y evitar la pérdida de sangre. Los ejemplos no limitantes de procedimientos quirúrgicos en los que pueden usarse FVII, típicamente administrado en la forma activada (es decir FVIIa) en una terapia para reducir el sangrado perioperatorio
25 incluyen, pero sin limitación, cirugía de válvulas cardiacas (Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11: S121-5127), reemplazo de la válvula aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74: 910-912), resección de hemangiopericitoma recurrente (Gerlach et al. (2002) J Neurosurg 96: 946-948), cirugía de cáncer (Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23: 325-326) y cirugía en úlceras duodenales (Vlot et al. (2000) Am J Med 108: 421423). El tratamiento con FVII puede promover la hemostasia en el sitio de cirugía y reducir o prevenir la pérdida de sangre, reduciendo o anulando de este modo la necesidad de transfusión. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, y con menos reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
35 También pueden usarse polipéptidos del factor VII para promover la coagulación y evitar la pérdida de sangre en sujetos con lesión traumática. El traumatismo se define como una lesión al tejido vivo por un agente extrínseco, y es la cuarta causa principal de muerte en los Estados Unidos. El traumatismo se clasifica como traumatismo contuso (que da como resultado compresión interna, daño a los órganos y hemorragia interna) o traumatismo penetrante (una consecuencia de un agente que penetra en el cuerpo y destruye tejido, vasos y órganos, dando como resultado hemorragia externa). El traumatismo puede estar provocado por varios acontecimientos incluyendo, pero sin limitación, accidentes de vehículos (que provocan traumatismo contuso y/o penetrante), heridas de bala (que provocan traumatismo penetrante), heridas de apuñalamiento (que provocan traumatismo penetrante), accidentes de maquinaria (que provocan traumatismo penetrante y/o contuso), y caídas desde alturas significativas (que provocan
45 traumatismo penetrante y/o contuso). La hemorragia descontrolada como resultado del traumatismo es responsable de la mayoría de la mortalidad asociada. La coagulopatía difusa es una complicación relativamente común asociada con pacientes de traumatismo, que aparece en hasta el 25-36 % de los sujetos. La coagulopatía puede desarrollarse poco después de la lesión, resultando de una diversidad de factores tales como dilución y consumo de factores de coagulación y plaquetas, fibrinolisis, acidosis e hipotermia. El tratamiento convencional implica terapia de reemplazo por transfusión con plasma congelado nuevo (FFP), plaquetas, RBC y/o crioprecipitado, corrección de acidosis y tratamiento de la hipotermia. Estas etapas son con frecuencia insuficientes para detener el sangrado y evitar la muerte. El tratamiento por administración de cantidades terapéuticas de FVII puede promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre en pacientes de traumatismo. Por ejemplo, a un paciente con una herida de bala que presenta sangrado masivo, además de intervención quirúrgica, se le administra FVII para controlar el sangrado
55 coagulopático (Kenet et al. (1999) Lancet 354: 1879). La terapia de coagulación con FVII puede reducir eficazmente la pérdida de sangre y hemorragia en pacientes con traumatismo contuso y penetrante (Rizoli et al. (2006) Crit Care
10:
R178). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente y con menos reacciones adversas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).
I.
Terapias de combinación
Puede administrarse cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento en
65 combinación con, antes de, simultáneamente con, o después de, otros agentes o procedimientos terapéuticos incluyendo, pero sin limitación, otros productos biológicos, compuestos de moléculas pequeñas y cirugía. Para cualquier enfermedad o afección, incluyendo todas las ejemplificadas anteriormente, para la que se indica FVII (incluyendo FVIIa y rFVIIa) o se ha usado y para la que están disponibles otros agentes y tratamientos, FVII puede usarse en combinación con los mismos. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse de forma similar. Dependiendo de la enfermedad o afección para tratar, las
imagen86
5 combinaciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, combinación con otros factores de coagulación recombinantes o purificados en plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides.
J. Artículos de fabricación y kits
Pueden envasarse compuestos farmacéuticos de polipéptidos de FVII modificados o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de FVII modificados, o un derivado o una parte biológicamente activa de los mismos como artículos de fabricación que contienen material de envasado, una composición farmacéutica que es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno hemostático, y una etiqueta que indica que el polipéptido de FVII modificado o
15 molécula de ácido nucleico debe usarse para tratar una enfermedad o un trastorno hemostático.
Los artículos de fabricación descritos en el presente documento contienen materiales de envasado. Los expertos en la materia conocen bien materiales de envasado para su uso en envasado de productos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.352. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéuticos incluyen, pero sin limitación, envases de blíster, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, frascos y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo pretendido de administración y tratamiento. Se contempla una amplia serie de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en el presente documento así como una diversidad de tratamientos para cualquier enfermedad o trastorno hemostático.
25 Los polipéptidos de FVII modificados y moléculas de ácido nucleico también pueden proporcionarse como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para administración. Por ejemplo, pueden proporcionarse un FVII modificado con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un cuentagotas o un aplicador. El kit puede incluir, opcionalmente, instrucciones para su aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, dichos kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de FVII o un sistema regulado por FVII de un sujeto.
35 Los siguientes ejemplos se incluyen para fines ilustrativos solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
K. Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación y expresión de FVII
A. Clonación de FVII
45 Los nucleótidos que codifican el polipéptido precursor de isoforma de FVII humano de 466 aminoácidos (P08709; expuesto en SEQ ID NO: 1) se clonaron en el vector de expresión de mamíferos, pCMV Script (Stratagene; SEQ ID NO: 99), que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV). Brevemente, se usaron los oligonucleótidos CBO-125 (SEQ ID NO: 100) y CBO-126 (SEQ ID NO: 101) como cebadores directo e inverso, respectivamente, para amplificar la secuencia de FVII por PCR usando ADNc de FVII humano (Invitrogen) como el molde. El cebador CBO-125 contenía un sitio de restricción BamHI (en negrita), una secuencia de Kozak (doble subrayado), seguido de 18 nucleótidos con homología para el extremo 5’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayado), incluyendo el codón de inicio ATG. El cebador CBO-126 contenía un sitio de restricción EcoRI (en negrita), un codón de terminación (doble subrayado) y 21 nucleótidos con homología para el extremo 3’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayado).
55 Cebador directo CBO-125 5’ gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3’ Cebador inverso CBO-126 5’ gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3’
Se usaron condiciones de reacción y termociclación de PCR convencionales junto con el kit de PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), como se recomienda por el fabricante. El producto de PCR se digirió con enzimas de restricción BamH I y EcoR I y se ligó en los sitios de restricción BamH I y EcoR I del vector pCMV Script usando técnicas moleculares convencionales. El vector se transformó después en Escherichia coli. Se cultivaron colonias seleccionadas y se
65 recogieron células bacterianas para purificación del plásmido usando técnicas de biología molecular rutinarias.
imagen87
B. Generación de variantes de FVII
Se generaron variantes de FVII usando el kit de Mutagénesis Dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con oligonucleótidos específicamente diseñados que actuaron como cebadores 5 que incorporaban una mutación particular en ADN de nueva síntesis. El método QuikChange implica la amplificación lineal de ADN molde por la ADN polimerasa de alta afinidad PfuUltra. Los cebadores complementarios que incluyen la mutación deseada se extendieron durante la ciclación usando vector pCMV Script superenrollado bicatenario, purificado, que contenía la secuencia de ADNc de FVII clonada como un molde. La extensión de los cebadores dio como resultado la incorporación de la mutación de interés en cadenas de nueva síntesis, y dio como resultado un
10 plásmido mutado con muescas escalonadas. Después de la amplificación, el ácido nucleico se trató con Dpn I, que digiere las cadenas parentales dam metiladas del vector pCMV Script derivado de E. coli. Esto dio como resultado la “selección” de los plásmidos mutados de nueva síntesis, que no estaban metilados. El ADN del vector que contenía la mutación o las mutaciones deseadas se transformó en células E. coli ultracompetentes XL10-Gold, donde la ligasa bacteriana reparó las muescas y permitió que se produjera replicación normal.
15 La Tabla 13 posterior expone las variantes de FVII que se generaron. En algunos casos, se generaron variantes de FVII en las que se insertó una secuencia de unión para integrina de plaquetas IIb3 en diversas regiones del polipéptido de FVII. Se insertó una de tres secuencias de unión a integrina IIb3 diferentes: SFGRGDIRNV (SEQ ID NO: 110); CSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 111); o GGGSCSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 112). Las secuencias de
20 unión a integrina IIb3 se insertaron en el extremo C terminal del polipéptido de FVII después del resto de aminoácido P406 por numeración de FVII maduro, o se insertaron por deleción y reemplazo de los restos de aminoácidos de FVII S103 a S111, H115 a S126 o T127 a P134 por numeración de FVII maduro. También se generaron otras variantes de FVII en las que se insertó una secuencia de unión a albúmina de suero. Estas variantes de FVII contenían una de siete secuencias de unión a albúmina de suero diferentes:
25 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 103), IEDICLPRWGCLWE (SEQ ID NO: 104), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 105), IEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 106), GGGSIEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 107), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 108), o GGGSDICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 109). Las secuencias de unión a albúmina de suero se insertaron en el extremo C terminal del polipéptido de FVII después del resto de aminoácido P406 por numeración de FVII maduro, o se insertaron por deleción y reemplazo de los restos de aminoácidos de
30 FVII S103 a S111, H115 a S126 o T127 a P134 por numeración de FVII maduro. Las variantes de FVII de “Intercambio de Gla FIX” (es decir un polipéptido de FVII en el que el dominio Gla endógeno se ha reemplazado con el dominio Gla de FIX) contienen restos de aminoácidos Y1 a Y45 de SEQ ID NO: 83 en el extremo N terminal. En algunos ejemplos, las variantes de “Intercambio de Gla FIX” contienen una o más sustituciones de aminoácidos en la parte de dominio Gla de FIX. Se incluyen mutaciones que están en la parte de dominio Gla de FIX entre llaves y se
35 hace referencia a ellas usando posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FIX de tipo silvestre maduro, o el dominio Gla de FIX de tipo silvestre expuesto en SEQ ID NO: 83. Por ejemplo, {Intercambio de Gla FIX/M19K} indica que el polipéptido de FVII modificado contiene un dominio Gla de FIX heterólogo en el que la metionina en la posición 19 del dominio Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. En la Tabla 13 posterior están representados los restos de aminoácidos en los que se
40 inserta la secuencia de unión a albúmina de suero o integrina de plaquetas IIb3 en el polipéptido de FVII, y la secuencia de aminoácidos de la secuencia de unión. Por ejemplo, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los restos de aminoácidos H115 a S126 se han suprimido y reemplazado con una secuencia de unión a albúmina de suero con la secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 103).
45 Tabla 13. Variantes del factor VII
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
Tipo silvestre
Tipo silvestre
3
Q286N
Q143N 113
Q286E
Q143E 114
Q286D
Q143D 115
Q286S
Q143S 116
Q286T
Q143T 117
Q286R
Q143R 118
Q286K
Q143K 119
Q286A
Q143A 120
Q286V
Q143V 121
Q286M
Q143M 122
Q286L
Q143L 123
Q286Y
Q143Y 124
Intercambio de Gla FIX/Q286R
Intercambio de Gla FIX/Q143R 131
H257A/Q286R
H117A/Q143R 132
S222A/Q286R
S82A/Q143R 133
S222A/H257A/Q286R
S82A/H117A/Q143R 134
imagen88
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R 135
Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/H117A/Q143R 136
Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/ Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/H117A/ Q143R 137
Q286R/M298Q
Q143R/IM156Q 138
Q286R/M298Q/K341Q
K192Q/Q143R/M156Q 139
K199E/Q286R/M298Q
K60cE/Q143R/M156Q 140
Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141
Q286R/Q366V
Q143R/Q217V 142
Q286R/A292N/A294S/Q366V
Q143R/A150N/A152S/Q217V 143
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 144
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 145
H257S/Q286R
H117S/Q143R 146
H257S/Q286R/Q366V
H117S/Q143R/Q217V 147
S222A/H257A/Q286R/Q366V
S82A/H117A/Q143R/Q217V 148
Q286R/H373A
Q143R/H224A 149
S222A/H257A/Q286R/M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 150
V158D/E296V/M298Q
V158D/E296V/M298Q
158
Q286R/K341D
Q143R/K192D 151
Q286R/Q366D
Q143R/Q217D 152
Q286R/Q366N
Q143R/Q217N 153
Q286R/M298Q/Q366D
Q143R/M156Q/Q217D 154
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 155
Q286R/H373F
Q143R/H224F 156
Q286R/M298Q/H373F
Q143R/M156Q/H224F 157
T239S
T99S 159
T239N
T99N 160
T239Q
T99Q 161
T239V
T99V 162
T239L
T99L 163
T239H
T99H 164
T239I
T99I 165
P321K
P170iK 166
P321E
P170iE 167
P321Y
P170iY 168
P321S
P170iS 169
Q366D
Q217D 170
Q366E
Q217E 171
Q366N
Q217N 172
Q366T
Q217T 173
Q366S
Q217S 174
Q366V
Q217V 175
Q366I
Q217I 176
Q366L
Q217L 177
Q366M
Q217M 178
H373D
H224D 179
H373E
H224E 180
H373S
H224S 181
H373F
H224F 182
H373A
H224A 183
Q366D/H373E
Q217D/H224E 184
Q366V/H373V
Q217V/H224V 185
Q366V/H373L
Q217V/H224L 186
Q366V/H373I
Q217V/H224I 187
K161S
K24S 188
K161A
K24A 189
K161V
K24V 190
H216S
H76S 191
H216A
H76A 192
H216K
H76K 193
imagen89
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
H216R
H76R 194
S222A
S82A 195
S222K
S82K 196
S222V
S82V 197
S222D
S82D 200
S222N
S82N 198
S222E
S82E 199
H257A
H117A 201
H257S
H117S 202
S222K/H257A
S82K/H117A 203
H216A/H257A
H76A/H117A 204
H216A/S222A
H76A/S82A 205
S52A
S[52]A 206
S60A
S[60]A 207
E394N/P395A/R396S
E245N/P246A/R247S 208
R202S
R62S 209
A292N/A294S
A150N/A152S 210
G318N
G170fN 211
A175S
A39S 212
K109N
K-26N 213
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 214
A51N
A-84N 215
T130N/E132S
T[130]N/E[132]S 216
S50A/S62A
S[50]A/S[62]A 217
A122N/G124S/E394N/P395A/R396S
A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 218
A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N
A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S/G170fN 219
S52N/P54S
S[52]N/P[54]S 220
S119N/L121S
S[119]N/L[121]S 221
T128N/P129A
T[128]N/P[129]A 222
Q66N/Y68S
Q[66]N/Y[68]S 223
S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R3 96S
S[52]N/P[54]S/A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 224
K109N/A292N/A294S
[K109N]/A150N/A152S 225
K109N/A175S
[K109N]/A39S 226
V158T/L287T/M298K
V21T/L144T/M156K 256
V158D/L287T/M298K
V21D/L144T/M156K 257
S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWED DF
S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 227
H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWED DF
H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF 228
T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWED DF
T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 229
S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE
S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE 230
H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE
H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE 231
T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE
T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE 232
S103S111delinsDICLPRWGCLWE D
S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED 233
H115S126deinsDICLPRWGCLWE D
H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED 234
T128P134delinsDICLPRWGCLWE D
T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED 235
P406insIEDICLPRWGCLW
P257insTEDICLPRWGCLW 236
P406insGGGSIEDICLPRWGCLW
P257insGGGSIEDICLPRWGCL W 237
P406insDICLPRWGCLWED
P257insDICLPRWGCLWED 238
P406insGGGSDICLPRWGCLWED
P257insGGGSDICLPRWGCLWE D 239
S103S111delinsSFGRGDIRNV
S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV 240
H115S126delinsSFGRGDIRNV
H[115]S[126]delinsSFGRGDIRN V 241
T127P134delinsSFGRGDIRTN
T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV 242
P406insCSFGRGDIRNVC
P257insCSFGRGDIRNVC 243
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC
P257insGGGSCSFGRGDIRNVC 244
Intercambio de Gla FIX/S222A
Intercambio de Gla FIX/S82A 245
Intercambio de Gla FIX/H257A
Intercambio de Gla FIX/H117A 246
Intercambio de Gla FIX/S222A/H257A
Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247
imagen90
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
S222A/M298Q
S82A/M156Q 248
H257A/M298Q
H117A/M156Q 249
S222A/H257A/M298Q
S82A/H117A/M156Q 250
S222A/A292N/A294S/Q366V
S82A/A150N/A152S/Q217V 251
A175S/S222A/Q366V
A39S/S82A/Q217V 252
S222A/Q366V
S82A/Q217V 253
H257S/Q366V
H117S/Q217V 254
S222A/H373A
S82A/H224A 255
S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V
S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 258
S103S111delinsDICLPRWGCLWE D/G237V
S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 259
H115S126delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V
H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF/G97V 260
H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V
H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 261
H115S126delinsDICLPRWGCLWE D/G237V
H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 262
T128P134delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V
T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 263
T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V
T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 264
S103S111delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V
S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 265
T128P134delinsDICLPRWGCLWE D/G237V
T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 266
S103S111delinsSFGRGDERNV/G2 37V
S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV /G97V 267
H115S126delinsSFGRGDIRINV/G2 37V
H[115]S[126]delinsSFGRGDIRN V/G97V 268
T128P134delinsSFGRGDIRNV/G2 37V
T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV /G97V 269
M298Q/H373F
M156Q/H224F 270
S119N/L121S/A175S
S[119]N/L[121]S/A39S 271
T128N/P129A/A175S
T[128]N/P[129]A/A39S 272
A122N/G124S/A175S
A[122]N/G[124]S/A39S 273
{Intercambio de GlaFIX/E40L}/Q286R/M298 Q
{Intercambio de GlaFIX/E[40]L}/Q143R/M1 56Q 274
{Intercambio de GlaFIX/K43I}/Q286R/M298 Q
{Intercambio de GlaFIX/K[43]I}/Q143R/M1 56Q 275
{Intercambio de GlaFIX/Q44S}/Q286R/M298 Q
{Intercambio de GlaFIX/Q[44]S}/Q143R/M 156Q 276
{Intercambio de GlaFIX/M19K}/Q286R/M29 8Q
{Intercambio de GlaFIX/M[19]K}/Q143R/M 156Q 277
{Intercambio de GlaFIX/M19K/E40L/K43I/Q 44S}/Q286R/M298Q
{Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q14 3R/M156Q 278
T128N/P129A/Q286R
T[128]N/P[129]A/Q143R 279
T128N/P129A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280
T128N/P129A/Q286R/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281
V158D/Q286R/E296V/M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 282
T128N/P129A/V158D/E296V/M29 8Q
T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M 156Q 283
T128N/P129A/S222A
T[128]N/P[129]A/S82A 284
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222A/ Q286R
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S8 2A/Q143R 285
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R /M298Q
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q1 43R/M156Q 286
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286 R/M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q 143R/M156Q 287
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H37 3F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ H224F 288
S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q
S[52]A/S[60]A/V21D/E154V/M15 6Q 289
S52A/S60A/Q286R
S[52]A/S[60]A/Q143R 290
S52A/S60A/S222A
S[52]A/S[60]A/S82A 291
Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q 286R
Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82A /Q143R 292
S52A/S60A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/Q 143R/M156Q 293
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/ M298Q
S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 298
imagen91
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
S52A/S60A/Q286R/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H2 24F 297
V158D/T239V/E296V/M298Q
V21D/T99V/E154V/M156Q 298
T239V/Q286R
T99V/Q143R 299
S222A/T239V
S82A/T99V 300
Intercambio de GlaFIX/S222A/T239V/Q286R
Intercambio de GlaFIX/S82A/T99V/Q143R 301
T239V/Q286R/M298Q
T99V/Q143R/M156Q 302
S222A/T239V/H257A/Q286R/M29 8Q
S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 Q 303
Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298 Q
Intercambio de GlaFIX/T99V/Q143R/M 156 Q 304
T239V/Q286R/H373F
T99V/Q143R/H224F 305
T239V/Q286R/M298Q/H373F
T99V/Q143R/M156Q/H224F 306
V158D/T239I/E296V/M298Q
V21D/T99I/E154V/M156Q 307
T239I/Q286R
T99I/Q143R 308
S222A/T239I
S82A/T99I 309
Intercambio de GlaFIX/S222A/T239I/Q286R
Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310
T239I/Q286R/M298Q
T99I/Q143R/M156Q 311
S222A/T239I/H257A/Q286R/M298 Q
S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312
Intercambio de GlaFIX/T239I/Q286R/M298Q
Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313
T239I/Q286R/H373F
T99I/Q143R/H224F 314
T239I/Q286R/M298Q/H373F
T99I/Q143R/M156Q/H224F 315
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/H373F
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/H224F 316
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298 Q
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q 317
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298 Q/H373F
Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q/H224F 318
V158D/E296V/M298Q/H373F
V21D/E154V/M156Q/H224F 319
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H37 3F
V21D/Q143R/E154V/M156Q/H22 4F 320
H257A/Q286R/M298Q
H117A/Q143R/M156Q 321
H257S/Q286R/M298Q
H117S/Q143R/M156Q 322
Intercambio de GlaFIX/S222A/H257S/Q286R
Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323
S222A/H257S/Q286R/M298Q
S82A/H117S/Q143R/M156Q 324
H257S/Q286R/M298Q/H373F
H117S/Q143R/M156Q/H224F 325
S222A/Q286R/M298Q/H373F
S82A/Q143R/M156Q/H224F 326
Intercambio de GlaFIX/Q366V
Intercambio de GlaFIX/Q217V 327
S222A/Q286R/M298Q
S82A/Q143R/M156Q 328
T128N/P129A/A175S/Q366V
T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329
A122N/G124S/A175S/Q366V
A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V/ 330
T128N/P129A/A175S/S222A
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331
A122N/G124S/A175S/S222A
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332
T128N/P129A/A175S/Q286R
T[128]N/P[129]A/A39S/Q 143R 333
A122N/G124S/A175S/Q286R
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334
Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/ S222A/Q286R
Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A3 9S/S82A/Q143R 335
Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S /S222A/Q286R
Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A 39S/S82A/Q143R 336
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q 337
A122N/G124S/A175S/Q286R/M29 8Q
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q 338
T128N/P129A/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 339
A122N/G124S/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 340
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q/H373F
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 341
A122N/GI24S/A175S/Q286R/M29 8Q/H373F
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 342
T128N/P129A/M298Q
T[128]N/P[129]A/M 156Q 354
{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298 Q
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356
{Intercambio de Gla FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156QQ217N 357
imagen92
Variante (numeración de FVII maduro)
Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEQ ID NO
{Intercambio de Gla FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N
{Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q Q217N 358
T128N/P129A/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/M 156Q/H224F 359
V158D/Q286R/E296V/M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 360
M298Q/Q366N/H373F
M156Q/Q217N/H224F 361
T239V/M298Q/H373F
T99V/M156Q/H224F 362
T239I/M298Q/H373F
T99I/M156Q/H224F 363
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364
T239V/Q286R/M298Q/Q366N
T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365
T239I/Q286R/M298Q/Q366N
T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 Q
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M 156Q 367
T128N/P129A/S222A/T239V/H257 A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H1 17A/Q143R/M156Q 368
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M 156Q/H224F 369
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298 Q
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M1 56Q 370
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298 Q/H373F
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M1 56Q/H224F 371
C. Expresión de polipéptidos de FVII
Para el análisis de expresión inicial por ELISA y Transferencia de Western, se expresaron polipéptidos de FVII en 5 células BHK-21. Para ensayos bioquímicos, tales como los descritos posteriormente, los polipéptidos de FVII se expresaron en células 293-F Freestyle™ (Invitrogen).
El polipéptido de Factor VII de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) y polipéptidos de FVII variantes se expresaron inicialmente en la línea celular de riñón de cría de hámster BHK-21 (ATCC CRL 1632). Se cultivaron células BHK-21 10 en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, Invitrogen) con suero de ternero fetal al 10 % (FCS) en placas de cultivo de 100 mm a 37° ºC y CO2 5 %. Después del cultivo hasta aproximadamente 90 % de confluencia, las células se transfectaron con 24  g/ml (Sigma) y las células se incubaron durante 72 horas adicionales. Se ensayó la
15 expresión de FVII en el medio de cultivo celular por ELISA o Transferencia de Western.
Para análisis posteriores usando ensayos bioquímicos, se expresaron el polipéptido del Factor VII de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) y polipéptidos de FVII variantes en células 293-F Freestyle™ (Invitrogen). Las células se cultivaron en medio 293 FreestyleTM (Invitrogen) a 37 ºC y CO2 8 % en matraces de Erlenmeyer con tapones ventilados. Las 20 células se trasfectaron usando el protocolo sugerido por el fabricante. Brevemente, después del crecimiento a 1x106 células/ml, las células se centrifugaron y el medio se intercambió. Las células se tansfectaron después con 240 g de ADN plasmídico de FVII para cada 240 ml de células usando 293fectin (Invitrogen). Además, se añadieron 50 l de una reserva de Vitamina K1 de 1 mg/ml (Sigma) en etanol para cada 240 ml de células. Las células se cultivaron durante 5 días y después se recogió sobrenadante de cultivo. La expresión de FVII en el medio de cultivo celular se
25 ensayó por ELISA.
En algunos ejemplos, se expresaron polipéptidos de FVII de tipo silvestre y variantes en células CHO-Express (CHOX) (Excellgene). Se mantuvieron células CHO Express (CHOX) en medio Completo DM202 (SAFC BioSciences) y se usaron para inocular cultivos de siembra de producción. Se dejaron crecer cultivos de siembra 30 hasta 5 x 106 células viables/ml y se usaron aproximadamente 60 ml para inocular aproximadamente 0,6 l de medio Completo DM202 (la densidad de inoculación es 0,4 x 106 vc/ml) para generar un cultivo de producción. Este cultivo de producción se dejó crecer durante 4 días hasta alcanzar 8-12 x 106 vc/ml el día de la transfección. Se formó un complejo de transfección usando ADN plasmídico de Factor VII (6 mg) y 23,1 mg de Polietilenimina (PEI). El complejo de transfección se diluyó después en 0,5 l de medio de transfección Opti-MEM sin suero (Invitrogen), que
35 se añadió al cultivo de producción de 0,6 l, Después de 5 horas de transfección el cultivo se diluyó adicionalmente con 1 l de medio ProCHO5 (Lonza) complementado con L-glutamina 8 mM y Vitamina K1 4 mg/l. Se permitió que el cultivo de matraz de agitación de 2,2 l se expresara durante 5 -7 días antes de recoger el Factor VII en bruto. Después se recogieron sobrenadantes de cultivo por filtración y se purificó FVII.
40 Se realizó expresión de una de las variantes de FVII (Q286R/M298Q) en una línea celular estable. Esta línea se generó en Excellgene (Monthey, Valais, Suiza) por transfección de células CHOX. Brevemente, se cultivaron células en presencia de metotrexato, después se sembraron por dilución limitante a una célula por pocillo en placas de 96 pocillos. Los clones que producían los mayores niveles de FVII variante se determinaron por ELISA. Un clon (clon 52) se clonó adicionalmente por una segunda dilución limitante y se sembró en placas de 96 pocillos. Las colonias
45 se cultivaron a 37 ºC en medio DM204A (SAFC BioSciences), complementado con L-glutamina 8 mM, cisteína 1 mM, vitamina K1 1 mg/l. Se descubrió que 24 clones tenían mayores niveles de expresión de Q286R/M298Q, por análisis de ELISA, que el clon original 52. Estos 24 clones se expandieron adicionalmente en placas de 6 pocillos durante 6 días de cultivo, seguido de cultivo en matraces de agitación de 40 ml durante 4 días. Cada etapa de cultivo se realizó a 37 ºC en medio DMA204A, complementado como antes. Después de los cuatro días de cultivo, los clones se congelaron a 1 x 107 células viables/ml. Los niveles de Q286R/M298Q producidos por cada clon se
imagen93
5 determinaron por ELISA. El clon 5F7 fue el mayor productor, generando típicamente 25 -35 mg/l de Q286R/M298Q.
1. ELISA
Se usó un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de FVII humano y FVIIa en una muestra. Se usaron anticuerpos policlonales para FVII humano para capturar y detectar la proteasa en la solución. El inmunoensayo puede usarse para determinar la concentración de proteínas de medio acondicionado o una reserva purificada o para determinar la concentración de FVII en otra muestra, por ejemplo, una muestra de plasma humano o de ratón. La concentración de línea basal de FVII en sangre humana es de aproximadamente 50 nM y la forma enzimáticamente activa FVIIa, es aproximadamente 1 nM.
15 Para determinar la cantidad de proteína FVII o FVIIa humana en muestras se realizó un ELISA de tipo sándwich. Se recubrieron placas Maxisorp immuno de fondo plano de noventa y seis pocillos (Nunc) con 100 l/pocillo de avidina 5 ng/l (NeutrAvidin, Pierce Biotech.). Las placas se cubrieron y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) seguido de lavado cuatro veces en PBS con Tween-20 (PBST) 0,01 %. Las placas se bloquearon durante un mínimo de 1 hora a TA con agitación por incubación con albúmina de suero bovino (BSA) 1 % (p/v) en PBS añadida a cada pocillo a 200 l/pocillo. Las placas bloqueadas se almacenaron después a 4 ºC hasta su uso (hasta 2 semanas).
Antes de su uso, las placas se lavaron cuatro veces en PBST para retirar la BSA, y se añadieron 100 l/pocillo de
25 una solución de 1 ng/l de anticuerpo anti Factor VII biotinilado (R&D Systems) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos con agitación para permitir la formación del complejo con la avidina que la recubre. Se retiró el anticuerpo no unido en exceso lavando la placa con PBST (cuatro veces).
Se añadieron diluciones dobles en serie de un patrón de FVII (American Diagnostica; diluido en PBST), que variaba de 50 ng/l a 0,8 ng/l, a la placa a 100 l/pocillo. Se incluyó un pocillo que contenía PBST sin ningún FVII como un control solamente de tampón. Para ensayar muestras purificadas (antes y después de la activación, véase Ejemplo 3) de FVII o FVIIa, la muestra se diluyó en primer lugar 1:25 en PBST, y después se realizaron diluciones dobles en serie de modo que se ensayaron diluciones 25 veces, 50 veces, 100 veces y 200 veces. Las muestras diluidas se añadieron a los pocillos por duplicado a 100 l/pocillo. Para ensayar las muestras de plasma que contenían FVII o
35 FVIIa, la muestra de plasma se diluyó 1:100 y 1:400 en PBST y se añadió a los pocillos por duplicado a 100 l/pocillo. También se incluyó una muestra de plasma sin FVII o FVIIa para determinar los niveles de fondo. Las placas se incubaron después durante 30 minutos a TA con agitación para permitir que cualquier FVII o FVIIa en la muestra formara complejo con el anticuerpo anti FVII.
Después de incubación con la muestra, las placas se lavaron 4 veces con PBST. Un anticuerpo secundario, Equino anti FVII humano o Murino monoclonal anti FVII humano (American Diagnostica), se diluyó 1:5000 en PBST y se añadió a cada pocillo a un volumen de 100 l. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación para permitir que el anticuerpo añadido se uniera con el FVII o los complejos de FVII en la placa. Para retirar el anticuerpo secundario en exceso, las placas se lavaron con PBST (4 veces). Para detectar el anticuerpo 45 secundario unido, se añadieron 100 l de conjugado de HRP de cabra anti equino a una dilución 1:5000 en PBST, o 100 l de conjugado de HRP de cabra anti ratón a una dilución 1:20.000 en PBST a cada pocillo. Después de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación, las placas se lavaron cuatro veces con PBST y se añadieron 100 l/pocillo de una solución que contenía una mezcla 1:1 de sustrato de TMB y solución de peróxido de hidrógeno (Pierce Biotech). Las placas se agitaron durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente antes de la adición de 100 l/pocillo de H2SO4 2 M para detener la reacción. La densidad óptica a 450 nm se midió usando un lector de Placas M5 de Molecular Device y se restó el valor de fondo para la placa (medido con PBST solamente) del valor medido de cada pocillo. Se generó una curva patrón representando la concentración de los patrones de FVII frente a la absorbancia. Se generó típicamente un intervalo de curva patrón de aproximadamente 0,2 -50 ng/ml en las condiciones de ELISA anteriores. Después se determinó la concentración de
55 cada muestra usando la curva patrón y multiplicando por el factor de dilución, y se indicó un promedio y desviación típica.
2. Transferencia de Western
También se ensayó la expresión de FVII en medio de cultivo celular por transferencia de Western. Las alícuotas que contenían la muestra no diluida o diluciones dobles en serie en PBS del medio de cultivo celular de células transfectadas con FVII (células BHK-21 o CHOX) se marcaron Conc. 1 (no diluido), Conc. 2 (dilución doble) y Conc. 3 (dilución cuádruple). Las muestras se cargaron en un gel de SDS page junto a 10, 25 y 50 nanogramos de rFVII purificado de plasma de control (American Diagnostica). La proteína de FVII producida por células BHK-21 o CHOX 65 se detectó por transferencia de Western usando un anticuerpo equino policlonal primario anti FVII (American
imagen94
Diagnostica; usado a la concentración sugerida por el fabricante) y un anticuerpo secundario anti IgG equino conjugado con HRP (una dilución 1:2000 de solución 1 mg/ml de Zymed Laboratories). En algunos ejemplos, el FVII se detectó por transferencia de Western usando un anticuerpo de conejo primario anti Factor VIIa humano (Hematologic Technologies) y un anticuerpo secundario anti IgG de conejo conjugado con HRP (Invitrogen). Se
5 realizó comparación de los niveles de expresión con el rFVII purificado de plasma de control. Los resultados muestran que estaban presentes concentraciones que variaban de aproximadamente 20 ng a más de 50 ng de FVII en las alícuotas de cultivo celular.
Ejemplo 2
Purificación y activación de polipéptidos de FVII
Se purificaron polipéptidos de FVII usando una columna de Flujo Rápido de Q Sepharose, o CaptoQ (GE Healthcare), en la que se adsorberán polipéptidos de FVII con dominios Gla funcionales, seguido de una etapa de 15 elución de calcio. Típicamente, el sobrenadante de cultivo del transfectado se diluyó 2 veces con una solución que contenía Tris 20 mM pH 8,0 y Tween 20 0,01 %, y después se añadió EDTA 500 mM pH 8,0 a la muestra diluida hasta una concentración final de 1,5 mM. Las muestras se filtraron antes de cargarse en la columna de Flujo Rápido de Q Sepharose o CaptoQ, que se había preequilibrado primero con Tampón B (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 1 M, Tween 20 0,01 %), después Tampón A (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,01 %). Después de cargar, la columna se lavó con Tampón A hasta que la absorbancia del flujo continuo a 280 nm alcanzó una línea basal. El tampón A se reemplazó con Tampón C (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,01 %, CaCl2 5 mM) y se realizó un lavado de bomba para reemplazar completamente el tampón en las líneas. Tras completar el lavado de bomba, se aplicó Tampón C a la columna a 8 ml/min para eluir los polipéptidos de FVII, que se recogieron en fracciones. Después de la elución, la columna se lavó con Tampón B recogiendo al mismo tiempo fracciones, hasta
25 que el pigmento rosa (del medio de cultivo) se retiró de la columna por lavado. La columna se lavó después con Tampón A para reequilibrarla para su reutilización.
Las fracciones eluidas se purificaron adicionalmente usando una columna Mono Q o QHiTrap (GE Healthcare), que se preequilibró inicialmente con Tampón B, y después con Tampón A. Las fracciones recogidas con Tampón C anteriores, que contenían FVII, se agruparon y se diluyeron 2 veces con Tampón A, antes de añadirse EDTA, pH 8,0, a una concentración final de 40 mM. Se tomaron opcionalmente alícuotas pequeñas (por ejemplo 100 l) en este punto para su análisis, tal como por ELISA. La muestra combinada se cargó en la columna Mono Q (o QHiTrap), después se lavó con Tampón A. Para eluir los polipéptidos de FVII unidos, se procesó un gradiente del 0 % al 30 % de Tampón B a través de la columna y se recogieron las fracciones. La columna se lavó después con
35 Tampón B seguido de Tampón A para reequilibrar para su reutilización.
En algunos ejemplos, después de la primera columna de Capto Q, se intercambiaron los tampones de fracciones agrupadas por diafiltración a Tampón D (MES 20 mM, pH 6,0, CaCl2 10 mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 0,01 %) después se cargó en una columna de SP-HP que se había preequilibrado con Tampón D. Después de lavar con Tampón D, se aplicó un gradiente de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M a la columna y se recogieron las fracciones. Después se ajustaron las fracciones que contenían FVII a pH 8,0 y se diluyeron 2 veces en Tampón E (Tris 20 mM, pH 8,0, CaCl2 10 mM, Tween 20 0,01 %) y se aplicaron a una columna de Q H-HP que se había preequilibrado con Tampón
E. Esta columna se lavó después con Tampón E y el FVII se eluyó por un gradiente de NaCl 0 – 1 M en Tampón E.
45 Se activaron polipéptidos de FVII purificados a FVIIa usando el Factor Xa biotinilado del Kit de Escisión y Retirada de la Proteasa de Restricción de Factor Xa (Roche). Típicamente, se agruparon 7 fracciones de la purificación de Mono Q en un tubo cónico de 15 ml y se añadieron 388 l de CaCl2 500 mM, 38,9 l de BSA 10 % en agua destilada y 3,2 g de Factor Xa biotinilado. Después de incubación durante 14-16 horas a 37 ºC, se añadieron 250 l de Avidina Inmovilizada (Pierce) y la muestra se mezcló a 4 ºC durante 30 minutos. La solución resultante se filtró después a través de una columna Econo-pak (Bio-Rad) y el filtrado se mezcló con otros 250 l de Avidina Inmovilizada durante 30 minutos adicionales. La solución se filtró de nuevo y el filtrado se concentró a aproximadamente 300-500 l usando un filtro de centrífuga Amicon Ultra-4 de 10 kDa (Millipore). La concentración de FVIIa se analizó después por ELISA (como se describe en el Ejemplo 1.C.1) y se controló el nivel de activación del Factor VII por transferencia de Western. Se realizó transferencia de Western esencialmente como se describe en
55 el Ejemplo 1.C.2, pero usando en su lugar anticuerpo de conejo anti Factor VIIa humano (Haematologic Technologies, Inc.) a 1:2000 durante 1 hora como el anticuerpo primario, seguido de HRP de Cabra Anti IgG de Conejo (H+L) (Invitrogen) a 1:5000 durante 30 minutos.
Ejemplo 3
Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente viable en una solución
La concentración de FVIIa catalíticamente viable en una solución de reserva se determinó valorando un complejo de Factor VIIa y Factor Tisular soluble (FTs) con un inhibidor peptídico irreversible de FVIIa, Phe-Phe-Arg65 Clorometilcetona (FFR-CMK). El inhibidor se une con FVIIa pero no con FVII. La incubación extendida a una alta
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concentración de FVIIa (50 nM) asegura la valoración completa de la proteasa. La actividad residual del complejo de FVIIa/FT después de incubación con FFR-CMK se midió para determinar la concentración de FVIIa catalíticamente viable en la solución de reserva original.
5 Se pretrató una placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos (Nunc) añadiendo 150 l/pocillo de tampón de placa 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA 0,01 %, Tween-20 0,01 %) a cada pocillo e incubando la placa a 37 ºC durante un mínimo de 1 hora. El tampón se retiró completamente transfiriendo a una toalla de papel y centrifugando la placa boca abajo para retirar cualquier tampón restante, y la placa se secó al aire durante 1 hora y se almacenó cubierta a temperatura ambiente (TA).
Para preparar la mezcla de reacción de FVIIa/FTs/FFR-CMK, se diluyó en primer lugar una reserva de FVIIa (American Diagnostica; diluido a 5 M en glicerol 50 % (v/v) y se almacenó frío en alícuotas a -20 ºC) o una variante de FVIIa hasta 500 nM en tampón de ensayo directo 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %). La mezcla de FVIIa/FTs se realizó después mezclando 90 l de agua destilada con 36 l de tampón de
15 ensayo directo 5 x, 18 l de FVIIa 500 nM, y 18 l de FTs 5 M (Factor de Coagulación III humano recombinante/factor tisular soluble; R&D Systems; la solución de reserva usada fue de 19,6 mM en glicerol 50 % y se diluyó a 5 M en tampón de ensayo directo 1 x y se almacenó durante hasta dos semanas a 4 ºC). Después se permitió que los componentes formaran complejo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Se diluyó una solución de reserva de FFR-CMK 10 mM (BaChem) en DMSO (almacenado a -20 ºC) en agua hasta 3,5 M. Usando una fila de una placa de almacenamiento opaca de polipropileno (Costar), se realizaron diluciones dobles en serie en agua del FFR-CMK a través de 11 pocillos de una placa opaca de 96 pocillos, conteniendo el ultimo pocillo de la fila solamente agua como control. Esta es la solución de serie de inhibidor de FFR-CMK 10x. En cada pocillo de una fila de la placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos pretratada, se añadieron
25 10,8 l de la mezcla de FVIIa/FTs, seguido de 1,2 l de la serie de inhibidores de FFR-CMK 10x. Las soluciones se mezclaron bien y la placa se centrifugó a < 3000 rpm durante 5 minutos para retirar gotas en los pocillos. La placa se cubrió y se incubó durante 8 horas a 37 ºC.
Para ensayar la actividad residual del complejo de FVIIa/FT, se preparó en primer lugar una mezcla del sustrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica, n.º 217L; reserva reconstituida de un vial de 50 moles en 5 ml de agua destilada hasta 10 mM y se almacenó a 4 ºC) y tampón directo 5x (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM y BSA 0,05 %) mezclando 360 l de tampón de ensayo directo 5 x con 180 l de una solución 10 mM de Spectrozyme FVIIa y 1080 l de agua. A cada pocillo de la placa de ensayo, se añadieron 108 l de la solución de sustrato preparada. Los pocillos se mezclaron y la placa se incubó a 37 ºC. El aumento de absorbancia a 405 nm se
35 midió cada 30 segundos durante 1 hora a 37 ºC en un lector de placas Spectramax Gemini M5 de Molecular Devices.
Usando software SoftMax Pro (Molecular Devices), se midieron las tasas de absorbancia y se determinó la actividad fraccional de proteasas incubadas con un inhibidor dividiendo la tasa medida por la tasa de la proteasa no inhibida. La actividad fraccional se representó gráficamente frente a la concentración de FFR-CMK, y se descartaron los puntos que eran > 90 % o < 10 % de la actividad no inhibida. Después se dibujó una línea a través de los puntos restantes para determinar la ordenada en el origen, que representa la concentración de proteasa activa en la solución. Los valores de múltiples ensayos se midieron y promediaron y se determinó la desviación típica.
45 Ejemplo 4
Determinación de la actividad catalítica de FVIIa para su sustrato, Factor X
La actividad catalítica de las variantes de FVIIa para su sustrato, Factor x (FX), se evaluó indirectamente en un ensayo fluorogénico ensayando con respecto a la actividad de FXa, generado tras la activación por FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa.
A. Actividad catalítica dependiente de FT de FVIIa de tipo silvestre para su sustrato, Factor X
55 Se evaluó la actividad catalítica dependiente de FT de FVIIa de tipo silvestre en un ensayo fluorogénico en el que se incluía una forma lipidada de factor tisular (FT) purificado para proporcionar actividad óptima de FVIIa. Se determinó la actividad enzimática de FXa para Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH) midiendo el aumento de absorbancia del fluoróforo libre generado, AMC (7-amino-4-metilcoumarina), en función del tiempo.
Brevemente, el polipéptido de FVIIa de tipo silvestre se diluyó inicialmente hasta 0,5 M en tampón de ensayo 1x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, y BSA 0,01 %), después se diluyó adicionalmente a 0,1 nM en tampón de ensayo. Se reconstituyó FT de longitud completa lipidado (Innovin; Dade Behring) en 20 ml de agua para realizar una solución 3 nM y se diluyó hasta 0,2 nM en tampón de ensayo 1x. Se mezclaron cuatrocientos l de FVIIa 0,1 nM con 400 l de FT 0,2 nM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución se diluyó 65 adicionalmente por dos diluciones dobles en tampón de ensayo 1x que contenía FT 0,2 nM para obtener un total de
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tres diluciones de FVIIa de FVIIa 0,05 nM, 0,025 nM o 0,0125 nM conteniendo cada una FT 0,2 nM (soluciones de FVIIa/FT).
El sustrato, Factor X (FX; American Diagnostica; 80 g) se reconstituyó en 135,6 l de agua destilada para
5 proporcionar una reserva 10 M y se almacenó en alícuotas a -80 ºC. Las alícuotas no se congelaron y se descongelaron más de una vez. La reserva de FX se diluyó a 800 nM en tampón de ensayo directo, después se diluyó en serie 2 veces para obtener soluciones de FX que variaban de 800 nM a 50 nM.
Se reconstituyó Spectrofluor Xa (American Diagnostica; 10 moles) en tampón destilado a 5 mM y se almacenó a 4
10 ºC. A una placa de ensayo de área media negra de 96 pocillos (Costar), se añadieron 5 l de Spectrofluor Xa (American Diagnostica) a cada pocillo. Después se añadieron 25 l de la solución de FX a cada pocillo. A la última fila de pocillos de la placa, también se incluyó en el ensayo un control negativo en el que no se añadió FX. Por duplicado, se añadieron las tres concentraciones de las soluciones de FT/FVIIa a 20 l a pocillos de columnas respectivas de la placa de modo que cada dilución de FT/FVIIa se ensayó frente a cada dilución de FX, sin contener
15 un conjunto de columnas FT/FVIIa añadido (es decir FX solo). Las placas se mezclaron agitando. La fluorescencia se midió a lo largo del tiempo con un espectrafluorímetro preparado para leer cada 30 segundos durante 1 hora a 37 ºC (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, Punto de corte: 435 nm), y el tiempo se presentó en unidades de tiempo cuadráticas. Después del ensayo, se generó una curva patrón de fluorescencia de AMC en el mismo lector de placas para convertir de unidades de fluorescencia a M de sustrato liberado en el ensayo. Se diluyó 1 AMC 1 mm en DMSO
20 (Invitrogen) a 0,02 mM en tampón de ensayo 1x. Se realizaron seis diluciones en serie dobles del AMC que variaban de 20 nM a 0,625 nM en tampón de ensayo 1x. Se midió la fluorescencia del AMC usando las mismas condiciones de ensayo que se han descrito anteriormente y se representó una gráfica de fluorescencia frente a concentración de AMC. Se calculó la pendiente de la línea, que actuó como el factor de conversión para UFR a M en cálculos posteriores.
25 Se calcularon las constantes cinéticas para activación por FVIIa de FX realizando análisis de regresión lineal en la inversa de la concentración de sustrato frente a la inversa de la velocidad de escisión de sustrato (en unidades de segundos2), con V calculada como la inversa de la ordenada en el origen, Km, FVIIa como la pendiente en la ordenada en el origen, y Vmáx/ Km, FVIIa como la inversa de la pendiente. El valor de kcat se derivó después usando la
30 ecuación:
Kcat/Km, FVIIa = Vmáx/Km, FVIIa x 1/(0,5 x k2 x [FVIIa en M] x (UFR/factor de conversión M))
donde k2 = ([S] x kcat, FXa)/(Km, FXa + [S]), donde kcat, FXa y Km, FXa son las constantes para escisión de FXa de 35 SpectrofluorXa determinado experimentalmente usando patrones de FXa como kcat, FXa = 117 s-1, y Km, FXa = 164 M.
Usando las condiciones de ensayo anteriores, se determinó que la constante cinética k2 era de 88,1 s-1 .
La Km y kcat para cada una de las variantes de FVIIa se determinó para evaluar la actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1) 40 de cada uno para su sustrato, FX (Tabla 14). Se evaluó la proteasa FVIIa de tipo silvestre y se descubrió que
M-1 -1
mostraba una actividad de 1,8 x 107 s. La activación por el factor VIIa del Factor X, como se mide en Krishnaswamy, et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273: 8 4378-86) es de 2,9 X 107 M-1s-1 .
B. Análisis de la actividad catalítica de variantes de FVIIa para el sustrato, Factor X
45 La actividad catalítica de las variantes de FVIIa para el sustrato, Factor X (FX), se evaluó indirectamente en dos tipos de ensayos cromogénicos ensayando con respecto a la actividad de FXa, generado tras la activación por FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa. Los dos ensayos se realizaron bien en presencia o bien en ausencia de factor tisular lipidado, para evaluar la actividad tanto dependiente de FT como independiente de FT. Las variantes
50 de FVII se expresaron, purificaron y activaron a FVIIa como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Aunque la mayoría de las variantes de FVII se expresaron solamente en células 293-F Freestyle™, algunas también se expresaron en células BHK-21.
Ensayo indirecto dependiente de factor tisular lipidado
55 Se evaluó la actividad catalítica de las variantes de FVII en presencia del factor tisular usando el ensayo descrito en la sección A del Ejemplo 4, anterior, con modificaciones menores. Una de dichas modificaciones fue el uso de una proteasa de sustrato de Factor X que se había tratado con ERG-CMK y FFR-CMK para reducir la actividad de fondo (Molecular Innovations). Se realizaron dos tipos de análisis de datos usando dos ensayos separados; un ensayo de
60 análisis de intervalo lineal y un ensayo de análisis de intervalo hiperbólico. El ensayo de análisis de intervalo lineal usó un intervalo de concentraciones de Factor X entre 0 y 150 nM para asegurar una medición precisa de las constantes cinéticas en el intervalo lineal de la curva de dosis. Por el contrario, el ensayo de análisis de intervalo hiperbólico usó un intervalo de concentraciones de Factor X entre 0 y 1,44 M para asegurar la medición precisa de las constantes cinéticas con una curva de dosis de saturación (hiperbólica).
65 El ensayo indirecto de factor tisular lipidado con análisis de datos de intervalo lineal se realizó esencialmente como se describe en la sección A del Ejemplo 4, anterior, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de FVIIa/FT se prepararon como soluciones de FVIIa 0,1 nM/FT 0,4 nM y se incubaron durante 30 minutos antes de diluirse dos veces en FT 0,4 nM hasta una solución que contenía FVIIa 1,5625 pM/FT 0,4 nM. Se mezclaron
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5 veinticinco l de la solución de FVIIa/FT con 25 l de una solución de sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de 300 nM, 200 nM, 133,3 nM, 88,9 nM, 59,3, 39,5 nM, 36,3 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron de FVIIa 0,8 pM, FT 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM y Factor X 150 nM, 100 nM, 66,7 nM, 44,4 nM, 29,6 nM, 19,8 nM, 13,2 nM o 0 nM (Molecular Innovations) en 50 l/pocillo. La curva patrón de AMC, que actuó como el factor de conversión para UFR a M en cálculos posteriores, se expandió para incluir un intervalo de dosis que abarcaba AMC de 0 M a 100 M.
El ensayo indirecto de factor tisular lipidado con análisis de datos de intervalo hiperbólico se realizó esencialmente como se ha descrito en la sección A del Ejemplo 4, anterior, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de FVIIa/FT se prepararon como soluciones de FVIIa 0,1 nM/FT 0,4 nM y se incubaron durante 30 minutos
15 antes de diluirse dos veces en FT 0,4 mM hasta 1,5625 pM (o 0,78 pM para proteasas que se esperaba que tuvieran alta actividad) de FVIIa/FT 0,4 nM. Se mezclaron veinticinco l de la solución de FVIIa/FT con 25 l de una solución de sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de 1440 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron de FVIIa 0,8 (o 0,39) pM, FT 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM y Factor X 7 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM, 11,25 nM o 0 nM (Molecular Innovations) en 50 l/pocillo. Los parámetros de kcat y Km se calculan usando la ecuación hiperbólica de Michaelis Menten de la forma (Vmáx/(1+(Km/x))). La curva patrón de AMC, que actuó como el factor de conversión para UFR a M en cálculos posteriores, se expandió para incluir un intervalo de dosificación que abarcaba AMC de 0 M a 100  M.
25 Para determinar las constantes de tasa cinética para la activación por FVIIa o variante de FVIIa de FX, los datos sin procesar recogidos con la aplicación SoftMax Pro (Molecular Devices) se exportaron como archivos.XML. Se realizaron análisis lineales y no lineales de datos adicionales con XLfit4, un paquete software para ajuste de curvas automático y análisis estadístico dentro del ambiente de hojas de cálculo de Microsoft Excel (Software IDBS).
Para datos recogidos usando el ensayo de intervalo lineal, las constantes cinéticas kcat/Km (M-1s-1) se calculan directamente a partir de la pendiente de análisis de regresión lineal de la concentración de FX frente a la velocidad de la escisión de sustrato fluorogénico (en M/s2) donde kcat/Km = pendiente/[FVIIa] x0,5xk2. Se determinó que el factor de corrección k2 era 45 usando el método descrito en la sección A del Ejemplo 4 y constantes cinéticas para escisión de FXa de Spectrofluor FXa de kcat,FXa = 56 s-1 y Km,FXa = 126 nM, determinado experimentalmente con FX
35 activado (FXa) que se valoró por sitio activo previamente con AT-III/heparina. Los puntos de datos de exclusión que dieron como resultado valores de R2 menores de 0,98 aseguraron la linealidad de los conjuntos de datos usados en la rutina de ajuste.
Los análisis de datos recogidos usando el ensayo de intervalo hiperbólico se calcularon a partir de análisis de regresión no lineal de la concentración de FX frente a la velocidad de la escisión de sustrato fluorogénico (en M/s2). Los parámetros de kcat y Km individuales se calculan como parámetros de ajuste usando la ecuación hiperbólica de Michaelis Menten de la forma (Vmáx(1+(Km/x))) donde kcat = Vmáx/[FVIIa] x0,5xk2. La constante cinética, kcat/KM se calculó a partir de los parámetros ajustados individuales kcat y Km.
45 Ensayo indirecto independiente de factor tisular
La actividad catalítica de las variantes de FVIIa en presencia de factor tisular se evaluó en un ensayo directo similar al descrito anteriormente excepto que no se incluyó factor tisular en el ensayo. Por lo tanto, el ensayo para evaluar la actividad independiente de FT se realizó esencialmente como se ha descrito anteriormente, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de FVIIa se diluyeron a 50 nM (o 5 nM para variantes que se esperaba que tuvieran alta actividad independiente de FT). Se mezclaron veinticinco l de cada solución de FVIIa con 25 l de una solución de sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de 1050 nM, 700 nM, 466,7 nM, 311,1 nM, 207,4 nM, 138,3 nM, 92,2 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron de FVIIa 25 nM (o 2,5 nM para variantes de alta actividad),
55 Spectrofluor FXa 0,5 mM y Factor X 525 nM, 350 nM, 233,3 nM, 155,6 nM, 103,7 nM, 69,1 nM, 46,1 nM o 0 nM (Molecular Innovations) en 50 l/pocillo. Se realizaron análisis de datos como se ha descrito para el ensayo de intervalo lineal, anteriormente sin modificaciones.
La Tabla 14 proporciona la actividad catalítica de variantes de FVIIa como se mide en Ensayo Indirecto dependiente de FT usando polipéptidos de FVIIa expresados a partir de células 293-F y células BHK-21, y la actividad catalítica como se mide en un ensayo indirecto independiente de FT usando polipéptidos de FVIIa expresados a partir de células 293-F y/o células BHK-21. Los resultados se presentan como la constante cinética para la actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1), y también se expresan como un porcentaje de la actividad del FVIIa de tipo silvestre, donde la actividad es actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1) de cada variante de FVIIa para su sustrato, FX. El uso del 65 análisis de datos de intervalo lineal o hiperbólico también se indica para los valores presentados en las tablas. No
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todas las variantes de FVIIa se ensayaron en cada ensayo. Varias variantes de FVIIa mostraron actividad catalítica aumentada en comparación con la molécula de FVIIa de tipo silvestre. Por ejemplo, el polipéptido de FVIIa que contenía solamente la mutación Q286R (Q286R-FVIIa), tiene una actividad catalítica de entre 2 y 3 veces la de FVIIa de tipo silvestre, y el polipéptido de FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q (Q286R/M298Q-FVIIa), tienen actividad catalítica de más de 3 veces la de FVIIa de tipo silvestre.
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En un conjunto adicional de experimentos, la actividad catalítica de polipéptidos de FVIIa producidos en células BHK-21 se analizó usando los ensayos indirectos independientes de FT y dependientes de FT descritos anteriormente con modificaciones menores. Se produjeron varias variantes en células CHOX además de células BHK-21 o exclusivamente en células CHOX. Las variantes se ensayaron en condiciones idénticas 5 independientemente de la línea celular usada. Para el ensayo catalítico dependiente de FT (usando análisis lineal), los polipéptidos de FVIIa se valoraron en primer lugar en sitio activo con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB) para determinar la concentración de FVIIa, como se describe en el Ejemplo 12, posterior. Para maximizar el número de puntos de datos en el intervalo lineal, la concentración máxima de FX en el ensayo se ajustó a 25 nM (es decir 0-25 nM en lugar de 0-150 nM). El FX usado en el ensayo se activó (es decir FXa) y se valoró con 10 fluoresceína-mono-p’-guanidinobenzoato (FMGB), como se describe en el Ejemplo 15, posterior. Las constantes cinéticas para escisión de sustrato de Spectrafluor FXa se determinaron en este FXa valorado en sitio activo y se demostró que eran: Km de 190,2 M y una kcat de 340 s-1. La diferencia primaria está en kcat y se debe principalmente a las determinaciones de sitio activo mejoradas. Estos parámetros proporcionan un valor de factor de corrección k2 revisado de 246,4 que se usa en el análisis lineal para determinar la actividad catalítica de los polipéptidos de FVIIa
15 en presencia de FT.
Para el ensayo catalítico independiente de FT, los polipéptidos de FVIIa se valoraron en primer lugar en sitio activo con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB) para determinar la concentración de FVIIa, como se describe en el Ejemplo 12, posterior. El FX usado en el ensayo se activó (es decir FXa) y se valoró con fluoresceín-mono-p’
20 guanidinobenzoato (FMGB), como se describe en el Ejemplo 15. Las constantes cinéticas para escisión de sustrato de Spectrafluor FXa se determinaron en este FXa valorado en sitio activo y se demostró que eran: Km de 190,2 M y una kcat de 340 s-1. Estos parámetros proporcionan un valor del factor de corrección k2 revisado de 246,4 que se usa en el análisis para determinar la actividad catalítica de los polipéptidos de FVIIa en ausencia de FT.
25 La Tabla 15 expone la actividad catalítica de cada uno de los polipéptidos variantes de FVIIa ensayados. Los resultados se presentan como la constante cinética para actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1), y también se expresan
-
como un porcentaje de la actividad del FVIIa de tipo silvestre, donde la actividad es actividad catalítica, kcat/Km (M-1s 1) de cada variante de FVIIa para su sustrato, FX. La desviación típica (DT), el coeficiente de variación (como porcentaje; %CV) y el número de ensayos realizados (n) también se proporcionan. Algunas de las variantes 30 presentadas aumentaron notablemente la actividad catalítica en comparación con el polipéptido de FVII de tipo silvestre. Por ejemplo, la variante de intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q mostró una actividad catalítica dependiente de FT más de 6 veces la del polipéptido de FVII de tipo silvestre. La actividad catalítica aumentada de las variantes de FVIIa fue más pronunciada en el ensayo independiente de FT. Por ejemplo, las variantes de intercambio de Gla FIX/Q366V tuvieron más de 9 veces más actividad catalítica que FVIIa de tipo silvestre, las
35 variantes Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q, {Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Intercambio de Gla FIX/K43I}/ Q286R/M298Q, y {Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q tuvieron más de 70-80 veces más actividad catalítica que FVIIa de tipo silvestre, y la variante S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q tuvo más de 220 veces más actividad catalítica que FVIIa de tipo silvestre.
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Ejemplo 5
Determinación de la inhibición de FVIIa FT o FVIIa por AT-III/heparina
5 La potencia de la interacción entre el complejo de AT-III/heparina y FVIIa en presencia o ausencia de factor tisular soluble (FTs), es decir dependiente de FT o independiente de FT, se evaluó midiendo el nivel de inhibición de diversas concentraciones de AT-III en la actividad catalítica de FVIIa/FTs hacia un sustrato, Mesil-FPR-ACC. El valor de K0,5 se determinó para cada variante de FVIIa ensayada, que corresponde a la concentración molar de AT-III que se requirió para inhibición del 50 % (CI50) de la variante de FVIIa en un ensayo de 30 minutos a temperatura ambiente (25 º).
Se prepararon dos ensayos separados, uno con FTs y uno sin FTs. Se preparó una solución 2 M de AT-III/heparina (heparina 5 M final) mezclando 26,4 l de AT-III 151,7 M (AT-III humana purificada en plasma; Molecular Innovations) con 50 l de heparina BPM 0,2 mM (CalBiochem), 400 l de tampón de ensayo 5x (Hepes 100 mM, 15 NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05 %, PEG 8000 0,5 %, pH 7,4) y 1,523 ml de agua de uso en reactivos. Esta solución fue para su uso como la mayor concentración en el ensayo dependiente de FT. Se preparó una solución que contenía AT-III/heparina 4 M (heparina 5 M final) para su uso en el ensayo independiente de FT mezclando 52,8 l de AT-III 151,7 M (Molecular Innovations) con 50 l de heparina BPM 0,2 mM (CalBiochem), 400 l de tampón de ensayo 5x y 1,497 ml de agua de uso en reactivos. Las soluciones de AT-III/heparina se incubaron durante 5-10 minutos a temperatura ambiente y después se diluyeron dos veces en una placa de polipropileno de 96 pocillos profundos con un volumen final de 1 ml que contenía heparina 5 M, dando como resultado diluciones de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 y 0 nM, o 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, y 0 nM. Las variantes de FVIIa y FVIIa de tipo silvestre se diluyeron a 250 nM en tampón de ensayo 1x (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %, PEG 8000 0,1 %, pH 7,4). Para el ensayo dependiente de FT, se formaron complejos de FVIIa 5 25 nM/FTs 50 nM mezclando 20 l de FVIIa con 10 l de FTs 5 M (Factor de Coagulación Humana de R&D Systems
III: nº 2339-PA), 200 l de tampón de ensayo 5x y 770 l de agua de uso en reactivos e incubando las soluciones durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Para el ensayo independiente de FT, se mezclaron 100 l de FVIIa con 200 l de tampón de ensayo 5x y 700 l de agua de uso en reactivos para producir soluciones 25 nM de FVIIa. Para comenzar el ensayo, se mezclaron por separado 25 l de las soluciones de FVIIa/FT o FVIIa solamente con 25 l de cada dilución de AT-III/heparina en pocillos de una placa de ensayo de área media negra de 96 pocillos (Nunc). Las condiciones de ensayo finales para el ensayo dependiente de FT fueron FVIIa 2,5 nM/FTs 25 nM y las concentraciones de AT-III/heparina que variaban de 1000 nM a 0 nM. Para el ensayo independiente de FT, las concentraciones de FVIIa fueron FVIIa 12,5 nM y las concentraciones de AT-III/heparina variaron de 2000 nM a 0 nM. Las placas se incubaron durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente (25 ºC).
35 Se preparó una solución de reserva de sustrato de FVIIa (Mesil-FPR-ACC) disolviendo el sustrato en DMSO a 20 mM y preparando después una solución de trabajo de 0,5 mM en tampón de ensayo 1x. Después de incubación de la placa de ensayo anterior, se añadieron 50 l del sustrato de FVIIa a cada pocillo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la actividad residual de FVIIa se evaluó siguiendo las tasas iniciales de escisión de sustrato durante 15 minutos en un lector de fluorescencia ajustado a 30 ºC.
Para determinar el grado de inhibición por AT-III/heparina para FVIIa o variantes de FVIIa, los datos sin procesar recogidos con la aplicación SoftMax Pro (Molecular Devices) se exportaron como archivos.XML. Se realizaron análisis de datos no lineales adicionales con XLfit4, un paquete de software para ajuste de curvas automático y 45 análisis estadístico dentro del ambiente de hoja de cálculo de Microsoft Excel (IDBS Software). La plantilla de hoja de cálculo se usó para calcular la serie de diluciones de AT-III, relación de AT-III con respecto a FVIIa, y las relaciones de Vi/Vo para cada repetición de FVIIa en cada concentración de AT-III experimental. Los análisis de regresión no lineal de actividad de FVIIa residual (expresada como Vi/Vo) frente a concentración de AT-III se procesaron usando ng XLfit4 y una ecuación de inhibición hiperbólica de la forma ((C+(Amp*(1-(X/(K0,5+X))))); donde C = la compensación (fijada en 0 para permitir la extrapolación de conjuntos de datos que no alcanzan el 100 % de inhibición en el transcurso del ensayo), Amp = la amplitud del ajuste y K0,5, que corresponde a la concentración de AT-III requerida para inhibición semimáxima en las condiciones de ensayo. Para varias variantes de FVIIa, AT-III inhibió menos del 20-25 % de la actividad proteasa total a la mayor concentración ensayada de AT-III, lo que representa un límite superior de detección para el ensayo. Se asignó por lo tanto a variantes con menos de 20-25 %
55 de inhibición máxima un valor de K0,5 de límite inferior (5 M para dependiente de FT y 10 M para independiente de FT) y en la mayoría de los casos se esperaba que tuvieran resistencias a AT-III mayores que el valor indicado.
Las Tablas 16 y 17 proporcionan los resultados de los ensayos que se realizaron usando variantes de FVIIa expresadas en células 293-F Freestyle TM y/o células BHK-21, en presencia y ausencia de FT, respectivamente. Los resultados se presentan tanto como el parámetro de K0,5 ajustado como una representación del alcance de la resistencia a AT-III para cada variante en comparación con el FVIIa de tipo silvestre expresado como una relación de sus valores de K0,5 ajustados (K0,5 variante/K0,5 tipo silvestre). Varias variantes de FVIIa mostraron resistencia aumentada a AT-III en comparación con FVIIa de tipo silvestre. Por ejemplo, Q286R-FVIIa (es decir FVIIa que contiene la mutación Q286R), Q286R/S222A-FVIIa, Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX-FVIIa, 65 A175S/Q286R/Q366V-FVIIa, Q286M-FVIIa, Q286L-FVIIa y Q286Y-FVIIa están entre el grupo que mostró resistencia
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a AT-III en ausencia de FT que era más de 4 veces mayor que la de FVIIa de tipo silvestre.
Tabla 16. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en presencia de FT
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII Dependiente de FT
Células 293-F
Células BHK-21
K0,5 (nM)
K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt
WT
WT
72,3 1,0 56,0 1,0
V158D/E296V/M298Q
V21D/E154V/M156Q 75,1 1,0 79,0 1,4
Q286R
Q143R 60,6 0,8 59,1 1,1
S222A
S82A 47,6 0,7 43,9 0,8
H257S
H117S 50,6 0,7 52,9 0,9
H373D
H224D 423,6 5,9
H373E
H224E 152,1 2,1
H373S
H224S 64,2 0,9
H373F
H224F 38,7 0,5
H373A
H224A 76,9 1,1
Q366D
Q217D 2239,2 31,0
Q366E
Q217E 116,2 1,6
Q366N
Q217N 75,3 1,0
Q366T
Q217T 57,5 0,8
Q366S
Q217S 107,2 1,5
Q366V
Q217V 25,8 0,4 20,0 0,4
A175S
A39S 112,4 1,6
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 48,2 0,7
Q286R/S222A
Q143R/S82A 53,3 1,0
Q286R/S222A/ Intercambio de Gla FIX
Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 83,7 1,2
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 74,2 1,3
Q286R/M298Q/K341Q
Q143R/M156Q/K192Q 21,8 0,4
Q286R/M298Q/K199E
Q143R/M156Q/K60cE 101,1 1,8
P321K
P170iK 97,5 1,7
P321E
P170iE 66,0 1,2
P321Y
P170iY 49,5 0,9
P321S
P170iS 60,7 1,1
T239S
T99S 254,6 3,5
T239Q
T99Q 117,2 2,1
T239V
T99V 42,5 0,8
T239L
T99L 81,1 1,4
T239H
T99H 52,0 0,9
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Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII Dependiente de FT
Células 293-F
Células BHK-21
K0,5 (nM)
K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt
T239I
T99I 125,3 2,2
H257A/M298Q
H117A/M156Q 89,1 1,6
S222A/H257A/Q286R/ M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 66,6 0,9
Q286R/Q366V
Q143R/Q217V 62,0 1,1
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 72,0 1,3
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 38,5 0,7
Q286M
Q143M 53,1 0,7
Q286L
Q143L 114,4 1,6
Q286Y
Q143Y 131,3 1,8
Q366I
Q217I 23,2 0,3
Q366L
Q217L 23,0 0,3
Q366M
Q217M 35,4 0,5

Tabla 17. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a AT-III Dependiente de FT
Células 293-F
Células 293-F
K0,5 (nM)
K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt
WT
WT
2265 1,0 2222 1,0
V158D/E296V/M298 Q
V21D/E154V/M156Q 389 0,2 415 0,2
Q286R
Q143R 10000 >4,4 10000 >4,5
S222A
S82A 2338 1,0 2088 0,9
H257S
H117S 5884 2,6 5584 2,5
H373D
H224D 10000 >4,4
H373E
H224E 6949 3,1
H373S
H224S 9513 4,2
H373F
H224F 1306 0,6
H373A
H224A 10000 >4,4
Q366D
Q217D 10000 >4,4
Q366E
Q217E 6901 3,0
Q366N
Q217N 5186 2,3
Q366T
Q217T 5885 2,6
Q366S
Q217S 10000 >4,4
Q366V
Q217V 487 0,2 531 0,2
A175S
A39S 5785 2,6
imagen126
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a AT-III Dependiente de FT
Células 293-F
Células 293-F
K0,5 (nM)
K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 2926 1,3
Q286R/S222A
Q143R/S82A 10000 >4,5
Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX
Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 10000 >4,4
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 3663 1,6
Q286R/M298Q/K341Q
Q143R/M156Q/K192Q 72
Q286R/M298Q/K199E
Q143R/M156Q/K60cE 5182 2,3
P321K
P170iK 5274 2,4
P321E
P170iE 3666 1,6
P321Y
P170iY 705 0,3
P321S
P170iS 2689 1,2
T239S
T99S 10000 >4,4
T239Q
T99Q 2222 1,0
T239V
T99V 2644 1,2
T239L
T99L 8532 3,8
T239H
T99H 10000 >4,5
T239I
T99I 10000 >4,5
H257A/M298Q
H117A/M156Q 1344 0,6
S222A/H257A/Q286 R/M298Q
S82A/H117A/Q143R/ M156Q 7742 3,4
Q286R/Q366V
Q143R/Q217V 2251 1,0
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 10000 >4,5
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 3398 1,5
Q286M
Q143M 10000 >4,4
Q286L
Q143L 10000 >4,4
Q286Y
Q143Y 10000 >4,4
Q366I
Q217I 599 0,3
Q366L
Q217L 1708 0,8
Q366M
Q217M 914 0,4
Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente con modificaciones menores. Se usó heparina no fraccionada, de longitud completa (Calbiochem) en lugar de heparina de bajo peso molecular (heparina
5 BPM) para aumentar la velocidad de la reacción de inhibición (véase, por ejemplo, Olson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939). El tiempo de incubación del ensayo se aumentó a 60 minutos, y la concentración del sustrato de mesil-FPR-ACC usado para determinar la actividad residual se aumentó hasta una concentración final de 0,5 mM.
10 La Tabla 18 proporciona los resultados de los ensayos que se realizaron en ausencia de FT usando variantes de FVIIa expresadas en células BHK-21 y células CHOX. Los resultados se presentan tanto como el parámetro K0,5 ajustado como como una representación del alcance de la resistencia AT-III para cada variante en comparación con el FVIIa de tipo silvestre expresado como una relación de sus valores de K0,5 ajustados (K0,5 mutante/K0,5 tipo silvestre). La desviación típica (DT) y el número de ensayo (n) también se muestran.
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Ejemplo 6
Evaluación in vivo de la actividad procoagulante del polipéptido de FVIIa
5 Se establecieron modelos de ratón de hemofilia A para evaluar la actividad procoagulante de polipéptidos de FVIIa. Se indujo hemofilia A en ratones CD-1 por administración intraperitoneal de anticuerpos anti FVII, seguido de retirada quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado. También se usaron ratones deficientes en FVII (ratones FVIII-/-), pero no se trataron con anticuerpos anti FVIII. Los ratones se trataron después con polipéptido de FVIIa y se midió la cantidad de sangre perdida en 20 minutos para determinar la actividad procoagulante de los polipéptidos de FVIIa.
A. Evaluación in vivo de la actividad procoagulante de FVIIa de tipo silvestre
Se estableció un modelo de ratón de hemofilia A para evaluar la actividad procoagulante de polipéptidos de FVIIa.
15 Se indujo hemofilia A en ratones CD-1 mediante la administración de anticuerpos anti FVII, seguido de la retirada quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado. Los ratones se trataron después con polipéptido de FVIIa y se midió el tiempo que se tardaba en detener el sangrado, y la cantidad de sangre perdida durante este tiempo, para determinar la actividad procoagulante de los polipéptidos de FVIIa.
Los ratones CD-1 macho se anestesiaron por administración intraperitoneal tanto de tiobarbital sódico a 100 mg/kg como de ketamina a 100 mg/kg. Se administró lidocaína por inyección subcutánea en el cuello ventral para reducir la sensibilidad. La tráquea y la arteria carótida se canularon a través de una pequeña incisión cutánea en el cuello para facilitar la respiración sin restricciones y la administración de anticuerpo anti Factor VIII, Factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa) y/o polipéptidos de FVII modificados.
25 Se administró a los ratones con cánulas 3,76 mg de anticuerpo de oveja anti FVIII humano (Affinity Biologicals, lote IG129R4, 612 UB de ratón/ml) en 40 l. Esta dosis se determinó realizando un experimento de respuesta a dosis inicial con el anticuerpo (usando 0,376, 0,94, 1,88 y 3,76 mg de anti FVIII humano), y evaluando la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado. Después de 20 minutos, las colas de los ratones se colocaron en tubos de 15 ml que contenían solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 39 ºC durante un periodo de 10 minutos. A los 30 minutos, las colas se retiraron brevemente de la solución de PBS y se cortaron los últimos 5 mm de las colas para iniciar el sangrado. Se anotó el tiempo en el que comenzó el sangrado. Las colas se devolvieron después al tubo que contenía PBS a 39 ºC y se permitió que sangraran durante 5 minutos (presangrado) para asegurar que los ratones había respondido al anticuerpo anti FVIII. Después del presangrado, se administraron a los ratones
35 polipéptidos de FVIIa o el vehículo en el que las proteínas de FVIIa se prepararon y suministraron. Los polipéptidos de FVIIa se diluyeron en PBS o un tampón compuesto de cloruro sódico 52 mM, cloruro cálcico deshidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polisorbato 80 0,01 % y manitol 165 mM. Las preparaciones de FVIIa se administraron a 1, 3 o 10 mg/kg, en un volumen equivalente a 3 ml/kg, a través de las cánulas carótidas y las colas se colocaron en tubos nuevos que contenían PBS a 39 ºC. El sangrado se controló durante un periodo de 20 minutos y se anotaron los tiempos en los que se detuvo el sangrado. El tiempo de sangrado total se calculó como la suma de la duración de sangrado durante el presangrado, y la duración del sangrado después de la administración de polipéptidos de FVIIa, o PBS o tampón.
Para determinar la cantidad de sangre perdida durante los episodios de sangrado, se ensayaron los contenidos de
45 los tubos de 15 ml con respecto a contenido de hemoglobina. Se diluyó Triton X-100 1 en 4 en agua estéril y se añadieron 100 l a 1 ml de las muestras para provocar hemolisis. La absorbancia de las muestras se midió después a una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de sangre perdida, se leyó la absorbancia frente a una curva patrón generada midiendo la absorbancia a 546 nm de volúmenes conocidos de sangre murina, diluida en PBS y hemolisada como anteriormente con Triton X 100.
Se realizó un experimento que comparaba rhFVIIa generado como se ha descrito anteriormente con el FVIIa humano recombinante disponible en el mercado (NovoSeven®, Novo Nordisk) y se evaluó la pérdida de sangre después de la administración de una dosis de 3 mg/kg de cada proteína. La pérdida de sangre en el grupo de vehículo (tampón, n = 15) fue de 671,9  57,89 l durante el periodo de 20 minutos. Esto se redujo por el rhFVIIa
55 producido por Catalyst Biosciences hasta 264,1  56,59 l y por NovoSeven® hasta 273,7  53,93 l (n = 14). Este experimento demostró la equivalencia entre las dos proteínas.
B. Análisis de la actividad coagulante de variantes de FVIIa en ratones CD-1 con hemofilia A inducida
Se llevaron a cabo experimentos iniciales para determinar la dosis requerida y el tiempo y duración del efecto de anticuerpos anti FVIII humano cuando se proporcionaron por la vía intraperitoneal para inducir hemofilia en ratones CD-1. Para el primer lote de anti FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), esta se basó inicialmente en la dosis usada para los experimentos de canulación, descritos anteriormente. La dosis que se determinó que provocaba un estado hemofílico (sangrado descontrolado durante un periodo de ensayo de 20 minutos) fue de 7,54
65 mg/ratón (80 l de una solución de reserva de 94,25 mg/ml). Este lote tuvo una actividad neutralizante de 612 UB de ratón/ml. Para el segundo lote de anti FVIII humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, actividad neutralizante de 474 UB de ratón/ml), la dosis usada fue de 11,98 mg/ratón (120 l de una solución de reserva 99,8 mg/ml) y se administró a las 6 horas antes del corte de la cola.
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5 Para inducir hemofilia, se dosificó a ratones CD-1 macho (25-35 g) por vía intraperitoneal el lote 1 o el lote 2 de anti FVIII antes del experimento. Se anestesiaron ratones macho CD-1 y FVIII-/-por administración intraperitoneal de un cóctel de ketamina/xilacina (45 mg/ml y 3,6 mg/ml, respectivamente, en solución salina) y se colocaron en una plataforma caliente (39 ºC) para asegurar que no había descenso de la temperatura corporal. La habitación del procedimiento se mantuvo a una temperatura de 27,78 ºC. Diez minutos antes del corte de la cola la cola se
10 sumergió en 10 ml de PBS precalentado (tubo de centrífuga de 15 ml; 39 ºC). Se inyectaron a de ocho a diez ratones polipéptidos de FVIIa humano recombinante (Novoseven®, Novo Nordisk) o FVII modificado diluidos en un tampón compuesto de cloruro sódico 52 mM, cloruro cálcico deshidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polisorbato 80 0,01 % y manitol 165 mM a través de la vena de la cola en una única inyección. También se inyectó solamente vehículo en un grupo de ratones como control. Si no se realizó la inyección, el animal se excluyó del estudio. Se
15 realizó una inyección con polipéptido de FVIIa o vehículo 5 minutos antes del corte de la cola. Se realizó un corte de la cola usando una cuchilla a 5 mm del final de la cola y se recogió sangre en PBS durante un periodo de 20 minutos. Al final del periodo de recogida, se evaluó la pérdida de sangre total. Los tubos de recogida se mezclaron y se tomó una alícuota de 1 ml de cada muestra y se ensayó con respecto al contenido de hemoglobina. Se diluyó Triton X-100 1 en 4 enagua estéril y se añadieron 100 l a las muestras de 1 ml para provocar hemolisis. La
20 absorbancia de las muestras se midió después a una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de sangre perdida, se leyó la absorbancia frente a una curva patrón generada midiendo la absorbancia a 546 nm de volúmenes conocidos de sangre murina, diluida en PBS y hemolisada como anteriormente con Triton X 100.
1. Estudio de respuesta a dosis que evalúa la actividad coagulante de FVIIa de tipo silvestre
25 También se realizó un estudio de respuesta a dosis en el que se evaluó FVIIa de tipo silvestre 0,3, 1 o 3 mg/kg. Los ratones que recibieron el vehículo perdieron 1002,3  60,71 l en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo significativamente en ratones a los que se administraron 3 mg/kg de FVIIa de tipo silvestre, a 415,5  90,85 l (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 mg/kg dio como resultado
30 pérdida de sangre de 679,57  83,95 l y una dosis menor de 0,3 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 852,42  94,46 l.
2. Análisis inicial de la actividad coagulante de variante de FVIIa
35 Se usó la inyección de solamente vehículo como control. Los ratones que recibieron el vehículo solamente perdieron 915,2  105,6 l en el ensayo de 20 minutos, que se redujo a 352  99,86 l (media  E.T.M) si se administró a los ratones FVIIa humano recombinante. La cantidad de sangre perdida se redujo aún más a 165,8  48,41  l si se administró al ratón Q286R-FVIIa (es decir FVIIa que contiene la mutación Q286R), a 141,3  43,77 l con Q286R/M298Q-FVIIa o a 129,5  36,64 l con V158D/E296V/M298Q-FVIIa. Los ratones a los que se administró
40 S222A-FVIIa también mostraron pérdida de sangre reducida (a 225,7  62,75 l) en comparación con ratones a los que se administró FVIIa de tipo silvestre. La administración de Intercambio de Gla FIX-FVIIa, Q366V-FVIIa o A122N/G124S-FVIIa dio como resultado aproximadamente la misma cantidad de pérdida de sangre que la observada en ratones a los que se proporcionó FVIIa humano (334,6  54,95 l, 321,7  102,6 l y 329,8  83,91 l respectivamente), mientras que los ratones a los que se administró H257A-FVIIa, S222A/Q286R-FVIIa o H257A
45 FVIIa parecían tener una pérdida de sangre ligeramente mayor (390  107 l, 447,3  127,7 l y 443,7  139,5 l respectivamente).
3. Respuesta a dosis que evalúa la actividad coagulante de variante de FVIIa
50 Un estudio de respuesta a dosis en el que se administró a los ratones 0,1, 0,3, 1 o 3 mg/kg de Q286R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa o V158D/E296V/M298Q-FVIIa. Los ratones que recibieron el vehículo solamente perdieron 915,2  105,6 l de sangre en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo significativamente en ratones a los que se administraron 3 mg/kg de cualquiera de Q286R-FVIIa (141,3  43,77 l), S222A-FVIIa (225,7  62,75 l) o Q286R/M298Q-FVIIa (129,5  36,64 l) (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La
55 reducción de la dosis a 1 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 641  96,48 l en ratones que recibieron Q286R-FVIIa y 487,92  92,07 l en ratones que recibieron S222A-FVIIa. Dosis menores de esta variante de FVIIa dieron como resultado aproximadamente la misma pérdida de sangre (817,71  107,94 l y 900,34  115,77 l para Q286R-FVIIa y S222A-FVIIa respectivamente) como se observó en ratones que recibieron el control de vehículo. Por el contrario, los ratones que recibieron Q286R/M298Q-FVIIa 1 mg/kg tuvieron una pérdida de sangre
60 significativamente reducida (69,36  15,55 l) en comparación con los ratones de control solo de vehículo. A dosis menores de 0,3 mg/kg y 0,1 mg/kg, la pérdida de sangre fue de 538,3  94,04 l y 664  121,6 l, respectivamente. Los ratones que recibieron 0,3, 1 y 3 mg/kg de V158D/E296V/M298Q-FVIIa tuvieron un pérdida de sangre de 754,49  121,6 l, 481,95  114,22 l y 133,25  50,09 l respectivamente.
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Se llevaron a cabo estudios de respuesta a dosis adicionales para Q286R-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa y V158D/E296V/M298Q-FVIIa y los datos se combinaron con los anteriores. En los experimentos que evalúan el efecto de Q286R-FVIIa, el grupo que recibió el vehículo perdió 833,61  73,95 l de sangre. Esto se redujo significativamente a 196,71  49,18 l en ratones que se trataron con 3 mg/kg de Q286R-FVIIa. La reducción de la 5 dosis a 1 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 577,78  66,29 l. Cuando se dosificó a los ratones 0,1 y 0,3 mg/kg de Q286R-FVIIa la pérdida de sangre producida fue similar al valor de control de vehículo (739,58  104,28 l y 806,63  65,17 l, respectivamente). En los experimentos que evalúan el efecto de Q286R/M298Q-FVIIa, el grupo de vehículo produjo pérdida de sangre de 902,42  88,04 l, lo que se redujo significativamente por el tratamiento tanto con 1 como 3 mg/kg de Q286R/M298Q-FVIIa a 145,17  38,89 l y 140,76  33,36   121,62 l y 551,94  67,60 l respectivamente. En los experimentos que evalúan V158D/E296V/M298Q-FVIIa el grupo de control de vehículo demostró pérdida de sangre de 966,64  57,97 l, que se redujo significativamente por el tratamiento con V158D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg a 128,19  27,73 l. La reducción de la dosis a 1 mg/kg condujo a pérdida de sangre de 565,50  65,78 l y la reducción de la dosis adicionalmente a 0,3 y 0,1 mg/kg
15 produjo pérdida de sangre que fue similar al grupo de control (811,16  71,87 l y 893,62  106,73 l). Se realizó análisis estadístico por Kruskal Wallis seguido de postensayo de Dunn y se aceptó la significación cuando p < 0,05.
4. Actividad coagulante de H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa a una dosis de 3 mg/kg.
20 Un conjunto de experimentos ensayó H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa a una dosis de 3 mg/kg. La inyección solamente de vehículo se usó como un control. Los ratones que recibieron el vehículo perdieron 915,2  105,6 l en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo adicionalmente hasta 211,1  67,70 l si los ratones se trataron con H373F-FVIIa. La pérdida de sangre se vio menos afectada tras el tratamiento con H216A-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa, con valores de 558,6  66,22, 577,1  151,4 y 477,1  112,6 l respectivamente.
25
4. Actividad coagulante de Q286R/M298Q/intercambio de Gla FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa, Q286R/M298Q/K341D-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a una dosis de 3 mg/kg.
La actividad coagulante de Q286R/M298Q/intercambio de Gla FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa,
30 Q286R/M298Q/K341 D-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a una dosis de 3 mg/kg se evaluó en el modelo de ratón de hemofilia CD-1. Se usó la inyección solo de vehículo como un control. Los ratones que recibieron el vehículo perdieron 803  92,18 l en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo por tratamiento con S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa hasta 118,6  63,27 l. El tratamiento con Q286R/M298Q/intercambio de Gla FIX-FVIIa a 3 mg/kg redujo la pérdida de sangre en comparación con el grupo de vehículo de 888,89  104,76 l a
35 171,83  62,06 l. En los experimentos que evalúan Q286R/M298Q/K341D-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa la pérdida de sangre del grupo de vehículo fue 813,1  82,66 l. Esto se redujo a 39,42  5,53 l de pérdida de sangre después del tratamiento con Q286R/M298Q/H373F-FVIIa. Q286R/M298Q/K341D-FVIIa parecía ser menos eficaz en el ensayo, dando como resultado pérdida de sangre de 636,7  121,6 l.
40 5. Estudio de respuesta a dosis para evaluar la actividad coagulante de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa
Se evaluó la respuesta a dosis a S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa a 0,3, 0,5, 1 y 3 mg/kg. Los ratones que recibieron el vehículo perdieron 832,48  71,70 l en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo significativamente en 45 ratones a los que se administraron 3 mg/kg de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa, hasta 118,63  63,27 l (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 y 0,5 mg/kg dio como resultado una reducción significativa en la pérdida de sangre (202,69  77,60 l y 366,52  106.21 l) y una dosis menor de 0,3 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre en comparación con más con niveles de vehículo (742,04  112 l). También se evaluó una respuesta a dosis de Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a 0,1, 0,3, 1 y 3 mg/kg y en este 50 experimento los ratones que recibieron el vehículo tuvieron una pérdida de sangre de 813,15  82,66 l. Esto se redujo significativamente en ratones que se trataron con 3 mg/kg de Q286R/M298Q/H373F-FVIIa, hasta 39,42  5,52 l (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 y 0,3 mg/kg condujo a valores de pérdida de sangre de 208,10  105,12 y 508,9  155,8 l respectivamente. La dosis menor ensayada de 0,1 mg/kg produjo pérdida de sangre que se acercaba a los niveles de control de vehículo (733,5 
55 152,88 l).
C. Análisis de actividad coagulante de FVIIa en ratones FVIII-/-
También se usó un modelo de ratón de hemofilia A usando ratones deficientes en FVIII (ratones FVIII-/-) para evaluar
60 la actividad coagulante de polipéptidos de FVIIa, usando los mismos protocolos que se han descrito anteriormente excepto que los ratones no se trataron con anticuerpos anti FVIII.
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1. Estudio de respuesta a dosis que evalúa la actividad coagulante de FVIIa de tipo silvestre
Se realizaron estudios de respuesta a dosis para evaluar la actividad coagulante de NovoSeven® y rhFVIIa de tipo silvestre en ratones FVIII-/-a 0,3, 1, 3 y 6 mg/kg. En el experimento de NovoSeven®, la pérdida de sangre en el 5 grupo de vehículo fue de 912,79  38,32 l, lo que se redujo significativamente por tratamiento con NovoSeven® a 6 y 3 mg/kg (hasta 361,74  55,28 l y 586,98  60,56 l; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 674,84  46,88 l y a la dosis menor ensayada el valor fue de 801,08  41,39 l. En el experimento de rhFVIIa de tipo silvestre, el grupo de control de vehículo produjo pérdida de sangre de 904,08  15,38 l. Esto se redujo significativamente (p < 0,05 usando
10 Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn) por rhFVIIa de tipo silvestre a 6 mg/kg hasta 451,04  74,17 l. La reducción de la dosis a 3 mg/kg produjo un valor de pérdida de sangre de 695,75  60,50 l reduciendo al mismo tiempo la dosis adicionalmente hasta 1 y 0,3 mg/kg dio como resultado valores de pérdida de sangre cercanos a y a los niveles de control de vehículo (846,08  34,17 l y 936,43  31,39 l, respectivamente).
15 2. La respuesta a dosis que evalúa la actividad coagulante de Q143R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa y V158D/E296V/M298Q-FVIIa
El primer conjunto de experimentos ensayaron FVIIa humano recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk), V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q286R-FVIIa y S222A-FVIIa a 3 mg/kg. La inyección solamente de vehículo se usó 20 como un control. Los ratones que recibieron el vehículo tuvieron solamente pérdida de sangre de 942,9  27,37 l en el ensayo de 20 minutos. El tratamiento con NovoSeven® FVII, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q143R-FVIIa y S222A-FVIIa redujo la pérdida de sangre hasta 468  55,9   73,12 l, 697,26  92,22 l y 675,07  35,29 l respectivamente. Q143R-FVIIa, cuando se ensayó de nuevo en ratones FVIII-/-a 3 mg/kg, demostró una pérdida de sangre reducida de 754,84  60,96 l en comparación con el grupo de control de vehículo (935,54  51,96 l).
25 Cuando se evaluó a 5 mg/kg, Q143R-FVIIa produjo una reducción adicional en la pérdida de sangre hasta 445,87  79,62 l en comparación con el grupo de control de vehículo (960,42  24,5 l).
Los segundos conjuntos de experimentos fueron estudios de respuesta a dosis en los que se evaluaron V158D/E296V/M298Q-FVIIa y Q286R/M298Q-FVIIa a 0,3, 1 y 3 mg/kg. El tratamiento con V158D/E296V/M298Q30 FVIIa a 3 mg/kg dio como resultado una reducción significativa de pérdida de sangre (375,62  74,22 l) en comparación con el control de vehículo (960,42  24,5 l; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 y 0,3 mg/kg condujo a valores de pérdida de sangre más cercanos a los niveles de control, de 834,76  54,38 l y 841,62  68,99 l respectivamente. Un segundo experimento que evaluó un lote diferente de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produjo un valor de pérdida de sangre de control de vehículo de 912,79  35 38,32 l, que se inhibió significativamente a 3 y 1 mg/kg (247,24  35,17 l y 628,30  37,36 l; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de postensayo de Dunn). El tratamiento con una dosis menor de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produjo pérdida de sangre que se acercaba a los valores de control (841,85  19,32 l). En el experimento que evaluó el efecto de Q286R/M298Q-FVIIa en ratones FVIII-/-, el grupo de vehículo produjo pérdida de sangre de 941,39  35,18 l. Esto se inhibió significativamente a una dosis de 3 mg/kg, dando como resultado pérdida de
40 sangre de 258,92  59,82 l. A dosis menores de 1 y 0,3 mg/kg los niveles de pérdida de sangre producidos fueron de 616,82  78,43 l y 924,9  38,01 l, respectivamente.
D. Análisis de la actividad coagulante de variantes de FVIIa adicionales en el uso del modelo de hemofilia inducida
45 La actividad coagulante de varias variantes de FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducida (MHI) con ratones CD-1 descrito en el Ejemplo 6.B, anterior. El protocolo fue igual que el descrito anteriormente, excepto por la evaluación de la variante de FVIIa T128N/P129A y la variante de FVIIa M156Q/H224F, en la que se usaron lotes diferentes (tercero y cuarto, respectivamente) de anti FVIII humano. Para el tercer lote de anti FVIII humano (lote 3;
50 Affinity Biologicals, lote IG1603R1, actividad neutralizante de 418 UB de ratón/ml) la dosis usada fue de 12,17 mg/ratón (120 l de una solución de reserva de 101,4 mg/ml), que se administró a las 18 horas antes del corte de la cola. Para el cuarto lote de anti FVIII humano (lote 4; Affinity Biologicals, lote IG1639R1, actividad neutralizante de 875 UB de ratón/ml) la dosis usada fue de 8,04 mg/ratón (80 l de una solución de reserva 100,45 mg/ml). La pérdida de sangre se midió como se ha descrito anteriormente, y se presenta posteriormente en la Tabla 19 como el
55 porcentaje de inhibición (calculado usando los valores promedio para la variante de interés y dividiendo por el grupo de vehículo), y el valor de DE50 determinado usando análisis de regresión no lineal (usando software GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), que restringe la parte superior e inferior de la curva de respuesta a la pérdida de sangre observada con animales de control tratados con vehículo y normales, respectivamente.
60
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Tabla 19.
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (numeración de Quimotripsina) Pérdida de Sangre de MHI; % de Inhibición (1,5 mg/kg) n Pérdida de Sangre por MHI; DE50 (mg/kg) n
WT (NovoSeven®)
WT (NovoSeven®)
61 1 0,7 1
WT
WT
59 1 0,75 1
T128N/P129A
T[128]N1P[129]A 78 1 0,5 1
Intercambio de Gla FIX
Intercambio de Gla FIX
63 1
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 64 1
V158D/E296V/M298Q
V21D/E154V/M156Q 86 3 0,5 3
Q286R
Q143R 76 2 0,55 2
S222A
S82A 75 1 0,45 1
H257S
H117S 50 1
H373F
H224F 78 1
Q366V
Q217V 64 1
A175S
A39S 58 1
K109N/A175S
K[109]N/A39S 60 1
Q286R/H257A
Q143R/H117A 58 1
Q286R/S222A
Q143R/S82A 50 1
Q286R/S222A/H257A
Q143R/S82A/H117A 68 1
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 85 2 0,15 2
Q286R/M298Q †
Q143R/M156Q † 89 1 0,16 2
Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q 83 2 0,13 1
S222A/H257A/Q286R/ M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 85 1 0,2 1
H257S/Q286R/Q366V
H117S/Q143R/Q217V 46 1
S222A/H257A/Q286R/ Q366V
S82A/H117A/Q143R/Q217V 49 1
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 88 1
Q286R/H373F
Q143R/H224F 75 1
Q286R/M298Q/H373F
Q143R/M156Q/H224F 95 1 0,15 1
M298Q/H373F
M156Q/H224F 95 1 0,21 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R
Intercambio de Gla F1X/S82A/Q143R 85 1 0,4 1
V158D/Q286R/E296V/ M298Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q 95 1
T128N/P129A/Q286R/ H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/H2 24F/ 70 1
† polipéptido de FVIIa producido a partir de células CHOX
E. Análisis de la actividad coagulante de variantes de FVIIa adicionales en el uso del modelo de hemofilia inducida
La actividad coagulante de varias variantes de FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducida (MHI) con ratones CD-1 descrito en el Ejemplo 6.B, anterior. El protocolo fue igual que el descrito anteriormente, excepto que para estos experimentos se usaron los lotes 4 a 6 de anti FVIII. Los detalles de estos lotes fueron los siguientes: lote 4 (detallado anteriormente), para el quinto lote (lote 5; Affinity Biologicals, lote IGI593R2, actividad neutralizante de
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255 UB de ratón/ml) la dosis usada fue de 12,25 mg/ratón (120 l de una solución de reserva 102,1 mg/ml), que se administró a las 6 horas antes del corte de la cola. Para el sexto lote (lote 6; Affinity Biologicals, lote IG1703R2, actividad neutralizante de 685 UB de ratón/ml) la dosis usada fue de 8,02 mg/ratón (80 l de una solución de reserva 100,2 mg/ml), que se administró a las 4 de la tarde el día antes del experimento. La pérdida de sangre se midió 5 como se ha descrito anteriormente, y se presenta a continuación en la Tabla 20 como el porcentaje de inhibición (calculado usando los valores promedio para la variante de interés y dividiendo por el grupo de vehículo), en cada caso todas las dosis se muestran con los valores de inhibición correspondientes debajo, y el valor de DE50 determinado usando análisis de regresión no lineal (usando software GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), restringiendo la parte superior e inferior de la curva de respuesta con la pérdida de sangre observada con animales
10 de control tratados con vehículo y normales, respectivamente. El “n/grupo” se refiere a la cantidad de ratones por grupo mientras que la “n” en referencia al cálculo de DE50 se refiere a la cantidad de experimentos realizada con la variante.
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Ejemplo 7
Determinación de la constante cinética de Michaelis Menten de la actividad amidolítica de FVIIa en un sustrato de moléculas pequeñas
5 La actividad amidolítica de las variantes de FVII puede evaluarse midiendo la constante cinética de Michaelis Menten del polipéptido de FVIIa en el sustrato de peptidilo Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH). Dicho ensayo puede realizarse de la siguiente manera.
10 Se incluye factor tisular purificado humano lipidado (Innovin, Dade Behring, VWR Cat nº 68100-390) en el ensayo para proporcionar actividad óptima de FVIIa. El complejo de FT-FVIIa escinde Spectrozyme FVIIa como un sustrato cromogénico altamente específico que libera un cromóforo de paranitroanilina (pNA), que puede controlarse midiendo la absorción a 405 nm. La actividad enzimática se determina controlando la absorbancia a 405 nm del pNA libre generado en función del tiempo.
15 Las reacciones se realizan a tres concentraciones de enzima diferentes. Para la reacción, las variantes de FVIIa se diluyen en primer lugar a 40 nM en tampón de ensayo directo 1x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %) en un tubo de 1,7 ml (tubos de microcentrífuga de adhesión baja de ISC Bioexpress). Se diluyó adicionalmente FVIIa en presencia de FT (Innovin, Dade Behring) diluyendo a 2 nM en un depósito de polipropileno
20 de 12 pocillos (Axygen) de la siguiente manera: 720 l de tampón directo 5x (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2, 25 mM, BSA 0,05 %), 180 l de FVIIa 40 nM y 2700 l de FT 2x (solución de reserva 6 nM reconstituida en 10 ml de agua). La proteasa diluida se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reserva de FVIIa 2 nM se diluye adicionalmente en diluciones en serie dobles para proporcionar una reserva de proteasa 1 nM y 0,5 nM, respectivamente, también en presencia de FT. Las reacciones de dilución en serie son las siguientes: en primer
25 lugar, 1800 l de reserva 2 nM de FVIIa/FT a partir de la anterior diluida en 360 l de tampón directo 5x, 900 l de FT 2x y 540 l de agua. Esta reserva diluida de diluye de nuevo 1:1 en 1800 l de FT 1x en tampón directo.
Se realiza una placa de dilución del sustrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica). La solución de reserva de Spectrozyme FVIIa se realiza por reconstitución del vial de 50 moles en agua destilada hasta 10 mM y se almacena
30 a 4 ºC. Se añaden 80 l (Spectrozyme FVIIa 10 mM) y 60 l + 20 l de agua (Spectrozyme FVIIa 7,5 mM) del Spectrozyme FVIIa 10 mM a pocillos en dos columnas adyacentes de una placa de ensayo de polipropileno de 96 pocillos (Costar). Los dos pocillos se diluyen en serie 2 veces por cada uno de los 8 pocillos de la columna respectiva para componer una serie de concentraciones de sustrato 10x que varían del sustrato 10 mM a 78 M bajando por los pocillos de la primera columna y de sustrato 7,5 mM a 58,6 M bajando por los pocillos de la
35 segunda columna.
Se añaden cinco l de cada dilución de sustrato de Spectrozyme FVIIa a una placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos (Costar). Se añaden cuarenta y cinco l de cada una de las tres diluciones de FVIIa/FT a tres grupos de columnas de las diluciones en serie de sustrato. Durante esta etapa, se tiene cuidado de evitar
40 introducir burbujas en los pocillos del ensayo. Si se introducen burbujas, estas pueden retirarse perforando con una aguja limpia antes del comienzo de cada ensayo. Las placas se mezclan después por agitación. Antes del inicio del ensayo, se mide la longitud del trayecto de los pocillos de ensayo usando un espectrofotómetro de lector de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices) tomando una lectura de puntos finales y usando la característica Pathcheck del software SoftMax Pro (Molecular Devices). El aumento de la absorbancia a 405 nm se mide cada 30
45 segundos durante una hora a 37 ºC.
El software SoftMax Pro se usa para convertir la velocidad de absorbancia (miliunidades/s) a la concentración de pNA liberado (M/s) usando la longitud de trayecto y el coeficiente de extinción del grupo saliente pNA a 405 nM, 9600 M-1cm-1. La ecuación de conversión es la siguiente: velocidad x (1/60 x 1000) x (1/9600 x Longitud del trayecto)
50 x 100000. Los resultados para cada concentración de proteasa se representan gráficamente usando software Graph Pad Prism con la concentración de sustrato en el eje X y las velocidades M/s determinadas en el eje Y. Usando el software Graph Pad Prism 4 se determina Km e Ymáx ajustando los datos a una ecuación de Michaelis Menten de la siguiente manera:
55 Y = ((kcatKm/1000000) x X x [E])/(1+(X + Km)
donde: X es la concentración de sustrato (M)
Y es la actividad enzimática (M/s)
-1)
kcatKm es la constante de especificidad (M-1s
60 Km es la constante de Michaelis (M) E es la concentración de enzima (M)
Se establecieron los valores iniciales de E=1, Km = X a 0,5 x Y máx y kcatK = 1000.
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Ejemplo 8
Evaluación de la potencia de la interacción entre variantes de FVIIa e IRFT
5 La potencia de interacción entre polipéptidos de FVIIa, tales como los proporcionados en el presente documento, e IRFT, puede evaluarse usando uno o más ensayos. En un ejemplo, la potencia de la interacción entre IRFT y un complejo de FVIIa/FT se evalúa midiendo el nivel de inhibición de diversas concentraciones de IRFT en la actividad catalítica de un FVIIa/FT para un sustrato, Spectrazyme VIIa. En otro ejemplo, puede usarse un ensayo de resonancia de plasmina superficial de alto rendimiento (RPS).
A. Determinación de la CI50 para inhibición por IRFT de FVIIa/FT
La potencia de la interacción entre IRFT y el complejo de FVIIa/FT se evaluó midiendo el nivel de inhibición de diversas concentraciones de IRFT en la actividad catalítica de un FVIIa/FT para un sustrato, Spectrazyme VIIa. La
15 concentración de IRFT que se requería para el 50 % de inhibición (CI50) se calculó para cada variante de FVII, y un patrón de FVIIa.
Se pretrató una placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos (Nunc) añadiendo 150 l/pocillo de tampón de placa 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA 0,01 %, Tween-20 0,01 %) a cada pocillo e incubando la placa a 37 ºC durante un mínimo de 1 hora. El tampón se retiró completamente agitando y transfiriendo la placa y centrifugando la placa boca abajo para retirar el tampón restante. La placa se secó al aire durante 1 hora, y se almacenó a temperatura ambiente (TA).
En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml (tubo de microcentrífuga de adhesión baja de ISC Bioexpress), se preparó
25 una mezcla de FVIIa/FT en un volumen total de 450 l mezclando 9 l de FVIIa 250 nM (American Diagnostica, FVIIa de tipo silvestre o una variante respectiva para ensayar) con 337,5 l de FT 2x (Innovin; Dade Behring; producto liofilizado resuspendido en 10 ml de agua destilada para generar FT 2x, que equivale aproximadamente a 7 nM de FT lipidado), 90 l de tampón de ensayo 5x (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05 %) y 13,5 l de agua, dando como resultado una solución que contiene FVIIa 5 nM y FT 5,2 nM. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que los componentes formaran complejo. A cada pocillo de 2 columnas en la placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos pretratada, se añadieron 25 l de la mezcla de FVIIa/FTs respectiva y la placa se cubrió para evitar la evaporación.
Se disolvió inicialmente IRFT Recombinante Humano (R&D Systems) en 33 l de glicerol al 50 % (v/v) para
35 componer una reserva 10 M para almacenamiento a -20 ºC. La reserva de IRFT se diluyó adicionalmente a 1,5 M en un tampón final 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %) en una placa de almacenamiento de polipropileno de la siguiente manera: para cada proteasa ensayada, se prepararon 87,5 l de una solución de IRFT 1,5 M mezclando 13,1 l de IRFT 10 M con 17,5 l de tampón de ensayo 5x y 56,9 l de agua destilada. Se realizaron diluciones triples en serie de la solución de IRFT en tampón de ensayo 1x mezclando 27,5 l de IRFT en 55 l de tampón de ensayo 1x, de modo que se generaron soluciones que contenían IRFT 750 nM, 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,26 nM, 3.1 nM y 1.03 nM. El pocillo final de la serie contenía solamente tampón 1 x como control.
Se añadieron veinticinco l de cada dilución a IRFT a 2 pocillos (es decir en duplicado) de 2 columnas de la placa de
45 ensayo de media área transparente de 96 pocillos que contenía la mezcla de FVIIa/FT, de modo que la mezcla de proteasas se ensayó por duplicado con cada dilución de IRFT. Se añadió también una solución de tampón de ensayo 1x sin IRFT a 2 pocillos que contenían la mezcla de FVIIa/FT como control negativo. La placa se agitó brevemente y después se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos antes de la incubación a 37 ºC durante 1,5 horas.
Se preparó una solución de reserva de Spectrazyme VIIa (American Diagnostica) reconstituyendo 50 moles en 5 ml de agua destilada a 10 mM y almacenando a 4 ºC hasta su uso. Inmediatamente antes de su uso, la solución se diluyó a 600 M en agua destilada. Después de la incubación de la placa de ensayo anterior, se añadieron 10 l del Spectrazyme VIIa diluido a cada pocillo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la placa se incubó a 37 ºC. El aumento de absorbancia a 405 nm se midió cada 30 segundos durante una hora a 37 ºC, y se calculó la
55 velocidad de absorbancia usando software SoftMax Pro (Molecular Devices).
Para determinar el grado de inhibición por IRFT, las tasas de absorción de reacciones de proteasa que contenían IRFT se dividieron en primer lugar por la velocidad de absorbancia de reacciones que no contenían IRFT (la muestra de control) para obtener la actividad fraccional, y se determinó el log10 de cada concentración de IRFT. Usando Software GraphPad Prism, se representó gráficamente el log10 [IRFT] frente a la actividad fraccional para cada proteasa, y se generó una curva de respuesta a dosis con un ajuste de curva que suponía que la parte superior e inferior de los datos de actividad se fijaban a 1 y 0, respectivamente. El software se usó para determinar la inhibición de IRFT tanto como el valor de log de CI50 (pCI50) como la CI50 absoluta (inhibición de IRFT en nM) para cada proteasa, y se determinó su promedio y desviación típica.
65 El nivel de inhibición de IRFT de cada una de las variantes de FVIIa en complejo con FT lipidado (Innovin; Dade Behring) se determinó y se expresó como el factor de aumento de resistencia a IRFT en comparación con FVIIa de tipo silvestre (Tabla 21).
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Tabla 21. Inhibición de las variantes de FVIIa por IRFT
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (numeración de quimotripsina) Factor de resistencia de IRFT
wt
wt
1,0
A292N/A294S
A150N/A152S 2,4
A175S
A39S 1,5
K109N
K[109]N 0,7
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 1,1
A122N/G124S/E394N/P395A/R396S
A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 1,0
B. Exploración de resonancia de plasmón superficial (RPS) de variantes de FVIIa con respecto a resistencia a IRFT
10 La resistencia relativa de diversas variantes de FVIIa a la inhibición por IRFT soluble recombinante humano se evaluó usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS) de alto rendimiento con el instrumento Biacore T100. La resistencia relativa de variantes de FVIIa a la inhibición por IRFT se evaluó por la medición de la cantidad relativa de variante de FVIIa unida con IRFT soluble inmovilizada en una microplaca sensora CM5 de Biacore en comparación con la cantidad de FVIIa de tipo silvestre unido después de un tiempo de inyección y una
15 concentración de proteasa normalizados.
Para cada experimento, se inmovilizó IRFT soluble (R&D Systems) en una nueva microplaca sensora CM5 Serie S de Biacore de 4 celdas de flujo (GE Healthcare) usando el protocolo de acoplamiento de amina disponible dentro del Software de control Biacore T-100 (GE Healthcare) y los reactivos proporcionados con el Kit de Acoplamiento de 20 Amina (GE Healthcare). Las cuatro células de flujo disponibles se utilizaron para inmovilización de dos densidades diferentes de IRFT y albúmina de suero bovino (BSA), que actuó como un agente de bloqueo en las células de referencia. BSA se diluyó a 5 g/ml en acetato sódico (pH 4,0) y se inmovilizó en las celdas de flujo 1 y 3 a 1000 y 2000 unidades de respuesta (UR), respectivamente. Para inmovilización de IRFT, se resuspendió IRFT soluble liofilizado (10 g) en 100 l de tampón de acoplamiento 1x (Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20
25 0,01 %, pH 7,4) hasta una concentración de 0,1 mg/ml. Un total de 20 l de IRFT 0,1 mg/ml se diluyó hasta 10 g/ml en acetato sódico pH 4,0 para inmovilización en celdas de flujo 2 y 4 a 1000 y 2000 UR, respectivamente. Se usó tampón de acoplamiento como el tampón de ejecución durante las etapas de inmovilización.
Cada muestra de FVIIa se preparó a una concentración final de 320 nM en Tampón de Ejecución 1X (Hepes 20 mM,
30 NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %, pH 7,4) que contenía FTs 620 nM (Factor de Coagulación Humana III; R&D Systems). Generalmente, cada variante de FVIIa se diluyó 10 veces en Tampón de Ejecución 1x antes de la dilución final de 320 nM. Se prepararon complejos de FVIIa/FTs a un volumen final de 120 l por duplicado permitiendo que se cargaran hasta 48 variantes de FVIIa únicas en una placa de almacenamiento de 96 pocillos y se evaluó con inyecciones por duplicado en una única ejecución. El complejo de
35 FVIIa/FTs se incubó a TA durante 10-15 minutos antes del inicio de la primera inyección de muestra.
Se creó un método de análisis de unión normalizado dentro del Software Biacore Control (GE Healthcare) en el que cada repetición de FVIIa se inyecta durante 180 segundos de tiempo de asociación seguido de solamente 60 segundos de disociación a un caudal de 10 l/minuto. La regeneración de la microplaca sensora siguió a la fase de 40 disociación durante 30 segundos con glicina 10 mM, NaCl 500 mM, pH 3,0 y después un periodo de estabilización de 60 segundos con Tampón de Ejecución 1x al mismo caudal de 10 l/minuto. Se registraron dos puntos de referencia de ensayo para cada ejecución y análisis de datos posterior, unos 5 segundos antes de la conclusión de la fase de asociación (unión) y un segundo presentado 5 segundos antes de la conclusión de la fase de disociación (disociación). Antes de iniciar un ensayo completo, la microplaca sensora se ensayó con una única inyección de
45 FVIIa de tipo silvestre/FTs 320 nM durante 180 segundos, que debería dar una respuesta de aproximadamente 400450 UR y 750-850 UR para unión con celdas de flujo 2 (1000 UR) y 4 (200 UR), respectivamente.
Se realizó análisis de datos en primer lugar con el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare) para inspeccionar los parámetros de validación de ensayo, que incluyen verificar que la unión con la célula de referencia 50 es mínima, la deriva de línea basal y la unión de inyecciones de blanco de control (tampón de ejecución). Se generaron tablas de datos dentro de esta aplicación que indicaban la cantidad de variante de FVIIa unida (en UR) tanto en el punto de indicación de unión como en el punto de indicación de disociación. Las tablas de datos se exportaron posteriormente para análisis adicional dentro del ambiente de hoja de cálculo de Microsoft Excel. Los
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puntos de datos sin procesar (UR unido) se corrigieron con respecto a unión de control con la microplaca sensora y
después se tomó una relación de la cantidad de FVIIa de tipo silvestre unido (en UR) en relación con la cantidad de
variante de FVIIa unida (en UR) para cada parámetro y se presentó como unión (wt/variante) y disociación
(wt/variante). La Tabla 22 presenta los resultados del estudio. La resistencia a la inhibición por IRFT se refleja como
5 un aumento en la relación para uno o ambos de los parámetros evaluados. Por ejemplo, un valor de unión
(wt/variante) o disociación (wt/variante) de 20 para una variante de FVIIa en particular indica que esa variante es 20
veces más resistente a la inhibición por IRFT que FVIIa de tipo silvestre. Varias variantes mostraron resistencia
aumentada a inhibición por IRFT. Por ejemplo, variantes que contienen la mutación K341-D (numeración de FVII
maduro) tales como Q286R/M298Q/K341D-FVIIa, Q286R/K341D-FVIIa y M298Q/K341D-FVIIa, tienen relaciones 10 que indican resistencia significativa a IRFT (mayor de 40-150 veces). En algunos casos, la velocidad de disociación
se vio afectada más que la velocidad de asociación.
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Ejemplo 9
Análisis farmacocinético de polipéptidos de FVIIa
5 Se evaluaron propiedades farmacocinéticas de polipéptidos de FVIIa midiendo la cantidad de Factor VIIa humano en plasma de ratón. Pueden usarse dos ensayos para cuantificar FVIIa en plasma. Puede usarse un ELISA para cuantificar la proteína de FVIIa total en plasma de ratón y un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVIIa:C) usado para cuantificar la actividad coagulante de los polipéptidos de FVIIa en plasma.
A. Administración de polipéptidos de FVIIa a ratones
Se evaluaron polipéptidos de FVIIa modificados y la proteína de FVIIa humana recombinante no modificada (rhFVIIa) (NovoSeven®, Novo Nordisk) en estudios farmacocinéticos. Para cada estudio, se inyectó a 18 ratones CD-1 macho una dosis de embolada intravenosa (0,1-3,0 mg/kg, dependiendo del estudio) de rFVIIa. A los 5, 15, 30,
15 60, 120 y 240 minutos después de la inyección, se sacrificaron tres ratones de cada protocolo de inyección usando asfixia por CO2 y se extrajeron aproximadamente 1,0 ml de sangre en una jeringa de 1,0 ml a través de una punción cardiaca percutánea. Cada jeringa se precargó con citrato sódico suficiente para conseguir una concentración final de 3,2 % en 1 ml de sangre. Las muestras de sangre se centrifugaron después a 9000 rpm durante 8 minutos a 4 ºC. El plasma se retiró a tubos de 1,5 ml individuales marcados (Eppendorf), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC. Adicionalmente, se inyectó a un ratón por cada experimento solamente vehículo (simulación) y se usó plasma de este ratón para determinación de la actividad de FVIIa de fondo.
B. Ensayo de ELISA
25 Se usó un kit disponible en el mercado, ELISA de Factor VII IMUBIND® (American Diagnostica) para detectar proteína de FVII en suero por ELISA. Este kit emplea una placa prerrecubierta con un anticuerpo anti FVII/FVIIa para capturar la proteína, y un anticuerpo anti FVII biotinilado para la detección mediante una peroxidasa de rábano rusticano marcada con estreptavidina. El kit se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes excepciones: en primer lugar, la curva patrón se ha estrechado para asegurar un intervalo lineal sobre el intervalo completo de concentraciones y abarca las concentraciones de 0,88 ng/ml hasta 10 ng/ml; en segundo lugar, la variante de FVIIa purificada en sí misma se usó para la curva patrón en lugar del patrón de FVII proporcionado con el kit debido a diferencias en la afinidad del anticuerpo. Los experimentos indicaron que el complejo de FVIIa con antitrombina III (ATIII), un inhibidor de plasma potencial de FVIIa, se detecta al 75 % del nivel de la proteasa libre, lo que asegura que el ensayo pueda detectar el FVIIa total en la muestra de plasma en las formas tanto activa como
35 inactiva.
Brevemente, las muestras de plasma se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron 10 veces en tampón de muestras (PBS + Triton X-100 0,1 % + BSA 1,0 %) y después se diluyeron en serie 5,5 veces para cuatro diluciones. Las cuatro muestras diluidas se diluyeron 2 veces en la placa de ELISA para diluciones de muestra finales de 20, 110, 605 y 3327,5 veces. Estas cuatro diluciones de plasma de ratón abarcaron un intervalo de concentraciones de proteasa de 33.000 ng/ml a 20 ng/ml. Cada muestra se midió en dos placas de ensayo separadas, y esas mediciones dentro del intervalo de la curva patrón se usaron para calcular la concentración de variante de FVIIa en la muestra de plasma.
45 C. Ensayo de coagulación
Se usó un kit disponible en el mercado (STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) como el ensayo de coagulación. Para determinar la actividad coagulante de los polipéptidos de FVIIa activos, se ensayaron muestras de plasma usando un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVIIa:C). El ensayo se realizó usando reactivos e instrucciones proporcionados en un kit comercial y el tiempo de coagulación se midió usando un instrumento de detección de coágulo electromecánico (STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). El kit se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes excepciones: en primer lugar, se usó la variante de FVIIa purificada en sí misma para la curva patrón en lugar del patrón de rhFVIIa proporcionado con el kit; en segundo lugar, se usaron los siguientes reactivos comerciales a granel para estudios de exploración farmacocinética rutinarios y
55 proporcionaron resultados comparables a los reactivos del kit: factor tisular soluble (CalBioChem, La Jolla, Ca) y mezcla de fosfolípidos sintéticos (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), tampón de TBSA (Tris-NaCl, pH 7,5 con BSA 1 %; DiaPharma, West Chester, Ohio), y solución de cloruro cálcico 25 M (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ).
El ensayo de coagulación se realizó de la siguiente manera. Se descongelaron muestras de plasma congeladas a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos y después se diluyeron 1:5000 en tampón. Se combinaron cincuenta l de plasma diluido con 50 l de plasma humano deficiente en Factor VII y 50 l de factor tisular relipidado y se preincubaron durante 180 segundos. Después de la preincubación, se añadieron 50 l de solución de cloruro cálcico (25 M) para iniciar la coagulación. El tiempo de coagulación se determinó usando detección de coágulo electromecánico. Cada muestra de plasma se ensayó por duplicado. El sistema se calibró 65 construyendo una curva patrón usando el tiempo de coagulación de diluciones en serie de tampón que contenían una cantidad conocida de la variante de FVIIa específica que se ensayaba. Las concentraciones de FVIIa en
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muestras de plasma de ratón se calcularon a partir de la parte lineal del log de FVIIa frente a la curva patrón de log de tiempo de coagulación. La capacidad de las muestras de plasma para inducir coagulación en plasma deficiente en Factor VII se presentó como ng de FVIIa/ml de plasma de ratón después de restar el fondo de FVIIa de tipo silvestre endógeno en plasma de ratones tratados con simulación.
5 La semivida de cada proteína de FVII se determinó de forma rutinaria realizando un ajuste convencional del logaritmo natural de la actividad a una línea recta, y midiendo el tiempo que tarda la actividad de las proteínas de FVIIa en reducirse a la mitad. Para proteínas de FVII con degradación multiexponencial, la semivida se determinó a partir de la parte terminal del perfil de logaritmo de plasma frente a tiempo. Se calcularon parámetros
10 farmacocinéticos adicionales de la siguiente manera: AUC de plasma0-inf/Dosis (calculado como [AUC(0-t) + Ct/(ln2/T1/2)], donde t es el último punto temporal con concentración en plasma medible del polipéptido de FVIIa dividido por la dosis IV (mg/kg)); semivida (la semivida del polipéptido de FVIIa durante la fase terminal de perfil de concentración de FVIIa en plasma frente al tiempo; T1/2 se calcula como -ln2 dividido por la pendiente negativa durante la fase terminal de la representación logarítmica-lineal de la curva de concentración de FVIIa en plasma
15 frente al tiempo); MRT0-último (tiempo medio que el polipéptido de FVIIa reside en el cuerpo; calculado como AUMC 0último/AUC 0-último, donde AUMC0-último es el área total bajo la curva de primer momento frente a tiempo (curva de concentración de FVIIa · tiempo frente a tiempo), y se calcula por la regla trapezoide lineal); CI (eliminación sistémica; calcula como dosis/AUC0-inf); y Vd (volumen de distribución basado en la constante e de eliminación terminal (); calculado como [Cl/(ln2/T1/2)]).
20
D. Propiedades farmacocinéticas de variantes de FVIIa
Usando el protocolo de FVIIa:C descrito anteriormente, se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo silvestre y variantes de FVIIa basándose en la actividad de coagulación en plasma. Los resultados se exponen
25 en la Tabla 23. Varias variantes de FVIIa mostraron parámetros farmacocinéticos mejorados en comparación con FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 23. Parámetros farmacocinéticos de ratón de variantes de FVIIa
Mutación (numeración de FVII maduro)
Dosis IV (mg/kg ) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min/kg) Vd (ml/kg) N
NovoSeven® RT FVIIa
0,1 1165 37 50 0,9 46 1
NovoSeven® FVIIa
0,1 741 30 31 1,4 58 1
NovoSeven® FVIIa
1,0 1156 36 41 1,7 89 1
WT
0,1 686 37 37 1,8 92 6
WT
1,0 798 50 57 1,5 118 2
P257insGGGSCSFGRGDIRNVC
0,1 391 32 32 2,3 108 1
T128N/P129A
0,1 1392 57 43 0,8 64 2
S52A
0,1 594 51 58 1,6 118 1
K109N
0,1 951 50 40 1,1 75 1
A51N
0,1 270 33 32 3,7 174 1
S52A/S60A
0,05 460 25 29 2,2 78 1
S52A/S60A
0,1 408 17 34 2,5 61 1
M298Q
0,1 258 76 33 4,9 443 2
T128N/P129A/M298Q
0,1 495 26 28 2,0 75 1
V158D/E296V/M298Q
0,05 72 13 10 13,9 258 1
V158D/E296V/M298Q
0,1 44 16(á), 45(â) 20 22,8 146 5 1
V158D/E296V/M298Q
1,0 39 7 13 26,6 979 2
V158D/E296V/M298Q
3,0 22 7,7á 7,9 45,6 506 1
V158D/E296V/M298Q
6,0 48 43 45 20,8 130 5 1
T128N/P129A/V158D/E296V/M2 98Q
0,1 125 11 14 8,0 122 1
S52A/S60A/V158D/E296V/M298 Q
0,1 47 15 11 21,4 450 1
Q286R
0,1 181 55 59 5,5 439 1
Q286R
0,3 460 41,7 76 1,8 110 1
Q286R
1,0 1256 67 68 0,8 80 2
T128N/P129A/Q286R
0,1 2443 96 82 0,4 56 1
S52A/S60A/Q286R
0,1 1565 43 60 0,6 55 1
Intercambio de Gla FIX
0,1 207 20 22 4,9 140 2
K341D
0,1 2817 106 114 0,1 22 1
S222A
0,1 189 32 33 5,3 248 1
imagen151
Mutación (numeración de FVII maduro)
Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min/kg) Vd (ml/kg) N
S222A
1,0 139 30 33 3,8 293 1
T128N/P129A/S222A
0,1 422 28,4(á), 71(â) 58 2,4 244 1
S52A/S60A/S222A
0,1 270 45 38 3,7 243 1
H257A
0,1 595 31 30 1,7 76 1
H257S
0,1 1015 59 62 1,0 84 1
H257S
0,75 816 50 62 1,2 85 1
Q366V
0,1 19 14 11 51,6 106 0 1
Intercambio de GlaFIX/Q366V
0,1 157 11 7,0 6,4 107 1
A122N/G124S/E394N/P395A/ R396S
0,1 1089 63 45 0,9 84 1
G318N
1,0 568 95 56 1,8 242 1
A175S
0,1 2081 111 85 0,5 76 2
K109N/A175S
0,1 1280 183 51 0,8 207 1
S119N/L121S/A175S
0,1 2460 102 50 0,4 60 1
T128N/P129A/A175S
0,1 2770 83 48 0,4 43 1
A122N/G124S/A175S
0,1 3240 91 50 0,3 40 1
A122N/G124S
0,1 679 52,9 42 1,1 87 1
H257A/Q286R
0,1 1848 56,8 73 0,5 44 1
S222A/Q286R
0,1 861 30 38 1,5 97 2
Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R
1,0 415 39 42 2,4 136 1
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A /S222A/Q286R
0,1 929 55 59 1,1 86 1
S222A/H257A/Q286R
0,1 976 56 42 1,0 83 1
Q286R/M298Q
0,055 1198 40 44 0,8 49 1
Q286R/M298Q
0,1 605 35 42 1,9 94 6
Q286R/M298Q
1,0 363 29 36 2,8 116 1
Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q
0,1 231 26 20 4,9 194 3
T128N/P129A/Q286R/M298Q
0,1 1571 41 60 0,6 38 1
T[128]N/P[129]A/
Q286R/M298Q
0,1 1326 42,3 50 0,8 47 1
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ Q286R/M298Q
0,1 427 30 32 2,3 101 1
{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q286R/M298Q
0,1 386 53 43 2,6 198 1
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q286R/M298Q
0,1 439 85 47 2,3 280 1
{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q286R/M298Q
0,1 291 14 24 3,4 150 1
{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q286R/M298Q
0,1 648 14 (á), 75 (â) 43 1,5 32 1
S52A/S60A/Q286R/M298Q
0,1 374 32 34 2,7 122 1
Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/ Q286R/M298Q
0,1 256 19 18 3,9 107 1
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q
0,1 154 18 17 6,5 166 1
S222A/M298Q
0,1 72 17 12 13,9 332 1
S222A/H257A/Q286R/M298Q
0,1 93 33 30 10,8 517 1
T128N/P129A/S222A/H257A/Q2 86R/M2986Q
0,1 770 38 45 1,3 72 1
S52A/S60A/S222A/H257A/Q28R/ M2986Q
0,1 469 26 28 2,1 78 1
A175S/Q286R/Q366V
0,1 353 28,9 23 2,8 118 1
Q286R/M298Q/K341D
0,1 219 23 20 4,6 151 1
M298Q/K341D
0,1 2430 78 76 0,4 46 1
imagen152
Mutación (numeración de FVII maduro)
Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min/kg) Vd (ml/kg) N
Q286R/M298Q/Q366N
0,1 569 29 32 1,8 74 1
T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N
0,1 1897 50 58 0,5 38 1
{Intercambio de Gla FIX
0,1 257 10(á), 20 3,9 163 1
K[43]I}/Q286R/M298Q/Q366N
28(â)
{Intercambio de Gla FIX K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M2 98Q /Q366N
0,1 393 24 27 2,5 89 1
T128N/P129A/0286R/H373F
0,1 1467 59 62 0,9 74 1
Q286R/M298Q/H373F
0,1 466 28 23 2,2 87 1
T128N/P129A/Q286R/M298Q /H373F
0,1 597 27(á), 67(â) 51 1,6 153 1
T128N/P129A/M298Q/H1373F
0,1 307 7(á), 27(â) 23 3,3 126 1
V158D/Q286R/E296V/M298 Q
0,1 172 14 36 5,8 535 1
S222A/T239V
0,1 127 47 39 7,9 535 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R
0,1 460 34 33 2,2 108 1
T239V/Q286R/M298Q
0,1 398 28(á),71 ( â) 60 2,5 258 1
Intercambio de Gla FIX/T239V/Q286R/M298Q
0,1 365 13(á),56( â) 29 2,7 220 1
T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q
0,1 914 38 36 1,1 60 1
S222A/T239V/H257A/Q286R/M2 98Q
0,1 181 28 31 5,5 225 1
T128N/P129A/S222A/T239V/H25 7A/ Q286R/M298Q
0,1 564 27 30 1,8 70 1
T239V/Q286R/H373F
0,1 385 72 54 2,6 269 1
T239V/Q286R/M298Q/H373F
0,1 149 36 23 6,7 353 1
T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q/H373F
0,1 345 27 27 2,9 113 1
V158D/T239I/E296V/M298Q
0,1 370 14(á),70( â) 50 2,7 273 1
T239I/Q286R
0,1 1820 85 76 0,6 68 1
S222A/T239I
0,1 1300 6(á), 81(â) 69 0,8 90 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R
0,1 1073 70 66 0,9 94 1
T2391/Q286R/M298Q
0,1 1029 27(á),60( â) 62 1,0 84 1
Intercambio de Gla FIX/T2391/Q286R/M298Q
0,1 1269 54 62 0,8 61 1
T128N/P129A/T2391/Q286R/ M298Q
0,1 2105 82 74 0,5 56 1
S222A/T2391/H257A/Q286R/M2 98Q
0,1 1212 31(á), 79(â) 60 0,8 101 1
T239I/Q286R/H373F
0,1 1841 30(á), 85(â) 69 0,5 62 1
V158D/T239V/E296V/M296Q
0,1 184 24(á), 134(â) 78 5,4 105 3 1
T239V/Q286R
0,1 1522 29(á), 72(â) 68 0,7 68 1
T239V/Q286R/M298Q/H373F
0,1 950 36 61 1,1 55 1
T239V/Q286R/M298Q/H373F
0,1 806 32 56 1,3 57 2
T239V/Q286R/M298Q/H373F
0,1 663 27 52 1,5 59 1
T239V/Q286R/M298Q/H373E
0,1 1350 53 62 0,7 57 1
S222A/H257S/Q286R/M298Q
0,1 814 33 31 1,2 59 1
H257S/Q286R/M298Q/H373F
0,1 297 34 34 3,4 163 1
S222A/Q286R/M298Q/H373F
0,1 106 35 23 9,4 478 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/
0,1 104 9,1(á),17 13 9,7 242 1
imagen153
Mutación (numeración de FVII maduro)
Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min/kg) Vd (ml/kg) N
Q286R/M298Q/H373F
(a)
S222A/Q286R/M298Q
0,1 347 24 26 2,9 102 1
Intercambio de Gla FIX / S222A/ Q286R/M298Q
0,1 263 11 13 3,8 62 1
T128N/P129A/A175S/Q366V
0,1 2196 52(á), 85(â) 78 0,5 56 1
A122N/G124S/A175S/Q366V
0,1 2148 92 81 0,5 62 1
T128N/P129A/A175S/S222A
0,1 4248 122 88 0,2 41 1
A122N/G124S/A175S/S222A
0,1 3316 102 83 0,3 44 1
T128N/P129A/A175S/Q286R
0,1 6160 151 94 0,2 35 1
A122N/G124S/A175S/Q286R
0,1 4097 139 93 0,2 49 1
Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R/H373F
0,1 480 26 30 2,1 79 1
V258D/E296V/M298Q/H373F
0,1 90 8,7(á), 20(â) 14 11,1 321 1
H257A/Q286R/M298Q
0,1 1029 42 48 1,0 59 1
Intercambio de Gla FIX /T128N/ P129A/A175S/S222A/Q286R
0,1 2787 38(á), 134(â) 88 0,4 69 1
Intercambio de Gla FIX /A122N/G124S/A175S/S222A/Q2 86R
0,1 3492 148 95 0,3 61 1
T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q
0,1 5120 171 96 0,2 48 1
A122N/G124S/ A175S/Q286R/M298Q
0,1 3681 154 92 0,3 61 1
T128N/P129A/A175S/S222A/ H257A/Q286R/M298Q
0,1 3140 113 87 0,3 52 1
A122N/G124S/A175S/S222A /H257A/Q286R/M298Q
0,1 2659 37,(á),13 0(â) 85 0,4 70 1
T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q/H373F
0,1 3580 118 88 0,3 48 1
A122N/G124S/A175S/Q286R/ M298Q/H373F
0,1 3148 105 84 0,3 48 1
V158D/Q286R/E296V/M298 Q/H373F
0,1 124 20 17 8,1 237 1
M298Q/H373F/Q366N
0,1 169 8 8,2 5,9 69 1
T239V/M298Q/H373F
0,1 110 18 16 9,1 235 1
T2391/M298Q/H373F
0,1 562 26 28 1,8 66 1
T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N/H373F
0,1 607 29 30 1,6 69 1
T239V/Q286R/M298Q/ Q366N
0,1 729 29 30 1,4 57 1
T239I/Q286R/M298Q/Q366N
0,1 1548 72 73 0,6 67 1
 = semivida alfa, que mide la semivida de distribución  = semivida beta, que mide la semivida de eliminación
La Tabla 24 expone los resultados del estudio usando los siguientes parámetros farmacocinéticos: % de Recuperación (in vivo) (la concentración en plasma de FVIIa medida a los 5 minutos después de la dosis (primer punto temporal) dividido por el máximo teórico de concentración en plasma de FVIIa (basándose en la masa de 5 FVIIa administrada y el volumen sanguíneo total teórico) por 100 %); % de Recuperación (in vitro) (la concentración de FVIIa medida en plasma con adición de una cantidad conocida de FVIIa dividida por la concentración en plasma de FVIIa teórica (basándose en la cantidad de FVIIa añadida a un volumen en plasma conocido) por 100 %); AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Dependiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven®
10 (Dependiente de FT) (calculado por AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)NoVoSeven® FVIIa/AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)FVIIa Mutante); AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Independiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven® (Independiente de FT) (calculada por AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa NovoSeven®/ AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa Mutante).
15
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imagen159
Ejemplo 10
Determinación de la unión del Factor VIIa con factor tisular soluble
5 La capacidad de las variantes de FVIIa expresadas a partir de células HEK 293 o BHK para unirse con el factor tisular soluble (FTs) se evaluó usando resonancia de plasmón superficial de Biacore. Las variantes de FVIIa se evaluaron mediante la medición del perfil de unión a tres concentraciones de proteasa en dos experimentos por duplicado, usando dos niveles diferentes de FTs unido con una microplaca CM5 de Biacore.
10 Se acopló una nueva microplaca sensora CM5 Serie S (GE Healthcare Cat nº BR1006-68) con albúmina de suero bovino y factor tisular soluble usando un instrumento T100 Biacore. Se llevó a cabo acoplamiento usando un tampón de acoplamiento Biacore (Na Hepes 30 mM pH 7,4, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 0,01 %) con un kit de acoplamiento de Amina (GE Healthcare Cat nº BR-1000-50) y el asistente de protocolo en el software T100 de Biacore. Para la inmovilización, se usaron las cuatro células de la microplaca. Las células 1 y 3 se acoplaron con
15 500 unidades de respuesta (UR) de proteína de referencia de albúmina de suero bovino diluida en tampón de acetato, pH 4,0 y las células 2 y 4 se acoplaron con 500 y 250 UR de FTs (R&D Systems) diluido en tampón de Acetato, pH 4,5.
Cada variante de FVIIa, y la proteasa FVIIa de tipo silvestre, se ensayaron a tres concentraciones y por duplicado.
20 Las proteasas se diluyeron a 60 nM, 30 nM y 15 nM en 100 l e tampón de Ensayo Biacore (Na Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %) en una placa de ensayo de 96 pocillos. Cada muestra se ensayó en el instrumento T100 Biacore usando 120 segundos de tiempo de contacto seguido de 180 segundos de tiempo de disociación a un caudal de 10 l/minuto. También se ensayó un blanco de tampón. La microplaca se regeneró con EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos y después 30 segundos. El
25 ensayo para medir la unión de FVIIa de tipo silvestre con FTs debería producir tres conjuntos de curvas que proporcionan una Kd de aproximadamente 8 nM.
Se usó software de evaluación Biacore T100 para analizar los datos. Específicamente, se utilizó el análisis de unión de Cinética/Afinidad 1:1, que ajusta los datos a la isoterma de Langmuir, y los datos se ajustaron individualmente
30 para dos repeticiones de cada variante en dos acoplamientos de unidades de respuesta. Los cuatro valores de Kd ajustados se promediaron y se presentan en la Tabla 25. Las variantes de FVIIa que contienen la mutación M298Q tendían a mostrar resultados de Kd menores y por lo tanto se unen más estrechamente con FTs.

Tabla 25. Unión de variantes de FVIIa con FT soluble
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (numeración de quimotripsina) Kd de afinidad (nM)
Células 293-F
Células BHK
wt
wt
7,9 9,0
Q286N
Q143N 8,9
Q286E
Q143E 3,8
Q286D
Q143D 9,8
Q286S
Q143S 8,2
Q286T
Q143T 10,6
Q286R
Q143R 7,6
Q286K
Q143K 8,2
Q286A
Q143A 6,3
Q286V
Q143V 11,9
S222A
S82A 4,2
H257S
H117S 4,2
Q366D
Q217D 3,2
Q366E
Q217E 5,6
Q366N
Q217N 3,8
Q366T
Q217T 7,1
imagen160
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (numeración de quimotripsina) Kd de afinidad (nM)
Células 293-F
Células BHK
Q366S
Q217S 9,0
Q366V
Q217V 7,9
A175S
A39S 6,5
V158T/L287T/M298K
V21T/L144T/M156K 8,4
V158D/L287T/M298K
V21D/L144T/M156K 8,5
Q286R/S222A
Q143R/S82A 7,3
Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX
Q143R/S82A/intercambio de Gla FIX 8,4
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 4,7
Q286R/M298Q/K341Q
Q143R/M156Q/K192Q 11,4
Q286R/M298Q/K199E
Q143R/M156Q/K60cE 4,9
S222A/M298Q
S82A/M156Q 5,1
H257A/M298Q
H117A/M156Q 3,1
S222A/H257A /Q286R/M298Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 2,5
Q286R/Q366V
Q143R/Q217V 29,3
A175S/Q286R/Q366V
A39S/Q143R/Q217V 18,3
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 8,6
Q286M
Q143M 7,1
Q286L
Q143L 7,1
Q286Y
Q143Y 7,5
Q366I
Q217I 6,7
Q366L
Q217L 5,2
Q366M
Q217M 4,7
H216A/H257A
H76A/H117A 6,0
Q286R/K341D
Q143R/K192D 3,5
M298Q/K341D
Q143R/Q217D 7,9
Q286R/Q366N
Q143R/Q217N 8,0
Q286R/M298Q/Q366D
Q143R/M56Q/Q217D 4,6
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 3,8
Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la unión de variantes de FVIIa con FT soluble usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente, pero con una modificación del intervalo de dosis de FVIIa a 30 nM, 15 nM y 7,5 nM y el análisis de datos de modo que se usó un modelo de dos estados para ajustarse a los datos de RPS. Este análisis de modelo de dos estados se proporcionó en el conjunto de Software de Evaluación Biacore T100 y se reproduce a continuación. Los resultados se proporcionan en la Tabla 26, posteriormente.
imagen161
Mutación (numeración de FVII maduro)
Mutación (numeración de quimotripsina) Kd de afinid ad (nM) DT %CV Kd-WT/Kdmut de afinid ad n
WT (NovoSeven®)
WT (NovoSeven®)
6,5 1,2 19 % 1,2 19
WT (NovoSeven-RT®)
WT (NovoSeven-RT®)
6,3 85 % 13 % 1,2 4
WT
WT
7,6 1,9 24 % 1,0 6
WT †
WT †
3,9 0,6 15 % 1,0 6
T128N/P129A
T[128]N/P[129]A 6,8 1,2 18 % 1,1 7
Intercambio de Gla FIX
Intercambio de Gla FIX
36,0 2,6 7 % 0,2 3
K109N
K[109]N 10,8 0,2 2 % 0,7 2
S52A/S60A
S[52]A/S[60]A 23,2 4,0 17 % 0,3 2
M298Q
M156Q 5,9 0,7 11 % 1,3 4
M298Q †
M156Q † 1,9 0,1 7 % 2,0 2
T128N/P129A/M298Q †
T[128]N/P[129]A/M156Q † 2,4 0,4 16 % 1,6 2
V158D/E296V/M298Q
V21D/E154V/M156Q 2,0 0,5 26 % 3,9 10
V158D/E296V/M298Q †
V21D/E154V/M156Q † 1,8 0,5 30 % 2,2 4
T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q
T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/ M156Q 2,0 0,1 4 % 3,9 2
S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q
S[52]A/S[60]A/V21D/E154V/M 156Q 14,6 1,3 9 % 0,5 2
Q286R
Q143R 6,7 0,4 5 % 1,1 2
T128N/P129A/Q286R
T[128]N/P[129]A/Q143R 11,1 4,3 39 % 0,7 6
T128N/P129A/Q286R †
T[128]N/P[129]A/Q143R † 10,0 1,6 16 % 0,4 4
S52A/S60A/Q286R
S[52]A/S[60]A/Q143R † 51,6 18,4 36 % 0,1 5
S222A
S82A 2,6 0,1 4 % 3,0 2
T128N/P129A/S222A
T[128]N/P[129]A/S82A 3,6 0,2 7 % 2,1 2
S52A/S60A/S222A
S[52]A/S[60]A/S82A 17,2 2,4 14 % 0,4 2
H257S
H117S 6,6 1,5 23 % 1,2 2
Intercambio de GlaFIX/Q366V
Intercambio de Gla FIX/Q217V 56,0 15,1 27 % 0,1 3
A175S
A39S 12,3 0,1 1 % 0,6 2
K109N/A175S
K[109]N/A39S 9,0 0,0 0 % 0,8 2
S119N/L121S/A175S
S[119]N/L[121]S/A39S 6,6 0,1 1 % 1,1 2
T128N/P129A/A175S
T[128]N/P[129]A/A39S 10,0 0,1 1 % 0,8 2
A122N/G124S/A175S
A[122]N/G[124]S/A39S 12,1 2,2 18 % 0,6 2
Q286R/H257A
Q143R/H117A 7,2 1,0 13 % 1,1 2
Q286R/H257A †
Q143R/H117A † 5,5 0,1 2 % 0,7 2
Q286R/S222A
Q143R/S82A 3,4 0,2 6 % 2,3 2
Intercambio de Gla FIX/ T128N/P129A/ S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/ T[128]N/P[129]A/ S82A/Q143R 21,3 5,6 26 % 0,4 6
Intercambio de Gla FIX/ T128N/P129A/S222A/Q286R †
Intercambio de Gla FIX/ T[128]N/P[129]A/S82A/Q143R † 24,6 6,4 26 % 0,2 6
Intercambio de Gla FIX/ S52A/S60A/S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/ S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R 56,9 8,5 15 % 0,1 2
Q286R/S222A/H257A
Q143R/S82A/H117A 6,0 0,5 8 % 1,3 2
imagen162
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 4,1 0,5 11 % 1,9 9
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q † 3,6 1,1 29 % 1,1 13
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q§ 3,2 0,2 7 % 1,2 4
Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q 30,4 5,4 18 % 0,3 3
Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q †
Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q † 22,1 1,5 7 % 0,2 8
T128N/P129A/Q286R/ M298Q
T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q 4,7 1,2 26 % 1,6 5
T128N/P129A/Q286R/ M298Q †
T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q † 3,9 0,4 11 % 1,0 8
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/ M298Q
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/M 156Q 20,8 1,4 7 % 0,4 5
Intercambio de Gla FIX /T128N/P129A/Q286R/ M298Q †
Intercambio de Gla FIX /T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q † 37,5 12,3 33 % 0,1 8
{Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/Q143R/M156Q 38,5 7,4 19 % 0,2 2
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M156Q 35,3 3,4 10 % 0,2 2
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q †
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M156Q † 23,7 3,6 15 % 0,2 2
{Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/Q143R/M156Q 40,8 6,4 16 % 0,2 3
{Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/Q143R/M156Q 16,7 2,4 14 % 0,5 2
S52A/S60A/ Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 25,1 1,7 7 % 0,3 3
Intercambio de Gla FIX /S52A/S60A/Q286R/M298Q †
Intercambio de Gla FIX/ S[52]A/S[60]A/Q143R/M156 Q † 6,0 0,1 1 % 0,6 2
{Intercambio de Gla FIX/ M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M29 8Q
{Intercambio de Gla FIX/ M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/ Q143R/M156Q 4,9 0,1 1 % 1,6 2
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M29 8Q †
{Intercambio de Gla FIX/K[43]1}/T[128]N/P[129]A/Q 143R/M 156Q † 10,5 1,3 13 % 0,4 2
T239V
T99V 5,2 1,5 1
T139I
T99I 6,2 1,2 1
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/ M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/ Q143R/M156Q 2,6 0,3 11 % 3,0 2
T128N/P129A/S222A/ H257A/Q286R/M298Q †
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/ Q143R/M156Q † 4,0 0,2 4 % 1,0 2
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M 298Q
S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q1 43R/M156Q 11,1 2,7 24 % 0,7 2
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 N †
T[129]N/P[129]A/Q143R/M156 Q/Q217N † 3,2 0,6 18 % 1,2 2
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N †
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M156Q/Q21 7N † 13,0 0,7 5 % 0,3 2
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T[128]N/P[129]A /Q286R/M298Q/Q366N †
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/T[128]N/P[129]A/Q 143R/M 156Q/Q217N † 13,1 0,3 2 % 0,3 2
T128N/P129A/Q286R/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/H224 F 6,8 0,0 0 % 1,1 2
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156 Q/H224F 3,1 0,1 4 % 2,4 2
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/ H224F 23,4 7,5 32 % 0,3 3
T128N/P129A/M298Q/H373F †
T[128]N/P[129]A/M156Q/H224 F † 1,3 0,5 41 % 3,1 2
V21D/Q143R/E154V/M156Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q
2,2 0,2 8 % 3,5 2
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R 19,1 7,7 40 % 0,4 7
imagen163
Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R †
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R † 14,9 0,4 3 % 0,3 2
T239V/Q286R/M298Q
T99V/Q143R/M156Q 2,5 0,1 4 % 3,1 2
Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/T99V/Q143R/M156Q 22,7 6,8 30 % 0,3 6
Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q †
Intercambio de Gla FIX/T99V/Q143R/M156Q † 25,7 9,2 36 % 0,2 6
T128N/P129A/T239V/Q286R /M298Q †
T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/ M156Q † 7,8 0,6 8 % 0,5 2
S222A/T239V/H257A/ Q286R/M298Q
S82A/T99V/H117A/Q143R/ M156Q 2,2 0,0 2 % 3,4 2
T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/ Q286R/M298Q †
[T128]N/P[129A]/S82A/T99V/H 117A/Q143R/M156Q † 3,6 0,7 18 % 1,1 2
T128N/P129A/T239V/Q286R /M298Q/H373F †
T[128N]/P129]A/T99V/Q143R/ M156Q/H224F † 3,9 0,1 3 % 1,0 2
T239I/Q286R
T99I/Q143R 8,0 0,2 3 % 1,0 2
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239l/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99I/Q143R 39,6 1,2 3 % 0,2 2
Intercambio de Gla FIX / T239I/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/T99I/Q143R/M156Q 13,1 2,1 16 % 0,6 2
T128N/P129A/T239I/Q286R/ M298Q †
[T128]N/P[129A]/T99I/Q143R/ M156Q † 5,1 0,9 18 % 0,8 2
T239I/Q286R/H373F
T99I/Q143R/H224F 7,8 0,1 1 % 1,0 2
V158D/T239V/E296V/M298 Q
V21D/T99V/E154V/M156Q 1,7 0,6 32 % 4,4 4
V158D/T239V/E296V/M298 Q †
V21D/T99V/E154V/M156Q † 1,9 0,7 36 % 2,1 4
T239V/Q286R
T99V/Q143R 2,3 0,0 1 % 1,7 2
T128N/P129A/T239I/ Q286R/M298Q/H237F †
T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/ M156Q/H224F † 3,4 0,0 0 % 1,2 2
Intercambio de Gla FIX/ Q286R/S222A/H257S
Intercambio de Gla FIX/Q143R/S82A/H117S 34,3 9,1 27 % 0,2 3
S222A/Q286R/M298Q/ H373F
S82A/Q143R/M 156Q/H224F 2,1 0,1 6 % 3,7 2
Intercambio de Gla FIX/S222A/ Q286R/M298Q/H373F
Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q/H224F 9,5 0,9 9 % 0,8 2
T128N/P129A/A175S/ Q366V
T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 6,5 12,0 184 % 1,2 2
A122N/G124S/A175S/ Q366V
A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V 13,0 0,6 5 % 0,6 2
T128N/P129A/A175S/ S222A
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 4,5 0,3 7 % 1,7 2
A122N/G124S/A175S/ S222A
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 7,0 0,6 9 % 1,1 2
T128N/P129A/A175S/ Q286R
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R 8,6 0,1 1 % 0,9 2
A122N/G124S/A175S/ Q286R
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 8,6 0,0 0 % 0,9 2
Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/H373F
Intercambio de Gla FIX/ S82A/Q143R/H224F 40,9 7,5 18 % 0,2 3
Intercambio de Gla FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q2 86R
Intercambio de Gla FIX/A[122]N/G[124]S/A39S/S8 2A/Q143R 43,7 14,0 32 % 0,2 2
T128N/P129A/A175S/ Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/ M156Q 5,5 0,0 0 % 1,4 2
A122N/G124S/A175S/ Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R /M156Q 5,3 0,1 2 % 1,4 2
T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/ Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H 117A/Q143R/M156Q 6,7 0,8 11 % 1,1 2
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/ Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/ H117A/Q143R/M156Q 7,7 0,6 8 % 1,0 2
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q /H373F
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/ M156Q/H224F 7,4 3,2 43 % 1,0 2
A122N/G124S/A175S/ Q286R/M298Q/H373F
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R /M156Q/H224F 5,0 0,1 3 % 1,5 2
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F
V21 D/Q143R/E154V/M156Q/H224 F 1,7 0,5 27 % 4,5 3
M298Q/Q366N/H373F †
M156Q/Q217N/H224F † 1,6 0,9 60 % 2,5 4
T239V/M298Q/H373F †
T99V/M156Q/H224F † 3,5 0,4 11 % 1,1 2
T239I/M298Q/H373F †
T99I/M156Q/H224F 2,3 0,6 24 % 1,7 4
T128N/P129A/Q286R/
T[128]N/P[129]A/Q143R/ 2,6 0,6 23 % 1,5 2
imagen164
M298Q/Q366N/H373F †
M156Q/Q217N/H224F †
T239V/Q286R/M298Q /Q366N †
T99V/Q143R/M156Q /Q217N † 4,1 0,3 8 % 0,9 2
T239I/Q286R/M298Q/Q366N †
T99I/Q143R/M156Q/Q217N † 2,4 0,6 27 % 1,6 2
† producido en células CHOX § producido en el clon de línea celular estable CHOX 52-5F7
Ejemplo 11
Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+
5 Se ensayaron variantes de FVIIa, expresadas a partir de células HEK 293 o BHK, con respecto a resistencia a la inhibición por Zn2+ tanto en presencia como en ausencia de factor tisular soluble. Brevemente, se diluyó ZnCl2 (Aldrich) a 20 mM en dH2O y después a 4 mM en tampón de ensayo 1x (Na Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 1,5 mM, Tween-20 0,01 % y PEG-8000 0,01 %). Se realizaron diluciones dobles en serie para generar once
10 concentraciones de cinc, hasta 3,9 M, a través de una placa de 96 pocillos. El último pocillo en la fila contenía tampón sin cinc para medir la actividad proteolítica de FVIIa no inhibido. Las variantes de FVIIa, y la proteasa de tipo silvestre, se diluyeron hasta 500 nM y después de nuevo 10 veces hasta 50 nM. Esta solución de reserva 50 nM se usó para ensayos realizados sin factor tisular soluble (FTs, R&D Systems). Para ensayos con factor tisular soluble, la proteasa se diluyó de nuevo en tampón de ensayo 1X con FTs hasta concentraciones finales de 12,5 nM y 125
15 nM, respectivamente. Las soluciones se preincubaron durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
Para comenzar la reacción de inhibición, se mezclaron 20 l de la solución de FVIIa/FTs o FVIIa con 60 l de la serie de cinc en cada fila para diez concentraciones. Para reacciones de inhibición solamente con FVIIa, las mezclas se iniciaron usando ZnCl2 2 mM, y para FVIIa/FTs, se iniciaron usando ZnCl2 4 mM. La placa se incubó durante 30
20 minutos a temperatura ambiente. Para ensayar la inhibición por Zn2+, se añadieron 20 l de sustrato de FVIIa (MesildFPR-ACC, disuelto hasta 20 mM en DMSO y diluido en tampón de ensayo) a los pocillos hasta una concentración final de 90 M. Las concentraciones de FTs y cinc se mantuvieron en el ensayo añadiéndolas según fuera apropiado a la solución de sustrato. El aumento de fluorescencia (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) se midió durante 60 minutos a 30 ºC en un lector de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). La actividad proteolítica residual se calculó a
25 cada concentración de cinc dividiendo la tasa inhibida por la tasa de proteasa no inhibida. Se calculó la concentración de Zn2+ necesaria para inhibir la mitad de la actividad proteolítica (K0,5) representando la concentración de cinc frente a actividad residual, y ajustando con una ecuación hiperbólica usando software XLFit4 (IDBS). Cada proteasa se ensayó dos veces en dos ocasiones separadas para obtener un valor promedio para la K0,5.
30 Los resultados se proporcionan en la Tabla 27. Las mutaciones de H257 y H216 aumentaron la resistencia aproximadamente 3 veces. Las mutaciones M268Q también aumentaron la resistencia a cinc 3 veces. En todos los casos, el efecto se conservó en grados diferentes cuando se combinó con mutaciones adicionales. Las variantes más resistentes fueron combinaciones de las mutaciones anteriores: H216A/H257A-FVIIa y H257A/M298Q-FVIIa.
35
Tabla 27. Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+
Mutación (numeración de FVIImaduro)
Mutación (numeración dequimotripsina) K0,5 (mM)
HEK 293
BHK
WT
WT
87,0 42,0
M298Q
M156Q 187,3
Q286R
Q143R 30,1 22,5
H216S
H76S 231,0
H216A
H76A 244,5
H216K
H76K 248,8
H216R
H76R 316,5
S222A
S82A 87,5 63,8
S222K
S82K 73,0
H257A
H117A 217,5 113,0
H257S
H117S 149,7 128,0
K161S
K24S 51,5
imagen165
Mutación (numeración de FVIImaduro)
Mutación (numeración dequimotripsina) K0,5 (mM)
HEK 293
BHK
K161A
K24A 73,5
K161V
K24V 79,5
Q286R/S222A
S82A/Q143R 24,5
Q286R/S222A/ Intercambio de Gla FIX
S82A/Q143R/intercambio de Gla FIX 34,0
S222A/M298Q
S82A/M156Q 138,0
H257A/M298Q
H117A/M156Q 481,0
S222A/H257A/Q286R/M298 Q
S82A/H117A/Q143R/M156Q 180,6
S222A/Q286R/Q366V
S82A/Q143R/Q217V 40,5
S222V
S82V 86,8
S222D
S82D 89,5
S222N
S82N 94,6
S222E
S82E 110,5
H216A/H257A
H76A/H117A 407,5
H216A/S222A
H76A/S82A 226,0
H257S/Q286R
H117S/Q143R 316,5
S222A/H373A
S82A/H224A 94,0
Ejemplo 12
Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente activa usando el titulante de sitio activo 45 metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB)
En algunos casos, la concentración de FVIIa catalíticamente activo en una solución de reserva se determinó
valorando un complejo de FVIIa y factor tisular soluble (FTs) con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB), un
sustrato de éster fluorogénico desarrollado como un sitio activo para serina proteasa de tipo tripsina. El ensayo se 10 llevó a cabo esencialmente como se describe en Payne et al. (Biochemistry (1996) 35: 7100-7106) con algunas
modificaciones menores. MUGB reacciona fácilmente con FVIIa, pero no FVII o proteasa inactiva, para formar un
intermedio de acil-enzima eficazmente estable en condiciones en las que la concentración de MUGB es saturante y
la desacilación es especialmente lenta y limitante de la velocidad para catálisis. En estas condiciones, la proteasa
FVIIa experimenta una única renovación catalítica para liberar el fluoróforo 4-metilumbeliferona (4-MU). Cuando se 15 calibre el estallido inicial de fluorescencia a una curva patrón de concentración externa de fluorescencia de 4-MU,
puede calcularse la concentración de sitios activos.
Se realizaron ensayos con un volumen de reacción de 1 ml o 2 ml en una cubeta de cuarzo de 0,4 cm x 1 cm o 1 cm
x 1 cm, respectivamente, con agitación continua. Cada reacción contenía FTs 0,5 M (R&D Systems Human) en un 20 tampón de ensayo que contenía Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y PEG 8000 0,1 %, pH 7,6. La solución
patrón de 4-MU se preparó nueva a una concentración de reserva de 0,5 M en DMSO y la concentración se confirmó
mediante espectroscopia de absorbancia a 360 nm usando un coeficiente de extinción de 19.000 M-1 cm-1 en tampón
Tris 50 mM, pH 9,0. Se preparó MUGB a una concentración de reserva de 0,04 M en DMSO basándose en el peso
seco. Se iniciaron ensayos añadiendo 4 l de MUGB 4 mM (para la reacción de 2,0 ml) o MUGB 2 mM (para la 25 reacción de 1,0 ml) (en cada caso una concentración final de 8 M) a una solución de FTs 0,5 M (20,2 l o 10,1 l
de FTs 49,4 M) en tampón de ensayo 1x y midiendo en primer lugar la hidrólisis de fondo de MUGB durante 150
200 segundos antes de la adición de FVIIa o una variante de FVIIa a una concentración final de 100-200 nM
basándose en el ELISA inicial (Ejemplo 1C.1) o la valoración del sitio activo con FFR-CMK (Ejemplo 3). La liberación
de fluorescencia de 4-MU en la fase de estallido de la reacción se siguió durante 1000-1200 segundos adicionales. 30 Se preparó una curva patrón de 4-MU libre por valoración de la 4-MU calibrada por absorbancia en tampón de
ensayo 1x que contenía FTs 0,5 M en etapas de 20 nM hasta una concentración final de 260-300 nM.
Para análisis de datos, se importaron trazas de reacción al paquete de software Graphpad Prism y se restó la contribución de hidrólisis de fondo de la curva por extrapolación de la tasa medida inicial de hidrólisis de MUGB espontánea, que era típicamente menor de 5 % del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se ajustó a una única ecuación exponencial con un componente lineal (para explicar la lenta velocidad de desacilación) de la forma fluorescencia = Amp(1-e-kt)+Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido en las condiciones de ensayo de saturación representadas anteriormente, k es la constante de velocidad de primer orden observada para
imagen166
5 formación de acil-enzima y B es una constante de velocidad aparente asociada con la renovación completa de MUGB. La concentración de proteasa FVIIa activa se calcula por comparación del parámetro de ajuste con respecto a amplitud para la curva patrón de 4-MU. Se midieron los valores de múltiples ensayos, se promediaron y se determinó la desviación típica.
Ejemplo 13
Actividad específica de polipéptidos variantes de FVIIa para mesil-dFPR-ACC
Para evaluar la actividad de variantes de FVIIa, se determinó la actividad (actividad/mol) de polipéptidos de FVIIa
15 para escisión de un sustrato de ACC tripeptídico (Mesil-dFPR-ACC) en un conjunto de condiciones de ensayo normalizadas. El ensayo implicaba una preincubación de polipéptidos de FVIIa con una cantidad de saturación de FTs antes de dilución en el sustrato de mesil-dFPR-ACC. Las tasas iniciales de escisión de sustrato se siguieron después por la evaluación del aumento de fluorescencia de ACC. Las fases iniciales de liberación de fluorescencia se normalizaron a una curva patrón de ACC interna y se presentaron los datos como moles/s/moles de FVIIa.
Para preparar las reacciones, cada muestra de FVIIa para ensayar se diluyó en una placa de almacenamiento de polipropileno hasta 200 nM en tampón de ensayo 1x (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,1 %, PEG8000 0,1 %, pH 7,5). Cuando fue necesario, se preparó una dilución 1:10 del FVIIa de reserva de modo que el volumen pipeteado mínimo fue de 5 l. Se preparó una dilución de factor tisular soluble (FTs) de reserva (R&D 25 Systems) hasta una concentración final de 1,0 M con un volumen apropiado de tampón de ensayo 1X necesario para dar cuenta de la exploración de 8 a 32 proteasas/placa. Por ejemplo, cuando se ensayaron 8 proteasas, se requirieron 1,0 ml de FTs 1,0 M/placa, mientras que para ensayar 32 proteasas, se requirieron 2,5 ml de FTs/placa. Las muestras de FVIIa formaron complejo con FTs a una concentración final de FVIIa 100 nM/FTs 500 nM en un volumen de ensayo de 50 l mezclando 25 l de variante de FVIIa 200 nM con 25 l de FTs 1,0 M en la placa de almacenamiento de polipropileno. Después se incubaron reacciones de complejo de FVIIa/FTs a temperatura ambiente durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio. Después del periodo de equilibrado, se distribuyeron 10 l de cada reacción de complejo de FVIIa/FTs a la fila correspondiente de una placa de ensayo negra de media área de 96 pocillos (Costar). Las variantes de FVIIa y controles se ensayaron por triplicado. El sustrato de mesil-dFPR-ACC se preparó hasta 1,1X la concentración final de 0,09 mM para dar cuenta de la dilución 1:10 del polipéptido de
35 FVIIa en sustrato. Para una placa de media área de 96 pocillos completa, se prepararon 20 ml de sustrato de mesildFPR-ACC 0,1 mM en tampón de ensayo 1X por dilución del sustrato de reserva almacenado en DMSO seco.
El ensayo se procesó en una estación de trabajo automática BioMek® FX (Beckman Coulter) equipada con una cabeza de 96 puntas (puntas de 130 l MBP BioRobotix ART®). La placa de ensayo (predistribuida con 10 l de las reacciones de FVIIa/FTs) se colocó en la cubierta de la estación de trabajo con un depósito de un único canal cargado de la solución de mesil-dFPR-ACC 1,1 X. La temperatura del lector de placas se ajustó a 37 ºC. La estación de trabajo BioMek® FX inició el ensayo transfiriendo 90 l desde el depósito de un único canal cargado con el sustrato de mesil-dFPR-ACC 1,1X a cada pocillo de la placa de ensayo negra que contenía 10 l de FVIIa/FTs. Las concentraciones finales de las variantes de FVIIa, FTs y la concentración de Mesil-dFPR-ACC en el ensayo fueron
45 de 10 nM, 50 nM y 0,09 mM, respectivamente. La estación de trabajo mezcló después 70 l de la muestra de 100 l dos veces. La placa de ensayo negra se transfirió a un lector de placas SpectraMax Gemini (Molecular Devices) y las velocidades de reacción iniciales se siguieron durante 10 minutos a 37 ºC.
Después de completar el ensayo, se leyó una placa que contenía una curva patrón de ACC libre (100 l/pocillo) en el mismo lector de placas SpectraMax Gemini y se usó para proporcionar una conversión precisa de UFR/s a M/s. La placa convencional se preparó de la siguiente manera. En todos los pocillos “de número par” (es decir cada segundo pocillo) de la fila superior de una placa de ensayo de media área negra de 96 pocillos, la muestra de ACC 1 mM se diluyó a 25 nM en Tampón de Ensayo 1X hasta un volumen final de 200 l (5 l de ACC 1 mM en 195 l de Tampón de Ensayo 1x). Se pipetearon cien l de Tampón de Ensayo 1x en todos los pocillos restantes de las columnas “de
55 número par”. El sustrato de ACC se diluyó en serie 1:1 por las columnas pares para generar 6 concentraciones de ACC más. La última fila se dejó solamente con 100 l de Tampón de Ensayo 1x (es decir sin ACC). La fluorescencia se midió usando una versión de lectura de puntos finales de las condiciones de ensayo y se representó una gráfica de fluorescencia frente a concentración de ACC. La pendiente de la línea a través de estos puntos proporcionó el factor de conversión de UFR a M.
Se usó software SoftMax Pro (Molecular Devices) para analizar los datos para la lectura de placas así como la curva patrón. El archivo que contenía los datos se guardó y se exportó como un archivo de texto ASCII, que se importó al programa Microsoft Excel, se procesó y se analizó usando una plantilla creada en Microsoft Excel. Tras importar los datos a la plantilla de Microsoft Excel, se calculó el promedio de conversión de UFR/M a partir de la pendiente de la 65 curva patrón de ACC y se usó para proporcionar un factor de conversión que cambió los datos de placas de UFR/s a
imagen167
la medición de actividad en  mol/s/mol, y se calculó por las siguientes expresiones:
5 Datos promedio (UFR/s) * factor de conversión (UFR/M) = Actividad (en M/s) Actividad específica (en mol/s/mol) = [(M/s)* (100 l)*(1/1000000)]/[(10 nM)*(100 l)*(1/1000000)*(1/1000)]
La Tabla 28 expone la actividad específica de las variantes de FVIIa que se ensayaron, incluyendo la actividad
10 relativa al FVIIa de tipo silvestre. También se incluyen la desviación típica (DT) y el coeficiente de variación (como porcentaje; %CV). Varias variantes de FVIIa mostraron actividad específica aumentada para escisión de MesildFPR-ACC en comparación con el polipéptido de FVIIa de tipo silvestre. Por ejemplo, Q366V-FVIIa mostró actividad específica para escisión de Mesil-dFPR-ACC que era 4 veces mayor que la observada con la variante de FVIIa de tipo silvestre. Las variantes de FVIIa que contenían la mutación H373F también tendían a mostrar actividad
15 específica aumentada para escisión de Mesil-dFPR-ACC en comparación con el polipéptido de FVIIa de tipo silvestre.
Tabla 28. Actividad específica de polipéptidos de FVIIa para Mesil-dFPR-ACC
Mutación (numeración de FVIImaduro)
Mutación (numeración dequimotripsina) Activi dad ((mol / s/mol ) DT %C V Activi dad (%WT) n
WT (NovoSeven®)
WT (NovoSeven®)
2,31 0,3 4 0,1 5 100 % 3
WT
WT
2,40 0,1 5 0,0 6 104 % 4
T128N/P129A
T[128]N/P[129]A 2,50 108 % 1
Intercambio de Gla FIX
Intercambio de Gla FIX
1,63 71 % 1
A122N/G124S
A[122]N/G[124]S 2,24 97 % 1
S52A/S60A
S[52]A/S[60]A 1,95 85 % 1
V158D/E296V/M298Q
V21D/E154V/M156Q 3,28 142 % 1
T128N/P129A/V158D/ E296V/M298Q
T[128]N/P[129]A/V21D/ E154V/M156Q 3,26 142 % 1
S52A/S60A/V158D/ E296V/M1298Q
S[52]A/S[60]A/V21D/ E154V/M156Q 2,56 111 % 1
Q286R
Q143R 1,24 54 % 1
T128N/P129A/Q286R
T[128]N/P[129]A/Q143R 1,21 52 % 1
S52A/S60A/Q286R
S[52]A/S[60]A/Q143R 0,44 0,1 1 0,2 5 19 % 2
S222A
S82A 2,35 102 % 1
T128N/P129A/S222A
T[128]N/P[129]A/S82A 2,70 117 % 1
S52A/S60A/S222A
S[52]A/S[60]A/S82A 1,22 53 % 1
H257S
H117S 2,64 115 % 1
H373F
H224F 1,17 51 % 1
Q366V
Q217V 9,29 403 % 1
Intercambio de Gla FIX/Q366V
Intercambio de Gla FIX/Q217V 2,82 122 % 1
K109N/A175S
K[109]N/A39S 3,38 147 % 1
Q286R/H257A
Q143R/H117A 1,96 85 % 1
Intercambio de Gla FIX/ T128N/P129A/ S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129)A/ S82A/Q143R 0,53 23 % 1
Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/S222A/ Q286R
Intercambio de Gla FIX/S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R 0,44 0,4 2 0,9 6 19 % 2
Q286R/M298Q
Q143R/M156Q 1,91 0,1 1 0,0 6 83 % 5
Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q 1,53 66 % 1
T128N/P129A/Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 1,80 78 % 1
imagen168
Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/ M298Q
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 0,78 34 % 1
{Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/Q143R/M156Q 1,16 50 % 1
{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M156Q 1,20 52 % 1
{Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/Q143R/M156Q 1,11 48 % 1
{Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R/M298Q
{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/Q143R/M156Q 1,26 55 % 1
S52A/S60A/ Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/Q143R/ M156Q 1,08 0,1 7 0,1 5 47 % 2
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/ M298Q
T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 1,66 72 % 1
S52A/S60A/S222A/ H257A/Q286R/M298Q
S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R/ M156Q 0,98 42 % 1
H257S/Q286R/Q366V
H117S/Q143R/Q217V 2,00 0,1 7 0,0 8 87 % 2
S222A/H257A/Q286R/ Q366V
S82A/H117A/Q143R/Q217V 2,43 105 % 1
Q286R/M298Q/Q366N
Q143R/M156Q/Q217N 2,35 102 % 1
Q286R/H373F
Q143R/H224F 0,78 34 % 1
T128N/P129A/ Q286R/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/ H224F 2,31 100 % 1
S52A/S60A/ Q286R/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/ H224F 3,14 136 % 1
Q286R/M298Q/H373F
Q143R/M156Q/H224F 4,59 199 % 1
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F
T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H22 4F 2,83 123 % 1
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F
S[52]A/S[60]A/Q143R/ M156Q/H224F 5,02 218 % 1
M298Q/H373F
M156Q/H224F 4,00 174 % 1
V21D/Q143R/E154V/M156Q
V21D/Q143R/E154V/ M156Q 1,83 79 % 1
S222A/T239V
S82A/T99V 1,91 83 % 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R 0,66 28 % 1
T239V/Q286R/M298Q
T99V/Q143R/M156Q 1,74 75 % 1
Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/T99V/Q143R/M156Q 1,13 49 % 1
S222A/T239V/H257A/ Q286R/M298Q
S82A/T99V/H117A/Q143R/M156Q 1,66 72 % 1
T239V/Q286R/H373F
T99V/Q143R/H224F 1,53 66 % 1
T239V/Q286R/M298Q/H373F
T99V/Q143R/M156Q/ H224F 3,07 133 % 1
V158D/T239I/E296V/M298Q
V21D/T99I/E154V/M156Q 2,24 97 % 1
T239I/Q286R
T99I/Q143R 0,88 38 % 1
S222A/T239I
S82A/T99I 1,36 59 % 1
Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R
Intercambio de Gla FIX /S82A/T99I/Q143R 0,25 11 % 1
T239I/Q286R/M298Q
T99I/Q143R/M156Q 1,37 60 % 1
Intercambio de Gla FIX / T239I/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX/T99I/Q143R/M156Q 0,67 29 % 1
S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q
S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 1,41 61 % 1
T239I/Q286R/H373F
T99I/Q143R/H224F 1,24 54 % 1
V158D/T239V/E296V/M298Q
V21D/T9V/E154V/ M156Q 2,19 0,1 5 0,0 7 95 % 3
T239V/Q286R
T99V/Q143R 1,26 0,1 4 0,1 1 55 % 2
T239I/Q286R/M298Q/H237F
T99I/Q143R/M156Q/H224F 1,59 0,2 1 0,1 3 69 % 3
H257S/Q286R/M298Q
H117S/Q143R/M156Q 1,85 0,2 3 0,1 3 80 % 2
imagen169
Intercambio de Gla FIX/Q286R/S222A/H257S
Intercambio de Gla FIX /Q143R/S82A/H117S 0,49 0,0 4 0,0 9 21 % 2
S222A/H257S/Q286R/ M298Q
S82A/H117S/Q143R/M156Q 1,77 0,2 3 0,1 3 77 % 2
H257S/Q286R/M298Q/ H373F
H117S/Q143R/M156Q/H224F 2,32 0,4 1 0,1 8 101 % 3
S222A/Q286R/M298Q/ H373F
S82A/Q143R/M156Q/ H224F 2,79 0,3 9 0,1 4 121 % 2
Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F
Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R/M156Q/H224F 1,92 83 % 1
S222A/Q286R/M298Q
S82A/Q143R/M156Q 1,90 82 % 1
Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/M298Q
Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q 1,12 49 % 1
T128N/P129A/A175S/ Q366V
T[128]N/P[129]A/A39S/ Q217V 3,40 148 % 1
A122N/G124S/A175S/ Q366V
A[122]N/G[124]S/A39S/ Q217V 2,34 0,2 2 0,0 9 101 % 2
T128N/P129A/A175S/ S222A
T[128]N/P[129]A/A39S/ S82A 3,19 138 % 1
A122N/G124S/A175S/ S222A
A[122]N/G[124]S/A39S/ S82A 2,68 0,3 0 0,1 1 116 % 2
T128N/P129A/A175S/ Q286R
T[128]N/P[129]A/A39S/ Q143R 1,88 81 % 1
A122N/G124S/A175S/ Q286R
A[122]N/G[124]S/A39S/ Q143R 2,16 0,4 2 0,2 0 94 % 2
Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/H373F
Intercambio de Gla FIX/ S82A/Q143R/H224F 1,37 0,2 6 0,1 9 60 % 2
V158D/E296V/M298Q/ H373F
V21D/E154V/M156Q/ H224F 5,60 243 % 1
H257A/Q286R/M298Q
H117A/Q143R/M156Q 2,18 95 % 1
Intercambio de Gla FIX/ T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R
Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/Q1 43R 0,75 32 % 1
Intercambio de Gla FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q2 86R
Intercambio de Gla FIX/A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/Q1 43R 0,89 38 % 1
T128N/P129A/A175S/ Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156 Q 2,02 88 % 1
A122N/G124S/A175S/ Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156 Q 3,03 131 % 1
T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/ Q286R/M298Q
T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117A/ Q143R/M156Q 2,18 95 % 1
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/ Q286R/M298Q
A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117A/ Q143R/M156Q 1,99 86 % 1
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q /H373F
T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156 Q/H224F 2,78 121 % 1
A122N/G124S/A175S/ Q286R/M298Q/H373F
A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156 Q/H224F 2,71 118 % 1
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F
V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224F 1,89 82 % 1
Ejemplo 15
Activación de FX y determinación de la concentración de proteasa catalíticamente activa usando el titulante5 de sitio activo fluoresceín-mono-p’-guanidinobenzoato (FMGB)
La concentración del Factor X (FX), que es capaz de hacerse catalíticamente activo, en una solución de reserva del
cimógeno se determinó por activación de muestras de FX con Veneno de Víbora de Russell (RVV-asa) seguido de
valoración del Factor X activo (FXa) con fluoresceína-mono-p’-guanidinobenzoato (FMGB), un sustrato de éster 10 fluorogénico desarrollado como un titulante de sitio activo para serina proteasas de tipo tripsina. Después de la
activación, se llevó a cabo el ensayo de valoración de sitio activo esencialmente como se describe en Bock et al.
(Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273: 375-388) con algunas modificaciones menores. FMGB
reacciona fácilmente con FXa, pero no FX o proteasa inactiva, para formar un intermedio de acil enzima eficazmente
estable en condiciones en las que la concentración de FMGB es de saturación y la desacilación es especialmente 15 lenta y limitante de la velocidad para catálisis. En estas condiciones, la proteasa FXa experimenta una única
renovación catalítica para liberar el fluoróforo fluoresceína. Cuando el estallido inicial de fluorescencia se calibra a
una curva patrón de concentración externa de fluorescencia de fluoresceína, puede calcularse la concentración de

Claims (39)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende una modificación en un polipéptido de FVII, donde:
    5 la modificación está en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o en un resto correspondiente en un locus alineado en un polipéptido de FVII; la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con Arg (R); el polipéptido de FVII modificado, cuando se activa, muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido de FVII que no tiene la modificación en la posición 286; el polipéptido de FVII modificado comprende solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido no modificado y, opcionalmente, contiene un dominio Gla heterólogo o una parte del mismo; y el polipéptido de FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3.
    15
  2. 2.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1, donde el polipéptido de FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
  3. 3.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1, donde el polipéptido de FVII modificado es un fragmento catalíticamente activo que contiene un reemplazo en una posición correspondiente a la posición 286 en un polipéptido de FVII.
  4. 4.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que tiene solamente la modificación
    individual en la posición 286. 25
  5. 5.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que tiene una o dos o tres modificaciones adicionales además de la modificación en la posición 286.
  6. 6.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 5, en el que una modificación adicional es un remplazo, una inserción o una supresión de aminoácido.
  7. 7.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 5 o reivindicación 6, donde una modificación adicional es un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 287, 290, 292, 294,
    35 296, 298, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 y 396.
  8. 8. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende remplazos de aminoácidos seleccionados de entre Q286R, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/H257A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/S222A/H257A/Intercambio de Gla FIX, Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A294S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V, S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/H373A, S222A/H257A/Q286R/M298Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D, Q286R/Q366N, Q286R/H373F, T128N/P129A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/H373F, S52A/S60A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/H373F/, T239V/Q286R, T239V/Q286R/H373F, T239I/Q286R/H373F, T128N/P129A/A175S/Q286R y A122N/G124S/A175S/Q286R.
    45
  9. 9.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde toda o una parte contigua del dominio Gla de FVII nativo se retira y se remplaza con un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente de la misma para efectuar unión a fosfolípidos.
  10. 10.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 9, donde:
    el dominio Gla heterólogo es un dominio Gla de FIX; y el dominio Gla heterólogo contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre las posiciones 19, 40, 43 y 44 del domino Gla de FIX expuesto en SEQ ID NO: 83.
    55
  11. 11.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende uno o más remplazos de aminoácidos que introducen o eliminan uno o más sitios de glucosilación en comparación con el polipéptido de FVII no modificado.
  12. 12.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipéptido de FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
  13. 13.
    El polipéptido de FVII modificado de la reivindicacióin 12, que comprende una secuencia de aminoácidos
    expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 118, 131-137, 142-149, 151-153, 156, 279, 281, 285, 290, 292, 296, 299, 65 301, 305, 308, 310; 314, 316, 323, 334-336, 341 y 342.
    543
    imagen2
  14. 14. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipéptido no modificado es un polipéptido humano.
  15. 15.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipéptido no modificado 5 es un polipéptido no humano.
  16. 16. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que es un polipéptido maduro.
  17. 17.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde solamente se modifica la 10 secuencia primaria.
  18. 18. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que comprende una modificación química o una modificación postraduccional.
    15 19. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y 18, donde el polipéptido de FVII está glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol (PEG).
  19. 20.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que es un polipéptido 20 monocatenario.
  20. 21. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que es un polipéptido bicatenario.
  21. 22.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y 21 que está activado. 25
  22. 23. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, 21 y 22 que es un polipéptido de FVIa que se ha activado por escisión proteolítica entre los restos R152 y 1153 de SEQ ID NO: 3, dando como resultado una proteasa de dos cadenas unida por un enlace disulfuro (FVIIa).
    30 24. La forma bicatenaria activada del polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y 21.
  23. 25. La forma bicatenaria activada del polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 21, donde el polipéptido de FVII está completamente activado.
    35 26. Una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-25.
  24. 27.
    Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26. 40 28. El vector de la reivindicación 27, donde el vector es un vector procariota, vector viral o un vector eucariota.
  25. 29. El vector de la reivindicación 27 o 28, donde el vector es un vector de mamífero.
  26. 30.
    El vector de la reivindicación 27, donde el vector es un vector viral seleccionado de entre un adenovirus, un virus 45 adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus.
  27. 31. Una célula, que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 27-30.
  28. 32. La célula de la reivindicación 31, que es una célula eucariota. 50
  29. 33.
    La célula de la reivindicación 32, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.
  30. 34.
    La célula de la reivindicación 33, donde la célula de mamífero se selecciona de entre células de riñón de cría de
    hámster (BHK-21), células 293 y células CHO. 55
  31. 35. Una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-25 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  32. 36.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 35 que se formula para administración local, sistémica o tópica. 60
  33. 37. La composición farmacéutica de la reivindicación 35 o reivindicación 36 que se formula para administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular.
  34. 38.
    La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 35-37 que se formula para liberación 65 controlada.
    544
    imagen3
  35. 39.
    La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 35-38 que se formula para administración de dosificación individual.
  36. 40.
    El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-25 para uso en el tratamiento de una
    5 enfermedad o afección seleccionada de entre trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, deficiencia del factor VII, trastornos de sangrado, sangrado quirúrgico y sangrado resultante de traumatismo.
  37. 41. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 35-39 para uso para el tratamiento de una
    10 enfermedad o afección seleccionada de entre trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, deficiencia del factor VII, trastornos de sangrado, sangrado quirúrgico y sangrado resultante de traumatismo.
  38. 42. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 40 para uso en el tratamiento de un paciente que tiene 15 Hemofilia A con inhibidores o Hemofilia B con inhibidores.
  39. 43. La composición farmacéutica de la reivindicación 41 para uso en el tratamiento de un paciente que tiene hemofilia A con inhibidores.
    545
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