ES2295415T3 - Fragmentos de la glicoproteina zn-alfa2 humana y su uso en metodos de tratamiento de la obesidad. - Google Patents

Abstract

Un método para cribar un antagonista que bloquea la unión de un polipéptido APM1 o un fragmento de polipéptido APM1 a un polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I, que comprende a) poner en contacto el polipéptido APM1 según la ID SEC Nº: 4 o un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 108-244 de la ID SEC Nº: 4 con un polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I que comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 o los aminoácidos 18-295 de la ID SEC Nº: 3 en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo; y b) detectar la unión del polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I que comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 o los aminoácidos 18-295 de la ID SEC Nº: 3 al polipéptido APM1 según la ID SEC Nº: 4, o un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 108-244 de la ID SEC Nº: 4 en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo.

Description

Fragmentos de la glicoproteína ZN-\alpha2 humana y su uso en métodos de tratamiento de la obesidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la investigación metabólica, en particular al descubrimiento de compuestos eficaces para reducir la masa corporal y útiles para tratar enfermedades y trastornos relacionados con el metabolismo. Las enfermedades o trastornos relacionados con el metabolismo que se prevé tratar mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperlipidemia, aterosclerosis, diabetes e hipertensión.

Antecedentes de la invención

La siguiente discusión pretende facilitar el entendimiento de la invención, pero no se pretende ni se acepta que sea el estado de la técnica para la invención.

La obesidad es un problema sanitario que es grave, generalizado y creciente. En los Estados Unidos, el 20 por ciento de la población es obesa; en Europa, es obeso un porcentaje ligeramente menor (Friedman (2000) Nature 404:632-634). La obesidad está asociada a un riesgo incrementado de hipertensión, enfermedad cardiovascular, diabetes y cáncer, así como complicaciones respiratorias y osteoartritis (Kopelman (2000) Nature 404:635-643). Incluso una pequeña pérdida de peso mejora estas enfermedades asociadas.

Aunque se admite que los factores asociados con el estilo de vida, que incluyen el entorno, la dieta, la edad y el ejercicio, desempeñan un papel en la obesidad, los estudios con gemelos, los análisis de agregación familiar y los estudios de adopción indican que la obesidad es en gran medida el resultado de factores genéticos (Barsh et al (2000) Nature 404:644-651). El hecho de que se esté identificando un número creciente de genes relacionados con el metabolismo está de acuerdo con estos estudios. Algunos de los genes estudiados de manera más exhaustiva incluyen los que codifican leptina (ob) y su receptor (db), proopiomelanocortina (Pomc), receptor de melanocortina-4 (Mc4r), proteína agouti (A^{Y}), carboxipeptidasa E (fat), receptor de 5-hidroxitriptamina 2C (Htr2c), hélice-bucle-hélice básico nesciente 2 (Nhlh2), prohormona convertasa 1 (PCSK1), y proteína tubby (tubby) (resumidos en Barsh et al (2000) Nature 404:644-651).

El documento WO 99/62939 se refiere a una glicoproteína de un peso molecular de alrededor de 43 kDa que está presente en la orina de pacientes humanos con caquexia neoplásica, y producida por la línea de células tumorales murinas MAC16, que tiene actividad lipolítica y de movilización de lípidos. Se describe que esta proteína es muy similar a la zinc-\alpha-2-glicoproteína (ZAG) informada por primera vez por Burgi y Schmidt (1961) J. Biol. Chem. 236:1066-1074. Araki et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:679-683 determinó la secuencia de aminoácidos de la zinc-\alpha-2-glicoproteína de plasma humano, según la cual la cadena polipeptídica consiste en 276 aminoácidos que se pliegan en 3 dominios.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en la proteína interaccionante con ZAG de Genset (GZIP) y sus fragmentos. Los fragmentos de polipéptidos GZIP biológicamente activos comprenden todo o parte del sitio de unión a APM1 (ABS). Los fragmentos de polipéptido GZIP que contienen todo o parte del ABS se unen a la región globular de homología con C1q de APM1 (gAPM1). Los polipéptidos GZIP biológicamente activos, solos o en combinación con polipéptidos gAPM1, poseen efectos inesperados in vitro e in vivo por lo que se refiere a su actividad biológica incrementada como se describe aquí, lo que incluye la utilidad para la reducción de peso, la prevención del aumento de peso y el control de las concentraciones sanguíneas de glucosa en humanos y en otros mamíferos. Más específicamente, las actividades biológicas de los polipéptidos GZIP y gAPM1 en combinación tienen un efecto mayor que el efecto esperado de los dos polipéptidos solos. Estos efectos incluyen la reducción de las concentraciones elevadas de ácidos grasos libres provocadas por la administración de epinefrina, la inyección i.v. de "Intralipid" o la administración de una comida de ensayo elevada en grasas, así como la oxidación incrementada de los ácidos grasos en las células musculares, la reducción de las concentraciones de glucosa, la modulación del gasto energético, la resistencia a la insulina y la pérdida de peso en mamíferos que consumen una dieta elevada en grasas/elevada en sacarosa.

GZIP es una glicoproteína de 42 kDa que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I. La estructura genómica de GZIP es análoga a la de la cadena pesada de HLA de clase I y refleja la estructura de dominios del polipéptido zinc-\alpha-2-glicoproteína (ZAG). El polipéptido GZIP tiene la estructura de dominios: (péptido señal)-(dominio \alpha1)-(dominio \alpha2)-(dominio \alpha3). Los dominios \alpha1 y \alpha2 de GZIP establecen una hendidura de unión para el ácido graso. El dominio \alpha3 de GZIP contiene un sitio de unión para la región globular de homología con C1q del fragmento de polipéptido APM1 (gAPM1). Este sitio de unión de APM1 (ABS) se definió por medio de clones de cADN de GZIP solapantes extraídos como presas en un ensayo de cribado de doble híbrido mediante el uso de gAPM1 como cebo (véase el Ejemplo 15). En base a estos resultados, se cree que GZIP proporciona directa o indirectamente dos señales (en lugar de solamente una) a su célula objetivo, por ejemplo una proporcionada por medio del ácido graso unido y otra proporcionada por medio de gAPM1 unido. Juntos, el polipéptido o fragmento de polipéptido GZIP, y el polipéptido o fragmento de polipéptido APM1, tienen efectos biológicos que son inesperados en base a los efectos manifestados por los polipéptidos individuales o los fragmentos de polipéptidos solos.

Así, la invención se dirige a un método de cribado como se define en las reivindicaciones.

En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de polipéptidos GZIP purificados, aislados o recombinantes para el método de cribado. En las realizaciones preferidas, los fragmentos de polipéptido GZIP que se usan comprenden los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221-242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 180-251, 192-251, 204-251, 221-251, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2. En otras realizaciones preferidas, los fragmentos de polipéptido GZIP que se usan comprenden los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200- 295, 206-295, 177-248, 189-248, 201-248, 218-248, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3.

Los polipéptidos GZIP son capaces de unirse con los polipéptidos APM1. Los polipéptidos GZIP son capaces de unirse con la región globular de homología con C1q de los polipéptidos APM1, que aquí se llama "gAPM1". Los fragmentos del polipéptido APM1 que son capaces de unirse con GZIP se seleccionan de los aminoácidos 18-244, 93-244, 101-244, 108-244 de la ID SEC Nº: 4. Los polipéptidos APM1 y gAPM1, y sus fragmentos, se describen en la publicación PCT WO 01/51645.

La invención proporciona un método de uso de un fragmento de polipéptido GZIP en un método para cribar compuestos en busca de uno o más antagonistas que bloquean la unión de los polipéptidos APM1 de la invención a los polipéptidos GZIP de la invención.

En una realización preferida, dicho compuesto se selecciona de, pero no se limita a, un compuesto orgánico o inorgánico de peso molecular bajo, proteína, péptido, carbohidrato o lípido. Opcionalmente, dicho compuesto es un fragmento de polipéptido GZIP seleccionado de los aminoácidos 221-242 de la ID SEC Nº: 2 ó 218-239 de la ID SEC Nº: 3.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la invención con más detalle, se exponen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de las expresiones usadas para describir aquí la invención.

Como se usa aquí de manera intercambiable, las expresiones "oligonucleótidos" y "polinucleótidos" y "ácido nucleico" incluyen secuencias de ARN, ADN o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria. Las expresiones abarcan "nucleótidos modificados" que comprenden al menos una modificación, lo que incluye a modo de ejemplo y sin limitación: (a) un grupo de unión alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un carbohidrato análogo. Para los ejemplos de grupos de unión, purinas, pirimidinas y carbohidratos análogos, véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 95/04064. Las secuencias polinucleotídicas de la invención se pueden preparar mediante cualquier método conocido, que incluye la generación sintética, recombinante, ex vivo, o una combinación suya, así como la utilización de los métodos de purificación conocidos en la técnica.

Las expresiones construcción polinucleotídica, polinucleótido recombinante y polipéptido recombinante se usan aquí de manera coherente con su uso en la técnica. Las expresiones "en dirección 5'" y "en dirección 3'" también se usan aquí de manera coherente con su uso en la técnica. Las expresiones "emparejamiento de bases" y "emparejamiento de bases de Watson y Crick" se usan de manera intercambiable aquí, y de manera coherente con su uso en la técnica. De forma similar, las expresiones "complementario", "su complemento", "complemento", "polinucleótido complementario", "ácido nucleico complementario" y "secuencia nucleotídica complementaria" se usan de forma intercambiable aquí y de manera coherente con su uso en la técnica.

El término "purificado" se usa aquí para describir un polinucleótido o vector polinucleotídico de la invención que se ha separado de otros compuestos que incluyen, pero no se limitan a, otros ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis del polinucleótido). Purificado se puede referir también a la separación de polinucleótidos cerrados covalentemente de polinucleótidos lineales, o viceversa, por ejemplo. Un polinucleótido está sustancialmente puro cuando al menos alrededor de un 50%, 60%, 75% o 90% de una muestra contiene una única secuencia polinucleotídica. En algunos casos esto implica una determinación entre conformaciones (lineal frente a cerrado covalentemente). Un polinucleótido sustancialmente puro comprende típicamente alrededor de un 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% peso/peso de una muestra de ácido nucleico. La pureza u homogeneidad del polinucleótido se puede señalar mediante varios medios conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida de una muestra, seguido de visualización de una única banda de polinucleótido al teñir el gel. Para ciertos fines se puede proporcionar una resolución más elevada mediante el uso de HPLC o de otros medios conocidos en la técnica.

De forma similar, el término "purificado" se usa aquí para describir un polipéptido de la invención que se ha separado de otros compuestos que incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otras proteínas. En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido está sustancialmente puro cuando al menos alrededor de un 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de las moléculas de polipéptido de una muestra tienen una única secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones preferidas, un polipéptido sustancialmente puro comprende típicamente alrededor de un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% peso/peso de una muestra de proteína. La pureza u homogeneidad del polipéptido se señala mediante varios métodos conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida de una muestra, seguido de visualización de una única banda de polipéptido al teñir el gel. Para ciertos fines se puede proporcionar una resolución más elevada mediante el uso de HPLC o de otros métodos conocidos en la técnica.

Además, como se usa aquí, el término "purificado" no requiere una pureza absoluta; en su lugar, pretende ser una definición relativa. Se contempla expresamente la purificación de un material de partida o material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. De forma alternativa, la purificación se puede expresar como "al menos" una pureza en porcentaje respecto de polinucleótidos (ADN, ARN o ambos) o polipéptidos heterólogos. Como una realización preferida, los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención son al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% puros respecto de los polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Como una realización preferida adicional, los polinucleótidos o polipéptidos tienen una pureza que oscila "al menos" a partir de cualquier número, hasta las milésimas, entre el 90% y el 100% (p.ej., al menos un 99,995% puro) respecto de los polinucleótidos o polipéptidos heterólogos. Además, la pureza de los polinucleótidos o polipéptidos se puede expresar como un porcentaje (como se describió anteriormente) respecto de todos los materiales y compuestos distintos de la disolución portadora. Cada número, hasta las milésimas, se puede considerar como una especie individual de pureza.

La expresión "aislado" requiere que el material se extraiga de su medio original (p.ej., el medio natural si se da de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se da de forma natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal polinucleótido podría ser parte de un vector, o tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y todavía estar aislado, ya que el vector o la composición no es parte de su medio natural.

Están excluidos específicamente de la definición de "aislado": los cromosomas naturales (p.ej., extensiones cromosómicas), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas, y bibliotecas de cADN que existen como una preparación de ácidos nucleicos in vitro o como una preparación de células hospedadoras transfectadas/transformadas, en las que las células hospedadoras son una preparación heterogénea in vitro o están colocadas en placas como una población heterogénea de colonias únicas. También están excluidas específicamente las bibliotecas anteriores en las que una EST en 5' constituye menos de un 5% (o alternativamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 10%, 25%, 50%, 75%, o 90%, 95%, o 99%) del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas de vector. Además, están excluidas específicamente las preparaciones de ADN genómico celular completo o de ARN celular completo (que incluyen dichas preparaciones de células completas que se rompen de forma mecánica o se digieren enzimáticamente). Además, están excluidas específicamente las anteriores preparaciones de células completas en forma de una preparación in vitro o en forma de una mezcla heterogénea separada mediante electroforesis (que incluye las transferencias de la misma) en las que el polinucleótido de la invención no se ha separado adicionalmente de los polinucleótidos heterólogos del medio de electroforesis (p.ej., mediante separación adicional cortando una única banda de una población de bandas heterogéneas en un gel de agarosa o una transferencia en nailon).

El término "cebador" denota una secuencia oligonucleotídica específica que es complementaria a una secuencia nucleotídica seleccionada como objetivo, y que se usa para hibridar a la secuencia nucleotídica seleccionada como objetivo. Un cebador sirve como punto de iniciación para la polimerización nucleotídica catalizada por una ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa.

El término "sonda" denota un segmento de ácido nucleico definido (o un segmento de análogo de nucleótidos, p.ej., APN como se define más adelante) que se puede usar para identificar una secuencia polinucleotídica específica presente en una muestra, y dicho segmento de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia polinucleotídica específica a identificar.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin tener en cuenta la longitud del polímero. Así, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término no especifica o excluye las modificaciones tras la expresión de los polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares están abarcados expresamente por el término polipéptido. También están incluidos dentro de la definición los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, los aminoácidos que no se dan de forma natural, los aminoácidos que se dan de forma natural solamente en un sistema biológico no relacionado, los aminoácidos modificados de los sistemas mamíferos, etc.), los polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, que se dan tanto de forma natural como no natural.

Sin limitarse por la teoría, los polipéptidos GZIP son capaces de modular la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos, y así se cree que tratan "las enfermedades que implican la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos". La expresión "tejidos periféricos" pretende incluir el tejido muscular y adiposo. Los polipéptidos GZIP distribuyen los lípidos alimentarios hacia el músculo, el tejido adiposo o el hígado. Los polipéptidos GZIP incrementan o disminuyen la oxidación de los lípidos alimentarios, preferiblemente los ácidos grasos libres (AGL) en el músculo. Los lípidos alimentarios incluyen, pero no se limitan a, triglicéridos y ácidos grasos libres.

Las enfermedades que se cree que implican la distribución de los lípidos alimentarios incluyen la obesidad y las enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad tales como la obesidad, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (DMID, o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía y lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero no se limita a, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y tensión arterial elevada. Otros trastornos relacionados con la obesidad incluyen la hiperlipidemia y la hiperuricemia. Aún otras enfermedades o trastornos relacionados con la obesidad incluyen caquexia, deterioro progresivo, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia y bulimia.

El término "heterólogo", cuando se usa aquí, pretende designar cualquier polipéptido o polinucleótido distinto del polipéptido GZIP o de un polinucleótido que codifica un polipéptido GZIP de la presente invención.

Las expresiones "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" se definen según su significado habitual. Un significado definido expuesto en el M.P.E.P. controla un significado definido en la técnica, y un significado definido expuesto en el control de la jurisprudencia de jurisdicción federal controla un significado expuesto en el M.P.E.P. Teniendo esto en cuenta, las expresiones se pueden sustituir entre sí en toda la presente solicitud para dar el significado específico asociado a cada expresión.

La expresión "célula hospedadora recombinante para" un polinucleótido particular de la presente invención significa una célula hospedadora que ha sido alterada por la mano del hombre para que contenga dicho polinucleótido de una manera que no se halla de forma natural en dicha célula. Por ejemplo, dicha célula hospedadora se puede transfectar o transducir de forma transitoria o estable con dicho polinucleótido de la presente invención.

Las expresiones "actividad biológica", "respuesta biológica" y "efecto biológico", como se usan aquí incluyen, pero no se limitan a, la actividad de disminución de la concentración de ácidos grasos libres, actividad de disminución de la concentración de glucosa, actividad de disminución de la concentración de triglicéridos, estimulación de la lipolisis adiposa, estimulación de la oxidación de lípidos o ácidos grasos libres en el músculo, incremento de la captación de leptina en una línea de hepatocitos, reducción significativa del incremento posprandial de los ácidos grasos libres o la glucosa plasmática debidos a una comida elevada en grasas, reducción significativa o eliminación de la producción de cuerpos cetónicos como resultado de una comida elevada en grasas, incremento de la captación de glucosa en las células del músculo esquelético, adipocitos, eritrocitos o en el cerebro, incremento de la sensibilidad a la insulina, inhibición de la progresión desde la intolerancia a la glucosa hasta la resistencia a la insulina, reducción de la masa corporal, disminución de la masa adiposa, incremento de la masa muscular no adiposa, prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo, control de la glucosa sanguínea en personas con diabetes mellitus no insulinodependiente o diabetes mellitus insulinodependiente, tratamiento de la resistencia a la insulina, prevención del desarrollo de resistencia a la insulina y otras actividades descritas aquí.

El término "obesidad", como se usa aquí, se define en las clasificaciones de peso de la OMS (Kopelman (2000) Nature 404:635-643). El peso insuficiente es menor de 18,5 (delgado); el peso normal es 18,5-24,9 (normal); el sobrepeso de grado 1 es 25,0-29,9 (sobrepeso); el sobrepeso de grado 2 es 30,0-39,0 (obesidad); el sobrepeso de grado 3 es mayor o igual a un IMC de 40,0 (obesidad mórbida). IMC es el índice de masa corporal y está en kg/m^{2}. También se puede usar la circunferencia de la cintura para indicar un riesgo de complicaciones metabólicas, en el que en hombres una circunferencia igual o mayor de 94 cm indica un riesgo incrementado, e igual o mayor de 102 cm indica un riesgo sustancialmente incrementado. De forma similar para mujeres, igual o mayor de 80 cm indica un riesgo incrementado, e igual o mayor de 88 cm indica un riesgo sustancialmente incrementado. La circunferencia de la cintura se mide en cm en el punto medio entre el límite inferior de las costillas y el límite superior de la pelvis. Otras medidas de la obesidad incluyen, pero no se limitan a, el grosor de un pliegue cutáneo, que es una medida en cm del grosor de un pliegue cutáneo mediante el uso de plicómetro, y la bioimpedancia, que se basa en el principio de que la masa sin grasa conduce la corriente mejor que la masa grasa, debido a que es principalmente una disolución de electrolitos; la medida de la resistencia a una corriente débil (impedancia) aplicada a través de las extremidades proporciona una estimación de la grasa corporal mediante el uso de una ecuación obtenida empíricamente.

El término "diabetes", como se usa aquí, pretende abarcar el diagnóstico habitual de diabetes realizado a partir de cualquiera de los métodos que incluyen, pero no se limitan a, la siguiente lista: síntomas de diabetes (p.ej., poliuria, polidipsia, polifagia) más concentraciones plasmáticas de glucosa ocasionales mayores de o iguales a 200 mg/dl, en el que la glucosa plasmática ocasional se define en cualquier momento del día independientemente del momento del consumo de alimento o bebida; concentraciones plasmáticas de glucosa tras ayunar 8 horas menores de o iguales a 126 mg/dl; y concentraciones plasmáticas de glucosa mayores de o iguales a 200 mg/dl 2 horas después de la administración oral de 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua.

La expresión "intolerancia a la glucosa (ITG)", como se usa aquí, pretende indicar la enfermedad asociada a la resistencia a la insulina que es intermedia entre la DMNID franca y la tolerancia normal a la glucosa (TNG). Se sabe que un porcentaje elevado de la población con ITG desarrolla DMNID respecto de las personas con tolerancia normal a la glucosa (Sad et al., New Engl J Med 1988; 319:1500-6). Así, proporcionando agentes terapéuticos y métodos para reducir o prevenir la ITG, es decir, para normalizar la resistencia a la insulina, se puede retrasar o evitar la progresión a DMNID. La ITG se diagnostica mediante un procedimiento en el que se determina que la respuesta a la glucosa posprandial de una persona afectada es anormal, determinada mediante las concentraciones plasmáticas de glucosa posprandial durante 2 horas. En este análisis, se administra al paciente una cantidad medida de glucosa y se miden las concentraciones sanguíneas de glucosa a intervalos regulares, habitualmente cada media hora durante las primeras dos horas, y después cada hora. En un individuo "normal" o que no tiene ITG, las concentraciones de glucosa se elevan durante las dos primeras horas hasta una concentración menor de 140 mg/dl, y después caen rápidamente. En un individuo con ITG, las concentraciones sanguíneas de glucosa son mayores y la velocidad de caída es menor.

La expresión "síndrome de resistencia a la insulina", como se usa aquí, pretende abarcar el grupo de anormalidades que resultan de un intento de compensar la resistencia a la insulina que pone en marcha una serie de acontecimientos que desempeñan un papel importante en el desarrollo tanto de hipertensión como de arteriopatía coronaria (CAD), tal como vasculopatía ateroesclerótica prematura. Se ha informado que la concentración plasmática incrementada de triglicéridos y disminuida de HDL-colesterol, estados que se sabe que están asociados a CAD, también están asociados con la resistencia a la insulina. Así, al proporcionar agentes terapéuticos y métodos para reducir o prevenir la resistencia a la insulina, la invención proporciona métodos para reducir o prevenir la aparición del síndrome de resistencia a la insulina.

La expresión "síndrome de ovario poliquístico (SOPQ)", como se usa aquí, pretende designar el trastorno sin atribuir etiológicamente de mujeres premenopáusicas, que afecta al 5-10% de esta población, caracterizado por hiperandrogenismo, anovulación crónica, defectos en la acción de la insulina, secreción de insulina, esteroidogénesis ovárica y fibrinolisis. Las mujeres con SOPQ son frecuentemente resistentes a la insulina y tienen un riesgo incrementado de desarrollar intolerancia a la glucosa o DMNID en la tercera y cuarta décadas de la vida (Dunaif et al. (1996) J Clin Endocrinol Metab 81:3299). El hiperandrogenismo es también una característica de una diversidad de varios estados resistentes a la insulina, desde el síndrome de tipo A, pasando por el leprechaunismo y la diabetes lipoatrófica, hasta el síndrome de tipo B, cuando estos estados se dan en mujeres premenopáusicas. Se ha propuesto que la hiperinsulinemia per se provoca hiperandrogenismo. Se ha demostrado que los agentes sensibilizadores a la insulina, p.ej., troglitazona, son eficaces en SOPQ y que, en particular, se mejoran los defectos de la acción de la insulina, la secreción de la insulina, la esteroidogénesis ovárica y la fibrinolisis (Ehrman et al. (1997) J Clin Invest 100:1230), como en los humanos resistentes a la insulina.

La expresión "resistencia a la insulina", como se usa aquí, pretende abarcar el diagnóstico habitual de resistencia a la insulina realizado mediante cualquiera de varios métodos que incluyen, pero no se limitan a: el análisis de la tolerancia a la glucosa intravenosa o la medida de la concentración de insulina en ayunas. Se sabe que existe una correlación excelente entre el nivel de la concentración de insulina en ayunas y el grado de resistencia a la insulina. Por lo tanto, se podrían usar las concentraciones elevadas de insulina en ayunas como un marcador sustituto de la resistencia a la insulina con el fin de identificar qué individuos con tolerancia normal a la glucosa (TNG) tienen resistencia a la insulina. Otra manera de realizar esto es seguir la aproximación descrita en The New England Journal of Medicine, nº 3, pág. 1188 (1995), es decir, seleccionar sujetos obesos como criterio inicial para el acceso al grupo de tratamiento. Algunos sujetos obesos tienen intolerancia a la glucosa (ITG) mientras otros tienen tolerancia normal a la glucosa (TNG). Ya que básicamente todos los sujetos obesos son resistentes a la insulina, es decir, incluso los sujetos obesos de TNG son resistentes a la insulina, tienen hiperinsulinemia en ayunas. Por lo tanto, el objetivo del tratamiento según la presente invención se puede definir como individuos con TNG que son obesos o que tienen hiperinsulinemia en ayunas, o ambos.

Se puede realizar también un diagnóstico de resistencia a la insulina mediante el uso de la prueba de pinzamiento euglucémico con glucosa. Esta prueba implica la administración simultánea de una infusión de insulina constante y una infusión de glucosa de velocidad variable. Durante la prueba, que dura 3-4 horas, la concentración plasmática de glucosa se mantiene constante a concentraciones euglucémicas midiendo la concentración de glucosa cada 5-10 minutos y después ajustando la infusión de glucosa de velocidad variable para mantener inalterada la concentración plasmática de glucosa. En estas circunstancias, la velocidad de la entrada de glucosa en el torrente circulatorio es igual a la velocidad total de consumo de glucosa en el cuerpo. La diferencia entre la velocidad de consumo de glucosa en el estado basal (sin infusión de insulina) y en el estado con infusión de insulina representa la captación de glucosa mediada por la insulina. En los individuos normales, la insulina provoca un incremento brusco y grande del consumo total de glucosa corporal, mientras en los sujetos con DMNID este efecto de la insulina está muy debilitado y es solamente un 20-30% del normal. En los sujetos resistentes a la insulina con ITG o TNG, la velocidad del consumo de glucosa estimulado por la insulina está a mitad de camino entre el normal y el de DMNID. Por ejemplo, a una concentración de insulina plasmática en estado estacionario de alrededor de 100 \muU/ml (una concentración fisiológica) la velocidad de consumo de glucosa en los sujetos normales es de alrededor de 7 mg/kg/min. En los sujetos de DMNID, es de alrededor de 2,5 mg/kg/min, y en los pacientes con ITG (o sujetos resistentes a la insulina con TNG) es de alrededor de 4-5 mg/kg/min. Esta es una prueba sumamente reproducible y precisa, y puede distinguir pacientes dentro de estas categorías. También se sabe que a medida que los sujetos se hacen más resistentes a la insulina, se eleva la concentración de insulina en ayunas. Existe una correlación positiva excelente entre el nivel de la concentración de insulina en ayunas y la magnitud de la resistencia a insulina medida mediante las pruebas de pinzamiento euglucémico con glucosa, y, por lo tanto, esto proporciona el fundamento para usar las concentraciones de insulina en ayunas como una medida sustituta de la resistencia a la insulina.

La expresión "agente que actúa sobre la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a un compuesto o polipéptido de la invención que modula la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos como se describió previamente. Preferiblemente, el agente incrementa o disminuye la oxidación de los lípidos alimentarios, preferiblemente los ácidos grasos libres (AGL), en el músculo. Preferiblemente, el agente disminuye o incrementa el peso corporal de los individuos, o se usa para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad, tal como la obesidad, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, aterosclerosis, enfermedad ateromatosa, cardiopatía, hipertensión, ictus, síndrome X, diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID, o diabetes tipo II) y diabetes mellitus insulinodependiente (DMID, o diabetes tipo I). Las complicaciones relacionadas con la diabetes a tratar mediante los métodos de la invención incluyen las lesiones microangiopáticas, lesiones oculares, retinopatía, neuropatía, lesiones renales. La cardiopatía incluye, pero no se limita a, insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria y tensión arterial elevada. Otros trastornos relacionados con la obesidad a tratar mediante los compuestos de la invención incluyen la hiperlipidemia y la hiperuricemia. Aún otras enfermedades o trastornos relacionados con la obesidad de la invención incluyen caquexia, deterioro progresivo, pérdida de peso relacionada con el SIDA, pérdida de peso relacionada con el cáncer, anorexia y bulimia.

La expresión "respuesta a un agente que actúa sobre la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a la eficacia del fármaco, que incluye pero no se limita a, la capacidad de metabolizar un compuesto, la capacidad de convertir un profármaco en un fármaco activo, y la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un individuo.

La expresión "efectos secundarios a un agente que actúa sobre la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a los efectos adversos de la terapia que resultan de la ampliación de la acción farmacológica principal del fármaco, o a reacciones adversas idiosincrásicas que resultan de una interacción del fármaco con factores propios del hospedador. Los "efectos secundarios a un agente que actúa sobre la distribución de los lípidos alimentarios entre el hígado y los tejidos periféricos" pueden incluir, pero no se limitan a, reacciones adversas tales como toxicidades dermatológicas, hematológicas o hepatológicas, e incluyen además la ulceración gástrica e intestinal, la alteración de la función plaquetaria, lesión renal, nefritis, rinitis vasomotora con secreciones acuosas profusas, edema angioneurótico, urticaria generalizada, y asma bronquial hasta edema laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.

La expresión "enfermedades y trastornos relacionados con GZIP", como se usa aquí, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que comprende un funcionamiento anormal de GZIP, o que se podría tratar o prevenir modulando la concentración o actividad de GZIP. "Funcionamiento anormal de GZIP" incluye, pero no se limita a, los niveles anormales de expresión de GZIP (incrementados o disminuidos, pero preferiblemente disminuidos), la actividad anormal de GZIP (incrementada o disminuida), y las interacciones anormales con ligandos o moléculas de unión (incrementadas o disminuidas). "Anormal" significa un cambio del tipo o nivel de actividad observado en las células, tejidos o pacientes normales, u observado previamente en la célula, tejido o paciente antes del inicio de la enfermedad. Las enfermedades y trastornos relacionados con GZIP incluyen la obesidad y las enfermedades y trastornos relacionados con el metabolismo descritos previamente.

La expresión "tratamientos cosméticos" pretende incluir los tratamientos con compuestos o polipéptidos de la invención que incrementan o disminuyen la masa corporal de un individuo cuando el individuo no es clínicamente obeso o clínicamente delgado. Así, estos individuos tienen un índice de masa corporal (IMC) por debajo del límite de la obesidad clínica (p.ej. por debajo de 25 kg/m^{2}) y por encima del límite de la delgadez clínica (p.ej. por encima de 18,5 kg/m^{2}). Además, estos individuos son preferiblemente sanos (p.ej. no tienen una enfermedad o trastorno relacionado con el metabolismo de la invención). Los "tratamientos cosméticos" pretenden abarcar también, en algunas circunstancias, incrementos más localizados del tejido adiposo, por ejemplo, aumentos o pérdidas específicamente alrededor de la cintura o caderas, o alrededor de las caderas y muslos, por ejemplo. Estos aumentos o pérdidas localizadas de tejido adiposo se pueden identificar mediante los incrementos o disminuciones de la medida de la cintura o de la cadera, por ejemplo.

El término "prevenir", como se usa aquí, se refiere a administrar un compuesto antes del inicio de los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno para prevenir una manifestación física de las anormalidades asociadas con la obesidad o GZIP.

El término "tratar", como se usa aquí, se refiere a administrar un compuesto tras el inicio de los síntomas clínicos.

La expresión "que necesita tratamiento", como se usa aquí, se refiere a un juicio hecho por un cuidador (p.ej., médico, enfermera, enfermera practicante, etc. en el caso de humanos; veterinario en el caso de animales, que incluyen mamíferos que no son humanos) que considera que un individuo o animal necesita o se beneficiará del tratamiento. Este juicio se realiza basándose en una diversidad de factores que pertenecen al campo de la experiencia del cuidador, pero que incluyen el conocimiento de que el individuo o animal está enfermo, o estará enfermo, como resultado de un estado que es tratable mediante los compuestos de la invención.

La expresión "percibe la necesidad de tratamiento" se refiere a una determinación subclínica de que un individuo desea reducir peso por razones cosméticas como se discutió anteriormente respecto al "tratamiento cosmético". La expresión "percibe la necesidad de tratamiento" en otras realizaciones se puede referir a la decisión que toma un dueño de un animal para el tratamiento cosmético del animal.

El término "individuo" o "paciente", como se usa aquí, se refiere a cualquier animal, que incluye mamíferos, preferiblemente ratones, ratas, otros roedores, conejos, perros, gatos, cerdos, ganado, ovejas, caballos o primates, y lo más preferiblemente humanos. El término puede especificar machos o hembras o ambos, o excluir machos o hembras.

La expresión "animal que no es humano" se refiere a cualquier vertebrado que no es humano, que incluye pájaros y más habitualmente mamíferos, preferiblemente primates, animales tales como cerdos, cabras, ovejas, burros, caballos, gatos, perros, conejos o roedores, más preferiblemente ratas o ratones. Los términos "animal" y "mamífero" abarcan expresamente los sujetos humanos a menos que vayan seguidos por la expresión "que no es humano".

Los inventores creen que los polipéptidos GZIP son capaces de reducir significativamente la respuesta posprandial de los ácidos grasos libres, glucosa y triglicéridos plasmáticos en ratones alimentados con comida elevada en grasas/sacarosa, sin afectar a las concentraciones de leptina, insulina o glucagón. Además, se cree que los polipéptidos GZIP modulan la oxidación de los ácidos grasos libres en el músculo in vitro y ex vivo, preferiblemente incrementan la oxidación. Además, se cree que los polipéptidos GZIP modulan el aumento de peso en ratones que se alimentan con una dieta elevada en grasas/sacarosa. Además, los polipéptidos GZIP se pueden usar en combinación con fragmentos de polipéptido APM1 para producir un efecto biológico (p.ej., actividad de disminución de la concentración de ácidos grasos libres) que es mayor que el efecto esperado de una composición que comprende fragmentos de polipéptido GZIP o fragmentos de polipéptido APM1 solos.

Realizaciones preferidas de la invención I. Polipéptidos GZIP

Los polipéptidos GZIP tienen actividad medible in vitro e in vivo. Estas actividades incluyen, pero no se limitan a, la modulación, preferiblemente la reducción, de la respuesta posprandial de los ácidos grasos libres, glucosa y triglicéridos plasmáticos en ratones alimentados con comida elevada en grasas/sacarosa (Ejemplo 6), el cambio, preferiblemente un incremento, de la oxidación de los ácidos grasos libres en el músculo in vitro y ex vivo (Ejemplo 10), y la pérdida de peso mantenida en ratones con una dieta elevada en grasas/sacarosa. También se proporcionan otros ensayos de actividad del polipéptido GZIP in vitro e in vivo (Ejemplos 2-14, por ejemplo), y las personas de experiencia habitual en la técnica pueden diseñar ensayos equivalentes.

La expresión "polipéptidos GZIP" incluye tanto el polipéptido "de tamaño completo" como los fragmentos de los polipéptidos GZIP "de tamaño completo" (aunque cada una de las especies anteriores se puede especificar en particular).

Los polipéptidos GZIP "intactos" o "de tamaño completo", como se usa aquí, significa la secuencia del polipéptido de tamaño completo de cualquier polipéptido GZIP, desde la metionina N-terminal hasta el codón de parada C-terminal. Los ejemplos de polipéptidos GZIP intactos o de tamaño completo se hallan en el listado de secuencias.

La expresión "actividad relacionada con el metabolismo", como se usa aquí, se refiere al menos a una, y preferiblemente a todas, las actividades descritas aquí para los polipéptidos GZIP. Los ensayos para la determinación de estas actividades se proporcionan aquí (p.ej., Ejemplos 2-14), y las personas de experiencia habitual en la técnica pueden diseñar ensayos equivalentes. Opcionalmente, la "actividad relacionada con el metabolismo" se puede seleccionar del grupo que consiste en la distribución de lípidos, el metabolismo lipídico y la actividad similar a insulina, o una actividad dentro de una de estas categorías. La actividad de "distribución de lípidos" significa la capacidad de llevar a cabo la localización de los lípidos alimentarios entre los grupos principales de tejidos, que incluyen el tejido adiposo, el hígado y el músculo. Los inventores creen que los polipéptidos GZIP de la invención desempeñan un papel en la distribución de los lípidos al músculo, hígado o tejido adiposo. La actividad de "metabolismo lipídico" significa la capacidad de influir en el metabolismo de los lípidos. Los inventores creen que los polipéptidos GZIP de la invención tienen la capacidad de influir en la concentración de los ácidos grasos libres en el plasma, así como de modular, preferiblemente incrementar, el metabolismo de los lípidos en el músculo por medio de experimentos de oxidación de ácidos grasos libres, y de influir transitoriamente en las concentraciones de los triglicéridos en el plasma y el músculo. La actividad "similar a insulina" significa la capacidad de los polipéptidos GZIP de modular las concentraciones de glucosa en el plasma. Los inventores creen que los polipéptidos GZIP no afectan de forma significativa a las concentraciones de insulina, pero sí afectan a las concentraciones de glucosa, de forma similar a los efectos de la insulina. Estos efectos pueden variar en presencia de los polipéptidos GZIP intactos (de tamaño completo), o son significativamente mayores en presencia de los fragmentos de polipéptidos GZIP en comparación con los polipéptidos GZIP de tamaño completo.

La expresión "significativamente mayor", como se usa aquí, se refiere a una comparación de la actividad de un polipéptido GZIP en un ensayo relacionado con el metabolismo en comparación con las células sin tratar en el mismo ensayo. "Significativamente", como se usa aquí, significa estadísticamente significativo tal como se determina habitualmente.

La invención se dirige a ensayos de cribado de agonistas o antagonistas de la actividad del polipéptido GZIP. La actividad del polipéptido GZIP es la capacidad de GZIP de unirse a los polipéptidos APM1, en particular a los polipéptidos gAPM1.

El polipéptido GZIP de tamaño completo está compuesto de al menos cuatro regiones distintas, que incluyen:

1.

una secuencia señal putativa N-terminal de los aminoácidos 1-20 de la ID SEC Nº: 2 ó 1-17 de la ID SEC Nº: 3;

2.

un dominio \alpha 1 de alrededor de los aminoácidos 21-112 de la ID SEC Nº: 2 ó 18-109 de la ID SEC Nº: 3 que, junto con el dominio \alpha 2, constituye una hendidura de unión de ácidos grasos libres;

3.

un dominio \alpha 2 de alrededor de los aminoácidos 113-204 de la ID SEC Nº: 2 ó 110-201 de la ID SEC Nº: 3 que, junto con el dominio \alpha 2, constituye una hendidura de unión de ácidos grasos libres; y

4.

un dominio \alpha 3 de alrededor de los aminoácidos 205-298 de la ID SEC Nº: 2 ó 202-295 de la ID SEC Nº: 3 que comprende un sitio de unión a APM1.

La invención se dirige, entre otros, a polipéptidos APM1 aislados, purificados o recombinantes como se describen en la publicación PCT WO 01/51645, que son capaces de unirse con los polipéptidos GZIP de la invención.

El polipéptido APM1 de tamaño completo consiste en al menos cuatro regiones distintas que incluyen:

1.

una secuencia señal putativa N-terminal de los aminoácidos 1-17 de la ID SEC Nº: 4;

2.

una región única de los aminoácidos 18-41 de la ID SEC Nº: 4;

3.

una región similar a colágeno de los aminoácidos 42-107 de la ID SEC Nº: 4; y

4.

una región globular de los aminoácidos 108-244 de la ID SEC Nº: 4.

Como se usa aquí, "polipéptido APM1" significa la secuencia polipeptídica de tamaño completo de cualquier polipéptido APM1, desde la metionina N-terminal hasta el codón de parada C-terminal. Los ejemplos de polipéptidos APM1 intactos o de tamaño completo se hallan en la ID SEC Nº: 4. La expresión "fragmentos de polipéptido APM1", como se usa aquí, se refiere a los fragmentos del polipéptido APM1 "intacto" o "de tamaño completo" que tienen "actividad relacionada con la obesidad". Las expresiones "polipéptidos gAPM1" y "fragmentos de polipéptido gAPM1" se usan de manera intercambiable y se refieren a fragmentos de polipéptidos de la región globular solamente, y así son una expresión más restringida que "fragmentos de polipéptido APM1".

Los polipéptidos GZIP se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y pueden estar parcialmente o sustancialmente purificados. Una versión producida de forma recombinante de cualquiera de los polipéptidos GZIP se puede purificar sustancialmente mediante el método en una etapa descrito por Smith et al. ((1988) Gene 67(1):31-40) o mediante los métodos descritos aquí o conocidos en la técnica. Los polipéptidos GZIP se pueden purificar también a partir de fuentes naturales o recombinantes, mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de la invención mediante métodos conocidos en la técnica de purificación de proteínas.

También se contemplan específicamente las preparaciones de polipéptidos GZIP que implican una purificación parcial o la selección de los polipéptidos GZIP. Se prevé que estas preparaciones brutas sean el resultado de la concentración de células que expresan polipéptidos GZIP, quizás con unas cuantas etapas de purificación adicionales, pero antes de completar la purificación del fragmento. Las células que expresan los polipéptidos GZIP están presentes en un sedimento, se lisan, o el polipéptido bruto se liofiliza, por ejemplo.

En las realizaciones preferidas, los fragmentos de polipéptido GZIP usados en el método de cribado comprenden los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221-242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 180-251, 192-251, 204-251, 221-251, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2. En otras realizaciones preferidas, los fragmentos de polipéptido GZIP usados en el método de cribado comprenden los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200-295, 206-295, 177-248, 189-248, 201-248, 218-248, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3.

Variantes

Alguien de experiencia habitual en la técnica reconocerá que algunos aminoácidos de las secuencias de polipéptido GZIP de la presente invención se pueden variar sin efecto significativo sobre la estructura o función de las proteínas; habrá aminoácidos críticos en la secuencia que determinen la actividad. Tales variantes incluyen secuencias del polipéptido GZIP con una o más deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de aminoácidos a partir de mutaciones naturales o de la manipulación humana seleccionadas según reglas generales conocidas en la técnica, de forma que tengan poco efecto sobre la actividad. Más adelante se proporciona información sobre cómo hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente sinónimas.

Existen dos aproximaciones principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio (véase Bowie, et al. (1990) Science, 247, 1306-10). El primer método depende del proceso de la evolución, en el que las mutaciones se aceptan o se rechazan mediante selección natural. La segunda aproximación usa la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciones o cribados para identificar las secuencias que mantienen la funcionalidad.

Estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos, e indican qué cambios de aminoácidos es probable que sean permisivos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos más enterrados requieren cadenas laterales apolares, mientras generalmente se conservan pocas características de las cadenas laterales superficiales. Se describen otras sustituciones fenotípicamente sinónimas en Bowie et al. (anteriormente mencionado) y en las referencias citadas ahí.

En el caso de una sustitución de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido según la invención, se pueden sustituir uno o varios aminoácidos por aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente" se usa aquí para designar cualquier aminoácido que se puede sustituir por uno de los aminoácidos que tienen propiedades similares, de forma que alguien experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas.

En las realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el título de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se criban.

TABLA 1

1

Se realizan modificaciones sustanciales de la función o de la identidad inmunológica de los polipéptidos GZIP seleccionando las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio seleccionado como objetivo, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los residuos que se dan de forma natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Los residuos así sustituidos se pueden introducir también en los sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

Las variaciones se pueden realizar mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida), barrido de alaninas y mutagénesis mediante PCR. Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis mediante casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis mediante selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante de GZIP.

El análisis de barrido de aminoácidos se puede emplear también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el barrido están los aminoácidos relativamente pequeños y neutros. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicocola, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido de este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono \beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina se prefiere típicamente además porque es el aminoácido más habitual. Además, se halla frecuentemente tanto en posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución por alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isóstero.

Los aminoácidos de las secuencias de los polipéptidos GZIP que son esenciales para la función se pueden identificar también mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alaninas (véase, p.ej., Cunningham, et al. (1989) Science 244(4908):1081-5). Este último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se ensayan después en función de su actividad relacionada con el metabolismo mediante el uso de ensayos como los descritos anteriormente. Son de especial interés las sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros que pueden producir proteínas con características mejoradas sumamente deseables, tales como menos agregación. La agregación puede no solamente reducir la actividad, sino también ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas o fisiológicamente aceptables, porque los agregados pueden ser inmunógenos (véase, p.ej., Pinckard, et al., (1967) Clin. Exp. Immunol 2:331-340; Robbins, et al., (1987) Diabetes, jul.; 36(7):838-41; y Cleland, et al., (1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 10(4):307-77).

Así, el fragmento, derivado, análogo u homólogo de los polipéptidos GZIP puede ser, por ejemplo: (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado), y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético (es decir, puede ser un aminoácido que no se da de forma natural); o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente; o (iii) uno en el que los polipéptidos GZIP están fusionados con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la semivida del fragmento (por ejemplo, polietilenglicol); o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados a la forma anterior del fragmento, tal como un péptido de la región de fusión de Fc de IgG o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación de la forma anterior del fragmento, o una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Producción

Nótese que, a lo largo de la descripción, dondequiera que se discutan los polipéptidos GZIP, se pretende específicamente que estén incluidos los fragmentos, variantes y derivados de GZIP como un subgrupo preferido de los polipéptidos GZIP.

Los polipéptidos GZIP se aíslan preferiblemente a partir de muestras de tejido de humanos o de mamíferos, o se expresan a partir de genes humanos o mamíferos en células humanas o mamíferas. Los polipéptidos GZIP de la invención se pueden hacer mediante el uso de métodos de expresión rutinarios conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica el polipéptido deseado se liga en un vector de expresión adecuado para cualquier hospedador conveniente. Se usan sistemas hospedadores eucarióticos y procarióticos para la formación de los polipéptidos recombinantes. El polipéptido se aísla después a partir de las células lisadas o del medio de cultivo y se purifica hasta el grado necesario para su uso deseado. La purificación es mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial, fraccionamiento salino, cromatografía, centrifugación y similares. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, que describe una diversidad de métodos para purificar proteínas.

En una realización alternativa, los polipéptidos de la invención se aíslan a partir de leche. Los polipéptidos se pueden purificar en forma de polipéptidos GZIP de tamaño completo, que se pueden escindir después, según sea apropiado, in vitro para generar un fragmento de GZIP, o, de forma alternativa, se pueden purificar los propios fragmentos de GZIP a partir de la leche. Se puede usar cualquiera de un gran número de métodos para purificar los presentes polipéptidos a partir de leche, que incluyen los descritos en Protein Purification Applications, A Practical Approach (nueva edición), editado por Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, Harwell; Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Wilkins y Velander (1992) 49:333-8; las patentes de EE.UU. nºs 6.140.552; 6.025.540; Hennighausen, Protein Expression and Purification, vol. 1, págs. 3-8 (1990); Harris et al. (1997) Bioseparation 7:31-7; Degener et al. (1998) J. Chromatog. 799:125-37; Wilkins (1993) J. Cell. Biochem. supl. 0 (17 parte A):39. En una realización típica, la leche se centrifuga, p.ej. a una velocidad relativamente baja, para separar la fracción lipídica, y el sobrenadante acuoso se centrifuga después a una velocidad mayor para separar la caseína de la leche de la fracción restante, el "suero". A menudo las proteínas biomédicas se hallan en esta fracción de suero, y se pueden aislar a partir de esta fracción mediante el uso de procedimientos cromatográficos estándar u otros procedimientos usados habitualmente para la purificación de proteínas, p.ej. como se describe en otra parte en la presente solicitud. En una realización preferida, los polipéptidos GZIP se purifican mediante el uso de anticuerpos específicos para los polipéptidos GZIP, p.ej. mediante el uso de cromatografía de afinidad. Además, se pueden usar métodos para aislar fragmentos de GZIP particulares, p.ej. métodos electroforéticos o de otro tipo para el aislamiento de proteínas de un tamaño particular. El aislamiento de polipéptidos GZIP mediante el uso de estos métodos se puede dar de forma natural, ya que se ha descubierto que los polipéptidos GZIP están presentes de forma natural en la leche de los mamíferos, o pueden ser el resultado de la producción recombinante de la proteína en las glándulas mamarias de un mamífero que no es humano, como se describe más adelante. En tal realización, GZIP se produce en forma de una proteína de fusión con una secuencia polipeptídica heteróloga antigénica, cuya secuencia antigénica se puede usar para purificar la proteína, p.ej., mediante el uso de metodología de inmunoafinidad estándar.

Además, se pueden producir fragmentos de proteína más cortos mediante síntesis química. De forma alternativa, las proteínas de la invención se pueden extraer de células o tejidos de humanos o de animales que no son humanos. Se conocen en la técnica métodos para purificar proteínas, e incluyen el uso de detergentes o agentes caotrópicos para romper las partículas, seguido de extracción diferencial y separación de los polipéptidos mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación en función de la densidad, y electroforesis en gel.

Se puede usar cualquier cADN de GZIP, que incluye los de las ID SEC Nºs: 2 ó 3, para expresar los polipéptidos GZIP. El ácido nucleico que codifica el GZIP a expresar se une de manera operable a un promotor en un vector de expresión mediante el uso de tecnología de clonación convencional. El inserto de cADN de GZIP en el vector de expresión puede comprender la secuencia que codifica: el polipéptido GZIP de tamaño completo (a modificar más tarde); de 6 aminoácidos en 6 aminoácidos cualquier número entero menor que el polipéptido GZIP de tamaño completo; un fragmento de GZIP; o variantes y polipéptidos similares en cierto porcentaje.

El vector de expresión es cualquiera de los sistemas de expresión en mamíferos, levaduras, insectos o bacterias conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen aquí. Los vectores y sistemas de expresión disponibles comercialmente están disponibles de una diversidad de proveedores, que incluyen Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), e Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para incrementar la expresión y facilitar el plegamiento adecuado de la proteína, se puede optimizar el contexto de los codones y el emparejamiento de los codones de la secuencia para el organismo de expresión particular en el que se introduce el vector de expresión, como explicó Hatfield, et al., patente de EE.UU. nº 5.082.767.

Si el ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos GZIP carece de una metionina que sirva como sitio de iniciación, se puede introducir una metionina de iniciación al lado del primer codón del ácido nucleico mediante el uso de técnicas convencionales. De forma similar, si el inserto de cADN de polipéptido GZIP carece de una señal de poli A, esta secuencia se puede añadir a la construcción, por ejemplo, mediante corte y empalme de la señal de poli A de pSG5 (Stratagene) mediante el uso de las enzimas endonucleasas de restricción BglI y SalI, e incorporándola en el vector de expresión en mamíferos pXT1 (Stratagene). pXT1 contiene las LTRs y una porción del gen gag del virus de la leucemia murina de Moloney. La posición de las LTRs en la construcción permite una transfección estable eficaz. El vector incluye el promotor de timidina quinasa de herpes simplex y el gen seleccionable de neomicina.

El ácido nucleico que codifica GZIP se puede obtener mediante PCR a partir de un vector que contiene la secuencia nucleotídica de GZIP mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos complementarios para el cADN de GZIP deseado, y que contienen secuencias para endonucleasas de restricción de Pst I incorporadas en el cebador de 5' y BglII en el extremo 5' del cebador correspondiente de 3' del cADN, teniendo cuidado de asegurar que la secuencia que codifica GZIP está colocada de forma apropiada con respecto a la señal de poli A. El polinucleótido purificado obtenido de la reacción de PCR resultante se digiere con PstI, los extremos se hacen romos con una exonucleasa, se digiere con Bgl II, se purifica y se liga en pXT1, que ahora contiene una señal de poli A y está digerido con BglII.

La transfección de un vector que expresa GZIP en células 3T3 de ratón NIH es una realización para introducir polinucleótidos en células hospedadoras. La introducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido en una célula hospedadora se puede llevar a cabo mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al. ((1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., Amsterdam). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención se pueden expresar de hecho en una célula hospedadora que carece de un vector recombinante.

Un polipéptido de esta invención se puede recuperar y purificar de los cultivos de células recombinantes mediante métodos conocidos, que incluyen la precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatito y cromatografía con lectina. Lo más preferiblemente, se emplea la cromatografía líquida de elevada eficacia ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención, y preferiblemente la forma secretada, se pueden recuperar también de: productos purificados a partir de fuentes naturales, que incluyen líquidos, tejidos y células corporales, aislados directamente o cultivados; productos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico, que incluye, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de vegetales superiores, de insectos y de mamíferos.

Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar sin glicosilar. Preferiblemente, los polipéptidos de la invención están sin glicosilar. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo de metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por el hospedador. Así, se conoce en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codón de iniciación de la traducción se elimina generalmente con una eficacia elevada de cualquier proteína tras la traducción en todas las células eucarióticas. Aunque la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también se elimina de manera eficaz en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas este proceso de eliminación procariótico es ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que la metionina N-terminal está unida covalentemente.

Además de abarcar las células hospedadoras que contienen las construcciones de los vectores discutidos aquí, la invención también abarca células hospedadoras primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, en particular de origen mamífero, que se han modificado para eliminar o sustituir material genético endógeno (p.ej., secuencia codificante), o para incluir material genético (p.ej., secuencias polinucleotídicas heterólogas) que está asociado de manera operable con los polinucleótidos de la invención, y que activa, altera o amplifica los polinucleótidos endógenos. Por ejemplo, se pueden usar los métodos conocidos en la técnica para asociar de manera operable regiones de control heterólogas (p.ej., un promotor o potenciador) y secuencias polinucleotídicas endógenas por medio de la recombinación homóloga, véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº 5.641.670, expedida el 24 de junio de 1997; la publicación internacional nº WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; la publicación internacional nº WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA, nov.; 86(22):8932-5; Koller et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA, nov.; 86(22):8927-31; y Zijlstra et al. (1989) Nature, 23 de nov.; 342(6248):435-8.

Modificaciones

Además, los polipéptidos de la invención se pueden sintetizar químicamente mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véase, p.ej., Creighton, 1983 Proteins. Nueva York: W.H. Freeman and Company; y Hunkapiller et al., (1984) Nature, 12-18 de jul.; 310(5973):105-11). Por ejemplo, se puede sintetizar un fragmento relativamente corto de la invención mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos que no son clásicos, o análogos químicos de aminoácidos en forma de una sustitución o adición en la secuencia del fragmento. Los aminoácidos que no son clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos habituales, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido \alpha-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, \gamma-Abu, \varepsilon-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicocola, t-butilalanina, fenilglicocola, ciclohexilalanina, \beta-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos sintéticos tales como \beta-metil aminoácidos, C\alpha-metil aminoácidos, N\alpha-metil aminoácidos, y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio).

La invención abarca polipéptidos que se modifican de forma diferencial durante o después de la traducción, p.ej., mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.

Las modificaciones postraduccionales adicionales abarcadas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos unidas en N o en O, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal, unión de restos químicos al esqueleto de aminoácidos, modificaciones químicas de las cadenas de carbohidratos unidas en N o en O, y adición o deleción de un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresión en células hospedadoras procarióticas. Los polipéptidos se pueden modificar también con una molécula marcadora detectable, tal como una molécula marcadora enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad, para permitir la detección y el aislamiento del polipéptido.

Multímeros

Los polipéptidos GZIP pueden estar en monómeros o multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). Los polipéptidos GZIP son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros son al menos dímeros, al menos trímeros, o al menos tetrámeros.

Los multímeros pueden ser homómeros o heterómeros. Como se usa aquí, el término homómero se refiere a un multímero que contiene solamente polipéptidos que corresponden a los polipéptidos GZIP (que incluyen fragmentos de polipéptidos, variantes, variantes de corte y empalme, y proteínas de fusión que corresponden a estos fragmentos de polipéptidos tal como se describen aquí). Estos homómeros pueden contener fragmentos de polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. Un homómero es un multímero que contiene solamente fragmentos de polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. Un homómero es un multímero que contiene fragmentos de polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos diferentes. El multímero es un homodímero (p.ej., que contiene polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes) o un homotrímero (p.ej., que contiene polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes). El multímero homomérico es al menos un homodímero, al menos un homotrímero, o al menos un homotetrámero.

Como se usa aquí, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene uno o más polipéptidos heterólogos (es decir, que corresponden a proteínas diferentes o sus polipéptidos) además de los polipéptidos de la invención. El multímero es un heterodímero, un heterotrímero, o un heterotetrámero. El multímero heteromérico es al menos un heterodímero, al menos un heterotrímero, o al menos un heterotetrámero. El multímero heteromérico contiene un fragmento de polipéptido GZIP y un fragmento de polipéptido APM1, preferiblemente en el que dicho fragmento de polipéptido APM1 es un fragmento de polipéptido gAPM1.

Los multímeros pueden ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas o covalentes o pueden estar unidos de forma indirecta, por ejemplo mediante la formación de liposomas. Así, los multímeros tales como, por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, se forman cuando los polipéptidos de la invención se ponen en contacto entre sí en disolución. Los heteromultímeros, tales como, por ejemplo, heterotrímeros o heterotetrámeros se forman cuando los polipéptidos GZIP se ponen en contacto con anticuerpos hacia los polipéptidos (que incluyen anticuerpos hacia la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión de la invención) en disolución. Los multímeros se forman mediante asociaciones covalentes con o entre los polipéptidos GZIP. Tales asociaciones covalentes pueden implicar uno o más residuos de aminoácidos contenidos en la secuencia del polipéptido (p.ej., la expuesta en el listado de secuencias, o contenida en el polipéptido codificado por un clon depositado). En otro ejemplo, las asociaciones covalentes son uniones entre residuos de cisteína localizados dentro de las secuencias polipeptídicas, que interaccionan en el polipéptido nativo (es decir, que se dan de forma natural). En otro ejemplo, las asociaciones covalentes son la consecuencia de la manipulación química o recombinante.

Los multímeros se pueden generar mediante el uso de métodos químicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos que se desea que estén contenidos en los multímeros de la invención se pueden unir químicamente mediante el uso de moléculas ligadoras y de métodos de optimización de la longitud de la molécula ligadora conocidos en la técnica (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). Además, se pueden generar multímeros mediante el uso de métodos conocidos en la técnica para formar una o más uniones intermoleculares entre los residuos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los polipéptidos que se desea que estén contenidos en el multímero (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). Además, los polipéptidos GZIP se pueden modificar de forma rutinaria mediante la adición de cisteína o biotina al extremo C-terminal o N-terminal del polipéptido, y se pueden aplicar métodos conocidos en la técnica para generar multímeros que contienen uno o más de estos polipéptidos modificados (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925).

De forma alternativa, los multímeros se pueden generar mediante el uso de métodos de ingeniería genética conocidos en la técnica. Los polipéptidos contenidos en los multímeros se producen de forma recombinante mediante el uso de la tecnología de fusión de proteínas descrita aquí o conocida por otra parte en la técnica (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). En una realización específica, los polinucleótidos que codifican un homodímero se generan ligando una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido a una secuencia que codifica un polipéptido ligador y después además a un polinucleótido sintético que codifica el producto traducido del polipéptido en la orientación inversa desde el extremo C-terminal original hasta el extremo N-terminal (que carece de la secuencia líder) (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número 5.478.925). Se aplican los métodos recombinantes descritos aquí o conocidos por otra parte en la técnica para generar los polipéptidos recombinantes de la invención que contienen un dominio transmembrana (o un péptido hidrofóbico o señal) y que se pueden incorporar en liposomas mediante técnicas de reconstitución de membranas (véase, p.ej., la patente de EE.UU. número
5.478.925).

II. Polinucleótidos de GZIP

Los polinucleótidos preferidos son aquellos que codifican los polipéptidos GZIP usados en la invención. Los polinucleótidos recombinantes que codifican polipéptidos GZIP se pueden usar de una diversidad de maneras, que incluyen, pero no se limitan a, la expresión de los polipéptidos en células recombinantes para el uso en ensayos de cribado de antagonistas y agonistas de su actividad, así como para facilitar su purificación para el uso de una diversidad de maneras que incluyen, pero no se limitan a, ensayos de cribado de agonistas y antagonistas de su actividad, cribados diagnósticos y generación de anticuerpos, así como en el tratamiento o la prevención de enfermedades y trastornos relacionados con el metabolismo, o para reducir la masa corporal.

La invención se refiere a los polinucleótidos que codifican los polipéptidos GZIP y sus polipéptidos variantes como se describen aquí. Estos polinucleótidos pueden ser purificados, aislados o recombinantes. En todos los casos, los polinucleótidos GZIP deseados son aquellos que codifican los polipéptidos GZIP de la invención que tienen una actividad relacionada con el metabolismo, como se describe y se discute aquí.

Fragmentos

Un fragmento polinucleotídico es un polinucleótido que tiene una secuencia que es exactamente igual que parte, pero no todo, el polipéptido GZIP de tamaño completo o una secuencia nucleotídica del polipéptido GZIP especificado. Tales fragmentos pueden ser "independientes", es decir, no son parte o no están fusionados con otros polinucleótidos, o pueden estar comprendidos dentro de otro polinucleótido que no es GZIP (heterólogo) del cual forman una parte o región. Sin embargo, varios fragmentos polinucleotídicos de GZIP pueden estar comprendidos dentro de un único polinucleótido.

Variantes

Se prevén las variantes de polinucleótidos de GZIP que codifican polipéptidos GZIP. Las variantes de los polinucleótidos, tal como se usa la expresión aquí, son polinucleótidos cuya secuencia difiere de un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido puede ser una variante que se da de forma natural, tal como una variante alélica que se da de forma natural, o puede ser una variante que no se sabe que se dé de forma natural. Tales variantes que no se dan de forma natural del polinucleótido se pueden producir mediante técnicas de mutagénesis, que incluyen las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. En general, las diferencias son limitadas, de forma que las se-
cuencias nucleotídicas de referencia y de la variante son muy similares globalmente, y, en muchas regiones, idénticas.

También se prevén específicamente las variantes polinucleotídicas que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, aún codifican los polipéptidos GZIP de la presente invención. También sería rutinario para un experto en la técnica generar las variantes degeneradas descritas anteriormente, por ejemplo, para optimizar la expresión de los codones para un hospedador particular (p.ej., cambiar los codones del ARNm humano por aquellos preferidos por otras células hospedadoras mamíferas o bacterianas).

Como se expuso anteriormente, los polinucleótidos variantes se pueden dar de forma natural, tal como una variante alélica natural, o mediante métodos recombinantes. Una "variante alélica" significa una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (véase, p.ej., B. Lewin, (1990) Genes IV, Oxford University Press, Nueva York). Las variantes que no se dan de forma natural se pueden producir mediante el uso de métodos de mutagénesis conocidos en la técnica. Tales variantes de ácidos nucleicos incluyen las producidas mediante sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Entre éstas, se prefieren especialmente las sustituciones, adiciones y deleciones sinónimas, que no alteran las propiedades y las actividades de los polipéptidos GZIP de la invención. También se prefieren a este respecto las sustituciones conservativas.

Los cambios de nucleótidos presentes en un polinucleótido variante son preferiblemente sinónimos, lo cual significa que no alteran los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Sin embargo, los cambios de nucleótidos también pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones de aminoácidos, fusiones y truncamientos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia.

En los casos en los que las sustituciones de nucleótidos den como resultado uno o más cambios de aminoácidos, los polipéptidos GZIP preferidos incluyen aquellos que mantienen una o más actividades relacionadas con el metabolismo tal como se describe en la sección I de las realizaciones preferidas de la invención.

"Mantener las mismas actividades" significa que la actividad medida mediante el uso del polipéptido codificado por el polinucleótido de GZIP variante en los ensayos es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, y no más de un 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115%, 120% o 125% de la actividad medida mediante el uso de un polipéptido GZIP descrito en la sección de ejemplos.

Que la actividad esté "incrementada" significa que la actividad medida mediante el uso del polipéptido codificado por el polinucleótido de GZIP variante en los ensayos es al menos un 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450% o 500% de la actividad medida mediante el uso de un polipéptido GZIP descrito en la sección de ejemplos.

Que la actividad esté "disminuida" significa que la actividad medida mediante el uso del polipéptido codificado por el polinucleótido de GZIP variante en los ensayos está disminuida en al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 80%, 90% o 95% de la actividad medida mediante el uso de un polipéptido GZIP descrito en la sección de ejemplos.

Porcentaje de identidad

La presente invención se dirige además a moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias polinucleotídicas de la ID SEC Nº: 1 o sus fragmentos, que codifican un polipéptido que tiene actividad relacionada con el metabolismo como se describió en la sección I de las realizaciones preferidas de la invención. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien de experiencia habitual en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que son al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico mostradas en la ID SEC Nº: 1 o sus fragmentos codificarán un polipéptido que tiene actividad biológica. De hecho, ya que todas las variantes degeneradas de estas secuencias nucleotídicas codifican el mismo polipéptido, esto estará claro para el técnico experto incluso sin realizar el ensayo de comparación anteriormente descrito. Se reconocerá además en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable codificará también un polipéptido que tiene actividad biológica. Esto se debe a que el técnico experto es consciente de las sustituciones de aminoácidos que es menos probable o que no es probable que afecten de forma significativa a la función de la proteína (p.ej., la sustitución de un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático), como se describió previamente en la sección I de las realizaciones preferidas de la invención.

Un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a una secuencia nucleotídica de referencia de la presente invención significa que la secuencia nucleotídica del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia que codifica el polipéptido GZIP. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica al menos un 95% idéntica a una secuencia nucleotídica de referencia, hasta un 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden estar delecionados, insertados, o sustituidos con otros nucleótidos. La secuencia problema puede ser una secuencia completa o cualquier fragmento especificado como se describe aquí.

Los métodos para determinar y definir si cualquier molécula de ácido nucleico particular o polipéptido es al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia nucleotídica de la presente invención se pueden realizar mediante el uso de programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objetivo, también denominada alineación de secuencias global, se puede determinar mediante el uso del programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., ((1990) Comput Appl Biosci., jul; 6(3):237-45). En una alineación de secuencias, las secuencias problema y objetivo son ambas secuencias de ADN. Se puede comparar una secuencia de ARN convirtiendo primero los Us en Ts. El resultado de dicha alineación de secuencias global está en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: matriz=unitaria, k-tuple=4, penalización por emparejamiento incorrecto=1, penalización por unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco 0,05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos objetivo, lo que sea más corto.

Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia problema debido a deleciones en 5' o 3', y no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en cuenta los truncamientos en 5' y 3' de la secuencia objetivo cuando calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias objetivo truncadas en los extremos 5' o 3' respecto de la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia problema que están en 5' y 3' de la secuencia objetivo, que no están emparejadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Se determina si un nucleótido está emparejado/alineado mediante los resultados de la alineación de secuencias de FASTDB. Este porcentaje se sustrae después del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior mediante el uso de los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se usa para los fines de la presente invención. Solamente se calculan con el fin de ajustar manualmente la puntuación del porcentaje de identidad los nucleótidos fuera de los nucleótidos de 5' y 3' de la secuencia objetivo, como se muestran en la alineación de FASTDB, que no están emparejados/alineados con la secuencia problema.

Por ejemplo, se alinea una secuencia objetivo de 90 nucleótidos con una secuencia problema de 100 nucleótidos para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se dan en el extremo 5' de la secuencia objetivo y, por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra emparejamiento/alineación de los primeros 10 nucleótidos en el extremo 5'. Los 10 nucleótidos sin emparejar representan un 10% de la secuencia (número de nucleótidos sin emparejar en los extremos 5' y 3'/número total de nucleótidos en la secuencia problema) de forma que se resta un 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada mediante el programa FASTDB. Si los 90 nucleótidos restantes estuvieran perfectamente emparejados, el porcentaje de identidad final sería un 90%.

En otro ejemplo, una secuencia objetivo de 90 nucleótidos se compara con una secuencia problema de 100 nucleótidos. Esta vez las deleciones son deleciones internas, de forma que no hay nucleótidos en 5' o 3' de la secuencia objetivo que no estén emparejados/alineados con la secuencia problema. En este caso el porcentaje de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, solamente se corrigen manualmente los nucleótidos de 5' y 3' de la secuencia objetivo que no están emparejados/alineados con la secuencia problema. No se hacen otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.

III. Vectores recombinantes de la invención

El término "vector" se usa aquí para designar una molécula de ADN o ARN circular o lineal que es bicatenaria o monocatenaria, y que comprende al menos un polinucleótido de interés que se quiere transferir a un hospedador celular o a un organismo hospedador unicelular o multicelular.

La presente invención se refiere a vectores recombinantes que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos aquí.

La presente invención abarca una familia de vectores recombinantes que comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos GZIP de la invención.

En una primera realización preferida, se usa un vector recombinante de la invención para amplificar el polinucleótido insertado en un hospedador celular adecuado, y este polinucleótido se amplifica cada vez que se replica el vector recombinante. El polinucleótido insertado puede ser uno que codifica los polipéptidos GZIP de la invención.

Una segunda realización preferida de los vectores recombinantes según la invención consiste en vectores de expresión que comprenden polinucleótidos que codifican los polipéptidos GZIP de la invención. En ciertas realizaciones, los vectores de expresión se emplean para expresar un polipéptido GZIP de la invención, preferiblemente un GZIP modificado descrito en la presente invención, que se puede purificar y, por ejemplo, usar como tratamiento para enfermedades relacionadas con el metabolismo, o simplemente para reducir la masa corporal de los individuos.

La expresión requiere que se proporcionen señales apropiadas en los vectores, y dichas señales incluyen diversos elementos reguladores, tales como potenciadores/promotores procedentes de fuentes virales y mamíferas, que controlan la expresión de los genes de interés en las células hospedadoras. Se incluyen generalmente en los vectores de expresión de la invención marcadores dominantes de selección mediante fármacos para establecer clones celulares permanentes y estables que expresan los productos, ya que son elementos que relacionan la expresión de los marcadores de selección mediante fármacos con la expresión del polipéptido.

Más en particular, la presente invención se refiere a vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido GZIP de la invención, o un GZIP modificado como se describe aquí, o sus variantes o fragmentos, bajo el control de una secuencia reguladora seleccionada entre polipéptidos GZIP, o de forma alternativa bajo el control de una secuencia reguladora exógena.

Por lo tanto, los vectores de expresión preferidos de la invención se seleccionan del grupo que consiste en: (a) una secuencia reguladora de GZIP que controla la expresión de un polinucleótido codificante unido de manera operable a ella; y (b) una secuencia codificante de GZIP de la invención, unida de manera operable a secuencias reguladoras que permiten su expresión en un hospedador celular u organismo hospedador adecuado.

Algunos de los elementos que se pueden hallar en los vectores de la presente invención se describen con más detalle en las siguientes secciones.

1) Características generales de los vectores de expresión de la invención

Un vector recombinante según la invención comprende, pero no se limita a, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (cromosoma artificial bacteriano), un fago, un fagómido, un cósmido, un plásmido, o incluso una molécula de ADN lineal que puede consistir en un ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Tal vector recombinante puede comprender una unidad transcripcional que comprende una construcción de:

(1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, normalmente de alrededor de 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar la transcripción;

(2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe a ARNm y que finalmente se traduce a un polipéptido, y dicha secuencia estructural o codificante está unida de manera operable a los elementos reguladores descritos en (1); y

(3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción. Las unidades estructurales destinadas al uso en sistemas de expresión de levaduras o eucarióticos incluyen preferiblemente una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. De forma alternativa, cuando se expresa una proteína recombinante sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo N-terminal. Este residuo puede o no escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación, marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, y un promotor derivado de un gen sumamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural colocada en 3'. La secuencia estructural heteróloga se monta en la fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o al medio extracelular. En una realización específica en la que se adapta el vector para la transfección y la expresión de secuencias deseadas en células hospedadoras mamíferas, los vectores preferidos comprenderán un origen de replicación del hospedador deseado, un promotor y potenciador adecuado, y también cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitios de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas flanqueantes en 5'. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo el origen, promotor temprano, potenciador, sitios de corte y empalme y poliadenilación de SV40 se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

2) Elementos reguladores Promotores

Las regiones promotoras adecuadas usadas en los vectores de expresión de la presente invención se eligen tomando en cuenta el hospedador celular en el que se expresa el gen heterólogo. No se cree que el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés sea importante, con tal de que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula seleccionada como objetivo. Así, cuando se selecciona como objetivo una célula humana, es preferible colocar la región codificante de ácido nucleico adyacente y bajo el control de un promotor que es capaz de expresarse en una célula humana, tal como, por ejemplo, un promotor humano o
viral.

Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el que controla la expresión, o de forma alternativa puede ser endógeno para el polinucleótido nativo que contiene la secuencia codificante a expresar. Además, el promotor es generalmente heterólogo con respecto a las secuencias del vector recombinante en el que se ha insertado la construcción promotor/secuencia codificante.

Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado mediante el uso, por ejemplo, de vectores CAT (cloranfenicol transferasa) y más preferiblemente vectores pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos preferidos son los promotores LacI, LacZ, o de la ARN polimerasa de bacteriófago T3 o T7, los promotores gpt, \lambda PR, PL y trp (documento EP 0036776), el promotor de polihedrina, o el promotor de la proteína p10 de baculovirus (equipo de Novagen) (Smith et al., (1983) Mol Cell Biol, dic.; 3(12):2156-65; O'Reilly et al., 1992), el promotor \lambda PR o también el promotor trc.

Los promotores eucarióticos incluyen el inmediatamente temprano de CMV, timidina quinasa de HSV, temprano y tardío de SV40, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-L de ratón. Además, se pueden elegir promotores específicos para un tipo particular de células, tales como los que facilitan la expresión en tejido adiposo, tejido muscular o hígado. La selección de un vector y promotor adecuado está dentro del nivel de experiencia habitual en la técnica.

La elección de un promotor está dentro de la capacidad de una persona experta en el campo de la ingeniería genética. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, vol. 1, 2, 3 (1989), o también a los procedimientos descritos por Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.

Otros elementos reguladores

Cuando se emplea un inserto de cADN, se deseará típicamente incluir una señal de poliadenilación para llevar a cabo la poliadenilación apropiada del transcrito génico. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y se puede emplear cualquier secuencia tal como las señales de poliadenilación de la hormona del crecimiento humana y de SV40. También se contempla como elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensajero y para minimizar la lectura a través del casete hasta otras secuencias.

Los vectores que contienen la secuencia de ADN apropiada como se describió anteriormente se pueden utilizar para transformar un hospedador apropiado para permitir la expresión del polipéptido o polinucleótido deseado.

3) Marcadores seleccionables

Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permitiría una identificación sencilla de las células que contienen la construcción de expresión. Los genes marcadores seleccionables para la selección de las células hospedadoras transformadas son preferiblemente dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S. cerevisiae o resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o levano sacarasa para micobacterias, y este último marcador es un marcador de selección negativa.

4) Vectores preferidos Vectores bacterianos

Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

Los expertos en la técnica conocen un gran número de otros vectores adecuados y que están disponibles comercialmente, tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).

Vectores de baculovirus

Un vector adecuado para la expresión de los polipéptidos de la invención es un vector de baculovirus que se puede propagar en células de insecto y en líneas celulares de insecto. Un sistema de vector de hospedador adecuado específico es el vector de transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea de células SF9 (ATCC nº CRL 1711) que deriva de Spodoptera frugiperda.

Otros vectores adecuados para la expresión de un polipéptido de la cabeza globular de APM1 en un sistema de expresión de baculovirus incluyen los descritos por Chai et al. (1993; Biotechnol Appl Biochem., dic.; 18(parte 3):259-73); Vlasak et al. (1983; Eur J Biochem, 1 de sep.; 135(1):123-6); y Lenhard et al. (1996; Gene, 9 de mar.; 169(2):187-90).

Vectores virales

En una realización específica, el vector deriva de un adenovirus. Los vectores de adenovirus preferidos según la invención son los descritos por Feldman y Steg (1996; Semin Interv Cardiol, sep.; 1(3):203-8), u Ohno et al. (1994; Science, 5 de ago.; 265(5173):781-4). Otro adenovirus recombinante preferido según esta realización específica de la presente invención es el adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (solicitud de patente francesa nº FR-93.05954); publicación nº FR2705361.

En general, se entiende que los vectores de retrovirus y los vectores de virus adenoasociados son los sistemas de administración de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, en particular a mamíferos, que incluyen humanos. Estos vectores proporcionan una administración eficaz de genes a las células, y los ácidos nucleicos transferidos se integran de forma estable en el ADN cromosómico del
hospedador.

Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de vehículos de administración de genes in vitro o in vivo retrovirales de la presente invención incluyen los retrovirus seleccionados del grupo que consiste en el virus inductor de focos celulares de visón, virus de sarcoma murino, virus de reticuloendoteliosis y virus de sarcoma de Rous. Los virus de leucemia murina particularmente preferidos incluyen los virus 4070A y 1504A, los virus de Abelson (ATCC nº VR-999), Friend (ATCC nº VR-245), Gross (ATCC nº VR-590), Rauscher (ATCC nº VR-998) y de leucemia murina de Moloney (ATCC nº VR-190; solicitud PCT nº WO 94/24298). Los virus de sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen los de título elevado de Bryan (ATCC nºs VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos son los descritos en Roth et al. (1996), solicitud PCT nº WO 93/25234, solicitud PCT nº WO 94/06920, Roux et al., ((1989) Proc Natl Acad Sci U S A, dic.; 86(23):9079-83), Julan et al., (1992) J. Gen. Virol. 3:3251-3255 y Neda et al., ((1991) J Biol Chem, 5 de ago.; 266(22):14143-6).

Aún otro sistema de vector viral que se contempla en la invención consiste en el virus adenoasociado (VAA). El virus adenoasociado es un virus deficiente que se da de forma natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpesvirus, como virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo vital productivo (Muzyczka et al., (1992) Curr Top Microbiol Immunol; 158:97-129). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se están dividiendo, y exhibe una frecuencia elevada de integración estable (Flotte et al., (1992) Am J Respir Cell Mol Biol, sep.; 7(3):349-56; Samulski et al., (1989) J Virol, sep.; 63(9):3822-8; McLaughlin et al., (1989) Am. J. Hum. Genet. 59:561-569). Una característica ventajosa del VAA deriva de su eficacia reducida para transducir las células primarias respecto de las células transformadas.

5) Administración de los vectores recombinantes

Para llevar a cabo la expresión de los polinucleótidos de la invención, estas construcciones se deben administrar en una célula. Esta administración se puede realizar in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar las líneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad.

Un mecanismo es la infección viral en la que la construcción de expresión está encapsulada en una partícula viral infecciosa.

También se contemplan en la presente invención varios métodos no virales para la transferencia de polinucleótidos a células mamíferas cultivadas, e incluyen, sin limitarse, la precipitación con fosfato cálcico (Graham et al., (1973) Virology, ago.; 54(2):536-9; Chen et al., (1987) Mol Cell Biol, ago.; 7(8):2745-52), DEAE-dextrano (Gopal, (1985) Mol Cell Biol, mayo; 5(5):1188-90), electroporación (Tur-Kaspa et al., (1986) Mol Cell Biol, feb.; 6(2):716-8; Potter et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA, nov.; 81(22):7161-5.), microinyección directa (Harland et al., (1985) J Cell Biol, sep.; 101(3):1094-9), liposomas cargados de ADN (Nicolau et al., (1982) Biochim Biophys Acta, 11 de oct.; 721(2):185-90; Fraley et al., (1979) Proc Natl Acad Sci USA, jul.; 76(7):3348-52), y la transfección mediada por receptor (Wu y Wu, (1987) J Biol Chem, 5 de abr.; 262(10):4429-32; Wu y Wu (1988) Biochemistry, 9 de feb.; 27(3):887-92). Algunas de estas técnicas se pueden adaptar de forma satisfactoria para el uso in vivo o ex vivo.

Una vez que se ha administrado el polinucleótido de expresión a la célula, se puede integrar de manera estable en el genoma de la célula receptora. Esta integración puede ser en la localización y orientación cognada por medio de recombinación homóloga (sustitución génica), o se puede integrar en una localización aleatoria inespecífica (aumento génico). En aún otras realizaciones, el ácido nucleico se puede mantener de forma estable en la célula en forma de un segmento separado episómico de ADN. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente o en sincronización con el ciclo de la célula hospedadora.

Una realización específica de un método para administrar una proteína o péptido al interior de una célula de un vertebrado in vivo comprende la etapa de introducir una preparación que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido desnudo que codifica de manera operable el polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, mediante el cual el polinucleótido desnudo es captado hacia el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero se puede aplicar también in vivo.

Las composiciones para el uso in vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo" se describen en la solicitud PCT nº WO 90/11092 (Vical Inc.) y también en la solicitud PCT nº WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa), así como en los artículos de Tascon et al. (1996) Nature Medicine, 2(8):888-892 y de Huygen et al. ((1996) Nat Med, ago.; 2(8):893-8).

En aún otra realización de la invención, la transferencia de un polinucleótido desnudo de la invención, que incluye una construcción polinucleotídica de la invención, en células se puede llevar a cabo con un bombardeo de partículas (biolística), y dichas partículas son microproyectiles cubiertos con ADN acelerados a una velocidad elevada, lo que les permite atravesar las membranas celulares y entrar en las células sin destruirlas, tal como describió Klein et al. ((1990) Curr Genet, feb.; 17(2):97-103).

En una realización adicional, el polinucleótido de la invención se puede encerrar en un liposoma (Ghosh y Bacchawat, (1991) Targeted Diagn Ther; 4:87-103; Wong et al., (1980) Gene 10:87-94; Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol.; 149:157-76). Estos liposomas se pueden dirigir adicionalmente hacia células que expresan LSR incorporando leptina, triglicéridos, ACRP30 u otros ligandos de LSR conocidos en la membrana del liposoma.

En una realización específica, la invención proporciona una composición para la producción in vivo de un polipéptido de cabeza globular GZIP descrito aquí. Esta comprende un polinucleótido desnudo que codifica de manera operativa este polipéptido, en disolución en un vehículo fisiológicamente aceptable, y adecuado para la introducción en un tejido para provocar que las células del tejido expresen dicho polipéptido.

La cantidad de vector a inyectar al organismo hospedador deseado varía según el sitio de inyección. Como dosis indicativa, se inyectarán entre 0,1 y 100 \mug del vector en el cuerpo del animal, preferiblemente el cuerpo de un mamífero, por ejemplo el cuerpo de un ratón.

En otra realización del vector según la invención, se puede introducir in vitro en una célula hospedadora, preferiblemente en una célula hospedadora recogida previamente del animal a tratar, y más preferiblemente una célula somática tal como una célula muscular. En una etapa posterior, la célula que se ha transformado con el vector que codifica el polipéptido de cabeza globular GZIP deseado o con su fragmento deseado se reintroduce en el cuerpo del animal para administrar la proteína recombinante en el cuerpo de forma local o sistémica.

IV. Células recombinantes de la invención

Otro objetivo de la invención consiste en células hospedadoras recombinantes, es decir, que se han transformado o transfectado con uno de los polinucleótidos descritos aquí, y más exactamente con un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido GZIP tal como cualquiera de los descritos en los "polinucleótidos" de GZIP. Estos polinucleótidos pueden estar presentes en las células como resultado de la transfección transitoria o estable. La invención incluye células hospedadoras que se transforman (células procarióticas) o que se transfectan (células eucarióticas) con un vector recombinante tal como cualquiera de los descritos en "vectores recombinantes de la invención".

En general, una célula hospedadora recombinante de la invención comprende al menos uno de los polinucleótidos o de los vectores recombinantes de la invención que se describen aquí.

Las células hospedadoras preferidas usadas como receptores para los vectores recombinantes de la invención son las siguientes:

a) Células hospedadoras procarióticas: cepas de Escherichia coli (es decir, la cepa DH5-\alpha), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de especies tales como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, y

b) Células hospedadoras eucarióticas: células HeLa (ATCC nº CCL2; nº CCL2.1; nº CCL2.2), células Cv 1 (ATCC nº CCL70), células COS (ATCC nº CRL1650; nº CRL1651), células Sf-9 (ATCC nº CRL1711), células C127 (ATCC nº CRL-1804), 3T3 (ATCC nº CRL-6361), CHO (ATCC nº CCL-61), de riñón humano 293 (ATCC nº 45504; nº CRL-1573), BHK (ECACC nº 84100501; nº 84111301), células PLC, HepG2, y Hep3B.

Las construcciones en las células hospedadoras se pueden usar de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante.

Tras la transformación de un hospedador adecuado y el cultivo del hospedador hasta una densidad celular apropiada, se induce el promotor seleccionado mediante medios apropiados, tales como desplazamiento de temperatura o inducción química, y las células se cultivan durante un período adicional.

Las células se recogen típicamente mediante centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se conserva para la purificación posterior.

Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas se pueden romper mediante cualquier método conveniente, que incluye ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes de lisis celular. El técnico experto conoce bien tales métodos.

Además, según la invención, estas células recombinantes se pueden crear in vitro o in vivo en un animal, preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en ratones, ratas, perros, cerdos, ovejas, ganado y primates, por no incluir humanos. Las células recombinantes creadas in vitro se pueden implantar después quirúrgicamente en un animal, por ejemplo. Los métodos para crear células recombinantes in vivo en animales se conocen bien en la técnica.

La presente invención también abarca células hospedadoras recombinantes homólogas primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, preferiblemente de origen mamífero y en particular de origen humano, que se han modificado para: a) insertar polinucleótidos exógenos (heterólogos) en el ADN cromosómico endógeno de un gen seleccionado como objetivo, b) eliminar el ADN cromosómico endógeno, o c) sustituir el ADN cromosómico endógeno con polinucleótidos exógenos. Las inserciones, deleciones o sustituciones de secuencias polinucleotídicas pueden ser en las secuencias codificantes del gen seleccionado como objetivo o en las regiones reguladoras, tales como las secuencias promotoras y potenciadoras, asociadas de manera operable con el gen seleccionado como
objetivo.

La presente invención se refiere además a un método para producir una célula hospedadora recombinante homóloga in vitro o in vivo, en el que se altera la expresión de un gen seleccionado como objetivo que no se expresa normalmente en la célula. Preferiblemente, la alteración provoca la expresión del gen seleccionado como objetivo en condiciones de crecimiento normales o en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el gen seleccionado como objetivo. El método comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción polinucleotídica, y la construcción polinucleotídica comprende: (i) una secuencia de selección de objetivo; (ii) una secuencia reguladora o una secuencia codificante; y (iii) un sitio donante de corte y empalme sin emparejar, si es necesario, por lo que se produce una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga.

La presente invención se refiere además a un método para alterar la expresión de un gen seleccionado como objetivo en una célula in vitro o in vivo, en el que el gen no se expresa normalmente en la célula, que comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción polinucleotídica, y la construcción polinucleotídica comprende: (i) una secuencia de selección de objetivo; (ii) una secuencia reguladora o una secuencia codificante; y (iii) un sitio donante de corte y empalme sin emparejar, si es necesario, por lo que se produce una célula transfectada; (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, por lo que se produce una célula recombinante homóloga; y (c) mantener la célula recombinante homóloga in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen.

La presente invención se refiere además a un método para producir un polipéptido de la presente invención mediante la alteración de la expresión de un gen endógeno seleccionado como objetivo en una célula in vitro o in vivo, en el que el gen no se expresa normalmente en la célula, que comprende las etapas de: (a) transfectar la célula in vitro con una construcción polinucleotídica, y la construcción polinucleotídica comprende: (i) una secuencia de selección de objetivo; (ii) una secuencia reguladora o una secuencia codificante; y (iii) un sitio donante de corte y empalme sin emparejar, si es necesario, por lo que se produce una célula transfectada; (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, por lo que se produce una célula recombinante homóloga; y (c) mantener la célula recombinante homóloga in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen, por lo que se produce el polipéptido.

La presente invención se refiere además a una construcción polinucleotídica que altera la expresión de un gen seleccionado como objetivo en un tipo de célula en el que el gen no se expresa normalmente. Esto ocurre cuando se inserta una construcción polinucleotídica en el ADN cromosómico de la célula seleccionada como objetivo, en el que la construcción polinucleotídica comprende: a) una secuencia de selección de objetivo; b) una secuencia reguladora o una secuencia codificante; y c) un sitio donante de corte y empalme sin emparejar, si es necesario. Además se incluyen construcciones polinucleotídicas, como se describieron anteriormente, en las que la construcción comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido y que está en el marco de lectura con el gen endógeno seleccionado como objetivo tras la recombinación homóloga con el ADN cromosómico.

Se pueden producir las composiciones y se pueden llevar a cabo los métodos, mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas en las patentes de EE.UU. nºs: 6.054.288; 6.048.729; 6.048.724; 6.048.524; 5.994.127; 5.968.502; 5.965.125; 5.869.239; 5.817.789; 5.783.385; 5.733.761; 5.641.670; 5.580.734; publicaciones internacionales nºs: WO 96/29411, WO 94/12650; y artículos científicos descritos por Koller et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 10:705-730.

La expresión de GZIPs en células de mamífero, y típicamente humanas, se puede hacer deficiente, o de forma alternativa se puede incrementar, con la inserción de una secuencia genómica o de cADN de GZIP con la sustitución del homólogo del gen de GZIP en el genoma de una célula animal mediante un polinucleótido de GZIP según la invención. Estas alteraciones genéticas se pueden generar mediante recombinación homóloga, mediante el uso de las construcciones de ADN específicas que se han descrito previamente.

Un tipo de célula hospedadora que se puede usar son cigotos mamíferos, tales como cigotos murinos. Por ejemplo, se puede someter a los cigotos murinos a microinyección con una molécula de ADN purificada de interés, por ejemplo una molécula de ADN purificada que se ha ajustado previamente a un intervalo de concentración de 1 ng/ml (para insertos de BAC), 3 ng/\mul (para insertos de bacteriófago P1) en Tris-HCI 10 mM, pH 7,4, EDTA 250 \muM que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM, y espermidina 70 \muM. Cuando el ADN a microinyectar tiene un gran tamaño, se pueden usar poliaminas y concentraciones salinas elevadas para evitar la ruptura mecánica de este ADN, como describió Schedl et al ((1993) Nature, 18 de mar.; 362(6417):258-61).

Cualquiera de los polinucleótidos de la invención, que incluyen las construcciones de ADN descritas aquí, se pueden introducir en una línea de células madre (ES) embrionarias, preferiblemente una línea de células ES de ratón. Las líneas de células ES derivan de células pluripotenciales sin diferenciar de la masa de células interna de los blastocistos preimplantacionales. Las líneas de células ES preferidas son las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC nº CRL-1821), ES-D3 (ATCC nº CRL 1934 y nº CRL-11632), YS001 (ATCC nº CRL-11776), 36.5 (ATCC nº CRL-11116). Para mantener las células ES en un estado indiferenciado, se cultivan en presencia de células de soporte con crecimiento inhibido que proporcionan las señales apropiadas para conservar el fenotipo embrionario y servir como matriz para la adherencia de las células ES. Las células de soporte preferidas son fibroblastos embrionarios primarios que se establecen a partir de tejido de embriones del día 13-día 14 de prácticamente cualquier cepa de ratón, y que se mantienen en cultivo tal como describió Abbondanzo et al. (1993; Methods Enzymol; 225:803-23), y se inhibe su crecimiento mediante irradiación, tal como describió Robertson ((1987) Embryo-derived stem cell lines. en: E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford), o mediante la presencia de una concentración inhibidora de LIF, tal como describieron Pease y Williams (1990; Exp Cell Res., oct.; 190(2):209-11).

Las construcciones en las células hospedadoras se pueden usar de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante.

Tras la transformación de un hospedador adecuado y el cultivo del hospedador hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce mediante medios apropiados, tales como desplazamiento de temperatura o inducción química, y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se recogen típicamente mediante centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se conserva para la purificación posterior. Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas se pueden romper mediante cualquier método conveniente, que incluye ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes de lisis celular. El técnico experto conoce bien tales métodos.

Anticuerpos

La presente invención se refiere además a anticuerpos y a receptores de antígenos de células T (TCR) que se unen de forma específica a los polipéptidos y, más específicamente, a los epítopos de los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (que incluye IgA1 e IgA2), IgD, IgE o IgM, e IgY. Como se usa aquí, el término "anticuerpo" (Ab) pretende incluir los anticuerpos completos, que incluyen anticuerpos completos de cadena única, y sus fragmentos de unión a antígenos. En una realización preferida, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos humanos de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab'F(ab)_{2} y F(ab')_{2}, Fd, Fvs de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fvs unidos por puentes disulfuro (sdFv) y los fragmentos que comprenden un dominio V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, que incluye aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, cabra, conejillo de indias, camello, caballo o gallina.

Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos, que incluyen los anticuerpos de cadena única, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con todo o parte de lo siguiente: la región de la bisagra, los dominios CH1, CH2 y CH3. También está incluida en la invención cualquier combinación de la(s) región(es)
variable(s) y la región de la bisagra, los dominios CH1, CH2 y CH3. La presente invención incluye además anticuerpos monoclonales y policlonales quiméricos, humanizados y humanos, que se unen de forma específica a los polipéptidos de la presente invención. La presente invención incluye además anticuerpos que son anti-idiotípicos para los anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos y triespecíficos o tener una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido de la presente invención, o pueden ser específicos para un polipéptido de la presente invención y para las composiciones heterólogas, tales como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Véase, p.ej., los documentos WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al. (1991); las patentes de EE.UU. 5.573.920, 4.474.893, 5.601.819, 4.714.681, 4.925.648; Kostelny, S.A. et al. (1992).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar en cuanto a el/los epítopo(s) o la(s) porción(es) que alberga(n) epítopo(s) de un polipéptido de la presente invención, que son reconocidos o que se unen específicamente al anticuerpo. En el caso de las proteínas secretadas de la presente invención, los anticuerpos pueden unirse específicamente a una proteína de tamaño completo codificada por un ácido nucleico de la presente invención, una proteína madura (es decir, la proteína generada por la escisión del péptido señal) codificada por un ácido nucleico de la presente invención, un péptido señal codificado por un ácido nucleico de la presente invención, o cualquier otro polipéptido de la presente invención. Por lo tanto, el/los epítopo(s) o la(s) porción(es) que alberga(n) epítopo(s) de un polipéptido se puede(n) especificar como se describe aquí, p.ej., por las posiciones N-terminales o C-terminales, por el tamaño en los residuos de aminoácidos contiguos, o de otra forma como se describe aquí. Los anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítopo o polipéptido de la presente invención se pueden excluir también como especies individuales. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen de forma específica a los polipéptidos especificados de la presente invención, y permite la exclusión de los mismos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar también en cuanto a su reactividad cruzada. Se incluyen los anticuerpos que no se unen de forma específica a ningún otro análogo, ortólogo ni homólogo de los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos que no se unen a polipéptidos con menos de un 95%, menos de un 90%, menos de un 85%, menos de un 80%, menos de un 75%, menos de un 70%, menos de un 65%, menos de un 60%, menos de un 55%, y menos de un 50% de identidad (calculada mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica y descritos aquí, p.ej., mediante el uso de FASTDB y los parámetros expuestos aquí) respecto de un polipéptido de la presente invención también están incluidos en la presente invención. Además, están incluidos en la presente invención los anticuerpos que se unen solamente a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con un polinucleótido de la presente invención en condiciones de hibridación rigurosas (como se describe aquí). Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar también en cuanto a su afinidad de unión. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o valor de Kd menor de 5X10^{-6} M, 10^{-6} M, 5X10^{-7} M, 10^{-7} M, 5X10^{-8} M, 10^{-8} M, 5X10^{-9} M, 10^{-9} M, 5X10^{-10} M, 10^{-10} M, 5X10^{-11} M, 10^{-11} M, 5X10^{-12} M, 10^{-12} M, 5X10^{-13} M, 10^{-13} M, 5X10^{-14} M, 10^{-14} M, 5X10^{-15} M y 10^{-15} M.

Los anticuerpos de la presente invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, los métodos conocidos en la técnica para purificar, detectar y seleccionar como objetivo los polipéptidos de la presente invención, que incluyen métodos diagnósticos y terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir de forma cualitativa y cuantitativa las concentraciones de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas (véase, p.ej., Harlow et al., 1988).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos se pueden fusionar además de forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el extremo N- o C-terminal o se pueden conjugar químicamente (lo que incluye las conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden fusionar de forma recombinante o conjugarlos a moléculas útiles como moléculas marcadoras en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véase, p.ej., los documentos WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la patente de EE.UU. 5.314.995; y el documento EP 0 396 387.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico suyo se puede administrar a un animal para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. La expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos por medio de la tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión, en el que el dominio de unión está formado a partir del plegamiento de los dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma en la superficie interna y una distribución de cargas complementaria a las características de un determinante antigénico de un antígeno, lo que permite una reacción inmunológica con el antígeno. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, que incluye un clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al método mediante el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el uso de una amplia diversidad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen el uso de tecnología de hibridomas, tecnología recombinante y tecnología de expresión en
fagos.

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Los métodos con hibridomas incluyen los conocidos en la técnica (véase, p.ej., Harlow et al. 1988; Hammerling, et al, 1981). Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} se pueden producir, por ejemplo, a partir de anticuerpos producidos por hibridomas mediante escisión proteolítica, mediante el uso de enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir F(ab')_{2}).

De forma alternativa, los anticuerpos de la presente invención se pueden producir por medio de la aplicación de la tecnología de ADN recombinante o por medio de química sintética mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante el uso de diversos métodos de expresión en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de expresión en fagos, los dominios funcionales del anticuerpo se expresan en la superficie de una partícula de fago, que porta secuencias polinucleotídicas que los codifica. El fago con una propiedad de unión deseada se selecciona a partir de un repertorio o de una biblioteca combinatoria de anticuerpos (p.ej. humana o murina) mediante selección directa con el antígeno, típicamente el antígeno unido o capturado en una superficie o esfera sólida. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13 con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con puentes disulfuro fusionados de forma recombinante a la proteína del gen III o del gen VIII del fago. Los ejemplos de los métodos de expresión en fagos que se pueden usar para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman U. et al. (1995); Ames, R.S. et al. (1995); Kettleborough, C.A. et al. (1994); Persic, L. et al. (1997); Burton, D.R. et al. (1994); los documentos PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de EE.UU. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727 y 5.733.743.

Como se describió en las referencias anteriores, tras la selección del fago se pueden aislar las regiones codificantes del anticuerpo a partir del fago y usarlas para generar anticuerpos completos, que incluyen anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígenos deseado, y expresarlos en cualquier hospedador deseado, que incluye células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias. Por ejemplo, las técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' F(ab)_{2} y F(ab')_{2} se pueden emplear también mediante el uso de métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en el documento WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al. (1992); y Sawai, H. et al. (1995); y Better, M. et al. (1988).

Los ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fvs y anticuerpos de cadena única incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al. (1991); Shu, L. et al. (1993); y Skerra, A. et al. (1988). Para algunos usos, que incluyen el uso in vivo de los anticuerpos en humanos y en ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, p.ej., Morrison, (1985); Oi et al., (1986); Gillies, S.D. et al. (1989); y la patente de EE.UU. 5.807.715. Los anticuerpos se pueden humanizar mediante el uso de una diversidad de técnicas que incluyen el injerto de CDR (documentos EP 0 239 400; WO 91/09967; patente de EE.UU. 5.530.101; y 5.585.089), el remodelado de la superficie (documentos EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., 1991; Studnicka G.M. et al., 1994; Roguska M.A. et al., 1994), y la mezcla aleatoria de cadenas (patente de EE.UU. 5.565.332). Se pueden producir anticuerpos humanos mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen los métodos de expresión en fagos descritos anteriormente. Véase además las patentes de EE.UU. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; los documentos WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741.

También se incluyen en la presente invención los anticuerpos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (lo que incluye las conjugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos distintos de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para dirigir los polipéptidos de la presente invención hacia tipos celulares particulares, in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de la presente invención se pueden usar también en inmunoensayos in vitro y en métodos de purificación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véase, p.ej., Harbor et al., anteriormente mencionado; los documentos WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura, M. et al. 1994; la patente de EE.UU. 5.474.981; Gillies, S.O. et al., 1992; Fell, H.P. et al., 1991).

La presente invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados a dominios de anticuerpos distintos de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar o conjugar a una región Fc de un anticuerpo, o a su porción. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región de la bisagra, el dominio CH1, el dominio CH2 y el dominio CH3 o cualquier combinación de dominios completos o de sus porciones. Los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpos anteriores para incrementar la semivida in vivo de los polipéptidos, o para el uso en inmunoensayos mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden fusionar o conjugar también a las porciones de anticuerpo anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros por medio de la formación de puentes disulfuro entre las porciones Fc. Se pueden producir formas multiméricas superiores fusionando los polipéptidos de las porciones de IgA e IgM. Los métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpos se conocen en la técnica. Véase, p.ej., las patentes de EE.UU. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112.946; los documentos EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi, A. et al. (1991); Zheng, X.X. et al. (1995); y Vil, H. et al. (1992).

La invención se refiere además a anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que alteran las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos de la invención de forma parcial o total. Se incluyen tanto anticuerpos específicos de receptor como anticuerpos específicos de ligando. Se incluyen anticuerpos específicos de receptor, que no evitan la unión del ligando pero evitan la activación del receptor. La activación del receptor (es decir, la señalización) se puede determinar mediante técnicas descritas aquí o conocidas por otra parte en la técnica. También se incluyen los anticuerpos específicos de receptor que evitan la unión del ligando y la activación del receptor. De forma similar, se incluyen anticuerpos neutralizantes que se unen a los ligandos y evitan la unión del ligando al receptor, así como anticuerpos que se unen al ligando, por lo que evitan la activación del receptor, pero no evitan que el ligando se una al receptor. Además se incluyen anticuerpos que activan el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas para todas o algunas de las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos se pueden especificar como agonistas o antagonistas para las actividades biológicas, que comprenden las actividades específicas descritas aquí. Los anteriores agonistas de anticuerpos se pueden producir mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Véase, p.ej., el documento WO 96/40281; la patente de EE.UU. 5.811.097; Deng, B. et al. (1998); Chen, Z. et al. (1998); Harrop, J.A. et al. (1998); Zhu, Z. et al. (1998); Yoon, D.Y. et al. (1998); Prat, M. et al. (1998) J.; Pitard, V. et al. (1997); Liautard, J. et al. (1997); Carlson, N.G. et al. (1997) J.; Taryman, R.E. et al. (1995); Muller, Y.A. et al. (1998); Bartunek, P. et al. (1996).

Como se discutió anteriormente, se pueden utilizar los anticuerpos de los polipéptidos de la invención, a su vez, para generar anticuerpos anti-idiotípicos que "imitan" los polipéptidos de la invención mediante el uso de métodos bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, p.ej., Greenspan y Bona (1989); y Nissinoff (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen y que inhiben de forma competitiva la multimerización del polipéptido o la unión de un polipéptido de la invención a un ligando se pueden usar para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerización del polipéptido o el dominio de unión y, como consecuencia, se unen y neutralizan al polipéptido o su ligando. Tales anticuerpos anti-idiotípicos de neutralización se pueden usar para unirse a un polipéptido de la invención o para unirse a sus ligandos/receptores, y por lo tanto bloquean su actividad biológica.

La invención también se refiere a un anticuerpo purificado o aislado capaz de unirse de forma específica a un polipéptido mutado de tamaño completo o maduro de la presente invención o a un fragmento o variante suyo que comprende un epítopo del polipéptido mutado. En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de la presente invención, y que incluye al menos uno de los aminoácidos que pueden estar codificados por las mutaciones que provocan el rasgo genético.

Los animales o mamíferos que no son humanos, ya sean de tipo natural o transgénicos, que expresan una especie diferente de un polipéptido de la presente invención para el que se desea la unión el anticuerpo, y los animales que no expresan un polipéptido de la presente invención (es decir, un animal con genes desactivados) son particularmente útiles para preparar los anticuerpos. Los animales con genes desactivados reconocerán todas o la mayoría de las regiones expuestas de un polipéptido de la presente invención como antígenos extraños, y por lo tanto producirán anticuerpos con una serie más amplia de epítopos. Además, los polipéptidos más pequeños con solamente 10 a 30 aminoácidos pueden ser útiles para obtener una unión específica a cualquiera de los polipéptidos de la presente invención. Además, el sistema inmunitario humoral de los animales que producen una especie de un polipéptido de la presente invención que se parece a la secuencia antigénica reconocerá preferentemente las diferencias entre la especie del polipéptido nativo del animal y la secuencia del antígeno, y producirá anticuerpos hacia estos sitios únicos en la secuencia del antígeno. Dicha técnica será particularmente útil para obtener anticuerpos que se unan específicamente a cualquiera de los polipéptidos de la presente invención.

Las preparaciones de anticuerpos preparadas según cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que albergan antígenos en muestras biológicas; también se usan de forma semicuantitativa o cualitativa para identificar la presencia del antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos se pueden usar también en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

Los anticuerpos de la invención se pueden marcar mediante cualquiera de los marcadores radiactivos, fluorescentes o enzimáticos conocidos en la técnica.

Por lo tanto, la invención se dirige también a un método para detectar específicamente la presencia de un polipéptido de la presente invención según la invención en una muestra biológica, y dicho método comprende las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica que se sospecha que contiene un polipéptido de la presente invención;

b) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de la presente invención en condiciones adecuadas para la unión antígeno-anticuerpo; y

c) detectar el complejo antígeno-anticuerpo formado.

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La invención también se refiere a un equipo de diagnóstico para detectar in vitro la presencia de un polipéptido de la presente invención en una muestra biológica, en el que dicho equipo comprende:

a) un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de la presente invención, opcionalmente marcado;

b) un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados, y dicho reactivo porta opcionalmente una molécula marcadora, o es capaz de ser reconocido él mismo por un reactivo marcado, más en particular en el caso en el que el anticuerpo monoclonal o policlonal anteriormente mencionado no está marcado él mismo.

A. Producción de anticuerpos monoclonales mediante fusión de hibridomas

Los anticuerpos monoclonales hacia epítopos de cualquiera de los péptidos identificados y aislados como se describió se pueden preparar a partir de hibridomas murinos según el método clásico de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495 (1975) o sus métodos derivados. Brevemente, se inocula a un ratón de forma repetida unos microgramos de la proteína seleccionada o los péptidos derivados de ella a lo largo de un periodo de varias semanas. Después se sacrifica el ratón, y se aíslan las células productoras de anticuerpos del bazo. Las células del bazo se fusionan por medio de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y las células sin fusionar en exceso se destruyen mediante el cultivo del sistema en un medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células fusionadas de forma satisfactoria se diluyen, y las alícuotas de la dilución se colocan en pocillos de una placa de microtitulación en los que se continúa con el crecimiento del cultivo. Los clones productores de anticuerpos se identifican mediante la detección del anticuerpo en el líquido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoensayo, tales como ELISA, como describió en un principio Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980), y sus métodos derivados. Los clones positivos seleccionados se pueden ampliar y se puede recoger su producto de anticuerpo monoclonal para su uso. Se describen procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales en Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, Nueva York. Sección 21-2.

También están incluidos en particular en la presente invención los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al polipéptido GZIP. Más en particular, están incluidos en la presente invención los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 209-254, 215-248, 221-242 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 206-251, 212-245, 218-239 de la ID SEC Nº: 3. Además, están incluidos más en particular en la presente invención los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 21-202, 21-208 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 18-199, 18-205 de la ID SEC Nº: 3.

Además, están incluidos en particular en la presente invención los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al polipéptido APM1. Más en particular, están incluidos en la presente invención los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a fragmentos del polipéptido APM1 que comprenden los aminoácidos 165-205, 171-199, 177-193 ó 179-190 de la ID SEC Nº: 4. Además, se prefieren más en particular los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que contiene la región globular de homología con C1q que comprende los aminoácidos 91-244, 101-244 ó 108-244 de la ID SEC Nº: 4.

B. Producción de anticuerpos policlonales mediante inmunización

Se puede preparar antisuero policlonal que contiene anticuerpos hacia epítopos heterogéneos de una única proteína mediante la inmunización de animales adecuados con la proteína expresada o los péptidos derivados de ella descritos anteriormente, que pueden estar sin modificar o modificados para incrementar la inmunogenicidad. La producción eficaz de anticuerpos policlonales se ve afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie hospedadora. Por ejemplo, las moléculas pequeñas tienden a ser menos inmunógenas que otras, y pueden requerir el uso de vehículos y adyuvantes. Además, la respuesta de los animales hospedadores varía con el sitio de las inoculaciones y la dosis, y las dosis inadecuadas o excesivas de antígenos dan como resultado antisueros con título bajo. Las dosis pequeñas (nivel de ng) de antígeno administradas en múltiples sitios intradérmicos parecen ser las más fiables. Se puede hallar un protocolo de inmunización eficaz para conejos en Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).

Se pueden administrar inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, y se recoge el antisuero cuando su título de anticuerpos comienza a caer, tal como se determina de forma semicuantitativa, por ejemplo, mediante inmunodifusión doble en agar frente a concentraciones conocidas del antígeno. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. et al., cap. 19 en: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). La concentración estable de anticuerpo está habitualmente en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (alrededor de 12 \muM). La afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva, como se describe, por ejemplo, en Fisher, D., cap. 42 en: Manual of Clinical Immunology, 2ª ed. (Rose y Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980).

Las preparaciones de anticuerpo preparadas según cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que albergan antígenos en muestras biológicas; también se usan de forma semicuantitativa o cualitativa para identificar la presencia del antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos se pueden usar también en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

También están incluidos en particular en la presente invención los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un polipéptido GZIP. Más en particular, están incluidos en la presente invención los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 209-254, 215-248, 221-242 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 206-251, 212-245, 218-239 de la ID SEC Nº: 3. Además, están incluidos más en particular en la presente invención los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 21-202, 21-208 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 18-199, 18-205 de la ID SEC Nº: 3.

Además, están incluidos en particular en la presente invención los anticuerpos policlonales que se unen específicamente al polipéptido APM1. Más en particular, están incluidos en la presente invención los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a fragmentos del polipéptido APM1 que comprenden los aminoácidos 165-205, 171-199, 177-193 ó 179-190 de la ID SEC Nº: 4. Además, se prefieren más en particular los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que contiene la región globular de homología con C1q que comprende los aminoácidos 91-244, 101-244 ó 108-244 de la ID SEC Nº: 4.

IX. Ensayos para identificar antagonistas de la unión de APM1 a GZIP

La invención proporciona métodos para cribar uno o más compuestos antagonistas que bloquean la unión del polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 a un fragmento de polipéptido GZIP. Dicho fragmento de polipéptido APM1 contiene todo o parte de la región globular de homología con C1q de APM1 (véase la publicación PCT WO 01/51645). El fragmento de polipéptido APM1 adicionalmente preferido es dicho fragmento de polipéptido APM1 que contiene todo o parte de la región globular de homología con C1q que comprende los aminoácidos 18-244, 93-244, 101-244 ó 108-244 de la ID SEC Nº: 4 y que se une específicamente al polipéptido GZIP de la invención. Dicho fragmento de polipéptido GZIP preferido es el polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal, en el que dicho polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 ó 18-295 de la ID SEC Nº: 3.

Dicho compuesto preferido es un polipéptido.

Otro compuesto preferido es un fragmento de polipéptido. Dicho fragmento de polipéptido preferido es un fragmento de polipéptido GZIP. Dicho fragmento de polipéptido particularmente preferido es un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221- 242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200-295, 206-295, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3. Otro fragmento de polipéptido preferido es un fragmento de polipéptido APM1. Otro fragmento particularmente preferido es un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 177-193 ó 179-190 de la ID SEC Nº: 4.

Otro compuesto preferido es un péptido.

Otro compuesto preferido es una proteína.

Otro compuesto preferido es un anticuerpo. Dicho anticuerpo preferido es un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido GZIP. Un anticuerpo particularmente preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 221-242 de la ID SEC Nº: 2 ó 218-239 de la ID SEC Nº: 3. Otro anticuerpo preferido es aquel que se une específicamente al polipéptido APM1. Otro anticuerpo particularmente preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 177-193 de la ID SEC Nº: 4. Otro anticuerpo particularmente preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 93-244, 101-244 ó 108-244 de la ID SEC Nº: 4. Otro compuesto preferido es un carbohidrato. Otro compuesto preferido es un lípido. Otro compuesto preferido es un compuesto orgánico de peso molecular bajo. Otro compuesto preferido es un compuesto inorgánico de peso molecular bajo.

Un ejemplo de dicho método de cribado de uno o más compuestos antagonistas que bloquean la unión de un polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 a un fragmento de polipéptido GZIP es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) que comprende: a) incubar y así poner en contacto el polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 inmovilizado con o sin un compuesto candidato; b) poner en contacto además dicho polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 inmovilizado que se ha puesto en contacto con dicho compuesto candidato con un fragmento de polipéptido GZIP; c) poner en contacto el fragmento de polipéptido GZIP unido a dicho polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 inmovilizado con anticuerpo anti-GZIP biotinilado; d) poner en contacto el anticuerpo anti-GZIP unido biotinilado con una enzima conjugada a estreptavidina; y e) poner en contacto la enzima unida conjugada a estreptavidina con el sustrato de dicha enzima, en la que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato da como resultado un cambio de color; y f) detectar el resultado, en el que dicho resultado identifica dicho compuesto como un antagonista si el grado del cambio de color se reduce tras la incubación de dicho polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 inmovilizado con dicho compuesto.

Otro ejemplo de dicho método de cribado de uno o más compuestos antagonistas que bloquean la unión de un polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 al fragmento de polipéptido GZIP es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) que comprende: a) incubar y así poner en contacto el fragmento de polipéptido GZIP inmovilizado con o sin un compuesto candidato; b) poner en contacto además dicho fragmento de polipéptido GZIP inmovilizado que se ha puesto en contacto con dicho compuesto candidato con un polipéptido o fragmento de polipéptido APM1; c) poner en contacto el polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 unido a dicho fragmento de polipéptido GZIP inmovilizado con anticuerpo anti-APM1 biotinilado (véase la publicación PCT WO 01/51645); d) poner en contacto el anticuerpo anti-APM1 unido biotinilado con una enzima conjugada a estreptavidina; y e) poner en contacto la enzima unida conjugada a estreptavidina con el sustrato de dicha enzima, en la que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato da como resultado un cambio de color; y f) detectar el resultado, en el que dicho resultado identifica dicho compuesto como un antagonista si el grado del cambio de color se reduce tras la incubación de dicho fragmento de polipéptido GZIP inmovilizado con dicho compuesto.

Dichos ejemplos de cribado de uno o más compuestos antagonistas que bloquean la unión del polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 a un fragmento de polipéptido GZIP mediante ELISA son muy conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. Las personas de experiencia habitual en la técnica pueden idear además ensayos alternativos de cribado de uno o más compuestos antagonistas que bloquean la unión del polipéptido o fragmento de polipéptido APM1 a un fragmento de polipéptido GZIP.

X. Ensayos para identificar antagonistas de la actividad manifestada por un fragmento de polipéptido GZIP

La invención proporciona métodos para cribar compuestos en busca de uno o más antagonistas de la actividad manifestada por un fragmento de polipéptido GZIP, en los que dicha actividad se selecciona de, pero no se limita a, la distribución de lípidos, el metabolismo lipídico y la actividad similar a insulina. Dicho fragmento de polipéptido GZIP preferido es un polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal, en el que dicho polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 ó 18-295 de la ID SEC Nº: 3.

Dicho compuesto preferido es un polipéptido.

Otro compuesto preferido es un fragmento de polipéptido. Dicho fragmento de polipéptido preferido es un fragmento de polipéptido GZIP. Dicho fragmento de polipéptido GZIP particularmente preferido es un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221-242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200-295, 206-295, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3.

Otro compuesto preferido es un péptido.

Otro compuesto preferido es una proteína.

Otro compuesto preferido es un anticuerpo. Dicho anticuerpo preferido es un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido GZIP. Dicho anticuerpo particularmente preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 221-242 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 218-239 de la ID SEC Nº: 3.

Otro compuesto preferido es un carbohidrato.

Otro compuesto preferido es un lípido.

Otro compuesto preferido es un compuesto orgánico de peso molecular bajo.

Otro compuesto preferido es un compuesto inorgánico de peso molecular bajo.

La invención proporciona además métodos para cribar compuestos en busca de dicho antagonista de la actividad manifestada por un fragmento de polipéptido GZIP que comprende: a) poner en contacto dicho fragmento de polipéptido GZIP con o sin dicho compuesto; b) detectar un resultado basándose en la actividad, en la que dicha actividad se selecciona de, pero no se limita a, la distribución de lípidos, el metabolismo lipídico y la actividad similar a insulina; y c) en el que dicho resultado identifica dicho compuesto como dicho antagonista si dicho resultado con dicho compuesto se opone a dicho resultado sin dicho compuesto. El ensayo ejemplar que se puede usar se describe en los Ejemplos 2 y 10.

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XI. Ensayos para identificar antagonistas de la actividad manifestada por la combinación de un fragmento de polipéptido GZIP y un fragmento de polipéptido APM1

La invención proporciona métodos para cribar compuestos en busca de uno o más antagonistas de la actividad manifestada por la combinación de un fragmento de polipéptido GZIP y un fragmento de polipéptido APM1, en los que dicha actividad se selecciona de, pero no se limita a, la distribución de lípidos, el metabolismo lipídico y la actividad similar a insulina. Dicho fragmento de polipéptido GZIP preferido es un polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal, en el que dicho polipéptido GZIP maduro sin el péptido señal comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 ó 18-295 de la ID SEC Nº: 3.

Dicho fragmento de polipéptido APM1 preferido comprende la región globular de homología con C1q de APM1. El fragmento de polipéptido APM1 particularmente preferido es dicho fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 101-244 de la ID SEC Nº: 4. Otro fragmento de polipéptido APM1 particularmente preferido es dicho fragmento de polipéptido APM1 del plasma que tiene un peso molecular aparente de 27 kDa (véase el documento PCT WO 01/51645).

Dicho compuesto preferido es un polipéptido.

Otro compuesto preferido es un fragmento de polipéptido. Dicho fragmento de polipéptido preferido es un fragmento de polipéptido GZIP. Dicho fragmento de polipéptido GZIP particularmente preferido es un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221-242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200-295, 206-295, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3. Otro fragmento de polipéptido preferido es un fragmento de polipéptido APM1. Dicho fragmento de polipéptido APM1 particularmente preferido es un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 177-193 ó 179-190 de la ID SEC Nº: 4.

Otro compuesto preferido es un péptido.

Otro compuesto preferido es una proteína.

Otro compuesto preferido es un anticuerpo. Dicho anticuerpo preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido GZIP. Dicho anticuerpo particularmente preferido que se une a un fragmento de polipéptido GZIP es dicho anticuerpo dirigido hacia un fragmento de polipéptido GZIP que comprende los aminoácidos 221-242 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 218-239 de la ID SEC Nº: 3, o los aminoácidos 21-202, 21-208 de la ID SEC Nº: 2, o los aminoácidos 18-199, 18-205 de la ID SEC Nº: 3. Otro anticuerpo preferido es aquel que se une específicamente a un polipéptido APM1. Dicho anticuerpo particularmente preferido dirigido hacia APM1 es dicho anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 177-193 de la ID SEC Nº: 4. Otro anticuerpo particularmente preferido es un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 93-244, 101-244 ó 108-244 de la ID SEC Nº: 4.

Otro compuesto preferido es un carbohidrato.

Otro compuesto preferido es un lípido.

Otro compuesto preferido es un compuesto orgánico de peso molecular bajo.

Otro compuesto preferido es un compuesto inorgánico de peso molecular bajo.

La invención proporciona además métodos para cribar compuestos en busca de dicha actividad antagonista manifestada por la combinación de un fragmento de polipéptido GZIP y un fragmento de polipéptido APM1 que comprende: a) poner en contacto dicha combinación de fragmento de polipéptido GZIP y fragmento de polipéptido APM1 con o sin dicho compuesto; b) detectar un resultado basándose en la actividad, en la que dicha actividad se selecciona de, pero no se limita a, la distribución de lípidos, el metabolismo lipídico y la actividad similar a insulina; y c) en el que dicho resultado identifica dicho compuesto como dicho antagonista si dicho resultado con dicho compuesto se opone a dicho resultado sin dicho compuesto. El ensayo ejemplar que se puede usar se describe en los Ejemplos 2 y 10.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos, y no como medio de limitación. Alguien de experiencia habitual en la técnica sería capaz de diseñar ensayos y métodos equivalentes basándose en la presente descripción, todo lo cual forma parte de la presente invención.

Ejemplo 1 Análisis de Northern del ADN de GZIP

El análisis de la expresión de GZIP en diferentes tejidos humanos (adultos y fetales) y líneas celulares, así como en embriones de ratón en diferentes fases de desarrollo, se lleva a cabo mediante el uso de transferencias de ARN poli A^{+} adquiridas de Clontech (p.ej., nºs 7780-1, 7757-1, 7756-1, 7768-1 y 7763-1). El marcado de las sondas de ARN se realiza mediante el uso del equipo RNA Strip-EZ de Ambion siguiendo las instrucciones del fabricante. La hibridación de las sondas de ARN a las transferencias de ARN se realiza con disolución de hibridación Ultrahyb (Ambion). Brevemente, las transferencias se prehibridan durante 30 min a 58ºC (rigurosidad baja) o 65ºC (rigurosidad elevada). Después de añadir la sonda marcada (2x10^{6} cpm/ml), las transferencias se hibridan durante la noche (14-24 h), y se lavan 2 x 20 min a 50ºC con SSC 2x/0,1% de SDS (rigurosidad baja), 2 x 20 min a 58ºC con SSC 1x/0,1% de SDS (rigurosidad media) y 2 x 20 min a 65ºC con SSC 1x/0,1% de SDS (rigurosidad elevada). Después de completar los lavados, las transferencias se exponen en el Phosphoimager (Molecular Dynamics) durante 1-3 días.

Ejemplo 2 Ensayos in vitro de la actividad relacionada con el metabolismo

Se determina la actividad de diversas preparaciones y diversas variantes de secuencia de los polipéptidos GZIP mediante el uso de diversos ensayos in vitro que incluyen los proporcionados más adelante. Estos ensayos son también ejemplares de los que se pueden usar para desarrollar antagonistas y agonistas de polipéptidos GZIP. Para hacerlo, el efecto de los polipéptidos GZIP en los ensayos anteriores, p.ej. sobre la actividad de leptina o LSR, en presencia de las moléculas candidatas se compararía con el efecto de los polipéptidos GZIP en los ensayos en ausencia de las moléculas candidatas. Ya que se cree que los polipéptidos GZIP reducen el peso corporal en ratones con una dieta de cafetería elevada en grasas (Ejemplo 5), estos ensayos sirven también para identificar los tratamientos candidatos para reducir (o incrementar) el peso corporal.

Línea de células hepáticas

Se pueden llevar a cabo pruebas de la eficacia de los polipéptidos GZIP sobre los LSR mediante el uso de líneas de células hepáticas que incluyen, por ejemplo, PLC, HepG2, Hep3B (humano), Hepa 1-6, BPRCL (ratón), o MCA-RH777, MCA-RH8994 (rata).

Las células hepáticas de ratón BPRCL (depósito ATCC) se colocan con una densidad de 300.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM (glucosa elevada) que contiene glutamina y penicilina-estreptomicina (Bihain & Yen, 1992). Los medios se cambian en el día 2. En el día 3, las monocapas confluentes se lavan una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (2 ml/pocillo). Las células se incuban a 37ºC durante 30 min con concentraciones crecientes de AdipoQ (AQ) o AdipoQ globular (AQ-GH) recombinante en DMEM que contienen 0,2% (p/v) de BSA, Hepes 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, 3,7 g/l de bicarbonato sódico, pH 7,5. Las incubaciones continúan durante 3 h a 37ºC tras la adición de 10 ng/ml de ^{125}I-leptina de ratón (actividad específica 22100 cpm/ng). Las monocapas se lavan 2 veces de forma consecutiva con PBS que contiene un 0,2% de BSA, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y después 2 veces consecutivamente con PBS. Las células se lisan con NaOH 0,1 N que contiene EDTA 0,24 mM. Los lisados se recogen en tubos, y se realiza el recuento en un contador \gamma.

Modelo de la barrera hematoencefálica

El efecto de los polipéptidos GZIP sobre el transporte de leptina en el cerebro se puede determinar mediante el uso de células derivadas de cerebro. Un método que se prevé es usar el modelo de la barrera hematoencefálica descrito por Dehouck, et al (J Neurochem 54:1798-801, 1990) que usa un co-cultivo de células endoteliales de capilares cerebrales y astrocitos para ensayar el efecto de los polipéptidos GZIP sobre el trasporte de leptina (u otras moléculas) por medio de LSR u otros receptores.

Este ensayo sería un indicador del efecto potencial de los polipéptidos GZIP sobre el trasporte de leptina al cerebro, y se podría usar para cribar variantes de polipéptidos GZIP en cuanto a su capacidad para modular el trasporte de leptina por medio de LSR u otros receptores del cerebro. Además, se podrían cribar mediante el uso de este ensayo agonistas y antagonistas putativos del efecto de los polipéptidos GZIP sobre el trasporte de leptina por medio de LSR u otros receptores. El trasporte incrementado de leptina a través de la barrera hematoencefálica incrementaría presumiblemente su acción como factor de saciedad.

Análisis de FACS de la expresión de LSR

El efecto de los polipéptidos GZIP sobre LSR se puede determinar también midiendo el nivel de expresión de LSR en la superficie celular mediante citometría de flujo, mediante el uso de anticuerpos anti-LSR y anticuerpos secundarios fluorescentes. La citometría de flujo es una tecnología basada en láser que se usa para medir características de partículas biológicas. El principio subyacente de la citometría de flujo es que la luz se dispersa y se emite fluorescencia a medida que la luz de la fuente de excitación alcanza las partículas en movimiento.

Este es un ensayo de elevado rendimiento que se podría adaptar fácilmente para cribar polipéptidos GZIP y variantes, así como agonistas o antagonistas putativos de los polipéptidos GZIP. A continuación se proporcionan dos ensayos. El anticuerpo, la línea celular y los análogos de polipéptidos GZIP variarían dependiendo del experimento, pero se podría usar una línea celular humana, un anticuerpo anti-LSR humano y APM1 globular para cribar variantes, agonistas y antagonistas a ser usados para tratar humanos.

Ensayo 1

Las células se pretratan con polipéptidos GZIP intactos (o sin tratar) antes de la recogida y el análisis mediante FACS. Las células se recogen mediante el uso de una disolución de disociación no enzimática (Sigma), y después se incuban durante 1 h a 4ºC con una dilución 1:200 de anti-LSR 81B o un anti-suero irrelevante en PBS que contiene un 1% (p/v) de BSA. Después de lavar dos veces con el mismo tampón, se añade anticuerpo conjugado a FITC anti-conejo de cabra (Rockland, Gilbertsville, PA) a las células, seguido de una incubación adicional durante 30 min a 4ºC. Después de lavar, las células se fijan en un 2% de formalina. El análisis de citometría de flujo se realiza en un citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Ensayo 2

Las células se cultivan en matraces T175 según las instrucciones del fabricante durante 48 horas antes del análisis.

Las células se lavan una vez con tampón FACS (PBS 1x/2% de FBS, esterilizado por filtración), y se desprenden manualmente del matraz en 10 ml de tampón de FACS. La suspensión de células se transfiere a un tubo cónico de 15 ml y se centrifuga a 1200 rpm, 4ºC durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y las células se resuspenden en 10 ml de tampón de FACS enfriado a 4ºC. Se realiza un recuento de células y se ajusta la densidad celular con tampón de FACS hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Se añadió un mililitro de la suspensión de células a cada pocillo de una placa de 48 pocillos para análisis. Las células se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Las placas se comprueban para asegurar que las células están sedimentadas, se elimina el sobrenadante y las células se resuspenden colocando la placa en un agitador vórtex. Se añade un mililitro de tampón de FACS a cada pocillo, seguido de centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Este lavado de células descrito se realizó un total de 3 veces.

El anticuerpo primario, titulado en experimentos de cribado para determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:5000 ó 1:10000), se añade a las células en un volumen total de 50 \mul de tampón de FACS. Las placas se incuban durante 1 h a 4ºC protegidas de la luz. Tras la incubación, las células se lavan 3 veces como se expuso anteriormente. El anticuerpo secundario apropiado, titulado en experimentos de cribado para determinar las diluciones de trabajo apropiadas (por ejemplo 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:5000 ó 1:10000), se añade a las células en un volumen total de 50 \mul de tampón de FACS. Las placas se incuban durante 1 h a 4ºC protegidas de la luz. Tras la incubación, las células se lavan 3 veces como se expuso anteriormente. Tras el lavado final, las células se resuspenden en 500 \mul de tampón de FACS y se transfieren a un tubo de FACS. Las muestras se colocan en hielo protegidas de la luz y se analizan antes de 1 hora.

Unión y captación celular de polipéptidos GZIP detectada mediante microscopía de fluorescencia

Conjugación con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de polipéptidos GZIP: Se marcan proteínas GZIP purificadas a una concentración de 1 mg/ml con FITC mediante el equipo de conjugación FluoroTag FITC de Sigma (nº de referencia FITC-1). Se sigue el protocolo resumido en el manual de Sigma para la conjugación a pequeña escala para marcar proteínas GZIP.

Cultivo de células: Se siembran células de músculo esquelético de ratón C2C12 (ATCC, Manassas, VA CRL-1772) y hepatocitos de ratón Hepa-1-6 (ATCC, Manassas, VA CRL-1830) en placas de 6 pocillos a una densidad celular de 2x10^{5} células por pocillo. Las células C2C12 y Hepa-1-6 se cultivan según las instrucciones del proveedor durante 24-48 horas antes del análisis. El ensayo se realiza cuando las células son un 80% confluentes.

Unión y captación celular de proteínas GZIP marcadas con FITC mediante el uso de microscopía: Las células C2C12 y Hepa-1-6 se incuban en presencia/ausencia de anticuerpo dirigido contra el LSR humano (81B: secuencia N-terminal de LSR humano; no reacciona de forma cruzada con LSR de ratón, y 93A: secuencia C-terminal, reacciona de forma cruzada con LSR de ratón) o un antisuero dirigido contra gC1qr (953) durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2}. Los anticuerpos de LSR se añaden a los medios a una concentración de 2 \mug/ml. El antisuero anti-gC1qr se añade a los medios a un volumen de 2,5 \mul de suero sin diluir (concentración elevada) o a una dilución 1:100 (concentración baja). Tras la incubación con el anticuerpo especificado, se añade FITC-polipéptido GZIP (50 nM/ml) a cada pocillo de cultivo celular. Las células se incuban otra vez durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2}. Las células se lavan 2x con PBS, y se desprenden del pocillo en 1 ml de PBS. La suspensión de células se transfiere a un tubo Eppendorf y se centrifuga a 1000 rpm durante 2 minutos. Se elimina el sobrenadante y las células se resuspenden en 200 \mul de PBS. Se analiza la unión y la captación de FITC-polipéptido GZIP mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 40X.

Este ensayo puede ser útil para identificar agentes que facilitan o evitan la captación o unión de polipéptidos GZIP a las células.

Efecto sobre LSR como receptor de lipoproteínas

También se puede ensayar el efecto de la proteína GZIP sobre la actividad de unión, interiorización y degradación de lipoproteínas de LSR. La medida de LSR como receptor de lipoproteínas se describe en Bihain & Yen, ((1992) Biochemistry, 19 de mayo; 31(19):4628-36). El efecto de la proteína GZIP sobre la actividad de unión, interiorización y degradación de lipoproteínas de LSR (u otros receptores) se puede comparar con el de la proteína GZIP intacta, con células sin tratar como control adicional. Este ensayo también se puede usar para cribar variantes activas e inhibidoras de la proteína GZIP, así como agonistas y antagonistas de la actividad relacionada con el metabolismo.

Las células hepáticas humanas PLC (depósito ATCC) se colocan a una densidad de 300.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos (día 0) en DMEM (glucosa elevada) que contiene glutamina y penicilina-estreptomicina (Bihain & Yen, 1992). Los medios se cambian en el día 2. En el día 3, las monocapas confluentes se lavan una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (2 ml/pocillo). Las células se incuban a 37ºC durante 30 min con 10 ng/ml de leptina recombinante humana en DMEM que contiene un 0,2% (p/v) de BSA, Hepes 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, 3,7 g/l de bicarbonato sódico, pH 7,5, seguido por otra incubación de 30 min a 37ºC con concentraciones crecientes de polipéptido GZIP. Las incubaciones continúan durante 2 h a 37ºC tras la adición de oleato 0,8 mM y 20 \mug/ml de ^{125}I-LDL. Las monocapas se lavan 2 veces de forma consecutiva con PBS que contiene un 0,2% de BSA, seguido por 1 lavado con PBS/BSA, y después 2 veces consecutivamente con PBS. Las cantidades de unión, captación y degradación inducida por oleato de ^{125}I-LDL se miden como se describió previamente (Bihain & Yen, 1992, anteriormente mencionado). Los resultados se muestran como la media de determinaciones por triplicado.

Se cree que la adición de proteína GZIP conduce a una actividad incrementada de LSR como receptor de lipoproteínas. La unión y captación de LDL inducida por oleato se vería más afectada por las proteínas GZIP en comparación con la degradación. Esta actividad incrementada de LSR daría como resultado potencialmente una eliminación incrementada de las lipoproteínas ricas en triglicéridos durante el estado posprandial. Así, se eliminaría más grasa alimentaria a través del hígado, en vez de ser depositada en el tejido adiposo.

Este ensayo se podría usar para determinar la eficacia de un compuesto (o agonistas o antagonistas) para incrementar o disminuir la actividad de LSR (o la captación, unión y degradación de lipoproteínas por medio de otros receptores), y así influir en la velocidad de eliminación de las lipoproteínas ricas en triglicéridos.

Efecto sobre la diferenciación muscular

Se cultivan células C2C12 (línea celular de músculo esquelético murino; ATCC CRL 1772, Rockville, MD) de forma dispersa (alrededor de un 15-20%) en DMEM completo (con glutamina, pen/estrep, etc.) + 10% de FCS. Dos días más tarde se hacen confluentes en un 80-90%. En este momento, el medio se cambia a DMEM+2% de suero de caballo para permitir la diferenciación. El medio se cambia diariamente. La formación abundante de miotubos se da tras 3-4 días de estar en un 2% de suero de caballo, aunque el curso exacto de la diferenciación de C2C12 depende de durante cuánto tiempo se han hecho pases y cómo se han mantenido, entre otras cosas.

Para ensayar el efecto de la presencia de la proteína GZIP sobre la diferenciación muscular, se añade gACRP30 (1 a 2,5 \mug/ml) el día después de la siembra, cuando las células están todavía en DMEM con un 10% de FCS. Dos días después de colocar las células en placas (un día después de añadir por primera vez gACRP30), a alrededor de un 80-90% de confluencia, el medio se cambia a DMEM+2% de suero de caballo más gACRP30.

Efecto sobre la oxidación de ácidos grasos en las células musculares

Las células C2C12 se diferencian en presencia o ausencia de 2 \mug/ml de proteína GZIP durante 4 días. En el día 4, se determinan las velocidades de oxidación de oleato midiendo la conversión de 1-^{14}C-oleato (0,2 mM) hasta ^{14}CO_{2} durante 90 min. Este experimento se puede usar para cribar los polipéptidos y péptidos activos, así como los agonistas y antagonistas o activadores e inhibidores de los polipéptidos GZIP.

El efecto de gACRP30 sobre la velocidad de la oxidación de oleato se puede comparar en células C2C12 diferenciadas (células de músculo esquelético murino; ATCC, Manassas, VA CRL-1772) y en una línea de hepatocitos (Hepa1-6; ATCC, Manassas, VA CRL-1830). Las células cultivadas se mantienen según las instrucciones del fabricante. El ensayo de oxidación de oleato se lleva a cabo como se describió previamente (Muoio et al (1999) Biochem J 338;783-791). Brevemente, se mantienen miocitos prácticamente confluentes en medios de diferenciación con poco suero (DMEM, 2,5% de suero de caballo) durante 4 días, en cuyo tiempo se hace máxima la formación de miotubos. Los hepatocitos se mantienen en el mismo medio DMEM complementado con un 10% de FCS durante 2 días. Una hora antes del experimento el medio se elimina y se añade 1 ml de medio de preincubación (MEM, 2,5% de suero de caballo, glucosa 3 mM, glutamina 4 mM, Hepes 25 mM, 1% de BSA sin AGL, oleato 0,25 mM, 5 \mug/ml de gentamicina). Al comienzo del experimento de oxidación se añade ácido ^{14}C-oleico (1 \muCi/ml, American Radiolabeled Chemical Inc., St. Louis, MO) y las células se incuban durante 90 min a 37ºC en ausencia/presencia de 2,5 \mug/ml de gACRP30. Tras el periodo de incubación se extraen 0,75 ml del medio y se analizan los productos de oxidación de ^{14}C como se describe más adelante para el experimento de oxidación de AGL en músculo.

Análisis de triglicéridos y proteínas tras la oxidación de oleato en células cultivadas

Tras la transferencia del medio para el ensayo de oxidación de oleato, las células se colocan en hielo. Para determinar el contenido de triglicéridos y proteínas, las células se lavan con 1 ml de PBS 1x para eliminar el medio residual. A cada pocillo se le añaden 300 \mul de disolución de disociación celular (Sigma) y se incuba a 37ºC durante 10 min. Las placas se golpean suavemente para desprender las células, y se añaden 0,5 ml de PBS 1x. La suspensión celular se transfiere a un tubo Eppendorf, cada pocillo se lava con 0,5 ml adicionales de PBS 1x, y se transfiere a un tubo Eppendorf apropiado. Las muestras se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desecha y se añaden 750 \mul de PBS 1x/2% de CHAPS al sedimento celular. La suspensión celular se agita en vórtex y se coloca en hielo durante 1 hora. Las muestras se centrifugan después a 13.000 rpm durante 20 min a 4ºC. Los sobrenadantes se transfieren a un tubo nuevo y se congelan a -20ºC hasta que se analizan. La medida cuantitativa de la concentración de triglicéridos en cada muestra se determina mediante el uso del ensayo enzimático GPO-TRINDER de Sigma Diagnostics. Se cumple el procedimiento resumido en el manual, con las siguientes excepciones: el ensayo se realiza en una placa de 48 pocillos, se ensayan 350 \mul de volumen de muestra, el blanco de control consistió en 350 \mul de PBS/2% de CHAPS, y el patrón contuvo 10 \mul del patrón proporcionado en el equipo más 690 \mul de PBS/2% de CHAPS. El análisis de las muestras se lleva a cabo en un Spectra Count de Packard a una longitud de onda de 550 nm. El análisis de proteínas se lleva a cabo en 25 \mul de cada muestra de sobrenadante mediante el uso del ensayo de proteínas BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de las muestras se lleva a cabo en un Spectra Count de Packard a una longitud de onda de 550 nm.

Captación de glucosa in vitro por las células musculares

Se obtienen células musculares L6 de la Colección Europea de Cultivos (Porton Down) y se usan en 7-11 pases. Las células se mantienen en medio de cultivo de tejidos estándar DMEM, y se determina la captación de glucosa mediante el uso de [^{3}H]-2-desoxiglucosa (2DG) con o sin fragmento de polipéptido GZIP en presencia o ausencia de insulina (10^{-8} M) como se ha descrito previamente (Walker, P.S. et al. (1990) Glucose transport activity in L6 muscle cells is regulated by the coordinate control of subcellular glucose transporter distribution, biosynthesis, and mRNA transcription. JBC 265(3):1516-1523; y Kilp, A. et al. (1992) Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle cells in culture. Endocrinology 130(5):2535-2544). La captación de 2DG se expresa como el porcentaje de cambio comparado con el control (sin añadir insulina o fragmento de polipéptido GZIP). Los valores se presentan como la media \pm EEM de grupos de 4 pocillos por experimento. Las diferencias entre grupos de pocillos se analizan mediante la prueba t de Student, y se considera que los valores de probabilidad p<0,05 son significativos.

Ejemplo 3 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre ratones alimentados con una dieta elevada en grasas

Se realizan los experimentos mediante el uso de ratones C57BL/6 de aproximadamente 6 semanas de edad (8 por grupo). Todos los ratones se guardan de forma individual. Los ratones se mantienen con una dieta elevada en grasas a lo largo de cada experimento. La dieta elevada en grasas (dieta de cafetería; D12331 de Research Diets, Inc.) tiene la siguiente composición: 16% kcal de proteínas, 26% kcal de sacarosa, y 58% kcal de grasas. Las grasas están compuestas principalmente de aceite de coco hidrogenado.

Después de alimentar a los ratones con una dieta elevada en grasas durante 6 días, se insertan bombas microosmóticas mediante el uso de anestesia de isoflurano, y se usan para proporcionar polipéptidos GZIP de tamaño completo, fragmentos de polipéptidos GZIP, solución salina y un péptido irrelevante a los ratones de forma subcutánea (s.c.) durante 18 días. Los polipéptidos GZIP se proporcionan a dosis de 100, 50, 25 y 2,5 \mug/día, y el péptido irrelevante se proporciona a 10 \mug/día. Se mide el peso corporal en el primer, tercer y quinto día de la dieta elevada en grasas, y después diariamente tras el comienzo del tratamiento. Las muestras finales de sangre se toman mediante punción cardiaca y se usan para determinar las concentraciones de triglicéridos (TG), colesterol total (CT), glucosa, leptina e insulina. También se determina para cada grupo la cantidad de alimento consumido por día.

Ejemplo 4 Ensayos de la actividad relacionada con el metabolismo en humanos

Los ensayos de la eficacia de los polipéptidos GZIP en humanos se llevan a cabo de acuerdo con las recomendaciones de un médico y con directrices establecidas. Los parámetros ensayados en ratones se ensayan también en humanos (p.ej. ingesta de alimentos, peso, TG, CT, glucosa, insulina, leptina, AGL). Se espera que los factores fisiológicos debieran mostrar cambios a corto plazo. Los cambios en el aumento de peso requieren un periodo de tiempo más largo. Además, se necesitaría monitorizar cuidadosamente la dieta. Se administrarían los polipéptidos GZIP, preferiblemente polipéptidos GZIP que comprenden la región de homología con C1q, en dosis diarias de alrededor de 6 mg de proteína por persona de 70 kg o alrededor de 10 mg por día. También se ensayarían otras dosis, por ejemplo 1 mg o 5 mg por día hasta 20 mg, 50 mg o 100 mg por día.

Ejemplo 5 Ensayos de la actividad relacionada con el metabolismo en un modelo de diabetes lipoatrófica murina

Previamente, se informó que la leptina invierte la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus en ratones con lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature 401: 73-76 (1999)). Se descubrió que la leptina es menos eficaz en un modelo diferente en ratón lipodistrófico de diabetes lipoatrófica (Gavrilova et al Nature 403: 850 (2000)). La presente invención abarca el uso de polipéptidos GZIP para reducir la resistencia a la insulina y la hiperglucemia en este modelo, solos o en combinación con leptina, el péptido de leptina (solicitud provisional de EE.UU. nº 60/155.506), u otros compuestos. Los ensayos incluyen el descrito previamente en Gavrilova et al. ((2000) Diabetes, nov.; 49(11):1910-6; (2000) Nature, 24 de feb.; 403(6772):850) que usa ratones A-ZIP/F-1, excepto que los polipéptidos GZIP se administrarían mediante el uso de los métodos descritos previamente en el Ejemplo 3 (o en los Ejemplos 6-8). Se analizarían las concentraciones de glucosa e insulina de los ratones, y se monitorizaría la ingesta de alimentos y el peso del hígado, así como otros factores, tales como las concentraciones de leptina, AGL y TG, medidas típicamente en los experimentos (véase el Ejemplo 3, anteriormente, o los Ejemplos 6-8).

Ejemplo 6 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre los ácidos grasos libres plasmáticos en ratones C57 BL/6

Se ensaya el efecto de los polipéptidos GZIP sobre la lipemia posprandial (LPP) en ratones C57BL6/J normales.

Los ratones usados en este experimento se hicieron ayunar durante 2 horas antes del experimento, tras lo cual se tomó una muestra de sangre inicial. Todas las muestras de sangre se toman de la cola mediante el uso de tubos capilares revestidos con EDTA (50 \mul por cada punto de tiempo). En el tiempo 0 (8:30 AM) se da una comida elevada en grasas estándar (6 g de mantequilla, 6 g de aceite de girasol, 10 g de leche en polvo descremada, 10 g de sacarosa, 12 ml de agua destilada recién preparada siguiendo el Nb#6, JF, pág. 1) mediante sonda (vol= 1% del peso corporal) a todos los animales.

Inmediatamente tras la comida elevada en grasas se inyectan 25 \mug de un polipéptido GZIP i.p. en 100 \mul de solución salina. Se inyecta de nuevo la misma dosis (25 \mug/ml en 100 \mul) a los 45 min y 1 h 45 min. A los animales de control se les inyecta solución salina (3x100 \mul). Los animales tratados y sin tratar se manejan de modo alternante.

Se toman muestras de sangre a intervalos horarios y se colocan en hielo inmediatamente. Se prepara el plasma mediante centrifugación tras cada punto de tiempo. El plasma se guarda a -20ºC y se determinan los ácidos grasos libres (AGL), triglicéridos (TG) y glucosa en menos de 24 horas mediante el uso de equipos de ensayo estándar (Sigma y Wako). Debido a la cantidad limitada de plasma disponible, la glucosa se determina por duplicado mediante el uso de muestras mezcladas. Para cada punto de tiempo se mezclan volúmenes iguales de plasma de los 8 animales por grupo de tratamiento.

Ejemplo 7 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre la leptina e insulina plasmáticas en ratones C57 BL/6

Se ensaya el efecto de los polipéptidos GZIP sobre las concentraciones plasmáticas de leptina e insulina durante la lipemia posprandial (LPP) en ratones C57BL6/J normales. El procedimiento experimental es el mismo que el descrito en el Ejemplo 6, excepto en que se extrajo sangre solamente a las 0, 2 y 4 horas para permitir muestras de sangre mayores necesarias para la determinación de leptina e insulina mediante RIA.

Brevemente, se hace ayunar a 16 ratones durante 2 horas antes del experimento, tras lo cual se toma una muestra de sangre inicial. Todas las muestras de sangre se toman de la cola mediante el uso de tubos capilares revestidos con EDTA (100 \mul por cada punto de tiempo). En el tiempo 0 (9:00 AM) se da una comida elevada en grasas estándar (véase el Ejemplo 6) mediante sonda (vol=1% del peso corporal) a todos los animales. Inmediatamente tras la comida elevada en grasas, se inyectan 25 \mug de un polipéptido GZIP i.p. en 100 \mul de solución salina. Se inyecta de nuevo la misma dosis (25 \mug/ml en 100 \mul) a los 45 min y 1 h 45 min (grupo tratado). A los animales de control se les inyecta solución salina (3x100 \mul). Los animales tratados y sin tratar se manejan de modo alternante.

Las muestras de sangre se colocan en hielo inmediatamente y se prepara el plasma mediante centrifugación tras cada punto de tiempo. El plasma se guarda a -20ºC y se determinan los ácidos grasos libres (AGL) en menos de 24 horas mediante el uso de un equipo de ensayo estándar (Wako). Se determinan leptina e insulina mediante RIA (ML-82K y SRI-13K, LINCO Research, Inc., St. Charles, MO) siguiendo el protocolo del fabricante. Sin embargo, se usan solamente 20 \mul de plasma. Cada determinación se realiza por duplicado. Debido a la cantidad limitada de plasma disponible, leptina e insulina se determinan en 4 mezclas de 2 animales cada una en ambos grupos de
tratamiento.

Ejemplo 8 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre AGL, TG y glucosa plasmática en ratones C57 BL/6

Se ensaya el efecto de los polipéptidos GZIP sobre las concentraciones plasmáticas de AGL, TG, glucosa, leptina e insulina durante la lipemia posprandial (LPP) en ratones C57BL6/J normales. También se ha demostrado la pérdida de peso que resulta de los polipéptidos GZIP (2,5 \mug/día) administrados a ratones C57BL6/J normales con una dieta elevada en grasas (Ejemplo 3).

El procedimiento experimental es similar al descrito en el Ejemplo 6. Brevemente, se hace ayunar a 14 ratones durante 2 horas antes del experimento, tras lo cual se toma una muestra de sangre inicial. Todas las muestras de sangre se toman de la cola mediante el uso de tubos capilares revestidos con EDTA (50 \mul por cada punto de tiempo). En el tiempo 0 (9:00 AM) se da una comida elevada en grasas estándar (véase el Ejemplo 6) mediante sonda (vol=1% del peso corporal) a todos los animales. Inmediatamente tras la comida elevada en grasas, se inyectan 25 \mug de un polipéptido GZIP i.p. en 100 \mul de solución salina a 4 ratones. Se inyecta de nuevo la misma dosis (25 \mug en 100 \mul) a los 45 min y 1 h 45 min. Un segundo grupo de tratamiento recibe 3 veces 50 \mug de polipéptido GZIP en los mismos intervalos. A los animales de control se les inyecta solución salina (3x100 \mul). Los animales tratados y sin tratar se manejan de modo alternante.

Las muestras de sangre se colocan en hielo inmediatamente. Se prepara el plasma mediante centrifugación tras cada punto de tiempo. El plasma se guarda a -20ºC y se determinan los ácidos grasos libres (AGL), triglicéridos (TG) y glucosa en menos de 24 horas mediante el uso de equipos de ensayo estándar (Sigma y Wako).

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Ejemplo 9 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre los AGL tras inyección de epinefrina

En los ratones, los ácidos grasos libres plasmáticos se incrementan tras la administración intragástrica de una comida de ensayo elevada en grasas/sacarosa. Estos ácidos grasos libres se producen principalmente por la actividad de enzimas lipolíticas, es decir, lipoproteína lipasa (LPL) y lipasa hepática (HL). En estas especies, estas enzimas se hallan en cantidades significativas tanto unidas al endotelio como circulando libres en el plasma. Otra fuente de ácidos grasos libres plasmáticos es la lipasa sensible a hormonas (LSH) que libera ácidos grasos libres del tejido adiposo tras la estimulación \beta-adrenérgica. Para analizar si los polipéptidos GZIP regulan también el metabolismo de los ácidos grasos libres liberados por LSH, se inyecta epinefrina a los ratones.

Se administra epinefrina a dos grupos de ratones (5 \mug) mediante inyección intraperitoneal. A un grupo tratado se le inyecta polipéptido GZIP (25 \mug) una hora antes y de nuevo junto con epinefrina, mientras los animales de control reciben solución salina. Se aísla el plasma y se miden los ácidos grasos libres y la glucosa como se describió anteriormente (Ejemplo 8).

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Ejemplo 10 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre la oxidación de AGL en el músculo

Para investigar el efecto de los polipéptidos GZIP sobre la oxidación de los ácidos grasos libres en el músculo, se aíslan músculos intactos de las extremidades posteriores de ratones C57BL/6J, y se mide la oxidación de AGL mediante el uso de oleato como sustrato (Clee, S.M. et al. Plasma and vessel wall lipoprotein lipase have different roles in atherosclerosis. J Lipid Res 41, 521-531 (2000); Muoio, D. M., Dohm, G. L., Tapscott, E. B. & Coleman, R. A. Leptin opposes insulin's effects on fatty acid partitioning in muscles isolated from obese ob/ob mice. Am J Physiol 276, E913-921 (1999)). La oxidación de oleato en músculo aislado se mide como se describió previamente (Cuendet et al (1976) J Clin Invest 58:1078-1088; Le Marchand-Brustel, Y., Jeanrenaud, B. y Freychet, P. Insulin binding and effects in isolated soleus muscle of lean and obese mice. Am J Physiol 234, E348-E358 (1978). Brevemente, los ratones se sacrifican mediante dislocación cervical y se aíslan rápidamente los músculos sóleo y EDL de las extremidades posteriores. El tendón distal de cada músculo se ata a un trozo de hilo de sutura para facilitar la transferencia entre los diferentes medios. Todas las incubaciones se llevan a cabo a 30ºC en 1,5 ml de tampón bicarbonato de Krebs-Henseleit (NaCI 118,6 mM, KCl 4,76 mM, KH_{2}PO_{4} 1,19 mM, MgSO_{4} 1,19 mM, CaCl_{2} 2,54 mM, NaHCO_{3} 25 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) complementado con un 4% de albúmina de suero bovino exenta de AGL (fracción V, grado de RIA, Sigma) y glucosa 5 mM (Sigma). La concentración total de oleato (Sigma) a lo largo del experimento es 0,25 mM. Todos los medios se oxigenan (95% de O_{2}; 5% de CO_{2}) antes de la incubación. La mezcla de gases se hidrata a lo largo del experimento mediante burbujeo a través de un lavador de gases (Kontes Inc., Vineland, NJ).

Los músculos se lavan durante 30 min en medios de incubación con oxigenación. Los músculos se transfieren después a medios nuevos (1,5 ml) y se incuban a 30ºC en presencia de 1 \muCi/ml de [1-^{14}C]-ácido oleico (American Radiolabeled Chemicals). Los frascos de incubación que contienen estos medios se sellan con un tapón de goma del cual se suspende un pocillo central que porta un trozo de papel Whatman (1,5 cm x 11,5 cm).

Tras un periodo de incubación inicial de 10 min con oxigenación constante, se elimina la circulación de gas para cerrar el sistema del medio externo y los músculos se incuban durante 90 min a 30ºC. Al final de este periodo se inyectan 0,45 ml de Solvable (Packard Instruments, Meriden, CT) en el papel Whatman del pocillo central y la oxidación de oleato por el músculo se para transfiriendo el frasco a hielo.

Después de 5 min, el músculo se extrae del medio y se extrae también una alícuota de 0,5 ml de medio. Los frascos se cierran de nuevo y se inyecta 1 ml de ácido perclórico del 35% con una jeringa en el medio atravesando el tapón de goma. Se recoge el CO_{2} de los medios acidificados mediante el Solvable del pocillo central. Después de un periodo de recogida de 90 min a 30ºC, se extrae el papel Whatman del pocillo central y se coloca en frascos de centelleo que contienen 15 ml de líquido de centelleo (HionicFlour, Packard Instruments, Meriden, CT). Se cuantifica la cantidad de radiactividad de ^{14}C mediante recuento de centelleo líquido. La velocidad de oxidación de oleato se expresa como nmoles de oleato producidos en 90 min/g de músculo.

Para ensayar el efecto de gACRP30 o ACRP30 sobre la oxidación de oleato, estas proteínas se añaden a los medios a una concentración final de 2,5 \mug/ml y se mantienen en los medios a lo largo del procedimiento.

Ejemplo 11 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre los triglicéridos en músculo e hígado aislados de ratones

Para determinar si la oxidación incrementada de AGL inducida por los polipéptidos GZIP va acompañada también por un aporte incrementado de AGL al músculo o hígado, se mide el contenido de triglicéridos del músculo de las extremidades posteriores y del hígado tras el tratamiento con polipéptido GZIP de los ratones. Se extraen muestras de los músculos de las extremidades posteriores así como del hígado de los animales tratados y sin tratar, y se determina la concentración de triglicéridos y de ácidos grasos libres siguiendo un método de extracción de lípidos estándar (Shimabukuro, M. et al. Direct antidiabetic effect of leptin through triglyceride depletion of tissues. Proc Natl Acad Sci USA 94, 4637-4641 (1997)) seguido de un análisis de TG y AGL mediante el uso de equipos de análisis estándar.

Ejemplo 12 Efecto de los polipéptidos GZIP sobre los AGL tras inyección de Intralipid

Se inyectan 30 \mul en inyección rápida de Intralipid-20% (Clintec) a dos grupos de ratones de forma intravenosa (vena de la cola) para generar una elevación brusca de los AGLs plasmáticos, evitando así la absorción intestinal (Intralipid es una emulsión de grasas intravenosa usada en la terapia nutricional). Al grupo tratado (tratado con polipéptido GZIP) se le inyecta un polipéptido GZIP (25 \mug) a los 30 y 60 minutos antes de administrar Intralipid, mientras los animales de control (control \sigma) reciben solución salina. Se aísla del plasma y se miden los AGLs como se describió previamente. Después se monitoriza el efecto de los polipéptidos GZIP sobre la caída de AGLs plasmáticos tras el máximo inducido por la inyección de Intralipid.

Ejemplo 13 Captación de glucosa in vitro por las células musculares

Se obtienen células musculares L6 de la Colección Europea de Cultivos (Porton Down) y se usan en 7-11 pases. Las células se mantienen en medio de cultivo de tejidos estándar DMEM, y se determina la captación de glucosa mediante el uso de [^{3}H]-2-desoxiglucosa (2DG) con o sin polipéptidos GZIP en presencia o ausencia de insulina (10^{-8} M) como se describió previamente (Walker, P.S. et al. (1990) Glucose transport activity in L6 muscle cells is regulated by the coordinate control of subcellular glucose transporter distribution, biosynthesis, and mRNA transcription. JBC 265(3):1516-1523; y Kilp, A. et al. (1992) Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle cells in culture. Endocrinology 130(5):2535-2544). La captación de 2DG se expresa como el cambio en porcentaje comparado con el control (sin adición de insulina o GZIP). Los valores se presentan como la media \pm EEM de grupos de 4 pocillos por experimento. Las diferencias entre grupos de pocillos se determinan mediante la prueba t de Student, y los valores de probabilidad p<0,05 se consideran significativos.

Ejemplo 14 Ensayos in vivo de la actividad relacionada con el metabolismo en modelos de diabetes de roedores

Ya que los perfiles metabólicos difieren entre los diversos modelos animales de obesidad y diabetes, se llevan a cabo análisis de múltiples modelos para distinguir el efecto de los polipéptidos GZIP sobre la hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia y obesidad. La mutación de colonias de animales de laboratorio y las sensibilidades diferentes a los regímenes alimentarios han hecho posible el desarrollo de modelos animales con diabetes no insulinodependiente asociada a obesidad y resistencia a la insulina. Se han desarrollado modelos genéticos tales como db/db y ob/ob (véase Diabetes, (1982) 31(1): 1-6) en ratones y fa/fa en ratas Zucker en los diversos laboratorios para entender la patofisiología de la enfermedad y ensayar la eficacia de los nuevos compuestos antidiabéticos (Diabetes, (1983) 32: 830-838; Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. (1994) 46: 1-57). Los animales homocigotos, ratones C57 BL/KsJ-db/db desarrollados por Jackson Laboratory, EE.UU., son obesos, hiperglucémicos, hiperinsulinémicos y resistentes a la insulina (J. Clin. Invest., (1990) 85: 962-967), mientras los heterocigotos son delgados y normoglucémicos. En el modelo db/db, el ratón desarrolla progresivamente insulinopenia con la edad, una característica observada habitualmente en las fases tardías de la diabetes tipo II humana cuando las concentraciones sanguíneas de glucosa no están controladas suficientemente. El estado del páncreas y su curso varían según los modelos. Ya que este modelo se parece al de la diabetes mellitus tipo II, los compuestos de la presente invención se ensayan en cuanto a sus actividades de disminución de glucosa y triglicéridos sanguíneos. Las ratas Zucker (fa/fa) son gravemente obesas, hiperinsulinémicas y resistentes a la insulina (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, ed. 4, 1990), págs. 299-340), y la mutación fa/fa puede ser el equivalente en ratas de la mutación db murina (Friedman et al., Cell 69:217-220, 1992; Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806, 1991). Los ratones Tubby (tub/tub) se caracterizan por obesidad, resistencia a la insulina moderada e hiperinsulinemia sin hiperglucemia significativa (Coleman et al., J. Heredity 81:424, 1990).

Previamente, se informó que la leptina invierte la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus en ratones con lipodistrofia congénita (Shimomura et al. Nature 401: 73-76 (1999)). Se ha descubierto que la leptina es menos eficaz en un modelo diferente en ratón lipodistrófico de diabetes lipoatrófica (Gavrilova et al Nature 403: 850 (2000)).

El modelo de estreptozotocina (STZ) de diabetes inducida químicamente se ensaya para examinar los efectos de la hiperglucemia en ausencia de obesidad. Los animales tratados con STZ son deficientes en insulina y gravemente hiperglucémicos (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, ed. 4, 1990), págs. 299-340). También se examina el modelo de glutamato monosódico (GMS) de obesidad inducida químicamente (Olney, Science 164:719, 1969; Cameron et al., Cli. Exp. Pharmacol. Physiol. 5:41, 1978), en el que la obesidad es menos grave que en los modelos genéticos y se desarrolla sin hiperfagia, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina. Finalmente, un modelo que no es químico ni genético para la inducción de obesidad incluye alimentar a los roedores con una dieta elevada en grasas/elevada en carbohidratos (dieta de cafetería) a voluntad.

La presente invención abarca el uso de polipéptidos GZIP para reducir la resistencia a la insulina y la hiperglucemia en cualquiera o en todos los modelos anteriores de diabetes en roedores o en humanos con diabetes tipo I o tipo II, u otras enfermedades metabólicas preferidas descritas previamente o los modelos basados en otros animales. En las composiciones de la presente invención, los polipéptidos GSSP4 pueden estar asociados, si se desea, con otros agentes antidiabéticos farmacológicamente activos compatibles tales como insulina, leptina (solicitud provisional de EE.UU. nº 60/155.506), o troglitazona, solos o en combinación. Los ensayos incluyen los descritos previamente en Gavrilova et al. ((2000) Diabetes, nov.; 49(11):1910-6; (2000) Nature, 24 de feb.; 403(6772):850) mediante el uso de ratones A-ZIP/F-1, excepto en que los polipéptidos GSSP4 se administran de forma intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Se analizarían las concentraciones de glucosa y de insulina de los ratones, y se monitorizaría la ingesta de alimentos y el peso del hígado, así como otros factores, tales como las concentraciones de leptina, AGL y TG, medidas típicamente en los experimentos.

Ensayo in vivo de la actividad anti-hiperglucémica de los polipéptidos GZIP

Los ratones diabéticos obesos alterados genéticamente (db/db) (machos, 7-9 semanas de edad) se guardan (7-9 ratones/jaula) en condiciones de laboratorio estándar a 22ºC y un 50% de humedad relativa, y se mantienen con una dieta de comida de roedores Purina y agua a voluntad. Antes del tratamiento, se recoge sangre de la vena de la cola de cada animal y se determinan las concentraciones de glucosa mediante el uso de One Touch Basic Glucose Monitor System (Lifescan). Se usan los ratones que tienen concentraciones plasmáticas de glucosa entre los 250 y 500 mg/dl. Cada grupo de tratamiento consiste en siete ratones que se distribuyen de forma que las concentraciones medias de glucosa son equivalentes en cada grupo en el inicio del estudio. La dosis se aplica a los ratones db/db mediante bombas micro-osmóticas, insertadas mediante el uso de anestesia de isoflurano, para proporcionar polipéptidos GZIP, solución salina y un péptido irrelevante a los ratones de forma subcutánea (s.c.). Se recogen muestras de sangre de la vena de la cola cada hora durante 4 horas y a las 24, 30 h tras la dosis, y se analizan las concentraciones sanguíneas de glucosa. La comida se retira 0-4 h tras la dosis y se reintroduce después. También se miden los pesos corporales individuales y el consumo medio de alimentos (cada jaula) después de 24 h. Se determinan las diferencias significativas entre grupos (se comparan los tratados con GZIP con los tratados con solución salina) mediante el uso de la prueba t de Student.

Ensayo de sensibilidad a la insulina in vivo

La sensibilidad a la insulina in vivo se examina mediante la utilización de pinzamientos hiperinsulinémicos-euglucémicos en dos etapas según el siguiente protocolo. Los roedores de cualquiera o de todos los diversos modelos descritos en el Ejemplo 2 se guardan durante al menos una semana antes de los procedimientos experimentales. Se realiza cirugía para la colocación de catéteres en la vena yugular y en la arteria carótida en condiciones estériles mediante el uso de anestesia con ketamina y xilacina (i.m.). Tras la cirugía, se deja que todos los roedores recobren la consciencia y se colocan en jaulas individuales. Se administran los polipéptidos GZIP o vehículo a través de la vena yugular tras la recuperación completa y durante los dos días siguientes. Dieciséis horas tras el último tratamiento, se realizan los pinzamientos hiperinsulinémicos-euglucémicos. Los roedores se colocan en un dispositivo inmovilizador y se administra una inyección rápida de 4 \muCi de [3-^{3}H]-glucosa (NEN), seguido de una infusión continua del marcador a una dosis de 0,2 \muCi/min (20 \mul/min). Dos horas después del inicio de la infusión de marcador, se recogen 3 muestras de sangre (0,3 ml cada una) a intervalos de 10 minutos (-20-0 min) para las medidas basales. Después se inicia una infusión de insulina (5 mU/kg/min), y se toman muestras de sangre de 100 \mul cada 10 min para monitorizar la glucosa plasmática. Se infunde una disolución de glucosa del 30% mediante el uso de una segunda bomba basándose en las concentraciones plasmáticas de glucosa para alcanzar y mantener la euglucemia. Una vez que se estabiliza el estado constante a 5 mU/kg/min de insulina (velocidad de infusión de glucosa y glucosa plasmática estables) se obtienen 3 muestras de sangre adicionales (0,3 ml cada una) para las medidas de glucosa, [3-^{3}H]-glucosa e insulina (100-120 min). Después se administra una dosis superior de insulina (25 mU/kg/min) y las velocidades de infusión de glucosa se ajustan para el segundo pinzamiento euglucémico, y se toman muestras de sangre en los minutos 220-240. La actividad específica de glucosa se determina en plasma desproteinizado, y se realizan los cálculos de Rd y de liberación hepática de glucosa (HGO), como se describió (Lang et al., Endocrinology 130:43, 1992). Después se determinan las concentraciones plasmáticas de insulina en el periodo basal y después de infusiones de 5 y 25 mU/kg/min, y se comparan entre los roedores tratados con GZIP y los tratados con vehículo.

La regulación mediante insulina de la homeostasis de la glucosa tiene dos componentes principales; la estimulación de la captación de glucosa periférica y la inhibición de la liberación hepática de glucosa. Mediante el uso de estudios con marcador en los pinzamientos de glucosa es posible determinar qué porción de la respuesta a insulina está afectada por los polipéptidos GZIP.

Ejemplo 15 Identificación de un sitio de unión en el dominio \alpha3 del polipéptido GZIP para un fragmento de polipéptido gAPM1 mediante ensayo de cribado de doble híbrido

El sistema de doble híbrido en levaduras está diseñado para estudiar interacciones proteína-proteína in vivo (Fields y Song, 1989), y se basa en la fusión de una proteína cebo al dominio de unión al ADN de la proteína Gal4 de levadura. Esta técnica se describe también en la patente de EE.UU. nº US 5.667.973 y en la patente de EE.UU. nº 5.283.173 (Fields et al.).

El procedimiento general de cribado de bibliotecas mediante el ensayo de doble híbrido se puede llevar a cabo como describió Harper et al. (1993) o como describió Cho et al. (1998), o también Fromont-Racine et al. (1997).

La proteína o polipéptido cebo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido o fragmento de polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos.

Más exactamente, la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido o variante suya se fusiona a un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN de la proteína GAL4, y la secuencia nucleotídica fusionada se inserta en un vector de expresión adecuado, por ejemplo pAS2 o pM3.

Después, se construye una biblioteca de cADN humano en un vector especialmente diseñado, de forma que el inserto de cADN humano se fusiona a una secuencia nucleotídica en el vector que codifica el dominio transcripcional de la proteína GAL4. Preferiblemente, el vector usado es el vector pACT. Los polipéptidos codificados por los insertos nucleotídicos de la biblioteca de cADN humano se denominan polipéptidos "presa".

Un tercer vector contiene un gen marcador detectable, tal como un gen de \beta-galactosidasa o un gen CAT que se coloca bajo el control de una secuencia de regulación que responde a la unión de una proteína Gal4 completa que contiene tanto el dominio de activación transcripcional como el dominio de unión al ADN. Por ejemplo, se puede usar el vector pG5EC.

También se usan dos cepas de levaduras diferentes. Un ejemplo ilustrativo pero no limitante de las dos cepas de levaduras diferentes puede ser lo siguiente:

-

Y190, cuyo fenotipo es (MATa, Leu2-3, 112ura3-12, trp1-901, his3-D200, ade2-101, gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-HIS3, cyh');

-

Y187, cuyo fenotipo es (MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, -112 URA3 GAL-lacZmet^{-}), que es el tipo sexual opuesto a Y190.

Brevemente, se co-transforman 20 \mug de biblioteca pAS2/gAPM1 y 20 \mug de pACT-cADN en la cepa de levadura Y190. Los transformantes se seleccionan para el cultivo en medio mínimo que carece de histidina, leucina y triptófano, pero que contiene el inhibidor de la síntesis de histidina 3-AT (50 mM). Las colonias positivas se criban en función de la \beta-galactosidasa mediante ensayo en filtro. Las colonias doblemente positivas (His^{+}, \beta-gal^{+}) se cultivan después en placas que carecen de histidina, leucina, pero que contienen triptófano y cicloheximida (10 mg/ml) para seleccionar la pérdida de los plásmidos pAS2/gAPM1 pero la retención de los plásmidos de la biblioteca pACT-cADN. Las cepas Y190 resultantes se aparean con las cepas Y187 que expresan gAPM1 o proteínas de control no relacionadas; tales como ciclofilina B, lamina o SNF1, como fusiones con Gal4 como describieron Harper et al. (1993) y Bram et al. (Bram RJ et al., 1993), y se criban en función de la \beta-galactosidasa mediante ensayo en filtro. Los clones de levaduras que son \beta-gal- tras el apareamiento con las fusiones de control Gal4 se consideran positivos falsos.

En otra realización del método de doble híbrido según la invención, la interacción entre el gAPM1 o un fragmento o variante suyo con las proteínas celulares se puede determinar mediante el uso del Matchmaker Two Hybrid System 2 (nº de catálogo K1604-1, Clontech). Como se describe en el manual adjunto del Matchmaker Two Hybrid System 2 (nº de catálogo K1604-1, Clontech), los ácidos nucleicos que codifican la proteína gAPM1 o una parte suya se insertan en un vector de expresión de forma que están en el marco de lectura con el ADN que codifica el dominio de unión al ADN del activador transcripcional de levadura GAL4. Se inserta un cADN deseado, preferiblemente cADN humano, en un segundo vector de expresión de forma que está en el marco de lectura con el ADN que codifica el dominio de activación de GAL4. Los dos plásmidos de expresión se transforman en la levadura, y la levadura se coloca en placas en un medio de selección que selecciona la expresión de los marcadores seleccionables de cada uno de los vectores de expresión, así como la expresión dependiente de GAL4 del gen HIS3. Los transformantes capaces de crecer en un medio que carece de histidina se criban en función de la expresión de lacZ dependiente de GAL4. Aquellas células que son positivas tanto en la selección con histidina como en el ensayo de lacZ contienen una interacción entre gAPM1 y la proteína o péptido codificado por el inserto de cADN inicialmente seleccionado.

El ensayo de cribado de doble híbrido se usó esencialmente como se describe aquí para identificar uno o más polipéptidos que tienen un sitio de unión para la región globular de homología con C1q de APM1. Se usaron como cebo dos construcciones de gAPM1 diferentes (véase el documento PCT WO 01/51645). En un grupo de experimentos de doble híbrido se usó como cebo la región globular de homología con C1q de APM1 sola. En un segundo grupo de experimentos de doble híbrido, se usó como cebo la región globular de homología con C1q de APM1 más quince aminoácidos adyacentes que codificaban una repetición similar a colágeno que contiene un sitio potencial para el procesamiento mediante proteasa dibásica. Se cribaron tres bibliotecas de cADN humano de músculo esquelético, hígado y cerebro. Se aislaron cinco clones de cADN independientes que codifican fragmentos de polipéptido GZIP solapantes como presas mediante el uso de la construcción de gAPM1 como cebo. Se deduce que el sitio de unión en el polipéptido GZIP para la región globular de homología con C1q de APM1 está en la región de solapamiento máximo de secuencias de aminoácidos (ABS) entre los cinco fragmentos de polipéptido GZIP codificados por los cinco cADNs presas de GZIP. ABS consiste en los aminoácidos 221-242 de la ID SEC Nº: 2 o los aminoácidos 217-239 de la ID SEC Nº: 3.

<110> GENSET

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<120> POLINUCLEÓTIDOS Y POLIPÉPTIDOS GZIP Y SUS USOS

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<130> 145.WO1

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<150> 60/327.725

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<151> 05-10-2001

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0

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<210> 1

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<211> 897

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(897)

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<400> 1

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3

4

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<210> 2

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<211> 298

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

5

6

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<210> 3

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<211> 295

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

7

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<210> 4

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<211> 244

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

8

Claims (3)

1. Un método para cribar un antagonista que bloquea la unión de un polipéptido APM1 o un fragmento de polipéptido APM1 a un polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I, que comprende

a)

poner en contacto el polipéptido APM1 según la ID SEC Nº: 4 o un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 108-244 de la ID SEC Nº: 4 con un polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I que comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 o los aminoácidos 18-295 de la ID SEC Nº: 3 en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo; y

b)

detectar la unión del polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I que comprende los aminoácidos 21-298 de la ID SEC Nº: 2 o los aminoácidos 18-295 de la ID SEC Nº: 3 al polipéptido APM1 según la ID SEC Nº: 4, o un fragmento de polipéptido APM1 que comprende los aminoácidos 108-244 de la ID SEC Nº: 4 en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido que tiene homología con la cadena pesada de HLA de clase I es un fragmento que comprende

a)

los aminoácidos 101-272, 121-298, 59-242, 221-298, 145-298, 221-242, 21-298, 21-202, 21-208, 203-298, 209-298, 180-251, 192-251, 204-251, 221-251, 21-246, 21-250 de la ID SEC Nº: 2, o

b)

los aminoácidos 98-269, 118-295, 56-239, 218-295, 142-295, 218-239, 18-295, 18-199, 18-205, 200-295, 206-295, 177-248, 189-248, 201-248, 218-248, 18-243, 18-247 de la ID SEC Nº: 3.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de ensayo es un anticuerpo, una proteína o un péptido.