ES2312594T3 - Polinucleotidos y polipeptidos gssp4 y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Uso de una secuencia de polipéptido que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 3 con actividad relacionada con el metabolismo para la fabricación de un medicamento para reducir los niveles de ácidos grasos libres en circulación en un individuo, y opcionalmente reducir la masa corporal.
Description
Polinucleótidos y polipéptidos GSSP4 y usos de
los mismos.
La presente invención se refiere al campo de la
investigación metabólica, en particular al descubrimiento de
compuestos eficaces para reducir los niveles de colesterol, la grasa
corporal y la masa corporal, y útiles para tratar enfermedades y
trastornos relacionados con el metabolismo. Las enfermedades o
trastornos metabólicos que se prevé que se traten por los métodos
de la invención incluyen, pero sin limitación, obesidad,
hiperlipidemia, hipercolesterolemia, aterosclerosis, diabetes,
intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina e
hipertensión.
El siguiente análisis pretende facilitar la
comprensión de la invención, pero no debe considerarse ni
reconocerse como la técnica anterior a la invención.
La obesidad es un problema de salud pública que
es grave, está muy extendido y continúa aumentando. En los Estados
Unidos, 20 por ciento de la población es obesa; en Europa, hay un
porcentaje ligeramente menor de personas obesas (Friedman (2000)
Nature 404:632-634). La obesidad está asociada con
un mayor riesgo de hipertensión, enfermedad cardiovascular,
diabetes y cáncer, así como con complicaciones respiratorias y
osteoartritis (Kopelman (2000) Nature 404:635-643).
Incluso pérdidas de peso moderadas mejoran estas afecciones
asociadas.
Aunque se admite que ciertos factores del estilo
de vida incluyendo el entorno, la dieta, la edad y el ejercicio
juegan un papel en la obesidad, ciertos estudios en gemelos,
análisis de agregación familiar y estudios de adopción indican que
la obesidad es, en gran parte, el resultado de factores genéticos
(Barsh et al (2000) Nature 404:644-651).
Está de acuerdo con estos estudios el hecho de que se estén
identificando un número creciente de genes relacionados con la
obesidad. Algunos de los genes estudiados más profundamente incluyen
los que codifican leptina (ob) y su receptor (db),
pro-opiomelanocortina (Pomc), receptor de
melanocortina-4 (Mc4r), proteína agouti
(A^{y}), carboxipeptidasa E (fat), receptor de
5-hidroxitriptamina 2C (Htr2c),
hélice-bucle-hélice 2 básica
naciente (Nhlh2), prohormona convertasa 1 (PCSK1) y proteína
tubby (tubby) (revisado en Barsh et al (2000) Nature
404:644-651).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que ciertos polipéptidos GSSP4 tienen efectos
inesperados in vitro e in vivo, incluyendo utilidad
para reducir el peso, prevención de aumento de peso, reducción de
los niveles de colesterol y control de los niveles sanguíneos de
glucosa en seres humanos y otros mamíferos. Estos efectos
inesperados de la administración de polipéptidos GSSP4 en mamíferos
también incluyen la reducción de niveles de ácidos grasos libres
elevados debido a la administración de epinefrina, inyección
i.v. de "Intralipid", o la administración de una comida
de ensayo de alto contenido de grasa, así como un aumento de la
oxidación de ácidos grasos en células musculares, reducción de los
niveles de colesterol circulante, modulación de la glucosa
sanguínea y reducción de peso en mamíferos, particularmente los que
consumen una dieta de alto contenido de grasa/alto contenido de
carbohidratos. Estos efectos son inesperados y sorprendentes dado
que proteínas de estructura similar u homología (tales como colipasa
y la toxina intestinal 1 de mamba) no han demostrado tener utilidad
para la reducción de peso, prevención de aumento de peso, reducción
de los niveles de colesterol y control de los niveles sanguíneos de
glucosa. Sin embargo, los polipéptidos GSSP4 de la invención son
eficaces y pueden proporcionarse a niveles factibles para
tratamientos en seres humanos.
De esta manera, la invención se refiere a
polipéptidos GSSP4, a polinucleótidos que codifican dichos
polipéptidos, a vectores que comprenden dichos polinucleótidos
GSSP4 y a células recombinantes para dichos polinucleótidos GSSP4,
así como a composiciones farmacéutica y fisiológicamente aceptables,
a composiciones que comprenden dichos polipéptidos GSSP4 y a
métodos para administrar dichos polipéptidos o polinucleótidos GSSP4
en una composición farmacéutica y fisiológicamente aceptable para
reducir el peso corporal, los niveles de colesterol o los niveles
de glucosa, o para tratar enfermedades y trastornos relacionados con
el metabolismo. También forman parte de la invención ensayos para
identificar agonistas y antagonistas de actividades relacionadas con
el metabolismo.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
polipéptidos GSSP4 purificados, aislados o recombinantes. En
realizaciones preferidas, dichos polipéptidos comprenden, consisten
esencialmente en o constan de los que tienen actividad
significativa, donde dicha actividad se selecciona entre el grupo
consistente en reducción de colesterol, regulación de colesterol,
reparto de lípidos, metabolismo de lípidos, control de glucosa y
actividad semejante a la de la insulina. En realizaciones
preferidas, dichos polipéptidos comprenden, consisten esencialmente
en, o constan de el polipéptido de longitud completa de la SEC ID
Nº:3 o un fragmento de aminoácidos consecutivos de la secuencia del
polipéptido de longitud completa de la SEC ID Nº:3. En otras
realizaciones preferidas, dichos polipéptidos comprenden una
secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con los
aminoácidos consecutivos correspondientes de las secuencias
polipeptídicas identificadas en la SEC ID Nº:3.
\newpage
En otra realización preferida, el polipéptido
GSSP4 puede reducir los niveles (concentración) circulantes
(sanguíneos, séricos o plasmáticos) de: (i) ácidos grasos libres,
(ii) glucosa y/o (iii) triglicéridos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
estimulan significativamente la oxidación de ácidos grasos libres o
de lípidos en el músculo. Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son
los que hacen que las células C2C12 diferenciadas en presencia de
dichos polipéptidos experimenten una oxidación de oleato mayor en al
menos 10%, 20%, 30%, 35% o 40% en comparación con las células no
tratadas.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
tienen una eficacia mayor en al menos 30% que las células no
tratadas en relación con el aumento de la captación de leptina en
una línea celular hepática (preferiblemente células hepáticas de
ratón BPRCL (ATCC CRL-2217)).
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
reducen significativamente el aumento posprandial de ácidos grasos
libres en plasma, particularmente después de una comida de alto
contenido de grasa.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
reducen significativamente o eliminan laproducción de cuerpos
cetónicos, particularmente después de una comida de alto contenido
de grasa.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
aumentan la captación de glucosa en células de músculo
esquelético.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
aumentan la captación de glucosa en células adiposas.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
aumentan la captación de glucosa en células neuronales.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
aumentan la captación de glucosa en glóbulos rojos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
aumentan la captación de glucosa en el cerebro.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
reducen significativamente el aumento posprandial de glucosa
plasmática después de una comida, particularmente una comida de alto
contenido de carbohidratos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
previenen significativamente el aumento posprandial de glucosa
plasmática después de una comida, particularmente una comida de alto
contenido de grasa o de alto contenido de carbohidratos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
mejoran la sensibilidad a la insulina.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan la ingesta de alimentos o la selección de alimentos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan la saciedad.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan el metabolismo de ácidos grasos.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan el metabolismo del colesterol, particularmente en tejidos
esteroidogénicos. Por lo tanto, dichos polipéptidos tienen un papel
potencial para influir, directa o indirectamente o de ambas formas,
sobre los niveles de hormonas reproductoras (por ejemplo, estradiol,
progesterona, testosterona).
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan los niveles de cortisol.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan los niveles de aldosterona. Por lo tanto, dichos
polipéptidos tiene un papel potencial para influir, directa o
indirectamente o de ambas formas, sobre los niveles de sodio y
potasio.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
modulan la presión sanguínea, preferiblemente para normalizar la
presión sanguínea dentro de un intervalo normal.
Otros polipéptidos GSSP4 preferidos son los que
forman multímeros (por ejemplo, heteromultímeros u homomultímeros)
in vitro y/o in vivo. Son multímeros preferidos los
homodímeros u homotrímeros. Otros multímeros preferidos son
homomultímeros que comprenden al menos 4, 6, 8, 9, 10 ó 12
polipéptidos GSSP4. Otros multímeros preferidos son heteromultímeros
que comprenden polipéptidos GSSP4 de la invención.
Otras realizaciones preferidas incluyen
polipéptidos heterólogos que comprenden un polipéptido GSSP4 de la
invención.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que codifican
dichos polipéptidos GSSP4 descritos en el primer aspecto, o su
complemento. Otra realización preferida de la invención es un
polinucleótido recombinante, purificado o aislado que comprende, o
consistente en una secuencia genómica de mamífero, gen, ADNc o
fragmentos de los mismos. En un aspecto, la secuencia procede de un
ser humano, ratón u otro mamífero. En un aspecto preferido, la
secuencia genómica incluye polinucleótidos aislados, purificados o
recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15,
18, 20, 22, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500,
1000, 2000, 5000, 6000 ó 7500 nucleótidos de una cualquiera de las
secuencias polinucleotídicas descritas en la SEC ID Nº:1, 2, o los
complementos de las mismas, donde dicho tramo contiguo comprende
una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de
nucleótidos correspondiente de la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3. En otras
realizaciones, los polinucleótidos son ADN, ARN, híbridos de
ADN/ARN, cadenas sencillas y cadenas dobles.
También se prefieren polinucleótidos y
polipéptidos GSSP4 que tienen actividades reguladoras de
colesterol.
También se prefieren polinucleótidos y
polipéptidos GSSP4 que tienen actividades reguladoras del peso
corporal.
También se prefieren polinucleótidos y
polipéptidos GSSP4 que tienen actividades reguladoras de la grasa
corporal.
También se prefieren polinucleótidos y
polipéptidos GSSP4 que tienen actividades reguladoras de la
glucosa.
También se prefieren polinucleótidos y
polipéptidos GSSP4 que tienen actividades reguladoras de los
lípidos.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un vector recombinante que comprende, consiste esencialmente en o
consta de dicho polinucleótido descrito en el segundo aspecto.
También se describe en la presente memoria una
célula recombinante que comprende, consiste esencialmente en o
consta de dicho vector recombinante descrito en el tercer aspecto.
También se describe una célula hospedadora recombinante para un
polinucleótido de la invención.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a
una composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable que
comprende, consiste esencialmente en o consta de dichos polipéptidos
GSSP4 descritos en el primer aspecto y un diluyente farmacéutica o
fisiológicamente aceptable.
En un sexto aspecto, la invención se refiere a
un método para controlar los niveles de colesterol que comprende
proporcionar o administrar a individuos dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un método para reducir el peso corporal que comprende
proporcionar o administrar a individuos dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un método para reducir la grasa corporal que comprende
proporcionar o administrar a individuos dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un método para reducir o controlar la glucosa
sanguínea que comprende proporcionar o administrar a individuos
dicha composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos en el
segundo aspecto.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a
un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno
relacionado con el metabolismo que comprende proporcionar o
administrar a un individuo que necesita dicho tratamiento dicha
composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el
quinto aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto.
Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con la
obesidad se selecciona entre el grupo consistente en obesidad,
alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT), resistencia a la
insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, enfermedad
cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no
insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II), diabetes mellitus
insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I), complicaciones
relacionadas con la diabetes (tales como elevación de cuerpos
cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones oculares,
neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico (PCOS) y
lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como acantosis
nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los métodos de
la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin limitación,
insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y elevación de la
presión sanguínea. En realizaciones preferidas, dicho individuo es
un mamífero, preferiblemente un ser humano. En otra realización
preferida, la composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o los polinucleótidos descritos en el
segundo aspecto sugieren que un compuesto puede tener utilidad para
aliviar la resistencia a la insulina en individuos, particularmente
los que son obesos o tienen sobrepeso.
En otra realización preferida, la presente
invención puede usarse en terapia complementaria en individuos para
mejorar su nivel de colesterol, su peso o su nivel de glucosa, que
comprende una composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos en el
segundo aspecto en combinación con agentes conocidos.
\newpage
La presente invención también proporciona un
método para mejorar los niveles de colesterol, el peso corporal o
el control de glucosa en individuos, que comprende la administración
de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos en el
segundo aspecto de manera individual, sin agentes conocidos.
En otra realización preferida, la presente
invención puede administrarse concomitantemente o conjuntamente con
agentes conocidos, por ejemplo, en forma de unidades de dosificación
separadas a usar simultáneamente, por separado o secuencialmente
(antes o después del agente conocido). Por consiguiente, la presente
invención también proporciona un producto que contiene una
composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en
el quinto aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto
y un agente conocido como una preparación combinada para uso
simultáneo, separado o secuencial para mejorar los niveles de
colesterol, el peso corporal o el control de la glucosa en
individuos, particularmente los que son obesos o tienen sobrepeso.
La relación entre la composición de la presente invención y el
agente conocido debe ser tal que la cantidad de cada ingrediente
activo empleado sea una que proporcione un nivel terapéuticamente
eficaz, pero no mayor que la cantidad recomendada como segura para
la administración.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto puede usarse como un método para mejorar la
sensibilidad a la insulina en algunas personas, particularmente las
que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM, diabetes de
tipo I) o diabetes no insulinodependiente (tipo II) en combinación
con una terapia con insulina.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto puede usarse como un método para mejorar la
sensibilidad a la insulina en algunas personas, particularmente las
que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM, diabetes de
tipo I) o diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, tipo II)
en combinación con terapias alternativas.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa como un método en la profilaxis de los
efectos perjudiciales a largo plazo producidos por una elevada
dosificación prolongada de insulina en seres humanos que tienen IDDM
o NIDDM.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la hipersecreción de insulina y trastornos o afecciones
producidos como resultado de dicha hipersecreción de insulina.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la obesidad y las consecuencias o complicaciones de la
obesidad.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la hipercolesterolemia y las consecuencias o complicaciones
de la hipercolesterolemia.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la NIDDM o IDDM y las consecuencias o complicaciones de la
NIDDM o IDDM.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT).
De esta manera, otras realizaciones preferidas
proporcionan terapias y métodos para normalizar la resistencia a la
insulina.
De esta manera, otras realizaciones preferidas
proporcionan terapias y métodos para reducir, ralentizar o prevenir
la progresión hasta NIDDM.
En otras realizaciones preferidas, la presente
invención de dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto se usa en terapia o en métodos para reducir o
prevenir la aparición del síndrome de resistencia la insulina.
En otras realizaciones preferidas, se tratan o
previenen de acuerdo con los métodos de la invención otras
afecciones, particularmente la obesidad, asociadas con la
resistencia la insulina. De esta manera, por medio de la prevención
o tratamiento de la obesidad, los métodos de la invención permitirán
a un individuo tener una vida más cómoda y evitar el inicio de
diversas enfermedades inducidas por la obesidad.
En otras realizaciones preferidas, la diana de
los métodos de acuerdo con la presente invención incluye individuos
con una tolerancia normal a la glucosa (NGT) que son obesos o que
tienen hiperinsulinemia en ayunas, o que tienen ambas cosas.
En un octavo aspecto, la invención se refiere a
un método para controlar los niveles sanguíneos de ácidos grasos
libres (FFA) y el metabolismo de los lípidos que comprende
proporcionar o administrar a individuos que necesitan un aumento de
la movilización y utilización de las reservas de grasa y una
reducción de las reservas de grasa totales dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto.
En otra realización preferida, la identificación
de dichos individuos que necesitan un aumento de la movilización y
utilización de las reservas de grasa y una reducción de las reservas
de grasa totales a tratar con dicha composición farmacéutica o
fisiológicamente aceptable comprende una persona que está implicada
en una actividad física que aumenta la demanda metabólica. Además,
el aumento de la movilización y utilización de las reservas de
grasa y la reducción de las reservas de grasa totales proporcionaría
un medio para reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso
y reducir la grasa corporal en individuos con sobrepeso y obesos. De
esta manera, la reducción del peso y de la obesidad reducirá el
riesgo de enfermedades crónicas asociadas con la obesidad tales
como, pero sin limitación, la aparición de diversos trastornos del
metabolismo de los lípidos, hipertensión, diabetes de tipo II,
aterosclerosis, enfermedad cardiovascular e ictus.
En aspectos relacionados, las realizaciones de
la presente invención incluyen métodos para provocar la inducción
de una respuesta biológica deseada en un individuo, que comprenden
las etapas de: proporcionar o administrar a un individuo una
composición que comprende un polipéptido GSSP4, donde dicha
respuesta biológica se selecciona entre el grupo consistente en:
(a) reducción de los niveles (concentración)
circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de ácidos grasos
libres;
(b) reducción de los niveles (concentración)
circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de glucosa;
(c) reducción de los niveles (concentración)
circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de
triglicéridos;
(d) estimulación de la oxidación de ácidos
grasos libres o de lípidos en el músculo;
(e) aumento de la captación de leptina en
células hepáticas o en el hígado;
(f) reducción del aumento posprandial en los
ácidos grasos libres plasmáticos, particularmente después de una
comida de alto contenido de grasa; y,
(g) reducción o eliminación de la producción de
cuerpos cetónicos, particularmente después de una comida de alto
contenido de grasa;
(h) aumento de la sensibilidad de los tejidos a
la insulina, particularmente del músculo, tejido adiposo, hígado o
cerebro,
(i) reducción de los niveles de colesterol,
particularmente en los individuos que tienen el colesterol elevado
(es decir, mayor de 200 mg/dl);
(j) modulación de los niveles (concentración)
circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de glucosa dentro
del intervalo fisiológico, preferiblemente manteniendo la glucosa
entre 60 y 190 mg/dl;
(k) modulación de los niveles (concentración)
circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de FFA dentro del
intervalo fisiológico, preferiblemente manteniendo los FFA entre 190
y 420 mg/dl;
(l) modulación de la producción de cuerpos
cetónicos como resultado de una comida de alto contenido de grasa,
donde dicha modulación es preferiblemente una reducción o
eliminación;
(m) reducción del peso corporal particularmente
en individuos con un IMC mayor de 27.
En un noveno aspecto, la invención se refiere a
un método para preparar el polipéptido GSSP4 descrito en el primer
aspecto, donde dicho método se selecciona entre el grupo consistente
en: escisión proteolítica, metodología recombinante y síntesis
artificial.
En un décimo aspecto, la presente invención
proporciona un método para preparar polipéptidos GSSP4
recombinantes, comprendiendo el método proporcionar un mamífero
transgénico, no humano, cuya leche contiene dichos polipéptidos
GSSP4 recombinantes, y purificar dichos polipéptidos GSSP4
recombinantes a partir de la leche de dicho mamífero no humano. En
una realización, dicho mamífero no humano es una vaca, cabra, oveja,
conejo o ratón. En otra realización, el método comprende purificar
polipéptidos GSSP4 recombinantes a partir de dicha leche, y además
comprende escindir dicha proteína in vitro para obtener
polipéptidos GSSP4 deseados.
En un decimoprimer aspecto, la invención se
refiere a un anticuerpo purificado o aislado capaz de unirse
específicamente a una proteína que comprende la secuencia de uno de
los polipéptidos de la presente invención. En un aspecto de esta
realización, el anticuerpo es capaz de unirse a un polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos, al menos 8
aminoácidos consecutivos o al menos 10 aminoácidos consecutivos de
la secuencia de uno de los polipéptidos de la presente
invención.
En un decimosegundo aspecto, la invención se
refiere al uso de polipéptidos descritos en el primer aspecto o
polinucleótidos descritos en el segundo aspecto para el tratamiento
de enfermedades y trastornos relacionados con el metabolismo o para
reducir o aumentar la masa corporal. Preferiblemente, dicha
enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo se selecciona
entre el grupo consistente en obesidad, alteración de la tolerancia
a la glucosa (IGT), resistencia a la insulina, aterosclerosis,
enfermedad ateromatosa, enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus,
síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM o
diabetes de tipo II), diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o
diabetes de tipo I), complicaciones relacionadas con la diabetes
(tales como elevación de los cuerpos cetónicos), microangiopatía,
retinopatía, lesiones oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de
ovario poliquístico (PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como
síndromes tales como acantosis nigricans, leprechaunismo y
lipoatrofia a tratar por los métodos de la invención. La enfermedad
cardiaca incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca,
insuficiencia coronaria y elevación de la presión sanguínea. En
realizaciones preferidas, dicho individuo es un mamífero,
preferiblemente un ser humano.
En un decimotercer aspecto, la invención se
refiere al uso de polipéptidos descritos en el primer aspecto o
polinucleótidos descritos en el segundo aspecto para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos
relacionados con el metabolismo o para reducir la masa corporal.
Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con el
metabolismo se selecciona entre el grupo consistente en obesidad,
alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT), resistencia a la
insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, enfermedad
cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no
insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II), diabetes
mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea. En realizaciones preferidas,
dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En un decimocuarto aspecto, la invención
proporciona polipéptidos del primer aspecto de la invención o una
composición del quinto aspecto para uso en un método de tratamiento
del cuerpo de un ser humano o un animal.
En un decimoquinto aspecto, la invención
proporciona polinucleótidos descritos en el segundo aspecto o una
composición aceptable del mismos, para uso en un método de
tratamiento del cuerpo de un ser humano o de un animal. En un
decimosexto aspecto, la invención se refiere a métodos para reducir
el peso corporal con fines cosméticos, que comprenden proporcionar
a un individuo dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o polinucleótidos descritos
en el segundo aspecto, o polipéptidos descritos en el primer
aspecto. Preferiblemente, para dicha reducción de peso corporal,
dicho individuo tiene un IMC de al menos 20, 25, 30, 35 ó 40.
En un decimoséptimo aspecto, la invención se
refiere a la composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o a polinucleótidos descritos en el
segundo aspecto o a un polipéptido descrito en el primer aspecto
para reducir la masa corporal en dichos individuos con un IMC de al
menos 30, 35, 40 o 45 o para el tratamiento o prevención de
enfermedades o trastornos relacionados con el metabolismo.
Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con el
metabolismo se selecciona entre el grupo consistente en obesidad,
alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT), resistencia a la
insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, enfermedad
cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no
insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II), diabetes
mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea. En realizaciones preferidas,
dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En realizaciones preferidas, la identificación
de dichos individuos a tratar con dicha composición farmacéutica o
fisiológicamente aceptable comprende la genotipificación de
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de GSSP4 o la medición de
los niveles de polipéptido GSSP4 o de su ARNm en muestras clínicas
de dichos individuos. Preferiblemente, dichas muestras clínicas se
seleccionan entre el grupo consistente en sangre, suero, plasma,
orina y saliva.
En un decimoctavo aspecto, la invención se
refiere a la composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable
descrita en el quinto aspecto o a los polinucleótidos descritos en
el segundo aspecto para reducir el peso corporal por razones
cosméticas.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a la composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o a los polinucleótidos
descritos en el segundo aspecto para reducir los niveles de
glucosa.
En un decimonoveno aspecto, la invención se
refiere a métodos para tratar la resistencia a la insulina, que
comprenden proporcionar a un individuo dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o dichos polinucleótidos descritos en el segundo aspecto, o
un polipéptido descrito en el primer aspecto.
La SEC ID Nº:1 muestra la secuencia genómica de
GSSP4 indicando regiones reguladoras, exones, alelos y posiciones
polimórficas, y cebadores de microsecuenciación inversos y directos
para identificar el haplotipo.
La SEC ID Nº:2 muestra la secuencia de ADNc del
polinucleótido GSSP4.
La SEC ID Nº:3 muestra la secuencia
polipeptídica de GSSP4.
Las SEC ID Nº:4-18 muestran
secuencias de nucleótidos 47-méricas de GSSP4 que
comprenden un alelo polimórfico en la posición 24. Los
correspondientes alelos y cebadores indicados en la SEC ID Nº: 1 son
los siguientes:
SEC ID Nº:4 VLP_1206_C_A, m=C o A
SEC ID Nº:5 VLP_148_A_G, r=A o G
SEC ID Nº:6 VLP_1851_T_C, y=T o C
SEC ID Nº:7 VLP_2551_G_A, r=G o A
SEC ID Nº:8 VLP_3124_C_T, y=C o T
SEC ID Nº:9 VLP_3563_G_A, r=G o A
SEC ID Nº:10 VLP_3792_G_A, r=G o A
SEC ID Nº:11 VLP_4417_A_C, m=A o C
SEC ID Nº:12 VLP_5757_T_C, y=T o C
SEC ID Nº:13 VLP_6322_A_G, r=G o A
SEC ID Nº:14 VLP_816_G_A, r=G o A
SEC ID Nº:15 VLP_924_G_A, r=G o A
SEC ID Nº:16 VLP_99-1_174_T_C,
y=T o C
SEC ID Nº:17 VLP_99-1_325_C_G,
s=C o G
SEC ID Nº:18 VLP_99-2_389_T_C,
y=T o C
Antes de describir la invención con más detalle,
se proporcionan las siguientes definiciones para ilustrar y definir
el significado y alcance de los términos usados para describir la
presente invención.
Como se usa indistintamente en la presente
memoria, los términos "oligonucleótidos" y
"polinucleótidos" y ácido nucleico incluyen secuencias de ARN,
ADN o híbridos de ARN/ADN de más de un nucleótido en una sola cadena
o en forma de dúplex. Los términos incluyen "nucleótidos
modificados" que comprenden al menos una modificación,
incluyendo a modo de ejemplo y no de limitación: (a) un grupo de
unión alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma
análoga de pirimidina, o (d) un azúcar análogo. Como ejemplos de
grupos de unión análogos, purinas, pirimidinas y azúcares véase,
por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 95/04064. Las secuencias
polinucleotídicas de la invención pueden prepararse por cualquier
método conocido, incluyendo la generación sintética, recombinante,
ex vivo, o una combinación de las mismas, así como utilizando
cualquier método de purificación conocido en la técnica.
Las expresiones construcción polinucleotídica,
polinucleótido recombinante y polipéptido recombinante se usan en
la presente memoria de acuerdo con su uso en la técnica. Las
expresiones "cadena arriba" y "cadena abajo" también se
usan en la presente memoria consecuentemente con su uso en la
técnica. Las expresiones "pares de bases" y "pares de bases
de Watson y Crick" se usan indistintamente en la presente memoria
y consecuentemente con su uso en la técnica. De manera similar, las
expresiones "complementario", "complemento del mismo",
"complemento", "polinucleótido complementario", "ácido
nucleico complementario" y "secuencia de nucleótidos
complementaria" se usan indistintamente en la presente memoria y
consecuentemente con su uso en la técnica.
El término "purificado" se usa en la
presente memoria para describir un polinucleótido o vector
polinucleotídico de la invención que se ha separado de otros
compuestos incluyendo, pero sin limitación, otros ácidos nucleicos,
carbohidratos, lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en
la síntesis del polinucleótido). Purificado también puede
referirse, por ejemplo, a la separación de polinucleótidos cerrados
covalentemente de polinucleótidos lineales, o viceversa. Un
polinucleótido es sustancialmente puro cuando al menos
aproximadamente 50%, 60%, 75% o 90% de una muestra contiene una
única secuencia polinucleotídica. En algunos casos esto implica una
determinación entre conformaciones (lineal frente a cerrada
covalentemente). Típicamente, un polinucleótido sustancialmente
puro comprende aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99%
peso/peso de una muestra de ácido nucleico. La pureza u
homogeneidad de un polinucleótido puede indicarse por varios medios
bien conocidos en la técnica, tales como una electroforesis en gel
de agarosa o poliacrilamida de una muestra seguida de la
visualización de una única banda polinucleotídica tras la tinción
del gel. Para ciertos fines puede proporcionarse una mayor
resolución mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en
la técnica.
De forma similar, el término "purificado"
se usa en la presente memoria para describir un polipéptido de la
invención que se ha separado de otros compuestos incluyendo, pero
sin limitación, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otras
proteínas. En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido es
sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente 50%, 60%, 75%,
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de las moléculas
polipeptídicas de una muestra tienen una única secuencia de
aminoácidos. En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido
sustancialmente puro comprende, típicamente, aproximadamente 50%,
60%, 70%, 80%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% peso/peso de una
muestra de proteína. La pureza u homogeneidad de un polipéptido se
indica por varios métodos bien conocidos en la técnica, tales como
una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida de una
muestra seguida de la visualización de una única banda polipeptídica
tras la tinción del gel. Para ciertos fines puede proporcionarse
una mayor resolución mediante el uso de HPLC u otros métodos bien
conocidos en la
técnica.
técnica.
Además, como se usa en la presente memoria, el
término "purificado" no requiere una pureza absoluta; en su
lugar, se pretende que sea una definición relativa. Se contempla
expresamente la purificación del material de partida o del material
natural en al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres
órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud.
Como alternativa, la purificación puede expresarse como "al
menos" un porcentaje de pureza con respecto a polinucleótidos
heterólogos (ADN, ARN o ambos) o polipéptidos. Como una realización
preferida, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente
invención tienen una pureza de al menos; 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, 99,5% o 100% con
respecto a polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Como otra
realización preferida, los polinucleótidos o polipéptidos tienen
"al menos" una pureza que varía desde cualquier número hasta la
posición número mil, entre 90% y 100% (por ejemplo, una pureza de
menos 99,995%) con respecto a polinucleótidos o polipéptidos
heterólogos. Además, la pureza de los polinucleótidos o
polipéptidos puede expresarse como un porcentaje (como se ha
descrito anteriormente) con respecto a todos los materiales y
compuestos distintos de la solución de vehículo. Cada número, hasta
la posición número mil, puede considerarse una especie individual de
pureza.
El término "aislado" requiere retirar el
material de su entorno original (por ejemplo, del entorno
natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o
polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está
aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado
de alguno o de todos los materiales coexistentes en el sistema
natural, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un
vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de
una composición, y aun así estar aislado por el hecho de que el
vector o la composición no son parte de su entorno natural.
Se excluyen específicamente de la definición de
"aislado": cromosomas de origen natural (por ejemplo,
extensiones cromosómicas), bibliotecas de cromosomas artificiales,
bibliotecas genéricas y bibliotecas de ADNc que existen como una
preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación
de células hospedadoras transfectadas/transformadas, donde las
células hospedadoras son una preparación in vitro heterogénea
o se siembran en placas como una población heterogénea de colonias
individuales. También se excluyen específicamente las bibliotecas
anteriores en las que una EST 5' constituye menos de 5% (o como
alternativa, 1%, 2%, 3%, 4%, 10%, 25%, 50%, 75% o 90%, 95% o 99%)
del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas de vector.
También se excluyen específicamente preparaciones de ADN genómico
de células completas o de ARN de células completas (incluyendo
dichas preparaciones de células completas, que se rompen
mecánicamente o se digieren enzimáticamente). Se excluyen más
específicamente las preparaciones de células completas anteriores
como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea
separada por electroforesis (incluyendo transferencias de las
mismas) en las que el polinucleótido de la invención no se ha
separado adicionalmente de los polinucleótidos heterólogos en el
medio de electroforesis (por ejemplo, una separación adicional por
escisión de una única banda a partir de una población de bandas
heterogéneas en un gel de agarosa o transferencia de nylon).
El término "cebador" denota una secuencia
oligonucleotídica específica que es complementaria a una secuencia
de nucleótidos diana y se usa para hibridar con la secuencia de
nucleótidos diana. Un cebador sirve como un punto de inicio para la
polimerización de nucleótidos catalizada por una ADN polimerasa, ARN
polimerasa o transcriptasa inversa.
El término "sonda" denota un segmento de
ácido nucleico definido (o un segmento análogo de nucleótidos, por
ejemplo, APN como se define en la presente memoria más adelante) que
puede usarse para identificar una secuencia polinucleotídica
específica presente en una muestra, comprendiendo dicho segmento de
ácido nucleico una secuencia de nucleótidos complementaria a la
secuencia de polinucleótidos específica que se va a identificar.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos sin tener en cuenta la longitud del
polímero. Por lo tanto, dentro de la definición de polipéptido se
incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término tampoco
especifica ni excluye modificaciones posteriores a la expresión de
polipéptidos. Por ejemplo, se incluyen expresamente en el término
polipéptido polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos
glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y
similares. También se incluyen dentro de la definición polipéptidos
que pueden contener uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo,
por ejemplo, aminoácidos no naturales, aminoácidos que sólo son
naturales en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos de
sistemas de mamíferos modificados etc.), polipéptidos con
enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural.
enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural.
Las expresiones "control de la glucosa
sanguínea", "regulación de la glucosa" "regulación de la
glucosa sanguínea", "modulación de la glucosa sanguínea" y
"control de la glucosa" se refieren a mantener o regular los
niveles de glucosa en sangre, suero y plasma entre
70-190 mg/dl. Sin limitarse a teoría alguna, los
compuestos/polipéptidos de la presente invención presentan un
método de control crónico de la glucosa dentro de un intervalo
estrecho y más fisiológico en comparación con el control de la
glucosa que se consigue con las terapias actuales que tratan
trastornos del metabolismo de la glucosa o de la acción de la
insulina, incluyendo, pero sin limitación, hiperglucemia,
resistencia a la insulina, diabetes mellitus insulinodependiente y
diabetes mellitus no insulinodependiente.
Sin limitarse a teoría alguna, los
compuestos/polipéptidos de la invención son capaces de modular el
control de la glucosa (como se ha definido anteriormente),
dirigiendo o repartiendo la glucosa entre el hígado y los tejidos
periféricos y, por lo tanto, se cree que tratan "enfermedades que
implican el control de la glucosa entre el hígado y los tejidos
periféricos". La expresión "tejidos periféricos" pretende
incluir sangre, cerebro, músculo y tejido adiposo. En realizaciones
preferidas, los compuestos/polipéptidos de la invención dirigen o
reparten la glucosa hacia el hígado, músculo y corazón. En
realizaciones preferidas alternativas, la glucosa se dirige o se
reparte hacia el tejido adiposo. En otras realizaciones preferidas,
la glucosa se dirige o se reparte hacia el hígado. En otras
realizaciones preferidas, la glucosa se dirige o se reparte hacia el
cerebro. En otras realizaciones preferidas, la glucosa se dirige
hacia la sangre. En otras realizaciones preferidas más, los
compuestos/polipéptidos de la invención aumentan o disminuyen la
oxidación de la glucosa, preferiblemente por el músculo.
Sin limitarse por la teoría, los
compuestos/polipéptidos de la invención son capaces de modular el
reparto de lípidos endógenos o de la dieta entre el hígado y los
tejidos periféricos y, por lo tanto, se cree que tratan
"enfermedades que implican el reparto de lípidos entre el hígado y
los tejidos periféricos". La expresión "tejidos
periféricos" pretende incluir sangre, músculo y tejido adiposo.
En realizaciones preferidas, los compuestos/polipéptidos de la
invención reparten los lípidos hacia el músculo. En realizaciones
preferidas alternativas, los lípidos se reparten hacia la sangre.
En realizaciones preferidas alternativas, los lípidos se reparten
hacia la el tejido adiposo. En otras realizaciones preferidas, los
lípidos se reparten hacia el hígado. En otras realizaciones
preferidas más, los compuestos/polipéptidos de la invención aumentan
o disminuyen la oxidación de los lípidos endógenos o de la dieta,
preferiblemente ácidos grasos libres (FFA) por el músculo. Los
lípidos endógenos y de la dieta incluyen, pero sin limitación,
triglicéridos (TG) y FFA.
Las "enfermedades preferidas" en las que se
cree que está implicado el control del colesterol, grasa corporal,
metabolismo de lípidos, glucemia, reparto de la glucosa en sangre y
reparto de lípidos incluyen obesidad, alteración de la tolerancia a
la glucosa (IGT), resistencia a la insulina, aterosclerosis,
enfermedad ateromatosa, enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus,
cánceres reproductivos, hipercortisolismo, aldosteronismo,
hiperandrogenismo, hipercalemia, hipernatremia,
hiperlipoproteinemia, hiperinsulinemia, hiperglucemia, síndrome X,
diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, diabetes de tipo
II), diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM, diabetes de tipo
I), complicaciones relacionadas con la diabetes (por ejemplo,
cetosis), microangiopatía, retinopatía, lesiones oculares,
neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico (PCOS) y
lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como acantosis
nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia, que se van a prevenir o
tratar mediante los métodos de la invención. La enfermedad cardiaca
incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia
coronaria y elevación de la presión sanguínea.
El término "heterólogo", cuando se usa en
la presente memoria, se pretende que designe cualquier polipéptido
o polinucleótido distinto de un polipéptido GSSP4 o un
polinucleótido que codifica un polipéptido GSSP4 de la presente
invención.
Las expresiones "que comprende", "que
consiste en" y "que consiste esencialmente en" se definen de
acuerdo con su significado convencional. El significado definido
expuesto en el M.P.E.P. controla el significado definido en la
técnica y el significado definido expuesto en la ley de casos
reguladora del Circuito Federal controla el significado expuesto en
el M.P.E.P. Teniendo esto en consideración, las expresiones pueden
sustituirse entre sí a lo largo de la presente solicitud para dar el
significado específico asociado con cada término.
La expresión "célula hospedadora recombinante
para" un polinucleótido particular de la presente invención se
refiere a una célula hospedadora que se ha alterado artificialmente
para que contenga dicho polinucleótido de un modo que no se
encuentra de forma natural en dicha célula. Por ejemplo, dicha
célula puede transfectarse o transducirse de forma transitoria o
estable con dicho polinucleótido de la invención.
El término "obesidad", como se usa en la
presente memoria, se define por el National Heart, Lung and Blood
Institute Expert Panel (J Amer Diet Assoc
98:1178-1191, 1998) en base al Índice de Masa
Corporal (IMC). El IMC se calcula como el peso corporal en
kilogramos dividido por el cuadrado de la altura en metros, es
decir, kg/m^{2}. Un IMC de menos de 18,5 kg/m^{2} se considera
"peso por debajo de lo normal"; un IMC de 18,5 - 24,9
kg/m^{2} se considera "normal" (sano); un IMC de
25,0-29,9 kg/m^{2} se considera "sobrepeso";
un IMC de 30,0-34,9 kg/m^{2} se considera
"obesidad de clase I"; un IMC de 35,0-39,9
kg/m^{2} se considera "obesidad de clase II"; y un IMC de
más de 39,9 kg/m^{2} se considera "obesidad de clase III".
También puede usarse la circunferencia de cintura para indicar un
riesgo de complicaciones metabólicas donde, en hombres, una
circunferencia de más de o igual a 94 cm indica un riesgo aumentado,
y mayor de o igual a 102 cm indica un riesgo sustancialmente
aumentado. De forma similar, para mujeres, una circunferencia de más
de o igual a 88 cm indica un riesgo aumentado, y de más de o igual
a 88 cm indica un riesgo sustancialmente aumentado. La
circunferencia de la cintura se mide en cm en el punto medio entre
el borde inferior de las costillas y el borde superior de la
pelvis. Otras medidas de obesidad incluyen, pero sin limitación, el
espesor de los pliegues de piel, que es una medida en cm del
espesor de los pliegues de la piel usando calibres y bioimpedancia,
que se basa en el principio de que la masa magra y el agua
conducirán la corriente eléctrica y la medición de la resistencia a
una corriente débil (impedancia) aplicada a través de las
extremidades proporciona una estimación de la grasa corporal usando
una ecuación obtenida empíricamente.
Las expresiones "diabetes mellitus
insulinodependiente", "IDDM", "diabetes de tipo I" y
"diabéticos de tipo I" son sinónimas, inclusivas o
intercambiables.
La expresión "complicaciones relacionadas con
la diabetes" se refiere a estados patológicos o fisiológicos
experimentados por pacientes diabéticos de tipo I (como se han
definido previamente) o diabéticos de tipo II (como se han definido
previamente) o por ambos tipos.
La expresión "diabetes mellitus no
insulinodependiente", "NIDDM", "diabetes de tipo II" y
"diabéticos de tipo II" son sinónimas, inclusivas o
intercambiables.
La expresión "agente que actúa sobre el
control de la glucosa sanguínea, dirigiendo la glucosa entre el
hígado y los tejidos periféricos" se refiere a un compuesto o
polipéptido de la invención que modula el control de la glucosa
sanguínea como se ha descrito previamente. Preferiblemente, el
agente aumenta o disminuye la oxidación de la glucosa,
preferiblemente por el músculo. Preferiblemente, el agente aumenta o
disminuye el peso corporal de los individuos o se usa para tratar o
prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo
tal como obesidad, alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT),
resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa,
enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
mellitus no insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II),
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea.
La expresión "respuesta a un agente que actúa
sobre el control de la glucosa sanguínea, dirigiendo la glucosa
entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a la
eficacia de un fármaco, incluyendo, pero sin limitación, la
capacidad de metabolizar un compuesto, la capacidad de convertir un
profármaco en un fármaco activo y la farmacocinética (absorción,
distribución, eliminación) y la farmacodinámica (relacionada con el
receptor) de un fármaco en un
individuo.
individuo.
La expresión "efectos secundarios de un agente
que actúa sobre el control de la glucosa sanguínea, dirigiendo la
glucosa entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a
los efectos adversos de la terapia debidos a extensiones de la
acción farmacológica principal del fármaco o a reacciones adversas
indiosincráticas debidas a una interacción del fármaco con factores
únicos del hospedador. Los "efectos secundarios de un agente que
actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y
los tejidos periféricos" pueden incluir, pero sin limitación,
reacciones adversas tales como toxicidades dermatológicas,
hematológicas o hepatológicas y además incluyen úlceras gástricas e
intestinales, alteración de la función plaquetaria, lesión renal,
nefritis, rinitis vasomotora con secreciones acuosas abundantes,
edema angioneurótico, urticaria generalizada y asma bronquial hasta
edema laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.
La expresión "agente que actúa sobre el
reparto de la glucosa entre el hígado y los tejidos periféricos"
se refiere a un compuesto o polipéptido de la invención que modula
el reparto de la glucosa entre el hígado y los tejidos periféricos
como se ha descrito previamente. Preferiblemente, el agente aumenta
o disminuye los niveles sanguíneos de glucosa. Preferiblemente, el
agente aumenta o disminuye la oxidación de la glucosa,
preferiblemente por el músculo. Preferiblemente, el agente aumenta o
disminuye el peso corporal de los individuos o se usa para tratar o
prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo
tal como obesidad, alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT),
resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa,
enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
mellitus no insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II),
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea.
La expresión "respuesta a un agente que actúa
sobre el reparto de la glucosa entre el hígado y los tejidos
periféricos" se refiere a la eficacia de un fármaco, incluyendo,
pero sin limitación, la capacidad de metabolizar un compuesto, la
capacidad de convertir un profármaco en un fármaco activo y la
farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y la
farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un
individuo.
La expresión "efectos secundarios de un agente
que actúa sobre el reparto de la glucosa entre el hígado y los
tejidos periféricos" se refiere a los efectos adversos de la
terapia debidos a extensiones de la acción farmacológica principal
del fármaco o a reacciones adversas indiosincráticas debidas a una
interacción del fármaco con factores únicos del hospedador. Los
"efectos secundarios de un agente que actúa sobre el reparto de
los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos
periféricos" pueden incluir, pero sin limitación, reacciones
adversas tales como toxicidades dermatológicas, hematológicas o
hepatológicas y además incluyen úlceras gástricas e intestinales,
alteración de la función plaquetaria, lesión renal, nefritis,
rinitis vasomotora con secreciones acuosas abundantes, edema
angioneurótico, urticaria generalizada y asma bronquial hasta edema
laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.
La expresión "agente que actúa sobre el
reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos
periféricos" se refiere a un compuesto o polipéptido de la
invención que modula el reparto de los lípidos de la dieta entre el
hígado y los tejidos periféricos como se ha descrito previamente.
Preferiblemente, el agente aumenta o reduce la oxidación de los
lípidos de la dieta, preferiblemente los ácidos grasos libres (FFA)
por el músculo. Preferiblemente, el agente aumenta o disminuye el
peso corporal de los individuos o se usa para tratar o prevenir una
enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo tal como
obesidad, alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT),
resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa,
enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
mellitus no insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II),
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea.
La expresión "respuesta a un agente que actúa
sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los
tejidos periféricos" se refiere a la eficacia de un fármaco,
incluyendo, pero sin limitación, la capacidad de metabolizar un
compuesto, la capacidad de convertir un profármaco en un fármaco
activo y la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación)
y la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en
un individuo.
La expresión "efectos secundarios de un agente
que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el
hígado y los tejidos periféricos" se refiere a los efectos
adversos de la terapia debidos a extensiones de la acción
farmacológica principal del fármaco o a reacciones adversas
indiosincráticas debidas a una interacción del fármaco con factores
únicos del hospedador. Los "efectos secundarios de un agente que
actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y
los tejidos periféricos" pueden incluir, pero sin limitación,
reacciones adversas tales como toxicidades dermatológicas,
hematológicas o hepatológicas y además incluyen úlceras gástricas e
intestinales, alteración de la función plaquetaria, lesión renal,
nefritis, rinitis vasomotora con secreciones acuosas abundantes,
edema angioneurótico, urticaria generalizada y asma bronquial hasta
edema laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.
La expresión "agente que actúa sobre el
reparto de los lípidos endógenos entre el hígado y los tejidos
periféricos" se refiere a un compuesto o polipéptido de la
invención que modula el reparto de los lípidos endógenos entre el
hígado y los tejidos periféricos como se ha descrito previamente.
Preferiblemente, el agente aumenta o reduce la oxidación de los
lípidos endógenos, preferiblemente los ácidos grasos libres (FFA)
por el músculo. Preferiblemente, el agente aumenta o disminuye el
peso corporal de los individuos o se usa para tratar o prevenir una
enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo tal como
obesidad, alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT),
resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa,
enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes
mellitus no insulinodependiente (NIDDM o diabetes de tipo II),
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes de tipo I),
complicaciones relacionadas con la diabetes (tales como elevación
de los cuerpos cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones
oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico
(PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como
acantosis nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los
métodos de la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea.
La expresión "respuesta a un agente que actúa
sobre el reparto de los lípidos endógenos entre el hígado y los
tejidos periféricos" se refiere a la eficacia de un fármaco,
incluyendo, pero sin limitación, la capacidad de metabolizar un
compuesto, la capacidad de convertir un profármaco en un fármaco
activo y la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación)
y la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en
un individuo.
La expresión "efectos secundarios de un agente
que actúa sobre el reparto de los lípidos endógenos entre el hígado
y los tejidos periféricos" se refiere a los efectos adversos de
la terapia debidos a extensiones de la acción farmacológica
principal del fármaco o a reacciones adversas indiosincráticas
debidas a una interacción del fármaco con factores únicos del
hospedador. Los "efectos secundarios de un agente que actúa sobre
el reparto de los lípidos endógenos entre el hígado y los tejidos
periféricos" pueden incluir, pero sin limitación, reacciones
adversas tales como toxicidades dermatológicas, hematológicas o
hepatológicas y además incluyen úlceras gástricas e intestinales,
alteración de la función plaquetaria, lesión renal, nefritis,
rinitis vasomotora con secreciones acuosas abundantes, edema
angioneurótico, urticaria generalizada y asma bronquial hasta edema
laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.
La expresión "enfermedades y trastornos
relacionados con GSSP4", como se usa en la presente memoria, se
refiere a cualquier enfermedad o trastorno que comprende un
funcionamiento aberrante de GSSP4, o que podría tratarse o
prevenirse modulando los niveles o la actividad de GSSP4.
"Funcionamiento aberrante de GSSP4" incluye, pero sin
limitación, niveles aberrantes de expresión de un polipéptido GSSP4
(aumentadas o disminuidas, pero preferiblemente disminuidos),
actividad aberrante de un polipéptido GSSP4 (aumentados o
disminuidos), e interacciones aberrantes con ligandos o moléculas
de unión (aumentadas o disminuidas). Por "aberrante" se
entiende un cambio del tipo o nivel de actividad observado en
células, tejidos o pacientes normales, o visto previamente en la
célula, tejido o paciente antes del comienzo de la enfermedad. En
realizaciones preferidas, estas enfermedades y trastornos
relacionados con GSSP4 incluyen obesidad y las enfermedades y
trastornos metabólicos descritos previamente.
Se entiende que la expresión "tratamientos
cosméticos" incluye tratamientos con compuestos o polipéptidos
de la invención que aumentan o reducen la masa corporal de un
individuo, donde el individuo no es clínicamente obeso o
clínicamente delgado como se ha definido anteriormente. De esta
manera, estos individuos tienen un índice de masa corporal (IMC)
por debajo del límite establecido para la obesidad clínica (por
ejemplo, por debajo de 30 kg/m^{2}) y por encima del límite para
la delgadez clínica (por ejemplo, por encima de 18,5 kg/m^{2}).
Además, estos individuos preferiblemente están sanos (por ejemplo,
no tienen una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo
de la invención). También se entiende que "tratamientos
cosméticos" incluyen, en algunas circunstancias, aumentos más
localizados en el tejido adiposo, por ejemplo, aumentos o pérdidas
específicamente alrededor de la cintura o las caderas, o alrededor
de las caderas y los muslos. Estos aumentos o pérdidas localizadas
de tejido adiposo pueden identificarse por aumentos o disminuciones,
por ejemplo, en el tamaño de la cintura o de la cadera, por
ejemplo.
El término "prevenir" o "prevención",
como se usa en la presente memoria, se refiere a la administración
de un compuesto antes del inicio de los síntomas clínicos de una
enfermedad o afección para prevenir la manifestación física de
aberraciones asociadas con la obesidad o la resistencia a la
insulina en alguna medida. El término "prevenir" o
"prevención" no significa que el resultado sea necesariamente
absoluto, sino más bien eficaz para proporcionar algún grado de
prevención o mejoría de la progresión del trastorno metabólico o
relacionado con GSSP4 (es decir, proporcionar efectos protectores),
mejoría de los síntomas del trastorno y mejoría de la reaparición
del trastorno metabólico o relacionado con GSSP4.
El término "tratar" o "tratamiento",
como se usa en la presente memoria, se refiere a la administración
de un compuesto después del inicio de los síntomas clínicos. El
término "tratar" o "tratamiento" significa mejorar,
aliviar los síntomas, eliminar la causa de los síntomas en una base
temporal o permanente, o prevenir o ralentizar la aparición de los
síntomas del trastorno o afección indicada.
La expresión "que necesita tratamiento",
como se usa en la presente memoria, se refiere a la opinión del
cuidador (por ejemplo, médico, enfermera, practicante, etc. en el
caso de los seres humanos; y veterinario en el caso de animales,
incluyendo mamíferos no humanos) de que un individuo o animal
necesita o se beneficiará del tratamiento. Esta opinión se adquiere
basándose en una diversidad de factores incluidos en el campo del
cuidador experto, pero que incluyen el conocimiento de que el
individuo o animal está enfermo, o estará enfermo, como resultado de
una afección que se puede tratar por los compuestos de la
invención.
La expresión "percibe la necesidad de un
tratamiento" se refiere a la determinación subclínica de que un
individuo desea reducir el peso por razones cosméticas como se ha
descrito anteriormente en la sección de "tratamiento
cosmético". La expresión "percibe la necesidad de
tratamiento" en otras realizaciones puede hacer referencia a la
decisión del propietario de un animal de realizar un tratamiento
cosmético del animal.
El término "paciente" o "individuo",
como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal,
incluyendo mamíferos, preferiblemente ratones, ratas, otros
roedores, conejos, perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, caballos o
primates, y más preferiblemente seres humanos. El término puede
hacer referencia a machos o hembras, o a ambos sexos, o excluir
machos o hembras.
La expresión "animal no humano" se refiere
a cualquier vertebrado no humano, incluyendo aves y más
habitualmente mamíferos, preferiblemente primates, animales tales
como cerdos, cabras, ovejas, burros, caballos, gatos, perros,
conejos o roedores, más preferiblemente ratas o ratones. Tanto el
término "animal" como "mamífero" incluyen expresamente
seres humanos a menos que vaya seguido de la expresión "no
humano". Los inventores creen que los polipéptidos GSSP4 pueden
reducir significativamente la respuesta posprandial de la glucosa en
un individuo, particularmente después de una comida de alto
contenido de grasa/alto contenido de carbohidratos, sin afectar a
los niveles de insulina. Además, se cree que los polipéptidos GSSP4
de la invención modulan el aumento de peso, particularmente en
individuos con una dieta de alto contenido de grasa/alto contenido
de carbohidratos.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 en la modulación de la glucosa como una nueva
herramienta importante para controlar la homeostasis de energía y
la regulación de la glucosa.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 en el reparto de la glucosa como una nueva
herramienta importante para controlar la homeostasis de energía y
la regulación de la glucosa.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 en el reparto de los lípidos como una nueva
herramienta importante para controlar la homeostasis de energía y
la regulación de los lípidos.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 en el reparto de los lípidos de la dieta como una
nueva herramienta importante para controlar la homeostasis de
energía y la regulación de los lípidos.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 en el reparto de los lípidos endógenos como una
nueva herramienta importante para controlar la homeostasis de
energía y la regulación de los lípidos.
Se han identificado polipéptidos GSSP4 que
tienen actividad medible in vitro e in vivo. Estas
actividades incluyen, pero sin limitación, la reducción de la
respuesta posprandial de los niveles plasmáticos de ácidos grasos
libres, glucosa y triglicéridos, particularmente en ratones
alimentados con una comida de alto contenido de
grasa/carbohidratos, aumento de la oxidación de ácidos grasos libres
en músculo in vitro y ex vivo, y pérdida de peso
mantenida en ratones alimentados con una dieta de alto contenido de
grasa/carbohidratos. También se proporcionan otros ensayos para la
actividad de los polipéptidos GSSP4 in vitro e in vivo
(ejemplos 2-13, por ejemplo), y los especialistas en
la técnica pueden diseñar ensayos equivalentes.
La expresión actividad "relacionada con la
obesidad" o "relacionada con el metabolismo", como se usa en
la presente memoria, se refiere a al menos una, y preferiblemente a
todas las actividades descritas en la presente memoria para los
polipéptidos GSSP4. En la presente memoria se proporcionan ensayos
para la determinación de estas actividades, y los especialistas
habituales en la técnica pueden diseñar ensayos equivalentes. La
expresión actividad "relacionada con el metabolismo", como se
usa en la presente memoria, se refiere a al menos una, y
preferiblemente a todas las actividades descritas en la presente
memoria para los polipéptidos GSSP4. Los ensayos para la
determinación de estas actividades se proporcionan en la presente
memoria, se conocen en la técnica o pueden diseñarse por los
especialistas habituales en la técnica. Opcionalmente, la
"actividad relacionada con el metabolismo" puede seleccionarse
entre el grupo consistente en el control de la glucosa sanguínea,
el reparto de la glucosa, el metabolismo de la glucosa, el reparto
de los lípidos, el metabolismo de los lípidos y la actividad del
tipo de la insulina, o una actividad dentro de una de estas
categorías. Opcionalmente, la actividad "relacionada con la
obesidad" puede seleccionarse entre el grupo consistente en el
reparto de los lípidos, el metabolismo de los lípidos y la actividad
del tipo de la insulina, o una actividad dentro de una de estas
categorías. Por actividad de "reparto de lípidos" se entiende
la capacidad de localizar los lípidos de la dieta entre los grupos
de tejidos principales incluyendo el tejido adiposo, el hígado y el
músculo. Los inventores han demostrado que los polipéptidos GSSP4 de
la invención intervienen en el reparto de los lípidos en el
músculo, hígado o tejido adiposo. Por actividad de "metabolismo de
los lípidos" se entiende la capacidad de influir en el
metabolismo de los lípidos. Los inventores, por medio de
experimentos de oxidación de ácidos grasos libres (ejemplos 4, 8,
10, 11 y 12), han demostrado que los polipéptidos GSSP4 de la
invención tienen capacidad de influir en el nivel de ácidos grasos
libres en el plasma además de aumentar el metabolismo de los
lípidos en el músculo y de influir de manera transitoria en los
niveles de triglicéridos en el plasma y en el músculo (ejemplos 7,
10 y 13). Por actividad "del tipo de la insulina" se entiende
la capacidad de los polipéptidos GSSP4 de modular los niveles de
glucosa en el plasma. Los inventores han descubierto que los
polipéptidos GSSP4 no afectan significativamente a los niveles de
insulina, pero afectan a los niveles de glucosa de manera similar a
los efectos de la insulina (ejemplos 9 y 10). Estos efectos no se
ven en presencia del polipéptido GSSP4 intacto (de longitud
completa) o son significativamente mayores en presencia de los
polipéptidos GSSP4 en comparación con el polipéptido GSSP4 de
longitud completa.
Por polipéptido GSSP4 "intacto" o "de
longitud completa", como se usa en la presente memoria, se
entiende la secuencia del polipéptido de longitud completa del
polipéptido GSSP4 de la SEC ID Nº:3, desde la metionina
N-terminal al codón de terminación
C-terminal. Los polipéptidos GSSP4 preferidos tienen
la actividad biológica descrita en la presente memoria, y por lo
tanto pueden ser útiles para preparar anticuerpos, ensayos de
diagnóstico, etc.
Como otra realización preferida, están los
polipéptidos GSSP4 que no permiten una elevación de la glucosa
plasmática por encima de 190 mg/dl, particularmente después del
consumo de alimentos, o que previenen una reducción de la glucosa
en suero por debajo de 70 mg/dl, particularmente después del consumo
de alimentos.
Como otra realización preferida, están los
polipéptidos GSSP4 que no permiten una elevación de los ácidos
grasos plasmáticos por encima de 420 mg/dl, particularmente después
del consumo de alimentos, o que previenen una reducción de los
ácidos grasos en suero por debajo de 190 mg/dl, particularmente
después del consumo de alimentos.
Por "significativamente", como se usa en la
presente memoria, se entiende estadísticamente significativo como
se determina típicamente por los especialistas habituales en la
técnica. Por ejemplo, los datos se calculan típicamente como media
\pm SEM, y un valor de p \leq 0,05 se considera estadísticamente
significativo. El análisis estadístico típicamente se realiza
usando el ensayo t de Student para datos no pareados o el ensayo t
de Student para datos pareados, según sea apropiado en cada
estudio.
En los ejemplos mostrados más adelante se
proporcionan "ensayos relacionados con el metabolismo"
representativos. Estos ensayos incluyen, pero sin limitación,
métodos in vivo e in vitro para medir la respuesta
posprandial, métodos para medir la captación de la glucosa, la
oxidación de la glucosa, la concentración de glucosa, la
concentración de lípidos, los niveles de ácidos grasos libres, la
oxidación de ácidos grasos y métodos para medir la modulación del
peso. En realizaciones preferidas, la respuesta posprandial se mide
en animales no humanos, preferiblemente roedores. En realizaciones
preferidas se miden parámetros fisiológicos incluyendo, pero sin
limitación, los niveles de glucosa, ácidos grasos, insulina y
leptina. En otras realizaciones preferidas se mide la oxidación de
ácidos grasos en las células in vitro o ex vivo,
preferiblemente en células o tejido muscular de animales no
humanos, preferiblemente roedores. En otras realizaciones
preferidas, la modulación del peso se mide en animales humanos o no
humanos, preferiblemente roedores (ratas o ratones), primates,
perros, gatos o cerdos con una dieta de alto contenido de
grasa/carbohidratos. Opcionalmente, la "actividad relacionada con
el metabolismo" incluye otras actividades no identificadas
específicamente en la presente memoria. En general, los
"parámetros medibles" en relación con la obesidad y el campo de
la investigación metabólica pueden seleccionarse entre el grupo
consistente en los niveles de ácidos grasos libres, la oxidación de
ácidos grasos libres, los niveles de triglicéridos, los niveles de
glucosa, los niveles de insulina, los niveles de leptina, la ingesta
de alimentos y el peso corporal.
En estos ensayos relacionados con el
metabolismo, los polipéptidos o polinucleótidos GSSP4, o ambos,
provocarían un cambio significativo en al menos uno de los
parámetros medibles seleccionados entre el grupo consistente en la
lipemia posprandial, los niveles de ácidos grasos libres, los
niveles de triglicéridos, los niveles de glucosa, la oxidación de
la glucosa, la captación de glucosa, la oxidación de ácidos grasos
libres y el peso. Como alternativa, los polipéptidos o
polinucleótidos GSSP4, o ambos, tendrían un cambio significativo en
al menos uno de los parámetros medibles seleccionados entre el grupo
consistente en un aumento de los niveles sanguíneos de ácidos
grasos (FFA), una reducción de los niveles sanguíneos de glucosa,
una reducción en los niveles de insulina, un aumento en la
oxidación de la glucosa y un aumento de la oxidación de FFA.
La invención se refiere, entre otras cosas, a
polipéptidos GSSP4 aislados, purificados o recombinantes. Los
polipéptidos GSSP4 de la invención son útiles para tratar o prevenir
la resistencia a la insulina, y para reducir el peso corporal o
aumentar el peso corporal (usando antagonistas de polipéptidos
GSSP4) como un tratamiento cosmético o para el tratamiento
prevención de enfermedades y trastornos relacionados con el
metabolismo. Los polipéptidos GSSP4 también son útiles, entre otras
cosas, en ensayos de selección de agonistas o antagonistas de la
actividad de los polipéptidos GSSP4, para inducir la producción de
anticuerpos específicos para el polipéptido GSSP4, y en ensayos de
diagnóstico.
Los polipéptidos GSSP4 de la presente invención
preferiblemente se proporcionan en una forma aislada, y pueden
estar parcialmente o sustancialmente purificados. Una versión
producida de manera recombinante de uno cualquiera de los
polipéptidos GSSP4 puede purificarse sustancialmente por el método
de una etapa descrito por Smith et al. ((1988) Gene
67(1):31-40) o por los métodos descritos en
la presente memoria o conocidos en la técnica.
Los polipéptidos de la invención también pueden
purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes usando
anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de la invención por
métodos conocidos en la técnica de la purificación de proteínas.
También se contemplan específicamente
preparaciones de polipéptidos GSSP4 de la invención que implican una
purificación parcial o selección de los polipéptidos GSSP4. Se
prevé que estas preparaciones brutas sean el resultado de la
concentración de células que expresan polipéptidos GSSP4 quizás con
una pocas etapas de purificación adicionales, pero antes de
terminar la purificación de los polipéptidos. Por ejemplo, las
células que expresan los polipéptidos GSSP4 están presentes en un
sedimento, se lisan o el producto bruto se liofiliza.
Los polipéptidos GSSP4 pueden tener una longitud
de cualquier número entero desde al menos 6 aminoácidos consecutivos
hasta 1 aminoácido menos que un polipéptido GSSP4 de longitud
completa de la SEC ID Nº:4. De esta manera, para la SEC ID Nº:4, un
polipéptido GSSP4 puede tener: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,
67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,
101, 102, 103, 104, o 105 aminoácidos consecutivos.
Cada polipéptido GSSP4 descrito anteriormente
puede especificarse adicionalmente en términos de sus posiciones
N-terminal y C-terminal. Por
ejemplo, en la presente invención se incluyen todas las
combinaciones de una posición N-terminal y
C-terminal que podrían ocupar polipéptidos de 6
aminoácidos contiguos a 1 aminoácido menos que el polipéptido GSSP4
de longitud completa, en cualquier secuencia de polipéptido GSSP4 de
longitud completa intacta y contigua dada. De esta manera, un
fragmento de 6 aminoácidos consecutivos podría ocupar posiciones
seleccionadas entre el grupo consistente en 1-6,
2-7, 3-8, 4-9,
5-10, 6-11, 7-12,
8-13, 9-14, 10-15,
11-16, 12-17, 13-18,
14-19, 15-20, 16-21,
17-22, 18-23, 19-24,
20-25, 21-26, 22-27,
23-28, 24-29, 25-30,
26-31, 27-32,
28-33, 29-34, 30-35,
31-36, 32-37, 33-38,
34-39, 35-40, 36-41,
37-42, 38-43, 39-44,
40-45, 41-46, 42-47,
43-48, 44-49,
45-50, 46-51, 47-52,
48-53, 49-54, 50-55,
51-56, 52-57, 53-58,
54-59, 55-60, 56-61,
57-62, 58-63,
59-64,60-65, 61-66,
62-67,63-68, 64-69,
65-70,66-71,67-72,
68-73, 69-74,70-75,
71-76, 72-77, 73-78,
74-79, 75-80,
76-81, 77-82, 78-83,
79-84, 80-85, 81-86,
82-87, 83-88, 84-89,
85-90, 86-91, 87-92,
88-93, 89-94, 90-95,
91-96, 92-97,
93-98, 94-99,
95-100, 96-101,
97-102, 98-103,
99-104, y 100-105, de un fragmento
de 105 aminoácidos consecutivos. De forma similar, en la presente
invención se incluyen las posiciones ocupadas por todos los demás
fragmentos de tamaños comprendidos entre 6 aminoácidos y 105
aminoácidos de la SEC ID Nº:3 y también pueden preverse
inmediatamente basándose en estos dos ejemplos y, por lo tanto, no
se indican individualmente para no alargar innecesariamente la
memoria descriptiva. Además, en la presente invención se incluyen
las posiciones ocupadas por fragmentos de 6 a 105 aminoácidos
consecutivos de la SEC ID Nº:3 y también pueden preverse
inmediatamente basándose en estos dos ejemplos y, por lo tanto, no
se indican individualmente para no alargar innecesariamente la
memoria descriptiva. Además, las posiciones ocupadas por fragmentos
de 6 aminoácidos consecutivos a 1 aminoácido menos que cualquier
otro polipéptido GSSP4 de longitud completa también pueden preverse
basándose en estos dos ejemplos y, por lo tanto, no se indican
individualmente para no alargar innecesariamente la memoria
descriptiva.
Los polipéptidos GSSP4 de la presente invención
pueden describirse, como alternativa, por las fórmulas "n a c"
(inclusive); donde "n" equivale a la posición del aminoácido
más N-terminal (como se define por la lista de
secuencias) y "c" equivale a la posición del aminoácido más
C-terminal (como se define por la lista de
secuencias) del polipéptido; y además donde "n" equivale a un
número entero comprendido entre 1 y 99; y donde "c" equivale a
un número entero comprendido entre 7 y 105, el número de aminoácidos
de la secuencia del polipéptido de longitud completa; y donde
"n" es un número entero menor que "c" en al menos 6. Por
lo tanto, para las secuencias proporcionadas en la SEC ID Nº:3,
"n" es cualquier número entero de la lista consistente en: 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99; y "c" es cualquier
número entero seleccionado entre el grupo consistente en: 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,
61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 y 105. Todas las
combinaciones de posiciones "n" y "c" se incluyen como
realizaciones específicas de la invención. Además, la fórmula
"n" a "c" puede modificarse como
'"n1-n2" a "c1-c2'", donde
"n1-n2" y "c1-c2"
representan intervalos posicionales seleccionados entre dos números
enteros anteriores cualesquiera que representan posiciones de
aminoácidos de la lista de secuencias. Las fórmulas alternativas
incluyen '"n1-n2" a "c"' y '"n" a
"c1-c2"'.
Estas realizaciones específicas, y otras
realizaciones de fragmentos de polipéptidos o polinucleótidos
descritos en la presente memoria, éstas pueden modificarse para ser
"al menos", "iguales a", "iguales o menores que",
"menores que", "de al menos ___ pero no mayores de" o
"de ___ a ___" en un tamaño especificado o posiciones
N-terminales y/o C-terminales
especificadas. Debe indicarse que todos los intervalos usados para
describir cualquier realización de la presente invención son
inclusivos a menos que se indique específicamente otra cosa.
La presente invención también proporciona la
exclusión de cualquier fragmento individual especificado por las
posiciones N-terminal y C-terminal o
de cualquier fragmento especificado por tamaño en restos
aminoacídicos como se ha descrito anteriormente. Además, puede
excluirse como especie individual cualquier número de fragmentos
especificados por las posiciones N-terminal y
C-terminal o por tamaño en restos aminoacídicos como
se ha descrito anteriormente. Además, cualquier número de
fragmentos especificados por las posiciones
N-terminal y C-terminal o por
tamaño en restos aminoacídicos como se ha descrito anteriormente
pueden constituir un fragmento polipeptídico en cualquier
combinación y también pueden incluir opcionalmente secuencias
polipeptídicas no GSSP4.
La expresión "fragmento de GSSP4", como se
usa en la presente memoria, se refiere a fragmentos de polipéptidos
GSSP4 de longitud completa que comprenden al menos 6 y cualquier
otro número entero de aminoácidos hasta 104 del polipéptido GSSP4
de longitud completa (definido anteriormente). Los polipéptidos
GSSP4 de la invención incluyen variantes, fragmentos, análogos y
derivados de los polipéptidos GSSP4 descritos anteriormente,
incluyendo polipéptidos GSSP4 modificados.
Un especialista habitual en la técnica
reconocerá que algunos aminoácidos de las secuencias de polipéptidos
GSSP4 de la presente invención pueden variar sin un efecto
significativo en la estructura o función de las proteínas; habrá
aminoácidos críticos en la secuencia que determinan la actividad. De
esta manera, la invención también incluye variantes de polipéptidos
GSSP4 que tienen actividad relacionada con el metabolismo como se
ha descrito anteriormente. Estas variantes incluyen secuencias de
polipéptidos GSSP4 con una o más deleciones, inserciones,
inversiones, repeticiones y sustituciones de aminoácidos por
mutaciones naturales o por manipulación humana, seleccionadas de
acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica de manera
que tengan poco efecto sobre la actividad. Más adelante se
proporcionan pautas en relación a cómo realizar sustituciones de
aminoácidos fenotípicamente silenciosas.
Hay dos estrategias principales para estudiar la
tolerancia a cambios de una secuencia de aminoácidos (véase, Bowie,
et al. (1990) Science, 247,1306-10). El
primer método se basa en el proceso de evolución, en el que se
aceptan o se rechazan mutaciones por selección natural. La segunda
estrategia usa ingeniería genética para introducir cambios de
aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y
selecciones o exploraciones para identificar secuencias que
mantienen la funcionalidad.
Estos estudios han revelado que ciertas
proteínas son sorprendentemente tolerantes de sustituciones de
aminoácidos e indican los cambios de aminoácidos probables en
ciertas posiciones de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los
aminoácidos enterrados requieren cadenas laterales no polares,
mientras que generalmente se conservan algunas características de
cadenas laterales en la superficie. Se describen otras sustituciones
fenotípicamente silenciosas por Bowie et al. (supra) y las
referencias citadas en dicho texto.
En caso de una sustitución de aminoácidos en la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la
invención, uno o varios aminoácidos pueden reemplazarse por
aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido
"equivalente" se usa en la presente memoria para designar
cualquier aminoácido que pueda usarse en lugar de otro de los
aminoácidos, con propiedades similares, de manera que un
especialista en la técnica espere que la estructura secundaria y la
naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan sustancialmente
sin cambios.
En realizaciones particulares, se muestran
sustituciones conservativas en la Tabla 1 bajo el encabezado de
sustituciones preferidas. Si estas sustituciones producen un cambio
en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios
sustanciales, o como se describe más adelante haciendo referencia a
las clases de aminoácidos, y se exploran los productos.
Las modificaciones sustanciales en función de la
identidad inmunológica del polipéptido GSSP4 se realizan
seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena
principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo,
como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o
hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la
cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basándose
en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, bis, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la
cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas incluirán
cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos
restos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de
sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones pueden realizarse usando métodos
conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (dirigida), mutagénesis mediante alanina y
mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter et al,
Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al, Nucl. Acids
Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de casete [Wells et al,
Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells
et al, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u
otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para
producir el ADN variante de GSSP4.
Los aminoácidos de las secuencias de
polipéptidos GSSP4 de la invención que son esenciales para la
función también pueden identificarse por métodos conocidos en la
técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis mediante
alanina (véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989)
Science 244(4908):1081-5). Este último
procedimiento introduce mutaciones individuales de alanina en todos
los restos de una molécula. Después se ensaya la actividad
relacionada con el metabolismo de las moléculas mutantes resultantes
usando ensayos descritos anteriormente. Son de un interés especial
sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados
o neutros que pueden producir proteínas con características
mejoradas muy deseables, tales como menor agregación. La agregación
no sólo puede reducir la actividad, sino que también puede ser muy
problemática cuando se preparan mutaciones farmacéutica o
fisiológicamente aceptables, porque los agregados pueden ser
inmunogénicos (véase, por ejemplo, Pinckard, et al., (1967)
Clin. Exp. Immunol 2:331-340; Robbins, et
al., (1987) Diabetes Jul;36(7):838-41; y
Cleland, et al., (1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.
10(4):307-77).
De esta manera, el fragmento, derivado, análogo
u homólogo de los polipéptidos GSSP4 de la presente invención puede
ser, por ejemplo: (i) uno en el que uno o más de los restos
aminoacídicos se han sustituido por un resto aminoacídico
conservado o no conservado (preferiblemente un resto aminoacídico
conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede estar
codificado o no por el código genético (es decir, puede ser un
aminoácido natural o no); o (ii) uno en el que uno o más de los
restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente; o (iii) uno en
el que el polipéptido GSSP4 se ha fusionado con otro compuesto, tal
como un compuesto para aumentar la vida media del fragmento (por
ejemplo, polietilenglicol); o (iv) uno en el que los aminoácidos
adicionales se han fusionado a la forma anterior del fragmento, tal
como un péptido de región de fusión Fc de IgG o una secuencia líder
o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación de
la forma anterior del fragmento o una secuencia de
pro-proteína. Estos fragmentos, derivados y
análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de la presente memoria.
análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de la presente memoria.
Otra realización de la invención se refiere a un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido GSSP4 que tiene una secuencia de aminoácidos que
contiene al menos una sustitución de aminoácidos conservativa, pero
no más de 50 sustituciones de aminoácidos conservativas, no más de
40 sustituciones de aminoácidos conservativas, no más de 30
sustituciones de aminoácidos conservativas y no más de 20
sustituciones de aminoácidos conservativas. También se proporcionan
polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de un
fragmento de GSSP4, que tiene al menos una, pero no más de 10, 9, 8,
7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos conservativas.
Otra realización específica de un polipéptido
GSSP4 modificado de la invención es un polipéptido que es resistente
a proteolisis, por ejemplo, un polipéptido GSSP4 en el que se ha
modificado un enlace -CONH-péptido y se ha
reemplazado por uno o más de los siguientes: un enlace (CH2NH)
reducido; un enlace (NHCO) retroinverso; un enlace metilenoxi
(CH2-0); un enlace tiometileno
(CH2-S); un enlace carba (CH2CH2); un enlace
cetometileno (CO-CH2); un enlace hidroxietileno
(CHOH-CH2)); un enlace (N-N); un
enlace E-alceno; o un enlace -CH=CH-. De esta
manera, la invención también incluye un polipéptido GSSP4 o una
variante del mismo en la que al menos se ha modificado un enlace
peptídico como se ha descrito anteriormente.
Además, los aminoácidos tienen dentro del cuerpo
quiralidad L o D. En algunas realizaciones, es preferible alterar
la quiralidad de los aminoácidos en los polipéptidos GSSP4 de la
invención para prolongar la vida media dentro del cuerpo. De esta
manera, en algunas realizaciones, uno o más de los aminoácidos están
preferiblemente en la configuración L. En otras realizaciones, uno
o más de los aminoácidos están preferiblemente en la configuración
D.
Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen polipéptidos que tienen una identidad de secuencia
de aminoácidos de al menos 50%, al menos 60% o 70%, 80%, 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polipéptido
GSSP4 como se ha descrito anteriormente. Con un polipéptido que
tiene una "identidad" de secuencia de aminoácidos de al menos
95% con una secuencia de aminoácidos del polipéptido GSSP4 se quiere
decir que la secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia
del polipéptido GSSP4 excepto porque puede incluir hasta cinco
alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia
de aminoácidos del polipéptido GSSP4. La secuencia de referencia es
el polipéptido GSSP4 con una secuencia correspondiente a las
secuencias proporcionadas en la SEC ID Nº:3. Por lo tanto, para
obtener un polipéptido que tenga una identidad de secuencia de
aminoácidos de al menos 95% con una secuencia de aminoácidos del
polipéptido GSSP4, hasta 5% (5 de 100) de los restos aminoacídicos
de la secuencia pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por
otro aminoácido en comparación con la secuencia del polipéptido
GSSP4. Estas alteraciones pueden estar presentes en los extremos
amino o carboxi o en cualquier otro lugar entre esas posiciones
terminales, entremezcladas de forma individual entre restos de la
secuencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la
secuencia.
Como un aspecto práctico, se puede determinar si
cualquier polipéptido particular tiene un porcentaje de identidad
con un polipéptido GSSP4 de forma convencional usando programas
informáticos conocidos. Tales algoritmos y programas incluyen, pero
sin limitación, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y
Lipman, (1988) Proc Natl Acad Sci USA
Apr;85(8):2444-8; Altschul et al.,
(1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-410;
Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res.
22(2):4673-4680; Higgins et al.,
(1996) Meth. Enzymol. 266:383-402; Altschul et
al., (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;
Altschul et al., (1993) Nature Genetics
3:266-272). En una realización particularmente
preferida, las homologías de secuencia de proteína y ácido nucleico
se evalúan usando la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local
Básico ("BLAST"), que se conoce bien en la técnica (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul (1990) Proc Natl Acad Sci USA
Mar;87(6):2264-8; Altschul et al.,
1990,1993,1997, todos supra). En particular se usan cinco
programas BLAST específicos para realizar las siguientes tareas:
(1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de
aminoácidos con una base de datos de secuencia de proteína;
(2) BLASTN compara una secuencia problema de
nucleótidos con una base de datos de secuencia de nucleótidos;
(3) BLASTX compara los productos de traducción
conceptual de seis fases de una secuencia problema de nucleótidos
(ambas cadenas) con una base de datos de secuencia de proteína;
(4) TBLASTN compara una secuencia problema de
proteína con una base de datos de secuencia de nucleótidos traducida
en las seis fases de lectura (ambas cadenas); y
(5) TBLASTX compara las traducciones de seis
fases de una secuencia problema de nucleótidos con las traducciones
de seis fases de una base de datos de secuencia de nucleótidos.
Los programas BLAST identifican secuencias
homólogas identificando segmentos similares, a los que se hace
referencia en la presente memoria como "pares de segmentos de alta
puntuación", entre una secuencia problema de aminoácidos o de
ácido nucleico y una secuencia de ensayo que se obtiene
preferiblemente a partir de una base de datos de secuencias de
proteínas o ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de alta
puntuación se identifican preferiblemente (es decir, se alinean)
mediante una matriz de puntuación, muchas de las cuales se conocen
en la técnica. Preferiblemente, la matriz de puntuación usada es la
matriz BLOSUM62 (véase, Gonnet et al., (1992) Science Jun
5;256(5062):1443-5; Henikoff y Henikoff
(1993) Proteins Sep;17(1):49-61). Menos
preferiblemente también se pueden usar las matrices PAM o PAM250
(véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds, (1978) Matrices for
Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and
Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
Los programas BLAST evalúan el significado estadístico de todos los
pares de segmentos de alta puntuación identificados y seleccionan
preferiblemente los segmentos que satisfacen un umbral de
significado especificado por el usuario, tal como un porcentaje de
homología especificado por el usuario. Preferiblemente, el
significado estadístico de un par de segmentos de alta puntuación se
evalúa usando la fórmula de significado estadístico de Karlin
(véase, por ejemplo,Karlin y Altschul, (1990) Proc Natl Acad Sci
USA Mar;87(6):2264-8). Los programas BLAST se
pueden usar con los parámetros por defecto o con parámetros
modificados proporcionados por el usuario. Preferiblemente, los
parámetros son parámetros por defecto.
Un método preferido para determinar la mejor
coincidencia global entre una secuencia problema (una secuencia de
la presente invención) y una secuencia objeto, también denominada un
alineamiento de secuencias global, se puede determinar usando el
programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et
al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245. En un
alineamiento de secuencias, las secuencias desconocida y objeto son
secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento de
secuencia global está en porcentaje de identidad. Son parámetros
preferidos usados en un alineamiento de aminoácidos con FASTDB:
Matriz=PAM 0, k-tuple=2, Penalización por
Desacoplamiento=1, Penalización por Unión=20, Grupo de
Aleatorización=25 Longitud=0, Puntuación Límite=l, Tamaño de
Ventana=longitud de secuencia, Penalización por Hueco=5,
Penalización por Tamaño de Hueco=0,05, Tamaño de Ventana=247 o la
longitud de la secuencia de aminoácidos objeto, la que sea más
corta.
Si la secuencia objeto es más corta que la
secuencia problema debido a deleciones N- o
C-terminales, no debido a deleciones internas, los
resultados, en porcentaje de identidad, se tienen que corregir
manualmente debido a que el programa FASTDB no tiene en cuenta
truncamientos N- y C-terminales de la secuencia
objeto cuando calcula el porcentaje de identidad global. Para
secuencias objeto truncadas en los extremos N y C, con respecto a
la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige
calculando el número de restos de la secuencia problema que son N-
y C- terminales de la secuencia objeto, que no están
emparejados/alineados con un resto sujeto correspondiente, como un
porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Se
determina si un resto está emparejado/alineado por los resultados
del alineamiento de secuencia de FASTDB. Este porcentaje se resta
después del porcentaje de identidad, calculado por el anterior
programa FASTDB usando los parámetros especificados, para lograr
una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación de
porcentaje de identidad final es lo que se usa para los propósitos
de la presente invención. Solamente los restos de los extremos N y
C de la secuencia objeto que no están emparejados/alineados con la
secuencia problema se consideran para los propósitos de ajustar
manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir,
solamente los restos aminoacídicos problema fuera de los restos N- y
C-terminales más alejados de la secuencia objeto.
Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos aminoacídicos se
alinea con una secuencia problema de 100 restos para determinar el
porcentaje de identidad. La deleción tiene lugar en el extremo N de
la secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no se
empareja/alinea con los primeros restos en el extremo N. Los 10
restos no emparejados representan 10% de la secuencia (número de
restos en los extremos N y C no emparejados/número total de restos
en la secuencia problema) de forma que se resta 10% de la puntuación
de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los
90 restos restantes están perfectamente emparejados, el porcentaje
de identidad final sería 90%.
En otro ejemplo se compara una secuencia objeto
de 90 restos con una secuencia problema de 100 restos. Esta vez,
las deleciones son internas de forma que no hay restos en los
extremos N o C de la secuencia objeto que no están
emparejados/alineados con la secuencia problema. En este caso, el
porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige
manualmente. De nuevo solamente las posiciones de restos fuera de
los extremos N- y C-terminales de la secuencia
objeto, como se muestran en el alineamiento FASTDB, que no están
emparejados/alineados con la secuencia problema, se corrigen
manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los
propósitos de la presente invención.
Obsérvese, a lo largo de la descripción, que
cuando se discuten polipéptidos GSSP4, los fragmentos de GSSP4
están específicamente destinados a incluirse como un subconjunto
preferido de polipéptidos GSSP4. Los métodos de producción
específicos se abordan con detalle en las secciones III, IV, V y VI
de la presente memoria descriptiva.
En resumen, los polipéptidos GSSP4 se aíslan
preferiblemente a partir de muestras de tejido de mamífero,
preferiblemente muestras humanas, o se expresan a partir de genes
de mamífero, preferiblemente genes humanos, en células de mamífero,
preferiblemente células humanas. Los polipéptidos GSSP4 de la
invención se pueden producir usando métodos de expresión conocidos
en la técnica. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos
deseados de la invención, incluyendo fragmentos de los mismos, se
ligan en un vector de expresión adecuado para el hospedador
particular usado. Se pueden usar tanto sistemas de hospedador
eucariotas como procariotas para formar polipéptidos recombinantes.
Los polipéptidos se aíslan a partir de células lisadas o del medio
de cultivo y se purifican hasta el grado necesario para su uso
destinado. Además se pueden producir fragmentos de proteína más
cortos por síntesis química. La purificación es mediante técnicas
conocidas en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial,
fraccionamiento con sal, cromatografía, centrifugación y similares.
Los nucleótidos que comprenden la secuencia codificante de los
polinucleótidos de la invención, o fragmentos de los mismos, se
clonan en vectores de expresión por cualquier especialista en la
técnica. Los vectores de expresión preferidos incluyen vectores de
expresión eucariotas y procariotas. Se prefiere adicionalmente el
vector de expresión pGEX-3X. La purificación de
polipéptidos GSSP4 se puede facilitar por fusión recombinante de un
péptido heterólogo al extremo C o N de los polipéptidos GSSP4. Los
polipéptidos de fusión preferidos expresados incluyen polipéptidos
heterólogos que contienen un marcador His añadido al extremo C, un
marcador de glutatión-S-transferasa
(GST) y un sitio de digestión con proteasa factor Xa.
Un método preferido para preparar los
polipéptidos de la invención incluye un método que comprende las
siguientes etapas: se dejan crecer células de Escherichia
coli, preferiblemente BL21, y que comprenden preferiblemente el
vector pGEX-3X que contiene los polinucleótidos de
la invención que contienen un marcador His añadido al extremo C, un
marcador GST y un sitio de proteasa Xa, hasta la subconfluencia,
preferiblemente a una absorbancia de 0,8, y se inducen con
isopropil beta-D-tiogalactósido. Las
células se sedimentan, se lavan y se lisan en tampón,
preferiblemente en tampón que contiene hidrocloruro de guanidina. Se
deja que los polipéptidos se unan a níquel, preferiblemente perlas
que contienen Ni-NTA, y se lavan con tampones,
preferiblemente tampones que contienen urea. Los polipéptidos
unidos a níquel se equilibran con tampón, preferiblemente tampón que
contiene cloruro sódico y cloruro cálcico, preferiblemente a pH
7,5. Los polipéptidos unidos a níquel se digieren, es decir, se
tratan con tampón que comprende proteasa, preferiblemente proteasa
factor Xa. La digestión se realiza preferiblemente a temperatura
ambiente durante de 12 a 20 horas. El marcador GST escindido, si lo
hay, se elimina por lavado con tampón, preferiblemente tampón con
urea, preferiblemente a pH 5,9. Los polipéptidos de la invención se
eluyen con tampón, preferiblemente tampón con urea, preferiblemente
a pH 4,5. Los polipéptidos de la invención se repliegan,
preferiblemente mediante métodos que comprenden las siguientes
etapas: Los polipéptidos se diluyen en tampón común en la técnica,
preferiblemente hasta una concentración de 100 microgramos/ml,
preferiblemente en tampón que contiene urea a pH 4,5. Los
polipéptidos se dializan contra tampón, preferiblemente tampón de
diálisis que comprende urea 4 M, cisteína 5 mM,
Tween-20 al 0,02%, glicerol al 10%, Tris 10 mM,
cloruro sódico 150 mM y NaH2PO4 100 mM, preferiblemente a pH 8,3.
El tampón de diálisis que comprende urea 2 M se usa para sustituir
el tampón de diálisis inicial, y el tampón de diálisis se sustituye
al menos 1, 2 ó 3 veces durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 días. El
polipéptido replegado se desala mediante cualquier método conocido
en la técnica, preferiblemente usando una columna de filtración.
Los polipéptidos de la invención se purifican adicionalmente
mediante métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, los
polipéptidos se purifican por HPLC de fase inversa. Los
polipéptidos preferiblemente se eluyen con ácido trifluoroacético al
0,08% y un gradiente de acetonitrilo de 10-50%, y
la elución se controla preferiblemente a 206 nm. El acetonitrilo y
el ácido trifluoroacético se retiran para las composiciones que
comprenden el polipéptido purificado, preferiblemente por
evaporación por liofilización.
Se describen ejemplos adicionales de métodos
útiles para la expresión o purificación de polipéptidos de la
invención en Methods in Enzymology.
El ácido nucleico que codifica un fragmento de
GSSP4 se puede obtener por PCR a partir de un vector que contenga la
secuencia de nucleótidos de GSSP4 usando cebadores
oligonucleotídicos complementarios al ADNc de GSSP4 deseado y que
contenga secuencias de endonucleasa de restricción.
La transfección de un vector que expresa un
fragmento de GSSP4 en células NIH 3T3 de ratón es una realización
para introducir polinucleótidos en células hospedadoras. La
introducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido en
una célula hospedadora se puede realizar por transfección con
fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido
catiónico, electroporación, transducción, infección u otros
métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de
laboratorio convencionales, tales como Davis et al. ((1986)
Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc.,
Amsterdam). Se contempla específicamente que, de hecho, los
polipéptidos de la presente invención se pueden expresar por una
célula hospedadora que carezca de un vector recombinante.
Un polipéptido de esta invención (es decir, un
fragmento de GSSP4) se puede recuperar y purificar a partir de
cultivos celulares recombinantes por métodos bien conocidos
incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción
con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes,
cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción
hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de
hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Mucho más
preferiblemente se emplea cromatografía líquida de alta resolución
("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente
invención, y preferiblemente la forma secretada, también se pueden
recuperar a partir de: productos purificados de fuentes naturales,
incluyendo fluidos corporales, tejidos y células aislados
directamente o cultivados; productos de procedimientos sintéticos
químicos; y productos producidos por técnicas recombinantes a
partir de un hospedador procariota o eucariota, incluyendo, por
ejemplo, células bacterianas, de levadura, de planta superior, de
insecto y de mamífero.
Dependiendo del hospedador empleado en un
procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la
presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados.
Preferiblemente, los polipéptidos de la invención no están
glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también
pueden incluir un resto metionina modificado inicial, en algunos
casos como un resultado de procesos mediados por el hospedador.
Además de incluir células hospedadoras que
contienen las construcciones de vector que se discuten en la
presente memoria, la invención también incluye células hospedadoras
primarias, secundarias e inmortalizadas procedentes de vertebrado,
particularmente procedentes de mamífero que se han creado por
ingeniería genética para delecionar o sustituir material genético
endógeno (por ejemplo, secuencia codificante), y/o para incluir
material genético (por ejemplo, secuencias polinucleotídicas
heterólogas) que está asociado de forma funcional a los
polinucleótidos de la invención, y que activa, altera y/o amplifica
los polinucleótidos endógenos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas
conocidas en este campo para asociar de forma funcional regiones de
control heterólogas (por ejemplo, promotor y/o potenciador) y
secuencias polinucleotídicas endógenas por recombinación homóloga,
véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.641.670
presentada el 24 de junio de 1997; la Publicación Internacional Nº
WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; la Publicación
Internacional Nº WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994;
Keller et al, (1989) Proc Natl Acad Sci USA
Nov;86(22):8932-5; Koller et al.,
(1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov;
86(22):8927-31; y Zijlstra et al.
(1989) Nature Nov 23;342(6248):435-8;
incorporándose las descripciones de cada uno de estos textos como
referencia en su totalidad).
Además, los polipéptidos de la invención se
pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en este
campo (véase, por ejemplo,Creighton, 1983 Proteins. New York, New
York: W.H. Freeman and Company; y Hunkapiller et al, (1984)
Nature Jul 12-18;310(5973):
105-11). Por ejemplo, se puede sintetizar un
fragmento de la invención relativamente corto usando un
sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir
aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una
sustitución o adición en la secuencia del fragmento. Los
aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitación, los
D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido
2,4-diaminobutírico, ácido a-amino
isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido
2-amino butírico, g-Abu,
e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib,
ácido 2-amino isobutírico, ácido
3-amino propiónico, ornitina, norleucina,
norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina,
ácido cisteico, t-butilglicina,
t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina,
b-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño
tales como b-metil aminoácidos,
Ca-metil aminoácidos, Na-metil
aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, los
aminoácidos pueden ser D (dextrógiros) o L (levógiros).
La invención incluye fragmentos de polipéptidos
que se modifican de forma diferencial durante o después de la
traducción, por ejemplo, por glicosilación, acetilación,
fosforilación, amidación, derivatización por grupos
protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un
molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede
realizar cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante
técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión
química específica por bromuro de cianógeno, tripsina,
quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación,
formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia
de tunicamicina; etc.
Las modificaciones
post-traduccionales adicionales incluidas en la
invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidrato ligadas a
N o ligadas a O, procesamiento de extremos
N-terminal o C-terminal), unión de
restos químicos a la cadena principal del aminoácido,
modificaciones químicas de cadenas de carbohidrato ligadas a N o
ligadas a O y adición o deleción de un resto de metionina
N-terminal como resultado de la expresión en una
célula hospedadora procariota. Los fragmentos polipeptídicos también
pueden modificarse con un marcador detectable, tal como un marcador
de enzimático, fluorescente, isotónico o de afinidad para permitir
la detección y aislamiento del polipéptido.
La invención también proporciona derivados
modificados químicamente de los polipéptidos de la invención que
pueden proporcionar ventajas adicionales tales como una mayor
solubilidad, estabilidad y tiempo en circulación del polipéptido, o
menor inmunogenicidad. Véase la Patente de Estados Unidos Nº:
4.179.337. Los restos químicos para la modificación pueden
seleccionarse entre polímeros solubles en agua tales como
polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propileno,
copolímeros de glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol
polivinílico y similares. Los polipéptidos pueden modificarse en
posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones
predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos,
tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular y puede ser ramificado o no ramificado. En el caso del
polietilenglicol, el peso molecular preferido está comprendido
entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el
término "aproximadamente" que en las preparaciones de
polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y otras menos que
el peso molecular indicado) para facilitar la manipulación y
fabricación. Pueden usarse otros tamaños dependiendo del perfil
terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación
sostenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad
biológica, la facilidad de manipulación, el grado o ausencia de
antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol en una
proteína terapéutica o análogo).
Las moléculas de polietilenglicol (u otros
restos químicos) deben unirse al polipéptido teniendo en cuenta los
efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos del
polipéptido. Los especialistas en la técnica disponen de varios
métodos de unión, por ejemplo, por el documento EP 0 401 384,
incorporado en la presente memoria como referencia (acoplamiento de
PEG a G-CSF), véase también Malik et al.
(1992) Exp Hematol. Sep;20(8): 1028-35, que
presenta la pegilación de GM-CSF usando cloruro de
tresilo). Se prefiere para fines terapéuticos la unión a un grupo
amino, tal como la unión en el extremo N-terminal o
un grupo lisina.
Los fragmentos polipeptídicos de la invención
pueden estar en forma de monómeros o multímeros (es decir, dímeros,
triméros, tetrámeros y multímeros superiores). Por consiguiente, la
presente invención se refiere a monómeros y multímeros de los
fragmentos polipeptídicos de la invención, a su preparación y a
composiciones (preferiblemente composiciones farmacéuticas o
fisiológicamente aceptables) que los contienen. En realizaciones
específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros,
dímeros, trímeros o tetrámeros. En otras realizaciones, los
multímeros de la invención son al menos dímeros, al menos trímeros o
al menos tetrámeros.
Los multímeros incluidos en la invención pueden
ser homómeros o heterómeros. Como se usa en la presente memoria, el
término homómero se refiere a un multímero que contiene sólo
polipéptidos correspondientes a los polipéptidos GSSP4 de la
invención (incluyendo fragmentos de polipéptidos, variantes,
variantes de corte y empalme y proteínas de fusión correspondientes
a estos fragmentos polipeptídicos descritos en la presente memoria).
Estos homómeros pueden contener fragmentos polipeptídicos que
tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. En una
realización específica, un homómero de la invención es un multímero
que contiene sólo fragmentos polipeptídicos que tienen secuencias
de aminoácidos idénticas. En otra realización específica, un
homómero de la invención es un multímero que contiene fragmentos
polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos diferentes. En
realizaciones específicas, el multímero de la invención es un
homodímero (por ejemplo, que contiene fragmentos polipeptídicos que
tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes) o un
homotrímero (por ejemplo, que contiene fragmentos polipeptídicos
que tienen secuencias de aminoácidos idénticas y/o diferentes). En
otras realizaciones, el multímero homomérico de la invención es al
menos un homodímero, al menos un homotrímero o al menos un
homotetrámero.
Como se usa en la presente memoria, el término
heterómero se refiere a un multímero que contiene uno o más
polipéptidos heterólogos (es decir, que corresponden a diferentes
proteínas o fragmentos polipeptídicos de las mismas) además de los
polipéptidos de la invención. En una realización específica, el
multímero de la invención es un heterodímero, un heterotrímero o un
heterotetrámero. En otras realizaciones, el multímero heteromérico
de la invención es al menos un heterodímero, al menos un
heterotrímero o al menos un heterotetrámero.
Los multímeros de la invención pueden ser el
resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o
covalentes y/o pueden unirse indirectamente, por ejemplo, por medio
de la formación de liposomas. De esta manera, en una realización,
los multímeros de la invención, tales como, por ejemplo, homodímeros
o homotrímeros, se forman cuando entran en contacto entre sí en
solución polipéptidos de la invención. En otra realización, los
heteromultímeros de la invención, tales como, por ejemplo,
heterotrímeros o heterotetrámeros, se forman cuando polipéptidos de
la invención entran en contacto con anticuerpos contra los
polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos contra la
secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión de la
invención) en solución. En otras realizaciones, los multímeros de
la invención se forman por asociaciones covalentes con y/o entre
los polipéptidos de la invención. En estas asociaciones covalentes
pueden estar implicados uno o más restos aminoacídicos contenidos
en la secuencia polipeptídica (por ejemplo, la indicada en la lista
de secuencias, o contenida en el polipéptido codificado por un clon
depositado). En un caso, las asociaciones covalentes son
entrecruzamientos entre restos de cisteína localizados dentro de las
secuencias polipeptídicas, que interaccionan en el polipéptido
nativo (es decir, natural). En otro caso, las asociaciones
covalentes son la consecuencia de manipulación química o
recombinante. Como alternativa, en dichas asociaciones covalentes
pueden estar implicados uno o más restos aminoacídicos contenidos en
la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión de
la invención.
En un ejemplo, las asociaciones covalentes son
entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión
de la invención (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos
número 5.478.925). En un ejemplo específico, las asociaciones
covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en la
proteína de fusión Fc de la invención (como se describe en la
presente memoria). En otro ejemplo específico, las asociaciones
covalentes de proteínas de fusión de la invención son entre la
secuencia de polipéptido heterólogo de otra proteína que es capaz
de formar multímeros asociados covalentemente, tales como por
ejemplo osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la Publicación
Internacional Nº: WO 98/49305, cuyo contenido se incorpora en la
presente memoria como referencia en su totalidad). En otra
realización, dos o más polipéptidos de la invención se unen a
través de enlazadores peptídicos. Los ejemplos incluyen los
enlazadores peptídicos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº
5.073.627 (incorporada en la presente memoria como referencia).
Pueden producirse proteínas que comprenden múltiples polipéptidos
de la invención separados por enlazadores peptídicos usando la
tecnología de ADN recombinante convencional.
Otro método para preparar polipéptidos
multímeros de la invención implica el uso de polipéptidos de la
invención fusionados a una secuencia polipeptídica de cremallera de
leucina o de cremallera de isoleucina. Son ejemplos de dominios de
cremallera de leucina adecuados para producir proteínas multiméricas
solubles de la invención los descritos en la solicitud PCT WO
94/10308, incorporada en la presente memoria como referencia. Las
proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de
la invención fusionado con una secuencia polipeptídica que dimeriza
o trimeriza en solución se expresan en células hospedadoras
adecuadas, y la proteína de fusión multimérica soluble resultante
se recupera del sobrenadante de cultivo usando técnicas conocidas en
este campo.
Los polipéptidos triméricos de la invención
pueden ofrecer la ventaja de una mejor actividad biológica. Los
restos de cremallera de leucina y los restos de isoleucina
preferidos son los que forman preferiblemente trímeros. Un ejemplo
es una cremallera de leucina derivada de la proteína D surfactante
pulmonar (SPD), como se describe en Hoppe et al. FEBS
Letters (1994) 16 de
Mayo;344(2-3):191-5 y en la
solicitud de patente de Estados Unidos con Nº de Serie Nº
08/446.922, incorporada en la presente memoria como referencia. En
la preparación de polipéptidos triméricos de la invención pueden
emplearse otros péptidos derivados de proteínas triméricas
naturales. En otro ejemplo, las proteínas de la invención están
asociadas por interacciones entre Flag® y la secuencia polipeptídica
contenida en las proteínas de fusión de la invención que contienen
la secuencia polipeptídica Flag®. En otra realización, las
proteínas de la invención están asociadas por interacciones entre la
secuencia del polipéptido heterólogo contenida en proteínas de
fusión Flag® de la invención y un anticuerpo
anti-Flag®.
Los multímeros de la invención pueden generarse
usando técnicas químicas conocidas en este campo. Por ejemplo, los
polipéptidos que se desea que contengan los multímeros de la
invención pueden formar entrecruzamientos usando moléculas
enlazadoras y técnicas de optimización de la longitud de moléculas
enlazadoras conocidas en este campo (véase, por ejemplo, la Patente
de Estados Unidos Número 5.478.925, que se incorpora en la presente
memoria como referencia en su totalidad). Además, pueden generarse
multímeros de la invención usando técnicas conocidas en este campo
para formar uno o más entrecruzamientos intermoleculares entre los
restos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los
polipéptidos que se desea que contenga el multímero (véase, por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5.478.925, que se
incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad).
Además, los polipéptidos de la invención pueden modificarse
rutinariamente por medio de la adición de cisteína o biotina al
extremo C o al extremo N del polipéptido y pueden aplicarse técnicas
conocidas en este campo para generar multímeros que contengan uno o
más de estos polipéptidos modificados (véase, por ejemplo, la
Patente de Estados Unidos Número 5.478.925, que se incorpora en la
presente memoria como referencia en su totalidad). Además, pueden
aplicarse al menos 30 técnicas conocidas en este campo para generar
liposomas que contengan los componentes polipeptídicos que se desea
que estén contenidos en el multímero de la invención (véase, por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 5.478.925, que se
incorpora en la presente memoria como referencia en su
totalidad).
Como alternativa, los multímeros de la invención
pueden generarse usando técnicas de ingeniería genética conocidas
en este campo. En una realización, se producen polipéptidos
contenidos en multímeros de la invención de manera recombinante
usando la tecnología de proteínas de fusión descrita en la presente
memoria o conocida de otra manera en la técnica (véase, por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 5.478.925, que se
incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad).
En una realización específica, se generan polinucleótidos que
codifican un homodímero de la invención ligando una secuencia
polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención a una
secuencia que codifica un polipéptido enlazador y después también a
un polinucleótido sintético que codifica el producto traducido del
polipéptido en la orientación inversa desde el extremo C al extremo
N (sin la secuencia líder) (véase, por ejemplo, la Patente de
Estados Unidos Número 5.478.925, que se incorpora en la presente
memoria como referencia en su totalidad). En otra realización, se
aplican técnicas recombinantes descritas en la presente memoria o
conocidas de otra manera en la técnica para generar polipéptidos
recombinantes de la invención que contengan un dominio transmembrana
(o péptido hidrófobo o señal) y que puedan incorporarse por
técnicas de reconstitución de membranas en liposomas (véase,
por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 5.478.925, que se
incorpora en la presente memoria como referencia en su
totalidad).
Son polinucleótidos preferidos los que codifican
polipéptidos GSSP4 de la invención. Los polinucleótidos
recombinantes que codifican polipéptidos GSSP4 pueden usarse de
varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, la expresión de
los polipéptidos en células recombinantes para uso en ensayos de
selección de antagonistas y agonistas de su actividad, así como
para facilitar su purificación para uso de una diversidad de maneras
que incluyen, pero sin limitación, en ensayos de selección de
agonistas y antagonistas de su actividad, selecciones de diagnóstico
e inducción de anticuerpos, así como el tratamiento y/o prevención
de enfermedades y trastornos relacionados con el metabolismo y/o
para reducir la masa corporal.
La invención se refiere a los polinucleótidos
que codifican polipéptidos GSSP4 y fragmentos polipeptídicos
variantes de los mismos como se describe en la presente memoria.
Estos polinucleótidos pueden estar purificados, aislados y/o pueden
ser recombinantes. En todos los casos, los polinucleótidos GSSP4
deseados de la invención son los que codifican polipéptidos GSSP4
de la invención con actividad relacionada con el metabolismo como se
describe y analiza en la presente memoria.
Un fragmento polinucleotídico es un
polinucleótido que tiene una secuencia que es completamente igual
que parte, pero no todo el polipéptido GSSP4 de longitud completa o
la secuencia de nucleótidos del polipéptido GSSP4 especificado.
Estos fragmentos pueden ser "independientes", es decir, sin
formar parte o estar fusionados a otros polinucleótidos, o pueden
estar comprendidos dentro de otro polinucleótido no GSSP4
(heterólogo) del que constituye una parte o región. Sin embargo,
varios fragmentos de polinucleótidos GSSP4 pueden estar comprendidos
dentro de un solo polinucleótido.
Los polinucleótidos GSSP4 de la invención
comprenden desde 18 bases consecutivas hasta 18 bases consecutivas
menos que las secuencias polinucleotídicas de longitud completa que
codifican los polipéptidos GSSP4 intactos, por ejemplo, las
secuencias polinucleotídicas GSSP4 de la SEC ID Nº: 1 ó 2. En un
aspecto de esta realización, el polinucleótido comprende al menos
18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,
100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160,
165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225,
230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290,
295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355,
360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420,
425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485,
490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550,
555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615,
620, 625, 630, 635, 640, 645 ó 648 nucleótidos consecutivos de un
polinucleótido de la presente invención.
Además de los tamaños de ácido nucleico
preferidos indicados anteriormente, otros ácidos nucleicos
preferidos comprenden al menos 18 nucleótidos, en la presente
memoria "al menos 18" se define como cualquier número entero
comprendido entre 18 y el número entero que representa 18
nucleótidos menos que la posición de nucleótido más 3' del ADNc de
los polipéptidos GSSP4 indicado en la SEC ID Nº: 2, o en otras
partes de la presente memoria.
También se incluyen como polinucleótidos
preferidos de la presente invención fragmentos de ácido nucleico de
al menos 18 nucleótidos de longitud, como se ha descrito
anteriormente, que están especificados adicionalmente en términos
de su posición 5' y 3' indicada en la lista de secuencias presentada
más adelante. En el caso de las variantes alélicas y degeneradas y
otras variantes, la posición 1 se define como el nucleótido más 5'
de la ORF, es decir, el nucleótido "A" del codón de iniciación
(ATG), estando numerados los demás nucleótidos consecutivamente.
Por lo tanto, Cada combinación de una posición de nucleótido 5' y 3'
que puede ocupar un fragmento polinucleotídico de la invención, con
una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, en un
polinucleótido de polipéptido GSSP4 intacto de la presente
invención se incluye en la invención como una especie individual.
Los fragmentos polinucleótidos especificados por las posiciones 5' y
3' pueden preverse inmediatamente y, por lo tanto, no se indican
individualmente para no alargar innecesariamente la memoria
descriptiva.
Debe tenerse en cuenta que las especies
anteriores de fragmentos polinucleotídicos de la presente invención
pueden describirse alternativamente por la fórmula "x a y";
donde "x" equivale a la posición de nucleótido más 5' e
"y" equivale a la posición de nucleótido más 3' del
polinucleótido; y además donde "x" equivale a un número entero
comprendido entre 1 y el número de nucleótidos de la secuencia
polinucleotídica de la presente invención menos 18, y donde
"y" equivale a un número entero comprendido entre 19 y el
número de nucleótidos de la secuencia polinucleotídica de la
presente invención menos 18 nucleótidos; y donde "x" es un
número entero menor que "y" en al menos 18.
Los fragmentos de polinucleótidos GSSP4 de la
invención comprenden desde 18 bases consecutivas hasta la secuencia
polinucleotídica de longitud completa que codifica los fragmentos de
GSSP4 descritos en la Sección II de las Realizaciones Preferidas de
la Invención. En un aspecto de esta realización, el polinucleótido
comprende al menos 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,
75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140,
145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205,
210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270,
275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 25, 30, 35, 40,
345, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 390, 95, 400, 05, 10, 15, 20,
25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 500,
05, 510, 515, 520, 25, 30, 35, 40, 545, 50, 55, 560, 65, 570, 75,
80, 85, 90, 95, 600, 605, 610, 15, 620, 25, 630, 635, 640, 645, 50,
655, 660, 665, 70, 75, 80, 85, 690, 95, 700, 705, 10, 15, 720, 25,
40, 70, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500,
1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100 ó 2200 nucleótidos consecutivos
de un polinucleótido de la presente invención.
Además de los tamaños de ácido nucleico
preferidos indicados anteriormente, otros ácidos nucleicos
preferidos comprenden al menos 18 nucleótidos, donde "al menos
18" se define como cualquier número entero comprendido entre 18
y el número entero correspondiente a la posición de nucleótido más
3' del ADNc de un fragmento de GSSP4 en la presente memoria.
También se incluyen como polinucleótidos
preferidos de la presente invención fragmentos de ácido nucleico de
al menos 18 nucleótidos de longitud, como se ha descrito
anteriormente, que están especificados adicionalmente en términos
de su posición 5' y 3'. Las posiciones 5' y 3' se representan por
los números de posición indicados en la lista de secuencias
presentada más adelante. En el caso de las variantes alélicas y
degeneradas y otras variantes, la posición 1 se define como el
nucleótido más 5' de la fase de lectura abierta (ORF, por sus siglas
en inglés), es decir, el nucleótido "A" del codón de
iniciación (ATG), estando numerados los demás nucleótidos
consecutivamente. Por lo tanto, cada combinación de una posición de
nucleótido 5' y 3' que puede ocupar un fragmento polinucleotídico
de la invención, con una longitud de al menos 18 nucleótidos
contiguos, en un fragmento de polinucleótido GSSP4 de la presente
invención se incluye en la invención como una especie individual.
Los fragmentos polinucleótidos especificados por las posiciones 5'
y 3' pueden preverse inmediatamente y, por lo tanto, no se indican
individualmente para no alargar innecesariamente la memoria
descriptiva.
Debe tenerse en cuenta que las especies
anteriores de fragmentos polinucleotídicos de la presente invención
pueden describirse alternativamente por la fórmula "x a y";
donde "x" equivale a la posición de nucleótido más 5' e
"y" equivale a la posición de nucleótido más 3' del
polinucleótido; y además donde "x" equivale a un número entero
comprendido entre 1 y en número de nucleótidos de las secuencias
polinucleotídicas de GSSP4 de la presente invención menos 18, y
donde "y" equivale a un número entero comprendido entre 9 y el
número de nucleótidos de las secuencias polinucleotídicas de GSSP4
de la presente invención; y donde "x" es un número entero
menor que "y" en al menos 18. Todas las combinaciones de
posiciones "x" e "y" se incluyen como realizaciones
específicas de la invención. Además, la fórmula "x" a "y"
puede modificarse como "'x1-x2" a
"y1-y2'", donde "x1-x2" e
"y1-y2" representan intervalos de posiciones
seleccionados entre dos posiciones de nucleótidos cualesquiera de
la lista de secuencias. Otras fórmulas alternativas incluyen
'"x1-x2" a "y"' y "'x" a
"y1-y2'".
Estas realizaciones específicas y otras
realizaciones de fragmentos polinucleotídicos descritas en la
presente memoria pueden modificarse para tener un tamaño "de al
menos", "igual a", "igual o menor que", "menor
que", "de al menos ___ pero no mayor de ___" o "de ___ a
___" un tamaño especificado o posiciones 5' y/o 3'
especificadas.
La presente invención también proporciona la
exclusión de cualquier especie de fragmento polinucleotídico de la
presente invención especificado por posiciones 5' y 3' o
polinucleótido especificado por tamaño de nucleótidos como se ha
descrito anteriormente. Puede excluirse cualquier número de
fragmentos especificados por posiciones 5' y 3' o por tamaño de
nucleótidos, como se ha descrito anteriormente.
En otras realizaciones preferidas, se prevén
variantes de polinucleótidos GSSP4 que codifican polipéptidos
GSSP4. Las variantes de polinucleótidos, como se usa este término en
la presente memoria, son polinucleótidos cuya secuencia difiere de
un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido
puede ser una variante natural tal como una variante alélica
natural, o puede ser una variante que no se considera natural.
Estas variantes no naturales del polinucleótido pueden obtenerse por
técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a
polinucleótidos, células u organismos. En general, las diferencias
son limitadas, de manera que las secuencias de nucleótidos de la
referencia y de la variante son muy similares en general y, en
muchas regiones, idénticas.
También se prevén específicamente variantes de
polinucleótidos que comprenden una secuencia sustancialmente
diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la
degeneración del código genético, codifican polipéptidos GSSP4 de
la presente invención. También sería rutinario para un especialista
en la técnica generar las variantes degeneradas descritas
anteriormente, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones
para un hospedador particular (por ejemplo, cambio de codones en el
ARNm humano por los preferidos en células hospedadoras de otro
mamífero o bacterianas).
Como se ha indicado anteriormente, las variantes
de polinucleótidos pueden ser naturales, tales como una variante
alélica natural, o pueden obtenerse por métodos recombinantes. Por
"variante alélica" se entiende una de varias formas
alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un
organismo (véase, por ejemplo, B. Lewin, (1990) Genes IV, Oxford
University Press, New York). Las variantes no naturales se pueden
producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en este campo.
Estas variantes de ácido nucleico incluyen las producidas por
sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las
sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar a uno o más
nucleótidos. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden
producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos
conservativas o no conservativas. Entre éstas se prefieren
especialmente las sustituciones, deleciones y adiciones
silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de los
polipéptidos GSSP4 de la invención. También se prefieren en relación
con esto las sustituciones conservativas.
Los cambios de nucleótidos presentes en una
variante de polinucleótido son preferiblemente silenciosos, lo cual
significa que no alteran los aminoácidos codificados por el
polinucleótido. Sin embargo, los cambios de nucleótidos también
pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones,
fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado
por la secuencia de referencia.
En los casos en los que las sustituciones de
nucleótidos ocasionan cambios en uno o más aminoácidos, los
polipéptidos GSSP4 preferidos incluyen los que retienen una o más
de las actividades relacionadas con el metabolismo descritas en la
Sección I de las realizaciones Preferidas de la Invención.
Por "retienen las mismas actividades" se
entiende que la actividad medida usando el polipéptido codificado
por la variante de polinucleótido GSSP4 en ensayos es al menos 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, y no más de 101%,
102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115%, 120% o 125% de la actividad
medida usando un polipéptido GSSP4 descrito en la Sección de
Ejemplos en la presente memoria.
Por actividad "aumentada" se entiende que
la actividad medida usando el polipéptido codificado por la variante
de polinucleótido GSSP4 en ensayos es al menos 125%, 130%, 135%,
140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%,
275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450% o 500% de la actividad
medida usando un polipéptido GSSP4 descrito en la Sección de
Ejemplos en la presente memoria.
Por actividad "disminuida" se entiende que
la actividad medida usando el polipéptido codificado por la variante
de polinucleótido GSSP4 en ensayos está reducida en al menos 25%,
30%, 35%, 40%, 45%, o 50% con respecto a la actividad medida usando
un polipéptido GSSP4 descrito en la Sección de Ejemplos en la
presente memoria.
La presente invención se refiere además a
moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias con una identidad
de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con
las secuencias polinucleotídicas de la SEC ID Nº: 1 ó 2 o
fragmentos de las mismas que codifican un polipéptido con actividad
relacionada con el metabolismo como se describe en la Sección I de
las Realizaciones Preferidas de la Invención. Por supuesto, debido a
la degeneración del código genético, un especialista habitual en la
técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las
moléculas de ácido nucleico con una identidad de al menos 50%, 60%,
70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las secuencias de ácido
nucleico mostradas en la SEC ID Nº:1 ó 2 o fragmentos de las mismas
codificarán un polipéptido con actividad biológica. De hecho, como
todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos
codifican el mismo polipéptido, esto será evidente para el
especialista en la técnica incluso sin realizar el ensayo de
comparación descrito anteriormente. También se reconocerá en la
técnica que, para las moléculas de ácido nucleico que no son
variantes degeneradas, un número razonable también codificarán un
polipéptido con actividad biológica. Esto se debe a que el
especialista en la técnica es completamente consciente de las
sustituciones de aminoácidos con menos probabilidad o sin
probabilidad de afectar significativamente a la función de la
proteína (por ejemplo, el reemplazo de un aminoácido alifático por
otro aminoácido alifático), como se ha descrito adicionalmente con
anterioridad en la Sección I de las realizaciones Preferidas de la
Invención.
Por un polinucleótido que tiene una
"identidad" de secuencia de nucleótidos de al menos, por
ejemplo, 95% con una secuencia de referencia de la presente
invención, se entiende que la secuencia de nucleótidos del
polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia con la
excepción de que la secuencia del polinucleótido puede incluir
hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la
secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido
GSSP4. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene
una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 95% con
respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de
los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden delecionarse,
insertarse o sustituirse por otro nucleótido. La secuencia problema
puede ser una secuencia entera o cualquier fragmento especificado
como se describe en la presente memoria.
Los métodos para determinar y definir si
cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular tiene
una identidad de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98% o 99% con una secuencia de nucleótidos de la presente invención
se pueden llevar a cabo usando programas informáticos conocidos. Un
método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre
una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y
una secuencia objeto, también denominada un alineamiento de
secuencia global, se puede determinar usando el programa de
ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al.,
((1990) Comput Appl Biosci. Jul;6(3):237-45).
En un alineamiento de secuencia, las secuencias problema y objeto
son secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse
convirtiendo primero las U en T. El resultado de dicho alineamiento
de secuencia global está en porcentaje de identidad. Los parámetros
preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN
para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria,
k-tuple=4, Penalización de Desacoplamiento=1,
Penalización de Unión=30, Longitud de Grupo de Aleatorización=0,
Puntuación Límite=1, Penalización de Hueco=5, Penalización de
Tamaño de Hueco 0,05, Tamaño de Ventana=500 o la longitud de la
secuencia de nucleótidos objeto, lo que sea menor.
Si la secuencia objeto es más corta que la
secuencia problema debido a deleciones 5' o 3', no debido a
deleciones internas, debe realizarse una corrección manual en los
resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en
cuenta los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objeto cuando
calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias objeto
truncadas en los extremos 5' o 3' con respecto a la secuencia
problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el
número de bases de la secuencia problema que están en posición 5' y
3' con respecto a la secuencia objeto, que no están
emparejadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de
la secuencia problema. Se determina si un nucleótido está
emparejado/alineado por los resultados del alineamiento de
secuencia de FASTDB. Este porcentaje se resta después del porcentaje
de identidad, calculado por el anterior programa FASTDB usando los
parámetros especificados, para lograr una puntuación de porcentaje
de identidad final. Esta puntuación corregida es lo que se usa para
los propósitos de la presente invención. Para ajustar manualmente
la puntuación del porcentaje de identidad sólo se calculan los
nucleótidos fuera de los nucleótidos 5' y 3' de la secuencia
objeto, como se representa por el programa FASTDB, que no están
emparejados/alineados con la secuencia problema. No se realizan
otras correcciones manuales para los propósitos de la presente
invención.
También se incluyen en la presente invención
polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente
invención que están fusionados en fase a las secuencias codificantes
de secuencias de aminoácidos heterólogas adicionales. También se
incluyen en la presente invención ácidos nucleicos que codifican
polipéptidos de la presente invención junto con otras secuencias no
codificantes incluyendo, por ejemplo, sin limitación, secuencias no
codificantes 5' y 3', secuencias de vectores, o secuencias usadas
para la purificación, sondeo o cebado. Por ejemplo, las secuencias
heterólogas incluyen secuencias transcritas no traducidas que pueden
participar en la transcripción y procesamiento del ARNm, por
ejemplo, unión a ribosomas y estabilidad del ARNm. Las secuencias
heterólogas, como alternativa, pueden comprender secuencias
codificantes adicionales que proporcionan funcionalidades
adicionales. De esta manera, una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido puede fusionarse a una secuencia marcadora,
tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la
purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones
preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de
aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina,
tal como el marcador proporcionado en el vector pQE (QIAGEN, Inc.,
9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, de los que
muchos están disponibles en el mercado. Por ejemplo, la
hexa-histidina permite la purificación conveniente
de la proteína de fusión (véase Gentz et al., (1989) Proc
Natl Acad Sci USA Feb;86(3):821-4). El
marcador "HA" es otro péptido útil para la purificación que
corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del
virus de la gripe (véase Wilson et al., (1984) Cell
37(3):767-78). Como se ha descrito
anteriormente, otra de estas proteínas de fusión incluye ADNc del
fragmento de GSSP4 fusionado a Fc en el extremo N o C.
El término "vector" se usa en la presente
memoria para designar una molécula de ADN o ARN circular o linear,
que es bicatenaria o monocatenaria, y que comprende al menos un
polinucleótido de interés que se pretende transferir a una célula
hospedadora o a un organismo hospedador unicelular o
multicelular.
La presente invención se refiere a vectores
recombinantes que comprenden uno cualquiera de los polinucleótidos
descritos en la presente memoria.
La presente invención incluye una familia de
vectores recombinantes que comprenden polinucleótidos que codifican
polipéptidos GSSP4 de la invención.
En una primera realización preferida, se usa un
vector recombinante de la invención para amplificar el
polinucleótido insertado en una célula hospedadora adecuada,
amplificándose este polinucleótido cada vez que se replica el
vector recombinante. El polinucleótido insertado puede ser uno que
codifica polipéptidos GSSP4 de la invención.
Una segunda realización preferida de los
vectores recombinantes de acuerdo con la invención consiste en
vectores de expresión que comprenden polinucleótidos que codifican
polipéptidos GSSP4 de la invención. Dentro de ciertas
realizaciones, se emplean vectores de expresión para expresar un
polipéptido GSSP4 de la invención, preferiblemente un fragmento de
GSSP4 modificado descrito en la presente invención, que después
puede purificarse y, por ejemplo, usarse como tratamiento de
enfermedades metabólicas o simplemente para reducir la masa corporal
de individuos.
La expresión requiere que en los vectores se
proporcionen las señales apropiadas, incluyendo dichas señales
diversos elementos reguladores tales como potenciadores/promotores
tanto de fuentes virales como procedentes de mamífero, que dirigen
la expresión de los genes de interés en las células hospedadoras. En
los vectores de expresión de la invención generalmente se incluyen
marcadores de selección de fármacos dominantes para establecer
clones celulares permanentes y estables que expresan los productos,
ya que son elementos que asocian la expresión de los marcadores de
selección de fármacos con la expresión del polipéptido.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que
codifican un polipéptido GSSP4 de la invención, o un fragmento de
GSSP4 modificado como se describe en la presente memoria, o
variantes o fragmentos de los mismos, bajo el control de una
secuencia reguladora seleccionada entre polipéptidos GSSP4, o como
alternativa bajo el control de una secuencia reguladora exógena.
Por consiguiente, los vectores de expresión
preferidos de la invención se seleccionan entre el grupo consistente
en: (a) una secuencia reguladora de fragmentos de GSSP4 y que
dirige la expresión de un polinucleótido codificante unido
operativamente al mismo; y (b) una secuencia codificante de un
fragmento de GSSP4 de la invención, unida operativamente a
secuencias reguladoras que permiten su expresión en una célula
hospedadora y/u organismo hospedador adecuado.
Algunos de los elementos que pueden encontrarse
en los vectores de la presente invención se describen con más
detalle en las siguientes secciones.
Un vector recombinante de acuerdo con la
invención comprende, pero sin limitación, un YAC (cromosoma
artificial de levadura, por sus siglas en inglés), un BAC
(cromosoma artificial bacteriano, por sus siglas en inglés), un
fago, un fagémido, un cósmido, un plásmido o incluso una molécula de
ADN lineal que puede consistir en un ADN cromosómico, no
cromosómico, semisintético o sintético. Dicho vector recombinante
puede comprender una unidad transcripcional que comprende un
conjunto de:
(1) un elemento o elementos genéticos que tienen
un papel regulador en la expresión de genes, por ejemplo promotores
o potenciadores. Los potenciadores son elementos de actuación en cis
de ADN, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud que
actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción;
(2) una secuencia estructural o codificante que
se transcribe en ARNm y finalmente se traduce en un polipéptido,
estando unida dicha secuencia estructural o codificante a los
elementos reguladores descritos en (1); y
(3) secuencias apropiadas de inicio y
terminación de la transcripción. Las unidades estructurales
destinadas al uso en sistemas de expresión de levadura o eucariotas
preferiblemente incluyen una secuencia líder que permite la
secreción extracelular de la proteína traducida por una célula
hospedadora. Como alternativa, cuando una proteína recombinante se
expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un
resto N-terminal. Este resto después puede
escindirse o no de la proteína recombinante expresada para
proporcionar un producto final.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación, marcadores de
selección que permiten la transformación de la célula hospedadora y
un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la
transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. La
secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada
con secuencias de inicio y terminación de la traducción, y
preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción
de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio
extracelular. En una realización específica donde el vector está
adaptado para transferir y expresar secuencias deseadas en células
hospedadoras de mamífero, los vectores preferidos comprenderán un
origen de replicación en el hospedador deseado, un promotor y
potenciador adecuado y también cualquier sitio de unión a ribosomas
necesario, sitio de poliadenilación, sitio donador de aceptor de
corte y empalme, secuencias terminadoras de la transcripción y
secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Pueden usarse secuencias
de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo el origen,
promotor temprano, potenciador, sitios de corte y empalme y de
poliadenilación de SV40 para proporcionar los elementos genéticos no
transcritos necesarios.
Las regiones promotoras adecuadas usadas en los
vectores de expresión de la presente invención se eligen teniendo
en cuenta la célula hospedadora en la que se expresa en gen
heterólogo. El promotor particular empleado para controlar la
expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no se
considera importante, siempre que sea capaz de dirigir la expresión
del ácido nucleico en la célula diana. De esta manera, cuando el
objetivo es una célula humana, es preferible poner la región
codificante del ácido nucleico adyacente y bajo el control de un
promotor que pueda expresarse en una célula humana tal como, por
ejemplo, un promotor humano o viral.
Un promotor adecuado puede ser heterólogo con
respecto al ácido nucleico para el que controla la expresión o,
como alternativa, puede ser endógeno para el polinucleótido nativo
que contiene la secuencia codificante a expresar. Además, el
promotor generalmente es heterólogo con respecto a las secuencias de
vector recombinante dentro de las cuales se ha insertado la
secuencia promotora/codificante de la construcción.
Las regiones promotoras pueden seleccionarse
entre cualquier gen deseado usando, por ejemplo, vectores CAT
(cloranfenicol acetiltransferasa) y, más preferiblemente vectores
pKK232-8 y pCM7. Son promotores bacterianos
preferidos los promotores Lad, LacZ, los promotores de la ARN
polimerasa del bacteriófago T3 o T7, los promotores gpt, lambda PR,
PL y trp (documento EP 0036776), el promotor de la polihedrina, o el
promotor de la proteína p10 de baculovirus (Kit Novagen) (Smith
et al., (1983) Mol Cell Biol Dec;
3(12):2156-65; O'Reilly et al.,
(1992), el promotor lambda PR o también el promotor trc.
Los promotores eucariotas incluyen el promotor
temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV,
los promotores temprano y tardío de SV40, los LTR de retrovirus y la
metalotioneína-L de ratón. Además, pueden elegirse
promotores específicos para un tipo celular particular, tales como
los que facilitan la expresión en tejido adiposo, tejido muscular o
hígado. La selección de un vector y promotor conveniente está bien
dentro de la capacidad de un especialista habitual en la
técnica.
La elección de un promotor está bien dentro de
la capacidad de un especialista en el campo de la ingeniería
genética. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Sambrook et
al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3 (1989), o también a los
procedimientos descritos por Fuller et al. (1996) Immunology
in Current Protocols in Molecular Biology.
Cuando se emplea un inserto de ADNc, típicamente
se deseará incluir una señal de poliadenilación para lograr una
poliadenilación apropiada del transcrito del gen. No se cree que la
naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la
práctica con éxito de la invención y puede emplearse cualquier
secuencia de este tipo, tal como las señales de poliadenilación de
la hormona de crecimiento humana y de SV40. También se contempla
como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos
elementos pueden servir para aumentar los niveles de mensajero y
minimizar la lectura de otras secuencias desde el casete.
Estos marcadores conferirían un cambio
identificable a la célula que permitiría la fácil identificación de
las células que contienen la construcción de expresión. Los genes
marcadores de selección para la selección de células hospedadoras
transformadas son, preferiblemente, la dihidrofolato reductasa o la
resistencia a neomicina para cultivos de células eucariotas, TRP1
para S. cerevisiae o resistencia a tetraciclina, rifampicina o
ampicilina en E. coli, o levano sacarasa para micobacterias,
siendo este último marcador un marcador de selección negativo.
Como un ejemplo representativo pero no
limitante, los vectores de expresión útiles para uso en bacterias
pueden comprender un marcador de selección y un origen de
replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles en el
mercado que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017).
Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo,
pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), y pGEM1
(Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos).
Se conocen gran cantidad de otros vectores
adecuados por los especialistas en la técnica y están disponibles
en el mercado, tal como los siguientes vectores bacterianos: pQE70,
pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript,
psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A
(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO,
pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL
(Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).
Un vector adecuado para la expresión de
polipéptidos de la invención es un vector de baculovirus que puede
propagarse en células de insecto y en líneas de células de insecto.
Un sistema de vector hospedador adecuado específico es el vector de
transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa
para transfectar la línea celular SF9 (ATCC NºCRL 1711) que procede
de Spodoptera frugiperda.
Otros vectores adecuados para la expresión de
polipéptidos GSSP4 en un sistema de expresión de baculovirus
incluyen los descritos en Chai et al. (1993. Biotechnol Appl
Biochem. Dic.;18 (Pt 3):259-73); Vlasak et
al. (1983. Eur J Biochem Sep
1;135(l):123-6); y Lenhard et al.
(1996; Gene, 9 Mar; 169(2):187-90).
En una realización específica, el vector procede
de un adenovirus. Son vectores de adenovirus preferidos de acuerdo
con la invención los descritos por Feldman y Steg (1996; Semin
Interv Cardiol Sep; 1 (3):203-8) o Ohno et
al. (1994; Science, 5 Agosto; 265 (5173):
781-4). Otro adenovirus recombinante preferido de
acuerdo con esta realización específica de la presente invención es
el adenovirus humano de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de
origen animal (solicitud de patente francesa Nº
FR-93.05954).
Generalmente, se entiende que los vectores de
retrovirus y vectores de virus adenoasociados son sistemas de
administración de genes recombinantes de elección para la
transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo,
particularmente a mamíferos, incluyendo seres humanos. Estos
vectores proporcionan una administración eficaz de genes en
células, y los ácidos nucleicos transferidos se integran de forma
estable en el ADN cromosómico del hospedador.
Los retrovirus particularmente preferidos para
la preparación o construcción de vehículos retrovirales de
administración de genes in vitro o in vivo de la
presente invención incluyen retrovirus seleccionados del grupo
constituido por virus inductores de focos en células del visón,
virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus
del sarcoma de Rous. Los virus de la leucemia murina particularmente
preferidos incluyen los virus 4070A y 1504A, Abelson (ATCC Nº
VR-999), Friend (ATCC Nº VR-245),
Gross (ATCC Nº VR-590), Rauscher (ATCC Nº
VR-998) y el virus de la leucemia murina de Moloney
(ATCC Nº VR-190; Solicitud PCT Nº WO 94/24298). Los
virus del sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen el de
Bryan de alto título (ATCC Nº VR-334,
VR-657, VR-726,
VR-659 y VR-728). Otros vectores
retrovirales preferidos son los que se describen en Roth et
al. (1996), Solicitud PCT Nº WO 93/25234, Solicitud PCT Nº WO
94/ 06920, Roux et al, ((1989) Proc Natl Acad Sci U S A Dic;
86 (23): 9079-83), Man et al., (1992) J. Gen.
Virol. 3: 3251-3255 y Neda et al., ((1991) J
Biol Chem 5 agosto; 266 (22):
14143-6).
14143-6).
Otro sistema de vector viral más que se
contempla en la invención consiste en el virus adenoasociado (AAV).
El virus adenoasociado es un virus defectuoso de origen natural que
requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpesvirus, como
un virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo vital
productivo (Muzyczka et al., (1992) Curr Top Microbiol
Immunol; 158: 97-129). También es uno de los pocos
virus que puede integrar su ADN en células que no estén en división
y presenta una alta frecuencia de integración estable (Flotte et
al., (1992) Am J Respir Cell Mol Biol Sep; 7 (3):
349-56; Samulski et al., (1989) J Virol Sep;
63 (9): 3822-S; McLaughlin et al., (1989)
Am. J. Hum. Genet. 59:561-569). Una característica
ventajosa de los AAV proviene de su reducida eficacia para
transducir células primarias con respecto a células
transformadas.
Para lograr la expresión de los polinucleótidos
de la invención, estas construcciones deben administrarse a una
célula. Esta administración puede realizarse in vitro, como
en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas
celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento
de ciertas patologías.
Un mecanismo es la infección viral, en la que la
construcción de expresión está encapsulada en una partícula viral
infecciosa.
También se contemplan en la presente invención
varios métodos no virales para la transferencia de polinucleótidos
en células de mamífero cultivadas, e incluyen, sin limitación,
precipitación con fosfato cálcico (Graham et al., (1973)
Virology, Aug; 54 (2): 536-9; Chen et al.,
(1987) Mol Cell Biol, Aug; 7 (8): 2745-52),
DEAE-dextrano (Gopal, (1985) Mol Cell Biol, May; 5
(5): 1188-90), electroporación
(Tur-Kaspa et al., (1986) Mol Cell Biol,
Feb; 6 (2): 716-8; Potter et al, (1984) Proc
Natl Acad Sci USA, Nov.; 81 (22): 7161-5.),
microinyección directa (Harland et al., (1985) J Cell Biol,
Sep.; 101 (3): 1094-9), liposomas cargados con ADN
(Nicolau et al., (1982) Biochim Biophys Acta, Oct 11; 721
(2): 185-90; Fraley et al., (1979) Proc Natl
Acad Sci USA M; 76 (7): 3348-52) y transfección
mediada por receptor (Wu y Wu, (1987) J Biol Chem Apr 5; 262 (10):
4429-32; Wu y Wu (1988) Biochemistry, Feb 9; 27
(3): 887-92). Algunas de estas técnicas pueden
adaptarse con éxito para el uso in vivo o ex vivo.
Una vez que el polinucleótido de expresión se ha
administrado a la célula, puede integrarse de forma estable en el
genoma de la célula receptora. Esta integración puede ser en la
localización y orientación afín mediante recombinación homóloga
(reemplazo génico) o puede integrarse en una localización
inespecífica aleatoria (aumento génico). En otras realizaciones
más, el ácido nucleico puede mantenerse de forma estable en la
célula como un segmento de ADN episomal separado. Dichos segmentos
de ácidos nucleicos o "episomas" codifican las secuencias
suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación
independiente de o en sincronización con el ciclo de la célula
hospedadora.
Una realización específica para un método para
administrar una proteína o péptido en el interior de una célula de
un vertebrado in vivo comprende la etapa de introducir una
preparación que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y
un polinucleótido desnudo que codifique operativamente el
polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que
comprende la célula, por el cual el polinucleótido desnudo se capta
hacia el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto
es particularmente aplicable para la transferencia in vitro
pero puede aplicarse también in vivo.
Se describen composiciones para usar in
vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido
"desnudo" en la solicitud PCT Nº WO 90/11092 (Vical Inc.) y
también en la solicitud PCT Nº WO 95/11307 (Institut Pasteur,
INSERM, Universidad de Ottawa), así como en los artículos de Tascon
et al. (1996) Nature Medicine. 2 (8): 888-892
y de Huygen et al. ((1996) Nat Med, Aug 2; 2 (8):
893-8).
En otra realización más de la invención, la
transferencia de un polinucleótido desnudo de la invención,
incluyendo una construcción polinucleotídica de la invención, al
interior de células, puede realizarse con un bombardeo de
partículas (biolística), siendo dichas partículas microproyectiles
recubiertos de ADN acelerados hasta una velocidad elevada, que
permite que perforen las membranas celulares y entren en las células
sin destruirlas, tal como se describe en Klein et al. ((1990)
Curr Genet Feb; 17 (2): 97-103).
En una realización más, el polinucleótido de la
invención puede encerrarse en un liposoma (Ghosh y Bacchawat,
(1991) Targeted Diagn Ther;4: 87-103; Wong et
al., (1980) Gene 10: 87-94; Nicolau et
al., (1987) Methods Enzymol.; 149:157-76).
Estos liposomas pueden dirigirse además a células que expresen LSR
mediante la incorporación de leptina, triglicéridos, ACRP30 u otros
ligandos de LSR conocidos en la membrana del liposoma.
\newpage
En una realización específica, la invención
proporciona una composición para la producción in vivo de un
polipéptido GSSP4 descrito en la presente memoria. Comprende un
polinucleótido desnudo que codifica operativamente este
polipéptido, en solución en un vehículo fisiológicamente aceptable y
adecuado para la introducción en un tejido para provocar que las
células del tejido expresen dicho polipéptido.
La cantidad de vector que se inyecta en el
organismo hospedador deseado varía de acuerdo con el lugar de
inyección. Como una dosis indicativa, se inyectarán entre 0,1 y 100
\mug del vector en el cuerpo de un animal, preferiblemente en el
cuerpo de un mamífero, por ejemplo, el cuerpo de un ratón.
En otra realización del vector de acuerdo con la
invención, puede producirse in vitro en una célula
hospedadora, preferiblemente en una célula hospedadora recogida
previamente del animal que se va a tratar y, más preferiblemente,
una célula somática tal como una célula muscular. En una etapa
posterior, la célula que se ha transformado con el vector que
codifica los polipéptidos GSSP4 deseados o o el fragmento deseado de
los mismos se reintroduce en el cuerpo del animal para administrar
la proteína recombinante dentro del cuerpo por vía local o
sistémica.
En la presente memoria se describen células
hospedadoras recombinantes, por ejemplo, que se han transformado o
transfectado con uno de los polinucleótidos descritos en la presente
memoria y, más en concreto, con un polinucleótido que comprende un
polinucleótido que codifica un polipéptido GSSP4 de la invención,
tal como cualquiera de los que se describen en la sección
"Polinucleótidos de la invención". Estos polinucleótidos
pueden estar presentes en células como resultado de una transfección
estable o transitoria. Las células hospedadoras pueden
transformarse (células procariotas) o transfectarse (células
eucariotas) con un vector recombinante tal como uno cualquiera de
los que se describen en la sección "Vectores recombinantes de la
invención".
Generalmente, una célula hospedadora
recombinante comprende al menos uno de los polinucleótidos o de los
vectores recombinantes que se describen en la presente memoria.
Son células hospedadoras preferidas usadas como
receptoras de vectores recombinantes las siguientes:
a) Células hospedadoras procariotas: cepas de
Escherichia coli (por ejemplo, cepa
DH5-\alpha), Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium y cepas de especies como Pseudomonas,
Streptomyces y Staphylococcus y
b) Células hospedadoras eucariotas: células HeLa
(ATCC NºCCL2; NºCCL2.1; NºCCL2.2), células Cv 1 (ATCC NºCCL70),
células COS (ATCC NºCRL1650; NºCRL1651), células
Sf-9 (ATCC NºCRL1711), células C127 (ATCC Nº
CRL-1804), 3T3 (ATCC Nº CRL-6361),
CHO (ATCC Nº CCL-61), de riñon humano 293 (ATCC Nº
45504; Nº CRL-1573), BHK (ECACC W 84100501;
Nº 84111301), células PLC, HepG2 y Hep3B.
Las construcciones en las células hospedadoras
pueden usarse de una forma convencional para producir el producto
génico codificado por la secuencia recombinante.
Después de la transformación de un hospedador
adecuado y del cultivo del hospedador a una densidad celular
apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados,
tal como cambio de temperatura o inducción química, y las células se
cultivan durante un periodo adicional.
Típicamente, las células se recogen por
centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el
extracto bruto resultante se conserva para una purificación
adicional.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método
conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación,
sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas.
Además, estas células recombinantes pueden
generarse in vitro o in vivo en un animal,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente seleccionado del
grupo constituido por ratones, ratas, perros, cerdos, ovejas, vacas
y primates, sin incluir seres humanos. Posteriormente, las células
recombinantes generadas in vitro también pueden implantarse
quirúrgicamente, por ejemplo, en un animal. Son bien conocidos en la
técnica métodos para generar células recombinantes in vivo en
animales.
En la presente memoria se describen células
hospedadoras homólogamente recombinantes primarias, secundarias e
inmortalizadas procedentes de vertebrados, preferiblemente
procedentes de mamíferos y, particularmente, de origen humano, que
se han obtenido por ingeniería genética para: a) insertar
polinucleótidos exógenos (heterólogos) en el ADN cromosómico
endógeno de un gen de dirección, b) delecionar un ADN cromosómico
endógeno, y/o c) reemplazar un ADN cromosómico endógeno con
polinucleótidos exógenos. Las inserciones, deleciones y/o reemplazos
de secuencias polinucleotídicas pueden realizarse en las secuencias
codificantes del gen de dirección y/o en regiones reguladoras tales
como secuencias promotoras y potenciadoras, asociadas de manera
funcional con el gen de dirección.
En la presente memoria se describe un método de
preparación de una célula hospedadora homólogamente recombinante
in vitro o in vivo, donde se altera la expresión de un
gen de dirección que normalmente no se expresa en la célula.
Preferiblemente la alteración provoca la expresión del gen de
dirección en condiciones de cultivo normales o en condiciones
adecuadas para producir el polipéptido codificado por el gen de
dirección. El método comprende las etapas de: (a) transfectar la
célula in vitro o in vivo con una construcción
polinucleotídica, comprendiendo la construcción polinucleotídica;
(i) una secuencia de dirección; (ii) una secuencia reguladora y/o
una secuencia codificante; y (iii) un sitio donante de corte y
empalme no emparejado, si es necesario, produciéndose de este modo
una célula transfectada;
y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga.
y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga.
Se describe además un método de alteración de la
expresión de un gen de dirección en una célula in vitro o
in vivo donde el gen no se expresa normalmente en la célula,
que comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in
vitro o in vivo con una construcción polinucleotídica,
comprendiendo la construcción polinucleotídica; (i) una secuencia
de dirección; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia
codificante; y (iii) un sitio donante de corte y empalme no
emparejado, si es necesario, produciéndose de este modo una célula
transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro
o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación
homóloga, produciéndose de este modo una célula homólogamente
recombinante; y (c) mantener la célula homólogamente recombinante
in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la
expresión del gen.
En la presente memoria se describe un método de
preparación de un polipéptido de la presente invención por
alteración de la expresión de un gen de dirección endógeno en una
célula in vitro o in vivo, donde el gen no se expresa
normalmente en la célula, que comprende las etapas de: a)
transfectar la célula in vitro con una construcción
polinucleotídica, comprendiendo la construcción polinucleotídica:
(i) una secuencia de dirección; (ii) una secuencia reguladora y/o
una secuencia codificante; y (iii) un sitio donante de corte y
empalme no emparejado, si es necesario, produciéndose de este modo
una célula transfectada; (b) mantener la célula transfectada in
vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la
recombinación homóloga, produciéndose de este modo una célula
homólogamente recombinante; y c) mantener la célula homólogamente
recombinante in vitro o in vivo en condiciones
apropiadas para la expresión del gen, generando de este modo el
polipéptido.
Se describe además una construcción
polinucleotídica que altera la expresión de un gen de dirección en
un tipo celular en el que el gen no se expresa normalmente. Esto se
produce cuando se inserta una construcción polinucleotídica en el
ADN cromosómico de la célula de dirección, donde la construcción
polinucleotídica comprende: a) una secuencia de dirección; b) una
secuencia reguladora y/o una secuencia codificante; y c) un sitio
donante de corte y empalme no emparejado, si es necesario. Se
incluyen además construcciones polinucleotídicas, como se han
descrito anteriormente, donde la construcción comprende además un
polinucleótido que codifica un polipéptido y está en fase con el gen
endógeno de dirección después de la recombinación homóloga con ADN
cromosómico.
Las composiciones pueden producirse, y los
métodos realizarse, mediante técnicas conocidas en este campo,
tales como las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº:
6.054.288; 6.048.729; 6.048.724; 6.048.524; 5.994.127; 5.968.502;
5.965.125; 5.869.239; 5.817.789; 5.783.385; 5.733.761; 5.641.670;
5.580.734; Publicaciones Internacionales Nº: WO96/29411, WO
94/12650; y artículos científicos descritos por Koller et
al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 10:705-730;
cuyas descripciones se incorporan como referencia en su
totalidad).
En la expresión de GSSP4 en mamíferos y,
típicamente, seres humanos, las células pueden volverse defectuosas
o, como alternativa, pueden mejorarse, con la inserción de una
secuencia genómica o de ADNc de GSSP4, con el reemplazo del
homólogo del gen de GSSP4 en el genoma de una célula animal por un
polinucleótido GSSP4. Estas alteraciones genéticas pueden generarse
mediante acontecimientos de recombinación homóloga usando
construcciones de ADN específicas que se han descrito
anteriormente.
Una clase de células hospedadoras que pueden
usarse son cigotos de mamíferos, tales como cigotos murinos. Por
ejemplo, pueden someterse cigotos murinos a microinyección con una
molécula de ADN de interés purificada, por ejemplo, una molécula de
ADN purificada que se haya ajustado previamente a un intervalo de
concentración de 1 ng/ml -para insertos de BAC- 3 ng/\mul -para
insertos de bacteriófago P1 - en Tris-HCl 10 mM a pH
7,4, EDTA 250 \muM que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM
y espermidina 70 \muM. Cuando el ADN que se va a microinyectar
tiene un gran tamaño, pueden usarse poliaminas y elevadas
concentraciones de sal para evitar la rotura mecánica de este DNA,
como se describe en Schedl et al ((1993) Nature, Mar 18; 362
(6417): 258-61).
Cualquiera de los polinucleótidos descritos en
la presente memoria, incluyendo las construcciones de ADN descritas
en la presente memoria, pueden introducirse en una línea de células
madre (ES) embrionarias no humanas, preferiblemente una línea de
células ES de ratón. Las líneas de células ES proceden de células no
comprometidas pluripotentes de la masa celular interna de los
blastocistos anteriores a la implantación. Son líneas de células ES
preferidas las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC
NºCRL-1821), ES-D3 (ATCC NºCRL1934 y
Nº CRL-11632), YS001 (ATCC Nº
CRL-11776), 36.5 (ATCC Nº
CRL-11116). Para mantener las células ES en un
estado no comprometido, se cultivan en presencia de células
alimentadoras de crecimiento inhibido que proporcionan las señales
apropiadas para conservar este fenotipo embrionario y servir como
una matriz para la adherencia de las células ES. Son células
alimentadoras preferidas fibroblastos embrionarios primarios que se
establecen a partir de tejidos de embriones del día 13 al día 14 de
prácticamente cualquier cepa de ratón, que se mantienen en cultivo,
como se describe en Abbondanzo et al. (1993. Methods
Enzymol; 225: 803-23) y cuyo crecimiento se inhibe
por irradiación, como se describe en Robertson ((1987)
Embryo-derived stem cell lines. En: EJ. Robertson
Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical
approach. IRL Press, Oxford), o mediante la presencia de una
concentración inhibidora de LEF, como describen Pease y Williams
(1990; Exp Cell Res. Oct;190(2):209-11).
Las construcciones en las células hospedadoras
pueden usarse de una forma convencional para producir el producto
génico codificado por la secuencia recombinante.
Después de la transformación de un hospedador
adecuado y del cultivo del hospedador a una densidad celular
apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados,
tal como cambio de temperatura o inducción química, y las células
se cultivan durante un periodo adicional. Típicamente, las células
se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o
químicos, y el extracto bruto resultante se conserva para una
purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método
conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación,
sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas en la
técnica.
La presente invención también proporciona
métodos y composiciones para la generación de animales no humanos y
plantas que expresan polipéptidos GSSP4 recombinantes, es decir,
fragmentos de GSSP4 recombinantes o polipéptidos GSSP4 de longitud
completa. Los animales o plantas pueden ser transgénicos, es decir,
cada una de sus células contiene un gen que codifica un polipéptido
GSSP4, o, como alternativa, puede introducirse un polinucleótido
que codifica un polipéptido GSSP4 en células somáticas del animal o
planta, por ejemplo, en células epiteliales secretoras mamarias de
un mamífero. En realizaciones preferidas, el animal no humano es un
mamífero, tal como una vaca, oveja, cabra, cerdo o conejo.
Los métodos para obtener animales transgénicos,
tales como mamíferos, son bien conocidos por los especialistas en
la técnica, y cualquiera de estos métodos puede usarse en la
presente invención. En resumen, pueden producirse mamíferos
transgénicos, por ejemplo, transfectando una célula madre
pluripotente, tal como una célula ES con un polinucleótido que
codifica un polipéptido de interés. Después, las células ES
transformadas satisfactoriamente pueden introducirse en un embrión
en las primeras fases de desarrollo, que después se implanta en el
útero de un mamífero de la misma especie. En ciertos casos, las
células transformadas ("transgénicas") comprenderán parte de
la línea germinal del animal resultante, y animales adultos que
comprenden las células transgénicas en la línea germinal después
pueden emparejarse con otros animales, con lo que finalmente se
obtiene una población de animales tansgénicos que tienen el
transgén en cada una de sus células y que pueden transmitir de
manera estable el transgén a cada descendiente. Pueden usarse otros
métodos para introducir el polinucleótido, por ejemplo,
introduciendo el polinucleótido que codifica el polipéptido de
interés en un huevo fertilizado o en un embrión en sus primeras
fases de desarrollo por microinyección. Como alternativa, el
transgén puede introducirse en un animal por infección de cigotos
con un retrovirus que contiene el transgén (Jaenisch, R. (1976)
Proc. Nad. Acad. Sci. USA 73,1260-1264). Se
describen métodos para obtener mamíferos transgénicos, por ejemplo,
en Wall et al. (1992) J Cell Biochem 1992
Jun;49(2):113-20; Hogan, et al. (1986)
en Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; en el documento
WO 91/08216, o en la Patente de Estados Unidos Nº 4.736.866.
En un método preferido, los polinucleótidos se
microinyectan en el oocito fertilizado. Típicamente, los oocitos
fertilizados se microinyectan usando técnicas convencionales y
después se cultivan in vitro hasta que se obtiene un
"embrión en fase de preimplantación". Estos embriones en fase
de preimplantación preferiblemente contienen de aproximadamente 16
a 150 células. Se describen métodos para cultivar oocitos
fertilizados hasta la fase de preimplantación, por ejemplo, por
Gordon et al. ((1984) Methods in Enzymology, 101,414); Hogan
et al. ((1986) en Manipulating the mouse embryo. A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y) (para el embrión de ratón); Hammer et al.
((1985) Nature, 315, 680) (para embriones de conejo y porcinos);
Gandolfi et al. ((1987) J. Reprod. Fert.
81,23-28); Rexroad et al. ((1988) J. Anim.
Sci. 66,947-953) (para embriones ovinos); y
Eyestone et al. ((1989) J. Reprod. Fert. 85,
715-720); Camous et al. ((1984) J. Reprod.
Fert. 72,779-785); y Heyman et al. ((1987)
Theriogenology 27, 5968) (para embriones bovinos); incorporándose
en la presente memoria en su totalidad la descripción de cada una de
dichas referencias. Los embriones en fase de preimplantación
después se transfieren a una hembra apropiada por métodos
convencionales para permitir el nacimiento de un animal transgénico
o quimérico, dependiendo de la fase de desarrollo cuando se
introduce el transgén.
Como la frecuencia de incorporación del transgén
a menudo es baja, a menudo es deseable la detección de la
integración de transgén en los embriones en fase de preimplantación
usando cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.
Puede usarse cualquiera de varios métodos para detectar la presencia
de un transgén en un embrión en fase de preimplantación. Por
ejemplo, pueden retirarse una o más células del embrión en fase de
preimplantación y puede detectarse la presencia o ausencia del
transgén en la célula o células extraídas usando cualquier método
convencional, por ejemplo, PCR. Como alternativa, la presencia de un
transgén puede detectarse en el útero o después del parto usando
métodos convencionales.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, se generan mamíferos transgénicos que
secretan polipéptidos GSSP4 recombinantes en su leche. Como la
glándula mamaria es un órgano productor de proteínas muy eficaz,
dichos métodos pueden usarse para producir concentraciones de
proteínas en el intervalo de gramos por litro y a menudo
significativamente mayores. Preferiblemente, la expresión en la
glándula mamaria se consigue uniendo operativamente el
polinucleótido que codifica el polipépotido GSSP4 a un promotor
específico de glándula mamaria y, opcionalmente, a otros elementos
reguladores. Los promotores adecuados y otros elementos incluyen,
pero sin limitación, los derivados de WAP corto y largo de mamífero,
alfa, beta y kappa caseína, alfa y beta lactoglobulina, genes
beta-CN 5', así como el promotor del virus de tumor
mamario de ratón (MMTV). Estos promotores y otros elementos pueden
obtenerse a partir de cualquier mamífero incluyendo, pero sin
limitación, vacas, cabras, ovejas, cerdos, ratones, conejos y
cobayas. Se proporcionan promotores y otras secuencias reguladoras,
vectores y otras enseñanzas relevantes, por ejemplo, por Clark
(1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50;
Jost et al. (1999) Nat.
Biotechnol 17:160-4; Patentes de Estados Unidos Nº 5.994.616; 6.140.552; 6.013.857; Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kim et al. (1999) J. Biochem. (Japón) 126:320-5; Soulier et al. (1999) Euro. J. Biochem. 260:533-9; Zhang et al. (1997) Chin. J. Biotech. 13:271-6; Rijnkels et al. (1998) Transgen. Res. 7:5-14; Korhonen et al. (1997) Euro. J. Biochem. 245:482-9; Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen. Res. 6:75-84; Hitchin et al. (1996) Prot. Expr. Purif. 7:247-52; Platenburg et al. (1994) Transgen. Res. 3:99-108; Heng-Cherl et al. (1993) Animal Biotech. 4:89-107; y Christa et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267:1665-71; cuyas descripciones enteras se incorporan en la presente memoria como referencia.
Biotechnol 17:160-4; Patentes de Estados Unidos Nº 5.994.616; 6.140.552; 6.013.857; Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kim et al. (1999) J. Biochem. (Japón) 126:320-5; Soulier et al. (1999) Euro. J. Biochem. 260:533-9; Zhang et al. (1997) Chin. J. Biotech. 13:271-6; Rijnkels et al. (1998) Transgen. Res. 7:5-14; Korhonen et al. (1997) Euro. J. Biochem. 245:482-9; Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen. Res. 6:75-84; Hitchin et al. (1996) Prot. Expr. Purif. 7:247-52; Platenburg et al. (1994) Transgen. Res. 3:99-108; Heng-Cherl et al. (1993) Animal Biotech. 4:89-107; y Christa et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267:1665-71; cuyas descripciones enteras se incorporan en la presente memoria como referencia.
En otra realización, los polipéptidos de la
invención pueden producirse por la leche introduciendo
polinucleótidos que codifican los polipéptidos en células somáticas
de la glándula mamaria in vivo, por ejemplo, células
epiteliales secretoras mamarias. Por ejemplo, puede infundirse ADN
plasmídico a través del canal del pezón, por ejemplo, en asociación
con DEAE-dextrano (véase, por ejemplo, Hens et
al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1523:161-171),
en asociación con un ligando que puede llevar a endocitosis mediada
por receptores de la construcción (véase, por ejemplo, Sobolev
et al. (1998) 273:7928-33), o en un vector
viral tal como un vector retroviral, por ejemplo, el virus de la
leucemia de gibón (véase, por ejemplo, Archer et al. (1994)
PNAS 91:6840-6844). En cualquiera de estas
realizaciones, el polinucleótido puede unirse de manera funcional a
un promotor específico de glándula mamaria, como se ha descrito
anteriormente, o como alternativa, a cualquier promotor de expresión
fuerte tal como CMV o MoMLV LTR.
La idoneidad de cualquier vector, promotor,
elemento regulador, etc. para uso en la presente invención puede
evaluarse de antemano por transfección de células tales como células
epiteliales mamarias, por ejemplo, células MacT (células
epiteliales mamarias bovinas) o células GME (células epiteliales
mamarias de cabra), in vitro y evaluando la eficacia de la
transfección y expresión del transgén en las células.
Para la administración in vivo, los
polinucleótidos pueden administrase en cualquier formulación
adecuada, en cualquiera de un intervalo de concentraciones (por
ejemplo, 1-500 \mug/ml, preferiblemente
50-100 \mug/ml), en cualquier volumen (por
ejemplo, 1-100 ml, preferiblemente 1 a 20 ml), y
pueden administrarse cualquier número de veces (por ejemplo, 1, 2,
3, 5 ó 10 veces), a cualquier frecuencia (por ejemplo, cada 1, 2, 3,
5, 10, o cualquier número de días). Las concentraciones,
frecuencias, modos de administración, etc. adecuados dependerán del
polinucleótido, vector, animal, etc., particular y pueden
determinarse fácilmente por un especialista en la técnica.
En una realización preferida, se usa un vector
retroviral tal como el virus de la leucemia de gibón, como se
describe en Archer et al. ((1994) PNAS
91:6840-6844). Como la infección retroviral
típicamente requiere división celular, puede estimularse la
división celular en la glándula mamaria junto con la administración
del vector, por ejemplo, usando un factor tal como benzoato de
estradiol, progesterona, reserpina o dexametasona. Además, la
infección retroviral y otros métodos de infección pueden facilitarse
usando compuestos auxiliares tales como polibreno.
En cualquiera de los métodos descritos en la
presente memoria para obtener polipéptidos GSSP4 a partir de la
leche, la cantidad de leche obtenida y, por lo tanto, la cantidad de
polipéptidos GSSP4 producidos, puede aumentarse usando cualquier
método convencional de inducción de la lactación, por ejemplo,
usando hexestrol, estrógenos y/o progesterona.
Los polinucleótidos usados en estas
realizaciones pueden codificar un polipéptido GSSP4 de longitud
completa o un fragmento de GSSP4. Típicamente, el polipéptido
codificado incluirá una secuencia señal para asegurar la secreción
de la proteína en la leche. Cuando se usa una secuencia de GSSP4 de
longitud completa, la proteína de longitud completa puede aislarse,
por ejemplo, a partir de la leche y escindirse in vitro
usando una proteasa adecuada. Como alternativa, puede introducirse
un segundo polinucleótido que codifica proteasa en el animal o en
las células de la glándula mamaria, con lo que la expresión de la
proteasa da como resultado la escisión del polipéptido GSSP4 in
vivo, con lo que se permite el aislamiento directo de fragmentos
de GSSP4 de la leche.
Los polipéptidos GSSP4 de la invención pueden
administrarse a animales no humanos y/o a seres humanos, solos o en
composiciones farmacéuticas o fisiológicamente aceptables en las que
se mezclan con vehículos o excipientes adecuados. Después, la
composición farmacéutica o fisiológicamente aceptable se proporciona
a una dosis terapéuticamente eficaz. Una dosis terapéuticamente
eficaz se refiere a la cantidad de un polipéptido GSSP4 suficiente
para dar como resultado la prevención o mejora de los síntomas o el
estado fisiológico de enfermedades o trastornos relacionados con el
metabolismo que se determina por los métodos descritos en la
presente memoria. Una dosis terapéuticamente eficaz también puede
referirse a la cantidad de un polipéptido GSSP4 necesaria para
producir una reducción del peso o para prevenir un aumento en la
velocidad de aumento de peso en personas que desean este efecto por
razones cosméticas. Una dosificación terapéuticamente eficaz de un
polipéptido GSSP4 de la invención es la dosis que es adecuada para
potenciar la pérdida de peso o el aumento de peso con un uso o
administración periódica continuada. Pueden encontrarse técnicas
para la formulación y administración de polipéptidos GSSP4 en
"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co.,
Easton, PA última edición.
\newpage
Otras enfermedades o trastornos en cuyo
tratamiento pueden usarse los polipéptidos GSSP4 de la invención
incluyen, pero sin limitación, obesidad y enfermedades o trastornos
relacionados con el metabolismo tales como obesidad, alteración de
la tolerancia a la glucosa (IGT), resistencia a la insulina,
aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, enfermedad cardíaca,
hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no
insulinodependiente y diabetes de tipo II. Las complicaciones
relacionadas con la diabetes de tipo II a tratar por los métodos de
la invención incluyen lesiones microangiopáticas, lesiones oculares
y lesiones renales. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin
limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y
elevación de la presión sanguínea. Otros trastornos relacionados
con el metabolismo a tratar por los compuestos de la invención
incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Los polipéptidos GSSP4
también pueden usarse para potenciar la función física durante el
trabajo o el ejercicio o para potenciar un sentimiento
de bienestar general. Las actividades de función física incluyen andar, correr, saltar, levantar peso y/o escalar.
de bienestar general. Las actividades de función física incluyen andar, correr, saltar, levantar peso y/o escalar.
Los polipéptidos GSSP4 o antagonistas de los
mismos también pueden usarse para tratar la dislexia, trastorno de
déficit de atención (ADD), trastorno de déficit de
atención/hiperactividad (ADHD) y trastornos psiquiátricos tales
como esquizofrenia mediante la modulación del metabolismo de ácidos
grasos, más específicamente, la producción de ciertos ácidos grasos
poliinsaturados de cadena larga.
Se considera expresamente que los polipéptidos
GSSP4 de la invención pueden proporcionarse solos o en combinación
con otros compuestos farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Actualmente se conocen bien en la técnica otros compuestos útiles
para el tratamiento de la obesidad y otras enfermedades y
trastornos.
En una realización preferida, los polipéptidos
GSSP4 son útiles para, y se usan en, el tratamiento de la
resistencia a la insulina usando métodos descritos en la presente
memoria y conocidos en la técnica. Más particularmente, una
realización preferida se refiere a un proceso para la modificación y
regulación terapéutica del metabolismo de la glucosa en un sujeto
animal o humano, que comprende administrar a un sujeto que necesita
tratamiento (como alternativa, en una base temporizada diaria) un
polipéptido GSSP4 (o polinucleótido que codifica dicho polipéptido)
en una cantidad de dosificación y durante un periodo de tiempo
suficiente para reducir los niveles plasmáticos de glucosa en dicho
sujeto animal o humano.
Otras realizaciones preferidas se refieren a
métodos para la profilaxis o tratamiento de la diabetes que
comprenden administrar a un sujeto que necesita tratamiento (como
alternativa en una base temporizada diaria) un polipéptido GSSP4 (o
polinucleótido que codifica dicho polipéptido) en una cantidad de
dosificación y durante un periodo de tiempo suficiente para reducir
los niveles plasmáticos de glucosa en dicho sujeto animal o
humano.
Las vías de administración adecuadas incluyen
administración oral, nasal, rectal, transmucosa o intestinal,
liberación parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares,
subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales,
intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales,
intranasales, intrapulmonares (inhaladas) o intraoculares usando
métodos conocidos en la técnica. Un método particularmente útil para
administrar los compuestos para potenciar la pérdida de peso
implica la implantación quirúrgica, por ejemplo en la cavidad
abdominal del receptor, de un dispositivo para liberar los
polipéptidos GSSP4 durante un periodo de tiempo prolongado. Otras
vías de administración particularmente preferidas son formulaciones
de aerosol y de depósito. Se contemplan expresamente formulaciones
de liberación sostenida, particularmente de depósito, de los
medicamentos de la presente invención.
Las composiciones y medicamentos farmacéutica o
fisiológicamente aceptables para uso de acuerdo con la presente
invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más
vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y
auxiliares. Una formulación adecuada depende de la vía de
administración elegida.
Algunos de los medicamentos descritos en la
presente memoria incluirán un vehículo farmacéutica o
fisiológicamente aceptable y al menos un polipéptido que es un
polipéptido GSSP4 de la invención. Para inyección, los agentes de
la invención pueden formularse en soluciones acuosas,
preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como
solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico,
tal como un tampón fosfato o bicarbonato. Para administración
transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para
que la barrera sea permeable. Tales penetrantes se conocen en
general en la técnica.
Las preparaciones farmacéutica o
fisiológicamente aceptables que pueden tomarse por vía oral incluyen
cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas
cerradas herméticamente preparadas de gelatina y un plastificante,
tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los
ingredientes activos mezclados con cargas, tales como lactosa,
aglutinantes, tales como almidones, y/o lubricantes, tales como
talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En
cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar drisueltos o
suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos,
parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden
añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración
oral deben estar en dosificaciones adecuadas para dicha
administración.
Para la administración bucal, las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de
manera convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se
administran convencionalmente en forma de una presentación de
pulverización en aerosol desde envases presurizados o un
nebulizador, con el uso de un propulsor gaseoso adecuado, por
ejemplo, dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado,
la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una
válvula para liberar una cantidad predeterminada. Las cápsulas y
cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o
insuflador, pueden formularse de manera que contengan una mezcla en
polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o
almidón.
Los compuestos pueden formularse para
administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección
en embolada o por infusión continua. Las formulaciones para
inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria,
por ejemplo, en ampollas o recipientes multi-dosis,
con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas
tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos
acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como
agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéutica o
fisiológicamente aceptables para administración parenteral incluyen
soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en
agua. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que
aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil
celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión
puede contener además estabilizantes adecuados o agentes que
aumenten la solubilidad de los compuestos, y que permitan la
preparación de soluciones muy concentradas.
Como alternativa, el ingrediente activo puede
estar en forma de polvo o liofilizado para la constitución con un
vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos, antes del
uso.
Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos también pueden formularse como una
preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada
pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía
subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo
tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales
poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión
en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como
derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal
moderadamente soluble.
Además, los compuestos pueden liberarse usando
un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables
de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente
terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación
sostenida y son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
Dependiendo de su naturaleza química, las cápsulas de liberación
sostenida pueden liberar los compuestos durante un periodo de unas
semanas a más de 100 días.
Dependiendo de la naturaleza química y de la
estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplearse
estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.
Las composiciones farmacéuticas o
fisiológicamente aceptables también pueden comprender vehículos o
excipientes en fase sólida o de gel adecuados. Los ejemplos de
tales vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitación,
carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones,
derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como
polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéutica o
fisiológicamente aceptables adecuadas para uso en la presente
invención incluyen composiciones en las que los ingredientes
activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el
fin para el que están destinadas. Más específicamente, una cantidad
terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir
el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto sometido
a tratamiento. La determinación de las cantidades eficaces está
bien dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica,
especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en
la presente memoria.
Para cualquier compuesto usado en el método de
la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse
inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Por ejemplo,
una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un
intervalo de concentraciones circulantes que incluye o comprende un
punto o intervalo de concentraciones que, según se ha demostrado,
aumenta la captación o unión de leptina o lipoproteína en un
sistema in vitro. Esta información puede usarse para
determinar de manera más segura las dosis útiles en seres
humanos.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a
la cantidad del compuesto que tiene como resultado la mejoría de
los síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica
de estos compuestos puede determinarse por procedimientos
farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales
experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis
letal para 50% de la población de ensayo) y la DE50 (la dosis
terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de
dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice
terapéutico y puede expresarse como la relación entre la DL50 y la
DE50. Se prefieren los compuestos que presentan altos índices
terapéuticos.
\newpage
Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de
cultivo de células y estudios animales pueden usarse para la
formulación de un intervalo de dosificación para uso en seres
humanos. La dosificación de estos compuestos preferiblemente está
dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen
la DE50, con toxicidad pequeña o nula. La dosificación puede variar
dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación
empleada y la vía de administración utilizada. La formulación
exacta, la vía de administración y la dosificación pueden elegirse
por el médico individual teniendo en consideración el estado del
paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en "The
Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1).
La cantidad y el intervalo de dosificación
pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles
plasmáticos del compuesto activo que sean suficientes para mantener
o prevenir una pérdida o aumento de peso, dependiendo de la
situación particular. Las dosificaciones necesarias para conseguir
estos efectos dependerán de las características individuales y de la
vía de administración.
Los intervalos de dosificación también pueden
determinarse usando el valor de la concentración mínima eficaz. Los
compuestos deben administrarse usando un régimen que mantenga
niveles plasmáticos por encima de la concentración mínima eficaz
durante 10-90% del tiempo, preferiblemente entre
30-90%; y más preferiblemente entre
50-90%. En casos de administración local o
captación selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede
no estar relacionada con la concentración plasmática.
La cantidad de composición administrada, por
supuesto, dependerá del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de la
gravedad de la afección, de la manera de administración y criterio
del médico a cargo del caso.
Un intervalo de dosificación preferido para la
cantidad de polipéptido GSSP4 de la invención, que puede
administrarse en una base regular diaria para conseguir los
resultados deseados, incluyendo una reducción en los niveles de
lipoproteínas ricas en triglicéridos en plasma circulante, varía de
0,01-0,5 mg/kg de masa corporal. Un intervalo de
dosificación más preferido es de 0,05-0,1 mg/kg. Por
supuesto, estas dosificaciones diarias pueden liberarse o
administrarse en pequeñas cantidades periódicamente durante el
transcurso del día. Debe tenerse en cuenta que estos intervalos de
dosificación son sólo intervalos preferidos y no se pretende que
sean limitantes de la invención.
La invención se refiere, entre otras cosas, a
métodos para prevenir o tratar enfermedades y trastornos
relacionados con el metabolismo, que comprenden proporcionar a un
individuo que necesita dicho tratamiento un polipéptido GSSP4 de la
invención. Preferiblemente, el polipéptido GSSP4 tiene actividad
relacionada con el metabolismo in vitro o in vivo.
Preferiblemente, el polipéptido GSSP4 se proporciona al individuo en
una composición farmacéutica que preferiblemente se toma por vía
oral. Preferiblemente, el individuo es un mamífero, y más
preferiblemente es un ser humano. En realizaciones preferidas, la
enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo se selecciona
entre el grupo consistente en obesidad, alteración de la tolerancia
a la glucosa (IGT), resistencia a la insulina, aterosclerosis,
enfermedad ateromatosa, enfermedad cardiaca, hipertensión, ictus,
síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM,
diabetes de tipo II), diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM,
diabetes de tipo I), complicaciones relacionadas con la diabetes
(tales como elevación de los cuerpos cetónicos), microangiopatía,
retinopatía, lesiones oculares, neuropatía, nefropatía, síndrome de
ovario poliquístico (PCOS) y lesiones microangiopáticas, así como
síndromes tales como acantosis nigricans, leprechaunismo y
lipoatrofia a tratar por los métodos de la invención. La enfermedad
cardiaca incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca,
insuficiencia coronaria y elevación de la presión sanguínea. En
realizaciones muy preferidas, se usan polipéptidos GSSP4 en
composiciones farmacéuticas para modular el peso corporal en
individuos sanos por razones cosméticas.
La invención también se refiere a un método para
prevenir o tratar enfermedades y trastornos relacionados con el
metabolismo, que comprende proporcionar a un individuo que necesita
dicho tratamiento un compuesto identificado por ensayos de la
invención (descritos en la Sección VI de las Realizaciones
Preferidas de la Invención y en los Ejemplos). Preferiblemente,
estos compuestos antagonizan o agonizan los efectos de los
polipéptidos GSSP4 en las células in vitro, músculos ex
vivo, o en modelos animales. Como alternativa, estos compuestos
agonizan o antagonizan los efectos de los polipéptidos GSSP4 sobre
el metabolismo de la glucosa, el metabolismo de los ácidos grasos o
el metabolismo de los lípidos. Preferiblemente, el compuesto se
proporciona al individuo en una composición farmacéutica que
preferiblemente se toma por vía oral. Preferiblemente, el individuo
es un mamífero, y más preferiblemente es un ser humano. En
realizaciones preferidas, la enfermedad o trastorno relacionado con
el metabolismo se selecciona entre el grupo consistente en obesidad,
alteración de la tolerancia a la glucosa (IGT), resistencia a la
insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, enfermedad
cardiaca, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no
insulinodependiente (NIDDM, diabetes de tipo II), diabetes mellitus
insulinodependiente (IDDM, diabetes de tipo I), complicaciones
relacionadas con la diabetes (tales como elevación de los cuerpos
cetónicos), microangiopatía, retinopatía, lesiones oculares,
neuropatía, nefropatía, síndrome de ovario poliquístico (PCOS) y
lesiones microangiopáticas, así como síndromes tales como acantosis
nigricans, leprechaunismo y lipoatrofia a tratar por los métodos de
la invención. La enfermedad cardiaca incluye, pero sin limitación,
insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y elevación de la
presión sanguínea. En realizaciones muy preferidas, las
composiciones farmacéuticas se usan para modular los niveles de
glucosa. En realizaciones muy preferidas, las composiciones
farmacéuticas se usan para modular el peso corporal por razones
cosméticas.
\newpage
En otra realización preferida, los pacientes
NIDDM a menudo se tratan con secretagogos de insulina orales, tales
como fumarato de
1,1-dimetil-2-(2-morfolinofenil)guanidina
(BTS67582) o sulfonilureas incluyendo tolbutamida, tolazamida,
clorpropamida, glibendamida, glimepirida, glipizida y glidazida, o
con agentes de sensibilización a la insulina incluyendo metformina,
ciglitazona, trogitazona y pioglitazona. Otro uso de la presente
invención es en la terapia de pacientes NIDDM para mejorar su peso
y control de glucosa, que comprende una composición farmacéutica o
fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto o
polinucleótidos descritos en el segundo aspecto en combinación con
un secretagogo de insulina oral o un agente de sensibilización a la
insulina. Preferiblemente, el secretagogo de insulina oral es
fumarato de
1,1-dimetil-2-(2-morfolinofenil)guanidina
(BTS67582) o una sulfonilurea seleccionada entre tolbutamida,
tolazamida, clorpropamida, glibendamida, glimepirida, glipizida y
glidazida. Preferiblemente, el agente de sensibilización a la
insulina se selecciona entre metformina, ciglitazona, troglitazona
y
pioglitazona.
pioglitazona.
La presente invención también proporciona un
método para mejorar el peso y control de glucosa de pacientes
NIDDM, que comprende la administración de dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto solos, sin
un secretagogo de insulina oral o un agente de sensibilización a la
insulina. En otra realización preferida, la presente invención puede
administrarse concomitante o conjuntamente con el secretagogo de
insulina oral o el agente de sensibilización a la insulina, por
ejemplo, en forma de unidades de dosificación separadas a usar
simultáneamente, por separado o secuencialmente (antes o después
del secretagogo o antes o después del agente de sensibilización).
Por consiguiente, la presente invención también proporciona un
producto que contiene una composición de dicha composición
farmacéutica o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto
aspecto o polinucleótidos descritos en el segundo aspecto y un
secretagogo de insulina oral o agente de sensibilización a la
insulina como una preparación combinada para uso simultáneo,
separado o secuencial para mejorar el peso y el control de la
glucosa en pacientes NIDDM. La relación entre la composición de la
presente invención y el secretagogo de insulina oral o agente de
sensibilización a la insulina es tal que la cantidad de cada
ingrediente activo empleado será una que proporcione un nivel
terapéuticamente eficaz, pero no mayor que la cantidad recomendada
como segura para la administración.
La acción de reducir la resistencia a la
insulina por la presente invención indica que los compuestos de esta
invención pueden ser útiles en la fabricación de un medicamento que
puede usarse como sensibilizador a la insulina. Por consiguiente,
la presente invención proporciona además el uso en la fabricación de
un medicamento que es un sensibilizador a la insulina.
En otras realizaciones, algunos pacientes a los
que se les ha diagnosticado diabetes mellitus insulinodependiente
(IDDM, Tipo I) también pueden mostrar resistencia a la insulina en
cierta medida. Por lo tanto, puede ser beneficioso tratar a estos
pacientes con dicha composición farmacéutica o fisiológicamente
aceptable descrita en el quinto aspecto o con polinucleótidos
descritos en el segundo aspecto para reducir su resistencia a la
insulina. Esto significaría que estos pacientes necesitarían una
menor dosificación de insulina para mantener un control similar o
mejor de su diabetes, ya que la dosis de insulina está asociada con
una mayor eficacia de reducción de la glucosa sanguínea. Esta
terapia proporcionaría efectos beneficiosos a largo plazo en
términos de la reducción de los efectos perjudiciales que pueden
producirse por una dosificación elevada prolongada del tratamiento
con insulina. Además, algunos pacientes con diabetes mellitus no
insulinodependiente (NIDDM, Tipo II) también se tratan con insulina
y tienen resistencia a la insulina. Por consiguiente, la presente
invención proporciona además un método, y el uso del mismo en la
fabricación de un medicamento para reducir la cantidad de insulina
que necesita diariamente un ser humano que tiene NIDDM. La presente
invención también proporciona un método, y el uso de la composición
en la fabricación de un medicamento para la profilaxis de los
efectos perjudiciales a largo plazo producidos por una dosificación
elevada prolongada de insulina en seres humanos que tienen IDDM.
Una consecuencia de la resistencia es la
elevación de las concentraciones de glucosa. Esto, a su vez,
ocasiona un aumento en la liberación de insulina. La
hiperinsulinemia, tanto en ayunas como en situación posprandial, es
un signo característico de la resistencia a la insulina. La
hiperinsulinemia también se produce por estimulación de la
gluconeogénesis. Ciertos estudios epidemiológicos han demostrado que
la hiperinsulinemia es un factor de riesgo para la morbilidad y
mortalidad en enfermedades cardiovasculares (Smith U. (1994) Am.
J. Clin. Nutr. 59, suppl. 686S). Por consiguiente, la invención
también proporciona agentes terapéuticos y métodos para reducir o
prevenir la hipersecreción de insulina y trastornos o afecciones
debidas a esta hipersecreción.
La NIDDM está asociada con diversas
complicaciones. Como se define en la presente memoria,
"complicaciones de la NIDDM" se refiere a complicaciones
cardiovasculares o varias de las alteraciones metabólicas y
circulatorias que están asociadas con la hiperglucemia, por
ejemplo, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia y/o
hiperproinsulinemia, retraso de liberación de insulina,
dislipidemia, retinopatía, neuropatía periférica, hipertensión y
otras enfermedades de las arterias coronarias (CAD). La CAD es una
causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes con NIDDM.
De esta manera, al proporcionar agentes terapéuticos y métodos para
reducir los niveles de glucosa, la invención proporciona agentes
terapéuticos y métodos para tratar o prevenir la NIDDM y sus
consecuencias.
La invención también proporciona agentes
terapéuticos y métodos para tratar y prevenir una alteración de la
tolerancia a la glucosa (IGT). El significado habitual de alteración
de la tolerancia a la glucosa es que es una afección asociada con
la resistencia a la insulina que es intermedia entre franca, NIDDM y
una tolerancia a la glucosa normal (NGT). Se sabe que un alto
porcentaje de la población IGT progresa a NIDDM en relación con las
personas con una tolerancia a la glucosa normal (Sad, et al., New
Engl. J. Med. 1988; 319:1500-6). De esta
manera, al proporcionar agentes terapéuticos y métodos para reducir
o prevenir la IGT, es decir, para normalizar la resistencia a la
insulina, puede retrasarse o prevenirse la progresión hasta
NIDDM.
La IGT se diagnostica por un procedimiento en el
que se determina que la respuesta de una persona afectada a la
glucosa posprandial es anómala según se evalúa por los niveles de
glucosa plasmática posprandiales de 2 horas. En este ensayo, se
administra una cantidad medida de glucosa al paciente y se miden los
niveles de glucosa sanguínea a intervalos regulares, normalmente
cada media hora durante las dos primeras horas y cada hora
posteriormente. En un individuo "normal" o sin IGT, los niveles
de glucosa se elevan durante las dos primeras horas hasta un nivel
menor de 140 mg/dl y después se reducen rápidamente. En un individuo
con IGT, los niveles de glucosa sanguínea son mayores y el nivel de
reducción tiene una menor velocidad.
La resistencia a la captación de glucosa
estimulada por la insulina en individuos que no se vuelven
francamente hiperglucémicos, sin embargo, aumenta la probabilidad
de que estos individuos desarrollen otras numerosas enfermedades.
En particular, un intento de compensar la resistencia a la insulina
pone en marcha una serie de acontecimientos que juegan un papel
importante en el desarrollo tanto de la hipertensión como de la
enfermedad cardiaca coronaria (CAD), tal como la enfermedad
vascular aterosclerótica prematura. Este grupo de anomalías se
denomina comúnmente "Síndrome Metabólico", o "Síndrome de
Resistencia a la Insulina" o "síndrome X". También se ha
notificado que están asociadas con la resistencia a la insulina las
concentraciones plasmáticas elevadas de triglicéridos y las
concentraciones plasmáticas reducidas de
colesterol-HDL, condiciones que se sabe que están
asociadas con la CAD. De esta manera, al proporcionar agentes
terapéuticos y métodos para reducir o prevenir la resistencia a la
insulina, la invención proporciona métodos para reducir y/o prevenir
la aparición del síndrome de resistencia a la insulina.
Otras enfermedades están asociadas con la
resistencia a la insulina y, de esta manera, pueden tratarse o
prevenirse de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo,
la obesidad, que es el resultado de un desequilibrio entre la
ingesta calórica y el gasto de energía, está muy relacionada con la
resistencia a la insulina y la diabetes (Hotamisligil, Spiegelman
et al., Science, 1993,259:87-91). En los
seres humanos la obesidad puede definirse como un peso corporal que
excede en 20% el peso corporal deseado para individuos del mismo
sexo, altura y estructura (Slans, L. B., in Endocrinology &
Metabolism, 2d Ed., McGraw-Hill, New York 1987,
páginas 1203-1244; véase también, R. H. Williams,
Textbook of Endocrinology, 1974, páginas
904-916). En otros animales (o también en seres
humanos) la obesidad puede determinarse por patrones de peso
corporal correlacionados con los perfiles de prolactina dado que
miembros de una especie que son jóvenes, delgados y "sanos" (es
decir, sin ningún trastorno ni trastorno metabólico) tienen
perfiles plasmáticos diarios de niveles de prolactina que siguen un
patrón regular que es muy reproducible con una pequeña desviación
típica. La obesidad, o el exceso de depósitos de grasa, se
correlaciona y puede desencadenar el inicio de diversos trastornos
metabólicos, por ejemplo, hipertensión, diabetes de tipo II
(NIDDM), aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, etc. Incluso en
ausencia de obesidad clínica (de acuerdo con la definición anterior)
la reducción de los almacenes de grasa corporal (notablemente los
almacenes de grasa visceral) en el hombre, especialmente en una base
a largo plazo o permanente, tendría un efecto beneficioso
significativo, tanto cosmética como fisiológicamente. De esta
manera, por medio de la prevención o tratamiento de la obesidad, los
métodos de la invención permitirán a un individuo tener una vida más
cómoda y evitar el inicio de diversas enfermedades inducidas por la
obesidad.
En otra realización, la invención proporciona un
método para tratar a un sujeto que tiene el síndrome de ovario
poliquístico (PCOS). PCOS se encuentra entre los trastornos más
comunes de las mujeres premenopáusicas, afectando a
5-10% de esta población. Es un síndrome de etiología
desconocida caracterizado por hiperandrogenismo, anovulación
crónica, defectos en la acción de la insulina, secreción de la
insulina, esteroidogénesis ovárica y fibrinolisis. Las mujeres con
PCOS a menudo presentan resistencia a la insulina y tienen un mayor
riesgo de desarrollar intolerancia a la glucosa o NIDDM en la
tercera o cuarta décadas de vida (Dunaif et al. J. Clin.
Endocrinol. Metab. 81:3299). El hiperandrogenismo también es
una característica de una diversidad de estados de resistencia a la
insulina, desde el síndrome de tipo A, a través del leprechaunismo y
la diabetes lipoatrófica, hasta el síndrome de tipo B, cuando estas
afecciones aparecen en mujeres premenopáusicas. Se ha sugerido que
la hiperinsulinemia per se produce hiperandrogenismo. Se ha
demostrado que los agentes de sensibilización a la insulina, por
ejemplo, troglitazona, son eficaces en PCOS y que, en particular, se
mejoran los defectos en la acción de la insulina, secreción de
insulina, esteroidogénesis ovárica y fibrinolisis (Ehrman et
al. J. Clin. Invest. 100:1230), tales como en seres
humanos resistentes a la insulina. Por consiguiente, la invención
proporciona métodos para reducir la resistencia a la insulina y
normalizar la glucosa sanguínea para tratar y/o prevenir de esta
manera PCOS.
La resistencia a la insulina también está
asociada con frecuencia con infecciones y cánceres. De esta manera,
la prevención o reducción de la resistencia a la insulina de acuerdo
con los métodos de la invención puede prevenir o reducir infecciones
y cánceres.
La resistencia a la insulina puede
diagnosticarse por varios métodos, tales como por el ensayo de
tolerancia a la glucosa intravenosa o por la medición del nivel de
insulina en ayunas. Es bien conocido que hay una excelente
correlación entre la altura del nivel de insulina en ayunas y el
grado de resistencia a la insulina. Por lo tanto, se podrían usar
los niveles elevados de insulina en ayunas como un marcador
sustituto para la resistencia a la insulina con el fin de
identificar a los individuos con tolerancia a la glucosa normal
(NGT) que tienen resistencia a la insulina. Otra forma de hacer
esto es seguir la estrategia descrita en The New England Journal of
Medicine, Nº 3, páginas 1188 (1995), es decir, seleccionar sujetos
obesos como un criterio inicial para la entrada en el grupo de
tratamiento. Algunos sujetos obesos tienen alterada la tolerancia a
la glucosa (IGT) mientras que otros tienen una tolerancia a la
glucosa normal (NGT). Como esencialmente todos los sujetos obesos
son resistentes a la insulina, es decir, incluso los sujetos obesos
NGT son resistentes a la insulina, tienen hiperinsulinemia en
ayunas. Por lo tanto, la diana del tratamiento de acuerdo con la
presente invención puede definirse como individuos NGT que son
obesos o que tienen hiperinsulinemia en ayunas, o que tienen ambas
cosas.
La resistencia a la insulina también puede
diagnosticarse por el ensayo de pinza de glucosa euglucémica. Este
ensayo implica la administración simultánea de una infusión
constante de insulina y una infusión de velocidad variable de
glucosa. Durante este ensayo, que dura 3-4 horas, la
concentración plasmática de glucosa se mantiene constante a niveles
euglucémicos midiendo el nivel de glucosa cada 5-10
minutos y después ajustando la infusión de glucosa de velocidad
variable para mantener el nivel plasmático de glucosa sin cambios.
En estas circunstancias, la velocidad de entrada de glucosa en la
corriente sanguínea es igual a la velocidad global de eliminación
de glucosa en el cuerpo. La diferencia entre la velocidad de
eliminación de glucosa en el estado basal (sin infusión de
insulina) y el estado con infusión de insulina representa la
captación de glucosa mediada por insulina. En individuos normales,
la insulina provoca un aumento brusco y prolongado en la eliminación
global de glucosa en el cuerpo, mientras que en sujetos NIDDM, este
efecto de la insulina está debilitado en gran medida y sólo es
20-30% del normal. En sujetos resistentes a la
insulina con IGT o NGT, la velocidad de eliminación de glucosa
estimulada por insulina está aproximadamente en la mitad del camino
entre los sujetos normales y NIDDM. Por ejemplo, a una
concentración plasmática de insulina en estado estacionario de
aproximadamente 100 uU/ml (un nivel fisiológico), la velocidad de
eliminación de glucosa en sujetos normales es de aproximadamente 7
mg/kg/min. En sujetos NIDDM, es de aproximadamente 2,5 mg/.kg/min.,
y en pacientes con IGT (o sujetos resistentes a la insulina con
NGT) es de aproximadamente 4-5 mg/kg/min. Éste es un
ensayo preciso y muy reproducible y puede distinguir pacientes
dentro de estas categorías. También se sabe que según se van
volviendo los sujetos más resistentes a la insulina, se eleva el
nivel de insulina en ayunas. Hay una excelente correlación positiva
entre la altura del nivel de insulina en ayunas y la magnitud de la
resistencia a la insulina medida por los ensayos de pinza de la
glucosa euglucémica y, por lo tanto, esto proporciona el fundamento
para usar los niveles de insulina en ayunas como medida sustituta de
la resistencia a la insulina.
De esta manera, puede usarse cualquiera de los
ensayos descritos anteriormente u otros ensayos conocidos en la
técnica para determinar que un sujeto es resistente a la insulina,
pudiendo tratarse dicho paciente de acuerdo con los métodos de la
invención para reducir o curar la resistencia a la insulina. Como
alternativa, los métodos de la invención también pueden usarse para
prevenir el desarrollo de resistencia a la insulina en un sujeto,
por ejemplo, los que se sabe que tienen un mayor riesgo de
desarrollar resistencia a la insulina.
Más generalmente, la presente invención se
refiere al tratamiento con polipéptidos GSSP4, cuando se demuestra
que un individuo tiene un genotipo particular para el marcador
GSSP4. El tratamiento comprende proporcionar polipéptidos GSSP4
farmacéuticamente aceptables al individuo. La cantidad exacta de
polipéptido GSSP4 proporcionada se determinará por medio de ensayos
clínicos bajo la pauta de médicos cualificados, pero sería de
esperar que estuviera en el intervalo de 5-7 mg por
individuo y por día. En general, un intervalo preferido sería de
0,5 a 14 mg por individuo y por día, siendo un intervalo muy
preferido el comprendido entre 1 y 10 mg por individuo y por día.
Los individuos que podrían beneficiarse del tratamiento con
polipéptidos GSSP4 pueden identificarse por genotipificación.
Los métodos de tratamiento usando
genotipificación para identificar individuos que se beneficiarían de
los tratamientos de la invención se basan en el descubrimiento de
que se han identificado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
en GSSP4 que demuestran una asociación en adolescentes obesos con
los niveles de ácidos grasos libres (FFA) y del cociente
respiratorio, otros que demuestran una asociación con la relación
entre IMC y leptina, y otros que demuestran una asociación con los
niveles de glucosa. Además, una combinación de SNP de GSSP4
asociados con el metabolismo de FFA y leptina también puede predecir
las personas que tendrán un sobrepeso grave.
En resumen, el término "genotipo", como se
usa en la presente memoria, se refiere a la identidad de los alelos
presentes en un individuo o en una muestra. El término
"genotipificación" de una muestra o un individuo en relación
con un marcador bialélico consiste en determinar el alelo específico
o el nucleótido específico que lleva un individuo en un marcador
bialélico. Los marcadores bialélicos generalmente consisten en un
polimorfismo en una posición de una sola base. Por lo tanto, cada
marcador bialélico corresponde a dos formas de una secuencia
polinucleotídica que, cuando se comparan entre sí, presentan una
modificación de nucleótido en una posición. Normalmente, la
modificación de nucleótido implica la sustitución de un nucleótido
por otro, opcionalmente el alelo original o alternativo de los
marcadores bialélicos descritos en la SEC ID Nº:1. Opcionalmente
puede especificarse que está presente el alelo original o el alelo
alternativo de estos marcadores bialélicos. Los polinucleótidos
preferidos pueden consistir, consistir esencialmente o comprender,
un tramo contiguo de nucleótidos cadena arriba y cadena abajo de la
posición de alelo alternativo indicada en la SEC ID Nº:1 así como
secuencias que son complementarias a dicho tramo. El "tramo
contiguo" puede tener una longitud de al menos 8, 10, 12, 15,
18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 ó 1000 nucleótidos, en
la medida en que un tramo contiguo de estas longitudes sea
coherente con las longitudes de la secuencia de identificación
particular.
Los métodos de genotipificación comprenden
determinar la identidad de un nucleótido en el sitio del marcador
bialélico de GSSP4 por cualquier método conocido en la técnica.
Preferiblemente se usa microsecuenciación. El genotipo se usa para
determinar si un individuo debe tratarse con polipéptidos GSSP4. De
esta manera, estos métodos de genotipificación se realizan en
muestras de ácido nucleico derivadas de un solo individuo. Estos
métodos son bien conocidos en la técnica y se describen con detalle
en las solicitudes mencionadas más adelante brevemente.
Para identificar el nucleótido presente en un
sitio de marcador bialélico puede usarse cualquier método conocido
en la técnica. Como el alelo de marcador bialélico a detectar se ha
identificado y especificado en la presente invención, la detección
resultará sencilla para un especialista en la técnica empleando
cualquiera de varias técnicas. Muchos métodos de genotipificación
requieren la amplificación previa de la región de ADN que lleva el
marcador bialélico de interés. Aunque en el momento actual a menudo
se prefiere la amplificación de la diana o señal, los presentes
métodos de genotipificación también incluyen métodos de detección
ultrasensibles que no requieren amplificación.
Los métodos bien conocidos por los especialistas
en la técnica que pueden usarse para detectar polimorfismos
bialélicos incluyen métodos tales como el análisis por transferencia
puntual convencional, análisis de polimorfismo conformacional
monocatenario (SSCP; Orita et al. (1989) Proc Natl Acad Sci
USA Apr;86(8):2766-70), electroforesis en
gel en gradiente de desnaturalización (DGGE), análisis de
heterodúplex, detección de escisión de desacoplamientos y otras
técnicas convencionales tales como las descritas en Sheffield et
al. (1991; Am J Hum Genet
Oct;49(4):699-706); White et al.
(1992), Grompe et al. ((1989) Proc Natl Acad Sci USA
Aug;86(15):5888-92; (1993) Nat Genet.
Oct;5(2):III-7). Otro método para determinar
la identidad del nucleótido presente en un sitio polimórfico
particular emplea un derivado de nucleótido resistente a
exonucleasa especializado como se describe en la patente de Estados
Unidos 4.656.127.
Los métodos preferidos implican determinar
directamente la identidad del nucleótido presente en un sitio de
marcador bialélico por un ensayo de secuenciación, ensayo de
amplificación con especificidad de alelo o ensayo de hibridación. A
continuación se proporciona una descripción de algunos métodos
preferidos. Un método muy preferido es la técnica de
microsecuenciación. El término "secuenciación" se usa en la
presente memoria para hacer referencia a la extensión por la
polimerasa de complejos de doble cadena de cebador/plantilla e
incluye tanto la secuenciación tradicional como la
microsecuenciación. Los marcadores bialélicos preferidos, como se
muestran en la SEC ID Nº:1 y los 47meros correspondientes como se
muestran en las SEC ID Nº:4-18, incluyen, pero sin
limitación:
- 1
- Marcador bialélico 1: posición base 148, alelos alternos A/G
- 2
- Marcador bialélico 2: posición base 2551, alelos alternos G/A
- 3
- Marcador bialélico 3: posición base 4417, alelos alternos A/C
- 4
- Marcador bialélico 4: posición base 6322, alelos alternos A/G (cambio de aminoácido de isoleucina a valina)
- 5
- Marcador bialélico 7: posición base 816, alelos alternos G/A
- 6
- Marcador bialélico 8: posición base 924, alelos alternos G/A
- 7
- Marcador bialélico 9: posición base 1206, alelos alternos C/A
- 8
- Marcador bialélico 10: posición base 1851, alelos alternos T/C
- 9
- Marcador bialélico 11: posición base 3124, alelos alternos C/T
- 10
- Marcador bialélico 12: posición base 3563, alelos alternos G/A
- 11
- Marcador bialélico 13: posición base 3792, alelos alternos G/A
- 12
- Marcador bialélico 14: posición base 5757, alelos alternos C/T
\vskip1.000000\baselineskip
El nucleótido presente en un sitio polimórfico
puede determinarse por métodos de secuenciación. En una realización
preferida, se someten muestras de ADN a amplificación por PCR antes
de la secuenciación usando cualquier método conocido en la técnica.
Preferiblemente, el ADN amplificado se somete a reacciones de
secuenciación con terminador didesoxi automático usando un
protocolo de secuenciación de ciclo de
colorante-cebador. El análisis de la secuencia
permite la identificación de la base presente en el sitio del
marcador bialélico.
En los métodos de microsecuenciación, el
nucleótido en un sitio polimórfico en un ADN diana se detecta por
una reacción de extensión de cebador de un solo nucleótido. Este
método implica cebadores de microsecuenciación apropiados que
hibridan justo cadena arriba de la base polimórfica de interés en el
ácido nucleico diana. Se usa una polimerasa para extender
específicamente el extremo 3' del cebador con un solo ddNTP
(terminador de la cadena) complementario al nucleótido en el sitio
polimórfico. Después se determina la identidad del nucleótido
incorporado de cualquier manera adecuada. Se describen cebadores de
microsecuenciación preferidos en la SEC ID Nº: 1.
Típicamente, las reacciones de
microsecuenciación se realizan usando ddNTP fluorescentes y los
cebadores de microsecuenciación extendidos se analizan por
electroforesis en máquinas de secuenciación ABI 377 para determinar
la identidad del nucleótido incorporado como se describe en el
documento EP 412 883. Como alternativa, puede usarse electroforesis
capilar para procesar un gran número de ensayos simultáneamente.
Pueden usarse diferentes estrategias para el
marcaje y detección de ddNTP. Se ha descrito un método de detección
de fases homogéneas basado en transferencia de energía por
resonancia de fuorescencia por Chen y Kwok ((1997) Nucleic Acids
Res. Jan 15;25(2):347-53) y Chen et
al. ((1997) Proc Natl Acad Sci USA Sep 30;94(20):
10756-61). En este método, se incuban fragmentos de
ADN genómico amplificados que contienen sitios polimórficos con un
cebador marcado con fluoresceína en el extremo 5' en presencia de
didesoxirribonucleósido trifosfatos marcados con colorante alélicos
y una Taq polimerasa modificada. El cebador marcado con colorante se
extiende una base por el colorante-terminador
específico para el alelo presente en la plantilla. Al final de la
reacción de genotipificación, se analizan directamente las
intensidades de fluorescencia de los dos colorantes en la mezcla de
reacción sin separación o purificación. Todas estas etapas pueden
realizarse en el mismo tubo y los cambios de fluorescencia pueden
controlarse a tiempo real. Como alternativa, el cebador extendido
puede analizarse por Espectrometría de masas
MALDI-TOF. La base en el sitio polimórfico se
identifica por la masa añadida sobre el cebador de
microsecuenciación (véase Haff y Smirnov, (1997) Nucleic Acids Res.
Sep 15;25(18):3749-50; (1997) Genome Res.
Apr;7(4):378-88).
La microsecuenciación puede conseguirse por el
método de microsecuenciación establecido o por modificaciones o
derivados de dicho método. Los métodos alternativos incluyen varias
técnicas de microsecuenciación en fase sólida. El protocolo básico
de microsecuenciación es el mismo que se ha descrito anteriormente,
con la excepción de que el método se realiza como un ensayo de fase
heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana se inmoviliza
o captura en un soporte sólido. Para simplificar la separación del
cebador y el análisis de adición de nucleótido terminal, se unen
oligonucleótidos a soportes sólidos o se modifican de tal manera que
se permite la separación por afinidad así como extensiones por la
polimerasa. Los extremos 5' y los nucleótidos internos de los
oligonucleótidos sintéticos pueden modificarse de varias formas
diferentes para permitir diferentes estrategias de separación de
afinidad, por ejemplo, biotinilación. Si se usa un solo grupo de
afinidad sobre los oligonucleótidos, los oligonucleótidos pueden
separarse del reactivo terminador incorporado. Esto elimina la
necesidad de separación física o por tamaños. Más de un
oligonucleótido pueden separarse del reactivo terminador y
analizarse simultáneamente si se usa más de un grupo de afinidad.
Esto permite el análisis de varias especies de ácido nucleico o más
información sobre la secuencia de ácido nucleico por reacción de
extensión. No es necesario que el grupo de afinidad esté en el
oligonucleótido de cebado, sino que puede estar presente, como
alternativa, en la plantilla.
Por ejemplo, la inmovilización puede realizarse
a través de una interacción entre el ADN biotinilado y pocillos de
microtitulación recubiertos con estreptavidina o partículas de
poliestireno recubiertas con avidina. De la misma manera, pueden
unirse oligonucleótidos o plantillas a un soporte sólido en un
formato de alta densidad. En estas reacciones de microsecuenciación
en fase sólida, los ddNTP incorporados pueden estar radiomarcados
(Syvänen, (1994) Clin Chim Acta.
May;226(2):225-36) o unidos a fluoresceína
(Livak y Hainer, (1994) Hum
Mutat.;3(4):379-85). La detección de los
ddNTP radiomarcados puede conseguirse por técnicas basadas en
centelleo. La detección de ddNTP unidos a fluoresceína puede
basarse en la unión de anticuerpo antifluoresceína conjugado con
fosfatasa alcalina, seguido de incubación con un sustrato
cromogénico (tal como fosfato de p-nitrofenilo).
Otros posibles pares de
indicador-detección incluyen: ddNTP unido a
dinitrofenilo (DNP) y conjugado anti-DNP fosfatasa
alcalina (Harju et al., (1993) Clin Chem. Nov;39(11 Pt
1):2282-7) o ddNTP biotinilado y estreptavidina
conjugada con peroxidasa de rábano picante con
o-fenilendiamina como sustrato (documento WO 92/15712). Como
otro procedimiento de microsecuenciación en fase sólida alternativo,
Nyren et al. ((1993) Anal Biochem.
Jan;208(l):171-5) describieron un método
basado en la detección de actividad ADN polimerasa por un ensayo de
detección de pirofosfato inorgánico luminométrico enzimático
(ELIDA).
Pastinen et al. ((1997) Genome Res.
Jun;7(6):606-14) describen un método para la
detección múltiple de un polimorfismos de un solo nucleótido en el
que se aplica el principio de minisecuenciación en fase sólida a un
formato de matriz de oligonucleótidos. Más adelante se describen con
más detalle matrices de alta densidad de sondas de ADN unidas a un
soporte sólido (chips de DNA).
Se apreciará que puede usarse cualquier cebador
que tenga un extremo 3' inmediatamente adyacente al nucleótido
polimórfico. De manera similar, se apreciará que puede realizarse un
análisis de microsecuenciación para cualquier marcador bialélico o
cualquier combinación de marcadores bialélicos de la presente
invención.
La discriminación entre los dos alelos de un
marcador bialélico también puede conseguirse por amplificación
específica de alelos, una estrategia selectiva por la que uno de los
alelos se amplifica sin, o a una velocidad mucho mayor que, la
amplificación del otro alelo. Esto se consigue situando la base
polimórfica en el extremo 3' de uno de los cebadores de
amplificación. Debido a las formas de extensión desde el extremo 3'
del cebador, una no coincidencia en o cerca de esta posición tiene
un efecto inhibidor sobre la amplificación. Por lo tanto, en
condiciones de amplificación apropiadas, estos cebadores sólo
dirigen la amplificación en su alelo complementario. La
determinación de la localización precisa de la no coincidencia y de
las condiciones de ensayo correspondientes está dentro del
conocimiento del especialista en la técnica.
El "Ensayo de Ligamiento a
Oligonucleótidos" (OLA) usa dos oligonucleótidos que se diseñan
de manera que sean capaces de hibridarse a secuencias contiguas de
una sola cadena de las moléculas diana. Uno de los oligonucleótidos
se biotinila, y el otro se marca de forma detectable. Si se
encuentra la secuencia complementaria precisa en una molécula
diana, los oligonucleótidos hibridarán de tal forma que sus extremos
estén contiguos, y se creará un sustrato de ligamiento que puede
capturarse o detectarse. El OLA puede detectar polimorfismos de un
solo nucleótido y puede combinarse ventajosamente con PCR como se
describe por Nickerson et al. ((1990) Proc Natl Acad Sci USA
Nov; 87(22): 8923-7). En este método, se usa
PCR para conseguir la amplificación exponencial del ADN diana, que
después se detecta usando OLA.
Otros métodos de amplificación que son
particularmente adecuados para la detección de polimorfismo de un
solo nucleótido incluyen LCR (reacción en cadena de la ligasa) y
Gap LCR (GLCR). LCR usa dos pares de sondas para amplificar
exponencialmente una diana específica. Las secuencias de cada pareja
de oligonucleótidos se seleccionan de manera que permitan al par
hibridarse con las secuencias contiguas de la misma cadena de la
diana. Dicha hibridación forma un sustrato para una ligasa
dependiente de plantilla. De acuerdo con la presente invención, la
LCR puede realizarse con oligonucleótidos que tienen las secuencias
proximal y distal de la misma cadena de un sitio del marcador
bialélico.
En una realización, el oligonucleótido se
diseñará de forma que incluya el sitio del marcador bialélico. En
dicha realización, las condiciones de reacción se seleccionan para
que los oligonucleótidos puedan ligarse juntos sólo si la molécula
diana contiene o carece del nucleótido específico que es
complementario al marcador bialélico del oligonucleótido.
En una realización alternativa, los
oligonucleótidos no incluirán el marcador bialélico, de tal forma
que cuando se hibriden con la molécula diana, se cree un
"hueco" como se describe en el documento WO 90/01069. Después,
este hueco se "carga" con dNTP complementarios (como los
mediados por ADN polimerasa), o por un par adicional de
oligonucleótidos. Por lo tanto, al final de cada ciclo, cada cadena
individual tiene un complemento capaz de servir como diana durante
el siguiente ciclo y se obtiene amplificación exponencial de forma
específica para el alelo de la secuencia deseada.
El Genetic Bit Analysis^{TM} mediado por
liagasa/polimerasa es otro método para determinar la identidad de
un nucleótido en un sitio seleccionado previamente en una molécula
de ácido nucleico (documento WO 95/21271). Este método implica la
incorporación de un nucleósido trifosfato que es complementario al
nucleótido presente en el sitio seleccionado previamente sobre el
extremo de una molécula cebadora, y su posterior ligamiento con un
segundo oligonucleótido. La reacción se controla detectando un
marcador específico unido a la fase sólida de la reacción o por
detección en solución.
Un método preferido para determinar la identidad
del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico
hibridación de ácido nucleico. Las sondas de hibridación que pueden
usarse convenientemente en tales reacciones, incluyen
preferiblemente sondas específicas para ADNc de GSSP4 que rodean a
los marcadores bialélicos de GSSP4. Puede usarse cualquier ensayo
de hibridación incluyendo hibridación de Southern, hibridación de
Northern, hibridación de transferencia puntual e hibridación en fase
sólida (véase Sambrook et al., supra).
Hibridación se refiere a la formación de una
estructura dúplex mediante dos ácidos nucleicos monocatenarios
debido al emparejamiento de bases complementarias. Puede producirse
hibridación entre cadenas de ácido nucleico exactamente
complementarias o entre cadenas de ácido nucleico que contienen
regiones minoritarias de desacoplamientos. Pueden diseñarse sondas
específicas que hibriden con una forma de marcador bialélico y no
con la otra y, por lo tanto, que sean capaces de discriminar entre
diferentes formas alélicas. Las sondas con especificidad de alelo a
menudo se usan por parejas, mostrando un miembro de un par un
acoplamiento perfecto con una secuencia diana que contiene el alelo
original y mostrando el otro un acoplamiento perfecto con la
secuencia diana que contiene el alelo alternativo.
Las condiciones de hibridación deben ser
suficientemente rigurosas como para que haya una diferencia
significativa en la intensidad de hibridación entre alelos, y
preferiblemente una respuesta esencialmente binaria, con lo que una
sonda hibrida sólo con uno de los alelos. Las condiciones de
hibridación rigurosas, con especificidad de secuencia, bajo las
cuales una sonda hibridará sólo con la secuencia diana exactamente
complementaria son bien conocidas en la técnica (Sambrook et
al., supra). Las condiciones rigurosas son dependientes de la
secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En
general, las condiciones rigurosas se seleccionan de manera que
estén aproximadamente 5ºC por debajo del punto de fusión térmica
(Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH
definidos. Aunque estas hibridaciones pueden realizarse en solución,
se prefiere emplear un ensayo de hibridación en fase sólida. El ADN
diana que comprende un marcador bialélico de la presente invención
puede amplificarse antes de la reacción de hibridación.
La presencia de un alelo específico en la
muestra se determina detectando la presencia o ausencia de dúplex
híbridos estables formados entre la sonda y el ADN diana. La
detección de dúplex híbridos puede realizarse por varios métodos.
Se conocen bien varios formatos de ensayos de detección que utilizan
marcadores detectables unidos a la diana o a la sonda para permitir
la detección de los dúplex híbridos. Típicamente, los dúplex de
hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y
después se detectan los marcadores unidos a los dúplex. Los
especialistas en la técnica reconocerán que pueden emplearse etapas
de lavado para retirar el exceso de ADN diana o sonda, así como el
conjugado no unido. Además, son adecuados formatos de ensayo
heterogéneos convencionales para detectar los híbridos usando los
marcadores presentes en los cebadores y sondas.
Dos ensayos desarrollados recientemente permiten
la discriminación de alelos basada en la hibridación sin necesidad
de separaciones o lavados (véase Landegren U. et al., (1998)
Genome Res. Aug;8(8):769-76). En ensayo
TaqMan aprovecha la actividad nucleasa 5' de la Taq ADN polimerasa
para digerir una sonda de ADN hibridada específicamente con el
producto de amplificación que se acumula. Las sondas TaqMan se
marcan con un par de colorante donador-aceptor que
interacciona por transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET). La escisión de la sonda TaqMan por la
polimerasa en avance durante la amplificación disocia el colorante
donador del colorante aceptor de inactivación, aumentando en gran
medida la fluorescencia del donador. Todos los reactivos necesarios
para detectar dos variantes alélicas pueden ensamblarse al principio
de la reacción y los resultados se controlan a tiempo real (véase
Livak et al., 1995).
En un procedimiento basado en hibridación
homogénea alternativa, se usan balizas moleculares para las
discriminaciones de alelos. Las balizas moleculares son sondas
oligonucleotídicas con forma de horquilla que indican la presencia
de ácidos nucleicos específicos en soluciones homogéneas. Cuando se
unen a sus dianas, experimentan una reorganización conformacional
que restaura la fluorescencia de un fluoróforo inactivado
internamente (Tyagi et al., (1998) Nat Biotechnol.
Jan;16(1):49-53).
Los polinucleótidos proporcionados en la
presente memoria pueden usarse para producir sondas que pueden
usarse en ensayos de hibridación para la detección de alelos
marcadores bialélicos en muestras biológicas. Estas sondas se
caracterizan por comprender preferiblemente entre 8 y 50
nucleótidos, y por ser suficientemente complementarias a una
secuencia que comprende un marcador bialélico de la presente
invención como para hibridar con el mismo y preferiblemente por ser
suficientemente específicas como para poder discriminar la secuencia
diana para una sola variación de nucleótido. Una sonda
particularmente preferida tiene una longitud de 25 nucleótidos.
Preferiblemente, el marcador bialélico está a una distancia menor de
4 nucleótidos del centro de la sonda polinucleotídica. En sondas
particularmente preferidas, el marcador bialélico está en el centro
de dicho polinucleótido. En realizaciones preferidas, la base
polimórfica está a una distancia de menos de 5, 4, 3, 2 ó 1
nucleótido del centro de dicho polinucleótido, más preferiblemente
en el centro de dicho polinucleótido. Preferiblemente, las sondas de
la presente invención están marcadas o inmovilizadas en un soporte
sólido.
Por medio del ensayo de la hibridación con una
sonda con especificidad de alelo, se puede detectar la presencia o
ausencia de un alelo marcador bialélico en una muestra dada. Dentro
de los "ensayos de hibridación" se incluyen específicamente
hibridaciones paralelas de alto rendimiento en formato de matriz y
se describen más adelante.
Los ensayos de hibridación basados en matrices
de oligonucleótidos se basan en las diferencias en estabilidad de
hibridación de oligonucleótidos cortos con variantes de secuencia
diana perfectamente emparejadas y desemparejadas. Se consigue un
acceso eficaz a la información sobre el polimorfismo a través de una
estructura básica que comprende matrices de alta densidad de sondas
oligonucleotídicas unidas a un soporte sólido (por ejemplo, el
chip) en posiciones seleccionadas. Cada chip de ADN puede contener
de miles a millones de sondas de ADN sintéticas individuales
dispuestas en un patrón de tipo rejilla y miniaturizarse hasta el
tamaño de un dime.
La tecnología del chip ya se ha aplicado con
éxito en numerosos casos. Por ejemplo, se ha realizado la selección
de mutaciones en el gen BRCA1, en cepas mutantes de S.
cerevisiae, y en el gen de la proteasa del virus
VIH-1 (Hacia et al., (1996) Nat Genet.
Dec;14(4):441-7; Shoemaker et al.,
(1996) Nat Genet Dec; 14(4):450-6; Kozal
et al., (1996) Nat Med.
Jul;2(7):753-9). Pueden producirse chips de
diversos formatos para uso en la detección de polimorfismos
bialélicos en una base adaptada por Affymetrix (GeneChip^{TM}),
Hyseq (HyChip y HyGnostics) y Protogene Laboratories.
En general, estos métodos emplean matrices de
sondas oligonucleotídicas que son complementarias a segmentos de
secuencia de ácido nucleico diana de un individuo, incluyendo dichas
secuencias diana un marcador polimórfico. El documento EP 785280
describe una estrategia de enlosamiento para la detección de
polimorfismos de un solo nucleótido.
En resumen, las matrices generalmente pueden
"enlosarse" para un gran número de polimorfismos específicos.
Por "enlosamiento" se entiende generalmente la síntesis de una
serie definida de sondas oligonucleotídicas que se obtiene a partir
de una secuencia complementaria a la secuencia diana de interés, así
como variaciones preseleccionadas de esa secuencia, por ejemplo,
sustitución de una o más posiciones dadas con uno o más miembros de
la serie base de monómeros, es decir, nucleótidos. En la solicitud
PCT Nº WO 95/11995 se describen adicionalmente estrategias de
enlosamiento. En un aspecto particular, las matrices se enlosan para
un número de secuencias marcadoras bialélicas identificadas
específicas. En particular, la matriz se enlosa para incluir varios
bloques de detección, siendo específico cada bloque de detección
para un marcador bialélico específico o una serie de marcadores
bialélicos.
\newpage
Por ejemplo, un bloque de detección puede
enlosarse para incluir varias sondas que incluyen el segmento de
secuencia que incluye un polimorfismo específico. Para asegurar
sondas que son complementarias a cada alelo, las sondas se
sintetizan en pares que difieren en el marcador bialélico. Además de
las sondas que difieren en la base polimórfica, dentro del bloque
de detección generalmente también se enlosan sondas monosustituidas.
Estas sondas monosustituidas tienen bases en y hasta un cierto
número de bases en cualquier dirección desde el polimorfismo,
sustituidas con los demás nucleótidos (seleccionados entre A, T, G,
C y U). Típicamente, las sondas en un bloque de detección enlosado
incluirán sustituciones de las posiciones de secuencia hasta y que
incluyen las que están separadas por 5 bases del marcador bialélico.
Las sondas monosustituidas proporcionan controles internos para la
matriz enlosada, para distinguir la hibridación real de la
hibridación cruzada artefactual. Después de completar la
hibridación con la secuencia diana y de lavar la matriz, la matriz
se explora para determinar la posición de la matriz con la que
hibrida la secuencia diana. Después se analizan los datos de
hibridación de la matriz explorada para identificar el alelo o
alelos del marcador bialélico que están presentes en la muestra. La
hibridación y la exploración pueden realizarse como se describe en
la publicación PCT Nº WO 92/10092 y WO 95/11995 y en la patente de
Estados Unidos Nº 5.424.186.
De esta manera, en algunas realizaciones los
chips pueden comprender una matriz de secuencias de ácido nucleico
de fragmentos de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En
realizaciones preferidas, la base polimórfica está a una distancia
de menos de 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido del centro de dicho
polinucleótido, más preferiblemente en el centro de dicho
polinucleótido. En algunas realizaciones, el chip puede comprender
una matriz de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de estos
polinucleótidos.
Otra técnica que puede usarse para analizar
polimorfismos incluye sistemas integrados multicomponente que
miniaturizan y compartimentalizan procesos tales como PCR y
reacciones de electroforesis capilar en un solo dispositivo
funcional. Se describe un ejemplo de esta técnica en la patente de
Estados Unidos 5.589.136, que describe la integración de la
amplificación por PCR y la electroforesis capilar en chips.
Pueden preverse sistemas integrados
principalmente cuando se usan sistemas de microfluidos. Estos
sistemas comprenden un patrón de microcanales diseñados en una
oblea de vidrio, silicio, cuarzo o plástico incluida en un
microchip. El movimiento de las muestras se controla por fuerzas
eléctricas, electro-osmóticas o hidrostáticas
aplicadas a través de diferentes áreas del microchip para crear
válvulas microscópicas funcionales y bombas sin partes móviles.
Variando el voltaje se controla el flujo de líquido en
intersecciones entre los canales micromecanizados y cambios en el
caudal de líquido para el bombeo a través de diferentes secciones
del microchip.
Para la genotipificación de marcadores
bialélicos, el sistema de microfluidos puede integrar amplificación
de ácidos nucleicos, microsecuenciación, electroforesis capilar y un
método de detección tal como detección de fluorescencia inducida por
láser.
En una primera etapa, las muestras de ADN se
amplifican, preferiblemente por PCR. Después, los productos de
amplificación se someten a reacciones de microsecuenciación
automáticas usando ddNTP (fluorescencia específica para cada ddNTP)
y los cebadores de oligonucleótidos apropiados que hibridan cadena
arriba de la base polimórfica diana. Una vez finalizada la
extensión en el extremo 3', los cebadores se separan de los ddNTP
fluorescentes no incorporados por electroforesis capilar. El medio
de separación usado en electroforesis capilar puede ser, por
ejemplo, poliacrilamida, polietilenglicol o dextrano. Los ddNTP
incorporados en los productos de extensión de cebador de un solo
nucleótido se identifican por detección de fluorescencia. Este
microchip puede usarse para procesar al menos de 96 a 384
mues-
tras en paralelo. Puede usar la detección de fluorescencia inducida por láser de cuatro colores habitual de los ddNTP.
tras en paralelo. Puede usar la detección de fluorescencia inducida por láser de cuatro colores habitual de los ddNTP.
Los estudios de asociación se centran en las
frecuencias de población y se basan en el fenómeno de desequilibrio
de ligamiento. El desequilibrio de ligamiento es la desviación de la
aleatoriedad de la aparición de pares de alelos específicos en
diferentes loci en el mismo cromosoma. Si un alelo específico en un
gen dado está asociado directamente con un rasgo particular, su
frecuencia estará estadísticamente aumentada en una población
afectada (positiva para el rasgo), en comparación con la frecuencia
en una población negativa para el rasgo o en una población de
control aleatoria. Como consecuencia de la existencia de
desequilibrio de ligamiento, la frecuencia de todos los demás
alelos presentes en el haplotipo que lleva el alelo causante del
rasgo también estará aumentada en individuos positivos para el
rasgo en comparación con individuos negativos para el rasgo o
controles aleatorios. Por lo tanto, la asociación entre el rasgo y
cualquier alelo (específicamente un alelo marcador bialélico) en el
desequilibrio de ligamiento con el alelo causante del rasgo será
suficiente para sugerir la presencia de un gen relacionado con el
rasgo en esa región particular.
Pueden genotipificarse poblaciones de
casos-control en relación con marcadores bialélicos
para identificar asociaciones que localicen de forma más estrecha
un alelo causante de un rasgo, ya que cualquier marcador en
desequilibrio de ligamiento con un marcador dado asociado con un
rasgo se asociará con el rasgo. El desequilibrio de ligamiento
permite analizar las frecuencias relativas en poblaciones de
casos-control de un número limitado de
polimorfismos genéticos (específicamente marcadores bialélicos) como
alternativa a la selección de todos los polimorfismos funcionales
posibles para encontrar alelos causantes de rasgos. Los estudios de
asociación comparan la frecuencia de alelos marcadores en
poblaciones de casos-control no relacionadas, y
representan herramientas poderosas para la disección de rasgos
complejos.
Los estudios de asociación basados en la
población no se refieren a la herencia familiar, sino que comparan
la prevalencia de un marcador genético particular, o una serie de
marcadores, en poblaciones de casos-control. Son
estudios de casos-control basados en la comparación
de individuos de casos no relacionados (afectados o positivos para
el rasgo) e individuos de control no relacionados (no afectados,
negativos para el rasgo o aleatorios). Preferiblemente, el grupo de
control se compone de individuos no afectados o negativos para el
rasgo. Además, el grupo de control es étnicamente correspondiente a
la población de casos. Además, el grupo de control preferiblemente
corresponde a la población de casos para el factor de confusión
conocido principal para el rasgo en estudio (por ejemplo, coincide
en edad en caso de un rasgo dependiente de la edad). Idealmente,
los individuos de las dos muestras se emparejan de tal manera que es
de esperar que difieran únicamente en su estado de enfermedad. Las
expresiones "población positiva para el rasgo", "población de
casos" y "población afectada" se usan indistintamente en la
presente memoria.
Una etapa importante en la disección de rasgos
complejos usando estudios de asociación es la elección de
poblaciones de casos-control (véase, Lander y
Schork, (1994) Science, Sep
30;265(5181):2037-48). Una etapa importante
en la elección de poblaciones de casos-control es la
definición clínica de un rasgo o fenotipo dado. Cualquier rasgo
genético puede analizarse por el método de asociación propuesto en
la presente memoria por medio de la selección cuidadosa de los
individuos a incluir en los grupos fenotípicos positivo y negativo
para el rasgo. A menudo son útiles cuatro criterios: fenotipo
clínico, edad de inicio, historia familiar y gravedad.
El procedimiento de selección para rasgos
continuos o cuantitativos (tales como, por ejemplo, la presión
sanguínea) implica la selección de individuos en extremos opuestos
de la distribución fenotípica del rasgo en estudio, para incluir en
estas poblaciones positiva para el rasgo y negativa para el rasgo
individuos con fenotipos no solapantes. Preferiblemente, las
poblaciones de casos-control consisten en
poblaciones fenotípicamente homogéneas. Las poblaciones positivas
para el rasgo y negativas para el rasgo consisten en poblaciones
fenotípicamente uniformes de individuos, representando cada uno
entre 1 y 98%, preferiblemente entre 1 y 80%, más preferiblemente
entre 1 y 50%, aún más preferiblemente entre 1 y 30% y aún más
preferiblemente entre 1 y 20% de la población total en estudio, y
estos individuos preferiblemente se seleccionan entre individuos que
presentan fenotipos no solapantes. Cuanto más clara es la
diferencia entre los dos fenotipos del rasgo, mayor es la
probabilidad de detectar una asociación con marcadores bialélicos.
La selección de los fenotipos drásticamente diferentes pero
relativamente uniformes permite comparaciones eficaces en estudios
de asociación y la posible detección de diferencias marcadas a
nivel genético, siempre que los tamaños de muestra de las
poblaciones en estudio sean suficientemente significativos.
En realizaciones preferidas, se recluta un
primer grupo de entre 50 y 300 individuos positivos para el rasgo,
preferiblemente aproximadamente 100 individuos, de acuerdo con sus
fenotipos. En estos estudios se incluye un número similar de
individuos negativos para el rasgo.
En la presente invención, los ejemplos típicos
de criterios de inclusión incluyen obesidad y trastornos
relacionados con la obesidad así como parámetros fisiológicos
asociados con la obesidad tales como niveles de ácidos grasos
libres, niveles de glucosa, niveles de insulina, niveles de leptina,
niveles de triglicéridos, niveles de oxidación de ácidos grasos
libres y pérdida de peso.
La estrategia general para realizar estudios de
asociación usando marcadores bialélicos derivados de una región que
lleva un gen candidato es explorar dos grupos de individuos
(poblaciones de casos-control) para medir y
comparar estadísticamente las frecuencias de alelos de los
marcadores bialélicos de la presente invención en los dos
grupos.
Si se identifica una asociación estadísticamente
significativa con un rasgo para al menos uno o más de los
marcadores bialélicos analizados, se puede asumir que: el alelo
asociado es directamente responsable de causar el rasgo (es decir,
el alelo asociado es el alelo causante del rasgo), o más
probablemente, el alelo asociado está en desequilibrio de
ligamiento con al alelo causante del rasgo. Las características
específicas del alelo asociado con respecto a la función del gen
candidato normalmente proporcionan una perspectiva adicional a la
relación entre el alelo asociado y el rasgo (causal o en
desequilibrio de ligamiento). Si las pruebas indican que lo más
probable es que el alelo asociado dentro del gen candidato no sea el
alelo causante del rasgo sino que esté en desequilibrio de
ligamiento con el alelo causante del rasgo real, el alelo causante
del rasgo puede encontrarse por secuenciación de las proximidades
del marcador asociado, y realizando estudios adicionales de
asociación con los polimorfismos que se revelan de una manera
repetitiva. Los estudios de asociación normalmente se realizan en
dos etapas sucesivas. En una primera fase, en las poblaciones
positiva para el rasgo y negativa para el rasgo se determinan las
frecuencias de un número reducido de marcadores bialélicos del gen
candidato. En una segunda fase del análisis, se refina
adicionalmente la posición de los loci genéticos responsables del
rasgo dado usando una mayor densidad de marcadores de la región
relevante. Sin embargo, si el gen candidato en estudio tiene una
longitud relativamente pequeña, puede ser suficiente una sola fase
para establecer asociaciones significativas.
Como se ha descrito anteriormente, cuando
aparece por primera vez un cromosoma que lleva un alelo de una
enfermedad en una población como resultado de mutación o migración,
el alelo mutante necesariamente reside en un cromosoma que tiene
una serie de marcadores ligados: el haplotipo ancestral. Este
haplotipo puede rastrearse a través de poblaciones y puede
analizarse su asociación estadística con un rasgo dado. Los estudios
de asociación de complementación de un solo punto (alélico) con
estudios de asociación de múltiples puntos también denominados
estudios de haplotipo aumentan la potencia estadística de los
estudios de asociación. De esta manera, un estudio de asociación de
haplotipo permite definir la frecuencia y el tipo de haplotipo
portador ancestral. El análisis del haplotipo es importante ya que
aumenta la potencia estadística de un análisis que implica
marcadores individuales.
En una primera etapa de un análisis de
frecuencia de haplotipo, se determina la frecuencia de los posibles
haplotipos basándose en diversas combinaciones de los marcadores
bialélicos identificados de la invención. Después se compara la
frecuencia de haplotipo para poblaciones distintas de individuos
positivos para el rasgo y de control. El número de individuos
positivos para el rasgo que deberían someterse a este análisis para
obtener resultados estadísticamente significativos normalmente varía
entre 30 y 300, variando el número preferido de individuos entre 50
y 150. Se aplican las mismas consideraciones al número de individuos
no afectados (o control aleatorio) usados en el estudio. Los
resultados de este primer análisis proporcionan frecuencias de
haplotipo en poblaciones de casos-control, y para
cada frecuencia de haplotipo evaluada, se calculan un valor de p y
una razón de posibilidades. Si se encuentra una asociación
estadísticamente significativa, puede conseguirse una aproximación
del riesgo relativo de que un individuo que lleva el haplotipo dado
esté afectado con el rasgo en estudio.
Los marcadores bialélicos de la presente
invención también pueden usarse para identificar patrones de
marcadores bialélicos asociados con rasgos detectables resultantes
de interacciones poligénicas. El análisis de la interacción
genética entre alelos en loci no ligados requiere una
genotipificación individual usando las técnicas descritas en la
presente memoria. El análisis de la interacción alélica entre una
serie seleccionada de marcadores bialélicos con un nivel apropiado
de significado estadístico puede considerarse un análisis de
haplotipo. El análisis de interacción consiste en estratificar las
poblaciones de casos-control con respecto a un
haplotipo dado para los primeros loci y realizar un análisis de
haplotipo con los segundos loci con cada subpoblación.
La invención se refiere a métodos para
seleccionar uno o más compuestos que modulen la actividad de GSSP4
en las células, que incluyen proporcionar posibles compuestos a
ensayar a las células. En los ejemplos 2, 5-7,
9-11 se describen ensayos ejemplares que pueden
usarse. En estos ensayos se añadirían compuestos a ensayar con
respecto su actividad inhibidora o estimuladora en comparación con
los efectos de polipéptidos GSSP4 solos. También pueden usarse
otros ensayos en los que se observa un efecto basándose en la
adición de polipéptidos GSSP4 para seleccionar moduladores de la
actividad de polipéptidos GSSP4 o efectos de la presencia de
polipéptidos GSSP4 en las células. La etapa esencial es aplicar un
compuesto desconocido y después controlar en un ensayo el cambio
con respecto a lo que se observa cuando sólo se aplican a las
células los polipéptidos GSSP4. Un cambio se define como algo que
es significativamente diferente en presencia del compuesto más un
polipéptido GSSP4 en comparación con cuando está presente el
polipéptido GSSP4 solo. En este caso, sería significativamente
diferente un "aumento" o una "disminución" en un efecto
medible de al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%
o 75%.
El término "modulación", como se usa en la
presente memoria, se refiere a un cambio medible en una actividad.
Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, modulación de receptores
estimulados por lipolisis (LSR), modulación de leptina, modulación
de lipoproteínas, niveles plasmáticos de FFA, oxidación de FFA,
niveles de TG, niveles de glucosa y peso. Estos efectos pueden ser
in vitro o preferiblemente in vivo. La modulación de
una actividad puede ser un aumento o una reducción de la actividad.
De esta manera, la actividad de LSR puede aumentarse o disminuirse,
la actividad de la leptina puede aumentarse o disminuirse y la
actividad de lipoproteínas puede aumentarse o disminuirse. De
manera similar, los niveles de FFA, TG y glucosa (y el peso) pueden
aumentarse o disminuirse in vivo. La oxidación de ácidos
grasos libres puede aumentarse o disminuirse in vivo o ex
vivo.
Por actividad "LSR" se entiende la
expresión de LSR en la superficie de la célula, o en una
conformación particular, así como su capacidad de unirse a, captar
y degradar la leptina o lipoproteínas. Por actividad de la
"leptina" se entiende su unión, captación o degradación por
LSR, así como su transporte a través de la barrera hematoencefálica,
y potencialmente estos sucesos cuando LSR no es necesariamente el
factor de mediación o el único factor de mediación. De manera
similar, por actividad de "lipoproteína" se entiende su unión,
captación y degradación por LSR, así como estos sucesos cuando LSR
no es necesariamente el factor de mediación o el único factor de
mediación. En los ejemplos 2, 5-7,
9-11 se proporcionan ensayos ilustrativos. Estos
ensayos y otros ensayos comparables pueden usarse para
determinar/identificar compuestos que modulan la actividad de los
polipéptidos GSSP4. En algunos casos, puede ser importante
identificar compuestos que modulan algunas pero no todas las
actividades de los polipéptidos GSSP4, aunque preferiblemente se
modifican todas las actividades.
El término "aumentar", como se usa en la
presente memoria, se refiere a la capacidad de un compuesto de
aumentar la actividad de los polipéptidos GSSP4 de alguna manera
medible en comparación con el efecto de los polipéptidos GSSP4 en
su ausencia. Como resultado de la presencia del compuesto, puede
aumentar la unión y/o la captación de leptina, por ejemplo, en
comparación con los controles en presencia del polipéptido GSSP4
solo. Preferiblemente, un aumento de actividad es un aumento de al
menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% en
comparación con el nivel de actividad en presencia del polipéptido
GSSP4.
De manera similar, el término "disminuir",
como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de un
compuesto de disminuir la actividad de alguna manera medible en
comparación con el efecto de un polipéptido GSSP4 en su ausencia.
Por ejemplo, la presencia del compuesto reduce las concentraciones
plasmáticas de FFA, TG y glucosa en ratones. Además, como resultado
de la presencia de un compuesto, puede disminuir la unión y/o la
captación de leptina, por ejemplo, en comparación con los controles
en presencia del polipéptido GSSP4 solo. Preferiblemente, una
disminución de actividad es una disminución de al menos 25%, 30%,
35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% en comparación con el
nivel de actividad en presencia del polipéptido GSSP4 solo.
La invención se refiere a un método para
identificar un compuesto potencial para modular la masa corporal en
un individuo que necesita una modulación de la masa corporal, que
comprende: a) poner en contacto una célula con un polipéptido GSSP4
y un compuesto candidato; b) detectar un resultado seleccionado
entre el grupo consistente en modulación de LSR, modulación de
leptina, modulación de lipoproteína; modulación de la oxidación de
FFA; y c) donde dicho resultado identifica dicho compuesto
potencial si dicho resultado difiere del resultado obtenido cuando
dicha célula se pone en contacto con el polipéptido GSSP4 solo.
En realizaciones preferidas, dicha puesta en
contacto comprende además un ligando de dicho LSR. Preferiblemente
dicho ligando se selecciona entre el grupo consistente en
citoquinas, lipoproteínas, ácido grasos libres y C1q, y más
preferiblemente dicha citoquina es leptina, y aún más
preferiblemente dicha leptina es un fragmento polipeptídico de
leptina como se describe en la solicitud provisional de Estados
Unidos Nº 60/155.506 incorporada en la presente memoria como
referencia en su totalidad, incluyendo cualquier figura, dibujo o
tabla.
En otras realizaciones preferidas, dicho
polipéptido GSSP4 es de ratón o de ser humano. En otras
realizaciones preferidas, dicha célula se selecciona entre el grupo
consistente en PLC, CHO-K1, Hep3B y HepG2.
En otra realización preferida, dicha modulación
de lipoproteína se selecciona entre el grupo consistente en la
unión, captación y degradación. Preferiblemente, dicha modulación es
un aumento de dicha unión, captación o degradación. Como
alternativa, dicha modulación es una reducción de dicha unión,
captación o degradación.
En otras realizaciones preferidas, la modulación
de leptina se selecciona entre el grupo consistente en la unión,
captación, degradación y transporte. Preferiblemente, dicha
modulación es un aumento de dicha unión, captación, degradación o
transporte. Como alternativa, dicha modulación es una reducción de
dicha unión, captación, degradación o transporte. Preferiblemente,
dicho transporte es a través de la barrera hematoencefálica.
En otras realizaciones preferidas, dicha
modulación de LSR es la expresión en la superficie de dicha célula.
Preferiblemente, dicha detección comprende FACS, más preferiblemente
dicha detección comprende además anticuerpos que se unen
específicamente a dicho LSR, y aún más preferiblemente dichos
anticuerpos se unen específicamente al extremo carboxi de dicho
LSR.
En otras realizaciones preferidas, dicho
compuesto potencial se selecciona entre el grupo consistente en
péptidos, bibliotecas de péptidos, bibliotecas no peptídicas,
peptoides, ácidos grasos, lipoproteínas, medicamentos, anticuerpos,
moléculas pequeñas y proteasas.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a polipéptidos que llevan epítopos y fragmentos
polipeptídicos que llevan epítopos. Estos epítopos pueden ser
"epítopos antigénicos" o tanto un "epítopo antigénico"
como un "epítopo inmunogénico". Un "epítopo inmunogénico"
se define como parte de una proteína que induce una respuesta de
anticuerpo in vivo cuando el polipéptido es el inmunógeno.
Por otra parte, una región de polipéptido a la que se une un
anticuerpo se define como un "determinante antigénico" o
"epítopo antigénico". El número de epítopos inmunogénicos de
una proteína generalmente es menor que el número de epítopos
antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen, et al. (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:39984002. Debe tenerse en cuenta
particularmente que aunque un epítopo particular puede no ser
inmunogénico, es útil ya que pueden obtenerse anticuerpos in
vitro contra cualquier epítopo.
Un epítopo puede comprender tan solo 3
aminoácidos en un conformación espacial que es única para el
epítopo. En general, un epítopo consiste en al menos 6 de estos
aminoácidos, y con más frecuencia al menos 8-10 de
estos aminoácidos. En una realización preferida, los epítopos
antigénicos comprenden un número de aminoácidos que es cualquier
número entero comprendido entre 3 y 50. Pueden producirse fragmentos
que funcionan como epítopos por medios convencionales. Véase, por
ejemplo, Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:5131-5135 (1985), descrito adicionalmente en la
Patente de Estados Unidos Nº 4.631.211. Los métodos para determinar
los aminoácidos que constituyen un epítopo inmunogénico incluyen
cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear
bidimensional y mapeo de epítopos, por ejemplo, el método Pepscan
descrito por H. Mario Geysen et al. (1984); Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002; Publicación PCT Nº
WO 84/03564; y Publicación PCT Nº WO 84/03506. Otro ejemplo es el
algoritmo de Jameson y Wolf, Comp. Appl. Biosci.
4:181-186 (1988) (incorporándose dicha bibliografía
como referencia en su totalidad). El análisis antigénico de
Jameson-Wolf, por ejemplo, puede realizarse usando
el programa informático PROTEAN, usando parámetros por defecto
(Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison,
WI).
Los fragmentos que llevan epítopos de la
presente invención preferiblemente comprenden de 6 a 50 aminoácidos
(es decir, cualquier número entero comprendido entre 6 y 50,
inclusive) de un polipéptido de la presente invención. También se
incluyen en la presente invención fragmentos antigénicos entre los
números enteros 6 y la secuencia de longitud completa de la lista
de secuencias. Se incluyen todas las combinaciones de secuencias
entre los números enteros de 6 y la secuencia de longitud completa
de un polipéptido de la presente invención. Los fragmentos que
llevan epítopos pueden especificarse por el número de restos
aminoacídicos contiguos (como un subgénero) o por posiciones
N-terminales y C-terminales
específicas (como especie) como se ha descrito anteriormente en
relación con los fragmentos polipeptídicos de la presente invención.
De la misma manera, también puede excluirse cualquier número de
fragmentos que llevan epítopos de la presente invención.
Los epítopos antigénicos son útiles, por
ejemplo, para inducir anticuerpos, incluyendo anticuerpos
monoclonales, que se unen específicamente al epítopo (véase Wilson
et al., 1984; y Sutcliffe, J. G. et al., 1983). Los
anticuerpos después pueden usarse en diversas técnicas tales como
técnicas de diagnóstico y de identificación de tejidos/células, como
se describe en la presente memoria, y en métodos de
purificación.
De manera similar, pueden usarse epítopos
inmunogénicos para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien
conocidos en la técnica (véase, Sutcliffe et al., supra;
Wilson et al., supra; Chow, M. et al.;(1985) y Bittle,
F. J. et al., (1985). Un epítopo inmunogénico preferido
incluye los polipéptidos de la lista de secuencias. Los epítopos
inmunogénicos pueden presentarse junto con un vehículo proteico, tal
como albúmina, a un sistema animal (tal como un conejo o ratón) si
es necesario. Se ha demostrado que epítopos inmunogénicos que
comprenden sólo de 8 a 10 aminoácidos son suficientes para inducir
anticuerpos capaces de unirse a, como mínimo, epítopos lineales de
un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en transferencia de
Western.).
Los polipéptidos que llevan epítopos de la
presente invención se usan para inducir anticuerpos de acuerdo con
métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero sin
limitación, inmunización in vivo, inmunización in
vitro y métodos de presentación en fagos (véase, por ejemplo,
Sutcliffe, et al., supra; Wilson, et al.,
supra y Bittle, et al., 1985). Si se usa inmunización
in vivo, los animales pueden inmunizarse con el péptido
libre; sin embargo, puede reforzarse la titulación de anticuerpo
anti-péptido por acoplamiento del péptido a un
vehículo macromolecular, tal como hemocianina de lapa californiana
(KLH) o toxoide tetánico. Por ejemplo, los péptidos que contienen
cisteína pueden acoplarse a un vehículo usando un enlazador tal como
éster de
maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(MBS), mientras que otros péptidos pueden acoplarse a vehículos
usando un agente de unión más general tal como glutaraldehído. Se
inmunizan animales tales como conejos, ratas y ratones con péptidos
libres o acoplados al vehículo, por ejemplo, por inyección
intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen
aproximadamente 100 \mug de péptido o vehículo proteico y
adyuvante de Freund. Pueden necesitarse varias inyecciones de
refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas,
para proporcionar una titulación útil de anticuerpo
anti-péptido, que puede detectarse, por ejemplo, por
medio de un ensayo ELISA usando péptido libre adsorbido en una
superficie sólida. El título de anticuerpos
anti-péptido en el suero de un animal inmunizado
puede aumentarse por medio de la selección de anticuerpos
anti-péptido, por ejemplo, por adsorción del péptido
en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de
acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.
Como apreciará un especialista en la técnica, y
como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos de la presente
invención incluyendo, pero sin limitación; polipéptidos que
comprenden un epítopo inmunogénico o antigénico, pueden fusionarse
a secuencias polipeptídicas heterólogas. Por ejemplo, los
polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse con la
región constante que comprende partes de inmunoglobulinas (IgA,
IgE, IgG, IgM), o partes de la región constante (CH1, CH2, CH3,
cualquier combinación de las mismas incluyendo dominios enteros y
partes de los mismos) dando como resultado polipéptidos quiméricos.
Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una
mayor vida media in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo,
para proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros
dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las
regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas de
inmunoglobulinas de mamífero (véase, por ejemplo, el documento EPA
0.394.827; y Traunecker et al., 1988). Las proteínas de
fusión que tienen una estructura dimérica con enlaces disulfuro
debido a la parte de IgG también pueden ser más eficaces en la unión
y neutralización de otras moléculas que los polipéptidos
monoméricos o fragmentos de los mismo solos (véase, por ejemplo,
Fountoulakis et al., 1995). También pueden recombinarse
ácidos nucleicos que codifican los epítopos anteriores con el gen de
interés para ayudar en la detección y purificación del polipéptido
expresado.
Pueden generarse otras proteínas de fusión de la
invención por medio de las técnicas de barajado de genes, barajado
de motivos, barajado de exones o barajado de codones (denominadas
colectivamente "barajado de ADN"). Puede emplearse barajado de
ADN para modular las actividades de los polipéptidos de la presente
invención generando de manera eficaz agonistas y antagonistas de
los polipéptidos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados
Unidos Nº: 5.605.793; 5.811.238; 5.834.252; 5.837.458; y Patten,
P.A., et al, (1997); Harayama, S., (1998); Hansson, L.O.,
et al (1999); y Lorenzo, M.M. y Blasco, R., (1998). Cada uno
de estos documentos se incorpora en la presente memoria como
referencia). En una realización, uno o más componentes, motivos,
secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de los
polinucleótidos codificantes de la invención, o los polipéptidos
codificados por los mismos, pueden recombinarse con uno o más
componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc.
de una o más moléculas heterólogas.
La presente invención se refiere además a
anticuerpos y receptores de antígenos de células T (TCR), que se
unen específicamente a los polipéptidos, y más específicamente, a
los epítopos de los polipéptidos de la presente invención. Los
anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (incluyendo IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgD, IgE o IgM, e
IgY. Como se usa en la presente memoria, se entiende que el término
"anticuerpo" (Ab) incluye anticuerpos enteros, incluyendo
anticuerpos enteros monocatenarios, y fragmentos de unión a
antígenos de los mismos. En una realización preferida, los
anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos
humano de la presente invención e incluyen, pero sin limitación,
Fab, Fab' F(ab)2 y F(ab')2, Fd, Fv
monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por
enlaces disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio
V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden tener cualquier origen
animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los
anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, de cabra, de cobaya, de
camello, de caballo o de pollo.
Los fragmentos de anticuerpos de unión a
antígenos, incluyendo anticuerpos monocatenarios, pueden comprender
la región o regiones variables solas o en combinación con todo o
parte de las siguientes regiones: región de bisagra, dominios CH1,
CH2 y CH3. También se incluye en la invención cualquier combinación
de regiones variables y región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3.
La presente invención también incluye anticuerpos monoclonales y
policlonales quiméricos, humanizados y humanos, que se unen
específicamente a los polipéptidos de la presente invención. La
presente invención también incluye anticuerpos que son
anti-idiotípicos para los anticuerpos de la presente
invención.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser monoespecíficos, biespecíficos y triespecíficos o pueden tener
una mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos
pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido
de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un
polipéptido de la presente invención como para composiciones
heterólogas tales como un polipéptido heterólogo o un material de
soporte sólido. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/17715; WO
92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al. (1991);
las Patentes de Estados Unidos 5.573.920, 4.474.893, 5.601.819,
4.714.681, 4.925.648; Kostelny, S.A. et al. (1992).
Los anticuerpos de la presente invención pueden
describirse o especificarse en términos del epítopo o epítopos o de
la parte o partes que llevan epítopos de un polipéptido de la
presente invención, que se reconoce o se une específicamente al
anticuerpo. En el caso de proteínas de la presente invención o
proteínas secretadas, los anticuerpos pueden unirse específicamente
a una proteína de longitud completa codificada por un ácido
nucleico de la presente invención, una proteína madura (es decir, la
proteína generada por escisión del péptido señal) codificada por un
ácido nucleico de la presente invención, un péptido señal codificado
por un ácido nucleico de la presente invención o cualquier otro
polipéptido de la presente invención. Por lo tanto, el epítopo o
epítopos o la parte o partes de polipéptido que llevan epítopos
pueden especificarse como se describe en la presente memoria, por
ejemplo, por las posiciones N-terminal y
C-terminal, por tamaño en restos aminoacídicos
contiguos o pueden describirse de otra manera en la presente memoria
(incluyendo la lista de secuencias). También pueden excluirse como
especies individuales anticuerpos que se unen específicamente a
cualquier epítopo o polipéptido de la presente invención. Por lo
tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen
específicamente a polipéptidos especificados de la presente
invención, y permite su exclusión.
Los anticuerpos de la presente invención también
pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad
cruzada. Se incluyen anticuerpos que no se unen específicamente a
ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de los polipéptidos de la
presente invención. En la presente invención también se incluyen
anticuerpos que no se unen a polipéptidos con una identidad menor
de 95%, menor de 90%, menor de 85%, menor de 80%, menor de 75%,
menor de 70%, menor de 65%, menor de 60%, menor de 55%, y menor de
50% (calculada usando métodos conocidos en la técnica y descritos
en la presente memoria, por ejemplo, usando FASTDB y los parámetros
indicados en la presente memoria) con un polipéptido de la presente
invención. En la presente invención también se incluyen anticuerpos
que sólo se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos, que
hibridan con un polinucleótido de la presente invención en
condiciones de hibridación rigurosas (como se describe en la
presente memoria). Los anticuerpos de la presente invención también
pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de
unión. Las afinidades de unión preferidas incluyen las que tienen
una constante de disociación o valor de Kd menor de 5 x 10^{-6}M,
10^{-6} M, 5 x 10^{-7} M, 10^{-7} M, 5 x 10^{-8} M,
10^{-8} M, 5 x 10^{-9} M, 10^{-9} M, 5 x 10^{-10} M,
10^{-10} M, 5 x 10^{-11} M, 10^{-11} M, 5 x 10^{-12} M,
10^{-12} M, 5 x 10^{-13} M, 10^{-13} M, 5 x 10^{-14} M,
10^{-14} M, 5 x 10^{-15} M y 10^{-15} M.
Los anticuerpos de la presente invención tienen
usos que incluyen, pero sin limitación, métodos conocidos en la
técnica para purificar, detectar y dirigir los polipéptidos de la
presente invención incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos
tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los
anticuerpos tienen utilidad en inmunoensayos para medir cualitativa
y cuantitativamente los niveles de los polipéptidos de la presente
invención en muestras biológicas (véase, por ejemplo, Harlow et
al., 1988).
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse solos o en combinación con otras composiciones. Los
anticuerpos también pueden fusionarse de manera recombinante a un
polipéptido heterólogo en el extremo N o C o conjugarse
químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes)
con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los
anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse de manera
recombinante o conjugarse con moléculas útiles como marcadores en
ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos
heterólogos, fármacos o toxinas. Véanse, por ejemplo, los documentos
WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Patente de Estados Unidos
5.314.995; y el documento EP 0 396 387.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
prepararse por cualquier método adecuado conocido en la técnica.
Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención o un fragmento
antigénico del mismo puede administrarse a un animal para inducir
la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. La
expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a los
anticuerpos producidos por la tecnología de hibridoma. El término
"anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de
polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión, donde el
dominio de unión se forma por plegamiento de dominios variables de
una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión
tridimensionales con una forma de superficie interna y distribución
de carga complementarias a las características de un determinante
antigénico de un antígeno, que permite una reacción inmunológica
con el antígeno. La expresión "anticuerpo monoclonal" se
refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo un
clon eucariota, procariota o de fago, y no al método por el cual se
produce. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una
amplia diversidad de técnicas conocidas en este campo incluyendo el
uso de la tecnología de hibridoma, recombinante y de presentación en
fagos.
Las técnicas de hibridoma incluyen las conocidas
en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow et al. 1988; y
Hammerling, et al, 1981). (Incorporándose dicha bibliografía
como referencia en su totalidad). Los fragmentos Fab y
F(ab')2 pueden producirse, por ejemplo, a partir de
anticuerpos producidos por hibridoma por medio de escisión
proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir
fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')2).
Como alternativa, los anticuerpos de la presente
invención pueden producirse por la aplicación de la tecnología de
ADN recombinante o por medio de química sintética usando métodos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de la
presente invención pueden prepararse usando diversos métodos de
presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de
presentación en fagos, se presentan dominios funcionales de
anticuerpo en la superficie de una partícula de fago, que lleva
secuencias polinucleotídicas que los codifican. Se selecciona el
fago con la propiedad de unión deseada a partir de un repertorio o
biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o
murina) por medio de la selección directa con un antígeno,
típicamente un antígeno unido o capturado en una superficie sólida
o perla. El fago usado en estos métodos típicamente es un fago
filamentoso incluyendo fd y M13 con dominios de anticuerpo Fab, Fv o
Fv estabilizados por enlaces disulfuro fusionados de manera
recombinante con el gen del fago o el gen de la proteína VIII. Los
ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para
obtener los anticuerpos de la presente invención incluyen los
descritos en Brinkman U. et al. (1995); Ames, R.S. et
al. (1995); Kettleborough, C.A. et al. (1994); Persic,
L. et al. (1997); Burton, D.R. et al. (1994);
documentos PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047;
WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de
Estados Unidos 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717,
5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637,
5.780.225, 5.658.727 y 5.733.743.
Como se describe en las referencias anteriores,
después de la selección del fago, las regiones codificantes de
anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar
anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier
otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en
cualquier hospedador deseado incluyendo células de mamífero,
células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias. Por
ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de manera
recombinante fragmentos Fab, Fab' F(ab)2 y
F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como
los descritos en el documento WO 92/22324; Mullinax, R.L. et
al. (1992); y Sawai, H. et al. (1995); y Better, M. et
al. (1988).
Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para
producir Fv monocatenarios y anticuerpos incluyen las descritas en
las Patentes de Estados Unidos 4.946.778 y 5.258.498; Huston et
al. (1991); Shu, L. et al. (1993); y Skerra, A. et
al. (1988). Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo
de anticuerpos en seres humanos y en ensayos de detección in
vitro, puede se preferible usar anticuerpos quiméricos,
humanizados o humanos. En la técnica se conocen métodos para
producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison,
(1985); Oi et al., (1986); Gillies, S.D. et al.
(1989); y la Patente de Estados Unidos 5.807.715. Los anticuerpos
pueden humanizarse usando una diversidad de técnicas que incluyen
injerto de CDR (documentos EP 0 239 400; WO 91/09967; Patente de
Estados Unidos 5.530.101; y 5.585.089), chapado (veneering) o
revestimiento (resurfacing), (documentos EP 0 592 106; EP 0 519
596; Padlan E.A., 1991; Studnicka G.M. et al., 1994; Roguska
M.A. et al, 1994) y barajado de cadenas (Patente de Estados
Unidos 5.565.332). Pueden prepararse anticuerpos humanos por una
diversidad de métodos conocidos en la técnica incluyendo los
métodos de presentación en fagos descritos anteriormente. Véanse
también las Patentes de Estados Unidos 4.444.887, 4.716.111,
5.545.806 y 5.814.318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO
96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741.
En la presente invención también se incluyen
anticuerpos fusionados de manera recombinante o conjugados
químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no
covalentes) a un polipéptido de la presente invención. Los
anticuerpos pueden ser específicos para antígenos distintos de los
polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos
pueden usarse para dirigir los polipéptidos de la presente invención
a tipos celulares particulares, in vitro o in vivo,
por medio de la fusión o la conjugación de los polipéptidos de la
presente invención con anticuerpos específicos para receptores
específicos de la superficie celular. También pueden usarse
anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la
presente invención en inmunoensayos in vitro y en métodos de
purificación usando métodos conocidos en la técnica (véase, por
ejemplo, Harbor et al. supra; WO 93/21232; EP 0 439
095; Naramura, M. et al. 1994; Patente de Estados Unidos
5.474.981; Gillies, S.O. et al., 1992; Fell, H.P. et
al., 1991).
La presente invención también incluye
composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente
invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo
distintos de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos
de la presente invención pueden fusionarse o conjugarse con una
región Fc de anticuerpo, o una parte de la misma. La parte de
anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede
comprender la región de bisagra, el dominio CH1, el dominio CH2 y
el dominio CH3 o cualquier combinación de dominios enteros o partes
de los mismos. Los polipéptidos de la presente invención pueden
fusionarse o conjugarse con las partes de anticuerpo anteriores
para aumentar la vida media in vivo de los polipéptidos o
para uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica.
Los polipéptidos también pueden fusionarse o conjugarse con las
partes de anticuerpo anteriores para formar multímeros. Por
ejemplo, las partes Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente
invención pueden formar dímeros a través de la unión por enlaces
disulfuro entre las partes Fc. Pueden obtenerse formas multiméricas
superiores fusionando los polipéptidos a partes de IgA e IgM. En la
técnica se conocen métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos
de la presente invención a partes de anticuerpo. Véanse, por
ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.336.603, 5.622.929,
5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112.946; los documentos EP 0 307
434, EP 0 367 166; los documentos WO 96/04388, WO 91/06570;
Ashkenazi, A. et al. (1991); Zheng, X.X. et al.
(1995); y Vil, H. et al. (1992).
La invención se refiere además a anticuerpos que
actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la
presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye
anticuerpos que rompen las interacciones receptor/ligando con los
polipéptidos de la invención de forma parcial o total. Se incluyen
tanto anticuerpos con especificidad de receptor como anticuerpos
con especificidad de ligando. Se incluyen anticuerpos con
especificidad de receptor, que no impiden la unión del ligando pero
impiden la activación del receptor. La activación del receptor (es
decir, la señalización) puede determinarse por técnicas descritas en
la presente memoria o conocidas de otra manera en la técnica.
También se incluyen anticuerpos con especificidad de receptor que
impiden tanto la unión del ligando como la activación del receptor.
De manera similar, se incluyen anticuerpos de neutralización que se
unen al ligando e impiden la unión del ligando al receptor, así como
anticuerpos que se unen al ligando impidiendo de esta manera la
activación del receptor, pero no impiden la unión del ligando al
receptor. También se incluyen anticuerpos que activan el receptor.
Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas para todas o no
todas las actividades biológicas afectadas por activación del
receptor mediada por ligando. Los anticuerpos pueden especificarse
como agonistas o antagonistas para actividades biológicas que
comprenden actividades específicas descritas en la presente
memoria. Los anticuerpos agonistas anteriores pueden prepararse
usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el
documento WO 96/40281; Patente de Estados Unidos 5.811.097; Deng,
B. et al. (1998); Chen, Z. et al. (1998); Harrop, J.A.
et al. (1998); Zhu, Z. et al. (1998); Yoon, D.Y.
et al. (1998); Prat, M. et al. (1998) J.; Pitard, V.
et al. (1997); Liautard, J. et al. (1997);
Carlson, N.G. et al. (1997) J.; Taryman, R.E. et al. (1995); Muller, Y.A. et al. (1998); Bartunek, P. et al. (1996).
Carlson, N.G. et al. (1997) J.; Taryman, R.E. et al. (1995); Muller, Y.A. et al. (1998); Bartunek, P. et al. (1996).
Como se ha descrito anteriormente, los
anticuerpos de los polipéptidos de la invención pueden utilizarse,
a su vez, para generar anticuerpos anti-idiotípicos
que "imitan" a los polipéptidos de la invención usando
técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica (véase,
por ejemplo, Greenspan y Bona (1989); y Nissinoff (1991). Por
ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen e inhiben de manera
competitiva la multimerización del polipéptido o la unión de un
polipéptido de la invención al ligando para generar
anti-idiotipos que "imitan" al dominio de
unión o multimerización del polipéptido y, como consecuencia, se
unen y neutralizan el polipéptido o su ligando. Estos anticuerpos
anti-idiotípicos de neutralización pueden usarse
para unirse a un polipéptido de la invención o para unirse a sus
ligandos/receptores y, por lo tanto, bloquear su actividad
biológica.
La invención también se refiere a un anticuerpo
purificado y aislado capaz de unirse específicamente a un
polipéptido maduro o de longitud completa mutado de la presente
invención o a un fragmento o variante del mismo, que comprende un
epítopo del polipéptido mutado. En otra realización preferida, la
presente invención se refiere a un anticuerpo que puede unirse a un
polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos de
un polipéptido de la presente invención y que incluye al menos uno
de los aminoácidos que puede codificarse por las mutaciones
causantes del rasgo.
Son particularmente útiles para preparar
anticuerpos animales o mamíferos no humanos, de tipo silvestre o
transgénicos, que expresan una especie de un polipéptido de la
presente invención diferente al polipéptido al que se desea unir el
anticuerpo, y animales que no expresan un polipéptido de la presente
invención (es decir, un animal knock out). Los animales knock out
para ciertos genes reconocerán todas o la mayoría de las regiones
expuestas de un polipéptido de la presente invención como antígenos
extraños, y por lo tanto producirán anticuerpos con una mayor gama
de epítopos. Además, los polipéptidos más pequeños con sólo 10 a 30
aminoácidos pueden ser útiles para obtener una unión específica a
uno cualquiera de los polipéptidos de la presente invención.
Además, el sistema inmune humoral de los animales que producen una
especie de polipéptido de la presente invención que se parece a la
secuencia antigénica preferiblemente reconocerá las diferencias
entre las especies de polipéptido nativo del animal y la secuencia
antigénica, y producirá anticuerpos contra esos sitios únicos en la
secuencia antigénica. Esta técnica será particularmente útil para
obtener anticuerpos que se unen específicamente a uno cualquiera de
los polipéptidos de la presente invención.
Las preparaciones de anticuerpo preparadas de
acuerdo con cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos
cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que
llevan antígenos en muestras biológicas; también se usan
semi-cuantitativamente o cualitativamente para
identificar la presencia de un antígeno en una muestra biológica.
Los anticuerpos también pueden usarse en composiciones terapéuticas
para destruir células que expresan la proteína o para reducir los
niveles de la proteína en el cuerpo.
Los anticuerpos de la invención pueden marcarse
con uno cualquiera de marcadores radiactivos, fluorescentes o
enzimáticos conocidos en la técnica.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por consiguiente, la invención también se
refiere a un método para detectar específicamente la presencia de un
polipéptido de la presente invención de acuerdo con la invención en
una muestra biológica, comprendiendo dicho método las siguientes
etapas:
a) poner en contacto la muestra biológica con un
anticuerpo policlonal o monoclonal que se una específicamente a un
polipéptido de la presente invención; y
b) detectar el complejo
antígeno-anticuerpo formado.
La invención también se refiere a un kit de
diagnóstico para detectar in vitro la presencia de un
polipéptido de la presente invención en una muestra biológica, donde
dicho kit comprende:
a) un anticuerpo policlonal o monoclonal que se
une específicamente a un polipéptido de la presente invención,
opcionalmente marcado; y
b) un reactivo que permite la detección de los
complejos antígeno-anticuerpo formados, donde dicho
reactivo tiene opcionalmente un marcador, o puede reconocerse a sí
mismo mediante un reactivo marcado, más particularmente en el caso
en el que el anticuerpo monoclonal o policlonal mencionado
anteriormente no está marcado por sí mismo.
Los anticuerpos de la invención pueden marcarse
con uno cualquiera de marcadores radiactivos, fluorescentes o
enzimáticos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con
fines ilustrativos y no como medios de limitación, para respaldar
el descubrimiento de que los polipéptidos GSSP4 tienen eficacia en
la reducción de la resistencia a la insulina y en la mejora del
metabolismo de la glucosa y de los lípidos y pueden tener una acción
sensibilizadora a la insulina. Un especialista en la técnica será
capaz de diseñar ensayos y métodos equivalentes basándose en la
descripción de la presente memoria, y todos ellos forman parte de la
presente invención.
El análisis de la expresión de GSSP4 en
diferentes tejidos humanos (adultos y fetales) y líneas celulares,
así como en embriones de ratón en diferentes fases del desarrollo,
se realiza usando transferencias de ARN poli A^{+} adquiridas en
Clontech (por ejemplo, nº
7780-1,7757-1,
7756-1, 7768-1 y
7763-1). El marcaje de sondas de ADN se realiza
usando el kit RNA Strip-EZ de Ambion de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. La hibridación de sondas de ADN
con manchas de transferencia de ARN se realiza con solución de
hibridación Ultrahyb (Ambion). En resumen, se prehibridan manchas
de transferencias durante 30 min a 58ºC (baja rigurosidad) o a 65ºC
(alta rigurosidad). Después de añadir la sonda marcada (2x10^{6}
cpm/ml), las manchas de transferencia se hibridan durante una noche
(14-24 horas), y se lavan 2 veces durante 20 min a
50ºC con SSC 2x/SDS al 0,1% (baja rigurosidad), 2 veces durante 20
min a 58ºC con SSC 1x/SDS al 0,1% (rigurosidad media) y 2 veces
durante 20 min a 65ºC con SSC 1x/SDS al 0,1% (rigurosidad elevada).
Después de completarse los lavados, las manchas de transfer encia
completadas se exponen en el phosphoimager (Molecular Dynamics)
durante 1-3 días.
La actividad de diversas preparaciones de
polipéptidos GSSP4 se evaluó usando diversos ensayos in
vitro, incluyendo los que se proporcionan a continuación. Estos
ensayos también son ejemplares de los que pueden usarse para
desarrollar antagonistas y agonistas de los polipéptidos GSSP4. Para
hacer esto, se compara el efecto de los polipéptidos GSSP4 en los
ensayos anteriores, por ejemplo sobre la captación de la glucosa y
la oxidación y el reparto de ácidos grasos en presencia de las
moléculas candidatas con el efecto de los polipéptidos GSSP4 en los
ensayos en ausencia de las moléculas candidatas.
Se obtienen células musculares L6 en la European
Culture Collection (Porton Down) y se usan en los pases
7-11. Las células se mantienen en medio de cultivo
de tejidos convencional DMEM, y se evalúa la captación de glucosa
usando [^{3}H]-2-desoxiglucosa
(2DG) con o sin polipéptidos GSSP4 en presencia o ausencia de
insulina (10^{-8} M) como se ha descrito previamente (Walker P S
et al, Glucose transport activity in L6 muscle cells is
regulated by the coordinate control of subcellular glucose
transporter distribution, biosynthesis, and mRNA transcription,
JBC, 1990;265(3), 1516-1523, y Kilp A et
al, Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle
cells in culture, Endocrinology, 1992; 130(5),
2535-2544). La captación de 2DG se expresa como el
cambio en porcentaje comparado con el control (sin adición de
insulina o GSSP4). Los valores se presentan como la media \pm SEM
de grupos de 4 pocillos por experimento. Las diferencias entre los
grupos de pocillos se evalúan por ensayo t de Student, y se
consideran significativos valores de probabilidad p<0,05.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se diferencian células C2C12 en presencia o
ausencia de 2 \mug/ml de proteína GSSP4 durante 4 días. En el día
4, se determinan las velocidades de oxidación de oleato midiendo la
conversión de 1-^{14}C-oleato (0,2
mM) en ^{14}CO_{2} durante 90 min. Este experimento puede
usarse para seleccionar fragmentos activos y péptidos así como
agonistas y antagonistas o activadores e inhibidores de polipéptidos
GSSP4.
El efecto de los polipéptidos sobre la velocidad
de oxidación de oleato puede compararse en células C2C12
diferenciadas (células de músculo esquelético murino; ATCC,
Manassas, VA CRL-1772) y en una línea celular de
hepatocitos (Hepal-6; ATCC, Manassas, VA
CRL-1830). Las células cultivadas se mantienen de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo de
oxidación de oleato se realiza como se ha descrito previamente
(Muoio et al (1999) Biochem J 338;783-791).
En resumen, los miocitos casi confluentes se mantienen en medio de
diferenciación bajo en suero (DMEM, suero de caballo al 2,5%)
durante 4 días, momento en el que la formación de miotubos es
máxima. Los hepatocitos se mantienen en el mismo medio DMEM
suplementado con FCS al 10% durante 2 días. Una hora antes del
experimento, el medio se retira y se añade 1 ml de medio de
preincubación (MEM, suero de caballo al 2,5%, glucosa 3 mM,
Glutamina 4 mM, Hepes 25 mM, BSA sin FFA al 1%, Oleato 0,25 mM, 5
\mug/ml de gentamicina). Al principio del experimento de
oxidación, se añade ácido ^{14}C-oleico (1
\muCi/ml, American Radiolabeled Chemical Inc., St. Louis, MO) y
las células se incuban durante 90 min a 37ºC en ausencia/presencia
de 2,5 \mug/ml de polipéptidos GSSP4. Después del periodo de
incubación, se retiran 0,75 ml del medio y se ensaya con respecto a
los productos de ^{14}C-oxidación como se describe
a continuación para el experimento de oxidación de FFA muscular.
Después de transferir el medio para el ensayo de
oxidación de oleato, las células se ponen en hielo. Para determinar
el contenido de triglicéridos y proteínas, las células se lavan con
1 ml de PBS 1x para retirar el medio residual. A cada pocillo se le
añaden 300 \mul de solución de disociación celular (Sigma) y se
incuba a 37ºC durante 10 min. Las placas se golpean suavemente para
soltar las células, y se añaden 0,5 ml de PBS 1x. La suspensión
celular se transfiere a un tubo eppendorf, y cada pocillo se aclara
con 0,5 ml más de PBS 1x y se transfiere al tubo eppendorf
apropiado. Las muestras se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos
a temperatura ambiente. El sobrenadante se desecha y al sedimento
celular se le añaden 750 \mul de PBS 1x/chaps al 2%. La
suspensión celular se agita vorticialmente y se pone en hielo
durante 1 hora. Después, las muestras se centrifugan a 13000 rpm
durante 20 min a 4ºC. Los sobrenadantes se transfieren a un nuevo
tubo y se congelan a -20ºC hasta que se analizan. Se determina una
medición cuantitativa del nivel de triglicéridos en cada muestra
usando el kit enzimático Sigma Diagnostics
GPO-TRINDER. Se sigue el procedimiento indicado en
el manual, con las siguientes excepciones: el ensayo se realiza en
una placa de 48 pocillos, se ensayan 350 \mul de volumen de la
muestra, el blanco de control consistía en 350 \mul de PBS/chaps
al 2%, y el patrón contenía 10 \mul de patrón proporcionado en el
kit más 690 \mul de PBS/chaps al 2%. El análisis de las muestras
se realiza en un Packard Spectra Count a una longitud de onda de
550 nm. El análisis de proteínas se realiza en 25 \mul de cada
una de las muestras de sobrenadante usando el ensayo de proteínas
BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. El
análisis de las muestras se realiza en un Packard Spectra Count a
una longitud de onda de 550 nm.
Conjugación con isotiocianato de fluoresceína
(FITC) de polipéptidos GSSP4: se marcan proteínas GSSP4 purificadas
a una concentración de 1 mg/ml con FITC usando el kit de conjugación
FluoroTag FITC de Sigma (Nº de artículo FITC-1).
Para marcar la proteína GSSP4 se sigue el protocolo indicado en el
manual de Sigma para conjugación a pequeña escala.
Cultivo de células: se siembran células de
músculo esquelético de ratón C2C12 (ATCC, Manassas, VA
CRL-1772) y hepatocitos de ratón
Hepa-1-6 (ATCC, Manassas, VA
CRL-1830) en placas de 6 pocillos a una densidad
celular de 2x10^{5} células por pocillo. Las células C2C12 y
Hepa-1-6 se cultivan de acuerdo con
las instrucciones del depósito durante 24-48 horas
antes del análisis. Se realiza el ensayo cuando las células alcanzan
una confluencia de 80%.
Unión celular de la proteína GSSP4 marcada con
FITC y captación usando microscopía: se incuban células C2C12 y
Hepa 1-6 en presencia/ausencia de anticuerpo
dirigido contra LSR humano (81B: secuencia
N-terminal de LSR humano; no presenta reacción
cruzada con LSR de ratón y 93A: secuencia
C-terminal, presenta reacción cruzada con LSR de
ratón) o un antisuero dirigido contra gC1qr (953) durante 1 hora a
37ºC, 5% de CO2. Se añaden al medio anticuerpos para LSR a una
concentración de 2 \mug/ml. El antisuero
anti-gC1qr se añade al medio a un volumen de 2,5
\mul de suero no diluido (alta concentración) o a una dilución de
1:100 (baja concentración). Después de la incubación con el
anticuerpo especificado, se añade FITC-polipéptido
GSSP4 (50 nM/ml) a cada pocillo de cultivo celular. Las células se
incuban de nuevo durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO2. Las células se
lavan 2 veces con PBS, las células se raspan del pocillo y se
introducen en 1 ml de PBS. La suspensión celular se transfiere a un
tubo eppendorf y se centrifuga a 1000 rpm durante 2 minutos. Se
retira el sobrenadante y las células se resuspenden en 200 \mul
de PBS. La unión y captación de FITC-polipéptido
GSSP4 se analiza por microscopía de fluorescencia con 40
aumentos.
Este ensayo puede ser útil para identificar
agentes que faciliten o impidan la captación y/o unión de
polipéptidos GSSP4 a las células.
Como los perfiles metabólicos difieren entre
diversos modelos animales de obesidad y diabetes, se emprende el
análisis de múltiples modelos para separar los efectos de
polipéptidos GSSP4 sobre la hiperglucemia, hiperinsulinemia,
hiperlipidemia y obesidad. La mutación en colonias de animales de
laboratorio y diferentes sensibilidades a regímenes dietéticos han
hecho posible el desarrollo de modelos animales con diabetes no
insulinodependiente asociada con la obesidad y la resistencia a la
insulina. Se han desarrollado modelos genéticos tales como db/db y
ob/ob (véase Diabetes, (1982) 31(1): 1-6) en
ratones y fa/fa en ratas zucker por los diversos laboratorios para
comprender la patofisiología de la enfermedad y ensayar la eficacia
de nuevos compuestos antidiabéticos (Diabetes, (1983) 32:
830-838; Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. (1994). 46:
1-57). Los animales homocigotos, ratones C57
BL/KsJ-db/db desarrollados por Jackson Laboratory,
Estados Unidos, son obesos, hiperglucémicos, hiperinsulinémicos y
resistentes a la insulina (J. Clin, invest., (1990)
85:962-967), mientras que los heterocigotos son
delgados y normoglucémicos. En el modelo db/db, el ratón desarrolla
progresivamente insulinopenia con la edad, una característica que
se observa comúnmente en las últimas fases de la diabetes humana de
tipo II cuando los niveles sanguíneos de azúcar no están
controlados suficientemente. El estado del páncreas y su curso
varían de acuerdo con los modelos. Como este modelo se parece al de
la diabetes mellitus de tipo II, los compuestos de la presente
invención se ensayan con respecto a las actividades reductoras de
los niveles sanguíneos de azúcar y de triglicéridos. Las ratas
Zucker (fa/fa) son gravemente obesas, hiperinsulinémicas y
resistentes a la insulina (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E.
Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds.
(Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990),
págs. 299-340), y la mutación fa/fa puede ser el
equivalente en rata de la mutación db murina (Friedman et
al., Cell 69:217-220,1992; Truett et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806, 1991). Los ratones tubby
(tub/tub) se caracterizan por obesidad, resistencia moderada a la
insulina e hiperinsulinemia sin hiperglucemia significativa (Coleman
et al., J. Heredity 81:424, 1990).
Previamente, se ha notificado que la leptina
invierte la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus con
lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature 401:
73-76 (1999)). Se ha descubierto que la leptina es
menos eficaz en un modelo de ratón lipodistrófico diferente de
diabetes lipoatrófica (Gavrilova et al Nature 403: 850
(2000); incorporado en la presente memoria en su totalidad
incluyendo cualquier dibujo, figura o tabla).
El modelo de estreptozotocina (STZ) para la
diabetes inducida químicamente se ensaya para examinar los efectos
de la hiperglucemia en ausencia de obesidad. Los animales tratados
con STZ presentan deficiencia de insulina y son gravemente
hiperglucémicos (Coleman, Diabetes 31:1,1982; E. Shafrir, en
Diabetes Mellitus; H. Eifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science
Publishing Co., Inc., New York, ed. 4,1990), págs.
299-340). También se examina el modelo de obesidad
inducida químicamente por glutamato monosódico (MSG) (Olney, Science
164:719, 1969; Cameron et al., Cli. Exp. Pharmacol. Physiol.
5:41,1978), en el que la obesidad es menos severa que en modelos
genéticos y se desarrolla sin hiperfagia, hiperinsulinemia y
resistencia a la insulina. Finalmente, un modelo no químico y no
genético para inducción de obesidad incluye roedores que se
alimentan con una dieta de alto contenido de grasa y alto contenido
de carbohidratos (dieta de cafetería) ad libitum.
La presente invención incluye el uso de
polipéptidos GSSP4 para reducir la resistencia a la insulina y la
hiperglucemia en cualquiera o todos los modelos de diabetes en
roedores anteriores o en seres humanos con diabetes de tipo I o de
tipo II u otras enfermedades metabólicas preferidas descritas
previamente o modelos basados en otros mamíferos. En las
composiciones de la presente invención, los polipéptidos GSSP4
pueden, si se desea, estar asociados con otros agentes
antidiabéticos farmacológicamente activos compatibles, tales como
insulina, leptina (solicitud provisional de Estados Unidos Nº
60/155.506) o troglitazona, solos o en combinación. Los ensayos
incluyen lo descrito previamente en Gavrilova et al. ((2000)
Diabetes Nov, 49(11): 1910-6; (2000) Nature
Feb 24; 403(6772): 850) usando ratones
A-ZIP/F-1, con la excepción de que
los polipéptidos GSSP4 se administran por vía intraperitoneal,
subcutánea, intramuscular o intravenosa. Se ensayan los niveles de
glucosa e insulina de los ratones, y se controlan la ingesta de
alimento y el peso del hígado, así como otros factores, tales como
los niveles de leptina, FFA y TG, medidos típicamente en nuestros
experimentos.
Se alojan (7-9 ratones/jaula)
ratones diabéticos obesos genéticamente alterados (db/db) (macho, de
7-9 semanas de edad) en condiciones de laboratorio
convencionales a 22ºC y a una humedad relativa de 50%, y se
mantienen con una dieta de alimento para roedores Purina y agua
ad libitum. Antes del tratamiento, se recogen muestras de
sangre de la vena de la cola de cada animal y se determinan las
concentraciones sanguíneas de glucosa usando el Sistema de Control
One Touch BasicGlucose (Lifescan). Se usan los ratones que tienen
niveles plasmáticos de glucosa comprendidos entre 250 y 500 mg/dl.
Cada grupo de tratamiento consiste en siete ratones que se
distribuyen de manera que los niveles medios de glucosa sean
equivalentes en cada grupo al principio del estudio. Los ratones
db/db se dosifican con bombas micro-osmóticas,
insertadas usando anestesia con isoflurano, para proporcionar al
ratón polipéptidos GSSP4, solución salina y un péptido irrelevante,
por vía subcutánea (s.c). Se toman muestras de sangre de la vena de
la cola cada hora durante 4 horas y 24 y 30 h después de la
dosificación y se analizan para determinar las concentraciones
sanguíneas de glucosa. Se retira la comida 0-4 h
después de la dosificación y posteriormente se introduce de nuevo.
También se miden los pesos corporales individuales y el consumo
medio de alimento (en cada jaula) después de 24 horas. Las
diferencias significativas entre grupos (comparando los animales
tratados con GSSP4 y los tratados con solución salina) se evalúan
usando el ensayo t de Student.
La sensibilidad a la insulina in vivo se
examina utilizando pinzas
hiperinsulinémicas-euglucémicas de dos etapas de
acuerdo con el siguiente protocolo. Se encierran en jaulas roedores
de cualquiera de los diversos modelos descritos en el ejemplo 2
durante al menos una semana antes de los procedimientos
experimentales. Se realizan cirugías para colocar catéteres en la
vena yugular y en la arteria carótida en condiciones estériles
usando anestesia con ketamina y xilazina (i.m.). Después de la
cirugía, se deja que todos los ratones recuperen la consciencia y
se ponen en jaulas individuales. Se administran polipéptidos GSSP4 o
vehículo a través de la vena yugular después de la recuperación
completa y durante los dos días siguientes. Dieciséis horas después
del último tratamiento, se realizan pinzas
hiperinsulinémicas-euglucémicas. Los roedores se
ponen en dispositivos inmovilizadores y se administra una inyección
en embolada de 4 \muCi de [^{3}H] de glucosa (NEN), seguido de
una infusión continua del indicador a una dosis de 0,2 \muCI/min
(20 \mul/min). Dos horas después de la infusión del indicador, se
recogen 3 muestras de sangre (de 0,3 ml cada una) a intervalos de 10
minutos (-20-0 min) para las mediciones basales.
Después se inicia una infusión de insulina (5 mU/kg/min), y se toman
muestras de sangre de 100 \mul cada 10 minutos para controlar la
glucosa plasmática. Se infunde una solución de glucosa al 30%
usando una segunda bomba basada en los niveles plasmáticos de
glucosa para alcanzar y mantener la euglucemia. Una vez establecido
el estado estacionario a 5 mU/kg/min de insulina (velocidad de
infusión de glucosa y glucosa plasmática estable), se obtienen 3
muestras de sangre más (de 0,3 ml cada una) para realizar las
mediciones de glucosa, [^{3}H] glucosa e insulina
(100-120 min). Después se administra una dosis mayor
de insulina (25 mU/kg/min.) y las velocidades de infusión de
glucosa se ajustan para la segunda pinza euglucémica y se toman
muestras de sangre en el minuto 220-240. La
actividad específica de la glucosa se determina en plasma
desproteinizado y se realizan los cálculos de Rd y de producción de
glucosa hepática (HGO), como se describe (Lang et al.,
Endocrinology 130:43,1992). Después se determinan los niveles
plasmáticos de insulina en el periodo basal y después de infusiones
de 5 y 25 mU/kg/min y se comparan entre roedores tratados con GSSP4
y tratados con vehículo.
La regulación por medio de la insulina de la
homeostasis de la glucosa tiene dos componentes principales;
estimulación de la captación de glucosa periférica y supresión de la
producción de glucosa hepática. Usando estudios de indicadores en
las pinzas de glucosa, es posible determinar la parte de la
respuesta a la insulina que está afectada por los polipéptidos
GSSP4.
Se realizan experimentos usando ratones C57BL/6
de aproximadamente 6 semanas de edad (8 por grupo). Todos los
ratones se encierran individualmente. Los ratones se mantienen con
una dieta de alto contenido de grasa a lo largo de todos los
experimentos. La dieta de alto contenido de grasa (dieta de
cafetería; D12331 de Research Diets, Inc.) tiene la siguiente
composición: 16% de kcal de proteínas, 26% de kcal de carbohidratos
y 58% de kcal de grasa. La grasa se compone principalmente de
aceite de coco, hidrogenado.
Después de alimentar a los ratones con la dieta
de alto contenido de grasa durante 6 días, se insertan bombas
micro-osmóticas usando anestesia con isoflurano, y
se usan para proporcionar polipéptidos GSSP4 de longitud completa,
fragmentos de polipéptido GSSP4, solución salina y un péptido
irrelevante a los ratones por vía subcutánea (s.c.) durante 18
días. Los polipéptidos GSSP4 se proporcionan a dosis de 100, 50, 25
y 2,5 \mug/día y el péptido irrelevante se proporciona a 10
\mug/día. Se mide el peso corporal el primer, tercer y quinto día
de la dieta de alto contenido de grasa y posteriormente diariamente
después del inicio del tratamiento. Se mide el peso corporal final
y se extraen muestras finales de sangre por punción cardiaca y se
usan para determinar los niveles de triglicéridos (TG), colesterol
total (TC), glucosa, leptina e insulina. También se determina la
cantidad de alimento consumido al día para cada grupo. La glucosa
plasmática se determina por un procedimiento de glucosa oxidasa
(Analox GM7) y la insulina plasmática se determina por
radioinmunoensayo (Amerlex, Amersham).
Se ensaya el efecto de polipéptidos GSSP4 sobre
la lipemia posprandial (PPL) en ratones C57BL6/J normales.
Los ratones usados en este experimento se dejan
en ayunas durante 2 horas antes del experimento, después de lo cual
se toma una muestra de sangre basal. Todas las muestras de sangre se
toman de la cola usando tubos capilares recubiertos con EDTA (50
\mul en cada punto de tiempo). A tiempo 0 (8:30 AM), se administra
una comida estándar de alto contenido de grasa (6 g de mantequilla,
6 g de aceite de girasol, 10 g de lecha desnatada en polvo, 10 g de
sacarosa, 12 ml de agua destilada, preparada recientemente siguiendo
Nb#6, JF, pg.1) por medio de una sonda (vol.=1% de peso corporal) a
todos los animales.
Inmediatamente después de la comida de alto
contenido de grasa, se inyectan 25 \mug de un polipéptido GSSP4
i.p. en 100 \mul de solución salina. Se inyecta de nuevo la misma
dosis (25 \mug/ml en 100 \mul) a 45 min y a 1 hora 45 min. A
los animales de control se les inyecta solución salina (3x100
\mul). Los animales no tratados y tratados se manipulan de forma
alterna.
Se toman muestras de sangre a intervalos
horarios y se ponen en hielo inmediatamente. Se prepara plasma por
centrifugación después de cada punto de tiempo. El plasma se
mantiene a -20ºC y se determinan los niveles de ácido grasos libres
(FFA), triglicéridos (TG) y glucosa en un periodo de 24 horas usando
kits de ensayo estándar (Sigma y Wako). debido a que se dispone de
una cantidad limitada de plasma, la glucosa se determina por
duplicado usando muestras reunidas. Para cada punto de tiempo, se
reúnen volúmenes iguales de plasma de los 8 animales por grupo de
tratamiento.
Se ensaya el efecto de polipéptidos GSSP4 sobre
los niveles plasmáticos de leptina e insulina durante la lipemia
posprandial (PPL) en ratones C57BL6/J normales. El procedimiento
experimental es el mismo que se ha descrito previamente, con la
excepción de que la sangre se extrae sólo a las 0, 2 y 4 horas para
poder obtener mayores muestras de sangre necesarias para la
determinación de la leptina y la insulina por medio de un RIA.
En resumen, se dejan en ayunas 16 ratones
durante 2 horas antes del experimento, después de lo cual se toma
una muestra de sangre basal. Todas las muestras de sangre se toman
de la cola usando tubos capilares recubiertos con EDTA (100 \mul
en cada punto de tiempo). A tiempo 0 (9:00AM), se administra una
comida estándar de alto contenido de grasa por medio de una sonda
(vol.=1% de peso corporal) a todos los animales. Inmediatamente
después de la comida de alto contenido de grasa, se inyectan 25
\mug de un polipéptido GSSP4 i.p. en 100 \mul de solución
salina. De nuevo se inyecta la misma dosis (25 \mug en 100 \mul)
a 45 min y a 1 hora 45 min (grupo tratado). A los animales de
control se les inyecta solución salina (3x100 \mul). Los animales
no tratados y tratados se manipulan de forma
alterna.
alterna.
Las muestras de sangre se ponen inmediatamente
en hielo y se prepara el plasma por centrifugación después de cada
punto de tiempo. El plasma se mantiene a -20ºC y se determinan los
ácidos grasos libres (FFA) dentro de un periodo de 24 horas usando
un kit de ensayo estándar (Wako). La leptina y la insulina se
determinan por RIA (ML-82K y
SRI-13K, LESTCO Research, Inc., St. Charles, MO)
siguiendo el protocolo del fabricante. Sin embargo, sólo se usan 20
\mul de plasma. Cada determinación se realiza por duplicado.
Debido a que se dispone de una cantidad limitada de plasma, la
leptina y la insulina se determinan en 4 grupos de 2 animales cada
uno en los dos grupos de tratamiento.
Se ha descrito el efecto de polipéptidos GSSP4
sobre los niveles plasmáticos de FFA, TG, glucosa, leptina e
insulina durante la lipemia posprandial (PPL) en ratones C57BL6/J
normales. Se muestra una pérdida de peso debida a los polipéptidos
GSSP4 (2,5 \mug/día) administrados a ratones C57BL6/J normales con
una dieta de alto contenido de grasa.
El procedimiento experimental es similar al
descrito previamente. En resumen, se dejan en ayunas 14 ratones
durante 2 horas antes del experimento, después de lo cual se toma
una muestra de sangre basal. Todas las muestras de sangre se toman
de la cola usando tubos capilares recubiertos con EDTA (50 \mul en
cada punto de tiempo). A tiempo 0 (9:00AM), se administra una
comida estándar de alto contenido de grasa por medio de una sonda
(vol.=1% de peso corporal) a todos los animales. Inmediatamente
después de la comida de alto contenido de grasa, a 4 ratones se les
inyectan 25 \mug de un polipéptido GSSP4 i.p. en 100 \mul de
solución salina. Se inyecta de nuevo la misma dosis (25 \mug en
100 \mul) a 45 min y a 1 h 45 min. Un segundo grupo de tratamiento
recibe 3 veces 50 \mug de polipéptido GSSP4 a los mismos
intervalos. A los animales de control se les inyecta solución
salina (3x100 \mul). Los animales no tratados y tratados se
manipulan de forma alterna.
Las muestras de sangre se ponen inmediatamente
en hielo. Se prepara plasma por centrifugación después de cada
punto de tiempo. El plasma se mantiene a -20ºC y se determinan los
niveles de ácidos grasos libres (FFA), triglicéridos (TG) y glucosa
en un periodo de 24 horas usando kits de ensayo estándar (Sigma y
Wako).
En ratones, los niveles plasmáticos de ácidos
grasos libres aumentan después de la administración intragástrica
de una comida de ensayo de alto contenido de grasa/carbohidratos.
Estos ácidos grasos libres se producen principalmente por la
actividad de enzimas lipolíticas, es decir, lipoproteína lipasa
(LPL) y lipasa hepática (HL). En esta especie, estas enzimas se
encuentran en cantidades significativas tanto unidas al endotelio
como circulando libremente en el plasma. Otra fuente de ácidos
grasos libres plasmáticos es la lipasa sensible a hormonas (HSL)
que libera ácidos grasos libres del tejido adiposo después de la
estimulación \beta-adrenérgica. Para ensayar si
los polipéptidos GSSP4 también regulan el metabolismo de los ácidos
grasos libres liberados por HSL, se inyecta epinefrina en los
ratones.
\newpage
Los grupos de ratones reciben epinefrina (5
\mug) por medio de inyección intraperitoneal. En un grupo tratado
se inyecta polipéptido GSSP4 (25 \mug) una hora antes y de nuevo
junto con epinefrina, mientras que los animales de control reciben
solución salina. Se aísla el plasma y se miden los ácidos grasos
libres y la glucosa como se ha descrito anteriormente.
Para investigar el efecto de polipéptidos GSSP4
sobre la oxidación de ácidos grasos libres en músculo, se aíslan
músculos intactos de las patas traseras de ratones C57BL/6J y se
mide la oxidación de FFA usando oleato como sustrato (Clee et
al (2000) J Lipid Res 41:521-531; Muoio et
al (1999) Am J Physiol 276:E913-921). La
oxidación de oleato en músculo aislado se mide como se ha descrito
previamente (Cuendet et al (1976) J Clin Invest
58:1078-1088; Le Marchand-Brustel
(1978) Am J Physiol 234:E348-E358). En resumen, se
sacrifican ratones por dislocación cervical y se aíslan rápidamente
los músculos soleus y EDL de las patas traseras. El tendón distal
de cada músculo se fija a una pieza de sutura para facilitar la
transferencia entre diferentes medios. Todas las incubaciones se
realizan a 30ºC en 1,5 ml de tampón bicarbonato de
Krebs-Henseleit (NaCl 118,6 mM, KCl 4,76 mM,
KH_{2}PO_{4} 1,19 mM, MgSO_{4} 1,19 mM, CaCl_{2} 2,54 mM,
NaHCO_{3} 25 mM, hepes 10 mM, pH 7,4) suplementado con albúmina
de suero bovino sin FFA al 4% (fracción V, calidad RIA, Sigma) y
glucosa 5 mM (Sigma). La concentración total de oleato (Sigma) a lo
largo del experimento es 0,25 mM. Todos los medios se oxigenan (95%
de O_{2}; 5% de CO_{2}) antes de la incubación. La mezcla de gas
se hidrata a lo largo de todo el experimento burbujeando a su través
un lavador de gases (Kontes Inc., Vineland, NJ).
Los músculos se aclaran durante 30 min en medio
de incubación con oxigenación. Los músculos después se transfieren
a medio nuevo (1,5 ml) y se incuban a 30ºC en presencia de 1
\muCi/ml de [1-^{14}C]-ácido oleico (American
Radiolabeled Chemicals). Los viales de incubación que contienen este
medio se cierran herméticamente con un tabique de goma del cual se
suspende un pocillo central que lleva una pieza de papel Whatman
(1,5 cm x 11,5 cm).
Después de un periodo de incubación inicial de
10 min con oxigenación constante, se retira la circulación de gas
para cerrar el sistema al medio exterior y los músculos se incuban
durante 90 min a 30ºC. Al final de este periodo, se inyectan 0,45
ml de Solvable (Packard Instruments, Meriden, CT) en el papel
Whatman en el pocillo central y se detiene la oxidación de oleato
por el músculo transfiriendo el vial a hielo.
Después de 5 min, se retira el músculo del medio
y también se retira una alícuota de 0,5 ml de medio. Los viales se
cierran de nuevo y se inyecta 1 ml de ácido perclórico al 35% con
una jeringa en el medio perforando a través del tabique de goma. El
CO_{2} liberado del medio acidificado se recoge por el Solvable en
el pocillo central. Después de un periodo de recolección de 90 min
a 30ºC, se retira el papel Whatman del pocillo central y se pone en
viales de centelleo que contienen 15 ml de fluido de centelleo
(HionicFlour, Packard Instruments, Meriden, CT). La cantidad de
radiactividad ^{14}C se cuantifica por recuento de centelleo de
líquidos. La velocidad de oxidación de oleato se expresa como nmol
de oleato producido en 90 min/g de músculo.
Para ensayar el efecto de gACRP30 o ACRP30 sobre
la oxidación de oleato, estas proteínas se añaden al medio a una
concentración final de 2,5 \mug/ml y se mantienen en el medio a lo
largo de todo el procedimiento.
Para determinar si el aumento de la oxidación de
FFA inducida por polipéptidos GSSP4 también va acompañado de un
aumento de la liberación de FFA en el músculo o hígado, se mide el
contenido de triglicéridos en músculo de pata trasera o en hígado
después del tratamiento de ratones con polipéptido GSSP4. Se extraen
muestras de músculo de las patas traseras así como muestras de
hígado a partir de animales tratados y no tratados y se determina
la concentración de triglicéridos y de ácidos grasos libres
siguiendo un método convencional de extracción de lípidos
(Shimabukuro et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA
94:4637-4641) seguido de un análisis de TG y FFA
usando kits de ensayo convencionales.
En dos grupos de ratones se inyectan en embolada
por vía intravenosa (a través de la vena de la cola) 30 \mul de
Intralipid-20% (Clintec) para generar una elevación
repentina de los niveles plasmáticos de FFA, evitando de esta
manera la absorción intestinal. (Intralipid es una emulsión grasa
intravenosa usada en terapia nutricional). En un grupo tratado
(tratado con polipéptido GSSP4) se inyecta polipéptido GSSP4 (25
\mug) a 30 y 60 minutos antes de administrar Intralipid, mientras
que los animales de control (\ding{115} control) recibieron
solución salina. Se aísla el plasma y se miden los FFA como se ha
descrito previamente. Después se controla el efecto de los
polipéptidos GSSP4 sobre la reducción de los niveles plasmáticos de
FFA después del pico inducido por la inyección de Intralipid.
Los ensayos de la eficacia en seres humanos se
realizan de acuerdo con las recomendaciones de un médico y con
pautas establecidas. Los parámetros ensayados en ratones también se
ensayan en seres humanos (por ejemplo, la ingesta de alimentos,
peso, TG, TC, glucosa, insulina, leptina y FFA). Es de esperar que
los factores fisiológicos muestren cambios a corto plazo. Los
cambios en el aumento de peso requerirían un periodo de tiempo más
prolongado. Además, la dieta se controla cuidadosamente. GSSP4 se
administra en dosis diarias de aproximadamente 6 mg de proteína por
persona de 70 kg o aproximadamente 10 mg al día. También se ensayan
otras dosis, por ejemplo 1 mg o 5 mg al día hasta 20 mg, 50 mg o 100
mg al día.
Se ha notificado que la leptina invierte la
resistencia a la insulina y la diabetes mellitus en ratones con
lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature 401:
73-76 (1999)). Se ha descubierto que la leptina es
menos eficaz en un modelo de ratón lipodistrófico diferente de
diabetes lipoatrófica (Gavrilova et al Nature 403: 850
(2000); incorporado en la presente memoria en su totalidad
incluyendo cualquier dibujo, figura o tabla). La presente invención
incluye el uso de GSSP4 o fragmentos polipeptídicos para reducir la
resistencia a la insulina y la hiperglucemia en este modelo sola o
en combinación con leptina, el péptido de leptina (solicitud
provisional de Estados Unidos Nº 60/155.506), u otros compuestos.
Los ensayos incluyen lo descrito previamente en Gavrilova et
al. ((2000) Diabetes Nov;49(11): 1910-6;
(2000) Nature Feb 24;403(6772):850) usando ratones
A-ZIP/F-1, con la excepción de que
se administra usando los métodos descritos previamente en el ejemplo
5 (o ejemplos 8-10). Se ensayan los niveles de
glucosa e insulina de los ratones, y se controlan la ingesta de
alimento y el peso del hígado, así como otros factores, tales como
los niveles de leptina, FFA y TG, medidos típicamente en nuestros
experimentos (véase el ejemplo 5, anterior, o los ejemplos
8-10).
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> GENSET
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polinucleótidos y Polipéptidos GSSP4
y usos de los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 103.WO1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-02-09
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2001-04-18
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2001-06-04
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2001-02-09
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<160> 18
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<223> región reguladora 5'
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<223> exon 2
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<221> exon
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<221> misc_feature
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<223> región reguladora 3'
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<220>
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<221> alelo
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<222> 148
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<223> VLP-148_A_G : base
polimórfica A o G
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<221> alelo
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<222> 816
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<223> VLP-816_G_A : base
polimórfica G o A
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<221> alelo
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<222> 924
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<223> VLP-924_G_A : base
polimórfica G o A
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<221> alelo
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<222> 1206
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<223> VLP-12 06_C_A : base
polimórfica C o A
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<220>
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<221> alelo
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<222> 1851
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<223> VLP-1851_T_C : base
polimórfica T o C
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<220>
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<221> alelo
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<222> 2551
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<223> VLP-2551_G_A : base
polimórfica G o A
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<220>
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<221> alelo
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<222> 3124
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<223> VLP-3124_C_T : base
polimórfica C o T
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<221> alelo
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<222> 3563
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP-3563_G_A : base
polimórfica G o A
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<220>
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<221> alelo
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<222> 3792
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP-3792_G_A : base
polimórfica G o A
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
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<222> 4417
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP-4417_A_C : base
polimórfica A o C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
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<222> 5757
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP-5757_T_C : base
polimórfica T o C
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
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<222> 6322
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP-6322_A_G : base
polimórfica A o G
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 82..103
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<223> VLP_82_103F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 522..542
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<223> VLP_522_542F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 1004..1024
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<223> VLP_1004_1024R complemento
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 999..1020
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<223> VLP_999_1021F
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 1381..1402
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_1381_1402P
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1479..1500
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_1479_1500R
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1892..1914
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 1892 1914P complemento
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1922..1943
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<223> VLP 1922 1944R complemento
\newpage
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2689..2711
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 2689 2711R complemento
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2937..2958
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 2937 2958P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3260..3281
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 3260 3281R complemento
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 3475..3497
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<223> VLP 3475 3498F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3934..3956
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 3934 3956R complemento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4565..4587
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 4565 4587R complemento
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 5536..5557
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<223> VLP 5536 5557F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6133..6154
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<223> VLP 6133 6154P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6647..6667
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_6647_6667R complemento
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6808..6829
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<223> VLP_6808_6829R complemento
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 128..147
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<223> VLP_128_148A_F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 128..148
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<223> VLP_128_148G_F
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 240..261
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<223> VLP_240_261R complemento
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2534..2550
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_2534_2551A_F
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 2745..2765
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_2745_2765R
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 3346..3356
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_240_261R
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 4401..4416
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<223> VLP_4401_4417A_F
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4620..4640
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<223> VLP_4620_4640R complemento
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
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<222> 6298..6321
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6298..6322
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP 6298 6322A F complemento
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6478..6499
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_6478_6499R complemento
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<400> 1
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<210> 2
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig-peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..20
\vskip0.400000\baselineskip
<223> matriz de Von Heijne, puntuación:
7,21 sec: VSIMLLLVTVSDC/AV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1..68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 69..386
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 387..666
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VLP_6322_A_G : base polimórfica A o
G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 105
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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103.US2.PRO
Claims (8)
1. Uso de una secuencia de polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 3 con
actividad relacionada con el metabolismo para la fabricación de un
medicamento para reducir los niveles de ácidos grasos libres en
circulación en un individuo, y opcionalmente reducir la masa
corporal.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
dicho medicamento es una composición fisiológicamente aceptable que
comprende un vehículo y dicha secuencia de polipéptido.
3. Uso de una secuencia de polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 3 con
actividad relacionada con el metabolismo para la fabricación de un
medicamento para reducir los niveles de glucosa en circulación en un
individuo, y opcionalmente reducir la masa corporal.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde
dicho medicamento es una composición fisiológicamente aceptable que
comprende un vehículo y dicha secuencia de polipéptido.
5. Uso de una secuencia de polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 3 con
actividad relacionada con el metabolismo para la fabricación de un
medicamento para reducir los niveles de triglicéridos en circulación
en un individuo, y opcionalmente reducir la masa corporal.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde
dicho medicamento es una composición fisiológicamente aceptable que
comprende un vehículo y dicha secuencia de polipéptido.
7. Uso de una secuencia de polipéptido que
comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº: 3 con
actividad relacionada con el metabolismo para la fabricación de un
medicamento para reducir los niveles de colesterol en circulación en
un individuo, y opcionalmente reducir la masa corporal.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde
dicho medicamento es una composición fisiológicamente aceptable que
comprende un vehículo y dicha secuencia de polipéptido.
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