TW202330928A - 用於治療ｈｔ１之基因療法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了用於基因療法之組合物及方法。此外，本揭露提供了用於透過新穎的基因療法機制治療HT1之組合物及方法。

Description

用於治療HT1之基因療法
人類疾病之一個子集可追溯至胚胎發育早期遺傳或獲得的DNA變化。基因療法開發者特別感興趣的係由單個基因之突變所致之疾病，稱為單基因疾病。據信有超過6,000種單基因疾病。通常，由遺傳之突變所致之任何特定遺傳疾病均為相對罕見的，但總體來說，遺傳相關疾病之死亡率較高。眾所周知的遺傳疾病包括囊腫纖維化、杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、杭丁頓氏症(Huntington's disease)及鐮狀細胞病。其他類別之遺傳疾病包括代謝失調，諸如有機酸血症及溶體儲積症，其中功能異常的基因導致代謝過程之缺陷及毒性副產物之累積，該等毒性副產物可導致短期及長期的嚴重發病率及死亡率。
單基因疾病由於其疾病病理學之簡單性而受到生物醫學創新者之特別關注。然而，此等疾病及病症中之絕大多數仍實質上無法治療。因此，在此項技術中仍存在對治療此類疾病之長期需要。
在一些實施例中，本揭露提供了將轉殖基因整合至個體組織中之至少一個細胞群之基因體中的方法。在一些實施例中，此類方法可包括向個體投與遞送編碼功能性蛋白之轉殖基因的組合物的步驟，該個體組織中之細胞未能表現由基因產物編碼之功能性蛋白，其中該組合物包括：包含表現匣之多核苷酸匣，該表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼轉殖基因；且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且在整合至細胞之基因體中之靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列，其中在投與組合物後，轉殖基因被整合至細胞群之基因體中。
在一些實施例中，本揭露提供了在一段時間內提高組織中轉殖基因之表現水準之方法，該方法包括向有需要之個體投與遞送轉殖基因的組合物的步驟，該轉殖基因整合至個體組織中之至少一個細胞群之基因體中，其中該組合物包括：包含表現匣之多核苷酸匣，該表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼轉殖基因；且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且在整合至細胞之基因體中之靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列，其中在投與組合物後，轉殖基因被整合至細胞群之基因體中且轉殖基因在組織中之表現水準在一段時間內增加。在一些實施例中，增加的表現水準包含在組織中表現轉殖基因之細胞之百分比增加。
在一些實施例中，本揭露提供了包括向個體投與一定劑量之向個體組織中之細胞遞送轉殖基因的組合物的步驟之方法，其中轉殖基因(i)編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)；(ii)在複數個細胞之基因體中的靶整合位點處整合；(iii)一旦整合，便功能性表現FAH；且(iv)相對於組織中之其他細胞，賦予該複數個細胞選擇性優勢，使得隨時間推移，該組織達成FAH之功能性表現水準，其中組合物包含：包含表現匣之多核苷酸匣，該表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼轉殖基因；且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且在靶整合位點處整合轉殖基因時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。在一些實施例中，選擇性優勢包含在組織中表現轉殖基因之細胞之百分比增加。
在一些實施例中，本揭露提供了治療單基因疾病之方法。在一些實施例中，本揭露提供了治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之方法。在一些實施例中，HT1之方法包含向個體投與一定劑量之組合物，該組合物包含：包含表現匣之多核苷酸匣，該表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼 FAH轉殖基因；且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且在靶整合位點處整合轉殖基因時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。在一些實施例中，第三核酸序列選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，第四核酸序列選自SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 5。
在一些實施例中，組合物包含遞送媒劑。在一些實施例中，遞送媒劑為顆粒，例如奈米顆粒，例如脂質奈米顆粒。在一些實施例中，遞送媒劑為重組病毒載體。在一些實施例中，重組病毒載體為重組AAV載體。在一些實施例中，重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，組合物進一步包含AAV2 ITR序列。在一些實施例中，組合物包含AAV2 ITR序列之一部分。在一些實施例中，組合物包含與AAV2 ITR具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性之ITR。在一些實施例中，組合物包含選自SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 30之ITR序列。
根據各種實施例，可根據本文所描述之方法及組合物表現多種轉殖基因中之任一者。舉例而言，在一些實施例中，轉殖基因為或包含 FAH轉殖基因。在一些實施例中， FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。在一些實施例中，轉殖基因為或包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22中之任一者具有80%一致性之序列。
在一些實施例中，本發明提供了用於將轉殖基因整合至細胞之基因體中之靶整合位點中的重組病毒載體，其包括：包含表現匣之多核苷酸匣，該表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列包含 FAH轉殖基因；且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且在整合至細胞之基因體中之靶整合位點中時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。在一些實施例中，第二核酸序列為編碼P2A肽之序列。在一些實施例中，第二核酸序列與SEQ ID NO: 6具有至少80%一致性。在一些實施例中，第二核酸序列編碼與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列一致性之P2A肽。在一些實施例中，提供的重組病毒載體包含序列SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26。
如本文所描述的，本揭露涵蓋關於將一或多種轉殖基因整合至細胞之基因體中之若干有利認識。舉例而言，在一些實施例中，整合不包含核酸酶活性。
儘管可靶向任何適合應用之組織，但在一些實施例中，組織為肝臟。
如本文所描述的，提供的方法及組合物包括具有至少四個核酸序列之多核苷酸匣。在一些實施例中，第二核酸序列包含：a)編碼2A肽之核酸序列；b)編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列；c)編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或d)編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。在一些實施例中，第三核酸序列及第四核酸序列為將轉殖基因及第二核酸序列整合至靶整合位點中之同源臂。在一些實施例中，靶整合位點包含內源啟動子及內源基因。在一些實施例中，靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之內源白蛋白基因座。在一些實施例中，同源臂引導表現匣整合於緊靠該內源白蛋白基因之起始密碼子之3'或緊靠該內源白蛋白基因之終止密碼子之5'。
根據各種態樣，第三核酸及/或第四核酸可具有顯著長度(例如長度為至少800個核苷酸)。在一些實施例中，第三核酸在200-3,000個核苷酸之間。在一些實施例中，第四核酸在200-3,000個核苷酸之間。
在一些實施例中，多核苷酸匣不包含啟動子序列。在一些實施例中，在將表現匣整合至細胞之基因體中之靶整合位點後，轉殖基因在靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。在一些實施例中，靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。在一些實施例中，在將表現匣整合至細胞之基因體中之靶整合位點後，轉殖基因在內源白蛋白啟動子之控制下表現，而不破壞內源白蛋白基因之表現。
在一些實施例中，提供的組合物可以1E12 vg/kg與1E14 vg/kg之間的劑量向個體投與。在一些實施例中，提供的組合物可以3E12 vg/kg與1E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。在一些實施例中，提供的組合物可以3E12 vg/kg與3E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。在一些實施例中，提供的組合物可以不多於3E13 vg/kg之劑量向個體投與。在一些實施例中，提供的組合物可以不多於3E12 vg/kg之劑量向個體投與。在一些實施例中，提供的組合物可僅向個體投與一次。在一些實施例中，提供的組合物可向個體投與多於一次。
在一些實施例中，本揭露提供了可向新生兒個體投與提供的組合物的見解。此外，在一些實施例中，可向年齡在0天與1個月、3個月與1歲、1歲與5歲以及5歲與更大年齡之間的個體投與提供的組合物。在一些實施例中，可向個體投與提供的組合物，其中個體為動物。在一些實施例中，可向個體投與提供的組合物，其中個體為人類。
如在本申請案中所用的，術語「約」及「大約」用作等效物。本文中對公開案、專利或專利申請案之任何引用均以引用之方式整體併入。本申請案中所用的具有或不具有約/大約之任何數值均意謂涵蓋一般熟習相關技術者所理解的任何正常波動。
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實施方式中顯而易知。然而應理解，實施方式雖然指示本發明之實施例，但是僅為了說明而給出，並非具有限制性。本發明範圍內之各種變化及修改將自實施方式而變得對於熟習此項技術者顯而易知。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2022年5月9日提交之美國臨時申請案第63/339,783號及2021年10月18日提交之美國臨時申請案第63/257,028號之優先權，該等申請案中之每一者之全部內容以引用之方式併入本文。 定義
為了使本發明更容易理解，首先在下文定義某些術語。以下術語及其他術語之其他定義在整個說明書中闡明。
約： 術語「約」在本文中用於提及值時係指在上下文中與所提及值相似之值。一般而言，熟悉上下文之熟習此項技術者將瞭解該上下文中由「約」涵蓋之相關變化程度。舉例而言，在一些實施例中，術語「約」可涵蓋在所提及值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之一系列值。
成人 ：如本文所用，術語「成人」係指年齡為十八歲或更大之人類。在一些實施例中，成年人類之體重在約90磅至約250磅之範圍內。
相關 ：當該術語在本文中使用時，若一個事件或實體之存在、水準及/或形式與另一事件或實體之存在、水準及/或形式相關聯，則兩個事件或實體彼此「相關」。舉例而言，若特定實體(例如多肽、遺傳特徵、代謝物、微生物等)之存在、水準及/或形式與疾病、病症或疾患之發生率及/或易感率(例如在相關群體中)相關聯，則認為該特定實體與特定疾病、病症或疾患相關。在一些實施例中，若二或更多個實體直接或間接相互作用，以使得其在物理上彼此靠近及/或保持靠近，則該兩個或更多個實體在物理上彼此「相關」。在一些實施例中，二或更多個在物理上彼此相關之實體彼此共價連接；在一些實施例中，二或更多個在物理上彼此相關之實體彼此不共價連接，但例如藉助氫鍵、凡得瓦(van der Waals)相互作用、疏水相互作用、磁性及其組合而非共價相關。
生物樣品 ：如本文所用，術語「生物樣品」通常係指獲自或衍生自如本文所描述之感興趣之生物來源(例如組織或生物或細胞培養物)的樣品。在一些實施例中，感興趣之來源包含生物，諸如動物或人類。在一些實施例中，生物樣品為或包含生物組織或流體。在一些實施例中，生物樣品可為或包含骨髓；血液；血球；腹水；組織或細針生檢樣品；含有細胞之體液；自由漂浮之核酸；痰；唾液；尿液；腦脊液、腹膜液；胸水；糞便；淋巴；婦科液體；皮膚拭子；陰道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗滌液或灌洗液，諸如導管灌洗液或支氣管肺泡灌洗液；吸出物；刮擦物；骨髓標本；組織生檢標本；手術標本；糞便、其他體液、分泌物及/或排泄物；及/或由此產生之細胞 等。在一些實施例中，生物樣品為或包含獲自個體之細胞。在一些實施例中，所獲得細胞為或包括來自獲得樣品之個體的細胞。在一些實施例中，樣品為藉由任何合適手段直接自感興趣之來源獲得之「初級樣品」。舉例而言，在一些實施例中，藉由選自由以下組成之群的方法獲得初級生物樣品：生檢( 例如細針吸出或組織生檢)、手術、收集體液( 例如血液、淋巴、糞便 等) 等。在一些實施例中，如自上下文將清楚的，術語「樣品」係指藉由處理(例如藉由移除一或多種組分及/或藉由向其中添加一或多種劑)初級樣品而獲得之製劑。例如，使用半透膜過濾。此「經處理樣品」可包含例如自樣品中提取或藉由使初級樣品經受諸如mRNA之擴增或反轉錄、某些組分之分離及/或純化 等之技術來獲得的核酸或蛋白質。
生物標誌物 ：本文所用之術語「生物標誌物」與其在此項技術中之使用一致，係指其存在、水準或形式與特定生物事件或感興趣之狀態相關聯，使得其被視為該事件或狀態之「標誌物」的實體。除其他事物外，本揭露提供了用於基因療法( 例如，可用於評估基因療法治療之一或多個特徵或特性，諸如有效負載表現之程度、水準及/或持久性)之生物標誌物。在一些實施例中，生物標誌物為細胞表面標誌物。在一些實施例中，生物標誌物為細胞內的。在一些實施例中，生物標誌物存在於細胞之外(例如，在細胞外分泌或以其他方式產生或存在，例如在諸如血液、尿液、淚液、唾液、腦脊液等之體液中)。在某些實施例中，本揭露證實了可在自已接受基因療法之個體獲得的樣品中偵測到之生物標誌物用於評估該基因療法之一或多個特徵或特性的有效性；在一些此類實施例中，樣品為除被遞送基因療法之細胞、組織及/或流體以外及/或除有效負載有效的細胞、組織及/或流體以外的胞、組織及/或流體。
密碼子最佳化 ：如本文所用，術語「密碼子最佳化」係指以使得由基因編碼之多肽序列保持相同，而改變的密碼子改進了多肽序列之表現過程之方式來改變給定基因之密碼子的過程。舉例而言，若多肽具有人類蛋白質序列且在大腸桿菌中表現，則在對DNA序列進行密碼子最佳化以將人類密碼子改變為更有效地在大腸桿菌中表現的密碼子時，通常將提高表現。
可偵測部分 ：如本文所用，術語「可偵測部分」係指任何實體(例如，分子、複合物或其部分或組分)。在一些實施例中，提供了可偵測部分及/或其用作離散的分子實體；在一些實施例中，可偵測部分為另一分子實體之一部分及/或與另一分子實體相關。可偵測部分之實例包括但不限於：各種配位體、放射性核種(例如 3H、 14C、 18F、 19F、 32P、 35S、 135I、 125I、 123I、 64Cu、 187Re、 111In、 90Y、 99mTc、 177Lu、 89Zr等)、螢光染料(具體示範性螢光染料參見下文)、化學發光劑(諸如吖錠酯、穩定的二氧環丁烷及其類似物)、生物發光劑、光譜可解析之無機螢光半導體奈米晶體(亦即量子點)、金屬奈米顆粒(例如金、銀、銅、鉑等)奈米團簇、順磁性金屬離子、酶(酶之具體實例參見下文)、比色標籤(諸如染料、膠體金及其類似物)、生物素、長葉毛地黃配質、半抗原、抗體及/或可獲得抗血清或單株抗體之蛋白質。
兒童 ：如本文所用，術語「兒童」係指年齡在兩歲與18歲之間的人類。體重可因年齡及特定兒童而異，通常範圍為30磅至150磅。
組合療法 ：如本文所用，術語「組合療法」係指個體同時暴露於二或更多種治療方案(例如二或更多種治療劑，例如基因療法及非基因療法治療模態)之彼等情況。在一些實施例中，二或更多種方案可同時投與；在一些實施例中，此類方案可依序投與(例如，在第二方案之任何劑量投與之前投與第一方案之所有「劑量」)；在一些實施例中，此類劑以重疊給藥方案投與。在一些實施例中，組合療法之「投與」可涉及向個體投與一或多種劑或模態，該個體以組合方式接受其他一或多種劑或模態。為清楚起見，組合療法並不要求個別劑在單一組合物中一起投與(或甚至必須同時投與)。
組合物 ：熟習此項技術者將理解，如本文所用，術語「組合物」可用於指包含一或多種指定組分之離散物理實體。通常，除非另外指定，否則組合物可具有任何形式，例如氣體、凝膠、液體、固體等。
確定 ：本文所描述之許多方法包括「確定」步驟。普通熟習此項技術者，藉由閱讀本說明書，認識到此「確定」可利用熟習此項技術者可獲得之各種技術中之任一者，包括例如本文明確提及之特定技術或經由使用該等技術來完成。在一些實施例中，確定涉及調處物理樣品。在一些實施例中，確定涉及考量及/或調處資料或資訊，例如使用電腦或適於執行相關分析的其他處理單元。在一些實施例中，確定涉及自來源接收相關資訊及/或材料。在一些實施例中，確定涉及將樣品或實體之一或多個特徵與類似參考進行比較。
基因 ：如本文所用，術語「基因」係指編碼基因產物( 例如RNA產物及/或多肽產物)之DNA序列。在一些實施例中，基因包括編碼序列( 例如編碼特定產物之序列)；在一些實施例中，基因包括非編碼序列。在一些特定實施例中，基因可包括編碼( 例如外顯子)及非編碼( 例如內含子)序列兩者。在一些實施例中，基因可包括一或多個調控元件( 例如啟動子、強化子、沉默子、終止訊息)，其例如可控制或影響基因表現之一或多個態樣( 例如細胞類型特異性表現、可誘導表現)。在一些實施例中，基因位於或存在於基因體中(例如在染色體或其他可複製核酸中或上) (或具有與位於或存在於基因體中之基因相同的核苷酸序列)。
基因產物或表現產物 ：如本文所用，術語「基因產物」或「表現產物」通常係指自基因轉錄之RNA (加工前及/或後)或由自基因轉錄之RNA編碼的多肽(修飾前及/或後)。
「改進 (improve) 」 、 「增加 (increase) 」 、 「抑制 (inhibit) 」 或 「減少 (reduce) 」： 如本文所用，術語「改進」、「增加」、「抑制」、「減少」或其語法等效物指示相對於基線或其他參考量測值的值。在一些實施例中，合適參考量測可為或包含在其他方面可比較的條件下，在不存在(例如，之前及/或之後)特定劑或治療時，或在合適可比較的參考劑存在下，在特定系統中(例如，在單一個體中)之量測值。在一些實施例中，合適參考量測值可為或包含在已知或預期在相關劑或治療存在下以特定方式作出反應之類似系統中的量測值。
嬰兒 ：如本文所用，術語「嬰兒」係指年齡小於兩歲的人類。嬰兒之典型體重在3磅至20磅之範圍內。
新生兒： 如本文所用，術語「新生兒」係指新出生的人類。
核酸 ：如本文所用，在其最廣泛意義上，係指併入或可併入寡核苷酸鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，核酸為經由磷酸二酯鍵，併入或可併入寡核苷酸鏈中之化合物及/或物質。如自上下文清楚，在一些實施例中， 「核酸」係指個別核酸殘基(例如核苷酸及/或核苷)；在一些實施例中， 「核酸」係指包含個別核酸殘基之寡核苷酸鏈。在一些實施例中， 「核酸」為或包含RNA；在一些實施例中， 「核酸」為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為一或多個核酸殘基、包含其或由其組成。在一些實施例中，核酸為一或多個核酸類似物、包含其或由其組成。在一些實施例中，核酸類似物與核酸之不同之處在於其不利用磷酸二酯主鏈。在一些實施例中，核酸為一或多種天然核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)、包含其或由其組成。在一些實施例中，核酸為一或多種核苷類似物(例如2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-氧腺苷、8-氧鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)、包含其或由其組成。在一些實施例中，核酸具有編碼諸如RNA或蛋白質之功能基因產物的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，藉由自天然來源中分離、藉由基於互補模板之聚合來酶促合成( 活體內或 活體外)、在重組細胞或系統中增殖及化學合成中之一或多者來製備核酸。在一些實施例中，核酸為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基長。在一些實施例中，核酸為部分或全部單股的；在一些實施例中，核酸為部分或全部雙股的。在一些實施例中，核酸具有核苷酸序列，該序列包含至少一個元件，該元件編碼多肽，或為編碼該多肽之序列的補體。在一些實施例中，核酸具有酶促活性。
肽 ：如本文所用，術語「肽」或「多肽」係指胺基酸之任何聚合物鏈。在一些實施例中，肽具有在自然界中存在之胺基酸序列。在一些實施例中，肽具有不在自然界中存在之胺基酸序列。在一些實施例中，肽具有經工程改造之胺基酸序列，因為其透過操作人工來設計及/或產生。在一些實施例中，肽可包含天然胺基酸、非天然胺基酸或兩者或由其組成。在一些實施例中，肽可包含僅天然胺基酸或僅非天然胺基酸或由其組成。在一些實施例中，肽可包含D-胺基酸、L-胺基酸或兩者。在一些實施例中，肽可包含僅D-胺基酸。在一些實施例中，肽可包含僅L-胺基酸。在一些實施例中，肽為線性的。在一些實施例中，術語「肽」可附加於參考肽、活性或結構之名稱；在此類情況下，其在本文中用於指共有相關活性或結構且因此可視為相同類別或家族之肽之成員的肽。對於各此類別，本說明書提供及/或熟習此項技術者知道其胺基酸序列及/或功能已知之類別中之示範性肽；在一些實施例中，此等示範性肽為肽類別或家族之參考肽。在一些實施例中，肽類別或家族之成員展示與該類別之參考肽；在一些實施例中與該類別中之所有肽的顯著序列同源性或一致性、與其共有共同序列模體(例如特徵序列元件)，及/或與其共有共同活性(在一些實施例中，處於可比較水準下或在指定範圍內)。舉例而言，在一些實施例中，成員肽展示至少約30-40%，且通常大於約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的與參考肽之總體序列同源性或一致性程度及/或包括至少一個展現出通常大於90%或甚至95%、96%、97%、98%、或99%之極高序列一致性的區域(例如保守區域，其可在一些實施例中為或包含特徵序列元件)。此保守區域通常涵蓋至少3-4個且通常多達20個或更多個胺基酸；在一些實施例中，保守區域涵蓋具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個連續胺基酸之至少一個鏈段。
個體： 如本文所用，術語「個體」係指生物，通常為哺乳動物(例如人類，在一些實施例中包括出生前人類形式)。在一些實施例中，個體患有相關疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體顯示疾病、病症或疾患之一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體不顯示疾病、病症或疾患之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體為具有疾病、病症或疾患之易感性或風險所特有的一或多個特徵的人類。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體為投與及/或已投與診斷及/或療法之個體。
實質上： 如本文所用，術語「實質上」係指展現感興趣之特徵或性質之完全或接近完全範圍或程度的定性條件。普通熟習生物技術者將理解生物及化學現象很少地(若有的話)達到完成及/或進行至完成或達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於捕獲在許多生物及化學現象中固有的潛在缺少完全性。
變異體 ：如本文在分子例如核酸、蛋白質或小分子之情境中所用，術語「變異體」係指展示出與參考分子顯著的結構一致性但在結構上與參考分子不同的分子，例如與參考實體相比，存在或不存在或處於一或多個化學部分之水準下。在一些實施例中，變異體亦在功能上與其參考分子不同。一般而言，特定分子是否被恰當地視為參考分子之「變異體」係基於其與參考分子之結構一致性程度。如熟習此項技術者將理解的，任何生物或化學參考分子均具有某些特徵結構元件。藉由定義，變異體為共有一或多個此類特徵結構元件但在至少一個態樣中與參考分子不同的獨特分子。僅給出幾個實例，多肽可具有由複數個胺基酸構成之特徵序列元件，該等胺基酸在線性或三維空間中相對於彼此具有指定位置及/或有助於特定結構模體及/或生物學功能；核酸可具有由複數個核苷酸殘基構成之特徵序列元件，該等核苷酸殘基在線性或三維空間中相對於彼此具有指定位置。在一些實施例中，變異多肽或核酸可由於胺基酸或核苷酸序列中之一或多個差異及/或化學部分( 例如碳水化合物、脂質、磷酸酯基團)中之一或多個差異而與參考多肽或核酸不同，該等化學部分為多肽或核酸之共價組分( 例如其連接至多肽或核酸主鏈)。在一些實施例中，變異多肽或核酸展示出與參考多肽或核酸之至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%的總體序列一致性。在一些實施例中，變異多肽或核酸不與參考多肽或核酸共有至少一個特徵序列元件。在一些實施例中，參考多肽或核酸具有一或多種生物活性。在一些實施例中，變異多肽或核酸共有參考多肽或核酸之一或多種生物活性。在一些實施例中，變異多肽或核酸缺乏參考多肽或核酸之一或多種生物活性。在一些實施例中，與參考多肽或核酸相比，變異多肽或核酸展示出降低的一或多種生物活性水準。在一些實施例中，若感興趣之多肽或核酸具有與參考多肽或核酸之胺基酸或核苷酸序列相同的胺基酸或核苷酸序列，但在特定位置處具有少量序列改變，則該感興趣之多肽或核酸被視為參考多肽或核酸之「變異體」。通常，與參考相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%或約2%之殘基經取代、插入或缺失。在一些實施例中，與參照相比，變異多肽或核酸包含約10、約9、約8、約7、約6、約5、約4、約3、約2或約1個經取代殘基。通常，相對於參考，變異多肽或核酸包含極少數量( 例如少於約5、約4、約3、約2或約1個)之取代、插入或缺失的功能殘基( 亦即參與特定生物活性之殘基)。在一些實施例中，與參考相比，變異多肽或核酸包含不多於約5、約4、約3、約2或約1個添加或缺失，且在一些實施例中，不包含添加或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異多肽或核酸包含少於約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約10、約9、約8、約7、約6個，且通常少於約5、約4、約3或約2個添加或缺失。在一些實施例中，參考多肽或核酸為在自然界中存在的多肽或核酸。在一些實施例中，參考多肽或核酸為人類多肽或核酸。 某些實施例之詳細描述 基因療法
基因療法藉由基因轉移(即遞送治療基因(稱為轉殖基因)之過程)改變患者細胞之基因表現譜。已知各種遞送媒劑用作將轉殖基因轉運至細胞核中以改變或增強細胞能力(例如蛋白質體、功能性等)之載體。開發者在使用各種載體將基因引入諸如肝臟、眼睛視網膜及骨髓造血細胞之組織細胞方面取得了長足進步。此等方法在一些情況下導致了經批准療法，且在其他情況下，在臨床試驗中展示出極具希望的結果。
有多種基因療法方法。在習知AAV基因療法中，將轉殖基因引入宿主細胞之細胞核中，但並不意欲在染色體DNA中整合。轉殖基因自存在於細胞核內的稱為游離基因體(episome)之非整合遺傳元件表現。第二類型之基因療法採用不同類型的病毒，諸如慢病毒，其與轉殖基因一起但在任意位點處將自身插入染色體DNA中。
基因之游離基因體表現必須由外源啟動子驅動，從而產生校正或改善疾病狀況之蛋白質。 基因療法之限制
細胞分裂及組織生長時之稀釋效應。在基於游離基因體表現之基因療法的情況下，當細胞在生長或組織再生過程期間分裂時，療法之益處通常會下降，因為轉殖基因並不意欲整合至宿主染色體中，因此不會在細胞分裂期間複製。因此，各新一代細胞進一步降低了靶組織中表現轉殖基因之細胞的比例，導致隨時間推移降低或消除治療益處。
無法控制插入位點。儘管使用病毒介導之插入進行一些基因療法有可能提供長期益處，因為基因被插入宿主染色體，但無法控制基因之插入位置，此存在破壞必需基因或插入可能促進非所需影響(諸如腫瘤形成)之位置的風險。出於此原因，此等整合基因療法方法主要局限於 離體方法，在該等方法中細胞在體外進行處理，然後重新插入。
使用外源啟動子增加腫瘤形成之風險。兩種基因療法方法之共同特點為將轉殖基因與外源啟動子一起引入細胞中。需要啟動子起始DNA向信使RNA或mRNA之轉錄及擴增，該信使RNA或mRNA最終將被轉譯成蛋白質。自基因療法轉殖基因表現高水準的治療蛋白需要強經工程改造之啟動子。儘管此等啟動子對於蛋白質表現為必不可少的，但其他人在動物模型中進行之先前研究表明，基因療法載體之非特異性整合可導致腫瘤發展之顯著增加。啟動子之強度在增加此等腫瘤之發展中起著至關重要的作用。因此，用強啟動子驅動高水準表現之嘗試可能產生長期的有害後果。 A. 基因編輯
基因編輯為藉由使用外源遞送之基因編輯機制在細胞DNA中引入斷裂來缺失、改變或增加異常基因。大多數當前基因編輯方法在其功效方面受到限制，此係由於非所要的在靶及脫靶修飾率高，且基因校正效率低，部分原因為細胞試圖快速修復引入的DNA斷裂。目前基因編輯之重點為禁用功能失調的基因或校正或跳過基因中之個別有害突變。由於可能突變之數量，此等方法均無法解決特定遺傳疾病內之整個突變群體，正如藉由插入完整的校正基因來解決的那樣。
與基因療法方法不同，基因編輯允許修復的遺傳區域經由正常的細胞分裂傳播至新一代細胞。此外，可使用細胞自身的調節機制來表現所需的蛋白質。傳統基因編輯方法係基於核酸酶的，且其使用源自細菌之核酸酶以在特定位置切割DNA，以便導致缺失、做出改變或對體內DNA應用校正序列。
一旦核酸酶切割了DNA，傳統基因編輯技術便使用兩種途徑修飾DNA：同源定向修復或HDR及非同源末端連接或NHEJ。HDR涉及高度精確地摻入與DNA損傷位點互補之校正DNA序列。HDR具有關鍵優勢，因為其可高保真地修復DNA，且避免在校正位點引入非所要突變。NHEJ為一種選擇性較低、更加易誤的過程，該過程快速連接斷裂DNA之末端，導致斷裂位點處之插入或缺失頻率較高。 1. 基於核酸酶之基因編輯
基於核酸酶之基因編輯使用核酸酶，其為在切割DNA之細菌中經工程改造或最初鑑定之酶。基於核酸酶之基因編輯為兩步過程。首先，能夠切割雙股DNA中之一條或兩條股之外源核酸酶藉由合成的指導RNA引導至所需位點且進行特異性切割。在核酸酶進行所需的一或多個切割後，細胞的DNA修復機制被激活且透過NHEJ或不太常用的HDR來完成編輯過程。
NHEJ可在不存在DNA模板之情況下發生，以便細胞在修復DNA切口時進行拷貝。此為細胞用來修復雙股斷裂之主要或默認途徑。NHEJ機制可用於引入較小插入或缺失，稱為插入或缺失(indel)，從而導致基因功能之敲除。NHEJ由於其修復模式而在DNA中產生插入及缺失，且亦可導致引入脫靶、非所要的突變，包括染色體畸變。
發生核酸酶介導之HDR與核酸酶、指導RNA及與已切割之DNA相似的DNA模板之共同遞送。因此，細胞可使用該模板以構築修復性DNA，從而用校正基因序列替換有缺陷的基因序列。吾人咸信HDR機制為使用基於核酸酶之方法插入校正序列時的較佳修復途徑，因為其具有高保真度。然而，用核酸酶切割後對基因體之大部分修復繼續使用NHEJ機制。更頻繁的NHEJ修復途徑有可能在切割位點引起非所要突變，從而限制了任何基於核酸酶之基因編輯方法此時可靶向的疾病範圍。
傳統基因編輯使用了三種基於核酸酶的方法中之一者：轉錄激活因子樣效應核酸酶，或TALEN；規律間隔重複短迴文序列簇相關蛋白-9，或CRISPR/Cas9；及鋅指核酸酶或ZFN。儘管此等方法已為研究及產品開發之重大進步做出貢獻，但其具有固有局限性。 2. 基於核酸酶之基因編輯之限制
基於核酸酶之基因編輯方法受到其使用細菌核酸酶切割DNA以及依賴外源啟動子進行轉殖基因表現的限制。此等限制包括：
核酸酶導致靶上及脫靶突變。基於易誤NHEJ過程及潛在的脫靶核酸酶活性，習知基因編輯技術可導致基因毒性，包括染色體改變。
將基因編輯組分遞送至細胞係複雜的。基因編輯需要將多種組分同時遞送至同一細胞中。此在技術上具有挑戰性，且目前需要使用多個載體。
細菌來源之核酸酶具有免疫原性。由於習知基因編輯方法中所用之核酸酶大多來源於細菌，因此該等核酸酶具有更高的免疫原性潛力，此進而又限制了其實用性。
由於此等限制，基因編輯主要局限於細胞諸如造血細胞之 離體應用。 GENERIDE™ 技術平台
GENERIDE TM為一種新穎的基於AAV之無核酸酶基因體編輯技術，其可經由同源重組將治療性轉殖基因精確插入基因體中。無論細胞增殖及組織生長如何，GENERIDE TM均提供持久的轉殖基因表現，而GENERIDE TM校正的肝細胞在由於遺傳缺陷(例如由於FAH缺陷引起的HT1)而存在固有肝損傷之情況下展示出選擇性擴增。不希望受任何特定理論束縛，預期GENERIDE™為一種利用同源重組或HR (即保持基因體保真度之天然存在的DNA修復過程)之基因體編輯技術。在一些實施例中，藉由使用HR，GENERIDE™允許將轉殖基因插入特定的靶向基因體位置而不使用外源核酸酶，該等外源核酸酶為經工程改造以切割DNA的酶。GENERIDE™定向轉殖基因整合經設計以利用此等靶向位置處之內源啟動子來驅動高水準的組織特異性基因表現，而不存在與使用外源啟動子相關之有害問題。
GENERIDE™技術經設計以將校正基因精確整合至患者基因體中，以提供穩定的治療效果。由於GENERIDE™經設計以具有此持久的治療效果，因此其可用於針對兒科患者之罕見肝臟病症，在此等病症中，在患者生命早期提供治療至關重要，以免可能發生不可逆的疾病病理。在本文所描述之一些實施例中，包含GENERIDE™構築體之組合物可用於治療1型遺傳性酪胺酸血症或HT1，即在出生時即出現的威脅生命的疾病。
GENERIDE™平台技術具有克服傳統基因療法及習知基因編輯方法之一些關鍵限制的潛能，從而能夠很好地治療遺傳疾病，特別在兒科患者中。在一些實施例中，GENERIDE™使用AAV載體將基因遞送至細胞核中。隨後它使用HR將校正基因在由內源啟動子調控之位置處穩定整合至接受者之基因體中，從而產生終生蛋白質產生的潛力，即使身體隨時間推移而生長及變化，此對於習知AAV基因療法而言係不可行的。
與依賴於外源啟動子及核酸酶的基因療法及基因編輯技術相比，GENERIDE™提供若干個關鍵優勢。藉由利用HR之天然存在的過程，GENERIDE™不會面臨與依賴於工程細菌核酸酶之基因編輯方法相關的相同挑戰。此等酶之使用與宿主細胞DNA中非所要的且潛在危險修飾的風險顯著增加有關，此可能導致腫瘤形成的風險增加。此外，與習知基因療法相比，GENERIDE™旨在將校正基因精確、位點特異性、穩定且持久地整合至宿主細胞之染色體中。在使用GENERIDE™構築體之臨床前動物研究中，觀測到校正基因在基因體中之特定位置中的整合。因此，在一些實施例中，本揭露之方法及組合物(例如包含GENERIDE™構築體之彼等)提供了比不整合至基因體中且隨著細胞分裂而失去其作用之基因療法技術更持久的方法。此等益處使GENERIDE™能夠很好地用以治療遺傳疾病，特別在兒科患者中。
本文所揭示之模組化方法可用於允許GENERIDE™遞送穩健的組織特異性基因表現，該表現將在遞送至相同組織之不同治療劑之間可再現。在一些實施例中，此方法允許在不同的GENERIDE™產品候選者之間利用共同的製造過程及分析，且可縮短治療程序之開發過程。
關於非破壞性基因靶向之先前工作描述於WO 2013/158309中且以引用之方式併入本文。關於在沒有核酸酶之情況下進行基因體編輯之先前工作描述於WO 2015/143177中且以引用之方式併入本文。 B. 使用 GENERIDE™ 之基因體編輯：機制及屬性
在一些實施例中，使用GENERIDE™平台之基因體編輯不同於基因編輯，因為其使用HR以將校正基因遞送至基因體中之一個特定位置。在一些實施例中，GENERIDE™以精確方式插入校正基因，導致基因體中之位點特異性整合。在一些實施例中，GENERIDE™不需要使用外源核酸酶或啟動子；相反，其利用細胞現有的機制來整合及啟動治療性轉殖基因之轉錄。
在一些實施例中，GENERIDE™包含至少三種組分，其各自均有助於GENERIDE™方法之潛在益處。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含：同源臂、轉殖基因及促進產生兩種獨立的基因產物之核酸。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含編碼轉殖基因之第一核酸序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含促進產生兩種獨立的基因產物(例如2A肽)之第二核酸。在一些實施例中，本揭露提供了包含如本文所描述之第一核酸序列及第二核酸序列的表現匣。
在一些實施例中，第二核酸序列包含：編碼2A肽之核酸序列；編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列；編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；及/或編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含多核苷酸匣，該多核苷酸匣包含有包含該第一核酸及該第二核酸之表現匣。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含第三核酸序列，該第三核酸序列包含與基因體序列實質上同源的序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含第四核酸序列，該第四核酸序列包含與基因體序列實質上同源的序列。在一些實施例中，該第三核酸序列位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列。在一些實施例中，該第四核酸序列位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。 同源臂由數百個核苷酸構成。
在一些實施例中，本揭露之方法及組合物包含側翼序列，稱為同源臂。在一些實施例中，同源臂引導位點特異性整合(在本文中亦稱為促進整合)且限制構築體之脫靶插入。在一些實施例中，該第三及第四核酸序列包含同源臂。在一些實施例中，各同源臂係數百個核苷酸長，此與在CRISPR/Cas9中所用之指導序列相反，後者僅係幾十個鹼基對長。在一些實施例中，此增加的長度可促進改進的精度及位點特異性整合。在一些實施例中，GENERIDE™的同源臂引導轉殖基因整合於緊接高表現基因之後。在一些實施例中，緊接在高表現基因之後的轉殖基因之整合導致高水準表現，而無需引入外源啟動子。
在一些實施例中，第三或第四核酸之長度在200-3000、200-350、250-400、300-450、350-500、500-750、600-850、700-950、800-1050、900-1150、1000-1250、1100-1350、1200-1450、1300-1550、1400-1650、1500-1750、1600-1850、1700-1950、1800-2050、1900-2150、2000-2250、2100-2350、2200-2450、2300-2550、2400-2650、2500-2750、2600-2850、2700-2950或2800-3000個核苷酸之間。在一些實施例中，第三或第四核酸之長度為約300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200或1700個核苷酸。在一些實施例中，第四核酸之長度為1000個核苷酸。在一些實施例中，第三核酸之長度為1600個核苷酸。
在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少70%的同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少80%的同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少90%的同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少95%的同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少99%的同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座100%的同源性。
在一些實施例中，同源臂具有相同的長度(亦稱為平衡同源臂或均勻同源臂)。在一些實施例中，同源臂具有不同的長度(亦稱為不平衡同源臂或不均勻同源臂)。在一些實施例中，與參考序列或平衡同源臂相比，包含不同長度之不平衡同源臂的組合物提供改進的效果(例如增加的靶位點整合率)。在一些實施例中，與參考序列(例如包含相同長度之同源臂的組合物)相比，包含不同長度之同源臂(其中各同源臂具有至少一定的長度)的組合物提供改進的效果(例如增加的靶位點整合率)。
在一些實施例中，各同源臂之長度大於50 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度大於100 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度大於400 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少750 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1100 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1200 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1300 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1500 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1600 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1700 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1800 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少1900 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一同源臂之長度為至少2000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1100 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1200 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1300 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1500 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1600 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1700 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1800 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少1900 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一同源臂之長度為至少2000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1300 nt，且另一同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1600 nt，且另一同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1250 nt，且另一同源臂之長度為至少1250 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少400 nt，且另一同源臂之長度為至少800 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少600 nt，且另一同源臂之長度為至少600 nt。
在一些實施例中，5'同源臂比3'同源臂長。在一些實施例中，3'同源臂比5'同源臂長。舉例而言，在一些實施例中，5'同源臂之長度為大約1600 nt，且3'同源臂之長度為大約1000 nt。在一些實施例中，5'同源臂之長度為大約1000 nt，且3'同源臂之長度為大約1600 nt。在一些實施例中，與合適的參考序列( 例如缺乏同源臂之病毒載體)相比，包含同源臂之病毒載體提供改進的效果( 例如增加的靶位點整合率)。在一些實施例中，包含同源臂之病毒載體提供0.01%或更多( 例如0.05%或更多、0.1%或更多、0.2%或更多、0.3%或更多、0.4%或更多、0.5%或更多、0.6%或更多、0.7%或更多、0.8%或更多、0.9%或更多、1%或更多、1.5%或更多、2%或更多、5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多)的靶位點整合率。在一些實施例中，包含同源臂之病毒載體提供隨時間推移而增加的靶位點整合率。在一些實施例中，相對於靶位點整合之初始量測值，靶位點整合率隨時間推移而增加。在一些實施例中，隨時間推移的靶位點整合率為靶位點整合之初始量測值之至少1.5倍( 例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍)。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多天後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多週後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多個月後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多年後量測。
在一些實施例中，相對於參考序列( 例如具有相同長度之同源臂的病毒載體、具有至少一個低於500 nt之同源臂的病毒載體)，包含不同長度之同源臂的病毒載體提供了改進的效果( 例如增加的靶位點整合率)。在一些實施例中，相對於參考組合物( 例如具有相同長度之同源臂的病毒載體、具有至少一個低於500 nt之同源臂的病毒載體)，包含不同長度之同源臂的病毒載體提供至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.5倍、至少3.0倍、至少3.5倍或至少4.0倍改進的編輯活性。
在一些實施例中，包含不同長度之同源臂的病毒載體提供0.01%或更多( 例如0.05%或更多、0.1%或更多、0.2%或更多、0.3%或更多、0.4%或更多、0.5%或更多、0.6%或更多、0.7%或更多、0.8%或更多、0.9%或更多、1%或更多、1.5%或更多、2%或更多、5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多)的靶位點整合率。在一些實施例中，包含不同長度之同源臂的病毒載體提供隨時間推移而增加的靶位點整合率。在一些實施例中，相對於靶位點整合之初始量測值，靶位點整合率隨時間推移而增加。在一些實施例中，隨時間推移的靶位點整合率為靶位點整合之初始量測值之至少1.5倍( 例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍)。
在一些實施例中，包含不同長度之同源臂的病毒載體可在物種或物種之模型系統( 例如小鼠、人類或其模型)中提供改進的基因編輯。在一些實施例中，當針對在特定物種或特定物種之模型系統( 例如小鼠、人類或其模型)中之表現進行最佳化時，病毒載體可包含同源臂長度之不同組合。在一些實施例中，與第二物種或第二物種之模型系統( 例如小鼠、純小鼠模型)相比，包含同源臂長度之特定組合的病毒載體可在一種物種或一種物種之模型系統( 例如人類、人源化小鼠模型)中提供改進的基因編輯。在一些實施例中，與第二物種或第二物種之模型系統( 例如小鼠、純小鼠模型)相比，包含同源臂長度之特定組合的病毒載體可在一種物種或一種物種之模型( 例如人類、人源化小鼠模型)中針對高水準基因編輯進行最佳化。
在一些實施例中，同源臂引導轉殖基因整合於緊接高表現內源基因之後。在一些實施例中，同源臂引導轉殖基因之整合而不破壞內源基因表現(非破壞性整合)。
在一些實施例中，一或多種同源臂序列可與相應的野生型參考核苷酸序列( 例如野生型基因體序列)具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性。在一些實施例中，一或多種同源臂序列可為或包含與相應的野生型參考核苷酸序列( 例如野生型基因體序列)之一部分具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性的序列。
在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含經設計以靶向白蛋白基因座之5'同源臂及3'同源臂。在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之5'同源臂序列及與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之3'同源臂序列。在一些實施例中，病毒載體包含有包含SEQ ID NO: 1之5'同源臂及包含SEQ ID NO: 2之3'同源臂。在一些實施例中，病毒載體包含由SEQ ID NO: 1組成之5'同源臂及由SEQ ID NO: 2組成之3'同源臂。
在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含經設計以靶向白蛋白基因座之5'同源臂及3'同源臂。在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含與SEQ ID NO: 3具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之5'同源臂序列及與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之3'同源臂序列。在一些實施例中，病毒載體包含有包含SEQ ID NO: 3之5'同源臂及包含SEQ ID NO: 2之3'同源臂。在一些實施例中，病毒載體包含由SEQ ID NO: 3組成之5'同源臂及由SEQ ID NO: 2組成之3'同源臂。
在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含經設計以靶向白蛋白基因座之5'同源臂及3'同源臂。在一些實施例中，本文所提供之病毒載體可包含與SEQ ID NO: 4具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之5'同源臂序列及與SEQ ID NO: 5具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之3'同源臂序列。在一些實施例中，病毒載體包含有包含SEQ ID NO: 4之5'同源臂及包含SEQ ID NO: 5之3'同源臂。在一些實施例中，病毒載體包含由SEQ ID NO: 4組成之5'同源臂及由SEQ ID NO: 5組成之3'同源臂。
下文提供了示範性同源臂序列： 人類白蛋白 1.6 kb 5' 同源臂 (SEQ ID NO: 1) 人類白蛋白 1 kb 3' 同源臂 (SEQ ID NO: 2) 人類白蛋白 1 kb 5' 同源臂 (SEQ ID NO: 3) 小鼠白蛋白 1 kb 5' 同源臂 (SEQ ID NO: 4) 小鼠白蛋白 1.6 kb 3' 同源臂 (SEQ ID NO: 5) 靶位點整合之量測
如本申請案中所描述，傳統使用核酸酶將核酸材料引入細胞中之問題之一為(例如轉殖基因的)脫靶整合之機會顯著。因此，重要的是透過一或多種特異性靶向檢定來驗證正確的整合，如下文所描述的。
根據各種實施例，可在多個時間點中之任一者量測整合率。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多天後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多週後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多個月後量測。在一些實施例中，靶位點整合率在一或多年後量測。在一些實施例中，透過評估一或多種生物標誌物( 例如包含2A肽之生物標誌物)來量測靶位點整合率。在一些實施例中，透過評估一或多種分離的核酸( 例如mRNA、gDNA)來量測靶位點整合率。在一些實施例中，透過評估基因表現( 例如透過免疫組織化學染色)來量測靶位點整合率。 表1：用於評估靶位點整合之示範性方法
檢定類型 分析之樣品 示範性方法 示範性方案
基因體DNA整合率 (gDNA Int%) 肝臟(冷凍) qPCR 將肝臟生檢進行基因體DNA提取。運行qPCR方法以偵測含有在靶插入之對偶基因(例如白蛋白)之百分比。
融合mRNA 肝臟(冷凍) ddPCR 將肝臟生檢進行RNA提取。運行ddPCR方法以定量融合mRNA (自經編輯對偶基因轉錄之獨特嵌合mRNA)之拷貝數。該檢定量測靶插入後之轉錄活性。
ALB-2A 血漿 ELISA 收集且處理血液以獲得血漿。專有ELISA用於量測2A標記之白蛋白(用於靶向整合之通用循環生物標誌物)。該檢定量測靶插入後之總蛋白質表現。
肝細胞編輯% 固定肝臟切片 IHC 固定肝臟經切片且針對轉殖基因進行染色。計數轉殖基因陽性細胞且用於計算肝細胞編輯之百分比。對於向白蛋白基因座中之靶整合位點中之靶向整合，轉殖基因表現應為肝細胞特異性的。該檢定側重於每個細胞的靶整合，且與gDNA Int%正交，該gDNA Int%側重於每個對偶基因的靶整合。
GFP表現 固定細胞(例如HepG2)及/或固定組織(例如肝臟)切片 ICC/IHC 將固定細胞用核染料複染。GFP+細胞直接成像或使用抗HA標籤抗體染色。該檢定量測表現GFP轉殖基因之細胞之百分比，且為病毒載體編輯效率之指標。
FAH表現 固定細胞(例如HepG2)及/或固定組織(例如肝臟)切片 ICC/IHC 將固定細胞用核染料複染。使用抗FAH抗體染色細胞。該檢定量測表現FAH之細胞之百分比，且為病毒載體編輯效率之指標。
轉殖基因
在一些實施例中，本揭露之方法及組合物提供一或多種轉殖基因(例如FAH)。在一些實施例中，轉殖基因經選擇以整合至基因體中。在一些實施例中，轉殖基因為在個體細胞中存在之疾病相關基因的功能性版本。在一些實施例中，可最佳化轉殖基因與同源臂之組合大小以增加此等轉殖基因具有適合的序列長度以在遞送載體中有效包裝之可能性，此可增加轉殖基因最終在患者體內適當遞送之可能性。
在一些實施例中，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對某種細胞類型( 例如哺乳動物、昆蟲、細菌、真菌等)，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對人類細胞，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對特定組織類型( 例如肝臟、肌肉、CNS、肺)之人類細胞，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列可經密碼子最佳化以具有與參考核苷酸序列( 例如野生型基因序列)小於100%的核苷酸同源性。在某些實施例中，編碼轉殖基因之密碼子最佳化的核苷酸序列與參考核苷酸序列之間的核苷酸同源性小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在一些實施例中，個體體內之轉殖基因表現實質上來自於靶整合位點之整合。在一些實施例中，個體體內之總轉殖基因表現的75%或更多(例如80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、99%或更多、99.5%或更多)係來自靶整合位點處之轉殖基因整合。在一些實施例中，個體體內之總轉殖基因表現的25%或更少(例如20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少、1%或更少、0.5%或更少、0.1%或更少)來自除靶整合位點處之轉殖基因整合以外的來源(例如游離基因體表現、非靶整合位點處之整合)。
在一些實施例中，轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)。在一些實施例中，個體體內之總轉殖基因表現的75%或更多(例如80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、99%或更多、99.5%或更多)係來自瞬時表現。在一些實施例中，個體體內之總轉殖基因表現的25%或更少(例如20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少、1%或更少、0.5%或更少、0.1%或更少)來自除瞬時表現以外的來源(例如非靶整合位點處之整合)。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達一或更多週。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達一或更多個月。
在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)一或更多週，其水準與在治療後的一或更多天內觀測到的水準相當。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)一或更多個月，其水準與在治療後的一或更多天內觀測到的水準相當。
在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)一或更多週，其水準相對於在治療後一或更多天內觀測到的水準降低。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)一或更多個月，其水準相對於在治療後一或更多天內觀測到的水準降低。
在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於一個月。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於兩個月。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於三個月。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於四個月。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於五個月。在一些實施例中，治療後轉殖基因在個體體內瞬時表現(例如來自質體、小環DNA、病毒等之游離基因體表現)達不多於六個月。
在一些實施例中，可最佳化轉殖基因與同源臂之組合大小以增加此等轉殖基因具有適合的序列長度以在遞送載體中有效包裝之可能性，此可增加轉殖基因最終在患者體內適當遞送之可能性。
在一些實施例中，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對某種細胞類型(例如哺乳動物、昆蟲、細菌、真菌等)，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對人類細胞，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。在一些實施例中，針對特定組織類型(例如肝臟、肌肉、CNS、肺)之人類細胞，對編碼轉殖基因之核苷酸序列進行密碼子最佳化。
在一些實施例中，轉殖基因可為或包含與相應的野生型參考核苷酸序列( 例如野生型基因序列)具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，轉殖基因可為或包含與相應的野生型參考核苷酸序列( 例如野生型基因序列)之一部分具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性的序列。 促進產生兩種獨立的基因產物的核酸
用於多順反子表現之 2A 肽。在一些實施例中，本揭露之方法及組合物包含編碼2A肽之核酸。不希望受任何特定理論束縛，編碼2A肽之核酸序列可發揮許多重要作用。在一些實施例中，2A肽促進多順反子表現，即自同一mRNA產生兩種不同的蛋白質。此反過來又允許藉由將轉殖基因之轉錄與感興趣之組織中高度表現之靶基因偶合，在強內源啟動子之驅動下，以非破壞性方式整合轉殖基因。在一些實施例中，針對肝臟之治療程序，白蛋白基因座可用作整合位點。在一些實施例中，透過稱為核糖體跳過之過程，2A肽促進在各經修飾細胞中以與內源靶基因(例如白蛋白)相同的水準產生治療蛋白。在一些實施例中，個體之內源靶基因(例如白蛋白)正常產生，除了添加用作指示轉殖基因之成功整合及表現的循環生物標誌物的C-末端標籤。在一些實施例中，對內源靶基因(例如白蛋白)之修飾對其功能之影響最小。2A肽已摻入其他潛在的治療劑中，諸如T細胞受體嵌合抗原受體或CAR-T (Qasim等人 Sci Transl Med2017)。
下文提供了編碼一或多種2A肽之示範性序列： P2A 核苷酸序列 (SEQ ID NO: 6) P2A 肽序列 (SEQ ID NO: 7)
在一些實施例中，靶向特定基因座允許利用驅動高水準產生的強內源啟動子來最大化轉殖基因之表現。在一些實施例中，將轉殖基因之表現與高度表現的內源蛋白(例如白蛋白)相聯繫可允許轉殖基因以治療水準表現，而無需添加外源啟動子或將轉殖基因整合至大多數靶細胞中。
此得到了MMA、B型血友病及Crigler-Najjar二氏症候群之動物模型的支持。在此等模型中，將轉殖基因整合至大約1%的細胞中得到治療益處。在一些實施例中，白蛋白啟動子之強度克服了適度的整合水準，從而產生潛在的治療水準的轉殖基因表現。
不希望受任何特定理論束縛，GENERIDE™方法的潛在優勢包括以下： 將轉殖基因靶向整合至基因體中。
習知基因療法方法將治療性轉殖基因遞送至靶細胞。大多數此等方法之一個主要缺點為，一旦基因進入細胞內部，它們便不會整合至宿主細胞之染色體中，且不會自導致細胞分裂期間的DNA複製及分離的自然過程中受益。當在患者生命早期引入習知基因療法時，此尤其成問題，因為在兒童正常發育期間組織的快速生長將導致與轉殖基因相關的治療益處的削弱且最終喪失。在單獨的DNA股上之基因體外部表現的非整合基因稱為游離基因體。此游離基因體表現在經轉導之初始細胞中可能有效，該等初始細胞中之一些可能持續很長時間或持續患者一生。然而，游離基因體表現通常在諸如肝臟之靶組織中為瞬時的，其中細胞之周轉率較高，且在兒科患者之生命過程中趨於顯著增長。藉由GENERIDE™技術，轉殖基因被整合至基因體中，隨著細胞分裂及患者組織生長，此有可能提供穩定且持久的轉殖基因表現，且可能產生持久的治療益處。 在沒有外源啟動子之情況下之轉殖基因表現。
在一些實施例中，藉由GENERIDE™技術，轉殖基因在由有效內源啟動子調控之位置處表現。在一些實施例中，同源臂可用於將轉殖基因插入基因體中之精確位點處，該轉殖基因在有效內源啟動子(例如白蛋白啟動子)之控制下表現。不使用外源啟動子驅動轉殖基因之表現，該技術避免了與癌症之風險增加相關的啟動子脫靶整合的可能性。在一些實施例中，強內源啟動子之選擇將允許自具有典型的高度準確及可靠的HR過程的適度整合率的轉殖基因達成治療水準之蛋白質表現。 無核酸酶基因體編輯。
藉由利用HR之天然存在的過程，GENERIDE™經設計以避免與習知基因編輯技術中所用之外源核酸酶相關的非所需副作用。此等經工程改造之酶之使用與遺傳毒性相關，包括染色體改變，此係由於雙股DNA切口之易誤DNA修復造成的。避免使用核酸酶亦減少了需要遞送至細胞之外源組分之數量。 有效負載
在一些實施例中，本文所描述之一或多種載體或構築體可包含編碼一或多種有效負載之多核苷酸序列。根據各種態樣，可單獨或組合使用多種有效負載中之任一種( 例如具有診斷及/或治療目的之彼等有效負載)。在一些實施例中，有效負載可為或包含編碼肽或多肽之多核苷酸序列。在一些實施例中，有效負載為具有促進治療醫學疾患之生物過程的細胞內在或細胞外在活性之肽。在一些實施例中，有效負載可為或包含轉殖基因(在本文中亦稱為感興趣之基因(GOI))。在一些實施例中，有效負載可為或包含一或多個反向末端重複(ITR)序列( 例如一或多個AAV ITR)。在一些實施例中，有效負載可為或包含一或多種具有側翼ITR序列之轉殖基因。在一些實施例中，有效負載可為或包含一或多種編碼報告基因( 例如螢光或發光報告基因)之異源核酸序列。在一些實施例中，有效負載可為或包含一或多種生物標誌物( 例如有效負載表現之代理因子)。在一些實施例中，有效負載可包含用於多順反子表現之序列(包括 例如2A肽或內含子序列、內部核糖體進入位點)。在一些實施例中，2A肽為較小的( 例如大約18-22個胺基酸)肽序列，其能夠在單個編碼序列內共同表現二或更多種離散蛋白質產物。在一些實施例中，2A肽允許共同表現二或更多種離散蛋白質產物，不論蛋白質編碼序列之排列如何。在一些實施例中，2A肽為或包含共同模體( 例如DVEXNPGP)。在一些實施例中，2A肽促進蛋白質裂解。在一些實施例中，2A肽為或包含病毒序列( 例如口蹄疫病毒(F2A)、馬鼻炎A病毒、豬鐵士古病毒-1 (P2A)或明脈扁刺蛾(Thosea asigna)病毒(T2A))。
在一些實施例中，有效負載可為或包含多核苷酸序列，其包含表現匣。在一些實施例中，表現匣包含第一核酸序列及第二核酸序列，其中第一核酸序列編碼轉殖基因，且第二核酸序列位於第一核酸序列之5'或3'且促進產生兩種獨立的基因產物( 例如編碼2A肽之序列)。 監測方法
在一些實施例中，本揭露提供了及/或以其他方式評估基因療法之方法。在一些實施例中，本揭露提供了產物(例如多肽或核酸)及/或由本文所描述之組合物產生或編碼的生物標誌物之偵測。在一些實施例中，在取自已接受如本文所描述之整合基因療法治療之個體的生物樣品中評估產物或生物標誌物之存在。在一些實施例中，生物樣品為或包含毛髮、皮膚、糞便、血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、眼淚、玻璃狀液、肝臟生檢或黏液。
在一些實施例中，產物或生物標誌物在細胞內表現。在一些實施例中，產物或生物標誌物為細胞外分泌的。在一些實施例中，產物或生物標誌物包含2A肽。在一些實施例中，產物或生物標誌物包含白蛋白(例如經例如C-末端標籤修飾之白蛋白)。偵測各種產物或生物標誌物之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，藉由免疫學檢定或核酸擴增檢定來偵測產物或生物標誌物。在一些實施例中，偵測產物或生物標誌物之方法描述於WO/2020/214582中，其全部內容以引用之方式併入本文。在一些實施例中，偵測產物或生物標誌物係在個體接受基因療法治療或基因整合組合物後1、2、3、4、5、6、7、8週或更長時間進行。 遞送媒劑
此項技術中存在多種基因療法方法。因此，此項技術中有多種遞送機制。在一些實施例中，使用遞送媒劑提供轉殖基因。在一些實施例中，本揭露之組合物包含遞送媒劑。在一些實施例中，遞送媒劑為或包含非病毒顆粒。在一些實施例中，遞送媒劑為脂質顆粒(例如脂質奈米顆粒)。用於遞送核酸之各種脂質奈米顆粒為此項技術中已知的，例如WO2015184256、WO2013149140、WO2014089486A1、WO2009127060、WO2011071860、WO2020219941中所描述之彼等脂質奈米顆粒，該等文獻中之每一者之內容以引用之方式併入本文。
在一些實施例中，遞送媒劑為或包含胞泌體。熟習此項技術者將認識到胞泌體產生之各種方法及使用。此類方法及使用之實例描述於Luan等人, Acta Pharmacologica Sinica 第38卷, 第754–763頁 (2017)中。
在一些實施例中，遞送媒劑為或包含閉合環狀cDNA整合基因療法構築體。在一些實施例中，遞送媒劑為或包含重組病毒載體。在一些實施例中，重組病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，重組AAV載體包含衣殼AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59。在一些實施例中，重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少90%、95%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組病毒載體為或包含AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之變異體( 例如經密碼子最佳化之變異體)。
AAV衣殼 SEQ ID NO. 序列
AAV LK03 (核苷酸) 8
AAV-LK03 (蛋白質) 9
AAV8 (核苷酸) 10
AAV8 (蛋白質) 11
AAV-DJ (核苷酸) 12
AAV-DJ (蛋白質) 13
sL65 (核苷酸) 14
sL65 (蛋白質) 15
AAV-NP59 (核苷酸) 16
AAV-NP59 (蛋白質) 17
在一些實施例中，重組AAV載體包含至少一個ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含兩個ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含5' ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含3' ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含AAV2 ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含AAV2 ITR之一部分。在一些實施例中，重組AAV載體包含與AAV2 ITR具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性之ITR。在一些實施例中，重組AAV載體包含與SEQ ID No. 27-30中之一者具有90%、95%、99%、100%序列一致性之ITR。 145bp ITR： 130bp ITR： B環缺失ITR： C環缺失ITR： 治療方法
本文所揭示之組合物及構築體可用於任何 活體外或 活體內應用，其中需要自細胞中之特定靶基因座表現有效負載 ( 例如轉殖基因)，同時在靶基因座處及周圍維持內源基因之表現。舉例而言，本文所揭示之組合物及構築體可用於(例如透過基因療法)治療個體之病症、疾病或醫學疾患。
在一些實施例中，治療包含獲得或維持所需藥理學及/或生理學效應。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包含完全或部分預防疾病 ( 例如預防疾病之症狀)。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括完全或部分治癒疾病 ( 例如治癒與疾病相關之副作用)。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括預防疾病之復發。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括減緩疾病之進展。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括緩解疾病之症狀。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括預防疾病之消退。在一些實施例中，所需藥理學及/或生理學效應可包括穩定及/或減少與疾病相關之症狀。
在一些實施例中，治療包含在疾病發作之前、期間或之後 ( 例如在與疾病相關之症狀出現之前、期間或之後)投與組合物。在一些實施例中，治療包含組合療法 ( 例如與一或多種療法，包括不同類型之療法)。 靶向整合
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體引導有效負載( 例如轉殖基因及/或功能核酸)整合於靶基因座(在本文中亦稱為靶整合位點) ( 例如內源基因)。在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體引導有效負載整合於特定細胞類型中之靶基因座 ( 例如組織特異性基因座)。在一些實施例中，有效負載之整合發生於特定組織 ( 例如肝臟、中樞神經系統(CNS)、肌肉、腎臟、血管、肺)中。在一些實施例中，有效負載之整合發生於多個組織 ( 例如肝臟、中樞神經系統(CNS)、肌肉、腎臟、血管、肺)中。
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體引導有效負載整合於被視為安全港位點之靶基因座 ( 例如白蛋白、脂蛋白元A2 (ApoA2)、血紅素結合素)。在一些實施例中，靶基因座可選自適合與本文所提供之方法及組合物一起使用的任何基因體位點。在一些實施例中，靶基因座編碼多肽。在一些實施例中，靶基因座編碼在個體 ( 例如未患有疾病、病症或疾患之個體，或患有疾病、病症或疾患之個體)體內高度表現之多肽。在一些實施例中，有效負載之整合發生在一或多種內源基因 ( 例如編碼多肽之基因)之5'或3'端。在一些實施例中，有效負載之整合發生在一或多種內源基因 ( 例如編碼多肽之基因)之5'或3'端之間。
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體在具有極少或無脫靶整合 ( 例如非靶基因座處之整合)之情況下引導有效負載整合於靶基因座。在一些實施例中，與參考組合物或構築體相比 ( 例如相對於不具有側翼同源序列之組合物或構築體)，本文所提供之組合物及構築體在具有減少的脫靶整合之情況下引導有效負載整合於靶基因座。
在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因允許表現有效負載而不破壞內源基因表現。在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因允許自內源啟動子表現有效負載。在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因破壞內源基因表現。在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因破壞內源基因表現，而不會不利地影響靶細胞及/或個體 ( 例如藉由靶向安全港位點)。在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因不需要使用核酸酶 ( 例如Cas蛋白、核酸內切酶、TALEN、ZFN)。在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因係藉由使用核酸酶 ( 例如Cas蛋白、核酸內切酶、TALEN、ZFN)來輔助。
在一些實施例中，在靶基因座處整合轉殖基因賦予選擇性優勢 ( 例如相對於組織中之其他細胞，複數種細胞之存活率增加)。在一些實施例中，選擇性優勢可在一或多個表現轉殖基因之組織中產生增加的細胞之百分比。 組合物
在一些實施例中，可使用本文所提供之方法及構築體 ( 例如病毒載體)來產生組合物。在一些實施例中，組合物包括液體、固體及氣體組合物。在一些實施例中，組合物包含額外成分 ( 例如稀釋劑、穩定劑、賦形劑、佐劑)。在一些實施例中，額外成分可包含緩衝劑 ( 例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、有機酸緩衝劑)、抗氧化劑 ( 例如抗壞血酸)、低分子量多肽 ( 例如少於10個殘基)、各種蛋白質 ( 例如血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白)、親水聚合物 ( 例如聚乙烯吡咯啶酮)、胺基酸 ( 例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸、離胺酸)、碳水化合物 ( 例如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖、糊精)、螯合劑 ( 例如EDTA)、糖醇 ( 例如甘露醇、山梨醇)、成鹽相對離子 ( 例如鈉、鉀)及/或非離子界面活性劑 ( 例如Tween™、Pluronics™、聚乙二醇(PEG))等。在一些實施例中，水性載劑為水性pH緩衝溶液。
在一些實施例中，本文所提供之組合物可以一定劑量範圍提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以單一劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以多劑量提供。在一些實施例中，在一段時間內提供組合物。在一些實施例中，組合物以特定時間間隔 ( 例如變化的時間間隔、設定的時間間隔)提供。在一些實施例中，劑量可視劑型及投與途徑而變化。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以1E12 vg/kg與1E14 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以3E12 vg/kg與1E13 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以1E13 vg/kg與3E13 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以3E12 vg/kg與3E13 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以不多於3E13 vg/kg之劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以不多於1E13 vg/kg之劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可以不多於3E12 vg/kg之劑量提供。
在一些實施例中，本文所提供之組合物可在特定時間點 ( 例如個體之年齡)向個體投與。在一些實施例中，可向新生兒個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向新生個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，新生小鼠個體之年齡在0天與14天之間。在一些實施例中，新生小鼠個體之年齡在0天與1個月之間。在一些實施例中，可向年齡在7天與30天之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向年齡在3個月與1歲之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向年齡在1歲與5歲之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向年齡在4歲與7歲之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向年齡為5歲或更大之個體投與本文所提供之組合物。
在一些實施例中，可基於特定組織或器官之生長階段( 例如估算/平均成人體型或體重之百分比)在特定時間點向個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向個體投與本文所提供之組合物，其中組織或器官( 例如肝臟、肌肉、CNS、肺等)係估算/平均成人體型或體重之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。在一些實施例中，可向個體投與本文所提供之組合物，其中組織或器官係估算/平均成人體型或體重之大約20% (+/- 5%)。在一些實施例中，可向個體投與本文所提供之組合物，其中組織或器官係估算/平均成人體型或體重之大約50% (+/- 5%)。在一些實施例中，可向個體投與本文所提供之組合物，其中組織或器官係估算/平均成人體型或體重之大約60% (+/- 5%)。在一些實施例中，特定組織或器官之估算/平均成人體型或體重可如此項技術中所描述的來確定( 參見Noda 等人. Pediatric radiology, 1997；Johnson 等人Liver transplantation, 2005；以及Szpinda 等人Biomed research international, 2015，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文。 投與途徑
在一些實施例中，可經由此項技術中已知的多種途徑( 例如腸胃外、皮下、靜脈內、顱內、脊柱內、眼內、肌內、陰道內、腹膜內、皮上、皮內、直腸、經肺、骨內、經口、經頰、門靜脈內、動脈內、氣管內或經鼻)中之任一者(或多者)向個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可將本文所提供之組合物引入細胞，隨後將該等細胞引入個體( 例如肝臟、肌肉、中樞神經系統(CNS)、肺、血液細胞)。在一些實施例中，可經由此項技術中已知的遞送方法( 例如注射、導管)來引入本文所提供之組合物。
在一些實施例中，使用GENERIDE™平台之基因體編輯不同於習知基因療法，因為其使用同源重組以將校正基因遞送至基因體中之一個特定位置。在一些實施例中，GENERIDE™以精確方式插入校正基因，導致基因體中之位點特異性整合。在一些實施例中，GENERIDE™不需要使用外源核酸酶或啟動子。在一些實施例中，GENERIDE™可與一或多種外源核酸酶及/或啟動子組合。
在一些實施例中，提供的組合物包含一或多個同源臂、轉殖基因及促進產生兩種獨立的基因產物之核酸。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含編碼轉殖基因之第一核酸序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含促進產生兩種獨立的基因產物 ( 例如2A肽)之第二核酸。在一些實施例中，本揭露提供了包含如本文所描述之第一核酸序列及第二核酸序列的表現匣。
在一些實施例中，第二核酸序列包含：編碼2A肽之核酸序列；編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列；編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；及/或編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含多核苷酸匣，該多核苷酸匣包含有包含該第一核酸及該第二核酸之表現匣。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含第三核酸序列，該第三核酸序列包含與基因體序列實質上同源的序列。在一些實施例中，本揭露之組合物及方法包含第四核酸序列，該第四核酸序列包含與基因體序列實質上同源的序列。在一些實施例中，該第三核酸序列位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列。在一些實施例中，該第四核酸序列位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。
在一些實施例中，在沒有任何額外治療之情況下投與本文所描述之一或多種組合物。在一些實施例中，組合投與本文所描述之一或多種組合物。在一些實施例中，第一組合物可與第二組合物同時投與。在一些實施例中，第一組合物及第二組合物可依序投與( 例如彼此在幾分鐘、幾小時、幾天、幾週或幾個月內)。在一些實施例中，可經由相同途徑( 例如腸胃外、皮下、靜脈內、顱內、脊柱內、眼內、肌內、陰道內、腹膜內、皮上、皮內、直腸、經肺、骨內、經口、經頰、門靜脈內、動脈內、氣管內或經鼻)投與一或多種組合物。在一些實施例中，可經由不同途徑( 例如腸胃外、皮下、靜脈內、顱內、脊柱內、眼內、肌內、陰道內、腹膜內、皮上、皮內、直腸、經肺、骨內、經口、經頰、門靜脈內、動脈內、氣管內或經鼻)投與一或多種組合物。
在一些實施例中，第一及/或第二組合物以特定劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)僅投與一次。在一些實施例中，第一及/或第二組合物以特定劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)投與多於一次。在一些實施例中，在投與多於一個劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)之情況下，可同時、實質上同時或連續投與第一及/或第二組合物。在一些實施例中，在指定時間段內( 例如在幾分鐘、幾小時、幾天、幾週或幾個月內)投與多個劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)。
在一些實施例中，回應於生物標誌物(例如，如WO2020214582A1中所描述之循環生物標誌物)來投與第一及/或第二組合物。舉例而言，以特定劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)投與第一及/或第二組合物且在特定時間段內( 例如在幾分鐘、幾小時、幾天、幾週或幾個月內)監測生物標誌物(例如，如WO2020214582A1中所描述的)之水準。若生物標誌物(例如，如WO2020214582A1中所描述的)之水準(例如，與適當參考(例如投與之前生物標誌物之水準)相比)較低，則以特定劑量( 例如固定劑量或基於體重的劑量)投與第一及/或第二組合物。若生物標誌物(例如，如WO2020214582A1中所描述的)之水準(例如，與適當參考(例如初始投與之後生物標誌物之水準)相比)較高，則可重新評價第一及/或第二組合物之後續給藥( 例如固定劑量或基於體重的劑量) (例如治療暫停、減少固定劑量或基於體重的劑量)。 產生病毒載體之方法 病毒載體之產生
在一些實施例中，產生病毒載體 ( 例如AAV病毒載體)可包括上游產生病毒載體之步驟 (例如基於細胞之培養)及下游處理病毒載體之步驟 ( 例如純化、調配等)。在一些實施例中，上游步驟可包括細胞擴增、細胞培養、細胞轉染、細胞裂解、病毒載體產生及/或病毒載體收穫中之一或多者。
在一些實施例中，下游步驟可包括分離、過濾、濃縮、澄清、純化、層析 ( 例如親和、離子交換、疏水、混合模式)、離心 ( 例如超速離心)及/或調配中之一或多者。
在一些實施例中，相對於參考構築體或方法，例如Xiao等人. 1998及Grieger等人. 2015中所描述之彼等構築體或方法，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文，本文所描述之構築體及方法經設計以增加病毒載體產量 ( 例如AAV載體產量)、降低可複製型病毒載體 ( 例如可複製型AAV (rcAAV))之水準、提高病毒載體包裝效率 ( 例如AAV載體衣殼包裝)及/或其任何組合。 細胞株及轉染試劑
在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用細胞 ( 例如細胞培養物)。在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用包含一或多種細胞株 ( 例如哺乳動物細胞株)之細胞培養物。在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用HEK293細胞株或其變異體 ( 例如HEK293T、HEK293F細胞株)。在一些實施例中，細胞能夠在懸浮液中生長。在一些實施例中，細胞由黏附細胞構成。在一些實施例中，細胞能夠在不包含動物組分 ( 例如動物血清)之培養基中生長。在一些實施例中，細胞能夠在無血清培養基 ( 例如F17培養基、Expi293培養基)中生長。在一些實施例中，病毒載體之產生包括用表現構築體 ( 例如質體)轉染細胞。在一些實施例中，細胞經選擇以實現病毒載體 ( 例如AAV載體)之高表現。在一些實施例中，細胞經選擇以實現病毒載體之高包裝效率 ( 例如AAV載體之衣殼包裝)。在一些實施例中，細胞經選擇以提高轉染效率 ( 例如使用化學轉染試劑，包括陽離子分子)。在一些實施例中，細胞經工程改造以實現病毒載體 ( 例如AAV載體)之高表現。在一些實施例中，細胞經工程改造以實現病毒載體之高包裝效率 ( 例如AAV載體之衣殼包裝)。在一些實施例中，細胞經工程改造以提高轉染效率 ( 例如使用化學轉染試劑，包括陽離子分子)。在一些實施例中，可針對上述屬性中之二或更多者對細胞進行工程改造或選擇。在一些實施例中，細胞與一或多種表現構築體 ( 例如質體)接觸。在一些實施例中，細胞與一或多種轉染試劑 ( 例如化學轉染試劑，包括脂質、聚合物及陽離子分子)及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，細胞與一或多種陽離子分子 ( 例如陽離子脂質、PEI試劑)及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，細胞與PEIMAX試劑及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，細胞與FectoVir-AAV試劑及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，細胞與呈特定比率之一或多種轉染試劑及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，轉染試劑與表現構築體之比率提高了病毒載體之產生 ( 例如載體產量提高、包裝效率提高及/或轉染效率提高)。 表現構築體
在一些實施例中，表現構築體為或包含一或多種多核苷酸序列 ( 例如質體)。在一些實施例中，表現構築體包含特定多核苷酸序列元件 ( 例如有效負載、啟動子、病毒基因等)。在一些實施例中，表現構築體包含編碼病毒基因 ( 例如 rep或 cap基因或基因變異體、一或多種輔助病毒基因或基因變異體)之多核苷酸序列。在一些實施例中，特定類型之表現構築體包含多核苷酸序列元件之特定組合。在一些實施例中，特定類型之表現構築體不包含多核苷酸序列元件之特定組合。在一些實施例中，特定表現構築體不包含編碼 rep及 cap基因及/或基因變異體之多核苷酸序列元件。
在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因 ( 例如野生型 rep基因、 cap基因、病毒輔助基因或其組合)之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼病毒輔助基因或基因變異體 ( 例如疱疹病毒基因或基因變異體、腺病毒基因或基因變異體)之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼一或多個基因拷貝 ( 例如1個拷貝、2個拷貝、3個拷貝、4個拷貝、5個拷貝等)之多核苷酸序列，該一或多個基因拷貝表現一或多種野生型Rep蛋白。在一些實施例中，表現構築體包含編碼單個基因拷貝之多核苷酸序列，該單個基因拷貝表現一或多種野生型Rep蛋白 ( 例如Rep68、Rep40、Rep52、Rep78或其組合)。在一些實施例中，表現構築體包含編碼一或多種野生型Rep蛋白 ( 例如Rep68、Rep40、Rep52、Rep78或其組合)之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼至少四種野生型Rep蛋白 ( 例如Rep68、Rep40、Rep52、Rep78)之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼Rep68、Rep40、Rep52及Rep78中之每一者之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼一或多種野生型腺病毒輔助蛋白 ( 例如E2及E4)之多核苷酸序列。
在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因 ( 例如 rep基因、 cap基因、輔助基因)之野生型多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因 ( 例如 rep基因、 cap基因、輔助基因)之經修飾多核苷酸序列 ( 例如經密碼子最佳化)。在一些實施例中，表現構築體包含編碼經修飾病毒基因 ( 例如 rep基因、 cap基因、輔助基因)之經修飾多核苷酸序列。在一些實施例中，經修飾病毒基因經設計及/或工程改造以實現某些改進 ( 例如轉導提高、組織特異性、尺寸減小、免疫反應降低、包裝增加、rcAAV水準降低等)。
根據各種實施例，與先前技術相比，本文所揭示之表現構築體可提供增加的靈活性及模組化。在一些實施例中，本文所揭示之表現構築體可允許交換各種多核苷酸序列 ( 例如不同的 rep基因、 cap基因、有效負載、輔助基因、啟動子等)，同時提供某些改進 ( 例如病毒載體產量增加、包裝增加、rcAAV水準降低等)。在一些實施例中，本文所揭示之表現構築體與各種上游產生過程 ( 例如不同的細胞培養條件、不同的轉染試劑等)相容，同時提供某些改進 ( 例如病毒載體產量增加、包裝增加、rcAAV水準降低等)。
在一些實施例中，不同類型之表現構築體包含多核苷酸序列之不同組合。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含一或多種不存在於不同類型之表現構築體中的多核苷酸序列元件( 例如有效負載、啟動子、病毒基因等)。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼病毒基因( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)之多核苷酸序列元件及編碼有效負載( 例如轉殖基因及/或功能核酸)之多核苷酸序列元件。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼一或多種病毒基因( 例如 rep或 cap基因或基因變異體，及/或一或多種輔助病毒基因)之多核苷酸序列元件。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼一或多種病毒基因之多核苷酸序列元件，其中病毒基因來自一或多種病毒類型( 例如來自AAV及腺病毒之基因或基因變異體)。在一些實施例中，來自腺病毒之病毒基因為基因及/或基因變異體。在一些實施例中，來自腺病毒之病毒基因為E2A ( 例如E2A DNA結合蛋白(DBP)、E4 ( 例如E4開放閱讀框(ORF) 2、ORF3、ORF4、ORF6/7)、VA及/或其變異體中之一或多者。在一些實施例中，表現構築體用於產生病毒載體( 例如通過細胞培養)。在一些實施例中，表現構築體與一或多種轉染試劑( 例如化學轉染試劑)組合與細胞接觸。在一些實施例中，表現構築體與一或多種轉染試劑組合以特定比率與細胞接觸。在一些實施例中，不同類型之表現構築體與一或多種轉染試劑組合以特定比率( 例如重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，不同類型之表現構築體以約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率( 例如重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之第一表現構築體與第二表現構築體之比( 例如重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種有效負載之第一表現構築體及包含一或多種病毒輔助基因之第二表現構築體以約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之第一表現構築體與第二表現構築體之比( 例如重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，特定比率之表現構築體提高了AAV之產生( 例如病毒載體產量增加、包裝效率提高及/或轉染效率提高)。在一些實施例中，細胞與二或更多種表現構築體(例如依序或實質上同時)接觸。在一些實施例中，三或更多種表現構築體與細胞接觸。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個啟動子( 例如一或多個外源啟動子)。在一些實施例中，啟動子為或包含CMV、RSV、CAG、EF1α、PGK、A1AT、C5-12、MCK、肌絲間蛋白(desmin)、p5、p40或其組合。在一些實施例中，表現構築體包含特定多核苷酸序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個啟動子。在一些實施例中，表現構築體包含特定多核苷酸序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個啟動子。
在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以大於或等於1:1至3:1之比率與細胞接觸，其中病毒力價產量為透過投與參考系統( 例如包含各別質體之三-質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載)獲得之彼等產量的至少1.5倍。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以大於或等於1:1至5:1之比率與細胞接觸，其中病毒力價產量為透過投與參考系統( 例如包含各別質體之三-質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載)獲得之彼等產量的至少1.5倍。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以大於或等於1:1至6:1之比與細胞接觸，其中病毒力價產量為經由投與參考系統( 例如包含各別質體之三質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載)獲得之彼等產量的至少1.5倍。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以大於或等於1:1至8:1之比與細胞接觸，其中病毒力價產量為經由投與參考系統( 例如包含各別質體之三質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載)獲得之彼等產量的至少1.5倍。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以大於或等於1:1至10:1之比與細胞接觸，其中病毒力價產量為經由投與參考系統( 例如包含各別質體之三質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載)獲得之彼等產量的至少1.5倍。
在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以10:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以9:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以8:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以7:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以6:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以5:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以4:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以3:1與1:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以2:1與1:1之間的比率與細胞接觸。
在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與2:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與3:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與4:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與5:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與6:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與7:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與8:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與9:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1:1與10:1之間的比率與細胞接觸。在一些實施例中，將包含一或多種病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多種有效負載之第二表現構築體以1.5:1之比率與細胞接觸。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多種編碼細胞培養物( 例如細菌細胞培養物、哺乳動物細胞培養物)所必需之元件( 例如選擇標誌物、複製起點)的多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含一或多種編碼抗生素抗性基因( 例如康黴素(kanamycin)抗性基因、胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因)之多核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含一或多種編碼細菌複製起點( 例如colE1複製起點)之多核苷酸序列。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多個轉錄終止序列( 例如polyA序列)。在一些實施例中，表現構築體包含BGH polyA、FIX polyA、SV40 polyA、合成polyA或其組合中之一或多者。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個轉錄終止序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個轉錄終止序列。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個不同來源( 例如已知基因)之內含子，包括但不限於FIX內含子、白蛋白內含子或其組合。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個不同長度( 例如133 bp至4 kb)的內含子。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)內之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件( 例如 rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體在啟動子( 例如p5啟動子)之後包含一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體在 rep基因或基因變異體之前包含一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體在啟動子與 rep基因或基因變異體之間包含一或多個內含子序列。在一些實施例中，本文所提供之組合物包含表現構築體。在一些實施例中，組合物包含：(i)第一表現構築體，其包含編碼一或多種 rep基因之多核苷酸序列及編碼一或多種野生型腺病毒輔助蛋白之多核苷酸序列；及(ii)第二表現構築體，其包含編碼一或多種 cap基因及一或多種有效負載之多核苷酸序列。
在一些實施例中，表現構築體將包含用於產生病毒載體之三質體( 例如三重轉染)系統。在一些實施例中，三質體系統將包含：1)第一質體，其包含一或多個編碼 rep及 cap基因或其變異體之序列；2)編碼一或多種有效負載之第二序列；3)編碼一或多種輔助蛋白之第三序列。在一些實施例中，三質體系統可用於產生一或多種本文所揭示之病毒載體。 表徵 AAV 病毒載體之方法
根據各種實施例，病毒載體可透過評估各種特徵及/或特點來表徵。在一些實施例中，病毒載體之評估可在產生過程中之不同點進行。在一些實施例中，病毒載體之評估可在上游產生步驟完成後進行。在一些實施例中，病毒載體之評估可在下游產生步驟完成後進行。 病毒產量
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估病毒產量( 例如病毒力價)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之前評估病毒產量。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之後評估病毒產量。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估病毒產量是否大於或等於1e10 vg/mL。
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞裂解物中之病毒產量是否大於或等於1e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞裂解物中之病毒產量是否大於或等於5e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞裂解物中之病毒產量是否大於或等於1e12 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗裂解物中之病毒產量是否在5e9vg/mL與5e11 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗裂解物中之病毒產量是否在5e9vg/mL與1e10 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗裂解物中之病毒產量是否在1e10 vg/mL與1e11 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗裂解物中之病毒產量是否在1e11 vg/mL與1e12 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗裂解物中之病毒產量是否在1e12 vg/mL與1e13 vg/mL之間。
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否大於或等於1e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否大於或等於1e12 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否在1e10 vg/mL與1e15 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否在1e11 vg/mL與1e15 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否在1e12vg/mL與1e14 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估純化藥物中之病毒產量是否在1e13 vg/mL與1e14 vg/mL之間。
在一些實施例中，與此項技術中已知的先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供相當的或增加的病毒載體產量。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，所提供的包含使用雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的病毒載體產量。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合的雙質體系統相比，所提供的包含使用具有序列元件之特定組合的雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的病毒載體產量。在一些實施例中，與具有不同質體比之雙質體系統相比，所提供的包含使用具有特定質體比之雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的病毒載體產量。在一些實施例中，與特定培養條件下之參考( 例如具有不同質體比之雙質體系統、三質體系統)相比，所提供的包含使用具有特定質體比之雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的病毒載體產量。在一些實施例中，與大規模培養條件( 例如大於100 mL、大於250 mL、大於1 L、大於10 L、大於20 L、大於30 L、大於40 L、大於50 L等)下之參考( 例如具有不同質體比之雙質體系統、三質體系統)相比，所提供的包含使用具有特定質體比之雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的病毒載體產量。 病毒包裝
在一些實施例中，病毒載體之表徵包含評估病毒包裝效率( 例如完整衣殼相對於空衣殼之百分比)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或完整衣殼富集( 例如基於氯化銫之密度梯度、基於碘克沙醇之密度梯度或離子交換層析)之前評估病毒包裝效率。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或過濾之前評估病毒包裝效率是否大於或等於20% ( 例如20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或完整衣殼富集之後評估病毒包裝效率。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或過濾之後評估病毒包裝效率是否大於或等於50% ( 例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%)。
在一些實施例中，與此項技術中已知的先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供相當的或增加的包裝效率。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，所提供的包含使用雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的包裝效率。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合的雙質體系統相比，所提供的包含使用具有序列元件之特定組合的雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的包裝效率。在一些實施例中，與具有不同質體比之雙質體系統相比，所提供的包含使用具有特定質體比之雙質體轉染系統的用於產生及/或製造病毒載體之方法提供相當的或增加的包裝效率。 可複製型 (replication competent) 載體水準
在一些實施例中，病毒載體之表徵包含評估可複製型載體之水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或過濾之前評估可複製型載體之水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含在純化及/或過濾之後評估可複製型載體之水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包含評估可複製型載體水準是否小於或等於1 rcAAV/1E10 vg。
在一些實施例中，與此項技術中已知的先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供相當的或降低的可複製型載體水準。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，所提供的包含使用雙質體轉染系統的用於產生病毒載體之方法提供相當的或降低的可複製型載體水準。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合的雙質體系統相比，所提供的包含使用具有序列元件之特定組合的雙質體轉染系統的用於產生病毒載體之方法提供相當的或降低的可複製型載體水準。在一些實施例中，與不具有該一或多個內含子序列之雙質體系統相比，所提供的包含使用具有一或多個插入rep基因中之內含子序列的雙質體轉染系統的用於產生病毒載體之方法提供相當的或降低的可複製型載體水準。 1 型遺傳性酪胺酸血症 (HT-1)
1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)為一種由延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之功能喪失型突變引起的極其罕見的新生兒發病的代謝失調。若不治療，則HT1患者展示出急性肝衰竭、腎損傷，且經常在兒童早期發展為肝細胞癌。HT1之照護標準由終身用藥尼替西農(NTBC)及飲食限制組成。儘管此治療在預防器官衰竭方面有效，但由於藥物不順應及飲食依從性，仍存在強烈的未滿足的醫療需求。
HT1係由延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)缺陷引起的，該FAH為酪胺酸分解代謝途徑中的最後一種酶(參見圖5)。因此，FAH缺乏導致毒性代謝物(例如延胡索醯乙醯乙酸(FAA)及琥珀醯丙酮(SUAC))之異常累積，從而導致HT1之徵象及症狀( 參見LindBlad 等人PNAS, 1977及Grompe Semin Liver Dis, 2001)。
HT1為一種出現在嬰兒早期(出生後2年內)的嚴重的體染色體隱性代謝失調。據估計，全球每100,000-120,000名新生兒中有1人受HT-1影響，但發病率在某些地區更為常見，諸如Norway或Quebec, Canada ( 參見Russo 等人 ,Pediatric and Developmental Pathology, 2001)。患有HT-1之患者經受肝機能不良(肝腫大、肝硬化及肝細胞癌)，且亦可具有累及腎及神經系統之相關合併症，並且展示出成長遲緩。若不進行治療，HT-1為致命的，因此肝衰竭為導致早期死亡之主要原因，且所有HT-1患者均處於發展為肝細胞癌(HCC)之高風險下( 參見Russo 等人 ,Pediatric and Developmental Pathology, 2001；Morrow 等人 .Hereditary Tyrosinemia 第9-21頁, 2017；Chinsky 等人 .Genetics in Medicine, 2017；以及Ginkel 等人 .Pediatric Drugs, 2019)。
迄今為止，對HT1最治癒之治療涉及正位肝移植且僅在嚴重的HT-1病例中進行(參見Morrow等人. Hereditary Tyrosinemia 第9-21頁, 2017)。移植後，患者通常顯示尿液及血漿毒性代謝物水準下降，而非受到遏制(參見Paradis 等人 .American Journal of Human Genetics, 1990；Forget 等人 .Pediatric Radiology, 1999)。大概係因為腎臟之持續產生。大多數患者經由飲食限制(低苯丙胺酸及酪胺酸攝入)進行替代治療，且以0.5-2.0 mg/kg/天口服NTBC (2-硝基-4-三氟甲基苯甲醯基)-1,3-環己二酮，尼替西農) ( 參見Chinsky 等人 .Genetics in Medicine, 2017)。NTBC為4-羥苯基丙酮酸二氧酶之可逆抑制劑，從而阻斷酪胺酸代謝之第二步並防止毒性代謝物之形成(參見Holme 等人. Journal of Inherited Metabolic Disease, 1998)。HT1之常見治療包括在出生後第一個月內開始用NTBC治療及限制飲食，且不間斷地持續進行以防止肝衰竭、腎衰竭及HCC之發展( 參見Chinsky 等人 .Genetics in Medicine, 2017)。因此，消除了對肝臟移植之迫切需要。然而，早期診斷及治療至關重要，因為此治療之有效性視多早辨識疾病而定。據報導，與在新生嬰兒期治療之患者相比，在新生嬰兒期後接受NTBC治療之患者產生HCC之風險高2-12倍( 參見Mayorandan 等人 .Orphanet Journal of Rare Diseases, 2014)。
在一些實施例中，本揭露之個體為新生嬰兒、嬰兒、兒童或成人。在一些實施例中，本揭露之個體為一週齡、兩週齡、三週齡、四週齡、五週齡、六週齡、七週齡、八週齡、九週齡、十週齡或12週齡。在一些實施例中，本揭露之個體之年齡在一至三週、二至四週、三至五週、四至六週、五至七週、六至八週、六至九週、八至十週、九至十一週或十至十二週之間。在一些實施例中，本揭露之個體之年齡小於一個月。在一些實施例中，本揭露之個體之年齡為一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月。在一些實施例中，本揭露之個體之年齡在一至三個月、二至四個月、三至五個月或四至六個月之間。
在一些實施例中，本揭露之個體之年齡在1與5歲、3與7歲、5與9歲、7與11歲、9與13歲、11與15歲、13與17歲、15與19歲、17與21歲、19與23歲、21與25歲、23與27歲、25與29歲、27與31歲、29與33歲、31與35歲之間。在一些實施例中，本揭露之個體為30至40歲、40至50歲、50至60歲、60至70歲、70至80歲或80至90歲。
在一些實施例中，個體已接受或正在接受針對HT1之治療。在一些實施例中，針對HT1之治療方法包含照護標準治療(亦即NTBC及飲食限制)。在一些實施例中，針對HT1之治療包含NTBC。
在一些實施例中，本揭露之方法包含向已接受或正在接受針對HT1之治療的個體投與包含多核苷酸匣之組合物。在一些實施例中，本揭露之方法包含向已接受或正在接受NTBC之個體投與包含多核苷酸匣之組合物。在一些實施例中，同時或依序向個體投與包含多核苷酸匣之組合物及針對HT1之治療(例如NTBC)。
在一些實施例中，投與本揭露之組合物可導致照護標準或先前或同時治療之改變。在一些實施例中，個體接受更低或減少劑量的個體正在接受的治療。在一些實施例中，個體停止或不再接受個體已接受或正在接受的治療。
與大多數慢性疾病一樣，患者及健康照護提供者必須考慮與不順應長期照護相關的風險。由於疾病對生活及社會功能的限制，患者、其家人類及照顧者之生活質量受到疾病的顯著影響。加強對持續終生醫藥及食療之醫療建議可能具有挑戰性，因為飲食或醫療不順應期可能係無症狀的( 參見Chinsky 等人 .Genetics in Medicine, 2017)。重要的是，對醫藥及飲食治療之不順應或依從性差直接或間接影響患者結局，因為毒性代謝物水準升高可促進HCC發展。NTBC治療可導致血液中更高水準之酪胺酸，因為酪胺酸未分解代謝，且在沒有嚴格的飲食依從性之情況下，患者可能患上角膜疾病(角膜結晶)( 參見Chinsky 等人 .Genetics in Medicine, 2017)。
NTBC (商品名Orfadin)為一種昂貴的藥物，且長期NTBC治療效果尚不清楚。將FAH基因之功能拷貝引入HT-1患者之基因體中將代表一種更好的方法，可能自單次投與提供終生治療益處。
在一些實施例中，本揭露之轉殖基因包含編碼FAH之序列。在一些實施例中，編碼FAH之序列與SEQ.ID NO.: 18-22中之一者具有80%、85%、90%、95%、99% 序列一致性。 小鼠FAH (mFAH，SEQ ID NO: 18) 人類FAH (hFAH，SEQ ID NO: 19) 人類FAH–經密碼子最佳化之變異體3 (hFAH-co3，SEQ ID NO: 20) 人類FAH–經密碼子最佳化之變異體2 (hFAH-co2，SEQ ID NO: 21) 人類FAH–經密碼子最佳化之變異體1 (hFAH-co1，SEQ ID NO: 22)
因為GENERIDE™經設計以提供治療持久性，其可藉由在患者生命早期用在功能衰退可能發生之前恢復異常基因之功能之治療進行干預來為HT-1患者提供終生益處。在一些實施例中，使用GENERIDE™構築體遞送治療性轉殖基因，該構築體經設計以在緊接編碼白蛋白之基因之後整合，該基因係肝臟中表現最高之基因。在一些實施例中，轉殖基因之表現「背靠(piggyback)」白蛋白之表現，考慮到肝臟中之高水準白蛋白表現，此可能提供足夠治療水準的所需蛋白質。
在一些實施例中，本揭露之組合物包含如本文所描述之病毒載體衣殼及多核苷酸匣。在一些實施例中，本揭露之組合物可與下文提供之序列具有85%、90%、95%、90%、95%、99%或100%序列一致性： GR-FAH-co3_1.6/1.0_kb (SEQ ID NO. 23) GR-FAH-co2_1.6/1.0_kb (SEQ ID NO. 24) GR-FAH-co1_1.6/1.0_kb (SEQ ID NO. 25) GR-FAH-co1_1kb(SEQ ID NO. 26)
在一些實施例中，本揭露提供一種組合物，其包含重組AAV構築體，該重組AAV構築體包含：多核苷酸匣，其包含：包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中第一核酸序列與SEQ ID NO. 18、19、20、21或22具有80%序列一致性；且第二核酸序列(i)位於第一核酸序列之5'或3'；且(ii)在整合至細胞之基因體中之靶整合位點中時促進產生兩種獨立的基因產物；第三核酸序列，其位於表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；及第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。在一些實施例中，AAV構築體包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，組合物進一步包含AAV2 ITR序列。在一些實施例中，第二核酸序列與SEQ ID NO: 6具有80%一致性。在一些實施例中，第二核酸序列編碼與SEQ ID NO: 7具有90%序列一致性之P2A肽。在一些實施例中，第三核酸序列與SEQ ID NO. 1、3或4具有80%序列一致性。在一些實施例中，第四核酸序列與SEQ ID NO. 2或5具有80%序列一致性。 範例 實例 1. 材料及方法 動物研究
FAH敲除(Fah-/-，KO)及雜合Fah+/-同窩(HET)動物係自Jackson Laboratories購得。FRG小鼠係自Yecuris公司購得。 酪胺酸血症 FRG 小鼠中之GENERIDE TM PoC
將四週齡FRG雄性動物在麻醉下經由眶竇後用媒劑或rAAV.DJ-GR-hFAH以1e14 vg/kg治療。所有小鼠在研究開始前及給藥後一週均保持8 mg/L之尼替西農(NTBC)，然後基於體重減輕，在給藥後循環使用NTBC至5週，然後停止使用NTBC。在研究期間，藉由下頜下出血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存在-80℃下直至進一步分析。在給藥後第9週及第16週進行最終收穫。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對動物解剖整個肝臟或進行肝臟灌注以收集肝細胞。對於解剖整個肝臟之動物，用10%福馬林固定一個肝葉，且將剩餘的肝葉速凍並且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。肝臟灌注後，將分離的肝細胞在4℃下以300xg離心5 min且儲存在-80℃下。 FAH 小鼠中之GENERIDE TM 劑量反應 PoC
將14天大的兒科Fah-/- (KO)及Fah+/- (HET)動物在麻醉下經由眶竇後用rAAV.DJ-GR-mFAH以1e13、3e13或1e14 vg/kg之劑量治療。所有小鼠在研究開始前及給藥後一週均保持8 mg/L之NTBC，然後基於體重減輕，在給藥後循環使用NTBC至2週。在研究期間，藉由下頜下出血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存在-80℃下直至進一步分析。在給藥後16週進行最終收穫。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對動物進行肝臟灌注以收集肝細胞。在灌注開始之前，縫合且解剖一個肝葉用於福馬林固定。肝臟灌注後，將分離的肝細胞在4℃下以300xg離心5 min且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。 NTBC 與 GeneRide 之間的肝細胞癌 (HCC) 風險評估
Fah-/-動物自出生以來保持使用8 mg/L NTBC。在四週齡時，隨機選擇一組Fah-/-動物且在麻醉下經由眶竇後用rAAV.DJ-GR-mFAH以1e14 vg/kg之劑量治療，然後退出NTBC (GENERIDE TM治療組)。將另一組Fah-/-動物維持8 mg/L NTBC (標準照護組)。第三組Fah+/-同窩仔被納入研究但未接受任何治療(無NTBC或GeneRide)。對所有動物進行追蹤直至一歲，且定期評估HCC生物標誌物(AFP水準)。 NTBC ( 標準照護 ) 與GENERIDE TM 之間的相容性之評估
將四週齡Fah-/-動物在麻醉下經由眶竇後用rAAV.DJ-GR-mFAH以1e14 vg/kg之劑量治療。在研究開始前將所有小鼠均保持8 mg/L之NTBC直至給藥後4週，然後將NTBC維持在8 mg/L (對照)下或滴定至3 mg/L、0.8 mg/L或0.3 mg/L持續8週。在研究期間，藉由下頜下出血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存在-80℃下直至進一步分析。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對於肝臟解剖，用10%福馬林固定一個肝葉，且將剩餘的肝葉速凍並且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。 肝臟中之靶向基因體 DNA 整合
自冷凍肝組織中提取基因體DNA，且藉由長程(long-range)聚合酶鏈反應(PCR)擴增分析靶向基因體DNA整合，接著使用經鑑定方法進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)定量(參見下圖)。使用正向引子(F1)及反向引子(R1)進行長程PCR。藉由固相可逆固定珠(ABM，G950)清洗PCR產物，且將其用作使用正向引子(F1)、反向引子(R2)及探針(P1)之qPCR之模板。引子及探針為(F1) 5'-ATGTTCCACGAAGAAGCCA-3'、(R1) 5'-TCAGCAGGCTGAAATTGGT-3、(R2) 5'-AGCTGTTTCTTACTCCATTCTCA-3'、(P1) 5'-AGGCAACGTCATGGGTGTGACTTT-3'。小鼠運鐵蛋白受體(Tfrc)用作qPCR之內部對照。 血漿白蛋白 -2A 融合蛋白定量
藉由化學發光ELISA量測血漿中之小鼠白蛋白-2A，使用專有的兔多株抗2A抗體進行捕獲，且使用HRP標記之多株山羊抗小鼠白蛋白抗體(abcam ab19195)進行偵測。在哺乳動物細胞中表現且親和力純化之重組小鼠白蛋白-2A用於在1%對照小鼠血漿中構建標準曲線以解釋基質效應。於PBS中之1%牛乳(Cell Signaling 9999S)用於封閉且於PBST中之1% BSA用於樣品稀釋。 血漿肝臟損傷生物標誌物定量
將小鼠血漿中之丙胺酸轉胺酶(ALT)活性及總膽紅素水準定量為肝損傷之生物標誌物。按照供應商之說明，使用丙胺酸轉胺酶活性比色檢定套組(BioVision)來定量血漿ALT活性。根據製造商之方案，使用經認的臨床分析儀Advanced® BR2 Bilirubin Stat-Analyzer™ (Advanced Instruments, LLC)量測血漿中之總膽紅素。 血漿 α 胎兒蛋白定量
根據製造商之方案，使用化學發光ELISA套組(R&D Systems)來定量血漿α胎兒蛋白。 免疫組織化學
免疫組織化學係在機器人平台(Ventana discover Ultra Staining Module, Ventana Co., Tucson, AZ)上進行。將組織切片(4 µm)脫蠟且進行熱誘導抗原回收64 min。用過氧化物酶抑制劑(CM1)阻斷內源過氧化物酶8 min，隨後在室溫下以1:400稀釋度將切片與抗FAH抗體(Yecuris, Portland, OR)一起孵育60 min。隨後使用DISC偵測抗原-抗體複合物。OmniMap抗兔多聚體RUO偵測系統及DISCOVERY ChromoMap DAB套組Ventana Co., Tucson, AZ)。隨後將所有載玻片用蘇木精(Fisher Sci, Waltham, MA)進行複染、脫水、清洗且安裝，以便使用數位載玻片掃描儀(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)進行影像掃描。使用ImageJ軟體以盲法形式評價所掃描影響以定量陽性染色區域。下文提供了在本發明實例中所用之示範性序列： AAV-DJ-mha-mFAH (PM-0550 ； SEQ ID NO. 27) AAV-DJ-mha-hFAH (PM-0549 ； SEQ ID NO. 28) AAV-DJ-mha-mFAH (PM-0549 ； SEQ ID NO. 29) 在有或沒有 NTBC 治療之情況下 Fah-/- 小鼠之疾病進展及消退之表徵
在研究開始前將年齡為7週的Fah-/-小鼠均保持8 mg/L之NTBC飲用水。隨後向動物供應常規水(NTBC停止) 7天，接著以8 mg/L再供應含NTBC之水7天將上述循環再重複14天。在研究期間，監測動物之每日體重。定期取樣下頜下血液及尿液，且收集血清及血漿並且儲存在-80℃下直至進一步分析。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對於肝臟解剖，用10%福馬林固定一個肝葉，且將剩餘的肝葉速凍並且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。 在經編輯肝細胞之選擇性擴增期間，量測 GeneRide 治療之 Fah-/- 小鼠的疾病表型之嚴重程度。
將四週齡 Fah -/- 動物在麻醉下經由眶竇後用rAAV.DJ-GR-mFah以1e14 vg/kg之劑量治療。在研究開始前及給藥後3週將所有小鼠均保持8 mg/L之NTBC飲用水。此後，向動物供應常規水(NTBC停止)直至研究結束。在研究期間，監測動物之每日體重。定期取樣下頜下血液及尿液，且收集血清及血漿並且儲存在-80℃下直至進一步分析。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對於肝臟解剖，用10%福馬林固定一個肝葉，且將剩餘的肝葉速凍並且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。 評價GENERIDE TM 及尼替西農療法 (NTBC) 對肝細胞癌發展之預防作用。
將四週齡 Fah -/- 動物在麻醉下經由眶竇後用rAAV.DJ-GR-mFah以1e14 vg/kg之劑量治療。在研究開始前及給藥後1週將經GeneRide治療之小鼠保持8 mg/L之NTBC飲用水。此後，向動物供應常規水(NTBC停止)直至研究結束。接受8 mg/L之NTBC治療之 Fah -/- 動物及 Fah +/- 動物為研究對照。在1年研究期間，監測動物之體重。對於接受次優NTBC劑量(0.8mg/L之NTBC)之動物，自0.8 mg/L NTBC治療開始，每週2次監測體重。當觀測到任何動物之體重比前一週下降10%時，使該動物經受8 mg/L NTBC達7天。此後，動物返回接受0.8 mg/L NTBC直至或若存在下一體重下降事件。對於所有動物，定期取樣下頜下血液及尿液，且收集血清及血漿並且儲存在-80℃下直至進一步分析。在處死時，經由心臟穿刺收集血液以獲得血漿。對於肝臟解剖，用10%福馬林固定一個肝葉，且將剩餘的肝葉速凍並且儲存在-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中進行石蠟包埋。 血清活化部分凝血酶時間 (aPTT) 檢定
根據製造商之方案(Diagnostica Stago, Parsippany, NJ)使用具有提供的套組的STart® Stago血液凝固分析儀(#00595)進行血清aPTT定量。 血清臨床化學評價
使用液相層析-串聯質譜法(LC-MS/MS)在Charles River Laboratory (Ashland, OH)進行血清樣品分析。臨床化學評價包括天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)、丙麩胺酸轉移酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TPROT)、球蛋白(GLOB)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(UREAN)、肌酸酐(CREAT)、發電細胞(PHOS、NA、K、CL)、葡萄糖(GLUC)、膽固醇(CHOL)及三酸甘油酯(TRIG)。 實例 2. GENERIDE TM 治療可改善活體內肝功能
本實例證明，除其他外，包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體可用於治療或預防活體內(例如在一或多個小鼠模型中)酪胺酸血症。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、人類FAH (hFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖1A)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。向年齡為4週的FRG小鼠(酪胺酸血症小鼠模型)經由靜脈注射投與病毒載體且自出生時保持NTBC飲用水(8 mg/L)直至給藥後1週(圖1B)。在給藥後1與4週之間，視需要調整NTBC劑量( 例如若動物體重比前一週量測值下降10%，則將動物循環回8 mg/L NTBC飲用水一週)。自給藥後4週直至處死(給藥後9或16週時)，停止投與NTBC。
在治療後長達9週評估小鼠之循環GENERIDE TM生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖1C)且在治療後長達16週評估小鼠之身體生長(經由百分比體重變化) (圖1D)。亦評估了肝功能之標誌物(例如丙胺酸轉胺酶(ALT)、膽紅素) (圖1E及圖1F)。在治療後9週(9WK；收穫4隻動物)及16週(16WK；收穫4隻動物)處死小鼠且分離小鼠肝臟。處死經治療小鼠之一個子集，且收集肝臟樣品且經由用抗FAH抗體進行免疫組織化學染色來進行分析(圖1G)。自一個單獨的經治療小鼠子集中分離肝細胞，該等小鼠之肝臟已經灌注(n=2)。評估所分離肝細胞之gDNA整合(圖1H)。與健康Fah+/-雜合(HET)小鼠及僅媒劑經治療小鼠相比，亦評估來自小鼠之血漿樣品中α胎兒蛋白(AFP) (肝細胞癌(HCC)之標誌物)之存在(圖1I)。
除其他外，本揭露證明與參考(例如未經治療或媒劑治療)相比，用包含編碼人類FAH (hFAH)之序列的病毒載體治療可在患有1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之個體中(例如在FRG小鼠模型系統中)提供肝功能改善。在一些實施例中，與參考(例如未經治療或媒劑治療)相比，用本揭露之病毒載體治療個體可提供與肝功能降低相關之生物標誌物(例如ALT、膽紅素)之水準降低。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可允許或恢復相對於參考(例如未經治療或媒劑治療)之正常生長(例如經由體重隨時間之百分比變化來量測)。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如AFP)之水準降低。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供肝功能改善(例如透過評估肝功能之標誌物來量測)、相對於參考(例如未經治療或媒劑治療)之正常生長(例如透過體重隨時間推移之百分比變化來量測)及與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如AFP)水準降低中之一或多者。
除其他外，如圖1H中所示，本揭露證明本揭露之病毒載體能夠將轉殖基因序列(例如FAH)整合至個體體內之基因體靶位點中。在一些實施例中，轉殖基因序列(例如FAH)之整合可為個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)體內之細胞(例如肝臟細胞)提供選擇性優勢。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可使特定組織類型(例如肝臟)內之細胞(例如肝臟細胞)中所遞送之轉殖基因(例如FAH)的基因體DNA整合多於10% ( 例如20%、30%、40%、50%)。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可使特定組織類型(例如肝臟)內多於50% (例如60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%等)的細胞(例如肝臟細胞)由已成功整合所遞送之轉殖基因(例如FAH)的細胞組成。 實例 3. GENERIDE TM 治療允許活體內經編輯細胞之快速選擇性擴增
本實例證明，除其他外，可以某些劑量向個體(例如患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體，且為已成功整合了FAH編碼序列之細胞提供選擇性優勢。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖2A)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。經由靜脈注射向年齡為兩週的Fah-/-小鼠投與本文所描述之載體(圖2A)。自出生向小鼠提供8 mg/L之NTBC直至投與GENERIDE TM後1週(年齡為3週)。年齡在3與4週之間，8 mg/L NTBC飲用水僅向觀測到體重較前一週下降10%之動物提供。自年齡為4週直至處死(年齡為至少18週)，停止投與NTBC。另一組Fah-/-小鼠始終維持8 mg/L NTBC飲用水且用作標準照護對照組。評估小鼠在治療後長達8週之循環生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖2B)及NTBC移除後之存活率(圖2C)。評估了肝功能標誌物(例如ALT)及毒性代謝物(例如琥珀醯丙酮(SUAC))之存在(圖2D及圖2E)。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖2A)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。經由靜脈注射向年齡為1個月的Fah-/-小鼠投與本文所描述之載體(圖3A)。自出生將小鼠用8 mg/L之NTBC治療直至投與GENERIDE TM載體。自年齡為1個月直至處死(年齡為至少12個月)，停止投與NTBC。評估年齡為至少5個月的小鼠之循環生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖3B)且在治療後監測體重達至少6個月(圖3C)。亦在此等小鼠(年齡為至少6個月)中評估了HCC風險(AFP水準) (圖3D)。
除其他外，本揭露證明用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體)可為細胞(例如肝臟細胞)提供快速的選擇性優勢，從而導致在治療後4週內患病肝臟之完全再增生。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可使特定組織類型(例如肝臟)內多於50% (例如60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%等)的細胞(例如肝臟細胞)由在治療後4週內已成功整合所遞送之轉殖基因(例如FAH)的細胞組成。在一些實施例中，用本揭露之病毒載體以某些劑量(例如3E13 vg/kg、1E13 vg/kg、1E14 vg/kg)治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可在治療後4週內為細胞(例如肝臟細胞)提供選擇性優勢。
除其他外，本揭露證明與參考(例如未經治療)相比，用包含編碼小鼠FAH (mFAH)之序列的病毒載體治療可在患有1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之個體中(例如在FAH -/-小鼠模型系統中)提供肝功能改善。在一些實施例中，與參考(例如未經治療)相比，用本揭露之病毒載體治療個體可提供與肝功能降低相關之生物標誌物(例如ALT、膽紅素)之水準降低。在一些實施例中，相對於參考(例如未經治療或NTBC治療)，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供有害代謝物(例如SUAC)之水準降低。
除其他外，本揭露證明與參考(例如未經治療或經NTBC治療之個體)相比，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可降低HCC風險。在一些實施例中，與年齡匹配之參考(例如未經治療或經NTBC治療之個體)相比，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可在給藥後至少5個月(年齡為6個月)提供與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如AFP)之水準降低。
除其他外，本揭露證明用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可展示成年後的持續轉殖基因表現。在一些實施例中，向年齡為至少一個月之個體投與本揭露之病毒載體證明在給藥後至少5個月循環生物標誌物(例如ALB-2A)之持續表現。在一些實施例中，與參考(例如經NTBC治療之個體)相比，用本揭露之病毒載體治療之個體展示出相似的體重。在一些實施例中，與年齡為至少6個月的參考(例如未經治療或經NTBC治療之個體)相比，用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如AFP)之水準降低。 實例 4. GENERIDE TM 組合療法之最佳化
本實例證明，除其他外，可向個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體與某些劑量之一或多種替代療法(例如NTBC治療)之組合，以便最佳化已成功整合FAH編碼序列之細胞的選擇性優勢。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、以及長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。經由靜脈注射向三組(第1、2、3、4組)年齡為4週的Fah-/-小鼠以1e14 vg/kg之劑量投與本文所描述之病毒載體。所有組之小鼠均維持NTBC飲用水(8 mg/L)達4週，接著維持滴定劑量之NTBC (分別為3 mg/L、0.8 mg/L及0.3 mg/L)達8週。第1組中之小鼠保持標準劑量之NTBC達8週。評估小鼠在NTBC滴定後長達6週之循環生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖4B)。
除其他外，本揭露證明用本揭露之病毒載體治療個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之個體)可包括與一或多種替代療法(例如替代HT1療法)組合投與病毒載體，以便為細胞(例如肝臟細胞)提供選擇性優勢。在一些實施例中，可最佳化本揭露之病毒載體與一或多種替代療法(例如NTBC)之組合投與(例如經由最佳化劑量水準及/或時序)以為細胞(例如肝臟細胞)提供選擇性優勢，同時維持或改善肝功能(例如，與肝功能降低相關的生物標誌物(例如ALT、膽紅素)水準降低(圖4C)、有害代謝物(SUAC)水準降低等)。在一些實施例中，可滴定一或多種替代療法(例如NTBC療法)之劑量水準以在控制疾病嚴重程度(例如減輕疾病之症狀及/或副作用)的同時為細胞(例如肝臟細胞)提供選擇性優勢。
除其他外，本揭露證明用包含編碼FAH (FAH)之序列的病毒載體治療可在患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體中(例如在FAH-/-小鼠模型系統中)提供與補充的NTBC之滴定較低劑量的改進的整合。在一些實施例中，如圖4B所示，用本揭露之病毒載體治療個體可提供增加水準的循環生物標誌物(例如ALB-2A)以及次優NTBC劑量，而高劑量NTBC可防止GENERIDE TM編輯之細胞(例如肝細胞)的選擇性擴增。 實例 5. GENERIDE TM 治療可在編輯的細胞活體內完全選擇性擴增之前展示出改善的肝功能
本實例證明，除其他外，向個體(例如患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含特定組分以及編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體可在完成已成功整合了FAH編碼序列之細胞的選擇性擴增之前改善肝功能。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、以及長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。向Fah-/-小鼠以1e14 vg/kg之劑量投與本文所描述之病毒載體。在研究開始前及給藥後3週將所有小鼠均保持8 mg/L之NTBC飲用水。此後，向動物供應常規水(NTBC停止)直至研究結束。評估小鼠之循環GENERIDE TM生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖7A)、毒性代謝物(例如SUAC)之存在(圖7B)以及肝損傷及合成功能之標誌物(例如ALT) (圖7C)、血液凝固(例如活化部分凝血激酶時間(aPTT)) (圖7D)、血糖(圖7E)及/或體重(圖7F)。
如圖6A至圖6F中所示，NTBC治療可快速(例如少於7天)恢復遺傳性酪胺酸血症生物標誌物(例如SUAC)及肝臟合成功能(aPTT、ALT、血糖)，且一旦取出NTBC治療(例如少於3天)，異常水準之遺傳性酪胺酸血症生物標誌物(例如SUAC)及肝臟合成功能(aPTT、ALT、血糖)便隨之而來。
如圖7A至圖7F中所示，在GENERIDE TM治療7天內更換NTBC Fah-/-小鼠，校正細胞之擴增可能足以在不存在NTBC治療之情況下控制SUAC。在第7天，僅觀測到輕度肝損傷，且未偵測到嚴重的代謝功能障礙。自第17天至第28天，SUAC水準趨於下降至正常範圍，接著體重增加。重要的是，如圖8B中所示，第28天(例如4週)，用GENERIDE TM治療完全用已成功整合FAH轉殖基因之GENERIDE TM編輯的細胞完全再增生。如本文所示，GENERIDE TM治療產生與全劑量NTBC治療相當的肝臟及腎臟生物標誌物譜，且與健康Fah+/-小鼠相比，GENERIDE TM及NTBC治療展示出相似的水準(圖8C及圖8D)。 實例 6. 長期 GENERIDE TM 治療允許在低肝細胞癌 (HCC) 風險下肝臟中之經編輯細胞的快速選擇性擴增
本實例證明，除其他外，向個體(例如患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含特定組分以及編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體可為已成功整合了FAH編碼序列之細胞提供選擇性優勢，且此等經編輯肝細胞可賦予比未編輯肝細胞更低的產生HCC之風險。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、以及長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。向Fah-/-小鼠以1e14 vg/kg之劑量投與本文所描述之病毒載體。在研究開始前及給藥後1週將經GENERIDE TM治療之小鼠保持8 mg/L之NTBC飲用水。此後，向動物供應常規水(NTBC停止)直至研究結束(圖9A)。
在研究期間，監測動物之體重。對於接受次優NTBC劑量之動物，自0.8 mg/L NTBC治療開始，每週2次監測體重。若觀測到比前一週體重下降10%，則使動物經受8 mg/L NTBC達7天。評估小鼠之循環GENERIDE TM生物標誌物(例如ALB-2A水準) (圖9B)、毒性代謝物(例如SUAC)之存在(圖9B)及酪胺酸水準(圖9E)。亦在此等小鼠(年齡為至少7個月)中評估了HCC風險(AFP水準) (圖9D)。
如圖9C中所示，經GENERIDE TM治療之Fah-/-小鼠可能展示至少10個月之持久的肝細胞編輯。GENERIDE TM治療可將毒性代謝物(例如SUAC) (圖9B)降低至不可偵測水準且恢復酪胺酸代謝(圖9E)，證明了對NTBC治療之長期優越性。此優越性為臨床上相關的，尤其當未嚴格遵循飲食限制及NTBC治療時(例如與次優的 NTBC治療組相當)。與高劑量的連續NTBC (8 mg/L)相比，GENERIDE TM治療之Fah-/-小鼠可能展示HCC生物標誌物(例如AFP)減少(圖9D)，表明GENERIDE TM治療可能與標準照護(例如NTBC)相同或更低的HCC風險相關。 實例 7. 在兒科小鼠中最佳化 GENERIDE TM 療法。
本實例證明，可向兒科個體(例如患有遺傳性酪胺酸血症之兒科個體)投與包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體，以便最佳化已成功整合了FAH編碼序列之細胞的選擇性優勢。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之側翼3'同源臂的病毒載體。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。將FAH -/-小鼠分成4個不同的組(圖10A)。將第3組中之小鼠維持NTBC飲用水(8 mg/L)達4週，且維持標準劑量之NTBC (8 mg/L)達8週。將第4組中之小鼠維持NTBC飲用水(8 mg/L)達4週，接著維持0.8 mg/L滴定劑量之NTBC達8週。將第1組中之小鼠維持NTBC飲用水(8 mg/L)達4週，且在年齡為4週時以1E14 vg/kg之劑量投與本文所描述之病毒載體。使第2組中之小鼠接受由母親提供之母乳，該母親給藥了24 mg/L NTBC達3週。此確保了新生兒接受之劑量接近NTBC之標準劑量(例如8 mg/L)。在年齡為2週時，以1E14 vg/kg之劑量向第2組中之小鼠投與本文所描述之病毒載體。在此等小鼠中評估了HCC風險(例如AFP水準)。
作為當前照護標準之NTBC減少了患有遺傳性酪胺酸血症之患者體內毒性產物之累積(參見例如Ginkel等人, Adv Exp Med Biol. 2017;959:101-109)。然而，尤其若NTBC治療開始較晚(展現為腫瘤標誌物AFP之緩慢下降)，則發生肝癌之風險仍然存在(參見例如Ginkel等人, Adv Exp Med Biol. 2017;959:101-109)。
如圖10B中所示，GENERIDE TM治療可能早在出生後第14天對FAH -/-小鼠(例如第2組中之小鼠)有效，且FAH-/- 小鼠在接受治療後年齡為3個月時可能展現AFP水準降低。對於第2組中之小鼠，在年齡為2個月時AFP水準為至少約10 4至10 5ng/mL，且在年齡為3個月時AFP水準降低至至少約10 2至10 3ng/mL。另外，治療後AFP水準保持至少約10 2至10 3ng/mL達至少約12個月。
因此，本實例證明了本文所描述之病毒載體的早期投與(例如出生後第14天)可有效降低FAH -/-小鼠之HCC風險，特徵在於治療後AFP水準降低。 實例 8. 兒科小鼠之 GENERIDE TM 治療允許活體內經編輯細胞之快速選擇性擴增
本實例進一步證實可向兒科個體(例如患有1型遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列的病毒載體，且為已成功整合了FAH編碼序列之細胞提供選擇性優勢。
構築了包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。使Fah-/-小鼠接受由母親提供之母乳，該母親給藥了24 mg/L NTBC達3週。此確保了新生兒接受之劑量接近NTBC之標準劑量(例如8 mg/L)。經由靜脈注射在年齡為兩週(亦即出生後第14天)時向小鼠以3E12 vg/kg或1E13vg/kg之劑量投與本文所描述之載體。給藥後16週採集肝臟樣品且經由免疫組織化學染色用抗FAH抗體進行分析。
如圖11中所示，來自出生後第14天，以3E12 vg/kg或1E13vg/kg劑量投與GENERIDE TM治療之Fah-/-小鼠的肝臟樣品在治療後16週展現出對FAH蛋白之強烈染色。與以1E13vg/kg劑量投與GENERIDE TM治療之Fah-/-小鼠相比，來自投與3E12 vg/kg之GENERIDE TM治療之Fah-/-小鼠的肝臟樣品展現出對FAH蛋白的更高強度之染色。
因此，本實例證明，在兒科小鼠(例如出生後第14天)中以額外劑量(例如3E12 vg/kg或1E13vg/kg)投與本文所描述之載體有效地為已成功整合FAH編碼序列之細胞提供選擇性優勢，其特徵在於在肝臟樣品中對FAH樣品之強烈染色。此外，本實例證明，投與較低劑量之GENERIDE TM治療(例如3E12 vg/kg)的Fah-/-小鼠可改善疾病結果，其特徵在於已成功整合FAH編碼序列之細胞的強大的肝臟再增生。 實例 9: 雙質體及三質體系統可用於產生病毒載體
本實例證明，除其他外，二質體或三質體系統可用於產生AAV載體。
在一些實施例中，HEK293F細胞經擴增用於載體產生。在500 mL燒瓶中之200 mL Expi293培養基中將細胞分成2e6個細胞/mL。製備用於各種轉染條件之質體混合物且通過0.22 µM過濾器單元過濾。根據製造商之方案製備轉染試劑混合物( 例如PEI或FectoVIR-AAV)。將質體及轉染試劑混合物組合成單一的轉染混合物。將20 mL轉染混合物添加至於500 mL燒瓶中之100 mL HEK293F細胞中，且在37℃下孵育72小時。
在一些實施例中，用於雙質體系統之質體包含AAV rep序列及來自輔助病毒(「Rep/輔助質體」)之相關序列或AAV cap序列及有效負載(「有效負載/Cap質體」)。在一些實施例中，三質體系統中所用之質體包含單獨的質體，各質體編碼以下中之一者：1) AAV rep及AAV cap序列、2)來自輔助病毒之相關序列及3)有效負載。與GeneRide系統相容的具有小鼠白蛋白之側翼同源臂的人類感興趣之基因序列( 例如「mHA-FAH」)可用作小鼠實驗之有效負載。與GeneRide系統相容的具有人類白蛋白之側翼同源臂的人類感興趣之基因序列(例如「hHA-FAH」)可用作人類或人源化小鼠實驗之有效負載。在一些實施例中，有效負載可包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，有效負載可由SEQ ID NO: 31組成。在一些實施例中，有效負載可包含本文所描述之任何有效負載。在有效負載/Cap質體中評估編碼不同AAV衣殼之多種AAV cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因可編碼AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVC11.01、AAVC11.02、AAVC11.03、AAVC11.04、AAVC11.05、AAVC11.06、AAVC11.07、AAVC11.08、AAVC11.09、AAVC11.10、AAVC11.11、AAVC11.12、AAVC11.13、AAVC11.14、AAVC11.15、AAVC11.16、AAVC11.17、AAVC11.18、AAVC11.19、AAV-DJ、AAV-LK03、AAV-LK19、AAVrh.74、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.K、AAVrh.39、AAV12、AAV 13、AAVrh.8、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV、綿羊AAV、雜種AAV ( 例如包含一種AAV亞型之一或多個序列及第二亞型之一或多個序列的AAV)。在一些實施例中，有效負載/Cap質體可包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，有效負載/Cap質體可由SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，有效負載/Cap質體可包含SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，有效負載/Cap質體可由SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，有效負載/Cap質體可包含本文所揭示之任何有效負載或衣殼序列。
表1A：用於產生病毒載體之示範性序列。
名稱 序列(5' 至3') SEQ ID NO
感興趣之基因(GOI)匣 31
LK03-GR hFAH-co1 32
sL65-GR hFAH-co1 33
示範性實施例 1. 一種組合物，其包含： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列編碼轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在整合至細胞之基因體中之靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與該細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。 2. 如實施例1之組合物，其中該組合物進一步包含遞送媒劑。 3. 如實施例2之組合物，其中該遞送媒劑包含脂質奈米顆粒。 4. 如實施例3之組合物，其中該遞送媒劑包含重組病毒載體。 5. 如實施例4之組合物，其中該重組病毒載體為重組腺相關(AAV)病毒載體。 6. 如實施例5之組合物，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 7. 如上述實施例中任一項之組合物，其中該轉殖基因為或包含延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)轉殖基因。 8. 如實施例7之組合物，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 9. 如實施例7之組合物，其中該FAH轉殖基因與SEQ ID NO. 18、19、20、21或22具有80%序列一致性。 10. 如上述實施例中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 11. 如上述實施例中任一項之組合物，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 12. 如上述實施例中任一項之組合物，其中該第二核酸序列包含： a) 編碼2A肽之核酸序列； b) 編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c) 編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d) 編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 13. 如上述實施例中任一項之組合物，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為在包含內源啟動子及內源基因之靶整合位點處整合該表現匣之同源臂。 14. 如實施例13之組合物，其中該靶整合位點為內源白蛋白基因座。 15. 一種將轉殖基因整合至個體組織中之至少一個細胞群之基因體中的方法，該方法包含 向個體投與包含以下之組合物： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列編碼該轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在整合至該細胞之基因體中之靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於表現之3'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列； 其中，在投與該組合物後，將該轉殖基因整合至該細胞群之該基因體中。 16. 如實施例15之方法，其中該整合不包含核酸酶活性。 17. 如實施例15之方法，其中該組合物進一步包含遞送媒劑。 18. 如實施例17之方法，其中該遞送媒劑包含脂質奈米顆粒。 19. 如實施例17之方法，其中該遞送媒劑包含重組病毒載體。 20. 如實施例19之方法，其中該重組病毒載體為重組腺相關(AAV)病毒載體。 21. 如實施例19之方法，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 22. 如實施例15至21中任一項之方法，其中該轉殖基因為或包含延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)轉殖基因。 23. 如實施例22之方法，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 24. 如實施例22之方法，其中該FAH轉殖基因與SEQ ID NO.18、19、20、21或22具有80%序列一致性。 25. 如實施例15至24中任一項之方法，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 26. 如實施例15至25中任一項之方法，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 27. 如實施例15至26中任一項之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。 28. 如實施例27之方法，其中該靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。 29. 如實施例28之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該內源白蛋白啟動子之控制下經表現，而不破壞該內源白蛋白基因之表現。 30. 如上述實施例中任一項之方法，其中該組織為肝臟。 31. 如上述實施例中任一項之方法，其中該第二核酸序列包含： a) 編碼2A肽之核酸序列； b) 編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c) 編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d) 編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 32. 如上述實施例中任一項之方法，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為在包含內源啟動子及內源基因之靶整合位點處整合該表現匣之同源臂。 33. 如實施例32之方法，其中該靶整合位點為內源白蛋白基因座。 34. 一種在一段時間內增加組織中轉殖基因之表現水準之方法，該方法包含 向有需要之個體投與組合物，該組合物遞送轉殖基因，該轉殖基因整合至該個體組織中之至少一個細胞群之基因體中，其中該組合物包含： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列編碼該轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在整合至該細胞之基因體中之靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列； 其中，在投與該組合物後，將該轉殖基因整合至該細胞群之基因體中，且該轉殖基因在該組織中之表現水準在一段時間內增加。 35. 如實施例34之方法，其中該轉殖基因之該整合不包含核酸酶活性。 36. 如實施例34或35之方法，其中該增加的表現水準包含在該組織中表現該轉殖基因之細胞之百分比增加。 37. 如實施例34之方法，其中該組合物進一步包含遞送媒劑。 38. 如實施例37之方法，其中該遞送媒劑包含脂質奈米顆粒。 39. 如實施例37之方法，其中該遞送媒劑包含重組病毒載體。 40. 如實施例39之方法，其中該重組病毒載體為重組AAV載體。 41. 如實施例40之方法，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與，AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 42. 如實施例34至41中任一項之方法，其中該轉殖基因為或包含延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)轉殖基因。 43. 如實施例42之方法，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 44. 如實施例42之方法，其中該FAH轉殖基因與SEQ ID NO.18、19、20、21或22具有80%序列一致性。 45. 如實施例34至44中任一項之方法，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 46. 如實施例34至45中任一項之方法，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 47. 如實施例34至46中任一項之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。 48. 如實施例47之方法，其中該靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。 49. 如實施例48之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該內源白蛋白啟動子之控制下經表現，而不破壞該內源白蛋白基因之表現。 50. 如實施例34至49中任一項之方法，其中該組織為肝臟。 51. 如實施例34至50中任一項之方法，其中該第二核酸序列包含： a) 編碼2A肽之核酸序列； b) 編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c) 編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d) 編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 52. 如實施例34至51中任一項之方法，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為在包含內源啟動子及內源基因之靶整合位點處整合該表現匣之同源臂。 53. 如實施例52之方法，其中該靶整合位點為內源白蛋白基因座。 54. 一種用於將轉殖基因整合至細胞之基因體中之靶整合位點中的重組病毒載體，其包含多核苷酸匣，該多核苷酸匣包含： (i) 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列包含 FAH轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點時促進產生兩種獨立的基因產物； (ii) 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 (iii) 第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與該細胞之基因體中之該靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。 55. 如實施例54之重組病毒載體，其中該第三核酸在900-1150個核苷酸之間。 56. 如實施例54或實施例55之重組病毒載體，其中該第四核酸在1500-1750個核苷酸之間。 57. 如實施例54至56中任一項之重組病毒載體，其中該重組病毒載體為重組AAV載體。 58. 如實施例57之重組病毒載體，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與，AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAV-NP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 59. 如實施例54至58中任一項之重組病毒載體，其進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 60. 如實施例54至59中任一項之重組病毒載體，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 61. 如實施例54至60中任一項之重組病毒載體，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該 FAH轉殖基因在該靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。 62. 如實施例61中任一項之重組病毒載體，其中該靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。 63. 如實施例61之重組病毒載體，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該 FAH轉殖基因在該內源白蛋白啟動子之控制下經表現，而不破壞該內源白蛋白基因之表現。 64. 如實施例61中任一項之重組病毒載體，其中該兩種獨立的基因產物為自該 FAH轉殖基因表現之FAH蛋白及包含自該整合位點處之內源基因表現之內源蛋白的肽。 65. 如實施例54至64中任一項之重組病毒載體，其中該細胞為肝臟細胞。 66. 如實施例54至65中任一項之重組病毒載體，其中該第二核酸序列包含： a) 編碼2A肽之核酸序列； b) 編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c) 編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d) 編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 67. 如實施例54至66中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為將該 FAH轉殖基因及該第二核酸序列整合至包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因的內源白蛋白基因座中之同源臂。 68. 如實施例67之重組病毒載體，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為將該 FAH轉殖基因及該第二核酸序列整合至框內具有該內源白蛋白啟動子及該內源白蛋白基因的內源白蛋白基因座中之同源臂。 69. 如實施例67或實施例68之重組病毒載體，其中該同源臂引導該多核苷酸匣整合於緊靠該內源白蛋白基因之起始密碼子之3'或緊靠於該內源白蛋白基因之終止密碼子之5'。 70. 如實施例54至69中任一項之重組病毒載體，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 71. 一種方法，其包含以下步驟： 向個體投與一定劑量之組合物，該組合物向該個體組織中之細胞中遞送轉殖基因，其中該轉殖基因(i)編碼FAH；(ii)在複數個細胞之基因體中的靶整合位點處整合；(iii)一旦整合，便功能性表現FAH；以及(iv)相對於該組織中之其他細胞，賦予該複數個細胞選擇性優勢，使得隨時間推移，該組織達成高於未整合該轉殖基因之細胞的FAH之功能性表現水準，其中該組合物包含： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列編碼該轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在該靶整合位點處整合該轉殖基因時促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於該表現匣之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。 72. 如實施例71之方法，其中該轉殖基因之該整合不包含核酸酶活性。 73. 如實施例71或72之方法，其中該選擇性優勢包含在該組織中表現該轉殖基因之細胞之百分比增加。 74. 如實施例71至73中任一項之方法，其中該組合物進一步包含遞送媒劑。 75. 如實施例74之方法，其中該遞送媒劑包含脂質奈米顆粒。 76. 如實施例74之方法，其中該組合物包含重組病毒載體。 77. 如實施例76之方法，其中該重組病毒載體為重組AAV載體。 78. 如實施例77之方法，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與，AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 79. 如實施例71之方法，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 80. 如實施例71至79中任一項之方法，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 81. 如實施例71至80中任一項之方法，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 82. 如實施例71至81中任一項之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。 83. 如實施例82之方法，其中該靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。 84. 如實施例83之方法，其中在將該多核苷酸匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該內源白蛋白啟動子之控制下經表現，而不破壞該內源白蛋白基因之表現。 85. 如實施例71至84中任一項之方法，其中該組織為肝臟。 86. 如實施例71至85中任一項之方法，其中該第二核酸序列包含： a)編碼2A肽之核酸序列； b)編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c)編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d)編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 87. 如實施例71至86中任一項之方法，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為在包含內源啟動子及內源基因之靶整合位點處整合該表現匣之同源臂。 88. 如實施例87之方法，其中該靶整合位點為內源白蛋白基因座。 89. 一種治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之方法，該方法包含向個體投與一劑包含以下之組合物： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列編碼FAH轉殖基因；且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'，且在該靶整合位點處整合該轉殖基因時促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該第一核酸序列之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於該第二核酸序列之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列； 其中，在投與該組合物後，將該轉殖基因整合至該細胞群之基因體中。 90. 如實施例89之方法，其中該整合不包含核酸酶活性。 91. 如實施例89之方法，其中該組合物進一步包含遞送媒劑。 92. 如實施例91之方法，其中該遞送媒劑包含脂質奈米顆粒。 93. 如實施例91之方法，其中該遞送媒劑包含重組病毒載體。 94. 如實施例93之方法，其中該重組病毒載體為重組腺相關(AAV)病毒載體。 95. 如實施例93之方法，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與，AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 96. 如實施例95之方法，其中該 FAH轉殖基因為wt人類 FAH、經密碼子最佳化之 FAH、合成 FAH、 FAH變異體、 FAH突變體或 FAH片段。 97. 如實施例95之方法，其中該FAH轉殖基因與SEQ ID NO.18、19、20、21或22具有80%序列一致性。 98. 如實施例89至97中任一項之方法，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 99. 如實施例89至98中任一項之方法，其中該多核苷酸匣不包含啟動子序列。 100. 如實施例89至99中任一項之方法，其中在將該表現匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該靶整合位點處之內源啟動子之控制下經表現。 101. 如實施例100之方法，其中該靶整合位點為包含內源白蛋白啟動子及內源白蛋白基因之白蛋白基因座。 102. 如實施例101之方法，其中在將該多核苷酸匣整合至該細胞之基因體中之該靶整合位點後，該轉殖基因在該內源白蛋白啟動子之控制下經表現，而不破壞該內源白蛋白基因之表現。 103. 如實施例89至102中任一項之方法，其中該組織為肝臟。 104. 如實施例89至103中任一項之方法，其中該第二核酸序列包含： a) 編碼2A肽之核酸序列； b) 編碼內部核糖體進入位點(IRES)之核酸序列； c) 編碼N-末端內含肽剪接區及C-末端內含肽剪接區之核酸序列；或 d) 編碼剪接供體及剪接接受體之核酸序列。 105. 如實施例89至104中任一項之方法，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列為在包含內源啟動子及內源基因之靶整合位點處整合表現匣之同源臂。 106. 如實施例105之方法，其中該靶整合位點為內源白蛋白基因座。 107. 如實施例89之方法，其中該個體已接受或正在接受針對HT1之治療。 108. 如實施例107之方法，其中該個體已接受或正在接受NTBC ((2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲醯基)-1,3-環己二酮))。 109. 如實施例107或108之方法，其中NTBC與該組合物組合投與。 110. 如實施例109之方法，其中NTBC與該組合物同時或依序投與。 111. 如實施例89之方法，其中在用該組合物治療後，該個體接受較低或減少劑量之該個體正在接受的治療。 112. 如實施例89之方法，其中在用該組合物治療後，該個體接受相同劑量之該個體已接受或正在接受的治療。 113. 如實施例89之方法，其中在用該組合物治療後，該個體停止接受該個體已接受或正在接受的治療。 114. 如實施例89之方法，其中該個體為新生兒。 115. 如實施例89之方法，其中該個體為一週齡、兩週齡、三週齡、四週齡或五週齡。 116. 一種監測基因療法之方法，該方法包含以下步驟： 在來自已接受包含如實施例1之組合物的基因療法治療的個體之生物樣品中偵測藉由整合基因療法治療之整合所產生之生物標誌物之水準或活性，作為該基因療法治療之狀態之一或多種特徵之替代物，其中該基因療法治療之狀態之該一或多種特徵選自由以下組成之群：有效負載之水準、有效負載之活性、該基因療法治療在細胞群中之整合水準及其組合。 117. 如實施例116之方法，其中該有效負載為或包含細胞內表現之肽。 118. 如實施例116之方法，其中該有效負載為或包含細胞外分泌之肽。 119. 如實施例116至118中任一項之方法，其中該有效負載由多核苷酸匣編碼。 120. 如實施例116至119中任一項之方法，其中該生物樣品為或包含毛髮、皮膚、糞便、血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、眼淚、玻璃狀液、肝臟生檢或黏液。 121. 如實施例116至120中任一項之方法，其中偵測步驟包含免疫學檢定或核酸擴增檢定。 122. 如實施例116至121中任一項之方法，其中該生物標誌物包含可偵測部分，在轉譯由靶位點編碼之多肽之後，該可偵測部分變得與由該靶位點編碼之該多肽融合。 123. 如實施例116至123中任一項之方法，其中該生物標誌物包含可偵測部分，在轉譯由該靶位點編碼之該多肽之後，該可偵測部分變得與由該有效負載編碼之該多肽融合。 124. 如實施例116至123中任一項之方法，其中該生物標誌物包含為2A肽之可偵測部分。 125. 如實施例124之方法，其中該2A肽選自由P2A、T2A、E2A及F2A組成之群。 126. 如實施例116至125中任一項之方法，其中該個體接受單劑量的該基因療法治療或基因整合組合物。 127. 如實施例116至126中任一項之方法，其中該偵測步驟在該個體接受該基因療法治療或基因整合組合物後1、2、3、4、5、6、7、8週或更長時間進行。 128. 如實施例116至127中任一項之方法，其中該偵測步驟在該個體接受該基因療法治療或基因整合組合物後的多個時間點進行。 129. 如實施例116至128中任一項之方法，其中該偵測步驟在該個體接受該基因療法治療或基因整合組合物後至少3個月之時段內進行。 130. 如實施例116至129中任一項之方法，其中該方法進一步包含監測該個體對該基因療法之自體免疫反應。 131. 一種組合物，其包含重組AAV構築體，該重組AAV構築體包含： 多核苷酸匣，其包含： 包含第一核酸序列及第二核酸序列之表現匣，其中該第一核酸序列與SEQ ID NO. 18、19、20、21或22具有80%序列一致性；且該第二核酸序列 (i) 位於該第一核酸序列之5'或3'；且 (ii) 在整合至細胞之基因體中之靶整合位點後促進產生兩種獨立的基因產物； 第三核酸序列，其位於該表現匣之5'且包含與細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列5'實質上同源的序列；以及 第四核酸序列，其位於表現匣之3'且包含與該細胞之基因體中之靶整合位點之基因體序列3'實質上同源的序列。 132. 如實施例131之組合物，其中該重組病毒載體為或包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。 133. 如實施例131或132之組合物，其中該組合物進一步包含選自SEQ ID NO: 27-30之AAV2 ITR序列及/或ITR序列。 134. 如實施例131至133之組合物，其中該第二核酸序列與SEQ ID NO. 6具有80%序列一致性。 135. 如實施例131至133之組合物，其中該第二核酸序列編碼與SEQ ID NO. 7具有90%序列一致性之P2A肽。 136. 一種重組AAV構築體，其包含有包含SEQ ID NO: 23之核酸序列。 137. 一種重組AAV構築體，其包含有包含SEQ ID NO: 24之核酸序列。 138. 一種重組AAV構築體，其包含有包含SEQ ID NO: 25之核酸序列。 139. 一種重組AAV構築體，其包含有包含SEQ ID NO: 26之核酸序列。 140. 一種組合物，其包含如實施例136至139中任一項之重組AAV構築體。 141. 一種將轉殖基因整合至個體組織中之至少一個細胞群之基因體中的方法，該方法包含向個體投與包含如實施例136至139中任一項之重組AAV構築體的組合物。 142. 一種組合物，其包含如實施例54至70之重組病毒載體。 143. 一種治療方法，其包含投與如實施例1、131或142中任一項之組合物，其中該組合物以1E12 vg/kg與1E14 vg/kg之間的劑量向個體投與。 144. 如實施例143之方法，其中該組合物以3E12 vg/kg與1E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。 145. 如實施例143之方法，其中該組合物以3E12 vg/kg與3E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。 146. 如實施例143之方法，其中該組合物以不多於3E13 vg/kg之劑量向個體投與。 147. 如實施例143之方法，其中該組合物以不多於3E12 vg/kg之劑量向個體投與。 148. 如實施例142至147中任一項之方法，其中該組合物僅投與一次。 149. 如實施例142至147中任一項之方法，其中該組合物投與多於一次。 150. 如實施例143至149中任一項之方法，其中該個體為新生兒。 151. 如實施例143至149中任一項之方法，其中該個體之年齡在0天與1個月之間。 152. 如實施例143至149中任一項之方法，其中該個體之年齡在3個月與1歲之間。 153. 如實施例143至149中任一項之方法，其中該個體之年齡在1歲與5歲之間。 154. 如實施例143至149中任一項之方法，其中該個體之年齡為5歲或更大。 等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所描述之本發明之特定實施例之許多等效物。本發明之範圍不意欲局限於上述說明書，而是如以下申請專利範圍所闡述。
圖1A至圖1I示出了用如本文所描述之療法治療HT1小鼠模型之結果。圖1A示出了示範性多核苷酸匣。圖1B示出了示範性療法時程。圖1C示出了對循環生物標誌物之評估。圖1D示出了經治療小鼠之體重變化。圖1E及圖1F示出了經治療小鼠之肝功能之標誌物。圖1G示出了用FAH抗體對肝臟樣品進行的免疫組織化學染色。圖1H示出了對向宿主基因體DNA (gDNA INT)中之整合之評估。圖1I示出了對作為肝細胞癌(HCC)之經臨床驗證之生前生物標誌物的α胎兒蛋白(AFP)之存在的評估。 圖2A至圖2E示出了用如本文所描述之療法治療HT1小鼠模型之結果及選擇性優勢。圖2A示出了示範性載體及治療方案。圖2B示出了對GENERIDE TM生物標誌物之評估。圖2C示出了經治療小鼠之存活率。圖2D及圖2E示出了經治療小鼠之肝功能之標誌物。 圖3A至圖3D示出了用如本文所描述之療法治療小兒HT1小鼠模型之結果。圖3A示出了治療時程。圖3B示出了對GENERIDE TM生物標誌物之評估。圖3C示出了經治療小鼠之體重變化。圖3D示出了經治療小鼠之AFP水準。 圖4A至圖4C示出了用如本文所描述之療法的HT1小鼠模型之各種治療方案之結果。圖4A示出了用各種治療方案對小鼠之治療。圖4B示出了對循環生物標誌物之評估。圖4C示出了經治療小鼠之肝功能之標誌物。 圖5示出了酪胺酸代謝途徑之示意圖。 圖6A至圖6F示出了NTBC循環之結果。圖6A示出了示範性研究設計。圖6B示出了在HT1中累積之毒性代謝物(SUAC)之水準；圖6C示出了肝損傷之標誌物(例如ALT)。圖6D示出了肝臟合成功能之標誌物(例如展示凝血時間之活化部分凝血激酶時間(activated partial thromboplastin time，aPTT))。圖6E示出了血糖水準。圖6F示出了小鼠之體重變化。 圖7A至圖7F示出了在不存在NTBC之情況下治療後28天期間的GENERIDE TM治療之結果。圖7A示出了對循環生物標誌物(例如ALB2A)之評估。圖7B示出了HT1相關毒性代謝物(例如SUAC)之累積。圖7C示出了肝功能之標誌物(例如ALT)。圖7D示出了凝血時間。圖7E示出了血糖水準。圖7F示出了經治療小鼠之體重變化。 圖8A至圖8D示出了治療後4個月內GENERIDE TM治療之結果。圖8A示出了示範性研究設計。圖8B示出了對循環生物標誌物(例如ALB2A) (左圖)及用抗FAH抗體對肝臟樣品進行免疫組織化學染色(右圖)之評估。圖8C示出了作為各種生物標誌物(例如天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)、丙麩胺酸轉移酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB))之量度的肝功能之評估。圖8D示出了作為各種生物標誌物(例如尿素氮(UREAN)、肌酸酐(CREAT))之量度的腎功能之評估。 圖9A至圖9E示出了治療後若干月內GENERIDE TM治療之結果。圖9A示出了示範性研究設計。圖9B示出了在HT1中累積之毒性代謝物(例如SUAC)。圖9C示出了對循環生物標誌物(例如ALB2A)之評估。圖9D示出了對作為肝細胞癌(HCC)之經臨床驗證之生前生物標誌物的α胎兒蛋白(AFP)的評估。圖9E示出了對酪胺酸水準之評估。 圖10A至圖10B示出了投與GENERIDE TM治療之小兒HT1小鼠模型之結果。圖10A示出了治療時程之示意圖。圖3B示出了在出生後第14天(PND14)治療之小鼠之α胎兒蛋白(AFP)水準。 圖11示出了在投與GENERIDE TM治療之小鼠中肝功能標誌物之示範性免疫組織化學染色。

Claims (50)

  1. 一種組合物，其包含： 閉合環狀cDNA整合基因療法構築體，該基因療法構築體自5'至3'包含編碼(a)長度在1 kb與1.6 kb之間的5'同源臂；(b)編碼P2A肽之P2A編碼序列；(c)治療性有效負載；及(d)長度在1 kb與1.6 kb之間的3'同源臂的多核苷酸序列，其中： 該治療性有效負載包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之轉殖基因序列； 該等同源臂序列促進該構築體經由同源重組在內源白蛋白靶位點處之整合，使得白蛋白基因座可導致同時產生白蛋白-2A及轉殖基因作為單獨的蛋白質。
  2. 如請求項1之組合物，其中該閉合環狀DNA包含序列SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中該閉合環狀DNA由以下序列組成：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26。
  4. 如上述請求項中任一項之組合物，其中該5'同源臂序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3。
  5. 如上述請求項中任一項之組合物，其中該3'同源臂序列包含SEQ ID NO: 2。
  6. 如上述請求項中任一項之組合物，其中該P2A編碼序列包含SEQ ID NO: 6。
  7. 如請求項6之組合物，其中該P2A編碼序列編碼包含SEQ ID NO: 7之肽。
  8. 如上述請求項中任一項之組合物，其中編碼FAH之該轉殖基因序列包含SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22。
  9. 如上述請求項中任一項之組合物，其中編碼FAH之該轉殖基因序列由以下組成：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22。
  10. 如上述請求項中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含AAV衣殼蛋白。
  11. 如請求項10之組合物，其中該AAV衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  12. 一種治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之方法，該方法包含向個體投與一劑包含以下之組合物： 閉合環狀cDNA整合基因療法構築體，該基因療法構築體自5'至3'包含編碼(a)長度在1 kb與1.6 kb之間的5'同源臂；(b)編碼P2A肽之P2A編碼序列；(c)治療性有效負載；及(d)長度在1 kb與1.6 kb之間的3'同源臂的多核苷酸序列，其中： 該治療性有效負載包含編碼延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之轉殖基因序列； 該等同源臂序列促進該構築體經由同源重組在內源白蛋白靶位點處之整合，使得白蛋白基因座可導致同時產生白蛋白-2A及轉殖基因作為單獨的蛋白質。
  13. 如請求項12之方法，其中該閉合環狀DNA包含序列SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26。
  14. 如請求項12或13之方法，其中該閉合環狀DNA由以下序列組成：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26。
  15. 如請求項12至14中任一項之方法，其中該5'同源臂序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3。
  16. 如請求項12至15中任一項之方法，其中該3'同源臂序列包含SEQ ID NO: 2。
  17. 如請求項12至16中任一項之方法，其中該P2A編碼序列包含SEQ ID NO: 6。
  18. 如請求項17之方法，其中該P2A編碼序列編碼包含SEQ ID NO: 7之肽。
  19. 如請求項12至18中任一項之方法，其中編碼FAH之該轉殖基因序列包含SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22。
  20. 如請求項12至18中任一項之方法，其中編碼FAH之該轉殖基因序列由以下組成：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22。
  21. 如請求項12至20中任一項之方法，其中該組合物進一步包含AAV衣殼蛋白。
  22. 如請求項21之方法，其中該AAV衣殼蛋白包含與AAV8、AAV-DJ、AAV-LK03、sL65或AAVNP59之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  23. 如請求項12至22中任一項之方法，其中該組合物以1E12 vg/kg與1E14 vg/kg之間的劑量向個體投與。
  24. 如請求項23之方法，其中該組合物以3E12 vg/kg與1E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。
  25. 如請求項23之方法，其中該組合物以3E12 vg/kg與3E13 vg/kg之間的劑量向個體投與。
  26. 如請求項23之方法，其中該組合物以不多於3E13 vg/kg之劑量向個體投與。
  27. 如請求項23之方法，其中該組合物以不多於3E12 vg/kg之劑量向個體投與。
  28. 如請求項12至27中任一項之方法，其中該組合物僅投與一次。
  29. 如請求項12至27中任一項之方法，其中該組合物投與多於一次。
  30. 如請求項12至27中任一項之方法，其中該個體為新生嬰兒。
  31. 如請求項12至27中任一項之方法，其中該個體之年齡在0天與1個月之間。 [請求項30] 如請求項12至27中任一項之方法，其中該個體之年齡在3個月與1歲之間。 [請求項31] 如請求項12至27中任一項之方法，其中該個體之年齡在1歲與5歲之間。
  32. 如請求項12至27中任一項之方法，其中該個體之年齡為5歲或更大。
  33. 一種閉合環狀DNA，其由多核苷酸序列組成，該多核苷酸序列由SEQ ID NO: 23組成。
  34. 一種閉合環狀DNA，其由多核苷酸序列組成，該多核苷酸序列由SEQ ID NO: 24組成。
  35. 一種閉合環狀DNA，其由多核苷酸序列組成，該多核苷酸序列由SEQ ID NO: 25組成。
  36. 一種閉合環狀DNA，其由多核苷酸序列組成，該多核苷酸序列由SEQ ID NO: 26組成。
  37. 一種靶向肝臟的重組經工程改造之腺相關病毒載體，其用於治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)且編碼人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)，該病毒載體包含閉合環狀cDNA多核苷酸序列，該多核苷酸序列包含： 包含SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22之編碼功能性FAH之人類FAH多核苷酸序列，其前面為包含SEQ ID NO: 7之編碼2A-肽之2A-肽序列； 該人類FAH多核苷酸序列及該2A-肽序列一起由包含SEQ ID NO: 2之3'同源臂多核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之5'同源臂多核苷酸序列側接。
  38. 一種靶向肝臟的重組經工程改造之腺相關病毒載體，其編碼人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)或其經密碼子最佳化之變異體，該人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶或其經密碼子最佳化之變異體前面為2A-肽編碼序列且由跨越白蛋白終止密碼子之基因同源臂側接以促進在載體基因體中不需要外源核酸酶或啟動子之情況下的位點特異性同源重組，該病毒載體由閉合環狀cDNA多核苷酸序列組成， 該閉合環狀cDNA多核苷酸序列包含編碼功能性人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之治療性轉殖基因序列，該治療性轉殖基因序列前面為2A-肽編碼序列，它們一起由各自長度為1.0 kb至1.6 kb之該等基因同源臂側接，該等同源臂由5'同源臂序列及3'同源臂序列組成。
  39. 如請求項38之腺相關病毒載體，其中： 該5'同源臂序列由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3組成；且 該3'同源臂序列由SEQ ID NO: 2組成；且 該P2A編碼序列編碼包含SEQ ID NO: 7之肽。
  40. 如請求項38至39中任一項之腺相關病毒載體，其中編碼人類FAH或其經密碼子最佳化之變異體之該轉殖基因序列為包含SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22之cDNA序列。
  41. 如請求項40之腺相關病毒載體，其中編碼FAH之該轉殖基因序列由SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22組成。
  42. 一種治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效劑量之靶向肝臟的重組經工程改造之腺相關閉合環狀cDNA病毒載體，該病毒載體表現功能性治療性人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)，該人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶前面為2A-肽編碼序列且由跨越白蛋白終止密碼子之1.0 kb及1.6 kb的基因同源臂側接，以促進在載體基因體中沒有外源核酸酶或啟動子之情況下的位點特異性同源重組，其中該等同源臂序列促進該構築體經由同源重組在內源白蛋白靶位點處之整合，使得白蛋白基因座可導致同時產生白蛋白-2A及該人類FAH作為單獨的蛋白質。
  43. 如請求項42之方法，其中編碼人類FAH之治療性轉殖基因序列由SEQ ID NO: 20組成。
  44. 如請求項42之方法，其中編碼人類FAH之治療性轉殖基因序列由SEQ ID NO: 21組成。
  45. 如請求項42之方法，其中編碼人類FAH之治療性轉殖基因序列由SEQ ID NO: 22組成。
  46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中各基因同源臂獨立地為1.0 kb或1.6 kb。
  47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該等基因同源臂由5'同源臂序列及3'同源臂序列組成，且 該5'同源臂序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3；且 該3'同源臂序列包含SEQ ID NO: 2。
  48. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該重組經工程改造之腺相關閉合cDNA病毒載體包含編碼SEQ ID NO: 7之肽的P2A編碼序列。
  49. 如請求項42至48中任一項之方法，其中該P2A編碼序列包含SEQ ID NO: 6。
  50. 一種治療1型遺傳性酪胺酸血症(HT1)之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效劑量之編碼人類延胡索醯乙醯乙酸水解酶(FAH)的靶向肝臟的重組經工程改造之腺相關病毒載體，該病毒載體包含cDNA多核苷酸序列，該cDNA多核苷酸序列包含 編碼功能性人類FAH之FAH多核苷酸序列，該FAH多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 22，該FAH多核苷酸序列前面為編碼包含SEQ ID NO: 7之2A-肽的2A-肽序列； 該FAH多核苷酸序列及2A-肽序列一起由包含SEQ ID NO: 2之3'同源臂多核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之5'同源臂多核苷酸序列側接。
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