ES2312450T3 - Cabeza globular de obg3 y sus usos para reducir la masa corporal. - Google Patents
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Abstract
El uso de un fragmento globular de OBG3, en el que el fragmento globular de OBG3 se selecciona del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6, o (ii) una variante de cualquiera de los fragmentos globulares de OBG3 que tienen una o más sustituciones permisivas de aminoácidos, en la que cada una de dichas sustituciones permisivas de aminoácidos es una sustitución conservadora de aminoácidos, en la que la variante tiene al menos una pero no más de 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos; o (iii) aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6; ligados a polietilenglicol o en la forma de un péptido de fusión IgG Fc; causando el fragmento globular de OBG3 de (ii) o (iii) un cambio en al menos uno de los parámetros seleccionados entre lipemia post-prandial, nivel de ácidos grasos libres, nivel de triglicéridos, nivel de glucosa, oxidación de los ácidos grasos libres, o peso, siendo comparable el cambio causado por el fragmento globular de OBG3 de (ii) o (iii) a un cambio causado por el fragmento globular de OBG3 de (i), para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un trastorno relacionado con la obesidad.
Description
Cabeza globular de OBG3 y usos de la misma para
reducir la masa corporal.
La presente invención se refiere al campo de la
investigación metabólica, en particular al descubrimiento de
compuestos eficaces para reducir la masa corporal y útiles para
tratar enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad. Las
enfermedades o trastornos relacionados con la obesidad previstos
para ser tratados por los métodos de la invención incluyen, pero
sin limitarse a ellos, hiperlipidemia, ateroesclerosis, diabetes, e
hipertensión.
La siguiente exposición pretende facilitar el
entendimiento de la invención, pero ni se pretende ni se admite que
sea la técnica anterior a la invención.
La obesidad es un problema de salud pública que
es grave, que está muy extendido, y que va en aumento. En los
Estados Unidos, el 20 por ciento de la población es obesa; en
Europa, un porcentaje ligeramente más bajo es obeso (Friedman
(2000) Nature 404: 632-634). La obesidad se asocia
con un aumento del riesgo de hipertensión, enfermedad
cardiovascular, diabetes, y cáncer así como complicaciones
respiratorias y osteoartritis (Kopelman (2000) Nature 404:
635-643). Incluso una pérdida de peso moderada
mejora estas condiciones asociadas.
Aunque todavía se reconoce que los factores del
estilo de vida que incluyen el entorno, la dieta, la edad y el
ejercicio desempeñan un papel en la obesidad, los estudios de
gemelos, los análisis de agregación familiar, y los estudios de
adopción indican todos que la obesidad es en gran medida el
resultado de factores genéticos (Barsh et al (2000) Nature
404:644-651). De acuerdo con estos estudios, está el
hecho de que está siendo identificado un número creciente de genes
relacionados con la obesidad. Algunos de los genes más ampliamente
estudiados incluyen los que codifican la leptina (ob) y su
receptor (db), pro-opiomelanocortina
(Pomc), receptor 4 de melanocortina (Mc4r), proteína
agouti (A^{y}), carboxipeptidasa E (fat), receptor
2C de 5-hidroxitriptamina (Htr2c), nescient
helix-loop-helix 2 (Nhlh2)
básico, prohormona-convertasa 1 (IPCSK1), y
proteína tubby (tubby) (revisado en Barsh et al (2000)
Nature 404:644-651).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que porciones del polipéptido OBG3 de longitud
completa, denominadas fragmentos de polipéptido OBG3 o fragmentos
de polipéptido gOBG3, tienen efectos inesperados in vitro e
in vivo, incluyendo su uso para la reducción de peso y
prevención de la ganancia de peso en los seres humanos y otros
mamíferos. Estos efectos inesperados de la administración del
fragmento de polipéptido OBG3 o gOBG3 a los mamíferos incluyen
también la reducción de los niveles elevados de ácidos grasos libres
causados por la administración de epinefrina, inyección i.v. de
"intralipid", o administración de un alimento de ensayo rico
en grasas, así como el aumento de la oxidación de los ácidos grasos
en las células del músculo, y la reducción de peso en los mamíferos
que consumen una dieta rica en grasas/rica en sacarosa. Estos
efectos son inesperados y sorprendentes dado que la administración
del polipéptido OBG3 de longitud completa generalmente no tiene
ningún efecto ni in vivo ni in vitro. Dado que no se
observa ningún efecto después de la administración del polipéptido
OBG3 de longitud completa, los niveles de polipéptido OBG3 de
longitud completa requeridos para obtener un efecto lo hacen
inviable como un tratamiento potencial para los seres humanos en
este momento. Por contraste, los fragmentos de polipéptido gOBG3
descritos en esta memoria, son radicalmente más eficaces y por
tanto se pueden proporcionar a niveles que son factibles para
tratamientos a los seres humanos.
Por tanto, un primer aspecto de la invención es
el uso de un fragmento globular de OBG3, en el que el fragmento
globular de OBG3 se selecciona del grupo que consiste en:
- (i)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6, o
- (ii)
- una variante de cualquiera de los fragmentos globulares de OBG3 que tienen una o más sustituciones permisivas de aminoácidos, en la que cada una de dichas sustituciones permisivas de aminoácidos es una sustitución conservadora de aminoácidos, en la que la variante tiene al menos una pero no más de 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos; o
- (iii)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6; ligados a polietilenglicol o en forma de un péptido de fusión IgG Fc;
causando el fragmento globular de OBG3 de (ii) o
(iii) un cambio en al menos uno de los parámetros seleccionados
entre lipemia post-prandial, nivel de ácidos grasos
libres, nivel de triglicéridos, nivel de glucosa, oxidación de los
ácidos grasos libres, o peso, siendo el cambio causado por el
fragmento globular de OBG3 de (ii) o (iii) comparable a un cambio
causado por el fragmento globular de OBG3 de (i), para la
preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de
un trastorno relacionado con la obesidad, o para la preparación de
un medicamento para la reducción de la masa corporal o prevención
de ganancia de peso.
En una realización preferida, un fragmento de
polipéptido gOBG3 descrito en esta memoria, es capaz de reducir los
niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero o plasma) de:
(i) ácidos grasos libres, (ii) glucosa, y/o (iii) triglicéridos.
Los fragmentos de polipéptido más preferidos que demuestran
actividad para reducir el nivel de los ácidos grasos libres,
actividad para reducir el nivel de glucosa, y/o actividad para
reducir el nivel de triglicéridos, tienen una actividad que es
significativamente mayor que la de OBG3 de longitud completa a la
misma concentración molar, tienen una actividad mayor que la
actividad transitoria y/o tienen una actividad sostenida.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 más
preferidos son aquellos que estimulan de forma significativa la
oxidación de los lípidos o de los ácidos grasos libres en el
músculo en comparación con los polipéptidos OBG3 de longitud
completa a la misma concentración molar. Los fragmentos gOBG3 más
preferidos son aquellos que hacen que las células C2C12
diferenciadas en presencia de dichos fragmentos sufran al menos un
10%, 20%, 30%, 35%, o 40% más de oxidación de oleato en comparación
con las células no tratadas o las células tratadas con OBG3 de
longitud completa.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 más
preferidos son aquellos que son al menos un 30% más eficaces que el
OBG3 de longitud completa para aumentar la absorción de leptina en
una línea celular hepática (preferiblemente células hepáticas de
ratón BPRCL (ATCC CRL-2217)).
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 más
preferidos son aquellos que reducen de forma significativa el
aumento postprandial de los ácidos grasos libres en el plasma
debido a una comida rica en grasas.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 más
preferidos son aquellos que reducen de forma significativa o
eliminan la producción de cuerpos cetónicos como resultado de una
comida rica en grasas.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 más
preferidos son aquellos que forman multímeros (por ejemplo,
heteromultímeros u homomultímeros) in vitro y/o in
vivo. Los multímeros preferidos son los homodímeros u
homotrímeros. Otros multímeros preferidos son los homomultímeros
que comprenden al menos 4, 6, 8, 9, 10 o 12 subunidades de
fragmento de polipéptido OBG3 o gOBG3. Otros multímeros preferidos
son los heteromultímeros que comprenden un fragmento de polipéptido
gOBG3 descrito aquí.
Un vector recombinante puede comprender un
promotor ligado operativamente a una región codificadora capaz de
expresar:
- (a)
- un fragmento globular de OBG3 o una variante como se describe aquí; o
- (b)
- una fusión de dicho fragmento globular de OBG3 en la que el fragmento está en la forma de un péptido de fusión IgG Fc.
Una célula recombinante puede comprender dicho
vector recombinante. Una célula hospedante puede ser recombinante
para un polinucleótido descrito en esta memoria.
Una composición farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptable puede comprender, consiste esencialmente
en, o consiste en, un fragmento de polipéptido gOBG3 descrito en
esta memoria, y, alternativamente, un diluyente farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptable.
Un método para reducir la masa corporal puede
comprender proporcionar o administrar a los individuos que necesiten
reducir la masa corporal dicha composición farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptable.
La identificación de dichos individuos que
necesiten reducir la masa corporal a ser tratados con dicha
composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable puede
comprender la caracterización del genotipo de los polimorfismos de
los nucleótidos individuales (SNPs) de OBG3 o la medida de los
niveles de los polipéptidos OBG3 o gOBG3 o de mRNA en muestras
clínicas de dichos individuos. Preferiblemente, dichas muestras
clínicas se seleccionan del grupo que consiste en plasma, orina, y
saliva. Preferiblemente, un fragmento de polipéptido gOBG3 se
administra a un individuo con al menos una reducción del 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% en los niveles en sangre,
suero o plasma de OBG3 de longitud completa o del fragmento de OBG3
dividido de forma natural proteolíticamente en comparación con los
pacientes sanos no obesos.
Un método de prevenir o tratar una enfermedad o
trastorno relacionado con la obesidad puede comprender proporcionar
o administrar a un individuo que necesita dicho tratamiento una
composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable como se
describe en esta memoria. En las realizaciones preferidas, la
identificación de dichos individuos que necesitan tal tratamiento
para ser tratados con dicha composición farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptable comprende la caracterización del
genotipo de los polimorfismos de los nucleótidos individuales (SNPs)
de OBG3 o la medida de los niveles de los polipéptidos OBG3 o gOBG3
o de mRNA en muestras clínicas de dichos individuos.
Preferiblemente, dichas muestras clínicas se seleccionan del grupo
que consiste en sangre, suero, plasma, orina, y saliva.
Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con la
obesidad se selecciona del grupo que consiste en obesidad,
resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa,
cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes no
dependiente de la insulina y diabetes tipo II. Las complicaciones
relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas por los métodos
de la invención incluyen lesiones microangiopáticas, lesiones
oculares, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin
limitarse a ellas, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria,
y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la
obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen
hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos
adicionales de la invención relacionados con la obesidad, incluyen
caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA,
anorexia, y bulimia. En las realizaciones preferidas, dicho
individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
Un método para causar o inducir una respuesta
biológica deseada en un individuo puede comprender las etapas de:
proporcionar o administrar a un individuo una composición que
comprende un fragmento de polipéptido gOBG3, en el que dicha
respuesta biológica se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- reducir los niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero, o plasma) de ácidos grasos libres;
- (b)
- reducir los niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero o plasma) de glucosa;
- (c)
- reducir los niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero o plasma) de triglicéridos;
- (d)
- estimular la oxidación de lípidos o ácidos grasos libres en el músculo;
- (c)
- aumentar la absorción de leptina en el hígado o células hepáticas;
- (e)
- reducir el aumento postprandial de los ácidos grasos libres en el plasma debido a una comida rica en grasas; y,
- (f)
- reducir o eliminar la producción de cuerpos cetónicos como resultado de una comida rica en grasas; y
además en el que dicha respuesta biológica es
significativamente mayor que, o al menos 10%, 20%, 30%, 35%, o 40%
más grande que, la respuesta biológica causada o inducida por un
polipéptido OBG3 de longitud completa con la misma concentración
molar; o alternativamente en el que dicha respuesta biológica es
mayor que una respuesta transitoria; o alternativamente en el que
dicha respuesta biológica es sostenida.
Un método para preparar el fragmento globular
del polipéptido OBG3 para uso en el primer aspecto puede comprender
las etapas de (a) cultivar una célula hospedante en condiciones
adecuadas para expresar el fragmento, y (b) aislar el fragmento.
Un método para preparar un fragmento
recombinante del polipéptido gOBG3 o un polipéptido OBG3 de longitud
completa puede comprender proporcionar un mamífero no humano
transgénico, cuya leche contiene el fragmento recombinante del
polipéptido gOBG3 o la proteína de longitud completa, y purificar
dicho fragmento recombinante del polipéptido gOBG3 o dicho
polipéptido OBG3 de longitud completa procedente de la leche de
dicho mamífero no humano. En una realización, dicho mamífero no
humano es una vaca, cabra, oveja, conejo, o ratón. En otra
realización, el método puede comprender purificar un polipéptido
OBG3 recombinante de longitud completa procedente de dicha leche, y
dividir dicha proteína in vitro para obtener el fragmento de
polipéptido gOBG3 deseado.
Preferiblemente, las enfermedades y trastornos
relacionados con la obesidad se seleccionan del grupo que consiste
en obesidad, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad
ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
no dependiente de la insulina y diabetes tipo II. Las complicaciones
relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas por los métodos
de la invención incluyen lesiones microangiopáticas, lesiones
oculares, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin
limitarse a ellas, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria,
y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la
obesidad incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras
enfermedades o trastornos adicionales relacionados con la obesidad
incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el
SIDA, anorexia, y bulimia.
Los métodos para reducir el peso corporal con
fines estéticos pueden comprender proporcionar a un individuo una
composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita
en esta memoria, o el fragmento de polipéptido gOBG3 descrito en
esta memoria. Preferiblemente, para reducir el peso corporal dicho
individuo tiene un BMI de al menos 20 y no más de 25.
Alternativamente, para aumentar el peso corporal dicho individuo
tiene preferiblemente un BMI de al menos 15 y no más de 20.
Una composición farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptable descrita en esta memoria, se puede usar
para reducir el peso corporal por razones estéticas.
Los métodos para tratar la resistencia a la
insulina pueden comprender proporcionar a un individuo dicha
composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, o el
fragmento de polipéptido gOBG3 descrito en esta memoria.
En un aspecto preferido de los métodos
anteriores y los descritos aquí, la cantidad de fragmento de
polipéptido gOBG3 administrada a un individuo es suficiente para
llevar los niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero, o
plasma) de los polipéptidos OBG3 a sus niveles normales (niveles de
individuos no obesos). Los "niveles normales" pueden ser
especificados como la concentración total de todos los polipéptidos
OBG3 (OBG3 de longitud completa y sus fragmentos) circulantes o
solamente la concentración de todos los polipéptidos OBG3
circulantes divididos proteolíticamente.
La Figura 1 muestra un alineamiento de las
secuencias de los polipéptidos OBG3 humanos (APM1), y de ratón
(AdipoQ y ACRP30).
La Figura 2 muestra la secuencia de ácido
nucleico de AdipoQ clonada en los sitios BamHI y XhoI de pTrcHisB.
AdipoQ empieza en 510 y termina en 1214 (insertado en negritas).
Esta construcción (o estructura artificial) no contiene la secuencia
señal con N-terminal (MLLLQALLFLLILP).
La Figura 3 muestra un dibujo esquemático de la
estructura proteínica de APM1. Se muestran la supuesta secuencia
señal en el N-terminal (AA 1-17), la
región única (AA 18-41), la región de colágeno (AA
42-107), y la región globular (AA
108-244) en el carboxi terminal. Se muestran también
dos sitios de escisión por la proteasa después de AA 100 y AA
131.
La Figura 4 muestra la secuencia de ácido
nucleico de la región globular de AdipoQ clonada en pTrcHisB. La
región globular de AdipoQ empieza en 510 y termina en 927 bp. El
inserto está en negritas.
La Figura 5 es un gráfico que muestra una
comparación del efecto de AdipoQ (AQ) y la cabeza globular de AdipoQ
(AQ-GH) sobre la ^{125}I-leptina
asociada a las células en la línea celular hepática de ratón BPRCL.
Los resultados se muestran como porcentaje de los valores de control
en presencia de cantidades crecientes de compuesto (AQ o
AQ-GH), y son la media de determinaciones
triplicadas.
Las Figuras 6A, 6B, y 6C muestran gráficos de la
unión, absorción, y degradación, respectivamente, de
^{125}I-LDL en la línea celular hepática de ratón
BPRCL en presencia de cantidades crecientes de gOBG3.
La Figura 7 muestra un alineamiento de la
secuencia proteínica del clon obg3 (clon obg3; el inserto de la Fig.
2) con las secuencias publicadas de obg3 humano (apm1) y de ratón
(AdipoQ y acrp30). En el alineamiento, los aminoácidos (AAs) 45 a
110 contienen la región tipo colágeno; los AAs
111-247 contienen la región globular. Los sitios de
corte de la lisina-tripsina bloqueada están después
de los AAs 58, 61, 95, 103, 115, 125, y 134. Como se determina por
la secuenciación amino-terminal del producto gOBG3,
el sitio de comienzo de gOBG3 está en el AA 104 (101 para el gOBG3
humano o APM1).
La Figura 8 muestra una representación gráfica
del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug i.p.) sobre los ácidos grasos
libres (FFA) en el plasma, en ratones C57BL6/J después de una comida
rica en grasas (* p < 0,02).
Las Figuras 9A y 9B muestran representaciones
gráficas del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug i.p.) sobre los
triglicéridos (TG) en el plasma, en ratones C57BL6/J después de una
comida rica en grasas (p < 0,05 a las 2, 3 y 4 horas). La Figura
9A muestra los TG en mg/dl; la Figura 9B muestra los TG como
porcentaje del valor de partida.
La Figura 10 muestra una representación gráfica
del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug i.p.) sobre la glucosa del plasma
en ratones C57BL6/J después de una comida rica en grasas.
Las Figuras 11A y 11B muestran representaciones
gráficas del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug i.p.) sobre los FFA del
plasma, en ratones C57BL6/J después de una comida rica en grasas. La
Figura 11A muestra los FFA como mM; la Figura 11B muestra los FFA
como tanto por ciento del valor de partida.
Las Figuras 12A y 12B muestran representaciones
gráficas del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug) sobre la leptina del
plasma, en ratones C57BL6/J después de una comida rica en grasas. La
Figura 12A muestra la leptina como ng/ml; la Figura 12B muestra la
leptina como tanto por ciento del valor de partida.
Las Figuras 13A y 13B muestran representaciones
gráficas del efecto de gOBG3 (3 x 25 \mug) sobre la insulina del
plasma, en ratones C57BL6/J después de una comida rica en grasas. La
Figura 13A muestra los niveles de insulina en ng/ml; la Figura 13B
muestra la insulina como tanto por ciento del valor de partida.
Las Figuras 14A y 14B muestran representaciones
gráficas del efecto de OBG3 sobre los FFA del plasma, en ratones
C57BL6/J después de una comida rica en grasas. A t = 2 horas se vio
una reducción significativa en los FFA para ambos grupos de
tratamiento (p < 0,05). La Figura 14A muestra los niveles de FFA
en mM; la Figura 14B muestra los FFA como tanto por ciento del valor
de partida.
\newpage
Las Figuras 15A y 15B muestran representaciones
gráficas del efecto de OBG3 sobre los TG del plasma, en ratones
C57BL6/J después de una comida rica en grasas. La Figura 15A muestra
los niveles de TG en mg/dl; la Figura 15B muestra los TG como tanto
por ciento del valor de partida.
Las Figuras 16A y 16B muestran representaciones
gráficas del efecto de OBG3 sobre la glucosa del plasma, en ratones
C57BL6/J después de una comida rica en grasas. La Figura 16A muestra
los niveles de glucosa como mg/dl; la Figura 16B muestra los niveles
de glucosa como tanto por ciento del valor de partida.
La Figura 17 muestra una tabla que identifica
los SNP adicionales de APM1. Se muestra información sobre los
cambios de bases conocidos, localización, marcadores previos,
Amplicon, y cebadores directos e inversos para la
microsecuenciación.
Las Figuras 18A y 18B muestran representaciones
gráficas del efecto de la inyección de gACRP30 en ratones sobre los
aumentos de FFA (Fig. 18A) y glucosa (Fig. 18B) resultantes de la
inyección de epinefrina.
La Figura 19 muestra una representación gráfica
del efecto del tratamiento con gACRP30 sobre el metabolismo de los
ácidos grasos en el músculo aislado de ratones.
Las Figuras 20A y 20B muestran una
representación gráfica del efecto del tratamiento con gACRP30 sobre
el contenido en triglicéridos del músculo e hígado aislados de
ratones.
Las Figuras 21A, 21B, 21C, y 21D muestran
representaciones gráficas del efecto del tratamiento con gACRP30
sobre la ganancia y pérdida de peso en ratones. Los tratamientos
mostrados son solución salina (rombo), ACRP30 (cuadrado), y gACRP30
(triángulo). La Fig. 21A muestra los resultados del tratamiento de
ratones después de 19 días con una dieta rica en grasas. La Fig, 21B
muestra los resultados del tratamiento de ratones después de 6 meses
con una dieta rica en grasas.
La Figura 22 muestra una tabla de los valores
químicos del análisis de sangre con inyecciones de solución salina,
inyecciones de ACRP30, o inyecciones de gACRP30.
Las Figuras 23A y 23B muestran una separación
por SDS-PAGE de la purificación de ACRP30 y gACRP30
(23A) y un producto de escisión de apm1 (23B). La Fig. 23A, pista
II, muestra la forma completa de ACRP30 purificado por FPLC. La
pista I muestra el producto de la escisión proteolítica gACRP30. La
Fig. 23B muestra un producto de escisión de apm-1
después de inmunoprecipitación seguida por transferencia Western. El
peso molecular aparente de esta forma truncada es 27 kDa, que
corresponde a aproximadamente 70% de la forma completa de
apm-1 (pista IV). Esta forma truncada no fue
detectable cuando se usó para la inmunoprecipitación (pista V) un
segundo anti-suero, específico para la región de la
proteína no homóloga con la humana (HDQETTTQGPGVLLPLPKGA) y el mismo
antisuero anti-cabeza globular para la detección. Un
suero preinmune del mismo animal no detectó ninguna proteína; se
observó un dímero de apm-1 con ambos anticuerpos
específicos (MW aparente 74 kDa).
La Figura 24 muestra un gráfico que representa
la separación de los FFA del plasma después de la inyección de
Intralipid siguiendo el tratamiento con gACRP30 (rombos) o una
solución salina control (cuadrados).
Antes de describir la invención con mayor
detalle, se indican las siguientes definiciones para ilustrar y
definir el significado y alcance de los términos usados para
describir aquí la invención.
Como se usan en esta memoria, de forma
intercambiable, los términos "oligonucleótidos", y
"polinucleótidos" y ácido nucleico incluyen las secuencias de
RNA, DNA, o híbridas RNA/DNA de más de un nucleótido ya sea en
cadena sencilla o en forma dúplex. Los términos engloban los
"nucleótidos modificados" que comprenden al menos una
modificación, incluyendo a modo de ejemplo y no de limitación: (a)
un grupo alternativo de enlace, (b) una forma análoga de purina,
(c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un análogo de azúcar.
Para ejemplos de grupos análogos de enlace, purinas, pirimidinas, y
azúcares, véase por ejemplo la publicación PCT No. WO 95/04064. Las
secuencias de polinucleótidos descritas en esta memoria, pueden ser
preparadas por cualquier método conocido, incluyendo la generación
sintética, recombinante, ex vivo, o una combinación de las
mismas, así como utilizando cualquier método de purificación
conocido en la técnica.
Los términos estructura artificial de
polinucleótido, polinucleótido recombinante y polipéptido
recombinante se usan aquí de forma consistente con su uso en la
técnica. Los términos "hacia arriba" y "hacia abajo" se
usan también aquí de forma consistente con su uso en la técnica. Los
términos "pares de bases" y "pares de bases Watson &
Crick " se usan aquí de forma intercambiable y de forma
consistente con su uso en la técnica. Similarmente, los términos
"complementario", "complemento del mismo",
"complemento", "polinucleótido complementario", "ácido
nucleico complementario" y "secuencia de nucleótidos
complementaria" se usan aquí de forma intercambiable y de forma
consistente con su uso en la técnica.
El término "purificado" se usa aquí para
describir un polinucleótido o vector polinucleótido descrito en esta
memoria, que ha sido separado de otros compuestos incluyendo, pero
sin limitarse a ellos, otros ácidos nucleicos, carbohidratos,
lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis
del polinucleótido). Purificado se puede referir también a la
separación de polinucleótidos cerrados covalentemente a partir de
polinucleótidos lineales, o viceversa, por ejemplo. Un
polinucleótido es sustancialmente puro cuando al menos
aproximadamente 50%, 60%, 75%, o 90% de una muestra contiene una
única secuencia polinucleotídica. En algunos casos esto implica una
determinación entre conformaciones (lineal frente a cerrada
covalentemente). Un polinucleótido sustancialmente puro comprende
típicamente aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% peso/peso de
una muestra de ácido nucleico. La pureza u homogeneidad de un
polinucleótido se puede indicar por una serie de medios bien
conocidos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en
gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la visualización de
una única banda de un polinucleótido después de la tinción del gel.
Para ciertos propósitos se puede proporcionar una mayor resolución
usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.
Similarmente, el término "purificado" se
usa aquí para describir un polipéptido que ha sido separado de otros
compuestos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ácidos
nucleicos, lípidos, carbohidratos, y otras proteínas. En algunas
realizaciones preferidas, un polipéptido es sustancialmente puro
cuando al menos aproximadamente 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99%, o 99,5% de las moléculas polipeptídicas de una
muestra tienen una única secuencia de aminoácidos. En algunas
realizaciones preferidas, un polipéptido sustancialmente puro
comprende típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%,
96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% peso/peso de una muestra de proteína. La
pureza u homogeneidad de un polipéptido se indica por una serie de
métodos bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis de
una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la
visualización de una única banda de un polipéptido después de la
tinción del gel. Para ciertos propósitos se puede proporcionar una
mayor resolución usando HPLC u otros métodos bien conocidos en la
técnica.
Además, como se usa aquí, el término
"purificado" no requiere la pureza absoluta; si no más bien, se
usa como una definición relativa. Se contempla expresamente la
purificación del material de partida o material natural hasta al
menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y
más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud.
Alternativamente, la purificación se puede expresar como "al
menos" un tanto por ciento de pureza relativa para los
polinucleótidos (DNA, RNA o ambos) o los polipéptidos heterólogos.
Preferiblemente, los polinucleótidos o polipéptidos descritos en
esta memoria, tienen al menos; 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,
80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, 99,5% o 100% de pureza en
relación con los polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Son
más preferidos los polinucleótidos o polipéptidos que tienen "al
menos" una pureza que varía desde cualquier número, hasta la
posición de las milésimas, entre 90% y 100% (por ejemplo, al menos
99,995% de pureza) en relación con los polinucleótidos o
polipéptidos heterólogos. Adicionalmente, la pureza de los
polinucleótidos o polipéptidos se puede expresar como un porcentaje
(como se ha descrito antes) en relación con todos los materiales y
compuestos aparte de la solución vehículo. Cada número, hasta la
posición de las milésimas, puede ser reivindicado como especie
individual de pureza.
El término "aislado" requiere que el
material sea separado de su entorno original (por ejemplo, el
entorno natural si se presenta en la naturaleza). Por ejemplo, un
polinucleótido o polipéptido que aparece en la naturaleza presente
en un animal viviente no está aislado, pero el mismo polinucleótido
o DNA o polipéptido, separado de alguno o de todos los materiales
coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho
polinucleótido podría ser parte de un vector y/o dicho
polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y
aún así estar aislado porque el vector o composición no es parte de
su entorno natural.
Están específicamente excluidos de la definición
de "aislado": los cromosomas presentes en la naturaleza (por
ejemplo, cromosomas extendidos), las genotecas de cromosomas
artificiales, las genotecas genómicas, y las genotecas de cDNA que
existen o como una preparación de ácido nucleico in vitro o
como una preparación de una célula hospedante
transfectada/transformada, en la que las células hospedantes están o
en una preparación heterogénea in vitro o extendidas en
placas como una población heterogénea de colonias individuales.
También están específicamente excluidas las genotecas anteriores en
las que un 5' EST representa hasta menos del 5% (o alternativamente
1%, 2%, 3%, 4%, 10%, 25%, 50%, 75%, o 90%, 95%, o 99%) del número de
insertos de ácido nucleico en las moléculas del vector. También
están específicamente excluidos el DNA genómico de la célula
completa o las preparaciones de RNA de la célula completa
(incluyendo dichas preparaciones de la célula completa que están
mecánicamente divididas o enzimáticamente digeridas). También están
específicamente excluidas las preparaciones anteriores de la célula
completa o como una preparación in vitro o como una mezcla
heterogénea separada por electroforesis (incluyendo transferencias
de las mismas a membranas de filtro) en la que los polinucleótidos
descritos en esta memoria, no han sido después separados de los
polinucleótidos heterólogos en el medio de electroforesis (por
ejemplo, separando después por corte de una única banda de una
población heterogénea de bandas en un gel de agarosa o membrana de
nilón).
El término "cebador" indica una secuencia
específica de oligonucleótidos que es complementaria a una secuencia
objetivo de nucleótidos y que se usa para hibridarse con la
secuencia objetivo de nucleótidos. Un cebador sirve como un punto
de iniciación para la polimerización de los nucleótidos catalizada
por la DNA-polimerasa,
RNA-polimerasa, o transcriptasa inversa.
El término "sonda" indica un segmento
definido de ácido nucleico (o segmento análogo de nucleótido, por
ejemplo, PNA como se define aquí más adelante) que se puede usar
para identificar una secuencia polinucleotídica específica presente
en una muestra, comprendiendo dicho segmento de ácido nucleico una
secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia
polinucleotídica específica a ser identificada.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos sin tener en cuenta la longitud del
polímero. Por lo tanto, los péptidos, oligopéptidos, y proteínas
están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este
término tampoco especifica ni excluye las modificaciones
post-expresión de los polipéptidos. Por ejemplo,
los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos
glucosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y
similares, están expresamente englobados en el término polipéptido.
También están incluidos dentro de la definición los polipéptidos
que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por
ejemplo, aminoácidos que no están presentes en la naturaleza,
aminoácidos que sólo se presentan en la naturaleza en un sistema
biológico no relacionado, aminoácidos modificados procedentes de
sistemas de mamíferos etc), polipéptidos con enlaces sustituidos,
así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto
presentes en la naturaleza como no presentes en la naturaleza. Como
se usa aquí, el término "OBG3" se refiere genéricamente al OBG3
murino o humano, a menos que se especifique otra cosa. Los términos
"ACRP30" y "AdipoQ" se refieren específicamente a la forma
murina de OBG3 y el término "APM-1" se refiere
específicamente a la forma humana del gen.
Sin estar limitados por la teoría, los
compuestos/polipéptidos descritos en esta memoria, son capaces de
modular el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los
tejidos periféricos, y se consideran útiles por tanto para tratar
"enfermedades que implican el reparto de los lípidos de la dieta
entre el hígado y los tejidos periféricos." El término
"tejidos periféricos" incluye el tejido muscular y el tejido
adiposo. En las realizaciones preferidas, los
compuestos/polipéptidos descritos en esta memoria, reparten los
lípidos de la dieta hacia el músculo. En realizaciones preferidas
alternativas, los lípidos de la dieta se reparten hacia el tejido
adiposo. En otras realizaciones preferidas, los lípidos de la dieta
se reparten hacia el hígado. En otras realizaciones adicionales
preferidas, los compuestos/polipéptidos descritos en esta memoria,
aumentan o reducen la oxidación de los lípidos de la dieta,
preferiblemente de los ácidos grasos libres (FFA) por el músculo.
Los lípidos de la dieta incluyen, pero sin limitarse a ellos,
triglicéridos y ácidos grasos libres.
Las enfermedades preferidas que se cree que
implican el reparto de los lípidos de la dieta incluyen la obesidad
y enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como
obesidad, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad
ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
no dependiente de la insulina y diabetes tipo II. Las
complicaciones relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas
por los métodos de la invención incluyen lesiones
microangiopáticas, lesiones oculares, y lesiones renales. La
cardiopatía incluye, pero sin limitarse a ellas, insuficiencia
cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros
trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los
compuestos descritos en esta memoria, incluyen hiperlipidemia e
hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos adicionales
relacionados con la obesidad incluyen caquexia, consunción, pérdida
de peso relacionada con el SIDA, anorexia, y bulimia.
El término "heterólogo", cuando se usa
aquí, pretende designar cualquier polipéptido o polinucleótido
distinto de un polipéptido OBG3 o gOBG3 o de un polinucleótido que
codifica un polipéptido OBG3 o gOBG3 de la presente descripción.
Los términos "que comprende", "que
consiste en" y "que consiste esencialmente en" se definen de
acuerdo con su significado estándar. Pensando en esto, los términos
pueden ser sustituidos uno por otro a lo largo de la presente
solicitud con el fin de unirse al significado específico asociado
con cada término.
El término "célula hospedante recombinante
para" un polinucleótido particular descrito en esta memoria,
significa una célula hospedante que ha sido alterada por las manos
del hombre para contener dicho polinucleótido de un modo que no se
encuentra naturalmente en dicha célula. Por ejemplo, dicha célula
hospedante puede ser transfectada o transducida con dicho
polinucleótido de forma transitoria o estable.
El término "obesidad" como se usa aquí,
está definido en las clasificaciones de peso de la WHO (Kopelman
(2000) Nature 404: 635643). Bajo peso es cuando el BMI es menor de
18,5 (delgado); saludable es con BMI de 18,5-24,9
(normal); sobrepeso grado 1 es con BMI de 25,0-29,9
(sobrepeso); sobrepeso grado 2 es con BMI de
30,0-39,0 (obesidad); sobrepeso grado 3 es con BMI
mayor o igual a 40,0. El BMI es el índice de masa corporal (obesidad
mórbida) y se expresa en kg/m^{2}. También se puede usar la
circunferencia de la cintura para indicar el riesgo de
complicaciones metabólicas, donde en los hombres un circunferencia
mayor o igual a 94 cm indica un riesgo elevado, y mayor o igual a
102 cm indica un riesgo sustancialmente elevado. Similarmente para
las mujeres, mayor o igual a 88 cm indica un riesgo elevado, y
mayor o igual a 88 cm indica un riesgo sustancialmente elevado. La
circunferencia de la cintura se mide en cm en el punto medio entre
el borde inferior de las costillas y el borde superior de la
pelvis. Otras medidas de la obesidad incluyen, pero sin limitarse a
ellas, el espesor de los pliegues cutáneos que es una medida en cm
del espesor de los pliegues cutáneos usando calibres, y la
bioimpedancia, que se basa en el principio de que la masa sin grasa
conduce mejor la corriente que la masa con grasa porque es
principalmente una solución de electrolitos; la medida de la
resistencia a una corriente débil (impedancia) aplicada entre las
extremidades proporciona un estimado de la grasa corporal usando una
ecuación derivada empíricamente.
El término "agente que actúa sobre el reparto
de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos
periféricos" se refiere a un compuesto o polipéptido descrito en
esta memoria, que modula el reparto de los lípidos de la dieta
entre el hígado y los tejidos periféricos como se ha descrito
previamente. Preferiblemente, el agente aumenta o reduce la
oxidación de los lípidos de la dieta, preferiblemente de los ácidos
grasos libres (FFA) por el músculo. Preferiblemente el agente
reduce o aumenta el peso corporal de los individuos o se usa para
tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con la
obesidad tal como obesidad, resistencia a la insulina,
ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión,
ictus, síndrome X, diabetes no dependiente de la insulina y
diabetes tipo II. Las complicaciones relacionadas con la diabetes
tipo II a ser tratadas por los métodos de la invención incluyen
lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, y lesiones renales.
La cardiopatía incluye, pero sin limitarse a ellas, insuficiencia
cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros
trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los
compuestos descritos en esta memoria, incluyen hiperlipidemia e
hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos adicionales
relacionados con la obesidad de la invención incluyen caquexia,
consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, anorexia, y
bulimia.
Los términos "respuesta a un agente que actúa
sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los
tejidos periféricos" se refieren a la eficacia del fármaco,
incluyendo pero sin limitarse a ellas, la capacidad para
metabolizar un compuesto, la capacidad para convertir un
pro-fármaco en un fármaco activo, y la
farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y la
farmacodinamia (relacionada con el receptor) de un fármaco en un
individuo.
Los términos "efectos secundarios a un agente
que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el
hígado y los tejidos periféricos" se refieren a los efectos
adversos de la terapia que resultan de las extensiones de la
principal acción farmacológica del fármaco o a las reacciones
adversas idiosincrásicas que resultan de una interacción del
fármaco con factores únicos del hospedante. Los "efectos
secundarios a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos
de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" pueden
incluir, pero sin limitarse a ellas, reacciones adversas tales como
toxicidades dermatológicas, hematológicas o hepatológicas e
incluyen además úlceras gástricas e intestinales, trastornos de la
función plaquetaria, lesiones renales, nefritis, rinitis vasomotora
con profusas secreciones acuosas, edema angioneurótico, urticaria
generalizada, y asma bronquial a edema laríngeo y
broncoconstricción, hipotensión, y shock.
El término "enfermedades y trastornos
relacionados con OBG3" como se usa aquí, se refiere a cualquier
enfermedad o trastorno que comprende un funcionamiento aberrante de
OBG3, o que podría ser tratado o prevenido modulando los niveles o
la actividad de OBG3. El "funcionamiento aberrante de OBG3"
incluye, pero sin limitarse a ellos, niveles de expresión de OBG3
aberrantes (ya sea aumentados o reducidos, pero preferiblemente
reducidos), actividad aberrante de OBG3 (ya sea aumentada o
reducida), e interacciones aberrantes con ligandos o compañeros de
unión (ya sean aumentadas o reducidas). Por "aberrante" se
entiende un cambio del tipo, o nivel de actividad visto en las
células, tejidos, o pacientes normales, o visto previamente en la
célula, tejido, o paciente antes de la aparición de la enfermedad.
En las realizaciones preferidas, estas enfermedades y trastornos
relacionados con OBG3 incluyen la obesidad y las enfermedades y
trastornos relacionados con la obesidad descritos previamente.
El término "tratamientos estéticos" se
entiende que incluye tratamientos con los compuestos o polipéptidos
descritos en esta memoria, que aumentan o reducen la masa corporal
de un individuo cuando el individuo no está clínicamente obeso ni
clínicamente delgado. Así, estos individuos tienen un índice de masa
corporal (BMI) por debajo del umbral de la obesidad clínica (por
ejemplo, por debajo de 25 kg/m^{2}) y por encima del umbral de la
delgadez clínica (por ejemplo, por encima de 18,5 kg/m^{2}). En
adición, estos individuos están preferiblemente sanos (por ejemplo
no tienen una enfermedad o trastorno de la invención relacionados
con la obesidad). Los "tratamientos estéticos" se entiende
también que engloban, en algunas circunstancias, aumentos más
localizados del tejido adiposo, por ejemplo, ganancias o pérdidas
específicamente alrededor de la cintura o de las caderas, o
alrededor de las caderas y de los muslos, por ejemplo. Estas
ganancias o pérdidas localizadas de tejido adiposo se pueden
identificar por aumentos o reducciones en el tamaño de la cintura o
de las caderas, por ejemplo.
El término "prevenir" como se usa aquí, se
refiere a administrar un compuesto antes de la aparición de los
síntomas clínicos de una enfermedad o condición de modo que se
previene una manifestación física de aberraciones asociadas con la
obesidad o OBG3.
El término "tratar" como se usa aquí, se
refiere a administrar un compuesto después de la aparición de los
síntomas clínicos.
El término "con necesidad de tratamiento"
como se usa aquí, se refiere a un juicio hecho por una persona que
presta cuidados de salud (por ejemplo un médico, enfermera,
enfermeras practicantes, etc en el caso de los seres humanos; el
veterinario en el caso de los animales, incluyendo los mamíferos no
humanos) de que un individuo o animal requiere o tendrá beneficios
del tratamiento. Este juicio se hace basándose en una variedad de
factores que están dentro del campo de un experto en cuidados de
salud, pero que incluyen el conocimiento de que el individuo o
animal está enfermo, o estará enfermo, como resultado de una
condición que es tratable por los compuestos descritos en
esta
memoria.
memoria.
El término "percibe una necesidad de
tratamiento" se refiere a una determinación
sub-clínica de que un individuo desea reducir peso
por razones estéticas como se ha expuesto bajo el "tratamiento
estético" anterior. El término "percibe una necesidad de
tratamiento" en otras realizaciones se puede referir a la
decisión que el dueño de un animal toma sobre el tratamiento
estético del animal.
El término "individuo" como se usa aquí, se
refiere a cualquier animal, incluyendo los mamíferos,
preferiblemente ratones, ratas, otros roedores, conejos, perros,
gatos, cerdos, ganado, ovejas, caballos, o primates, y lo más
preferiblemente los seres humanos.
El término "animal no humano" se refiere a
cualquier vertebrado no humano, incluyendo las aves y más usualmente
los mamíferos, preferiblemente primates, animales tales como
cerdos, cabras, ovejas, burros, caballos, gatos, perros, conejos o
roedores, más preferiblemente ratas o ratones. Tanto los términos
"animal" como "mamífero" incluyen expresamente los sujetos
humanos a menos que vayan acompañados por el término "no
humano".
En esta invención se ha encontrado que un
fragmento de OBG3, llamado gOBG3, es capaz de reducir de forma
significativa la respuesta postprandial de los ácidos grasos
libres, glucosa, y triglicéridos del plasma, en ratones alimentados
con una comida rica en grasas/sacarosa. No hubo ningún efecto
significativo sobre los niveles de leptina, insulina o glucagón. En
adición, se encontró que el gOBG3 aumenta la oxidación de los ácidos
grasos libres del músculo in vitro y ex vivo. Además,
se demostró que el gOBG3 reduce y después que previene un aumento
en la ganancia de peso en ratones que hayan sido alimentados con una
dieta rica en grasas/sacarosa durante 19 días. En ratones que
habían sido mantenidos con la misma dieta rica en grasas/sacarosa
durante 6 meses, el tratamiento con gOBG3 dio como resultado una
pérdida de peso sostenida a lo largo de 16 días que fue
significativa, a pesar de ser mantenidos con la dieta rica en
grasas/sacarosa.
La presente invención engloba el uso de
fragmentos de polipéptido gOBG3 en el reparto de los ácidos grasos
libres (FFA) y como una importante herramienta nueva para controlar
la homeostasis de energía. De los tejidos que pueden de forma
significativa eliminar los lípidos de la circulación y causar la
oxidación de los FFA, el músculo es cuantitativamente el más
importante. El OBG3 globular es una nueva y única herramienta
farmacológica que controla el peso corporal sin interferir con la
ingesta de alimentos.
Se han identificado fragmentos del polipéptido
OBG3 que tienen actividad medible in vitro e in vivo.
Estas actividades incluyen, pero sin limitarse a ellas, reducción de
la respuesta postprandial de ácidos grasos libres, glucosa, y
triglicéridos del plasma, en ratones alimentados con una comida rica
en grasas/sacarosa (Ejemplo 8), aumento de la oxidación de los
ácidos grasos libres en el músculo in vitro y ex vivo
(Ejemplo 12), y pérdida de peso sostenida en los ratones sometidos a
una dieta rica en grasas/sacarosa (Ejemplo 14). Se proporcionan
también otros ensayos de la actividad del fragmento del polipéptido
OBG3 in vitro e in vivo (Ejemplos 4, 7, 9, 11, 13,
por ejemplo), y pueden ser diseñados ensayos equivalentes por los
expertos en la técnica.
Por contraste, el polipéptido OBG3
"intacto" o "de longitud completa" no tiene ni in
vivo ni in vitro las actividades que han sido
identificadas para los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en
esta memoria. En la mayoría de los casos, las actividades o no
están presentes o como mínimo son indetectables sobre los valores
de control en los ensayos usados. En otros casos, las actividades se
pueden medir, pero están presentes o en niveles extremadamente
reducidos y/o requieren significativamente más proteína en una base
molar en comparación con los fragmentos de polipéptido gOBG3
(véase, p. ej. el Ejemplo 10). Por polipéptido OBG3 "intacto" o
"de longitud completa" como se usa aquí, se expresa la
secuencia polipeptídica de longitud completa de cualquier
polipéptido OBG3, desde la metionina en N-terminal
hasta el codón de terminación en C-terminal.
Ejemplos de polipéptidos OBG3 intactos o de longitud completa se
encuentran en la SEQ ID NO: 2 (ratón), en la SEQ ID NO: 4 (ratón),
y en la SEQ ID NO: 6 (humanos). El término "fragmentos de
polipéptido OBG3" como se usa aquí, se refiere a fragmentos del
polipéptido OBG3 "intacto" o "de longitud completa" que
tiene "actividad relacionada con la obesidad". El término
"fragmentos de polipéptido gOBG3" se refiere a fragmentos de
polipéptido de la región globular solamente y es por tanto un
término más limitado que "fragmentos de polipéptido OBG3". El
término "fragmento" significa un polipéptido que tiene una
secuencia que es enteramente la misma como parte, pero no el todo,
de un polipéptido OBG3 intacto o de longitud completa. Dichos
fragmentos pueden ser "libres" (esto es, no son parte ni están
fijados a otros polipéptidos), o uno o más fragmentos pueden estar
presentes en un único polipéptido. Los fragmentos de OBG3 o gOBG3
son fragmentos contiguos del polipéptido OBG3 de longitud completa a
menos que se especifique otra cosa.
El término "actividad relacionada con la
obesidad" como se usa aquí, se refiere al menos a una, y
preferiblemente a todas, las actividades descritas en esta memoria,
para los fragmentos del polipéptido OBG3. Se proporcionan aquí
ensayos para la determinación de estas actividades (p. ej. los
ejemplos 4, 7-9, 11-14), y pueden
ser diseñados ensayos equivalentes por los expertos en la técnica.
Opcionalmente, la "actividad relacionada con la obesidad" se
puede seleccionar del grupo que consiste en reparto de lípidos,
metabolismo de lípidos, y actividad tipo insulina, o una actividad
dentro de una de estas categorías. Por actividad de "reparto de
lípidos" se entiende la capacidad para efectuar la localización
de los lípidos de la dieta entre los grupos principales de tejidos
incluyendo, tejido adiposo, hígado, y músculo. Se ha demostrado en
la invención que los fragmentos de polipéptido gOBG3 desempeñan un
papel en el reparto de lípidos al músculo, hígado o tejido adiposo.
Por actividad de "metabolismo de los lípidos" se entiende la
capacidad para influir en el metabolismo de los lípidos. Se ha
demostrado en la invención que los fragmentos de polipéptido gOBG3
tienen la capacidad de afectar al nivel de los ácidos grasos libres
en el plasma así como de aumentar el metabolismo de los lípidos en
el músculo a través de experimentos de oxidación de los ácidos
grasos libres (Ejemplos 4, 8, 10, 11, 12) y afectar de modo
transitorio a los niveles de triglicéridos en el plasma y en el
músculo (Ejemplos 8, 10 13). Por actividad "tipo insulina" se
entiende la capacidad de los fragmentos del polipéptido OBG3 para
modular los niveles de glucosa en el plasma. Se ha encontrado en la
invención que los fragmentos de polipéptido gOBG3 no tienen un
impacto significativo en los niveles de insulina pero sí tienen
impacto en los niveles de glucosa similarmente a los efectos de la
insulina (Ejemplos 9 y 10). Estos efectos no se ven en presencia del
polipéptido OBG3 intacto (de longitud completa) o son
significativamente mayores en presencia de los fragmentos de
polipéptido OBG3 en comparación con el polipéptido OBG3 de longitud
completa.
El término "significativamente mayor" como
se usa aquí, se refiere a una comparación de la actividad de un
fragmento del polipéptido OBG3 en un ensayo relacionado con la
obesidad comparada con la actividad de un polipéptido OBG3 de
longitud completa en el mismo ensayo. Por "significativamente"
como se usa aquí, se entiende estadísticamente significativo como
es típicamente determinado por los expertos en la técnica. Por
ejemplo, los datos se calculan típicamente como la media \pm SEM,
y un valor de p \leq 0,05 es considerado estadísticamente
significativo. El análisis estadístico se realiza típicamente
usando o la prueba t de Student no pareada o la prueba t de Student
pareada, según sea apropiado en cada estudio. Ejemplos de un cambio
significativo en la actividad como resultado de la presencia de un
fragmento del polipéptido OBG3 en comparación con la presencia de un
polipéptido OBG3 de longitud completa incluyen un aumento o una
reducción en un parámetro dado de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, o 75%. Uno o más, pero
no necesariamente todos, los parámetros medibles cambiarán de forma
significativa en la presencia de los fragmentos de polipéptido
gOBG3 en comparación con la presencia de un polipéptido OBG3
intacto.
Se proporcionan "ensayos relacionados con la
obesidad" representativos en los ejemplos 4, 7-9,
y 11-14. Estos ensayos incluyen, pero sin limitarse
a ellos, métodos para medir la respuesta postprandial, métodos para
medir la oxidación de los ácidos grasos libres, y métodos para
medir la modulación del peso. En las realizaciones preferidas, se
mide la respuesta post-prandial en animales no
humanos, preferiblemente ratones. En las realizaciones preferidas
se miden los cambios en los lípidos de la dieta, preferiblemente los
ácidos grasos libres y/o los triglicéridos. En otras realizaciones,
se miden otros parámetros fisiológicos incluyendo, pero sin
limitarse a ellos, los niveles de glucosa, insulina, y leptina. En
otras realizaciones preferidas, se mide la oxidación de los ácidos
grasos libres en células in vitro o ex vivo,
preferiblemente en las células del músculo o tejido de animales no
humanos, preferiblemente ratones. También en otras realizaciones
preferidas se mide la modulación del peso en seres humanos o en
animales no humanos, preferiblemente roedores (ratas o ratones),
primates, caninos, felinos o porcinos, sometidos a una dieta rica en
grasas/sacarosa. Opcionalmente, la "actividad relacionada con la
obesidad" incluye otras actividades no específicamente
identificadas aquí. En general, los "parámetros medibles" en
relación con la obesidad y el campo de la investigación metabólica
se pueden seleccionar del grupo que consiste en niveles de ácidos
grasos libres, oxidación de los ácidos grasos libres, niveles de
triglicéridos, niveles de glucosa, niveles de insulina, niveles de
leptina, ingesta de alimentos, peso, unión de leptina y
lipoproteína, absorción y degradación y expresión de LSR (receptor
de lipolisis
estimulado).
estimulado).
En estos ensayos relacionados con la obesidad,
los fragmentos preferidos de polipéptido gOBG3 descritos en esta
memoria, pero no los polipéptidos OBG3 de longitud completa, podrían
causar un cambio significativo en al menos uno de los parámetros
medibles seleccionados del grupo que consiste en lipemia
post-prandial, niveles de ácidos grasos libres,
niveles de triglicéridos, niveles de glucosa, oxidación de los
ácidos grasos libres, y peso. Alternativamente, los fragmentos de
polipéptido gOBG3 preferidos, pero no los polipéptidos OBG3 de
longitud completa, podrían tener un cambio significativo en al menos
uno de los parámetros medibles seleccionados del grupo que consiste
en un aumento en la actividad LSR, un aumento en la actividad de la
leptina y un aumento en la actividad de la lipoproteína. Por
actividad de "LSR" se entiende la expresión de LSR sobre la
superficie de la célula, o en una conformación particular, así como
su capacidad para unir, absorber, y degradar la leptina y la
lipoproteína. Por actividad de "leptina" se entiende su unión,
absorción y degradación por LSR, así como su transporte a través de
la barrera hematoencefálica, y potencialmente estas incidencias
cuando LSR no es necesariamente el factor mediador o el único
factor mediador. Similarmente, por actividad de "lipoproteína"
se entiende su unión, absorción y degradación por LSR, así como
estas incidencias cuando LSR no es necesariamente el factor mediador
o el único factor mediador.
Se pueden usar en la invención fragmentos de
polipéptido gOBG3 aislados, purificados o recombinantes. Los
fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en esta memoria, son
útiles para reducir o aumentar (usando antagonistas de los
polipéptidos OBG3) el peso corporal o bien como un tratamiento de
estética o para el tratamiento o prevención de enfermedades y
trastornos relacionados con la obesidad. Los fragmentos de
polipéptido OBG3 son útiles también, entre otros, en los ensayos de
cribado de agonistas o antagonistas de la actividad del fragmento
de OBG3, para inducir anticuerpos específicos del fragmento de OBG3,
y en ensayos de diagnóstico.
El polipéptido OBG3 de longitud completa está
constituido por al menos cuatro regiones distintas que incluyen:
- 1.
- una supuesta secuencia señal con N-terminal de los aminoácidos 1-17 de la SEQ ID NO: 6, de la SEQ ID NO: 2, o de la SEQ ID NO: 4;
- 2.
- una región única de los aminoácidos 18-41 de la SEQ ID NO: 6 o 18-44 de la SEQ ID NO: 2, o de la SEQ ID NO: 4;
- 3.
- una región tipo colágeno de los aminoácidos 42-107 de la SEQ ID NO: 6 o 45-110 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4; y
- 4.
- una región globular de los aminoácidos 108-244 de la SEQ ID NO: 6 o 111-247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4.
El término "restos de colágeno" se usa de
la manera estándar en la técnica para indicar el triplete de
aminoácidos glicina, X, Y, donde X e Y pueden ser cualquier
aminoácido.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en
esta memoria, se proporcionan preferiblemente en una forma aislada,
y pueden estar parcial o sustancialmente purificados. Una versión
producida recombinantemente de un fragmento del polipéptido OBG3 se
puede purificar sustancialmente mediante el método de una etapa
descrito por Smith et al. ((1988) Gene 67(1):
31-40) o por los métodos descritos en esta memoria,
o conocidos en la técnica (véase, p. ej. los Ejemplos
1-3). Los fragmentos se pueden purificar también a
partir de fuentes naturales o recombinantes usando anticuerpos
dirigidos frente a los fragmentos de polipéptido descritos en esta
memoria, por métodos conocidos en la técnica de purificación de
proteínas.
Se contemplan también específicamente las
preparaciones de fragmentos de polipéptido gOBG3 que incluyen una
purificación parcial o una selección de los fragmentos de
polipéptido gOBG3. Estas preparaciones crudas se prevé que sean el
resultado de la concentración de células que expresan fragmentos de
polipéptido OBG3 con quizás algunas etapas de purificación
adicionales, pero antes de completar la purificación del fragmento.
Las células que expresan fragmentos de polipéptido OBG3 están
presentes en un sedimento, se lisan, o el polipéptido crudo se
liofiliza, por ejemplo.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 para uso en
la invención, se seleccionan de los aminoácidos 101 a 244, 108 a
244, o 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6 y los aminoácidos 104 a 247, 111
a 247, o 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4. El
fragmento gOBG3 es humano o de ratón, pero lo más preferiblemente
humano.
Los fragmentos gOBG3 descritos en esta memoria,
incluyen variantes de los fragmentos gOBG3 descritos antes.
Se podrá reconocer por los expertos normales en
la técnica que algunos aminoácidos de las secuencias del fragmento
gOBG3 descrito en esta memoria, pueden ser variados sin efecto
significativo sobre la estructura o función de la proteína; pero
habrá aminoácidos críticos en la secuencia del fragmento que
determinan la actividad. Así, se pueden usar en la invención las
variantes de los fragmentos de polipéptido gOBG3 que tienen
actividad relacionada con la obesidad como se ha descrito antes.
Tales variantes incluyen las secuencias del fragmento gOBG3 con una
o más sustituciones de aminoácidos permisivas ya sea procedentes de
mutaciones naturales o de manipulación humana seleccionadas según
las reglas generales conocidas en la técnica de modo que tengan poco
efecto sobre la actividad. A continuación se proporciona una guía
acerca de cómo hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente
silentes.
Hay dos métodos principales para estudiar la
tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio (véase, Bowie,
et al. (1990) Science, 247,1306-10). El
primer método se basa en el proceso de evolución, en el que las
mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural. El
segundo método usa la ingeniería genética para introducir cambios
de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y
selecciones o cribados para identificar las secuencias que mantienen
la funcionalidad.
Estos estudios han revelado que las proteínas
son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos
e indican qué cambios de aminoácidos son probablemente permisivos en
una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, los restos
aminoácidos más escondidos requieren cadenas laterales no polares,
mientras que algunas características de las cadenas laterales de
superficie son en general conservadas. Otras de dichas sustituciones
fenotípicamente silentes están descritas por Bowie et al.
(citado antes) y las referencias citadas allí.
Se ven típicamente como sustituciones
conservadoras los reemplazamientos, uno por otro, entre los
aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Phe; el intercambio de los
restos hidroxilo Ser y Thr; el cambio de los restos ácidos Asp y
Glu; la sustitución entre los restos amida Asn y Gln; el cambio de
los restos básicos Lys y Arg; y los reemplazamientos entre los
restos aromáticos Phe, Tyr. En adición, los siguientes grupos de
aminoácidos generalmente representan cambios equivalentes: (1) Ala,
Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3)
Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp,
His.
Similarmente, los aminoácidos de las secuencias
del fragmento de polipéptido gOBG3 descrito en esta memoria, que
son esenciales para la función pueden ser identificados también por
métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al
sitio o mutagénesis mediante alanina (véase, por ejemplo,
Cunningham, et al. (1989) Science 244 (4908):
1081-5). El último procedimiento introduce
mutaciones simples de alanina en cada resto de la molécula. Las
moléculas mutantes resultantes se ensayan entonces en cuanto
actividad relacionada con la obesidad usando los ensayos que se han
descrito antes. Son de especial interés las sustituciones de
aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros que
pueden producir proteínas con mejores características altamente
deseables, tales como menos agregación. La agregación no sólo puede
reducir la actividad sino que también puede ser problemática cuando
se preparan formulaciones farmacéuticamente o fisiológicamente
aceptables, porque los agregados pueden ser inmunogénicos (véase,
por ejemplo, Pinckard, et al., (1967) Clin. Exp. Immunol 2:
331-340; Robbins, et al., (1987) Diabetes
Ju1; 36 (7): 838-41; y Cleland, et al.,
(1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 10 (4):
307-77).
La variante del fragmento gOBG3 descrito en esta
memoria, puede ser, por ejemplo: una en la que uno o más de los
restos aminoácidos se sustituyen con un resto aminoácido conservado
o no conservado (preferiblemente un resto aminoácido conservado) y
dicho resto aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por
el código genético (esto es, puede ser un aminoácido no presente en
la naturaleza). Un fragmento gOBG3 descrito en esta memoria, puede
también estar fusionado con otro compuesto para aumentar la semivida
del fragmento (polietilenglicol); o uno en el que los aminoácidos
adicionales de un péptido con la región de fusión IgG Fc están
fusionados con el fragmento gOBG3. Dichas variantes y fusiones se
consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir
de las enseñanzas de esta memoria.
Preferiblemente la variante tiene al menos una
sustitución conservadora de aminoácidos pero no más de 10, 9, 8, 7,
6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Otra realización específica de un fragmento
gOBG3 modificado descrito en esta memoria, es un polipéptido que es
resistente a la proteolisis, por ejemplo un fragmento gOBG3 en el
que un enlace -CONH-péptido está modificado y
reemplazado por uno o más de los siguientes: un enlace reducido
(CH2NH); un enlace retro inverso (NHCO); un enlace
metilen-oxi (CH2-O); un enlace
tiometileno (CH2-S); un enlace carba (CH2CH2); un
enlace cetometileno (CO-CH2); un enlace
hidroxietileno (CHOH-CH2); un enlace
(N-N); un enlace E-alceno; o un
enlace -CH=CH-. Así, la invención incluye también el uso de un
fragmento gOBG3 o de una variante del mismo como se describe en esta
memoria, en el cual al menos un enlace peptídico ha sido modificado
como se ha descrito antes.
En adición, los aminoácidos tienen quiralidad
dentro del cuerpo L o D. En algunas realizaciones puede ser
preferible alterar la quiralidad de los aminoácidos en los
fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en esta memoria, con el
fin de extender la semivida dentro del cuerpo. Así, en algunas
realizaciones, uno o más de los aminoácidos están preferiblemente
en la configuración L. En otras realizaciones, uno o más de los
aminoácidos están preferiblemente en la configuración D.
Un polipéptido puede incluir polipéptidos que
tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 50% de identidad,
al menos 60% de identidad, o 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con un fragmento de OBG3 o
gOBG3. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al
menos, por ejemplo, con 95% "de identidad" con una secuencia de
aminoácidos de un fragmento OBG3 o gOBG3 se entiende que la
secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia del fragmento
del polipéptido OBG3 o gOBG3 excepto en que puede incluir hasta
cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos del fragmento del polipéptido OBG3 o gOBG3.
La secuencia de referencia es el fragmento del polipéptido OBG3 o
gOBG3 con una secuencia que corresponde a la secuencia del listado
de secuencias. Así, para obtener un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos de al menos 95% de identidad con una
secuencia de aminoácidos del fragmento de OBG3 o gOBG3, hasta 5% (5
de 100) de los restos de aminoácidos de la secuencia pueden estar
insertados, delecionados, o sustituidos con otro aminoácido en
comparación con la secuencia del fragmento del polipéptido OBG3 o
gOBG3. Estas alteraciones pueden tener lugar en el amino o carboxi
terminales o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales,
intercaladas o bien individualmente entre restos de la secuencia o
bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia.
Como un asunto práctico, si cualquier
polipéptido particular es idéntico o no en porcentaje a un fragmento
de OBG3 o gOBG3 puede ser determinado convencionalmente usando
programas conocidos de ordenador. Tales algoritmos y programas
incluyen, pero de ningún modo están limitados a ellos, TBLASTN,
BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson and Lipman, (1988)
ProcNatl Acad Sci USA Apr; 85 (8): 2444-8; Altschul
et al., (1990) J Mol. Biol. 215 (3):
403-410; Thompson et al., (1994) Nucleic
Acids Res. 22 (2): 4673-4680; Higgins et al.,
(1996) Meth. Enzymol. 266: 383-402; Altschul et
al., (1997) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402;
Altschul et al., (1993) Nature Genetics 3:
266-272). En una realización particularmente
preferida, las homologías de la secuencia de proteína y ácido
nucleico se evalúan usando el Basic Local Alignment Search Tool
("BLAST"), que es bien conocido en la técnica (véase, por
ejemplo, Karlin and Altschul (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar; 87
(6): 2264-8; Altschul et al., 1990,1993,
1997, todos citados antes). En particular, se usan cinco programas
BLAST específicos para realizar las siguientes tareas:
(1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia
problema (secuencia query) de aminoácidos frente a una secuencia de
proteínas de la base de datos;
(2) BLASTN compara una secuencia query de
nucleótidos frente a una secuencia de nucleótidos de la base de
datos;
(3) BLASTX compara los productos de traducción
conceptual en seis marcos de lectura de una secuencia query de
nucleótidos (ambas cadenas) frente a una secuencia de proteínas de
la base de datos;
(4) TBLASTN compara una secuencia query de
proteínas frente a una secuencia de nucleótidos de la base de datos
traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); y
(5) TBLASTX compara las traducciones en seis
marcos de lectura de una secuencia query de nucleótidos frente a las
traducciones en seis marcos de lectura de una secuencia de
nucleótidos de la base de datos.
Los programas BLAST identifican las secuencias
homólogas identificando segmentos similares, a los que se denomina
aquí "pares de segmentos de mejor puntuación" entre una
secuencia query de aminoácidos o de ácido nucleico y una secuencia
de ensayo que se obtiene preferiblemente a partir de una secuencia
de proteína o de ácido nucleico de la base de datos. Los pares de
segmentos de mejor puntuación se identifican preferiblemente (esto
es, son alineados) por medio de una matriz de puntuación, muchas de
las cuales son conocidas en la técnica. Preferiblemente, la matriz
de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (véase, Gonnet et
al., (1992) Science Jun 5; 256 (5062): 1443-5;
Henikoff and Henikoff (1993) Proteins Sep; 17 (1):
49-61). Menos preferiblemente, se pueden usar
también las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz and
Dayhoff, eds, (1978) Matrices for Detecting Distance Relationships:
Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National
Biomedical Research Foundation). Los programas BLAST evalúan la
significancia estadística de todos los pares de segmentos de mejor
puntuación identificados, y preferiblemente seleccionan aquellos
segmentos que satisfacen el umbral de significancia especificado
por el usuario, tal como un porcentaje de homología especificado por
el usuario. Preferiblemente, la significancia estadística de un par
de segmentos de mejor puntuación se evalúa usando la fórmula de
significancia estadística de Karlin (véase, por ejemplo, Karlin and
Altschul, (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar; 87 (6):
2264-8). Los programas BLAST se pueden usar con los
parámetros por defecto o con parámetros modificados proporcionados
por el usuario. Preferiblemente, los parámetros son parámetros por
defecto.
Un método preferido para determinar la mejor
concordancia global entre una secuencia query (una secuencia de la
presente invención) y una secuencia sujeto (secuencia de la base de
datos), también denominada alineamiento global de secuencias, se
puede determinar usando el programa de ordenador FASTDB basado en el
algoritmo de Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:
237-245. En un alineamiento de secuencias la
secuencia query y la secuencia de la base de datos son ambas
secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento
global de secuencias se da en tanto por ciento de identidad. Los
parámetros preferidos usados en un alineamiento de aminoácidos en
un FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, penalización
por desparejamiento=1, penalización por unión=20, grupo
aleatorio=25 longitud=0, puntuación umbral =1, tamaño de la
ventana=longitud de la secuencia, penalización por gap=5,
penalización por tamaño del gap=0,05, tamaño de la ventana =247 o la
longitud de la secuencia de aminoácidos de la base de datos,
cualquiera que sea más corta.
Si la secuencia de la base de datos es más corta
que la secuencia query debido a las deleciones en N- o
C-terminal, no debido a las deleciones internas,
los resultados, en porcentaje de identidad, deben ser corregidos
manualmente porque el programa FASTDB no cuenta las truncaciones en
N- y C-terminal de la secuencia de la base de datos
cuando se calcula la identidad global en tanto por ciento. Para las
secuencias de la base de datos truncadas en los N- y
C-terminales, en relación con la secuencia query, el
porcentaje de identidad se corrige calculando el número de restos
de la secuencia query que son N- y C-terminales de
la secuencia de la base de datos, que no son concordantes/alineados
con un resto correspondiente de la base de datos, como un tanto por
ciento de las bases totales de la secuencia query. Si un resto es
concordante/alineado se determina por los resultados del
alineamiento de la secuencia con FASTDB. Este porcentaje se resta
entonces del tanto por ciento de identidad, calculado por el
programa anterior FASTDB usando los parámetros especificados, para
llegar a una puntuación final de tanto por ciento de identidad.
Esta puntuación final de tanto por ciento de identidad es la que se
usa para los fines de la presente descripción. Solamente los restos
de los N- y C-terminales de la secuencia de la base
de datos, que no son concordantes/alineados con la secuencia query,
son considerados para los fines de ajustar manualmente la
puntuación del tanto por ciento de identidad. Esto es, solamente los
restos de aminoácidos de la secuencia query fuera de los restos más
apartados de N- y C-terminales de la secuencia de la
base de datos.
Por ejemplo, una secuencia de la base de datos
de 90 restos de aminoácidos es alineada con una secuencia query de
100 restos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción
tiene lugar en el N-terminal de la secuencia de la
base de datos y por tanto, el alineamiento con FASTDB no
concuerda/alinea con los primeros restos en el
N-terminal. Los 10 restos no emparejados representan
el 10% de la secuencia (número de restos en el N- y
C-terminales no concordantes/número total de restos
en la secuencia query) así se resta el 10% de la puntuación del
porcentaje de identidad calculada con el programa FASTDB. Si los 90
restos restantes fueran perfectamente concordantes el porcentaje de
identidad final sería del 90%.
En otro ejemplo, una secuencia de la base de
datos de 90 restos se compara con una secuencia query de 100
restos. Esta vez las deleciones son internas de forma que no hay
restos en los N- o C-terminales de la secuencia de
la base de datos, que no son concordantes/alineados con la secuencia
query. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por
FASTDB no es corregido manualmente. Una vez más, solamente los
restos de las posiciones fuera de los extremos N y
C-terminales de la secuencia de la base de datos,
como se visualizan en el alineamiento por FASTDB, que no son
concordantes/alineados con la secuencia query se corrigen
manualmente. No se hacen otras correcciones manuales para los fines
de la presente descripción.
Nótese, a través de la descripción, que siempre
que se trata de fragmentos de polipéptido OBG3, se pretende
específicamente que estén incluidos los fragmentos gOBG3 como un
subconjunto preferido de fragmentos de polipéptido OBG3.
Los fragmentos de polipéptido OBG3 se aíslan
preferiblemente de muestras de tejidos humanos o de mamíferos o son
expresados a partir de genes humanos o de mamíferos en células de
seres humanos o de mamíferos. Los fragmentos de polipéptido gOBG3
descritos en esta memoria, pueden ser preparados usando métodos de
expresión rutinarios conocidos en la técnica. El polinucleótido que
codifica los fragmentos de polipéptido deseados está ligado a un
vector de expresión. adecuado para cualquier hospedante conveniente.
Ambos sistemas hospedantes, eucariótico y procariótico, se usan
para formar fragmentos de polipéptido recombinantes. El fragmento de
polipéptido se aísla después de las células lisadas o del medio de
cultivo y se purifica hasta donde sea necesario para el uso que se
pretende. La purificación se realiza por cualquier método conocido
en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial, fraccionamiento
de sales, cromatografía, centrifugación, y similares. Véase, por
ejemplo, Methods in Enzymology para una variedad de métodos para
purificar las proteínas. Véanse también los Ejemplos
1-3 para los métodos usados previamente para los
fragmentos de polipéptido OBG3.
Los polipéptidos descritos en esta memoria,
pueden ser aislados de la leche. Los polipéptidos se pueden
purificar como polipéptidos OBG3 de longitud completa, que pueden
ser divididos entonces, si es apropiado, in vitro para
generar un fragmento de OBG3, o, alternativamente, los propios
fragmentos de OBG3 pueden ser purificados a partir de la leche. Se
puede usar cualquiera de una serie de métodos para purificar los
presentes polipéptidos de la leche, incluyendo los descritos en
Protein Purification Applications, A Practical Approach (New
Edition), Edited by Simon Roe, AEA Technology Products and Systems,
Biosciences, Harwell; Clark (1998) J Mammary Gly Biol Neoplasia 3:
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J. Chromatog. 799: 125-37; Wilkins (1993) J. Cell.
Biochem. Suppl. 0 (17 part A). En una típica realización, se
centrifuga la leche, por ejemplo, a una velocidad relativamente baja
para separar la fracción lipídica, y se centrifuga entonces el
sobrenadante acuoso a una alta velocidad para separar la caseína de
la leche de la restante fracción "suero". A menudo, se
encuentran proteínas biomédicas en esta fracción de suero, y se
pueden aislar de esta fracción usando procedimientos cromatográficos
estándar u otros procedimientos comúnmente usados para purificación
de las proteínas, por ejemplo como se describe en otro sitio de la
presente solicitud. Los polipéptidos OBG3 se pueden purificar usando
anticuerpos específicos para los polipéptidos OBG3, por ejemplo
usando cromatografía de afinidad. En adición, se pueden usar métodos
para aislar fragmentos particulares de OBG3, por ejemplo métodos
electroforéticos u otros para aislar proteínas de un particular
tamaño. Los polipéptidos OBG3 aislados usando estos métodos pueden
estar presentes en la naturaleza, se ha descubierto que como
polipéptidos OBG3 están naturalmente presentes en la leche de
mamíferos (véase, p. ej. el Ejemplo 17), o pueden ser el resultado
de la producción recombinante de la proteína en las glándulas
mamarias de un mamífero no humano, como se describe más adelante. El
fragmento de OBG3 puede ser producido como una proteína de fusión
con una secuencia polipeptídica antigénica, heteróloga, cuya
secuencia antigénica puede ser usada para purificar la proteína,
por ejemplo, utilizando la metodología estándar de
inmuno-afinidad.
En adición, se pueden producir por síntesis
química fragmentos de proteína más cortos. Alternativamente, las
proteínas se pueden extraer de células o tejidos de seres humanos o
de animales. Los métodos para purificar las proteínas son conocidos
en la técnica, e incluyen el uso de detergentes o agentes
caotrópicos para romper las partículas seguido por extracción
diferencial y separación de los polipéptidos por cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación según
la densidad, y electroforesis en gel.
El cDNA de cualquier fragmento de OBG3,
incluyendo el de la Fig. 4, se puede usar para expresar los
fragmentos de polipéptido OBG3. El ácido nucleico que codifica el
fragmento de OBG3 a ser expresado puede estar operativamente ligado
a un promotor en un vector de expresión usando la tecnología
convencional de clonación. El cDNA del fragmento de OBG3 inserto en
el vector de expresión puede comprender la secuencia codificadora
para: el polipéptido OBG3 de longitud completa (para ser modificado
más tarde); de 6 aminoácidos a 6 aminoácidos menos que el
polipéptido OBG3 de longitud completa; un fragmento gOBG3; o
variantes y % de polipéptidos similares.
El vector de expresión puede ser cualquiera de
los sistemas de expresión en mamíferos, levaduras, insectos o
bacterias conocidos en la técnica, algunos de los cuales están
descritos en esta memoria, y ejemplos de los cuales se dan en los
Ejemplos (Ejemplos 1-3). Los vectores y sistemas de
expresión comercialmente disponibles se pueden conseguir de una
variedad de proveedores incluyendo Genetics Institute (Cambridge,
MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison,
Wisconsin), e Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para
aumentar la expresión y facilitar el plegamiento apropiado de las
proteínas, el contexto de los codones y el emparejamiento de los
codones de la secuencia puede ser optimizado para el organismo
particular de expresión en el cual se introduce el vector de
expresión, como es explicado por Hatfield, et al., Patente de
Estados Unidos No. 5.082.767.
Si el ácido nucleico que codifica los fragmentos
de polipéptido OBG3 carece de una metionina que sirva como sitio de
iniciación, se puede introducir una metionina de iniciación próxima
al primer codón del ácido nucleico usando técnicas convencionales.
Similarmente, si el inserto del cDNA del fragmento del polipéptido
OBG3 carece de una señal poly A, esta secuencia puede ser añadida a
la estructura artificial, por ejemplo, mediante corte de la señal
poly A de pSG5 (Stratagene) usando las enzimas endonucleasas de
restricción Bgll y SalI e incorporando la señal al vector de
expresión del mamífero pXTl (Stratagene). El pXTl contiene los LTR y
una porción del gen gag del virus de la leucemia murina de Moloney.
La posición de los LTR en la estructura artificial permite una
transfección estable eficaz. El vector incluye el promotor
timidina-cinasa del Herpes Simplex y el gen de
neomicina seleccionable.
El ácido nucleico que codifica un fragmento de
OBG3 se puede obtener por PCR a partir de un vector que contiene la
secuencia de nucleótidos de OBG3 usando cebadores oligonucleótidos
complementarios del cDNA del OBG3 deseado y que contiene las
secuencias de endonucleasa de restricción para Pst I incorporadas en
el cebador de 5' y BglII en el extremo 5' del correspondiente
cebador 3' de cDNA, teniendo cuidado de asegurar que la secuencia
que codifica el fragmento de OBG3 está posicionada apropiadamente
con respecto a la señal poly A. El fragmento purificado obtenido a
partir de la reacción de PCR resultante se digiere con PstI, se
termina de forma roma con una exonucleasa, se digiere con BglII, se
purifica y se liga a pXTl, que contiene ahora una señal poly A y se
digiere con BglII. Métodos alternativos se presentan en los Ejemplos
1-3.
La transfección de un vector que expresa un
fragmento de OBG3 en las células NIH 3T3 de ratón es un método para
introducir los polinucleótidos en las células hospedantes. La
introducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido en
una célula hospedante se puede efectuar mediante transfección por
fosfato de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, transducción, infección, u otros
métodos. Tales métodos están descritos en muchos manuales estándar
de laboratorio, tales como Davis et al. ((1986) Methods in
Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc.,
Amsterdam). Se contempla específicamente que los polipéptidos
descritos en esta memoria, pueden ser expresados de hecho por una
célula hospedante que carece de un vector recombinante. Los métodos
para expresar fragmentos de OBG3 en las células están descritos en
los Ejemplos 1-3.
Un polipéptido (esto es, un fragmento gOBG3)
puede ser recogido y purificado a partir de cultivos recombinantes
de células por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con
sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Lo más
preferiblemente, para purificación se emplea la cromatografía de
líquidos de alta resolución ("HPLC"). Los polipéptidos
descritos en esta memoria, y preferiblemente la forma segregada, se
pueden recoger también de: productos purificados procedentes de
fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células,
ya sea aislados directamente o cultivados; productos de
procedimientos químicos sintéticos; y productos producidos por
técnicas recombinantes a partir de un hospedante procariótico o
eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células de bacterias,
levaduras, plantas superiores, insectos, y células de mamíferos.
Dependiendo del hospedante empleado en un
procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos descritos
en esta memoria, pueden ser glucosilados o pueden no ser
glucosilados. Preferiblemente los polipéptidos descritos en esta
memoria, son no glucosilados. En adición, los polipéptidos descritos
en esta memoria, pueden incluir también un resto inicial de
metionina modificada, en algunos casos como resultado de los
procesos mediados por el hospedante. Así, es bien conocido en la
técnica que la metionina del N-terminal codificada
por el codón de iniciación de la traducción generalmente se separa
con alta eficacia de cualquier proteína después de la traducción en
todas las células eucarióticas. Aunque la metionina del
N-terminal en la mayor parte de las proteínas
también se separa en la mayor parte de los procariotas, para algunas
proteínas este procedimiento de separación procariótico es
ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que la
metionina del N-terminal está ligada
covalentemente.
En adición a las construcciones del vector
discutidas aquí, las células hospedantes pueden englobar células
hospedantes primarias, secundarias, e inmortalizadas de origen
vertebrado, particularmente de origen mamífero, que han sido
sometidas a ingeniería genética para delecionar o reemplazar
material genético endógeno (por ejemplo, la secuencia
codificadora), y/o para incluir material genético (por ejemplo, las
secuencias polinucleotídicas heterólogas) que está operativamente
asociado con los polinucleótidos descritos en esta memoria, y que
activa, altera, y/o amplifica los polinucleótidos endógenos. Por
ejemplo, se pueden usar métodos conocidos en la técnica para
asociar operativamente las regiones heterólogas de control (por
ejemplo, promotor y/o potenciador) y las secuencias
polinucleotídicas endógenas mediante recombinación homóloga, véase,
por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.641.670, emitida el
24 de junio de 1997; la publicación internacional No. WO 96/29411,
publicada el 26 de septiembre de 1996; la publicación internacional
No. WO 94/12650, publicada el 4, de agosto de 1994; Koller et
al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov; 86 (22):
8932-5; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad
Sci USA Nov; 86 (22):8927-31; y Zijlstra et
al. (1989) Nature Nov 23; 342 (6248): 435-8.
En adición, los polipéptidos descritos en esta
memoria, pueden ser sintetizados químicamente usando métodos
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Creighton, 1983
Proteins. New York, New York: W.H. Freeman and Company; y
Hunkapiller et al., (1984) Nature Jul 12-18;
310 (5973): 105-11). Por ejemplo, un fragmento
relativamente corto descrito en esta memoria, se puede sintetizar
mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Además, si se
desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos
químicos de aminoácidos como una sustitución en la secuencia del
fragmento. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitarse
a ellos, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido
2,4-diaminobutírico, ácido
a-amino-isobutírico, ácido
4-aminobutírico, Abu, ácido
2-aminobutírico, g-Abu,
e-Ahx, ácido
6-amino-hexanoico, Aib, ácido
2-amino-isobutírico, ácido
3-amino-propiónico, ornitina,
norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina,
homocitrulina, ácido cisteico, t-butiglicina,
t-butialanina, fenilglicina, ciclohexilalanina,
b-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño
tales como b-metil-aminoácidos,
Ca-metil-aminoácidos,
Na-metil-aminoácidos, y análogos de
aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D
(dextrógiro) o L (levógiro).
Los fragmentos de polipéptido se pueden
modificar de forma diferenciada durante o después de la traducción,
por ejemplo, por glucosilación, acetilación, fosforilación,
amidación, derivatización mediante grupos
protectores/
bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión con una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, que incluyen pero sin limitarse a ellas, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaina, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en la presencia de tunicamicina;
etc.
bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión con una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, que incluyen pero sin limitarse a ellas, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaina, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en la presencia de tunicamicina;
etc.
\newpage
Las modificaciones
post-traducción adicionales incluyen, por ejemplo,
cadenas de carbohidratos unidas por N o unidas por O, procesado de
los extremos N-terminal o
C-terminal), unión de los restos químicos a la
cadena principal de aminoácidos, modificaciones químicas de las
cadenas de carbohidratos unidas por N o unidas por O, y adición o
deleción de un resto de metionina de N-terminal como
resultado de la expresión en la célula hospedante procariótica. Los
fragmentos de polipéptido se pueden modificar también con una marca
detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica
o de afinidad para permitir la detección y aislamiento del
polipéptido.
También se proporcionan por la invención los
usos de derivados químicamente modificados de los polipéptidos
descritos en esta memoria, que pueden aportar ventajas adicionales
tales como aumento de la solubilidad, estabilidad y tiempo de
circulación del polipéptido, o reducción de la inmunogenicidad.
Véase la patente de Estados Unidos: 4.179.337. El resto químico
para derivatización es polietilenglicol. Los polipéptidos pueden ser
modificados en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en
posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir
uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Para el
polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre
aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el
término "aproximadamente" que en las preparaciones de
polietilenglicol, algunas moléculas tendrán más peso, algunas
menos, que el peso molecular indicado) para facilidad en la
manipulación y en la fabricación. Se pueden usar otros tamaños,
dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración
deseada de la liberación sostenida, los efectos, si los hubiera
sobre la actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el
grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del
polietilenglicol sobre una proteína terapéutica o análogo).
Las moléculas de polietilenglicol deberían estar
unidas al polipéptido con consideración de los efectos sobre los
dominios funcionales o antigénicos del polipéptido. Hay una serie de
métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica, por
ejemplo, EP 0 401 384, (acoplamiento de PEG a
G-CSF), véase también Malik et al. (1992)
Exp Hematol. Sep; 20 (8): 1028-35, informando sobre
la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo).
Por ejemplo, el polietilenglicol puede ser unido covalentemente a
los restos aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como, un
grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a
los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activada.
Los restos aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden
incluir restos de lisina y los restos de aminoácido en
N-terminal; los que tienen un grupo carboxilo libre
pueden incluir restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico
y el resto aminoácido del C-terminal. También se
pueden usar los grupos sulfhidrilo como un grupo reactivo para unir
las moléculas de polietilenglicol. Para fines terapéuticos se
prefiere la unión a un grupo amino, tal como la unión en el
N-terminal o grupo de lisina.
Se pueden desear específicamente proteínas
modificadas químicamente en el N-terminal. Usando el
polietilenglicol como una ilustración de la presente composición,
se puede seleccionar a partir de una variedad de moléculas de
polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la
proporción de las moléculas de polietilenglicol a las moléculas de
proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción
de pegilación a ser realizada, y el método para obtener la proteína
seleccionada pegilada en N-terminal. El método para
obtener la preparación pegilada en N-terminal (esto
es, separar este resto de otros restos monopegilados si fuera
necesario) puede ser por purificación del material pegilado en
N-terminal a partir de una población de moléculas
de proteína pegilada. Las proteínas selectivas modificadas
químicamente en el N-terminal se pueden conseguir
mediante alquilación reductora, que se aprovecha de la reactividad
diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina
frente al N-terminal) disponibles para la
derivatización de una proteína particular. Bajo condiciones
apropiadas de reacción, se alcanza la derivatización sustancialmente
selectiva de la proteína en el N-terminal con un
grupo carbonilo que contiene el polímero.
Los fragmentos de polipéptido descritos en esta
memoria, pueden ser monómeros o multímeros (esto es, dímeros,
trímeros, tetrámeros y multímeros más altos). Por consiguiente, la
presente descripción se refiere a monómeros y multímeros de los
fragmentos de polipéptido descritos en esta memoria, a su
preparación, y a composiciones (preferiblemente, composiciones
farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables) que los contienen.
En realizaciones específicas, los polipéptidos descritos en esta
memoria, son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En
realizaciones adicionales, los multímeros son al menos dímeros, al
menos trímeros, o al menos tetrámeros.
Los multímeros para uso en la invención pueden
ser homómeros o heterómeros. Como se usa aquí, el término homómero,
se refiere a un multímero que contiene solamente polipéptidos que
corresponden a los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en
esta memoria, (incluyendo fragmentos de polipéptido, variantes,
variantes de corte y empalme, y proteínas de fusión que
corresponden a estos fragmentos de polipéptido como se describe en
esta memoria). Estos homómeros pueden contener fragmentos de
polipéptido que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o
diferentes. En una realización específica, un homómero es un
multímero que contiene solamente fragmentos de polipéptido que
tienen una secuencia idéntica de aminoácidos. En otra realización
específica, un homómero es un multímero que contiene fragmentos de
polipéptido que tienen secuencias de aminoácidos diferentes. En
realizaciones específicas, el multímero es un homodímero (por
ejemplo, que contiene fragmentos de polipéptido que tienen
secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes) o un homotrímero
(por ejemplo, que contiene fragmentos de polipéptido que tienen
secuencias de aminoácidos idénticas y/o diferentes). En
realizaciones adicionales, el multímero homomérico es al menos un
homodímero, al menos un homotrímero, o al menos un
homotetrámero.
Como se usa aquí, el término heterómero se
refiere a un multímero que contiene uno o más polipéptidos
heterólogos (esto es, que corresponden a diferentes proteínas o
fragmentos polipeptídicos de las mismas) en adición a los
polipéptidos descritos en esta memoria. En una realización
específica, el multímero es un heterodímero, un heterotrímero, o un
heterotetrámero. En realizaciones adicionales, el multímero
heteromérico es al menos un heterodímero, al menos un heterotrímero,
o al menos un heterotetrámero.
Los multímeros descritos en esta memoria, pueden
ser el resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas
y/o covalentes y/o pueden estar ligados indirectamente, por ejemplo,
por formación de liposomas. Así, en una realización, los
multímeros, tales como, por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, se
forman cuando los polipéptidos descritos en esta memoria, se ponen
en contacto uno con otro en solución. En otra realización, los
heteromultímeros, tales como, por ejemplo, heterotrímeros o
heterotetrámeros, se forman cuando los polipéptidos descritos en
esta memoria, ponen en contacto los anticuerpos con los polipéptidos
descritos en esta memoria, (incluyendo anticuerpos para la
secuencia del polipéptido heterólogo en una proteína de fusión
descrita aquí) en solución. En otras realizaciones, se forman los
multímeros por asociaciones covalentes con y/o entre los
polipéptidos descritos en esta memoria. Tales asociaciones
covalentes pueden incluir uno o más restos aminoácidos contenidos
en la secuencia polipeptídica (por ejemplo, la indicada en el
listado de secuencias, o contenida en el polipéptido codificado por
un clon depositado). En un caso, las asociaciones covalentes están
reticuladas entre restos de cisteína localizados dentro de las
secuencias del polipéptido, que interactúan en el polipéptido
nativo (esto es, presente en la naturaleza). En otro caso, las
asociaciones covalentes son la consecuencia de la manipulación
química o recombinante. Alternativamente, tales asociaciones
covalentes pueden incluir uno o más restos aminoácidos contenidos
en la secuencia del polipéptido heterólogo en una proteína de fusión
descrita en esta memoria.
En un ejemplo, las asociaciones covalentes están
entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 5.478.925).
En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes están entre
la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión Fc (como
se describe en esta memoria). En otro ejemplo específico, las
asociaciones covalentes de las proteínas de fusión están entre la
secuencia heteróloga del polipéptido de otra proteína que es capaz
de formar multímeros asociados covalentemente, tales como por
ejemplo, osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la publicación
internacional número: WO 98/49305). En otra realización, dos o más
polipéptidos descritos en esta memoria, se pueden unir por medio de
enlaces de péptidos. Los ejemplos incluyen estos enlaces de péptidos
descritos en la patente de Estados Unidos No. 5.073.627. Las
proteínas que comprenden múltiples polipéptidos descritos en esta
memoria, separados por enlaces de péptidos se pueden producir por
tecnología convencional de DNA recombinante.
Otro método para preparar polipéptidos
multímeros descritos en esta memoria, incluye el uso de polipéptidos
descritos en esta memoria, fusionados a una secuencia polipeptídica
de la cremallera (zipper) o cierre de leucina o del cierre de
isoleucina. Los dominios del cierre de leucina y del cierre de
isoleucina son polipéptidos que promueven la multimerización de las
proteínas en las que se encuentran. Los cierres de leucina fueron
originalmente identificados en varias proteínas que se unen al DNA,
y desde entonces han sido encontrados en una variedad de diferentes
proteínas (Landschulz et al., (1988) Genes Dev. Jul; 2 (7):
786-800). Entre los cierres de leucina conocidos
están los péptidos y sus derivados presentes en la naturaleza que
forman dímeros o trímeros. Son ejemplos de dominios de cierre de
leucina adecuados para producir proteínas multiméricas solubles los
descritos en la solicitud PCT WO 94/10308. Las proteínas de fusión
recombinantes que comprenden un polipéptido descrito en esta
memoria, fusionado con una secuencia de polipéptido que se dimeriza
o trimeriza en solución pueden ser expresadas en células
hospedantes adecuadas, y la proteína de fusión multimérica soluble
resultante puede ser recogida del sobrenadante del cultivo usando
métodos conocidos en la técnica.
Los polipéptidos triméricos pueden ofrecer la
ventaja de una actividad biológica mejorada. Los restos de cierre
de leucina y los restos de isoleucina preferidos son aquellos que
forman preferiblemente trímeros. Un ejemplo es un cierre de leucina
derivado de la proteína tensioactiva del pulmón D (SPD), como se
describe en Hoppe et al. FEBS Letters (1994) May 16; 344
(2-3): 191-5. y en la solicitud de
patente de Estados Unidos Ser. No. 08/446.922. Otros péptidos
derivados de las proteínas triméricas presentes en la naturaleza se
pueden emplear para preparar polipéptidos triméricos. En otro
ejemplo, las proteínas descritas en esta memoria, se pueden asociar
por interacciones entre Flag® y la secuencia del polipéptido
contenida en las proteínas de fusión que contienen la secuencia de
polipéptido Flag®. En otra realización, las proteínas descritas en
esta memoria, se pueden asociar por interacciones entre la
secuencia del polipéptido heterólogo contenida en las proteínas de
fusión Flag® y el anticuerpo anti Flag®.
Los multímeros descritos en esta memoria, pueden
ser generados usando métodos químicos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, los polipéptidos que se desea que sean contenidos en los
multímeros descritos en esta memoria, pueden estar reticulados
químicamente usando moléculas de enlace y métodos de optimización de
la longitud de la molécula de enlace conocidos en la técnica
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número
5.478.925). Adicionalmente, los multímeros pueden ser generados
usando métodos conocidos en la técnica para formar uno o más
enlaces reticulantes inter-moléculas entre los
restos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los
polipéptidos que se desea que sean contenidos en el multímero
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número
5.478.925). Además, los polipéptidos descritos en esta memoria,
pueden ser modificados rutinariamente por la adición de cisteína o
biotina al C-terminal o N-terminal
del polipéptido y pueden ser aplicados métodos conocidos en la
técnica para generar multímeros que contienen uno o más de estos
polipéptidos modificados (véase, por ejemplo, la patente de Estados
Unidos número 5.478.925). Adicionalmente, se pueden aplicar al
menos 30 métodos conocidos en la técnica para generar liposomas que
contienen los componentes polipeptídicos que se desea que sean
contenidos en el multímero (véase, por ejemplo, la patente de
Estados Unidos número 5.478.925).
Alternativamente, los multímeros descritos en
esta memoria, pueden ser generados usando métodos de ingeniería
genética conocidos en la técnica. En una realización, los
polipéptidos contenidos en los multímeros pueden ser producidos
recombinantemente usando la tecnología de las proteínas de fusión
descrita en esta memoria, o conocida de otro modo en la técnica
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 5.478.925).
En una realización específica, los polinucleótidos que codifican un
homodímero pueden ser generados ligando una secuencia de
polinucleótidos que codifica un polipéptido descrito en esta
memoria, a una secuencia que codifica un enlace polipeptídico y
después además a un polinucleótido sintético que codifica el
producto traducido del polipéptido en la orientación inversa del
original C-terminal al N-terminal
(careciendo de la secuencia líder) (véase, por ejemplo, la patente
de Estados Unidos número 5.478.925). En otra realización, las
técnicas recombinantes descritas en esta memoria, o conocidas de
otro modo en la técnica pueden ser aplicadas para generar los
polipéptidos recombinantes descritos en esta memoria, que contienen
un dominio transmembranal (o hidrófobo o de péptido señal) y que
pueden ser incorporados a los liposomas por técnicas de
reconstitución de la membrana (véase, por ejemplo, la patente de
Estados Unidos número 5.478.925).
Los polinucleótidos preferidos son aquellos que
codifican los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en esta
memoria. Los polinucleótidos recombinantes que codifican los
fragmentos de polipéptido gOBG3 pueden ser usados de varios modos,
incluyendo, pero sin limitarse a ellos, expresar el polipéptido en
células recombinantes para uso en ensayos de cribado de
antagonistas y agonistas de su actividad así como para facilitar su
purificación para uso de varios modos incluyendo, pero sin
limitarse a ellos, ensayos de cribado para antagonistas y agonistas
de su actividad, cribados de diagnóstico, y producción de
anticuerpos, así como tratamiento y/o prevención de enfermedades y
trastornos relacionados con la obesidad y/o para reducir la masa
corporal.
Los polinucleótidos que codifican los fragmentos
de polipéptido OBG3 y gOBG3 y los fragmentos de polipéptido
variantes de los mismos pueden ser purificados, aislados, y/o
recombinantes. En todos los casos, los polinucleótidos gOBG3
deseados son aquellos que codifican los fragmentos de polipéptido
gOBG3 de la invención que tienen actividad relacionada con la
obesidad como se describe y se expone aquí.
Los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos descritos en esta memoria, pueden ser fusionados en
marco de lectura con las secuencias que codifican las secuencias
adicionales de aminoácidos heterólogos. También, los ácidos
nucleicos pueden codificar los polipéptidos descritos en esta
memoria, junto con las secuencias no codificantes adicionales,
incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, las secuencias
no codificantes 5' y 3', la secuencia vector, las secuencias usadas
para purificación, sondas, o cebadores. Por ejemplo, las secuencias
heterólogas incluyen las secuencias transcritas, no traducidas que
pueden desempeñar un papel en la transcripción, y procesado del
mRNA, por ejemplo, la unión a los ribosomas y la estabilidad del
mRNA. Las secuencias heterólogas pueden comprender alternativamente
secuencias codificadoras adicionales que proporcionan
funcionalidades adicionales. Así, una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido puede ser fusionada con una secuencia tag,
tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la
purificación del polipéptido fusionado. La secuencia del aminoácido
tag puede ser un péptido de hexa-histidina, tal como
el tag proporcionado en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton
Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales
están comercialmente disponibles. Por ejemplo, la
hexa-histidina proporciona la purificación
conveniente de la proteína de fusión (véase, Gentz et al.,
(1989) Proc Natl Acad Sci USA Feb; 86 (3): 821-4).
El "HA" tag es otro péptido útil para la purificación que
corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de
influenza (véase, Wilson et al., (1984) Cell 37
(3):767-78). Como se ha expuesto antes, las
proteínas de fusión para uso como se describe en el primer aspecto,
incluyen fragmentos gOBG3 fusionados con IgG Fc en el N- o
C-terminal.
El término "vector" se usa aquí para
designar una molécula de DNA o RNA circular o lineal, que es de
doble hebra o una única hebra, y que comprende al menos un
polinucleótido de interés que se busca que sea transferido a una
célula hospedante o a un organismo hospedante unicelular o
multicelular.
Un vector recombinante puede comprender un
promotor operativamente ligado a una región codificadora capaz de
expresar (a) un fragmento globular de OBG3 o una variante para uso
en el primer aspecto; o (b) una fusión de dicho fragmento globular
de OBG3 en la que el fragmento está en la forma de un péptido de
fusión IgG Fc.
Se pueden emplear vectores de expresión para
expresar tal fragmento globular de OBG3, variante o péptido de
fusión que pueden ser entonces purificados y, por ejemplo, ser
usados como tratamiento para las enfermedades relacionadas con la
obesidad, o simplemente para reducir la masa corporal de los
individuos.
La expresión requiere que se proporcionen las
señales apropiadas en los vectores, incluyendo dichas señales
diferentes elementos reguladores, tales como mejoradores/promotores
de ambas fuentes virales y de mamíferos, que dirigen la expresión
de los genes de interés en las células hospedantes. Se pueden
incluir en los vectores de expresión, marcadores dominantes de
selección del fármaco para establecer clones celulares permanentes
y estables que expresan los productos, ya que son elementos que
ligan la expresión de los marcadores de selección del fármaco a la
expresión del polipéptido.
Los vectores de expresión pueden incluir ácidos
nucleicos que codifican un fragmento gOBG3 descrito en esta
memoria, o un fragmento gOBG3 modificado como se describe aquí, o
variantes o fragmentos de los mismos, bajo el control de una
secuencia reguladora seleccionada entre los fragmentos de
polipéptido OBG3, o alternativamente bajo el control de una
secuencia reguladora exógena.
Consecuentemente, tales vectores de expresión
pueden consistir en: (a) una secuencia reguladora de un fragmento
de OBG3 que dirige la expresión de un polinucleótido codificador
ligado operativamente a la misma; y (b) un fragmento que codifica
la secuencia de gOBG3 descrita en esta memoria, ligado
operativamente a las secuencias reguladoras que permiten su
expresión en una célula hospedante y/o organismo hospedante
adecuado.
Alguno de los elementos que se pueden encontrar
en los vectores se describen con más detalle en las siguientes
secciones.
Un vector recombinante puede comprender, pero
sin limitarse a ellos, un YAC (cromosoma artificial de levadura),
un BAC (cromosoma artificial bacteriano), un fago, un fagémido, un
cósmido, un plásmido, o incluso una molécula lineal de DNA que
puede consistir en un DNA cromosómico, no cromosómico,
semi-sintético o sintético. Un vector recombinante
de este tipo puede comprender una unidad transcripcional que
comprende un conjunto de:
(1) un elemento o elementos genéticos que tienen
un papel regulador en la expresión de los genes, por ejemplo
promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos de DNA
que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 bp de
longitud que actúan sobre el promotor para aumentar la
transcripción;
(2) una secuencia estructural o codificadora que
está transcrita en el mRNA y eventualmente traducida a un
polipéptido, estando dicha secuencia estructural o codificadora
ligada operativamente a los elementos reguladores descritos en (1);
y
(3) secuencias apropiadas de iniciación y
terminación de la transcripción. Las unidades estructurales
destinadas al uso en levaduras o sistemas de expresión eucarióticos
incluyen preferiblemente una secuencia líder que permite la
secreción extracelular de la proteína traducida por una célula
hospedante. Alternativamente, cuando una proteína recombinante es
expresada sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un
resto N-terminal. Este resto puede ser o no
escindido posteriormente de la proteína recombinante expresada para
proporcionar un producto
final.
final.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinante incluirán orígenes de replicación, marcadores
seleccionables que permiten la transformación de la célula
hospedante, y un promotor derivado de un gen altamente expresado
para dirigir la transcripción de una secuencia estructural hacia
abajo. La secuencia estructural heteróloga es ensamblada en una
fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la
traducción, y preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir
la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico
o el medio extracelular. En una realización específica en la que el
vector es adaptado para transfectar y expresar las secuencias
deseadas en las células hospedantes del mamífero, los vectores
preferidos comprenderán un origen de replicación en el hospedante
deseado, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquiera
de los sitios necesarios de unión a ribosomas, sitios de
poliadenilación, sitios de corte y empalme de donador y aceptor,
las secuencias de terminación de la transcripción, y las secuencias
no transcritas en la región de flanqueo 5'. Las secuencias de DNA
derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo de origen SV40,
promotor inicial, potenciador, sitios de corte y empalme y de
poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos
genéticos no transcritos requeridos.
Las regiones adecuadas del promotor usadas en
los vectores de expresión se eligen teniendo en cuenta la célula
hospedante en la que es expresado el gen heterólogo. El promotor
particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de
ácido nucleico de interés no se considera importante, con tal de que
sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula
elegida. Así, cuando se elige como objetivo una célula humana, es
preferible colocar la región codificadora de ácido nucleico
adyacente a un promotor y bajo el control del mismo, que es capaz
de ser expresado en una célula humana, tal como, por ejemplo, un
promotor humano o viral.
Un promotor adecuado puede ser heterólogo con
respecto al ácido nucleico del que controla la expresión o
alternativamente puede ser endógeno al polinucleótido nativo que
contiene la secuencia codificadora a ser expresada. Adicionalmente,
el promotor es generalmente heterólogo con respecto a las secuencias
del vector recombinante dentro de las cuales ha sido insertada la
estructura artificial de la secuencia promotora/codificadora.
Las regiones del promotor se pueden seleccionar
a partir de cualquier gen objetivo usando, por ejemplo, vectores
CAT (cloramfenicol-transferasa) y más
preferiblemente vectores pKK232-8 y pCM7. Los
promotores bacterianos preferidos son los promotores de
RNA-polimerasa, LacI, LacZ, bacteriófago T3 o T7,
los promotores gpt, lambda PR, PL y trp (EP 0036776), el promotor
de polihedrina, o el promotor de proteína p10 de baculovirus (Kit
Novagen) (Smith et al., (1983) Mol Cell Biol Dec; 3 (12):
2156-65; O'Reilly et al., 1992), el promotor
lambda PR o también el promotor trc.
Los promotores eucarióticos incluyen el
inmediato temprano del CMV (citomegalovirus),
timidina-quinasa de HSV (virus del herpes simple),
SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus, y la
metalotioneina-L de ratón. En adición, los
promotores específicos para un tipo particular de células se pueden
elegir, tal como los que facilitan la expresión en tejido adiposo,
tejido muscular, o hígado. La selección de un vector y promotor
convenientes es bien conocida dentro del nivel de experiencia
ordinaria en la técnica.
La elección de un promotor está dentro de la
capacidad de una persona experta en el campo de la ingeniería
genética. Por ejemplo, se puede referir a Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989), o también a los
procedimientos descritos por Fuller et al. (1996) Immunology
in Current Protocols in Molecular Biology.
Cuando se emplea un inserto de cDNA, se desea
típicamente incluir una señal de poliadenilación para efectuar la
poliadenilación adecuada del transcripto del gen. La naturaleza de
la señal de poliadenilación no se cree que sea crucial para la
práctica satisfactoria de la invención, y se puede emplear
cualquiera de tales secuencias como la hormona de crecimiento
humano y las señales de poliadenilación de SV40. También se
contempla como un elemento de la casete de expresión un terminador.
Estos elementos pueden servir para mejorar los niveles de mensaje y
para minimizar la lectura a través de la casete hasta las otras
secuencias.
Los vectores que contienen la secuencia
apropiada de DNA como se ha descrito antes, se pueden utilizar para
transformar un hospedante apropiado para permitir la expresión del
polipéptido o polinucleótido deseado.
Estos marcadores deben conferir un cambio
identificable a la célula que permita la fácil identificación de
las células que contienen la estructura artificial de expresión. Los
genes del marcador de elección para la selección de células
hospedantes transformadas son preferiblemente
dihidrofolato-reductasa o resistencia a la
neomicina para el cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S.
cerevisiae o resistencia a tetraciclina, rifampicina o
ampicilina en E. coli, o levan-sacarasa para
las micobacterias, siendo este último marcador un marcador de
elección negativo.
Como un ejemplo representativo pero no
limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano
pueden comprender un marcador de elección y un origen bacteriano de
replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que
comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC37017). Tales vectores
comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3
(Pharmacia, Uppsala, Sweden), y pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI,
USA).
Muchos otros vectores adecuados son conocidos
por los expertos en la técnica, y están comercialmente disponibles,
tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60,
pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174,
pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene);
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,pXTl, pSG (Stratagene);
pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30
(QIAexpress).
Un vector adecuado para la expresión de los
polipéptidos descritos en esta memoria, es un vector de baculovirus
que se puede propagar en células de insectos y en líneas celulares
de insectos. Un sistema específico de vector hospedante adecuado es
el vector de transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen)
que se usa para transfectar la línea celular SF9 (ATCC Nº CRL 1711)
que se deriva de Spodoptera frugiperda.
Otros vectores adecuados para la expresión de un
polipéptido de cabeza globular Apml en un sistema de expresión en
baculovirus incluyen los descritos por Chai et al. (1993;
Biotechnol Appl Biochem. Dec; 18 (Pt 3): 259-73);
Vlasak et al. (1983; Eur J Biochem Sep 1; 135(1):
123-6); y Lenhard et al. (1996; Gene Mar 9;
169 (2): 187-90).
El vector de la presente descripción puede ser
derivado de un adenovirus. Los vectores de adenovirus preferidos
son los descritos por Feldman and Steg (1996; Semin Interv Cardiol
Sep;1 (3): 203-8) o Ohno et al. (1994;
Science Aug 5; 265(5173): 781-4). Otro
adenovirus recombinante preferido es el adenovirus humano tipo 2 o
5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (solicitud de
patente francesa No. FR-93.05954).
Los vectores de retrovirus y los vectores de
virus adeno-asociados generalmente se entiende que
son los sistemas de elección de liberación del gen recombinante
para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo,
particularmente a los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Estos
vectores proporcionan una eficaz liberación de genes a las células,
y los ácidos nucleicos transferidos están integrados de forma
estable en el DNA cromosómico del hospedante.
Los retrovirus particularmente preferidos para
la preparación o construcción de vehículos retrovirales de
liberación del gen in vitro o in vivo incluyen los
retrovirus seleccionados del grupo que consiste en virus inductor
de focos en células de visón (Mink-Cell Focus
Inducing Virus), virus del sarcoma murino, virus de la
reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Los virus de la
leucemia murina particularmente preferidos incluyen los virus 4070A
y los 1504A, Abelson (ATCC No VR-999), Friend (ATCC
No VR-245), Gross (ATCC No VR-590),
Rauscher (ATCC No VR-998) y el Virus de la leucemia
murina de Moloney (ATCC No VR-190; Solicitud PCT No
WO94/24298). Los virus del sarcoma de Rous particularmente
preferidos incluyen la cepa Bryan de alto título (ATCC Nos
VR-334, VR-657,
VR-726, VR-659 y
VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos son
los descritos en Roth et al. (1996), solicitud PCT No WO
93/25234, solicitud PCT No WO 94/06920, Roux et al., ((1989)
Proc Natl Acad Sci U S A Dec; 86 (23): 9079-83),
Julan et al., (1992) J. Gen. Virol. 3:
3251-3255 y Neda et al., ((1991) J Biol Chem
Aug 5; 266 (22):
14143-6).
14143-6).
Otro sistema más de vector vírico que se
contempla consiste en el virus adeno-asociado (AAV).
El virus adeno-asociado es un virus defectuoso
presente en la naturaleza que requiere otro virus, tal como un
adenovirus o un virus del herpes, como virus ayudador para una
replicación eficaz y un productivo ciclo vital (Muzyczka et
al., (1992) Curr Top Microbiol Immunol; 158:
97-129). Es también uno de los pocos virus que
pueden integrar su DNA en células que no se dividen, y presenta una
alta frecuencia de integración estable (Flotte et al.,
(1992) Am J Respir Cell Mol Biol Sep; 7 (3): 349-56;
Samulski et al., (1989) J Virol Sep; 63 (9):
3822-8; McLaughlin et al., (1989) Am. J.
Hum. Genet. 59: 561-569). Una característica
ventajosa de AAV se deriva de su reducida eficacia para transducir
las células primarias en relación con las células transformadas.
Con el fin de efectuar la expresión de los
polinucleótidos descritos en esta memoria, estas estructuras
artificiales deben ser liberadas a una célula. Esta liberación
puede ser realizada in vitro, como en procedimientos de
laboratorio para transformar las líneas celulares, o in vivo
o ex vivo, como en el tratamiento de ciertas
enfermedades.
Un mecanismo es la infección vírica en la que la
estructura artificial de expresión es encapsulada en una partícula
vírica infecciosa.
Se contemplan también varios métodos no víricos
para la transferencia de polinucleótidos a células de mamífero
cultivadas, e incluyen, sin que estén limitados a ellos,
precipitación de fosfato de calcio (Graham et al., (1973)
Virology Aug; 54 (2): 536-9; Chen et al.,
(1987) Mol Cell Biol Aug; 7 (8): 2745-52),
DEAE-dextrano (Gopal, (1985) Mol Cell Biol May; 5
(5): 1188-90), electroporación
(Tur-Kaspa et al., (1986) Mol Cell Biol Feb;
6 (2): 716-8; Potter et al., (1984) Proc Natl
Acad Sci USA Nov; 81 (22): 7161-5), microinyección
directa (Harly et al., (1985) J Cell Biol Sep; 101 (3):
1094-9), liposomas cargados con DNA (Nicolau et
al., (1982) Biochim Biophys Acta Oct 11; 721 (2):
185-90; Fraley et al., (1979)Proc Natl
Acad Sci USA Jul; 76 (7): 3348-52), y transfección
mediada por receptores (Wu y Wu, (1987) J Biol Chem Apr 5; 262 (10):
4429-32; Wu y Wu (1988) Biochemistry Feb 9; 27 (3):
887-92). Algunas de estas técnicas pueden ser
adaptadas satisfactoriamente para uso in vivo o ex
vivo.
Una vez que el polinucleótido de expresión ha
sido liberado a la célula, puede ser integrado de manera estable en
el genoma de la célula receptora. Esta integración puede hacerse en
lugar cognado y en orientación vía recombinación homóloga
(reemplazamiento del gen) o puede ser integrado en un lugar
aleatorio, no específico (aumento del gen). En otras realizaciones
adicionales, el ácido nucleico puede ser mantenido establemente en
la célula como un segmento de DNA separado, episomial. Tales
segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican las
secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la
replicación independiente del ciclo de la célula hospedante o en
sincronización con dicho ciclo.
Una realización específica para un método para
liberar una proteína o péptido al interior de una célula de un
vertebrado in vivo comprende la etapa de introducir una
preparación que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y
un polinucleótido desnudo que codifica operativamente el polipéptido
de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la
célula, con lo que el polinucleótido desnudo es llevado hacia el
interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto es
particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero
puede ser aplicado in vivo también.
Las composiciones para uso in vitro e
in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo" están
descritas en la solicitud PCT No. WO 90/11092 (Vical Inc) y también
en la solicitud PCT No. WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM,
Université d'Ottawa) así como en los artículos de Tascon et
al. (1996) Nature Medicine. 2 (8): 888-892 y de
Huygen et al. ((1996) Nat Med Aug; 2 (8):
893-8).
También en otra realización, la transferencia de
un polinucleótido desnudo, incluyendo una estructura artificial de
polinucleótido, a las células puede ser llevada a cabo con un
bombardeo de partículas (biolístico), siendo dichas partículas
microproyectiles recubiertos de DNA acelerados a una alta velocidad
que les permite perforar las membranas de la célula y entrar en las
células sin destruirlas, tal como está descrito por Klein et
al. ((1990) Curr Genet Feb; 17 (2): 97-103).
En otra realización, el polinucleótido puede ser
atrapado en un liposoma (Ghosh and Bacchawat, (1991) Targeted Diagn
Ther; 4: 87-103; Wong et al., (1980) Gene 10:
87-94; Nicolau et al., (1987) Methods
Enzymol.; 149: 157-76). Estos liposomas pueden ser
además dirigidos a las células que expresan LSR mediante la
incorporación de leptina, triglicéridos, ACRP30, u otros ligandos
conocidos de LSR en la membrana del liposoma.
En una realización específica, se puede
proporcionar una composición para la producción in vivo de un
polipéptido de cabeza globular Apml descrito en esta memoria. Dicha
composición comprende un polinucleótido desnudo que codifica
operativamente este polipéptido, en solución en un vehículo
fisiológicamente aceptable, y adecuado para la introducción en un
tejido para hacer que las células del tejido expresen dicho
polipéptido.
La cantidad de vector a ser inyectada al
organismo hospedante deseado varía según el sitio de inyección. Como
una dosis indicativa, se inyectará entre 0,1 y 100 \mug del
vector en un cuerpo animal, preferiblemente un cuerpo de mamífero,
por ejemplo un cuerpo de ratón.
En otra realización del vector, éste puede ser
introducido in vitro en una célula hospedante,
preferiblemente en una célula hospedante previamente recogida del
animal a ser tratado y más preferiblemente una célula somática tal
como una célula del músculo. En una etapa subsiguiente, la célula
que ha sido transformada con el vector que codifica el polipéptido
de cabeza globular deseado Apm1 o el fragmento deseado del mismo se
reintroduce en el cuerpo del animal con el fin de liberar la
proteína recombinante dentro del cuerpo localmente o
sistémicamente.
Las células hospedantes pueden comprender un
vector recombinante como se ha descrito antes. Estas pueden incluir
células hospedantes que son transformadas (células procarióticas) o
que son transfectadas (células eucarióticas) con un vector
recombinante tal como uno cualquiera de los descritos en "Vectores
recombinantes".
Generalmente, una célula hospedante recombinante
puede comprender al menos uno de los vectores recombinantes que se
describen en esta memoria.
Las células hospedantes preferidas usadas como
receptoras de los vectores recombinantes son las siguientes:
a) Células hospedantes procarióticas: cepas de
Escherichia coli (esto es cepa DH5-\alpha),
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de
especies como Pseudomonas, Streptomyces y
Staphylococcus, y
b) Células hospedantes eucarióticas: células
HeLa (ATCC Nº CCL2; Nº CCL2.1; Nº CCL2.2), células Cv 1 (ATCC Nº
CCL70), células COS (ATCC N CRL1650;N CRL1651), células
Sf-9 (ATCC Nº CRL1711), células C127 (ATCC Nº
CRL-1804), 3T3 (ATCC Nº CRL-6361),
CHO (ATCC Nº CCL-61), riñón humano 293 (ATCC Nº
45504; Nº CRL-1573), BHK (ECACC Nº 84100501; Nº
84111301), células PLC, HepG2, y Hep3B.
Las estructuras artificiales en las células
hospedantes se pueden usar de manera convencional para producir el
producto génico codificado por la secuencia recombinante.
Después de la transformación de un hospedante
adecuado y el crecimiento del hospedante hasta una densidad
apropiada de células, el promotor seleccionado es inducido por
medios apropiados, tales como subida de la temperatura o inducción
química, y se cultivan las células durante un periodo adicional.
Las células se recogen típicamente por
centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el
extracto crudo resultante se retiene para posterior
purificación.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de las proteínas se pueden romper por cualquier método
conveniente, incluyendo ciclo de
congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o el uso de agentes para lisado de las células. Tales
métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Además, estas células recombinantes pueden ser
creadas in vitro o in vivo en un animal,
preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente seleccionado
del grupo que consiste en ratones, ratas, perros, cerdos, ovejas,
reses, y primates, sin incluir los seres humanos. Las células
recombinantes creadas in vitro pueden ser también
implantadas más tarde quirúrgicamente en un animal, por ejemplo. Los
métodos para crear células recombinantes in vivo en animales
son bien conocidos en la técnica.
Las células hospedantes homólogamente
recombinantes primarias, secundarias, e inmortalizadas de origen
vertebrado, preferiblemente de origen mamífero y particularmente de
origen humano, pueden ser sometidas a ingeniería genética para: a)
insertar polinucleótidos exógenos (heterólogos) en el DNA
cromosómico endógeno de un gen objetivo, b) delecionar el DNA
cromosómico endógeno, y/o c) reemplazar el DNA cromosómico endógeno
con polinucleótidos exógenos. Las inserciones, deleciones, y/o
reemplazamientos de las secuencias de polinucleótido pueden ser
para las secuencias codificadoras del gen objetivo y/o para las
regiones reguladoras, tales como las secuencias promotoras y
potenciadoras, asociadas operativamente con el gen objetivo.
Una célula hospedante homólogamente recombinante
puede ser preparada in vitro o in vivo, en la que
está alterada la expresión de un gen objetivo normalmente no
expresado en la célula. Preferiblemente la alteración causa la
expresión del gen objetivo en condiciones normales de crecimiento o
en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado
por el gen objetivo. El método para preparar una célula de este tipo
puede comprender las etapas de: (a) transfectar la célula in
vitro o in vivo con una construcción de polinucleótido,
comprendiendo la construcción de polinucleótido; (i) una secuencia
de acceso; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia
codificadora; y (iii) un sitio donador de corte y empalme no
emparejado, si fuera necesario, produciendo así una célula
transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro
o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación
homóloga.
Un método para alterar la expresión de un gen
objetivo en una célula in vitro o in vivo en el que
el gen no está normalmente expresado en la célula, puede comprender
las etapas de (a) transfectar la célula in vitro o in
vivo con una construcción de polinucleótido, comprendiendo la
construcción de polinucleótido: (i) una secuencia de acceso; (ii)
una secuencia reguladora y/o una secuencia codificadora; y (iii) un
sitio donador de corte y empalme no emparejado, si fuera necesario,
produciendo así una célula transfectada; y (b) mantener la célula
transfectada in vitro o in vivo en condiciones
apropiadas para la recombinación homóloga, produciendo de este modo
una célula homólogamente recombinante; y (c) mantener la célula
homólogamente recombinante in vitro o in vivo en
condiciones apropiadas para la expresión del gen.
Un método para preparar un fragmento de
polipéptido gOBG3 descrito en esta memoria, puede comprender alterar
la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula in
vitro o in vivo en el que el gen no está normalmente
expresado en la célula, comprendiendo las etapas de: a) transfectar
la célula in vitro o in vivo con una construcción de
polinucleótido, comprendiendo la construcción de polinucleótido; (i)
una secuencia de acceso; (ii) una secuencia reguladora y/o una
secuencia codificadora; y (iii) un sitio donador de corte y empalme
no emparejado, si fuera necesario, produciendo así una célula
transfectada; (b) mantener la célula transfectada in vitro o
in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación
homóloga, produciendo de este modo una célula homólogamente
recombinante; y c) mantener la célula homólogamente recombinante
in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la
expresión del gen preparando de este modo el polipéptido.
Una construcción de polinucleótido puede alterar
la expresión de un gen objetivo en un tipo de célula en el que el
gen no está normalmente expresado. Esto ocurre cuando una
construcción de polinucleótido se inserta en el DNA cromosómico de
la célula objetivo, en la que la construcción de polinucleótido
comprende: a) una secuencia de acceso; b) una secuencia reguladora
y/o una secuencia codificadora; y c) un sitio donador de corte y
empalme no emparejado, si fuera necesario. Además, las
construcciones de polinucleótido, como se han descrito antes,
pueden comprender además un polinucleótido que codifica un
polipéptido y que está en marco de lectura con el gen endógeno
objetivo después de la recombinación homóloga con DNA
cromosómico.
Las composiciones se pueden producir, y los
métodos se pueden realizar, por métodos conocidos en la técnica,
tales como los descritos en las patentes de Estados Unidos Nos:
6.054.288; 6.048.729; 6.048.724; 6.048.524; 5.994.127; 5.968.502;
5.965.125; 5.869.239; 5.817.789; 5.783.385; 5.733.761; 5.641.670;
5.580.734; Publicaciones internacionales Nos: WO 96/29411, WO
94/12650; y artículos científicos descritos por Koller et
al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 10: 705-730.
La expresión del gen OBG3 en células de
mamíferos, y típicamente en células humanas, puede resultar
defectuosa, o alternativamente puede ser mejorada, con la inserción
de una secuencia genómica de OBG3 o de cDNA con el reemplazamiento
del compañero del gen OBG3 en el genoma de una célula animal por un
polinucleótido OBG3. Estas alteraciones genéticas pueden ser
generadas por sucesos de recombinación homóloga usando estructuras
artificiales específicas de DNA que han sido descritas
previamente.
Un tipo de célula hospedante que se puede usar
son los zigotos de mamíferos, tales como los zigotos murinos. Por
ejemplo, los zigotos murinos pueden ser sometidos a una
microinyección con una molécula del DNA purificado de interés, por
ejemplo una molécula de DNA purificado que ha sido previamente
ajustada a un intervalo de concentración desde 1 ng/ml -para los
insertos de BAC - 3 ng/\mul -para los insertos de bacteriófago PI
- en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 250 \muM que
contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM, y espermidina 70 \muM.
Cuando el DNA a ser microinyectado tiene un tamaño grande, se pueden
usar poliaminas y altas concentraciones de sal con el fin de evitar
la rotura mecánica de este DNA, como se describe por Schedl et
al ((1993) Nature Mar 18; 362 (6417):
258-61).
Uno cualquiera de los polinucleótidos descritos
en esta memoria, incluyendo las estructuras artificiales de DNA
descritas en esta memoria, puede ser introducido en una línea de las
células madres embrionarias (ES), preferiblemente una línea celular
ES de ratón. Las líneas celulares ES se derivan de células
pluripotentes, inmaduras, de la masa interior de la célula de los
blastocitos de pre-implantación. Las líneas
celulares ES preferidas son las siguientes:
ES-E14TG2a (ATCC No. CRL-1821),
ES-D3 (ATCC No. CRL1934 y No.
CRL-11632), YS001 (ATCC No.
CRL-11776), 36.5 (ATCC No.
CRL-11116). Para mantener las células ES en un
estado inmaduro, se cultivan en presencia de células alimentadoras
de crecimiento inhibido que proporcionan las señales apropiadas para
preservar este fenotipo embrionario y sirven como una matriz para
la adherencia de las células ES. Las células alimentadoras
preferidas son los fibroblastos embrionarios primarios que se
establecen desde el tejido de embriones del día 13- día 14 de
virtualmente cualquier cepa de ratón, que se mantienen en cultivo,
tal como se describe por Abbondanzo et al. (1993; Methods
Enzymol; 225: 803-23) y cuyo crecimiento se ha
inhibido por irradiación, tal como se describe por Robertson((1987)
Embryo-derived stem cell lines. En: E.J. Robertson
Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach.
IRL Press, Oxford), o por la presencia de una concentración
inhibidora de LIF, tal como se describe por Pease and Williams
(1990; Exp Cell Res. Oct; 190 (2): 20911).
Las estructuras artificiales en las células
hospedantes se pueden usar de manera convencional para producir el
producto génico codificado por la secuencia recombinante.
Después de la transformación de un hospedante
adecuado y el crecimiento del hospedante hasta una densidad
apropiada de células, el promotor seleccionado es inducido por
medios apropiados, tales como subida de la temperatura o inducción
química, y se cultivan las células durante un periodo adicional. Las
células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen por
medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se
retiene para posterior purificación. Las células microbianas
empleadas en la expresión de proteínas se pueden romper por
cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de
congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o el uso de agentes para lisado de las células. Tales
métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los métodos y composiciones para la generación
de animales no humanos y plantas que expresan polipéptidos OBG3
recombinantes, esto es fragmentos de OBG3 o polipéptidos OBG3 de
longitud completa recombinantes, se describen en esta memoria. Los
animales o plantas pueden ser transgénicos, esto es cada una de sus
células contiene un gen que codifica el polipéptido OBG3, o,
alternativamente, puede ser introducido un polinucleótido que
codifica el polipéptido en las células somáticas del animal o
planta, por ejemplo en las células epiteliales secretoras mamarias
de un mamífero. El animal puede ser un mamífero tal como una vaca,
oveja, cabra, cerdo, o conejo.
Los métodos para preparar animales transgénicos
tales como mamíferos son bien conocidos por los expertos en la
técnica, y se puede usar cualquiera de tales métodos. En resumen, se
pueden producir mamíferos transgénicos, por ejemplo, transfectando
una célula madre pluripotencial tal como una célula ES con un
polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. Las células
ES transformadas satisfactoriamente pueden ser introducidas
entonces en un embrión en fase inicial que se implanta después en el
útero de un mamífero de la misma especie. En ciertos casos, las
células transformadas ("transgénicas") comprenderán parte de la
línea germinal del animal resultante, y los animales adultos que
comprenden las células transgénicas en la línea germinal pueden ser
apareados entonces con otros animales, produciendo eventualmente de
este modo una población de animales transgénicos que tienen el
transgén en cada una de sus células, y que pueden transmitir
establemente el transgén a cada una de sus crías. Se pueden usar
otros métodos para introducir el polinucleótido, por ejemplo
introducir el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés
en un huevo fertilizado o en un embrión en fase inicial por medio
de microinyección. Alternativamente, se puede introducir el transgén
en un animal por infección de zigotos con un retrovirus que
contiene el transgén (Jaenisch, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
73,1260-1264). Los métodos para preparar mamíferos
transgénicos están descritos, por ejemplo, en Wall et al.
(1992) J Cell Biochem 1992 Jun; 49 (2): 113-20;
Hogan, et al. (1986) en Manipulating the mouse embryo. A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y.; en el documento WO 91/08216, o en la patente de
Estados Unidos No. 4.736.866.
En un método preferido, se microinyectan los
polinucleótidos en el oocito fertilizado. Típicamente, los oocitos
fertilizados son microinyectados usando técnicas estándar, y después
se cultivan in vitro hasta que se obtiene un "embrión de
pre-implantación". Tales embriones de
pre-implantación contienen preferiblemente
aproximadamente 16 a 150 células. Los métodos para cultivar los
oocitos fertilizados hasta la fase de preimplantación están
descritos, por ejemplo, por Gordon et al. ((1984) Methods in
Enzymology, 101,414); Hogan et al. ((1986) en Manipulating
the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y) (para el embrión de ratón); Hammer
et al. ((1985) Nature, 315,680) (para los embriones de conejo
y cerdo); Gandolfi et al. ((1987) J. Reprod. Fert.
81,23-28); Rexroad et al. ((1988) J. Anim.
Sci. 66,947-953) (para los embriones ovinos); y
Eyestone et al. ((1989) J. Reprod. Fert.
85,715-720); Camous et al. ((1984) J.
Reprod. Fert. 72,779-785); y Heyman et al.
((1987) Theriogenology 27, 5968) (para los embriones bovinos). Los
embriones de pre-implantación se transfieren
entonces a una hembra apropiada por métodos estándar para permitir
el nacimiento de un animal transgénico o quimérico, dependiendo de
la fase de desarrollo en la que es introducido el transgén.
Como a menudo la frecuencia de incorporación del
transgén es baja, es muy deseable la detección de la integración
del transgén en los embriones de pre-implantación,
usando cualquiera de los métodos descritos aquí. Se puede usar
cualquiera de una serie de métodos para detectar la presencia de un
transgén en un embrión de pre-implantación. Por
ejemplo, se pueden separar una o más células del embrión de
pre-implantación, y la presencia o ausencia del
transgén en la célula o células separadas se puede detectar usando
cualquier método estándar por ejemplo la PCR. Alternativamente, la
presencia de un transgén puede ser detectada en el útero o después
del parto usando métodos estándar.
Se pueden generar mamíferos transgénicos que
segreguen polipéptidos OBG3 recombinantes en su leche. Como la
glándula mamaria es un órgano productor de proteínas muy eficiente,
tales métodos pueden ser usados para producir concentraciones de
proteínas en el intervalo de gramos por litro, y a menudo de forma
más significativa. Preferiblemente, la expresión en la glándula
mamaria se alcanza uniendo operativamente el polinucleótido que
codifica el polipéptido OBG3 a un promotor específico de la
glándula mamaria y, opcionalmente, a otros elementos reguladores.
Los promotores adecuados y otros elementos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, los derivados de WAP corto y largo de mamífero,
alfa-, beta-, y kappa-caseina, alfa- y
beta-lactoglobulina, genes beta-CN
5', así como el promotor del virus del tumor de mama de ratón
(MMTV). Dichos promotores y otros elementos pueden ser derivados de
cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, vacas,
cabras, ovejas, cerdos, ratones, conejos, y cobayas. Las secuencias
del promotor y otras secuencias reguladoras, vectores, y otras
enseñanzas relevantes, se proporcionan por ejemplo, por Clark
(1998) J Mammary Gly Biol Neoplasia 3: 337-50; Jost
et al. (1999) Nat. Biotechnol 17: 160-4;
Patentes de Estados Unidos Nos. 5.994.616; 6.140.552; 6.013.857;
Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:
845-52; Kim et al. (1999) J. Biochem. (Japan)
126: 320-5; Soulier et al. (1999) Euro. J.
Biochem. 260: 533-9; Zhang et al. (1997)
Chin. J. Biotech. 13: 271-6; Rijnkels et al.
(1998) Transgen. Res. 7: 5-14; Korhonen et
al. (1997) Euro. J. Biochem. 245: 482-9;
Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen. Res. 6:
75-84; Hitchin et al. (1996) Prot. Expr.
Purif. 7: 247-52;Platenburg et al. (1994)
Transgen. Res. 3: 99-108; Heng-Cherl
et al. (1993) Animal Biotech. 4: 89-107; y
Christa et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267:
1665-71.
Los polipéptidos descritos en esta memoria,
pueden ser producidos en la leche mediante la introducción de los
polinucleótidos que codifican los polipéptidos en las células
somáticas de la glándula mamaria in vivo, por ejemplo en las
células epiteliales secretoras mamarias. Por ejemplo, el DNA
plásmido puede ser infundido a través del canal del pezón, por
ejemplo en asociación con DEAE-dextrano (véase, por
ejemplo, Hens et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1523:
161-171), en asociación con un ligando que puede
llevar a la endocitosis de la construcción mediada por el receptor
(véase, por ejemplo, Sobolev et al. (1998) 273:
7928-33), o en un vector vírico tal como un vector
retroviral, por ejemplo el virus de la leucemia del gibón ape
(véase, por ejemplo, Archer et al. (1994) PNAS 91:
6840-6844). En cualquiera de estas realizaciones, el
polinucleótido puede estar unido operativamente a un promotor
específico de la glándula mamaria, como se ha descrito antes, o,
alternativamente, a cualquier promotor fuertemente expresado tal
como CMV o MoMLV LTR.
La idoneidad de cualquier vector, promotor,
elemento regulador, etc. para el uso que se describe en esta
memoria, puede ser evaluada de antemano transfectando células tales
como las células epiteliales mamarias, por ejemplo células MacT
(células epiteliales mamarias bovinas) o células GME (células
epiteliales mamarias de cabra), in vitro y evaluando la
eficacia de la transfección y expresión del transgén en las
células.
Para la administración in vivo, los
polinucleótidos pueden ser administrados en cualquier formulación
adecuada, en cualquier concentración dentro de un intervalo de
concentraciones (por ejemplo 1-500 \mug/ml,
preferiblemente 50-100 \mug/ml), en cualquier
volumen (por ejemplo 1-100 ml, preferiblemente 1 a
20 ml), y pueden ser administrados en cualquier número de veces
(por ejemplo 1, 2, 3, 5, o 10 veces), a cualquier frecuencia (por
ejemplo cada 1, 2, 3, 5, 10, o cualquier número de días). Las
concentraciones, frecuencias, modos de administración, etc.
adecuados dependerán del particular polinucleótido, vector, animal,
etc., y pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la
técnica.
Se puede usar un vector retroviral tal como un
vector del virus de la leucemia de gibón ape, como se describe en
Archer et al. ((1994) PNAS 91: 6840-6844).
Como la infección retroviral requiere típicamente la división de
las células, se puede estimular la división de las células en las
glándulas mamarias conjuntamente con la administración del vector,
por ejemplo usando un factor tal como benzoato de estrodiol,
progesterona, reserpina, o dexametasona. Además, el método
retroviral y otros métodos de infección pueden ser facilitados
usando compuestos accesorios tales como polibreno.
En cualquiera de los métodos descritos aquí para
obtener polipéptidos OBG3 de la leche, la cantidad de leche
obtenida, y por tanto la cantidad de polipéptidos OBG3 producidos,
puede ser aumentada usando cualquier método estándar de inducción
de la lactación, por ejemplo usando hexestrol, estrógenos, y/o
progesterona.
Los polinucleótidos usados pueden codificar o un
polipéptido OBG3 de longitud completa o un fragmento de OBG3.
Típicamente, el polipéptido codificado incluirá una secuencia señal
para asegurar la secreción de la proteína en la leche. Cuando se
usa una secuencia de OBG3 de longitud completa, la proteína de
longitud completa puede ser aislada, por ejemplo, a partir de la
leche y escindida in vitro usando una proteasa adecuada.
Alternativamente, se puede introducir un segundo polinucleótido que
codifica la proteasa en el animal o en las células de la glándula
mamaria, con lo que la expresión de la proteasa produce la escisión
del polipéptido OBG3 in vivo, permitiendo de este modo el
aislamiento directo de fragmentos de OBG3 de la leche.
Los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en
esta memoria, se pueden administrar a animales y/o a seres humanos,
solos o en composiciones farmacéuticamente o fisiológicamente
aceptables en las que se mezclan con vehículos o excipientes
adecuados. La composición farmacéuticamente o fisiológicamente
aceptable puede ser administrada entonces a una dosis
terapéuticamente eficaz. Una dosis terapéuticamente eficaz se
refiere a aquella cantidad de fragmento gOBG3 suficiente para dar
resultados en la prevención o mejoría de los síntomas o estado
fisiológico de enfermedades o trastornos relacionados con la
obesidad como se determina por los métodos descritos en esta
memoria. Una dosis terapéuticamente eficaz se puede referir también
a la cantidad de fragmento OBG3 o gOBG3 necesaria para una
reducción de peso o una prevención de un aumento de peso o
prevención de un aumento del ritmo de ganancia de peso en personas
que desean este efecto por razones estéticas. Una dosis
terapéuticamente eficaz de un fragmento gOBG3 descrito en esta
memoria, es aquella dosis que es adecuada para estimular la pérdida
de peso o la ganancia de peso con el uso o administración periódica
continuada. Las técnicas para la formulación y administración de
fragmentos de polipéptido OBG3 se pueden encontrar en "Remington's
Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última
edición.
Otras enfermedades o trastornos en los que se
pueden usar los fragmentos de polipéptido gOBG3 para su tratamiento
o prevención incluyen, pero sin limitarse a ellas, la obesidad y
enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como
obesidad, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad
ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
no dependiente de la insulina y diabetes tipo II. Las complicaciones
relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas por los métodos
de la invención incluyen lesiones microangiopáticas, lesiones
oculares, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin
limitarse a ellas, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria,
y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la
obesidad a ser tratados con los compuestos descritos en esta
memoria, incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras enfermedades
o trastornos adicionales de la invención relacionados con la
obesidad incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada
con el SIDA, anorexia, y bulimia. Los fragmentos de polipéptido
gOBG3 pueden ser usados también para mejorar el rendimiento físico
durante el trabajo o ejercicio o mejorar una sensación de bienestar
general. Las actividades de rendimiento físico incluyen andar,
correr, saltar, ascender y/o escalar.
Los fragmentos de polipéptido OBG3 o gOBG3 o sus
antagonistas pueden ser usados también para tratar la dislexia, el
trastorno de déficit de atención (ADD), el trastorno de
hiperactividad con déficit de atención (ADHD), y los trastornos
psiquiátricos tales como esquizofrenia mediante la modulación del
metabolismo de los ácidos grasos, más específicamente, la producción
de ciertos ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
Se considera expresamente que los fragmentos de
polipéptido gOBG3 descritos en esta memoria, se pueden proporcionar
solos o en combinación con otros compuestos farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptables. Otros compuestos útiles para el
tratamiento de la obesidad y otras enfermedades y trastornos son
actualmente bien conocidos en la técnica.
En una realización preferida, los fragmentos de
polipéptido gOBG3 son útiles y se usan en el tratamiento de la
resistencia a la insulina y en la diabetes usando métodos descritos
en esta memoria, y conocidos en la técnica. Más particularmente, un
procedimiento para la modificación y regulación terapéutica del
metabolismo de la glucosa en un sujeto animal o en un ser humano
puede comprender administrar a un sujeto que necesite tratamiento
(alternativamente fijado en una base diaria) un fragmento de
polipéptido gOBG3 (o polinucleótido que codifica dicho polipéptido)
en una dosis y durante un periodo de tiempo suficiente para reducir
los niveles de glucosa del plasma, en dicho sujeto animal o ser
humano.
Otros métodos para la profilaxis o tratamiento
de la diabetes pueden comprender administrar a un sujeto que
necesite tratamiento (alternativamente fijado en una base diaria) un
fragmento de polipéptido gOBG3 (o polinucleótido que codifica dicho
polipéptido) en una dosis y durante un periodo de tiempo suficiente
para reducir los niveles de glucosa del plasma, en dicho sujeto
animal o ser humano.
Las vías de administración adecuadas incluyen la
administración oral, nasal, rectal, transmucosal, o intestinal,
administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares,
subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales,
intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales,
intranasales, intrapulmonares (inhalación) o intraoculares usando
métodos conocidos en la técnica. Un método particularmente útil para
administrar los compuestos para estimular la pérdida de peso
incluye la implantación quirúrgica, por ejemplo en la cavidad
abdominal del receptor, de un dispositivo para liberar fragmentos de
polipéptido OBG3 o gOBG3 durante un extenso periodo de tiempo.
Otras vías particularmente preferidas de administración son los
aerosoles y la formulación depot. Están expresamente contempladas
las formulaciones de liberación sostenida, particularmente depot, de
los medicamentos descritos en esta memoria.
Las composiciones y medicamentos
farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables pueden ser
formulados de una manera convencional usando uno o más vehículos
fisiológicamente aceptable que comprenden excipientes y auxiliares.
Una formulación apropiada depende de la vía de administración
elegida.
Ciertos medicamentos descritos en esta memoria,
incluirán un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente
aceptable y al menos un polipéptido que es un fragmento de
polipéptido gOBG3 como se describe en esta memoria. Para inyección,
los agentes descritos aquí, pueden ser formulados en soluciones
acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles
tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o tampones salinos
fisiológicos tales como un tampón de fosfato o bicarbonato. Para
administración transmucosal, se usan en la formulación, agentes
penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada. Dichos
agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Las preparaciones farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptables que se pueden tomar oralmente incluyen
cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas
selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o
sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes
activos en mezcla con agentes de carga tales como lactosa,
aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco
o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las
cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o
suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina
líquida, o polietilenglicoles líquidos. En adición, se pueden
añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración
oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración.
Para administración bucal, las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos o comprimidos para chupar
formulados de una manera convencional.
Para administración por inhalación, los
compuestos para uso según la presente invención se liberan
convenientemente en la forma de una presentación de pulverización
en aerosol a partir de envases presurizados o de un nebulizador,
con el uso de un adecuado propelente gaseoso, por ejemplo, dióxido
de carbono. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosis
se puede determinar proporcionando una válvula para liberar una
cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos por ejemplo, de gelatina,
para uso en un inhalador o insuflador, se pueden formular
conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo
adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para
administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección
en embolada o por perfusión continua. Las formulaciones para
inyección se pueden presentar en forma de dosis unitarias, por
ejemplo, en ampollas o en envases multi-dosis, con
un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales
como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos, y
pueden contener agentes de formulación tales como agentes de
suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptables para administración parenteral incluyen
soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en
agua. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que
aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente,
la suspensión puede contener también estabilizantes adecuados o
agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir
la preparación de soluciones muy concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede
estar en polvo o en forma liofilizada para reconstitución con un
vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos, antes
de su uso.
En adición a las formulaciones descritas
previamente, los compuestos pueden ser formulados también como una
preparación depot. Tales formulaciones de acción a largo plazo
pueden ser administradas por implantación (por ejemplo
subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular.
Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con
materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una
emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o
como derivados bastante solubles, por ejemplo, como una sal bastante
soluble.
Adicionalmente, los compuestos se pueden
administrar usando un sistema de liberación sostenida, tal como
matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que
contienen el agente terapéutico. Se han establecido diferentes
materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los
expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida
pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos
durante unas semanas hasta más de 100 días.
Dependiendo de la naturaleza química y la
estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear
estrategias adicionales para la estabilización de las proteínas.
Las composiciones farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptables pueden comprender también vehículos o
excipientes adecuados sólidos o en fase de gel. Ejemplos de tales
vehículos o excipientes incluyen pero sin limitarse a ellos,
carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares,
almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como
polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente o
fisiológicamente aceptables pueden incluir composiciones en las que
los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz
para alcanzar el fin que se proponen. Más específicamente, una
cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para
prevenir el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto
a ser tratado. La determinación de las cantidades eficaces está
dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente
a la vista de la descripción detallada proporcionada aquí.
Para cualquier compuesto usado descrito en esta
memoria, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada
inicialmente a partir de los ensayos de cultivo de las células. Por
ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para
alcanzar un intervalo de concentración circulante que incluye o
engloba un punto o intervalo de concentración que se ha demostrado
que aumenta la absorción o unión de la leptina o lipoproteína en un
sistema in vitro. Tal información se puede usar para
determinar más exactamente los dosis útiles en los seres
humanos.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a
aquella cantidad del compuesto que produce una mejoría de los
síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de
tales compuestos se puede determinar por procedimientos
farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de
experimentación, por ejemplo, para determinar la LD50, (la dosis
letal para el 50% de la población de ensayo) y la ED50 (la dosis
terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de
dosis entre los efectos tóxicos y los efectos terapéuticos es el
índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre LD50 y
ED50. Se prefieren los compuestos que presentan altos índices
terapéuticos.
Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos
celulares y estudios animales se pueden usar para formular un
intervalo de dosis para uso en los seres humanos. La dosis de tales
compuestos está preferiblemente dentro de un intervalo de
concentraciones circulantes que incluyen la ED50, con poca o ninguna
toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo
dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de
administración utilizada. La formulación exacta, la vía de
administración y la dosis pueden ser elegidas por cada médico a la
vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et
al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics",
Ch. 1).
La cantidad de dosis y el intervalo se pueden
ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del
compuesto activo que sean suficientes para mantener o prevenir la
pérdida o ganancia de peso, dependiendo de la situación particular.
Las dosis necesarias para alcanzar estos efectos dependerá de las
características del individuo y de la vía de administración.
Los intervalos de dosis se pueden determinar
también usando el valor de la concentración eficaz mínima. Los
compuestos se deben administrar usando un régimen que mantiene los
niveles plasmáticos por encima de la concentración eficaz mínima
durante 10-90% del tiempo, preferiblemente entre
30-90%; y lo más preferiblemente entre
50-90%. En los casos de administración local o
absorción selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede
que no esté relacionada con la concentración plasmática.
La cantidad de composición administrada
dependerá naturalmente, del sujeto a ser tratado, del peso del
sujeto, de la gravedad de la afección, de la manera de
administración y del criterio del médico prescriptor.
Un intervalo de dosis preferido para la cantidad
de un fragmento de polipéptido gOBG3 descrito en esta memoria, que
puede ser administrada en base diaria o regular para alcanzar los
resultados deseados, incluyendo una reducción en los niveles de
lipoproteínas circulantes plasmáticas ricas en triglicéridos, varían
de 0,01-0,5 mg/kg de masa corporal. Un intervalo de
dosis más preferido varía de 0,05-0,1 mg/kg.
Naturalmente, estas dosis diarias pueden ser liberadas o
administradas en pequeñas cantidades periódicamente a lo largo de un
día. Se debe observar que estos intervalos de dosis son solamente
intervalos preferidos y no significa que sean limitantes para la
invención.
El tratamiento de ratones con fragmentos de
polipéptido gOBG3 da como resultado la reducción de los niveles de
triglicéridos, la reducción de los niveles de ácidos grasos libres,
la reducción de los niveles de glucosa, y la reducción del peso
corporal así como un aumento de la oxidación muscular.
Los métodos para prevenir o tratar las
enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad pueden
comprender proporcionar a un individuo que necesita tal tratamiento
un fragmento de polipéptido gOBG3 como se describe en esta memoria.
Preferiblemente, el fragmento del polipéptido OBG3 tiene actividad
relacionada con la obesidad ya sea in vitro o in
vivo. Preferiblemente el fragmento del polipéptido OBG3 se
proporciona al individuo en una composición farmacéutica que
preferiblemente se toma oralmente. Preferiblemente el individuo es
un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano. En las
realizaciones preferidas, la enfermedad o trastorno relacionado con
la obesidad se selecciona del grupo que consiste en ateroesclerosis,
enfermedad cardiovascular, resistencia a la insulina, hipertensión,
ictus, síndrome X, diabetes tipo II y diabetes lipoatrófica. Las
complicaciones relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas
por los métodos de la invención incluyen lesiones
microangiopáticas, lesiones oculares, y lesiones renales. La
cardiopatía incluye, pero sin limitarse a ellas, insuficiencia
cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros
trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los
compuestos descritos en esta memoria, incluyen hiperlipidemia,
hipertrigliceridemia, y hiperuricemia. Otras enfermedades o
trastornos adicionales de la invención relacionados con la obesidad
incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el
SIDA, pérdida de peso relacionada con neoplasia, anorexia, y
bulimia. En las realizaciones altamente preferidas, se usan los
fragmentos de polipéptido gOBG3 en composiciones farmacéuticas para
modular el peso corporal en individuos sanos por razones
estéticas.
Los métodos para prevenir o tratar enfermedades
y trastornos relacionados con la obesidad pueden comprender
proporcionar a un individuo que necesita tal tratamiento un
compuesto identificado por los ensayos descritos en la Sección VI
de las Realizaciones preferidas y en los Ejemplos. Preferiblemente
estos compuestos antagonizan o agonizan los efectos de los
fragmentos de polipéptido OBG3 o gOBG3 en las células in
vitro, músculos ex vivo, o en modelos animales.
Alternativamente, estos compuestos agonizan o antagonizan los
efectos de los fragmentos de polipéptido OBG3 o gOBG3 sobre la
absorción y/o unión de la leptina y/o lipoproteína. Opcionalmente,
estos compuestos previenen la interacción, unión, o absorción de los
fragmentos de polipéptido OBG3 o gOBG3 con LSR in vitro o
in vivo. Preferiblemente, el compuesto se proporciona al
individuo en una composición farmacéutica que preferiblemente se
toma oralmente. Preferiblemente el individuo es un mamífero, y lo
más preferiblemente un ser humano. En las realizaciones preferidas,
la enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad se selecciona
del grupo que consiste en obesidad y enfermedades y trastornos
relacionados con la obesidad tales como ateroesclerosis,
cardiopatía, resistencia a la insulina, hipertensión, ictus,
síndrome X, diabetes tipo II, y diabetes lipoatrófica. Las
complicaciones relacionadas con la diabetes tipo II a ser tratadas
por los métodos descritos en esta memoria, pueden incluir lesiones
microangiopáticas, lesiones oculares, y lesiones renales. La
cardiopatía incluye, pero sin limitarse a ellas, insuficiencia
cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros
trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los
compuestos descritos en esta memoria, pueden incluir
hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, y hiperuricemia. Otras
enfermedades o trastornos adicionales de la invención relacionados
con la obesidad incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso
relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con neoplasia,
anorexia, y bulimia. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar
para modular el peso corporal razones estéticas.
El tratamiento se puede realizar con fragmentos
de polipéptido gOBG3 cuando se ha demostrado que el individuo tiene
un particular genotipo para un marcador Apm1 (Apm1 designa el
homólogo humano del polipéptido OBG3 de longitud completa), o
cuando se ha demostrado que tiene una cantidad reducida de Apm1
plasmático, ya sea de longitud completa o preferiblemente un
fragmento más biológicamente activo de Apm1, en comparación con los
valores control, por ejemplo los valores representativos de
individuos no enfermos, o en comparación con el del individuo antes
de la aparición de una enfermedad o condición. En cualquier caso, el
tratamiento debe comprender proporcionar al individuo fragmentos de
polipéptido gOBG3 farmacéuticamente aceptables. La cantidad exacta
de fragmento gOBG3 proporcionada se debe determinar mediante ensayos
clínicos bajo la dirección de médicos cualificados, pero es de
esperar que esté en el intervalo de 5-7 mg por
individuo al día. En general, un intervalo preferido debe variar de
0,5 a 14 mg por individuo al día, siendo un intervalo altamente
preferido entre 1 y 10 mg por individuo al día. Los individuos que
podrían beneficiarse del tratamiento con fragmentos de polipéptido
gOBG3 pueden ser identificados por dos métodos al menos:
determinaciones del nivel en suero plasmático y caracterización del
genotipo.
Estudios preliminares han demostrado que las
personas obesas tienen niveles más bajos de OBG3/Apm1 de longitud
completa que las personas no obesas. Se contempla el tratamiento de
individuos (preferiblemente obesos) que tienen niveles bajos de
OBG3/Apm1 de longitud completa con los fragmentos de polipéptido
gOBG3 descritos en esta memoria. En adición, se contempla el
tratamiento de individuos con niveles bajos del fragmento de
OBG3/Apm1 biológicamente activo con fragmentos de polipéptido
gOBG3. Los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos en esta
memoria, pueden ser administrados a individuos, preferiblemente
individuos obesos, que tienen niveles de OBG3 de longitud completa
(o alternativamente un fragmento maduro del polipéptido OBG3) que
son al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
aproximadamente 100% o 100% más bajos que los de los individuos no
obesos, preferiblemente individuos sanos como se determina por un
médico usando los estándares normales en la técnica. Los métodos
para determinar y comparar los niveles de OBG3 de longitud completa
en individuos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin
limitarse a ellos, el uso de un anticuerpo específico para Apml en
un formato tal como un radioinmunoensayo, ELISA, transferencia
Western, transferencia a membrana, o como parte de una matriz, por
ejemplo. Los métodos para generar anticuerpos frente a Apm1 y sus
fragmentos así como frente a proteínas con SNPs se exponen en los
documentos PCT/IB99/01858, solicitud de Estados Unidos No.
09/434.848, y WO 99/07736. Además, los anticuerpos específicos para
los fragmentos de polipéptido gOBG3 descritos aquí, su generación,
y su uso están descritos en esta memoria.
Otras características y ventajas de la invención
se describen en la Breve descripción de las figuras y en los
Ejemplos. Estos son a título de ejemplos solamente, y no limitan la
invención de ningún modo.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con
fines ilustrativos y no como medios de limitación. Un experto normal
en la técnica debería ser capaz de diseñar ensayos y métodos
equivalentes basados en esta descripción y todos ellos forman parte
de la presente invención.
Se debe observar que en el término polipéptido
OBG3 de longitud completa usado a todo lo largo de la memoria
descriptiva se pretende englobar los homólogos de la proteína ACRP30
(Scherer et al (1995) J Biol. Chem. 270:
26746-9), AdipoQ (Hu et al (1996) J Biol Chem
271: 10697-10703) y el homólogo humano
Apm-1 (Maeda et al (1996) Biochem Biophys
Res Commun 221: 289-9) o GBP28 (Nakano et al
(1996) J Biochem (Tokyo) 120:803-812). También OBG3
intenta englobar otros homólogos.
A continuación se detalla un método a título de
ejemplo para generar el OBG3 recombinante. Aunque el método
describe la producción del análogo de ratón, una persona experta en
la técnica debería ser capaz de usar la información proporcionada
para producir otros análogos de OBG3, incluyendo pero sin limitarse
a él, el análogo humano. En la Fig.1 se muestra un alineamiento de
las secuencias de aminoácidos del OBG3 humano (apm1) y de ratón
(AdipoQ y acrp30).
El análogo de OBG3 recombinante es clonado en
pTRC His B (Invitrogen) entre BamH1 y Xho1 (Fig. 2) y se mantiene
en E. coli DH5-alfa. La secuencia del inserto
de OBG3 corresponde a ACRP 30 genbank U37222 bases 88 a 791 excepto
en la posición 382 donde en #3 G reemplaza a A encontrado en ACRP 30
(V en lugar de M). El correspondiente nucleótido en AdipoQ U49915
es G como en el clon #3. El aminoácido V se conserva también en la
secuencia humana APM-1 D45371.
\vskip1.000000\baselineskip
Poner en placas las bacterias en medio agar LB
que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. Inocular 1 colonia en 5
ml de medio (sin agar) a 37ºC durante la noche. Añadir 2 ml de este
cultivo inicial a matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen 200
ml de medio LB y 100 \mug/ml de ampicilina. Incubar a 37ºC en un
agitador vibrador hasta que la OD_{600} = 0,2. Añadir IPTG hasta
una concentración final de 1 mM (solución stock = 1 M). Incubar a
37ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Sedimentar las bacterias por centrifugación
(Sorvall, 3500 rpm, 15 min, 4ºC) en un tubo
pre-pesado.
A 4ºC resuspender el sedimento en 3 ml/g de
tampón de lisis
Añadir 40 \mul/g de PMSF 10 mM
Añadir 80 \mul/g de lisozima a 10 mg/ml
Incubar durante 20 min sobre hielo, agitando
intermitentemente
Añadir 30 \mul/g de desoxicolato de sodio al
10%
Incubar a 37ºC hasta que el lisado se vuelve
viscoso
Congelar en nitrógeno líquido y descongelar a
37ºC tres veces
Sonicar 2X, 30 segundos, ciclo a 25%, nivel 2,5
de potencia
Centrifugar durante 30 min, 15000 rpm, 4ºC
Recoger el sobrenadante
Nota: El lisado se puede conservar congelado
antes de la etapa de sonicación.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Empaquetar 1 ml de resina Probond
(Invitrogen; 1 ml = 2 ml de gel suspendido) en una columna de 5 ml.
Lavar con 5 ml de PBS.
2. Aplicar 5 ml de sobrenadante bacteriano a
dicho 1 ml de gel. (Si el volumen es muy alto, usar varias columnas
pequeñas)
3. Lavar con 24 ml de tampón fosfato, pH 7,8,
seguido por un lavado con 24 ml de tampón fosfato, pH 6.
4. Eluir con tampón de imidazol y recoger
fracciones de 1 ml.
5. Analizar las fracciones por OD a 280 nm o por
SDS-PAGE (12,5%, dilución ½ en 2X tampón de muestra)
en condiciones reductoras (100ºC, 5 min)
6. Reunir las fracciones que contienen proteínas
(usualmente las fracciones números 2-4 para las
concentraciones de 0,8-1 mg/ml y las fracciones 1, 5
y 6 para las concentraciones de 0,2-0,4 mg/ml).
7. Dializar a fondo frente a 1 X PBS,
bicarbonato de amonio 24 mM o Tris 50 mM, pH 7,4 que contiene NaCl
250 nM. Concentrar mediante Speed-Vac si fuera
necesario.
8. Analizar las proteínas por el método
Lowry.
9. Dividir en alícuotas y almacenar a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Empaquetar 5 ml de resina Probond en una
columna de 5 ml.
2. Lavar con 4 volúmenes del lecho de tampón
fosfato pH 7,8, 1 ml/min.
3. Inyectar 25 ml de lisado (filtrado sobre 0,45
\mu o centrifugado a 3000 rpm, 30 min, 4ºC, Beckman Allegra 6R) a
0,5 ml/min.
4. Lavar con 4 volúmenes de lecho de tampón
fosfato, pH 7,8 a 1 ml/min.
5. Lavar con 12 volúmenes de lecho de tampón
fosfato pH 5,5 a 1 ml/min.
6. Eluir la fracción unida con tampón fosfato,
pH 5,5, que contiene imidazol 1 M a 1 ml/min.
7. Recoger las fracciones, dializar y analizar
las proteínas como se ha descrito para la purificación del lote,
etapas 7-9.
\vskip1.000000\baselineskip
Incubar el OBG3 purificado (obtenido como se ha
descrito antes o por un método equivalente) con tripsina
acetilada-tipo V-S procedente de
páncreas bovino (Sigma E.C. = 3.4.21.4) a 400 u/mg de proteína a
25ºC durante 10 min.
Parar la reacción pasando la muestra sobre una
columna poli-Prep (Biorad 731-1550)
a +4ºC que contiene un inhibidor inmovilizado de tripsina.
Recoger fracciones de 1,0 ml. Determinar la
concentración de proteína.
Reunir las fracciones que contienen proteína y
dializar extensamente frente a PBS usando tubo de diálisis con un
corte de peso molecular = 10.000 da.
Concentrar sobre un filtro estéril Amicon
YM-10 Centricon Filter (Millipore, corte de peso
molecular = 10.000 da).
Determinar la concentración final de proteína
usando el procedimiento de Lowry modificado por Markwell (1981) o el
ensayo BCA de proteínas (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) y BSA
como estándar.
Comprobar la pureza y la eficacia de la escisión
por análisis de SDS-PAGE usando un gel con gradiente
4-20%. El OBG3 intacto migra como una banda simple a
aproximadamente 37 kda aparentemente debido a las secuencias del
vector cotranscrito unido a la cola de histidina en el
N-terminal de AdipoQ, y forma un dímero a 74 kDa.
El OBG3 escindido forma una banda a aproximadamente 18 kda (gOBG3).
También se generan productos de degradación adicionales, todos
menores de 10 kda a partir de la región N-terminal.
Estos se separan de la banda de 18 kda deseada por diálisis con
membranas semipermeables con un corte de peso molecular de 10.000.
Los dos sitios potenciales de escisión para gOBG3 se muestran en la
Fig. 3. El sitio de escisión real ha sido identificado como el que
está después del aminoácido 103 (aminoácido 100 para el gOBG3 humano
o APM1) (Fig. 7). Esto es, el N-terminal del
producto de escisión de gOBG3 es Lys 104 (Lys 101 para el gOBG3
humano o APM1).
Se pueden usar también otros métodos
enzimáticos/proteolíticos que producen productos similares, por
ejemplo clostripaína. Otras enzimas preferidas deberían
preferiblemente escindir el OBG3 en un sitio próximo a la unión
entre la cola tipo colágeno y la cabeza globular (aproximadamente el
aminoácido 108 para el gOBG3 humano y aproximadamente el aminoácido
111 para el gOBG3 murino), preferiblemente deberían permitir que la
reacción sea parada fácilmente, preferiblemente que sea separado
fácilmente usando un inhibidor inmovilizado, o un método similar, y
preferiblemente corta el fragmento N-terminal en
pequeñas piezas (menores que un MW de 10.000). La escisión
preferiblemente tiene lugar en la presencia de no más de 6
repeticiones de colágeno, más preferiblemente 3 repeticiones de
colágeno, y lo más preferiblemente sin repeticiones de colágeno. Una
repetición de colágeno consiste en
GLY-X-Y. La determinación de si se
ha generado un gOBG3 activo, se puede comprobar usando los ensayos
in vitro y in vivo descritos en esta memoria,
(Ejemplos 4-6, 8-10).
Una primera táctica es buscar sitios de
restricción únicos cerca del comienzo de la región de la cabeza
globular (las secuencias de ácido nucleico de ratón y de
polipéptidos OBG3 humanos se proporcionan en el listado de
secuencias). Si está presente este sitio único, se puede usar para
escindir la región tipo colágeno en 5' a partir de la región de
cabeza globular. Si no está presente un único sitio, es posible
también, aunque más difícil, hacer esto usando enzimas de
restricción que cortan en más de una localización haciendo
digestiones parciales. El extremo 3' de la cabeza globular puede
ser cortado desde su vector de la cadena principal usando una
enzima apropiada. La cabeza globular puede ser clonada entonces en
un vector de expresión y se pueden identificar las estructuras
artificiales que contienen los fragmentos correctos. Para AdipoQ,
parece que la Tau I es la única enzima que debería separar la cola
del colágeno de la cabeza globular.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra táctica es someter a la PCR la región de
interés de la secuencia intacta (si el cDNA está disponible) usando
cebadores con sitios de restricción en el extremo de forma que los
productos de la PCR pueden ser clonados en vectores de interés.
Alternativamente, el gOBG3 puede ser generado también usando
RT-PCR para aislarlo del RNA del tejido adiposo.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, la región globular AdipoQ puede ser
clonada en pTrcHisB, poniendo un sitio BamHI en el oligo sentido y
un sitio XhoI en el oligo antisentido. Esto permite el aislamiento
del producto de la PCR, la digestión de dicho producto, y el enlace
con el vector pTrcHisB que también ha sido digerido con BamHI y XhoI
(Fig. 4). El vector, pTrcHisB, tiene un cola de
6-Histidina en N-terminal, que
permite la purificación de la proteína sobreexpresada procedente
del lisado usando una columna de resina Nickel. El vector pTrcHisB
se usa para la sobre-expresión de proteínas en E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligos a título de ejemplos para clonación
en el vector de E. coli incluyen:
A) obg3 sentido CTTAGTGGATCCCGCTTATGTGTATCGCTCAG
a 6 pares de bases desde la izquierda hay un sitio BamHI de 6 bp.
Así la región que es homóloga al gen empieza en el nucleótido
13.
B) obg3 antisentido GCTGTTCTCGAGTCAGTTGGTATCATGG
a 6 pares de bases desde la izquierda hay un sitio XhoI de 6 bp. Así
la región que es homóloga al gen empieza en el nucleótido 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo que sigue son ejemplos de las condiciones de
la PCR.
Las concentraciones finales de la reacción
son:
1X de tampón A de PE Biosystems
MgCl_{2} 1,5 mM
Cada uno de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200
\muM
2,5 unidades de Amplitaq Gold de PE
Biosystems
Cada cebador (sentido y antisentido) 0,4
\muM
10 ng de modelo de plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros de ciclo:
95ºC 10 min - - - 1 ciclo
95ºC 30 s
56ºC 30 s
72ºC 30 s
repetir las 3 etapas anteriores durante 30
ciclos
72ºC 7 min - - - 1 ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
La cabeza globular también puede ser
sobreexpresada en un sistema de Baculovirus usando el kit 6xHis
Baculovirus (Pharmingen), por ejemplo. La región globular AdipoQ es
clonada en el vector apropiado usando enzimas disponibles en el
sitio de clonación múltiple. Esto permite la
sobre-expresión de la proteína en un sistema
eucariótico que tiene algunas ventajas sobre el sistema de E.
coli, que incluye: expresión múltiple del gen, escisión del
péptido señal, corte y empalme del intrón, transporte nuclear,
proteína funcional, fosforilación, glucosilación, y acilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligos a título de ejemplos para clonación
en el vector de Baculovirus son los siguientes:
A). obg3 sentido
CTTAGTGAATTCGCTTATGTGTATCGCTCAGA a 6 pares de bases desde la
izquierda hay un sitio EcoRI de 6 bp. Así la región que es homóloga
al gen empieza en el nucleótido 13.
B). obg3 antisentido
GCTGTTCTGCAGTCAGTTGGTATCATGG a 6 pares de bases desde la izquierda
hay un sitio PstI de 6 bp. Así la región que es homóloga al gen
empieza en el nucleótido 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo que sigue son ejemplos de las condiciones de
la PCR.
Las concentraciones finales de la reacción
son:
1X de tampón A de PE Biosystems
MgCl_{2} 1,5 mM
Cada uno de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200
\muM
2,5 unidades de Amplitaq Gold de PE
Biosystems
Cada cebador (sentido y antisentido) 0,4
\muM
10 ng de modelo de plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros de ciclo:
95ºC 10 min - - - 1 ciclo
95ºC 30 s
60ºC 30 s
72ºC 30 s
repetir las 3 etapas anteriores durante 30
ciclos
72ºC 7 min - - - 1 ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
El OBG3 globular puede ser clonado también en un
vector de expresión de mamífero y puede ser expresado y purificado a
partir de células de mamífero, por ejemplo células
3T3-L1 (precursoras de adipocitos indiferenciados).
La cabeza globular se genera entonces en un entorno muy próximo a su
entorno endógeno. Sin embargo, este no es necesariamente el modo más
eficaz de preparar la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de diferentes preparaciones y
diferentes variantes de la secuencia de los fragmentos de
polipéptido gOBG3 se evalúa usando diferentes ensayos in
vitro incluyendo los que se indican a continuación. Estos
ensayos son también ejemplos de los que se pueden usar para
desarrollar antagonistas y agonistas del fragmento de polipéptido
gOBG3. Para hacer esto, el efecto de los fragmentos de polipéptido
gOBG3 en los ensayos anteriores, por ejemplo sobre la actividad de
la leptina y/o LSR, en presencia de las moléculas candidatos se debe
comparar con el efecto de los fragmentos de polipéptido gOBG3 en
los ensayos en ausencia de las moléculas candidatos. Puesto que se
ha demostrado que los fragmentos de polipéptido gOBG3 reducen el
peso corporal en ratones con una dieta de alto restaurante (Ejemplo
5), estos ensayos sirven también para identificar los tratamientos
candidatos para reducir (o aumentar) el peso corporal.
Los ensayos de eficacia de los fragmentos de
polipéptido gOBG3 sobre LSR se pueden realizar usando líneas de
células hepáticas, incluyendo por ejemplo, PLC, HepG2, Hep3B
(humano), Hepa 1-6, BPRCL (de ratón), o
MCA-RH777, MCA-RH8994 (de rata).
Para líneas de células humanas, se deben usar preferiblemente APM1 y
APM1 globular; para roedores, se deben usar preferiblemente
AdipoQ/ACRP30 de longitud completa y globular.
Las células hepáticas de ratón BPRCL (depósito
ATCC) se pusieron en placas a una densidad de 300.000
células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM (rico en
glucosa) que contiene glutamina y
penicilina-estreptomicina (Bihain & Yen, 1992).
Se cambió el medio el día 2. El día 3, se lavaron las monocapas
confluentes una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS,
pH 7,4) (2 ml/pocillo). Se incubaron las células a 37ºC durante 30
min con concentraciones crecientes de AdipoQ (AQ) recombinante o
AdipoQ globular (AQ-GH) en DMEM que contiene BSA al
0,2% (p/v), Hepes 5 mM, CaCl^{2} 2 mM, bicarbonato de sodio a 3,7
g/l, pH 7,5. Se continuaron las incubaciones durante 3 h a 37ºC
después de la adición de 10 ng/ml de
^{125}I-leptina de ratón (actividad específica,
22100 cpm/ng). Se lavaron las monocapas 2 veces consecutivamente con
PBS que contiene BSA al 0,2%, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y
después 2 veces consecutivamente con PBS. Se lisaron las células con
NaOH 0,1 N que contiene EDTA 0,24 mM. Se recogieron los lisados en
tubos, y se contaron en un contador gamma.
Los resultados de un experimento a título de
ejemplo se muestran como la media de determinaciones triplicadas en
la Fig. 5.
Los resultados indican que los fragmentos de
polipéptido gOBG3 son al menos un 30% más eficaces que el OBG3 para
aumentar la absorción de leptina en una línea celular hepática (Fig.
5). Este ensayo se puede usar para determinar la eficacia de los
fragmentos de polipéptido gOBG3 y los compuestos relacionados (o
agonistas o antagonistas) para aumentar o reducir la absorción de
leptina en el hígado, así como el mecanismo por el que el
fragmento/compuesto polipeptídico gOBG3 ejerce este efecto.
El efecto de los fragmentos de polipéptido gOBG3
sobre el transporte de leptina en el cerebro se puede determinar
usando células derivadas del cerebro. Un método que se prevé, es
usar el modelo de barrera hematoencefálica descrito por Dehouck,
et al (J Neurochem 54: 1798-801,1990) que usa
un co-cultivo de células endoteliales capilares de
cerebro y astrocitos para analizar los efectos de los fragmentos de
polipéptido gOBG3 sobre el transporte de leptina (u otras moléculas)
a través de LSR u otros receptores.
Este ensayo debería ser un indicador del efecto
potencial de los fragmentos de polipéptido gOBG3 sobre el
transporte de leptina al cerebro y podría ser usado para seleccionar
variantes de los fragmentos de polipéptido gOBG3 en cuanto a su
capacidad para modular el transporte de leptina a través de LSR u
otros receptores en el cerebro. En adición, también se podrían
cribar usando este ensayo los supuestos agonistas y antagonistas
del efecto de los fragmentos de polipéptido gOBG3 sobre el
transporte de leptina a través de LSR u otros receptores. El
aumento del transporte de leptina a través de la barrera
hematoencefálica debería aumentar presumiblemente su acción como un
factor saciante.
El efecto de los fragmentos de polipéptido gOBG3
sobre LSR se puede determinar también midiendo el nivel de
expresión de LSR en la superficie celular mediante citometría de
flujo de superficie, usando anticuerpos anti-LSR y
anticuerpos secundarios fluorescentes. La citometría de flujo es una
tecnología basada en láser que se usa para medir las
características de las partículas biológicas. El principio en que se
basa la citometría de flujo es que la luz se dispersa y la
fluorescencia que se emite como luz a partir de la fuente de
excitación golpea las partículas en movimiento.
Este es un ensayo de alto rendimiento que podría
ser adaptado fácilmente para seleccionar fragmentos de polipéptido
OBG3 y gOBG3 y variantes, así como los supuestos agonistas o
antagonistas de los fragmentos de polipéptido gOBG3. A continuación
se proporcionan dos ensayos. El anticuerpo, la línea celular y el
análogo del fragmento de polipéptido gOBG3 podrían variar
dependiendo del experimento, pero se podría usar una línea celular
humana, un anticuerpo anti-LSR humano y APM1
globular para seleccionar variantes, agonistas, y antagonistas a ser
utilizados para tratar a seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
1
Se pretratan las células o con OBG3 intacto o
con fragmentos de polipéptido gOBG3 (o no se tratan) antes de su
recogida y análisis por FACS. Se recogen las células usando solución
de disociación no enzimática (Sigma), y después se incuban durante
1 h a 4ºC con una dilución 1:200 de anti-LSR 81B o
un anti-suero irrelevante en PBS que contiene BSA
al 1% (p/v). Después de lavar dos veces con el mismo tampón, se
añade a las células anticuerpo anti-conejo de cabra
conjugado con FITC (Rockland, Gilbertsville, PA), seguido por una
incubación adicional durante 30 min a 4ºC. Después de lavado, se
fijan las células en formalina al 2%. El análisis por citometría de
flujo se realiza en un citómetro FACSCalibur
(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
El ensayo in vitro con la línea celular
hepática (descrito antes) ha demostrado que la actividad de LSR
(unión de leptina) aumenta con concentraciones crecientes de
fragmentos de polipéptido gOBG3. Aunque no se desea que esté
limitado por ninguna teoría particular, esto podría ser o bien el
resultado de un aumento del número de sitios de unión a LSR sobre
la superficie de la célula, o bien un cambio en la afinidad para la
leptina. El ensayo FACS debería presumiblemente detectar cambios en
el número de sitios de unión a LSR, aunque también podrían ser
detectados cambios en la conformación que reflejan cambios en
afinidad. Preferiblemente el anticuerpo debería ser frente al
C-terminal del LSR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
Se cultivan las células en matraces T175 según
las instrucciones del fabricante durante 48 horas antes del
análisis.
Se lavan las células una vez con tampón FACS (1x
PBS/ FBS al 2%, filtro esterilizado), y se raspan manualmente del
matraz en 10 ml de tampón FACS. Se transfiere la suspensión de
células a un tubo cónico de 15 ml y se centrifuga a 1200 rpm, 4ºC
durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y se resuspenden las
células en 10 ml de tampón FACS enfriado a 4ºC. Se realiza el
recuento de células y se ajusta la densidad celular con tampón FACS
hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Se añade un
mililitro de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 48
pocillos para análisis. Se centrifugan las células a 1200 rpm
durante 5 minutos a 4ºC. Se comprueban las placas para asegurarse
de que las células se han sedimentado, se separa el sobrenadante y
se resuspenden las células poniendo la placa sobre un mezclador en
vórtex. Se añade un mililitro de tampón FACS a cada pocillo,
seguido por centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Este
lavado de células descrito se realizó un total de 3 veces.
Se añade a las células un anticuerpo primario,
cuyo título se ha determinado en experimentos de cribado para
determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo 1:25,
1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:4000,
1:5000, o 1:10000), hasta un volumen total de 50 \mul de tampón
FACS. Se incuban las placas durante 1 h a 4ºC protegidas de la luz.
Después de la incubación, se lavan las células 3 veces como se ha
indicado antes. Se añade a las células un anticuerpo secundario
apropiado, cuyo título se ha determinado en experimentos de cribado
para determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo
1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000,
1:4000, 1:5000, o 1:10000), hasta un volumen total de 50 \mul de
tampón FACS. Se incuban las placas durante 1 h a 4ºC protegidas de
la luz. Después de la incubación, se lavan las células 3 veces como
se ha indicado antes. Después del lavado final, se resuspenden las
células en 500 \mul de tampón FACS y se transfieren a un tubo de
adquisición de FACS. Se ponen las muestras sobre hielo protegidas de
la luz y se analizan antes de 1 hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación de gOBG3 con isotiocianato de
fluoresceina (FITC): Se marcó gOBG3 purificado a una concentración
de 1 mg/ml con FITC usando el kit de conjugación FluoroTag FITC de
Sigma (Stock No. FITC-1). Para marcar el gOBG3 se
siguió el protocolo indicado en el Sigma Handbook para conjugación a
pequeña escala.
Cultivo celular: Se sembraron células C2C12 del
músculo esquelético de ratón (ATCC, Manassas,
VACRL-1772) y hepatocitos de ratón
Hepa-1-6 (ATCC, Manassas, VA
CRL-1830) en placas de 6 pocillos a una densidad
celular de 2x10^{5} células por pocillo. Las células C2C12 y
Hepa-1-6 se cultivaron según
instrucciones del depositario durante 24-48 horas
antes del análisis. Se llevó a cabo el ensayo cuando las células
tuvieron una confluencia del 80%.
Unión celular y absorción del gOBG3 marcado con
FITC usando microscopía: las células C2C12 y Hepa
1-6 se incubaron en presencia/ausencia de
anticuerpo dirigido frente a LSR humano (81B: secuencia
N-terminal de LSR humano; no reacciona de forma
cruzada con LSR de ratón y 93A: la secuencia
C-terminal, sí reacciona de forma cruzada con LSR
de ratón) o un antisuero dirigido frente a gClqr (953) durante 1
hora a 37ºC, 5% de CO2. Se añadieron anticuerpos LSR al medio a una
concentración de 2 \mug/ml. Se añadió el antisuero
anti-gClqr al medio a un volumen de 2.5 \mul de
suero sin diluir (alta concentración) o dilución 1:100 (baja
concentración). Después de incubación con el anticuerpo
especificado, se añadió FITC-gOBG3 (50 nM/ml) a cada
pocillo de cultivo celular. Se incubaron de nuevo las células
durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO2. Se lavaron las células 2x con PBS,
se rascaron las células del pocillo a 1 ml de PBS. Se transfirió la
suspensión de células a un tubo eppendorf y se centrifugó a 1000
rpm durante 2 minutos. Se separó el sobrenadante y se resuspendieron
las células en 200 \mul de PBS. Se analizó la unión y absorción
de FITC-gOBG3 por microscopía de fluorescencia con
un aumento de 40X.
El análisis de las células C2C12 y Hepa
1-6 revela idénticos fenotipos con respecto a los
perfiles de unión y absorción de FITC-gOBG3 tanto
en presencia como en ausencia de anticuerpos LSR. Parece que el
FITC-gOBG3 se localiza dentro de las vesículas del
citoplasma tanto de los hepatocitos de ratón como de los mioblastos
de ratón, dando a entender que la unión y absorción de
FITC-gOBG3 está teniendo lugar. La absorción de
FITC-gOBG3 parece que se bloquea cuando las células
fueron pretratadas con el anticuerpo anti-LSR que
reconoce el LSR de ratón. Sin embargo, la unión de
FITC-gOBG3 a la superficie celular tiene lugar en
una pequeña porción de las células (C2C12 y Hepa
1-6). A baja concentración del antisuero gClqr,
parece que FITC-gOBG3 está localizado dentro de las
vesículas del citoplasma de ambos tipos de células, similarmente al
fenotipo de las células que no han recibido
pre-tratamiento con anticuerpo antes de la adición
de FITC-gOBG3. El fenotipo de absorción y unión de
FITC-gOBG3 no es afectado por el
pre-tratamiento con un anticuerpo LSR que no
reconoce el LSR de ratón. Juntos, estos datos sugieren que la
absorción de FITC-gOBG3 puede ser bloqueada por un
anticuerpo LSR humano que reacciona de forma cruzada con el LSR de
ratón. Sin embargo, este fenotipo no se reproduce con otros
anticuerpos LSR que no tienen reactividad cruzada. Por tanto, este
ensayo puede ser útil para identificar agentes que facilitan o
previenen la absorción y/o unión de OBG3 o fragmentos de polipéptido
gOBG3 a las células.
Se puede ensayar también el efecto de gOBG3
sobre la actividad del LSR de unión, internalización y degradación
de las lipoproteínas. La medida de LSR como receptor de
lipoproteínas está descrita en Bihain & Yen, ((1992)
Biochemistry May 19; 31 (19): 4628-36). El efecto de
gOBG3 sobre la actividad del LSR (u otros receptores) de unión,
internalización y degradación de lipoproteínas se puede comparar con
la de OBG3 intacto, con células sin tratar como un control
adicional. Este ensayo se puede usar también para cribar las
variantes activas e inhibidoras de gOBG3, así como los agonistas y
antagonistas de la actividad relacionada con la obesidad.
Las células hepáticas humanas PLC (Depósito
ATCC) se pusieron en placas a una densidad de 300.000
células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM (rico en
glucosa) que contiene glutamina y
penicilina-estreptomicina (Bihain & Yen, 1992).
Se cambió el medio el día 2. El día 3, se lavaron las monocapas
confluentes una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS,
pH 7,4) (2 ml/pocillo). Se incubaron las células a 37ºC durante 30
min con 10 ng/ml de leptina recombinante humana en DMEM que contiene
BSA al 0,2% (p/v), Hepes 5 mM, CaCl_{2}2 mM, 3,7 g/l de
bicarbonato de sodio, pH 7,5, seguido por otros 30 min de incubación
a 37ºC con concentraciones crecientes de gOBG3. Se continuaron las
incubaciones durante 2 h a 37ºC después de adición de oleato 0,8 mM
y 20 \mug/ml de ^{125}I-LDL. Se lavaron las
monocapas 2 veces consecutivamente con PBS que contiene BSA al
0,2%, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y después 2 veces
consecutivamente con PBS. Las cantidades de unión, absorción y
degradación de ^{125}I-LDL inducidas por el
oleato, se midieron como se ha descrito previamente (Bihain &
Yen, 1992, cita anterior). Los resultados se presentan como la media
de determinaciones triplicadas.
Como se muestra en la Figura 6, la adición de
gOBG3 lleva a un aumento de la actividad de LSR como un receptor de
lipoproteínas. La unión y absorción de LDL inducidas por el oleato
parecen más afectadas por el gOBG3 en comparación con la
degradación. Este aumento de la actividad de LSR podría producir
potencialmente un mejor aclaramiento de las lipoproteínas ricas en
triglicéridos durante el estado postprandial. De este modo, debería
ser eliminada más grasa de la dieta a través del hígado, en lugar de
ser depositada en el tejido adiposo.
Este ensayo podría ser usado para determinar la
eficacia de un compuesto (o los agonistas o antagonistas) para
aumentar o reducir la actividad de LSR (o la absorción, unión y
degradación de lipoproteínas a través de otros receptores), y por
tanto afecta a la tasa de aclaramiento de las lipoproteínas ricas en
triglicéridos.
Se siembran células C2C12 (línea celular del
músculo esquelético murino; ATCC CRL 1772, Rockville, MD) con baja
densidad (aproximadamente 15-20%) en DMEM completo
(con glutamina, penicilina/estreptomicina, etc) + FCS al 10%. Dos
días más tarde tenían una confluencia de 80-90%. En
este momento, se cambia el medio a DMEM+suero de caballo al 2% para
permitir la diferenciación. Se cambia el medio diariamente. Después
de 3-4 días de estar en el suero de caballo al 2%,
aparece abundante formación de miotubos aunque el tiempo exacto de
diferenciación de las células C2C12 depende de cuánto tiempo han
sido sometidas a pases y cómo han sido mantenidas, entre otras
cosas.
Para ensayar el efecto de la presencia de
gACRP30 sobre la diferenciación muscular, se añadió gACRP30 (1 a
2,5 \mug/ml) el día después de la siembra cuando las células
estaban todavía en DMEM con FCS al 10%. Dos días después de poner
en placas las células (un día después de que fue añadido gACRP30 por
primera vez), a aproximadamente 80-90% de
confluencia, se cambió el medio a DMEM+ suero de caballo al 2% más
gACRP30.
Los resultados muestran que la adición de
gACRP30 hace que las células empiecen a organizarse dentro de un
día después de su adición. Por contraste con la orientación
aleatoria de las células no tratadas con gACRP30, las tratadas con
gACRP30 se alinearon ellas mismas en relación una con otra. En
adición, la diferenciación tuvo lugar sólo 2 días después de
tratamiento con gACRP30, en contraste con los 3 a 4 días necesarios
en su ausencia.
Se diferenciaron las células C2C12 en presencia
o ausencia de 2 \mug/ml de gACRP30 durante 4 días. El día 4, se
determinaron las tasas de oxidación del oleato midiendo la
conversión de 1-^{14}C-oleato (0,2
mM) aCO_{2} durante 90 min. Las células C2C12 diferenciadas en la
presencia de gACRP30 sufren el 40% más de oxidación del oleato que
los controles diferenciados en ausencia de gACRP30. Se puede usar
este experimento para cribar los fragmentos y péptidos activos así
como los agonistas y antagonistas o activadores e inhibidores de los
polipéptidos OBG3 y gOBG3.
El efecto de gACRP30 sobre la tasa de oxidación
del oleato se comparó en células C2C12 diferenciadas (células del
músculo esquelético murino; ATCC, Manassas, VA
CRL-1772) y en una línea celular de hepatocitos
(Hepa1-6; ATCC, Manassas, VA
CRL-1830). Se mantuvieron las células cultivadas
según las instrucciones del fabricante. El ensayo de oxidación del
oleato se realizó como se ha descrito previamente (Muoio et
al (1999) Biochem J 338; 783-791). En resumen,
se mantuvieron los miocitos casi confluentes en medio de
diferenciación bajo en suero (DMEM, suero de caballo al 2,5%)
durante 4 días, a cuyo tiempo la formación de miotubos llegó a ser
máxima. Se mantuvieron los hepatocitos en el mismo medio DMEM
suplementado con FCS al 10% durante 2 días. Una hora antes del
experimento se separó el medio y se añadió 1 ml de medio de
preincubación (MEM, suero de caballo al 2,5%, glucosa 3 mM,
glutamina 4 mM, Hepes 25 mM, BSA al 1% libre de FFA, oleato 0,25 mM,
gentamicina a 5 \mug/ml). Al comienzo del experimento de
oxidación se añadióácido oleico marcado con ^{14}C (1 \muCi/ml,
American Radiolabeled Chemical Inc., St. Louis, MO) y se incubaron
las células durante 90 min a 37ºC en ausencia/presencia de 2,5
\mug/ml de gACRP30. Después del periodo de incubación se separaron
0,75 ml del medio y se ensayaron en cuanto aproductos de oxidación
marcados con ^{14}C como se describe más adelante para el
experimento de oxidación de los FFA en el músculo.
La oxidación del oleato en las células C2C12
determinada a lo largo de 90 min aumentó de forma significativa
(39%; p = 0,036, test t de dos colas) en las células tratadas con
gACRP30. Por contraste, no se observó ningún aumento detectable en
la tasa de oxidación de los FFA en los hepatocitos incubados con
gACRP30.
Después de la transferencia del medio para el
ensayo de oxidación del oleato, se pusieron las células sobre
hielo. Para determinar el contenido de triglicéridos y proteínas, se
lavaron las células con 1 ml de 1x PBS para eliminar el medio
residual. Se añadieron a cada pocillo 300 \mul de solución de
disociación de las células (Sigma) y se incubaron a 37ºC durante 10
min. Se taparon las placas para soltar las células, y se añadieron
0,5 ml de 1x PBS. Se transfirió la suspensión celular a un tubo
eppendorf, se lavó cada pocillo con 0,5 ml adicionales de 1x PBS, y
se transfirió a un tubo eppendorf apropiado. Se centrifugaron las
muestras a 1000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se
eliminó el sobrenadante y se añadieron al sedimento de células 750
\mul de 1x PBS/chaps al 2%. Se agitó la suspensión celular en
vórtex y se puso sobre hielo durante 1 hora. Se centrifugaron
entonces las muestras a 13000 rpm durante 20 min a 4ºC. Se
transfirieron los sobrenadantes a un nuevo tubo y se congelaron a
20ºC hasta su análisis. Se determinó cuantitativamente el nivel de
triglicéridos en cada muestra usando el kit enzimático
GPO-TRINDER de Sigma Diagnostics. Se siguió el
procedimiento indicado en el manual con las siguientes excepciones:
se realizó el ensayo en una placa de 48 pocillos, se ensayaron 350
\mul de volumen de muestra, el blanco control consistió en 350
\mul de PBS/chaps al 2%, y el estándar contenía 10 \mul de
estándar proporcionado en el kit más 690 \mul de PBS/chaps al 2%.
El análisis de las muestras se realizó en un Packard Spectra Count a
una longitud de onda de 550 nm. El análisis de proteínas se realizó
sobre 25 \mul de cada muestra de sobrenadante usando el ensayo de
proteínas BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El análisis de las muestras se realizó en un Packard Spectra Count a
una longitud de onda de 550 nm.
La producción de triglicéridos tanto en las
células C2C12 como en las células Hepa 1-6 no cambió
de forma significativa en la ausencia/presencia de ACRP30 y
gACRP30. El contenido de proteína de todas las células analizadas
fue equivalente en ausencia/presencia de ACRP30 y gACRP30.
Se realizan los experimentos usando ratones
C57B1/6 de aproximadamente 6 semanas de edad (8 por grupo). Todos
los ratones se ponen en jaulas individuales. Se mantienen los
ratones con una dieta rica en grasas a lo largo de cada
experimento. La dieta rica en grasas (dieta de cafeteria; D12331 de
Research Diets, Inc) tiene la siguiente composición: kcal de
proteínas 16%, kcal de sacarosa 26%, y kcal de grasas 58%. La grasa
estaba principalmente compuesta de aceite de cacahuete,
hidrogenado.
Una vez que se hubo alimentado a los ratones con
una dieta rica en grasas durante 6 días, se insertan bombas
micro-osmóticas usando anestesia de isoflurano, y se
usan para administrar a los ratones subcutáneamente (s.c.) durante
18 días gOBG3, OBG3, solución salina, y un péptido irrelevante. El
gOBG3 se proporciona a dosis de 50, 25, y 2,5 \mug/día; el OBG3
se proporciona a 100, 50, y 5 \mug/día, y el péptido irrelevante
se proporciona a 10 \mug/día. El peso corporal se determina el
primero, tercero y quinto día de la dieta rica en grasas, y después
diariamente a partir del comienzo del tratamiento. Se toman muestras
finales de sangre por punción cardiaca y se usan para determinar
los niveles de triglicéridos (TG), de colesterol total (TC), de
glucosa, de leptina, y de insulina. Se determina también la cantidad
de alimento consumida por día para cada grupo.
En un experimento preliminar, los ratones
tratados con 2,5 \mug/día de gOBG3 habían reducido de forma
significativa el peso corporal.
Los análisis de la eficacia de gOBG3 en humanos
se realizan de acuerdo con las recomendaciones de un médico y con
las normas establecidas. Los parámetros analizados en ratones se
analizan también en los seres humanos (por ejemplo, ingesta de
alimento, peso, TG, TC, glucosa, insulina, leptina, FFA). Es de
esperar que los factores fisiológicos presenten cambios a corto
plazo. Los cambios en la ganancia de peso podrían requerir un
periodo de tiempo más largo. En adición, la dieta necesitará ser
vigilada cuidadosamente. El OBG3 globular se debe administrar a
dosis diarias de aproximadamente 6 mg de proteína por persona de 70
kg o aproximadamente 10 mg por día. También se pueden ensayar otras
dosis, por ejemplo 1 mg o 5 mg al día hasta 20 mg, 50 mg, o 100 mg
al día.
Previamente, se había publicado que la leptina
invierte la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus en
ratones con lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature
401: 73-76 (1999). Se encontró que la leptina era
menos eficaz en un modelo de diabetes lipoatrófica de ratón
lipodistrófico diferente (Gavrilova et al Nature 403: 850
(2000). Se pueden usar fragmentos de polipéptido OBG3 o gOBG3 para
reducir la resistencia a la insulina y la hiperglucemia en este
modelo bien solos o en combinación con leptina, el péptido de
leptina (solicitud provisional de Estados Unidos No 60/155.506), u
otros compuestos. Los ensayos incluyen el descrito previamente en
Gavrilova et al. ((2000) Diabetes Nov; 49(11):
1910-6; (2000) Nature Feb 24; 403 (6772): 850)
usando ratones A-ZIP/F-1, excepto
que el gOBG3 debe ser administrado usando los métodos previamente
descritos en el Ejemplo 5 (o en los Ejemplos 8-10).
Los niveles de glucosa e insulina de los ratones deben ser
analizados, y la ingesta de alimento y el peso del hígado deben ser
monitorizados, así como otros factores, tales como los niveles de
leptina, FFA, y TG, típicamente medidos en los experimentos de esta
invención (véase el Ejemplo 5 anterior, o los Ejemplos
8-10).
Se analizó el efecto de la cabeza globular de
acrp-30 sobre la lipemia postprandial (PPL) en
ratones C57BL6/J normales. ACRP-30 es otro nombre
para adipo Q y es la proteína de ratón homóloga de la proteína
humana apm-1. OBG3 es un modo genérico para
referirse a todas estas formas. La forma de cabeza globular se
indica colocando una "g" delante, por ejemplo
g-acrp30 o gOBG3. El gOBG3 usado se preparó mediante
digestión proteolítica de OBG3 recombinante como se ha descrito
previamente en el Ejemplo 2. Se usó tripsina acetilada como
proteasa.
Los ratones usados en este experimento se
mantuvieron en ayunas durante 2 horas antes del experimento tras lo
cual se tomó una muestra de sangre como línea base. Todas las
muestras de sangre fueron tomadas de la cola usando tubos capilares
recubiertos con EDTA (50 \mul en cada punto de tiempo). En el
tiempo 0 (8:30 AM), se dio a todos los animales por sonda
nasogástrica (vol = 1% de peso corporal) una comida estándar rica en
grasas (6 g de mantequilla, 6 g de aceite de girasol, 10 g de leche
desecada desnatada, 10 g de sacarosa, 12 ml de agua destilada
preparada recientemente siguiendo Nb#6, JF, pg.1).
Inmediatamente después de la comida rica en
grasas, se inyectaron i.p. 25 \mug de gOBG3 en 100 \mul de
solución salina. Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 \mug/ml en
100 \mul) a los 45 min y a 1 h 45 min (grupo tratado, n=8). Los
animales testigos (n=8) fueron inyectados con solución salina (3x100
\mul). Los animales tratados y no tratados fueron manipulados de
modo alternativo.
Se tomaron muestras de sangre a intervalos de
una hora, y se pusieron inmediatamente sobre hielo. Se preparó el
plasma por centrifugación después de cada punto de tiempo. Se
mantuvo el plasma a -20ºC y se determinaron los ácidos grasos
libres (FFA), los triglicéridos (TG) y la glucosa dentro de las 24
horas usando kits de ensayo estándares (Sigma and Wako). Debido a
la cantidad limitada de plasma disponible, se determinó la glucosa
por duplicado usando las muestras reunidas. Para cada punto de
tiempo, se reunieron volúmenes iguales de plasma de los 8 animales
por grupo de tratamiento. Las barras de error mostradas para la
glucosa representan por tanto la SD de la determinación por
duplicado y no la variación entre animales como para TG y FFA.
El aumento de los FFA del plasma, debido a la
comida rica en grasas fue significativamente más bajo en los ratones
tratados con gOBG3 a todos los puntos de tiempo entre 1 y 4 h. Esto
puede ser interpretado como un aumento de la oxidación de los FFA
(Fig. 8).
\newpage
El tratamiento con gOBG3 también llevó a un
aumento significativamente más pequeño de los TG del plasma, en
comparación con los ratones no tratados. Sin embargo, este efecto
fue menos pronunciado que el efecto sobre los FFA (Fig. 9).
El metabolismo de la glucosa se mejoró
significativamente después del tratamiento con gOBG3; este efecto
puede ser interpretado como un aumento de la sensibilidad de la
insulina posiblemente debido a la reducción de los FFA (Fig.
10).
Similares resultados se vieron previamente en un
experimento anterior que incluye solo 2 tratamientos (a 0 y a 45
minutos; no se muestran los datos). Se observó un fuerte efecto de
reducción de los FFA por el gOBG3 acoplado con un menor efecto de
reducción de los TG.
Se analizó el efecto de la cabeza globular de
acrp-30 sobre los niveles plasmáticos de leptina e
insulina durante la lipemia postprandial (PPL) en ratones normales
C57BL6/J. El procedimiento experimental fue el mismo que se ha
descrito en el Ejemplo 8, excepto que la sangre fue tomada sólo a
las 0,2 y 4 horas para poder tener muestras de sangre más grandes
que son necesarias para la determinación de leptina e insulina por
RIA.
En resumen, 16 ratones fueron mantenidos en
ayunas durante 2 horas antes del experimento tras lo cual se tomó
una muestra de sangre como línea base. Todas las muestras de sangre
fueron tomadas de la cola usando tubos capilares recubiertos con
EDTA (100 \mul en cada punto de tiempo). En el tiempo 0 (9:00 AM),
se administró a todos los animales por sonda nasogástrica (vol = 1%
de peso corporal) una comida estándar rica en grasas (véase el
Ejemplo 8). Inmediatamente después de la comida rica en grasas, se
inyectaron i.p. 25 \mug de gOBG3 en 100 \mul de solución
salina. Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 \mug/ml en 100
\mul) a los 45 min y a 1 h 45 min (grupo tratado, n=8). Los
animales testigos (n=8) fueron inyectados con solución salina
(3x100 \mul). Los animales tratados y no tratados fueron
manipulados de modo alternativo.
Las muestras de sangre se pusieron
inmediatamente sobre hielo y se preparó el plasma por centrifugación
después de cada punto de tiempo. Se mantuvo el plasma a -20ºC y se
determinaron los ácidos grasos libres (FFA) antes de 24 horas
usando un kit estándar de ensayo (Wako). Se determinaron la leptina
e insulina por RIA (ML-82K y
SRI-13K, LINCO Research, Inc., St. Charles, MO)
siguiendo el protocolo del fabricante. Sin embargo, se usaron
solamente 20 \mul de plasma. Se hizo cada determinación por
duplicado. Debido a la limitada cantidad de plasma disponible, se
determinaron la leptina y la insulina en 4 conjuntos de 2 animales
cada uno, en ambos grupos de tratamiento.
Como se ha mostrado previamente (Ejemplo 8), el
tratamiento con gOBG3 redujo de forma significativa el aumento
postprandial de los FFA del plasma, causado por la comida rica en
grasas a las 2 horas (Fig. 11). No hubo ningún cambio significativo
en los niveles de leptina del plasma, a ningún punto de tiempo; el
tratamiento con gOBG3 no afectó a los niveles de leptina (Fig. 12).
Los niveles de insulina (Fig. 13) indican un aumento marginal de la
insulina a las 2 horas. Sin embargo, cuando se analizó como
porcentaje de cambio desde t_{o}, este aumento (212% vs. 260%,
testigo vs. tratado) no fue estadísticamente significativo (p =
0,09).
Estos datos reconfirman la aceleración
previamente mostrada del metabolismo de los FFA por tratamiento con
gOBG3. También demuestran que el gOBG3 no afecta a los niveles de
leptina e insulina del plasma, y que el gOBG3 reduce la
hiperglucemia durante la lipemia postprandial y también induce la
pérdida de peso durante el tratamiento a lo largo de varios días.
Sin estar limitado por ninguna teoría particular, los datos
sugieren: a) que la reducción de peso es causada por un aumento del
metabolismo independiente de la leptina; y b) que el gOBG3 lleva a
un aumento de la sensibilidad a la insulina.
Se ha descrito el efecto de la cabeza globular
de acrp30 sobre los niveles plasmáticos de FFA, TG, glucosa,
leptina e insulina durante la lipemia postprandial (PPL) en ratones
C57BL6/J normales. También se ha demostrado la pérdida de peso que
resulta a partir del gOBG3 (2,5 \mug/día) administrado a ratones
C57BL6/J normales con una dieta rica en grasas (Ejemplo 5). En
comparación, se necesitó una dosis mucho más alta de la forma
completa de acrp30 (200 \mug/día) para inducir un efecto
relativamente más pequeño en los ratones. Este ejemplo demuestra el
efecto de la forma completa de acrp30 sobre los niveles plasmáticos
de FFA, TG y glucosa.
El procedimiento experimental fue similar al
descrito en el Ejemplo 8. En resumen, 14 ratones fueron mantenidos
en ayunas durante 2 horas antes del experimento tras lo cual se tomó
una muestra de sangre como línea base. Todas las muestras de sangre
fueron tomadas de la cola usando tubos capilares recubiertos con
EDTA (50 \mul en cada punto de tiempo). Al tiempo 0 (9:00 AM), se
administró a todos los animales por sonda nasogástrica (vol = 1% de
peso corporal) una comida estándar rica en grasas (véase el Ejemplo
8). Inmediatamente después de la comida rica en grasas, se
inyectaron i.p. 4 ratones con 25 \mug de OBG3 en 100 \mul de
solución salina. Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 \mug
en100 \mul) a los 45 min y a 1 h 45 min. Un segundo grupo de
tratamiento (n=4) recibió 3 veces 50 \mug de OBG3 a los mismos
intervalos. Los animales testigos (n=6) fueron inyectados con
solución salina (3x100 \mul). Los animales tratados y no tratados
fueron manipulados de modo alternativo.
Las muestras de sangre se pusieron
inmediatamente sobre hielo. Se preparó el plasma por centrifugación
después de cada punto de tiempo. Se mantuvo el plasma a --20ºC y se
determinaron los ácidos grasos libres (FFA), los triglicéridos (TG)
y la glucosa dentro de las 24 horas usando kits de ensayo estándares
(Sigma and Wako).
El tratamiento con OBG3 de longitud completa no
tuvo ningún efecto sobre los niveles de FFA del plasma (Fig. 14)
excepto durante t = 2 horas cuando se demostró una reducción
estadísticamente significativa (p<0,05). No se observó ningún
cambio significativo en los niveles postprandiales de TG (Fig. 15) y
de glucosa (Fig. 16) en los animales tratados.
Los datos presentados demuestran que la forma
completa de OBG3 no redujo los niveles de FFA, TG y glucosa en
contraste con lo que se observó para la región globular (Ejemplos 5,
8, 9). Solamente a las 2 horas después de la administración por
sonda nasogástrica, el tratamiento con OBG3 redujo las
concentraciones plasmáticas de FFA de forma significativa
(p<0,05). Estos resultados demuestran que gOBG3 es mucho más
activo in vivo que la proteína de longitud completa. Se
observó un efecto similar para la reducción del peso corporal; la
cabeza globular fue mucho más activa que la proteína de longitud
completa.
En los ratones, los ácidos grasos libres del
plasma, aumentaron después de la administración intragástrica de
una comida de ensayo rica en grasas/sacarosa. Estos ácidos grasos
libres son producidos en su mayor parte por la actividad de las
enzimas lipolíticas, esto es, lipoproteína-lipasa
(LPL) y lipasa hepática (HL). En estas especies, estas enzimas se
encuentran en cantidades significativas tanto unidas al endotelio
como circulando libremente en el plasma^{16}. Otra fuente de
ácidos grasos libres del plasma, es la hormona sensitiva lipasa
(HSL) que libera ácidos grasos libres a partir del tejido adiposo
después de estimulación \beta-adrenérgica. Para
analizar si gACRP30 regula también el metabolismo de los ácidos
grasos libres liberados por HSL, se inyectaron los ratones con
epinefrina.
Dos grupos de ratones (n=5 cada uno) recibieron
epinefrina (5 \mug) por inyección intraperitoneal. Un grupo
tratado fue inyectado con gACRP30 (25 \mug) una hora antes y de
nuevo junto con epinefrina, mientras que los animales testigos
recibieron solución salina. Se aisló el plasma y se midieron los
ácidos grasos libres y la glucosa como se ha descrito antes
(Ejemplo 10). Como se muestra en la Fig. 18, las inyecciones de
epinefrina (5 \mug) causaron un incremento en los ácidos grasos
libres y en la glucosa del plasma. Ambos efectos se redujeron de
forma significativa en los ratones tratados con gACRP30.
Esta reducción en el aumento de los niveles de
glucosa y FFA no fue debida al bloqueo del efecto
\beta-adrenérgico de la epinefrina, como se
demuestra induciendo la liberación de los FFA a partir del tejido
adiposo aislado in vitro. En estos estudios control, se
separó el tejido adiposo de los ratones C57BL/6J normales y se
incubó en tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit.
Se añadió epinefrina y se determinó la concentración de los FFA en
el medio después de una incubación de 90 min. La epinefrina (10
\muM) produjo un aumento de 1,7 veces en los ácidos grasos libres
en el medio. Las concentraciones crecientes de gACRP30 o ACRP30
hasta 50 \mug/ml no inhibieron este efecto de la epinefrina.
Los datos presentados hasta ahora indican que la
región globular de ACRP30 ejerce profundos efectos farmacológicos
sobre el metabolismo de sustratos de energía con el efecto más
evidente sobre los ácidos grasos libres del plasma. Además, las
reducción de la concentración de los FFA del plasma, no se puede
explicar ni por la inhibición de LPL-esto causaría
un aumento de los triglicéridos del plasma, mientras que realmente
se observa una reducción de los triglicéridos en el plasma -ni por
inhibición de HSL. Por lo tanto, la explicación más sencilla es que
el gACRP30 causa un aumento de la separación de los ácidos grasos
libres de la circulación mediante la promoción de la absorción
celular.
Para investigar el efecto de gACRP30 sobre la
oxidación de los ácidos grasos libres en el músculo, se aislaron
músculos intactos de las extremidades traseras de ratones C57BL/6J y
se midió la oxidación de los FFA usando oleato como sustrato (Clee
et al (2000) J Lipid Res 41:521-531; Muoio
et al (1999) Am J Physiol 276: E913-921). La
oxidación del oleato en el músculo aislado se midió como se ha
descrito previamente (Cuendet et al (1976) J Clin Invest
58:1078-1088; LeMarchand-Brustel
(1978) Am J Physiol 234:E348-E358). En resumen, se
sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se aislaron
rápidamente los músculos sóleo y EDL de las extremidades traseras.
El tendón distal de cada músculo se ató a una pieza de sutura para
facilitar la transferencia entre diferentes medios. Todas las
incubaciones se llevaron a cabo a 30ºC en 1,5 ml de tampón de
bicarbonato de Krebs-Henseleit (NaCl 118,6 mM, KCl
4,76 mM, KH_{2}PO_{4} 1,19 mM, MgSO_{4} 1,19 mM, CaCl_{2}
2,54 mM, NaHCO_{3} 25 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) suplementado con
seroalbúmina bovina al 4% libre de FFA (fracción V, grado RIA,
Sigma) y glucosa 5 mM (Sigma). La concentración total de oleato
(Sigma) a lo largo del experimento fue 0,25 mM. Todos los medios
fueron oxigenados (O_{2} al 95%; CO_{2} al 5%) antes de la
incubación. La mezcla de gas fue hidratada a lo largo del
experimento haciendo burbujear a su través un lavador de gas (Kontes
Inc., Vineland, NJ).
Se lavaron los músculos durante 30 min en medio
de incubación con oxigenación. Se transfirieron entonces los
músculos a medio fresco (1,5 ml) y se incubaron a 30ºC en la
presencia de 1 \muCi/ml de [1-^{14}C]ácido
oleico (American Radiolabeled Chemicals). Los viales de incubación
que contienen este medio se sellaron con un séptum de goma del cual
se suspendió un pocillo central que lleva una pieza de papel Whatman
(1,5 cm x 11,5 cm).
Después de un periodo inicial de incubación de
10 min con oxigenación constante, se separó la circulación de gas
para cerrar el sistema al entorno exterior y se incubaron los
músculos durante 90 min a 30ºC. Al final de este periodo, se
inyectaron 0,45 ml de Solvable (Packard Instruments, Meriden, CT)
sobre el papel Whatman en el pocillo central y se paró la oxidación
del oleato por el músculo transfiriendo el vial al hielo.
Después de 5 min, se separó el músculo del
medio, y se separó también una alícuota de 0,5 ml del medio. Se
cerraron los viales de nuevo y se inyectó 1 ml de ácido perclórico
al 35% con una jeringa hasta el medio penetrando a través del
séptum de goma. Se recogió el CO_{2} liberado del medio
acidificado mediante Solvable en el pocillo central. Después de un
periodo de recogida de 90 min a 30ºC, se separó el papel Whatman del
pocillo central y se puso en viales de centelleo que contienen 15
ml de fluido de centelleo (HionicFlour, Packard Instruments,
Meriden, CT). La cantidad de radioactividad ^{14}C se cuantificó
por contaje de centelleo líquido. La tasa de oxidación del oleato se
expresó como nmol de oleato producido en 90 min/g de músculo.
Para analizar el efecto de gACRP30 o ACRP30
sobre la oxidación del oleato, se añadieron estas proteínas al medio
a una concentración final de 2,5 \mug/ml y se mantuvieron en el
medio a lo largo del procedimiento.
Se analizaron dos músculos de diferente
capacidad oxidativa (sóleo y extensor digitorum longus (EDL)) (Fig.
19). Se aislaron los músculos EDL y sóleo de ambas patas de ratones
C57BL/6J normales (n=18). Se incubó un músculo de cada par en medio
con 2,5 \mug/ml de gACRP30 (gris oscuro) y el otro en medio sin
gACRP30 (testigo-gris claro). Este diseño
experimental permitió comparar la oxidación del oleato en pares de
músculos aislados del mismo animal. Se determinó laoxidación de
C-oleato a lo largo de 90 minutos. La incubación de
los músculos EDL y sóleo durante 90 minutos en medio que contiene
2,5 \mug/ml de gACRP30 lleva a un aumento estadísticamente
significativo en la oxidación del oleato (p<0,05,
t-Test apareado, una cola) o (p=0,0041, análisis de
varianza de medidas repetidas, tests univariados de hipótesis para
efectos dentro del sujeto) en ambos tipos de músculos.
Ambos tipos de músculos mostraron una respuesta
significativa a gACRP30. El aumento relativo en la oxidación de los
FFA fue del 17% (p=0,03) y del 10% (p=0,04) para EDL y sóleo,
respectivamente. En los seres humanos, los músculos representan
aproximadamente el 25% del peso corporal. Por tanto, incluso un
aumento moderado en la oxidación de los ácidos grasos libres puede
tener consecuencias cuantitativamente importantes sobre la
utilización global de energía.
Para determinar si el aumento de la oxidación de
los FFA inducido por gACRP30 va acompañado también por un aumento
de la liberación de los FFA en el músculo o en el hígado, se midió
el contenido de triglicéridos en el músculo de la pata trasera y en
el hígado después de tratamiento de los ratones con gACRP30. Se
separaron muestras de los músculos de la pata trasera así como del
hígado de los animales tratados y no tratados y se determinó la
concentración de triglicéridos y ácidos grasos libres siguiendo un
método estándar de extracción de lípidos (Shimabukuro et al
(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:4637-4641) seguido
por análisis de TG y FFA usando kits estándar de ensayo.
El tratamiento a corto plazo de los animales con
gACRP30 (2 inyecciones de 25 \mug cada una administradas dentro
de las 3 horas antes del sacrificio) no cambió el contenido de
triglicéridos ni del músculo de la pata trasera ni del tejido del
hígado (no se muestran datos). Sin embargo, después de 3 días de
tratamiento, durante cuyo periodo los ratones C57BL/6J normales
consumieron una dieta normal de roedores, los ratones que habían
recibido 25 \mug de gACRP30 dos veces al día mostraron un
contenido significativamente más alto (p=0,002) de triglicéridos en
el músculo (Fig. 20A) que los que recibieron solución salina
(testigo: gris claro; gACRP30: gris oscuro). Esto estuvo en
contraste con una falta de aumento de los triglicéridos en el hígado
(Fig. 20B). Además, no se observó un aumento detectable en los TG
del músculo después del día 16 de tratamiento demostrado
independientemente por medida directa del contenido de TG en el
músculo tiñendo con rojo oleoso O las secciones del microscopio
congeladas. En resumen, los datos indican que el aumento del
contenido de TG fue transitorio.
\newpage
Estos datos son consistentes con la idea de que
el gACRP30 aumenta la tasa de separación de los ácidos grasos
libres del plasma al menos parcialmente al aumentar su liberación al
músculo; muchos de los FFA son oxidados inmediatamente mientras que
algunos se almacenan como triglicéridos y son oxidados
posteriormente. Se obtuvo un soporte adicional para esta
interpretación midiendo la concentración de cuerpos cetónicos en el
plasma de animales tratados y no tratados después de una comida rica
en grasas/sacarosa.
Los cuerpos cetónicos (KB) se producen en el
hígado como resultado de la oxidación de los ácidos grasos libres,
pero la formación de KB no ocurre de forma significativa en el
músculo. En los ratones que reciben la comida de ensayo rica en
grasas y la inyección de solución salina, el nivel de KB del plasma,
aumentó de forma significativa a lo largo de las 3 horas siguientes
(183 \pm 12%, n=6). Los animales tratados con gACRP30, por otro
lado, no mostraron aumento de las concentraciones de KB del plasma.
Por lo tanto, el gACRP30 inhibe o bien directamente la formación de
KB o puede reducir la producción de KB inhibiendo la oxidación de
los FFA en el hígado.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos estudios independientes demostraron que el
gACRP30 también afecta a la homeostasis global de la energía. En el
primero, se administró a ratones C57BL/6J machos de 10 semanas de
edad una dieta purificada muy rica en grasas/sacarosa durante 19
días para promover la ganancia de peso (véase el Ejemplo 5); la
media de peso corporal en este momento fue de 30 g. Se implantó
entonces quirúrgicamente a los ratones una bomba osmótica (Alzet,
Newark, DE) que libera 2,5 \mug/día de gACRP30, o 5 \mug/día de
ACRP30, o solución salina fisiológica. Se mantuvieron los ratones
con la dieta rica en grasas y se registró su peso corporal a lo
largo del siguiente periodo de 10 días.
Los ratones tratados con solución salina o con 5
\mug/día de ACRP30 de longitud completa continuaron ganando peso
a un ritmo medio diario de 0,16% y 0, 22%, respectivamente. Por
contraste, los ratones tratados con gACRP30 experimentaron una
reducción de peso significativa (-3,7%, p = 0,002) durante los
primeros 4 días y después su peso permaneció constante (Fig. 21A).
Por lo tanto, en esta cepa endogámica de ratones normales, una
infusión continua de una dosis diaria baja de gACRP30 puede prevenir
la ganancia de peso causada por una alimentación rica en
grasas/sacarosa, de un modo sostenible.
Se confirmó este resultado y se extendió en un
segundo estudio realizado en ratones C57BL/6J machos obesos,
maduros, de 9 meses de edad, que habían recibido la misma dieta rica
en grasas/sacarosa durante 6 meses; el peso corporal medio cuando
empezó el estudio era 52,5 \pm 0,8 g. Se trataron tres grupos de 8
ratones con solución salina, ACRP30 o gACRP30 durante 16 días. Los
animales en el grupo tratado recibieron dos veces al día 25 \mug
de proteína subcutáneamente. Se registraron los pesos corporales en
los puntos de tiempo indicados.
El tratamiento con gACRP30 llevó a una pérdida
de peso significativa (p < 0,05) el día 3. Este efecto se hizo
aún más significativo cuando continuó el estudio. Durante el periodo
de estudio de 16 días, los ratones C57BL/6J obesos que recibieron
gACRP30 perdieron aproximadamente 8% (p=0,001) de su peso corporal
inicial a pesar del hecho de haber sido mantenidos con una dieta
rica en grasas/sacarosa (Fig. 21B). Los animales tratados con
solución salina sólo presentaron fluctuaciones marginales en su peso
corporal (p = n.s). Los animales tratados con ACRP30 de longitud
completa, pero a una dosis 10 veces más alta que la usada en el
primer experimento, también perdieron peso significativamente
(-3,2%, p=0,025). De modo interesante, los ratones tratados con
gACRP30 continuaron perdiendo peso a un ritmo constante durante el
periodo de 16 días del estudio, mientras que el ritmo de reducción
de peso en los tratados con el ACRP30 de longitud completa disminuyó
durante la última fase del estudio. El consumo de alimentos en los
animales tratados con gACRP30 no fue significativamente diferente
del de los animales tratados con solución salina o con ACRP30 (Fig.
21D).
El tratamiento con gACRP30 causó una reducción
significativa en la concentración de ácidos grasos libres en el
plasma (Fig. 21C). Este efecto fue significativo después de 3 días
de tratamiento (p<0,05 vs. solución salina) y continuó a lo
largo del periodo completo del estudio. Se muestra el nivel de los
FFA en el plasma el día 16 del estudio. La concentración inicial de
FFA en el plasma fue la misma en los tres grupos de tratamiento. Se
debe observar, sin embargo, que a pesar de esta reducción la
concentración de los ácidos grasos libres en el plasma de estos
animales masivamente obesos permanece aproximadamente
40-60% más alta que la de los ratones normales. Un
análisis químico de la sangre (incluyendo determinación de SGPT,
SGOT, urea, creatinina o bilirrubina) realizado sobre las muestras
terminales de sangre no reveló ningún parámetro anormal en el plasma
(Fig. 22).
Los datos se expresan como la media \pm SEM.
Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
El análisis estadístico se realizó típicamente usando o la prueba t
de Student no pareada o la prueba t de Student pareada, como se
indica en cada estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
La forma recombinante de la proteína ACRP30
usada tiene un peso molecular aparente de 37 kDa y forma un dímero
de 74 kDa (Fig 23A, pista II). Se generó un fragmento proteolítico
que contiene la región completa de la cabeza globular (gACRP30) y
que migra con un peso molecular aparente de 18 kDa usando tripsina
acetilada (Fig. 23A, pista I). Ambas preparaciones de proteína
(ACRP30 y gACRP30) estaban esencialmente libres de endotoxina; se
usaron columnas de afinidad ActiClean Etox (Sterogen Bioseparations
Inc., Carlsbad, CA) para separar contaminaciones potenciales de
endotoxina siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de
endotoxina se determinaron por Endosafe, Charleston, SC. Como se
determina por la secuenciación en N-terminal de
gACRP30 purificado, el sitio de escisión estaba justo antes del
aminoácido 104 (justo antes del aminoácido 101 para gOBG3 o APM1
humanos).
La inmunoprecipitación de Apm1 en el plasma
humano seguida por transferencia Western se utilizó para detectar
un producto de escisión de apm-1, el homólogo humano
de ACRP30, usando un anti-suero específico de la
cabeza globular para la etapa de inmunoprecipitación así como para
la etapa de detección. El suero preinmune o el suero preparado
frente al dominio de la cabeza globular o región
no-homóloga humana (HDQETTTQGPGVLLPLPKGA) se
reticularon con la proteína A (Sigma Chemical CO, Saint Louis, MO)
usando
dimetil-pimelimidato-dihidrocloruro
(Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO). Después de lavado (sal 0,2 M)
se eluyeron las proteínas a partir de la proteína A, se separaron
por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa pura Protran® (Schleicher and Schuell, Keene, NH)
usando procedimientos estándar. Los productos Apm-1
se visualizaron usando anticuerpos del dominio de la cabeza
globular marcados con biotina; kit de peroxidasa de rábano conjugada
con estreptavidina y sustrato de CN/DAB (Pierce, Rockford, IL) según
las instrucciones del fabricante.
El peso molecular aparente de esta forma
truncada fue 27 kDa, que corresponde a aproximadamente 70% de la
forma completa de apm-1 (Fig. 23B, pista IV). Esta
forma truncada no fue detectable cuando se realizó la
inmunoprecipitación usando un anticuerpo diferente dirigido frente
a la región no-homóloga humana
(HDQETTTQGPGVLL
PLPKGA) de apm-1; este dominio está localizado hacia el extremo del terminal NH_{2} de la proteína fuera del dominio globular (Fig. 23, pista V). Ambos anticuerpos anti-apm-1 dirigidos frente al dominio globular o el dominio no globular identificaron la forma de la proteína de longitud completa, así como una baja abundancia de dímero de MW aparente de 74 kDa.
PLPKGA) de apm-1; este dominio está localizado hacia el extremo del terminal NH_{2} de la proteína fuera del dominio globular (Fig. 23, pista V). Ambos anticuerpos anti-apm-1 dirigidos frente al dominio globular o el dominio no globular identificaron la forma de la proteína de longitud completa, así como una baja abundancia de dímero de MW aparente de 74 kDa.
Se inyectaron intravenosamente (vena caudal) dos
grupos de ratones (n=5 cada uno) con 30 \mul en embolada de
Intralípid al 20% (Clintec) para generar una subida rápida de los
FFA del plasma, evitando de este modo la absorción intestinal.
(Intralipid es una emulsión de grasa intravenosa usada en terapia
nutricional). Se inyectó un grupo tratado (\blacklozenge tratado
con gACRP30) con gACRP30 (25 \mug) a los 30 y 60 minutos antes de
la administración de Intralipid, mientras que los animales testigos
(\ding{115} testigo) recibieron solución salina. Se aisló el
plasma y se midieron los FFA como se ha descrito previamente.
Después se monitorizó el efecto de gACRP30 sobre
la caída de los FFA en el plasma después del pico inducido por la
inyección de Intralipid. Como se muestra en la Fig. 24, el gACRP30
acelera la separación de los FFA del plasma después de la inyección
de Intralipid. Por lo tanto, el gACRP30 acelera el aclaramiento de
los FFA sin interferir con la absorción intestinal. Aunque sin
desear que sea limitada por ninguna teoría, debido a que el
Intralipid no produce una respuesta significativa a la insulina, los
resultados indican también que la regulación por gACRP30 del
metabolismo de los FFA tiene lugar independientemente de la
insulina.
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<151>
2000-01-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/229,881
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent.pm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4517
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20966
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..4811
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' región reguladora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4812..4851
\vskip0.400000\baselineskip
<223> exón 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15144..15365
\vskip0.400000\baselineskip
<223> exón 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16277..20559
\vskip0.400000\baselineskip
<223> exón 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20560..20966
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' región reguladora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3787
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-27-261: base polimórfica G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11118
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14387-129: base polimórfica A o
C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15120
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-48: base polimórfica C o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15196
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-124: base polimórfica G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15427
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-355: base polimórfica G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15500
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-428: base polimórfica A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15863
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14405-105: base polimórfica A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17170
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-16-189: base polimórfica deleción
de A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3528..3545
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-27.pu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3928..3946
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-27.complemento
rp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10990..11008
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 99-14387.pu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11423..11442
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 99-14387.complemento
rp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15073..15092
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-12.pu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15503..15520
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-12.complemento
rp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15759..15776
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 99-14405.pu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16191..16211
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 99-14405.complemento
rp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16892..17001
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-16.pu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17384..17402
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9-16.complemento
rp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3775..3799
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-27-261.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11106..11130
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14387-129.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15108..15312
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-48.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15184..15208
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-124.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15415..15439
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-355.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15488..15512
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-428.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15851..15875
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14405-105.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17158..17182
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-16-189.sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3768..3786
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-27-261.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3788..3806
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-27-261.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11099..11117
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14387-129.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11119..11137
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14387-129.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15101..15119
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-48.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15121..15139
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-48.complemento mis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15177..15195
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-124.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15197..15215
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-124.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15408..15426
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-355.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15428..15446
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-355.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15481..15499
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-428.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15501..15519
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-12-428.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15844..15862
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14405-105.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15864..15882
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
99-14405-105.complemento mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17151..17169
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-16-189.mis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17171..17189
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
9-16-189.complemento mis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. El uso de un fragmento globular de OBG3, en
el que el fragmento globular de OBG3 se selecciona del grupo que
consiste en:
- (i)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6, o
- (ii)
- una variante de cualquiera de los fragmentos globulares de OBG3 que tienen una o más sustituciones permisivas de aminoácidos, en la que cada una de dichas sustituciones permisivas de aminoácidos es una sustitución conservadora de aminoácidos, en la que la variante tiene al menos una pero no más de 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos; o
- (iii)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6; ligados a polietilenglicol o en la forma de un péptido de fusión IgG Fc;
causando el fragmento globular de OBG3 de (ii) o
(iii) un cambio en al menos uno de los parámetros seleccionados
entre lipemia post-prandial, nivel de ácidos grasos
libres, nivel de triglicéridos, nivel de glucosa, oxidación de los
ácidos grasos libres, o peso, siendo comparable el cambio causado
por el fragmento globular de OBG3 de (ii) o (iii) a un cambio
causado por el fragmento globular de OBG3 de (i), para la
preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un
trastorno relacionado con la obesidad.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
el trastorno relacionado con la obesidad se selecciona entre
obesidad, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad
ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
no dependiente de la insulina, y diabetes tipo II.
3. El uso de un fragmento globular de OBG3, en
el que el fragmento globular de OBG3 se selecciona del grupo que
consiste en:
- (i)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6, o
- (ii)
- una variante de cualquiera de los fragmentos globulares de OBG3 que tienen una o más sustituciones permisivas de aminoácidos, en la que cada una de dichas sustituciones permisivas de aminoácidos es una sustitución conservadora de aminoácidos, en la que la variante tiene al menos una pero no más de 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos; o
- (iii)
- aminoácidos 104 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 111 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 135 a 247 de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 101 a 244 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 108 a 244 de la SEQ ID NO: 6, y aminoácidos 132 a 244 de la SEQ ID NO: 6; ligados a polietilenglicol o en la forma de un péptido de fusión IgG Fc;
causando el fragmento globular de OBG3 de (ii) o
(iii) un cambio en al menos uno de los parámetros seleccionados
entre lipemia post-prandial, nivel de ácidos grasos
libres, nivel de triglicéridos, nivel de glucosa, oxidación de los
ácidos grasos libres, o peso, siendo comparable el cambio causado
por el fragmento globular de OBG3 de (ii) o (iii) a un cambio
causado por el fragmento globular de OBG3 de (i), para la
preparación de un medicamento para la reducción de la masa corporal
o prevención de ganancia de peso.
4. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha sustitución conservadora de
aminoácidos es:
- (a)
- el reemplazamiento de un aminoácido con otro aminoácido, en el que el aminoácido a ser reemplazado se selecciona entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Phe, y es reemplazado con otro de dichos aminoácidos alifáticos;
- (b)
- el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr;
- (c)
- el cambio de los restos ácidos Asp y Glu;
- (d)
- la sustitución entre los restos amida Asn y Gln;
- (e)
- el cambio de los restos básicos Lys y Arg; o
- (f)
- el reemplazamiento de un resto aminoácido aromático con otro resto aminoácido aromático, en el que el aminoácido Phe se reemplaza con Tyr, o el aminoácido Tyr se reemplaza con Phe.
5. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento globular de OBG3
tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos
101 a 244 de la SEQ ID NO: 6.
6. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fragmento globular de OBG3
tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos
108 a 244 de la SEQ ID NO: 6.
7. El uso según una cualquiera de
reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento globular de OBG3 o
variante es un homotrímero.
8. El uso según una cualquiera de
reivindicaciones 1 a 7, en el que el fragmento globular de OBG3 o
variante tiene un enlace peptídico modificado, que es resistente a
la proteolisis.
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