ES2350573T3 - Cabeza globular de obg3 ensanchada, homotrimérica y sus usos. - Google Patents

Cabeza globular de obg3 ensanchada, homotrimérica y sus usos. Download PDF

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ES2350573T3 ES03756083T ES03756083T ES2350573T3 ES 2350573 T3 ES2350573 T3 ES 2350573T3 ES 03756083 T ES03756083 T ES 03756083T ES 03756083 T ES03756083 T ES 03756083T ES 2350573 T3 ES2350573 T3 ES 2350573T3
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Jiunn-Chern Yeh
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Abstract

Un fragmento globular homotrimérico de un polipéptido que tiene SEQ ID NO: 2 (gOBG3), en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244. 24-244, 25-244, 26- 244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, ó 36- 244 de SEQ ID NO: 2, en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye con un aminoácido distinto de cisteína.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de la investigación metabólica, en particular al descubrimiento de compuestos eficaces para tratar la obesidad y las en-fermedades y trastornos relacionados con la obesidad. Las enfermedades o trastornos relacionados con la obesidad previstos para ser tratados por los métodos de la inven-5 ción incluyen, pero sin limitación, hiperlipidemia, ateroesclerosis, diabetes, e hiperten-sión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La siguiente exposición pretende facilitar el entendimiento de la invención, pero 10 ni se pretende ni se admite que sea la técnica anterior a la invención.
La obesidad es un problema de salud pública que es grave, que está muy ex-tendido, y que va en aumento. En los Estados Unidos, el 20 por ciento de la población es obesa; en Europa, hay un porcentaje ligeramente menor de personas obesas [Friedman (2000) Nature 404:632-634]. La obesidad está asociada con un mayor 15 riesgo de hipertensión, enfermedad cardiovascular, diabetes y cáncer, así como con complicaciones respiratorias y osteoartritis [Kopelman (2000) Nature 404:635-643]. Incluso una pérdida de peso moderada mejora estas afecciones asociadas.
El mantenimiento de la ganancia o pérdida de peso está asociado a cambios compensadores del gasto energético que se oponen al mantenimiento de un peso cor-20 poral que es diferente del peso normal [Leibel et al. (1995) N Engl J Med 332:621-8]. Estos cambios pueden explicar, en parte, la baja eficacia a largo plazo de los trata-mientos contra la obesidad [Wadden (1993) Ann Intern Med 229:688-93]. Además, se ha documentado bien la sensibilidad disminuida a la insulina tras la ganancia de peso y el efecto beneficioso incluso de pequeñas reducciones de peso sobre el metabolismo 25 de los carbohidratos y la sensibilidad a la insulina en algunos pacientes [Olefsky et al. (1974) J Clin Invest 53:64-76].
Aunque todavía se reconoce que los factores del estilo de vida que incluyen el entorno, la dieta, la edad y el ejercicio desempeñan un papel en la obesidad, los estu-dios de gemelos, los análisis de agregación familiar, y los estudios de adopción indican 30 todos que la obesidad es en gran medida el resultado de factores genéticos [Barsh et al. (2000) Nature 404:644-651]. De acuerdo con estos estudios, está el hecho de que está siendo identificado un número creciente de genes relacionados con la obesidad. Algunos de los genes más ampliamente estudiados incluyen los que codifican la lep-tina (ob) y su receptor (db), pro-opiomelanocortina (Pomc), receptor 4 de melanocor-35 tina (Mc4r), proteína agouti (Ay), carboxipeptidasa E (fat), receptor 2C de 5-hidroxitrip-tamina (Htr2c), nescient helix-loop-helix 2 (Nhlh2) básico, prohormona-convertasa 1 (PCSKl), y proteína tubby (tubby) [revisado en Barsh et al. (2000) Nature 404:644-651].
El documento WO 01/51645 describe una proteína denominada OBG3 globu-5 lar, que reduce la ganancia de peso en animales, tiene una actividad similar a la insu-lina y es activa en el reparto de los lípidos y el metabolismo lipídico. OBG3 globular es un fragmento de OBG3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. En el documento WO 01/51645, se describe que esta proteína es eficaz para reducir la masa corporal y para tratar enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como hiperlipide-10 mias, ateroesclerosis, diabetes, e hipertensión.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el descubrimiento de que los fragmentos del polipéptido OBG3 de longitud completa que comprenden el dominio globular, denomi-15 nados fragmentos del polipéptido gOBG3, forman homotrímeros que tienen efectos inesperados in vitro e in vivo, que incluyen la utilidad para la reducción de peso, la pre-vención de la ganancia de peso, y el control de los niveles de glucosa en la sangre en seres humanos y otros mamíferos. La invención se basa además en el descubrimiento de que los multímeros del homotrímero de gOBG3 formados por medio de enlaces 20 disulfuro en el residuo de cisteína en la región única dispuesta en posición N-terminal tienen una actividad específica más baja para las actividades descritas en la presente memoria que la del homotrímero de gOBG3 no multimérico. La presente invención se basa además en el descubrimiento de que los fragmentos del polipéptido gOBG3 que comprenden toda o parte de la región similar a colágeno forman homotrímeros de 25 gOBG3 más estables que tienen las actividades descritas en la presente memoria.
Estos efectos inesperados de la administración del fragmento de polipéptido OBG3 homotrimérico a mamíferos incluyen también la reducción de los niveles eleva-dos de ácidos grasos libres causados por la administración de epinefrina, inyección i.v. de "intralipid", o administración de un alimento de ensayo de alto contenido en grasas, 30 así como el aumento de la oxidación de los ácidos grasos en las células del músculo, y la reducción de peso en los mamíferos que consumen una dieta de alto contenido en grasas/sacarosa. Estos efectos son inesperados y sorprendentes, dado que la admi-nistración de multímeros de homotrímeros de gOBG3 generalmente no tiene efecto o tiene un efecto significativamente reducido in vivo o in vitro que depende de la activi-35 dad biológica específica y de la cantidad administrada. Debido a que no se observa ningún efecto tras la administración de los multímeros de homotrímeros de gOBG3, los niveles de homotrímeros de gOBG3 multiméricos necesarios para alcanzar cierto efecto lo hacen inviable en la mayoría de los casos como tratamiento potencial para seres humanos en este momento. En contraste, el homotrímero de gOBG3 no multi-5 mérico de la invención es radicalmente más eficaz, y así se puede proporcionar a ni-veles que son viables para los tratamientos en seres humanos.
Así, la invención se refiere a los fragmentos del polipéptido gOBG3, los polinu-cleótidos que codifican dichos fragmentos del polipéptido gOBG3, los vectores que comprenden dichos polinucleótidos de gOBG3, y las células recombinantes para di-10 chos polinucleótidos de gOBG3, así como las composiciones farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables que comprenden dichos fragmentos del polipéptido gOBG3 y los métodos para administrar dichas composiciones farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables de gOBG3 para reducir el peso corporal o para tratar en-fermedades y trastornos relacionados con la obesidad, en los que dicho fragmento del 15 polipéptido gOBG3 comprende toda o parte de la región similar a colágeno, y además en los que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 no comprende el residuo de cis-teína en la región única dispuesta en posición N-terminal, debido a que dicho residuo de cisteína se ha sustituido con un aminoácido distinto de la cisteína o debido a que dicho fragmento no abarca dicho residuo de cisteína. También forman parte de la in-20 vención los ensayos para identificar agonistas y antagonistas de la actividad relacio-nada con la obesidad.
En un primer aspecto, la invención se refiere a un fragmento del polipéptido gOBG3 purificado, aislado o recombinante, en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 forma homotrímeros que tienen una actividad inesperada, en el que dicha acti-25 vidad inesperada se selecciona del grupo que consiste en el reparto de lípidos, el me-tabolismo lipídico, y la actividad similar a la insulina, en el que dicho polipéptido gOBG3 comprende toda o parte de la región similar a colágeno, y en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende una sustitución de un aminoácido dis-tinto de cisteína por la cisteína de la región única dispuesta en posición N-terminal 30 seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fe-nilalanina, glicocola, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, pro-lina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina, preferiblemente en el que dicho aminoácido sustituido es serina. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad inesperada se seleccionan de los aminoácidos 18-35 244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244 de SEQ ID NO:2, en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. Los fragmentos del polipéptido gOGB3 que tienen una actividad inesperada son humanos.
En otras realizaciones sumamente preferidas, la invención se refiere a un 5 fragmento del polipéptido OBG3 en el que dicho fragmento del polipéptido OBG3 forma homotrímeros que tienen una actividad inesperada seleccionada del grupo que consiste en el reparto de lípidos, el metabolismo lipídico, y la actividad similar a la in-sulina, en el que dicho fragmento del polipéptido OBG3 comprende, consiste esen-cialmente en, o consiste en un fragmento del polipéptido gOBG3 purificado, aislado o 10 recombinante, en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende toda o parte de la región similar a colágeno, y en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende una sustitución de un aminoácido distinto de la cisteína por la cis-teína de la región única dispuesta en posición N-terminal seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicocola, histidina, 15 isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina, preferiblemente en el que dicho aminoácido sus-tituido es serina. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad ines-perada se seleccionan de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-20 244, 34-244, 35-244, 36-244 de SEQ ID NO:2, en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad inesperada son humanos.
En otras realizaciones sumamente preferidas, la invención se refiere a un fragmento del polipéptido gOBG3 purificado, aislado o recombinante, en el que dicho 25 fragmento del polipéptido gOBG3 forma homotrímeros que tienen una actividad ines-perada, en el que dicha actividad inesperada se selecciona del grupo que consiste en la prevención de la ganancia de peso, la reducción de peso, y el mantenimiento de la pérdida de peso, en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende toda o parte de la región similar a colágeno, y en el que dicho fragmento del polipéptido 30 gOBG3 comprende una sustitución de un aminoácido distinto de cisteína por la cis-teína de la región única dispuesta en posición N-terminal seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicocola, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina, preferiblemente en el que dicho aminoácido sus-35 tituido es serina. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad ines-perada se seleccionan de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244 de SEQ ID NO:2 en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. El fragmento del polipéptido gOBG3 que 5 tiene una actividad inesperada es humano.
En otras realizaciones sumamente preferidas, la invención se refiere a un fragmento del polipéptido OBG3 en el que dicho fragmento del polipéptido OBG3 forma homotrímeros que tienen una actividad inesperada seleccionada del grupo que consiste en la prevención de la ganancia de peso, la reducción del peso, y el mante-10 nimiento de la pérdida de peso, y en el que dicho fragmento del polipéptido OBG3 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un fragmento del polipéptido gOBG3 purificado, aislado o recombinante, en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende toda o parte de la región similar a colágeno, y en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende una sustitución de un aminoácido dis-15 tinto de la cisteína por la cisteína de la región única dispuesta en posición N-terminal seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fe-nilalanina, glicocola, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, pro-lina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina, preferiblemente en el que dicho aminoácido sustituido es serina. Dicho fragmento del polipéptido 20 gOBG3 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, los aminoácidos 18 a 244 de SEQ ID NO:2, en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende todo o parte de la región similar a colágeno y en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad inesperada se seleccionan de los aminoácidos 18-244, 19-244, 25 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244 de SEQ ID NO:2, en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. El fragmento del polipéptido gOBG3 que tiene una actividad inesperada es humano.
En una realización más preferida, el fragmento del polipéptido gOBG3 forma 30 homotrímeros capaces de disminuir los niveles (concentración) circulantes (en sangre, suero o plasma) de: (i) ácidos grasos libres, (ii) glucosa, y/o (iii) triglicéridos. Los frag-mentos del polipéptido gOBG3 más preferidos forman homotrímeros que muestran una actividad de reducción del nivel de los ácidos grasos libres, actividad de reducción del nivel de glucosa, y/o actividad de reducción del nivel de triglicéridos, tienen una 35 actividad que es significativamente mayor que la de OBG3 de longitud completa a la misma concentración molar, tienen una actividad mayor que la actividad transitoria y/o tienen una actividad sostenida.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que mantienen la pérdida de peso, preferiblemente en indi-5 viduos que eran "obesos" previamente, y que ahora son "sanos" (tal como se define en la presente memoria).
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 más preferidos son aquellos que forman homotrímeros que estimulan de forma significativa la oxidación de los lípidos o de los ácidos grasos libres en el músculo en comparación con los polipéptidos OBG3 de lon-10 gitud completa a la misma concentración molar. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que provocan que las células C2Cl2 se diferencien en presencia de dichos fragmentos hasta experi-mentar al menos un 10%, 20%, 30%, 35%, o 40% más oxidación de oleato en compa-ración con las células sin tratar o con las células tratadas con OBG3 de longitud com-15 pleta.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que son al menos un 30 % más eficaces que el OBG3 de longitud completa para aumentar la absorción de leptina en una línea celular hepática (preferiblemente células hepáticas de ratón BPRCL (ATCC CRL-2217)). 20
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que reducen significativamente el incremento postprandial de ácidos grasos libres en plasma, en particular tras una comida de alto contenido en grasas.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos 25 que forman homotrímeros que reducen significativamente o eliminan la producción de cuerpos cetónicos, en particular tras una comida de alto contenido en grasas.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que incrementan la absorción de glucosa en las células del músculo esquelético. 30
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que incrementan la absorción de glucosa en las células adi-posas.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que incrementan la absorción de glucosa en las células neu-35 ronales.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que incrementan la absorción de glucosa en los glóbulos rojos.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos 5 que forman homotrímeros que incrementan la absorción de glucosa en el cerebro.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que reducen significativamente el incremento postprandial de la glucosa plasmática tras una comida, en particular una comida de alto contenido en carbohidratos. 10
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que previenen significativamente el incremento postprandial de la glucosa plasmática tras una comida, en particular una comida de alto contenido en grasas o en carbohidratos.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos 15 que forman homotrímeros que mejoran la sensibilidad a la insulina.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que inhiben la progresión desde la tolerancia alterada a la glucosa hasta la resistencia a la insulina.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos 20 que forman homotrímeros que incrementan la masa muscular, preferiblemente aque-llos que incrementan el número de células musculares, más preferiblemente aquellos que incrementan el número de fibras musculares.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que favorecen el incremento del contorno corporal, preferi-25 blemente los fragmentos que favorecen el incremento de la masa muscular. Los frag-mentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos favorecen la velocidad de crecimiento, preferiblemente favoreciendo un incremento de la velocidad de creci-miento mayor que la velocidad de crecimiento media en ausencia de los fragmentos del polipéptido gOBG3. 30
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que favorecen la velocidad de crecimiento en mamíferos recién nacidos, preferiblemente en recién nacidos de vaca, cabra, oveja, conejo, ratón, rata, cerdo, perro, o humano, más preferiblemente en recién nacidos humanos con una edad de 0-6 meses, y lo más preferiblemente en recién nacidos humanos con una 35 edad de 0-3 meses. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 adicionalmente descritos son aquellos que forman homotrímeros que favorecen la velocidad de crecimiento en recién nacidos de peso insuficiente o en animales prematuros, preferiblemente recién nacidos de peso insuficiente o prematuros de vaca, cabra, oveja, conejo, ratón, rata, cerdo, perro, o humano, más preferiblemente recién nacidos de peso insuficiente o 5 prematuros humanos con una edad de 0-6 meses, lo más preferiblemente recién naci-dos de peso insuficiente o prematuros humanos con una edad de 0-3 meses.
Los fragmentos del polipéptido gOGB3 forman homotrímeros in vitro y/o in vivo. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 más preferidos son aquellos que forman homotrímeros in vitro y/o in vivo, en los que al menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 10 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de dicho fragmento del polipéptido gOBG3 comprende dicho homotrímero. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 más preferidos en particular son aquellos que forman homotrímeros in vitro y/o in vivo que tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste en el reparto de lípidos, metabolismo 15 lipídico, y actividad similar a la insulina. Además, los fragmentos del polipéptido gOBG3 más preferidos en particular son aquellos que forman homotrímeros in vitro y/o in vivo que tienen una actividad seleccionada del grupo que consiste en la prevención de la ganancia de peso, la reducción del peso, y el mantenimiento de la pérdida de peso. 20
Las realizaciones descritas adicionalmente incluyen polipéptidos heterólogos que comprenden un fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención. Dicho polipép-tido heterólogo consiste en un péptido señal fusionado en posición N-terminal a dicho polipéptido gOBG3 de la invención. En una realización, dicho péptido señal es un pép-tido señal de zinc-alfa 2-glicoproteína humana de la secuencia de aminoácidos 25 MVRMVPVLLSLLLLLGPAVP, preferiblemente codificado por el polinucleótido de se-cuencia atggtaagaatggtgcctgtcctgctgtctctgctgctgcttctgggtcctgctgtcccc.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que codifica dicho fragmento del polipéptido gOBG3 o polipép-tido OBG3 de longitud completa descrito en el primer aspecto, o el complemento del 30 mismo. En las realizaciones adicionales los polinucleótidos son ADN, ARN, híbridos ADN/ARN, monocatenarios y bicatenarios.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende, consiste esencialmente en o consiste en, dicho polinucleótido descrito en el segundo aspecto. 35
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una célula recombinante que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, dicho vector recombinante des-crito en el tercer aspecto. Dicha célula recombinante preferida es una célula recombi-nante procariótica o eucariótica. Dicha célula recombinante procariótica preferida es una célula recombinante de E. coli. Dicha célula recombinante eucariótica preferida es 5 una célula recombinante de mamífero. La célula recombinante de mamífero particu-larmente preferida se selecciona del grupo que consiste en una célula recombinante COS, una célula recombinante de ovario de hámster chino (CHO), una célula recombi-nante de riñón embrionario humano (HEK), y una célula recombinante de adipocito 3T3-L1. Una realización adicional incluye una célula hospedadora recombinante para 10 un polinucleótido de la invención. Dicha célula hospedadora preferida es una célula hospedadora procariótica o eucariótica. Dicha célula hospedadora procariótica prefe-rida es una célula hospedadora de E. coli. Dicha célula hospedadora eucariótica prefe-rida es una célula hospedadora de mamífero. La célula hospedadora de mamífero par-ticularmente preferida se selecciona del grupo que consiste en una célula 15 hospedadora COS, una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO), una célula hospedadora de riñón embrionario humano (HEK), y una célula hospedadora de adipocito 3T3-L1.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica-mente o fisiológicamente aceptable que comprende, consiste esencialmente en o con-20 siste en dicho fragmento del polipéptido gOBG3 descrito en el primer aspecto y, de manera alternativa, un diluyente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. Di-cha composición más preferida farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable com-prende, consiste esencialmente en, o consiste en un homotrímero de dicho fragmento del polipéptido gOBG3 descrito en el primer aspecto y, de manera alternativa, un dilu-25 yente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. En dicha composición farma-céuticamente o fisiológicamente aceptable, preferiblemente al menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de dicho fragmento del polipéptido gOBG3 del primer aspecto comprende el homotrímero. 30
En un sexto aspecto, la invención se refiere a un método para reducir la masa corporal que comprende proporcionar o administrar a los individuos que necesitan re-ducir la masa corporal dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto. Se prefiere además un método para reducir la masa corporal grasa que comprende proporcionar o administrar a individuos que lo 35 necesitan dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto. Se prefiere además un método para incrementar la masa corpo-ral sin grasa que comprende proporcionar o administrar a individuos que lo necesitan dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto. Se prefiere además un método para incrementar la velocidad de cre-5 cimiento del contorno o la longitud corporal que comprende proporcionar o administrar a individuos que lo necesitan dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto.
En una realización más preferida, la presente invención se puede usar en la te-rapia complementaria de pacientes obesos para mejorar su peso en combinación con 10 un agente reductor del peso. Los ejemplos del agente reductor del peso incluyen los inhibidores de lipasas, tales como orlistat, y los inhibidores de la reabsorción de sero-tonina (SSRI) y los inhibidores de la reabsorción de noradrenalina, tales como sibu-tramina.
En las realizaciones más preferidas, la invención se refiere a un método para 15 mantener una masa corporal reducida que comprende proporcionar o administrar a individuos que necesitan mantener una masa corporal reducida dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto. Se pre-fiere adicionalmente un método para mantener una masa corporal grasa reducida que comprende proporcionar o administrar a individuos que lo necesitan dicha composición 20 farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto, devol-ver la ingesta de energía a un nivel normal en dicho individuo, y mantener un gasto energético incrementado en dicho individuo. Preferiblemente, dicho individuo es capaz de mantener un peso estable que está un 10-20% por debajo de su peso obeso (tal como se describe en la presente memoria). 25
En otras realizaciones preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar en combinación con una ingesta de energía reducida y/o un gasto energético incrementado como método para mantener la pérdida de peso.
También se describe la identificación de dichos individuos que necesitan redu-30 cir la masa corporal para ser tratados con dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable que comprende la caracterización del genotipo de los poli-morfismos de los nucleótidos individuales (SNPs) de OBG3 o la medida de los niveles del polipéptido OBG3 o del mARN en muestras clínicas de dichos individuos. Dichas muestras clínicas se seleccionan del grupo que consiste en plasma, orina, y saliva. Un 35 fragmento del polipéptido gOGB3 de la presente invención se administra a un individuo con al menos una reducción del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de los niveles en sangre, suero o plasma de OBG3 de longitud completa o del fragmento de OBG3 escindido de manera natural proteolíticamente en comparación con los pacientes sanos no obesos. 5
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad que comprende propor-cionar o administrar a un individuo que necesita tal tratamiento dicha composición far-macéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto. En las realizaciones descritas, la identificación de dichos individuos que necesitan tal trata-10 miento para ser tratados con dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable comprende la caracterización del genotipo de los polimorfismos de los nu-cleótidos individuales (SNPs) de OBG3 o la medida de los niveles del polipéptido OBG3 o del mARN en muestras clínicas de dichos individuos. Dichas muestras clíni-cas se seleccionan del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, y saliva. 15 Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad se selec-ciona del grupo que consiste en obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apo-plejía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las complicacio-20 nes relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención inclu-yen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesio-nes renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia e 25 hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos relacionados con el metabolismo de la invención incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, perdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia, y bulimia. En las realizaciones preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En la presente memoria se describen métodos para provocar o inducir una res-30 puesta biológica deseada en un individuo, que comprenden las etapas de: proporcio-nar o administrar a un individuo una composición que comprende un polipéptido del primer aspecto, en el que dicha respuesta biológica se selecciona del grupo que con-siste en:
(a) reducción de los niveles (concentración) circulantes (sanguíneos, séricos o 35 plasmáticos) de ácidos grasos libres;
(b) reducción de los niveles (concentración) circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de glucosa;
(c) reducción de los niveles (concentración) circulantes (sanguíneos, séricos o plasmáticos) de triglicéridos; 5
(d) estimulación de la oxidación de ácidos grasos libres o de lípidos en el mús-culo;
(c) aumento de la absorción de leptina en células hepáticas o en el hígado;
(e) reducción del aumento posprandial en los ácidos grasos libres plasmáticos, particularmente después de una comida de alto contenido en grasas; y, 10
(f) reducción o eliminación de la producción de cuerpos cetónicos, particular-mente después de una comida de alto contenido en grasas;
(g) aumento de la sensibilidad de los tejidos a la insulina, particularmente del músculo, tejido adiposo, hígado o cerebro,
(h) inhibición de la progresión desde una tolerancia alterada a la glucosa a la 15 resistencia a la insulina;
(i) incremento de la síntesis de proteínas en las células musculares;
(j) reducción del contenido de triglicéridos en los adipocitos;
(k) incremento de la utilización de energía a partir de los alimentos o de las re-servas metabólicas; 20
(l) incremento de la velocidad de crecimiento, preferiblemente el crecimiento del contorno o la longitud;
(m) incremento del crecimiento muscular; y
(n) incremento del crecimiento esquelético;
y además en el que dicha respuesta biológica es significativamente mayor que, 25 o al menos un 10%, 20%, 30%, 35%, o 40% más grande que, la respuesta biológica causada o inducida por un polipéptido OBG3 de longitud completa con la misma con-centración molar; o alternativamente en el que dicha respuesta biológica es mayor que una respuesta transitoria; o alternativamente en el que dicha respuesta biológica es sostenida. En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-30 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar la glucosa sanguínea en ciertas personas con diabetes mellitus no insu-linodependiente (NIDDM, diabetes tipo II) en combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para 35 controlar la glucosa sanguínea en ciertas personas con diabetes mellitus insulinode-pendiente (IDDM, diabetes tipo I) en combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar el peso corporal en combinación con la terapia de insulina. 5
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar el peso corporal en ciertas personas con diabetes mellitus insulinodepen-diente (IDDM, diabetes tipo I) en combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición 10 farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar la glucosa sanguínea en ciertas personas con diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM, diabetes tipo II) por sí solo, sin combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición 15 farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar la glucosa sanguínea en ciertas personas con diabetes mellitus insulinode-pendiente (IDDM, diabetes tipo I) por sí solo, sin combinación con la terapia de insu-lina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición 20 farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar el peso corporal en ciertas personas con diabetes mellitus no insulinodepen-diente (NIDDM, diabetes tipo II) por sí solo, sin combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para 25 controlar el peso corporal en ciertas personas con diabetes mellitus insulinodepen-diente (IDDM, diabetes tipo I) por sí solo, sin combinación con la terapia de insulina.
En una realización adicionalmente preferida, la presente invención se puede usar en la terapia complementaria de pacientes de NIDDM para mejorar su peso o el control de la glucosa en combinación con un secretagogo de insulina oral o un agente 30 sensibilizante a la insulina. Preferiblemente, el secretagogo de insulina oral es fuma-rato de 1,1-dimetil-2-(2-morfolinofenil)guanidina (BTS67582) o una sulfonilurea selec-cionada entre tolbutamida, tolazamida, clorpropamida, glibenclamida, glimepirida, gli-pizida y glidazida. Preferiblemente, el agente de sensibilización a la insulina se selecciona entre metformina, ciglitazona, troglitazona y pioglitazona. 35
La presente invención proporciona además un método para mejorar el peso corporal o el control de la glucosa de pacientes de NIDDM por sí solo, sin un secreta-gogo de insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina.
En una realización adicionalmente preferida, la presente invención se puede usar en la terapia complementaria de pacientes de IDDM para mejorar su peso o el 5 control de la glucosa en combinación con un secretagogo de insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina. Preferiblemente, el secretagogo de insulina oral es fuma-rato de 1,1-dimetil-2-(2-morfolinofenil)guanidina (BTS67582) o una sulfonilurea selec-cionada entre tolbutamida, tolazamida, clorpropamida, glibenclamida, glimepirida, gli-pizida y glidazida. Preferiblemente, el agente de sensibilización a la insulina se 10 selecciona entre metformina, ciglitazona, troglitazona y pioglitazona.
La presente invención proporciona además un método para mejorar el peso corporal o el control de la glucosa de pacientes de IDDM por sí solo, sin un secreta-gogo de insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina.
En otra realización preferida, la presente invención puede administrarse con-15 comitante o conjuntamente con el secretagogo de insulina oral o el agente de sensibi-lización a la insulina, por ejemplo, en forma de unidades de dosificación separadas a usar simultáneamente, por separado o secuencialmente (antes o después del secreta-gogo o antes o después del agente de sensibilización). Por lo tanto, la presente inven-ción proporciona además una composición farmacéuticamente o fisiológicamente 20 aceptable y un secretagogo de insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina en forma de una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial para la mejora del peso corporal o el control de la glucosa en pacientes de NIDDM o IDDM.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición 25 farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables proporciona además un método para el uso como un agente sensibilizador a la insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para mejorar la sensibilidad a la insulina en ciertas personas con diabetes mellitus no insuli-30 nodependiente (NIDDM, diabetes tipo II) en combinación con la terapia de insulina.
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para mejorar la sensibilidad a la insulina en ciertas personas con diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM, diabetes tipo I) en combinación con la terapia de insulina. 35
En realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para mejorar la sensibilidad a la insulina en ciertas personas con diabetes mellitus no insuli-nodependiente (NIDDM, diabetes tipo II) sin terapia de insulina.
También se describe en la presente memoria un método para producir el frag-5 mento del polipéptido gOBG3 descrito en el primer aspecto, en el que dicho método se selecciona del grupo que consiste en: escisión proteolítica, metodología recombinante y síntesis artificial.
También se describe en la presente memoria un método para producir un fragmento del polipéptido gOBG3 recombinante o un polipéptido OBG3 de longitud 10 completa, y el método comprende proporcionar un animal transgénico no humano cuya leche contiene dicho fragmento del polipéptido gOBG3 recombinante o dicha proteína de longitud completa, y purificar dicho fragmento del polipéptido gOBG3 re-combinante o dicho polipéptido OBG3 de longitud completa de la leche de dicho ma-mífero no humano. Dicho mamífero no humano es una vaca, cabra, oveja, conejo, o 15 ratón. En otra realización descrita, el método comprende purificar un polipéptido OBG3 maduro recombinante que no tiene el péptido señal a partir de dicha leche, y que com-prende además escindir dicha proteína in vitro para obtener un fragmento del polipép-tido gOBG3 deseado.
En un décimo aspecto, la invención se refiere al uso del polipéptido descrito en 20 el primer aspecto para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad y/o para reducir la masa corporal. Preferiblemente, dichas enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad se seleccionan del grupo que consiste en obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes 25 mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insuli-nodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las lesiones microan-giopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y 30 tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. En las realiza-ciones preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención se refiere además al uso del polipéptido del primer aspecto para la prevención de la ganancia de peso, para la reducción del peso, y/o para el mante-35 nimiento de la pérdida de peso. En las realizaciones preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En un decimoprimer aspecto, la invención se refiere al uso del polipéptido des-crito en el primer aspecto para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad y/o para reducir la masa 5 corporal. Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hiper-tensión, apoplejía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las 10 complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la in-vención incluyen las lesiones microangiopáticas, las lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipi-15 demia e hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos relacionados con el metabo-lismo de la invención incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, perdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia, y bulimia. En las reali-zaciones preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención se refiere además al uso del polipéptido del primer aspecto para 20 la preparación de un medicamento para la prevención de la ganancia de peso, para la reducción de peso, y/o para el mantenimiento de la pérdida de peso. En las realizacio-nes preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En un decimotercer aspecto, la invención se refiere a métodos para reducir el peso corporal, que comprenden proporcionar a un individuo dicha composición farma-25 céuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto, o el polipép-tido descrito en el primer aspecto. Cuando la reducción del peso corporal se lleva a cabo con fines cosméticos, el individuo tiene un IMC de al menos 20, y no más de 25. En las realizaciones para el tratamiento de la obesidad, el individuo puede tener un IMC de al menos 20. Una realización para el tratamiento de la obesidad prevé el tra-30 tamiento de individuos con valores de IMC de al menos 25. Otra realización para el tratamiento de la obesidad prevé el tratamiento de individuos con valores de IMC de al menos 30. Aún otra realización prevé el tratamiento de individuos con valores de IMC de al menos 40. De manera alternativa, para incrementar el peso corporal de un indivi-duo, el valor de IMC debería ser al menos 15 y no más de 20. 35
En un aspecto relacionado, la invención se refiere a métodos para mantener la pérdida de peso, que comprenden proporcionar a un individuo dicha composición far-macéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto, o el poli-péptido descrito en el primer aspecto. Cuando el mantenimiento de la pérdida de peso se lleva a cabo con fines cosméticos, el individuo tiene un IMC de al menos 20, y no 5 más de 25. En las realizaciones para el tratamiento de la obesidad por medio del mantenimiento de la pérdida de peso, el individuo puede tener un IMC de al menos 20. Una realización para el tratamiento de la obesidad por medio del mantenimiento de la pérdida de peso prevé el tratamiento de individuos con valores de IMC de al menos 25. Otra realización para el tratamiento de la obesidad por medio del mantenimiento de 10 la pérdida de peso prevé el tratamiento de individuos con valores de IMC de al menos 30.
En un decimocuarto aspecto, la invención se refiere a la composición farma-céuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto para reducir la masa corporal y/o para el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos 15 relacionados con la obesidad. Preferiblemente, dicha enfermedad o trastorno relacio-nado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateroma-tosa, cardiopatía, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinode-pendiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o 20 diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención inclu-25 yen hiperlipidemia e hiperuricemia. En las realizaciones preferidas, dicho individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano. En las realizaciones descritas, la identi-ficación de dichos individuos a tratar con dicha composición farmacéuticamente o fi-siológicamente aceptable comprende la caracterización del genotipo de los polimor-fismos de los nucleótidos individuales (SNPs) de OBG3 o la medición de los niveles 30 del polipéptido OBG3 o del mARN en muestras clínicas de dichos individuos. Dichas muestras clínicas se seleccionan del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, y saliva.
En un decimoquinto aspecto, la invención se refiere a la composición farma-céuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto para reducir el 35 peso corporal por razones cosméticas.
En un aspecto relacionado, la invención se refiere a la composición farmacéuti-camente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto para mantener la pérdida de peso por razones cosméticas.
En realizaciones más preferidas, la invención se refiere a la composición far-5 macéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto en un mé-todo para tratar a un sujeto que tiene resistencia a la insulina. En aún otras realizacio-nes preferidas, se trata a un sujeto que tiene resistencia a la insulina según los métodos de la invención para reducir o curar la resistencia a la insulina. Debido a que la resistencia a la insulina también está asociada a menudo con infecciones y cáncer, 10 la prevención o la reducción de la resistencia a la insulina según los métodos de la invención puede prevenir o reducir las infecciones y el cáncer.
En una realización más preferida, los métodos de la invención se usan para prevenir el desarrollo de resistencia a la insulina en un sujeto, p.ej., los que se sabe que tienen un mayor riesgo de desarrollar resistencia a la insulina. 15
También se describe un método para usar un fragmento del polipéptido gOBG3 homotrimérico en un método para cribar compuestos en busca de uno o más antago-nistas de la actividad de un fragmento del polipéptido gOBG3 homotrimérico, en el que dicha actividad se selecciona, pero sin limitación, de reducción de peso, manteni-miento de la pérdida de peso, reparto de lípidos, metabolismo lipídico, y actividad si-20 milar a la insulina.
Dicho compuesto se selecciona, pero sin limitación, de un compuesto orgánico o inorgánico de bajo peso molecular, proteína, péptido, carbohidrato, o lípido.
También se describe un mamífero, preferiblemente un ser humano recién na-cido, con un complemento para favorecer, mejorar, potenciar o aumentar la asimila-25 ción, la utilización o el almacenamiento de energía y de otros nutrientes presentes en los alimentos consumidos por los mamíferos recién nacidos, en particular los seres humanos recién nacidos, y en particular la energía y otros nutrientes de la leche de inicio o la leche materna. También se describe proporcionar a un mamífero, preferi-blemente un ser humano recién nacido, un complemento para favorecer, mejorar, po-30 tenciar o incrementar la velocidad de crecimiento. Los métodos preferidos de comple-mentación con un polipéptido del primer aspecto incluyen, pero sin limitación:
(a) la adición directa de un polipéptido del primer aspecto a la leche de inicio sintética o a la leche materna;
(b) la administración de la composición farmacéuticamente o fisiológicamente 35 aceptable descrita en el quinto aspecto antes de la alimentación, preferiblemente 1-15 minutos antes de la alimentación, más preferiblemente 1-5 minutos antes de la ali-mentación; y
(c) la administración de la composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto tras la alimentación, preferiblemente 1-15 mi-5 nutos tras la alimentación, más preferiblemente 1-5 minutos tras la alimentación;
en los que las vías de administración de un polipéptido del primer aspecto o de la composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable descrita en el quinto aspecto se seleccionan de las vías oral, bucal, nasal e intramuscular, preferiblemente la vía oral. 10
En los aspectos preferidos de los métodos de la invención descritos en la pre-sente memoria, la cantidad de fragmento del polipéptido gOBG3 o de polinucleótido administrada a un individuo es suficiente para llevar los niveles (concentración) circu-lantes (en sangre, suero, o plasma) de los polipéptidos OBG3 a sus niveles normales (niveles de individuos no obesos). Los "niveles normales" se pueden especificar como 15 la concentración total de todos los polipéptidos OBG3 (OBG3 de longitud completa y sus fragmentos) circulantes, o solamente la concentración de todos los polipéptidos OBG3 circulantes escindidos proteolíticamente.
En las realizaciones preferidas de las composiciones de la invención descritas en la presente memoria, las composiciones de la invención pueden comprender ade-20 más cualquier combinación del fragmento del polipéptido gOBG3 del primer aspecto, insulina, secretagogos de insulina o agentes sensibilizantes a la insulina, de forma que la composición produce un efecto biológico mayor que el efecto esperado para dicho fragmento del polipéptido gOBG3 administrado solo en vez de en combinación con insulina, secretagogos de insulina o agentes sensibilizantes a la insulina. 25
En una realización adicional, dicha función biológica incluye, pero sin limitación, la actividad de disminución del nivel de ácidos grasos libres, actividad de disminución del nivel de glucosa, actividad de disminución del nivel de triglicéridos, estimulación de la lipolisis adiposa, estimulación de la oxidación de los lípidos musculares o de los áci-dos grasos libres, incremento de la absorción de leptina en una línea de células hepá-30 ticas, reducción significativa del incremento postprandial de ácidos grasos libres o glu-cosa en el plasma debida a una comida de alto contenido en grasas, reducción o eliminación significativa de la producción de cuerpos cetónicos como resultado de una comida de alto contenido en grasas, incremento de la absorción de glucosa en las cé-lulas del músculo esquelético, células adiposas, glóbulos rojos o en el cerebro, incre-35 mento de la sensibilidad a la insulina, inhibición de la progresión desde una tolerancia alterada a la glucosa hasta la resistencia a la insulina, reducción de la masa corporal, disminución de la masa grasa, incremento de la masa muscular no grasa, prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo, control de la glucosa sanguínea en ciertas personas con diabetes mellitus no insulinodepen-5 diente o diabetes mellitus insulinodependiente, tratamiento de la resistencia a la insu-lina o prevención del desarrollo de resistencia a la insulina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de los polipéptidos 10 OBG3 humanos (APM1), y de ratón (AdipoQ y ACRP30).
La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico de AdipoQ clonada en los sitios Xhol de pTrcHisB. AdipoQ comienza en 510 y termina en 1214 (inserto en ne-grita). Esta construcción no contiene la secuencia derivada del péptido señal N-termi-nal (MLLLQALLFLLILP). 15
La Figura 3 muestra un dibujo esquemático de la estructura proteica de APM1. Se muestran la secuencia señal supuesta en el extremo N-terminal (AA 1-17), la re-gión única (AA 18-41), la región similar a colágeno (AA 42-107), y el dominio globular (AA 108-244) en el extremo carboxiterminal. Se muestran también dos sitios de esci-sión por la proteasa después de AA 100 y AA 131. 20
La Figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico del dominio globular de AdipoQ clonada en pTrcHisB. El dominio globular de AdipoQ comienza en 510 y ter-mina en 927 pb. El inserto está en negrita.
La Figura 5 es un gráfico que muestra una comparación del efecto de AdipoQ (AQ) y la cabeza globular de AdipoQ (AQ-GH) sobre la 125I-leptina asociada a las cé-25 lulas en la línea celular hepática de ratón BPRCL. Los resultados se muestran como porcentaje de los valores de control en presencia de cantidades crecientes de com-puesto (AQ o AQ-GH), y son la media de determinaciones triplicadas.
Las Figuras 6A, 6B, y 6C muestran gráficos de la unión, absorción, y degrada-ción, respectivamente, de 125I-LDL en la línea celular hepática de ratón BPRCL en pre-30 sencia de cantidades crecientes de gOBG3.
La Figura 7 muestra un alineamiento de la secuencia proteínica del clon obg3 (clon obg3; el inserto de la Fig. 2) con las secuencias publicadas de obg3 humano (apm1) y de ratón (AdipoQ y acrp30). En el alineamiento, los aminoácidos (AAs) 45 a 110 contienen la región similar a colágeno; los AAs 111-247 contienen el dominio glo-35 bular. Los sitios de corte de la lisina-tripsina bloqueada están después de los AAs 58, 61, 95, 103, 115, 125, y 134. Como se determina por la secuenciación amino-terminal del producto gOBG3, el sitio de comienzo de gOBG3 está en el AA 104 (101 para el gOBG3 humano o APM1).
La Figura 8 muestra una representación gráfica del efecto de gOBG3 (3 x 25 5 µg ip) sobre los ácidos grasos libres (FFA) en el plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas (* p < 0,02).
Las Figuras 9A y 9B muestran representaciones gráficas del efecto de gOBG3 (3 x 25 µg ip) sobre los triglicéridos (TG) en el plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas (p < 0,05 a las 2, 3 y 4 horas). La Figura 9A 10 muestra los TG en mg/dl; la Figura 9B muestra los TG como porcentaje del valor de partida.
La Figura 10 muestra una representación gráfica del efecto de gOBG3 (3 x 25 µg ip) sobre la glucosa del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto con-tenido en grasas. 15
Las Figuras 11A y 11B muestran representaciones gráficas del efecto de gOBG3 (3x25 µg ip) sobre los FFA del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas. La Figura 11A muestra los FFA como mM; la Figura 11B muestra los FFA como porcentaje del valor de partida.
Las Figuras 12A y 12B muestran representaciones gráficas del efecto de 20 gOBG3 (3x25 µg) sobre la leptina del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas. La Figura 12A muestra la leptina como ng/ml; la Figura 12B muestra la leptina como porcentaje del valor de partida.
Las Figuras 13A y 13B muestran representaciones gráficas del efecto de gOBG3 (3x25 µg) sobre la insulina del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida 25 de alto contenido en grasas. La Figura 13A muestra los niveles de insulina en ng/ml; la Figura 13B muestra la insulina como porcentaje del valor de partida.
Las Figuras 14A y 14B muestran representaciones gráficas del efecto de OBG3 sobre los FFA del plasma, en ratones C57BL6/J después de una comida de alto con-tenido en grasas. A t = 2 horas se vio una reducción significativa en los FFA para am-30 bos grupos de tratamiento (p < 0,05). La Figura 14A muestra los niveles de FFA en mM; la Figura 14B muestra los FFA como porcentaje del valor de partida.
Las Figuras 15A y 15B muestran representaciones gráficas del efecto de OBG3 sobre los TG del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas. La Figura 15A muestra los niveles de TG en mg/dl; la Figura 15B muestra los 35 TG como porcentaje del valor de partida.
Las Figuras 16A y 16B muestran representaciones gráficas del efecto de OBG3 sobre la glucosa del plasma en ratones C57BL6/J tras una comida de alto contenido en grasas. La Figura 16A muestra los niveles de glucosa como mg/dl; la Figura 16B muestra los niveles de glucosa como porcentaje del valor de partida. 5
La Figura 17 muestra una tabla que identifica los SNP adicionales de APM1. Se muestra información sobre los cambios de bases conocidos, localización, marcado-res previos, Amplicon, y cebadores directos e inversos para la microsecuenciación.
Las Figuras 18A y 18B muestran representaciones gráficas del efecto de la in-yección de gACRP30 en ratones sobre los aumentos de FFA (Fig. 18A) y glucosa (Fig. 10 18B) resultantes de la inyección de epinefrina.
La Figura 19 muestra una representación gráfica del efecto del tratamiento con gACRP30 sobre el metabolismo de los ácidos grasos en el músculo aislado de rato-nes. Los tratamientos mostrados son el control (amarillo) y gACRP30 (rojo).
Las Figuras 20A y 20B muestran una representación gráfica del efecto del tra-15 tamiento con gAGRP30 sobre el contenido en triglicéridos del músculo e hígado aisla-dos de ratones.
Las Figuras 21A, 21B, 21C, y 21D muestran representaciones gráficas del efecto del tratamiento con gACRP30 sobre la ganancia y pérdida de peso en ratones. Los tratamientos mostrados son solución salina (rombo), ACRP30 (cuadrado oscuro), 20 y gACRP30 (triángulo). La Fig. 21A muestra los resultados del tratamiento de ratones tras 19 días con una dieta de alto contenido en grasas. La Fig. 21B muestra los resul-tados del tratamiento de ratones tras 6 meses con una dieta de alto contenido en gra-sas.
La Figura 22 muestra una tabla de los valores de bioquímica sanguínea anali-25 zados con inyecciones de solución salina, inyecciones de ACRP30, o inyecciones de gACRP30.
La Figura 23 muestra un gráfico que representa la eliminación de los FFAs del plasma después de la inyección de Intralipid tras el tratamiento con gACRP30 (rom-bos) o un control de solución salina (triángulos). 30
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:1 es la secuencia de nucleótidos de cADN con un marco de lectura abierto cuya localización se indica tal como se representa.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el 35 cADN de SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de nucleótidos de cADN con un marco de lectura abierto cuya localización se indica tal como se representa.
SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el cADN de SEQ ID NO:3. 5
SEQ ID NO:5 es la secuencia de nucleótidos genómica que comprende el gen que codifica la proteína de SEQ ID NO:2.
El Listado de Secuencias adjunto se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.
10
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Antes de describir la invención con mayor detalle, se indican las siguientes de-finiciones para ilustrar y definir el significado y alcance de los términos usados para describir la invención en la presente memoria.
Como se usan en la presente memoria, de forma intercambiable, los términos 15 "oligonucleótidos", y "polinucleótidos" y ácido nucleico incluyen las secuencias de ARN, ADN, o híbridas ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en cadena sencilla o en forma dúplex. Los términos engloban los "nucleótidos modificados" que compren-den al menos una modificación, incluyendo a modo de ejemplo y no de limitación: (a) un grupo alternativo de enlace, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga 20 de pirimidina, o (d) un análogo de azúcar. Para ejemplos de grupos análogos de en-lace, purinas, pirimidinas, y azúcares, véase por ejemplo la publicación PCT No. WO 95/04064. Las secuencias polinucleotídicas de la invención pueden prepararse por cualquier método conocido, incluyendo la generación sintética, recombinante, ex vivo, o una combinación de las mismas, así como utilizando cualquier método de purifica-25 ción conocido en la técnica.
Los términos estructura artificial de polinucleótido, polinucleótido recombinante y polipéptido recombinante se usan en la presente memoria de forma consistente con su uso en la técnica. Los términos "hacia arriba" y "hacia abajo" se usan también en la presente memoria de forma consistente con su uso en la técnica. Las expresiones 30 "emparejamiento de bases" y "emparejamiento de bases de Watson y Crick" se usan de manera intercambiable en la presente memoria y de forma consistente con su uso en la técnica. De manera similar, las expresiones "complementario", "complemento del mismo", "complemento", "polinucleótido complementario", "ácido nucleico comple-mentario" y "secuencia de nucleótidos complementaria" se usan de manera intercam-35 biable en la presente memoria y de forma consistente con su uso en la técnica.
El término "purificado" se usa en la presente memoria para describir un polinu-cleótido o vector polinucleotídico de la invención que se ha separado de otros com-puestos incluyendo, pero sin limitación, otros ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis del polinucleótido). Purificado 5 también puede referirse, por ejemplo, a la separación de polinucleótidos cerrados co-valentemente de polinucleótidos lineales, o viceversa. Un polinucleótido es sustan-cialmente puro cuando al menos aproximadamente 50%, 60%, 75% o 90% de una muestra contiene una única secuencia polinucleotídica. En algunos casos esto implica una determinación entre conformaciones (lineal frente a cerrada covalentemente). Un 10 polinucleótido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 % peso/peso de una muestra de ácido nucleico. La pureza u homo-geneidad de un polinucleótido se puede indicar por una serie de medios bien conoci-dos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la visualización de una única banda de un polinucleótido 15 después de la tinción del gel. Para ciertos fines, se puede alcanzar una mayor resolu-ción mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.
De forma similar, el término "purificado" se usa en la presente memoria para describir un polipéptido de la invención que se ha separado de otros compuestos in-cluyendo, pero sin limitación, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otras proteínas. 20 En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido está sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente un 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de las moléculas polipeptídicas de una muestra tienen una única se-cuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido sustan-cialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 25 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % peso/peso de una muestra de proteína. La pureza u homogeneidad de un polipéptido se indica por una serie de métodos bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la visualización de una única banda de un polipéptido después de la tinción del gel. Para ciertos fines, se puede alcanzar una mayor resolu-30 ción mediante el uso de HPLC u otros métodos bien conocidos en la técnica.
Además, como se usa en la presente memoria, el término "purificado" no re-quiere una pureza absoluta; en lugar de ello, se pretende como una definición relativa. Se contempla expresamente la purificación del material de partida o material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más pre-35 feriblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Alternativamente, la purificación se puede expresar como "al menos" un porcentaje de pureza relativa para los polinucleó-tidos (ADN, ARN o ambos) o los polipéptidos heterólogos. Como una realización prefe-rida, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención tienen una pureza de al menos; 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 5 99%, 99,5% o 100% con respecto a polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Como otra realización preferida, los polinucleótidos o polipéptidos tienen "al menos" una pu-reza que varía desde cualquier número hasta la posición número mil, entre 90% y 100% (por ejemplo, una pureza de menos 99,995%) con respecto a polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Además, la pureza de los polinucleótidos o polipéptidos 10 puede expresarse como un porcentaje (como se ha descrito anteriormente) con res-pecto a todos los materiales y compuestos distintos de la solución de vehículo. Cada número, hasta la posición de las milésimas, puede ser reivindicado como especie indi-vidual de pureza.
El término "aislado" requiere retirar el material de su entorno original (p.ej., del 15 entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que aparece en la naturaleza presente en un animal viviente no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de alguno o de todos los mate-riales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una com-20 posición, y aún así estar aislado porque el vector o composición no es parte de su en-torno natural.
Están específicamente excluidos de la definición de "aislado": los cromosomas presentes en la naturaleza (p.ej., cromosomas extendidos), las genotecas de cromo-somas artificiales, las genotecas genómicas, y las genotecas de cADN que existen o 25 como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de una célula hospedadora transfectada/transformada, en la que las células hospedadoras están o en una preparación heterogénea in vitro o extendidas en placas como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las bi-bliotecas anteriores en las que una EST 5' constituye menos de 5% (o como alterna-30 tiva, 1%, 2%, 3%, 4%, 10%, 25%, 50%, 75% o 90%, 95% o 99%) del número de in-sertos de ácido nucleico en las moléculas de vector. También están específicamente excluidos el ADN genómico de la célula completa o las preparaciones de ARN de la célula completa (incluyendo dichas preparaciones de la célula completa que están mecánicamente divididas o enzimáticamente digeridas). Se excluyen más específica-35 mente las preparaciones de células completas anteriores como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis (incluyendo las transferencias de las mismas) en las que el polinucleótido de la invención no se ha separado adicionalmente de los polinucleótidos heterólogos en el medio de electrofo-resis (p.ej., una separación adicional por escisión de una única banda a partir de una 5 población de bandas heterogéneas en un gel de agarosa o transferencia de nylon).
El término "cebador" indica una secuencia específica de oligonucleótidos que es complementaria a una secuencia diana de nucleótidos y que se usa para hibridarse con la secuencia de nucleótidos diana. Un cebador sirve como un punto de iniciación para la polimerización de los nucleótidos catalizada por la ADN-polimerasa, ARN-poli-10 merasa, o transcriptasa inversa.
El término "sonda" denota un segmento de ácido nucleico definido (o un seg-mento análogo de nucleótidos, p.ej., APN como se define en la presente memoria más adelante) que se puede usar para identificar una secuencia polinucleotídica específica presente en una muestra, comprendiendo dicho segmento de ácido nucleico una se-15 cuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de polinucleótidos específica que se va a identificar.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin tener en cuenta la longitud del polímero. Por lo tanto, dentro de la definición de polipéptido se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término tampoco especifica ni ex-20 cluye las modificaciones post-expresión de los polipéptidos. Por ejemplo, los polipépti-dos que incluyen la unión covalente de grupos glucosilo, grupos acetilo, grupos fos-fato, grupos lipídicos y similares, están expresamente englobados en el término polipéptido. También están incluidos dentro de la definición los polipéptidos que con-tienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos 25 que no están presentes en la naturaleza, aminoácidos que sólo se presentan en la naturaleza en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados proce-dentes de sistemas de mamíferos etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto presentes en la naturaleza como no presentes en la naturaleza. Como se usa en la presente memoria, el término 30 "OBG3" se refiere genéricamente al OBG3 murino o humano, a menos que se especi-fique otra cosa. Los términos "ACRP30" y "AdipoQ" se refieren específicamente a la forma murina de OBG3, y el término "APM1" se refiere específicamente a la forma humana del gen.
Sin limitarse por la teoría, los compuestos/polipéptidos de la invención son ca-35 paces de modular el reparto de lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféri-cos, y por lo tanto se cree que tratan "enfermedades que implican el reparto de lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos". El término "tejidos periféricos" in-cluye el tejido muscular y el tejido adiposo. En las realizaciones preferidas, los com-puestos/polipéptidos de la invención reparten los lípidos de la dieta hacia el músculo. 5 En realizaciones preferidas alternativas, los lípidos de la dieta se reparten hacia el te-jido adiposo. En otras realizaciones preferidas, los lípidos de la dieta se reparten hacia el hígado. En otras realizaciones adicionales preferidas, los compuestos/polipéptidos de la invención aumentan o reducen la oxidación de los lípidos de la dieta, preferible-mente de los ácidos grasos libres (FFA) por el músculo. Los lípidos de la dieta inclu-10 yen, pero sin limitación, triglicéridos y ácidos grasos libres.
Las enfermedades preferidas que se cree que implican el reparto de los lípidos de la dieta incluyen la obesidad y las enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como la obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la in-sulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apoplejía, 15 síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones re-nales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia 20 coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos relacionados con el metabolismo de la invención incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, perdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia, y bulimia. 25
El término "heterólogo", cuando se usa en la presente memoria, pretende de-signar cualquier polipéptido o polinucleótido distinto de un polipéptido OBG3 o OBG3 o de un polinucleótido que codifica un polipéptido gOBG3 de la presente invención.
Las expresiones "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencial-mente en" se definen de acuerdo con su significado convencional. El significado defi-30 nido expuesto en el M.P.E.P. controla el significado definido en la técnica y el signifi-cado definido expuesto en la ley de casos reguladora del Circuito Federal controla el significado expuesto en el M.P.E.P. Teniendo esto en consideración, las expresiones pueden sustituirse entre sí a lo largo de la presente solicitud para dar el significado específico asociado con cada término. 35
La expresión "célula hospedadora recombinante para" un polinucleótido parti-cular de la presente invención se refiere a una célula hospedadora que se ha alterado artificialmente para que contenga dicho polinucleótido de un modo que no se encuen-tra de forma natural en dicha célula. Por ejemplo, dicha célula puede transfectarse o transducirse de forma transitoria o estable con dicho polinucleótido de la invención. 5
El término "obesidad", tal como se usa en la presente memoria, se define en las clasificaciones de peso de la OMS (Kopelman (2000) Nature 404:635-643). Bajo peso es cuando el IMC es menor de 18,5 (delgado); saludable es con IMC de 18,5-24,9 (normal); sobrepeso grado 1 es con IMC de 25,0-29,9 (sobrepeso); sobrepeso grado 2 es con IMC de 30,0-39,0 (obesidad); sobrepeso grado 3 es con IMC mayor o 10 igual a 40,0 (obesidad mórbida). El IMC es el índice de masa corporal y se expresa en kg/m2. También se puede usar la circunferencia de la cintura para indicar el riesgo de complicaciones metabólicas, donde en los hombres una circunferencia mayor o igual a 94 cm indica un riesgo elevado, y mayor o igual a 102 cm indica un riesgo sustancial-mente elevado. De forma similar, para mujeres, una circunferencia de más de o igual a 15 88 cm indica un riesgo aumentado, y de más de o igual a 88 cm indica un riesgo sus-tancialmente aumentado. La circunferencia de la cintura se mide en cm en el punto medio entre el borde inferior de las costillas y el borde superior de la pelvis. Otras me-didas de la obesidad incluyen, pero sin limitación, el espesor de los pliegues cutáneos que es una medida en cm del espesor de los pliegues cutáneos usando calibres, y la 20 bioimpedancia, que se basa en el principio de que la masa sin grasa conduce mejor la corriente que la masa con grasa porque es principalmente una solución de electrolitos; la medida de la resistencia a una corriente débil (impedancia) aplicada entre las ex-tremidades proporciona una estimación de la grasa corporal usando una ecuación de-rivada empíricamente. 25
La expresión "ingesta de energía", tal como se usa en la presente memoria, se define como la energía introducida en un individuo de la ingesta calórica total, es decir, la energía total de la dieta de alimentos y líquidos.
La expresión "gasto de energía", tal como se usa en la presente memoria, se define como el gasto de energía total (TEE), que incluye el gasto de energía en reposo 30 (REE), el efecto térmico de la alimentación (TEF), y las actividades tales como el ejer-cicio. Tanto la "ingesta de energía" como el "gasto de energía" fueron definidos por Rosenbaum et al. [Am J Clin Nutr (2000) Jun; 71(6):1421-32).
La expresión "mantenimiento de la pérdida de peso", tal como se usa en la pre-sente memoria, se define como el mantenimiento de un peso estable en un individuo 35 que tiene un peso del 10-20% por debajo del peso inicial obeso del individuo. Preferi-blemente, el peso nuevo mantenido tras la pérdida de peso es un peso sano (tal como se define en la presente memoria). Cuando el mantenimiento de la pérdida de peso se lleva a cabo con fines cosméticos, el individuo tiene un IMC de al menos 20, y no más de 25. Tal como se define para el tratamiento de la obesidad por medio del manteni-5 miento de la pérdida de peso, el individuo puede tener un IMC de al menos 20.
El término "diabetes", tal como se usa en la presente memoria, pretende abar-car el diagnóstico habitual de diabetes realizado a partir de cualquiera de los métodos que se incluyen, pero sin limitación, en la siguiente lista: síntomas de diabetes (p.ej. poliuria, polidipsia, polifagia) más niveles de glucosa plasmática ocasionales mayores 10 o iguales a 200 mg/dl, en el que la glucosa plasmática ocasional se define en cualquier momento del día independientemente del momento del consumo de comida o bebida; niveles de glucosa plasmática en ayunas de 8 horas mayores o iguales a 126 mg/dl; y niveles de glucosa plasmática mayores o iguales a 200 mg/dl 2 horas tras la adminis-tración oral de 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua. 15
La expresión "tolerancia alterada a la glucosa (IGT)", tal como se usa en la pre-sente memoria, pretende indicar la afección asociada a la resistencia a la insulina que es intermedia entre la NIDDM manifiesta y la tolerancia normal a la glucosa (NGT). Se sabe que un porcentaje elevado de la población con IGT progresa hasta NIDDM res-pecto de las personas con una tolerancia normal a la glucosa (Sad et al., New Engl J 20 Med 1988; 319:1500-6). De esta manera, al proporcionar agentes terapéuticos y mé-todos para reducir o prevenir la IGT, es decir, para normalizar la resistencia a la insu-lina, puede retrasarse o prevenirse la progresión hasta NIDDM. La IGT se diagnostica por un procedimiento en el que se determina que la respuesta a la glucosa posprandial de una persona afectada es anómala según se evalúa por los niveles de glucosa 25 plasmática posprandiales de 2 horas. En este ensayo, se administra una cantidad me-dida de glucosa al paciente y se miden los niveles de glucosa sanguínea a intervalos regulares, normalmente cada media hora durante las dos primeras horas y cada hora posteriormente. En un individuo "normal" o sin IGT, los niveles de glucosa se elevan durante las dos primeras horas hasta un nivel menor de 140 mg/dl y después se redu-30 cen rápidamente. En un individuo con IGT, los niveles de glucosa sanguínea son ma-yores y el nivel de reducción tiene una menor velocidad.
La expresión "Síndrome de Resistencia a la Insulina", tal como se usa en la presente memoria, pretende abarcar el grupo de anormalidades que resultan de un intento de compensar la resistencia a la insulina que pone en marcha una serie de 35 sucesos que desempeñan un papel importante en el desarrollo de hipertensión y de arteriopatía coronaria (CAD), tal como la enfermedad vascular ateroesclerótica pre-matura. También se ha informado que están asociadas con la resistencia a la insulina las concentraciones plasmáticas elevadas de triglicéridos y las concentraciones plas-máticas reducidas de colesterol-HDL, afecciones que se sabe que están asociadas 5 con la CAD. De esta manera, al proporcionar agentes terapéuticos y métodos para reducir o prevenir la resistencia a la insulina, la invención proporciona métodos para reducir y/o prevenir la aparición del síndrome de resistencia a la insulina.
La expresión "resistencia a la insulina", tal como se usa en la presente memo-ria, pretende abarcar el diagnóstico habitual de la resistencia a la insulina realizado 10 mediante cualquiera de varios métodos, tal como el ensayo de tolerancia a la glucosa intravenosa o la medida del nivel de insulina en ayunas. Es bien conocido que hay una excelente correlación entre la altura del nivel de insulina en ayunas y el grado de re-sistencia a la insulina. Por lo tanto, se podrían usar los niveles elevados de insulina en ayunas como un marcador sustituto para la resistencia a la insulina con el fin de identi-15 ficar a los individuos con tolerancia a la glucosa normal (NGT) que tienen resistencia a la insulina. Otra manera de hacerlo es seguir la aproximación descrita en The New England Journal of Medicine, Nº 3, pág. 1188 (1995), es decir, seleccionar sujetos obesos como criterio inicial para la entrada en el grupo de tratamiento. Algunos sujetos obesos tienen alterada la tolerancia a la glucosa (IGT) mientras que otros tienen una 20 tolerancia a la glucosa normal (NGT). Como esencialmente todos los sujetos obesos son resistentes a la insulina, es decir, incluso los sujetos obesos NGT son resistentes a la insulina y tienen hiperinsulinemia en ayunas. Por lo tanto, el objetivo del trata-miento según la presente invención se puede definir como individuos NGT que son obesos o que tienen hiperinsulinemia en ayunas, o ambos. 25
El diagnóstico de la resistencia a la insulina se puede realizar también me-diante el uso del ensayo de pinza de glucosa euglucémica. Este ensayo implica la ad-ministración simultánea de una infusión constante de insulina y una infusión de veloci-dad variable de glucosa. Durante el ensayo, que dura 3-4 horas, la concentración plasmática de glucosa se mantiene constante a niveles euglucémicos midiendo el nivel 30 de glucosa cada 5-10 minutos y después ajustando la infusión de glucosa a velocidad variable para mantener el nivel plasmático de glucosa sin cambios. En estas circuns-tancias, la velocidad de entrada de glucosa en la corriente sanguínea es igual a la ve-locidad global de eliminación de glucosa en el cuerpo. La diferencia entre la velocidad de eliminación de glucosa en el estado basal (sin infusión de insulina) y el estado con 35 infusión de insulina representa la absorción de glucosa mediada por insulina. En indi-viduos normales, la insulina provoca un aumento brusco y prolongado en la elimina-ción global de glucosa en el cuerpo, mientras que en sujetos NIDDM, este efecto de la insulina está debilitado en gran medida y sólo es 20-30% del normal. En sujetos re-sistentes a la insulina con IGT o NGT, la velocidad de eliminación de glucosa estimu-5 lada por insulina está aproximadamente en la mitad del camino entre los sujetos nor-males y NIDDM. Por ejemplo, a una concentración plasmática de insulina en estado estacionario de aproximadamente 100 µU/ml (un nivel fisiológico), la velocidad de eli-minación de glucosa en sujetos normales es de aproximadamente 7 mg/kg/min. En sujetos NIDDM, es de aproximadamente 2,5 mg/kg/min., y en pacientes con IGT (o 10 sujetos resistentes a la insulina con NGT) es de aproximadamente 4-5 mg/kg/min. Éste es un ensayo preciso y muy reproducible, y puede distinguir entre pacientes dentro de estas categorías. También se sabe que a medida que los sujetos se van volviendo más resistentes a la insulina, se eleva el nivel de insulina en ayunas. Hay una exce-lente correlación positiva entre la altura del nivel de insulina en ayunas y la magnitud 15 de la resistencia a la insulina medida por los ensayos de pinza de la glucosa euglucé-mica y, por lo tanto, esto proporciona el fundamento para usar los niveles de insulina en ayunas como medida sustituta de la resistencia a la insulina.
La expresión "agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a un compuesto o polipéptido de la inven-20 ción que modula el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos perifé-ricos como se ha descrito previamente. Preferiblemente, el agente aumenta o reduce la oxidación de los lípidos de la dieta, preferiblemente los ácidos grasos libres (FFA) por el músculo. Preferiblemente, el agente disminuye o aumenta el peso corporal de los individuos, o se usa para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado 25 con la obesidad tal como obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apople-jía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las 30 lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones re-nales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos adicionales de la invención relacionados con la obe-35 sidad incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pér-dida de peso relacionada con el cáncer, anorexia, y bulimia.
La expresión "respuesta a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a la eficacia de un fár-maco, incluyendo, pero sin limitación, la capacidad de metabolizar un compuesto, la 5 capacidad de convertir un profármaco en un fármaco activo y la farmacocinética (ab-sorción, distribución, eliminación) y la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un individuo.
Los términos "efectos secundarios a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" se refieren a los efectos 10 adversos de la terapia que resultan de las extensiones de la principal acción farmaco-lógica del fármaco o a las reacciones adversas idiosincrásicas que resultan de una interacción del fármaco con factores únicos del hospedador. Los "efectos secundarios a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" pueden incluir, pero sin limitación, reacciones adversas tales como 15 toxicidades dermatológicas, hematológicas o hepatológicas e incluyen además úlceras gástricas e intestinales, trastornos de la función plaquetaria, lesiones renales, nefritis, rinitis vasomotora con profusas secreciones acuosas, edema angioneurótico, urticaria generalizada, y asma bronquial a edema laríngeo y broncoconstricción, hipotensión, y shock. 20
El término "enfermedades y trastornos relacionados con OBG3" como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que comprende un funcionamiento anormal de OBG3, o que podría ser tratado o prevenido modulando los niveles o la actividad de OBG3. El "funcionamiento anormal de OBG3" incluye, pero sin limitación, niveles de expresión de OBG3 anormales (ya sea aumentados o 25 reducidos, pero preferiblemente reducidos), actividad anormal de OBG3 (ya sea au-mentada o reducida), e interacciones anormales con ligandos o compañeros de unión (ya sean aumentadas o reducidas). Por "anormal" se entiende un cambio del tipo, o nivel de actividad visto en las células, tejidos, o pacientes normales, o visto previa-mente en la célula, tejido, o paciente antes de la aparición de la enfermedad. En las 30 realizaciones preferidas, estas enfermedades y trastornos relacionados con OBG3 incluyen la obesidad y las enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad descritos previamente.
La expresión "tratamientos cosméticos" pretende incluir los tratamientos con los compuestos o los polipéptidos de la invención que aumentan o reducen la masa corpo-35 ral de un individuo cuando el individuo no está clínicamente obeso ni clínicamente del-gado. Así, estos individuos tienen un índice de masa corporal (IMC) por debajo del umbral de la obesidad clínica (p.ej., por debajo de 25 kg/m2) y por encima del umbral de la delgadez clínica (p.ej., por encima de 18,5 kg/m2). Además, estos individuos es-tán preferiblemente sanos (p.ej., no tienen una enfermedad o trastorno de la invención 5 relacionados con la obesidad). Los "tratamientos cosméticos" se entiende también que engloban, en algunas circunstancias, aumentos más localizados del tejido adiposo, por ejemplo, ganancias o pérdidas específicamente alrededor de la cintura o de las cade-ras, o alrededor de las caderas y de los muslos, por ejemplo. Estas ganancias o pérdi-das localizadas de tejido adiposo se pueden identificar por aumentos o reducciones en 10 el tamaño de la cintura o de las caderas, por ejemplo.
El término "prevenir" como se usa en la presente memoria, se refiere a admi-nistrar un compuesto antes de la aparición de los síntomas clínicos de una enferme-dad o afección de modo que se previene una manifestación física de aberraciones asociadas con la obesidad o OBG3. De manera alternativa, el término "prevenir" se 15 puede usar también para indicar la reducción, o la gravedad, de los síntomas clínicos asociados a una enfermedad o afección.
El término "tratar", como se usa en la presente memoria, se refiere a adminis-trar un compuesto después de la aparición de los síntomas clínicos.
La expresión "que necesita tratamiento", como se usa en la presente memoria, 20 se refiere a la opinión del cuidador (p.ej., médico, enfermera, practicante, etc. en el caso de los seres humanos; y veterinario en el caso de animales, incluyendo mamífe-ros no humanos) de que un individuo o animal necesita o se beneficiará del trata-miento. Esta opinión se realiza basándose en una diversidad de factores que están en el campo de la experiencia del cuidador, pero que incluyen el conocimiento de que el 25 individuo o animal está enfermo, o estará enfermo, como resultado de una afección que se puede tratar mediante los compuestos de la invención.
La expresión "percibe la necesidad de un tratamiento" se refiere a la determi-nación subclínica de que un individuo desea reducir el peso por razones cosméticas como se ha descrito anteriormente en la sección de "tratamiento cosmético". El tér-30 mino "percibe una necesidad de tratamiento" en otras realizaciones se puede referir a la decisión que el dueño de un animal toma sobre el tratamiento cosmético del animal.
El término "individuo" o "paciente", como se usa en la presente memoria, se re-fiere a cualquier animal, incluyendo mamíferos, preferiblemente ratones, ratas, otros roedores, conejos, perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, caballos o primates, y más 35 preferiblemente seres humanos. El término puede hacer referencia a machos o hem-bras, o a ambos sexos, o excluir machos o hembras.
La expresión "animal no humano" se refiere a cualquier vertebrado no humano, incluyendo aves y más habitualmente mamíferos, preferiblemente primates, animales tales como cerdos, cabras, ovejas, burros, caballos, gatos, perros, conejos o roedores, 5 más preferiblemente ratas o ratones. Los términos tanto "animal" como "mamífero" incluyen expresamente los sujetos humanos a menos que vayan acompañados por el término "no humano".
En esta invención se ha encontrado que un fragmento de OBG3, llamado gOBG3, es capaz de reducir de forma significativa la respuesta postprandial de los 10 ácidos grasos libres, glucosa, y triglicéridos del plasma, en ratones alimentados con una comida de alto contenido en grasas/sacarosa. No hubo ningún efecto significativo sobre los niveles de leptina, insulina o glucagón. Además, se encontró que el gOBG3 aumenta la oxidación de los ácidos grasos libres del músculo in vitro y ex vivo. Ade-más, se demostró que el gOBG3 reduce y después previene un aumento en la ganan-15 cia de peso en ratones que hayan sido alimentados con una dieta de alto contenido en grasas/sacarosa durante 19 días. En ratones que habían sido mantenidos con la misma dieta de alto contenido en grasas/sacarosa durante 6 meses, el tratamiento con gOBG3 dio como resultado una pérdida de peso sostenida a lo largo de 16 días que fue significativa, a pesar de ser mantenidos con la dieta de alto contenido en gra-20 sas/sacarosa.
La presente invención abarca el uso de fragmentos del polipéptido OBG3 en el reparto de los ácidos grasos libres (FFA) y como una importante herramienta nueva para controlar la homeostasis de la energía. De los tejidos que pueden de forma signi-ficativa eliminar los lípidos de la circulación y causar la oxidación de los FFA, el mús-25 culo es cuantitativamente el más importante. El OBG3 globular es una nueva y única herramienta farmacológica que controla el peso corporal sin interferir con la ingesta de alimentos.
REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN 30
I. Fragmentos del Polipéptido OBG3 de la Invención
Se han identificado fragmentos del polipéptido OBG3 que tienen actividad me-dible in vitro e in vivo. Estas actividades incluyen, pero sin limitación, la reducción de la respuesta postprandial de ácidos grasos libres, glucosa, y triglicéridos del plasma, en ratones alimentados con una comida de alto contenido en grasas/sacarosa (Ejemplo 35 8), aumento de la oxidación de los ácidos grasos libres en el músculo in vitro y ex vivo (Ejemplo 12), y pérdida de peso sostenida en los ratones sometidos a una dieta de alto contenido en grasas/sacarosa (Ejemplo 14). Se proporcionan también otros ensayos de la actividad del fragmento del polipéptido OBG3 in vitro e in vivo (Ejemplos 4, 7, 9, 11, 13, por ejemplo), y pueden ser diseñados ensayos equivalentes por los expertos 5 en la técnica.
En contraste, el polipéptido OBG3 "intacto" o "de longitud completa" no tiene ni in vivo ni in vitro las actividades que han sido identificadas para los fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención. En la mayoría de los casos, las actividades o no están presentes o como mínimo son indetectables sobre los valores de control en los 10 ensayos usados. En otros casos, las actividades se pueden medir, pero están pre-sentes o en niveles extremadamente reducidos y/o requieren significativamente más proteína en una base molar en comparación con los fragmentos del polipéptido gOBG3 (véase, p.ej., el Ejemplo 10). Mediante el polipéptido OBG3 "intacto" o "de lon-gitud completa" como se usa en la presente invención, se indica la secuencia polipep-15 tídica de longitud completa de cualquier polipéptido OBG3, desde la metionina N-ter-minal hasta el codón de terminación C-terminal. Los ejemplos de polipéptidos OBG3 intactos o de tamaño completo se hallan en SEQ ID NO:2 (humano) y SEQ ID NO:4 (ratón). La expresión "fragmentos del polipéptido OBG3", tal como se usa en la pre-sente memoria, se refiere a los fragmentos del polipéptido OBG3 "intacto" o "de longi-20 tud completa" que tienen una "actividad relacionada con la obesidad" o una "actividad similar a la insulina". El término "fragmentos del polipéptido gOBG3" se refiere a los fragmentos de polipéptido compuestos por el dominio globular solamente, y es por tanto un término más limitado que "fragmentos del polipéptido OBG3". El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene una secuencia que es enteramente la 25 misma como parte, pero no el todo, de un polipéptido OBG3 intacto o de longitud com-pleta. Tales fragmentos pueden ser "independientes" (es decir, no son parte o no es-tán fusionados a otros polipéptidos), o uno o más fragmentos pueden estar presentes en un único polipéptido. Los fragmentos de gOBG3 son fragmentos contiguos del poli-péptido OBG3 de longitud completa a menos que se especifique de otra manera. 30
El término "actividad relacionada con la obesidad" como se usa en la presente memoria, se refiere al menos a una, y preferiblemente a todas, las actividades descri-tas en la presente memoria para los fragmentos del polipéptido OBG3. Se proporcio-nan ensayos para la determinación de estas actividades en la presente memoria (p.ej. los Ejemplos 4, 7-9, 11-14), y los expertos en la técnica pueden diseñar ensayos equi-35 valentes. Opcionalmente, la "actividad relacionada con la obesidad" se puede selec-cionar del grupo que consiste en reparto de lípidos, metabolismo de lípidos, y actividad tipo insulina, o una actividad dentro de una de estas categorías. Por actividad de "re-parto de lípidos" se entiende la capacidad de localizar los lípidos de la dieta entre los grupos de tejidos principales incluyendo el tejido adiposo, el hígado y el músculo. Los 5 inventores han demostrado que los fragmentos del polipéptido OBG3 de la invención desempeñan un papel en el reparto de los lípidos hacia el músculo, el hígado o el te-jido adiposo. Por actividad de "metabolismo de los lípidos" se entiende la capacidad de influir en el metabolismo de los lípidos. Los inventores han demostrado que los frag-mentos del polipéptido OBG3 de la invención tienen la capacidad de afectar al nivel de 10 los ácidos grasos libres en el plasma así como de aumentar el metabolismo de los lípidos en el músculo a través de experimentos de oxidación de los ácidos grasos li-bres (Ejemplos 4, 8, 10, 11, 12) y afectar de modo transitorio a los niveles de triglicéri-dos en el plasma y en el músculo (Ejemplos 8, 10, 13). Por actividad "tipo insulina" se entiende la capacidad de los fragmentos del polipéptido OBG3 para modular los nive-15 les de glucosa en el plasma. Los inventores han descubierto que los fragmentos del polipéptido OBG3 no tienen un impacto significativo en los niveles de insulina, pero sí tienen impacto en los niveles de glucosa de manera similar a los efectos de la insulina (Ejemplos 9 y 10). Estos efectos no se observan en presencia de multímeros de homotrímeros de fragmentos del polipéptido gOBG3, o son significativamente mayores 20 en presencia de trímeros de fragmentos del polipéptido gOBG3 no multiméricos en comparación con los multímeros de homotrímeros de fragmentos del polipéptido gOBG3.
La expresión "significativamente mayor", tal como se usa en la presente memo-ria, se refiere a una comparación de la actividad de un homotrímero de fragmentos del 25 polipéptido gOBG3 no multimérico en un ensayo relacionado con la obesidad en com-paración con la actividad de los multímeros de homotrímeros de fragmentos del poli-péptido gOBG3 en el mismo ensayo. Por "significativamente" como se usa en la pre-sente memoria, se entiende estadísticamente significativo como es típicamente determinado por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los datos se calculan típica-30 mente como una media ± SEM, y un valor de p < 0,05 se considera estadísticamente significativo. El análisis estadístico típicamente se realiza usando el ensayo t de Student para datos no pareados o el ensayo t de Student para datos pareados, según sea apropiado en cada estudio. Los ejemplos de un cambio significativo en la actividad como resultado de la presencia de un fragmento del polipéptido OBG3 de la invención 35 en comparación con la presencia de un polipéptido OBG3 de longitud completa inclu-yen un aumento o una reducción en un parámetro dado de al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, o 75%. Uno o más, pero no necesariamente todos, los parámetros medibles cambiarán de forma significativa en presencia de los fragmentos del polipéptido OBG3 en comparación con 5 la presencia de un polipéptido OBG3 intacto.
Se proporcionan "ensayos relacionados con la obesidad" representativos en los Ejemplos 4, 7-9, y 11-14. Estos ensayos incluyen, pero sin limitación, métodos para medir la respuesta postprandial, métodos para medir la oxidación de los ácidos grasos libres, y métodos para medir la modulación del peso. En las realizaciones preferidas, 10 se mide la respuesta post-prandial en animales no humanos, preferiblemente ratones. En las realizaciones preferidas se miden los cambios en los lípidos de la dieta, preferi-blemente los ácidos grasos libres y/o los triglicéridos. En otras realizaciones, se miden otros parámetros fisiológicos incluyendo, pero sin limitación, los niveles de glucosa, insulina, y leptina. En otras realizaciones preferidas, se mide la oxidación de los ácidos 15 grasos libres en células in vitro o ex vivo, preferiblemente en tejido o células muscula-res de animales no humanos, preferiblemente ratones. También en otras realizaciones preferidas se mide la modulación del peso en seres humanos o en animales no huma-nos, preferiblemente roedores (ratas o ratones), primates, caninos, felinos o porcinos, sometidos a una dieta de alto contenido en grasas/sacarosa. Opcionalmente, la "acti-20 vidad relacionada con la obesidad" incluye otras actividades no específicamente iden-tificadas en la presente memoria. En general, los "parámetros medibles" en relación con la obesidad y el campo de la investigación metabólica se pueden seleccionar del grupo que consiste en niveles de ácidos grasos libres, oxidación de ácidos grasos li-bres, niveles de triglicéridos, niveles de glucosa, niveles de insulina, niveles de leptina, 25 ingesta de alimentos, peso, unión de leptina y lipoproteínas, absorción y degradación y expresión de receptor estimulado por la lipolisis (LSR).
En estos ensayos relacionados con la obesidad, los fragmentos del polipéptido OBG3 preferidos de la invención, pero no los polipéptidos OBG3 de longitud completa, provocarían un cambio significativo en al menos uno de los parámetros medibles se-30 leccionados del grupo que consiste en lipemia post-prandial, niveles de ácidos grasos libres, niveles de triglicéridos, niveles de glucosa, oxidación de ácidos grasos libres, y peso. Alternativamente, los fragmentos del polipéptido OBG3 preferidos de la inven-ción, pero no los polipéptidos OBG3 de longitud completa, tendrían un cambio signifi-cativo en al menos uno de los parámetros medibles seleccionados del grupo que con-35 siste en un aumento en la actividad LSR, un aumento en la actividad de la leptina y un aumento en la actividad de la lipoproteína. Por actividad de "LSR" se entiende la ex-presión de LSR sobre la superficie de la célula, o en una conformación particular, así como su capacidad para unir, absorber, y degradar la leptina y la lipoproteína. Por ac-tividad de "leptina" se entiende su unión, absorción y degradación por LSR, así como 5 su transporte a través de la barrera hematoencefálica, y potencialmente estas inciden-cias cuando LSR no es necesariamente el factor mediador o el único factor mediador. Similarmente, por actividad de "lipoproteína" se entiende su unión, absorción y degra-dación por LSR, así como estas incidencias cuando LSR no es necesariamente el factor mediador o el único factor mediador. 10
La invención se refiere, entre otros, a fragmentos del polipéptido OBG3 aisla-dos, purificados o recombinantes. Los fragmentos del polipéptido OBG3 de la inven-ción son útiles para reducir o aumentar (mediante el uso de antagonistas de los poli-péptidos OBG3) el peso corporal como tratamiento cosmético o para el tratamiento o la prevención de las enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad. Los 15 fragmentos del polipéptido OBG3 son también útiles, entre otros, en ensayos de cri-bado en busca de agonistas o antagonistas de la actividad de los fragmentos de OBG3; para generar anticuerpos específicos para los fragmentos del polipéptido OBG3; y en ensayos de diagnóstico. Cuando se usan para tratamientos cosméticos, o para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos o afecciones relacio-20 nados con la obesidad, se pueden proporcionar uno o más fragmentos del polipéptido OBG3 a un sujeto. Así, se pueden combinar diversos fragmentos de la proteína de longitud completa en un "cóctel" para el uso en los diversos regímenes de tratamiento.
El polipéptido OBG3 de longitud completa está constituido por al menos cuatro regiones distintas que incluyen: 25
1. una secuencia señal supuesta en posición N-terminal aproximadamente en los aminoácidos 1-17 de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4;
2. una región única dispuesta en posición N-terminal aproximadamente en los aminoácidos 18-41 de SEQ ID NO:2 o 18-44 de SEQ ID NO:4;
3. una región similar a colágeno aproximadamente en los aminoácidos 42-107 de 30 SEQ ID NO:2 o 45-110 de SEQ ID NO:4; y
4. un dominio globular aproximadamente en los aminoácidos 108-244 de SEQ ID NO:2 o 111-247 de SEQ ID NO:4.
El término "restos de colágeno" se usa de la manera estándar en la técnica para indicar el triplete de aminoácidos glicina, X, Y, donde X e Y pueden ser cualquier 35 aminoácido.
Los fragmentos del polipéptido OBG3 de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y pueden estar parcialmente o sustancialmente purificados. Una versión producida de manera recombinante de un fragmento del poli-péptido OBG3 se puede purificar sustancialmente mediante el método en una etapa 5 descrito por Smith et al. ((1988) Gene 67(1):31-40) o mediante los métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica (véanse, p.ej., los Ejemplos 1-3). Los fragmentos de la invención también pueden purificarse a partir de fuentes natura-les o recombinantes mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra los fragmentos de los polipéptidos de la invención mediante métodos conocidos en la técnica de la purifi-10 cación de proteínas.
También se contemplan específicamente las preparaciones de fragmentos del polipéptido OBG3 de la invención que implican una purificación parcial o la selección de los fragmentos del polipéptido OBG3. Estas preparaciones crudas se prevé que sean el resultado de la concentración de células que expresan fragmentos del polipép-15 tido OBG3 con quizás algunas etapas de purificación adicionales, pero antes de com-pletar la purificación del fragmento. Las células que expresan fragmentos del polipép-tido OBG3 están presentes en un sedimento, se lisan, o el polipéptido crudo se liofiliza, por ejemplo.
Los fragmentos del polipéptido gOGB3 de la invención, y los polinucleótidos 20 que codifican los mismos, que tienen una actividad inesperada se seleccionan de los aminoácidos numerados en 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, de SEQ ID NO:2 en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido sustituto. 25
Estas realizaciones específicas, y otras realizaciones de fragmentos de poli-péptidos y polinucleótidos descritas en la presente memoria, se pueden modificar para que sean "al menos", "iguales a", "iguales a o menores de", "menores de", "al menos ____ pero no mayores de ____" o "de _____ a _____" un tamaño especificado o posi-ciones N-terminales y/o C-terminales especificadas. Debe indicarse que todos los in-30 tervalos usados para describir cualquier realización de la presente invención son inclu-sivos a menos que se indique específicamente otra cosa.
La presente invención también proporciona la exclusión de cualquier fragmento individual especificado por las posiciones N-terminal y C-terminal o de cualquier frag-mento especificado por tamaño en restos aminoacídicos como se ha descrito ante-35 riormente. Además, puede excluirse como especie individual cualquier número de fragmentos especificados por las posiciones N-terminal y C-terminal o por tamaño en restos aminoacídicos como se ha descrito anteriormente. Además, cualquier número de fragmentos especificados por las posiciones N-terminal y C-terminal o por tamaño en restos de aminoácidos como se ha descrito anteriormente pueden constituir un 5 fragmento polipeptídico en cualquier combinación y también pueden incluir opcional-mente secuencias polipeptídicas que no son de OBG3.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 descritos en la presente memoria inclu-yen las variantes, fragmentos, análogos y derivados de los fragmentos del polipéptido gOBG3 descritos anteriormente, que incluyen los fragmentos del polipéptido gOBG3 10 modificados.
También se describen fragmentos del polipéptido OBG3 escindidos de manera proteolítica de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. También se describe un fragmento del polipéptido OBG3 de los aminoácidos 85-244 de SEQ ID NO:2 producido mediante la escisión con colagenasa del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2. También se describe 15 un fragmento del polipéptido OBG3 de los aminoácidos 88-247 de SEQ ID NO:4 pro-ducido mediante la escisión con colagenasa del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:4. También se describe un fragmento del polipéptido OBG3 de los aminoácidos 85-244 del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2 producido mediante la escisión con metalopro-teinasa-1 de la matriz (MMP-1) de SEQ ID NO:2. También se describe un fragmento 20 del polipéptido OBG3 de los aminoácidos 88-247 de SEQ ID NO:4 producido mediante la escisión con metaloproteinasa-1 de la matriz (MMP-1) del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:4. Se prefiere particularmente el fragmento del polipéptido OBG3 de los ami-noácidos 34-244 de SEQ ID NO:2 en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína, preferiblemente serina, producido mediante la 25 escisión con plasmina del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2 en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido distinto de cisteína, preferiblemente serina. Además, se prefiere particularmente un fragmento del polipéptido OBG3 de los aminoácidos 34-244 de SEQ ID NO:2 producido mediante la escisión con plasmina del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2. Se prefiere particularmente el fragmento del poli-30 péptido OBG3 de los aminoácidos 34-244 de SEQ ID NO:2 en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína, preferiblemente serina, producido mediante la escisión con tripsina del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2 en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye por dicho aminoácido distinto de cis-teína, preferiblemente serina. Además, se prefiere particularmente un fragmento del 35 polipéptido OBG3 de los aminoácidos 34-244 de SEQ ID NO:2 producido mediante la escisión con tripsina del polipéptido OBG3 de SEQ ID NO:2.
Variantes
Un especialista habitual en la técnica reconocerá que algunos aminoácidos de las secuencias de los fragmentos de gOBG3 de la presente invención pueden variar 5 sin un efecto significativo en la estructura o la función de la proteína; pero habrá ami-noácidos críticos en la secuencia del fragmento que determinan la actividad. Así, la invención incluye además las variantes de los fragmentos del polipéptido gOBG3 que tienen una actividad relacionada con la obesidad tal como se describió anteriormente. Estas variantes incluyen secuencias del fragmento de OBG3 con una o más delecio-10 nes, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de aminoácidos por muta-ciones naturales o por manipulación humana, seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica de manera que tengan poco efecto sobre la activi-dad. Más adelante se proporcionan pautas en relación a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas. 15
Existen dos aproximaciones principales para estudiar la tolerancia de una se-cuencia de aminoácidos al cambio (véase, Bowie, et al. (1990) Science, 247,1306-10). El primer método se basa en el proceso de evolución, en el que se aceptan o se re-chazan mutaciones por selección natural. El segundo método usa la ingeniería gené-tica para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clo-20 nado y selecciones o cribados para identificar las secuencias que mantienen la funcionalidad.
Estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tole-rantes a las sustituciones de aminoácidos e indican qué cambios de aminoácidos son probablemente permisivos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, la mayo-25 ría de los aminoácidos enterrados requieren cadenas laterales apolares, mientras que generalmente se conservan algunas características de cadenas laterales en la superfi-cie. Otras sustituciones fenotípicamente silenciosas están descritas por Bowie et al. (anteriormente mencionado) y en las referencias citadas en ese documento.
Se ven típicamente como sustituciones conservadoras los reemplazamientos, 30 uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Phe; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr; el cambio de los restos ácidos Asp y Glu; la sustitución entre los restos amida Asn y Gln; el cambio de los restos básicos Lys y Arg; y los reempla-zamientos entre los restos aromáticos Phe, Tyr. Además, los siguientes grupos de aminoácidos generalmente representan cambios equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, 35 Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr, (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
De manera similar, los aminoácidos de las secuencias de los fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención que son esenciales para la función se pueden identificar también mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como la muta-5 génesis dirigida o la mutagénesis mediante barrido de alaninas (véase, p.ej., Cunningham, et al. (1989) Science 244(4908):1081-5). El último procedimiento intro-duce mutaciones simples de alanina en cada resto de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se ensayan entonces en cuanto a la actividad relacionada con la obesidad usando los ensayos que se han descrito antes. Son de un interés especial 10 las sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados o neutros que pueden producir proteínas con características mejoradas muy deseables, tales como menor agregación. La agregación no sólo puede reducir la actividad, sino que también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéutica-mente o fisiológicamente aceptables, porque los agregados pueden ser inmunogéni-15 cos (véase, p.ej., Pinckard, et al., (1967) Clin. Exp. Immunol 2:331-340; Robbins, et al., (1987) Diabetes Jul;36(7):838-41; y Cleland, et al., (1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77).
De esta manera, el fragmento, derivado, análogo u homólogo del fragmento de gOBG3 de la presente invención puede ser, por ejemplo: (i) uno en el que uno o más 20 de los restos aminoacídicos se han sustituido por un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente un resto aminoacídico conservado) y dicho resto ami-noacídico sustituido puede estar codificado o no por el código genético (es decir, puede ser un aminoácido natural o no); o (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente; o (iii) uno en el que el fragmento de 25 gOBG3 se ha fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del fragmento (por ejemplo, polietilenglicol); o (iv) uno en el que los ami-noácidos adicionales se han fusionado a la forma anterior del fragmento, tal como un péptido de región de fusión Fc de IgG o una secuencia líder o secretora, o una se-cuencia que se emplea para la purificación de la forma anterior del fragmento o una 30 secuencia de pro-proteína. Estos fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de la presente memoria.
Otra realización de la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento del polipéptido gOBG3 que tiene una se-35 cuencia de aminoácidos que contiene al menos una sustitución de aminoácidos con-servativa, pero no más de 50 sustituciones de aminoácidos conservativas, no más de 40 sustituciones de aminoácidos conservativas, no más de 30 sustituciones de ami-noácidos conservativas y no más de 20 sustituciones de aminoácidos conservativas. También se proporcionan polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos 5 de un fragmento de gOBG3, que tiene al menos una, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos conservativas.
Otra realización específica de un fragmento de gOBG3 modificado de la inven-ción es un polipéptido que es resistente a la proteolisis, por ejemplo un fragmento de gOBG3 en el que un enlace peptídico -CONH- está modificado y reemplazado por uno 10 o más de los siguientes: un enlace (CH2NH) reducido; un enlace (NHCO) retroinverso; un enlace metilen-oxi (CH2-O); un enlace tiometileno (CH2-S); un enlace carba (CH2CH2); un enlace cetometileno (CO-CH2); un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2)); un enlace (N-N); un enlace E-alceno; o un enlace -CH=CH-. De esta manera, la inven-ción también incluye un fragmento de gOBG3 o una variante del mismo en la que al 15 menos se ha modificado un enlace peptídico como se ha descrito anteriormente.
Además, los aminoácidos tienen dentro del cuerpo quiralidad L o D. En algunas realizaciones, es preferible alterar la quiralidad de los aminoácidos en los fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención para prolongar la vida media dentro del cuerpo. De esta manera, en algunas realizaciones, uno o más de los aminoácidos están prefe-20 riblemente en la configuración L. En otras realizaciones, uno o más de los aminoácidos están preferiblemente en la configuración D.
Producción
Nótese, a través de la descripción, que siempre que se trata de fragmentos del polipéptido OBG3, se pretende específicamente que estén incluidos los fragmentos de 25 gOBG3 como un subconjunto preferido de fragmentos del polipéptido OBG3.
Los fragmentos del polipéptido OBG3 se aíslan preferiblemente de muestras de tejidos humanos o de mamíferos o son expresados a partir de genes humanos o de mamíferos en células de seres humanos o de mamíferos. Los fragmentos del polipép-tido OBG3 de la invención se pueden producir mediante el uso de métodos de expre-30 sión rutinarios conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica los fragmentos de polipéptido deseados está ligado a un vector de expresión adecuado para cualquier hospedador conveniente. Ambos sistemas hospedadores, eucariótico y procariótico, se usan para formar fragmentos de polipéptido recombinantes. El fragmento de poli-péptido se aísla después de las células lisadas o del medio de cultivo y se purifica 35 hasta donde sea necesario para el uso que se pretende. La purificación se realiza por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial, fraccio-namiento de sales, cromatografía, centrifugación, y similares. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology para una variedad de métodos para purificar las proteínas. Véanse también los Ejemplos 1-3 para los métodos usados previamente para los 5 fragmentos del polipéptido OBG3.
En una realización alternativa, los polipéptidos de la invención se aíslan de la leche. Los polipéptidos se pueden purificar como polipéptidos OBG3 de longitud com-pleta, que pueden ser escindidos entonces, si es apropiado, in vitro para generar un fragmento de OBG3, o, alternativamente, los propios fragmentos de OBG3 pueden ser 10 purificados a partir de la leche. Se puede usar cualquiera de una serie de métodos para purificar los presentes polipéptidos de la leche, incluyendo los descritos en Protein Purification Applications, A Practical Approach (New Edition), editado por Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, Harwell; Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Wilkins y Velander (1992) 49:333-15 8; patentes de EE.UU. Nºs 6.140.552; 6.025.540; Hennighausen, Protein Expression and Purification, vol. 1, pp.3-8 (1990); Harris et al. (1997) Bioseparation 7:31-7; Degener et al. (1998) J Chromatog 799:125-37; Wilkins (1993) J Cell Biochem Supl. 0 (17 parte A):39. En una típica realización, se centrifuga la leche, por ejemplo, a una velocidad relativamente baja para separar la fracción lipídica, y se centrifuga entonces 20 el sobrenadante acuoso a una alta velocidad para separar la caseína de la leche de la restante fracción "suero". A menudo, se encuentran proteínas biomédicas en esta fracción de suero, y se pueden aislar de esta fracción usando procedimientos croma-tográficos estándar u otros procedimientos comúnmente usados para purificación de las proteínas, por ejemplo como se describe en otro sitio de la presente solicitud. En 25 una realización preferida, los polipéptidos OBG3 se purifican mediante el uso de anti-cuerpos específicos para los polipéptidos OBG3, p.ej. mediante el uso de cromatogra-fía de afinidad. Además, se pueden usar métodos para aislar fragmentos particulares de OBG3, por ejemplo métodos electroforéticos u otros para aislar proteínas de un tamaño particular. Los polipéptidos OBG3 aislados mediante el uso de estos métodos 30 pueden estar presentes en la naturaleza, ya que se ha descubierto que los polipépti-dos OBG3 están naturalmente presentes en la leche de los mamíferos (véase, p.ej., el Ejemplo 17), o pueden ser el resultado de la producción recombinante de la proteína en las glándulas mamarias de un mamífero no humano, como se describe más ade-lante. En una realización, el fragmento de OBG3 se produce en forma de una proteína 35 de fusión con una secuencia polipeptídica heteróloga y antigénica, cuya secuencia antigénica se puede usar para purificar la proteína, p.ej., mediante el uso de la meto-dología de inmuno-afinidad habitual.
Además se pueden producir fragmentos de proteína más cortos por síntesis química. De manera alternativa, las proteínas de la invención se extraen de células o 5 tejidos de seres humanos o animales no humanos. Los métodos para purificar las proteínas son conocidos en la técnica, e incluyen el uso de detergentes o agentes caotrópicos para romper las partículas seguido por extracción diferencial y separación de los polipéptidos por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación según la densidad, y electroforesis en gel. 10
El cADN de cualquier fragmento de OBG3, incluyendo el de la Fig. 4, se puede usar para expresar los fragmentos del polipéptido OBG3. El ácido nucleico que codi-fica el fragmento de OBG3 a ser expresado está operativamente ligado a un promotor en un vector de expresión usando la tecnología convencional de clonación. El cADN del fragmento de OBG3 inserto en el vector de expresión puede comprender la se-15 cuencia codificadora para: el polipéptido OBG3 de longitud completa (para ser modifi-cado más tarde); de 6 aminoácidos a 1 aminoácido menos que el polipéptido OBG3 de longitud completa; un fragmento gOBG3; o variantes y % de polipéptidos similares.
El vector de expresión es cualquiera de los sistemas de expresión en mamífe-ros, levaduras, insectos o bacterias conocidos en la técnica, algunos de los cuales se 20 describen en la presente memoria, y ejemplos de los cuales se dan en los Ejemplos (Ejemplos 1-3). Los vectores y sistemas de expresión comercialmente disponibles se pueden conseguir de una variedad de proveedores incluyendo Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), e Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para aumentar la expresión y facilitar el 25 plegamiento apropiado de las proteínas, el contexto de los codones y el empareja-miento de los codones de la secuencia se puede optimizar para el organismo particular de expresión en el cual se introduce el vector de expresión, como se explica en Hatfield, et al., Patente de EE.UU. número 5.082.767.
Si el ácido nucleico que codifica los fragmentos del polipéptido OBG3 carece 30 de una metionina que sirva como sitio de iniciación, se puede introducir una metionina de iniciación próxima al primer codón del ácido nucleico usando técnicas convencio-nales. De forma similar, si el inserto de cADN del fragmento del polipéptido OBG3 ca-rece de una señal de poli A, puede añadirse esta secuencia a la construcción, por ejemplo, mediante corte y empalme de la señal de poli A de pSG5 (Stratagene) me-35 diante el uso de las enzimas endonucleasas de restricción BgII y SaIl, e incorporán-dola al vector de expresión de mamífero pXT1 (Stratagene). pXT1 contiene los LTR y una porción del gen gag de virus de leucemia de múrido Moloney. La posición de los LTR en la construcción permite una transfección estable eficaz. El vector incluye el promotor timidina-cinasa de herpes simplex y el gen de neomicina seleccionable. 5
El ácido nucleico que codifica un fragmento de OBG3 se puede obtener me-diante PCR a partir de un vector que contiene la secuencia de nucleótidos de OBG3 usando cebadores oligonucleotídicos complementarios del cADN del OBG3 deseado y que contiene las secuencias de endonucleasas de restricción para Pst I incorporadas en el cebador de 5' y para BgIII en el extremo 5' del cebador correspondiente de 3' del 10 cADN, teniendo cuidado de asegurar que la secuencia que codifica el fragmento de OBG3 está posicionada de manera apropiada con respecto a la señal de poli A. El fragmento purificado obtenido a partir de la reacción de PCR resultante se digiere con PstI, se termina de forma roma con una exonucleasa, se digiere con Bgl II, se purifica y se liga a pXT1, que contiene ahora una señal de poli A y se digiere con BglII. Méto-15 dos alternativos se presentan en los Ejemplos 1-3.
La transfección de un vector que expresa un fragmento de OBG3 en las células NIH 3T3 de ratón es una realización para introducir los polinucleótidos en las células hospedadoras. La introducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido en una célula hospedadora se puede realizar por transfección con fosfato cálcico, transfección 20 mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electropora-ción, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio habituales, tales como Davis et al. ((1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., Amsterdam). Se contempla específicamente que, de hecho, los polipéptidos de la presente invención se pueden 25 expresar por una célula hospedadora que carezca de un vector recombinante. Los métodos para expresar el fragmento de OBG3 de la invención en células se describen en los Ejemplos 1-3.
Un polipéptido de esta invención (es decir, un fragmento de gOBG3) se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos bien co-30 nocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Mucho más preferiblemente se emplea cro-matografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de 35 la presente invención, y preferiblemente la forma secretada, también se pueden recu-perar a partir de: productos purificados procedentes de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, ya sea aislados directamente o cultivados; pro-ductos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico, incluyendo, por 5 ejemplo, células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos, y células de mamíferos.
Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción re-combinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Preferiblemente, el dominio globular de OBG3 que comprende los poli-10 péptidos de la invención está sin glicosilar. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto metionina modificado inicial, en algunos casos como un resultado de procesos mediados por el hospedador. Así, es bien conocido en la técnica que la metionina del extremo N-terminal codificada por el codón de iniciación de la traducción generalmente se separa con alta eficacia de cualquier proteína des-15 pués de la traducción en todas las células eucarióticas. Aunque la metionina del ex-tremo N-terminal en la mayor parte de las proteínas también se separa en la mayor parte de los procariotas, para algunas proteínas este procedimiento de separación procariótico es ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que la metio-nina del extremo N-terminal está ligada covalentemente. 20
Además de incluir células hospedadoras que contienen las construcciones de vector que se discuten en la presente memoria, la invención también incluye células hospedadoras primarias, secundarias e inmortalizadas procedentes de vertebrados, particularmente procedentes de mamíferos que se han creado por ingeniería genética para delecionar o sustituir material genético endógeno (p.ej., una secuencia codifi-25 cante), y/o para incluir material genético (p.ej., secuencias polinucleotídicas heterólo-gas) que está asociado de forma funcional a los polinucleótidos de la invención, y que activa, altera y/o amplifica los polinucleótidos endógenos. Por ejemplo, se pueden usar métodos conocidos en la técnica para asociar de manera operable regiones de control heterólogas (p.ej., promotor y/o potenciador) y secuencias polinucleotídicas endóge-30 nas mediante recombinación homóloga, véase, p.ej., la Patente de EE.UU. número 5.641.670 presentada el 24 de junio de 1997; la Publicación Internacional Nº WO 96/29411, publicada el 26 de Septiembre de 1996; la Publicación Internacional Nº WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86(22):8932-5; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86(22):8927-31; y 35 Zijlstra et al. (1989) Nature 342(6248):435-8.
Modificaciones
Además, los polipéptidos de la invención se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en este campo (véase, por ejemplo, Creighton, 1983 Proteins. Nueva York, Nueva York: W.H. Freeman and Company; y Hunkapiller et al., 5 (1984) Nature 310(5973):105-11). Por ejemplo, se puede sintetizar un fragmento de la invención relativamente corto usando un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos quí-micos como una sustitución o adición en la secuencia del fragmento. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitación, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, 10 ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutí-rico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, b-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tales como b-metil 15 aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, los aminoácidos pueden ser D (dextrógiros) o L (levógiros).
La invención incluye fragmentos de polipéptidos que se modifican de forma di-ferencial durante o después de la traducción, p.ej., por glicosilación, acetilación, fosfo-rilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, esci-20 sión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede realizar cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formila-ción, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc. 25
Las modificaciones post-traduccionales adicionales incluidas en la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidrato ligadas a N o ligadas a O, procesa-miento de extremos N-terminal o C-terminal), unión de restos químicos a la cadena principal del aminoácido, modificaciones químicas de cadenas de carbohidrato ligadas a N o ligadas a O y adición o deleción de un resto de metionina N-terminal como re-30 sultado de la expresión en una célula hospedadora procariota. Los fragmentos de poli-péptido se pueden modificar también con una marca detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y aisla-miento del polipéptido.
La invención también proporciona derivados modificados químicamente de los 35 polipéptidos de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como una mayor solubilidad, estabilidad y tiempo en circulación del polipéptido, o menor inmunogenicidad. Véase la Patente de Estados Unidos Nº: 4.179.337. Los restos quí-micos para la modificación pueden seleccionarse entre polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilen glicol, carboximetilcelu-5 losa, dextrano, poli(alcohol vinílico) y similares. Los polipéptidos pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximada-10 mente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas tendrán más peso, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilidad en la manipulación y en la fabricación. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico de-seado (por ejemplo, la duración deseada de la liberación sostenida, los efectos, si los 15 hubiera sobre la actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol sobre una proteína tera-péutica o análogo).
Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) deberían unirse al polipéptido teniendo en cuenta los efectos sobre los dominios funcionales o antigéni-20 cos del polipéptido. Hay varios métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica, p.ej., el documento EP 0 401 384, (que acopla PEG a G-CSF), véase también Malik et al. (1992) Exp Hematol 20(8):1028-35, que informa de la pegilación de GM-CSF mediante el uso de cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede ser unido covalentemente a los restos aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como, 25 un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los restos aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos de lisina y los restos de aminoácido en N-ter-minal; los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto aminoácido del C-terminal. También se pueden 30 usar los grupos sulfhidrilo como un grupo reactivo para unir las moléculas de polieti-lenglicol. Para fines terapéuticos se prefiere la unión a un grupo amino, tal como la unión en el extremo N-terminal o grupo de lisina.
Se pueden desear específicamente proteínas modificadas químicamente en el extremo N-terminal. Usando el polietilenglicol como una ilustración de la presente 35 composición, se puede seleccionar a partir de una variedad de moléculas de polieti-lenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de las moléculas de polietilenglicol a las moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a ser realizada, y el método para obtener la proteína seleccionada pegilada en N-terminal. El método para obtener la preparación pegilada 5 en N-terminal (esto es, separar este resto de otros restos monopegilados si fuera ne-cesario) puede ser por purificación del material pegilado en N-terminal a partir de una población de moléculas de proteína pegilada. Las proteínas selectivas modificadas químicamente en el extremo N-terminal se pueden conseguir mediante alquilación reductora, que se aprovecha de la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos 10 amino primarios (lisina frente al N-terminal) disponibles para la derivatización de una proteína particular. Bajo condiciones apropiadas de reacción, se alcanza la derivatiza-ción sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N-terminal con un grupo carbonilo que contiene el polímero.
Multímeros 15
Los fragmentos del polipéptido de la invención están en homotrímeros. Un homotrímero (p.ej., que contiene fragmentos de polipéptido que tienen secuencias de aminoácidos idénticas). Lo más preferiblemente, dicho homotrímero de fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste en el reparto de lípidos, el metabolismo lipídico, y la actividad similar a la in-20 sulina. Además, lo más preferiblemente, dicho homotrímero de fragmentos del poli-péptido gOBG3 de la invención tiene una actividad seleccionada del grupo.
Los multímeros descritos en la presente memoria pueden ser el resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes y/o pueden estar ligados indirectamente, por ejemplo, por formación de liposomas. Así, en la realización más 25 preferida, los homotrímeros de la invención se forman cuando los polipéptidos de la invención entran en contacto entre sí en disolución. En otras realizaciones, los multí-meros de la invención se forman por asociaciones covalentes con y/o entre los poli-péptidos de la invención. Tales asociaciones covalentes pueden incluir uno o más restos aminoácidos contenidos en la secuencia polipeptídica (p.ej., la indicada en el 30 listado de secuencias, o contenida en el polipéptido codificado por un clon depositado). En un caso, las asociaciones covalentes son entrecruzamientos entre restos de cis-teína localizados dentro de las secuencias polipeptídicas, que interaccionan en el poli-péptido nativo (es decir, natural). En otro caso, las asociaciones covalentes son la consecuencia de manipulación química o recombinante. Como alternativa, en dichas 35 asociaciones covalentes pueden estar implicados uno o más restos aminoacídicos contenidos en la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión de la invención.
El homotrímero de fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste en el reparto de lípidos, el metabolismo 5 lipídico, y la actividad similar a la insulina. Además, lo más preferiblemente, dicho homotrímero de fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste en la prevención de la ganancia de peso, la re-ducción de peso, y el mantenimiento de la pérdida de peso.
En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga 10 contenida en una proteína de fusión de la invención (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5.478.925). En un ejemplo específico, las asociaciones cova-lentes son entre la secuencia heteróloga contenida en la proteína de fusión Fc de la invención (como se describe en la presente memoria). En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión de la invención son entre la secuencia 15 de polipéptido heterólogo de otra proteína que es capaz de formar multímeros asocia-dos covalentemente, tales como por ejemplo osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº: documento WO 98/49305). En otra realización, dos o más polipéptidos de la invención se unen a través de enlazadores peptídicos. Los ejemplos incluyen los enlazadores peptídicos descritos en la pat. de EE.UU. Nº 20 5.073.627. Pueden producirse proteínas que comprenden múltiples polipéptidos de la invención separados por enlazadores peptídicos usando la tecnología de ADN recom-binante convencional.
Otro método para preparar polipéptidos multímeros de la invención implica el uso de polipéptidos de la invención fusionados a una secuencia polipeptídica de cre-25 mallera de leucina o de cremallera de isoleucina. Los dominios de la cremallera de leucina y de la cremallera de isoleucina son polipéptidos que favorecen la multimeriza-ción de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identifi-caron inicialmente en varias proteínas de unión al ADN, y desde entonces se han hallado en una diversidad de proteínas diferentes (Landschulz et al., (1988) Genes 30 Dev. Jul;2(7):786-800). Entre las cremalleras de leucina conocidas están los péptidos y sus derivados presentes en la naturaleza que forman dímeros o trímeros. Los ejem-plos de dominios de cremalleras de leucina para producir las proteínas multiméricas solubles de la invención son los descritos en la solicitud PCT WO 94/10308. Las pro-teínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de la invención fusio-35 nado con una secuencia polipeptídica que dimeriza o trimeriza en solución se expre-san en células hospedadoras adecuadas, y la proteína de fusión multimérica soluble resultante se recupera del sobrenadante de cultivo usando técnicas conocidas en este campo.
Los polipéptidos triméricos de la invención pueden ofrecer la ventaja de una 5 mejor actividad biológica. Los restos de cremalleras de leucina y los restos de isoleu-cina preferidos son aquellos que forman preferiblemente trímeros. Un ejemplo es una cremallera de leucina derivada de la proteína surfactante pulmonar D (SPD), tal como se describe en Hoppe et al. FEBS Letters (1994) 344(2-3): 191-5 y en la solicitud de patente de EE.UU. de Nº de serie 08/446.922. En la preparación de polipéptidos trimé-10 ricos de la invención pueden emplearse otros péptidos derivados de proteínas triméri-cas naturales. En otro ejemplo, las proteínas de la invención están asociadas por in-teracciones entre Flag® y la secuencia polipeptídica contenida en las proteínas de fusión de la invención que contienen la secuencia polipeptídica Flag®. En otra realiza-ción, las proteínas de la invención están asociadas por interacciones entre la secuen-15 cia del polipéptido heterólogo contenida en proteínas de fusión Flag® de la invención y un anticuerpo anti-Flag®.
Los multímeros de la invención pueden generarse usando técnicas químicas conocidas en este campo. Por ejemplo, los polipéptidos que se desea que estén con-tenidos en los multímeros de la invención se pueden entrecruzar químicamente 20 usando moléculas de enlace y métodos de optimización de la longitud de la molécula de enlace conocidos en la técnica (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). Además, los multímeros de la invención se pueden generar mediante el uso de métodos conocidos en la técnica para formar uno o más entrecruzamientos intermoleculares entre los restos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los 25 polipéptidos que se desea que estén contenidos en el multímero (véase, p.ej., la pa-tente de EE.UU. número 5.478.925). Además, los polipéptidos de la invención se pue-den modificar de forma rutinaria mediante la adición de cisteína o biotina al extremo C-terminal o N-terminal del polipéptido, y se pueden aplicar métodos conocidos en la técnica para generar multímeros que contienen uno o más de estos polipéptidos modi-30 ficados (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). Además, se pueden aplicar al menos 30 métodos conocidos en la técnica para generar liposomas que con-tienen los componentes polipeptídicos que se desea que estén contenidos en el mul-tímero de la invención (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925).
Como alternativa, los multímeros de la invención pueden generarse usando 35 técnicas de ingeniería genética conocidas en este campo. En una realización, los poli-péptidos contenidos en los multímeros de la invención se pueden producir de manera recombinante mediante el uso de la tecnología de proteínas de fusión descrita en la presente memoria, o conocida de otro modo en la técnica (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). En una realización específica, los polinucleótidos que co-5 difican un homodímero de la invención se generan ligando una secuencia de polinu-cleótidos que codifica un polipéptido de la invención a una secuencia que codifica un polipéptido ligador, y después además a un polinucleótido sintético que codifica el pro-ducto traducido del polipéptido en la orientación inversa desde el extremo C-terminal original al N-terminal (que carece de la secuencia líder) (véase, p.ej., la patente de 10 EE.UU. número 5.478.925). En otra realización, las técnicas recombinantes descritas en la presente memoria, o conocidas de otro modo en la técnica, se pueden aplicar para generar los polipéptidos recombinantes de la invención, que contienen un domi-nio transmembranal (o hidrófobo o de péptido señal) y que se puede incorporar en liposomas mediante técnicas de reconstitución de membranas (véase, p.ej., la patente 15 de EE.UU. número 5.478.925).
II. Polinucleótidos de OBG3 de la Invención
Los polinucleótidos preferidos son aquellos que codifican OBG3 de longitud completa y fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención. Los polinucleótidos 20 recombinantes que codifican OBG3 de longitud completa y los fragmentos del polipép-tido gOBG3 se pueden usar de diversas maneras, que incluyen, pero sin limitación, expresar el polipéptido en células recombinantes para el uso en ensayos de cribado de antagonistas y agonistas de su actividad, así como para facilitar su purificación para el uso de diversas maneras que incluyen, pero sin limitación, ensayos de cribado para 25 agonistas y antagonistas de su actividad, cribados de diagnóstico, y producción de anticuerpos, así como el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad y/o para reducir la masa corporal.
La invención se refiere a los polinucleótidos que codifican OBG3 de longitud completa y los fragmentos del polipéptido gOBG3 y los fragmentos polipeptídicos va-30 riantes de los mismos, tal como se describen en la presente memoria. Estos polinu-cleótidos pueden estar purificados, aislados y/o pueden ser recombinantes. En todos los casos, los OBG3 y polinucleótidos de gOBG3 deseados de la invención son aque-llos que codifican fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención que tienen una actividad relacionada con la obesidad tal como se describe y se discute en la presente 35 memoria.
Fragmentos
Un fragmento polinucleotídico es un polinucleótido que tiene una secuencia que es completamente igual que parte, pero no todo, el polipéptido OBG3 de longitud completa o la secuencia de nucleótidos del polipéptido gOBG3 especificado. Estos 5 fragmentos pueden ser "independientes", es decir, sin formar parte o estar fusionados a otros polinucleótidos, o pueden estar comprendidos dentro de otro polinucleótido no OBG3 o no gOBG3 (heterólogo) del que constituyen una parte o región. Sin embargo, varios fragmentos de polinucleótidos gOBG3 pueden estar comprendidos dentro de un solo polinucleótido. 10
Variantes
En otras realizaciones preferidas, se prevén variantes de los polinucleótidos de gOBG3 que codifican fragmentos del polipéptido gOBG3. Las variantes de polinucleó-tidos, como se usa este término en la presente memoria, son polinucleótidos cuya se-cuencia difiere de un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido 15 puede ser una variante natural tal como una variante alélica natural, o puede ser una variante que no se considera natural. Estas variantes no naturales del polinucleótido pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleó-tidos, células u organismos. En general, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias de nucleótidos de la referencia y de la variante son muy similares en 20 general y, en muchas regiones, idénticas.
También se prevén específicamente variantes de polinucleótidos que com-prenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican fragmentos del polipéptido gOBG3 de la presente invención. También sería rutinario para un especia-25 lista en la técnica generar las variantes degeneradas descritas anteriormente, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (p.ej., el cambio de codones en el mARN humano por los preferidos en células hospedado-ras de otro mamífero o bacterianas).
Como se ha indicado anteriormente, las variantes de polinucleótidos pueden 30 ser naturales, tales como una variante alélica natural, o pueden obtenerse por méto-dos recombinantes. Una "variante alélica" se refiere a una de varias formas alternati-vas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (véase, p.ej., B. Lewin, (1990) Genes IV, Oxford University Press, Nueva York). Las variantes no naturales se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en este 35 campo. Estas variantes de ácido nucleico incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pue-den implicar a uno o más nucleótidos. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. En especial, entre éstas se prefieren las sustituciones, adiciones o 5 deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y las actividades de un frag-mento del polipéptido gOBG3 de la invención. También se prefieren en relación con esto las sustituciones conservativas.
Los cambios de nucleótidos presentes en una variante de polinucleótido son preferiblemente silenciosos, lo cual significa que no alteran los aminoácidos codifica-10 dos por el polinucleótido. Sin embargo, los cambios de nucleótidos también pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia.
En los casos en los que las sustituciones de nucleótidos ocasionan cambios en uno o más aminoácidos, los fragmentos del polipéptido gOBG3 preferidos incluyen los 15 que retienen una o más de las actividades relacionadas con la obesidad descritas en la Sección I de las Realizaciones Preferidas de la Invención.
Por "retienen las mismas actividades" se entiende que la actividad medida usando el polipéptido codificado por la variante del polinucleótido de gOBG3 en ensa-yos es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, y no 20 más de un 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115%, 120% o 125% de la activi-dad medida usando un fragmento de gOBG3 descrito en la Sección de Ejemplos en la presente memoria.
Por actividad "aumentada" se entiende que la actividad medida usando el poli-péptido codificado por la variante de polinucleótido de gOBG3 en ensayos es al menos 25 un 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450% o 500% de la actividad medida usando un fragmentos de gOBG3 descrito en la Sección de Ejemplos en la presente memoria.
Por actividad "disminuida" se entiende que la actividad medida usando el poli-30 péptido codificado por la variante de polinucleótido de gOBG3 en los ensayos está reducida en al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% con respecto a la activi-dad medida usando un fragmentos de gOBG3 descrito en la Sección de Ejemplos en la presente memoria.
Porcentaje de identidad
Se describen además moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias con una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o los fragmentos de las mismas que codifican un polipéptido que tiene una actividad rela-5 cionada con la obesidad tal como se describe en la Sección I de las Realizaciones Preferidas de la Invención. Por supuesto, debido a la degeneración del código gené-tico, un especialista habitual en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico con una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las secuencias de ácido nu-10 cleico mostradas en la SEC ID Nº:1 ó SEQ ID NO:3 o los fragmentos de las mismas codificarán un polipéptido que tiene actividad biológica. De hecho, como todas las va-riantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipép-tido, esto será evidente para el especialista en la técnica incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito anteriormente. También se reconocerá en la técnica que, 15 para las moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificarán un polipéptido con actividad biológica. Esto se debe a que el especialista en la técnica es completamente consciente de las sustituciones de aminoácidos con menos probabilidad o sin probabilidad de afectar significativamente a la función de la proteína (por ejemplo, el reemplazo de un aminoácido alifático por otro 20 aminoácido alifático), como se ha descrito adicionalmente con anterioridad en la Sec-ción I de las realizaciones Preferidas de la Invención.
Por un polinucleótido que tiene una "identidad" de secuencia de nucleótidos de al menos, por ejemplo, un 95% con una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es 25 idéntica a la secuencia de referencia con la excepción de que la secuencia del polinu-cleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el fragmento de gOBG3. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos un 95% con respecto a una secuencia de nucleótidos de 30 referencia, hasta un 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden dele-cionarse, insertarse o sustituirse por otro nucleótido. La secuencia problema puede ser una secuencia entera o cualquier fragmento especificado como se describe en la pre-sente memoria.
Los métodos para determinar y definir si cualquier molécula de ácido nucleico o 35 polipéptido particular tiene una identidad de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de nucleótidos de la presente inven-ción se pueden llevar a cabo usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también denominada 5 un alineamiento de secuencia global, se puede determinar usando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., ((1990) Comput Appl Biosci. 6(3):237-45). En un alineamiento de secuencia, las secuencias problema y ob-jeto son secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse convirtiendo primero las U en T. El resultado de dicho alineamiento de secuencia global está en 10 porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-tuple=4, Penalización de Desacoplamiento=1, Penalización de Unión=30, Longitud de Grupo de Aleatorización=0, Puntuación Límite=1, Penalización de Hueco=5, Penalización de Tamaño de Hueco 0,05, Tamaño de Ventana=500 o la 15 longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, lo que sea menor.
Si la secuencia objeto es más corta que la secuencia problema debido a dele-ciones en 5' o 3', no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección ma-nual en los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objeto cuando calcula el porcentaje de identi-20 dad. Para secuencias objeto truncadas en los extremos 5' o 3' con respecto a la se-cuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de ba-ses de la secuencia problema que están en posición 5' y 3' con respecto a la secuencia objeto, que no están emparejadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Se determina si un nucleótido está empare-25 jado/alineado por los resultados del alineamiento de secuencia de FASTDB. Este por-centaje se resta después del porcentaje de identidad, calculado por el anterior pro-grama FASTDB usando los parámetros especificados, para lograr una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es lo que se usa para los pro-pósitos de la presente invención. Para ajustar manualmente la puntuación del porcen-30 taje de identidad sólo se calculan los nucleótidos fuera de los nucleótidos 5' y 3' de la secuencia objeto, como se representa por el programa FASTDB, que no están empa-rejados/alineados con la secuencia problema.
Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 nucleótidos se alinea con una se-cuencia problema de 100 nucleótidos para determinar el porcentaje de identidad. Las 35 deleciones se dan en el extremo 5' de la secuencia objeto y, por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de los primeros 10 nucleóti-dos en el extremo 5'. Los 10 nucleótidos no emparejados representan el 10% de la secuencia (número de nucleótidos en los extremos 5' y 3' no emparejados/número total de nucleótidos en la secuencia problema), de manera que se resta el 10% de la 5 puntuación del porcentaje de identidad calculada mediante el programa FASTDB. Si los 90 nucleótidos restantes estuvieran perfectamente emparejados, el porcentaje de identidad final sería del 90%.
En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 nucleótidos con una secuencia problema de 100 nucleótidos. Esta vez las deleciones son deleciones inter-10 nas, de forma que no hay nucleótidos en los extremos 5' o 3' de la secuencia objeto que no estén emparejados/alineados con la secuencia problema. En este caso, el por-centaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solamente se corrigen los nucleótidos en 5' y 3' de la secuencia objeto que no están emparejados/alineados con la secuencia problema. No se realizan otras correcciones 15 manuales para los propósitos de la presente invención.
Fusiones
También se incluyen en la presente invención los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención que están fusionados en el marco de lectura a las secuencias codificantes de secuencias de aminoácidos heterólogas adicionales. 20 También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención junto con otras secuencias no codificantes adi-cionales, que incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, secuencias no codificantes en 5' y 3', secuencias de vectores, o secuencias usadas para la purificación, sondeo o cebado. Por ejemplo, las secuencias heterólogas incluyen las secuencias transcritas, 25 no traducidas que pueden desempeñar un papel en la transcripción, y procesado del mARN, por ejemplo, la unión a los ribosomas y la estabilidad del mARN. Las secuen-cias heterólogas, como alternativa, pueden comprender secuencias codificantes adi-cionales que proporcionan funcionalidades adicionales. Así, una secuencia de nucleó-tidos que codifica un polipéptido puede ser fusionada con una secuencia marcadora, 30 tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipép-tido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como el marca-dor proporcionado en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, de los que muchos están disponibles en el mercado. Por 35 ejemplo, la hexa-histidina permite la purificación conveniente de la proteína de fusión (véase Gentz et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86(3):821-4). El marcador "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la pro-teína hemaglutinina del virus de la gripe (véase Wilson et al., (1984) Cell 37(3):767-78). Como se ha descrito anteriormente, otra de estas proteínas de fusión incluye 5 cADN del fragmento de gOBG3 fusionado a Fc en el extremo N- o C-terminal.
III. Vectores Recombinantes de la Invención
El término "vector" se usa en la presente memoria para designar una molécula de ADN o ARN circular o lineal, que es de doble hebra o una única hebra, y que com-10 prende al menos un polinucleótido de interés que se busca que sea transferido a una célula hospedadora o a un organismo hospedador unicelular o multicelular.
La presente invención se refiere a vectores recombinantes que comprenden uno cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria.
La presente invención abarca una familia de vectores recombinantes que com-15 prenden polinucleótidos que codifican fragmentos del polipéptido OBG3 de la inven-ción.
En una primera realización preferida, se usa un vector recombinante de la in-vención para amplificar el polinucleótido insertado en una célula hospedadora ade-cuada, amplificándose este polinucleótido cada vez que se replica el vector recombi-20 nante. El polinucleótido insertado puede ser uno que codifica fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención.
Una segunda realización preferida de los vectores recombinantes de acuerdo con la invención consiste en vectores de expresión que comprenden polinucleótidos que codifican fragmentos del polipéptido OBG3 de la invención. En ciertas realizacio-25 nes, se emplean vectores de expresión para expresar un fragmento de OBG3 de la invención, preferiblemente un fragmento de OBG3 modificado descrito en la presente invención, que después se puede purificar y, por ejemplo, usar como tratamiento de enfermedades relacionadas con la obesidad, o simplemente para reducir la masa cor-poral de individuos. 30
La expresión requiere que en los vectores se proporcionen las señales apro-piadas, incluyendo dichas señales diversos elementos reguladores tales como poten-ciadores/promotores tanto de fuentes virales como procedentes de mamífero, que diri-gen la expresión de los genes de interés en las células hospedadoras. En los vectores de expresión de la invención generalmente se incluyen generalmente marcadores se-35 leccionables de fármacos dominantes para establecer clones celulares permanentes y estables que expresan los productos, ya que son elementos que asocian la expresión de los marcadores seleccionables de fármacos con la expresión del polipéptido.
Más en particular, la presente invención se refiere a vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que codifican un fragmento de OBG3 de la invención, o un 5 fragmento de OBG3 modificado como se describe en la presente memoria, o variantes o fragmentos de los mismos, bajo el control de una secuencia reguladora seleccionada entre fragmentos del polipéptido OBG3, o como alternativa bajo el control de una se-cuencia reguladora exógena.
Por consiguiente, los vectores de expresión preferidos de la invención se se-10 leccionan entre el grupo consistente en: (a) una secuencia reguladora de un fragmento de OBG3 que dirige la expresión de un polinucleótido codificador ligado operativa-mente a la misma; y (b) una secuencia codificante de un fragmento de OBG3 de la invención, unida operativamente a secuencias reguladoras que permiten su expresión en una célula hospedadora y/u organismo hospedador adecuado. 15
Algunos de los elementos que se pueden encontrar en los vectores de la pre-sente invención se describen con más detalle en las siguientes secciones.
1) Características generales de los vectores de expresión de la invención:
Un vector recombinante de acuerdo con la invención comprende, pero sin limi-tación, un YAC (cromosoma artificial de levadura, por sus siglas en inglés), un BAC 20 (cromosoma artificial bacteriano, por sus siglas en inglés), un fago, un fagémido, un cósmido, un plásmido o incluso una molécula de ADN lineal que puede consistir en un ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Un vector recombinante de este tipo puede comprender una unidad transcripcional que comprende un conjunto de: 25
(1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la ex-presión de los genes, por ejemplo promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos de actuación en cis de ADN, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción;
(2) una secuencia estructural o codificadora que está transcrita en el mARN y 30 eventualmente traducida a un polipéptido, estando dicha secuencia estructural o codi-ficadora ligada operativamente a los elementos reguladores descritos en (1); y
(3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de la transcripción. Las uni-dades estructurales destinadas al uso en sistemas de expresión de levadura o euca-riotas preferiblemente incluyen una secuencia líder que permite la secreción extrace-35 lular de la proteína traducida por una célula anfitriona. Como alternativa, cuando una proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede in-cluir un resto N-terminal. Este resto puede ser o no escindido posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replica-5 ción, marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula anfitriona y un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural en dirección 3'. La secuencia estructural heteróloga es ensam-blada en una fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la tra-ducción, y preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la pro-10 teína traducida hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. En una realización específica en la que el vector es adaptado para transfectar y expresar las secuencias deseadas en las células hospedadoras del mamífero, los vectores preferi-dos comprenderán un origen de replicación en el hospedador deseado, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquiera de los sitios necesarios de unión a ribo-15 somas, sitios de poliadenilación, sitios de corte y empalme de donador y aceptor, las secuencias de terminación de la transcripción, y las secuencias no transcritas en la región de flanqueo 5'. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo de origen SV40, promotor temprano, potenciador, sitios de corte y empalme y de poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no 20 transcritos requeridos.
2) Elementos reguladores
Promotores
Las regiones promotoras adecuadas usadas en los vectores de expresión de la presente invención se eligen teniendo en cuenta la célula hospedadora en la que se 25 expresa el gen heterólogo. El promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no se considera importante, con tal de que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula elegida. Así, cuando se elige como objetivo una célula humana, es preferible colocar la región codi-ficante de ácido nucleico adyacente a un promotor y bajo el control del mismo, que es 30 capaz de ser expresado en una célula humana, tal como, por ejemplo, un promotor humano o viral. El promotor utilizado puede ser constitutivo o inducible.
Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el que controla la expresión o, como alternativa, puede ser endógeno para el po-linucleótido nativo que contiene la secuencia codificante a expresar. Adicionalmente, el 35 promotor es generalmente heterólogo con respecto a las secuencias del vector recom-binante dentro de las cuales ha sido insertada la estructura artificial de la secuencia promotora/codificante.
Las regiones del promotor se pueden seleccionar a partir de cualquier gen ob-jetivo usando, por ejemplo, vectores CAT (cloranfenicol-transferasa) y más preferible-5 mente vectores pKK232-8 y pCM7. Son promotores bacterianos preferidos los promo-tores LacI, LacZ, los promotores de la ARN polimerasa del bacteriófago T3 o T7, los promotores gpt, lambda PR, PL y trp (documento EP 0036776), el promotor de la po-lihedrina, o el promotor de la proteína p10 de baculovirus (Kit Novagen) (Smith et al., (1983) Mol Cell Biol 3(12):2156-65; O'Reilly et al., 1992), el promotor lambda PR o 10 también el promotor trc.
Los promotores eucarióticos incluyen el inmediato temprano de CMV, timidina-quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus, y la metalotioneina-L de ratón. Además, pueden elegirse promotores específicos para un tipo celular parti-cular, tales como los que facilitan la expresión en tejido adiposo, tejido muscular o 15 hígado. La selección de un vector y promotor convenientes es bien conocida dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica.
La elección de un promotor está bien dentro de la capacidad de un especialista en el campo de la ingeniería genética. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 20 Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989), o también a los procedimientos descritos por Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.
Otros elementos reguladores
Cuando se emplea un inserto de cADN, se desea típicamente incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito del gen. La 25 naturaleza de la señal de poliadenilación no se cree que sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y se puede emplear cualquiera de tales secuencias como la hormona de crecimiento humano y las señales de poliadenilación de SV40. También se contempla como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos ele-mentos pueden servir para aumentar los niveles de mensajero y minimizar la lectura 30 de otras secuencias desde el casete.
Los vectores que contienen la secuencia apropiada de ADN como se ha descrito an-tes, se pueden utilizar para transformar un hospedador apropiado para permitir la ex-presión del polipéptido o polinucleótido deseado.
3) Marcadores seleccionables 35
Estos marcadores deben conferir un cambio identificable a la célula que per-mita la fácil identificación de las células que contienen la construcción de expresión. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células hospedadoras transformadas son, preferiblemente, la dihidrofolato reductasa o la resistencia a neo-micina para cultivos de células eucariotas, TRP1 para S. cerevisiae o resistencia a 5 tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o levano sacarasa para micobacterias, siendo este último marcador un marcador de selección negativo.
4) Vectores preferidos
Vectores bacterianos
Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión 10 útiles para su uso en bacterias pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores co-merciales incluyen, pero sin limitación, pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Muchos otros vectores adecuados 15 son conocidos por los expertos en la técnica, y están comercialmente disponibles, ta-les como los siguientes vectores bacterianos: pTrc-His, pET30-His, pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pMH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, 20 pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).
Vectores de baculovirus
Un vector adecuado para la expresión de polipéptidos de la invención es un vector de baculovirus que puede propagarse en células de insecto y en líneas de cé-lulas de insecto. Un sistema de vector hospedador adecuado específico es el vector de 25 transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea celular SF9 (ATCC NºCRL 1711) que procede de Spodoptera frugiperda.
Los expertos en la técnica conocen otros vectores de baculovirus adecuados, por ejemplo, FastBacHT. Otros vectores adecuados para la expresión de un polipéptido de la cabeza globular de APM1 en un sistema de expresión de baculovirus incluyen, pero 30 sin limitación, los descritos por Chai et al. (1993; Biotechnol Appl Biochem. Dic.;18 (Pt 3):259-73); Vlasak et al. (1983; Eur J Biochem Sep 1;135(1):123-6); y Lenhard et al. (1996; Gene Mar 9; 169(2): 187-90).
Vectores de mamíferos
Otros vectores adecuados para la expresión de los polipéptidos de la invención 35 son los vectores de mamíferos. Los expertos en la técnica conocen varios sistemas de vectores adecuados, por ejemplo, pcADN4HisMax, pcADN3.1Hygro-His y pcADN3.1Hygro.
Vectores víricos
En una realización específica, el vector procede de un adenovirus. Son vecto-5 res de adenovirus preferidos de acuerdo con la invención los descritos por Feldman y Steg (1996; Semin Interv Cardiol 1(3):203-8) o Ohno et at. (1994; Science 265(5173):781-4). Otro adenovirus recombinante preferido de acuerdo con esta reali-zación específica de la presente invención es el adenovirus humano de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (solicitud de patente francesa Nº FR-10 93.05954).
Generalmente, se entiende que los vectores de retrovirus y vectores de virus adenoasociados son sistemas de administración de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, particularmente a mamífe-ros, incluyendo seres humanos. Estos vectores proporcionan una eficaz liberación de 15 genes a las células, y los ácidos nucleicos transferidos están integrados de forma es-table en el ADN cromosómico del anfitrión.
Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de vehículos retrovirales de administración de genes in vitro o in vivo de la presente in-vención incluyen retrovirus seleccionados del grupo constituido por virus inductores de 20 focos en células del visón, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Los virus de la leucemia murina particularmente preferidos incluyen los virus 4070A y los 1504A, Abelson (ATCC No VR-999), Friend (ATCC No VR-245), Gross (ATCC No VR-590), Rauscher (ATCC No VR-998) y el Virus de la leu-cemia murina de Moloney (ATCC No VR-190; Solicitud PCT Nº WO 94/24298). Los 25 virus del sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen la cepa Bryan de alto título (ATCC Núms. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores re-trovirales preferidos son los descritos en Roth et al. (1996), Solicitud PCT Nº WO 93/25234, Solicitud PCT Nº WO 94/06920, Roux et al., ((1989) Proc Natl Acad Sci USA 86(23):9079-83), Julan et al., (1992) J. Gen. Virol. 3:3251-3255 y Neda et al. ((1991) J 30 Biol Chem 266(22):14143-6). Otro sistema de vector viral más que se contempla en la invención consiste en el virus adenoasociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus defectuoso de origen natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpesvirus, como un virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo vital produc-tivo (Muzyczka et al., (1992) Curr Top Microbiol Immunol; 158: 97-129). También es 35 uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células que no estén en división, y presenta una alta frecuencia de integración estable (Flotte et al., (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7(3): 349-56; Samulski et al., (1989) J Virol 63(9):3822-8; McLaughlin et al., (1989) Am J Hum Genet 59:561-569). Una característica ventajosa de los AAV proviene de su reducida eficacia para transducir células primarias con respecto a cé-5 lulas transformadas.
5) Administración de vectores recombinantes
Para lograr la expresión de los polinucleótidos de la invención, estas construc-ciones deben administrarse a una célula. Esta administración puede realizarse in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo 10 o ex vivo, como en el tratamiento de ciertas patologías.
Un mecanismo es la infección vírica en la que la estructura artificial de expre-sión es encapsulada en una partícula vírica infecciosa.
También se contemplan en la presente invención varios métodos no virales para la transferencia de polinucleótidos en células de mamífero cultivadas, e incluyen, 15 sin limitación, la precipitación con fosfato cálcico (Graham et al., (1973) Virology, 54(2): 536-9; Chen et al., (1987) Mol Cell Biol 7(8):2745-52), DEAE-dextrano (Gopal, (1985) Mol Cell Biol 5(5):1188-90), electroporación (Tur-Kaspa et al., (1986) Mol Cell Biol 6(2):716-8; Potter et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(22):7161-5.), microinyec-ción directa (Harland et al., (1985) J Cell Biol 101(3):1094-9), liposomas cargados con 20 ADN (Nicolau et al., (1982) Biochim Biophys Acta 721(2):185-90; Fraley et al., (1979) Proc Natl Acad Sci USA 76(7):3348-52), y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, (1987) J Biol Chem 262(10):4429-32; Wu y Wu (1988) Biochemistry 27(3):887-92). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse con éxito para el uso in vivo o ex vivo. 25
Una vez que el polinucleótido de expresión ha sido liberado a la célula, puede ser integrado de manera estable en el genoma de la célula receptora. Esta integración puede hacerse en lugar cognado y en orientación por medio de recombinación homó-loga (sustitución del gen), o se puede integrar en un lugar aleatorio, inespecífico (au-mento génico). En otras realizaciones más, el ácido nucleico puede mantenerse de 30 forma estable en la célula como un segmento de ADN episomal separado. Tales seg-mentos de ácido nucleico o "episomas" codifican las secuencias suficientes para per-mitir el mantenimiento y la replicación independiente del ciclo de la célula anfitriona o en sincronía con dicho ciclo.
Una realización específica para un método para administrar una proteína o 35 péptido en el interior de una célula de un vertebrado in vivo comprende la etapa de introducir una preparación que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido desnudo que codifique operativamente el polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, por el cual el polinucleótido desnudo se capta hacia el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto es 5 particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero puede aplicarse también in vivo.
Las composiciones para el uso in vitro e in vivo que comprenden un polinucleó-tido "desnudo" se describen en la solicitud PCT nº WO 90/11092 (Vical Inc.) y también en la solicitud PCT nº WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa) 10 así como en los artículos de Tascon et al. (1996) Nature Medicine 2(8):888-892 y de Huygen et al. ((1996) Nat Med 2(8):893-8).
Aún en otra realización de la invención, la transferencia de un polinucleótido desnudo de la invención, que incluye una construcción de polinucleótido de la inven-ción, al interior de las células se puede llevar a cabo con un bombardeo de partículas 15 (biolística), y dichas partículas son microproyectiles revestidos con ADN acelerados a gran velocidad, lo que les permite atravesar las membranas celulares y entrar en las células sin destruirlas, tal como describe Klein et al. ((1990) Curr Genet Feb;17(2):97-103).
En una realización adicional, el polinucleótido de la invención puede encerrarse 20 en un liposoma (Ghosh y Bacchawat, (1991) Targeted Diagn Ther 4: 87-103; Wong et al., (1980) Gene 10: 87-94; Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol 149:157-76). Estos liposomas pueden ser además dirigidos a las células que expresan LSR mediante la incorporación de leptina, triglicéridos, ACRP30, u otros ligandos conocidos de LSR en la membrana del liposoma. 25
En una realización específica, la invención proporciona una composición para la producción in vivo de un polipéptido de la cabeza globular de APM1 descrito en la presente memoria. Dicha composición comprende un polinucleótido desnudo que co-difica operativamente este polipéptido, en disolución en un vehículo fisiológicamente aceptable, y adecuado para la introducción en un tejido para hacer que las células del 30 tejido expresen dicho polipéptido.
La cantidad de vector a ser inyectada al organismo anfitrión deseado varía se-gún el sitio de inyección. Como una dosis indicativa, se inyectarán entre 0,1 y 100 µg del vector en el cuerpo de un animal, preferiblemente en el cuerpo de un mamífero, por ejemplo, el cuerpo de un ratón. En otra realización del vector de acuerdo con la 35 invención, puede producirse in vitro en una célula hospedadora, preferiblemente en una célula hospedadora recogida previamente del animal que se va a tratar y, más preferiblemente, una célula somática tal como una célula muscular. En una etapa sub-siguiente, la célula que ha sido transformada con el vector que codifica el polipéptido de cabeza globular deseado Apm1 o el fragmento deseado del mismo se reintroduce 5 en el cuerpo del animal con el fin de liberar la proteína recombinante dentro del cuerpo localmente o sistémicamente.
IV. Células Recombinantes de la Invención
Otro objetivo de la invención consiste en células hospedadoras recombinantes 10 para, es decir, que se han transformado o transfectado con uno de los polinucleótidos descritos en la presente memoria, y de manera más precisa un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un fragmento del polipéptido OBG3 de la invención tal como cualquiera de los descritos en los "Polinucleótidos de la Invención". Estos polinucleótidos pueden estar presentes en células como resultado de una 15 transfección estable o transitoria. La invención incluye células hospedadoras que se transforman (células procarióticas) o que se transfectan (células eucarióticas) con un vector recombinante tal como cualquiera de los descritos en "Vectores Recombinantes de la Invención".
En general, una célula hospedadora recombinante de la invención comprende 20 al menos uno de los polinucleótidos o los vectores recombinantes de la invención que se describen en la presente memoria.
Las células hospedadoras preferidas usadas como receptores para los vecto-res recombinantes de la invención son las siguientes:
a) Células hospedadoras procarióticas: cepas de Escherichia coli (por ejemplo, 25 cepa DH5-α), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y cepas de especies como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus y
b) Células hospedadoras eucarióticas: células HeLa (ATCC Nº CCL2; Nº CCL2.1; Nº CCL2.2), células Cv 1 (ATCC Nº CCL70), células COS (ATCC Nº CRL1650; Nº CRL1651), células Sf-9 (ATCC Nº CRL1711), células C127 (ATCC Nº 30 CRL-1804), 3T3 (ATCC Nº CRL-6361), CHO (ATCC Nº CCL-61), riñón humano 293 (ATCC Nº 45504; Nº CRL-1573), BHK (ECACC Nº 84100501; Nº 84111301), células PLC, HepG2, y Hep3B.
Las estructuras artificiales en las células hospedadoras se pueden usar de ma-nera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia re-35 combinante.
Después de la transformación de un anfitrión adecuado y el crecimiento del an-fitrión hasta una densidad apropiada de células, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados, tales como subida de la temperatura o inducción química, y se cultivan las células durante un periodo adicional. 5
Las células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para posterior purificación.
Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden romper por cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-desconge-lación, sonicación, rotura mecánica, o el uso de agentes para lisado de las células. 10 Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
Además, según la invención, estas células recombinantes pueden generarse in vitro o in vivo en un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente selec-cionado del grupo constituido por ratones, ratas, perros, cerdos, ovejas, vacas y pri-mates, sin incluir seres humanos. Posteriormente, las células recombinantes genera-15 das in vitro también pueden implantarse quirúrgicamente, por ejemplo, en un animal. Son bien conocidos en la técnica los métodos para generar células recombinantes in vivo en animales.
La presente invención abarca también las células hospedadoras homóloga-mente recombinantes primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, 20 preferiblemente de origen mamífero y en particular de origen humano, que se han mo-dificado para: a) insertar polinucleótidos exógenos (heterólogos) en el ADN cromosó-mico endógeno de un gen objetivo, b) delecionar el ADN cromosómico endógeno, y/o c) reemplazar el ADN cromosómico endógeno con polinucleótidos exógenos. Las in-serciones, deleciones, y/o reemplazamientos de las secuencias de polinucleótido pue-25 den ser para las secuencias codificadoras del gen objetivo y/o para las regiones regu-ladoras, tales como las secuencias promotoras y potenciadoras, asociadas operativamente con el gen objetivo.
La presente invención se refiere además a un método para producir una célula hospedadora homólogamente recombinante in vitro o in vivo, en la que se altera la 30 expresión de un gen objetivo que no se expresa normalmente en la célula. Preferible-mente la alteración causa la expresión del gen objetivo en condiciones normales de crecimiento o en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el gen objetivo. El método comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción polinucleotídica, comprendiendo la construcción polinucleo-35 tídica; (i) una secuencia de acceso; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio donador de corte y empalme no emparejado, si fuera nece-sario, produciendo así una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga.
La presente invención se refiere además a un método para alterar la expresión 5 de un gen objetivo en una célula in vitro o in vivo en la que el gen no se expresa nor-malmente en la célula, que comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción polinucleotídica, comprendiendo la construcción polinu-cleotídica: (i) una secuencia de acceso; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuen-cia codificadora; y (iii) un sitio donador de corte y empalme no emparejado, si fuera 10 necesario, produciendo así una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfec-tada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, pro-duciéndose de este modo una célula homólogamente recombinante; y (c) mantener la célula homólogamente recombinante in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen. 15
La presente invención se refiere además a un método de preparación de un polipéptido de la presente invención por alteración de la expresión de un gen objetivo endógeno en una célula in vitro o in vivo, donde el gen no se expresa normalmente en la célula, que comprende las etapas de: a) transfectar la célula in vitro con una cons-trucción polinucleotídica, comprendiendo la construcción polinucleotídica: (i) una se-20 cuencia de acceso; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio donador de corte y empalme no emparejado, si fuera necesario, produciendo así una célula transfectada; (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, produciéndose de este modo una célula homólogamente recombinante; y c) mantener la célula homóloga-25 mente recombinante in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen, generando de este modo el polipéptido.
La presente invención se refiere además a una construcción de polinucleótido que altera la expresión de un gen objetivo en un tipo celular en el que el gen no se expresa normalmente. Esto ocurre cuando una construcción de polinucleótido se in-30 serta en el ADN cromosómico de la célula objetivo, en la que la construcción de poli-nucleótido comprende: a) una secuencia de acceso; b) una secuencia reguladora y/o una secuencia codificadora; y c) un sitio donador de corte y empalme no emparejado, si fuera necesario. Se incluyen además construcciones polinucleotídicas, como se han descrito anteriormente, donde la construcción comprende además un polinucleótido 35 que codifica un polipéptido y está en el marco de lectura con el gen objetivo endógeno después de la recombinación homóloga con el ADN cromosómico.
Las composiciones se pueden producir, y los métodos se pueden realizar, por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en las patentes de Estados Unidos Nos: 6.054.288; 6.048.729; 6.048.724; 6.048.524; 5.994.127; 5.968.502; 5 5.965.125; 5.869.239; 5.817.789; 5.783.385; 5.733.761; 5.641.670; 5.580.734; Publi-caciones Internacionales Nº: WO96/29411, WO 94/12650; y los artículos científicos descritos por Koller et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 10:705-730.
La expresión del gen OBG3 en células de mamíferos, y típicamente en células humanas, se puede hacer deficiente, o alternativamente se puede mejorar, con la in-10 serción de una secuencia genómica o de cADN de OBG3 con la sustitución del equi-valente del gen OBG3 en el genoma de una célula animal mediante un polinucleótido de OBG3 según la invención. Estas alteraciones genéticas pueden ser generadas por sucesos de recombinación homóloga usando estructuras artificiales específicas de ADN que han sido descritas previamente. 15
Un tipo de célula hospedadora que se puede usar son los zigotos de mamífe-ros, tales como los zigotos murinos. Por ejemplo, se puede someter a cigotos murinos a microinyección con una molécula de ADN purificada de interés, por ejemplo, una molécula de ADN purificada que se haya ajustado previamente a un intervalo de con-centración de 1 ng/ml -para insertos de BAC- 3 ng/µl -para insertos de bacteriófago 20 P1- en Tris-HCl 10 mM, a pH 7,4, EDTA 250 µM que contiene KaCl 100 mM, esper-mina 30 µM, y espermidina 70 µM. Cuando el ADN que se va a microinyectar tiene un gran tamaño, se pueden usar poliaminas y concentraciones salinas elevadas para evitar la rotura mecánica de este ADN, como se describe en Schedl et al ((1993) Nature 362(6417):258-61). 25
Cualquiera de los polinucleótidos de la invención, lo que incluye las construc-ciones de ADN descritas en la presente memoria, se puede introducir en una línea de células madre embrionarias (ES), preferiblemente una línea celular ES de ratón. Las líneas celulares ES se derivan de células pluripotentes, inmaduras, de la masa interior de la célula de los blastocitos de pre-implantación. Las líneas celulares ES preferidas 30 son las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC No. CRL-1821), ES-D3 (ATCC No. CRL1934 y No. CRL-11632), YS001 (ATCC No. CRL-11776), 36.5 (ATCC No. CRL-11116). Para mantener las células ES en un estado indiferenciado, se cultivan en presencia de cé-lulas de soporte de crecimiento inhibido que proporcionan las señales apropiadas para preservar este fenotipo embrionario y sirven como una matriz para la adherencia de 35 las células ES. Las células de soporte preferidas son los fibroblastos embrionarios primarios que se establecen a partir del tejido de embriones de 13 días-14 días de prácticamente cualquier cepa de ratón, que se mantienen en cultivo, tal como describe Abbondanzo et al. (1993; Methods Enzymol 225:803-23) y cuyo crecimiento se inhibe mediante irradiación, como se describe en Robertson ((1987) Embryo-derived stem 5 cell lines. En: E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford), o mediante la presencia de una concentración inhibitoria de LIF, tal como se describe en Pease y Williams (1990; Exp Cell Res 190(2):209-11).
Las estructuras artificiales en las células hospedadoras se pueden usar de ma-10 nera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia re-combinante.
Después de la transformación de un anfitrión adecuado y el crecimiento del anfitrión hasta una densidad apropiada de células, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados, tales como subida de la temperatura o inducción 15 química, y se cultivan las células durante un periodo adicional. Las células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para posterior purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden romper por cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonicación, rotura 20 mecánica, o el uso de agentes para lisado de las células. Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
IV. Animales transgénicos
También se describen métodos y composiciones para la generación de anima-25 les no humanos y plantas que expresan un polipéptido OBG3 recombinante, es decir, un fragmento del polipéptido gOBG3 recombinante o un polipéptido OBG3 de longitud completa recombinante. Los animales o plantas pueden ser transgénicos, es decir, cada una de sus células contiene un gen que codifica el polipéptido OBG3, o, alterna-tivamente, puede ser introducido un polinucleótido que codifica el polipéptido en las 30 células somáticas del animal o planta, por ejemplo en las células epiteliales secretoras mamarias de un mamífero. En realizaciones preferidas, el animal no humano es un mamífero, tal como una vaca, oveja, cabra, cerdo o conejo. En las realizaciones más preferidas, dicho gen que codifica dicho fragmento del polipéptido gOBG3 o dicho poli-péptido OBG3 de longitud completa comprende el polinucleótido de SEQ ID NO:5. 35
Los métodos para obtener animales transgénicos, tales como mamíferos, son bien conocidos por los especialistas en la técnica, y cualquiera de estos métodos puede usarse en la presente invención. En resumen, se pueden producir mamíferos transgénicos, por ejemplo, transfectando una célula madre pluripotencial tal como una célula ES con un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. Las células ES 5 transformadas de manera eficaz se pueden introducir después en un embrión en fase inicial que se implanta después en el útero de un mamífero de la misma especie. En ciertos casos, las células transformadas ("transgénicas") comprenderán parte de la línea germinal del animal resultante, y los animales adultos que comprenden las célu-las transgénicas en la línea germinal pueden ser apareados entonces con otros ani-10 males, produciendo eventualmente de este modo una población de animales transgé-nicos que tienen el transgén en cada una de sus células, y que pueden transmitir establemente el transgén a cada una de sus crías. Se pueden usar otros métodos para introducir el polinucleótido, por ejemplo introducir el polinucleótido que codifica el poli-péptido de interés en un huevo fertilizado o en un embrión en fase inicial por medio de 15 microinyección. Alternativamente, se puede introducir el transgén en un animal por infección de zigotos con un retrovirus que contiene el transgén (Jaenisch, R. (1976) Proc Natl Acad Sci USA 73, 1260-1264). Los métodos para producir mamíferos trans-génicos se describen, p.ej., en Wall et al. (1992) J Cell Biochem 1992 49(2):113-20; Hogan, et al. (1986) en Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold 20 Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; en el documento WO 91/08216; o en la patente de EE.UU. número 4.736.866.
En un método preferido, los polinucleótidos se microinyectan en el oocito fertili-zado. Típicamente, los oocitos fertilizados son microinyectados usando técnicas es-tándar, y después se cultivan in vitro hasta que se obtiene un "embrión de pre-implan-25 tación". Estos embriones en fase de preimplantación preferiblemente contienen aproximadamente de 16 a 150 células. Los métodos para cultivar oocitos fertilizados hasta la fase de pre-implantación se describen, p.ej., en Gordon et al. ((1984) Methods in Enzymology, 101,414); Hogan et al. ((1986) en Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) 30 (para el embrión de ratón); Hammer et al. ((1985) Nature, 315,680) (para embriones de conejo y cerdo); Gandolfi et al. ((1987) J Reprod Fert 81, 23-28); Rexroad et al. ((1988) J Anim Sci 66, 947-953) (para embriones ovinos); y Eyestone et al. ((1989) J Reprod Fert 85, 715-720); Camous et al. ((1984) J Reprod Fert 72, 779-785); y Heyman et al. ((1987) Theriogenology 27, 5968) (para embriones bovinos); incorporándose en la pre-35 sente memoria en su totalidad la descripción de cada una de dichas referencias. Los embriones en fase de preimplantación después se transfieren a una hembra apropiada por métodos convencionales para permitir el nacimiento de un animal transgénico o quimérico, dependiendo de la fase de desarrollo cuando se introduce el transgén.
Como a menudo la frecuencia de incorporación del transgén es baja, es muy 5 deseable la detección de la integración del transgén en los embriones de pre-implan-tación usando cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. Puede usarse cualquiera de varios métodos para detectar la presencia de un transgén en un embrión en fase de preimplantación. Por ejemplo, se pueden separar una o más célu-las del embrión de pre-implantación, y la presencia o ausencia del transgén en la cé-10 lula o células separadas se puede detectar usando cualquier método estándar, p.ej., la PCR. Alternativamente, la presencia de un transgén puede ser detectada en el útero o después del parto usando métodos estándar.
También se describe la generación de animales transgénicos que secretan po-lipéptidos OBG3 recombinantes en la leche. Como la glándula mamaria es un órgano 15 productor de proteínas muy eficiente, tales métodos pueden ser usados para producir concentraciones de proteínas en el intervalo de gramos por litro, y a menudo de forma más significativa. Preferiblemente, la expresión en la glándula mamaria se alcanza uniendo operativamente el polinucleótido que codifica el polipéptido OBG3 a un pro-motor específico de la glándula mamaria y, opcionalmente, a otros elementos regula-20 dores. Los promotores adecuados y otros elementos incluyen, pero sin limitación, los derivados de WAP corto y largo de mamífero, alfa-, beta-, y kappa-caseina, alfa- y beta-lactoglobulina, genes beta-CN 5', así como el promotor del virus del tumor de mama de ratón (MMTV). Estos promotores y otros elementos pueden obtenerse a par-tir de cualquier mamífero incluyendo, pero sin limitación, vacas, cabras, ovejas, cer-25 dos, ratones, conejos y cobayas. Se proporcionan promotores y otras secuencias re-guladoras, vectores y otras enseñanzas relevantes, por ejemplo, por Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Jost et al. (1999) Nat Biotechnol 17:160-4; Patentes de Estados Unidos Nos. 5.994.616; 6.140.552; 6.013.857; Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kim et al. (1999) J Biochem (Japón) 126:320-5; Soulier et al. 30 (1999) Euro J Biochem 260:533-9; Zhang et al. (1997) Chin J Biotech 13:271-6; Rijnkels et al. (1998) Transgen Res 7:5-14; Korhonen et al. (1997) Euro J Biochem 245:482-9; Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen Res 6:75-84; Hitchin et al. (1996) Prot Expr Purif 7:247-52; Platenburg et al. (1994) Transgen Res 3:99-108; Heng-Cherl et al. (1993) Animal Biotech 4:89-107; y Christa et al. (2000) Euro J Biochem 267:1665-71. 35
Los polipéptidos de la invención se pueden producir en la leche mediante la in-troducción de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos en las células somáti-cas de la glándula mamaria in vivo, p.ej. en las células epiteliales secretoras mama-rias. Por ejemplo, el ADN plasmídico se puede infundir a través del canal del pezón, p.ej. en asociación con DEAE-dextrano (véase, p.ej., Hens et al. (2000) Biochim. 5 Biophys. Acta 1523:161-171), en asociación con un ligando que puede llevar a la en-docitosis mediada por receptores de la construcción (véase, p.ej., Sobolev et al. (1998) 273:7928-33), o en un vector viral tal como un vector retroviral, p.ej. el virus de la leu-cemia del mono gibón (véase, p.ej., Archer et al. (1994) PNAS 91:6840-6844). En cualquiera de estas realizaciones, el polinucleótido puede estar unido operativamente 10 a un promotor específico de la glándula mamaria, como se ha descrito antes, o, alter-nativamente, a cualquier promotor fuertemente expresado tal como CMV o MoMLV LTR.
La idoneidad de cualquier vector, promotor, elemento regulador, etc., para uso en la presente invención se puede evaluar de antemano por transfección de células 15 tales como células epiteliales mamarias, p.ej., células MacT (células epiteliales mama-rias bovinas) o células GME (células epiteliales mamarias de cabra), in vitro y eva-luando la eficacia de la transfección y expresión del transgén en las células.
Para la administración in vivo, los polinucleótidos se pueden administrar en cualquier formulación adecuada, en cualquiera de varias concentraciones (p.ej., 1-500 20 µg/ml, preferiblemente 50-100 µg/ml), en cualquier volumen (p.ej.: 1-100 ml, preferi-blemente 1 a 20 ml), y se puede administrar cualquier número de veces (p.ej., 1, 2, 3, 5, ó 10 veces), con cualquier frecuencia (p.ej., cada 1, 2, 3, 5, 10, o cualquier número de días). Las concentraciones, frecuencias, modos de administración, etc. adecuados dependerán del polinucleótido, vector, animal, etc. particular, y pueden ser determina-25 dos fácilmente por un experto en la técnica.
En una realización preferida, se usa un vector retroviral tal como el vector viral de la leucemia de mono gibón, tal como se describe en Archer et al. ((1994) PNAS 91:6840-6844). Como la infección retroviral típicamente requiere división celular, puede estimularse la división celular en la glándula mamaria junto con la administra-30 ción del vector, por ejemplo, usando un factor tal como benzoato de estradiol, proges-terona, reserpina o dexametasona. Además, la infección retroviral y otros métodos de infección pueden facilitarse usando compuestos auxiliares tales como polibreno.
En cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria para obtener polipéptidos OBG3 de la leche, la cantidad de leche obtenida, y por tanto la cantidad 35 de polipéptidos OBG3 producidos, puede ser aumentada usando cualquier método estándar de inducción de la lactación, por ejemplo usando hexestrol, estrógenos, y/o progesterona.
Los polinucleótidos usados en tales realizaciones pueden codificar un polipép-tido OBG3 de tamaño completo o un fragmento del polipéptido gOBG3. Típicamente, 5 el polipéptido codificado incluirá una secuencia señal para asegurar la secreción de la proteína en la leche. Cuando se usa una secuencia de OBG3 de longitud completa, la proteína de longitud completa se puede aislar, p.ej., de la leche, y escindirla in vitro mediante el uso de una proteasa adecuada. De manera alternativa, se puede introdu-cir un segundo polinucleótido que codifica la proteasa en el animal o en las células de 10 la glándula mamaria, por lo que la expresión de la proteasa da como resultado la esci-sión del polipéptido OBG3 in vivo, lo que permite el aislamiento directo de los frag-mentos del polipéptido gOBG3 a partir de la leche.
V. Composiciones Farmacéuticamente o Fisiológicamente Aceptables de la 15 Invención
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención se pueden administrar a animales y/o a seres humanos, solos o en composiciones farmacéuticamente o fisioló-gicamente aceptables en las que se mezclan con vehículos o excipientes adecuados. Después, la composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se propor-20 ciona a una dosis terapéuticamente eficaz. Una dosis terapéuticamente eficaz se re-fiere a aquella cantidad de fragmento gOBG3 suficiente para dar resultados en la pre-vención o mejoría de los síntomas o estado fisiológico de enfermedades o trastornos relacionados con la obesidad como se determina por los métodos descritos en la pre-sente memoria. Una dosis terapéuticamente eficaz se puede referir también a la canti-25 dad de fragmento OBG3 necesaria para una reducción de peso o una prevención de un aumento de peso, o la prevención de un aumento del ritmo de ganancia de peso en personas que desean este efecto por razones cosméticas. Una dosificación terapéuti-camente eficaz de un fragmento de gOBG3 de la invención es la dosis que es ade-cuada para potenciar la pérdida de peso o el aumento de peso con un uso o adminis-30 tración periódica continuada. Las técnicas para la formulación y administración de fragmentos del polipéptido OBG3 se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Otras enfermedades o trastornos que en las que los fragmentos del polipéptido OBG3 de la invención se podrían usar para tratarlas o prevenirlas incluyen, pero sin 35 limitación, la obesidad y las enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ate-roesclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes me-llitus insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas 5 con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a ser tratados con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia e hiperuricemia. Otras enfer-10 medades o trastornos adicionales de la invención relacionados con la obesidad inclu-yen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia, y bulimia. Los fragmentos del polipéptido gOBG3 pueden ser usados también para mejorar el rendimiento físico durante el trabajo o ejercicio o mejorar una sensación de bienestar general. Las actividades de rendimiento 15 físico incluyen andar, correr, saltar, ascender y/o escalar.
Los fragmentos del polipéptido gOBG3 o los antagonistas de los mismos se pueden usar también para tratar la dislexia, el trastorno de déficit de atención (ADD), el trastorno de hiperactividad con déficit de atención (ADHD), y los trastornos psiquiátri-cos tales como esquizofrenia, mediante la modulación del metabolismo de los ácidos 20 grasos, más específicamente, la producción de ciertos ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
Se considera expresamente que los fragmentos del polipéptido gOBG3 descri-tos de la invención se pueden proporcionar solos o en combinación con otros com-puestos farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables. Actualmente se conocen 25 bien en la técnica otros compuestos útiles para el tratamiento de la obesidad y otras enfermedades y trastornos.
En una realización preferida, los fragmentos del polipéptido gOBG3 son útiles y se usan en el tratamiento de la resistencia a la insulina y en la diabetes usando méto-dos descritos en la presente memoria, y conocidos en la técnica. Más en particular, 30 una realización preferida se refiere a un proceso para la modificación y regulación te-rapéutica del metabolismo de la glucosa en un sujeto animal o humano, que com-prende administrar a un sujeto que necesita tratamiento (como alternativa, en una base temporizada diaria) un fragmento del polipéptido OBG3 o OBG (o polinucleótido que codifica dicho polipéptido) en una cantidad de dosificación y durante un periodo de 35 tiempo suficiente para reducir los niveles plasmáticos de glucosa en dicho sujeto ani-mal o humano.
Otras realizaciones preferidas se refieren a métodos para la profilaxis o trata-miento de la diabetes que comprenden administrar a un sujeto que necesita trata-miento (como alternativa en una base temporizada diaria) un fragmento del polipéptido 5 OBG3 o OBG (o polinucleótido que codifica dicho polipéptido) en una cantidad de do-sificación y durante un periodo de tiempo suficiente para reducir los niveles plasmáti-cos de glucosa en dicho sujeto animal o humano.
Vías de administración.
Las vías de administración adecuadas incluyen administración oral, nasal, rec-10 tal, transmucosa o intestinal, liberación parenteral, que incluye inyecciones intramus-culares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventri-culares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, intrapulmonares (inhaladas) o intraoculares usando métodos conocidos en la técnica. Un método parti-cularmente útil para administrar los compuestos para estimular la pérdida de peso in-15 cluye la implantación quirúrgica, por ejemplo en la cavidad abdominal del receptor, de un dispositivo para liberar fragmentos del polipéptido OBG3 o gOBG3 durante un ex-tenso periodo de tiempo. Otras vías particularmente preferidas de administración son los aerosoles y la formulación de depósito. Se contemplan expresamente formulacio-nes de liberación sostenida, particularmente de depósito, de los medicamentos de la 20 presente invención.
Composición/Formulación
Las composiciones y medicamentos farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables para uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de ma-nera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que com-25 prenden excipientes y auxiliares. Una formulación apropiada depende de la vía de ad-ministración elegida.
Algunos de los medicamentos descritos en la presente memoria incluirán un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable y al menos un polipéptido que es un fragmento del polipéptido OBG3 de la invención. Para inyección, los agen-30 tes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico, tal como un tampón fosfato o bicarbonato. Para administración transmucosa, se usan en la formulación, agentes penetrantes apropia-dos para la barrera a atravesar. Dichos agentes penetrantes son generalmente cono-35 cidos en la técnica.
Las preparaciones farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables que se pueden tomar oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cáp-sulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbi-tol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con 5 agentes de carga tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubri-cantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para ad-10 ministración oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de com-primidos o comprimidos para chupar formulados de una manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se administran convencionalmente en forma de una presenta-15 ción de pulverización en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor gaseoso adecuado, por ejemplo, dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para liberar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina, para uso en un inhalador o insuflador, pueden formularse de manera que 20 contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyec-ción, p.ej., por inyección rápida o por perfusión continua. Las formulaciones para in-yección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en 25 ampollas o recipientes multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspen-sión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables para ad-30 ministración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabili-zantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para 35 permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo o liofili-zado para la constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin piróge-nos, antes del uso.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos pueden 5 ser formulados también como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía sub-cutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio 10 iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal mode-radamente soluble.
Adicionalmente, los compuestos se pueden administrar usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sóli-dos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diferentes materiales de 15 liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Dependiendo de su naturaleza química, las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los compuestos durante un periodo de unas semanas a más de 100 días.
Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo te-rapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de las 20 proteínas.
Las composiciones farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables pueden comprender también vehículos o excipientes adecuados sólidos o en fase de gel. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitación, carbonato cál-cico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y 25 polímeros tales como polietilenglicoles.
Dosificación Eficaz.
Las composiciones farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables adecua-das para uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingre-dientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el fin para el 30 que están destinadas. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo o aliviar los síntomas existen-tes del sujeto a ser tratado. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la vista de la descrip-ción detallada proporcionada en la presente memoria. 35
Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis tera-péuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones circulantes que incluye o comprende un punto o inter-valo de concentraciones que, según se ha demostrado, aumenta la absorción o unión 5 de leptina o lipoproteína en un sistema in vitro. Tal información se puede usar para determinar más exactamente las dosis útiles en los seres humanos.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto que produce una mejoría de los síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuti-10 cos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, p.ej., para de-terminar la LD50, (la dosis letal para el 50% de la población de ensayo) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los efectos terapéuticos es el índice terapéutico y se puede ex-presar como la relación entre LD50 y ED50. Se prefieren los compuestos que presen-15 tan altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis para uso en los seres humanos. La dosis de tales compuestos está preferiblemente dentro de un intervalo de concentra-ciones circulantes que incluyen la ED50, con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede 20 variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden ser elegidas por cada médico a la vista de la afección del paciente. (véase, p.ej., Fingl et al, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1). 25
La cantidad de dosis y el intervalo se pueden ajustar individualmente para pro-porcionar niveles plasmáticos del compuesto activo que sean suficientes para mante-ner o prevenir la pérdida o ganancia de peso, dependiendo de la situación particular. Las dosis necesarias para alcanzar estos efectos dependerán de las características del individuo y de la vía de administración. 30
Los intervalos de dosis se pueden determinar también usando el valor de la concentración eficaz mínima. Los compuestos se deben administrar usando un régi-men que mantiene los niveles plasmáticos por encima de la concentración eficaz mí-nima durante 10-90 % del tiempo, preferiblemente entre 30-90 %; y lo más preferible-mente entre 50-90 %. En los casos de administración local o absorción selectiva, la 35 concentración local eficaz del fármaco puede que no esté relacionada con la concen-tración plasmática.
La cantidad de composición administrada dependerá naturalmente, del sujeto a ser tratado, del peso del sujeto, de la gravedad de la afección, de la manera de admi-nistración y del criterio del médico prescriptor. 5
Un intervalo de dosificación preferido para la cantidad de un fragmento del polipéptido OBG3 de la invención, que se puede administrar diariamente o de manera regular para conseguir los resultados deseados, que incluyen una reducción en los niveles de lipoproteínas circulantes en plasma ricas en triglicéridos, varía de 0,01 - 0,5 mg/kg de masa corporal. Un intervalo de dosificación más preferido es de 0,05 - 0,1 10 mg/kg. Naturalmente, estas dosis diarias pueden ser liberadas o administradas en pequeñas cantidades periódicamente a lo largo de un día. Debe tenerse en cuenta que estos intervalos de dosificación son sólo intervalos preferidos y no se pretende que sean limitantes de la invención.
15
VI. Métodos de tratamiento
El tratamiento de ratones con fragmentos del polipéptido gOBG3 da como re-sultado la reducción de los niveles de triglicéridos, la reducción de los niveles de áci-dos grasos libres, la reducción de los niveles de glucosa, y la reducción del peso cor-poral así como un aumento de la oxidación muscular. 20
La invención se refiere, entre otras cosas, a métodos para prevenir o tratar en-fermedades y trastornos relacionados con la obesidad, que comprenden proporcionar a un individuo que necesita dicho tratamiento un fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención. Preferiblemente, el fragmento del polipéptido OBG3 tiene actividad rela-cionada con la obesidad, ya sea in vitro o in vivo. Preferiblemente el fragmento del 25 polipéptido OBG3 se proporciona al individuo en una composición farmacéutica que preferiblemente se toma oralmente. Preferiblemente el individuo es un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano. En las realizaciones preferidas, la enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en ate-roesclerosis, enfermedad cardiovascular, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a 30 la insulina, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes tipo I, diabetes tipo II y diabetes lipoatrófica. Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar me-diante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros 35 trastornos relacionados con la obesidad a tratar con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, e hiperuricemia. Otras enfermedades o trastornos adicionales de la invención relacionados con la obesidad incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con neoplasia, anorexia, y bulimia. En las realizaciones sumamente preferidas, se 5 usan los fragmentos del polipéptido OBG3 en composiciones farmacéuticas para mo-dular el peso corporal en individuos sanos por razones cosméticas.
La invención también se refiere a un método para prevenir o tratar enfermeda-des y trastornos relacionados con la obesidad, que comprende proporcionar a un indi-viduo que necesita dicho tratamiento un compuesto identificado mediante los ensayos 10 de la invención (descritos en la Sección VI de las Realizaciones Preferidas de la In-vención y en los Ejemplos). Preferiblemente, estos compuestos antagonizan o agoni-zan los efectos de los fragmentos del polipéptido gOBG3 en las células in vitro, mús-culos ex vivo, o en modelos animales. Alternativamente, estos compuestos agonizan o antagonizan los efectos de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre la absorción 15 y/o unión de la leptina y/o lipoproteína. Opcionalmente, estos compuestos previenen la interacción, unión, o absorción de los fragmentos del polipéptido gOBG3 con LSR in vitro o in vivo. Preferiblemente, el compuesto se proporciona al individuo en una com-posición farmacéutica que preferiblemente se toma oralmente. Preferiblemente el indi-viduo es un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano. En las realizaciones 20 preferidas, la enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en obesidad y enfermedades y trastornos relacionados con la obe-sidad tales como ateroesclerosis, cardiopatía, tolerancia alterada a la glucosa, resis-tencia a la insulina, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes tipo I, diabetes tipo II, y diabetes lipoatrófica. Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar me-25 diante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero sin limitación, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, y tensión arterial alta. Otros trastornos relacionados con la obesidad a tratar con los compuestos de la invención incluyen hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, e hiperuricemia. Otras enfermedades o 30 trastornos adicionales de la invención relacionados con la obesidad incluyen caquexia, consunción, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con neoplasia, anorexia, y bulimia. En realizaciones muy preferidas, las composiciones farmacéuticas se usan para modular el peso corporal por razones cosméticas.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-35 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar la glucosa sanguínea en ciertos individuos, en particular aquellos con diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, en combinación con la tera-pia de insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-5 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar el peso corporal en ciertos individuos, en particular aquellos con diabe-tes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, en combinación con la terapia de insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-10 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar la glucosa sanguínea en ciertos individuos, en particular aquellos con diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, sola, sin combinación con la terapia de insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-15 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para controlar el peso corporal en ciertos individuos, en particular aquellos con diabe-tes tipo II o resistencia a la insulina, sola, sin combinación con la terapia de insulina.
En una realización más preferida, la presente invención se puede usar en tera-pia complementaria, en particular en ciertos individuos, en particular aquellos con 20 diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, para mejorar su peso o el control de la glucosa en combinación con un secretagogo de insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina. Preferiblemente, el secretagogo de insulina oral es fuma-rato de 1,1-dimetil-2-(2-morfolinofenil)guanidina (BTS67582) o una sulfonilurea selec-cionada entre tolbutamida, tolazamida, clorpropamida, glibenclamida, glimepirida, gli-25 pizida y glidazida. Preferiblemente, el agente de sensibilización a la insulina se selecciona entre metformina, ciglitazona, troglitazona y pioglitazona.
La presente invención proporciona además un método para mejorar el peso corporal o el control de la glucosa de ciertos individuos, en particular aquellos con diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, sólo, sin un secretagogo de 30 insulina oral o un agente sensibilizante a la insulina.
En otra realización preferida, la presente invención puede administrarse con-comitante o conjuntamente con el secretagogo de insulina oral o el agente de sensibi-lización a la insulina, por ejemplo, en forma de unidades de dosificación separadas a usar simultáneamente, por separado o secuencialmente (antes o después del secreta-35 gogo o antes o después del agente de sensibilización). Por lo tanto, la presente inven-ción proporciona además una composición farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable y un secretagogo de insulina oral o agente sensibilizante a la insulina como preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial para la mejora del peso corporal o el control de la glucosa en ciertos individuos, en particular aquellos 5 con diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable proporciona además un método para el uso como un agente sensibilizador a la insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-10 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para mejorar la sensibilidad a la insulina en ciertos individuos, en particular aquellos con diabetes tipo I, diabetes tipo II, o resistencia a la insulina, en combinación con la terapia de insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-15 ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable se puede usar como método para mejorar la sensibilidad a la insulina en ciertos individuos, en particular aquellos con diabetes tipo II o resistencia a la insulina, sin la terapia de insulina.
En las realizaciones más preferidas, la presente invención de dicha composi-ción farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable proporciona además un método 20 para el uso como inhibidor de la progresión de la tolerancia alterada a la glucosa hasta la resistencia a la insulina. Más en general, la presente invención se refiere al trata-miento con fragmentos del polipéptido gOBG3 cuando se demuestra que un individuo tiene un genotipo particular para un marcador APM1 (APM1 designa el homólogo humano del polipéptido OBG3 de longitud completa), o cuando se ha demostrado que 25 tiene una cantidad reducida de APM1 plasmático, ya sea de longitud completa o prefe-riblemente un fragmento más biológicamente activo de APM1, en comparación con los valores de control, p.ej. los valores representativos de individuos sin enfermedad, o en comparación con ese individuo antes de la aparición de una enfermedad o afección. En cualquier caso, el tratamiento comprende proporcionar fragmentos del polipéptido 30 OBG3 o gOBG3 farmacéuticamente aceptables al individuo. La cantidad exacta de fragmento gOBG3 proporcionada se debe determinar mediante ensayos clínicos bajo la dirección de médicos cualificados, pero es de esperar que esté en el intervalo de 5-7 mg por individuo al día. En general, un intervalo preferido debe variar de 0,5 a 14 mg por individuo al día, siendo un intervalo altamente preferido entre 1 y 10 mg por indivi-35 duo al día. Los individuos que se podrían beneficiar del tratamiento con fragmentos del polipéptido OBG3 o gOBG3 se pueden identificar por dos métodos al menos: determi-naciones del nivel en suero plasmático y caracterización del genotipo.
Niveles de OBG3/APM1
Los estudios preliminares han demostrado que las personas obesas tienen 5 niveles más bajos de OBG3/APM1 de longitud completa que las personas no obesas. La invención prevé el tratamiento de individuos (preferiblemente obesos) que tienen niveles bajos de OBG3/APM1 de longitud completa con fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención. Además, la invención se refiere preferiblemente al tratamiento de individuos con niveles bajos del fragmento biológicamente activo de OBG3/APM1 10 con fragmentos del polipéptido gOBG3 de la invención. En las realizaciones adicionales, los fragmentos del polipéptido OBG3 o OBG3 de la presente invención se administran a los individuos, preferiblemente individuos obesos, cuyos niveles de OBG3 de longitud completa (o de manera alternativa un fragmento del polipéptido OBG3 maduro) son al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 15 alrededor de 100% o 100% menores que en los individuos que no son obesos, preferiblemente individuos sanos tal como lo determina un médico mediante el uso de patrones normales en la técnica. Los métodos para determinar y comparar los niveles de OBG3 de longitud completa en individuos se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación, el uso de un anticuerpo específico para APM1 en un formato tal 20 como un radioinmunoensayo, ELISA, transferencia de Western, transferencia puntual, o como parte de una matriz, por ejemplo. Los métodos para generar anticuerpos hacia, y para la detección de, APM1 y los fragmentos del mismo así como para proteínas con SNPs se incluyen en la presente invención, y se discuten en el documento PCT/IB99/01858, solicitud de EE.UU. nº 09/434.848, y el documento WO 99/07736. 25 Además, los anticuerpos específicos para los fragmentos del polipéptido OBG3/gOBG3 de la invención, su generación, y su uso se describen en la presente memoria.
VII. Ensayos para Identificar Moduladores de la Actividad de los Fragmentos del 30 Polipéptido OBG3
En la presente memoria se describen métodos para cribar en busca de uno o más compuestos que modulen la actividad de los fragmentos del polipéptido gOBG3 en las células, que incluye proporcionar a las células los compuestos potenciales a ensayar, y en los que la modulación del efecto o la actividad de un fragmento del poli-35 péptido gOBG3 indica el/los compuesto(s). Los ensayos ejemplares que se pueden usar se describen en los Ejemplos 4-5, 7-14, 16, y 18. En estos ensayos se añadirían los compuestos a ensayar con respecto a su actividad inhibidora o estimuladora en comparación con los efectos del fragmento del polipéptido gOBG3 solo. También se pueden usar otros ensayos en los que se observa un efecto basado en la adición de 5 un fragmento del polipéptido gOBG3 para cribar en busca de moduladores de la activi-dad del fragmento del polipéptido gOBG3 o los efectos de la presencia del fragmento del polipéptido gOBG3 sobre las células. La etapa esencial es aplicar un compuesto desconocido y después monitorizar en un ensayo el cambio con respecto a lo que se observa cuando se aplica solamente el fragmento del polipéptido gOBG3 a la célula. 10 Un cambio se define como algo que es significativamente diferente en presencia del compuesto más el fragmento del polipéptido gOBG3 en comparación con el fragmento del polipéptido gOBG3 solo. En este caso, sería significativamente diferente un "au-mento" o una "disminución" en un efecto medible de al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. 15
El término "modulación", como se usa en la presente memoria, se refiere a un cambio medible en una actividad. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, modula-ción de receptores estimulados por lipolisis (LSR), modulación de leptina, modulación de lipoproteínas, niveles plasmáticos de FFA, oxidación de FFA, niveles de TG, niveles de glucosa y peso. Estos efectos pueden ser in vitro o preferiblemente in vivo. La mo-20 dulación de una actividad puede ser un aumento o una reducción de la actividad. De esta manera, la actividad de LSR puede aumentarse o disminuirse, la actividad de la leptina puede aumentarse o disminuirse y la actividad de lipoproteínas puede aumen-tarse o disminuirse. De manera similar, los niveles de FFA, TG y glucosa (y el peso) pueden aumentarse o disminuirse in vivo. La oxidación de ácidos grasos libres puede 25 aumentarse o disminuirse in vivo o ex vivo.
Por actividad de "LSR" se entiende la expresión de LSR sobre la superficie de la célula, o en una conformación particular, así como su capacidad para unir, absorber, y degradar la leptina y la lipoproteína. Por actividad de "leptina" se entiende su unión, absorción y degradación por LSR, así como su transporte a través de la barrera 30 hematoencefálica, y potencialmente estas incidencias cuando LSR no es necesaria-mente el factor mediador o el único factor mediador. Similarmente, por actividad de "lipoproteína" se entiende su unión, absorción y degradación por LSR, así como estas incidencias cuando LSR no es necesariamente el factor mediador o el único factor mediador. Se proporcionan ensayos ejemplares en el Ejemplo 4-5, 7-14, 16, y 18. Es-35 tos ensayos y otros ensayos comparables se pueden usar para determinar/identificar los compuestos que modulan la actividad de los fragmentos del polipéptido gOBG3. En algunos casos, puede ser importante identificar compuestos que modulan algunas pero no todas las actividades de los fragmentos del polipéptido gOBG3, aunque prefe-riblemente se modifican todas las actividades. 5
El término "aumentar", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de un compuesto de aumentar la actividad de un fragmento del polipéptido gOBG3 de cierta manera medible en comparación con el efecto de un fragmento del polipéptido gOBG3 en su ausencia. Como resultado de la presencia del compuesto, podría aumentar la unión y/o la absorción de leptina, por ejemplo, en comparación con 10 los controles en presencia del fragmento del polipéptido gOBG3 solo. Preferiblemente, un aumento de actividad es un aumento de al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% en comparación con el nivel de actividad en pre-sencia del fragmento del polipéptido gOBG3.
De manera similar, el término "disminuir", como se usa en la presente memoria, 15 se refiere a la capacidad de un compuesto de disminuir la actividad de alguna manera medible en comparación con el efecto de un fragmento de gOBG3 en su ausencia. Por ejemplo, la presencia del compuesto reduce las concentraciones plasmáticas de FFA, TG y glucosa en ratones. Además, como resultado de la presencia de un compuesto, puede disminuir la unión y/o la absorción de leptina, por ejemplo, en comparación con 20 los controles en presencia del fragmento del polipéptido gOBG3 solo. Preferiblemente, una disminución de actividad es una disminución de al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% en comparación con el nivel de activi-dad en presencia del fragmento del polipéptido gOBG3 solo.
En la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto 25 potencial para modular la masa corporal en individuos que necesitan una modulación de la masa corporal, que comprende: a) poner en contacto una célula con un frag-mento del polipéptido gOBG3 y un compuesto candidato; b) detectar un resultado se-leccionado del grupo que consiste en la modulación de LSR, la modulación de leptina, la modulación de lipoproteínas, la modulación de la oxidación de FFA; y c) donde di-30 cho resultado identifica dicho compuesto potencial si dicho resultado difiere del resul-tado obtenido cuando dicha célula se pone en contacto con el fragmento del polipép-tido gOBG3 solo.
En realizaciones preferidas, dicha puesta en contacto comprende además un ligando de dicho LSR. Preferiblemente, dicho ligando se selecciona del grupo que 35 consiste en citocinas, lipoproteínas, ácidos grasos libres, y C1q, y más preferiblemente dicha citocina es leptina, y lo más preferiblemente dicha leptina es un fragmento poli-peptídico de leptina tal como se describe en la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/155.506.
En otras realizaciones preferidas, dicho fragmento del polipéptido gOBG3 es de 5 ratón o es de humano. En otras realizaciones preferidas, dicha célula se selecciona entre el grupo consistente en PLC, CHO-K1, Hep3B y HepG2.
En otra realización preferida, dicha modulación de lipoproteína se selecciona entre el grupo consistente en la unión, absorción y degradación. Preferiblemente, di-cha modulación es un aumento de dicha unión, absorción o degradación. Como alter-10 nativa, dicha modulación es una reducción de dicha unión, absorción o degradación.
En otras realizaciones preferidas, la modulación de leptina se selecciona entre el grupo consistente en la unión, absorción, degradación y transporte. Preferiblemente, dicha modulación es un aumento de dicha unión, absorción, degradación o transporte. Como alternativa, dicha modulación es una reducción de dicha unión, absorción, de-15 gradación o transporte. Preferiblemente, dicho transporte es a través de la barrera hematoencefálica.
En otras realizaciones preferidas, dicha modulación de LSR es la expresión en la superficie de dicha célula. Preferiblemente, dicha detección comprende FACS, más preferiblemente dicha detección comprende además anticuerpos que se unen especí-20 ficamente a dicho LSR, y aún más preferiblemente dichos anticuerpos se unen especí-ficamente al extremo carboxi de dicho LSR.
En otras realizaciones preferidas, dicho compuesto potencial se selecciona en-tre el grupo consistente en péptidos, bibliotecas de péptidos, bibliotecas no peptídicas, peptoides, ácidos grasos, lipoproteínas, medicamentos, anticuerpos, moléculas pe-25 queñas y proteasas. Otras características y ventajas de la invención se describen en la Breve Descripción de las Figuras y en los Ejemplos. Estos son a título de ejemplos solamente, y no limitan la invención de ningún modo. A lo largo de esta solicitud, se citan diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patentes publicadas.
30
VIII. Ensayos para Identificar Antagonistas de la Actividad de Fragmentos del Polipéptido gOBG3 Homotriméricos
En la presente memoria se describen métodos para cribar compuestos en busca de uno o más antagonistas de la actividad de los fragmentos del polipéptido gOBG3 homotriméricos, en los que dicha actividad se selecciona, pero sin limitación, 35 de la reducción de peso, reparto de lípidos, metabolismo lipídico, y actividad similar a la insulina. Preferiblemente, dicho compuesto se selecciona, pero sin limitación, de un compuesto orgánico o inorgánico de bajo peso molecular, proteína, péptido, carbohi-drato, o lípido. Dicho fragmento del polipéptido gOBG3 preferido que forma homotrí-meros que tienen dicha actividad se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 5 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, de SEQ ID NO:2, en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína. Otro fragmento del polipéptido gOBG3 preferido que forma homotrímeros que tienen dicha actividad se selecciona de los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, o 10 42-244 de SEQ ID NO:2.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no como me-dios de limitación. 15
Se debería observar que la expresión polipéptido OBG3 de longitud completa usada a lo largo de la memoria descriptiva pretende abarcar los homólogos de la pro-teína de ratón ACRP30 [Scherer, et al., "A novel serum protein similar to Clq, produced exclusively in adipocytes"; J Biol Chem 270, 26746-26749 (1995)], AdipoQ de ratón [Hu, et al, "AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity", J Biol 20 Chem 271, 10697-10703 (1996)], APM1 humano [Maeda, et al, "cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen-like factor, APM1 (AdiPose Most abundant Gene transcript 1)", Biochem Biophys Res Commun 221, 286-289 (1996)] y GBP28 humano [Nakano, et al, "Isolation and characterization of GBP28, a novel gelatin-binding protein purified from human plasma", J Biochem (Tokio) 120, 803-812 25 (1996)]. OBG3 pretende abarcar también otros homólogos. Se entiende que gOBG3 se refiere a fragmentos polipeptídicos del polipéptido OBG3 de longitud completa que consisten en el dominio globular.
EJEMPLO 1: Producción de OBG3 recombinante 30
A continuación se detalla un método a título de ejemplo para generar el OBG3 recombinante. Aunque el método describe la producción del análogo de ratón, una persona experta en la técnica debería ser capaz de usar la información proporcionada para producir otros análogos de OBG3, que incluyen, pero sin limitación, el análogo humano. En la Fig. 1 se muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos 35 del OBG3 humano (apm1) y de ratón (AdipoQ y acrp30).
El análogo de OBG3 recombinante se clona en pTRC His B (Invitrogen) entre BamH1 y Xhol (Fig. 2) y se mantiene en E.coli DH5-alfa. La secuencia del inserto de OBG3 corresponde a ACRP30 genbank U37222, bases 88 a 791, excepto en la posición 382 en la que en #3 G reemplaza a A hallado en ACRP 30 (V en vez de M). 5 El correspondiente nucleótido en AdipoQ U49915 es G como en el clon #3. El aminoácido V se conserva también en la secuencia humana APM1 D45371.
Cultivo:
Poner en placas las bacterias en medio agar LB que contiene 100 µg/mL de ampicilina. Inocular 1 colonia en 5 ml de medio (sin agar) a 37°C durante la noche. 10 Añadir 2 ml de este cultivo inicial a matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen 200 ml de medio LB y 100 µg/mL de ampicilina. Incubar a 37°C en un agitador orbital hasta que la OD600 = 0,2. Añadir IPTG hasta una concentración final de 1 mM (solución de reserva = 1 M). Incubar a 37ºC durante la noche.
Lisis: 15
Sedimentar las bacterias mediante centrifugación (Sorvall, 3500 rpm, 15 min, 4°C) en un tubo pre-pesado.
A 4°C resuspender el sedimento en 3 ml/g de tampón de lisis
Añadir 40 µL/g de PMSF 10 mM
Añadir 80 µL/g de lisozima a 10 mg/ml 20
Incubar durante 20 min sobre hielo, agitando intermitentemente
Añadir 30 µL/g de desoxicolato de sodio al 10%
Incubar a 37ºC hasta que el lisado sea viscoso
Congelar en nitrógeno líquido y descongelar a 37°C tres veces
Sonicar 2X, 30 segundos, ciclo a 25 %, nivel 2,5 de potencia 25
Centrifugar 30 min, 15000 rpm, 4ºC
Recoger el sobrenadante
Nota: El lisado se puede conservar congelado antes de la etapa de sonicación.
Purificación del lote:
1. Empaquetar 1 ml de resina Probond (Invitrogen; 1 ml = 2 ml de gel sus-30 pendido) en una columna de 5 ml. Lavar con 5 ml de PBS.
2. Aplicar 5 ml de sobrenadante bacteriano a dicho 1 ml de gel. (Si el volu-men es muy alto, usar varias columnas pequeñas)
3. Lavar con 24 ml de tampón fosfato, pH 7,8, seguido por un lavado con 24 ml de tampón fosfato, pH 6. 35
4. Eluir con tampón de imidazol y recoger fracciones de 1 ml.
5. Analizar las fracciones mediante OD a 280 nm o mediante SDS-PAGE (12,5%; dilución ½ en tampón de muestras 2X) en condiciones reductoras (100ºC, 5 min)
6. Mezclar las fracciones que contienen proteína (normalmente los núme-5 ros de fracción 2-4 para las concentraciones de 0,8 - 1 mg/mL y las fracciones 1,5 y 6 para las concentraciones de 0,2 - 0,4 mg/mL).
7. Dializar a fondo con PBS 1X, bicarbonato amónico 24 mM o Tris 50 mM, pH 7,4 que contiene NaCl 250 nM. Concentrar mediante Speed-Vac si fuera ne-cesario. 10
8. Analizar las proteínas por el método Lowry.
9. Alicuotar y almacenar a -20ºC.
Sistema de purificación por cromatografía de líquidos
1. Empaquetar 5 ml de resina Probond en una columna de 5 ml.
2. Lavar con 4 volúmenes del lecho de tampón fosfato pH 7,8, 1 ml/min. 15
3. Inyectar 25 mL de lisado (filtrado con 0,45 µ o centrifugado a 3000 rpm, 30 min, 4ºC, Beckman Allegra 6R) a 0,5 mL/min.
4. Lavar con 4 volúmenes de lecho de tampón fosfato, pH 7,8 a 1 ml/min.
5. Lavar con 12 volúmenes de lecho de tampón fosfato pH 5,5 a 1 ml/min.
6. Eluir la fracción unida con tampón fosfato, pH 5,5, que contiene imidazol 20 1 M a 1 ml/min.
7. Recoger las fracciones, dializar y analizar las proteínas como se ha des-crito para la purificación del lote, etapas 7-9.
EJEMPLO 2: Generación de OBG3 Globular Mediante Escisión Enzimática 25
Incubar el OBG3 purificado (obtenido como se ha descrito anteriormente o por medio de un método equivalente) con tripsina acetilada-tipo V-S procedente de pán-creas bovino (Sigma E.C. = 3.4.21.4) a 400 u/mg de proteína a 25°C durante 10 min.
Parar la reacción pasando la muestra por una columna Poli-Prep (Biorad 731-1550) a + 4°C que contiene un inhibidor de tripsina inmovilizado. 30
Recoger fracciones de 1,0 ml. Determinar la concentración de proteína.
Reunir las fracciones que contienen proteína y dializar exhaustivamente con PBS usando un tubo de diálisis con un umbral de P.M. = 10.000 da.
Concentrar sobre un filtro Amicon YM-10 Centricon (Millipore, umbral de P.M. = 10.000 da). 35
Determinar la concentración final de proteína usando el procedimiento de Lowry modificado por Markwell (1981) o el ensayo BCA de proteínas (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) y BSA como estándar.
Comprobar la pureza y la eficacia de la escisión por análisis de SDS-PAGE usando un gel con gradiente 4-20 %. El OBG3 intacto migra como una banda simple a 5 aproximadamente 37 kDa aparentemente debido a las secuencias del vector co-trans-critas unidas a la cola de histidina en el extremo N-terminal de AdipoQ, y forma un dímero a 74 kDa. El OBG3 escindido forma una banda a aproximadamente 18 kda (gOBG3). También se generan productos de degradación adicionales, todos menores de 10 kda a partir de la región N-terminal. Estos se separan de la banda de 18 kDa 10 deseada por diálisis con membranas semipermeables con un umbral de PM de 10.000. Los dos sitios potenciales de escisión para gOBG3 se muestran en la Fig. 3. El sitio de escisión real ha sido identificado como el que está después del aminoácido 103 (aminoácido 100 para el gOBG3 humano o APM1) (Fig. 7). Esto es, el extremo N-terminal del producto de escisión de gOBG3 es Lys 104 (Lys 101 para el gOBG3 15 humano o APM1).
Se pueden usar otros métodos enzimáticos/proteolíticos que producen un fragmento del polipéptido gOBG3 preferido, p.ej. clostripaína, adipsina, plasmina, co-lagenasa, metaloproteinasa-1 de la matriz (MMP-1), o la proteasa que procesa prece-rebelina. Otras enzimas preferidas deberían preferiblemente escindir el OBG3 en un 20 sitio próximo a la unión entre la cola tipo colágeno y la cabeza globular (aproximada-mente el aminoácido 108 para el gOBG3 humano y aproximadamente el aminoácido 111 para el gOBG3 murino), preferiblemente deberían permitir que la reacción sea parada fácilmente, preferiblemente que sea separado fácilmente usando un inhibidor inmovilizado, o un método similar, y preferiblemente corta el fragmento N-terminal en 25 pequeñas piezas (menores que un PM de 10.000). La escisión ocurre preferiblemente en presencia de no más de 8 repeticiones de colágeno, más preferiblemente no más de 3 repeticiones de colágeno, y lo más preferiblemente sin repeticiones de colágeno. Una repetición de colágeno consiste en Gly-X-Y. La determinación de si se ha gene-rado un gOBG3 activo, se puede comprobar usando los ensayos in vitro e in vivo des-30 critos en la presente memoria, (Ejemplos 4-6, 8-10).
EJEMPLO 3: Generación de gOBG3 por metodología recombinante Clonación en el sitio de restricción
Una primera táctica es buscar sitios de restricción únicos cerca del comienzo 35 de la región de la cabeza globular (las secuencias de ácido nucleico de ratón y de po-lipéptidos OBG3 humanos se proporcionan en el listado de secuencias). Si están pre-sentes, se pueden usar para escindir dentro de la región similar a colágeno de 5' y generar un fragmento C-terminal compuesto de la región de la cabeza globular. Si no está presente un único sitio, es posible también, aunque más difícil, hacer esto usando 5 enzimas de restricción que cortan en más de una localización haciendo digestiones parciales. El extremo 3' de la cabeza globular puede ser cortado desde su vector de la cadena principal usando una enzima apropiada. La cabeza globular puede ser clonada entonces en un vector de expresión y se pueden identificar las estructuras artificiales que contienen los fragmentos correctos. Para AdipoQ, parece que la Tau I es la única 10 enzima que debería separar la cola del colágeno de la cabeza globular.
Clonación por PCR
Otra táctica es someter a PCR a la región de interés de la secuencia intacta (si el cADN está disponible) usando cebadores con sitios de restricción en el extremo de 15 forma que los productos de la PCR pueden ser clonados en vectores de interés. Alter-nativamente, el gOBG3 puede ser generado también usando RT-PCR para aislarlo del ARN del tejido adiposo.
Vector de E. coli 20
Por ejemplo, el dominio globular AdipoQ se puede clonar en pTrcHisB, po-niendo un sitio Bam HI en el oligo directo y un sitio Xho I en el oligo inverso. Esto per-mite el aislamiento del producto de la PCR, la digestión de dicho producto, y el enlace con el vector pTrcHisB que también ha sido digerido con Bam HI y Xho I (Fig. 4). El vector, pTrcHisB, tiene un cola de 6-Histidina en N-terminal, que permite la purificación 25 de la proteína sobreexpresada procedente del lisado usando una columna de resina Nickel. El vector pTrcHisB se usa para la sobre-expresión de proteínas en E. coli.
Los oligos a título de ejemplos para clonación en el vector de E. coli incluyen:
A) OBG3 directo CTTAGTGGATCCCGCTTATGTGTATCGCTCAG a 6 pares de bases desde la izquierda hay un sitio BamHI de 6 pb. Así la región que es homó-30 loga al gen empieza en el nucleótido 13.
B) OBG3 inverso GCTGTTCTCGAGTCAGTTGGTATCATGG a 6 pares de ba-ses desde la izquierda hay un sitio Xhol de 6 pb. Así la región que es homóloga al gen empieza en el nucleótido 13.
Lo que sigue son ejemplos de las condiciones de la PCR. 35
Las concentraciones finales de la reacción son:
1X de tampón A de PE Biosystems
MgCl2 1,5 mM
200 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
2,5 unidades de Amplitaq Gold de PE Biosystems 5
0,4 uM de cada cebador (directo e inverso)
10 ng de molde de plásmido
Parámetros de ciclo:
95ºC 10 min – 1 ciclo 10
95ºC 30 seg
56ºC 30 seg
72ºC 30 seg
repetir las 3 etapas anteriores durante 30 ciclos
72ºC 7 min — 1 ciclo. 15
Vector BAC
La cabeza globular también puede ser sobreexpresada en un sistema de Baculovirus usando el kit 6xHis Baculovirus (Pharmingen), por ejemplo. El dominio globular AdipoQ se clona en el vector apropiado usando enzimas disponibles en el 20 sitio de clonación múltiple. Esto permite la sobre-expresión de la proteína en un sistema eucariótico que tiene algunas ventajas sobre el sistema de E. coli, que incluye: expresión múltiple del gen, escisión del péptido señal, corte y empalme del intrón, transporte nuclear, proteína funcional, fosforilación, glucosilación, y acilación.
Los oligos a título de ejemplos para clonación en el vector de Baculovirus son 25 los siguientes:
A). OBG3 directo CTTAGTGAATTCGCTTATGTGTATCGCTCAGA a 6 pares de bases desde la izquierda hay un sitio EcoRI de 6 pb. Así la región que es homóloga al gen empieza en el nucleótido 13.
B). OBG3 inverso GCTGTTCTGCAGTCAGTTGGTATCATGG a 6 pares de ba-30 ses desde la izquierda hay un sitio PstI de 6 pb. Así la región que es homóloga al gen empieza en el nucleótido 13.
Lo que sigue son ejemplos de las condiciones de la PCR.
Las concentraciones finales de la reacción son: 35
1X de tampón A de PE Biosystems
MgCl2 1,5 mM
200 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
2,5 unidades de Amplitaq Gold de PE Biosystems
0,4 uM de cada cebador (directo e inverso) 5
10 ng de molde de plásmido
Parámetros de ciclo:
95ºC 10 min — 1 ciclo
95ºC 30 seg 10
60ºC 30 seg
72ºC 30 seg
repetir las 3 etapas anteriores durante 30 ciclos
72ºC 7 min — 1 ciclo.
15
Vector de un mamífero
El OBG3 globular puede ser clonado también en un vector de expresión de mamífero y puede ser expresado y purificado a partir de células de mamífero, por ejemplo células 3T3-L1 (precursoras de adipocitos indiferenciados). La cabeza globu-lar se genera entonces en un entorno muy próximo a su entorno endógeno. Sin em-20 bargo, este no es necesariamente el modo más eficaz de preparar la proteína.
EJEMPLO 4: Ensayos in vitro de la actividad relacionada con la obesidad
La actividad de diferentes preparaciones y diferentes variantes de la secuencia de los fragmentos del polipéptido gOBG3 se evalúa usando diferentes ensayos in vitro 25 que incluyen los que se indican a continuación. Estos ensayos son también ejemplos de los que se pueden usar para desarrollar antagonistas y agonistas del fragmento de polipéptido gOBG3. Para hacer esto, el efecto de los fragmentos del polipéptido gOBG3 en los ensayos anteriores, por ejemplo sobre la actividad de la leptina y/o LSR, en presencia de las moléculas candidatas se debe comparar con el efecto de los frag-30 mentos del polipéptido gOBG3 en los ensayos en ausencia de las moléculas candida-tos. Puesto que se ha demostrado que los fragmentos del polipéptido gOBG3 reducen el peso corporal en ratones con una dieta de cafetería (Ejemplo 5), estos ensayos sir-ven también para identificar los tratamientos candidatos para reducir (o aumentar) el peso corporal. 35
Línea de células hepáticas:
Los ensayos de eficacia de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre LSR se pueden realizar usando líneas de células hepáticas, que incluyen, por ejemplo, PLC, HepG2, Hep3B (humano), Hepa 1-6, BPRCL (de ratón), o MCA-RH777, MCA-5 RH8994 (de rata). Para líneas de células humanas, se deben usar preferiblemente APM1 y APM1 globular; para roedores, se deben usar preferiblemente AdipoQ/ACRP30 de longitud completa y globular.
Las células hepáticas de ratón BPRCL (depósito ATCC) se pusieron en placas a una densidad de 300.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM 10 (rico en glucosa) que contiene glutamina y penicilina-estreptomicina (Bihain y Yen, 1992). Se cambió el medio el día 2. El día 3, se lavaron las monocapas confluentes una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (2 ml/pocillo). Se incubaron las células a 37°C durante 30 min con concentraciones crecientes de AdipoQ (AQ) recombinante o AdipoQ globular (AQ-GH) en DMEM que contiene BSA al 15 0,2 % (p/v), Hepes 5 mM, CaCl2 2 mM, bicarbonato de sodio a 3,7 g/l, pH 7,5. Se con-tinuaron las incubaciones durante 3 h a 37°C después de la adición de 10 ng/ml de 125I-leptina de ratón (actividad específica, 22100 cpm/ng). Se lavaron las monocapas 2 veces consecutivamente con PBS que contiene BSA al 0,2 %, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y después 2 veces consecutivamente con PBS. Se lisaron las células 20 con NaOH 0,1 N que contiene EDTA 0,24 mM. Se recogieron los lisados en tubos, y se contaron en un contador gamma.
Los resultados de un experimento a título de ejemplo se muestran como la media de determinaciones triplicadas en la Fig.5.
Los resultados indican que los fragmentos del polipéptido gOBG3 son al menos 25 un 30 % más eficaces que el OBG3 para aumentar la absorción de leptina en una lí-nea celular hepática (Fig. 5). Este ensayo se puede usar para determinar la eficacia de los fragmentos del polipéptido gOBG3 y los compuestos relacionados (o agonistas o antagonistas) para aumentar o reducir la absorción de leptina en el hígado, así como el mecanismo por el que el fragmento/compuesto polipeptídico gOBG3 ejerce este 30 efecto.
Modelo de barrera hematoencefálica:
El efecto de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre el transporte de lep-tina en el cerebro se puede determinar usando células derivadas del cerebro. Un mé-35 todo que se prevé es usar el modelo de barrera hematoencefálica descrito por Dehouck, et al., "An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro", J Neurochem 54, 1798-1801 (1990) que usa un co-cultivo de células endoteliales capilares de cerebro y astrocitos para analizar los efectos de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre el transporte de leptina (u otras molécu-5 las) a través de LSR u otros receptores.
Este ensayo debería ser un indicador del efecto potencial de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre el transporte de leptina al cerebro y podría ser usado para seleccionar variantes de los fragmentos del polipéptido gOBG3 en cuanto a su capaci-dad de modular el transporte de leptina a través de LSR u otros receptores en el cere-10 bro. Además, también se podrían cribar usando este ensayo los supuestos agonistas y antagonistas del efecto de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre el transporte de leptina a través de LSR u otros receptores. El aumento del transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica debería aumentar presumiblemente su acción como un factor saciante. 15
Análisis FACS de la expresión de LSR
El efecto de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre LSR se puede deter-minar también midiendo el nivel de expresión de LSR en la superficie celular mediante citometría de flujo de superficie, usando anticuerpos anti-LSR y anticuerpos secunda-20 rios fluorescentes. La citometría de flujo es una tecnología basada en láser que se usa para medir las características de las partículas biológicas. El principio en que se basa la citometría de flujo es que la luz se dispersa y la fluorescencia que se emite como luz a partir de la fuente de excitación golpea las partículas en movimiento.
Este es un ensayo de alto rendimiento que se podría adaptar fácilmente para 25 seleccionar fragmentos del polipéptido OBG3 y las variantes, así como los supuestos agonistas o antagonistas de los fragmentos del polipéptido gOBG3. A continuación se proporcionan dos ensayos. El anticuerpo, la línea celular y el análogo del fragmento de polipéptido gOBG3 podrían variar dependiendo del experimento, pero se podría usar una línea celular humana, un anticuerpo anti-LSR humano y APM1 globular para se-30 leccionar variantes, agonistas, y antagonistas a ser utilizados para tratar a seres humanos.
Ensayo 1:
Se pretratan las células con fragmentos del polipéptido gOBG3 intactos (o se dejan sin tratar) antes de su recogida y análisis mediante FACS. Se recogen las célu-35 las usando una disolución de disociación no enzimática (Sigma), y después se incuban durante 1 h a 4 °C con una dilución 1:200 de anti-LSR 81B o un anti-suero irrelevante en PBS que contiene BSA al 1 % (p/v). Después de lavar dos veces con el mismo tampón, se añade a las células anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con FITC (Rockland, Gilbertsville, PA), seguido por una incubación adicional durante 30 min a 5 4°C. Después del lavado, se fijan las células en formalina al 2 %. El análisis por cito-metría de flujo se realiza en un citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
El ensayo in vitro con la línea celular hepática (descrito antes) ha demostrado que la actividad de LSR (unión de leptina) aumenta con concentraciones crecientes de 10 fragmentos del polipéptido gOBG3. Aunque no se desea limitarse por ninguna teoría particular, esto podría ser o bien el resultado de un aumento del número de sitios de unión a LSR en la superficie celular, o bien un cambio en la afinidad para la leptina. El ensayo FACS debería detectar presumiblemente cambios en el número de sitios de unión a LSR, aunque también podrían ser detectados cambios en la conformación que 15 reflejan cambios de afinidad. Preferiblemente el anticuerpo debería ser frente al C-ter-minal del LSR.
Ensayo 2:
Se cultivan las células en matraces T175 según las instrucciones del fabricante 20 durante 48 horas antes del análisis.
Se lavan las células una vez con tampón FACS (1x PBS/FBS al 2 %, filtro este-rilizado), y se raspan manualmente del matraz en 10 ml de tampón FACS. Se trans-fiere la suspensión de células a un tubo cónico de 15 ml y se centrifuga a 1200 rpm, 4°C durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y se resuspenden las células en 25 10 ml de tampón FACS enfriado a 4°C. Se realiza el recuento de células y se ajusta la densidad celular con tampón FACS hasta una concentración de 1 x 106 células/ml. Se añade un mililitro de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 48 pocillos para análisis. Se centrifugan las células a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Se comprue-ban las placas para asegurarse de que las células se han sedimentado, se separa el 30 sobrenadante y se resuspenden las células poniendo la placa sobre un mezclador en vórtex. Se añade un mililitro de tampón FACS a cada pocillo, seguido por centrifuga-ción a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Este lavado de células descrito se realizó un total de 3 veces.
Se añade a las células un anticuerpo primario, titulado en experimentos de cri-35 bado para determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:5000, ó 1:10000), en un volumen total de 50 µL de tampón FACS. Se incuban las placas durante 1 h a 4°C protegidas de la luz. Después de la incubación, se lavan las células 3 veces como se ha indicado antes. Se añade a las células un anticuerpo secundario, titulado en expe-5 rimentos de cribado para determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:5000, ó 1:10000), en un volumen total de 50 µL de tampón FACS. Se incuban las placas du-rante 1 h a 4°C protegidas de la luz. Después de la incubación, se lavan las células 3 veces como se ha indicado antes. Después del lavado final, se resuspenden las célu-10 las en 500 µL de tampón FACS y se transfieren a un tubo de adquisición de FACS. Se ponen las muestras sobre hielo protegidas de la luz y se analizan antes de 1 hora.
Unión Celular y Absorción de gOBG Detectada por Microscopía de Fluorescencia
Conjugación de gOBG3 con isotiocianato de fluoresceína (FITC): Se marcó 15 gOBG3 purificado a una concentración de 1 mg/ml con FITC usando el equipo de conjugación FluoroTag FITC de Sigma (Nº de ref. FITC-1). Para marcar el gOBG3 se siguió el protocolo indicado en el Manual de Sigma para conjugación a pequeña es-cala.
Cultivo celular: se sembraron células de músculo esquelético de ratón C2C12 20 (ATCC, Manassas, VA CRL-1772) y hepatocitos de ratón Hepa-1-6 (ATCC, Manassas, VA CRL-1830) en placas de 6 pocillos a una densidad celular de 2x105 células por pocillo. Las células C2C12 y Hepa-1-6 se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del depósito durante 24-48 horas antes del análisis. Se llevó a cabo el ensayo cuando las células tuvieron una confluencia del 80 %. 25
Unión celular y absorción del gOBG3 marcado con FITC usando microscopía: las células C2C12 y Hepa 1-6 se incubaron en presencia/ausencia de anticuerpo diri-gido frente a LSR humano (81B: secuencia N-terminal de LSR humano; no reacciona de forma cruzada con LSR de ratón y 93A: secuencia C-terminal, presenta reacción cruzada con LSR de ratón) o un antisuero dirigido contra gC1qr (953) durante 1 hora a 30 37ºC, 5% de CO2. Se añadieron anticuerpos hacia LSR al medio a una concentración de 2 µg/mL. El antisuero anti-gC1qr se añadió al medio a un volumen de 2,5 µL de suero sin diluir (alta concentración) o a una dilución de 1:100 (baja concentración). Después de incubación con el anticuerpo especificado, se añadió FITC-gOBG3 (50 nM/ml) a cada pocillo de cultivo celular. Las células se incubaron de nuevo durante 1 35 hora a 37ºC, 5% de CO2. Se lavaron las células 2x con PBS, se rascaron las células del pocillo a 1 ml de PBS. Se transfirió la suspensión de células a un tubo eppendorf y se centrifugó a 1000 rpm durante 2 minutos. Se separó el sobrenadante y se resus-pendieron las células en 200 µL de PBS. Se analizó la unión y absorción de FITC-gOBG3 por microscopía de fluorescencia con un aumento de 40X. 5
El análisis de las células C2C12 y Hepa 1-6 revela idénticos fenotipos con res-pecto a los perfiles de unión y absorción de FITC-gOBG3 tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos LSR. Parece que el FITC-gOBG3 se localiza dentro de las vesículas del citoplasma tanto de los hepatocitos de ratón como de los mioblastos de ratón, dando a entender que la unión y absorción de FITC-gOBG3 está teniendo lugar. 10 La absorción de FITC-gOBG3 parece que se bloquea cuando las células fueron pre-tratadas con el anticuerpo anti-LSR que reconoce el LSR de ratón. Sin embargo, la unión de FITC-gOBG3 a la superficie celular tiene lugar en una pequeña porción de las células (C2C12 y Hepa 1-6). A baja concentración del antisuero Gc1qr, parece que FITC-gOBG3 está localizado dentro de las vesículas del citoplasma de ambos tipos de 15 células, similarmente al fenotipo de las células que no han recibido pre-tratamiento con anticuerpo antes de la adición de FITC-gOBG3. El fenotipo de absorción y unión de FITC-gOBG3 no es afectado por el pre-tratamiento con un anticuerpo LSR que no re-conoce el LSR de ratón. Juntos, estos datos sugieren que la absorción de FITC-gOBG3 puede ser bloqueada por un anticuerpo LSR humano que reacciona de forma 20 cruzada con el LSR de ratón. Sin embargo, este fenotipo no se reproduce con otros anticuerpos LSR que no tienen reactividad cruzada. Por tanto, este ensayo puede ser útil para identificar agentes que facilitan o previenen la absorción y/o unión de los fragmentos del polipéptido gOBG3 a las células.
25
Efecto sobre LSR como un receptor de lipoproteínas
Se puede ensayar también el efecto de gOBG3 sobre la actividad del LSR de unión, internalización y degradación de las lipoproteínas. La medida de LSR como receptor de lipoproteínas se describe en Bihain & Yen, ((1992) Biochemistry 31(19):4628-36; incorporado en la presente memoria en su totalidad incluyendo los 30 dibujos, tablas o figuras). El efecto de gOBG3 sobre la actividad del LSR (u otros re-ceptores) de unión, internalización y degradación de lipoproteínas se puede comparar con la de OBG3 intacto, con células sin tratar como un control adicional. Este ensayo se puede usar también para cribar variantes activas e inhibidoras de gOBG3, así como los agonistas y antagonistas de la actividad relacionada con la obesidad. 35
Las células hepáticas humanas PLC (Depósito ATCC) se pusieron en placas a una densidad de 300.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM (rico en glucosa) que contiene glutamina y penicilina-estreptomicina (Bihain & Yen, 1992). Se cambió el medio el día 2. El día 3, se lavaron las monocapas confluentes una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (2 ml/pocillo). Las células se 5 incubaron a 37ºC durante 30 min con 10 ng/mL de leptina recombinante humana en DMEM que contenía un 0,2% (p/v) de BSA, Hepes 5 mM, CaCl2 2 mM, 3,7 g/L de bi-carbonato sódico, pH 7,5, seguido de otros 30 min de incubación a 37ºC con concen-traciones crecientes de gOBG3. Se continuó con las incubaciones durante 2 h a 37ºC tras la adición de oleato 0,8 mM y 20 µg/mL de 125I-LDL. Se lavaron las monocapas 2 10 veces consecutivamente con PBS que contiene BSA al 0,2 %, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y después 2 veces consecutivamente con PBS. Las cantidades de unión, absorción y degradación de 125I-LDL inducidas por el oleato, se midieron como se ha descrito previamente (Bihain & Yen, 1992, anteriormente mencionado). Los re-sultados se presentan como la media de determinaciones triplicadas. 15
Como se muestra en la Figura 6, la adición de gOBG3 lleva a un aumento de la actividad de LSR como un receptor de lipoproteínas. La unión y absorción de LDL in-ducidas por el oleato parecen más afectadas por el gOBG3 en comparación con la degradación. Este aumento de la actividad de LSR podría producir potencialmente un mejor aclaramiento de las lipoproteínas ricas en triglicéridos durante el estado post-20 prandial. De este modo, debería ser eliminada más grasa de la dieta a través del hígado, en lugar de ser depositada en el tejido adiposo.
Este ensayo podría ser usado para determinar la eficacia de un compuesto (o los ago-nistas o antagonistas) para aumentar o reducir la actividad de LSR (o la absorción, unión y degradación de lipoproteínas a través de otros receptores), y por tanto afecta a 25 la tasa de aclaramiento de las lipoproteínas ricas en triglicéridos.
Efecto sobre la diferenciación muscular
Se siembran células C2C12 (línea celular del músculo esquelético murino; ATCC CRL 1772, Rockville, MD) con baja densidad (aproximadamente 15-20%) en 30 DMEM completo (con glutamina, penicilina/estreptomicina, etc.) +10% de FCS. Dos días más tarde tenían una confluencia de 80-90 %. En este momento, se cambia el medio a DMEM+suero de caballo al 2 % para permitir la diferenciación. Se cambia el medio diariamente. Después de 3-4 días de estar en el suero de caballo al 2 %, apa-rece abundante formación de miotubos aunque el tiempo exacto de diferenciación de 35 las células C2C12 depende de cuánto tiempo han sido sometidas a pases y cómo han sido mantenidas, entre otras cosas.
Para ensayar el efecto de la presencia de gACRP30 sobre la diferenciación muscular, se añadió gACRP30 (1 a 2,5 µg/mL) el día después de la siembra cuando las células estaban todavía en DMEM con un 10% de FCS. Dos días después de po-5 ner en placas las células (un día después de que fue añadido gACRP30 por primera vez), a aproximadamente 80-90 % de confluencia, se cambió el medio a DMEM+ suero de caballo al 2 % más gACRP30. Los resultados muestran que la adición de gACRP30 hace que las células empiecen a organizarse dentro de un día después de su adición. Por contraste con la orientación aleatoria de las células no tratadas con 10 gACRP30, las tratadas con gACRP30 se alinearon ellas mismas en relación una con otra. Además, la diferenciación tuvo lugar sólo 2 días después del tratamiento con gACRP30, en contraste con los 3 a 4 días necesarios en su ausencia.
Efecto de la Oxidación de Ácidos Grasos en Células Musculares 15
Se diferenciaron las células C2C12 en presencia o ausencia de 2 µg/mL de gACRP30 durante 4 días. El día 4, se determinaron las tasas de oxidación del oleato midiendo la conversión de 1-14C-oleato (0,2 mM) a 14CO2 durante 90 min. Las células C2C12 diferenciadas en la presencia de gACRP30 sufren el 40 % más de oxidación del oleato que los controles diferenciados en ausencia de gACRP30. Se puede usar 20 este experimento para cribar los fragmentos y péptidos activos, así como los agonistas y antagonistas o activadores e inhibidores de los polipéptidos gOBG3.
El efecto de gACRP30 sobre la tasa de oxidación del oleato se comparó en células C2C12 diferenciadas (células del músculo esquelético murino; ATCC, Manassas, VA CRL-1772) y en una línea celular de hepatocitos (Hepal-6; ATCC, 25 Manassas, VA CRL-1830). Se mantuvieron las células cultivadas según las instruccio-nes del fabricante. El ensayo de oxidación de oleato se realizó como se ha descrito previamente (Muoio et al (1999) Biochem J 338;783-791). En resumen, se mantuvie-ron los miocitos casi confluentes en medio de diferenciación bajo en suero (DMEM, suero de caballo al 2,5 %) durante 4 días, a cuyo tiempo la formación de miotubos 30 llegó a ser máxima. Se mantuvieron los hepatocitos en el mismo medio DMEM suple-mentado con FCS al 10 % durante 2 días. Una hora antes del experimento se separó el medio y se añadió 1 mL de medio de preincubación (MEM, suero de caballo al 2,5%, glucosa 3 mM, glutamina 4 mM, Hepes 25 mM, BSA al 1% libre de FFA, oleato 0,25 mM, 5 µg/mL de gentamicina). Al principio del experimento de oxidación, se aña-35 dió ácido 14C-oleico (1 µCi/ml, American Radiolabeled Chemical Inc., St. Louis, MO) y las células se incubaron durante 90 min a 37ºC en ausencia/presencia de 2,5 µg/ml de gACRP30. Después del periodo de incubación se separaron 0,75 ml del medio y se ensayaron en cuanto a productos de oxidación marcados con 14C como se describe más adelante para el experimento de oxidación de los FFA en el músculo. 5
La oxidación del oleato en las células C2C12 determinada a lo largo de 90 min au-mentó de forma significativa (39 %; p = 0,036, prueba t bilateral) en las células tratadas con gACRP30. Por contraste, no se observó ningún aumento detectable en la tasa de oxidación de los FFA en los hepatocitos incubados con gACRP30.
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Análisis de Triglicéridos y Proteínas tras la Oxidación del Oleato en Células Cultivadas
Después de la transferencia del medio para el ensayo de oxidación del oleato, se pusieron las células sobre hielo. Para determinar el contenido de triglicéridos y proteínas, se lavaron las células con 1 ml de 1x PBS para eliminar el medio residual. A cada pocillo se le añaden 300 µL de solución de disociación celular (Sigma) y se in-15 cuba a 37ºC durante 10 min. Las placas se golpearon suavemente para soltar las cé-lulas, y se añadieron 0,5 ml de PBS 1x. Se transfirió la suspensión celular a un tubo eppendorf, se lavó cada pocillo con 0,5 ml adicionales de 1x PBS, y se transfirió a un tubo eppendorf apropiado. Se centrifugaron las muestras a 1000 rpm durante 10 mi-nutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron al sedi-20 mento de células 750 µL de PBS 1x/CHAPS al 2%. Se agitó la suspensión celular en vórtex y se puso sobre hielo durante 1 hora. Después, las muestras se centrifugaron a 13000 rpm durante 20 min a 4ºC. Los sobrenadantes se transfirieron a un nuevo tubo y se congelaron a -20ºC hasta que se analizaron. Se determinó cuantitativamente el nivel de triglicéridos en cada muestra usando el kit enzimático GPO-TRINDER de 25 Sigma Diagnostics. Se siguió el procedimiento indicado en el manual con las siguien-tes excepciones: el ensayo se realizó en una placa de 48 pocillos, se ensayaron 350 µL de volumen de la muestra, el blanco de control consistió en 350 µL de PBS/CHAPS al 2%, y el patrón contuvo 10 µL de patrón proporcionado en el equipo más 690 µL de PBS/CHAPS al 2%. El análisis de las muestras se realizó en un Packard Spectra 30 Count a una longitud de onda de 550 nm. El análisis de proteínas se realizó sobre 25 µL de cada muestra de sobrenadante usando el ensayo de proteínas BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de las muestras se realizó en un Packard Spectra Count a una longitud de onda de 550 nm.
La producción de triglicéridos tanto en las células C2C12 como en las células Hepa 1-35 6 no cambió de forma significativa en la ausencia/presencia de ACRP30 y gACRP30. El contenido de proteína de todas las células analizadas fue equivalente en ausen-cia/presencia de ACRP30 y gACRP30.
Absorción de Glucosa en Células Musculares in vitro 5
Se obtienen células musculares L6 de la European Culture Collection (Porton Down) y se usan en los pases 7-11. Las células se mantienen en medio de cultivo de tejidos estándar DMEM, y se determina la absorción de glucosa mediante el uso de [3H]-2-desoxiglucosa (2DG) con o sin fragmento del polipéptido gOBG3 en presencia o ausencia de insulina (10-8 M) como se ha descrito previamente (Walker, P.S. et al. 10 (1990) Glucose transport activity in L6 muscle cells is regulated by the coordinate con-trol of subcellular glucose transporter distribution, biosynthesis, and mRNA transcription. JBC 265(3):1516-1523; y Kilp, A. et al. (1992) Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle cells in culture. Endocrinology 130(5):2535-2544. La absorción de 2DG se expresa como el porcentaje de cambio en comparación con el 15 control (sin insulina añadida o fragmento del polipéptido gOBG3). Los valores se pre-sentan como la media ± SEM de grupos de 4 pocillos por experimento. Las diferencias entre los grupos de pocillos se evalúan mediante la prueba t de Student, y se consideran significativos los valores de probabilidad p<0,05.
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EJEMPLO 5: Efecto de gOBG3 sobre ratones alimentados con una dieta de alto contenido en grasas
Se realizan los experimentos usando ratones C57B1/6 de aproximadamente 6 semanas de edad (8 por grupo). Todos los ratones se ponen en jaulas individuales. Se mantienen los ratones con una dieta de alto contenido en grasas a lo largo de cada 25 experimento. La dieta de alto contenido en grasas (dieta de cafetería; D12331 de Research Diets, Inc) tiene la siguiente composición: kcal de proteínas 16 %, kcal de sacarosa 26 %, y kcal de grasas 58 %. La grasa estaba principalmente compuesta de aceite de cacahuete, hidrogenado.
Una vez que se hubo alimentado a los ratones con una dieta de alto contenido 30 en grasas durante 6 días, se insertan bombas micro-osmóticas usando anestesia de isoflurano, y se usan para proporcionar a los ratones subcutáneamente (s.c.) durante 18 días gOBG3, OBG3, solución salina, y un péptido irrelevante. El gOBG3 se propor-ciona a dosis de 50, 25, y 2,5 µg/día; OBG3 se proporciona a 100, 50, y 5 µg/día; y el péptido irrelevante se proporciona a 10 µg/día. El peso corporal se determina el pri-35 mer, tercer y quinto día de la dieta de alto contenido en grasas, y después diariamente a partir del comienzo del tratamiento. Se toman muestras finales de sangre por pun-ción cardiaca y se usan para determinar los niveles de triglicéridos (TG), de colesterol total (TC), de glucosa, de leptina, y de insulina. Se determina también la cantidad de alimento consumida por día para cada grupo. 5
En un experimento preliminar, los ratones tratados con 2,5 µg/día de gOBG3 habían reducido de forma significativa el peso corporal.
EJEMPLO 6: Análisis de la actividad relacionada con la obesidad en humanos
Los análisis de la eficacia de gOBG3 en humanos se realizan de acuerdo con 10 las recomendaciones de un médico y con las normas establecidas. Los parámetros ensayados en ratones también se ensayan en seres humanos (por ejemplo, la ingesta de alimentos, peso, TG, TC, glucosa, insulina, leptina y FFA). Es de esperar que los factores fisiológicos presenten cambios a corto plazo. Los cambios en la ganancia de peso podrían requerir un periodo de tiempo más largo. Además, la dieta necesitará ser 15 vigilada cuidadosamente. El OBG3 globular se debe administrar a dosis diarias de aproximadamente 6 mg de proteína por persona de 70 kg o aproximadamente 10 mg por día. También se pueden ensayar otras dosis, por ejemplo 1 mg o 5 mg al día hasta 20 mg, 50 mg, o 100 mg al día.
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EJEMPLO 7: Ensayos in vivo de Actividad Relacionada con la Obesidad en Modelos de Diabetes en Roedores
Como los perfiles metabólicos difieren entre diversos modelos animales de obesidad y diabetes, se emprende el análisis de múltiples modelos para separar los efectos de los fragmentos del polipéptido gOBG3 sobre la hiperglucemia, hiperinsuli-25 nemia, hiperlipidemia y obesidad. La mutación en colonias de animales de laboratorio y diferentes sensibilidades a regímenes dietéticos han hecho posible el desarrollo de modelos animales con diabetes no insulinodependiente asociada con la obesidad y la resistencia a la insulina. Se han desarrollado modelos genéticos tales como db/db y ob/ob (véase Diabetes, (1982) 31(1): 1-6) en ratones y fa/fa en ratas zucker por los 30 diversos laboratorios para comprender la patofisiología de la enfermedad y ensayar la eficacia de nuevos compuestos antidiabéticos (Diabetes, (1983) 32: 830-838; Annu Rep Sankyo Res Lab (1994) 46:1-57). Los ratones homocigotos C57 BL/KsJ-db/db desarrollados por Jackson Laboratory son obesos, hiperglucémicos, hiperinsulinémi-cos, y resistentes a la insulina (J Clin Invest (1990) 85:962-967), mientras los ratones 35 heterocigotos son delgados y normoglucémicos. En el modelo db/db, los ratones desarrollan progresivamente insulinopenia con la edad, una característica que se ob-serva comúnmente en las últimas fases de la diabetes humana de tipo II cuando los niveles sanguíneos de azúcar no están controlados suficientemente. El estado del páncreas y su curso varían de acuerdo con los modelos. Como este modelo se parece 5 al de la diabetes mellitus de tipo II, los compuestos de la presente invención se ensa-yan con respecto a las actividades reductoras de los niveles sanguíneos de azúcar y de triglicéridos. Las ratas Zucker (fa/fa) son gravemente obesas, hiperinsulinémicas y resistentes a la insulina (Coleman, Diabetes 31:1,1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva 10 York, ed. 4, 1990), págs. 299-340), y la mutación fa/fa puede ser el equivalente en ratas de la mutación db murina (Friedman et al. Cell 69:217-220, 1992; Truett et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7806, 1991). Los ratones Tubby (tub/tub) se caracterizan por obesidad, resistencia moderada a la insulina e hiperinsulinemia sin hiperglucemia significativa (Coleman et al., J Heredity 81:424,1990). 15
Previamente, se ha informado que la leptina invierte la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus en ratones con lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature 401:73-76 (1999); incorporado en la presente memoria en su totalidad incluyendo cualquier dibujo, figura o tabla). Se ha descubierto que la leptina es menos eficaz en un modelo de ratón lipodistrófico diferente de diabetes lipoatrófica (Gavrilova et al 20 Nature 403:850 (2000); incorporado en la presente memoria en su totalidad incluyendo cualquier dibujo, figura o tabla). La presente invención incluye el uso de fragmentos del polipéptido gOBG3 para reducir la resistencia a la insulina y la hiperglucemia en este modelo solos o en combinación con leptina, el péptido de leptina (solicitud provisional de EE.UU. Nº 60/155.506), u otros compuestos. Los ensayos incluyen el descrito pre-25 viamente en Gavrilova et al. ((2000) Diabetes 49(11):1910-6; (2000) Nature 403(6772):850) usando ratones A-ZIP/F-1, con la excepción de que se administraría un fragmento del polipéptido gOBG3 usando los métodos descritos previamente en el Ejemplo 5 (o los Ejemplos 8-10). Se ensayan los niveles de glucosa e insulina de los ratones, y se controlan la ingesta de alimento y el peso del hígado, así como otros 30 factores, tales como los niveles de leptina, FFA y TG, medidos típicamente en nues-tros experimentos (véase el Ejemplo 5, anterior, o los Ejemplos 8-10).
El modelo de estreptozotocina (STZ) para la diabetes inducida químicamente se ensaya para examinar los efectos de la hiperglucemia en ausencia de obesidad. Los animales tratados con STZ presentan deficiencia de insulina y son gravemente 35 hiperglucémicos (Coleman, Diabetes 31:1,1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, ed. 4, 1990), págs. 299-340). También se examina el modelo de obesidad inducida química-mente por glutamato monosódico (MSG) (Olney, Science 164:719, 1969; Cameron et al., Clin Exp Pharmacol Physiol 5:41, 1978), en el que la obesidad es menos grave que 5 en los modelos genéticos, y se desarrolla sin hiperfagia, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina. Finalmente, un modelo no químico y no genético para la inducción de obesidad incluye roedores que se alimentan con una dieta de alto contenido en grasas y alto contenido en carbohidratos (dieta de cafetería) ad libitum.
La presente invención incluye el uso de un fragmento del polipéptido gOBG3 10 para reducir la resistencia a la insulina y la hiperglucemia en cualquiera o en todos los modelos de diabetes en roedores anteriores o en seres humanos con diabetes de tipo I o de tipo II u otras enfermedades metabólicas preferidas descritas previamente o modelos basados en otros mamíferos. En las composiciones de la presente invención, el fragmento del polipéptido gOBG3 puede, si se desea, estar asociado con otros 15 agentes antidiabéticos farmacológicamente activos compatibles, tales como insulina, leptina (solicitud provisional de EE.UU. Nº 60/155.506) o troglitazona, solos o en combinación. Los ensayos incluyen el descrito previamente en Gavrilova et al. ((2000) Diabetes 49(11):1910-6; (2000) Nature 403(6772):850) mediante el uso de ratones A-ZIP/F-1, excepto que el fragmento del polipéptido gOBG3 se administra de manera 20 intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), o intravenosa (i.v.). Se ensayan los niveles de glucosa e insulina de los ratones, y se controlan la ingesta de alimento y el peso del hígado, así como otros factores, tales como los niveles de leptina, FFA y TG, medidos típicamente en nuestros experimentos.
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Ensayo in vivo de Actividad Antihiperglucémica de un Fragmento del Polipéptido gOBG3
Los ratones diabéticos obesos alterados genéticamente (db/db) (machos, 7-9 semanas de edad) se albergan (7-9 ratones/jaula) en condiciones de laboratorio habituales a 22ºC y 50% de humedad relativa, y se mantienen con una dieta de 30 comida Purina de roedores y agua a voluntad. Antes del tratamiento, se recogen muestras de sangre de la vena caudal de cada animal y se determinan las concentraciones sanguíneas de glucosa usando el Sistema de Control One Touch Basic Glucose (Lifescan). Se usan los ratones que tienen niveles plasmáticos de glucosa comprendidos entre 250 y 500 mg/dl. Cada grupo de tratamiento consiste en 35 siete ratones que se distribuyen de manera que los niveles medios de glucosa sean equivalentes en cada grupo al principio del estudio. Los ratones db/db se dosifican con bombas micro-osmóticas, insertadas usando anestesia con isoflurano, para proporcionar al ratón el fragmento del polipéptido gOBG3, solución salina y un péptido irrelevante, por vía subcutánea (s.c). Se toman muestras de sangre de la vena caudal 5 cada hora durante 4 horas y 24 y 30 h después de la dosificación y se analizan para determinar las concentraciones sanguíneas de glucosa. Se retira la comida 0-4 h después de la dosificación y posteriormente se introduce de nuevo. También se miden los pesos corporales individuales y el consumo medio de alimento (en cada jaula) después de 24 horas. Las diferencias significativas entre grupos (comparando los 10 animales tratados con el fragmento de gOBG3 y los tratados con solución salina) se evalúan usando el ensayo t de Student.
Ensayo de Sensibilidad a Insulina in vivo
La sensibilidad a la insulina in vivo se examina utilizando pinzas hiperinsuliné-15 micas-euglucémicas de dos etapas de acuerdo con el siguiente protocolo. Se encie-rran en jaulas roedores de cualquiera de los diversos modelos descritos en el Ejemplo 2 durante al menos una semana antes de los procedimientos experimentales. Se reali-zan cirugías para colocar catéteres en la vena yugular y en la arteria carótida en con-diciones estériles usando anestesia con ketamina y xilazina (i.m.). Tras la cirugía, se 20 deja que todos los roedores recobren la consciencia y se colocan en jaulas individua-les. Se administra el fragmento del polipéptido gOBG3 o vehículo a través de la vena yugular tras la recuperación completa y durante los dos días siguientes. Dieciséis horas después del último tratamiento, se realizan pinzas hiperinsulinémicas-euglucé-micas. Los roedores se colocan en aparatos de inmovilización y se administra una 25 inyección rápida de 4 µCi de [3-3H] glucosa (NEN), seguido por una infusión continua de: el marcador a una dosis de 0,2 µCi/min (20 µl/min). Dos horas después de la infu-sión del marcador, se recogen 3 muestras de sangre (de 0,3 ml cada una) a intervalos de 10 minutos (-20-0 min) para las mediciones basales. Después se inicia una infusión de insulina (5 mU/kg/min), y se toman muestras de sangre de 100 µl cada 10 minutos 30 para controlar la glucosa plasmática. Se infunde una solución de glucosa al 30% usando una segunda bomba basada en los niveles plasmáticos de glucosa para al-canzar y mantener la euglucemia. Una vez establecido el estado estacionario a 5 mU/kg/min de insulina (velocidad de infusión de glucosa y glucosa plasmática estable), se obtienen 3 muestras de sangre más (de 0,3 ml cada una) para realizar las medicio-35 nes de glucosa, [3-3H] glucosa e insulina (100-120 min). Después se administra una dosis mayor de insulina (25 mU/kg/min.), y las velocidades de infusión de glucosa se ajustan para la segunda pinza euglucémica, y se toman muestras de sangre a los 220-240 min. Se determina la actividad específica de la glucosa en plasma desproteini-zado, y se realizan los cálculos de Rd y la producción de glucosa hepática (HGO), tal 5 como se describe (Lang et al., Endocrinology 130:43, 1992). Después se determinan los niveles plasmáticos de insulina en el periodo basal y después de infusiones de 5 y 25 mU/kg/min, y se comparan entre roedores tratados con fragmento de gOBG3 y tratados con vehículo.
La regulación por medio de la insulina de la homeostasis de la glucosa tiene 10 dos componentes principales; estimulación de la absorción de glucosa periférica y su-presión de la producción de glucosa hepática. Usando estudios con marcadores en las pinzas de glucosa, es posible determinar la parte de la respuesta a la insulina que está afectada por el fragmento del polipéptido gOBG3.
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EJEMPLO 8: Efecto de gOBG-3 sobre los Ácidos Grasos Libres del Plasma, en Rato-nes C57 BL/6
Se analizó el efecto de la cabeza globular de ACRP30 sobre la lipemia post-prandial (PPL) en ratones C57BL6/J normales. ACRP30 otro nombre para adipo Q, y es el homólogo de la proteína de ratón de la proteína APM1 humana. OBG3 es un 20 modo genérico para referirse a todas estas formas. La forma de cabeza globular se indica colocando una 'g' delante, por ejemplo gACRP30 o gOBG3. El gOBG3 usado se preparó mediante digestión proteolítica de OBG3 recombinante como se ha descrito previamente en el Ejemplo 2. Se usó tripsina acetilada como proteasa.
Los ratones usados en este experimento se mantuvieron en ayunas durante 2 25 horas antes del experimento tras lo cual se tomó una muestra de sangre como valor inicial. Todas las muestras de sangre se tomaron de la cola usando tubos capilares recubiertos con EDTA (50 µL en cada punto de tiempo). A tiempo 0 (8:30 AM), se ad-ministró una comida estándar de alto contenido en grasas (6 g de mantequilla, 6 g de aceite de girasol, 10 g de leche desnatada en polvo, 10 g de sacarosa, 12 ml de agua 30 destilada, preparada recientemente siguiendo Nb#6, JF, pg.1) por medio de una sonda (vol.=1% de peso corporal) a todos los animales.
Inmediatamente después de la comida de alto contenido en grasas, se inyecta-ron i.p. 25 µg de gOBG3 en 100 µL de solución salina. Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 µg/mL en 100 µL) a los 45 min y a 1 h 45 min (grupo tratado, n=8). Los ani-35 males de control (n=8) fueron inyectados con solución salina (3x100 µL). Los animales tratados y no tratados fueron manipulados de modo alternativo.
Se tomaron muestras de sangre a intervalos de una hora, y se pusieron inme-diatamente sobre hielo. Se preparó el plasma por centrifugación después de cada punto de tiempo. Se mantuvo el plasma a -20°C y se determinaron los ácidos grasos 5 libres (FFA), los triglicéridos (TG) y la glucosa en 24 horas usando equipos de ensayo estándar (Sigma y Wako). Debido a la cantidad limitada de plasma disponible, se de-terminó la glucosa por duplicado usando las muestras reunidas. Para cada punto de tiempo, se reunieron volúmenes iguales de plasma de los 8 animales por grupo de tratamiento. Las barras de error mostradas para la glucosa representan por tanto la SD 10 de la determinación por duplicado y no la variación entre animales como para TG y FFA.
Resultados
El aumento de los FFA del plasma, debido a la comida de alto contenido en 15 grasas fue significativamente más bajo en los ratones tratados con gOBG3 a todos los puntos de tiempo entre 1 y 4 h. Esto puede ser interpretado como un aumento de la oxidación de los FFA (Fig. 8).
El tratamiento con gOBG3 también llevó a un aumento significativamente más pequeño de los TG del plasma, en comparación con los ratones no tratados. Sin em-20 bargo, este efecto fue menos pronunciado que el efecto sobre los FFA (Fig. 9).
El metabolismo de la glucosa se mejoró significativamente después del trata-miento con gOBG3; este efecto puede ser interpretado como un aumento de la sensi-bilidad a la insulina posiblemente debido a la reducción de los FFA (Fig. 10).
Similares resultados se vieron previamente en un experimento anterior que incluye 25 solo 2 tratamientos (a 0 y a 45 minutos; no se muestran los datos). Se observó un fuerte efecto de reducción de los FFA por el gOBG3 acoplado con un menor efecto de reducción de los TG.
EJEMPLO 9: Efecto de gOBG3 sobre la Leptina Plasmática y la Insulina en Ratones 30 C57BL/6
Se analizó el efecto de la cabeza globular de ACRP30 sobre los niveles plas-máticos de leptina e insulina durante la lipemia postprandial (PPL) en ratones norma-les C57BL6/J. El procedimiento experimental fue el mismo que se ha descrito en el Ejemplo 8, excepto que la sangre fue tomada sólo a las 0,2 y 4 horas para poder tener 35 muestras de sangre más grandes que son necesarias para la determinación de leptina e insulina por RIA.
En resumen, 16 ratones fueron mantenidos en ayunas durante 2 horas antes del experimento tras lo cual se tomó una muestra de sangre como línea base. Todas las muestras de sangre se tomaron de la cola usando tubos capilares recubiertos con 5 EDTA (100 µL en cada punto de tiempo). A tiempo 0 (9:00 AM), se administró a todos los animales mediante sonda (vol = 1% de peso corporal) una comida estándar de alto contenido en grasas (véase el Ejemplo 8). Inmediatamente después de la comida de alto contenido en grasas, se inyectaron i.p. 25 µg de gOBG3 en 100 µL de solución salina. Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 µg en 100 µL) a los 45 min y a 1 h 45 10 min (grupo tratado, n=8). Los animales de control (n=8) fueron inyectados con solución salina (3x100 µL). Los animales tratados y no tratados fueron manipulados de modo alternativo.
Las muestras de sangre se pusieron inmediatamente sobre hielo y se preparó el plasma por centrifugación después de cada punto de tiempo. Se mantuvo el plasma 15 a -20°C y se determinaron los ácidos grasos libres (FFA) antes de 24 horas usando un equipo estándar de ensayo (Wako). Se determinaron la leptina e insulina por RIA (ML-82K y SRI-13K, LINCO Research, Inc., St. Charles, MO) siguiendo el protocolo del fabricante. Sin embargo, se usaron solamente 20 µL de plasma. Se hizo cada determi-nación por duplicado. Debido a la limitada cantidad de plasma disponible, se determi-20 naron la leptina y la insulina en 4 conjuntos de 2 animales cada uno, en ambos grupos de tratamiento.
Resultados
Como se ha mostrado previamente (Ejemplo 8), el tratamiento con gOBG3 re-25 dujo de forma significativa el aumento postprandial de los FFA del plasma, causado por la comida de alto contenido en grasas a las 2 horas (Fig. 11). No hubo ningún cambio significativo en los niveles de leptina del plasma, a ningún punto de tiempo; el tratamiento con gOBG3 no afectó a los niveles de leptina (Fig. 12). Los niveles de in-sulina (Fig. 13) indican un aumento marginal de la insulina a las 2 horas. Sin embargo, 30 cuando se analizó como porcentaje de cambio desde t0, este aumento (212 % vs. 260 %, testigo vs. tratado) no fue estadísticamente significativo (p = 0,09).
Estos datos reconfirman la aceleración previamente mostrada del metabolismo de los FFA por tratamiento con gOBG3. También demuestran que el gOBG3 no afecta a los niveles de leptina e insulina del plasma, y que el gOBG3 reduce la hiperglucemia du-35 rante la lipemia postprandial y también induce la pérdida de peso durante el trata-miento a lo largo de varios días. Sin estar limitado por ninguna teoría particular, los datos sugieren: a) que la reducción de peso es causada por un aumento del metabo-lismo independiente de la leptina; y b) que el gOBG3 lleva a un aumento de la sensibi-lidad a la insulina. 5
EJEMPLO 10: Efecto de OBG3 sobre FFA, TG y Glucosa del Plasma, en Ratones C57 BL/6
Se ha descrito el efecto de la cabeza globular de acrp30 sobre los niveles plasmáticos de FFA, TG, glucosa, leptina e insulina durante la lipemia postprandial 10 (PPL) en ratones C57BL6/J normales. También se ha demostrado la pérdida de peso que resulta a partir del gOBG3 (2,5 µg/día) administrado a ratones C57BL6/J normales con una dieta de alto contenido en grasas (Ejemplo 5). En comparación, se necesitó una dosis mucho más alta de la forma completa de ACRJP30 (200 µg/día) para inducir un efecto relativamente más pequeño en los ratones. Este ejemplo demuestra el 15 efecto de la forma completa de acrp30 sobre los niveles plasmáticos de FFA, TG y glucosa.
El procedimiento experimental fue similar al descrito en el Ejemplo 8. En resu-men, 14 ratones fueron mantenidos en ayunas durante 2 horas antes del experimento tras lo cual se tomó una muestra de sangre como línea base. Todas las muestras de 20 sangre se tomaron de la cola usando tubos capilares recubiertos con EDTA (50 µL en cada punto de tiempo). A tiempo 0 (9:00 AM), se administró a todos los animales me-diante sonda (vol = 1% de peso corporal) una comida estándar de alto contenido en grasas (véase el Ejemplo 8). Inmediatamente después de la comida de alto contenido en grasas, se inyectaron i.p. a 4 ratones 25 µg de OBG3 en 100 µL de solución salina. 25 Se inyectó de nuevo la misma dosis (25 µg en 100 µL) a los 45 min y 1 hr 45 mm. Un segundo grupo de tratamiento (n=4) recibió 3 veces 50 µg de OBG3 a los mismos in-tervalos. Los animales de control (n=6) fueron inyectados con solución salina (3x100 µL). Los animales tratados y no tratados fueron manipulados de modo alternativo.
Las muestras de sangre se pusieron inmediatamente sobre hielo. Se preparó el 30 plasma por centrifugación después de cada punto de tiempo. Se mantuvo el plasma a -20°C y se determinaron los ácidos grasos libres (FFA), los triglicéridos (TG) y la glu-cosa en 24 horas usando equipos de ensayo estándar (Sigma y Wako).
Resultados
El tratamiento con OBG3 de longitud completa no tuvo ningún efecto sobre los niveles de FFA del plasma (Fig. 14) excepto durante t = 2 horas, cuando se demostró una reducción estadísticamente significativa (p<0,05). No se observó ningún cambio significativo en los niveles postprandiales de TG (Fig. 15) y de glucosa (Fig. 16) en los 5 animales tratados. Los datos presentados demuestran que la forma completa de OBG3 no redujo los niveles de FFA, TG y glucosa en contraste con lo que se observó para el dominio globular (Ejemplos 5, 8, 9). Solamente a las 2 horas después de la administración por sonda, el tratamiento con OBG3 redujo las concentraciones plas-máticas de FFA de forma significativa (p<0,05). Estos resultados demuestran que 10 gOBG3 es mucho más activo in vivo que la proteína de longitud completa. Se observó un efecto similar para la reducción del peso corporal; la cabeza globular fue mucho más activa que la proteína de longitud completa.
EJEMPLO 11: Efecto de gACRP30 sobre los FFA después de inyección de epinefrina 15
En los ratones, los ácidos grasos libres del plasma, aumentaron después de la administración intragástrica de una comida de ensayo de alto contenido en gra-sas/sacarosa. Estos ácidos grasos libres se producen principalmente por la actividad de enzimas lipolíticas, es decir, lipoproteína lipasa (LPL) y lipasa hepática (HL). En esta especie, estas enzimas se encuentran en cantidades significativas tanto unidas al 20 endotelio como circulando libremente en el plasma. Otra fuente de ácidos grasos libres plasmáticos es la lipasa sensible a hormonas (HSL) que libera ácidos grasos libres del tejido adiposo después de la estimulación β-adrenérgica. Para analizar si gACRP30 regula también el metabolismo de los ácidos grasos libres liberados por HSL, se in-yectaron los ratones con epinefrina. 25
Dos grupos de ratones (n=5 cada uno) recibieron epinefrina (5 µg) por inyec-ción intraperitoneal. Un grupo tratado fue inyectado con gACRP30 (25 µg) una hora antes y de nuevo junto con epinefrina, mientras que los animales de control recibieron solución salina. Se aisló el plasma y se midieron los ácidos grasos libres y la glucosa como se ha descrito antes (Ejemplo 10). Como se muestra en la Fig. 18, las inyeccio-30 nes de epinefrina (5 µg) causaron un incremento en los ácidos grasos libres y en la glucosa del plasma. Ambos efectos se redujeron de forma significativa en los ratones tratados con gACRP30.
Esta reducción en el aumento de los niveles de glucosa y FFA no fue debida al bloqueo del efecto β-adrenérgico de la epinefrina, como se demuestra induciendo la 35 liberación de los FFA a partir del tejido adiposo aislado in vitro. En estos estudios con-trol, se separó el tejido adiposo de los ratones C57BL/6J normales y se incubó en tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit. Se añadió epinefrina y se determinó la concentración de los FFA en el medio después de una incubación de 90 min. La epi-nefrina (10 μM) produjo un aumento de 1,7 veces en los ácidos grasos libres en el me-5 dio. Las concentraciones crecientes de gACRP30 o ACRP30 hasta 50 µg/ml no in-hibieron este efecto de la epinefrina.
Los datos presentados hasta ahora indican que el dominio globular de AGRP30 ejerce profundos efectos farmacológicos sobre el metabolismo de sustratos de energía, con el efecto más evidente sobre los ácidos grasos libres del plasma. Además, la reduc-10 ción de la concentración de los FFA del plasma no se puede explicar ni por la inhibi-ción de LPL, que causaría un aumento de los triglicéridos del plasma mientras que realmente se observa una reducción de los triglicéridos en el plasma, ni por la inhibi-ción de HSL. Por lo tanto, la explicación más sencilla es que gACRP30 causa un au-mento de la retirada de ácidos grasos libres de la circulación mediante la promoción de 15 la absorción celular.
EJEMPLO 12: Efecto de gACRP30 sobre la Oxidación de los FFA en el Músculo
Para investigar el efecto de gACRP30 sobre la oxidación de ácidos grasos li-bres en el músculo, se aislaron músculos intactos de las extremidades posteriores de 20 ratones C57BL/6J y se midió la oxidación de FFA mediante el uso de oleato como sustrato [Clee, et al., "Plasma and vessel wall lipoprotein lipase have different roles in atherosclerosis", J Lipid Res 41, 521-531 (2000); Muoio, et al., "Leptin opposes insulin's effects on fatty acid partitioning in muscles isolated from obese ob/ob mice", Am J Physiol 276, E913-921 (1999). La oxidación de oleato en músculo aislado se 25 midió como se describió previamente [Cuendet, et al., "Decreased basal, noninsulin-stimulated glucose uptake and metabolism by skeletal soleus muscle isolated from obese-hyperglycemic (ob/ob) mice", J Clin Invest 58, 1078-1088 (1976); Le Marchand-Brustel, et al., "Insulin binding and effects in isolated soleus muscle of lean and obese mice", Am J Physiol 234, E348-E358 (1978)]. En resumen, se sacrificaron los ratones 30 mediante dislocación cervical y se aislaron rápidamente los músculos sóleo y EDL de las extremidades traseras. El tendón distal de cada músculo se ató a una pieza de sutura para facilitar la transferencia entre diferentes medios. Todas las incubaciones se realizaron a 30ºC en 1,5 ml de tampón bicarbonato de Krebs-Henseleit (NaCl 118,6 mM, KCl 4,76 mM, KH2PO4 1,19 mM, MgSO4 1,19 mM, CaCl2 2,54 mM, NaHCO3 25 35 mM, hepes 10 mM, pH 7,4) complementado con albúmina de suero bovino sin FFA al 4% (fracción V, calidad RIA, Sigma) y glucosa 5 mM (Sigma). La concentración total de oleato (Sigma) a lo largo del experimento fue 0,25 mM. Todos los medios fueron oxigenados (O2 al 95 %; CO2 al 5 %) antes de la incubación. La mezcla de gas fue hidratada a lo largo del experimento haciendo burbujear a su través un lavador de gas 5 (Kontes Inc., Vineland, NJ).
Se lavaron los músculos durante 30 min en medio de incubación con oxigena-ción. Los músculos se transfirieron después a medio nuevo (1,5 ml) y se incubaron a 30ºC en presencia de 1 µCi/ml de [1-4C]-ácido oleico (American Radiolabeled Chemicals). Los viales de incubación que contienen este medio se sellaron con un 10 séptum de goma del cual se suspendió un pocillo central que lleva una pieza de papel Whatman (1,5 cm x 11,5 cm).
Después de un periodo inicial de incubación de 10 min con oxigenación cons-tante, se separó la circulación de gas para cerrar el sistema del entorno exterior y se incubaron los músculos durante 90 min a 30ºC. Al final de este periodo, se inyectaron 15 0,45 ml de Solvable (Packard Instruments, Meriden, CT) sobre el papel Whatman en el pocillo central y se paró la oxidación del oleato por el músculo transfiriendo el vial al hielo.
Después de 5 min, se separó el músculo del medio, y se separó también una alícuota de 0,5 ml del medio. Se cerraron los viales de nuevo y se inyectó 1 ml de 20 ácido perclórico al 35 % con una jeringa hasta el medio penetrando a través del sép-tum de goma. Se recogió el CO2 liberado del medio acidificado mediante Solvable en el pocillo central. Después de un periodo de recogida de 90 min a 30ºC, se retiró el papel Whatman del pocillo central y se puso en viales de centelleo que contenían 15 ml de líquido de centelleo (HionicFlour, Packard Instruments, Meriden, CT). La canti-25 dad de radioactividad 14C se cuantificó por contaje de centelleo líquido. La tasa de oxi-dación del oleato se expresó como nmol de oleato producido en 90 min/g de músculo.
Para analizar el efecto de gACRP30 o ACRP30 sobre la oxidación del oleato, se añadieron estas proteínas al medio a una concentración final de 2,5 µg/mL y se mantuvieron en el medio a lo largo del procedimiento. 30
Se analizaron dos músculos de diferente capacidad oxidativa (sóleo y extensor digitorum longus (EDL)) (Fig. 19). Se aislaron los músculos EDL y sóleo de ambas patas de ratones C57BL/6J normales (n=18). Se incubó un músculo de cada par en medio con 2,5 µg/mL de gACRP30 (gris oscuro) y el otro en medio sin gACRP30 (con-trol - gris claro). Este diseño experimental permitió comparar la oxidación del oleato en 35 pares de músculos aislados del mismo animal. Se determinó la oxidación de 14C-oleato a lo largo de 90 minutos. La incubación de los músculos EDL y sóleo durante 90 mi-nutos en medio que contiene 2,5 µg/ml de gACRP30 conduce a un aumento estadísti-camente significativo de la oxidación de oleato (p<0,05, prueba t para datos empareja-dos, unilateral) o (p=0,0041, análisis de varianza con medidas repetidas, pruebas 5 monofactoriales de hipótesis para efectos intraindividuales) en ambos tipos de mús-culos.
Ambos tipos de músculos mostraron una respuesta significativa hacia gACRP30. El aumento relativo en la oxidación de los FFA fue del 17 % (p=0,03) y del 10 % (p=0,04) para EDL y sóleo, respectivamente. En los seres humanos, los 10 músculos representan aproximadamente el 25 % del peso corporal. Por tanto, incluso un aumento moderado en la oxidación de los ácidos grasos libres puede tener consecuencias cuantitativamente importantes sobre la utilización global de energía.
EJEMPLO 13: Efecto de gArcp30 sobre los Triglicéridos en Músculo e Hígado Aislados 15 de Ratones
Para determinar si el aumento de la oxidación de los FFA inducido por gACRP30 va acompañado también por un aumento del transporte de FFA al músculo o hígado, se midió el contenido de triglicéridos en el músculo de las extremidades posteriores y en el hígado después del tratamiento de los ratones con gACRP30. Se 20 extrajeron muestras de los músculos de las extremidades posteriores así como del hígado de animales tratados y sin tratar, y se determinó la concentración de ácidos grasos libres y triglicéridos siguiendo un método de extracción de lípidos habitual Shimabukuro, et al., "Direct antidiabetic effect of leptin through triglyceride depletion of tissues", Proc Natl Acad Sci USA 94, 4637-4641 (1997), seguido de análisis de TG y 25 FFA mediante el uso de equipos de análisis habituales.
El tratamiento a corto plazo de los animales con gACRP30 (2 inyecciones de 25 µg cada una administradas dentro de las 3 horas antes del sacrificio) no cambió el contenido de triglicéridos ni del músculo de las extremidades posteriores ni del tejido del hígado (no se muestran datos). Sin embargo, después de 3 días de tratamiento, 30 durante cuyo periodo los ratones C57BL/6J normales consumieron una dieta normal de roedores, los ratones que habían recibido 25 µg de gACRP30 dos veces al día mostraron un contenido significativamente más alto (p=0,002) de triglicéridos en el músculo (Fig. 20A) que los que recibieron solución salina (control: gris claro; gACRP30: gris oscuro). Esto estuvo en contraste con una falta de aumento de los tri-35 glicéridos en el hígado (Fig. 20B). Además, no se observó un aumento detectable en los TG del músculo después del día 16 de tratamiento demostrado independiente-mente por medida directa del contenido de TG en el músculo tiñendo con rojo oleoso O las secciones del microscopio congeladas. En resumen, los datos indican que el aumento del contenido de TG fue transitorio. 5
Estos datos son consistentes con la idea de que el gACRP30 aumenta la tasa de separación de los ácidos grasos libres del plasma al menos parcialmente al au-mentar su liberación al músculo; muchos de los FFA son oxidados inmediatamente mientras que algunos se almacenan como triglicéridos y son oxidados posteriormente. Se obtuvo un soporte adicional para esta interpretación midiendo la concentración de 10 cuerpos cetónicos en el plasma de animales tratados y no tratados después de una comida de alto contenido en grasas/sacarosa.
Los cuerpos cetónicos (KB) se producen en el hígado como resultado de la oxidación de los ácidos grasos libres, pero la formación de KB no se da de manera significativa en el músculo. En ratones que reciben la comida de ensayo de alto conte-15 nido en grasas y una inyección de solución salina, el nivel de KB en plasma aumentó de manera significativa durante las siguientes 3 horas (183 ± 12%, n=6). Los animales tratados con gACRP30, por otro lado, no mostraron aumento de las concentraciones de KB del plasma. Por lo tanto, el gACRP30 inhibe o bien directamente la formación de KB o puede reducir la producción de KB inhibiendo la oxidación de los FFA en el 20 hígado.
EJEMPLO 14: Efecto de gACRP30 sobre la Ganancia de Peso y la Pérdida de Peso en Ratones y sobre el Mantenimiento de la Pérdida de Peso en Ratones
Dos estudios independientes demostraron que el gACRP30 también afecta a la 25 homeostasis global de la energía. En el primero, se administró a ratones C57BL/67 machos de 10 semanas de edad una dieta purificada de muy alto contenido en gra-sas/sacarosa durante 19 días para promover la ganancia de peso (véase el Ejemplo 5); el peso corporal medio en este momento fue 30 g. Después se implantó quirúrgi-camente a los ratones una bomba osmótica (Alzet, Newark, DE) que administraba 2,5 30 µg/día de gACRP30, 5 µg/día de ACRP30, o solución salina fisiológica. Se mantuvo a los ratones con la dieta de alto contenido en grasas y se registró su peso corporal a lo largo del siguiente periodo de 10 días.
Los ratones tratados con solución salina o 5 µg/día de ACRP30 de tamaño completo continuaron ganando peso a una velocidad diaria media del 0,16% y 0,22%, 35 respectivamente. Por contraste, los ratones tratados con gACRP30 experimentaron una reducción de peso significativa (-3,7%, p = 0,002) durante los primeros 4 días y después su peso permaneció constante (Fig. 21A). Por lo tanto, en esta cepa endo-gámica de ratones normales, una infusión continua de una dosis diaria baja de gACRP30 puede prevenir la ganancia de peso causada por una alimentación de alto 5 contenido en grasas/sacarosa, de un modo sostenible.
Se confirmó este resultado y se extendió en un segundo estudio realizado en ratones C57BL/6J machos obesos, maduros, de 9 meses de edad, que habían reci-bido la misma dieta de alto contenido en grasas/sacarosa durante 6 meses; el peso corporal medio cuando el estudio comenzó fue 52,5±0,8 g. Tres grupos de 8 ratones 10 se trataron con solución salina, ACRP30 o gACRP30 durante 16 días. Los animales del grupo tratado recibieron dos veces al día 25 µg de proteína subcutáneamente. Se registraron los pesos corporales en los puntos de tiempo indicados.
El tratamiento con gACRP30 llevó a una pérdida de peso significativa (p < 0,05) el día 3. Este efecto se hizo aún más significativo cuando continuó el estudio. Durante 15 el periodo de estudio de 16 días, los ratones C57BL/6J obesos que recibieron gACRP30 perdieron aproximadamente 8 % (p=0,001) de su peso corporal inicial a pesar del hecho de haber sido mantenidos con una dieta de alto contenido en gra-sas/sacarosa (Fig. 21B). Los animales tratados con solución salina sólo presentaron fluctuaciones marginales en su peso corporal (p = n.s). Los animales tratados con 20 ACRP30 de longitud completa, pero a una dosis 10 veces más alta que la usada en el primer experimento, también perdieron peso significativamente (-3,2 %, p=0,025). De modo interesante, los ratones tratados con gACRP30 continuaron perdiendo peso a un ritmo constante durante el periodo de 16 días del estudio, mientras que el ritmo de reducción de peso en los tratados con el ACRP30 de longitud completa disminuyó du-25 rante la última fase del estudio. El consumo de alimentos en los animales tratados con gACRP30 no fue significativamente diferente del de los animales tratados con solución salina o con ACRP30 (Fig. 21D).
El tratamiento con gACRP30 causó una reducción significativa en la concentra-ción de ácidos grasos libres en el plasma (Fig. 21C). Este efecto fue significativo des-30 pués de 3 días de tratamiento (p<0,05 vs. solución salina) y continuó a lo largo del periodo completo del estudio. Se muestra el nivel de los FFA en el plasma el día 16 del estudio. La concentración inicial de FFA en el plasma fue la misma en los tres grupos de tratamiento. Se debe observar, sin embargo, que a pesar de esta reducción la con-centración de los ácidos grasos libres en el plasma de estos animales masivamente 35 obesos permanece aproximadamente 40-60 % más alta que la de los ratones norma-les. Un análisis químico de la sangre (que incluye la determinación de SGPT, SGOT, urea, creatinina o bilirrubina) realizado sobre las muestras terminales de sangre no reveló ningún parámetro anormal en el plasma (Fig. 22).
Los datos se expresan como la media ± SEM. Un valor de p < 0,05 se consi-5 deró estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó típicamente usando o la prueba t de Student no pareada o la prueba t de Student pareada, como se indica en cada estudio.
Mantenimiento de la pérdida de peso en ratones 10
Para demostrar las propiedades de mantenimiento de la pérdida de peso de gACRP30, se somete a ratones normales a una dieta calórica reducida para favorecer la pérdida de peso. La dieta calórica reducida continúa hasta que los ratones pierden un 10% de su peso inicial. Un segundo grupo de ratones continúan con la dieta de reducción de peso hasta que los ratones pierden un 20% de su peso inicial. Después 15 se implanta quirúrgicamente a los ratones una bomba osmótica (Alzet, Newark, DE) que administra 2,5 µg/día de gACRP30, 5 µg/día de ACRP30, o solución salina fisioló-gica. Los ratones se devuelven a una dieta normal y se registran sus pesos corporales durante un período de 10 días. Después de 10 días, se considerará que el resultado de que los ratones que se han tratado con gACRP30 tienen un peso inferior que los 20 ratones que se trataron con solución salina, prueba que el tratamiento con gACRP30 favorece el mantenimiento de la pérdida de peso.
EJEMPLO 15: Efecto de gACRP30 sobre los FFA después de una Inyección de Intralipid 25
Se inyectaron intravenosamente (vena caudal) a dos grupos de ratones (n=5 cada uno) 30 µL en inyección rápida de Intralipid al 20% (Clintec) para generar una subida rápida de los FFA del plasma, evitando de este modo la absorción intestinal. (Intralipid es una emulsión de grasa intravenosa usada en terapia nutricional). Se in-yectó a un grupo tratado (♦ tratado con gACRP30) con gACRP30 (25 µg) a 30 y 60 30 minutos antes de la administración de Intralipid, mientras que los animales de control (▲ control) recibieron solución salina. Se aisló el plasma y se midieron los FFA como se ha descrito previamente.
Después se monitorizó el efecto de gACRP30 sobre la caída de los FFA en el plasma después del pico inducido por la inyección de Intralipid. Como se muestra en la 35 Fig. 23, el gACRP30 acelera la separación de los FFA del plasma después de la in-yección de Intralipid. Por lo tanto, el gACRP30 acelera el aclaramiento de los FFA sin interferir con la absorción intestinal. Aunque sin desear limitarse por ninguna teoría, debido a que el Intralipid no produce una respuesta significativa a la insulina, los re-sultados indican también que la regulación por gACRP30 del metabolismo de los FFA 5 tiene lugar independientemente de la insulina.
EJEMPLO 16: Solubilización de OBG3 y de los Fragmentos del Mismo
Construcción del vector: Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos selecciona-10 dos de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cis-teína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID 15 NO:2; los aminoácidos 18-247,19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-20 247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 se clonan en el vector de expresión bacteriano pTrcHis.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos seleccionados de los ami-noácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-25 244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; los ami-noácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los ami-noácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-30 247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 se clonan en un vector de expresión bacteriano modifi-cado pET30a (proporcionando un marcador de His en el extremo C-terminal del poli-35 péptido APM1 o ACRP30).
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos seleccionados de los ami-noácidos 1-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) o aminoácidos 1-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) se clonan en el vector de expresión Baculoviral FastBacHT. Los polinucleó-tidos que codifican un polipéptido heterólogo compuesto por el péptido señal de la 5 zinc-alfa 2-glicoproteína humana fusionado de manera N-terminal al fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención, en los que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 10 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ IDNO:2; los aminoácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 15 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4, se clonan en el vector de expresión Baculoviral FastBacHT.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que comprenden los 20 aminoácidos 1-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) o los aminoácidos 1-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) se clonan en el vector de expresión de mamíferos pcADN4HisMax. Los polinucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo compuesto por el péptido señal de la zinc-alfa 2-glicoproteína humana fusionado de manera N-terminal al fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención, en los que dicho fragmento del polipéptido 25 gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ 2D NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 30 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se susti-tuye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 35 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4, se clonan en el vector de expresión de mamíferos pcADN4HisMax.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden los aminoáci-dos 1-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) o los aminoácidos 1-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) se clonan en el vector de expresión de mamíferos pcADN3.1Hygro. Los 5 polinucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo compuesto por el péptido señal de la zinc-alfa 2-glicoproteína humana fusionado de manera N-terminal al fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención, en los que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 10 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-15 247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se susti-tuye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4, se clonan en el vector de expresión de mamíferos pcADN3.1Hygro. 20
De manera alternativa, los polinucleótidos que codifican polipéptidos que com-prenden los aminoácidos 1-244, 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto 25 de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 1-247, 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se 30 sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 se clonan en cualquier vector de ex-presión bacteriano, mamífero o baculoviral, preferiblemente seleccionado de pTrcHis, pET30a, FastBacHT, pcADN4His, o pcADN3.1Hygro. Además, de manera alternativa, los polinucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo compuesto por el péptido 35 señal de la zinc-alfa 2-glicoproteína fusionado de manera N-terminal al fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención, en los que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 5 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 10 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4, se clonan en cualquier vector de expresión bacteriano, mamífero o baculoviral, preferiblemente seleccionado de pTrcHis, pET30a, FastBacHT, pcADN4His, o pcADN3.1Hygro. 15
De manera alternativa, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos selec-cionados de los aminoácidos 1-244, 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido 20 distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 1-247, 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se 25 sustituye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 se clonan en un vector de expresión de Pichia Pastoris (levadura), preferiblemente PHIL-S1. Además, de manera alterna-tiva, los polinucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo compuesto por un péptido señal de la zinc-alfa 2-glicoproteína humana fusionado de manera N-terminal 30 al fragmento del polipéptido gOBG3 de la invención, en los que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244, 24-244, 25-244, 26-244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, 36-244, 37-244, 38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2 (APM1) en los que la cisteína de la posición 36 se sustituye por un aminoácido 35 distinto de cisteína; los aminoácidos 37-244,38-244, 39-244, 40-244, 41-244, ó 42-244 de SEQ ID NO:2; los aminoácidos 18-247, 19-247, 20-247, 21-247, 22-247, 23-247, 24-247, 25-247, 26-247, 27-247, 28-247, 29-247, 30-247, 31-247, 32-247, 33-247, 34-247, 35-247, 36-247, 37-247, 38-247, 39-247, 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4 (ACRP30) en los que la cisteína de la posición 39 se susti-5 tuye por un aminoácido distinto de cisteína; o los aminoácidos 40-247, 41-247, 42-247, 43-247, 44-247, ó 45-247 de SEQ ID NO:4, se clonan en un vector de expresión de Pichia Pastoris (levadura), preferiblemente PHIL-S1.
Crecimiento celular e inducción de la expresión de OBG3: Se transformaron células 10 hospedadoras E. coli DH5alpha con un vector de expresión pTrcHis que contenía el polinucleótido de SEQ ID NO:1 que codifica un polipéptido que comprende los resi-duos de aminoácidos 110-244 de APM1 (SEQ ID NO:2), también denominado gAPM1 (110-244). Las células se cultivaron durante la noche a temperatura ambiente (~22ºC) y se indujeron a una densidad aproximada (OD600) de 0,45. Las células se indujeron 15 con IPTG 1 mM durante 6 horas a temperatura ambiente. Las células se recogieron y se lisaron con una prensa de French y sonicación en tampón que comprendía Bis-Tris-Propano 50 mM, pH 8,75, 1% de Triton X-100, MgCl2 5 mM y CaCl2 5 mM y NaCl 50 mM. Los extractos se centrifugaron para obtener una fracción soluble. La proteína so-luble de la fracción de sobrenadante se pasó a través de una columna de afinidad de 20 Ni a 5ºC. La columna se lavó después con imidazol 25 mM. De manera alternativa, se usan varios lavados con imidazol creciente hasta 25 mM. La proteína gAPMl (110-224) se eluyó de la columna con una concentración de imidazol 100 mM. El eluyente que comprendía la fracción de gAPMl (110-244) se hizo pasar a través de una columna de intercambio iónico con el uso de una resina de DEAE. De manera alternativa, se usa 25 una columna de hidroxiapatita. La proteína gAPMl (110-244) se eluyó con un tampón de salinidad elevada y se dializó para reducir la concentración salina. Este material se usó en el Ejemplo 18 para ensayar el efecto sobre la oxidación de FFA.
EJEMPLO 17: Efecto de gAPMl sobre la Oxidación de Ácidos Grasos Libres 30
Se compararon las proteínas marcadas gAPMl-marcador de His (110-244), gACRP30-marcador de his (104-247) y gACRP30 (104-247)-N-term-His/C-term-Flag en función de su actividad en un ensayo de oxidación de ácidos grasos libres (FFA). Brevemente, se cultivaron células C2C12 y células SKMC hasta una confluencia del ~95%. Las células se diferenciaron durante 7 días. Las células se privaron de nutrien-35 tes durante la noche en DME exento de suero que contenía un 0,5% de Albumax I (BSA rico en ácidos grasos). Después las células se preincubaron en un medio que comprendía medio basal Eagle (BME), HEPES 20 mM, pH 7,4, L-Glutamina 4 mM, 1% de BSA exento de ácidos grasos (0,15 mM). (Como control negativo, se incluyó un matraz sin células con 2 ml de medios de preincubación solamente). Las células se 5 trataron con 5,0 ug/ml de gACRP30 escindido con tripsina (0,275 mg/ml), 5,0 ug/ml de gACRP30 expresado en bacterias (0,36 mg/ml), 5,0 ug/ml de gACRP30 expresado en bacterias marcado con His-Flag (0,24 mg/ml), 5,0 ug/ml de gAPMl (110-244) (0,09 mg/ml) expresado en bacterias (la expresión bacteriana se describe en el Ejemplo 17) durante 2 horas a 37ºC. Como control positivo, se añadió isoproterenol 100 uM a las 10 células 15 minutos antes de la adición de ácido perclórico.
Las células tratadas se ensayaron como sigue:
1. Se añadieron 100 ul de medio con ácido palmítico 4 mM y 4 uCi/ml ácido 14C-palmítico a cada uno de los matraces, y las células se incubaron a 37ºC du-rante 90 minutos. 15
2. Mediante el uso de una jeringa de tipo Luer-lock de 1 ml, se inyectó Solvable en el pocillo central que contenía un papel de filtro aproximadamente 15 min antes de añadir el ácido perclórico.
3. Mediante el uso de una jeringa de tipo Luer-lock de 1 ml, se añadió 1 ml de ácido perclórico y las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC. 20
4. Después de 1 hora, se añadieron 15 ml de Hionic Fluor y el papel de filtro se transfirió a un vial de centelleo apropiado y se agitó durante 30 min a 4ºC, y después se llevó a cabo el recuento.
Los gAPMl (110-244), gACRP30 (104-247) marcados con His de manera N-terminal e isoproterenol (control positivo) incrementaron de manera significativa la oxi-25 dación de FFA por encima de las células sin tratar. La proteína de ratón recombinante que contenía tanto un marcador de His N-terminal como un marcador FLAG C-terminal no fue activa en este ensayo.
EJEMPLO 18: Evaluación in vivo de OBG3 de fragmentos del polipéptido gOBG3 de la 30 invención.
Evaluación de 7 días: Se estableció un protocolo de estudio para evaluar el efecto sobre el metabolismo de los lípidos o de la glucosa de los polipéptidos gOBG3 recombinantes aislados y purificados de la invención, por ejemplo, los aminoácidos 101-244, 105-244, 110-244, 19-244, 111-191, 191-244, y 144-199 de SEQ ID NO:2, y 35 los aminoácidos 104-247 de SEQ ID NO:4, y los análogos marcados con His de los mismos. Este protocolo se puede ampliar para incluir el cribado eficaz de cualquier polipéptido para el uso potencial en métodos para alterar el metabolismo de los lípidos o la glucosa. Una característica de este protocolo es la longitud experimental a corto plazo, así como la detección de efectos experimentales a medio plazo. Los ratones se 5 tratan durante un total de 7 días. Al inicio del tratamiento, se miden los efectos agudos sobre el metabolismo de grasas/glucosa o sobre la producción de glucosa hepática llevando a cabo un estudio de lipemia postprandial (PPL) o una prueba de tolerancia a la glucosa (ITT), respectivamente. Los efectos a corto plazo sobre la química sanguí-nea se determinan después de 3-4 días de tratamiento, y se lleva a cabo un análisis 10 completo al final del periodo de tratamiento. Esto incluye un segundo estudio, ya sea PPL, ITT u OGTT (prueba de tolerancia a la glucosa oral). Además, se miden los efectos sobre el peso corporal, la composición corporal (% de tejido adiposo y no adi-poso), el almacenamiento de lípidos en el hígado y músculo y se aíslan tejidos para investigar los efectos sobre la expresión génica o para determinar los cambios histoló-15 gicos según métodos rutinarios conocidos en la técnica.
I. Ensayo de Tolerancia a la Glucosa
Se lleva a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa estándar (GTI) tras la in-yección de los polipéptidos de ensayo en ratones como sigue: 20
1. Los ratones se someten a ayuno durante 3-6 horas. El modelo estándar usa ratones macho C57B1/6 mantenidos con una dieta de alto contenido en grasas, esto da como resultado una sensibilidad a la insulina disminuida.
2. Se toma una muestra de sangre inicial de la cola y se mide el nivel de glucosa mediante el uso de tiras de análisis de glucosa y el 'One Touch Ultra System' 25 (Johnson & Johnson); como con todas las demás extracciones de sangre.
3. El tratamiento con el polipéptido de ensayo (5-150 ug/50 ul/ratón) se administra mediante inyección i.p. A los animales de control se les inyecta un volumen igual de solución salina.
4. Inmediatamente tras el tratamiento, se inyecta glucosa i.p. (Dosis: 1 g/kg de 30 peso corporal).
5. Después de realizar todas las inyecciones, se monitoriza el nivel de glucosa plasmática 30', 60', 90', y 120' tras el tratamiento.
6. Para la evaluación de 7 días, se inyecta a los ratones a la misma hora cada día durante 7 días consecutivos, y se lleva a cabo el ensayo GTT cada día de 35 acuerdo con la etapa 5 anterior.
II. Ensayo de Tolerancia a la Insulina
Se lleva a cabo una prueba de tolerancia a la insulina estándar (ITT) tras la in-yección de los polipéptidos de ensayo en ratones como sigue: 5
1. Los ratones se someten a ayuno durante 3-6 horas. El protocolo estándar usa ratones macho C57B1/6 mantenidos con una dieta de alto contenido en grasas, esto da como resultado una sensibilidad a la insulina disminuida.
2. Se toma una muestra de sangre inicial de la cola y se mide el nivel de glucosa mediante el uso de tiras de análisis de glucosa y el 'One Touch Ultra System' 10 (Johnson & Johnson), como con todas las demás extracciones de sangre.
3. El tratamiento con la proteína de ensayo (5-150 ug/50 ul/ratón) se administra mediante inyección i.p. A los animales sin tratar se les inyecta un volumen igual de solución salina.
4. Inmediatamente tras el tratamiento, se inyecta insulina (Dosis: 0,3 UI/kg de 15 peso corporal).
5. Se monitoriza el nivel de glucosa plasmática 15', 30', 60', 90', y 120' tras el tratamiento.
6. Para la evaluación de 7 días, se inyecta a los ratones a la misma hora cada día durante 7 días consecutivos, y se lleva a cabo el ensayo ITT cada día de 20 acuerdo con la etapa 5 anterior.
III. Ensayo de Lipemia Postprandial
Se lleva a cabo un ensayo de lipemia postprandial estándar (PPL) tras la in-yección de los polipéptidos de prueba en ratones como sigue: 25
1. Los ratones se someten a ayuno durante 3-6 horas. El protocolo estándar usa ratones macho C57B1/6 normales.
2. Se toma una muestra de sangre inicial de la cola.
3. Se administra una comida de ensayo de alto contenido en grasas/sacarosa (6 g de mantequilla, 6 g de aceite de girasol, 10 g de leche en polvo descremada, 30 10 g de sacarosa, 12 ml de agua destilada recién preparada) mediante sonda (Dosis: 1% del peso corporal total del animal en ml).
4. Tras la comida de prueba, los animales se tratan con la proteína de ensayo (5-150 ug/50 ul/ratón) administrada mediante inyección i.p. A los animales sin tratar se les inyecta un volumen igual de solución salina. Este tratamiento se 35 repite cada día a lo largo de un estudio de evaluación de 7 días.
5. Se toman muestras de sangre a las 1, 2, 3 y 4 hr tras el tratamiento. Las muestras se almacenan inmediatamente en hielo hasta la separación del plasma.
6. Se ensayan los parámetros metabólicos en las muestras de plasma, lo que 5 incluye la glucosa, insulina, leptina, triglicéridos, y FFAs.
Se determinó la concentración de glucosa plasmática como se describió ante-riormente en el ensayo GTT mediante el uso del 'One Touch Ultra System'. De manera alternativa, se usa un equipo de análisis de glucosa estándar (Sigma). Se determina la concentración de los triglicéridos y de los ácidos grasos libres (FFAs) mediante el uso 10 de ensayos calorimétricos (Triglicéridos, Sigma; FFA, Wako Biochemicals, Osaka). La insulina y la leptina se determinan mediante RIA (Linco Research, St Charles, MO).
Además del protocolo de estudio de evaluación de 7 días, se pueden llevar a cabo los ensayos GTT, ITT, y PPL en estudios de cualquier duración, lo que incluye periodos de un único día, a corto plazo, y a largo plazo tras la inyección de los poli-15 péptidos de ensayo.
EJEMPLO 19: Complementación de la leche de inicio
El siguiente ejemplo describe un método para administrar polipéptidos gOBG3 a recién nacidos como soporte nutritivo complementario y proporciona además un 20 método para favorecer el crecimiento de un lactante mediante la administración de leche materna humana enriquecida con gOBG3, o una formulación sustituta de la le-che materna enriquecida con gOBG3 de una fuente que no es humana. El polvo de polipéptido gOBG3 deshidratado o liofilizado se añade directamente a leche materna humana extraída (recién extraída o precalentada tras el almacenamiento) o cualquier 25 formulación sustituta de la leche materna precalentada de una fuente que no es humana, en un intervalo de 5-1000 ng/ml, preferiblemente 20-800 ng/ml, más preferi-blemente 65-650 ng/ml. La complementación con los polipéptidos de la invención se proporciona a lactantes, en particular a lactantes prematuros, en biberones de leche materna humana o leche materna sustituta en todas las alimentaciones del día, y se 30 sigue proporcionando desde el nacimiento hasta los 6 meses de edad. Los recién na-cidos prematuros pueden tener un peso bajo o muy bajo en el nacimiento.
El objetivo principal del estudio es demostrar que un polipéptido de la invención añadido a la leche humana (HM) o a un sustituto de la leche humana (HMS) favorece el crecimiento aceptable en lactantes prematuros. Un objetivo secundario es evaluar la 35 bioquímica del suero (es decir, el estado de las proteínas, calcio, fosfatasa alcalina), la tolerancia, los problemas clínicos, y la morbilidad de los lactantes prematuros que con-sumen el módulo nutricional. Otro objetivo secundario es comparar la composición complementaria de la presente invención con un polvo enriquecido comercial que se ha usado durante varios años para favorecer el crecimiento de lactantes prematuros. 5 Se lleva a cabo un estudio multicéntrico, con enmascaramiento doble, aleatorizado, prospectivo, por intención de tratar, para evaluar a los lactantes prematuros que reci-ben leche para prematuros complementada con una composición de enriquecimiento de leche humana en polvo disponible comercialmente (Enfamil, RTM, Human Milk Fortifier, control) o el polvo de polipéptido de complementación (de ensayo) de la pre-10 sente invención (experimental) en cada alimentación. Los sujetos se inscriben y se asignan aleatoriamente a cada polvo enriquecido antes de los 21 días de vida. El Día de Estudio 1 es cuando comienza el enriquecimiento del polvo de ensayo y el sujeto alcanza una ingesta de al menos 100 mL/kg/día. Se determinan los índices antropo-métricos, la bioquímica del suero, la ingesta, la tolerancia y los datos de morbilidad. 15 Cada lactante se estudia hasta el alta hospitalaria; solamente las variables antropo-métricas (peso, longitud, y perímetro craneal) se recogen tras el Día de Estudio 29. Los lactantes prematuros se inscriben en unidades de cuidados intensivos neonatales que han aceptado colaborar con los investigadores del estudio. Son seleccionables para participar los lactantes individuales, gemelos, o trillizos nacidos aproximadamente 20 con una edad gestacional de 33 semanas, con un peso apropiado para la edad gesta-cional, y que pesan alrededor de 1600 g. Se asignan aleatoriamente ciento cuarenta y cuatro lactantes al grupo de control o al grupo experimental; 70 lactantes prematuros se asignan aleatoriamente al grupo de control, y 74 lactantes prematuros se asignan aleatoriamente al grupo experimental. La asignación aleatoria es proporcional al peso 25 en el nacimiento y el sexo.
Las variables independientes (tratamientos) son el polvo de enriquecimiento de control y el polvo de ensayo experimental que se añaden a HM o HMS. Ambas com-posiciones de enriquecimiento (de ensayo y de control) se proporcionan en paquetes pequeños de forma de polvo, y se añaden a 25 mL de HM o HMS. La variable primaria 30 de respuesta es la ganancia de peso (g/kg/día) desde el día de estudio 1 hasta el día de estudio 29 o el alta hospitalaria, lo que ocurra antes. Las variables secundarias de respuesta son la ganancia de longitud (mm/día) y la bioquímica del suero para evaluar el estado de las proteínas, el estado de los electrolitos, la homeostasis mineral, y el estado de las vitaminas A y E. La bioquímica del suero incluye también los resultados 35 de laboratorio no programados para ser registrados en el gráfico médico. Las variables terciarias incluyen la ganancia de perímetro craneal (mm/día), la historia clínica, la ingesta, la tolerancia, los problemas clínicos/morbilidad, el estado respiratorio, el uso de antibióticos, y el número de transfusiones. La ingesta media de energía total du-rante el periodo de estudio no es diferente entre los grupos, alrededor de 118 5 kcal/kg/día.
EJEMPLO 20: Determinación de la formación de homotrímeros a partir de fragmentos del polipéptido gOBG3.
La formación de homotrímeros de fragmentos del polipéptido gOBG3 se deter-10 mina mediante el uso del equilibrio de sedimentación en centrífugas analíticas, un método que determina el peso molecular de manera precisa e independientemente de otros factores físicos tales como la forma.
El homotrímero de fragmentos del polipéptido gOBG3 candidato se purifica, por ejemplo mediante el uso de un protocolo que comprende un método de filtración en gel 15 tal como la columna de filtración en gel 16/60 superdex 200 (Amersham). Dicha con-centración proteica de homotrímero de fragmentos del polipéptido gOBG3 candidato purificado se lleva a 3 µM en fosfato 5,7 mM (pH 7,5), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM. Las muestras se centrifugan a 8,000 rpm durante 18 horas a 10ºC en una ultracentrífuga analítica Beckman XL-A antes de registrar la absorbancia. Los datos se ajustan glo-20 balmente mediante el uso de MacNonlin PPC a la siguiente ecuación que describe la sedimentación de una especie homogénea: Abs = B + A' exp[H x M (x2-x02] en la que Abs = absorbancia a radio x, A' = absorbancia a un radio de referencia x0, H = (1-νρ)ω2/2RT, R = constante de los gases, T = temperatura en Kelvin, ν = volumen espe-cífico parcial = 0,71896131 mL/g, ρ = densidad del disolvente = 1,0061 g/ml, ω = velo-25 cidad angular en radianes/s, M = peso molecular aparente, y B = absorbancia del di-solvente (blanco).
REFERENCIAS ADICIONALES
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<110> Lucas, John
Yeh, Jiunn-chern
Dialynas, Deno 5
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10
<160> 5
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
<210> 1 15
<211> 4517
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> 20
<221> CDS
<222> (27)...(761)
<400> 1
25
<210> 2
<211> 244 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
10
<210> 3
<211> 1276
<212> ADN 5
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (46)...(789) 10
<400> 3
<210> 4
<211> 247
<212> PRT 5
<213> Mus musculus
<220>
<221> VARIANTE
<222> 50 10
<223> Aminoácido polimórfico Pro o Ser
<221> VARIANTE
<222> 74
<223> Aminoácido polimórfico Ala o Ser 15
<221> VARIANTE
<222> 113
<223> Aminoácido polimórfico Met o Val
<221> VARIANTE 5
<222> 117
<223> Aminoácido polimórfico Ala o Gly
<221> VARIANTE
<222> 148 10
<223> Aminoácido polimórfico Gly o Asn
<221> VARIANTE
<222> 243
<223> Aminoácido polimórfico Tyr o Phe 15
<400> 4
<210> 5 20
<211> 20966
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5 25

Claims (11)

  1. 5 REIVINDICACIONES
    1. Un fragmento globular homotrimérico de un polipéptido que tiene SEQ ID NO: 2 (gOBG3), en el que dicho fragmento del polipéptido gOBG3 se selecciona de los aminoácidos 18-244, 19-244, 20-244, 21-244, 22-244, 23-244. 24-244, 25-244, 26-5 244, 27-244, 28-244, 29-244, 30-244, 31-244, 32-244, 33-244, 34-244, 35-244, ó 36-244 de SEQ ID NO: 2, en el que la cisteína de la posición 36 se sustituye con un ami-noácido distinto de cisteína.
  2. 2. El fragmento de polipéptido según la reivindicación 1, en el que el 10 aminoácido distinto de cisteína es serina.
  3. 3. El fragmento de polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el fragmento está fusionado con un péptido de la región IgG-Fc.
    15
  4. 4. Un polinucleótido, o el complemento del mismo, que codifica el frag-mento del polipéptido gOBG3 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 4.
    20
  6. 6. Una célula hospedadora transformada que comprende un vector según la reivindicación 5.
  7. 7. Una composición que comprende un vehículo y un fragmento del polipéptido gOBG3 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 25
  8. 8. Un fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en la prevención de la ganancia de peso, para el uso en la reducción del peso y para el uso en el mantenimiento de la pérdida de peso.
    30
  9. 9. Un fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la obesidad seleccio-nado de obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, ateroes-clerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, apoplejía, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus 35 insulinodependiente (IDDM o diabetes tipo I).
  10. 10. Un fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en la disminución de los niveles circulantes en sangre, suero o plasma de: (i) ácidos grasos libres, (ii) glucosa, y/o (iii) triglicéridos. 5
  11. 11. Un fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en la estimulación de la oxidación de lípidos o ácidos grasos libres en el músculo.
    10
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