JP7128190B2

JP7128190B2 - ウィルソン病を処置するための遺伝子療法

Info

Publication number: JP7128190B2
Application number: JP2019535891A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン，ジェームス・エム; シドレーン，ジェニー・アグネス; ゴヴィンダサミイ，ラクシュマナン
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: EP3562514A4; US20190338310A1; CN110290814A; KR102604096B1; WO2018126116A1; CA3048044A1; BR112019013245A2; MX2019007873A; JP2020514286A; EP3562514A1; EP4361277A3; US11473106B2; EP4361277A2; KR20230160411A; KR20190101410A; US20220389455A1

Description

電子形態で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書と共に電子形態で提出された配列表資料を参照することにより本明細書に組み込む。このファイルは「ＵＰＮ－１６－７９４０ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称である。

１．導入
本出願は、ウィルソン病を処置するための遺伝子療法で有用な実施形態に関する。

２．背景
本出願は、ウィルソン病を処置するための遺伝子療法で有用な実施形態に関する。ウィルソン病は、第１３染色体上の銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）遺伝子の突然変異に起因する、常染色体劣性の遺伝性障害である銅蓄積障害である。銅が組織中に蓄積すると、典型的には１２歳から２３歳の間に観察される神経症状または精神症状及び肝疾患として顕在化する。高い銅レベルは、適切な処置がなければ、やがて重篤な臓器損傷を引き起こし得る。

ウィルソン病の現在の処置アプローチは、キレート剤（ペニシラミン［Ｃｕｐｒｉｍｉｎｅ］及び塩酸トリエンチン［Ｓｙｐｒｉｎｅ］）、亜鉛（腸細胞による銅の吸収を遮断するため）、及び循環中のアルブミンと錯体を形成する銅キレート薬であるテトラチオモリブデート（ＴＭ）を用いる連日経口療法であり、これには、罹患した個体がその生涯にわたって薬を服用することが必要である。更に、こうした処置は、薬物誘導性ループス、筋無力症、逆説的悪化などの副作用を引き起こす場合があり、正常な銅代謝を回復させない。肝臓移植はウィルソン病の治癒に有効であるが、移植レシピエントは、拒絶反応を防止するために不断の免疫抑制レジメンを維持することが必要である。

３．概要
本明細書に記述される実施形態は、ベクターの静脈内（ＩＶ）投与後、長期間、ことによると１０年以上にわたり、ウィルソン病（「ＷＤ」）の臨床的に意義のある是正をもたらす、それを必要とする対象に正常なヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）を送達するためのＡＡＶ遺伝子療法ベクターに関する。ベクター用量は、循環銅レベルを約２５％以上低下させる血中レベルのＡＴＰ７Ｂを送達するよう意図される。一実施形態において、循環銅のレベルは、尿中の銅の排泄量によって評価される。別の実施形態では、血漿中の循環銅のレベルが評価される。

一態様において、本出願は、ＷＤと診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を提示する。ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂ」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列のサイズのため、効果的な発現を可能にする制御エレメントの選択が重要である。導入遺伝子の発現が十分でなければ、異常の
是正に必要なベクター投与量は、高すぎて実用的でないものになる。したがって、本明細書に記述されるように、例えばエンハンサー、プロモーター、及びポリＡの選択は重要である。

一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列は配列番号１に示されている。一実施形態において、ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列は配列番号２に示されている。ｈＡＴＰ７Ｂのコーディング配列は、一実施形態では、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。このような配列は、天然のｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列（配列番号３）と８０％未満の同一性を共有し得る。一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、配列番号１に示されているものである。

別の態様において、本明細書では、ＷＤ患者への投与に好適な、本明細書に記述されるｒＡＡＶを含む水性サスペンションが提示される。一部の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液と、１ｍＬあたり約１×１０^１２～約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶとを含む。サスペンションは、一実施形態では静脈内注射に好適である。他の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む。

別の実施形態において、本明細書では、ＷＤを有する患者を本明細書に記述されるｒＡＡＶで処置する方法が提示される。一実施形態では、水性サスペンションにおいて、患者の体重１ｋｇあたり約１×１０^１１～約３×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶが患者に送達される。

図１は、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ベクターの概略表現である。図２Ａ及び図２Ｂは、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおける尿中及び血清中の銅レベルが経時的に上昇することを示す。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおける経時的な（Ａ）尿中銅レベル及び（Ｂ）血清銅レベル（黒色）。ヘテロ接合性同腹仔（Ｈｅｔ）を対照とした（灰色）。自然史研究で試料を毎週収集し、誘導結合型プラズマ質量分析を行って、銅レベルを評価した。図３Ａ～図３Ｃは、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの尿中銅レベル、血清銅レベル、及び肝疾患スコアを示す。誘導結合型プラズマ質量分析により、雄及び雌のヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスならびにＡｔｐ７ｂＫＯマウス（ＫＯ）の経時的な（Ａ）尿中銅レベル及び（Ｂ）血清銅レベルを評価した。（Ｃ）２月齢、３月齢、４月齢、５月齢、９月齢、１０月齢、及び１２月齢でＡｔｐ７ｂＫＯマウスを剖検した。肝臓を採取し、Ｈ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図４は、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおけるＴｉｍｍ染色を示す。識別番号１３４５の２月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓における、Ｔｉｍｍ染色による銅染色の代表的結果。黒色沈着物は、銅に対する陽性染色を示す。識別番号３０７の３．７月齢の野生型マウスを陰性対照とした。図５は、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおいて肝疾患が経時的に発生することを示す。２月齢、３月齢、４月齢、５月齢、９月齢、１０月齢、及び１２月齢でＡｔｐ７ｂＫＯマウスを剖検し、肝臓を採取して肝疾患を評価した。線維症及び銅の蓄積を含む肝臓病変の組織病理学的評価のため、Ｈ＆Ｅ染色、ＳｉｒｉｕｓＲｅｄ染色、及びＴｉｍｍ染色を行った。＊は、１２月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓における再生の領域である。ＷＴは、Ｔｉｍｍ染色により見られる銅の蓄積の陰性対照としての野生型マウスから得た切片である。図６Ａ～図６Ｃは、８月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清化学値を示す。８月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウス（ＫＯ）及びヘテロ接合性マウス（Ｈｅｔ）における、（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、及び（Ｃ）総ビリルビンレベル。図７は、８月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝疾患を示す。Ａｔｐ７ｂＫＯマウス及びヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスを８月齢時に剖検した。肝臓を採取し、Ｈ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図８Ａ及び図８Ｂは、８月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝線維症及び銅の蓄積を示す。Ａｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウス及びヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスを８月齢時に剖検した。肝臓を採取し、線維症及び銅の蓄積の評価のため、それぞれＳｉｒｉｕｓＲｅｄ及びＴｉｍｍ染色で染色した。（Ａ）線維症及び（Ｂ）銅の蓄積を含む肝臓病変の組織病理学的評価を、１～５のスコアリングシステムに従って行った。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図９は、８月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝臓銅レベルを示す。Ａｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウス及びヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスを８月齢時に剖検した。肝臓を採取し、誘導結合型プラズマ質量分析によって肝臓銅レベルを評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図１０Ａ～図１０Ｃは、ＡＡＶ８遺伝子療法が、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの正常な肝臓の銅代謝を回復させ得ることを示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏを１０^１１ＧＣ／マウス及び１０^１０ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射し、雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、同じベクターを１０^１１、１０^１０、及び１０^９ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射した。（Ａ）雄及び（Ｂ）雌における血清銅レベルを誘導結合型プラズマ質量分析によって評価し、同齢の雄及び雌のヘテロ接合性（ｈｅｔ）マウスならびにＡｔｐ７ｂＫＯマウスの血清銅レベルと比較した。マウスを９月齢時に剖検し、肝臓を採取した。（Ｃ）誘導結合型プラズマ質量分析によって肝臓銅レベルも評価し、同齢で未注射のヘテロ接合性（ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。ｎｓは有意差なし、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。図１１は、高用量のＡＡＶ８遺伝子療法が、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝疾患の発生を防止することを示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏを１０^１１ＧＣ／マウス及び１０^１０ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射し、雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、同じベクターを１０^１１、１０^１０、及び１０^９ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射した。マウスを９月齢時に剖検し、肝臓を採取して肝疾患を評価した。線維症及び銅の蓄積を含む肝臓の組織病理学的病変を評価するため、Ｈ＆Ｅ染色、ＳｉｒｉｕｓＲｅｄ染色、及びＴｉｍｍ染色を行った。同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスの画像を比較のために含めてある（図２にも提示した）。ＷＴは、Ｔｉｍｍ染色により見られる銅の蓄積の陰性対照としての野生型（ＷＴ）マウスから得た切片である。ＫＯは、Ｔｉｍｍ染色により見られる銅の蓄積の陽性対照としての２月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスから得た切片である。図１２Ａ～図１２Ｃは、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおける高用量ＡＡＶ８遺伝子療法後の肝疾患の防止の数量化を示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏを１０^１１ＧＣ／マウス及び１０^１０ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射し、雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、同じベクターを１０^１１、１０^１０、及び１０^９ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射した。マウスを９月齢時に剖検し、組織学的評価のために肝臓を採取した。（Ａ）肝臓切片をＨ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した。（Ｂ）肝臓切片をＳｉｒｉｕｓＲｅｄで染色し、１～３のスコアリングシステムに従って線維症の評価を行い、（Ｃ）１～５のスコアリングシステムに従って銅の蓄積を評価するために、肝臓切片のＴｉｍｍ染色を行った。平均±ＳＥＭとして表してある値は、同齢で未注射のヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較した。ｎｓは有意差なし、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。図１３Ａ～図１３Ｃは、ＡＡＶ８遺伝子療法後のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清化学レベルを示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏを１０^１１ＧＣ／マウス及び１０^１０ＧＣ／マウスでＩＶ注射し、雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、同じベクターを１０^１１、１０^１０、及び１０^９ＧＣ／マウスでｉ．ｖ．注射した。血清中の（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、及び（Ｃ）総ビリルビンレベルを評価した。図１４は、ウェスタンブロットによるセルロプラスミンの検出を示す。マウス１匹あたり１０^１０または１０^１１ＧＣのＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５をｉ．ｖ．注射したＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける、銅結合形態（ホロ、下のバンド）及び銅非結合形態（アポ、上のバンド）のセルロプラスミンを検出したウェスタンブロット。投与後２１日目に血液試料を収集した。タンパク質マーカーを比較のために中央レーンに提示した。ベクター注射なしのＡｔｐ７ｂＫＯ同腹仔及びヘテロ接合性（ｈｅｔ）同腹仔を対照とした（１３１８、６月齢ｈｅｔ；１３１３、６月齢Ａｔｐ７ｂＫＯ；３８８、Ａｔｐ７ｂＫＯ）。図１５Ａ及び図１５Ｂは、ＡＡＶ８ベクターを投与した雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清銅レベルを示す。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（円形、ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；正方形、Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；上向き三角形、Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；逆三角形、ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ひし形、Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウス及びヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウスを対照とした。誘導結合型プラズマ質量分析により、（Ａ）雌及び（Ｂ）雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清銅レベルを評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図１６Ａ～図１６Ｃは、ＡＡＶ８ベクターを投与した雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清化学を示す。雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。血清中の（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、及び（Ｃ）総ビリルビンレベルを評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図１７は、ウェスタンブロットによって決定された、肝臓におけるＡＴＰ７Ｂｃｏ発現量を示す。雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与し、６月齢時に殺処分した。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおけるＡＴＰ７Ｂを検出したウェスタンブロットを、バンド濃度測定によって数量化した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図１８は、ＡＡＶ８ベクターを投与した雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝疾患を示す。雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与し、６月齢時に殺処分した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。肝臓切片をＨ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図１９Ａ及び図１９Ｂは、ＡＡＶ８ベクターを投与した雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝線維症及び銅の蓄積を示す。雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与し、６月齢時に殺処分した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。（Ａ）肝臓切片をＳｉｒｉｕｓＲｅｄで染色し、１～３のスコアリングシステムに従って線維症の評価を行い、（Ｂ）１～５のスコアリングシステムに従って銅の蓄積を評価するために、肝臓切片のＴｉｍｍ染色を行った。平均±ＳＥＭとして表してある値は、同齢で未注射のヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した。図２０は、ＡＡＶ８ベクターを投与した雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝臓銅レベルを示す。雌及び雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与し、６月齢時に殺処分した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。誘導結合型プラズマ質量分析によって肝臓銅レベルを評価し、同齢で未注射のヘテロ接合性（ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図２１は、ＡＡＶ８ベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおけるセルロプラスミンのウェスタンブロットによる検出を示す。様々なエンハンサー／プロモーターの組み合わせを有するｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（１、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；２、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；３、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５；４、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける、銅結合形態（ホロ、下のバンド）及び銅非結合形態（アポ、上のバンド）のセルロプラスミンを検出したウェスタンブロット。投与後２１日目に血液試料を収集した。タンパク質マーカーを比較のために中央レーンに提示した。ベクター注射なしのＡｔｐ７ｂＫＯ同腹仔、ヘテロ接合性（ｈｅｔ）同腹仔、及び野生型（ＷＴ）同腹仔を対照とした（１３１３、６月齢Ａｔｐ７ｂＫＯ；１３１８、６月齢ｈｅｔ；１３４５、２月齢Ａｔｐ７ｂＫＯ；１９４５、ＷＴ）。図２２は、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清銅レベルを示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。誘導結合型プラズマ質量分析によって血清銅レベルを評価し、ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯマウス（ＫＯ）と経時的に比較した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図２３Ａ～図２３Ｃは、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける血清化学を示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。マウスを６月齢時に剖検し、血清中の（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、及び（Ｃ）総ビリルビンレベルを評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図２４は、ウェスタンブロットによって決定された、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂｃｏ発現量を示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。マウスを６月齢時に剖検した。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおけるＡＴＰ７Ｂを検出したウェスタンブロットを、バンド濃度測定によって数量化した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図２５は、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝疾患を示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。マウスを６月齢時に剖検した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。肝臓切片をＨ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した。値は平均±ＳＥＭとして表してある。図２６Ａ及び図２６Ｂは、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝線維症及び銅の蓄積を示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。マウスを６月齢時に剖検した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。（Ａ）肝臓切片をＳｉｒｉｕｓＲｅｄで染色し、１～３のスコアリングシステムに従って線維症の評価を行い、（Ｂ）１～５のスコアリングシステムに従って銅の蓄積を評価するために、肝臓切片のＴｉｍｍ染色を行った。平均±ＳＥＭとして表してある値は、同齢で未注射のヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した。図２７は、ＡＡＶ８トランケート型ＡＴＰ７Ｂベクターを投与した雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝臓銅レベルを示す。雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスに、様々なトランケート型バージョンのｈＡＴＰ７Ｂｃｏの発現のためのＡＡＶ８ベクター（ＭＢＤ１Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ３Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ３Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－２Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－４Ｄｅｌ．ＰＡ７５；ＴＢＧ－ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏＭＢＤ１－５Ｄｅｌ．ＰＡ７５）を３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。マウスを６月齢時に剖検した。ビヒクル対照を投与したＡｔｐ７ｂＫＯ（ＰＢＳ）マウスを対照とした。誘導結合型プラズマ質量分析によって肝臓銅レベルを評価し、同齢で未注射のヘテロ接合性（ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した。平均±ＳＥＭとして表してある値は、同齢で未注射のヘテロ接合性（Ｈｅｔ）マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯ（ＫＯ）マウスと比較した。

４．詳細な説明
本出願に記述される実施形態は、ウィルソン病（ＷＤ）と診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂ」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。

本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ８カプシド」とは、参照により本明細書に組み込まれているＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０．１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＡＡＶ８カプシドを指す。このコードされる配列からのある程度の差異が許容され、これには、ＹＰ＿０７７１８０．１及びＷＯ２００３／０５２０５１（これは参照により本明細書に組み込まれている）における参照アミノ酸配列と約９９％の同一性（すなわち、参照配列からの約１％未満の差異）を有する配列が含まれ得る。カプシドひいてはコーディング配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法については記述されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１５／０３１５６１２を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「ＮＡｂ力価」とは、標的となるエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理的効果を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶＮａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶＮＡｂ力価は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，ＷｏｒｌｄｗｉｄｅＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記述されているように測定することができる。

アミノ酸配列との関連における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「パーセント同一」という用語は、２つの配列のうち、対応するようにアラインされたときに同じである残基を指す。同一性パーセントは、タンパク質の完全長にわたるアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそれらのペプチド断片、または対応する核酸配列コーディングシーケンサーについて容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸長であってよく、最長約７００アミノ酸であり得る。概して、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を参照するとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインされた」配列に関して決定されたものである。「アラインされた」配列または「アライメント」とは、多くの場合、参照配列と比較した塩基またはアミノ酸の欠失または付加に対する補正を含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、公的または商業的に利用可能な様々なＭｕｌｔｉｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列には、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ」、「ＣｌｕｓｔａｌＸ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムといった配列アライメントプログラムが利用可能である。概し
て、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じてこれらの設定を変更することができる。代替的には、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるレベルの同一性またはアライメントを少なくとも提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用してもよい。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するようにトランスに、すなわち離れて作用する発現制御配列との両方を指す。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされている合成または人工のウイルス粒子で、同様にウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされているあらゆるウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわち子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持するものを指す。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製するのに必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（このゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに挟まれた目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス」であるように工学操作されていてよい）、これらの遺伝子は産生中に供給されてもよい。したがって、これは遺伝子療法に使用するのに安全であるとみなされる。子孫ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いては起こり得ないためである。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という言葉、及びその変化形は、包括的ではなく排他的に解釈されるものとする。本明細書における種々の実施形態は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という文言を使用して解釈され、かつ記述されていることも意図される。

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、別途指定しない限り、与えられている基準から１０％の変動を意味する。

本明細書において別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解し、また本出願において使用される用語の多くに関する一般的指針を当業者に提供する公開文献の参照により理解されるものと同じ意味を有する。

５．１遺伝子療法ベクター
一態様では、遺伝子療法において使用するためのヒトＡＴＰ７Ｂ遺伝子を搭載した組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提示される。ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクターは、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御される
べきである。ベクターは、ヒト対象への注入に好適なバッファー／担体において製剤化される。バッファー／担体には、ｒＡＡＶが注入チューブに固着することを防止するが、インビボでｒＡＡＶ結合活性に干渉しない成分が含まれているべきである。

５．１．１．ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクター
５．１．１．１．ｈＡＴＰ７Ｂ配列
ウィルソン病は、銅輸送Ｐ型ＡＴＰａｓｅをコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子の突然変異によって主に引き起こされる遺伝性代謝異常である。ＡＴＰ７Ｂは、銅を細胞内シャペロンタンパク質から分泌経路に輸送し、胆汁に排泄し、また、アポセルロプラスミンに組み込んで機能的なセルロプラスミンを合成するのに関与している。ウィルソン病の発生は、患部組織における銅の蓄積に起因する。参照により本明細書に組み込まれている、ＥＡＳＬ
ＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｗｉｌｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＥＡＳＬＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，５６（６７１－８５）を参照されたい。

ウィルソン病の臨床的特徴はカイザー・フライシャー輪であり、これは、神経症状のある患者の９５％及び神経症状のない者の半分をやや超える患者に存在する。神経学的徴候は不定であり、ほとんどの場合は振戦、運動失調、及びジストニアである。ウィルソン病患者は、あらゆるタイプの肝疾患を経験し得る。臨床的に明らかな肝疾患は、早ければ神経学的兆候の１０年前に起こる場合があり、神経症状のあるほとんどの患者は、ある程度の肝疾患を発症時に有する。肝疾患の主症状は、生化学的異常のみで無症候性のものから、その全ての合併症を伴う明白な硬変まで、大きくばらつき得る。ウィルソン病は、場合によりクームス陰性溶血性貧血及び急性腎不全が付随する急性肝不全として現れることもある。以下の表１は、ＷＤの予後指数を提示する（参照により本明細書に組み込まれている、ＥＡＳＬＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｗｉｌｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＥＡＳＬＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，５６（６７１－８５）を参照されたい）。

^＊＝スコアポイント、ＡＳＴの正常上限＝２０ＩＵ／ｍｌ（Ｋｉｎｇ’ｓＣｏｌｌｅｇｅにて）。≧１１のスコアは、肝臓移植なしの高い死亡確率に関連付けられる。

ＡＴＰ７Ｂは、細胞膜を通る銅の移動のための経路を形成する８つの膜貫通ドメインと、およそ７０アミノ酸及び高度に保存された金属結合モチーフＧＭｘＣｘｘＣ（ここでｘは任意のアミノ酸である）を各々が含む６つの金属結合ドメイン（ＭＢＤ）をもつ大きなＮ末端とを有する。他のドメインには、膜を通る銅の移動に必要な膜内ＣＰＣモチーフ、ＡＴＰ結合部位を含有するＮドメイン、保存されたアスパラギン酸残基を含有するＰドメイン、及びホスファターゼドメインを含むＡドメインが含まれる。ウィルソン病患者の一部または全てに存在する、ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子及び／または結果として生じるタンパク質における種々の突然変異が公知である。ＷＢに寄与する公知の突然変異の完全なリストは
、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５６７０にて確認することができ、これは参照により本明細書に組み込まれている。更に、カノニカル配列（アイソフォームａとも呼ばれ、最長のアイソフォームである；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００００４４．２）に加えて、４つの更なるアイソフォーム：ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１００５９１８．１、ＮＰ＿００１２３０１１１．１、ＮＰ＿００１３１７５０７．１、ＮＰ＿００１３１７５０８．１が公知であり、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に記述される組成物及び方法は、疾患を引き起こすいずれかのＡＴＰ７Ｂバリアントタンパク質を有する対象を処置するために使用され得る。

一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、配列番号２に示されるｈＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。したがって、一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれている添付の配列表に提示されている配列番号１または配列番号３により提示される配列を含み得るが、これらに限定されない。配列番号３は、天然のヒトＡＴＰ７ＢのｃＤＮＡを提示する。配列番号１は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化された、工学操作されたヒトＡＴＰ７ＢのｃＤＮＡ（本明細書では場合によりｈＡＴＰ７Ｂｃｏと呼ばれる）を提示する。本明細書におけるｈＡＴＰ７Ｂへの言及は、一部の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂの天然配列もしくはコドン最適化配列、または本明細書に記述されるバリアントのうちのいずれかを指し得ることを理解されたい。代替的には、または更に、ウェブベースまたは商業的に利用可能なコンピュータプログラム、ならびにサービスベースの企業を利用して、両ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡを含む核酸コーディング配列にアミノ酸配列を逆翻訳してもよい。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）、ＧｅｎｅＩｎｆｉｎｉｔｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ－／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、ＥｘＰａｓｙ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。所望の標的対象における発現のために（例えば、コドン最適化によって）最適化されている核酸配列を含め、記述されるｈＡＴＰ７Ｂポリペプチド配列をコードする全ての核酸が包含されることが意図される。

ＡＴＰ７Ｂの天然コーディング配列は４．３ｋｂ超（配列番号３；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＭ＿００５２６６４３０）であり、アミノ酸数１４６５のタンパク質（配列番号２）をもたらす。ＡＴＰ７Ｂの大きなサイズ及びＡＡＶベクターを含むウイルスベクターのパッケージング能が理由で、一部の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列を短縮することが望ましい。初めの５つのＭＢＤの欠失は、結果として生じるタンパク質の触媒的リン酸化を、野生型と一致するレベルで示したことが示されている。参照により本明細書に組み込まれている、ＨｕｓｔｅｒａｎｄＬｕｔｓｅｎｋｏ，Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ，Ｊｕｎｅ２００３を参照されたい。したがって、一実施形態において、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、１つ以上のＭＤＢを欠失させることによって短縮される。一実施形態において、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１～２が欠失している（例えば、配列番号１７及び配列番号３５のｎｔ４０３～ｎｔ４３６８に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１～３が欠失している。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１～４が欠失している（例えば、配列番号１８、及び配列番号３４のｎｔ４０３～ｎｔ３７６２、及び配列番号２９のｎｔ１０５９～ｎｔ４４１８に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１～５が欠失している（例えば、配列番号１９、配列番号３３のｎｔ４０３～ｎｔ３３６９、及び配列番号２８のｎｔ１０５９～ｎｔ４０２５に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１が欠失している（例えば、配列番号２０及び配列番号３２のｎｔ４０３～ｎｔ４６８６に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ２が欠失している（例えば、配列番号２１及び配列番号３１のｎｔ４０３～ｎｔ４６１７に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ３が欠失している（例
えば、配列番号２２及び配列番号３０のｎｔ４０３～ｎｔ４７１９に示されている通り）。別の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列は、ＭＢＤ１～４及び６が欠失している（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＣａｔｅｒｅｔａｌ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２００４Ｊｕｎ１５；３８０（Ｐｔ３）：８０５－８１３に記述されている通り）。また、Ｇｏｕｒｄｏｎｅｔａｌ，ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０１２Ａｐｒ；３９３（４）：２０５－１６、Ｌｕｔｓｅｎｋｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．（２００７）．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃｏｐｐｅｒ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇＡＴＰａｓｅｓ．”Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｓ８７（３）：１０１１－１０４６、Ｓａｆａｅｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２０１３）．“Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｅｔａｌｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｏｆＡＴＰ７Ｂ．”Ｍｅｔａｌｌｏｍｉｃｓ５（８）：９６４－９７２、及び米国特許公開第２０１５／００４５２８４号も参照されたい。これらは各々、参照により本明細書に組み込まれている。

一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は、配列番号３もしくは配列番号１の天然ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列、または配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２に示されているバリアントのうちのいずれかと、少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は、配列番号３もしくは配列番号１の天然ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列、または配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２に示されているバリアントのうちのいずれかと、少なくとも９０、８５、８０、７５、７０、または６５％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は、配列番号３もしくは配列番号１の天然ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列、または配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２に示されているバリアントのうちのいずれかと、約７９％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号１である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号１７である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号１８である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号１９である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号２０である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号２１である。別の実施形態では、ｈＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列は配列番号２２である。

コドン最適化されたコーディング領域は、種々の異なる方法によってデザインすることができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、または例えばＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）のようなコドン最適化サービスを提供する企業を利用して行ってもよい。コドン最適化アプローチの１つは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記述されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながら一部の実施形態では、ＯＲＦの断片のみを変更してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、このポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸断片を産生することができる。

コドンの実際の変更を行うため、または本明細書に記述されるようにデザインされたコドン最適化コーディング領域を合成するためには、いくつかの選択肢が利用可能である。このような改変または合成は、当業者に周知の標準的かつルーチン的な分子生物学的操作
を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各々８０～９０ヌクレオチド長であり所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対を、標準的方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、付着末端を含有する８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。例えば、対における各オリゴヌクレオチドは、対における他方のオリゴヌクレオチドに対して相補的である領域を、塩基３個分、４個分、５個分、６個分、７個分、８個分、９個分、１０個分、またはそれ以上超えて伸びるように合成される。各オリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端とアニールするようにデザインする。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次に、一本鎖の付着末端を介してこれらの二本鎖断片のうちおよそ５～６つを一緒にアニールさせてから、それらを一緒にライゲートし、標準的な細菌クローニングベクター、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次に、この構築物を標準的方法によってシーケンシングする。８０～９０塩基対の断片が５～６つ一緒にライゲートされた断片（すなわち約５００塩基対の断片）からなる、こうした構築物をいくつか調製することで、一連のプラスミド構築物において所望の配列全体が表されるようにする。次に、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲートして、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、シーケンシングする。更なる方法は、当業者にはすぐに明らかになるであろう。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。

本明細書に記述される療法の目標は、血清銅レベルを２５％以上低下させる機能的なＡＴＰ７Ｂ酵素をもたらすことである。一実施形態では、２４時間あたり３～８μｍｏｌ以下の尿中銅排泄量が望ましい。

本明細書に記述される療法の一次／二次目標としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
・血清セルロプラスミン非結合銅（ＮＣＣ）の正常化（＜１５０μｇ／Ｌ）
・血清アミノトランスフェラーゼの正常化（肝臓生化学検査、ＡＬＴ／ＡＳＴ）
・尿中Ｃｕの正常化（＜４０μｇ／２４時間（０．６μｍｏｌ／２４時間）ＵＬＮ）
・血清セルロプラスミンの正常化（＞２００ｍｇ／Ｌ）［不定であってよい］
・医師の全般的印象（ＣｌｉｎｉｃｉａｎＧｌｏｂａｌＩｍｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＧＩ）スケールの改善（１：重症度＆２：全般的改善）
・ＡＥの発生率
探索的：
・^６５Ｃｕ、質量分析により検出することができる銅の非放射性同位体
・ＩＱ、認知神経科学的機能、及び精神医学的機能の改善（ＵｎｉｆｉｅｄＷｉｌｓｏｎ’ｓＤｉｓｅａｓｅＲａｔｉｎｇＳｃａｌｅ（ＵＷＤＲＳ）＆ＭｉｎｉＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＮｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃＩｎｔｅｒｖｉｅｗ（Ｍ．Ｉ．Ｎ．Ｉ．））、及び
・ＰＲＯ（ＥＱ５Ｄ、ＭＭＡＳ－８、ＴＳＱＭ）。

一実施形態において、「対象」または「患者」は、上述のようにＷＤを有する哺乳動物対象である。いかなる重症度のＷＤを有する患者も、意図される対象であることが意図される。

５．１．１．２．ｒＡＡＶベクター
ＡＴＰ７Ｂは肝臓で天然に発現するため、肝臓への指向性を示すＡＡＶを使用することが望ましい。一実施形態において、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ８である。別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．１０である。更に別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、クレードＥのＡＡＶである。このようなＡＡＶに
は、ｒｈ．２；ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；ｂｂ．１、ｂｂ．２、ｐｉ．１、ｐｉ．２、ｐｉ．３、ｒｈ．３８、ｒｈ．４０、ｒｈ．４３、ｒｈ．４９、ｒｈ．５０、ｒｈ．５１、ｒｈ．５２、ｒｈ．５３、ｒｈ．５７、ｒｈ．５８、ｒｈ．６１、ｒｈ．６４、ｈｕ．６、ｈｕ．１７、ｈｕ．３７、ｈｕ．３９、ｈｕ．４０、ｈｕ．４１、ｈｕ．４２、ｈｕ．６６、及びｈｕ．６７が含まれる。このクレードは、改変されたｒｈ．２、改変されたｒｈ．５８、及び改変されたｒｈ．６４を更に含む。参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。しかしながら、肝臓指向性のあるいくつかのｒＡＡＶベクターのうち、いずれを使用してもよい。

下記の実施例に記述される特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５と呼ばれるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ－Ｓ１）プロモーターの制御下でｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクターである。外部のＡＡＶベクター成分は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３種のＡＡＶウイルスタンパク質の１：１：１０の比における６０個のコピーからなる、血清型８、Ｔ＝１の正二十面体カプシドである。このカプシドは、一本鎖ＤＮＡｒＡＡＶベクターゲノムを含有する。

一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂゲノムは、２つのＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれたｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子を含有する。一実施形態において、ｈＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのうちの１つ以上を含む。これらの制御配列は、ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子配列に「作動可能に連結している」。これらの配列を含有する発現カセットは、ウイルスベクターの産生に使用されるプラスミドに、工学操作によって載せてもよい。

ＩＴＲは、ベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝子エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要な唯一のウイルスシスエレメントである。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするために必要な最小限の配列はＡＡＶ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲであり、これらは、カプシドと同じＡＡＶ起源をもっていてもよいし、異なるＡＡＶ起源をもっていてもよい（ＡＡＶシュードタイプを産生するため）。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源に由来するＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源に由来する場合、結果として生じるベクターは、シュードタイプ型と呼ばれる場合がある。典型的には、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列及び任意の調節配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成が好適な場合がある。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮バージョンが記述されている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲが使用される。一実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号１４に示されているものである。一実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号１５に示されているものである。

一実施形態において、発現制御配列は、１つ以上のエンハンサーを含む。一実施形態では、配列番号４に示されているＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝臓制御領域の３４ｂｐコアエンハンサー）が含まれる。別の実施形態では、ＥｎＴＴＲ（トランスサイレチンの１００ｂｐエンハンサー配列）が含まれる。このような配列は、配列番号５に示されている。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，１６（２）：２８０－２８９，Ｆｅｂ．２００８を参照されたい。更に別の実施形態では、α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体エンハンサーが含まれる。更に別の実施形態では、ＡＢＰＳ（α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体
［ＡＢＰ］の１００ｂｐの遠位エンハンサーが４２ｂｐに短縮されたバージョン）エンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号６に示されている。更に別の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号７に示されている。別の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。このような組み合わせは、本明細書に記述されるエンハンサーのうちのいずれかの２つ以上のコピー、及び／または２つ以上のタイプのエンハンサーを含み得る。

ｈＡＴＰ７Ｂコーディング配列の発現は、肝臓特異的プロモーターから駆動される。ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子のサイズが理由で、比較的小さいサイズのプロモーターの使用が望ましい。本明細書に記述される、説明に役立つプラスミド及びベクターは、改変されたチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ－Ｓ１）プロモーター（配列番号８）を使用する。別の実施形態では、ＴＢＧプロモーターが使用される。ＴＢＧプロモーター配列は、配列番号９に示されている。代替的には、他の肝臓特異的プロモーター、例えば配列番号１１に示されるトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲプロモーター）、または配列番号１１のｎｔ２１～ｎｔ１９０に示される改変されたトランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲプロモーター）を使用してもよい。別の好適なプロモーターは、アルファ１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、またはその改変バージョン（この配列は配列番号１０に示されている）である。種々のプロモーター及びエンハンサーの組み合わせについては、以下の実施例で詳解する。

他の好適なプロモーターとしては、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４３２（１９９７））、ｈｕｍＡｌｂ；肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇｅｔ
ａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）が挙げられる。例えば、参照により組み込まれているＴｈｅＬｉｖｅｒＳｐｅｃｉｆｉｃＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。さほど望ましくはないが、他のプロモーター、例えばウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、または生理学的合図に応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記述されるベクターにおいて利用してもよい。

発現カセット及び／またはベクターは、プロモーターに加えて、他の適切な転写開始配列、終止配列、エンハンサー配列、及び効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含有してもよい。このような配列には、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント（例えばＷＰＲＥ）、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を増強する配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、そして所望であれば、コードされる産物の分泌を増強する配列が含まれる。一実施形態では、ＫＯＺＡＫ配列が含まれる。一実施形態では、ｈＡＴＰ７ＢｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するため、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが含まれる。本明細書において有用なポリＡシグナルは、配列番号１３に示されている約７５ｂｐのサイズの人工ポリＡ（ＰＡ７５）である。他の好適なポリＡ配列の例としては、例えば、とりわけウシ成長ホルモン（配列番号１２）、ＳＶ４０、ウサギベータグロビン、及びＴＫポリＡが挙げられる。

一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約３．０～約５．５キロベースのサイズになるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムが天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約４．７ｋｂのサイズになるように選択される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノム全体は、約５．２ｋｂ未満のサイズ
である。更なる実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノム全体は、約５．１ｋｂまたは約５．０ｋｂのサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕｅｔａｌ，ＭｏｌＴｈｅｒ，Ｊａｎ２０１０
１８（１）：８０－６を参照されたい。

一実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号２３のｎｔ１～ｎｔ５１３４、配列番号２４のｎｔ１～ｎｔ５０５６、配列番号２５のｎｔ１～ｎｔ５０６４、配列番号２６のｎｔ１～ｎｔ５０６８、配列番号２７のｎｔ１～ｎｔ５０４８、配列番号２８のｎｔ１～ｎｔ４２８４、配列番号２９のｎｔ１～ｎｔ４６７７、配列番号３０のｎｔ１～ｎｔ４９７８、配列番号３１のｎｔ１～ｎｔ４８７６、配列番号３２のｎｔ１～ｎｔ４９４５、配列番号３３のｎｔ１～ｎｔ３６２８、配列番号３４のｎｔ１～ｎｔ４０２１、または配列番号３５のｎｔ１～ｎｔ４６２７を含む。

ｒＡＡＶを生成するための例示的な産生プラスミドは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に示されている。

５．１．２．組成物
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂウイルスは、水性担体、賦形剤、希釈剤、またはバッファーを含む医薬組成物で提供される。一実施形態において、バッファーはＰＢＳである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂ製剤は、ＴＭＮ２００（２００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）中に０．００１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８を含有する水溶液に懸濁した、有効量のｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクターを含有するサスペンションである。しかしながら、緩衝食塩水、界面活性剤、及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）約１００ｍＭ～塩化ナトリウム約２５０ｍＭと同等のイオン強度に調整した生理的に適合性がある塩もしくは塩の混合物、または同等のイオン濃度に調整した生理的に適合性がある塩のうちの１つ以上を含むものをはじめとする、種々の好適な溶液が公知である。

例えば、本明細書において提示されるサスペンションは、ＮａＣｌ及びＫＣｌの両方を含有し得る。ｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲内であり得る。好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、中央にある疎水性のポリオキシプロピレン鎖（ポリ（プロピレンオキシド））が２つの親水性のポリオキシエチレン鎖（ポリ（エチレンオキシド））に挟まれた構成をしている非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールの中から選択され得る。一実施形態において、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、「Ｐ」の文字（ポロキサマーを表す）の後に３つの数字が続く名称を与えられる。最初の２つの数字に１００をかけると、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量が求められ、最後の数字に１０をかけると、ポリオキシエチレン含有率が求められる。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、サスペンションの最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してよい。別の実施形態では、ベクターは、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロキサマー１８８を含有する水溶液（ｐＨ７．３）に懸濁される。

一実施形態において、製剤は、ヒト対象に使用するのに好適であり、静脈内投与される
。一実施形態において、製剤は、ボーラス注射により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約１０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約２０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約３０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約６０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約９０分（±１０分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。しかしながら、必要または所望であれば、この時間を調整してよい。任意の好適な方法またはルートを使用して、本明細書に記述されるＡＡＶ含有組成物を投与し、場合によっては、本明細書に記述されるｈＡＴＰ７ＢのＡＡＶ媒介性送達と併せて、他の活性薬または療法薬を共投与することができる。投与ルートとしては、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与ルートが挙げられる。

一実施形態において、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍ．Ｌｏｃｋｅｔａｌ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ２０１４Ｆｅｂ１４に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、例えば、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）～約３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇを含有し得る。一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂ製剤は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋｅｔａｌ（上記）に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、少なくとも１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬまたはそれ以上を含有するサスペンションである。

患者に投与されるＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂの用量から空のカプシドが除去されることを確実にするために、空のカプシドは、ベクター精製プロセス中に、例えば、本明細書において詳解される方法を使用して、ベクター粒子から分離される。一実施形態において、パッケージングされたゲノムを含有するベクター粒子は、参照により本明細書に組み込まれている「ＳｃａｌａｂｌｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＡＡＶ８」と題するＷＯ２０１７／１００６７６に記述されているプロセスを使用して、空のカプシドから精製される。簡潔に述べると、清澄化され濃縮されたｒＡＡＶ産生細胞培養物の上清から、ゲノムを含有するｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉して単離する、２ステップの精製スキームが記述されている。このプロセスでは、高い塩濃度で行われる親和性捕捉法の後に、高いｐＨで行われるアニオン交換樹脂法を利用して、ｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子をもたらす。他のカプシドを有するベクターのために同様の精製法を使用してもよい。

いかなる従来の製造プロセスを利用してもよいが、本明細書（及びＷＯ２０１７／１００６７６）に記述されるプロセスは、５０～７０％の粒子がベクターゲノムを有する、すなわち、完全粒子５０～７０％のベクター調製物をもたらす。したがって、１．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの例示的な用量では、総粒子用量は２．３×１０^１２～３×１０^１２の粒子となる。別の実施形態では、提唱される用量は、１／２対数高いか、または５×１０^１２ＧＣ／ｋｇであり、総粒子用量は７．６×１０^１２～１．１×１０^１３の粒子となる。一実施形態において、製剤は、「空」対「完全」比が１以下、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５、好ましくは０．３未満のｒＡＡＶストックを特徴とする。

ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングされたゲノム）のストックまたは調製物は、ストック
中のｒＡＡＶ８粒子が、ストック中のｒＡＡＶ８の少なくとも約７５％～約１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％であり、「空のカプシド」が、ストックまたは調製物中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満であるとき、空のＡＡＶカプシド（及び他の中間体）を「実質的に含まない」。

概して、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子についてアッセイするための方法は、当技術分野において知られてきた。例えば、Ｇｒｉｍｍ
ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するには、その方法は、３つのカプシドタンパク質を分離させることができる任意のゲル、例えば、バッファー中に３～８％トリス－アセテートを含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、処置済みＡＡＶストックを供し、次に、試料物質が分離されるまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロンにゲルをブロッティングすることを含む。次に、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次に、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合によって連結したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性同位体の放出、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは化学発光検出キットを使用する。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合、カラム画分から試料を取り、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中で加熱してもよい。カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分解した。製造元の説明に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用し、銀染色を行ってもよい。一実施形態において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅＩ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化して、外来性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの失活後、試料を更に希釈し、複数のプライマーと、これらのプライマー間のＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブとを使用して増幅した。各試料について、規定の蛍光レベルに達するために必要なサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｓｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍで測定する。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用い、Ｑ－ＰＣＲ反応の標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）を使用して、ベクターゲノム力価をプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対して正規化することにより、これを決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイを使用することもできる。

一態様において、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（例えばＱｉａｇｅｎから市販されているもの）を利用する、最適化されたｑ－ＰＣＲ法が本明細書において提示される。より特定すると、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化後に試料をプロテイナーゼＫバッファーで希釈し、プロテイナーゼＫで処置してから熱失活することを除いては、標準的アッセイと同様である。好適には、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで試料を希釈する。プロテイナーゼＫバッファーは、２倍以上に濃縮してよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処置は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまで様々であり得る。処置ステップは約５５℃で約１５分間にわたって実施されるのが一般的だが、より低い温度（
例えば、約３７℃～約５０℃）でより長い期間（例えば、約２０分間～約３０分間）にわたって、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短い期間（例えば、約５～１０分間）にわたって行ってもよい。同様に、熱失活は約９５℃で約１５分間にわたるのが一般的だが、温度を低下させ（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次に、標準的アッセイにおいて説明されるように、試料を希釈し（例えば１０００倍）、ＴａｑＭａｎ解析に供する。

更に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノムの力価をｄｄＰＣＲによって決定するための方法が記述されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋｅｔａｌ，ＨｕＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＭｅｔｈｏｄｓ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ２０１４Ｆｅｂ１４を参照されたい。

５．２患者集団
上記で詳解したように、いかなる重症度のＷＤを有する対象も、本明細書に記述される組成物及び方法の意図されるレシピエントである。

対象は、各自の担当医の裁量にて、遺伝子療法処置の前及びそれと同時に、各自の標準治療処置（複数可）（例えば、銅の少ない食事；Ｄ－ペニシラミン及びトリエンチンなどのキレート剤での処置。他の薬剤としては、ジメルカプトコハク酸ナトリウム、ジメルカプトコハク酸、亜鉛、及びテトラチオモリブデートが挙げられる）の継続が許容され得る。代替策では、医師が、遺伝子療法処置を供与する前に標準治療療法を停止し、場合により、遺伝子療法を供与した後に併用療法として標準治療処置を再開することを選ぶ場合がある。

遺伝子療法レジメンの望ましいエンドポイントは、血清銅レベルを２５％以上低下させる機能的なＡＴＰ７Ｂ酵素をもたらす。一実施形態では、２４時間あたり３～８μｍｏｌ以下の尿中銅排泄量が望ましい。

ウィルソン病を有し得る患者を調査するためには、セルロプラスミン非結合銅（ＮＣＣ；別称「遊離銅」または銅指数）、２４時間尿中銅、肝臓銅、及び遺伝子突然変異試験をはじめとする多くの試験を使用することができる。銅レベルの測定のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＭｃＭｉｌｌｉｎｅｔａｌ，ＡｍＪ
ＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ．２００９；１３１（２）：１６０－１６５に記述されているように、当技術分野で公知である。一実施形態において、患者は、単独かつ／または補助的処置の使用と組み合わせたｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂを用いた処置の後に、所望の循環ＡＴＰ７Ｂレベルを達成する。

５．３．投薬及び投与ルート
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクターは、患者ごとに単回用量として送達される。一実施形態において、対象には、最小有効量（ＭＥＤ）（本明細書の実施例に記述される前臨床研究によって決定される）が送達される。本明細書において使用される場合、ＭＥＤとは、血清銅レベルを２５％以上低下させる機能的なＡＴＰ７Ｂ酵素をもたらすのに必要なｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂの用量を指す。

従来通り、ベクター力価は、ベクター調製物のＤＮＡ含有量に基づいて決定される。一実施形態では、実施例に記述される定量的ＰＣＲまたは最適化された定量的ＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態では、上述のデジタルドロップレットＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクター
調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態において、投与量は、約１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／体重１ｋｇ～約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ（両終点を含む）である。一実施形態において、投与量は５×１０^１１ＧＣ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。特定の実施形態では、患者に投与されるｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂの用量は、少なくとも５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、７．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、または７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。また、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内の量の複製欠損ウイルスを含有するような投与量単位で製剤化され得る。本明細書において使用される場合、「投与量」という用語は、処置の過程において対象に送達される総投与量、または（複数のうちの）単一の投与において送達される量を指す場合がある。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂは、例えば低銅食、あるいはＤ－ペニシラミン、トリエンチン、ジメルカプトコハク酸ナトリウム、ジメルカプトコハク酸、亜鉛、及び／またはテトラチオモリブデートの投与といった、ＷＤを処置するための１つ以上の療法と組み合わせて投与される。

５．４．臨床的目標の測定
処置の効力の測定値は、ＡＴＰ７Ｂ活性及びまたはセルロプラスミン非結合銅（ＮＣＣ；別称「遊離銅」または銅指数）、２４時間尿中銅、または肝臓銅レベルによって決定される導入遺伝子の発現及び活性によって測定することができる。効力の更なる評価は、食事性の銅に対する耐性の臨床的評価によって決定することができる。

本明細書において使用される場合、本明細書におけるｒＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂベクターは、セルロプラスミン非結合銅、２４時間尿中銅、及び／または肝臓銅を２５％以上低下させるＡＴＰ７Ｂ活性を達成するのに十分なレベルのＡＴＰ７Ｂを患者が発現する場合、患者の欠損したＡＴＰ７Ｂを活性ＡＴＰ７Ｂで「機能的に置き換える」または「機能的に補う」。

以下の実施例は単なる説明であり、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１：ｈＡＴＰ７Ｂを含有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ）
ＴＢＧ－Ｓ１プロモーター及びＥｎ３４エンハンサーの制御下にあるコドン最適化されたヒトｈＡＴＰ７ＢｃＤＮＡ（ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ）を有するＡＡＶ８ベクターにより、例示的な遺伝子療法ベクターＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５を構築した（図１）。ＡＴＰ７Ｂ発現カセットは、ＡＡＶ２由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれ、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＰＡ７５ポリ（Ａ）シグナルを更に含んだ。ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ゲノムの配列は、配列番号２４のｎｔ１～ｎｔ５０５６に示されている。

肝細胞特異的ＴＴＲプロモーターをＴＢＧ－Ｓ１の代わりに用い、ベクターＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５を上述のように構築した。ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５の配列は、配列番号２６のｎｔ１～ｎｔ５０６８に示されている。

ＴＢＧ－Ｓ１の代わりに、配列番号１１のｎｔ２１～ｎｔ１９０として示されている配列を有する改変されたＴＴＲプロモーターを利用して、ベクターＡＡＶ．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５を構築した。ＡＡＶ．Ｅｎ３４．ｍＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５の配列は、配列番号２７のｎｔ１～ｎｔ５０４８に示されている。

ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ベクターのＡＴＰ７Ｂ発現カセットは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＰＡ７５ポリ（Ａ）シグナルと共に、ＥｎＴＴＲエンハンサー及びＴＴＲプロモーターによって駆動された。ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５の配列は、配列番号２３のｎｔ１～ｎｔ５１３４に示されている。

ＡＡＶ８．ＥｎＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ベクターは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＰＡ７５ポリ（Ａ）シグナルと共に、ＡＢＰ－Ｓ２（ＡＢＰＳエンハンサー）エンハンサー及びＴＢＧ－Ｓ１プロモーターの制御下で、コドン最適化されたヒトＡＴＰ７ＢｃＤＮＡ（ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ）をコードする。ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５の配列は、配列番号２５のｎｔ１～ｎｔ５０６４に示されている。

更に、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３２のｎｔ１～ｎｔ４９４５に示されている通り）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ２Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３１のｎｔ１～ｎｔ４８７６に示されている通り）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ３Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３０のｎｔ１～ｎｔ４９７８）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３５のｎｔ１～ｎｔ４６２７）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３４のｎｔ１～ｎｔ４０２１）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号３３のｎｔ１～ｎｔ３６２８）、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号２９のｎｔ１～ｎｔ４６７７）、及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ）．ＰＡ７５（配列番号２８のｎｔ１～ｎｔ４２８４）を含むトランケート型ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターを、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＰＡ７５ポリ（Ａ）シグナル、ならびに表２に示したプロモーター及びエンハンサーを有する、示されているトランケート型ｈＡＴＰ７Ｂｃｏとしてデザインし、構築し、産生した。

簡潔に述べると、縮小サイズのトランスサイレチンエンハンサー及びプロモーターからコドン最適化バージョンのｈＡＴＰ７Ｂ（ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ）を発現するプラスミドを、ＡＡＶ８ウイルスカプシドにパッケージングした。

このベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔａｌ．ＡＰｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒＡＡＶｖｅｃｔｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｉｓｓ．ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＧｅｎｅｔｉｃＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８に記述されている、２９３細胞における従来のトリプルトランスフェクション技術を使用して調製した。全てのベクターは、これまでに記述されているように［Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２１：１２５９－１２７１（２０１０）］、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにてＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅによって産生された。

実施例２：ウィルソン病のマウスモデル
ウィルソン病の処置のための遺伝子療法アプローチを開発する前に、疾患表現型の動物モデルの十分な特性評価を行わなければならない。本明細書に記述される研究は、ｔｘ^Ｊマウス系統、ならびに全てのＡｔｐ７ｂＫＯマウスを出生時から哺育した後の銅代謝及び疾患病態の評価の両方に関する、初めての詳細な特性評価である。罹患した母の乳腺におけるＡｔｐ７ｂ欠損に起因して離乳前にもたらされる相反する銅欠乏症がない状態で、疾患進行のタイムラインを正確に決定した。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスは出生時から肝臓内に銅を蓄積させ、２月齢までに重度の銅の蓄積が明らかになり、肝疾患を併発する。

単一の臓器に影響を及ぼす単一遺伝子性疾患は、関連する組織学的病変が比較的少ない場合は特に、遺伝子療法アプローチのための魅力的な標的である。しかしながら、肝臓に影響を及ぼす代謝障害では、多くの場合、疾患の結果として肝実質が重度に損傷し得る。この代表例のうちの１つが、ウィルソン病タンパク質（銅輸送Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、Ａｔｐ７ｂ）の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患のウィルソン病である。機能的なＡｔｐ７ｂの欠如は、肝臓及び他の組織における銅の蓄積をもたらし、これが神経症状または精神症状を伴う肝疾患として顕在化する。ウィルソン病は、銅の吸収を低減させること、またはキレート療法を使用して身体から過剰な銅を除去することによって処置され得るが、多くの他の代謝障害に関しては、肝臓移植によって疾患に関連する遺伝的欠損を是正し、また機能不全の臓器を置き換えることもできる。

ウィルソン病は１：３０，０００の人々に影響を及ぼし、様々な疾患症状及び進行を示す。キレート化及び肝臓移植に代わる新たな治療代替策の開発を可能にするためには、この疾患の信頼できる動物モデルの十分な特性評価を行わなければならない。Ｌｏｎｇ－ＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎ（ＬＥＣ）ラット及び種々のトランスジェニックマウス系統を含め、いくつかのラット及びマウスのウィルソン病動物モデルがこれまでに報告されている（１～６）。マウスモデルにおけるウィルソン病の表現型の評価のために、我々は、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ（２）から入手可能な毒性乳マウス（ｔｘ^Ｊ）を選択した。これらのマウスは、コードされるタンパク質の第２の推定膜通過ドメイン内に位置し、機能不全のＡｔｐ７ｂタンパク質をもたらす、Ａｔｐ７ｂ遺伝子のＧｌｙ７１２Ａｓｐミスセンス突然変異を有する。

この系統の元々の名前である毒性乳マウスは、Ａｔｐ７ｂが肝臓に加えて乳腺組織でも
発現することの結果である。したがって、このモデルにおいて毒性乳の表現型が「自然発生する」のは、ウィルソン病の直接的結果である（７）。Ａｔｐ７ｂタンパク質が欠損しているため、銅が母から母乳に輸送されることができない（８）。罹患した母の乳を飲む罹患した子は、離乳して通常のマウス飼料を摂取するまで、その食餌から銅を一切受け取ることができないため、逆形態のウィルソン病（銅欠乏症）を呈する。この逆形態のウィルソン病は、これまでに記述されている白い毛色及び精神異常の原因でもある（９）。ここで我々は、このマウスモデルをｔｘ^ＪとしてではなくＡｔｐ７ｂノックアウト（ＫＯ）として記述することにする。その理由は、Ａｔｐ７ｂタンパク質が機能不全であること、そして、これらの研究で使用した全てのマウスを、毒性乳の問題を軽減するために生後７２時間以内にＢａｌｂ／ｃ乳母に哺育させたという事実である。したがって、ここで記述されるウィルソン病表現型の特性評価は、離乳前の銅欠乏症に関連するあらゆる潜在的な問題から切り離されたものである。

動物手技は全て、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により認可されたプロトコールに従って行った。

ＡＴＰ７ＢＫＯマウスは、機能的な銅輸送ＡＴＰａｓｅを発現しないため（Ｌｕｔｓｅｎｋｏｅｔａｌ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＣｏｐｐｅｒ－ＴｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇＡＴＰａｓｅｓ，ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，８７（３）：１０１１－４６（Ｊｕｌｙ２００７）、ウィルソン病のマウスモデルとした。ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるウィルソン病の進行を評価するため、自然史研究を行った。この研究は、２段階で行った。第１段階では、肝疾患の評価のために、マウスを様々な齢で剖検した。第２段階では、いくつかのバイオマーカーの評価のために、マウスを９月齢まで追跡した。

Ａｔｐ７ｂヘテロ接合性マウス及びＫＯマウスを、２月齢から７か月にわたり、尿中及び血清中の銅レベルについて、それぞれ毎週及び隔週ベースで評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。肝臓内のＡｔｐ７ｂは、銅を胆汁に排出し、糞便で排泄されるようにする（７）。Ａｔｐ７ｂの非存在下では、銅の排泄は尿路を介して起こる。尿中銅レベルは、研究した両方の遺伝子型において初めは同様であったが、３月齢において、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの尿中の銅レベルは、ヘテロ接合性動物と比較して上昇し始めた（図３Ａ）。研究終了時の尿中銅レベルは、平均して、ヘテロ接合性マウスでは０．１８μｇ／ｇ、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスでは１．０８μｇ／ｇであった。２月齢時のＡｔｐ７ｂＫＯマウスの血清銅レベルは、０．４７μｇ／ｇと比較して０．０７μｇ／ｇで、ヘテロ接合性動物と有意差があった（スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０００１、図３Ｂ）。３～４月齢においてＡｔｐ７ｂＫＯマウスの血清銅レベルは上がり始め、ヘテロ接合性マウスのそれと同等のレベルに達した。雄マウスまたは雌マウスの尿中銅レベルまたは血清銅レベルのいずれにも、差はほとんどまたは全くなかった。第１段階の結果は、肝臓における銅の蓄積が出生時から観察されたことを示す。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスが２月齢に達したとき、Ｔｉｍｍ法による銅染色により、肝臓における重度の銅の蓄積が明らかになった（図４）。

肝臓の代謝に影響を及ぼす単一遺伝子性疾患は、肝臓病変を伴うものと伴わないものとの２つのサブカテゴリーに分類することができる。ウィルソン病患者は、通常は硬変として顕在化する中等度から重度の肝疾患を呈する（１３、１４）。したがって我々は、このウィルソン病マウスモデルにおいて肝臓病態が発生する時間的過程を評価しようとした。経時的な肝臓病変の評価のため、２月齢、３月齢、４月齢、５月齢、９月齢、１０月齢、及び１２月齢でＡｔｐ７ｂＫＯマウスを剖検した（図５）。肝臓の切片をＨ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織病理を評価した（図３Ｃ）。単細胞壊死及び炎症を伴うわずかな肝細胞の肥大及び変性が、２月齢からＡｔｐ７ｂＫＯマウスに
存在した。肝細胞の肥大、変性、及び壊死の重症度は、６月齢までに最高になり、その後は一定の状態を保った。評価した他のパラメータは、炎症、胆管過形成、及び卵形細胞過形成を含め、２～３月齢から７月齢まで経時的に増加した。肝臓トランスアミナーゼのＡＬＴ及びＡＳＴは、２月齢時の正常値から、１０か月時点でＡＬＴ及びＡＳＴがそれぞれ１９９Ｕ／ｌ及び３８１Ｕ／ｌと、並行して増加した（表３）。１０月齢時の肝臓損傷の程度も、血清総ビリルビンレベルが２．５ｍｇ／ｄｌで突然上がったことから明らかであった。このマウスモデルでは、肝臓病変に加えて、肝結節性再生の領域が６月齢から明らかであった（一例が図５にアスタリスクによって示されている）。これはおそらく、肝疾患の重症度のため、驚くに当たらない。

肝臓切片の線維症及び銅の蓄積についても、それぞれＳｉｒｉｕｓＲｅｄ染色及びＴｉｍｍ染色によって評価した（図５）。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおいて、限局性または多巣性の門脈周囲線維症が３月齢までに見られた。これは、７月齢までには構造的破壊を伴うびまん性架橋線維症へと急速に進行した。肝臓病変の発生は、Ｔｉｍｍ染色（図５）によって見られるように、肝臓における大量の銅の蓄積に起因したと思われる。２月齢からＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓は、黒い染色によって示されるように、銅で飽和した状態になった。肝臓における銅の蓄積は、機能的なＡｔｐ７ｂの非存在下において胆汁への銅の排出が妨げられることに起因して起こる。肝臓内の銅のレベルは、肝細胞の損傷及び血清への銅の放出がおそらく原因で、経時的に低下した。このことはこれまでに示されており、ここで銅値は、亜広範壊死または広範壊死に伴って著しく低減し、再生及び線維症に伴って更に一層低減した（１、１５～１７）。線維性結合組織及び再生する肝細胞は、過剰濃度の銅を含有しない（１８）。

ＡＴＰ７ＢＫＯマウスの尿中の銅レベルもモニタリングした。自然史研究で試料を毎週収集し、次に誘導結合型プラズマ質量分析を行って、銅濃度を評価した。結果は、ヘテロ接合性同腹仔が低い銅レベルを維持した一方で、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスは、およそ第３週を起点として過剰な銅の尿への流出を呈し、その後、観察期間にわたって銅の尿中濃度が着実に上昇した（図２Ａ、３Ａ）ことを示しており、ウィルソン病患者に観察される高い尿中銅排泄率を表している。

Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの血清を隔週で収集し、誘導結合型プラズマ質量分析によって銅濃度を評価した。結果は、ヘテロ接合性同腹仔と比較して２月齢まで非常に低い血清銅レベルを示し、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの組織から銅を抽出して血液に送る能力の不全を示唆した。Ａｔｐ７ｂＫＯマウスが３～４月齢のとき、銅の血清濃度が著しく上昇し、ヘテロ接合性同腹仔のレベルに達した（図２Ｂ、３Ｂ）。

このＡｔｐ７ｂＫＯマウスモデルにおいて、疾患の進行は次の通りであった。Ｔｉｍｍ法による銅染色により、肝臓における重度の銅の蓄積が２月齢時に見られたが、他者がこれまでに記述しているのと同様に（１、１５～１７）、経時的に減少した。子の哺育によって、出生時からＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓内で銅が蓄積し、約２～３月齢で飽和レベルに達すると思われる。２月齢で肝疾患が発生した後、銅は血清中に放出され、３～４月齢までに肝細胞中の蓄積量の明らかな減少及び血清銅レベルの上昇がもたらされると思われる。この、初めは低かったレベルからヘテロ接合性マウスと同様のレベルへの血清銅レベルの上昇は、別のウィルソン病マウスモデルについてこれまでに報告されている（１７）、６週齢においてＡｔｐ７ｂ－／－系統の血清銅レベルが野生型マウスに見られるものと同様であり、４４週齢までに野生型マウスよりも２～３倍高く経時的に上昇するものとは異なる。

我々は、過剰な銅の尿への流出が約３月齢で始まることを観察したが、これも同様に、肝細胞の壊死及びその後の蓄積した銅の放出に起因する可能性がある。排泄の増加をもたらす腎臓におけるＡｔｐ７ｂ活性の欠如（２３～２５）、または肝臓銅輸送体Ｃｔｒ１の下方調節につながる肝臓内の銅の蓄積、及び小さな銅担体による尿中排泄（２６）を含め、腎臓を介する代替的な銅の排泄機構が示唆されている。繰り返しになるが、尿中銅排泄の時間的過程は、このマウスモデルと、これまでに報告されているものとでは異なる。ここで、尿中銅排泄はヘテロ接合性マウスとＡｔｐ７ｂＫＯマウスとで初めは同様だが、研究過程の間にＫＯマウスでは増加する。比較すると、Ａｔｐ７ｂ－／－系統の６週齢における尿中銅レベルは野生型マウスよりも３倍高く、１４～２０週齢まで上昇し、その後２０週齢で実質的に低下する（２６）。

肝細胞の肥大、変性、及び壊死は６月齢でピークに達し、付随すると思われる肝結節性再生の領域がこの齢以降に観察される。この再生への進行は、他のウィルソン病マウスモデルで報告されている（１７）。しかしながら、他のマウスモデルとは異なり、ここで記述するＡｔｐ７ｂＫＯマウスには胆管細胞癌の証拠はなかった。３月齢までには線維症の領域が見られ、７月齢までには構造的破壊と共に経時的に重症度が急速に増加した。３～４月齢までに血清トランスアミナーゼが顕著に増加しているが、血清総ビリルビンレベルの上昇は９か月でやっと起こり始め、肝疾患の進行を示している。

自然史研究の第２段階では、Ａｔｐ７ｂＫＯ同腹仔及びヘテロ接合性同腹仔を８月齢時に殺処分した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビンレベルを得た。図６Ａ～６Ｃ。Ｈ＆Ｅ染色の後に病理学者が組織病理をスコアリングスキームに照らして評価したものを図７に示す。図８Ａ及び８Ｂにはそれぞれ、線維症スコア及びＴｉｍｍ染色による銅染色スコアを示してある。図９には肝臓内の銅レベルを示してある。

実施例３：ウィルソン病のモデルにおけるＡＡＶ８．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクター
雄のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏを１０^１０ＧＣ／マウス及び１０^１１ＧＣ／マウスでＩＶ注射し、雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウスには、同じベクターを１０^９、１０^１０、及び１０^１１ＧＣ／マウスでＩＶ注射した。ベクター注射後の血清銅レベルをモニタリングした（図１０Ａ及び１０Ｂ）。雄Ａｔｐ７ｂＫＯマウスにおける１０^１０または１０^１１ＧＣ／マウスの投与は、ベクター投与２週間後ま
でに、血清銅レベルを平均０．１１μｇ／ｇからそれぞれ０．５２μｇ／ｇ及び０．３４μｇ／ｇまで上昇させた（図１０Ａ）。しかしながら、雌のマウスにおける効果はこれより低かった（図１０Ｂ）。ベクター投与７か月後の約９月齢時にマウスを殺処分し、肝臓銅レベルの評価のために肝臓を採取した。ヘテロ接合性マウス及びＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおける肝臓銅レベルは、それぞれ平均して６μｇ／ｇ及び２２２μｇ／ｇであった（図１０Ｃ）。＞１０^９ＧＣ／マウスの用量におけるＡＡＶ８ベクター投与は、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較して肝臓銅レベルを著しく低下させた。しかしながら、１０^９ＧＣ／マウスを投与した雌マウスと対照Ａｔｐ７ｂＫＯマウスとの間で肝臓銅レベルに有意差はなかった。この測定では、肝臓銅レベルにヘテロ接合性マウスとの有意差がなかったことから、雌マウスにおける高いベクター用量のより強力な効果があった（図１０Ｃ）。

ＡＡＶ８ベクターを投与したマウスを９月齢で剖検し、線維症及びＴｉｍｍ染色による銅レベルを含む銅関連肝疾患のパラメータについて肝臓を組織学的に評価した（図１１）。肝臓の切片をＨ＆Ｅで染色し、１～５のスコアリングシステムに従って組織学的に評価した（図１２Ａ）。肝臓銅レベルについて見られたものと同様に、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと、１０^９ＧＣ／マウスのＡＡＶ８ベクターを投与した雌マウスとの間で、肝臓病変の有意差はなかった。軽度のカリオサイトメガリー（ｋａｒｙｏｃｙｔｏｍｅｇａｌｙ）（肝細胞の肥大及び変性を意味する）、軽度の炎症、及び限局性または多巣性の門脈周囲卵形細胞過形成のみを有すると観察された、１０^１１ＧＣ／マウスを注射した雄マウスの肝臓病変では、用量依存的な減少があった。同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較して、１０^１０及び１０^１１ＧＣ／マウスを投与したマウスでは、肝細胞の肥大、変性／壊死、及び胆管過形成が有意に低減した（ｐ＜０．０５）。炎症及び卵形細胞過形成については、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較した有意な低減は、１０^１１ＧＣ／マウスの用量でのみ観察された（ｐ＜０．０５）。組織病理学的パラメータを組み合わせ、フィッシャーの複合確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓｃｏｍｂｉｎｅｄ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔ）を使用して評価したとき、１０^１０及び１０^１１ＧＣ／マウスのいずれの投与の後にも、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較して有意差があった（ｐ＜０．０００１）。

最も高いベクター用量を受けた雄マウスも線維症を有しなかった（これはＳｉｒｉｕｓ
Ｒｅｄ染色で評価した）（図１１及び１２Ｂ）。他の全てのベクター投与マウスに関し、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較して線維症の有意差はなかった（図１２Ｂ）。しかしながら、１０^１１ＧＣ／マウスを投与した雌マウスに見られた線維症の低減は十分であり、これらのマウスと雌Ａｔｐ７ｂヘテロ接合性マウスとの間の肝線維症スコアにも有意差はなかった。肝臓内の銅の蓄積についてのＴｉｍｍ染色は、誘導結合型プラズマ質量分析によって決定された定量的肝臓銅レベルにより見られたものと同様の結果を示した（図１２Ｃ）。同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと、ベクター投与群のうちのいずれとの間でも、Ｔｉｍｍ染色スコアの有意差はなかった。ＡＡＶ８．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターの効力を評価するために、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスに、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５（図２１、群１）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５（図２１、群２）、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５（図２１、群３）、及びＡＡＶ８．ＥｎＡＢＰＳ．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５（図２１、群４）をはじめとする種々の遺伝子療法ベクターを３×１０^１２ＧＣ／ｋｇでｉ．ｖ．投与した。ヘテロ接合性同腹仔及び野生型同腹仔、ならびに処置なしのＡｔｐ７ｂＫＯマウスを対照とした。血液試料を毎週収集し、銅結合形態と銅非結合形態と両方のセルロプラスミンのレベルをウェスタンブロットによって評価した。投与後２１日目に、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５で処置したＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおいて銅結合型セルロプラスミンの出現が観察され、血液中への銅の抽出の促進が示された（図２１、群２）。しかしなが
ら、上述の実験設定下では、試験した他の３つのベクターは、銅結合型セルロプラスミンの増加を示さなかった（図２１）。

本明細書に記述されるＡＡＶ８．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターを注射したＡＴＰ７ＢＫＯマウスの肝臓内の銅の蓄積を評価するため、その肝臓切片にＴｉｍｍ法による銅染色を行った。黒色沈着物は、銅の蓄積を示す。結果を図１９Ｂに示す。雄Ａｔｐ７ｂＫＯマウスに注射した５種全てのベクターにより、肝臓切片の黒色沈着物が、無処置またはＰＢＳのみのマウスから得た試料と比較して減少し、ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ベクターは、最小の黒色沈着物及び野生型と同様のパターンを示した（図１９Ｂ）。雌Ａｔｐ７ｂＫＯマウス（図１９Ｂ）は、肝臓内に雄と比較してより多くの銅沈着物を示し、性差を示している。更に無処置マウスと比較すると、雌Ａｔｐ７ｂＫＯマウスは、より少ない肝臓内の銅沈着物を示した。本明細書に記述されるＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターを注射した雄及び雌両方のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにおけるヒトＡＴＰ７Ｂタンパク質に対する抗体の生成については調査中である。

一方で、血清試料を収集し、実施例２に記述したように銅濃度を評価した。雌マウス及び雄マウスについて、データをそれぞれ図１５Ａ及び１５Ｂにプロットした。結果は、本明細書に記述されるＡＡＶ８．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクター３×１０^１２ＧＣ／ｋｇの処置が、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの血清銅レベルを上昇させるのに成功したことを示す（図１５Ａ及び１５Ｂ）。

更なる試験を次の通りに行った。

経時的な血清銅レベルを図１５Ａ及び１５Ｂに示す。ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビンレベルを得た。図１６Ａ～Ｃ。ＡＴＰ７Ｂ相対発現量を図１７に示す。Ｈ＆Ｅ染色の後に病理学者が組織病理をスコアリングスキームに照らして評価したものを図１８に示す。図１９Ａ及び１９Ｂにはそれぞれ、線維症スコア及びＴｉｍｍ染色による銅染色スコアを示してある。

実施例４：ＡＡＶ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターを注射したウィルソン病モデルにおけるセルロプラスミンのオキシダーゼ活性
銅は潜在的に毒性のある金属だが、様々な酵素の補因子として作用し、多くの生理機能に必須である。銅は、腸管吸収された後に肝細胞に輸送され、ここでトランスゴルジ網（ＴＧＮ）の膜内に位置するＡＴＰ７Ｂに結合する。この大きな膜貫通タンパク質は、この
金属を銅依存性酵素に移送することを担っている。健常な個体の血漿中に存在する銅の９５％がセルロプラスミンに結合しているため、セルロプラスミンへの銅の負荷は、この酵素のフェロキシダーゼ活性に必須であり、この金属の重要な分泌経路を構成する。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｕｒｉｌｌｏ，Ｏｉｈａｎａ，ｅｔａｌ．“Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆＷｉｌｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｂｙｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ６４．２（２０１６）：４１９－４２６を参照されたい。

オキシダーゼ活性を測定するため、ＳｉｇｍａのＣｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎＡｃｔｉｖｉｔｙＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＫｉｔ（ＭＡＫ１７７）またはＢｉｏＶｉｓｉｏｎのＣｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎＡｃｔｉｖｉｔｙＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＫｉｔを使用し、参照により本明細書に組み込まれている、その対応する製品情報に示されているプロトコールに従い、２０μｌの血清をプロセシングした。また、Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙｅｔａｌ，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎｆｒｏｍｉｔｓｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｅｒｕｍｂｙｕｓｅｏｆｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ”ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０．１２（１９７４）：１５５６－１５６３、及びＭｕｒｉｌｌｏｅｔａｌ．“Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆＷｉｌｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｂｙｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ６４．２（２０１６）：４１９－４２６（これらは参照により本明細書に組み込まれている）に示されているプロトコールに従い、オキシダーゼ活性アッセイを行った。

上述の４つのアッセイを使用して、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスの血清セルロプラスミンのオキシダーゼ活性を測定した。野生型マウス及びヘテロ接合性マウスから得た試料を対照とした。野生型マウスとＡｔｐ７ｂＫＯマウスとの間で差は検出されなかった。

更に、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスを硫酸アンモニウムありまたはなしで処置した。対照として野生型マウスを用意した。Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙｅｔａｌ，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎｆｒｏｍｉｔｓｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｅｒｕｍｂｙｕｓｅｏｆｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ”ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０．１２（１９７４）：１５５６－１５６３に示されているプロトコールを使用したセルロプラスミンオキシダーゼ活性アッセイにおいて、野生型マウスまたはＡｔｐ７ｂＫＯマウスの間の差は検出されなかった。

別の実験では、Ａｔｐ７ｂＫＯマウスを硫酸銅ありまたはなしで処置した。対照として野生型マウスを用意した。硫酸銅ありまたはなしで処置したマウスの間の差を検出するため、上述の４つの方法を使用してセルロプラスミンオキシダーゼ活性アッセイを行う。本明細書に記述されるマウスの肝臓ホモジネートも収集し、上述の４つの方法を使用して、セルロプラスミンのオキシダーゼ活性について試験する。硫酸銅を肝臓ホモジネートに更に加え、これを陽性対照とした。

実施例５：ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターの更なる試験
ＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５ベクターの用量依存的効果及び最小有効量（ＭＥＤ）を決定するため、雄及び雌両方の２月齢のＡＴＰ７ＢＫＯマウスに、１×１０^９、１×１０^１０、または１×１０^１１ＧＣ／マウスのベクターを静脈内注射した。セルロプラスミンのウェスタンブロットは、１×１０^１１ＧＣのＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５を受けた、試験した４匹のマウスの
うち３匹の血清における、銅結合型セルロプラスミンの出現を示し、銅抽出の増加を示唆している（図１４）。一方、同じベクターを１×１０^１０ＧＣで処置した際には、試験した５匹のマウスのうち１匹が、血液中の銅結合型セルロプラスミンを示した（図１４）。これらのデータは、マウス１匹あたり１×１０^１１ＧＣの用量におけるＡＡＶ８．ＥｎＴＴＲ．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ．ＰＡ７５の単回静脈内注射が、ウィルソン病のマウスモデルにおける銅の抽出を促進するのに成功したことを実証した。

実施例６：トランケート型ベクター
単一遺伝子性疾患は、ＡＡＶベクターを使用した遺伝子置換療法アプローチのための優れた候補である。しかしながら、ＡＡＶベクターカプシドの内部にパッケージングされ得るｃＤＮＡのサイズには限界がある。野生型ＡＡＶゲノムは４，７００ｂｐであり、より大きなゲノムをパッケージングする要請は、ＡＡＶカプシド内に封入されるＤＮＡ配列の完全性を低減させ得る（１９）。これまでに、所与の導入遺伝子のサイズと、発現に必要な転写制御配列及びポリＡ制御配列との両方を低減させる方法を調査するため、集中的な研究が行われてきた。これが首尾よく行われた一例は、長さ４，３７４ｂｐであるヒト凝固因子ＶＩＩＩのＢドメイン欠失導入遺伝子配列の生成を伴う、血友病Ａの処置のための遺伝子療法ベクターの開発である（１９～２１）。ウィルソン病の処置では、ＡＴＰ７Ｂ
ｃＤＮＡが４，３９５ｂｐであるため、この問題は増大する。したがって我々は、コドン最適化バージョンのヒトＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子の発現のため、縮小サイズのトランスサイレチンエンハンサー及びプロモーター（ＴＴＲ）配列を、７５ｂｐの合成ポリＡ配列（ＰＡ７５）（１９）と組み合わせて使用することを選択した。結果として生じたＡＡＶゲノムは５．１ｋｂであり、これをＡＡＶ８カプシド内にパッケージングした。

更に、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ２Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ３Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－２Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．Ｅｎ３４．ＴＢＧ－Ｓ１．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－４Ｄｅｌ）．ＰＡ７５、及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ（ＭＢＤ１－５Ｄｅｌ）．ＰＡ７５をはじめとするトランケート型ｈＡＴＰ７Ｂｃｏベクターをデザインし、産生し、３×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量でＡＴＰ７ＢＫＯマウスに静脈内注射した。

上述の種々のトランケート型ベクターで処置したＡｔｐ７ｂＫＯマウス、及びヘテロ接合性同腹仔について研究し、６月齢時に殺処分した。経時的な血清銅レベルを図２２に示す。ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び総ビリルビンレベルを得た。図２３。ＡＴＰ７Ｂ相対発現量を図２４に示す。Ｈ＆Ｅ染色の後に病理学者が組織病理をスコアリングスキームに照らして評価したものを図２５に示す。図２６には、線維症スコア及びＴｉｍｍ染色による銅染色スコアを示してある。剖検時の肝臓銅レベルを図２７に示す。

実施例７：上記実験の材料及び方法
Ａ．ＡＡＶベクターの産生
全てのＡＡＶベクターは、これまでに記述されているように（１０）、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにてＰｅｎｎＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅによって産生された。簡潔に述べると、縮小サイズのトランスサイレチンエンハンサー及びプロモーターからコドン最適化バージョンのｈＡＴＰ７Ｂ（ｈＡＴＰ７Ｂｃｏ）を発現するプラスミドを、ＡＡＶ８ウイルスカプシドにパッケージングした。

Ｂ．マウス
ヘテロ接合性Ａｔｐ７ｂ^＋／－マウスの繁殖ペアをＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から得て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにて特定病原体除去条件下でコロニーを管理した。動物手技及びプロトコールは全て、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により認可された。Ａｔｐ７ｂＫＯを生成し、その後の繁殖のために使用した。Ａｔｐ７ｂＫＯ交配ペアから生成された子は全て、生後７２時間以内にＢａｌｂ／ｃ乳母に哺育させた。雄及び雌のＡｔｐ７ｂＫＯマウス（２月齢）に、尾静脈を介して、１０^９～１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／マウスのＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＡＴＰ７ＢｃｏをＩＶ注射した（ｎ＝５／性別／群）。

Ｃ．血清解析
示された時点で血液を血清分離管に収集し、凝固させ、室温で５分間３，５００×ｇの遠心分離によって血清を単離した。血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び総ビリルビンレベルについて、ＡｎｔｅｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって解析した。血清及び尿の銅レベルについても、Ｅｘｏｖａ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）によって解析した。

Ｄ．肝臓銅解析
剖検時に採った肝臓試料の銅レベルについて、Ｅｘｏｖａ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）によって解析した。

Ｅ．組織病理
ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を細切し、標準的なプロトコールに従ってヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。肝線維症を検出するため、パラフィン切片にＳｉｒｉｕｓＲｅｄ染色を行った。切片を脱パラフィンし、０．１％（ｗ／ｖ）ＤｉｒｅｃｔＲｅｄ（Ｓｉｇｍａ）、４％（ｗ／ｖ）ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ）の溶液中で９０分間染色し、０．０１ＮＨＣｌで洗浄し（２×１分）、エタノール及びキシレンで段階的に脱水し、カバースリップを適用した。

Ｆ．Ｔｉｍｍ法による銅染色
ホルマリン固定パラフィン包埋した肝臓の切片を脱脂し、０．５％硫化アンモニウム（５分）、脱イオン水（１分すすぐ）、０．１ＮＨＣｌ（２～３分）、脱イオン水（２～３分すすぐ）、及び顕色剤（１部の５％硝酸銀、５部の２％（ｗ／ｖ）ヒドロキノン／５％（ｗ／ｖ）クエン酸、およそ１０分）において順次インキュベートした。対照動物（野生型及びＡＴＰ７ＢＫＯ）の肝臓切片を各ランに含め、一貫した染色強度についてモニタリングした。切片を最終的に水で洗浄し、ＮｕｃｌｅａｒＦａｓｔＲｅｄで対比染色し、脱水し、カバースリップを適用した。

Ｇ．組織病理スコアリング
組織病理学的病変を次の基準に基づいてスコアリングした。肝細胞の肥大及び変性：０、重大な病変なし；１、わずかなカリオサイトメガリー（低頻度から中頻度、小葉内の１～２つの肝細胞）、２、軽度のカリオサイトメガリー（小葉内の＜１０％の肝細胞）；３、肝細胞の解離及び低頻度から少数の単細胞壊死を伴う中等度のカリオサイトメガリー（小葉内の１０～５０％の肝細胞）；４、広範な肝細胞の解離及び高頻度の単細胞壊死を伴う重度のカリオサイトメガリー（小葉内の５１～９０％の肝細胞）；比較的正常な肝臓構造が維持される；５、小葉の崩壊及び多数の単細胞壊死を伴う顕著なカリオサイトメガリー（小葉内の＞９０％の肝細胞）。炎症：０、なし；１、軽度－門脈域内の少数の凝集物及び稀な実質内の病巣；正常範囲内とみなされる；２、中等度－周りの門脈周囲肝細胞に
及ぶか、または実質内で多巣性である；３、顕著－肝細胞の架橋もしくは解離または実質内で多巣性から癒合性。胆管過形成：０、なし；１、門脈域内で限局性または多巣性；２、門脈周囲領域内の肝細胞の解離；３、構造的歪みを伴う肝細胞の架橋または解離。卵形細胞過形成：０、なし；１、限局性または多巣性（門脈周囲）；２、肝細胞の架橋または解離；３、構造的歪みを伴う肝細胞の架橋または解離。結節性再生：０、非存在；１、存在。

Ｓｉｒｉｕｓｒｅｄ染色に基づく線維症の類別スキームは、文献（１１）に報告されているものから引用した：０、なし；１、限局性または多巣性；２、架橋；３、構造的破壊を伴う架橋（分布が小葉中心性か、中間帯性か、門脈周囲性か、またはびまん性かの注記付き）。

Ｈ．Ｔｉｍｍ染色に基づく銅の蓄積の類別スキームは、これまでに文献（１２）で記述されているものと同じであった：１、肝細胞の細胞質内に銅含有顆粒なし、または少数の銅含有顆粒が時折見られる；正常範囲内とみなされる；２、一部の小葉中心性肝細胞に明らかな銅含有顆粒；正常範囲内とみなされる；３、軽度－ほとんどの小葉中心性肝細胞（各小葉の１／３）に多数の顆粒；４、中等度－全ての小葉中心性肝細胞及び中間帯性肝細胞（全小葉内の肝細胞のおよそ２／３）に多数の顆粒が存在する；５、顕著－全小葉内の肝臓細胞の２／３超に大量の顆粒。

統計解析
全てのデータについて、群平均及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し、報告した。スチューデントｔ検定を行って２つの群を比較し、テューキーの多重比較検定を用いた一元分散分析（ＡＶＯＶＡ）を群間で行い、性別によって層別化した。ベクター投与において５つの病態パラメータを解析し、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスのものと比較した。比較は、Ｒプログラム（バージョン３．３．１；ｈｔｔｐｓ／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）でウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。各用量群について、「ｍｅｔａｐ」パッケージの「ｓｕｍｌｏｇ」関数を使用し、Ｒプログラムでフィッシャーの複合確率検定を使用して、同齢で未注射のＡＴＰ７ＢＫＯマウスと比較した、組み合わせた病態パラメータにおける差を評価した。０．０５のｐ値を有意とみなした。

実施例８：詳解
治療アプローチの臨床への応用可能性（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために疾患のマウスモデルが使用可能になる前に、モデルの詳細な特性評価を行わなければならない。他のウィルソン病マウスモデルの特性評価は行われてきたが（１、１５、１７）、この研究は、ｔｘ^Ｊマウス系統、ならびに全てのＡｔｐ７ｂＫＯマウスを出生時から哺育した後の銅代謝及び肝疾患の評価の両方に関する、初めての詳細な特性評価である。罹患した母の乳腺におけるＡｔｐ７ｂ欠損に起因して離乳前に起こる相反する銅欠乏症がない状態で、離乳前の銅欠乏症に関連するあらゆる潜在的な問題から疾患表現型を確実に切り離すことにより、これらのマウスにおける疾患進行のタイムラインをより正確に決定することができる。このマウスモデルにおける肝疾患及び結節性再生の発生は、他者が開発したＡｔｐ７ｂ^－／－系統についてこれまでに報告されているものと同様であった（１、１７）。しかしながら、子を出生時から哺育することでもたらされた銅の連続供給がおそらく理由で、このマウス系統のタイムラインはわずかに増加した。

このＡｔｐ７ｂＫＯマウスモデルにおいて、疾患の進行は次の通りであった。Ｔｉｍｍ法による銅染色により、肝臓における重度の銅の蓄積が２月齢時に見られたが、他者がこれまでに記述しているのと同様に（１、１５～１７）、経時的に減少した。子の哺育によって、出生時からＡｔｐ７ｂＫＯマウスの肝臓内で銅が蓄積し、約２～３月齢で飽和
レベルに達すると思われる。２月齢で肝疾患が発生した後、銅は血清中に放出され、３～４月齢までに肝細胞中の蓄積量の明らかな減少及び血清銅レベルの上昇がもたらされると思われる。この、初めは低かったレベルからヘテロ接合性マウスと同様のレベルへの血清銅レベルの上昇は、別のウィルソン病マウスモデルについてこれまでに報告されている（１７）、６週齢においてＡｔｐ７ｂ^－／－系統の血清銅レベルが野生型マウスに見られるものと同様であり、４４週齢までに野生型マウスよりも２～３倍高く経時的に上昇するものとは異なる。

我々は、過剰な銅の尿への流出が約３月齢で始まることを観察したが、これも同様に、肝細胞の壊死及びその後の蓄積した銅の放出に起因する可能性がある。排泄の増加をもたらす腎臓におけるＡｔｐ７ｂ活性の欠如（２３～２５）、または肝臓銅輸送体Ｃｔｒ１の下方調節につながる肝臓内の銅の蓄積、及び小さな銅担体による尿中排泄（２６）を含め、腎臓を介する代替的な銅の排泄機構が示唆されている。繰り返しになるが、尿中銅排泄の時間的過程は、このマウスモデルと、これまでに報告されているものとでは異なる。ここで、尿中銅排泄はヘテロ接合性マウスとＡｔｐ７ｂＫＯマウスとで初めは同様だが、研究過程の間にＫＯマウスでは増加する。比較すると、Ａｔｐ７ｂ^－／－系統の６週齢における尿中銅レベルは野生型マウスよりも３倍高く、１４～２０週齢まで上昇し、その後２０週齢で実質的に低下する（２６）。

このＡｔｐ７ｂＫＯマウスモデルの特性評価後、我々は、ウィルソン病を処置するための遺伝子療法アプローチを開発した。コドン最適化バージョンのヒトＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクターを２月齢のＡｔｐ７ｂＫＯマウスにＩＶ投与すると、ベクター投与の２週間後までに血清銅レベルが上昇した。ここで評価した、より高い用量のベクター（＞１０^９ＧＣ／マウス）は、同齢で未注射のＡｔｐ７ｂＫＯマウスと比較して肝臓銅レベルを著しく低下させた。肝臓病変は著しく用量依存的に減少し、１０^１１ＧＣ／マウスを注射した雄マウスには軽度の組織病理学的所見しか存在せず、肝線維症は全く存在しなかった。したがって、疾患発症の初期段階中に遺伝子療法アプローチを供与することで、ウィルソン病のマウスモデルにおける肝臓損傷が防止され、銅代謝が是正された。

本明細書に引用される全ての公開文献、ならびに米国仮特許出願第６２／４４０，６５９号及び同第６２／４７３，６５６号は、参照により本明細書に組み込まれている。同様に、本明細書において参照され、添付の配列表に記載される配列番号は、参照により組み込まれている。特定の実施形態を参照しながら本発明について記述したが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行ってよいことは理解されよう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるよう意図される。

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２５．ＴａｎｚｉＲＥ，ＰｅｔｒｕｋｈｉｎＫ，ＣｈｅｒｎｏｖＩ，ＰｅｌｌｅｑｕｅｒＪＬ，ＷａｓｃｏＷ，ＲｏｓｓＢ，ＲｏｍａｎｏＤＭ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＷｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅｉｓａｃｏｐｐｅｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇＡＴＰａｓｅｗｉｔｈｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏｔｈｅＭｅｎｋｅｓｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅ．ＮａｔＧｅｎｅｔ１９９３；５：３４４－３５０。
２６．ＧｒａｙＬＷ，ＰｅｎｇＦ，ＭｏｌｌｏｙＳＡ，ＰｅｎｄｙａｌａＶＳ，ＭｕｃｈｅｎｄｉｔｓｉＡ，ＭｕｚｉｋＯ，ＬｅｅＪ，ｅｔａｌ．ＵｒｉｎａｒｙｃｏｐｐｅｒｅｌｅｖａｔｉｏｎｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＷｉｌｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅｉｓａｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｃｅｓｓｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｈｅｐａｔｉｃｃｏｐｐｅｒｌｏａｄ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１２；７：ｅ３８３２７。

Claims

ウィルソン病（ＷＤ）のための肝臓指向性治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、前記ベクターゲノムが、
（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）エンハンサー及びＴＴＲプロモーターと、
（ｃ）トランケート型ＡＴＰ７Ｂが金属結合ドメイン１－３（ＭＢＤ１－３）欠失を有する、トランケート型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードするコーディング配列と、
（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲ配列と
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス。
前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８カプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
前記ＡＡＶ５’ＩＴＲ配列及び／またはＡＡＶ３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２に由来する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
前記ベクターゲノムがポリＡを更に含む、請求項１～３のいずれか１に記載のｒＡＡＶ。
前記ベクターゲノムがＷＰＲＥを更に含む、請求項１～４のいずれか１に記載のｒＡＡＶ。
前記ベクターゲノムがイントロンを更に含む、請求項１～５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
前記イントロンが、ヒトベータグロビンＩＶＳ２またはＳＶ４０に由来する、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
前記エンハンサーが、α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体（ＡＢＰ）エンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、またはＡｐｏＥエンハンサーである、請求項１～７のいずれか１に記載のｒＡＡＶ。
前記ベクターゲノムが、約３キロベース～約５．５キロベースのサイズである、請求項１～８のいずれか１に記載のｒＡＡＶ。
前記ポリＡがＳＶ４０ポリＡである、請求項４に記載のｒＡＡＶ。
前記（ｃ）のコーディング配列が天然のコーディング配列である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
前記（ｃ）のコーディング配列がコドン最適化配列である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
ウィルソン病患者へ投与するための水性サスペンションであって、前記サスペンションが、水性懸濁液と、ウィルソン病のための肝臓指向性治療薬として有用な約１×１０¹²ＧＣ／ｍＬ～約１×１０¹⁴ＧＣ／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）とを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドを有し、かつその中に、
（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）エンハンサー及びＴＴＲプロモーターと、
（ｃ）トランケート型ＡＴＰ７Ｂが金属結合ドメイン１－３（ＭＢＤ１－３）欠失を有する、トランケート型ヒト銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）をコードするコーディング配列と、
（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲ配列と
を含むベクターゲノムがパッケージングされている、
前記水性サスペンション。
前記水性サスペンションが静脈内注射のための、請求項１３に記載の水性サスペンション。
前記水性サスペンションが、前記水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む、請求項１３または１４に記載の水性サスペンション。
前記（ｃ）のコーディング配列が天然のコーディング配列である、請求項１３に記載の水性サスペンション。
前記（ｃ）のコーディング配列がコドン最適化配列である、請求項１３に記載の水性サスペンション。
ウィルソン病を有する患者を処置するための、請求項１に記載のｒＡＡＶを含んでなる医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶが、水性サスペンション中約１×１０¹²～約１×１０¹⁴ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで送達され、前記ＧＣがｏｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲに基づいて決定され計算される、前記医薬組成物。
前記ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１３に記載の水性サスペンション。
ウィルソン病の処置を必要とする対象のウィルソン病の処置に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。