KR20160146668A - Mmp-8 활성화 생성물, 이의 결정 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MMP-8 중간부(middle-part) 활성화 생성물과 같은 신규한 MMP-8 활성화 생성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 피험자로부터 유래되는 생물학적 시료에서 이러한 MMP-8 활성화 생성물 또는 활성화된 MMP-8 단편의 검출, 및 활성화된 MMP-8의 비정상적인 수준 또는 상승된 수준과 관련된 질환의 진단을 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

MMP-8 활성화 생성물, 이의 결정 및 용도{MMP-8 ACTIVATION PRODUCT, ITS DETERMINATION AND USE}
본 발명은 일반적으로 진단 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MMP-8 활성화 생성물, 바람직하게는 MMP-8 중간부(middle-part) 활성화 생성물, 피험자 유래의 생물학적 시료에서의 MMP-8 활성화, MMP-8 활성화 생성물 또는 활성화된 MMP-8 단편의 검출, 및 질환 또는 질환 진행의 소인 또는 위험성의 결정에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 활성화된 MMP-8의 비정상적인 수준 또는 상승된 수준과 관련된 질환의 진단을 위한 MMP-8 활성화 생성물의 용도에 관한 것이다.
치주질환은 인간의 치아 상태에 있어서 주요한 문제점이다. 사실상, 충치보다는 치주질환에 의해 더 많은 치아가 손실된다. 따라서, 신뢰 가능한 치주질환 진단 테스트가 강하게 요망되고 있으며; 특히, 질환의 발병을 조기 단계에서, 심지어 조기 치은염 단계에서 진단하는 것, 즉, 가시적인 파괴 징후가 발생하기 전에 조직 파괴가 시작되는 조기 단계에서 진단하는 것이 요망되고 있다.
치주질환은 치아를 지지하는 치은(잇몸) 및 턱 치조골(alveolar jaw bone) 구조물에 영향을 미치는 감염으로 인한 염증성 장애 그룹을 포함한다.
치주질환의 일차적인 원인은 치아에 부착된 세균태(bacterial plaque) 및 세균 바이오필름이다. 이들은 잇몸의 염증을 유발하여, 치주질환에서 실제의 치아-지지 구조물 및 뼈를 파괴할 수 있다. 통상, 잇몸선(gum line)의 위(치은연상)와 아래(치은연하) 모두에서 세균태 및 세균 바이오필름이 상당히 축적된다.
치은염(잇몸 염증)은, 치은염에서는, 치은에서 염증이 발생되지만, 너무 깊은(4 mm 초과) 치주낭(periodontal pocket)은 검출 불가능하며; 따라서, 연한 (골질의(bony)) 치아 지지 구조물 및 단단한 (골질의) 치아 지지 구조물의 비가역적인 파괴가 치은염과 관련이 없다는 점에서, 치주염과 구별된다. 치주염은 염증이 발생된 치은, 및 연한 (골질의) 치아 지지 구조물과 단단한 (골질의) 치아 지지 구조물의 파괴를 특징으로 하나; 치주염은 임상적으로-건강하게-보이는 치은에서는 놓쳐질 수 있다.
공개문헌(예, Pubmed search Apr 2010 / Jul 2013: MMP-8 640 / 891 Citations, MMP-8 in Periodont-/Implantology 95 / 136 Citations)의 증가로 반영되듯이 지난 20년 동안 개선된 진단 시스템에 대한 광범위한 연구 및 개발이 수행되어 왔음에도 불구하고, 치주질환 및 치과 임플란트에서의 이의 후속 질환인 임플란트 주위염(peri-implantitis)은 여전히 수십억 달러의 치과 치료 비용을 유발한다.
관심의 증가, 치료에 대한 주된 노력, 및 질환 체어 사이드(disease chair side)를 확인할 수 있는 개선된 테스트 시스템 또는 랩 테스트의 유용성에도 불구하고, 이러한 질환은 독일과 같은 산업화된 국가에서 급격하게 확산/증가하고 있다(Deutsche Mund Gesundheits Studie IV, 2006).
"근심협측(mesiobuccal) 부위 및 원심설측(distolingual) 부위에 관한 CDC 정의에 따르면, 치주염의 유병률은 2개의 연령 코호트에서 70.9% 및 87.4%였으며, 각각 1/4 및 1/2은 중증 형태를 제시한다"(B. Holtfreter 등, 2010).
지난 25년 동안, 그전 해들에서 치주염 및 다른 원인들에 의해 소실된 치아를 대체할 수 있는 치과 임플란트의 개발에 의해 복구 기술에서 급격한 진전이 이루어져 왔다.
그러나, 동일하거나 유사한 병태가 치주염에서 자연 치아에 적용되는 바와 같이, 치과 임플란트에도 적용된다.
자연 치아에 대해 전술한 바와 같이, 치주염은 주로 임플란트 표면에 접착, 임플란트와 지대주(abutment) 사이의 연결부로 및 연결부에 접착, 및 상기 보철 구조물에 접착되는 바이오필름에 존재하는 병원체에 의해 유발되며, 치과 임플란트를 둘러싼 조직의 유사한 숙주 반응이 박테리아 찌꺼기(LPS)에 의해 촉발: 유도되며, 염증 반응이 유도되고, 이러한 염증 반응은 통제를 벗어날 수 있으며, 염증 과정 중에 대량의 프로테아제, 즉 MMP-8을 방출할 것이다.
자연 치아와 유사하게, MMP-8의 불균형화된 활성화는 임플란트 주위 열구액(peri-implant sulcus fluid; PISF) 내 활성 MMP-8(aMMP-8)의 과다활성화 및 극히 높은 농도를 초래할 수 있으며(Ma J, 등, 2000, Xu L 등, 2008), 개개별로 예측 불가능한 시간 내에 치조골의 상당한 소실(임플란트 주위염)을 초래할 수 있으며, 결과적으로 임플란트의 소실을 초래할 수 있다.
일단, 임플란트 주위염의 일 단계에서는 해당 질환에 대한 치료 선택사항이 거의 없다. 치주염과 마찬가지로, 임플란트 주위염 임상 진단(Ma J, 등: 2000 및 Xu L, 등 2008)은 질환이 이미 유발한 파괴 수준을 예를 들어, 부착 소실의 탐지 또는 x-선 조사에 의해 측정함을 의미한다. 단백질 분석과 같은 다른 방법들은 특이적으로 충분하지 않은 것으로 입증되었거나, 파라미터들은 체어-사이드 진단학에 의해서는 접근 가능하지 않거나, 관련 생물학적 시료는 일상적인 진단을 위한 특수 실험실에 보내지기에 안정하지 않다.
따라서, 전문 치과 의료진, 전문 의료진 및 심지어 환자의 홈 모니터링의 경우, 활성 프로테아제(예, MMP-8)뿐만 아니라 활성화 과정을 인지할 수 있는 테스트 시스템, 특히 신속한 체어 사이드 테스트를 개발하는 것이 여전히 주로 흥미롭다. 이는 개별 치주 상황의 예측성 판단 또는 예후 분석을 개선할 수 있으며, 이는 자연 상태의 치아에서 향후 또는 기존의 치주질환의 경우에 중요하며, 임플란트의 경우, 임플란트 주위 장애의 위험성을 조기에 검출할 수 있게 한다.
의사는 전문 치과 의료진에게 가능한 한 조기에 위험 환자에 대해 알려줄 수 있을 것이며, 전문 치과 의료진은 보다 조기의 예방적 치료를 취할 수 있을 것이며, 환자는 보다 양호한 구강 위생을 실시하도록 동기 부여받을 것이다. 치주질환/장애의 조기 검출 및 후속적인 예방적 치료는, 의료 시스템이 충치 예방 전에 교육되었기 때문에, 수십억 달러의 치료 및 복구 비용의 절감에 일조할 수 있다.
더욱이, 이는 오늘날 잘 문서화되어 있으며, (만성) 치주염은 수많은 전신 질환들과 상호작용하며, 당뇨병, 심근 경색(MI), 뇌졸중 및 다른 심혈관 및 신경학적 질환(CVD), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 류마티스 관절염(RA), 모부스 크론(Morbus Crohn)(MC), 패혈증, HIV, 보렐리아증(borreliosis) 및 다른 저등급의 전신성 염증, 대사 증후군, 비만, 신증, 조직 이식, 정형외과적 장애 및 조산(PTD), 저체중아 출생 및 생식 위험, 예컨대 발기 부전, 정자 수 감소 및 정자 세포의 운동성 저하와 같은 수많은 전신 질환들에 있어서 상당한 위험 인자인 것으로 간주된다.
예를 들어, 교차비(odds ratio)는 치주염 환자 대(versus) 당뇨병을 가진 치주 건강 환자에 대해 증가하며(사망률)=7.7, PTD를 가진 치주 건강 환자에 대해 7.5, 뇌졸중을 가진 치주 건강 환자에 대해 8.5이다. 치주염은 MI, 당뇨병 및 뇌졸중에 대한 잘 인지된 위험 인자이다. 이들 연구들 다수는 또한, 치주질환의 전신성 바이오마커 및 국소(구강) 바이오마커로서의 MMP-8의 관련성을 보여주었다.
이와 같이, 예후 테스트 시스템을 사용하여 치주질환의 조기 발병을 진단하고, 치주 장애가 발병하거나 진행될 위험이 있는 환자를 확인하는 능력은 치과 산업/분야에서뿐만 아니라 사실상 전체 의료 산업/분야 및 의료 시스템에서도 중요하다. AETNA, US 의료 보험은, 예를 들어 치주 치료를 받지 않은 당뇨병 환자와 비교하여 치주 치료를 받은 당뇨병 환자의 경우 전체 의료 비용이 16% 감소하였음을 입증하였으며, 이는 구강 질환의 유의미성 및 영향을 가리키며, 예방적 치료와 조합하여 치주 위험의 개선된 조기 검출은 향후 환자 및 총 의료 비용에 대해 무엇을 의미할 수 있는지 생각해 볼 근거를 제공한다.
전신적인 MMP-8은 또한, 다른 질환들에서도 역할을 한다. 세포외 기질 턴오버에서의 MMP-8의 주요 역할, 염증 반응 및 다른 생리학적 과정의 조정, 광범위한 병태에서의 MMP-8의 연루, 및 일부 염증성 장애 및 암 진행에서 약물 표적 또는 질환 마커로서의 MMP-8의 역할은 잘 문서화되어 있다. MMP-8은 광범위한 염증성 장애 및 환자에서 가능한 약물 표적으로서 기술되어 있으며, 상승된 MMP-8 수준은 염증성 질환의 진행과 종종 연관이 있다(Dejonckheere E. 등, 2011).
조기의 혈청내 높은 MMP-8 수준은 패혈성 감염 및 심혈관 질환에서 치명적인 결과를 예측하는 것으로 확인되었다. 나아가, 박테리아 수막염(BM) 환자의 뇌척수액(CSF)에서 MMP-8 수준은 높거나 상승되어 있으며, 또한, 어린이 BM 환자의 CSF에서 MMP-8 수준은 생존자들보다 비생존자들 중에서 상당히 더 높은 것으로 나타났다.
또한, 양수에서의 염증 및/또는 감염은 조산 및 역 신생아 결과(adverse neonatal outcome)에 대한 위험 인자인 것으로 알려져 있다. MMP-8은 감염/염증의 예측 및 진단을 위한 마커, 및 또한 조산 및 신생아 합병증의 발병에 대한 마커로서 사용되어 왔다.
본 발명의 일 목적은 치주 또는 임플란트 주위 조직 분해, 치주 또는 임플란트 주위 염증과 관련된 질환을 초래하는 위험성, 소인 또는 능동적인 과정의 증가를 결정하는 신규 방법을 제공하는 것이었다.
본 발명의 또 다른 목적은 피험자 유래의 생물학적 시료에서 MMP-8 활성화 또는 활성화 과정을 검출하는 신규 방법을 제공하는 것이었다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 환자 그룹들 유래의 시료들에서 MMP-8 화학종의 존재를 검출하는 신규 방법을 제공하는 것이었다.
본 발명의 또 다른 목적은 MMP-8, 특히 MMP-8 활성화 생성물, 예컨대 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 형성; 존재; 농도 증가; 또는 활성화와 관련된 질환을 진단하는 신규 방법을 개발하는 것이었다.
조합 분석법은 또한, MMP-8 중간부 활성화 생성물이 개별적으로 또는 그룹에서 또는 보다 큰 활성을 가진 MMP-8 화학종과 함께 검출되도록 조작될 수 있다. 조합 분석법은 특히, 항체에 의해 인지되는 에피토프가 2개 분자 모두 또는 몇몇 분자들, 활성화 생성물 및 활성 MMP-8 둘 모두에 존재하는 공통 에피토프일 때 유용하며; 및/또는 에피토프가 보다 큰 활성을 가진 MMP-8 분자와 비교하여 MMP-8의 활성화 생성물에 배수(multiply)로 존재할 때 유용하며; 및/또는 MMP-8의 다수의 활성화 생성물이 입체 증배 효과(steric multiplication effect)라고 하는 현상인 활성화 과정 동안에 단일 MMP-8 분자로부터 제조될 때 유용하다.
본 발명의 측면들은 크기가 5 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 10 kDa 내지 30 kDa, 보다 바람직하게는 20 kDa 내지 35 kDa, 적합하게는 약 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14, kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 31 kDa, 32 kDa, 33 kDa, 34 kDa 및/또는 35 kDa인 MMP-8 활성화 생성물, 예컨대 MMP-8 중간부 활성화 생성물, 또는 시료에서 이러한 MMP-8 활성화 생성물의 검출에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 피험자 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계, 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물, 특히 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 시료에서 검출하는 단계, 및 선택적으로, 시료 내 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물(들)의 존재를 시료 내 활성 MMP-8의 보다 큰 부분들의 존재와 서로 관련시키는 단계를 포함하는, 시료에서 MMP-8의 활성화를 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 시료에서 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재는 시료 내 활성 MMP-8의 존재에 대해 가리키고/거나, 예측하고/거나 확인하는 것이며, 이는 예를 들어, 분석법에서 활성 MMP-8의 분석적 검출 및 이의 예측력을 증강시킨다. 예를 들어, 반복적으로 또는 만성적으로 상승된 구강액내 MMP-8 활성화 생성물은 치료 반응을 예측하고, 질환 진행, 예를 들어 치주염에서의 부착 소실의 위험이 있는 부위 및/또는 환자를 가리킨다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 질환 또는 질환 진행의 존재 또는 소인을 진단하는 것에 관한 것이다:
하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물, 예컨대 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 피험자로부터 수득된 생물학적 시료에서 결정하는 단계;
검출 결과를 참조 시료와 비교하는 단계로서, 이로써, 질환의 존재 또는 질환에 대한 소인이 진단될 것이며, 여기서,
a) 참조 시료는 정상적인 수준의 MMP-8을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 현재 해당 질환을 갖지 않거나 질환 소인을 갖지 않음을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖지 않거나 위험 소인을 갖지 않음을 가리키고, 참조 시료와 비교하여 생물학적 시료 내 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 상승된 수준은 피험자가 현재(테스트 시) 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성 증가의 소인을 가짐을 가리키거나;
b) 참조 시료는 현재 질환을 갖거나 질환 소인을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖거나 위험 소인을 가짐을 가리킨다.
본 발명의 특징적인 특색은 첨부된 청구항에 제시되어 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 MMP-8 활성화 단편을 나타내는 MMP-8 분자 화학종과 시간 분해성 면역형광측정 분석법(time resolved immunofluorometric assay)(IFMA) 및 면역-ELISA 방법(IEMA, ELISA)에 의해 분석된 MMP-8 면역반응성 수준 및 상이한 치주 염증 부담(burden) 수준들과의 연관성을 확인하는 것이었다.
도 1a는 연구 그룹 1 내지 그룹 4(실시예 1)에서 치아 수를 고려하였을 때, 흡연 상태에 따른 MMP-8 IFMA를 보여주며, 도 1b는 MMP-8 IEMA 수준을 보여준다. 그룹 1 내지 그룹 4를 통한 비흡연자에 대한 경향은 IFMA(p는 0.010) 및 IEMA(p는 0.028) 둘 모두에 대해 유의미하다.
도 2a는 MMP-8 화학종들 및 이들의 조합을 보여준다. 포레스트 블롯은 MMP-8 kDa 화학종의 유병률의 교차비(95% 신뢰 수준, CI)를 나타낸다. 종속 변수: IFMA 수준(치아 수에 의해 조정됨) > 그룹 4에서의 중앙 수준(강한 치주 염증 부담). 연관성은 유의미하다. 도 2b는 MMP-8 화학종들 및 이들의 조합을 보여준다. 포레스트 블롯은 MMP-8 kDa 화학종의 유병률의 교차비(95% CI)를 나타낸다. 종속 변수: 흡연. 연관성은 유의미하다.
도 2c는 MMP-8 화학종들 및 이들의 조합을 보여준다. 포레스트 블롯은 MMP-8 kDa 화학종의 유병률의 교차비(95% CI)를 나타낸다. 종속 변수: 흡연. 연관성은 유의미하다.
도 3은 MMP-8 IFMA 및 IEMA 수준의 진단 민감성 및 특이성의 평가(도 3a), 및 상태 변수(상태 변수)로서 강한 치주 염증 부담을 가진 25+35 kDa MMP-8 화학종 그룹 4의 유병률(도 3b)의 평가를 위한 수용자 작동 특성(receiver operating characteristic; ROC) 곡선 분석을 보여준다. ROC 곡선 하 면적, 95% 신뢰 구간 및 p-값에 대해서는 실시예 1을 참조한다.
도 4는 재조합 인간 MMP-8(Proteaimmun)의 유기수은 APMA( 4a) 및 산화적 NaOCl( 4b) 활성화제의 효과에 대한 SDS-PAGE(10%) 분석을 보여준다. rhMMP-8의 양 및 인큐베이션 시간은 지시되어 있다. APMA 및 NaOCl 둘 모두 활성화 시, 보다 낮은 분자량의 MMP-8 화학종의 발생을 유도한다. 특히, 화살표로 가리켜지는 20 kDa 내지 30 kDa 활성화 단편의 시간 의존적 형성을 관찰한다. 도 4c는 3개의 상이한 소스(Proteaimmun, Merck 및 Invent) 유래의, APMA 및 NaOCl에 의해 활성화된 rhMMP-8, 인간 체액 및 혈청을 사용한 웨스턴 면역블롯 분석을 보여준다. 레인 1: Proteaimmun rMMP-8; 레인 2: 레인 1 + APMA; 레인 3: 레인 1 + NaOCl; 레인 4: Merck rh MMP-8; 레인 5: 레인 4 + APMA; 레인 6: 레인 4 + NaOCl; 레인 7: Invent MMP-8 항원; 레인 8: 레인 7 + APMA; 레인 9: 레인 7 + NaOCl; 레인 10: 인간 치주염 치은 열구액(GCF); 레인 11: 인간 임플란트 주위염 열구액(PISF); 레인 12: 인간 교정 치료된 치아의 GCF; 레인 13: 인간 치주염 타액; 레인 14: 인간 치주염 구강 헹굼제; 레인 15, 감염된 인간 양수; 레인 16: 인간 수막염 뇌척수액; 레인 17: 인간 패혈증 혈청. MMP-8의 활성화 시 형성된 지배적인(prevalent) 20 kDa 내지 30 kDa 단편은 화살표로 가리켜진다. 실시예 2를 참조한다.
도 5 비감염된 인간 양수 시료(#16) 및 상이한 MMP-8 항체 및 상이한 MMP-8 농도로 감염된 인간 양수 시료(#12, #13 및 #19)의 웨스턴 면역블롯 분석을 보여준다.
도 6 상이한 인큐베이션 시간으로 APMA에 의해 활성화된 재조합 인간 MMP-8(Proteaimmun)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 시퀀싱에 사용된 밴드는 도에 가리켜져 있다.
도 7은 정제된 활성 MMP-8의 다양한 분획들의 SDS-PAGE를 보여준다. 시료들은 좌측부터 우측으로 존재하며; 분자량 마커는 PAGE 룰러이며, 1) 내지 4)는 정제된 hMMP-8의 다양한 분획들이고, 분자량 마커는 스펙트라 멀티컬러(Spectra Multicolor)이다.
도 8은 항-hMMP-8-MoAb 1491-E6-F7로 염색된 정제된 인간 aMMP-8의 다양한 분취물들의 웨스턴 블롯을 보여준다. 시료들은 좌측부터 우측으로 존재하며; 분자량 마커는 듀얼 엑스트라(Dual Xtra)이며, 1) 내지 4)는 정제된 hMMP-8의 다양한 분획들이고, 5)는 정제 전의 태반 추출물이다.
서열 목록
SEQ ID NO:1은 도 6의 밴드 3, 밴드 4, 밴드 5 및 밴드 6의 MMP-8 활성화 생성물, 예를 들어 크기가 25 kDa인 밴드 3에서 발견된 MMP-8 중간부 서열이다.
SEQ ID NO:2는 도 6의 밴드 2, 밴드 3, 밴드 4, 밴드 5 및 밴드 8의 MMP-8 활성화 생성물, 예를 들어 크기가 21 kDa인 밴드 4에서 발견된 MMP-8 중간부 서열이다.
본 발명자들은 놀랍게도, 활성화된 MMP-8의 존재가, 이의 새로 발견된 MMP-8 활성화 생성물, 예컨대 크기가 5 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 약 10 kDa 내지 30 kDa, 보다 바람직하게는 약 20 kDa 내지 35 kDa인 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 검출함으로써 다양한 생물학적 시료들에서 검출될 수 있음을 발견하였다. 단편화된 MMP-8은, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14, kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 31 kDa, 32 kDa, 33 kDa, 34 kDa 및 35 kDa의 크기를 가지며 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 다양한 정의된 분자 형태로 존재한다.
일 측면에서, 단편의 상이한 분자 화학종들은 시료 유형과 상관관계가 있을 수 있으며, 단편들의 특정 조합이 사용되어, 시료가 유래되는 피험자에 특정한 상태 또는 질환이 존재하거나 질환이 발병할 위험이 있는지 가리킬 수 있다.
MMP-8의 적어도 하나의 단편을 포함하는 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용함으로써 시료에서 검출될 수 있다. 분석법은 정성적 면역분석법, 준정량적 면역분석법 또는 정량적 면역분석법일 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 검출 방법의 비제한적인 예로는, 웨스턴 블로팅, IFMA, EIA, ELISA, 측류 분석법(Lateral Flow Assay), 딥-스틱 분석법(Dip-stick assay), 표면 플라즈몬 공명 분석법, 전기화학적 분석법 또는 임의의 다른 알려진 리간드 결합 또는 직접 검출 분석법 시스템을 포함한다. 직접 검출 분석법 시스템 또는 기술은, 분석을 위해 리간드 결합을 기재로 하지 않는 임의의 방법, 즉, 크기 배제 크로마토그래피[SEC], 예컨대 고압 액체 크로마토그래피[HPLC] 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC), 예컨대 SDS-PAGE; 또는 분자 분광법, 예컨대 핵 자기 공명 분광법(NMR), UV/VIS-분광법, 전기스프레이-이온화법(Elektrospray-Ionisation; ESI) 등과 같은 기술을 의미한다.
다르게 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용되는 용어들은 진단학 분야에서 보편적으로 사용되는 의미를 가진다. 구체적으로는, 하기 용어들이 하기 가리켜진 의미들을 가진다.
MMP -8 활성화 생성물은 생체내 또는 시험관내에서의 MMP-8의 활성화 동안에 자연적으로 형성되는 매트릭스 메탈로프로테이나제 8(MMP-8)의 하나 이상의 단편을 포함하는 생성물을 지칭한다. MMP-8 활성화 생성물은 내인성적으로(즉, 자가활성화) 생성되거나, 비제한적으로 APMA, NaOCl, 다른 산화적 작용제 및/또는 숙주-유래 프로테아제 및 미생물-유래 프로테아제와 같은 활성화 작용제 또는 활성화제를 사용함으로써 생성될 수 있다.
MMP -8 중간부 활성화 생성물은, 하나 이상의 서열이 실질적으로 C-말단부 또는 N-말단부가 아니며, 즉, C-말단 또는 N-말단의 전체 부분이 아닌, 총 MMP-8 서열의 중간 영역 도메인 유래의 하나 이상의 서열을 포함하는, 매트릭스 메탈로프로테이나제 8(MMP-8)의 적어도 하나의 단편을 포함하는 생성물을 지칭한다. 서열은 예를 들어, 전체 길이 단백질의 아미노산 Asn119으로부터 Ala132으로 연장되거나, 아미노산 Ile151으로부터 Asp165으로 연장될 수 있다.
활성 MMP -8은 이의 프로큐서 형태 또는 전구체 형태와 대조적으로, 상이한 형태의 활성화된 콜라게나제들을 지칭한다.
MMP -8 활성화는 MMP-8이 활성/활성화된 MMP-8으로 변환되는 생물학적 또는 생화학적 과정을 지칭한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 활성 MMP-8의 고분자량의 화학종 대신에 MMP-8 중간부 활성화 생성물과 같은 MMP-8 활성화 생성물을 검출함으로써, 활성 MMP-8의 검출이 증강될 수 있음을 발견하였다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물은 보다 높은 절대 농도로 존재하거나, 에피토프의 수는 생물학적 시료 내에서, 전형적인 크기가 55 kDa 내지 95 kDa인 보다 큰 활성을 가진 MMP-8 분자의 수보다 더 많다. 따라서, 보다 낮은 분자량의 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 바이오마커로서 사용함으로써, 예를 들어, 면역분석법에서 포착 항체에 의해 예후 값 또는 진단 값을 달성하기가 더 용이하다.
MMP-8의 보다 작은 단편이 활성화된 MMP-8의 고분자량 화학종의 검출보다 진단 및 예측 목적에 더 효과적인 이유는 완벽하게 명확하지 않다. 본 발명자들 자신을 임의의 설명적 모델로 약속하지 않으면서, 예비 관찰은, 박테리아에 의해 유발되며 환경 인자, 후천적 인자 및 유전적 인자들에 의해 지지되는, 바이오필름 PMN에서의 병원체에 대한 숙주의 면역 반응은 MMP-8의 85 kDa 프로엔자임(proenzyme)을 박테리아 공격 구획으로 가져가서, 85 kDa 프로엔자임을 활성화시킬 것임을 제안한다. 따라서, 프로엔자임 85 kDa은 64 kDa 단편으로 전환되고, 64 kDa은 콜라겐 및 박테리아/바이오필름에 결합하고, 치은 조직 및 치조골에서 콜라겐분해를 유발한다. 콜라겐에 결합할 수 있는 것보다 더 많은 64 kDa이 발생된다면, 과량의 64 kDa은 MMP 시스템의 천연 조절인자인 TIMP에 결합할 것이다.
그런 다음에도, 과량의 64 kDa이 여전히 형성된다면, 이들은 내인성적으로 및/또는 산화제 및 숙주-유래 프로테아제 및/또는 미생물-유래 프로테아제의 작용에 의해 40 kDa 단편으로 단편화되며, 자가분해에 의해 24 kDa 단편으로 단편화되고, 또한 아마도 다수의 작은 MMP-8 단편들, 예를 들어, 5 kDa, 9 kDa, 14 kDa 등으로 단편화된다.
40 kDa 단편도 85 kDa 프로엔자임의 추가적인 활성화를 유도 및 지지하는 것으로 알려져 있으나, 활성은 감소되어 있다.
생리학적 상황은, 우선 I기에서, 초기에 활성화된 64 kDa 중 대부분이 치주 병소에서 콜라겐 유형 1에 결합하며, 콜라겐분해를 위해 바이오필름에서 박테리아에 결합하는 것으로 보인다.
이후, II기에서; 과량의 64 kDa들이 이용 가능하게 된다면, 이들은 TIMP(TIMP1 및 TIMP2)에 결합하고, 40 kDa으로 단편화되기 시작할 수 있으며, 이러한 40 kDa 또한 TIMP에 결합할 것이다. 64 kDa 및 40 kDa 둘 모두는 TIMP1/TIMP2의 억제를 위해 약 1:1의 몰비로 복합체를 형성한다. 64 kDa 및 40 kDa은 치은 매트릭스 및 바이오필름에 결합되기 때문에, 따라서, 이들은 아마도 치은 열구액(GCF) 및 임플란트 주위 열구액(PISF) 또는 타액 또는 구세액에 용해된 GCF와 같은 표본에서는 이용 가능성이 낮다. 그러나, 24 kDa 및 다른 작은 MMP-8 단편들과 같은 "자유(free)" 비결합 단편은 상승된 농도 또는 고 농도로 이용 가능하게 되며, 이는 MMP-8의 조기 활성화 과정의 기(phase)를 가리키고 반영한다.
III기에서; 85 kDa에서 64 kDa으로의 활성화가 계속되어 과량의 64 kDa이 생성된다면, 이들은 40 kDa 단편(활성화를 지지하고 보다 심각한 상황을 초래할 것임) 및 작은 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 비롯한 다른 단편들로 자가분해될 것이다. 더 작은 단편, 즉, 아마도 5 kDa 내지 35 kDa의 다른 모든 단편들이 표본에서 이용 가능하게 될 것이며, 이는, 신속한 연조직 및 경조직 분해의 위험이 상승된 기를 가리키거나, 반영하거나 나타낸다.
진단/바이오마커 정보에 대해, 이는 즉, 생체내 자가분해에 의해 형성된 이러한 보다 작은 단편들이 임상적 상황에서, "결합된" 64 kDa 또는 "저해된" 64 kDa의 자연적인 평형이 균형을 잃고 있거나 잃었을 때, 및 과량의 64 kDa이 자가분해 또는 추가적인 단편화에 이용가능할 때에만 고농도를 보여주고 있음을 의미하며, 이는 질환 형성 또는 진행에 대한 상승된 위험성을 가리킨다.
본 발명의 실시형태 1은, MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물이 MMP-8의 활성화 단편을 포함하고, 크기가 20 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 약 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa 또는 35 kDa인 것을 특징으로 하는, MMP-8 활성화 생성물, 바람직하게는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 제공한다.
실시형태 2는, 활성화 생성물 및 활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 APMA를 사용하여 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, 실시형태 1에 따른 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 제공한다.
실시형태 3은, 활성화 생성물 및 활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 단백분해성 제거에 의해, 또는 NaOCl 또는 재활성 산소종에 의한 산화적 활성화를 수반하는 화학적 변형에 의해 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, 실시형태 1에 따른 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 제공한다.
실시형태 4는, 활성화 생성물이 MMP-8의 (C-말단 또는 N-말단이 아닌) 중간부 도메인인 서열 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 실시형태 1 내지 3 중 어느 한 실시예에 따른 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 제공한다.
실시형태 5는, 활성화 생성물이 MMP-8의 (C-말단 또는 N-말단이 아닌) 중간부 도메인인 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는, 실시형태 1 내지 4에 따른 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 제공한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는,
A. 피험자 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계;
B. MMP-8의 하나 이상의 활성화 단편을 포함하며 크기가 5 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 10 kDa 내지 30 kDa, 보다 바람직하게는 약 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa 또는 35 kD인 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및
C. 선택적으로, 시료 내 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 활성 MMP-8의 존재와 서로 관련시키는 단계; 및/또는
D. 선택적으로, 시료 내 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 활성 MMP-8의 다른 더 큰 부분들의 존재와 서로 관련시키는 단계
를 포함하는, 시료에서 MMP-8 활성화를 결정하는 방법을 제공하며,
여기서, 생물학적 시료에서의 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재는 시료에서의 활성 MMP-8의 존재를 가리키고/거나 확인하고/거나 예측하는 것이며, 분석법에서의 활성 MMP-8의 분석적 검출 및/또는 이의 예측력을 증강시킨다.
하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재는 전형적으로, 생물학적 시료에서 MMP-8의 활성화 생성물 검출용 리간드 시스템을 사용함으로써 결정된다. 바람직하게는, 리간드 시스템은 하나 이상의 항체, 항체 쌍 및/또는 항체 단편을 포함하며, 분석법은 정량적 면역분석법, 준정량적 면역분석법 또는 정성적 면역분석법, 예컨대 웨스턴 블로팅, IFMA, EIA, ELISA, 측류 분석법, 딥-스틱 분석법, 표면 플라즈몬 공명 분석법, 전기화학적 분석법 또는 임의의 다른 알려진 리간드 결합 분석법 시스템이다. 본 발명의 상이한 측면들에 따라 사용되는 항체는 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체, 선택적으로 재조합 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재는 생물학적 시료에서 MMP-8의 활성화 생성물의 직접 단백질 검출 기술을 사용함으로써 결정된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 방법은 하기 단계를 포함하며, 질환 또는 질환 진행의 소인 또는 위험성을 진단하는 데 사용된다:
I. MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 피험자로부터 수득된 생물학적 시료에서 결정하는 단계;
II. 단계 I에서 수득된 결과를 참조 시료와 비교하는 단계로서, 이로써, 질환 또는 질환 진행에 대한 소인 또는 위험성이 진단될 것이며, 여기서,
a) 참조 시료는 현재 정상적인 수준의 MMP-8을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 현재 해당 질환을 갖지 않거나 질환 소인을 갖지 않음을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖지 않거나 위험 소인을 갖지 않음을 가리키고, 참조 시료와 비교하여 생물학적 시료 내 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 상승된 수준은 피험자가 현재 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성 증가의 소인을 가짐을 가리키거나;
b) 참조 시료는 현재 질환을 갖거나 질환 소인을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖거나 위험 소인을 가짐을 가리킨다.
본 발명의 상이한 실시형태들에 따르면, 시료는 전형적으로, 치은 열구액, 임플란트 주위 열구액, 구강 플라크, 치태, 구강 헹굼제, 구세액(mouth wash), 타액, 치근관액(root canal fluid), 상처 삼출액(wound exudate), PUS, 경구 바이오필름, 조직 생검, 경구 면봉, 구강 병소 유래의 혈액으로부터 수득되거나, 대안적으로 시료는 구강으로부터 유래되지 않지만, 양수, 혈청, 혈장, 질 세척제, 세비액(nasal wash), 부비동, 귀, 동(sinus), 소변, 활액, 뇌척수액, 대변, 스왑(swap), 눈물, 세척액(lavage) (폐), 가래, 조직 생검, 상처 삼출액 및/또는 땀으로부터 유래된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 질환은 치주 염증, 치주 조직 소실(분해), 치은염, 치주염, 임플란트 주위염, 치아 소실, 치과 임플란트 차도, 치조골 소실, 점막염, 점막 변경, 치근부 치주 염증, 치근관 염증, 충치, 수직 턱뼈 파열, 교정적 치아 이동, 알레르기성 염증 반응 및/또는 구강 박테리아에 의해 유발되는 균혈증(bacteraemia) 중 하나 이상이다.
본 발명의 추가적인 실시형태에 따르면, 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재는 만성 치주염, 급성 치주염 또는 임플란트 주위염과 같은 치주질환을 가리키거나 예측하며, 여기서, 이들 구강 질환은 I형 당뇨병, II형 당뇨병, COPD(만성 폐색성 폐질환), 대사 증후군, 비만, 류마티스 질환, 관절염/관절 질환, 골다공증, 정형외과학적 질환, 자가면역 질환, 조직 이식 질환, 관절염, 말단 인공삽입물의 감염 또는 차도, 뇌졸중, 심근경색, 동맥경화증과 같은 심혈관 질환, 비제한적으로 조기분만, 저체중아 출생과 같은 임신 관련 위험, 발기 부전, 정자 수 감소 및 정자 세포의 운동성 저하와 같은 생식 위험과 같은 전신 질환 또는 장애들을 추가로 가리키거나, 증강시키거나 또는 공지된 위험 인자이다.
본 발명의 추가적인 실시형태에 따르면, 질환은 하기의 질환들이다:
a) 양막내 염증, 산모에서의 염증, 신생아 질환, 조산, 저체중아 출생 및 양막 병태(amniotic pathology)와 같은 부인과 질환;
b) 악성종양, 예를 들어 유방암 및 백혈병과 같은 암성 질환;
c) 류마티스 관절염 및 관절증과 같은 관절/류마티스 질환;
d) 모든 형태의 당뇨병, 네프론 질환, 신장 질환 및 비-치유 당뇨성 상처를 포함하는 당뇨 질환;
e) 원추 각막(Keratoconus) 및 투명 변연부 각막 변성(pellucid marginal degeneration of the cornea)과 같은 안 질환(예, 귀액으로부터);
f) 이비인후과학 질환(예, 귀, 부비동으로부터);
g) 보렐리아증(borreliosis), 패혈증, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), HIV, H. 파일로리-감염, 전신 염증, 저등급 전신 염증, 폐 감염과 같은 감염 및 염증, 및 기관지염과 같은 염증, 기관지 확장증, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 소아과학 감염/염증, 신경학적 감염, 수막염(예, 뇌척수액으로부터) 및 모부스 크론(Morbus Crohn)과 같은 염증 및 질환;
h) 혈관 질환과 같은 심혈관 질환, 동맥반내 염증과 같은 아테롬성 동맥 경화증, 색전증 및 뇌졸중;
i) 상처(예, 치명적인 상처, 만성 상처, 비-치유 상처 및 피부 화상과 같은 상처 삼출액으로부터);
j) 장 질환(대변 테스트로부터);
k) 외상 또는 사고 후 질환; 및/또는
l) 대사 증후군 및 비만.
본 발명의 실시형태는 또한, MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물 또는 서열 정보의 결정을 토대로, 개체가 특정 질환 또는 장애를 가지거나 특정 질환 또는 장애(상기 정의됨)에 대한 소인을 갖는지 결정하는 방법을 수행하기 위해, 시스템, 및 컴퓨터 시스템을 유발하는 컴퓨터 판독 매체를 제공한다.
특히, 나아가, 본 발명은 하기를 포함하는, 생물학적 시료 분석용 시스템에 관한 것이다:
a) 생물학적 시료를 수용하고, MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물을 결정하도록 되어 있는 결정 모듈로서,
여기서, MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물은 MMP-8의 활성화 단편을 포함하고, 크기가 5 kDa 내지 35kD인, 결정 모듈; 및/또는
b) 서열 정보로서, 여기서, 서열 정보는 SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 2를 포함하는, 서열 정보;
c) 결정 모듈로부터의 서열 정보를 저장하도록 되어 있는 저장 장치;
d) 저장 장치에 저장된 서열 정보를 참조 데이터와 비교하고, 비교 결과를 제공하도록 개조된 비교 모듈로서, 여기서, 비교 결과는 하기로부터 유래되는 참조 시료로부터 유래되는, 비교 모듈;
현재 정상적인 수준의 MMP-8을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로서, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 현재 해당 질환을 갖지 않거나 질환 소인을 갖지 않음을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖지 않거나 위험 소인을 갖지 않음을 가리키는, 피험자 또는 환자 그룹; 및/또는
질환을 가지거나 질환 소인을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로서, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 현재 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성 증가의 소인을 가짐을 가리키는, 피험자 또는 환자 그룹; 및
e) 부분적으로 비교 결과를 토대로 하는 내용을 사용자에게 디스플레이하기 위한 디스플레이 모듈로서, 여기서, 내용은 참조 시료와 비교하여, 생물학적 시료에서의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재 또는 상승된 수준을 가리키는 신호이며, 이는 현재 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가지거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성이 증가되는 소인을 가짐을 가리키는, 디스플레이 모듈.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 나아가 본 발명은 컴퓨터에서 하기 단계를 포함하는 방법을 실행하기 위한 비교 모듈 및 디스플레이 모듈을 포함하는 소프트웨어 모듈을 정의하기 위해, 컴퓨터 판독 지침이 기록된 컴퓨터 판독 매체에 의해 이용될 수 있다:
a) 비교 모듈을 이용하여, 저장 장치에 저장된 데이터를 참조 데이터와 비교하여, 비교 결과를 제공하는 단계로서, 여기서, 비교 결과, 즉, 참조 시료와 비교하여, 생물학적 시료에서의 MMP-8 활성화 생성물 또는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재 또는 상승된 수준은 현재 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가지거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성이 증가되는 소인을 가짐을 가리키는, 단계; 및
b) 부분적으로 비교 결과를 토대로 하는 내용을 사용자에게 디스플레이하는 단계로서,
여기서, 내용은 현재 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가지거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성이 증가되는 소인을 가짐을 가리키는 신호인 단계.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 다양한 실시형태들을 예시할 목적으로만 제공되며, 이들은 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것이 아니다. 당업자는, 본 발명이 첨부된 청구항에 의해 정의되며, 본 목적들을 수행하고, 전술한 목표 및 이점들을 수득하도록 잘 적응화됨을 쉽게 알게 될 것이다.
MMP -8의 면역형광측정 분석법
MMP-8 농도를 시간 분해성 면역형광측정 분석법(IFMA)에 의해 결정하였다. 모노클로날 MMP-8-단편 특이적 항체 1491-E6-F7 및 1492-B3-C11(Medix Biochemica, Kauniainen, Finland)을 각각 캐칭 항체(catching antibody) 및 트레이서 항체(tracer antibody)로서 사용하였다. 트레이서 항체를 유로퓸-킬레이트(Hemmila 등, 1984)를 사용하여 표지하였다. 분석법 완충제는 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5 mM CaCl2, 50 μM ZnCl2, 0.5% BSA, 0.05% 소듐 아자이드 및 20 mg/l 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)을 함유하였다. 시료를 분석법 완충제에서 희석시키고, 1시간 동안 인큐베이션한 후, 트레이스 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 증강 용액을 첨가하고, 5분 후, 형광을 1234 Delfia Research Fluorometer(Wallac, Turku, Finland)를 사용하여 측정하였다. MMP-8에 대한 모노클로날 항체의 특이성은 폴리클로날 MMP-8의 특이성에 상응하였다.
웨스턴 면역블로팅
분자 형태의 MMP-8을, 변형된 ECL 웨스턴 블로팅 키트를 제조업체(GE Healthcare, Amersham, UK)가 권고한 프로토콜에 따라 사용함으로써 검출하였다. 가리켜진 재조합 인간 MMP-8 및 가리켜진 체액/분비물 및 혈청 시료를 임의의 환원제 없이 Laemmli's 완충제와 함께 혼합하고, 5분 동안 가열한 후, 11% 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 단백질을 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막(Protran, Whatman GmbH, Dassel, Germany) 상으로 전기이동시켰다. TBST 완충제(22 mM NaCl 및 0.05% Triton-X를 함유하는 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) 중 5% 밀크 파우더(Valio Ltd., Helsinki, Finland)를 1시간 동안 사용하여 비특이적인 결합을 차단하였다. 그런 다음, 막을 1차 항체 1491-E6-F7(Medix Biochemica, Kauniainen, Finland)과 함께 밤새 인큐베이션하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제-연결 2차 항체(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 단계 사이에 막을 TBST에서 15분 동안 4회 세척하였다. 단백질을 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 시각화하였다.
농도계 분석
MMP-8의 상이한 분자량 형태들의 강도를 백그라운드 값 보정에 의해, GS-700 Imaging Densitometer Scanner(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Bio-Rad Quantity One 프로그램을 사용하여 스캐닝하고 분석하였다.
시퀀싱
단백질 동정 및 프로테옴(proteome) 데이터 분석을 Turunen 등(2012)에 의해 기술된 방법에 따라 수행하였다.
MDmAb 면역염색에 매칭하는 절제된 겔 밴드를 세척하고, 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 탈수시켰다. 단백질을 20 mM 다이티오트레이톨을 사용하여 환원시키고, 56℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 55 mM 요오도아세타미드 - 0.1 M 암모늄 하이드로겐 카르보네이트(NH4HCO3)를 사용하여 실온의 암실에서 15분 동안 알킬화시켰다. 0.1 M NH4HCO3를 사용하여 세척하고, ACN을 사용하여 탈수시킨 후, 겔 조각을 0.1 M NH4HCO3 중 시퀀싱 등급 변형된 트립신(Promega, USA) 10 ㎕ 내지 15 ㎕에서 최종 농도 0.01 ㎍/㎕ 트립신으로 재수화시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 분해시켰다. 트립신 분해 펩타이드를 각각 실온에서 15분 동안 25 mM NH4HCO3에서, 그런 다음 5% 포름산에서 2회 연속적으로 인큐베이션함으로써 겔 조각으로부터 용출시켰다. 생성되는 트립신 분해 펩타이드를 Zip Tip μC-18 역상 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 탈염시키고, 50% ACN - 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 MALDI 표적 플레이트 상으로 직접 용출시켰다. 33% ACN - 0.1% TFA 중 포화된 매트릭스 용액 α-시아노-4-하이드록시 신남산(CHCA)(Sigma, USA)을 첨가하였다.
MALDI-TOF 분석을 SmartBeam™ 레이저(355 nm)가 구비되고, 양성 및 반사 모드에서 작동되는 Autoflex III(Bruker Daltonics, Bremen Germany)에서 수행하였다. 전형적으로, 질량 스펙트럼을, MS/MS 스펙트럼에 대해 2000개의 레이저 샷 및 10000개 이하의 스펙트럼을 축적함으로써 획득하였다. 펩타이드 보정 표준(Bruker Daltonik GmbH, Leipzig, Germany)을 사용하여 분자 지정(molecular assignment)에 대해 외부 보정(external calibration)을 수행하였다. 트립신 자가분해 펩타이드 질량을 사용하여, 보정을 체크하거나 올바르게 하였다. 이들 자가분해 펩타이드, 및 이로부터 유래되는 케라틴이 존재할 때, 이들을 연구 제출 전에 제거하였다. 단백질 동정은, 파일(동일한 샷으로부터 기원하는 PMF 및 몇몇 리프트 스펙트럼(Lift spectra)(MSMS))들을 조합하고, SwissProt 데이터베이스에 대해 검색함으로써 수행하였다. '다른 박테리아'는 분류학 분야(42100개가 넘는 서열)에서 매트릭스 Science's Mascot(Matrix Science Ltd, UK)를 사용하여 선별하였다. FlexAnalysis™ v3.0 및 Biotools™ v3.1 소프트웨어(Bruker Daltonics)를 사용하여, 분자적 동위원소 질량을 각각 질량 목록 데이터 전송 및 Mascot 서버의 데이터베이스 사이의 검색 엔진 인터페이스로서 MS 스펙트럼의 피크에 지정하였다. 하기 파라미터들인 조합된 MS 및 MS/MS 검색을 위한 0.1 Da 전구체 관용성 및 0.5 Da 또는 1 Da MS/MS 단편 관용성을 검색용으로 설정하고, 고정 변형 및 가변 변형을 고려하였으며(각각 카르바미도메틸화된 시스테인 및 산화된 메티오닌), 하나의 트립신이 누락된 절단을 허용하였다. 계산된 분자량 및 관찰된 분자량뿐만 아니라 MS/MS 질량 스펙트럼의 품질 및 동정된 펩타이드들과 매칭하는 이들의 아미노산 서열을 비교함으로써, 단백질 동정을 추가로 평가하였다.
실시예 1
물질 및 방법
무작위로 선별된 192명의 치과 공중 진료소 환자들을 이러한 단면 연구에 포함시켰다. 연구 프로토콜은 Leppilahti JM 등(2011)에 의해 상세히 제시되어 왔다. 간략하게는, 구강 검사는 플로리다-프로브에 의한 치주낭 탐침 깊이(pocket probing depth; PPD)의 측정 및 2명의 교정 일반 치과의에 의해 수행되는 탐침 시 출혈(bleeding on probing; BOP)의 측정을 포함하였다. 백그라운드 특징을 설문조사에 의해 기록하고, 구강 헹굼 시료를 모든 환자들로부터 수집하였다. 모든 환자들은 고지에 입각한 동의(informed consent)를 제공하였으며, 연구 프로토콜은 헬싱키 대학교의 치의학부 및 헬싱키 대학교 중앙 병원의 윤리 위원회에 의해 승인받았다.
연구 환자들을, 치주 염증 부담 지수(Lindy O 등 2008)와 BOP%(Leppilahti JM 등 2011)를 조합함으로써 이들의 치주 염증 부담 수준을 기준으로 4개의 그룹으로 범주화하였다. 형성된 환자 그룹은 1) 깊어진(4 mm 이상) 치주낭을 갖지 않으며 BOP가 10% 미만인 31명의 치주 건강 피험자(그룹 1), 2) BOP가 10% 이상이지만 약한(mild) 치주 염증 부담을 가진 것으로 간주되는 깊어진 치주낭을 갖지 않는 17명의 환자(그룹 2), 3) PIBIxBOP가 100 이하인 97명의 환자(온건한 치주 염증 부담 수준; 그룹 3) 및 4) PIBIxBOP가 100 초과인 47명의 환자(강한 치주 염증성 수준; 그룹 4)였다.
구강 헹굼 시료
1회용 플라스틱 파이펫을 사용하여, 수돗물 1 ml을 환자의 입 안에 넣고, 1분 동안 헹굼한 후, 헹굼액을 튜브에 수집하였다. 추가적인 분석을 위해 시료를 즉시 동결시켰다(Leppilahti JM 등 2011).
MMP -8 분석
구강 헹굼 시료를 동결시킨 후, 이를 Hanemaaijer R 등(1997)에 의해 기술된 바와 같이 시간 분해성 면역형광 분석법(IFMA)에 의해 MMP-8 수준에 대해 분석하였다. 간략하게는, 모노클로날 MMP-8-단편 특이적 항체 1491-E6-F7 및 1492-B3-C11을 각각 캐칭 항체 및 트레이서 항체로서 사용하였다. 트레이서 항체를 유로퓸-킬레이트를 사용하여 표지하였다(문헌[Hemmila et al. 1984, Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem 137: 335-343]). 분석법 완충제는 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM CaCl2, 50 μM ZnCl2, 0.5% 소 혈청 알부민, 0.05% 소듐 아자이드 및 20 mg/리터 DTPA를 함유하였다. 시료를 분석법 완충제에서 희석시키고, 1시간 동안 인큐베이션한 후, 트레이스 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 증강 용액을 첨가하고, 5분 후, 형광을 1234 Delfia Research Fluorometer(Wallac, Turku, Finland)를 사용하여 측정하였다.
구강 헹굼 시료의 MMP-8 수준을 또한, 전술한 IEMA 방법에 의해 분석하였다. 또한, 스캐닝 이미지 분석에 의해 MMP-8의 상이한 분자 형태들(21 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 45 kDa, 55 kDa 및 60 kDa 내지 70 kDa)을 동정하기 위한 IFMA 방법의 트레이서 항체(1492-B3-C11)를 이용하는 전술한 웨스턴 면역블로팅에 의해 시료를 분석하였다.
데이터 분석
상이한 MMP-8 분자 형태의 유병률 및 총 MMP-8으로부터의 비율을 스캐닝 이미지로부터 분석하고, 모든 환자들에 대해 계산하였다. MMP-8 IFMA 및 IEMA 수준, 각각의 MMP-8 분자 형태들의 절대량 및 이들의 비율뿐만 아니라 조합들을 상이한 연구 그룹들 사이에서와 흡연자들과 비흡연자들 사이에서 비-파라미터 테스트(페어와이즈 비교를 위한 Mann-Whitney 테스트, 다수의 그룹들에 대한 Kruskall-Walllis 테스트 및 오더드 대안(ordered alternative)들에서의 트렌드에 대한 Joncheere-Terpstra 테스트)에 의해 비교하였다. 상이한 연구 그룹들에서 상이한 MMP-8 kDa-화학종들의 유병률/발현을 Chi Square 테스트에 의해 분석하였다.
하기 로지스틱 회귀(logistic regression)를 비조정(non-adjusted) 및 다중조정(multi-adjusted)으로서 진행시켰다:
1) IFMA 및 IEMA 수준과 상이한 MMP-8 kDa 화학종들의 유병률(종속 변수)과의 연관성; 다중-조정된 로지스틱 회귀 분석에서, 연속 변수로서 치아 수, BOP%, 및 4 mm 내지 5 mm 치주낭의 수 및 6 mm 이상 치주낭의 수 및 이분(예/아니오) 변수로서 흡연,
2) MMP-8 kDa 화학종의 유병률, 비율 및 절대 스캐닝 단위 및 이들의 조합과 높은 IFMA 및 IEMA 수준(그룹 4의 치아 수 수준과 강한 치주 염증 부담을 고려하여 중앙 IFMA 또는 IEMA 이상의 수준)과의 연관성; 다중-조정된 모델에서, 연속 변수로서 BOP%, 및 4 mm 내지 5 mm 치주낭의 수 및 6 mm 이상 치주낭의 수 및 이분(예/아니오) 변수로서 흡연,
3) MMP-8 kDa 화학종과 강한 치주 염증 부담 수준(그룹 4)과의 연관성; 다중-조정된 모델에서, 연속 변수로서 BOP%, 및 4 mm 내지 5 mm 치주낭의 수 및 6 mm 이상 치주낭의 수 및 이분(예/아니오) 변수로서 흡연,
4) MMP-8 kDa 화학종과 흡연과의 연관성; 다중-조정된 모델에서, 연속 변수로서 치아 수, BOP, 및 4 mm 내지 5 mm 치주낭의 수 및 6 mm 이상 치주낭의 수.
강한 치주 염증 부담을 가진 환자의 인지 모델을 전방 단계적 로지스틱 회귀 분석에 의해 수행하였다. IFMA 및 IEMA 수준(치아 수를 고려함), BOP% 및 흡연 상태(예/아니오)와 더불어, 21 kDa, 25 kDa 및 35 kDa MMP-8 화학종의 유병률, 절대량 및 비율을 하나씩 및 조합으로서 테스트하였다.
수용자 작동 특성(ROC) 분석을 실시하여, 연구 그룹에서 MMP-8 IFMA 및 IEMA 수준의 진단 민감성 및 특이성, 및 25+35 kDa 화학종의 유병률을 평가하였다.
0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다. 통계학적 분석은 IBM SPSS Statistics version 20에 의해 수행하였다.
결과
표 1은 치주 염증 부담을 기준으로 한 4개의 연구 그룹들의 특징을 보여준다. 그룹 1 및 그룹 2에서, 흡연자는 단지 4명(12.9%) 및 3명(17.6%)만 존재하였으며, 이들은 모두 하루에 10개 이하의 담배를 피웠다. 그룹 3 및 그룹 4에서, 흡연은 보다 통상적이었으며[각각 20명(20.6%) 및 23명(48.9%)], 그룹 3에서 10명(50%)의 환자 및 그룹 4에서 17명(73.9%)의 환자는 하루에 10개 초과의 담배를 피웠다. 남성 환자의 수는 치주 염증 부담이 증가함에 따라 증가하였다(p는 0.011).
Figure pct00001
MMP -8 kDa 화학종의 유병률, 절대량 및 비율
모든 연구 그룹들에 대해 상이한 MMP-8 kDa 화학종들의 유병률의 백분율, 및 절대량(스캐닝 단위) 및 비율의 중앙(IQR) 수준을 표 3에서 제시한다. 모든 연구 그룹들 사이에서 유의미한 차이를 보여준 이들 MMP-8 분자 형태, 즉, 25 kDa 및 35 kDa 화학종의 유병률 및 절대량을 흡연자 및 비흡연자들에 대해 개별적으로 계산하여 표 2에 추가로 제시한다.
그룹 4에서, 25 kDa, 35 kDa 및 25+35 kDa 화학종의 유병률 및 절대량 둘 모두는 흡연자들에서 유의미하게 더 높았다. 25 kDa 화학종의 유병률은 모든 그룹들 사이에서 유의미하게 상이하였으며(p는 0.025), 흡연자들(p는 0.011)과 비흡연자들(p는 0.046) 둘 모두에서의 25+35 kDa의 유병률은 그룹 4에서 더 높았다. 비흡연자들 사이에서, 35 kDa 화학종의 총량은 모든 연구 그룹들 사이에서 유의미하게 상이하였다. 조합 그룹 1 내지 3 대 그룹 4에서의 차이를 분석하였을 때, 그룹 4의 흡연자들에서, 25 kDa, 35 kDa 및 25+35 kDa 화학종의 유병률이 유의미하게 더 높았다(각각 p-값이 0.011, 0.038 및 0.005).
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
MMP -8 IFMA IEMA 수준
IFMA와 IEMA 분석 결과 사이의 상관관계는 매우 양호하였다(Pearson 상관 계수 0.954, p가 0.01 미만인 수준에서 유의미함). 현재의 IFMA 분석과 초기의 IFMA 분석 사이의 Pearson 상관 계수(Leppilahti 등 2011)는 p가 0.01 미만인 수준에서 0.627이었다.
표 4는 모든 연구 그룹들에 대해 치아 수 및 흡연 상태를 고려하였을 때, IFMA 및 IEMA에 의해 분석한 MMP-8 수준을 제시한다. 오더드 대안들(p는 0.035)에 대해 테스트하였을 때, MMP-8 IFMA 수준을 증가시키는 데 있어서 그룹 1 내지 4에서 상당한 트렌드가 존재하였으며, IEMA의 경우 이러한 트렌드는 유의미성에 도달하였다(p는 0.058). 치아 수를 고려하였을 때, IFMA 및 IEMA 둘 다에 대한 트렌드는 그룹 1 내지 4에서 유의미하였다(각각 p는 0.016 및 p는 0.025). 그룹 4의 수준을 그룹 1 내지 3의 수준과 비교하였을 때, 모든 비교들은 p-값이 0.035, 0.033, 0.013 및 0.011로 유의미한 결과를 제공하였다. 그룹 1 내지 3 사이의 수준들은 유사하였다(각각 p-값이 0.643, 0.822, 0.647 및 0.816).
흡연을 고려하였을 때, 트렌드는 비흡연자들보다 더 강하게 되었다: IFMA에 대해 p는 0.020이고, IEMA에 대해 p는 0.038이며, 치아 수도 고려하였을 때, IFMA에 대해 p는 0.010이고, IEMA에 대해 p는 0.028이었다(표 4, 도 1). 흡연자들에 대해 유의미한 트렌드는 발견되지 않았다. 치아 수를 고려하여 그룹 4의 흡연자들 및 비흡연자들의 수준을 그룹 1 내지 3의 흡연자들 및 비흡연자들의 수준과 비교하였을 때, 그룹 4의 비흡연 환자의 IFMA 및 IEMA 수준이 다른 연구 그룹들보다 유의미하게 더 높았다(각각 p-값은 0.009 및 0.013). 그러나, 그룹 3 및 그룹 4에서 연구 피험자들을 비흡연자, 일일 10개 이하의 담배를 피는 환자 및 일일 10개 초과의 담배를 피는 환자들로 나누었을 때, 통계학적 유의미성이 발견되지 않긴 했지만, 일일 10개 초과의 담배를 피는 흡연자들에서의 분포는 일일 10개 이하의 담배를 피는 환자에서보다 더 넓었으며, 특히 그룹 4에서는 비흡연자들과 유사하였다(도 1).
상이한 MMP -8 kDa 화학종들에 관한 IFMA IEMA 수준
IFMA 및 IEMA 수준은 21 kDa MMP-8 화학종 양성 환자에서 유의미하게 더 높은 수준에 있었다(각각의 p-값은 0.011 및 0.003이고; 비흡연자의 경우 p-값은 0.005 및 0.002이며; 흡연자들의 경우 차이는 유의미하지 않았음). 그러나, 흡연은 21 kDa 화학종의 유병률에 대해 유의미한 효과를 갖지 않았다.
다중-조정된 로지스틱 회귀 분석에서, IFMA 및 IEMA 수준은 21 kDa(IFMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.008; IEMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.004), 21 kDa과 25 kDa의 조합(IFMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.002; IEMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.001) 및 25 kDa과 35 kDa 화학종(21-35 kDa)(IFMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.002; IEMA에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.001)의 유병률과 연관이 있었으나, 25 kDa 및 35 kDa 화학종 단독의 유병률과는 연관이 없었다. 또한, 21+45 kDa 화학종의 조합은 비조정된 로지스틱 회귀 분석에서 IFMA 및 IEMA 수준과 연관이 있었다(둘 다에 대해, OR은 1, 95% CI 1 내지 1.001, p는 0.028). 다중-조정된 로지스틱 회귀 분석에서 다른 공변량들 중 흡연이 25 kDa, 35 kDa, 25+35 kDa, 21+35 kDa 화학종과 유의미하게 연관이 있었으며, BOP는 45 kDa, 21+45 kDa, 21-45 kDa, 25+45 kDa 및 35+45 kDa 화학종과 유의미하게 연관이 있었고, 둘 다 IFMA 또는 IEMA가 공변량일 때 그러하였다.
나아가, MMP-8 kDa 화학종 및 이들의 조합의 유병률, 총 스캐닝 단위와 절대 스캐닝 단위로부터의 비율과 높은 IFMA 수준(치아 수를 고려하여 그룹 4의 중앙 수준과 같거나 높은 수준)과의 연관성을 분석하였다. 21 kDa(p는 0.011), 25 kDa(p는 0.050), 21+25 kDa(p는 0.011), 21+35 kDa(p는 0.006), 21+45 kDa(p는 0.012), 21-35 kDa(p는 0.009) 및 21-45 kDa(p는 0.010)의 절대량(삽입 어구에서 다중-조정된 회귀 분석에 대한 p-값) 및 총 MMP-8 양(p는 0.010)은 비조정된 회귀 분석 및 다중-조정된 회귀 분석 둘 모두에서 높은 IFMA 수준(도 2a)과 연관이 있었다.
높은 IEMA 수준에 대해 유사한 테스트를 수행하였으며; 다중-조정된 회귀 분석에서, 21 kDa(p는 0.013), 25 kDa(p는 0.044), 21+25 kDa(p는 0.011), 21+35 kDa(p는 0.006), 21+45 kDa(p는 0.014), 21-35 kDa(p는 0.007) 및 21-45 kDa(p는 0.008)의 총량 및 총 MMP-8(p는 0.007)은 유의미하였다.
21 kDa 화학종에 대한 다른 MMP -8 분자 형태들의 유병률
25 kDa 및 35 kDa 화학종의 유병률을 21 kDa 화학종 양성 및 음성 피험자에 대해 분석하였다. 모든 연구 피험자들을 함께 분석할 때, 35 kDa 화학종 유병률은 21 kDa 음성 환자(56.5%)에서보다 21 kDa 양성 환자(89.6%)에서 유의미하게 더 높았다(p는 0.001 미만). 21 kDa 화학종이 양성/음성일 때, 그룹 3에서 25 kDa 화학종에 대해 88.3%/44.3%로 유의미한 차이가 발견되었으며(p는 0.001 미만); 21 kDa 화학종이 양성/음성일 때, 그룹 4에서 35 kDa 화학종에 대해 각각의 값은 94.7%/71.4%였고(p는 0.046), 25 kDa 화학종에 대해 100%/71.4%(p는 0.011)이었다.
IFMA , IEMA MMP -8 분자 형태들과 강한 치주 염증 부담과의 연관성
비조정된 분석에서, 25 kDa(OR 2.566, 95% CI 1.114 내지 5.909, p는 0.027), 25+35 kDa(OR 2.586, 95% CI 1.221 내지 5.477, p는 0.013) 및 21-45 kDa(OR 3.10, 95% CI 1.121 내지 8.568, p는 0.029) 화학종의 유병률은 강한 치주 염증 부담과 유의미하게 연관이 있었다(그룹 4). 그러나, 연관성은 다중-조정된 분석에서는 유의미하지 않았다(25+35 kDa 화학종 조합은 유의미성에 도달하며, p는 0.053).
IFMA 및 IEMA 수준은 비조정된 분석에서 그룹 4의 강한 치주 염증 부담과 연관이 있었으며; IFMA에 대해 OR 1, 95% CI 1.0 내지 1.001, p는 0.029이고, IEMA에 대해 OR 1, 95% CI 1.0 내지 1.001, p는 0.046이었다.
대신, 공변량 BOP% 및 흡연은 그룹 4의 강한 치주 염증 부담과 강하게 연관이 있었으며, 이때, 모든 분석들에서 BOP%에 대한 p-값은 0.001 미만이고, 흡연에 대한 p-값은 0.001 미만 내지 0.002였다.
IFMA MMP -8 kDa 화학종과 흡연과의 연관성
다중-조정된 모델에서 35 kDa 및 25+35 kDa MMP-8 화학종의 유병률은 비조정 및 조정된 로지스틱 회귀 분석 둘 다에서 흡연과 유의미하게 연관이 있었으며, 이때, 각각의 p-값은 0.033 및 0.008이었다. 45 kDa 화학종은 비조정된 분석에서는 유의미하지 않았으나, 조정된 모델에서는 보호적(protective)인 것으로 나타났다(p는 0.033)(도 3b).
또한, 35 kDa의 비율(p는 0.001 미만)뿐만 아니라 25+35(p는 0.001 미만), 25-45(0.003), 35+45(0.010), 21-45(p는 0.012) 및 21+35(p는 0.002) kDa 화학종의 조합들의 비율은 흡연과 연관이 있었다(도 3c)(각각의 언급된 MMP-8 화학종 뒤의 삽입 어구에서 다중-조정된 모델의 각각의 p-값). 임의의 MMP-8 화학종의 절대량은 흡연과 유의미하게 연관이 있지 않았다. 4 mm 내지 5 mm 치주낭의 수는 모든 다중-조정된 회구 분석에서 흡연과 유의미하게 연관이 있었다.
BOP%와 상이한 MMP -8 화학종들 사이의 연관성
모든 연구 피험자들에서, 45 kDa 화학종의 유병률은 BOP가 25% 미만인 환자보다 BOP가 25%이상인 환자에서 더 높았다(p는 0.003, Chi-square). 45 kDa 유형의 절대량(p는 0.002)에 대해 그리고 비흡연자(p는 0.001)에서도 차이는 통계학적으로 유의미하였다. 그러나, 그룹 1에서 탐침 시 출혈 유병률이 25% 이상인 경우는 0%였고, 그룹 2 및 그룹 3 둘 다에서는 9.1%였으며, 그룹 4에서는 81.8%였다. 따라서, BOP가 25% 이상인 대부분의 경우들은 주로 그룹 4에 속하였다. 그룹 4에서, 45 kDa 화학종의 절대량, 유병률 및 비율은 BOP가 25% 미만인 환자보다 BOP가 25% 이상인 환자에서 유의미하게 더 높았다(p-값은 각각 0.009, 0.022 및 0.037). 그룹 4의 흡연자들과 비흡연자들 사이에서는 유의미한 차이가 발견되지 않았다.
비조정된 로지스틱 회귀 분석에서, 45 kDa 유형 MMP-8의 유병률은 BOP%가 25% 이상, OR 3.66, 95% CI 1.523 내지 8.797, p가 0.004인 것과 연관이 있었다. 다중-조정된 로지스틱 회귀 분석에서, 45 kDa 유형의 유병률은 BOB가 25% 이상, OR 3.36, 95% CI 1.309 내지 8.634, p가 0.012인 것과 연관이 있었다. 다른 공변량들은 유의미하지 않았다. 다른 MMP-8 분자 형태들 중 어느 것도 BOP가 25% 이상인 것과 연관이 있지 않았다.
모델화 및 수용자 작동 특성 분석
전방 단계적 로지스틱 회귀 분석에 의해, 구강 헹굼 시료로부터 강한 치주 염증 부담을 가진 환자(그룹 4)의 인지 모델을 실시하였다. IFMA 및 IEMA(치아 수는 고려하지 않음), BOP% 및 흡연 상태(예/아니오)와 더불어, 21 kDa, 25 kDa 및 35 kDa 화학종의 유병률, 절대량 및 비율을 하나씩 및 조합으로서 테스트하였다. 최상의 모델은 BOP%, 흡연 상태와 25+35 kDa 화학종의 유병률의 조합이었으며, 이때 각각의 p-값은 0.001 미만, 0.006 미만 및 0.044 미만이었다.
수용자 작동 특성(ROC) 분석을 진행하여, 연구 그룹들에서 MMP-8 IFMA 및 IEMA 수준 및 25+35 kDa 화학종의 유병률의 진단 민감성 및 특이성을 평가하였다. 상태 변수로서 그룹 4에 대한 IFMA, IEMA 및 25+35 kDa 화학종에 대한 구별은 유의미하였다(도 4). 그룹 4에서 IFMA에 대해, ROC 곡선 하 면적은 0.602였으며, 95% 신뢰 구간(CI)은 0.507 내지 0.698이고, p-값은 0.035였으며; IEMA에 대해, ROC 곡선 하 면적은 0.604였으며, 95% CI는 0.510 내지 0.697이고, p-값은 0.033이었고; 25+35 kDa 유병률에 대해, ROC 곡선 하 면적은 0.604였으며, 95% CI는 0.514 내지 0.693이고, p-값은 0.033이었으며; BOP%에 대해, ROC 곡선 하 면적은 0.880이었으며, 95% CI는 0.832 내지 0.928이고, p-값은 0.025였다. IFMA 및 IEMA 분석과 더불어 ROC 분석은, 25+35 kDa MMP-8 활성화 생성물이 이를 수행하지 않은 55 kDa 내지 70 kDa MMP-8 화학종과 명백하게 상이한 치주염 환자를 확인시켜 주었음을 보여주었다.
실시예 2
SDS-PAGE (10%) 분석을 Kiili M 등(2002)에 따라 수행하였다.
rhMMP-8의 양 및 인큐베이션 시간을 도 4에 가리킨다. 도 4a는 재조합 인간 MMP-8(Proteaimmun)에 미치는 유기수은 APMA의 효과를 보여주며, 도 4b는 산화적 NaOCl 활성화제의 효과를 보여준다. APMA 및 NaOCl 둘 다 활성화 시, 보다 낮은 분자량의 MMP-8 화학종의 발생을 유도한다. 20 kDa 내지 30 kDa 활성화 단편의 형성에 의존하는 시간은 화살표에 의해 가리켜진다.
웨스턴 면역블롯 분석을 전술한 웨스턴 면역블로팅 방법을 사용하여 수행하였다. 도 4c는 APMA 및 NaOCl에 의해 활성화된 rhMMP-8(Proteaimmun, Merck 및 Invent MMP-8 항원) 및 상이한 인간 체액뿐만 아니라 혈청에 대해 1491-E6-F7-모노클로날 항-MMP-8 항체를 사용한 웨스턴 면역블롯 분석을 보여준다.
인간 치주염 치은 열구액(GCF); 인간 임플란트 주위염 열구액(PISF); 인간 교정 치료된 치아의 GCF; 인간 치주염 타액; 인간 치주염 구강 헹굼제; 감염된 인간 양수 시료; 인간 수막염 뇌척수액 및 인간 패혈증 혈청의 시료들을 하기에 가리켜지는 바와 같이 레인 10 내지 레인 17에서 사용하였다.
레인 1: Proteaimmun rMMP-8;
레인 2: 레인 1 + APMA;
레인 3: 레인 1 + NaOCl;
레인 4: Merck rh MMP-8;
레인 5: 레인 4 + APMA;
레인 6: 레인 4 + NaOCl;
레인 7: Invent MMP-8 항원;
레인 8: 레인 7 + APMA;
레인 9: 레인 7 + NaOCl;
레인 10: 인간 치주염 치은 열구액(GCF);
레인 11: 인간 임플란트 주위염 열구액(PISF);
레인 12: 인간 교정 치료된 치아의 GCF;
레인 13: 인간 치주염 타액;
레인 14: 인간 치주염 구강 헹굼제;
레인 15, 감염된 인간 양수;
레인 16: 인간 수막염 뇌척수액;
레인 17: 인간 패혈증 혈청.
MMP-8의 활성화 시 형성된 주요한 20-30 kDa 단편들은 화살표로 가리켜져 있다.
실시예 3
웨스턴 면역블롯 분석을, 비감염(#16) 및 감염된(#12, #13 및 #19) 인간 양수 시료를 사용하여 전술한 웨스턴 면역블로팅 방법을 사용하여 수행하였다. 분석에 사용된 IFMA를 사용하여 평가된 상이한 시료들 및 상이한 MMP-8 농도들을 모든 레인에 대해 하기에 나타낸다. 사용된 겔은 11%였다. 테스트를 3개의 상이한 항체들인 모노클로날 MMP-8 특이적 항체 1491-E6-F7(7.) 및 1492-B3-C11(4.)(Medix Biochemica, Kauniainen, Finland) 및 폴리클로날 항체(3.)(Lauhio A 등, 1994)를 사용하여 수행하였다. 다른 측면에서, 레인들은 사용된 모든 항체들에 대해 동일하지만, 폴리클로날 항-MMP-8에 대한 레인 8 및 레인 10에는 시료가 존재하지 않는다. 결과를 도 5에 나타낸다. MMP-8 단편 25 kDa + 35 kDa의 수준은 IFMA를 사용하여 평가된 MMP-8 수준과 상관관계가 있었다.
레인 1. 표준
레인 2. #16, 210 ㎍/l MMP -8(14 ㎕ x 15 ㎍/l)/웰
레인 3. #12, 210 ㎍/l MMP -8
레인 4. #12, 2000 ㎍/l MMP -8
레인 5. #12, 40000 ㎍/l MMP -8
레인 6. #12, 76160 ㎍/l MMP -8(14 ㎕ x 5440 ㎍/l)/웰
레인 7. #13, 210 ㎍/l MMP -8
레인 8. #13, 2000 ㎍/l MMP -8
레인 9. #13, 40000 ㎍/l MMP -8
레인 10. #13, 186088 ㎍/l MMP -8(14 ㎕ x 13292 ㎍/l)/웰
레인 11. #19, 210 ㎍/l MMP -8
레인 12. #19, 2000 ㎍/l MMP -8
레인 13. #19, 40000 ㎍/l MMP -8
레인 14. #19, 127666 ㎍/l MMP -8(14 ㎕ x 9119 ㎍/l)/웰
실시예 4
SDS-PAGE(10%) 분석을 Kiili M 등(2002)에 따라 수행하였다.
재조합 인간 MMP-8(Proteaimmun)을 APMA에 의해 활성화시키고, rhMMP-8의 양 및 인큐베이션 시간을 하기에 가리킨다. 시퀀싱에 사용된 밴드는 도 6에 나타나 있다.
레인 1. 1.5 ㎕ 분자량 표준(Bio-Rad)
레인 2. 2 ㎕ 분자량 표준(Bio-Rad)
레인 3. 1 ㎕ MMP-8(0.15 ㎍/㎕) + 3 ㎕ TNC 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.8: 0.2 M NaCl: 0.75 mM CaCl2)
레인 4. 비어있음
레인 5. 1 ㎕ MMP-8(0.15 ㎍/㎕) + 4 ㎕ 2 mM APMA + 3 ㎕ TNC 완충제, 인큐베이션 시간 2시간(37℃)
레인 6. 비어있음
레인 7. 1 ㎕ MMP-8(0.15 ㎍/㎕) + 4 ㎕ 2 mM APMA + 3 ㎕ TNC 완충제, 인큐베이션 시간 5.5시간(37℃)
시퀀싱을 전술한 시퀀싱 방법에 따라 수행하였다. 도 6의 겔 밴드 1 내지 8을 시퀀싱하였다. 밴드의 크기는 하기와 같았다;
밴드 2 = 32 kDa
밴드 3 = 25 kDa
밴드 4 = 21 kDa
밴드 5 = 25 kDa
밴드 6 = 21 kDa
밴드 7 = 12 kDa
밴드 8 = 5 kDa.
밴드 3, 밴드 4, 밴드 5 및 밴드 8은 SEQ ID NO: 1을 포함하였으며, 밴드 2, 밴드 3, 밴드 4, 밴드 5 및 밴드 6은 SEQ ID NO: 2를 포함하였다. 밴드 7은 MMP-8의 다른 단편을 동정하였다. MMP-8 단편은 밴드 1에서 동정되지 않았다. 밴드 3, 밴드 4 및 밴드 5의 MMP-8 활성화 생성물은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 둘 모두를 포함하였다. SEQ ID NO: 1의 아미노산 119-132 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 151-165는 총 MMP-8 서열의 중간 영역 도메인으로부터 유래되었다.
실시예 5
SDS PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 인간 태반으로부터 추출한 정제된 인간 aMMP-8에 대해 실시예 2 및 실시예 3에서 사용된 모노클로날 항체를 사용하여 수행하여, 단편을 보여주었다.
항-hMMP-8-Ab(마우스 항-hMMP8 MoAB 1491-E6-F7(Medix Biochemica))를 친화성 크로마토그래피 컬럼(30 ml 세파로스 컬럼(Bio Rad))용 NHS-세파로스(NHS-활성화된 세파로스 4 Fast Flow(GE Healthcare))에 결합시켰다. 태반 원료(인간 MMP-8-태반 추출물(in.vent.Diagnostica))의 농축을 원심분리 농축기(Vivaspin® Turbo 15 및 Vivaspin® 2(Sartorius))에 의해 수행하였다. 진행 당 농축된 원료 태반 추출물 10 ml을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다(겔-전기영동 "Mini Protean 3 cell" 및 블로팅 장비 "Mini Trans-Blot cell"(Bio Rad)). 시트르산 완충제 pH 2.2에 의해 산성 용출을 수행하였다. 분획 5 ml을 수집하였다. 분획을 풀링(pooling)하고, 원심분리 농축기에서 농축시켰다. 완충제 조성을 조정하여(mini dialyzer MD 1000(Scienova)), 정제된 인간 aMMP-8을 수득하였다. SDS-PAGE (Pierce Silver Stain Kit(Thermo Scientific)) 및 웨스턴 블롯(Protein-standards Precision Plus Protein Dual Xtra(BioRad)를 사용하는 Immun-Blot PVDF 막 0.2 ㎛ 7 x 8.4 cm(Bio Rad))을 수행하였다. 12% 분리 겔 및 4% 수집 겔을 포함하는 SDS-PAGE 및 WB SDS-겔을 이용하였다.
결과를 도 7에서 SDS-PAGE 및 도 8에서 웨스턴 블롯으로 보여준다.
SDS-Page 은(silver) 염색 겔은 모든 시료들에서 유사한 밴드를 나타내며, 현재까지 35 kDa초과로 알려진 단편과 더불어 10 kDa 내지 15 kDa의 단편 및 20 kDa 내지 35 kDa의 단편들을 주로 보여준다. 원형의 웨스턴 블롯 밴드는 상대적으로 약했지만, 본래의 블롯에서도 볼 수 있었다. 분자량 마커의 75 kDa 및 25 kDa 밴드로 표시된 "*"는 본래의 블롯에서 적색이고 명확하게 가시적이다. 면역 염색은 10 kDa 내지 15 kDa을 증폭시키며, 보다 고농도의 시료에서 20 kDa 내지 35 kDa 단편들을 또한 표시한다.
결과는 실시예 2 및 실시예 3에서 보여진 결과와 상관관계가 있으며, 이를 확인한다.
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<110> OY MEDIX BIOCHEMICA AB DENTOGNOSTICS GMBH <120> MMP-8 ACTIVATION PRODUCT, ITS DETERMINATION AND USE <130> B1661PFI <150> FI 20145192 <151> 2014-02-27 <160> 2 <170> Kopatentln 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> peptide <222> (1)..(14) <223> amino acids 119-132 <400> 1 Asn Tyr Thr Pro Gln Leu Ser Glu Ala Glu Val Glu Arg Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> peptide <222> (1)..(16) <223> amino acids 151-165 <400> 2 Ile Ser Gln Gly Glu Ala Asp Ile Asn Ile Ala Phe Tyr Gln Arg Asp 1 5 10 15

Claims (19)

  1. MMP-8 활성화 생성물로서,
    MMP-8 활성화 생성물, 바람직하게는 MMP-8 중간부(middle-part) 활성화 생성물이 MMP-8의 하나 이상의 활성화 단편을 포함하고, 크기가 20 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 약 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa 또는 35 kDa인 것을 특징으로 하는, MMP-8 활성화 생성물.
  2. 제1항에 있어서,
    활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 APMA를 사용하여 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, MMP-8 활성화 생성물.
  3. 제1항에 있어서,
    활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 단백분해성 제거에 의해, 또는 바람직하게는 NaOCl에 의한 산화적 활성화를 수반하는 화학적 변형에 의해 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, MMP-8 활성화 생성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물이 서열 SEQ ID NO: 1을 포함하는, MMP-8 활성화 생성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물이 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는, MMP-8 활성화 생성물.
  6. a) 피험자 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계;
    b) MMP-8의 하나 이상의 활성화 단편을 포함하며 크기가 5 kDa 내지 35 kDa, 바람직하게는 10 kDa 내지 30 kDa, 보다 바람직하게는 약 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa 또는 35 kD인 하나 이상의 MMP-8 활성화 생성물, 바람직하게는 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 존재를 생물학적 시료에서 검출하는 단계;
    c) 선택적으로, 시료 내 MMP-8 활성화 생성물의 존재를 활성 MMP-8의 존재와 서로 관련시키는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 시료 내 MMP-8 활성화 생성물의 존재를 활성 MMP-8의 다른 더 큰 부분들의 존재와 서로 관련시키는 단계
    를 포함하는, 시료에서 MMP-8 활성화를 결정하는 방법으로서,
    생물학적 시료에서 MMP-8 활성화 생성물의 존재는 시료 내 활성 MMP-8의 존재를 가리키고/거나, 확인하고/거나 예측하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    시료가 구강, 치은 열구액(gingival crevicular fluid), 임플란트 주위 열구액(peri-implant sulcular fluid), 구강 플라크(oral plaque), 치태, 구강 헹굼제(mouth-rinse), 구세액(mouth wash), 타액, 치근관액(root canal fluid), 상처 삼출액(wound exudate), PUS, 구강 바이오필름, 조직 생검, 경구 면봉, 구강 병소 유래의 혈액으로부터 유래되는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    시료가 양수(amniotic fluid), 혈청, 혈장, 질 세척제, 세비액(nasal wash), 부비동(nasal sinus), 귀, 동(sinus), 소변, 활액(synovial fluid), 뇌척수액, 대변, 스왑(swap), 눈물, 세척액(lavage)(폐), 조직 생검 및/또는 땀으로부터 유래되는 것인, 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 APMA를 사용하여 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물의 크기가 네이티브 MMP-8을 단백분해성 제거에 의해, 또는 바람직하게는 NaOCl에 의한 산화적 활성화를 수반하는 화학적 변형에 의해 활성화시킴으로써 수득되는 활성화 생성물에 상응하는, 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물이 서열 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 방법.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 생성물이 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는, 방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    MMP-8 활성화 생성물의 존재가 생물학적 시료 내 MMP-8 단편 검출용 리간드 시스템을 사용함으로써 결정되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    리간드 시스템이 하나 이상의 항체, 항체 쌍 및/또는 항체 단편을 포함하며,
    분석법이 정량적 면역분석법, 준정량적 면역분석법 또는 정성적 면역분석법이며, 바람직하게는 웨스턴 블로팅, IFMA, EIA, IEMA, ELISA, 측류 분석법(Lateral Flow Assay), 표면 플라즈몬 공명 분석법 및 전기화학적 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    MMP-8 활성화 생성물의 존재가 생물학적 시료 내 MMP-8 중간부 활성화 생성물의 직접 단백질 검출 기술을 사용함으로써 결정되는, 방법.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 수득된 결과를 참조 시료와 비교하는 단계를 추가로 포함하며, 이로써, 질환 또는 질환 진행에 대한 소인 또는 위험성이 진단될 것이며,
    a) 참조 시료는 현재 정상적인 수준의 MMP-8을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 해당 질환을 갖지 않거나 질환 소인을 갖지 않음을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖지 않거나 위험 소인을 갖지 않음을 가리키고, 참조 시료와 비교하여 생물학적 시료 내 MMP-8 활성화 생성물의 상승된 수준은 피험자가 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성 증가의 소인을 가짐을 가리키거나;
    b) 참조 시료는 현재 질환을 갖거나 질환 소인을 가진 것으로 알려져 있는 피험자 또는 환자 그룹으로부터 유래되며, 이로써, 생물학적 시료 및 참조 시료에 대한 유사한 결과들은 피험자가 해당 질환을 갖거나 질환 소인을 가짐을 가리키거나, 질환이 발병하거나 진행될 위험성을 갖거나 위험 소인을 가짐을 가리키는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    질환이 치주 염증, 치주 조직 소실(분해), 치은염, 치주염, 임플란트 주위염, 임플란트 주위 점막염(peri-implant mucositis), 치아 소실, 치과 임플란트 차도(remission), 치조골 소실, 점막염, 점막 변경, 치근부 치주 염증, 치근관 염증, 충치, 수직 턱뼈 파열, 교정적 치아 이동(orthodontic tooth movement), 알레르기성 염증 반응 및/또는 구강 박테리아에 의해 유발되는 균혈증(bacteraemia)인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    MMP-8 활성화 생성물의 존재가 만성 또는 급성 치주염 또는 임플란트 주위염과 같은 치주질환을 가리키거나 예측하며, 이들 구강 질환이 I형 당뇨병, II형 당뇨병, COPD(만성 폐색성 폐질환), 류마티스 질환, 아씨티데스(arthitides)/관절 질환, 골다공증, 정형외과학적 질환, 자가면역 질환, 조직 이식 질환, 관절염(arthritis), 말단 인공삽입물(end prosthetic)의 감염 또는 차도, 뇌졸중, 심근경색, 동맥경화증과 같은 심혈관 질환, 조기분만, 저체중아 출생과 같은 임신 관련 위험, 발기 부전, 정자 수 감소 및 정자 세포의 운동성 저하와 같은 생식 위험과 같은 전신 질환 또는 장애들을 가리키거나, 증강시키거나 또는 이들 질환 또는 장애들에 대한 공지된 위험 인자인, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    질환이 양막내 염증, 산모에서의 염증(maternal inflammation), 신생아 질환, 조산, 저체중아 출생, 양막 병태(amniotic pathology)와 같은 부인과 질환; 악성종양, 유방암 및 백혈병과 같은 암성 질환(cancerous disease); 류마티스 관절염, 관절증과 같은 관절/류마티스 질환; 모든 형태의 당뇨병들, 네프론 질환, 신장 질환(renal disease), 비-치유 당뇨성 상처를 포함하는 당뇨 질환; 원추 각막(Keratoconus), 투명 변연부 각막 변성(pellucid marginal degeneration of the cornea)과 같은 안 질환; 이비인후과학 질환(예, 귀, 부비동으로부터); 보렐리아증(borreliosis), 패혈증, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), HIV, H. 파일로리-감염, 전신 염증, 저등급 전신 염증, 폐 감염과 같은 감염 또는 염증 및 기관지염과 같은 염증, 기관지 확장증, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 소아과학 감염/염증; 신경학적 감염, 수막염, 모부스 크론(Morbus Crohn)과 같은 염증 및 질환; 혈관 질환과 같은 심혈관 질환, 동맥반내 염증(intra-arterial plaque inflammation)과 같은 아테롬성 동맥 경화증, 색전증 및 뇌졸중; 치명적인 상처(critical wound), 비-치유 상처 및 피부 화상과 같은 상처; 장 질환(대변 테스트로부터); 외상 또는 사고 후 질환; 및/또는 대사 증후군 및 비만인, 방법.
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