CN114072181A

CN114072181A - 监测基因疗法

Info

Publication number: CN114072181A
Application number: CN202080029191.8A
Authority: CN
Inventors: B·N·周; J·廖; S·戈尔多
Original assignee: Logic Biotherapy Co
Current assignee: Logic Biotherapy Co
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2022-02-18
Also published as: EP3955972A4; EP3955972A1; CA3135666A1; JP2022529433A; US20220308070A1; WO2020214582A1; BR112021020499A2; IL287186A; SG11202110584TA; AU2020258371A1; MA55727A; JP2024107256A; MX2021012541A; KR20220021906A

Abstract

除其他事项外，本公开提供了用于改进基因疗法的技术。除其他事项外，本公开提供了允许监测和/或评估基因疗法治疗的一种或多种特性，诸如像有效负载表达的程度、水平、和/或持久性的技术。在一些实施方案中，提供了对整合基因疗法特别有用的技术。

Description

监测基因疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月15日提交的美国临时申请号62/833,875的优先权，所述申请的内容通过引用整体并入。

序列表

本申请包含已以电子方式作为命名为“2012538-0082_SL.txt”的.txt文件提交的序列表。所述.txt文件创建于2020年4月10日，大小为26,104字节。所述序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

有一部分人类疾病可以追溯到胚胎发育早期遗传的或获得性的DNA变化。遗传疗法(也称为“基因疗法”)的开发人员特别关注的是由单个基因突变引起的疾病，称为单基因疾病。据信有超过6,000种单基因疾病。典型地，由遗传突变引起的任何特定遗传疾病都相对罕见，但总的来说，遗传相关疾病的死亡率较高。众所周知的遗传疾病包括囊性纤维化、杜氏肌营养不良症、亨廷顿病和镰状细胞性贫血。其他类别的遗传疾病包括代谢病症，如有机酸血症，以及溶酶体贮积病，其中功能失调的基因导致代谢过程的缺陷和有毒副产物的积累，这可能导致短期和长期的严重发病率和死亡率。

虽然基因疗法在治疗候选药物的开发方面受到了很多关注，但很少有人关注监测和评估基因疗法的有效性和轨迹的方法。需要新的方法和组合物以确保有效地应用基因疗法，包括与一种或多种另外的治疗相结合。

发明内容

除其他事项外，本公开展示了某些整合基因疗法技术可以产生新的生物标记物实体，其表达和/或活性可能与由基因疗法递送的目标有效负载(例如，由转基因编码和/或表达的产物)的表达和/或活性高度关联。此外，本公开教导这样的产生可以提供用于监测和/或以其他方式评估基因疗法和/或其成功、稳定性、维持等的策略。

除其他事项外，在一些实施方案中，已经发现目前公开的生物标记物可以直接从非侵入性地取自已接受基因疗法的受试者的生物样品中评估，并且此类生物标记物的评估可以提供关于有效负载的状态的信息，这将另外需要更多侵入性手术来确定。仅作为一个示例，本公开展示不需要进行组织活检来确定有效负载在组织中的递送或表达。相反，可以评估来自循环(例如，通过抽血)的生物标记物的分析以间接揭示有效负载在组织中的表达和/或活性的一个或多个方面。这可以简化和促进递送到细胞内位置的有效负载的分析。

在一些实施方案中，本公开提供了监测基因疗法的方法，所述方法包括以下步骤：在来自已接受整合基因疗法治疗的受试者的生物样品中，作为所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性的替代物，检测通过整合所述整合基因疗法治疗而产生的生物标记物的水平或活性，其中所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性选自由有效负载的水平、有效负载的活性、所述基因疗法治疗在细胞群中的整合水平及其组合组成的组。

在一些实施方案中，本公开提供了在已接受递送有效负载的基因整合组合物的受试者中监测所述有效负载的递送、水平和/或活性的方法，所述方法包括以下步骤：在来自所述受试者的生物样品中，作为所述有效负载的递送、水平和/或活性的替代物，检测通过整合所述基因整合组合物而产生的生物标记物的水平或活性。

在一些实施方案中，本公开提供了在已接受整合基因疗法治疗的受试者中确定基因疗法治疗状态的一种或多种特性的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供来自所述受试者的生物样品；b)确定生物标记物的水平，其中所述生物标记物是通过在所述受试者的基因组中整合所述基因疗法而产生的；以及c)基于所确定的所述生物标记物的水平，建立所述受试者中所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性，其中所确定的所述生物标记物的水平对应于所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性。

在一些实施方案中，本公开提供了向有需要的受试者递送基因疗法治疗的方法，所述方法包括以下步骤：a)向所述受试者施用整合基因疗法治疗，和b)在来自所述受试者的生物样品中，确定通过在所述受试者的基因组中整合所述基因疗法治疗而产生的生物标记物的水平。

在一些实施方案中，整合基因疗法治疗或基因整合组合物实现将包含编码有效负载的序列的核酸元件整合到受试者基因组中的靶位点中。本领域技术人员将理解，多个靶位点中的任一个都可能适用于如本文所述的方法和组合物。例如，在一些实施方案中，靶位点编码多肽(例如，白蛋白)。在一些实施方案中，核酸元件的整合发生在编码多肽的基因的5'或3'端。在一些实施方案中，靶位点编码白蛋白。

根据各个实施方案，可以如本文所述使用任何适合应用的有效负载。在一些实施方案中，有效负载是或包括肽/多肽/蛋白质、核酸(例如，shRNA、miRNA)及其任何组合。例如，在一些实施方案中，有效负载是或包括细胞内表达的肽。在一些实施方案中，有效负载是或包括细胞外分泌的肽。在一些实施方案中，有效负载是具有促进治疗医学疾患的生物过程的细胞内在或细胞外在活性的肽。在一些实施方案中，有效负载是在肝细胞中正常表达的肽。在一些实施方案中，有效负载是在肝细胞中异位表达的肽。在一些实施方案中，有效负载是甲基丙二酰基-CoA变位酶、α-1-抗胰蛋白酶或人因子IX。

如本文所述，许多实施方案包括使用一种或多种生物样品(例如，取自受试者的流体或组织样品)。根据本公开，考虑了多种生物样品中的任一种都与各个实施方案相容。例如，在一些实施方案中，生物样品是或包括毛发、皮肤、粪便、血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、眼泪、玻璃体液或粘液。

如本文所述，如适用于本文所述的方法和组合物的，检测(例如，检测信号，如生物标记物或可检测部分)可以以任何适合应用的方式实现。例如，在一些实施方案中，检测步骤是或包括免疫学测定或核酸扩增测定。

如本公开中所描述的，考虑了多种生物标记物的使用与各个实施方案相容。在一些实施方案中，生物标记物是或包括可检测部分，所述可检测部分在由靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由靶位点编码的多肽。在一些实施方案中，生物标记物是或包括可检测部分，所述可检测部分在由靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由有效负载编码的多肽。在一些实施方案中，生物标记物是或包括2A肽。在一些实施方案中，2A肽选自由P2A、T2A、E2A和F2A组成的组。在一些实施方案中，生物标记物可以是或包括弗林切割基序。在一些实施方案中，可检测部分可以是或包括与生物标记物(例如，抗体或其片段)结合的剂。

在一些实施方案中，核酸元件的整合不会显著破坏在靶位点编码的多肽的表达(即，靶位点处的多肽的表达基本上继续如受试者未接受整合基因疗法治疗或基因整合组合物时那样)。在一些实施方案中，整合在不使用外源提供的核酸酶的情况下发生。在一些实施方案中，整合在使用一种或多种外源提供的核酸酶的情况下发生。

根据各个实施方案，考虑了本文所述的方法和组合物与多种基因疗法方案相容。例如，在一些实施方案中，受试者接受单剂量的基因疗法治疗或基因整合组合物。在一些实施方案中，受试者接受多剂量(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂量)的基因疗法治疗或基因整合组合物。

此外，考虑了如本文所述的方法和组合物适用于基因疗法治疗后的多个时间中的任一个(例如，受试者接受基因疗法后的数小时、数天、数周或数月)。因此，在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后1、2、3、4、5、6、7、8或更多周进行检测步骤。在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后的多个时间点进行检测步骤。在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后至少3个月的时间段内(例如，多个时间)进行检测步骤。

令人惊讶的是，发现一些实施方案能够向在接受基因疗法时处于不同生命阶段的受试者提供益处(例如，促进监测和/或调整疗法)，并且在一些实施方案中，所提供的方法可用作受试者在生命阶段之间的转变。在一些实施方案中，受试者作为婴儿接受基因疗法治疗或基因整合组合物。在一些实施方案中，受试者在达到成年之前(例如，作为儿童)接受基因疗法治疗或基因整合组合物。在一些实施方案中，受试者作为成人接受基因疗法治疗或基因整合组合物。

特别考虑了本文所述的方法和组合物适用于多种受试者，除了需要应用基因疗法的那些之外，各受试者可能还具有混杂或复杂的因素/状况。此外，已知或怀疑一些形式的基因疗法可能会引起有问题的反应(例如，自身免疫反应、细胞因子风暴等)。因此，在一些实施方案中，所提供的方法还包括监测受试者对基因疗法的自身免疫反应。在一些实施方案中，所提供的方法还包括监测受试者对基因疗法的异常细胞因子反应(例如，细胞因子风暴)。

本公开还涵盖了可能需要不时调整(例如，增强或抑制)基因疗法的认识，并且考虑了各个实施方案在监测对这样的调整的需要和/或成功地进行了这样的调整方面是有利的。因此，在一些实施方案中，所提供的方法还包括：如果生物标记物的水平低于将指示已实现整合基因疗法的治疗有效量的水平，则向受试者施用另外的治疗(例如，激活剂)。另外或可选地，在一些实施方案中，所提供的方法还包括：如果生物标记物的水平超过指示有效负载的最佳或安全水平的水平，则向受试者递送另外的治疗(例如，减活剂)，该另外的治疗减少或抑制由基因疗法治疗递送的有效负载的表达。

如在本申请中使用的，术语“约(about)”和“大约(approximately)”作为等同物使用。在本文中对出版物、专利或专利申请的任何引证都通过引用整体并入。本申请中使用的带有或不带有约/大约的任何数字意在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优点在随后的详细描述中是显而易见的。然而，应当理解，虽然详细描述和实施方案指出了本发明的具体实施方案，但是仅以举例说明而非限制的方式给出。根据详述，在本发明范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

图1显示了在整合之前和在HR介导的整合到基因组中靶向白蛋白Alb基因座之后GeneRide^TM构建体(AAV)的示意图。来自GeneRide^TM编辑的Alb基因座的表达可导致同时产生作为单独蛋白质的白蛋白-2A和转基因。

图2描绘了用于分析基因组DNA(gDNA)整合的示例性方法。如所说明的，此类方法可用于测定白蛋白(Alb)基因座中GeneRide ^TM编辑的gDNA。在描绘的步骤1中，长距离PCR(LR-PCR)用引物F1/R1从分离的gDNA扩增产物。在描述的步骤2中，在巢式qPCR中用引物F2/R2扩增步骤1的纯化产物。

图3呈现了用于定量附加体DNA的示例性途径。如所说明的，可以通过qPCR使用用线性化附加体质粒构建的标准曲线来确定附加体拷贝数。

图4呈现了用于分析包含编码2A肽的核酸序列的mRNA的示例性途径。通过ddPCR用引物组Fwd/R_F确定融合的mRNA拷贝数。通过ddPCR用引物组Fwd/R_E测量内源性Alb拷贝数并用于归一化。

图5A至图5B呈现了用于检测和定量血浆中多肽的示例性途径。例如，可以通过所说明的方法分析血浆中的白蛋白-2A。图5A)描绘了包含捕获抗体和检测抗体的夹心ELISA。在说明中，呈现了用于捕获白蛋白-2A的抗2A抗体和用于检测的标记抗白蛋白抗体。可使用其他多肽的特异性捕获和检测抗体如白蛋白、人因子IX和cyno A1AT来检测血浆中的其他此类多肽。图5B)描绘了基于PBST缓冲液或10％小鼠血清中的重组小鼠白蛋白-2A的标准曲线。

图6A至图6C展示了体内附加体DNA的检测和分析。给新生小鼠(p2)注射1e14vg/kghF9-DJ。图6A)注射后附加体拷贝数随着时间的推移呈指数降低。图6B)注射后动物的肝脏生长没有受到显著影响。图6C)注射后动物的体重生长没有受到显著影响。

图7A至图7D展示了2A生物标记物随着时间的推移的体内检测、监测和分析。给新生C57小鼠在p2静脉内注射1e14 vg/kg hF9-DJ，并在注射后1、2、3、4和8周收获(n＝5/组)。图7A)肝脏中2A生物标记物的基因组DNA整合通过LR-PCR/qPCR定量并表示为内源性Alb的百分比。图7B至图7C)通过ELISA测量血浆中的ALB-2A和总小鼠白蛋白。图7D)图7B和图7C中呈现的数据的相关性。对血浆中加2A肽标签的白蛋白与总白蛋白的关系的分析证实，观察到出生后血浆ALB-2A增加与内源性白蛋白的指数增加相关。

图8A至图8B展示了随生物标记物一起递送的有效负载随着时间的推移的体内检测、监测和分析。给新生C57小鼠在p2静脉内注射1e14 vg/kg hF9-DJ，并在注射后1、2、3、4和8周收获。图8A)通过人特异性因子IX ELISA对小鼠血浆中的人因子IX进行定量。图8B)图7B和图8A中呈现的数据的相关性。

图9A-9E展示了在两个剂量和两个年龄组下生物标记物和有效负载递送的检测和分析。给新生C57小鼠(p2)或幼年小鼠(p21)静脉内注射1e13或1e14 vg/kg hF9-DJ，并在注射后8周收获(n＝6-8/组)。在收获时，在p2给药的动物的年龄为8周，而在p21给药的那些动物为11周龄。图9A)通过ELISA测量血浆中的ALB-2A。图9B)通过ELISA测量血浆中的人因子IX。图9C)肝脏中的融合mRNA通过ddPCR定量并表示为内源性白蛋白mRNA的百分比。图9D)肝脏中的基因组DNA整合通过LR-PCR/qPCR定量并表示为内源性Alb的百分比。图9E)通过qPCR测量肝脏中每个细胞的附加体拷贝数。

图10A至图10C展示了随生物标记物一起向不同年龄组的受试者递送的有效负载随时间的推移的体内检测、监测和分析。向新生FvB/NJ(p2)、幼年(p21)或成年小鼠(p42和p63)静脉内给予1e14 vg/kg hF9-DJ，并在注射后4周收获(n＝6-9/组)。在收获时，在p2给药的动物的年龄为4周，在p21给药的那些动物为7周龄，在p42给药的那些动物为11周龄，并且在p63给药的那些动物为14周龄。图10A至图10B)通过ELISA测量血浆中的ALB-2A和人因子IX。图10C)血浆ALB-2A与人因子IX的线性回归得到R²＝0.93。

图11A至图11C展示了通过包含用于基因组整合的不同同源臂的病毒载体随生物标记物一起递送的有效负载的体内检测、监测和分析。给新生FvB/NJ小鼠(p2)静脉内注射A1AT-DJ，最终剂量为1e13或1e14 vg/kg。HA-750bp对应于具有750bp同源臂的转基因，而HA-1kb对应于具有1kb同源臂的转基因。注射后6周收获动物(n＝6-9/组)。图11A至图11B)通过ELISA测量小鼠血浆中的ALB-2A和cyno A1AT。图11C)ALB-2A与A1AT的线性回归得到R²＝0.91。

图12A至图12B展示了随生物标记物一起递送的细胞内在有效负载的体内检测、监测和分析。给新生Mut^-/-；Tg^INS-MCK-Mut小鼠(p2)静脉内注射不同剂量的DJ-hMUT(1e13、3e13或1e14vg/kg)并在3个月的时间段内收获。图12A)肝脏中的基因组DNA整合通过LR-PCR/qPCR定量并表示为内源性Alb的百分比。通过ELISA测量血浆中的ALB-2A。图12B)在MCK-MUT小鼠的肝脏裂解物中，通过蛋白质印迹测量整合的转基因人MUT的蛋白质表达。循环中的ALB-2A显现与肝脏中基因组整合的水平以及MUT蛋白的水平呈线性相关。

图13A至图13B展示有效负载的表达可以在单次施用后增加(即GeneRide^TM编辑的肝细胞的选择性扩增)并且有效负载水平的增加可以通过生物标记物水平的分析来监测。给新生Mut^-/-；Tg^INS-MCK-Mut小鼠(p2)静脉内注射1e14 vg/kg的DJ-hMUT，并在7个月的时间段内收获。图13A至图13B)使用β-肌动蛋白作为上样对照，通过蛋白质印迹分析肝脏裂解物中的从MUT^-/-小鼠中的整合转基因表达的人MUT蛋白。还在这些肝脏裂解物中分析了ALB-2A(2A印迹)和总白蛋白。媒介物治疗的MUT^+/-和野生型B6小鼠作为参考进行分析。注：在MUT^-/-肝细胞中由转基因表达的MUT蛋白是人的，而MUT^+/-和野生型B6中的内源性蛋白是小鼠的。

图14展示了利用优化的ALB-2A ELISA方法，基于在仅样品稀释剂中或在1％小鼠血浆中制备的重组小鼠ALB-2A的标准曲线。

图15A至图15B展示了在野生型小鼠和小鼠NAFLD(DIO)模型中随生物标记物一起递送的有效负载的体内检测、监测和分析。成年小鼠(约9周龄)静脉内注射1e14vg/kg hF9-DJ，并且在第1周和此后每两周一次收集血浆样品，持续共16周。通过ELISA定量小鼠血浆中的ALB-2A和人因子IX。

图16A至图16C展示了生物标记物和有效负载递送的以剂量依赖方式的检测和分析。给新生FvB小鼠(p2)静脉内注射4.1e12、1.2e13、3.7e13、1.1e14、3.3e14和1e15vg/kgcA1AT-DJ，并在注射后4周收获(n＝5/组)。图16A至图16B)分别显示了通过ELISA测量的血浆中的ALB-2A和cA1AT水平。图16C)显示了ALB-2A与A1AT的线性回归得到R²＝0.97。

图17A至图17C展示了gDNA整合和有效负载递送的以剂量依赖方式的检测和分析。给新生Mut^+/-；Tg^INS-MCK-Mut小鼠(p0)静脉内注射低、中和高剂量的DJ-mMUT(2.1e13、6.7e13或2.0e14 vg/kg)，并在给药后90天收获。图17A显示了通过ELISA测量的血浆中的ALB-2A水平(低剂量n＝18，中剂量n＝19，高剂量n＝19)。图17B显示了肝脏中的gDNA整合百分比(低剂量n＝26，中剂量n＝25，高剂量n＝28)。图17C显示了两个分析中动物的ALB-2A和gDNA整合百分比的相关性。

定义

为了更容易理解本发明，下文首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的另外的定义。

约：在本文中用于提及一个值时，术语“约”是指在上下文中与所提及的值相似的值。一般来讲，熟悉上下文的本领域技术人员将理解所述上下文中“约”所涵盖的相关差异程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”可涵盖在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围。

激活剂：如在本文中使用的，术语“激活剂”指其存在或水平与靶标的如下水平或活性关联的剂，所述水平或活性与不存在所述剂(或具有不同水平的所述剂)的情况下观察到的相比提高。在一些实施方案中，激活剂是指其存在或水平与靶标的如下水平或活性关联的药剂，所述水平或活性可比于或大于特定参考水平或活性(例如，在适当参考条件下观察到的，诸如存在已知激活剂，例如阳性对照)。在一些实施方案中，激活剂与激活元件结合或以其他方式缔合以发挥其作用。

成人：如在本文中使用的，术语“成年”是指年满十八岁或以上的人。在一些实施方案中，成年人的体重在约90磅至约250磅的范围内。

相关：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式关联，则两个事件或实体彼此“相关”，如本文所用的术语。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传签名、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性关联(例如，在相关群体中)，则认为所述特定实体与所述特定疾病、病症或疾患相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使它们彼此在物理上接近和/或保持在物理上接近，则它们在物理上彼此“相关”。在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此不共价连接，而是非共价相关，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合。

生物样品：如在本文中使用的，术语“生物样品”典型地是指如本文所述从目标生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样品。在一些实施方案中，目标来源包括生物体，诸如动物或人类。在一些实施方案中，生物样品是或包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样品可以是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针穿刺活检样品；含有细胞的体液；自由浮动核酸；痰；唾液；尿；脑脊液、腹腔液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科流体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；冲洗物或灌洗物，例如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；抽吸物；刮片；骨髓标本；组织活检标本；外科标本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样品是或包括从个体获得的细胞。在一些实施方案中，获得的细胞是或包括来自获得样品的个体的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从目标来源获得的“初级样品”。例如，在一些实施方案中，初级生物样品通过选自下组的方法获得，该组由以下组成：活检(例如，细针穿刺抽吸或组织活检)、外科手术、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。在一些实施方案中，从上下文可以清楚地看出，术语“样品”是指通过对初级样品进行处理(例如，通过去除一种或多种组分和/或通过添加一种或多种剂)而获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“经处理的样品”可以包括例如从样品中提取的或通过使初级样品经受诸如mRNA的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等技术获得的核酸或蛋白质。

生物标记物：在本文中使用的术语“生物标记物”与在本领域中对其的使用一致，是指其存在、水平、或形式与关注的特定生物事件或状态关联的实体，因此它被认为是所述事件或状态的“标记物”。除其他事项外，本公开提供了基因疗法的生物标记物(例如，其可用于评估基因疗法治疗的一种或多种特征或特性，诸如像有效负载表达的程度、水平、和/或持久性)。在一些实施方案中，生物标记物是细胞表面标记物。在一些实施方案中，生物标记物是细胞内标记物。在一些实施方案中，在细胞外发现生物标记物(例如，在细胞外分泌或以其他方式产生或存在，例如在体液中，诸如血液、尿液、眼泪、唾液、脑脊液等)。在某些实施方案中，本公开展示了生物标记物的有效性，所述生物标记物可以在从已接受基因疗法的受试者获得的样品中检测以用于评估该基因疗法的一种或多种特征或特性；在一些这样的实施方案中，样品是细胞、组织和/或流体，除了递送基因疗法和/或除了其中有效负载处于活性状态的细胞、组织和/或流体之外。

可检测部分：如在本文中使用的，术语“可检测部分”是指任何实体(例如，分子、复合物或其部分或组分)。在一些实施方案中，提供了可检测部分和/或将其用作离散分子实体；在一些实施方案中，它是另一个分子实体的部分和/或与另一个分子实体缔合。可检测部分的实例包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁸F、¹⁹F、³²P、³⁵S、¹³⁵I、¹²⁵I、¹²³I、⁶⁴Cu、¹⁸⁷Re、¹¹¹In、⁹⁰Y、^99mTc、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Zr等)、荧光染料(对于特定的示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(例如像吖啶酯、稳定的二氧环丁烷等)、生物发光剂、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁性金属离子、酶(对于酶的特定实例，参见下文)、比色标记(例如像染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原、抗体和/或抗血清或单克隆抗体可用的蛋白质。

儿童：如在本文中使用的，术语“儿童”是指两岁和十八岁之间的人。体重因年龄和特定儿童而广泛变化，典型范围为30磅至150磅。

组合疗法：如在本文中使用的，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂，例如基因疗法和非基因疗法治疗方式)的那些情况。在一些实施方案中，可同时施用所述两种或更多种方案；在一些实施方案中，可依次施用此类方案(例如，在施用第二方案的任何剂量之前施用第一方案的所有“剂量”)；在一些实施方案中，以重叠给药方案施用此类剂。在一些实施方案中，组合疗法的“施用”可涉及向受试者施用一种或多种剂或剂型，所述受试者正接受组合中的另一种或多种剂或方式。为清楚起见，组合疗法不需要在单一组合物中将各剂一起(或甚至必须同时)施用。

组合物：本领域技术人员将理解，如在本文中使用的，术语“组合物”可用于指包含一种或多种指定组分的离散物理实体。通常，除非另有说明，否则组合物可以是任何形式的——例如，气体、凝胶、液体、固体等。

减活剂：如在本文中使用的，术语“减活剂”指其存在或水平与靶标的如下水平或活性关联的剂，所述水平或活性与不存在所述剂(或具有不同水平的所述剂)的情况下观察到的相比降低。在一些实施方案中，减活剂是指其存在或水平与靶标的如下水平或活性关联的药剂，所述水平或活性可比于或低于特定参考水平或活性(例如，在适当参考条件下观察到的，诸如存在已知激活剂，例如阳性对照)。在一些实施方案中，减活剂与减活元件结合或以其他方式缔合以发挥其作用。

确定：本文描述的许多方法包括“确定”步骤。阅读本说明书的本领域普通技术人员将理解，这种“确定”可以利用本领域技术人员可用的多种技术中的任一种(包括例如本文明确提及的特定技术)或通过使用其来完成。在一些实施方案中，确定涉及物理样品的操纵。在一些实施方案中，确定涉及数据或信息的考虑和/或操纵，例如利用适合于执行相关分析的计算机或其他处理单元。在一些实施方案中，确定涉及从来源接收相关信息和/或物质。在一些实施方案中，确定涉及将样品或实体的一个或多个特征与可比参考进行比较。

基因：如在本文中使用的，术语“基因”是指编码基因产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(例如，编码特定基因产物的序列)；在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可以包括编码序列(例如，外显子)和非编码序列(例如，内含子)两者。在一些实施方案中，基因可以包括一种或多种调控元件(例如启动子、增强子、沉默子、终止信号)，其例如可以控制或影响基因表达(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达)的一个或多个方面。在一些实施方案中，基因位于或发现于基因组中(例如，在染色体或其他可复制核酸中或上)(或具有与位于或发现于其中的相同的核苷酸序列)。

基因产物或表达产物：如在本文中使用的，术语“基因产物”或“表达产物”一般指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

“改进”、“增加”、“抑制”或“减少”：如在本文中使用的，术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物表示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或包括在不存在特定剂或治疗(例如，之前和/或之后)，或在存在适当的可比参考剂的另外的可比条件下在特定系统(例如，在单一个体)中的测量。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或包括在存在相关剂或治疗时已知或预期以特定方式响应的可比系统中的测量。

婴儿：如在本文中使用的，术语“婴儿”是指两岁以下的人。婴儿的典型体重范围为3磅高至20磅。

核酸：如在本文中使用的，在其最广泛的意义上，是指被掺入或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是或可以经由磷酸二酯键掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核酸类似物，或由其组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮杂腺苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化的碱基、插入的碱基及其组合)或由其组成。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物(例如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，可以通过以下的一种或多种来制备核酸：从天然来源分离、通过基于互补模板(体内或体外)的聚合的酶促合成、在重组细胞或系统中复制或化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸部分或全部地是单链；在一些实施方案中，核酸部分或全部地是双链。在一些实施方案中，核酸具有包括至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。

肽：如在本文中使用的，术语“肽”或“多肽”是指任何聚合的氨基酸链。在一些实施方案中，肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽具有被工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或由其组成。在一些实施方案中，肽可以包含仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸，或由其组成。在一些实施方案中，肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，肽是线性的。在一些实施方案中，术语“肽”可以附加到参考肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指如下肽，所述肽共享相关活性或结构，因此可被认为是肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将知晓所述类别内的示例性肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，此类示例性肽是针对肽类别或家族的参考肽。在一些实施方案中，肽类别或家族的成员显示出显著的序列同源性或同一性，与所述类别的参考肽(在一些实施方案中，与所述类别内的所有肽)共享共同序列基序(例如，特征序列元件)，和/或共享共同的活性(在一些实施方案中，按相当的水平或在指定的范围内)。例如，在一些实施方案中，成员肽显示与参考肽的序列同源性或同一性的总体程度，即至少约30％-40％，并且通常高于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括至少一个区域(例如，可能在一些实施方案中是或包括特征序列元件的保守区)，所述区域显示非常高的序列同一性，通常高于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％。这样的保守区通常涵盖至少3-4个并且经常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸的至少一段。

多肽：如在本文中使用的，术语“多肽”或“蛋白质”是指具有至少三个氨基酸残基的聚合物。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个或所有天然氨基酸。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个或所有非天然氨基酸。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个或所有D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个或所有L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的N-末端、在多肽的C-末端或其任何组合处修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，多肽包含一种或多种修饰，诸如乙酰化、酰胺化、氨乙基化、生物素化、氨甲酰化、羰基化、瓜氨酸化、脱酰胺化、脱亚胺化、消去化(eliminylation)、糖基化、脂化、甲基化、聚乙二醇化、磷酸化、苏素化或其组合。在一些实施方案中，多肽可以参与一个或多个分子内或分子间二硫键。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可包括钉合多肽。在一些实施方案中，多肽通过与一种或多种其他多肽的非共价或共价缔合参与非共价复合物形成(例如，如在抗体中那样)。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有被工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指如下多肽，所述多肽共享相关活性或结构，因此可被认为是多肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将知晓所述类别内的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，此类示例性多肽是针对多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员显示出显著的序列同源性或同一性，与所述类别的参考多肽(在一些实施方案中，与所述类别内的所有多肽)共享共同序列基序(例如，特征序列元件)，和/或共享共同的活性(在一些实施方案中，按相当的水平或在指定的范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参考多肽的序列同源性或同一性的总体程度，即至少约30％-40％，并且通常高于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，和/或包括至少一个区域(例如，可能在一些实施方案中包括特征序列元件的保守区)，所述区域显示非常高的序列同一性，通常高于90％或甚至95％、96％、97％、98％、或99％。这样的保守区通常涵盖至少3-4个并且经常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸的至少一段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含亲本多肽的片段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含多个片段，每个片段在同一亲本多肽中以相对于在目标多肽中发现的另一种不同的空间排列被发现(例如，在亲本中直接连接的片段可以在目标多肽中被空间分离，反之亦然，和/或片段在目标多肽中可能以与在亲本中不同的顺序存在)，使得目标多肽是其亲本多肽的衍生物。

受试者：如在本文中使用的，术语“受试者”是指生物体，典型地是哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人类形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或疾患的一种或多种症状或特性。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或疾患的任何症状或特性。在一些实施方案中，受试者是具有如下的一个或多个特征的受试者，该一个或多个特征表示易患疾病、病症或疾患或者有患疾病、病症或疾患的风险的特性。在一些实施方案中，受试者为患者。在一些实施方案中，受试者为施用和/或已施用诊断和/或疗法的个体。

基本上：如在本文中使用的，术语“基本上”是指展现出一个目标特性或性质的总体或接近总体的范围或程度的定性状况。生物学领域的普通技术人员应当理解的是生物学以及化学现象很少(如果有的话)会达到完成，和/或进行到完成或实现或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中被用来获得在许多生物学以及化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。

具体实施方式

本公开提供了用于监测和/或以其他方式评估基因疗法的技术。如本文所述，本公开涉及作为整合基因疗法治疗的结果产生的一种或多种生物标记物的检测和评估，所述一种或多种生物标记物的存在和相对量揭示关于经由基因疗法治疗递送的有效负载的信息，例如，有关递送的有效负载的存在、量和/或动力学的信息。在本公开的一方面，生物标记物的存在、量、和/或动力学充当确定递送的有效负载的存在、量和/或动力学的代表。在本公开的一些实施方案中，评估取自已接受整合基因疗法治疗的受试者的生物样品中的生物标记物。在本公开的一些实施方案中，可以在取自受试者的非组织生物样品中评估生物标记物。在本公开的一些实施方案中，有效负载被递送至(例如，通过合适的转基因的递送)并且保留在已接受整合基因疗法治疗的受试者的组织内。

整合基因疗法

基因疗法将遗传物质引入受试者的细胞中，典型地是为了表达可补偿异常基因的有效负载或以其他方式为受试者提供有益效果。整合基因疗法引入遗传物质，所述遗传物质变成整合到受体细胞中存在的遗传序列(即靶位点)中。

本领域技术人员知晓用于将遗传物质整合到受体细胞或生物体中目标靶位点的多种技术。此类整合的遗传元件可包括编码待递送至宿主细胞或生物体中的有效负载的核酸序列(即，如在本文中使用的术语“转基因”)。典型地，在载体的背景下递送转基因；本领域技术人员知晓可成功用于实现转基因整合的病毒载体系统和非病毒载体系统。

本公开提供了对各种整合基因疗法技术问题根源的鉴定。

例如，本公开理解低效或无效整合会限制基因疗法策略的有用性。如果载体无法整合，它典型地在生长过程或组织再生期间细胞分裂时损失，并且所递送的转基因(或有效负载)的任何益处或已提供的任何益处也将损失。即使整合最初成功，但随后由于例如重组事件或受体细胞死亡而损失，也会出现类似的困难。

本公开进一步理解许多基因整合技术或事件不能或不会精确控制靶整合位点，并且整合位点可以显著影响转基因表达的程度和/或时间，和/或会影响接受细胞的健康甚至生存能力。此外，本公开理解，即使是一些“靶向”基因整合技术也可能受到整合位点的负面影响，使得转基因表达可能无法实现和/或保持在希望的水平和/或持续希望的时间段。

本公开进一步理解，许多基因疗法途径引入与启动子(例如，外源性启动子)操作性缔合的转基因，并且此类启动子的表达特性可以负面影响受体细胞，包括通过潜在地增加不受控制的增殖(例如，癌症)的风险，特别是对于驱动高水平基因表达的启动子。

因此，本公开提供了以下见解：伴随着许多整合基因疗法治疗的一个问题的根源是无法或不能监测相关有效负载的表达(特别是随着时间的推移)。鉴于许多有效负载是或可能是细胞内的，和/或旨在其中表达有效负载和/或在其中有效负载有活性的组织可能相对难以获得，通常不会尝试定期监测。

本公开贡献了以下发现，某些基因整合技术可以产生用于成功整合转基因和表达有效负载的有效生物标记物。此外，本公开展示，某些此类技术产生可从容易获得的生物样品(例如，血液、尿液、眼泪等)评估的生物标记物。因此，除其他事项外，本公开提供了通过提供用于监测(例如，检测和/或定量，在许多实施方案中在多个时间点进行)由成功整合和反映有效负载表达而产生的生物标记物的系统来改进整合基因疗法的技术。

考虑了可以使用多种整合基因疗法技术中的任一种。通过非限制性举例的方式，在一些实施方案中，整合基因疗法可以是或包括使用基于载体的系统(例如，基于病毒载体的系统)、基于非病毒载体的系统、核酸酶介导的系统和/或使用GENERIDE^TM系统或其任何组合。

基于载体的系统

在一些实施方案中，整合基因疗法可以是或包括基于载体的系统(例如，病毒载体)。典型地，基于载体的系统将包括病毒或病毒遗传物质，可以向其中插入外源DNA片段以转移到细胞中。在本公开的一些实施方案的范围内，在其生命周期中包括DNA阶段的任何病毒都可以用作病毒载体。通过非限制性举例的方式，基于病毒载体的系统可以是单链DNA病毒、双链DNA病毒、在其生命周期中具有DNA阶段的RNA病毒(例如，逆转录病毒)。在一些实施方案中，病毒载体可以通过药学上可接受的配制品递送，例如脂质体或脂质颗粒(例如，微颗粒或纳米颗粒)。

作为一个非限制性实例，一种目标病毒是腺相关病毒。腺相关病毒或“AAV”是指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在形式和重组形式，例如AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、AAV 10型(AAV-10)、AAV 11型(AAV-11)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、绵羊AAV、混合AAV(即包含一种AAV亚型的衣壳蛋白和另一种亚型的基因组物质的AAV)、包含突变型AAV衣壳蛋白或嵌合AAV衣壳的AAV(即具有源自两个或更多个不同的AAV血清型的区域或结构域或单个氨基酸的衣壳蛋白，例如AAV-DJ、AAV-LK3、AAV-LK19)。“灵长类AAV”是指感染灵长类的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等等。

无论使用何种载体(例如，病毒载体)，为了促进靶向整合，靶向载体包含允许在整合位点进行同源重组的核酸序列，例如允许与白蛋白基因、胶原基因、肌动蛋白基因等同源重组的序列。该过程需要与“靶”分子(即整合进了核酸序列的核酸，例如细胞基因组中的靶基因座)的模板修复序列具有核苷酸序列同源性(使用“供体”分子(例如靶向载体))，并导致遗传信息从供体转移到靶标。因此，在主题组合物的靶向载体中，待整合进细胞基因组中的转基因的侧翼可以是如下的序列，这些序列与切割位点处的基因组序列含有足够的同源性(例如与切割位点侧翼，例如切割位点的约50个碱基或更少内，例如约30个碱基内、约15个碱基内、约10个碱基内、约5个碱基内、或紧挨靶整合位点侧翼的核苷酸序列具有70％、80％、85％、90％、95％或100％同源性)以支持所述基因组序列与其具有同源性的基因组序列之间的同源重组。供体和基因组序列之间大约25、50、100、250或500个核苷酸或更多的序列同源性将支持它们之间的同源重组。

非病毒载体系统

在一些实施方案中，整合基因疗法可以是或包括非基于病毒载体的系统。在一些实施方案中，非病毒载体系统可以是或包括质粒、基于聚合物的颗粒、ceDNA、脂质体、小环及其组合。在一些实施方案中，非病毒载体系统可以是或包括一种或多种化学载体的使用、电穿孔、弹道DNA(ballistic DNA)的使用(例如，粒子轰击)、声穿孔、光穿孔、磁转染、加氢穿孔(hydroporation)及其任何组合。

与以上描述类似，无论使用何种类型的非病毒载体系统，为了促进靶向整合，必须使用允许在整合位点进行同源重组的一个或多个核酸序列/将其递送到靶位点。

核酸酶介导的整合

根据各个实施方案，核酸酶介导的整合使用一种或多种核酸酶，即在细菌中工程化或最初鉴定的切割DNA的酶。典型地，核酸酶介导的整合是两步过程。首先，能够切割双链DNA中的一条或两条链的外源性核酸酶被合成引导RNA定向到希望的位点并进行特定切割。在核酸酶进行希望的一次或多次切割后，细胞的DNA修复机制被激活并通过NHEJ或(不太常见地)HDR完成编辑过程。

在一些实施方案中，NHEJ可以在细胞修复DNA切割时拷贝的DNA模板不存在的情况下发生。这是细胞用于修复双链断裂的主要或默认路径。NHEJ机制可用于引入小的插入或缺失，称为插缺(indel)，导致基因功能的敲除。NHEJ由于其修复模式而在DNA中产生插入和缺失，还可能导致引入脱靶、不需要的突变(包括染色体畸变)。

核酸酶介导的HDR随着核酸酶、引导RNA和与已切割的DNA相似的DNA模板的共同递送发生。因此，细胞可以使用该模板构建修复DNA，从而用正确的基因序列替代有缺陷的基因序列。在一些实施方案中，当使用基于核酸酶的途径插入校正序列时，HDR机制由于其高保真度而为优选的修复路径。然而，在用核酸酶切割后对基因组的大部分修复继续使用NHEJ机制。更频繁的NHEJ修复路径有可能在切割位点引起不需要的突变，从而限制了此时任何核酸酶介导的整合途径可以靶向的疾病范围。

GeneRide^TM技术平台

GeneRide^TM是一种基因组编辑技术，它利用同源重组或HR，一个自然发生的DNA修复过程，其可保持基因组的保真度。通过使用HR，GeneRide^TM允许将多核苷酸插入到特定的靶向基因组位置，而不使用外源性核酸酶，设计GeneRide^TM定向的多核苷酸整合是为了利用这些靶向位置的内源性启动子来驱动高水平的组织特异性基因表达，而不产生与使用外源性启动子相关的有害问题。在本公开的一些实施方案中，GeneRide^TM用于将编码有效负载的多核苷酸递送至宿主细胞或生物体。

GeneRide^TM技术可用于将编码治疗有效负载的多核苷酸精确整合到患者的基因组中，以提供稳定的治疗效果。由于设计GeneRide^TM是为了具有这种持久的治疗效果，因此它可以应用于靶向儿科患者的疾病，在这些患者中，在会发生不可逆疾病病理之前在患者生命早期提供治疗至关重要。

在一些实施方案中，GeneRide^TM使用AAV载体以将基因递送到细胞核中。然后，它使用HR将校正基因稳定地整合到受体基因组中的如下位置，在该位置其受内源性启动子调控，从而得到产生终身蛋白质的潜力，即使身体随着时间的推移而生长和变化。

GeneRide^TM可以将校正基因精确、位点特异性、稳定和持久地整合到宿主细胞的染色体中。在用GeneRide构建体进行的临床前动物研究中，观察到校正基因在基因组中特定位置的整合。

可应用GeneRide^TM的模块来提供稳健的组织特异性基因表达，这些基因表达将可在递送到一种或多种组织的不同治疗中重现。通过在GeneRide^TM构建体内取代不同的转基因，可以递送该转基因以解决新的治疗适应症，同时基本上保持构建体的所有其他组分。这种途径将允许利用不同的GeneRide^TM产品候选者之间共同的制造过程和分析，并可以缩短其他治疗计划的开发过程。

通过引用并入本文的WO 2013/158309中描述了以前的关于非破坏性基因靶向的工作。通过引用并入本文的WO 2015/143177中描述了以前在没有核酸酶的情况下进行基因组编辑的工作。

靶位点

用于根据本公开使用的整合基因疗法理想地实现整合，该整合实现整合的转基因与活性内源性启动子的操作性缔合，使得自启动子起的转录产生延伸到整个转基因的转录物。此外，在许多实施方案中，整合是在选定的靶位点进行的，以便这样的转录物包括不同于转基因的开放阅读框。

在许多实施方案中，用于根据本公开使用的整合基因疗法实现了在内源性基因中的靶位点处(例如，在内源性基因内或邻近内源性基因的特定位置处)的整合，并且延伸了自基因的启动子起转录产生的转录物，至少使得延伸到整个转基因。

在一些实施方案中，整合基因疗法治疗或基因整合组合物实现将包含编码有效负载的序列的核酸元件整合到受试者基因组中的靶位点中。本领域技术人员将理解，多个靶位点中的任一个都可能适用于如本文所述的方法和组合物。例如，在一些实施方案中，靶位点编码多肽。在一些实施方案中，靶位点可以编码在受试者(例如，未患有疾病、病症或疾患的受试者)中高度表达的多肽。在一些实施方案中，核酸元件的整合发生在编码多肽的内源性基因的5'或3'端。通过非限制性举例的方式，在一些实施方案中，靶位点编码白蛋白。

考虑了可针对如下的任何组织完成遗传元件和/或转基因的整合递送，包括但不限于肝脏、中枢神经系统(例如，脊柱)、肌肉、肾脏、眼睛的视网膜和骨髓的造血细胞。

有效负载

根据各个实施方案，可以如本文所述使用任何适合应用的有效负载。根据各个实施方案，转基因编码一种或多种有效负载。如在本文中使用的，术语“有效负载”和“目标基因”(GOI)可以互换使用。在一些实施方案中，有效负载是或包括肽、核酸(例如，shRNA、miRNA和/或编码一种或多种肽的核酸)及其任何组合。在一些实施方案中，整合基因疗法治疗和/或基因整合组合物包含单一有效负载。在一些实施方案中，整合基因疗法治疗和/或基因整合组合物包括两种或更多种有效负载(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)。

例如，在一些实施方案中，有效负载是或包括细胞内表达的肽或编码这样的肽的核酸序列(例如，转基因)。通过非限制性举例的方式，细胞内表达的肽包括甲基丙二酰基-CoA变位酶(MUT)、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)、丙酰基-CoA羧化酶、亚基α(PCCA)、ATP结合盒亚家族B成员11(ABCB11)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)、UDP葡糖醛酸基转移酶家族1成员A1(UGT1A1)、酸性α-葡糖苷酶(GAA)、溶酶体酸性葡糖神经酰胺酶(GBA)、Frataxin(FTX)。

在一些实施方案中，有效负载是或包括细胞外分泌的肽和/或编码这样的肽的核酸序列(例如，转基因)。通过非限制性举例的方式，分泌的肽包括人因子IX(F9)和α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)。

在一些实施方案中，有效负载是具有促进治疗医学疾患的生物过程的细胞内在或细胞外在活性的肽。

在一些实施方案中，有效负载可以是或包括在一种或多种健康组织中正常表达的肽，或编码这样的肽的核酸序列。例如，在一些实施方案中，有效负载是在肝细胞中正常表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在肌细胞中正常表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在中枢神经系统的细胞中正常表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在眼睛的细胞中正常表达的肽。

在一些实施方案中，有效负载可以是或包括在一种或多种健康组织中非正常表达的肽(例如，它是异位表达的)，或编码这样的肽的核酸序列。例如，在一些实施方案中，有效负载是在肝细胞中异位表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在肌细胞中正常表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在中枢神经系统的细胞中正常表达的肽。例如，在一些实施方案中，有效负载是在眼睛的细胞中正常表达的肽。

在一些实施方案中，有效负载可包括激活元件(例如，其被激活剂激活)。在一些实施方案中，有效负载可包括减活元件(例如，其被减活剂激活)。在一些实施方案中，激活剂或减活剂可以是或包括小分子，

生物标记物

本公开提供了整合基因疗法技术，其产生了可充当有效负载表达的代表的可检测生物标记物。

根据本公开，整合的转基因的表达涉及包括至少一个可翻译开放阅读框的转录物的产生，该开放阅读框编码与由转基因编码的有效负载分开或可与其分开的多肽。在一些实施方案中，转录物的翻译产生单一多肽，该多肽被切割以将有效负载与生物标记物分开；在一些实施方案中，转录物的翻译产生不同的生物标记物和有效负载多肽。

如本公开中所描述的，考虑了多种生物标记物的使用与各个实施方案相容。在一些实施方案中，生物标记物是或包括可检测部分，所述可检测部分在由靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由靶位点编码的多肽。在一些实施方案中，生物标记物是或包括可检测部分，所述可检测部分在由靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由有效负载编码的多肽。在一些实施方案中，将生物标记物与有效负载缔合可能是有利的，例如，当有效负载是内源性蛋白质的修饰形式并且因此将难以或不可能与内源性版本分离和分开检测时。在一些实施方案中，可检测部分可以是或包括与生物标记物(例如，抗体或其片段，例如结合2A肽的抗体)结合的剂。

在一些实施方案中，生物标记物是或包括2A肽。在一些实施方案中，2A肽选自由P2A、T2A、E2A和F2A组成的组。在一些实施方案中，生物标记物可以是或包括弗林切割基序。作为非限制性实例，Tian等人,FurinDB:A Databse of 20-Residue Furin Cleavage SiteMotifs,Substrates and Their Associated Drugs,(2011),Int.J.Mol.Sci.,第12卷:1060-1065中描述了一系列弗林切割基序。通过具体举例的方式，在一些实施方案中，2A肽可具有或包含氨基酸序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:1)，并且编码这样的2A肽的转基因可具有或包含核苷酸序列gccaccaacttcagcctgctgaaacaggccggcgacgtggaagagaaccctggcccc(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，2A肽将具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少80％相同的序列(例如，至少85％、90％、95％、99％相同)。在一些实施方案中，2A肽或编码2A肽的转基因可以是如下所述或是如下所述产生：Kim等人,(2011)High CleavageEfficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1in Human CellLines,Zebrafish and Mice,PLoS ONE,第6(4)卷:e18556；Wang等人(2015)2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyxmori,Sci Rep.,第5卷:16273；Yu等人(2012)Use of Mutated Self-Cleaving 2APeptides as a Molecular Rheostat to Direct Simultaneous Formation of Membraneand Secreted Anti-HIV Immunoglobulins.PLoS ONE 7(11):e50438；或Trichas等人(2008),Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenicmice,BMC Biology,第6卷:40。

在一些实施方案中，生物标记物可以是或包括标签(例如，免疫标签)，例如myc、HA、FLAG或其他标签。在一些实施方案中，生物标记物可以是或包括内部核糖体进入位点(IRES)。

检测可检测部分

如本文所述，许多实施方案包括使用一种或多种生物样品(例如，取自受试者的流体或组织样品)，并且检测生物标记物的方式可根据特定实施方案中使用的生物样品而变化。根据本公开，考虑了多种生物样品中的任一种都与各个实施方案相容。例如，在一些实施方案中，生物样品是或包括毛发、皮肤、粪便、血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、眼泪、玻璃体液或粘液。

根据各个实施方案，并且取决于所使用的一种或多种特定生物标记物，本领域技术人员将设想一种或多种检测或确定生物样品中生物标记物的存在和/或量/水平的合适方法。在一些实施方案中，可以使用多种方式中的任一种来检测生物标记物，包括荧光、放射性、化学发光、电化学发光、比色法、FRET、HTRF、同位素方法、配偶体结合(例如，生物素/亲和素，抗体，杂交)或任何其他已知的检测生物标记物的方式。在一些实施方案中，生物标记物可以通过可检测部分(例如，外源添加的可检测部分)的结合来检测，该可检测部分诸如包括例如根据一种或多种上述方式所述的标签的抗体，或者酶(例如，萤光素酶、β-gal)。

应用和另外的方面

本领域技术人员将容易理解本文所述的方法可用于涉及基因疗法的多种应用。在一些实施方案中，相对于希望的或“正常”表达水平，本文所述的方法可用于评估有效负载是过表达抑或低表达。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于预测或表征对基因疗法的潜在不良反应(例如，产生有害的免疫反应，如抗药抗体和/或细胞因子风暴)，因此可能允许干预和/或减轻不良反应。

特别设想本文所述的方法和组合物适用于多种疾病、病症或疾患中的任一种。通过非限制性举例的方式，一些实施方案可用于监测酸中毒/酸血症(academia)(例如，甲基丙二酸血症)、尿素循环病症、血友病、Crigler-Najjar、急性肝卟啉症、遗传性ATTR淀粉样变性、和/或α-1抗胰蛋白酶缺乏症(A1ATD)等等的疗法过程或其他参数。

根据各个实施方案，考虑了本文所述的方法和组合物与多种基因疗法方案相容。例如，在一些实施方案中，受试者接受单剂量的基因疗法治疗或基因整合组合物。在一些实施方案中，受试者接受多剂量(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂量)的一种或多种基因疗法治疗和/或基因整合组合物。

此外，考虑了如本文所述的方法和组合物适用于一种或多种基因疗法治疗后的多个时间中的任一个(例如，受试者接受基因疗法后的数小时、数天、数周或数月)。因此，在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后1、2、3、4、5、6、7、8或更多周进行检测步骤。在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后的多个时间点进行检测步骤。在一些实施方案中，在受试者接受基因疗法治疗或基因整合组合物后至少3个月的时间段内(例如，多个时间)进行检测步骤。

例示

实施例1：用于生物标记物和有效负载检测的示例性方法

本实施例展示了可用于检测、监测和/或分析根据本公开的生物标记物和/或有效负载的示例性方法。实施例2-7采用本文所述的方法和物质。

基因组DNA整合(INT)测定：长距离qPCR

使用Qiagen的DNeasy试剂盒从冷冻的小鼠肝脏组织中分离基因组DNA(gDNA)。将用引物F1/R1扩增的长距离PCR(LR-PCR)产物用SPRI磁珠进行纯化(步骤1)，并随着引物组F2/R2在巢式qPCR中使用(步骤2)(图2)。使用涵盖从5'同源臂上游到目标基因(GOI)的片段(约2.1Kb)的合成dsDNA来产生标准曲线。使标准品与样品并排运行。使用Tfrc作为上样对照用于归一化。

附加体DNA测定

使用Qiagen的DNeasy试剂盒从小鼠肝脏中分离基因组DNA(gDNA)。通过qPCR(图3)使用线性化附加体质粒构建的标准曲线来确定附加体拷贝数。使用Tfrc作为上样对照用于归一化。由于引物与内源性Alb基因的交叉反应性，对于基因组中的2个Alb拷贝，该测定的检测限为2。

融合mRNA测定

来自小鼠肝脏的RNA用Qiagen的RNeasy试剂盒分离。通过ddPCR用引物组Fwd/R_F证实融合的mRNA拷贝数(图4)。通过ddPCR用引物组Fwd/R_E测量内源性Alb拷贝数并用于归一化。

白蛋白-2A ELISA

血浆中的白蛋白-2A通过化学发光ELISA测量，使用专有的兔多克隆抗2A抗体进行捕获，并使用HRP标记的多克隆绵羊抗白蛋白抗体(BioRad AHP102P)进行检测(图5A)。使用在哺乳动物细胞中表达并亲和纯化的重组小鼠白蛋白-2A在10％对照小鼠血浆中构建标准曲线以解释基质效应(图5B)。使用1％的酪蛋白(Thermo 37528)进行封闭，并且使用0.1％的酪蛋白在PBST中进行样品稀释。

白蛋白ELISA

血浆中的总小鼠白蛋白通过化学发光ELISA测量，使用多克隆山羊抗小鼠白蛋白抗体(abcam ab19194)进行捕获，并使用多克隆绵羊HRP标记的抗白蛋白抗体(BioRadAHP102P)进行检测。小鼠白蛋白标准品购自Sigma(SLBX6058)。使用1％的酪蛋白(Thermo37528)进行封闭，并且使用0.1％的酪蛋白在PBST中进行样品稀释。

高敏白蛋白-2A ELISA

最初的白蛋白-2A ELISA方案经过优化，以改进该测定的灵敏度并最大限度地减少基质干扰。开发了专有的重组兔单克隆抗2A抗体并用于捕获，并使用HRP标记的多克隆山羊抗白蛋白抗体(abcam ab19195)进行检测(图5A)。使用在哺乳动物细胞中表达并以>95％的纯度亲和纯化的重组小鼠白蛋白-2A作为标准品在≤1％对照小鼠血浆或血清中构建校准曲线(图14)。使用由1％脱脂奶粉组成的缓冲液进行封闭，并将样品在1％PBST中的BSA中稀释。此优化方案的检测下限为<1ng/mL。

人因子IX ELISA

通过化学发光ELISA测量血浆中的人因子IX，使用单克隆小鼠抗人因子IX抗体(Sigma F2645)进行捕获，并使用山羊多克隆HRP标记的抗人因子IX抗体(AffinityBiologicals GAFIX-APHRP)进行检测。人因子IX标准品购自abcam(ab62544)，并且在6％对照小鼠血浆中构建标准曲线以解基质效应。使用3％的BSA进行封闭，并且使用1％的酪蛋白在PBST中进行样品稀释。

Cyno A1AT ELISA

血浆中的Cyno A1AT通过化学发光ELISA测量，使用山羊多克隆抗A1AT抗体进行捕获(MP Biomedical 55030)，并使用绵羊多克隆HRP标记的抗A1AT抗体(abcam ab8768)进行检测。使用在哺乳动物细胞中表达的重组Cyno A1AT在10％对照小鼠血浆中构建标准曲线以解释基质效应。使用3％的BSA进行封闭，并且使用1％的酪蛋白在PBST中进行样品稀释。

MUT蛋白质印迹

将冷冻的肝脏组织(约60mg)使用MP Biomedicals Lysing Matrix D(#116913050)在裂解缓冲液(0.5％Igepal-630，50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，补充Roche微型片剂蛋白酶抑制剂混合物)中伴随两轮珠磨(在3500rpm下每轮珠磨20秒)而均质化。将肝脏裂解物通过离心澄清，并通过BCA测定定量总蛋白。将裂解物(6μg/道)使用MES缓冲液在4％-12％NuPAGE BisTris中型凝胶(Life Technologies)上拆分，之后转移到Trans-Turbo Blot系统(Bio-Rad)上的硝酸纤维素膜中。在LI-COR Odyssey封闭缓冲液中封闭后，将膜与(a)兔单克隆抗MUT抗体(abcam ab134956)和小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体(abcam ab14128)或(b)兔多克隆抗2A抗体(专有)和小鼠多克隆抗白蛋白(abcam ab19194)一起孵育。在用二抗(抗兔IRDye800CW和抗小鼠IRDye680CT)孵育后，在LI-COR Odyssey系统中扫描印迹，并用ImageStudio软件分析图像。

转基因和载体

人因子IX转基因：在其5'-端具有P2A编码序列的密码子优化的人F9 cDNA侧翼是Alb终止密码子上游1.3Kb和下游1.4Kb的同源臂(SEQ ID NO:3)。

人甲基丙二酰基-CoA转基因：在5'端具有P2A编码序列的密码子优化的人MUTcDNA侧翼是Alb终止密码子上游1Kb和下游1Kb的同源臂(SEQ ID NO:4)。

小鼠甲基丙二酰基-CoA转基因：在5'端具有P2A编码序列的小鼠MUT cDNA侧翼是Alb终止密码子上游1Kb和下游1Kb的同源臂(SEQ ID NO:5)。

食蟹猴α-1-抗胰蛋白酶(cyno-A1AT)转基因：在5'端具有P2A编码序列的密码子优化的食蟹猴SERPINA1 cDNA侧翼是Alb终止密码子上游和下游1Kb(SEQ ID NO:6)或750bp(SEQ ID NO:7)的同源臂。

载体制备：用于rAAV生产的所有质粒均使用Qiagen的EndoFree PlasmidGigaprep试剂盒制备。

DJ载体以研究级规模产生，在贴壁HEK-293细胞中使用三重转染针对hF9和MUT进行CsCl梯度纯化，并在悬浮HEK-293F细胞中使用三重转染进行亲和纯化，随后针对cyno-A1AT进行碘克沙醇梯度纯化。通过qPCR定量物理滴度。

体内研究

所有动物程序均按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)的研究动物护理和使用指南进行。

C57BL/6和FvB/NJ小鼠购自Jackson Laboratory，以充当繁殖对，以产生用于新生(p2)和幼年(p21)注射的后代。给2日龄小鼠通过面部静脉而静脉内(i.v.)注射约10μL载体，最终剂量为1e13或1e14 vg/kg，或给媒介物组注射PBS。给21天龄的小鼠通过尾静脉而静脉内注射约100μL载体，最终剂量为1e13或1e14 vg/kg，或媒介物组的PBS。给成年小鼠(>6周龄)通过尾静脉而静脉内注射约200μL载体，最终剂量为1e13或1e14 vg/kg，或给媒介物组注射PBS。每周监测动物体重。除了被断头的p7动物外，活体采血通过脸颊采血进行，末端采血通过心脏穿刺进行。收获时，通过吸入CO₂对小鼠实施安乐死，收集肝脏、切片并立即速冻。

MUT小鼠模型(Mut^-/-；Tg^INS-MCK-Mut)从Charles Venditti博士(国家人类基因组研究所，美国国立卫生研究院)处获得。给新生小鼠(p1-2)通过面部静脉而静脉内注射约10μLhMUT-DJ载体，最终剂量为1e13、3e13或1e14 vg/kg，或给媒介物组注射PBS。

实施例2：附加体DNA的检测

本实施例展示了根据本文公开的方法检测和分析附加体DNA的应用。

给新生小鼠静脉内注射病毒载体，该病毒载体包含P2A编码序列和人因子IX转基因，设计成在内源性白蛋白靶位点整合(参见实施例1中描述的人因子IX转基因)。

注射后附加体拷贝数随着时间的推移呈指数降低(图6A)。在肝脏生长的同时观察到附加体拷贝降低(从p7时的0.15g到8周龄时的1g)(图6B)。尽管每个细胞的附加体拷贝随着时间的推移降低，转基因表达仍然较高，这是在前第一周内转基因在基因组中稳定整合后所预期的，如使用GeneRide^TM实现的(参见，例如，图7A和图8A)。

这些数据展示，随着肝脏的生长，每个细胞的附加体DNA随着时间的推移而降低。这些数据另外展示，动物的生长和发育不受高滴度AAV的影响，此处为1e14 vg/kg(图6B至图6C)。这些数据还展示，体内递送的病毒载体的附加体拷贝数可以作为给药和组织生长的代表。具体而言，附加体拷贝数与动物所暴露的剂量成正比。例如，如果动物错过给药(新生小鼠静脉内注射时可能发生)，该动物的附加体拷贝将远低于完全给药的动物。

实施例3：血浆中的ALB-2A的检测及与内源性白蛋白表达的变化的相关性

本实施例展示了在体内递送编码2A肽的核酸元件后对加2A-肽标签的白蛋白的检测和监测。本实施例还展示了血浆中ALB-2A水平的变化可能与内源性白蛋白表达的变化相关。

给新生小鼠静脉内注射实施例2中描述的病毒载体。早在注射后1周后就可以检测到基因组整合，并且在2周后它已经达到其平台期(图7A)。循环中的ALB-2A在前3-4周内增加，然后稳定(图7B)。观察到出生后血浆ALB-2A增加与内源性白蛋白的指数增加相关(图7C和图7D)。

这些数据展示根据本公开利用的方法允许即时检测和/或分析血浆中的ALB-2A，并且在体内递送编码2A肽的核酸元件后，可以相对较早地(例如，在1周内)实现血浆中ALB-2A的检测和/或分析。这些数据进一步展示，可以在初次递送编码2A肽的核酸元件后按多个时间间隔监测血浆中的ALB-2A水平，并且血浆中的ALB-2A的水平与在用于整合2A肽的靶位点(例如，白蛋白靶位点)编码的内源性多肽的水平的变化关联。

实施例4：早期生物标记物和有效负载检测和分析

本实施例展示根据本公开利用的方法允许在体内递送编码有效负载的核酸和编码生物标记物的核酸之后对有效负载进行早期体内检测和分析。本实施例还展示有效负载表达的动力学展现出与生物标记物表达的动力学的相似性。

给新生小鼠静脉内注射实施例2中描述的病毒载体。对从整合的转基因表达的人因子IX的血浆水平的分析揭示了与ALB-2A相似的早期动力学(分别为图8A至图8B)。与血浆中ALB-2A的动力学相似，出生后因子IX的水平随着内源性白蛋白的增加而增加。

这些数据展示可以在通过病毒载体递送后相对较早地(例如，在1周内)进行有效负载(例如，因子IX)的表达的检测和/或分析。这些数据还展示了有效负载的表达动力学与在初次递送有效负载后按多个时间间隔监测的随有效负载(例如，2A肽)一起递送的生物标记物的血浆水平的表达动力学相似。

实施例5：整合效率、血浆ALB-2A和转基因不受给药时动物年龄的影响

本实施例展示了根据本公开利用的方法可以应用于在接受此类治疗的受试者的不同年龄(包括非常年轻(例如，婴儿)和成人前发育阶段)施用的基因疗法治疗。本实施例进一步展示，本文所述的方法可应用于递送至具有低生长或高生长的组织的基因疗法的分析。

给新生(p2)或幼年(p21)小鼠静脉内注射实施例2中描述的病毒载体，并在注射后8周收获。无论测试的给药年龄如何，血浆中的ALB-2A和人因子IX(分别为图9A和9B)以及2A生物标记物的RNA整合(图9C)都易于检测。基因组DNA的整合效率不受动物给药年龄的显著影响(图9D)。注射后8周之后在p21给药的动物中附加体拷贝数仍然较高(图9E)，如将对应于幼年动物肝脏的较低生长。

这些数据展示可以在将所述生物标记物和有效负载递送至处于不同发育阶段的受试者(包括受试者的不同年龄和/或组织定向递送中组织的不同生长阶段)后检测和/或分析生物标记物(例如2A)和有效负载(例如因子IX)表达。在本实施例中，使用DJ载体将2A和有效负载的核酸递送靶向至肝脏。

实施例6：作为不同施药年龄的有效负载水平的代表的生物标记物水平

本实施例展示根据本公开利用的方法能够检测和分析作为有效负载水平的代表的生物标记物。本实施例还展示了使用生物标记物作为代表可针对对不同受试者年龄组递送有效负载和生物标记物而实践。

向新生(p2)、幼年(p21)或成年(p42和p63)小鼠静脉内给予实施例2中描述的病毒载体，并在注射后4周收获。相对于媒介物治疗，在测试的每个年龄组观察到血浆中的ALB-2A(图10A)和人因子IX(图10B)的即时检测。ALB-2A的相对水平指示了测试年龄组中的人因子IX水平(图10C)。

这些数据展示生物标记物(例如ALB-2A)的检测指示有效负载(例如因子IX)的表达。这些数据进一步说明生物标记物的检测和分析可用作递送至受试者的有效负载的水平的代表。此外，作为有效负载水平的代表的生物标记物水平的这种测量可用于分析递送至不同年龄组的受试者的有效负载。

实施例7：随着载体设计的变化，观察作为有效负载水平的代表的生物标记物水平

给新生小鼠静脉内注射病毒载体，该病毒载体包含P2A编码序列、食蟹猴SERPINA1cDNA和1Kb或750bp的同源臂，设计成在内源性白蛋白靶位点整合(参见实施例1中描述的食蟹猴α-1-抗胰蛋白酶(cyno-A1AT)转基因)。注射后6周收获动物。在用包含750bp和1Kb的同源臂的病毒载体递送后检测ALB-2A的血浆水平(图11A)。对于测试的两组同源臂，从整合的转基因表达的食蟹猴A1AT的血浆水平也可容易检测到(图11B)。ALB-2A的相对水平指示食蟹猴A1AT水平(图11C)。

实施例8：作为细胞内在有效负载整合和表达的代表的血浆生物标记物水平

在本实施例中使用称为Mut^-/-；Tg^INS-MCK-Mut小鼠(本文中称为MCK-Mut)的鼠类MMA模型。在该小鼠模型中，小鼠Mut基因的功能拷贝受肌酸激酶启动子的控制，从而使Mut能够在肌肉细胞中表达。给新生MCK-Mut小鼠(p2)静脉内注射不同剂量的病毒载体，该病毒载体包含P2A编码序列和密码子优化的人MUT cDNA(参见实施例1中描述的人甲基丙二酰基-CoA变位酶转基因)。在3个月的时间段内收获动物。血浆ALB-2A和肝脏基因组整合容易检测到(图12A)。肝脏和血浆中ALB-2A的相对水平指示肝脏中的MUT蛋白水平(图12B)。

这些数据展示，根据本公开利用的方法允许细胞内在有效负载(例如，MUT)表达，该表达可以通过对融合到由靶位点基因(例如，ALB-2A)编码的多肽的可检测部分的表达的检测和分析来评估。这些数据进一步展示细胞内在有效负载(例如，MUT)表达的变化可以反映在可检测部分(例如，2A肽)的血浆水平的类似变化中，使得对可检测部分的血浆水平的检测可以充当检测细胞内在有效负载的代表。此外，这些数据展示了实时监测细胞内在有效负载水平的能力，而无需检测细胞内在有效负载本身(例如通过肝活检)。

实施例9：作为有效负载水平随着时间的推移的变化的代表的生物标记物水平

新生MUT-MCK小鼠(p2)静脉内注射1e14 vg/kg的DJ-hMUT，并在7个月的时间段内收获。GeneRide编辑的肝细胞表达功能性MUT，这给予了它们优于Mut^-/-内源性肝细胞的选择性生长优势。因此，预期并观察到基因编辑的群体生长更快。这种扩增可以通过转基因以及ALB-2A的水平增加来检测(图13A至图13B)。

这些数据说明，在缺乏对应于由有效负载编码的多肽的蛋白质的野生型表达的组织中单剂量递送后，有效负载的水平可以随着时间的推移而增加。这些数据进一步展示生物标记物水平的增加跟踪有效负载水平的增加。本领域技术人员将能够应用本文公开的方法来检测和分析血浆生物标记物，如ALB-2A，作为细胞内有效负载(例如，MUT)表达的代表。

实施例10：长期生物标记物和有效负载检测和分析

本实施例展示根据本公开利用的方法允许在体内递送编码有效负载的核酸和编码生物标记物的核酸之后对有效负载表达的扩展体内评估。本实施例还展示测定的验证，即有效负载表达的动力学展现出与生物标记物表达的动力学的相似性。

给成年小鼠静脉内注射实施例2中描述的病毒载体。对从整合的转基因表达的人因子IX的血浆水平的分析揭示了与ALB-2A的第1周至第16周动力学相似(图15A至图15B)，在注射后的前数周内迅速增加，直至达到稳定状态。

这些数据展示可以在通过病毒载体递送后在扩展的时间段(例如，长达16周)内评估有效负载(例如，因子IX)的表达。重要地是，这些数据验证了有效负载的表达动力学与在初次递送有效负载后按多个时间间隔监测的随有效负载(例如，2A肽)一起递送的生物标记物的血浆水平的表达动力学相似。

实施例11：剂量依赖性生物标记物、gDNA和有效负载检测和分析

本实施例展示根据本公开利用的方法允许在体内递送编码有效负载的核酸和编码生物标记物的核酸之后对有效负载进行剂量依赖性检测和分析。

这些数据展示，根据本公开利用的方法允许有效负载(此处为细胞内在有效负载(例如，mMUT)或分泌的有效负载(例如，cA1AT))剂量依赖性表达，该表达可以通过对融合到由靶位点基因(例如，ALB-2A)编码的多肽的可检测部分的表达的检测和分析来评估。这些数据进一步展示分泌的有效负载(例如，cA1AT)表达的剂量依赖性变化可以反映在可检测部分(例如，2A肽)的血浆水平的类似变化中，使得对可检测部分的血浆水平的检测可以充当检测分泌的有效负载的代表(图16A至图16C)。此外，这些数据展示细胞内在有效负载的基因组整合水平也可以与可检测部分的血浆水平的类似变化关联(图17A至图17C)。

等效方案和范围

本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。本发明的范围并不旨在限于上述描述，而是如以下权利要求中所述：

序列表

<110> 逻辑生物治疗公司(LogicBio Therapeutics, Inc.)

<120> 监测基因疗法

<130> 2012538-0082

<150> 62/833875

<151> 2019-04-15

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

gccaccaact tcagcctgct gaaacaggcc ggcgacgtgg aagagaaccc tggcccc 57

<210> 3

<211> 4172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

aggttcgaac cctgctgaag ggagaggttc caatactaca aaatgtagcg ggatattgtc 60

atcacctttg gggacatgtc atcatggtcc ccagacagag ttacaaaact catcccctac 120

acagcactat gtctctggta ctgtttgttc tacagatgtc aacaacagag gcccagccat 180

ctcctattgc ttggcttgtc agtctttcta gcctccccat tattaatttc aaatggggca 240

ggtgttagga gggcaaaaat ccacatatta agtgcaaagc ctttcaggag atttcctgaa 300

actagacaaa acccgtgtga ctggcatcga ttattctatt tgatctagct agtcctagca 360

aagtgacaac tgctactccc ctcctacaca gccaagattc ctaagttggc agtggcatgc 420

ttaatcctca aagccaaagt tacttggctc caagatttat agccttaaac tgtggcctca 480

cattccttcc tatcttactt tcctgcactg gggtaaatgt ctccttgctc ttcttgcttt 540

ctgtcctact gcagggctct tgctgagctg gtgaagcaca agcccaaggc tacagcggag 600

caactgaaga ctgtcatgga tgactttgca cagttcctgg atacatgttg caaggctgct 660

gacaaggaca cctgcttctc gactgaggtc agaaacgttt ttgcattttg acgatgttca 720

gtttccattt tctgtgcacg tggtcaggtg tagctctctg gaactcacac actgaataac 780

tccaccaatc tagatgttgt tctctacgta actgtaatag aaactgactt acgtagcttt 840

taatttttat tttctgccac actgctgcct attaaatacc tattatcact atttggtttc 900

aaatttgtga cacagaagag catagttaga aatacttgca aagcctagaa tcatgaactc 960

atttaaacct tgccctgaaa tgtttctttt tgaattgagt tattttacac atgaatggac 1020

agttaccatt atatatctga atcatttcac attccctccc atggcctaac aacagtttat 1080

cttcttattt tgggcacaac agatgtcaga gagcctgctt taggaattct aagtagaact 1140

gtaattaagc aatgcaaggc acgtacgttt actatgtcat tgcctatggc tatgaagtgc 1200

aaatcctaac agtcctgcta atacttttct aacatccatc atttctttgt tttcagggtc 1260

caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct tagccggaag cggcgccacc aatttcagcc 1320

tgctgaaaca ggccggcgac gtggaagaga accctggccc tgctagccag cgcgtgaaca 1380

tgattatggc cgagagccct ggcctgatca ccatctgcct gctgggctac ctgctgagcg 1440

ccgagtgtac cgtgttcctg gaccacgaga acgccaacaa gatcctgaac agacccaaga 1500

gatacaacag cggcaagctg gaagagttcg tgcagggcaa cctggaacgc gagtgcatgg 1560

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cttatcctct ggatgaagtt gaaaccatat gaaggaatat ttggggggtg ggtcaaaaca 2760

gttgtgtatc aatgattcca tgtggtttga cccaatcatt ctgtgaatcc atttcaacag 2820

aagatacaac gggttctgtt tcataataag tgatccactt ccaaatttct gatgtgcccc 2880

atgctaagct ttaacagaat ttatcttctt atgacaaagc agcctccttt gaaaatatag 2940

ccaactgcac acagctatgt tgatcaattt tgtttataat cttgcagaag agaatttttt 3000

aaaatagggc aataatggaa ggctttggca aaaaaattgt ttctccatat gaaaacaaaa 3060

aacttatttt tttattcaag caaagaacct atagacataa ggctatttca aaattatttc 3120

agttttagaa agaattgaaa gttttgtagc attctgagaa gacagctttc atttgtaatc 3180

ataggtaata tgtaggtcct cagaaatggt gagacccctg actttgacac ttggggactc 3240

tgagggacca gtgatgaaga gggcacaact tatatcacac atgcacgagt tggggtgaga 3300

gggtgtcaca acatctatca gtgtgtcatc tgcccaccaa gtaa 3344

<210> 7

<211> 2844

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

ctactgcagg gctcttgctg agctggtgaa gcacaagccc aaggctacag cggagcaact 60

gaagactgtc atggatgact ttgcacagtt cctggataca tgttgcaagg ctgctgacaa 120

ggacacctgc ttctcgactg aggtcagaaa cgtttttgca ttttgacgat gttcagtttc 180

cattttctgt gcacgtggtc aggtgtagct ctctggaact cacacactga ataactccac 240

caatctagat gttgttctct acgtaactgt aatagaaact gacttacgta gcttttaatt 300

tttattttct gccacactgc tgcctattaa atacctatta tcactatttg gtttcaaatt 360

tgtgacacag aagagcatag ttagaaatac ttgcaaagcc tagaatcatg aactcattta 420

aaccttgccc tgaaatgttt ctttttgaat tgagttattt tacacatgaa tggacagtta 480

ccattatata tctgaatcat ttcacattcc ctcccatggc ctaacaacag tttatcttct 540

tattttgggc acaacagatg tcagagagcc tgctttagga attctaagta gaactgtaat 600

taagcaatgc aaggcacgta cgtttactat gtcattgcct atggctatga agtgcaaatc 660

ctaacagtcc tgctaatact tttctaacat ccatcatttc tttgttttca gggtccaaac 720

cttgtcacta gatgcaaaga cgccttagcc ggcagcggcg ccaccaactt cagcctgctg 780

aaacaggccg gcgacgtgga agagaaccct ggcccctctt ctgtctcatg gggcgtcctc 840

ctgctggctg gcctgtgctg cctgctcccc ggctctctgg ctgaggatcc ccagggagat 900

gctgcccaaa aaacggatac atccctccat gatcaagacc acccaaccct caacaagatc 960

acccccagcc tggctgagtt cggcttcagc ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac 1020

agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc atcgctacag cctttgcaat gctctccctg 1080

gggaccaagg ctgacactca cagtgaaatc ctggagggcc tgaatttcaa cgtcacggag 1140

attccggagg ctcaggtcca tgaaggcttc caggaactcc tccataccct caacaagcca 1200

gacagccagc tccagctgac caccggcaac ggcctgttcc tcaacaagtc actcaaagta 1260

gtggataagt ttttggagga tgtcaaaaaa ctgtaccact cagaagcctt ctctgtcaac 1320

tttgaggaca ccgaagaggc caagaaacag atcaacaatt acgtggagaa ggaaactcaa 1380

gggaaaattg tggatttggt caaggagctt gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat 1440

tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga ccctttgacg ttgaggccac caaggaagag 1500

gacttccacg tggaccaggc gaccaccgtg aaggtgccca tgatgaggcg tttaggcatg 1560

tttaacatct accactgtga gaagctgtcc agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc 1620

aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat gaggggaaac tgcagcacct ggaaaatgaa 1680

ctcacccatg atatcatcac caagttcctg gaaaatgaaa acagcaggtc tgccaactta 1740

catttaccca gactggccat tactggaacc tatgatctga agacagtcct gggccacctg 1800

ggtatcacta aggtcttcag caatggggct gacctctcag ggatcacgga ggaggcaccc 1860

ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct gtgctgacca tcgatgagaa agggactgaa 1920

gctgctgggg ccatgttttt agaggccata cccatgtcta ttccccccga ggtcaagttc 1980

aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa caaaatacca agtctcccct cttcatggga 2040

aaagtggtga atcccaccca gaaagagcag aagctgatca gcgaggagga cctgtaaaca 2100

catcacaacc acaaccttct caggtaacta tacttgggac ttaaaaaaca taatcataat 2160

catttttcct aaaacgatca agactgataa ccatttgaca agagccatac agacaagcac 2220

cagctggcac tcttaggtct tcacgtatgg tcatcagttt gggttccatt tgtagataag 2280

aaactgaaca tataaaggtc taggttaatg caatttacac aaaaggagac caaaccaggg 2340

agagaaggaa ccaaaattaa aaattcaaac cagagcaaag gagttagccc tggttttgct 2400

ctgacttaca tgaaccacta tgtggagtcc tccatgttag cctagtcaag cttatcctct 2460

ggatgaagtt gaaaccatat gaaggaatat ttggggggtg ggtcaaaaca gttgtgtatc 2520

aatgattcca tgtggtttga cccaatcatt ctgtgaatcc atttcaacag aagatacaac 2580

gggttctgtt tcataataag tgatccactt ccaaatttct gatgtgcccc atgctaagct 2640

ttaacagaat ttatcttctt atgacaaagc agcctccttt gaaaatatag ccaactgcac 2700

acagctatgt tgatcaattt tgtttataat cttgcagaag agaatttttt aaaatagggc 2760

aataatggaa ggctttggca aaaaaattgt ttctccatat gaaaacaaaa aacttatttt 2820

tttattcaag caaagaacct atag 2844

Claims

1.一种监测基因疗法的方法，所述方法包括以下步骤：

在来自已接受整合基因疗法治疗的受试者的生物样品中，作为所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性的替代物，检测通过整合所述整合基因疗法治疗而产生的生物标记物的水平或活性，其中所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性选自由有效负载的水平、有效负载的活性、所述基因疗法治疗在细胞群中的整合水平及其组合组成的组。

2.一种在已接受递送有效负载的基因整合组合物的受试者中监测所述有效负载的递送、水平和/或活性的方法，所述方法包括以下步骤：

在来自所述受试者的生物样品中，作为所述有效负载的递送、水平和/或活性的替代物，检测通过整合所述基因整合组合物而产生的生物标记物的水平或活性。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述有效负载是或包括细胞内表达的肽。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述有效负载是或包括细胞外分泌的肽。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述有效负载是或包括具有促进治疗医学疾患的生物过程的细胞内在或细胞外在活性的肽。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述有效负载是或包括在肝细胞中正常表达的肽。

7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述有效负载是或包括在肝细胞中异位表达的肽。

8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述有效负载是或包括甲基丙二酰基-CoA变位酶或人因子IX。

9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合基因疗法治疗或基因整合组合物实现将包含编码所述有效负载的序列的核酸元件整合到所述受试者的基因组中的靶位点中。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述靶位点编码多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸元件的整合发生在编码所述多肽的基因的5'或3'端。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述靶位点编码白蛋白。

13.如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述核酸元件的整合不显著破坏在所述靶位点编码的多肽的表达。

14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括毛发、皮肤、粪便、血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、眼泪、玻璃体液或粘液。

15.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括免疫学测定或核酸扩增测定。

16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包括可检测部分，所述可检测部分在由所述靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由所述靶位点编码的多肽。

17.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包括可检测部分，所述可检测部分在由所述靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由所述有效负载编码的多肽。

18.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包含可检测部分，所述可检测部分为2A肽或弗林蛋白酶切割基序。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述2A肽选自由P2A、T2A、E2A以及F2A组成的组。

20.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者接受单剂量的所述基因疗法治疗或基因整合组合物。

21.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤在所述受试者接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物后1、2、3、4、5、6、7、8或更多周进行。

22.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤在所述受试者已接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物后的多个时间点进行。

23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤在所述受试者已接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物后至少3个月的时间段内进行。

24.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者作为婴儿接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物。

25.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述受试者在达到成年之前接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物。

26.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述受试者作为成人接受所述基因疗法治疗或基因整合组合物。

27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括监测所述受试者对所述基因疗法的自身免疫反应。

28.一种在已接受整合基因疗法治疗的受试者中确定基因疗法治疗状态的一种或多种特性的方法，所述方法包括：

a)提供来自所述受试者的生物样品；

b)确定生物标记物的水平，其中所述生物标记物是通过在所述受试者的基因组中整合所述基因疗法而产生的；以及

c)基于所确定的所述生物标记物的水平，建立所述受试者中所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性，其中所确定的所述生物标记物的水平对应于所述基因疗法治疗状态的一种或多种特性。

29.一种向有需要的受试者递送基因疗法治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

a.向所述受试者施用整合基因疗法治疗；以及

b.在来自所述受试者的生物样品中，确定通过在所述受试者的基因组中整合所述基因疗法治疗而产生的生物标记物的水平。

30.如权利要求29所述的方法，所述方法还包括：

如果所述生物标记物的水平低于将指示已实现所述整合基因疗法的治疗有效量的水平，则向所述受试者施用另外的治疗。

31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述整合基因疗法治疗实现将包含编码有效负载的序列的核酸元件整合到所述受试者的基因组中的靶位点中。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述靶位点编码多肽。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述核酸元件的整合发生在编码所述多肽的基因的5'或3'端。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述靶位点编码白蛋白。

35.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述核酸元件的整合不显著破坏在所述靶位点编码的多肽的表达。

36.如权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括毛发、皮肤、粪便、血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、眼泪、玻璃体液或粘液。

37.如权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括免疫学测定或核酸扩增测定。

38.如权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包括可检测部分，所述可检测部分在由所述靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由所述靶位点编码的多肽。

39.如权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包括可检测部分，所述可检测部分在由所述靶位点编码的多肽翻译后变成融合到由所述有效负载编码的多肽。

40.如权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述生物标记物包含可检测部分，所述可检测部分为2A肽。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述2A肽选自由P2A、T2A、E2A以及F2A组成的组。

42.如权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述受试者接受单剂量的所述基因疗法治疗。

43.如权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述确定步骤在所述受试者已接受所述基因疗法治疗后1、2、3、4、5、6、7、8或更多周进行。

44.如权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述确定步骤在所述受试者已接受所述基因疗法治疗后的多个时间点进行。

45.如权利要求28至44中任一项所述的方法，其中所述确定步骤在所述受试者已接受所述基因疗法治疗后至少3个月的时间段内进行。

46.如权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述受试者作为婴儿接受所述基因疗法治疗。

47.如权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述受试者在达到成年之前接受所述基因疗法治疗。

48.如权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述受试者作为成人接受所述基因疗法治疗。

49.如权利要求28至48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括监测所述受试者对所述基因疗法的自身免疫反应。

50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：如果所述生物标记物的水平超过指示所述有效负载的最佳或安全水平的水平，则向所述受试者递送另外的治疗，所述另外的治疗减少或抑制由所述基因疗法治疗递送的有效负载的表达。