JP2005526492A - アディポネクチンフラグメントおよび結合体 - Google Patents
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Abstract
本発明はアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入される。非ポリペプチド部分は例えばPEGのようなポリマーでありうる。アディポネクチントリマーおよびカルシウムイオンを含む単離複合体をさらに記載する。本結合体または複合体は、2型糖尿病、心臓血管疾患、および敗血性ショックなどの疾患の治療において用いられる。
Description
発明の分野
本発明は、アディポネクチンポリペプチドを含む新規な結合体、新規なアディポネクチンポリペプチドフラグメント、このようなフラグメントもしくは結合体を調製する方法、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントもしくは結合体の一部をコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を含む発現ベクター、そのヌクレオチド配列を含む宿主細胞、その結合体を含む薬学的組成物、そのフラグメントを含む薬学的組成物、1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；敗血症性ショック；もしくは異脂肪血症の処置のため；または食物の摂取の減少を伴わない体重減少の処置のための医薬品の製造のためのその結合体の使用、および、1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；異脂肪血症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスを有する哺乳動物を処置する方法に関する。
本発明は、アディポネクチンポリペプチドを含む新規な結合体、新規なアディポネクチンポリペプチドフラグメント、このようなフラグメントもしくは結合体を調製する方法、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントもしくは結合体の一部をコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を含む発現ベクター、そのヌクレオチド配列を含む宿主細胞、その結合体を含む薬学的組成物、そのフラグメントを含む薬学的組成物、1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；敗血症性ショック；もしくは異脂肪血症の処置のため；または食物の摂取の減少を伴わない体重減少の処置のための医薬品の製造のためのその結合体の使用、および、1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；異脂肪血症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスを有する哺乳動物を処置する方法に関する。
発明の背景
アディポネクチン（30kDa）は、分化した脂肪細胞において独占的に発現される分泌タンパク質である。一次配列分析は、4つの主要なドメイン：切断されたアミノ末端シグナル配列、既知のタンパク質に対する相同性を有しない領域、コラーゲン様領域、およびカルボキシ末端の球状セグメントを示す。球状ドメインはホモトリマーを形成し、アディポネクチンコラーゲン様セグメント間のさらなる相互作用は、タンパク質がより高次の構造を形成することを引き起こす。アディポネクチンは1995/96年にクローニングされ、AdipoQおよびAcrp30としても知られており、そのヒト相同体は、独立して、apM1およびGBP28と命名された。
アディポネクチン（30kDa）は、分化した脂肪細胞において独占的に発現される分泌タンパク質である。一次配列分析は、4つの主要なドメイン：切断されたアミノ末端シグナル配列、既知のタンパク質に対する相同性を有しない領域、コラーゲン様領域、およびカルボキシ末端の球状セグメントを示す。球状ドメインはホモトリマーを形成し、アディポネクチンコラーゲン様セグメント間のさらなる相互作用は、タンパク質がより高次の構造を形成することを引き起こす。アディポネクチンは1995/96年にクローニングされ、AdipoQおよびAcrp30としても知られており、そのヒト相同体は、独立して、apM1およびGBP28と命名された。
Acrp30タンパク質は、特徴的なC末端の補体C1q因子様球状ドメインを含むモジュラー設計を示すタンパク質のファミリーと配列相同性を共有する。C1qに加えて、このファミリーのメンバーには、ヒトVIII型およびX型コラーゲン、プレセレベリン、ならびに冬眠調節タンパク質hib 20、25、および27が含まれる。C1q以外では、これらのタンパク質のC末端球状領域の機能に関してはほとんど知られていない。活動的かつ冬眠する動物において、hibファミリーのメンバーは、肝臓においてディファレンシャルに発現されており、このことは、エネルギーの貯蔵または動員における役割を示唆する。同様の機能は、Acrp30について示唆されてきた。なぜなら、そのC末端球状ドメインの三次元構造が、一次配列レベルで相同性がないにもかかわらず、腫瘍壊死因子α（TNF-α）のそれと顕著に類似しているからである。その種々の生物学的機能の間で、TNF-α（TNF-アルファ）は、エネルギーホメオスタシスのいくつかの局面を調節する。
種々の因子がインスリンシグナル伝達経路の成分の活性を調節することが示されてきており、このことは、インスリン抵抗性および2型糖尿病の病因論における潜在的な役割を示唆する。例えば、TNF-αは、脂肪細胞において、インスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を阻害し、IRS-1のリン酸化および活性化を減少させ、従ってインスリンシグナル伝達経路を阻害することが示されてきた。肥満がTNF-αの過剰発現と関連していると仮定すると、このことは、TNF-αによるIRS-媒介インスリンシグナル伝達の欠損が、少なくとも部分的には、肥満関連インスリン抵抗性の原因であり得ることを示唆する。さらに、インスリンレセプターおよびIRS-1は膵臓β細胞中に存在し、そしてTNF-αおよび他のサイトカインはインスリン分泌を変化させることが示されてきた。このように、TNF-αおよび／または他のプロ炎症性サイトカインによるインスリンシグナル伝達の欠損は、肥満および2型糖尿病と連鎖する重要な病原性のメカニズムであり得る。
T.Yokotaら（Blood, 2000; 96, 1723-1732）は、ヒト全長アディポネクチン（大腸菌において産生）が、ヒトマクロファージにおけるLPS誘導性のTNF-α産生を特異的に阻害することを示し、このことは、アディポネクチンもまた、抗炎症活性を有し得ることを示す。
PPARγアゴニストは、マクロファージの活性化を抑制し得、従って、これらの細胞によるサイトカインの産生を減少し得る。例えば、これらは、ヒト末梢単核細胞によるLPS誘導性のTNF-α合成を抑制することが示されてきた（C.Jiangら、Nature，1998；391，82-86）。
発明の簡単な開示
文献において、全長アディポネクチン（これは、大腸菌から産生されるヒトアディポネクチン、ならびに、大腸菌および哺乳動物細胞から産生されるマウスアディポネクチンである）とアディポネクチンの球状フラグメント（これは、大腸菌および哺乳動物細胞から産生されるマウスアディポネクチンACRP30である）の両方が報告されている。
文献において、全長アディポネクチン（これは、大腸菌から産生されるヒトアディポネクチン、ならびに、大腸菌および哺乳動物細胞から産生されるマウスアディポネクチンである）とアディポネクチンの球状フラグメント（これは、大腸菌および哺乳動物細胞から産生されるマウスアディポネクチンACRP30である）の両方が報告されている。
1〜4個のリジンを含むコラーゲン性ドメインの大部分を伴わない、報告された型の球状ドメインが一般的であるので、アディポネクチンの既知の球状フラグメントは、ヒドロキシル化およびグリコシル化される1個またはそれ以上のリジンを含まない。さらに、これらの球状フラグメントは、筋肉組織で強力であることが示されてきたが、しかし、これらは、肝細胞中の、インスリンによって減少されたグルコースのアウトプットに何らの効果も示すことができない。さらに、血中グルコースレベルを正常化する際にアディポネクチンの球状フラグメントの報告はなされていない。
報告された全長アディポネクチンは、筋肉組織におけるアディポネクチンの球状フラグメントと同程度に強力ではなく、さらに、大腸菌中で産生された全長アディポネクチンは、肝細胞中の、インスリンによって減少されたグルコースのアウトプットになんらの効果も示さなかった。哺乳動物細胞中で産生された全長マウスアディポネクチンは、肝細胞中の、インスリンによって減少されたグルコースのアウトプットに効果を示した。さらに、哺乳動物細胞中で産生された全長マウスアディポネクチンは、高い用量で与えられた場合には、マウスモデル（ob/ob）において、正常レベルの近くまで、血中グルコースを減少させることができた。
哺乳動物細胞中で産生される、コラーゲンドメイン（例えば、apM1（82〜244））を有するアディポネクチンの、本発明者らの中程度のサイズのフラグメントは、ヒドロキシル化およびグリコシル化される少なくとも一つのリジンを含み、さらに、これらは、比較的低い用量で、db/dbマウスモデルにおいて血中グルコースレベルを一過性に正常化することが示された。
理論に束縛されることなく、本発明者らは、本発明者らの中程度のサイズのアディポネクチンのフラグメントが、コラーゲン性ドメインにおける一つまたは複数のリジンの水酸基のグリコシル化に起因して、耐糖能異常および2型糖尿病の処置において、報告されている球状型よりもより強力であると考える。
本発明者らのフラグメントは、db/dbマウスモデルにおける血中グルコースレベルを一過性に正常化するので、これは、アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、一日に数回投与されるべきであるか、または、より好都合には、例えば、PEGのようなポリマーもしくは糖部分に結合体化されるべきであり、それによって半減期を増大させ、そして投与の頻度を減少させることを示す。血中グルコースレベルの一過性の正常化を扱う別のアプローチは、遺伝子治療によってアディポネクチンポリペプチドフラグメントを投与することである。
従って、一つの局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドフラグメント、例えば、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびにその類似体に関し、そのフラグメントは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含み、ここで、コラーゲンドメイン中の少なくとも一つのリジンがヒドロキシル化およびグリコシル化される。
さらに、本発明者らは、アディポネクチンの構造を分析し、そしてそれ自体非ポリペプチド部分を導入するための潜在的な部位として露出している表面であるアミノ酸を位置決めした。
従って、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、および、アディポネクチンポリペプチドに共有結合している第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。
すべての表面に露出したアミノ酸が非ポリペプチド部分を結合するために所望されるわけではないので、本発明のさらなる局面は、表面に露出したアミノ酸の位置に非ポリペプチド部分のための結合基を有する適切なアミノ酸を導入することである。
従って、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基は、表面に露出したアミノ酸残基によって占められるもとのアディポネクチンにおける位置に導入される。
さらに、野生型アディポネクチンは2つの保存性システイン残基を有し、そのうち、配列番号：1に関連してCys152は、本発明者らの分析によれば表面に露出しておらず、そしてそれ自体、非ポリペプチド部分についての適切な結合部位を探す場合の明白な選択ではない。
従って、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
さらに、アディポネクチンのN末端もまた、活性が失われていないと仮定すると、非ポリペプチドへの結合体化のために適切であり得る。
従って、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そしてそのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
さらに、本発明者らは、カルシウムイオンが、アディポネクチンポリペプチドが安定なトリマーを形成するために決定的であること、およびこのようなカルシウムイオンの除去がトリマー構造の不安定化をもたらすことを発見した。
従って、さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチドを含む結合体、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
さらに、本発明者らは、PEGのようなポリマーの導入が、アディポネクチンポリペプチドに結合した1、2、または3個のポリマーを有するトリマーをもたらすことを発見した。このようなトリマーが、カルシウムイオンを用いてさらに安定化される。
従って、さらなる局面において、本発明は、
a）アディポネクチンポリペプチドトリマーを含む結合体であって、ここでそのアディポネクチンポリペプチドトリマーが、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマー、およびそのアディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのポリペプチドモノマーのいずれか一つに共有結合されている一つの第1のポリマーを、得られるトリマーが一つのポリマーのみを含むような様式で含む、結合体、ならびに
b）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
a）アディポネクチンポリペプチドトリマーを含む結合体であって、ここでそのアディポネクチンポリペプチドトリマーが、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマー、およびそのアディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのポリペプチドモノマーのいずれか一つに共有結合されている一つの第1のポリマーを、得られるトリマーが一つのポリマーのみを含むような様式で含む、結合体、ならびに
b）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体を含む薬学的組成物、および薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントに関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント、および薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む薬学的組成物に関する。
さらなる局面において、本発明は、1型糖尿病、耐糖能異常（本明細書中以下IGTと呼ばれる）；2型糖尿病；X症候群；肥満；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；異脂肪血症；の処置のための医薬品の製造のため、または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセス；特に、IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患のための医薬品の製造のための本発明の結合体の使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、ヒト細胞におけるTNF-αの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態の処置のための医薬品の調製のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関し、ここで、上記医薬品はTNF-αの発現または放出を阻害する。
さらなる局面において、本発明は、1型糖尿病；耐糖能異常（本明細書中以下ではIGTという）；2型糖尿病；X症候群；肥満；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；異脂肪血症の処置のため；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセス；特に、IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患のための医薬品の製造のための本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、1型糖尿病；耐糖能異常（本明細書中以下ではIGTという）；2型糖尿病；X症候群；肥満；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；異脂肪血症；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセス；特に、IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患を有する哺乳動物を処置する方法に関し、この方法は、本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの有効量を投与する段階を包含する。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドを調製する方法に関し、この方法は、
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階であって、ここで、シグナルペプチドの最後の3つのアミノ酸がHDGである、段階、
b）上記ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）上記アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、ならびに
e）選択的に、上記アディポネクチンポリペプチドを入手する段階、
を包含する。
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階であって、ここで、シグナルペプチドの最後の3つのアミノ酸がHDGである、段階、
b）上記ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）上記アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、ならびに
e）選択的に、上記アディポネクチンポリペプチドを入手する段階、
を包含する。
アディポネクチンのポリペプチド、フラグメント、および類似体の配列は、「配列表」に列挙される。
発明の詳細な開示
本明細書において、多数の参考文献が引用される。これらはすべて、参照として本明細書に組み入れられることが意図される。
本明細書において、多数の参考文献が引用される。これらはすべて、参照として本明細書に組み入れられることが意図される。
本明細書の文脈において、本発明は、以下の定義を適用する。
例えば、「非ポリペプチド」、「アミノ酸残基」、「置換」または「結合基」において使用される場合、用語「a」または「an」は、一つまたは複数、あるいは少なくとも一つを意味することを意図し、例えば、非ポリペプチドは一つまたは複数の非ポリペプチドを意味する。「a」または「an」は、本明細書を通して、「一つまたは複数」あるいは「少なくとも一つ」と交換可能に使用され得る。
用語「結合体」（または、交換可能に「結合体化ポリペプチド」）は、一つまたは複数のポリペプチドの、一つまたは複数の非ポリペプチド部分への共有結合によって形成される不均一な（複合体またはキメラ性の意味において）分子を示すことを意図する。用語「共有結合」は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が、互いに直接的に共有結合的に結合するか、さもなくば、ポリペプチドに存在する結合基を使用する、架橋、スペーサー、または連結部分のような介在部分を通して互いに間接的に共有結合的に結合するかのいずれかであることを意味する。好ましくは、結合体は、関連する濃度および条件で可溶性、すなわち、血液のような生理学的液体中で可溶性である。本発明の結合体化されたポリペプチドの例には、グリコシル化されたポリペプチド、PED化されたポリペプチド、グリコシル化およびPEG化されたポリペプチド、ならびに、糖部分に結合したPEGを有するグリコシル化されたポリペプチドが含まれる。用語「非結合体化ポリペプチド」は、結合体のポリペプチド部分について使用され得る。
用語「非ポリペプチド部分」は、本発明のポリペプチドの結合基に結合体化し得る分子を示すことを意図する。このような分子の好ましい例には、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物、または有機誘導体化剤が含まれる。本発明の結合体の文脈において使用される場合、非ポリペプチド部分は、ポリペプチドの結合基を通して結合体のポリペプチド部分に連結されることが理解される。
用語「ポリマー分子」は、2つまたはそれ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子として定義され、ここで、そのモノマーのどれもがアミノ酸残基ではない。用語「ポリマー」は、用語「ポリマー分子」と交換可能に使用され得る。この用語は、インビトロのグリコシル化（すなわち、インビトロで実行される合成的グリコシル化であって、通常、炭化水素分子をポリペプチドの結合基に共有結合的に結合する段階を包含し、選択的に、架橋試薬を使用する）によって結合される炭水化物分子を網羅することが意図される。N-またはO-グリコシル化のようなインビボのグリコシル化（以下にさらに記載されるようなもの）によって結合される炭化水素分子は、本明細書中で「糖部分」といわれる。結合体におけるポリマー部分または糖部分のような非ポリペプチド部分の数が明確に示される場合以外は、結合体に含まれるか、または、さもなくば本発明において使用される「非ポリペプチド部分」との各々の言及は、結合体中の、一つまたは複数の非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子または糖部分）への言及であるべきである。
用語「モノPEG化」は、アディポネクチンポリペプチドが、それに共有結合された一つのポリエチレングリコール（PEG）を含む一つのみのポリマーを有することを意味することを意図する。モノPEG化は、結合体が均質であり得るか（例えば、N末端のモノPEG化）、または結合体が不均一であり得るか（例えば、各アディポネクチン分子における一つのリジン残基のモノPEG化）を意味し、例えば、アディポネクチン分子のいくつかは、K134位がPEG化され得、そしてアディポネクチン分子のいくつかは配列番号：1に対してK149位においてPEG化され得る（これらの例は単に例証であり、いかなる場合においても本発明を限定することを意図しない）。
用語「単離された」は、その物質が、そのもともとの環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出されたことを意味することが意図される。例えば、生きている動物に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において同時に存在している物質のいくつかまたはすべてから分離された、同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、かつ／または、このようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であり得、かつ、そのベクターもしくは組成物がその天然の環境の一部ではないという意味で、なお単離されている。
用語「結合基」は、ポリペプチドのアミノ酸残基が、関連する非ポリペプチド部分にカップリングし得ることを示すことを意図する。例えば、ポリマー、特にポリエチレングリコール（PEG）の結合体化については、頻繁に使用される結合基は、リジンのεアミノ基またはN末端アミノ基である。他のポリマー結合基には、遊離のカルボン酸基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のC末端アミノ酸残基のもの）、適切に活性化されたカルボニル基、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基（例えば、システインのスルフヒドリル基）が含まれる。
インビボN-グリコシル化については、用語「結合基」は、N-グリコシル化部位（配列N-X'-S/T/C-X''を有するもの、ここでX'はプロリン以外の任意のアミノ酸残基、X''はX'と同じであってもよいし、同じでなくてもよい任意のアミノ酸であり、そして好ましくはプロリン以外であり、Nはアスパラギンであり、そしてS/T/Cは、セリン、スレオニン、またはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはスレオニン、そして最も好ましくはスレオニンである）を構成するアミノ酸残基を示すための非慣用的な方法において使用される。N-グリコシル化部位のアスパラギン残基は、糖部分がグリコシル化の間に結合するものであるが、このような結合は、N-グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しない場合は、達成することができない。従って、非ポリペプチド部分がN-結合糖部分である場合、もとのポリペプチドのアミノ酸配列の変化と関連して使用されるような用語「第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基」は、N-グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基が、機能的なN-グリコシル部位がアミノ酸配列に導入されるような様式で変化されると理解される。O-グリコシル化部位については、結合基はセリンまたはスレオニン残基のOH基であり、そしてその点において、非ポリペプチド部分はO連結糖部分である。
本明細書において、アミノ酸の名称および原子の名称（例えば、CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、Cなど）は、タンパク質データバンク（PDB）（www.pbd.org.）によって定義されるように使用され、これは、IUPAC命名法に基づく（アミノ酸およびペプチド（残基の名称、原子の名称など）についてのIUPAC命名法およびシンポジウム、Eur.J.Biochem.,138, 9-37 (1984) 、Eur.J.Biochem.,152, 1 (1985)におけるそれらの訂正を伴う）。CAは、時折、Cαをいい、CBはCβをいう。用語「アミノ酸残基」は、以下からなる群に含まれるアミノ酸残基を示すことが意図される：アラニン残基（AlaまたはA）、システイン残基（CysまたはC）、アスパラギン酸残基（AspまたはD）、グルタミン酸残基（GluまたはE）、フェニルアラニン残基（PheまたはF）、グリシン残基（GlyまたはG）、ヒスチジン残基（HisまたH）、イソロイシン残基（IleまたはI）、リジン残基（LysまたはK）、ロイシン残基（LeuまたはL）、メチオニン残基（MetまたはM）、アスパラギン残基（AsnまたはN）、プロリン残基（ProまたはP）、グルタミン残基（GlnまたはQ）、アルギニン残基（ArgまたはR）、セリン残基（SerまたはS）、スレオニン残基（ThrまたはT）、バリン残基（ValまたはV）、トリプトファン残基（TrpまたはW）、およびチロシン（TryまたはY）残基。アミノ酸の位置／置換を同定するために使用される用語法は以下のように例証される：C152（例えば、配列番号：1に示されるアミノ酸配列におけるシステイン残基によって占められる位置番号152を示す）。C152Sは、152位のシステイン残基がセリンで置き換えられていることを示す。本明細書中でなされるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列と比較してなされる。複数の置換は、「+」を付して示され、例えば、F115N+V117T/Sは、115位のフェニルアラニン残基のアスパラギンでの置換、および117位のバリン残基のスレオニン残基またはセリン残基、好ましくはスレオニン残基での置換、を含むアミノ酸配列を意味する。T/Sは、本明細書中で所定の置換に関して使用される場合、T残基またはS残基のいずれか、好ましくはT残基を意味する。上記で説明したように、命名法X151Yは、ヒトアディポネクチンと比較して、151位のアミノ酸Xがアミノ酸Yで置換されていること、例えば、H151Nを意味することが意図される。
用語「ヌクレオチド配列」は、2つまたはそれ以上のヌクレオチド分子の連続的なストレッチを示すことが意図される。このヌクレオチド配列はゲノム性、cDNA、RNA、半合成、合成起源、またはそれらの組み合わせであり得る。
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、一般的に、例えば、米国特許第4,683,195号に記載されているような、所望のヌクレオチド配列のインビトロ増幅のための方法をいう。一般的には、PCR法は、テンプレートの核酸に優先的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成の反復するサイクルを含む。
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、本明細書中で交換可能に使用され、すべてのこのような用語は、細胞の増殖または培養から生じる子孫を含むことが理解されるべきである。「形質転換」および「トランスフェクション」は、DNAを細胞に導入するプロセスをいうために交換可能に使用される。
「作動可能に連結される」とは、酵素的なライゲーションの手段によるか、またはさもなくば、配列の正常な機能が実行され得るように、互いに関連した配置での、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合的な結合をいう。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレプロタンパク質として発現される場合に、一つのポリペプチドについての一つのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結されている；リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合に、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されるヌクレオチド配列が連続していること、および、分泌リーダーの場合には、連続的かつ読み取りフェーズにあることを意味する。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、標準的な組換えDNA方法とともに使用される。
用語「導入する」は、存在するアミノ酸残基の置換を意味することが主として意図されるが、さらなるアミノ酸残基の挿入も意味し得る。用語「除去する」は、別のアミノ酸残基によって除去されるアミノ酸残基の置換を意味することが主として意図されるが、除去されるアミノ酸残基の欠失（置換なし）もまた意味し得る。
所定の物質と関連して使用される場合、用語「免疫原性」は、免疫系からの応答を誘導するその物質の能力を示すことが意図される。免疫応答は、細胞または抗体が媒介する応答であり得る（さらなる免疫原性の定義については、例えば、Roitt: Essential Immunology（第8版、Blackwell）を参照されたい）。免疫原性は、当該分野で公知の任意の適切な方法の使用によって、例えば、インビボまたはインビトロで決定され得る。用語「減少した免疫原性」は、本発明の結合体またはポリペプチドが、比較し得る条件下で決定される場合に、野生型ヒトアディポネクチン（apM1）または野生型ヒトアディポネクチンの改変体のような参照分子よりも、測定可能により低い免疫応答を生じることを意味することが意図される。通常は、減少した抗体反応性は、減少した免疫原性の指標である。
用語「機能的インビボ半減期」は、その通常の意味において使用される。すなわち、結合体の所定の機能性の50％が保持される時間である（例えば、結合体の生物学的活性の50％が、身体／標的器官になお存在している時間、または結合体の活性が最初の値の50％である時間）。機能的インビボ半減期を決定するための代替として、「血清半減期」が決定され得る。すなわち、結合体分子の50％が、取り除かれる前に、血漿または血流中に循環する時間である。血清半減期の決定は、しばしば、機能的インビボ半減期の決定よりもより単純であり、血清半減期の強度は、通常、機能的インビボ半減期の強度の良好な指標である。血清半減期に対する代替的な用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」、および「クリアランス半減期」が含まれる。保持される機能性は、通常、抗ウイルス性活性、抗増殖性活性、免疫調節性活性、またはレセプター結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、当該分野において公知の任意の適切な方法によって決定され得る。
結合体は、通常、細網内皮系（RES）、腎臓、脾臓、もしくは肝臓の一つもしくはそれ以上の作用によって、または、特異的もしくは非特異的なタンパク質分解によって除去される。腎臓によって起こるクリアランスはまた、「腎性クリアランス」といわれ得、そして例えば、糸球体濾過、尿細管排泄、または尿細管除去によって達成される。通常、クリアランスは、結合体の物理的特性に依存し、この物理的特性には、分子量、サイズ（直径）（糸球体濾過のカットオフと比較して）、電荷、対称性、形状／強剛性、結合した炭水化物鎖、およびそのタンパク質についての細胞レセプターの存在が含まれる。約67kDaの分子量が腎性クリアランスのための重要なカットオフ値であると見なされている。
減少した腎性クリアランスは、任意の適切なアッセイ、例えば、確立されたインビボアッセイによって達成され得る。典型的には、腎性クリアランスは、標識された（例えば、放射性標識されたか、または蛍光標識された）ポリペプチド結合体を患者に投与すること、および患者から収集された尿中の標識活性を測定することによって測定される。減少した腎性クリアランスは、対応する非結合体化ポリペプチドまたは対応する非結合体化野生型ポリペプチドに対して、比較し得る条件下で測定される。
機能的なインビボ半減期または血清半減期について使用される場合、用語「増加した」は、結合体の関連する半減期が、参照分子（例えば、非結合体化野生型ヒトアディポネクチンまたは非結合体化改変体ヒトアディポネクチン）の半減期と比較して、比較し得る条件下で測定した場合に、統計学的に有意に増加することを示すために使用される。
用語「減少した免疫原性および／または増加した機能的インビボ半減期および／または増加した血清半減期」は、これらの特性のいずれか一つ、2つ、またはすべてを網羅するものとして理解されるべきである。好ましくは、本発明の結合体は、これらの特性、すなわち、減少した免疫原性および増加した機能的インビボ半減期、減少した免疫原性および増加した血清半減期または増加した機能的インビボ半減期および増加した血清半減期の少なくとも2つを有する。最も好ましくは、本発明の結合体はすべての特性を有する。
本発明の結合体は、とりわけ、一次肝細胞におけるグルコースアウトプットのインスリン依存性の減少を刺激することによる、試験アッセイ（実験セクションにおいて記載される）において活性を示すそれらの能力に基づくインスリン感作物質として有用である。
特定の変異と関連して使用される場合、用語「一つの違い」または「と異なる」は、特定のアミノ酸の違いとは別に存在する付加的な違いを許容することが意図される。例えば、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入に加えて、アディポネクチンポリペプチドは、このようなアミノ酸残基の導入および／または除去に関連しない他の置換を含み得る。用語「変異」および「置換」は、本明細書中で交換可能に使用される。
用語「アディポネクチンポリペプチド」は、このポリペプチドが、配列番号：1〜8、10〜12、または13のいずれか一つから選択される配列、ならびに、その相同体、類似体、およびフラグメントを有することを示すことが意図される。典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1〜8、10〜12、または13のいずれか一つ、ならびに、特定の配列のいずれか一つと、一つまたは複数、好ましくは1〜8個、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。便宜上のために、apM1（52〜244）、apM1（58〜244）、およびapM1（82〜244）をコードする一本鎖のcDNAを、それぞれ、配列番号：14〜16に示す。用語「相同体」は、ポリペプチドが配列番号：1〜8、10〜12、または13のいずれか一つと、少なくとも50％の同一性、例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、または95％の同一性を有することを示すことが意図される。用語「フラグメント」または「アディポネクチンポリペプチドフラグメント」は、配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つ、ならびに、その相同体、類似体、および短縮型を示すことが意図される。このような短縮は、公知の手順に従って、N末端またはC末端で起こり得、例えば、配列番号：5は、2つのアミノ酸を切除することによってC末端短縮され得、それによって、ヒト野生型アディポネクチンのアミノ酸101〜242を有する配列を産生する（ヒトアディポネクチン（101〜242）、またはapM1（101〜242））。本明細書を通じて使用される命名法の別のいくつかの例は、apM1（82〜244）であり、これは、アミノ酸82〜244のヒト野生型アディポネクチンの配列を意味し；およびapM1（52〜244）、これは、アミノ酸52〜244のヒト野生型アディポネクチンの配列を意味し；apM1（58〜244）、これは、アミノ酸58〜244のヒト野生型アディポネクチンの配列を意味する。本明細書を通じて使用されるさらなる命名法は、例えば、T121C-apM1（82〜244）であり、これは、アミノ酸82〜244のヒト野生型アディポネクチンの配列を意味し、ここで、121位のThrがCysに置換されている。
典型的には、用語フラグメントは、配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つが、1、2、3、4、5、または6個のアミノ酸残基がN末端で短縮化されているか、または、1、2、3、4、5、または6個のアミノ酸残基がC末端で短縮化されていることを意味する。非限定的な例において、フラグメントは6アミノ酸残基でN末端が短縮化され、選択的には、2アミノ酸残基がC末端が短縮化されている。
上記で言及したような同一性パーセントは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。典型的には、本発明者らは、CLUSTALWプログラム（Thompsonら、1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680）を使用している。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、試験アッセイ（実験セクションにおいて記載されている）：C2C12細胞におけるグルコースの取り込みに対するアディポネクチンの効果の測定において活性を示す。
アディポネクチンポリペプチドはまた、単球細胞株におけるLPS-誘導性のTNF-α産生を阻害することによって、試験アッセイ（実験セクションにおいて記載されている）における活性を示す。
アディポネクチンポリペプチドはまた、一次肝細胞におけるグルコースアウトプットの、インスリンによって媒介される抑制の増強によって、試験アッセイ（実験セクションにおいて記載されている）における活性を示す。
アディポネクチンポリペプチドはまた、血中グルコースレベルを低下および正常化することによって、db/dbマウス（実験セクションにおいて記載されている）における活性を示す。
ヒト野生型アディポネクチン（または交換可能に「ヒトアディポネクチン」）（配列番号：1）は、244アミノ酸残基、すなわち、アミノ酸1〜17のシグナル配列、アミノ酸18〜41の非相同性ドメイン、アミノ酸42〜107のコラーゲンドメイン、およびアミノ酸108〜244の球状ドメインからなる。ヒトアディポネクチンをコードする一本鎖cDNAは配列番号：9に示される。
用語「球状ドメイン」は、ヒトアディポネクチン（108〜244）（配列番号：6に示される）およびその類似体の配列を示すことが意図される。C末端短縮型ならびにN末端短縮型の両方であるフラグメントもまた、含まれることが意図される。ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインはトリマーを形成することが知られている。
アディポネクチンポリペプチドトリマーに関連して使用される場合、用語「トリマー」は、アディポネクチンポリペプチドモノマーの3つの分子がトリマーを形成することを意味する。
用語「ホモトリマー」は、3つの同一のモノマーからなるトリマーを意味する。
用語「ヘテロトリマー」は、トリマーが異なるモノマーからなり、例えば、2つのモノマーが同じであり得、かつ3つめが異なり得るか、または3つすべてが異なり得ることを意味する。その違いは、一つまたは2つのモノマーが、他のモノマーとは異なるアミノ酸配列を有するという点である。
用語「コラーゲンドメイン」は、ヒトアディポネクチン（42〜107）（配列番号：1において示されるようなもの）およびその類似体の配列を示すことが意図される。C末端短縮型ならびにN末端短縮型の両方であるフラグメントもまた、含まれることが意図される。コラーゲンドメインは、Gly-X-Yの反復配列を有することが周知であり、ここで、XおよびYは、同じかまたは異なり、そして以下のアミノ酸（一文字コード）：A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、Ｔ、W、Y、およびVから選択される。コラーゲンドメインの例は、アミノ酸Gly99〜Gly107（G99-G107）である。コラーゲンドメインの別の例は、アミノ酸Glu82〜Gly107（E82-G107）である。
用語「非相同性ドメイン」は、ヒトアディポネクチン（18〜41）（配列番号：1において示されるようなもの）およびその類似体の配列を示すことが意図される。C末端短縮型ならびにN末端短縮型の両方であるフラグメントもまた、含まれることが意図される。
用語「シグナルペプチド」は、ヒトアディポネクチン（1〜17）（配列番号：1において示されるようなもの）およびその類似体の配列を示すことが意図される。C末端短縮型ならびにN末端短縮型の両方であるフラグメントもまた、含まれることが意図される。シグナル配列の例は、アミノ酸Met1〜Asp17（M1-D17）である。
用語「もとのアディポネクチン」（または交換可能に、「もとのアディポネクチンポリペプチド」）は、本発明に従って改良した出発分子を示すことが意図される。もとのアディポネクチンは任意の起源、例えば、脊椎動物または哺乳動物起源（例えば、国際公開番号WO 01/51645に規定される起源のいずれか）、またなそのフラグメントであり得るが、もとのアディポネクチンは、典型的には、配列番号：1を有する野生型ヒトアディポネクチン、または配列番号：2〜8、10〜12、または13のフラグメントのいずれか、またはそれらの類似体である。
「類似体」は、もとのポリペプチドから一つまたは複数のアミノ酸残基、通常、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15のアミノ酸残基が異なるポリペプチドである。
本発明のポリペプチドまたは結合体について使用される場合、用語「機能的部位」は、アディポネクチンの機能または性能に必須であるか、またはさもなくばそれに関与する、従って、機能的部位に「局在化する」一つまたは複数のアミノ酸残基を示すことが意図される。
実施例2において調製されたapM1（82〜244）の特徴付けは、CHO細胞において産生されたapM1（82〜244）が、Pro残基（P95およびP104）上で部分的にヒドロキシル化され、そしてその分子上のコラーゲン様部分においてLys101残基で、部分的にヒドロキシル化および引き続きグリコシル化される（本明細書以下では、グリコ−ヒドロキシ−Lysともいう）ことを示した。このように、真核生物細胞は、典型的には、例えば、配列番号：3、10、12、または13のアディポネクチンポリペプチドを発現する哺乳動物細胞は、4、1、4、および4個のグリコ−ヒドロキシ−Lys残基を有する配列をそれぞれ産生する。1、2、3、または4個のLysがコラーゲンドメインに存在し、そしてアディポネクチンポリペプチドが哺乳動物細胞において産生される場合は常に、これはこのような翻訳後修飾を含む。さらに、Pro残基のより最適化された水酸化が所望されるならば、ポリペプチドの発現の間にビタミンCが存在するべきである。典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数、好ましくは1〜8の置換（配列番号：5を用いる状況において、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたN末端リジンは、より長いフラグメント、例えばapM1（82〜244）を構築すること、および引き続き適切な酵素、例えばトリプシンで切断することによって調製され得る）が特定の配列のいずれか一つで異なる配列から選択される。アディポネクチンポリペプチドが一つまたは複数の置換で異なる場合、これは、一つまたは複数のアミノ酸残基が導入または除去されたか、あるいはいくつかが導入され得、かついくつかが除去され得ることを意味する。
本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント
第1の局面において、本発明は、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ならびに、その相同体、類似体、およびフラグメントに関する。典型的には、本発明のアディポネクチンフラグメントは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、特定の配列のいずれか一つと、一つまたは複数、好ましくは1〜11個、例えば1〜8個の置換が異なる配列から選択される。
第1の局面において、本発明は、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ならびに、その相同体、類似体、およびフラグメントに関する。典型的には、本発明のアディポネクチンフラグメントは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、特定の配列のいずれか一つと、一つまたは複数、好ましくは1〜11個、例えば1〜8個の置換が異なる配列から選択される。
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入とは別に、一つまたは複数の置換（上記に説明したようなもの）もまた、このようなアミノ酸残基の導入および／または除去に関連しない他の置換を含み得る。しかし、アディポネクチンポリペプチドフラグメントならびに一つまたは複数の置換が異なる配列は生物学的活性を有するべきであり、このような活性は、例えば、インスリン抵抗性および糖尿病のマウスモデルのような関連する動物モデル（例えば、A.E.Halsethら、Biochemical and Biophysical Research Communications 294 (2002) 798-805において記載されているdb/dbマウス；または、X.M.Songら、Diabetologia 45 (2002) 56-65において記載されるob/obマウス；または、zuckerラットのようなラットモデル）において試験され得るか、あるいは、実験セクションにおいて記載される試験アッセイA、B、またはCのいずれか一つのようなインビトロアッセイにおける関連物において試験され得る。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換において特定される配列のいずれか一つが異なる配列から選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つから選択される。代表的なアディポネクチンポリペプチドフラグメントは配列番号：10である。別の代表的なアディポネクチンポリペプチドフラグメントは配列番号：12である。さらなる代表的なアディポネクチンポリペプチドフラグメントは配列番号：13である。
代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つと、一つまたは複数、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。
さらなる代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：3と、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。
さらなる代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：10と、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。
さらなる代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：12と、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。
さらなる代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：13と、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11、例えば1〜8個の置換、例えば1〜6個の置換が異なる配列から選択される。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、哺乳動物細胞、例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞において産生される。コラーゲンドメイン中のリジンは、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）において産生される場合に、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4つのリジン残基を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される少なくとも一つのリジン残基を含む。好ましくは、そのリジン残基は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される一つのリジン残基、好ましくはK101を含み、かつその位置は、好ましくは、ヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される2つのリジン残基を含み、好ましくはその位置の両方がヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、およびK101位、好ましくは、K68位、K77位、およびK101位のいずれか一つから選択される3つのリジン残基を含み、好ましくはその位置の3つすべてがヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K68、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、K65位、K68位、K77位、またはK101位、好ましくは、K68位、K77位、およびK101位から選択される4つのリジン残基を含み、好ましくはその位置の4つすべてがヒドロキシル化およびグリコシル化される。コラーゲンドメインのN末端アミノ酸は、典型的には、リジン（例えば、K65、K68、またはK77）ではない。なぜなら、このようなリジンは、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）における発現の際に、ヒドロキシル化およびグリコシル化されないからである。しかし、上記に説明したように、所望されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントがN末端アミノ酸K101を有するならば、そのリジンは、真核生物細胞におけるより長いフラグメントの発現に際してヒドロキシル化およびグリコシル化され得、続いて、適切な酵素（例えば、トリプシン）で切断される。
アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つのようなコラーゲンドメインを含み、このようなコラーゲンドメインは、真核生物細胞において産生された場合に、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む。アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：5に示されるapM1（101〜244）のようなコラーゲンドメインのアミノ酸7またはそれ以下のアミノ酸のみを有するならば、リジンはヒドロキシル化およびグリコシル化されない。しかし、apM1（101〜244）は、グリコ−ヒドロキシ−K101残基を有するように構築され得る。なぜなら、例えば、CHO細胞におけるapM1（82〜244）の産生は、トリプシンのような酵素（これは、アルギニンとリジンとの間を切断する）を用いる、R100位とK101位との間での引き続く切断は、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたK101位を有するapM1（101〜244）を生成する。
従って、特定の局面において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換のアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む。
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換のアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含み、ここでコラーゲンドメインが、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む上記のアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、コラーゲンドメインを有しないか、またはヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含まないアディポネクチンポリペプチドフラグメントを超えて特に好ましい。ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンの存在は、例えば、耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または異脂肪血症を処置するために有用である治療剤としての分子の全体の性能を改善する。さらに、本発明者らは、アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において受容可能な収量で発現されるならば、コラーゲンドメインは、56アミノ酸より多く、好ましくは50アミノ酸を超えないアミノ酸を含むべきではないことを発見した。しかし、コラーゲンドメインが50アミノ酸よりも多くを含む場合には、UCOEのような発現エンハンサーの補助を用いて発現を増大させることが可能であった。典型的には、いわゆるUCOEは、Cobra Therapeutics Limitedから入手され得るか、または例えば、WO 00/05393において記載されるように調製され得る。
このように、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含む上記のアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、大規模スケールの培養において再現可能であるように、哺乳動物発現系のような真核生物細胞発現系から高収量で発現される。
従って、本発明の好ましい局面は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、この球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換のアミノ酸配列と異なる配列を含み、そして、
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここで、このコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む。
ここで、この球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換のアミノ酸配列と異なる配列を含み、そして、
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここで、このコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含む。
典型的には、球状ドメインは、あまりに多くのアミノ酸の変化を含むべきではない。このことが、生物学的活性を低下させ得るか、または免疫原性の増加をもたらし得るからである。
従って、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントのさらなる実施態様において、球状ドメインは、配列番号：1に示されるような108〜244位のアミノ酸配列、ならびに、11までの置換でアミノ酸配列が異なる配列を含む。
さらなる実施態様において、球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列を含む。
球状ドメインにおいて、グリコシル化部位を導入するか、またはアミノ酸を除去／導入することが所望された状況において、球状ドメインは、一つまたは複数の置換で、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列が異なる。典型的には、球状ドメインは、1〜11個の置換（例えば、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11の置換）で、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列が異なる。
さらに、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるようなG42位に対応するアミノ酸66までを含むコラーゲンドメインとともに、球状ドメインの上記の実施態様のいずれか一つを含み、ここで、このコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む。さらなる実施態様において、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるようなA52位に対応するアミノ酸56までを含む。典型的には、コラーゲンドメインは配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるようなR58位に対応するアミノ酸50までを含み、例えば、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなR58位に対応するアミノ酸50まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなT61位に対応するアミノ酸47まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなE64位に対応するアミノ酸44まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなE67位に対応するアミノ酸41まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなD70位に対応するアミノ酸38まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなL73位に対応するアミノ酸35まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなP73位に対応するアミノ酸32まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなD79位に対応するアミノ酸29まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなE82位に対応するアミノ酸26まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなV85位に対応するアミノ酸23まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなA88位に対応するアミノ酸20まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなP91位に対応するアミノ酸17まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなF94位に対応するアミノ酸14まで、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるようなI97位に対応するアミノ酸11まで、配列番号：1に示されるようなI97位に対応するアミノ酸11から、配列番号：1に示されるようなR58位に対応するアミノ酸50まで、配列番号：1に示されるようなF94位に対応するアミノ酸14から、配列番号：1に示されるようなT61位に対応するアミノ酸47まで、配列番号：1に示されるようなP91位に対応するアミノ酸17から、配列番号：1に示されるようなE64位に対応するアミノ酸44まで、配列番号：1に示されるようなA88位に対応するアミノ酸20から、配列番号：1に示されるようなE67位に対応するアミノ酸41まで、配列番号：1に示されるようなV85位に対応するアミノ酸23から、配列番号：1に示されるようなD70位に対応するアミノ酸38まで、配列番号：1に示されるようなE82位に対応するアミノ酸26から、配列番号：1に示されるようなL73位に対応するアミノ酸35まで。このコラーゲンドメインは以下を含む：配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8、配列番号：1に示されるようなI97位に対応するアミノ酸11、配列番号：1に示されるようなF94位に対応するアミノ酸14、配列番号：1に示されるようなP91位に対応するアミノ酸17、配列番号：1に示されるようなA88位に対応するアミノ酸20、配列番号：1に示されるようなV85位に対応するアミノ酸23、配列番号：1に示されるようなE82位に対応するアミノ酸26、配列番号：1に示されるようなD79位に対応するアミノ酸29、配列番号：1に示されるようなP76位に対応するアミノ酸32、配列番号：1に示されるようなL73位に対応するアミノ酸35、配列番号：1に示されるようなD70位に対応するアミノ酸38、配列番号：1に示されるようなE67位に対応するアミノ酸41、配列番号：1に示されるようなE64位に対応するアミノ酸44、配列番号：1に示されるようなT61位に対応するアミノ酸47、配列番号：1に示されるようなR58位に対応するアミノ酸50、配列番号：1に示されるようなA52位に対応するアミノ酸56、配列番号：1に示されるようなG42位に対応するアミノ酸66。上記のコラーゲンドメインのいずれか一つは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む。典型的には、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインの場合と同様に、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンは、N末端でグリシンに隣接するべきである。The Journal of Biological Chemistry, 「Conformational Requirement for Lysine Hydroxylation in Collagen」, 第266巻、第34号、12月5日発行、22960-22967、1991もまた参照されたい。
コラーゲンドメインの長さに依存して、これは、1〜4個（例えば、1、2、3、または4個）のリジンを含み得る。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドフラグメントのコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるような、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4つのリジン残基を含む。上記に言及したように（K101にN末端リジンを有する、配列番号：5を有するアディポネクチンポリペプチドと関連して）、N末端残基である、コラーゲンドメイン中のリジンは、真核生物細胞において、このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの発現に際してヒドロキシル化およびグリコシル化されない。例えば、K65位、K68位、K77位、およびK101位の4つのリジン残基を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント（ここで、K65（配列番号：1において示される）がN末端アミノ酸である）が所望され、次いで、このようなフラグメントの発現は、コラーゲンドメインを有するフラグメントをもたらし、ここで、K68位、K77位、およびK101位の3つがヒドロキシル化およびグリコシル化され、そしてK65はヒドロキシル化およびグリコシル化されない。別の例は、K68位、K77位、およびK101位の3つのリジン残基を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメントであり、ここで、K68（配列番号：1において示される）はN末端アミノ酸であり、次いで、このようなフラグメントの発現は、コラーゲンドメインを有するフラグメントをもたらし、ここで、K77位およびK101位の2つはヒドロキシル化およびグリコシル化され、そしてK68はヒドロキシル化およびグリコシル化されない。しかし、所望のアディポネクチンポリペプチドフラグメントがN末端アミノ酸、K68を有するならば、そのリジンは真核生物細胞中でより長いフラグメントの発現の際にヒドロキシル化およびグリコシル化され得、続いて、グルタミン酸残基の後ろでタンパク質を特異的に切断する適切なプロテアーゼ（例えば、Staphylococcus aureus V8から精製されたプロテアーゼ（これは市販されている））を用いて切断する。別の例は、K77位およびK101位の2つのリジン残基を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメントであり、ここで、K77（配列番号：1において示される）はN末端アミノ酸であり、次いで、このようなフラグメントの発現は、コラーゲンドメインを有するフラグメントをもたらし、ここで、K101位はヒドロキシル化およびグリコシル化され、そしてK77はヒドロキシル化およびグリコシル化されない。しかし、所望のアディポネクチンポリペプチドフラグメントがN末端アミノ酸、K77を有するならば、そのリジンは真核生物細胞中でより長いフラグメントの発現の際にヒドロキシル化およびグリコシル化され得、続いて、プロリンの後ろで切断酵素として作用する適切なプロリルエンドプロテアーゼ（いくつかの場合において、プロリルオリゴペプチダーゼとも呼ばれ、これは、微生物、植物、および動物において広範囲に存在する）（例えば、微生物Flavobacterium meningosepticum由来の酵素（これは市販されている））を用いて切断する。N末端アミノ酸がリジンでない状況において、1、2、3、または4個のリジンを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、真核生物細胞における発現の際に、それぞれ、ヒドロキシル化およびグリコシル化される1、2、3、または4個のリジン残基を含む。従って、特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：1に示されるようなK101位のような、ヒドロキシル化およびグリコシル化される一つのリジン残基を含む。別の特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：1に示されるようなK77位およびK101位のような、ヒドロキシル化およびグリコシル化される2つのリジン残基を含む。さらなる特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：1に示されるようなK68位、K77位、およびK101位のような、ヒドロキシル化およびグリコシル化される3つのリジン残基を含む。さらなる特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、配列番号：1に示されるようなK65位、K68位、K77位、およびK101位のような、ヒドロキシル化およびグリコシル化される4つのリジン残基を含む。
上記の本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つが、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。このような方法は、組換えDNA技術を含み、好ましくは、「本発明における使用のためのアディポネクチンポリペプチドを調製する方法」のセクションにおいて言及される方法が使用され、特に適切な調製方法は、アディポネクチンポリペプチド（そのフラグメントを含む）を調製する方法であり、この方法は以下の段階を包含する：
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調節し、ここで、そのシグナルペプチドのC末端の最後の3つのアミノ酸がHDGである、段階、
b）上記ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）上記アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌させる段階、ならびに
e）上記ポリペプチドを入手する段階。
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調節し、ここで、そのシグナルペプチドのC末端の最後の3つのアミノ酸がHDGである、段階、
b）上記ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）上記アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌させる段階、ならびに
e）上記ポリペプチドを入手する段階。
配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つを含む上記のアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つ、ならびにその相同体、類似体、およびフラグメント（特定の実施態様のいずれか一つを含む）が、上記に言及された適切な動物モデルまたはインビトロアッセイにおいて生物学的活性について試験され得る。従って、一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、db/dbマウスにおいて血中グルコース濃度を正常化する。別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、筋肉細胞においてグルコースの取り込みを増強する。グルコースの取り込みを試験するための適切なインビトロアッセイは試験アッセイAである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、単球細胞株またはマクロファージにおけるLPS誘導性のTNF-α産生を阻害する。LPS誘導性のTNF-α産生の阻害を試験するための適切なインビトロアッセイは試験アッセイBである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、初代肝細胞において、インスリン媒介性のグルコースアウトプットの抑制を増強する。グルコース産生の減少を試験するための適切なインビトロアッセイは試験アッセイCである。筋肉細胞においてグルコースの取り込みを増強し、かつ単球細胞株またはマクロファージにおいてLPS誘導性のTNF-α産生を阻害するアディポネクチンポリペプチドフラグメントが好ましい。他の好ましいアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、筋肉細胞においてグルコースの取り込みを増強し、かつ初代肝細胞においてグルコース産生を減少させるものである。すべての試験モデル／アッセイにおいて、アディポネクチンポリペプチドが試験され、そしてアディポネクチンポリペプチドを受容しなかった対照群と比較されることが明白であるべきである。
本発明の結合体の第1の群
上記に言及したように、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。
上記に言及したように、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。
第2の局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分から本質的になる結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基は表面に露出しているアミノ酸残基である。
さらなる局面において、本発明は、配列番号：5または6から選択されるアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された一つの第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。
第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、アディポネクチンポリペプチドの表面に位置し、そして典型的には、溶媒に露出したその側鎖の25％より多く、例えば、溶媒に露出したその側鎖の50％より多くを有する。本発明者らは、球状ドメインにおけるこのような位置が、マウスACRP30の球状ドメインの結晶構造の三次元構造の分析に基づいて同定され得ると考えている。短報「The crystal structure of a complement-1q family protein suggets an evolutionary link to tumor necrosis factor」、Shapiroら、335-338を参照されたい。典型的には、球状ドメインおよびコラーゲンドメインにおいて、すべてのリジン残基は表面に露出している。表面に露出したアミノ酸残基は、本明細書中の実験セクションにおいて概略されるように同定された。
非ポリペプチド部分のための結合基を有する野生型分子においてすでに存在する、表面に露出したアミノ酸残基を使用することによって、変異を作製することが必要ではないが、しかし、結合体が生物学的活性を維持するならば、これは、作製され得る変異を除外しない。そして、それによって、例えば、耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または異脂肪血症の処置のためのその有用性、このような活性は、関連する動物モデル、例えばインスリン抵抗性および糖尿病のマウスモデル、例えば、db/dbまたはob/obマウスのようなマウスモデル、またはzuckerラットのようなラットモデルにおいて試験され得るか、あるいは、実験セクションにおいて記載される試験アッセイA、B、またはCのいずれか一つのような関連するインビトロアッセイにおいて試験され得る。
一つの実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、表面に露出したその側鎖の少なくとも25％、例えば少なくとも50％を有するアミノ酸残基である。特定の実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、表面に露出したその側鎖の100％を有するアミノ酸残基である。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。これらの位置の各々は実施態様とみなされており、そして請求項の主部を形成し得、さらに、これらの位置のいずれか一つは、本明細書以下の実施態様のいずれか一つと組み合わせられ得る。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
ヒトアディポネクチンの球状ドメイン中の表面に露出したアミノ酸の同定は、非ポリペプチド部分を結合するための所望の標的を選択することを可能にした。このような非ポリペプチド部分は、典型的には、ポリマー分子、親油性分子、または有機誘導体化剤から選択される。ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおける表面が露出したアミノ酸のいずれか一つに非ポリペプチド部分を結合させるための適切な方法は、当業者に周知である。ポリマー分子、親油性分子、または有機誘導体化剤から選択される非ポリペプチド部分を結合させる好ましい方法は、本明細書以後の、「本発明の結合体を調製する方法」のセクションにおいてより詳細に記載される。
アディポネクチンポリペプチドは、ヒトアディポネクチンの配列（108〜244）（配列番号：6において示される）において示されるような球状ドメインを有するべきである。結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は、配列番号：6に示されるアミノ酸配列、ならびにその類似体（フラグメントを含む）を有する球状ドメインを含む。言及したように、類似体、特に配列番号：6に示されるアミノ酸配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸残基が異なる類似体もまた含まれる。
従って、さらなる実施態様において、結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は球状ドメイン、好ましくは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインを含む。なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列から本質的になる。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11個、より好ましくは1〜8個の置換が、特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか一つ、ならびに、1〜11個の置換が、特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか一つ、ならびに、1〜11個の置換、例えば、1〜6個の置換が、特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。
特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換が、特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択され、そして、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つから選択される。代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、一つまたは複数、好ましくは1〜11個、より好ましくは1〜8個、例えば、1〜6個の置換において、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つと異なる配列から選択される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される少なくとも一つのリジン残基を含む。上記に言及したように、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において産生される場合、コラーゲンドメイン中のリジン残基は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。典型的には、リジン残基はヒドロキシル化およびグリコシル化される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくはK101位から選択される一つのリジン残基を含み、そして好ましくは、その位置はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくはK77位およびK101位から選択される2つのリジン残基を含み、そして好ましくは、それらの位置の両方はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくは、K68位、K77位およびK101位から選択される3つのリジン残基を含み、そして好ましくは、3つすべての位置がヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K68、グリコ−ヒドロキシ−K77、およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位から選択される4つのリジン残基を含み、そして好ましくは、4つすべての位置がヒドロキシル化およびグリコシル化される。
なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」に記載されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントの各々は、結合体のアディポネクチンポリペプチド部分として適切な実施態様と見なされる。
従って、本発明の結合体の好ましい局面の一つの例は、以下を含む結合体である：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、その球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換でアミノ酸配列が異なる配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるようなA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そして、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分、
ここで、このアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。上記に言及したように、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンと比較して、
のいずれか一つから、好ましくは、
のいずれか一つから選択される。しかし、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有する特定の好ましいアミノ酸残基は、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される。この点において、表面に露出したアミノ酸残基は、
のいずれか一つ、例えば、E120、E191、E206、E218、またはE220のいずれか一つから、あるいは、K134、K149、K169、K172、K177、K178、またはK180のいずれか一つから、あるいは、D144、D170、D179、D209、D227、D229、D231、またはD242のいずれか一つから選択され得る。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、その球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換でアミノ酸配列が異なる配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるようなA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そして、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分、
ここで、このアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基は表面に露出したアミノ酸残基である。上記に言及したように、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンと比較して、
第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有する表面に露出したアミノ酸残基が、球状ドメインもしくはコラーゲンドメインのいずれかに存在し得ること、あるいは、一つより多くの非ポリペプチド部分が結合している場合には、それらは、球状ドメインもしくはコラーゲンドメインに位置し得るか、または球状ドメインとコラーゲンドメインの両方に位置し得ることが明らかであることは当然である。
従って、さらなる実施態様において、結合基は球状ドメインに位置する。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、コラーゲンドメインをさらに含む。一つの実施態様において、結合基はコラーゲンドメインに位置する。一つのみの非ポリペプチドが結合するならば、これは、球状ドメインまたはコラーゲンドメインにおいてであり得る。一つより多く、例えば、2つの非ポリペプチドが結合するならば、一つはコラーゲンドメインにおいて、および一つが球状ドメインに位置し得、または両方がコラーゲンドメインにおいてであり得るか、または両方が球状ドメインにおいてであり得る。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは非相同ドメインを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはシグナルペプチドを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは単離されている。
さらなる実施態様において、一つのみの第1の非ポリペプチド部分がアディポネクチンポリペプチドに結合される。
さらなる実施態様において、本発明の結合体はモノPEG化される。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤から選択される。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子から選択される。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される。この点に関して、表面に露出したアミノ酸残基は、
のいずれか一つから選択され得る。典型的には、表面に露出したアミノ酸残基は、
のいずれか一つ、好ましくは、
のいずれか一つ、より好ましくは、E120、D144、K169、K178、D179、K180、E191、E206、E218、E220、D227、またはD229、特に、E120、K169、E191、E218、E220、D227、またはD229のいずれか一つから選択され得る。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分はポリマーであり、典型的には、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールである。このようなポリマーは、Shearwater、SunBio、Pierce、またはEnzonから市販されている。
さらなる実施態様において、ポリマーは、1kDa〜200kDa（kDaは周知の略号であり、キロダルトンを意味する）の分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、2kDa〜95kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、5kDa〜80kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、12kDa〜60kDa、例えば、5〜20kDa、12〜40kDa、20〜40kDa、5kDa、10kDa、12kDa、または20kDaの分子量を有する。
さらなる実施態様において、結合基を有するアミノ酸残基はリジン残基である。このようなリジン残基は、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、非相同性の、コラーゲンまたは球状ドメイン中に存在し得る。典型的には、球状ドメインに連結されたコラーゲンドメインの一部は、K65位、K68位、K77位、またはK101位である、1〜4個のリジン残基を含む。例えば、配列番号：3の配列はコラーゲンドメイン中に4つのリジン残基を有し、配列番号：4の配列はコラーゲンドメイン中に一つのリジンを有し、配列番号：5の配列はコラーゲンドメイン中に一つのリジンを有し、配列番号：10の配列はコラーゲンドメイン中に一つのリジンを有し、配列番号：11の配列はコラーゲンドメイン中に一つのリジンを有し、配列番号：12の配列はコラーゲンドメイン中に4つのリジンを有し、そして配列番号：13の配列はコラーゲンドメイン中に4つのリジンを有する。
結合基を有するアミノ酸残基として意図されるリジンが、アディポネクチンポリペプチドのコラーゲンドメインに位置される場合、そのリジンが、例えば哺乳動物細胞において産生されるならば、ヒドロキシル化およびグリコシル化され得るか、またはそのようないずれのグリコ−ヒドロキシ基をも含まないことがあり得る。リジンがヒドロキシル化およびグリコシル化されるならば、これは結合基としては好ましくないが、このようなグリコ−ヒドロキシ基は、例えば、mPEG-AMINEを使用することによって、PEGのようなポリマーに結合され得る。「第2の非ポリペプチド部分を含む本発明の結合体」のセクションもまた参照されたい。従って、アディポネクチンポリペプチドのコラーゲンドメインに位置するリジンが非ポリペプチドに結合体化されるべきであることが意図されるならば、このようなアディポネクチンポリペプチドは、細菌細胞、例えば、大腸菌において発現されるべきである。
さらなる実施態様において、リジンは、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される。
さらなる実施態様において、リジンは、ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つ、好ましくはK134位、K149位、K169位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される。
さらなる実施態様において、リジンは、ヒトアディポネクチンのK65位、K68位、K77位、K101位、K134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つ、好ましくはK134位、K149位、K169位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される。
典型的には、リジンは、ヒトアディポネクチンのK68位、K77位、K101位、K134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択されるが、しかし、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、当業者は、リジン残基がまた、ヒトアディポネクチンのK77位、K101位、K134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つ、特に、ヒトアディポネクチンのK101位、K134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つ、好ましくは、K134位、K149位、K169位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択され得ることを認識する。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド−PEG、mPEG-SPA、mPEG-SBA、PEG-SCM、mPEG-BTC（すべてShearwaterから市販されている）、およびSC-PEG（Enzonから市販されている）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、5k-PEG-SCM、12k-PEG-SCM、20k-PEG-SCM、5k-PEG-SPA、12k-PEG-SPA、20k-PEG-SPA（すべてShearwaterから市販されている）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、結合体は、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分、および有機誘導体化剤からなる群より選択される第2の非ポリペプチド部分をさらに含む。この第2の非ポリペプチド部分は、第1の非ポリペプチドとは異なる。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子から選択される。
さらなる実施態様において、上記の第2の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基から選択される。この点に関して、表面に露出したアミノ酸残基は、
のいずれか一つから選択され得る。典型的には、表面に露出したアミノ酸残基は、
のいずれか一つから、好ましくは、
のいずれか一つから、より好ましくは、E120、D144、K169、K178、D179、K180、E191、E206、E218、E220、D227、またはD229のいずれか一つから、特に、E120、K169、E191、E218、E220、D227、またはD229のいずれか一つから選択され得る。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つの除去されたリジン残基をさらに含む。
さらなる実施態様において、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基が除去される。
さらなる実施態様において、野生型ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される1〜6個のリジン残基が除去される。
このようなリジン残基は、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、コラーゲンドメインおよび／または球状ドメインから除去され得る。当業者は、そこから選択されるリジンの群が、全体のコラーゲンドメインまたはそのフラグメントのみがアディポネクチンポリペプチド中に存在しているのか否か、ならびに、従って、リジン残基の群が、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、もしくはK101位であり、および、ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか、または、より小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK77位もしくはK101位、および、球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか、または、さらにより小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK101位、および、球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか否かを理解する。明らかに、少なくとも一つのリジンが、リジンへの結合体化を可能にするために、アディポネクチンポリペプチド中に存在するべきである。
本発明の結合体の第2の群
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分から本質的になる結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
さらなる局面において、本発明は、配列番号：5または6から選択されるアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された一つの第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、このアディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
非ポリペプチド部分のためのスルフヒドリル結合基を有する野生型分子にすでに存在するシステイン残基を使用することによって、変異を作製する必要がなくなる。しかし、以下の条件で、変異が作製され得ることを除外するものではない：結合体が生物学的活性、および、それによって、例えば、耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または異脂肪血症を処置するためのその有用性を維持し、そのような活性が、関連する動物モデル（例えば、インスリン抵抗性および糖尿病のマウスモデル（例えば、db/dbもしくはob/obマウス）またはzuckerラットのようなラットモデル）において試験され得るか、あるいは、実験セクションにおいて記載されている試験アッセイA、B、またはCのいずれか一つのような、関連するインビトロアッセイにおいて試験され得る。野生型アディポネクチンポリペプチドは、2つのシステイン残基、すなわち、配列番号：1に対するC36位およびC152位を有する。
非ポリペプチド部分への結合体化のためのヒトアディポネクチンの球状ドメインにおける配列番号：1に対するC152の使用は明白な選択ではない。なぜなら、このシステインは、ヒトアディポネクチンの表面に露出したそのスルフヒドリル基（-SH）を有しないからである。「表面露出」の実験セクションを参照されたい。このような非ポリペプチド部分は、典型的には、ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される。ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおけるシステイン残基に非ポリペプチド部分を結合させるための適切な方法は、当業者に周知である。ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される非ポリペプチド部分を結合させる好ましい方法は、本発明以後の「本発明の結合体を調製する方法」のセクションにおいてより詳細に記載される。
アディポネクチンポリペプチドは、ヒトアディポネクチンの配列（108〜244）（配列番号：6に示される）に示されるような球状ドメインを有するべきである。結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は、配列番号：6に示されるアミノ酸配列、ならびにその類似体（フラグメントを含む）を有する球状ドメインを含む。言及されるように、類似体、特に、配列番号：6に示されるアミノ酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸残基が異なる類似体もまた含まれる。
従って、さらなる実施態様において、結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は、球状ドメイン、好ましくはコラーゲンドメインおよび球状ドメインを含む。なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列から本質的になる。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11個、例えば、1〜8個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか一つ、ならびに、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか、ならびに、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。
特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換において特定される配列のいずれか一つが異なる配列から選択され、かつK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、好ましくは3、10、12、または13から選択される。代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、一つまたは複数の置換、好ましくは、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、好ましくは3、10、12のいずれか一つと異なる配列から選択される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される少なくとも一つのリジン残基を含む。上記に言及したように、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞において産生される場合に、コラーゲンドメイン中のリジン残基は、ヒドロキル化およびグリコキシル化される。典型的には、リジン残基は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される一つのリジン残基、好ましくはK101位を含み、好ましくは、その位置はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される2つのリジン残基、好ましくはK77位およびK101位を含み、好ましくは、それらの位置の両方はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される3つのリジン残基、好ましくはK68位、K77位およびK101位を含み、好ましくは、それらの位置の3つすべてはヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K68、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位から選択される4つのリジン残基を含み、好ましくは、それらの位置の4つすべてはヒドロキシル化およびグリコシル化される。
なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」に記載されているアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントの各々は、結合体のアディポネクチンポリペプチド部分として適切な実施態様とみなされる。
従って、本発明の結合体の好ましい局面の一つの例は、以下を含む結合体である：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換においてアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分であって、ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1のポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換においてアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分であって、ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1のポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基はシステイン残基である。
さらなる実施態様において、そのシステインはヒトアディポネクチンの球状ドメインにおけるCys152である。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはコラーゲンドメインを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、非相同ドメインを含む。さらなる実施態様において、そのシステインはヒトアディポネクチンの非相同ドメインにおけるCys36である。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはシグナルペプチドを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは単離されている。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分のみがアディポネクチンポリペプチドに結合される。
さらなる実施態様において、本発明の結合体はモノPEG化されている。
さらなる実施態様において、一つの第1の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤から選択される。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分はポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、ポリマーは、1kDa〜200kDa（kDaは周知の略号であり、キロダルトンを意味する）の分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、2kDa〜95kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、5kDa〜80kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、12kDa〜60kDa、例えば、12〜40kDa、20〜40kDa、5kDa、10kDa、12kDa、または20kDaの分子量を有する。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、mPEG-ALDと組み合わせた、mPEG(MAL)、mPEG2(MAL)、mPEG-OPSS、PEG-ビニルスルホン、またはOPSS-PEG-ヒドラジドからなる群より選択される。さらなる実施態様において、ポリマー分子は、mPEG30kD-ALDと組み合わせた、5k-mPEG(MAL)、20k-mPEG(MAL)、40k-mPEG(MAL)、5k-mPEG-OPSS、10k-mPEG-OPSS、20k-mPEG-OPSS、OPSS-PEG2k-ヒドラジドからなる群より選択される。
さらなる実施態様において、結合体は、ポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤からなる群より選択される第2の非ポリペプチド部分をさらに含む。第2の非ポリペプチド部分は、第1の非ポリペプチドとは異なる。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子から選択される。
さらなる実施態様において、上記第2の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、またはシステイン残基から選択される。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つのリジン残基が除去されることをさらに含む。
さらなる実施態様において、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基が除去される。
さらなる実施態様において、野生型ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される1〜6個のリジン残基が除去される。
このようなリジン残基は、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、コラーゲンドメインおよび／または球状ドメインから除去され得る。当業者は、選択されるリジンの群が、全体のコラーゲンドメインまたはそのフラグメントのみがアディポネクチンポリペプチドに存在するか否かに依存し、従って、リジン残基の群が、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位、およびヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否か、あるいは、より小さな群で、例えば、コラーゲンドメインのK77位またはK101位、および球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否か、あるいは、なおより小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK101位、および球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否かに依存することを理解する。リジンに結合体化させることによって第2の非ポリペプチド部分を導入することが所望されるならば、明白に、一つのリジンへの結合体化を可能にするために、少なくとも一つのリジンがアディポネクチンポリペプチド中に存在するべきである。
本発明の結合体の第3の群
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そしてそのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そしてそのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分から本質的になる結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そしてそのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
非ポリペプチド部分のための結合基を有する野生型分子にすでに存在するN末端アミノ酸残基を使用することによって、変異を作製することは必要でないが、しかし、このことは、結合体が生物学的活性を維持するという条件で、変異が作製され得ることを除外せず、それによって、例えば、耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または異脂肪血症を処置するためのその有用性である、その活性は、関連する動物モデル（例えば、インスリン抵抗性および糖尿病のマウスモデル、例えば、db/dbマウスもしくはob/obマウス、またはzuckerラットのようなラットモデル）において試験され得、または、実験セクションにおいて記載される試験アッセイA、B、もしくはCのいずれか一つのようなインビトロアッセイにおける関連物において試験され得る。
このような非ポリペプチド部分は、典型的には、ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される。アディポネクチンポリペプチド中のN末端アミノ酸残基に非ポリペプチド部分を結合するための適切な方法は、当業者に周知である。ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される非ポリペプチド部分を結合する好ましい方法は、本明細書中以後の「本発明の結合体を調製する方法」のセクションにより詳細に記載されている。
アディポネクチンポリペプチドは、ヒトアディポネクチン（108〜244）（配列番号：6に示される）の配列に示されるような球状ドメインを有するべきである。結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は、配列番号：6に示されるアミノ酸配列を有する球状ドメイン、ならびに、その類似体（フラグメントを含む）を含む。言及したように、類似体、特に、配列番号：6に示されるアミノ酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸残基が異なる類似体が含まれる。
従って、さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメイン、好ましくはコラーゲンドメインおよび球状ドメインを含む。なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：12のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：4のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列から本質的になる。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11個、例えば、1〜8個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれ一つか、ならびに、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。
特定の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換において特定される配列のいずれか一つが異なる配列から選択され、かつK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つから選択される。代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、一つまたは複数の置換、好ましくは、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つと異なる配列から選択される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される少なくとも一つのリジン残基を含む。上記に言及したように、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞において産生される場合に、コラーゲンドメイン中のリジン残基は、ヒドロキル化およびグリコキシル化される。典型的には、リジン残基は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される一つのリジン残基、好ましくはK101位を含み、好ましくは、その位置はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される2つのリジン残基、好ましくはK77位およびK101位を含み、好ましくは、それらの位置の両方はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される3つのリジン残基、好ましくはK68位、K77位およびK101位を含み、好ましくは、それらの位置の3つすべてはヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K68、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、K65位、K68位、K77位、およびK101位から選択される4つのリジン残基を含み、好ましくは、それらの位置の4つすべてはヒドロキシル化およびグリコシル化される。
なおさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」に記載されているアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントの各々は、結合体のアディポネクチンポリペプチド部分として適切な実施態様とみなされる。
従って、本発明の結合体の好ましい局面の一つの例は、以下を含む結合体である：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換においてアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分であって、ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号：1に示されるようなA108位〜N244位のアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換においてアミノ酸配列が異なる配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されるリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分であって、ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはコラーゲンドメインを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、非相同ドメインを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは単離されている
さらなる実施態様において、一つの第1の非ポリペプチド部分のみがアディポネクチンポリペプチドに結合される。
さらなる実施態様において、本発明の結合体はモノPEG化されている。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤から選択される。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分はポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、ポリマーは、1kDa〜200kDa（kDaは周知の略号であり、キロダルトンを意味する）の分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、2kDa〜95kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、5kDa〜80kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、12kDa〜60kDa、例えば、5〜20kDa、12〜40kDa、20〜40kDa、5kDa、10kDa、12kDa、または20kDaの分子量を有する。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド−PEG、mPEG-SPA、mPEG-SBA、PEG-SCM、mPEG-OPSS、mPEG-BTC（すべてShearwaterから市販されている）、およびSC-PEGからなる群より選択される。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、5k-PEG-SCM、5k-mPEG-OPSS、10k-mPEG-OPSS、20k-mPEG-OPSS、12k-PEG-SCM、20k-PEG-SCM、5k-mPEG-ALD、20k-mPEG-ALD、30k-mPEG-ALD、および40k-mPEG2-ALD（すべてShearwaterから市販されている）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、結合体は、ポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤からなる群より選択される第2の非ポリペプチド部分をさらに含む。この第2の非ポリペプチド部分は、第1の非ポリペプチドとは異なる。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子から選択される。
さらなる実施態様において、上記第2の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、またはシステイン残基から選択される。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つのリジン残基が除去されることをさらに含む。
さらなる実施態様において、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基が除去される。
さらなる実施態様において、野生型ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される1〜6個のリジン残基が除去される。
このようなリジン残基は、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、コラーゲンドメインおよび／または球状ドメインから除去され得る。当業者は、選択されるリジンの群が、全体のコラーゲンドメインまたはそのフラグメントのみがアディポネクチンポリペプチドに存在するか否かに依存し、従って、リジン残基の群が、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位、およびヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否か、あるいは、より小さな群で、例えば、コラーゲンドメインのK77位またはK101位、および球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否か、あるいは、なおより小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK101位、および球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位であるか否かに依存する。リジンに結合体化させることによって第2の非ポリペプチド部分を導入することが所望されるならば、明白に、一つのリジンが、リジンへの結合体化を可能にするために、少なくとも一つのリジンがアディポネクチンポリペプチド中に存在するべきである。
本発明の結合体の第4の群
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入される。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入される。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分から本質的になる結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そしてそのアミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入される。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された一つの第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる配列番号：5または6から選択される位置に導入される。
もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置へのアミノ酸残基の導入は、新規なアディポネクチンポリペプチドをもたらすことは明らかである。このような新規なアディポネクチンポリペプチドもまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
従って、さらなる局面において、本発明は、第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含むアディポネクチンポリペプチドに関し、ここで、上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入される。
第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、アディポネクチンポリペプチドの表面に位置し、そして典型的には、溶媒に露出しているその側鎖の25％より多く、例えば、溶媒に露出しているその側鎖の50％より多くを有する。本発明者らは、球状ドメインにおけるそのような位置が、マウスACRP30の球状ドメインの結晶構造の三次元構造の分析に基づいて同定され得ると考える。短報「The crystal structure of a complement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumor necrosis factor」、Shapiroら、335-338頁を参照されたい。典型的には、球状ドメインおよびコラーゲンドメインにおいて、すべてのリジン残基は表面に露出している。表面に露出したアミノ酸残基は、本明細書中の実験セクションにおいて概説されるように同定されている。
もとのアディポネクチンポリペプチドにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置において非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を導入することによって、新規な分子が作製される。このような新規なアディポネクチンポリペプチドは、さらなる変異を含んでもよいし、または含まなくてもよい。しかし、このことは、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体が生物学的活性を維持するという条件で、変異が作製され得ることを除外せず、そしてそれによって、例えば、耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；または異脂肪血症を処置するためのその有用性である、そのような活性は、関連する動物モデル（例えば、インスリン抵抗性および糖尿病のマウスモデル、例えば、db/dbマウスもしくはob/obマウス、またはzuckerラットのようなラットモデル）において試験され得、または、実験セクションにおいて記載される試験アッセイA、B、もしくはCのいずれか一つのようなインビトロアッセイにおける関連物において試験され得る。
一つの実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、表面に露出したその側鎖の少なくとも25％、例えば少なくとも50％を有するアミノ酸残基である。特定の実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、表面に露出したその側鎖の100％を有するアミノ酸残基である。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
さらなる実施態様において、表面に露出したアミノ酸残基は、ヒトアディポネクチンの
から選択される。
表面に露出したアミノ酸残基として同定された上記の位置のいずれか一つは、第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基で置換され得、そしてそのようなアミノ酸残基は、典型的には、リジン、アルパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基から選択される。これらの位置の各々は、実施態様と見なされ、かつ、請求項の主部を形成し得、さらに、これらの位置のいずれか一つが、本明細書中以後の実施態様のいずれか一つと組み合わせられ得る。
ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおける表面に露出したアミノ酸の同定は、第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を導入し、そして引き続いて第1の非ポリペプチド部分を結合するための所望の標的を選択することを可能にした。このような非ポリペプチド部分は、典型的には、ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される。非ポリペプチド部分をヒトアディポネクチンの球状ドメインにおける表面に露出したアミノ酸のいずれか一つに結合させるための適切な方法は、当業者に周知である。ポリマー分子、親油性化合物、または有機誘導体化剤から選択される非ポリペプチド部分を結合するための好ましい方法は、本明細書中以後の「本発明の結合体を調製する方法」のセクションにより詳細に記載されている。
アディポネクチンポリペプチドは、ヒトアディポネクチンの配列（108〜244）（配列番号：6において示される）において示されるような球状ドメインを有するべきである。結合体のアディポネクチンポリペプチド部分は、配列番号：6に示されるアミノ酸配列、ならびにその類似体（フラグメントを含む）を有する球状ドメインを含む。言及したように、類似体、特に配列番号：6に示されるアミノ酸配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸残基が異なる類似体もまた含まれる。
従って、さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンポリペプチドは球状ドメイン、好ましくは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインを含む。なおさらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：10のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：11のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、そのアディポネクチンは、配列番号：12のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、そのアディポネクチンは、配列番号：13のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：6のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：5のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：4のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：3のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：2のアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、コラーゲンドメインおよび球状ドメインから本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：10のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：11のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：12のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：13のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：6のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：5のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：4のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：3のアミノ酸配列から本質的になる。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：2のアミノ酸配列から本質的になる。
典型的には、もとのアディポネクチンは、配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11個、例えば1〜8個の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、10、12、または13のいずれか一つ、ならびに、1〜11個の置換、例えば、1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換で特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択される。
特定の実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号： 3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、一つまたは複数の置換において特定される配列のいずれか一つと異なる配列から選択され、そして、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基を含む。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つから選択される。代替的な実施態様において、もとのアディポネクチンは、一つまたは複数の置換、好ましくは1〜11個の置換、より好ましくは1〜8個の置換、例えば、1〜6個の置換において、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13、好ましくは3、10、12、または13のいずれか一つと異なる配列から選択される。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される少なくとも一つのリジン残基を含む。上記に言及したように、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において産生される場合、コラーゲンドメイン中のリジン残基は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される。典型的には、リジン残基はヒドロキシル化およびグリコシル化される。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくはK101位から選択される一つのリジン残基を含み、そして好ましくは、その位置はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくはK77位およびK101位から選択される2つのリジン残基を含み、そして好ましくは、両方の位置はヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K77およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つ、好ましくは、K68位、K77位およびK101位から選択される3つのリジン残基を含み、そして好ましくは、3つすべての位置がヒドロキシル化およびグリコシル化される（例えば、グリコ−ヒドロキシ−K68、グリコ−ヒドロキシ−K77、およびグリコ−ヒドロキシ−K101）。さらなる実施態様において、もとのアディポネクチンは、K65位、K68位、K77位、またはK101位から選択される4つのリジン残基を含み、そして好ましくは、4つすべての位置がヒドロキシル化およびグリコシル化される。
なおさらなる実施態様において、もとのアディポネクチンポリペプチドは、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」に記載されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントの各々は、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体のいずれかにおいて、もとのアディポネクチンポリペプチド部分として適切な実施態様と見なされる。
従って、アディポネクチンポリペプチドの好ましい局面の一つの例は、第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、ここで、上記アミノ酸残基は、表面に露出したアミノ酸残基によって占められるもとのアディポネクチン中の位置に導入された。一つの実施態様において、もとのアディポネクチンは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、ここで球状ドメインが配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換のアミノ酸配列が異なる配列を含み、そしてコラーゲンドメインが配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そして上記コラーゲンドメインはヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含む。
さらに、本発明の結合体の好ましい局面の一つの例は、アディポネクチンポリペプチドフラグメント、およびアディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は、表面に露出したアミノ酸残基によって占められるもとのアディポネクチン中の位置に導入された。一つの実施態様において、もとのアディポネクチンは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、ここで球状ドメインが配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに、一つまたは複数の置換のアミノ酸配列が異なる配列を含み、そしてコラーゲンドメインが配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そして上記コラーゲンドメインはヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含む。
第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有する表面に露出したアミノ酸残基が、球状ドメインもしくはコラーゲンドメインのいずれかに導入され得ること、あるいは、一つより多くの非ポリペプチド部分が結合している場合には、それらは、球状ドメインもしくはコラーゲンドメインに導入され得るか、または球状ドメインとコラーゲンドメインの両方に導入され得ることが明らかであることは当然である。
従って、結合体またはアディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチドフラグメントのさらなる実施態様において、結合基を有する表面に露出したアミノ酸残基は球状ドメインに導入される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはコラーゲンドメインを含む。
さらなる実施態様において、結合基を有する表面に露出したアミノ酸残基はコラーゲンドメインに導入される。一つのみの第1の非ポリペプチドが結合するならば、これは、球状ドメインまたはコラーゲンドメインにおいてであり得る。一つより多く、例えば、2つの非ポリペプチドが結合するならば、一つはコラーゲンドメインに位置し得、および一つが球状ドメインに位置し得、または両方がコラーゲンドメインにおいてであり得、または両方が球状ドメインにおいてであり得る。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは非相同ドメインを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはシグナルペプチドを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは単離されている。
さらなる実施態様において、一つのみの第1の非ポリペプチド部分がアディポネクチンポリペプチドに結合される。
さらなる実施態様において、本発明の結合体はモノPEG化される。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステインから選択される。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基はグルタミン酸残基である。好ましいGlu変異は球状ドメインにおいて作製され、そして
のいずれか一つから選択され得る。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基はアスパラギン酸残基である。好ましいAsp変異は球状ドメインにおいて作製され、そして
のいずれか一つから選択され得る。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基はリジン残基である。好ましいLys変異は球状ドメインにおいて作製され、そして
のいずれか一つから選択され得る。
さらなる実施態様において、上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基はシステイン残基である。好ましいCys変異は球状ドメインにおいて作製され、そして
のいずれか一つから選択され得る。ヒトアディポネクチンに対してCys152（これは表面に露出していない）は好ましく維持され、その結果、アディポネクチンポリペプチドは球状ドメインに2つのシステインを含む。
上記のLys、Glu、Asp、またはCys変異は、結合体の一部として、アディポネクチンポリペプチドとしてのもとのアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つに導入され得、これは、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13の配列のいずれか一つのようなそのフラグメントを含むか、または上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントを含む。
本発明の非結合体化ポリペプチド部分を例証するために、いくつかの実施態様が以後本明細書で概説される。
典型的には、本明細書の実施態様は、
のいずれか一つ、例えば、T121C、S146C、またはT243Cから選択される変異を含むアディポネクチンポリペプチドに関する。好ましくは、アディポネクチンポリペプチドは、これらのシステイン変異の一つのみを含む。なぜなら、2つまたはそれ以上は、例えば、分子間および／または分子内のスルフ架橋が形成されることに起因して、発現の際に生成物の損失をもたらし得るからである。ヒトアディポネクチンと比較してCys152（これは表面に露出していない）は好ましく維持され、その結果、アディポネクチンポリペプチドは球状ドメインに2つまたはそれ以上のシステインを含み、これは、Cys152および一つまたは複数の導入されたシステインであり、好ましくは、一つの導入されたシステインおよび保存されたCys152である。
典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13の配列のいずれか一つ、あるいは上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。アディポネクチンポリペプチドの代表的な実施態様は、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52の配列のいずれか一つから選択される。
従って、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、
のいずれか一つから選択される変異を含む。このように、特定の変異の一つと組み合わせたこれらのアミノ酸配列の各々は本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部が形成され得る。典型的には、変異を含むアディポネクチンポリペプチドは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において産生され、従って、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つの配列は、ヒドロキシル化およびグリコシル化される、コラーゲンドメイン中のリジンを含む。あるいは、配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つの配列は、大腸菌のような細菌細胞において産生され、従って、ヒドロキシル化およびグリコシル化されない。例えば、一つの例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：17のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；別の例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：18のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：19のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：35のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：36のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：37のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：23のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：24のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：25のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：41のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：42のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：43のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：32のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：33のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：34のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：50のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：51のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：52のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含む；などである。好ましくは、球状ドメインに導入されたシステインを含む上記のアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において産生される。
さらに、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
から選択されるいずれか一つの変異を含む。従って、これらのアミノ酸配列の各々は、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載される実施態様を含み、特定の変異の一つと組み合わせて、本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。上記に言及したように、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、一つのみの導入されたCysを含むことが好ましい。しかし、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、生物学的活性が維持される限りは（上記に言及したように）、他の変異を含み得、これは、好ましくは11個までの置換が球状ドメイン中になされ得ることを意味する。例えば、一つの例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：17、23、26、29、または32の配列のいずれか一つである。別の例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：18、27、または33の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：19または28の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：35、41、44、47、または50の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：36、45、または51の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：37または46の配列のいずれか一つである。以下同様である。
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：17、23、26、29、または32の配列のいずれか一つである。別の例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：18、27、または33の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：19または28の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：35、41、44、47、または50の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：36、45、または51の配列のいずれか一つである。さらなる例において、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントに関し、
ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：37または46の配列のいずれか一つである。以下同様である。
また、上記に述べたように、上記のLys、Glu、Asp、またはCys変異は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13の配列のいずれか一つのようなそのフラグメントを含む結合体の一部としてのもとのアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つ、あるいは上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択されるアディポネクチンポリペプチドフラグメントに導入され得、これに関して、第1の非ポリペプチド部分は、上記の非ポリペプチド部分のための結合基を有する導入されたアミノ酸残基に結合される。
本発明のこの結合体部分を例証するために、いくつかの実施態様が以後本明細書で概説される。典型的には、本発明の実施態様は、
、例えば、T121C、S146C、またはT243Cのいずれか一つから選択される変異を含むアディポネクチンポリペプチド、および、導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体に関する。好ましくは、この結合体のアディポネクチンポリペプチドは、これらのシステイン変異の一つのみを含む。なぜなら、2つまたはそれ以上の変異は、例えば、分子間および／または分子内のスルフ架橋が形成されることにより、発現の際に生成物の損失をもたらし得るからである。典型的には、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13の配列のいずれか一つ、または、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択される。
従って、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、
のいずれか一つから選択される変異、および導入されたGlu残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、特定の変異の一つと組み合わせたこれらのアミノ酸配列の各々は本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。
さらに、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、
のいずれか一つから選択される変異、および導入されたAsp残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、特定の変異の一つと組み合わせたこれらのアミノ酸配列の各々は本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。
さらに、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、
のいずれか一つから選択される変異、および導入されたLys残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、特定の変異の一つと組み合わせたこれらのアミノ酸配列の各々は本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。
さらに、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、
のいずれか一つから選択される変異、および導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、特定の変異の一つと組み合わせたこれらのアミノ酸配列の各々は本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分の代表的な実施態様は、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52の配列のいずれか一つである。好ましくは、球状ドメインに導入されたシステインを含む上記のアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞、例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞において産生される。
例えば、一つの例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：17の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。別の例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：18の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：19の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：35の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：36の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：37の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N228Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：23の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：24の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：25の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：41の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：42の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：43の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N228Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：32の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：33の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：34の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：50の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：51の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。さらなる例において、本発明は、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cおよび導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む（例えば、配列番号：52の配列を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたシステイン残基N228Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体）。以下同様である。好ましくは、球状ドメインに導入された変異（例えばシステイン）を含む上記のアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞（例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞において産生される）において産生される。
さらに、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここでアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異、および
導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、結合体の一部としてのこれらのアミノ酸配列の各々は、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載される実施態様を含み、特定の変異の一つと組み合わせて、本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。上記に言及したように、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、一つのみの導入されたCysを含むこと、およびCys152が維持されることが好ましい。しかし、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、生物学的活性が維持される限りは（上記に言及したように）、他の変異を含み得、これは、好ましくは11個までの置換が球状ドメイン中になされ得ることを意味する。本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチドフラグメント部分の代表的な実施態様は、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52の配列のいずれか一つである。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここでアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
導入されたシステイン残基に共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む。従って、結合体の一部としてのこれらのアミノ酸配列の各々は、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載される実施態様を含み、特定の変異の一つと組み合わせて、本発明の実施態様を構成し、そして一つまたは複数の請求項の主部を形成し得る。上記に言及したように、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、一つのみの導入されたCysを含むこと、およびCys152が維持されることが好ましい。しかし、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、生物学的活性が維持される限りは（上記に言及したように）、他の変異を含み得、これは、好ましくは11個までの置換が球状ドメイン中になされ得ることを意味する。本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチドフラグメント部分の代表的な実施態様は、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52の配列のいずれか一つである。
例えば、一つの例において、本発明は以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
別の例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17、23、26、29、または32のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17、23、26、29、または32のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17または26のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17または26のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35、41、44、47、または50のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35、41、44、47、または50のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35または44のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35または44のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18、27、または33のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18、27、または33のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18または27のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18または27のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36、45、または51のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36、45、または51のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36または45のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36または45のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：19または28のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：19または28のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：37または46のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。以下同様である。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：37または46のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1の非ポリペプチド部分。以下同様である。
上記の第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有する導入されたアミノ酸残基（例えば、システイン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）に結合される第1の非ポリペプチド部分は、当業者に公知の方法によって、または本明細書中の「本発明の結合体を調製する方法」のセクションに示唆されるように導入され得る。従って、結合体が調製される場合、第1の非ポリペプチド部分のさらなる実施態様は、ポリマー、親油性化合物、および有機誘導体化剤から選択される。
さらなる実施態様において、第1の非ポリペプチド部分はポリマー、典型的には直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。このようなポリマーはShearwaterから市販されている。
特定の局面において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
別の例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17、23、26、29、または32のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17、23、26、29、または32のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17または26のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T121Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：17または26のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T121Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35、41、44、47、または50のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35、41、44、47、または50のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35または44のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：35または44のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N127Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18、27、または33のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18、27、または33のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18または27のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異S146Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：18または27のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基S146Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36、45、または51のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36、45、または51のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36または45のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N141Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：36または45のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N141Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：19または28のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異T243Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：19または28のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基T243Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。
さらなる例において、本発明は、以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：37または46のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N228Cに共有結合された第1のポリマー。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そして、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドは変異N228Cを含む；および
導入されたシステイン残基に共有結合した第1のポリマー。例えば、結合体は以下を含む：
配列番号：37または46のいずれか一つから選択される配列を有するアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む；および
導入されたシステイン残基N228Cに共有結合された第1のポリマー。
さらなる実施態様において、ポリマーまたは第1のポリマーは、1kDa〜200kDa（kDaは周知の略号であり、キロダルトンを意味する）の分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、2kDa〜95kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、5kDa〜80kDaの分子量を有する。なおさらなる実施態様において、ポリマーは、5または12kDa〜60kDa、例えば、5〜20kDa、12〜40kDa、20〜40kDa、5kDa、12kDa、または20kDaの分子量を有する。さらなる実施態様において、ポリマーまたは第1のポリマー分子は、mPEG-ALDと組み合わせた、mPEG(MAL)、mPEG2(MAL)、PEG-ビニルスルホン、mPEG-OPSS、またはOPSS-PEG-ヒドラジドからなる群より選択される。
例えば、PEGのようなポリマーを、導入されたCysに結合させるために、例えば、実施例に記載されているようなOPSSおよびVS化学が適切である。ポリマーを渇仰させるような、結合体を調製する適切な方法は、「本発明の結合体を調製する方法」のセクションに記載されている。
さらなる実施態様において、ポリマーまたは第1のポリマー分子は、mPEG30kD-ALDと組み合わせた、5k-mPEG(MAL)、5k-mPEG-OPSS、10k-mPEG-OPSS、20k-mPEG-OPSS、20k-mPEG(MAL)、40k-mPEG(MAL)、OPSS-PEG2k-ヒドラジドからなる群より選択される。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド−PEG、mPEG-SPA、mPEG-SBA、PEG-SCM、mPEG-BTC（すべてShearwaterから市販されている）、およびSC-PEGからなる群より選択される。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、5k-PEG-SCM、12k-PEG-SCM、20k-PEG-SCM、5k-PEG-SPA、12k-PEG-SPA、20k-PEG-SPA（すべてShearwaterから市販されている）からなる群より選択される。
アディポネクチンポリペプチド中のグリコシル化部位を導入することが所望される状況において、糖部分を結合させるために、このような糖部分が用語非ポリペプチド部分に含まれる。従って、本発明のこのような特定の局面は、アディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、そして糖部分は、アディポネクチンポリペプチドに共有結合され、ここで、そのアディポネクチンポリペプチドは、上記糖部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンが表面に露出したアミノ酸残基によって占められるような位置に導入された。さらに、もとのアディポネクチンが表面に露出したアミノ酸残基によって占められるような位置におけるアミノ酸残基の導入は新規なポリペプチドをもたらすので、次いで、なおさらなる本発明の局面は、糖部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含むアディポネクチンポリペプチドに関し、ここで、上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンが表面に露出したアミノ酸残基によって占められるような位置において導入された。さらに、グリコシル化部位の導入は、コラーゲン構造を妨害しないために、球状ドメインにおいて好ましく行われる。典型的には、表面に露出したアミノ酸残基は、配列番号：1に対して
から選択される。
表面に露出したアミノ酸残基として同定された上記の位置のいずれか一つは、糖部分のための結合基を有するアミノ酸残基で置換され得る。糖部分のための結合基は、N-またはO-グリコシル化部位から選択される。上記のように、N-グリコシル化部位はパターンN-X'-S/T/C-X''を有しなければならず、ここでX'およびX''は上記に定義した通りである。
従って、一つの実施態様において、結合基はO-グリコシル化部位から選択される。特に、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1に対して、
、好ましくは、
のいずれか一つから選択される変異を含む。T/SはTまたはSのいずれかを意味し、Tが好ましく、例えば、D242T/SはD242TまたはD242Sを意味し、ここでD242Tが好ましい。これらの変異の各々は、個々の実施態様を構成し、そして上記のアディポネクチンポリペプチドのいずれか一つ、例えば、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13の配列のいずれか一つ、または上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」に記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つと組み合わせて特許請求の範囲の主部であり得る。
さらに、特定の実施態様において、本発明は、以下を含む結合体に関する：アディポネクチンポリペプチドを含む結合体、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1に対して、
のいずれか一つから選択される変異を含む；および導入されたO-グリコシル化部位に共有結合した糖部分。さらに、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置におけるアミノ酸残基の導入は新規なポリペプチドをもたらすので、次いで、なおさらなる実施態様において、本発明は、配列番号：1に対して、
のいずれか一つから選択される変異（Tが好ましい）を含むアディポネクチンポリペプチドに関する。
従って、別の実施態様において、結合基はN-グリコシル化部位から選択される。特に、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1と比較して、
のいずれか一つから選択される変異、例えば、
、例えば、
を含む。これらの変異の各々は個々の実施態様を構成し、そして上記のアディポネクチンポリペプチド、例えば、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13のいずれか一つ、または、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つと組み合わせて、請求項の主部であり得る。
さらに、特定の実施態様において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1に対して、
のいずれか一つから選択される変異；および、導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分、を含む。さらに、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置でのN-グリコシル化部位の導入は新規なポリペプチドをもたらすので、次いで、なおさらなる実施態様において、本発明は、配列番号：1に対して、
のいずれか一つから選択される変異を含むアディポネクチンポリペプチドに関する。
典型的には、グリコシル部位が導入されるアディポネクチンポリペプチドが、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13の配列のいずれか一つ、または、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」において記載されたアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択され、このようなアディポネクチンポリペプチドは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において好ましく発現され、そしてこの点に関して、糖部分に結合体化される。このことを例証するために、いくつかの実施態様が本明細書以後に概説される。
従って、本発明は、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、もしくは13の配列のいずれか一つ、例えば、配列番号：10または配列番号：11から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関し、これは、配列番号：1に対して
のいずれか一つから選択される変異、例えば、
のいずれか一つから選択される変異、特に、
のいずれか一つから選択される変異、好ましくは、
のいずれか一つから選択される変異を含む。さらなる実施態様において、本発明は、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180T、例えば、Y111N、Y122N、R131N、D144N+S146T、H151N+N153T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む配列番号：10から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、Y111Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：53を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、Y122Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：54を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、R131Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：55を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、D144N+S146Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：56を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、H151N+N153Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：57を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、K178N+K180Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：58を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、P129Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：59を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、G145Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：60を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、P155Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：61を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180T、例えば、Y111N、Y122N、R131N、D144N+S146T、H151N+N153T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、Y111Nから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、Y122Nから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、R131Nから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、D144N+S146Tから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、H151N+N153Tから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。さらなる実施態様において、本発明は、K178N+K180Tから選択される変異を含む配列番号：11の配列から選択されるアディポネクチンポリペプチドに関する。
本明細書以後で、糖部分に結合体化されたか、または結合体化されていないかのいずれかのアディポネクチンポリペプチドにおけるN-グリコシル化部位の導入と組み合わせて、変異は、上記に言及したN-グリコシル化部位のいずれか一つから選択され得、そしてアディポネクチンポリペプチドは、上記に言及したアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれか一つから選択され得るが、しかし、例示の目的のために、アディポネクチンポリペプチドフラグメントおよびN-グリコシル化部位の小さな群のみが示される。
従って、本発明は、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択されるアディポネクチンポリペプチドに関し、ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含み、ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含む。
アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含み、ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含む。
さらに、本発明は、アディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1に対して、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、またはK178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む、配列番号：10の配列；および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を有する。さらなる実施態様において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドを含む結合体に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：1に対して、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、またはK178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異を含む、配列番号：11の配列；および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を有する。
さらに、本発明は以下を含む結合体に関する：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異；および導入されたN-グリコシル部位に共有結合した糖部分を含む。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、そしてコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180Tのいずれか一つから選択される変異；および導入されたN-グリコシル部位に共有結合した糖部分を含む。
糖部分は、当業者に公知の方法によって、または、本明細書中の「本発明の結合体を調製する方法」のセクションにおいて示唆されるように導入され得る。好ましくは、哺乳動物細胞株（例えば、CHO細胞、BHK細胞、またはHEK細胞）がアディポネクチンポリペプチドを発現するために使用される。
コラーゲンドメインがヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含む場合、これは、上記に詳細に説明したように、1、2、3、または4個のリジンを含み得る。
アディポネクチンポリペプチドは球状ドメイン中の一つより多い導入されたグリコシル化部位を含むように改変され得るが、4つより多いグリコシル化部位が導入されないという条件で、4つを超えないグリコシル化部位、すなわち、1〜4個のN-グリコシル化部位、または1〜4個のO-グリコシル化部位、またはそれらの混合物、例えば、一つのN-グリコシル化部位、2つのN-グリコシル化部位、3つのN-グリコシル化部位、4つのN-グリコシル化部位、3つのO-グリコシル化部位、4つのO-グリコシル化部位、または一つのN-グリコシル化部位および一つのO-グリコシル化部位、が導入されることが好ましい。より好ましい実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、少なくとも一つの導入されたN-グリコシル化部位、例えば、一つの導入されたN-グリコシル化部位を含む。アディポネクチンポリペプチドは、結合体化されていなくてもよく、または好ましくは、導入されたグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化部位に結合された糖部分と結合体化されてもよい。
アミノ酸残基（例えば、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、もしくはシステイン残基）に結合されたポリマー、または導入されたN-グリコシル化部位に結合された糖部分から典型的には選択される、第1の非ポリペプチド部分に加えて、アディポネクチンポリペプチドはまた、選択的に、第1のポリペプチド部分とは異なる第2の非ポリペプチド部分を含み得る。従って、例えば、第1の非ポリペプチド部分がポリマーであるならば、第2の非ポリペプチド部分は典型的には糖部分であり、または、第1の非ポリペプチド部分が糖部分であるならば、第2の非ポリペプチド部分は典型的にはポリマーである。
従って、さらなる実施態様において、結合体は、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分、および有機誘導体化剤からなる群より選択される第2の非ポリペプチド部分をさらに含む。第2の非ポリペプチド部分は、第1の非ポリペプチド部分とは異なるが、しかし、第1の非ポリペプチド部分と組み合わせて記載した上記の実施態様はまた、第2の非ポリペプチド部分のための実施態様と見なされる。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分はポリマー分子から選択される。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基は、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、またはシステイン残基、例えば、システイン残基から選択される。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、ポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールである。
さらなる実施態様において、第2の非ポリペプチド部分は、結合基として糖部分を有するポリマー分子である。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、mPEG-AMINE（Shearwaterから市販されている）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、ポリマー分子は、5k-mPEG-AMINE（Shearwaterから市販されている）からなる群より選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つの除去されたリジン残基をさらに含む。
さらなる実施態様において、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される1〜4個のリジン残基が除去される。
さらなる実施態様において、野生型ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、またはK180位のいずれか一つから選択される1〜6個のリジン残基が除去される。
このようなリジン残基は、アディポネクチンポリペプチドの長さに依存して、コラーゲンドメインおよび／または球状ドメインから除去される。当業者は、そこから選択されるリジンの群が、全体のコラーゲンドメインまたはそのフラグメントのみがアディポネクチンポリペプチド中に存在しているのか否か、ならびに、従って、リジン残基の群が、ヒトアディポネクチンのコラーゲンドメインのK65位、K68位、K77位、もしくはK101位であり、および、ヒトアディポネクチンの球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか、または、より小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK77位もしくはK101位、および、球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか、または、さらにより小さな群、例えば、コラーゲンドメインのK101位、および、球状ドメインのK134位、K149位、K169位、K172位、K177位、K178位、もしくはK180位であるか否かを理解する。それをリジンに結合体化させることによって第2の非ポリペプチド部分を導入することが所望されるならば、リジンへの結合体化を可能にするために少なくとも一つのリジンがアディポネクチンポリペプチド中に存在するべきである。
カルシウム組成物の局面
本発明者らは、カルシウムイオンがアディポネクチンポリペプチドにとって安定なトリマーを形成するために決定的であること、およびこのようなカルシウムイオンの除去がトリマー構造の不安定化をもたらすことを示した。マグネシウムイオンおよび亜鉛イオンのような他の二価カチオンでは何の効果も見られ得なかった。トリマー構造の不安定化は、ネイティブゲルにおいて示されるような不均一な組成物をもたらす。不安定化されたトリマー構造を有したアディポネクチンの液体溶液へのカルシウムイオンの付加は、安定なトリマー構造の回復をもたらす。特に、本発明者らは、カルシウムイオンの非存在下でpHを下げることがトリマー構造を不安定化させること、およびカルシウムイオンの付加が安定なトリマーをもたらすことを示した。安定なトリマー構造は、種々のインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて試験され得る生物学的活性を有し、このようなインビボモデルは、インスリン感受性または肥満症を試験するために認められたマウスモデルの一つであり得る。本発明者らの、ヒトアディポネクチンフラグメント（apM1（82〜244））の構造の分析から、ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおいて、配列番号：1に対するD187およびD195がカルシウムイオンの結合に関与していること、およびこれらの位置の一つまたは両方の変異がカルシウムイオンに対するアフィニティーの減少を生じることが明らかとなった。さらに、H163もまた、カルシウム結合のために重要であると考えられている。従って、カルシウム結合を維持するために、配列番号：1に対してD187およびD195を維持することが好ましく、ならびに、より好ましくは、D187、D195、およびH163が維持されるべきである。
本発明者らは、カルシウムイオンがアディポネクチンポリペプチドにとって安定なトリマーを形成するために決定的であること、およびこのようなカルシウムイオンの除去がトリマー構造の不安定化をもたらすことを示した。マグネシウムイオンおよび亜鉛イオンのような他の二価カチオンでは何の効果も見られ得なかった。トリマー構造の不安定化は、ネイティブゲルにおいて示されるような不均一な組成物をもたらす。不安定化されたトリマー構造を有したアディポネクチンの液体溶液へのカルシウムイオンの付加は、安定なトリマー構造の回復をもたらす。特に、本発明者らは、カルシウムイオンの非存在下でpHを下げることがトリマー構造を不安定化させること、およびカルシウムイオンの付加が安定なトリマーをもたらすことを示した。安定なトリマー構造は、種々のインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて試験され得る生物学的活性を有し、このようなインビボモデルは、インスリン感受性または肥満症を試験するために認められたマウスモデルの一つであり得る。本発明者らの、ヒトアディポネクチンフラグメント（apM1（82〜244））の構造の分析から、ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおいて、配列番号：1に対するD187およびD195がカルシウムイオンの結合に関与していること、およびこれらの位置の一つまたは両方の変異がカルシウムイオンに対するアフィニティーの減少を生じることが明らかとなった。さらに、H163もまた、カルシウム結合のために重要であると考えられている。従って、カルシウム結合を維持するために、配列番号：1に対してD187およびD195を維持することが好ましく、ならびに、より好ましくは、D187、D195、およびH163が維持されるべきである。
生物学的活性を試験する代表的な方法は、実験のセクションに記載される試験アッセイA、B、またはCにある。アディポネクチンポリペプチドトリマーは、通常、3つの同一のモノマーからなるが、しかし、そのトリマーはまた不均一であり得、例えば、2つのモノマーが同じで第3のモノマーが異なり得るか、または3つすべてのモノマーが異なり得る。その違いは、一つまたは2つのモノマーが他のモノマーとは異なるアミノ酸配列を有することである。別の違いは糖部分にあり得、例えば、各アディポネクチンポリペプチドモノマー上のコラーゲン性ドメインにおける異なるヒドロキシ−グリコシル化にある。個々のモノマーが同一であるが異なる糖部分が結合している場合、これは、用語「ホモトリマー」の範囲内に含まれることが意図される。アディポネクチンポリペプチドトリマーが3つの同一のモノマーからなる場合、これは3つの同一のアミノ酸配列であり。これはホモトリマーといわれる。さらなる実施態様において、トリマーはヘテロトリマーである。さらなる実施態様において、トリマーはホモトリマーである。
このように、カルシウムイオンはアディポネクチンポリペプチドトリマーを安定化し、そしてこの密接な集合は本明細書中で複合体といわれる。
従って、広範な局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチド、およびb）カルシウムイオンを含む単離された複合体に関する。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオンを含む単離された複合体に関する。
上記の局面の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、哺乳動物宿主細胞から発現および回収される。好ましい宿主細胞は、CHO細胞、BHK細胞、またはHEK細胞、特に、CHO-K1細胞およびHEK293細胞である。
上記の局面のさらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは酵母細胞から発現および回収される。
上記の局面の代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは細菌細胞から発現および回収される。細菌宿主細胞の例には、バチルス株（例えば、B.brevisもしくはB.subtilis）、シュードモナス株、またはストレプトマイセス株のようなグラム陽性細菌、あるいは大腸菌株のようなグラム陰性細菌が含まれる。代表的な実施態様は、大腸菌宿主細胞である。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが哺乳動物宿主細胞から発現および回収されるという条件で、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが細菌宿主細胞から発現および回収されるという条件で、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体に関する。
従って、a）の群は、一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドから選択され得るか、または別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体から選択され得る。
特に、ヒトアディポネクチン（apM1）およびそのフラグメント、ならびにその類似体、例えば、apM1（配列番号：6に示される）の球状ドメインと少なくとも80％の同一性を有する球状ドメインを含み、そして選択的にコラーゲンドメインまたはそのフラグメントを含むアディポネクチンポリペプチドがアディポネクチンポリペプチドの好ましい実施態様である。
一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、全長acrp30ではない。別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはacrp30フラグメント（104〜247）ではない。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、acrp30フラグメントではない。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはヒト全長アディポネクチンではない。ヒト全長アディポネクチンは、ヒト血漿から精製され得るか、または大腸菌細胞から組換え的に産生され得る。
安定なアディポネクチンポリペプチドはトリマーであり、ここでこのトリマーは3つのモノマーからなる。従って、さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドはトリマー（アディポネクチンポリペプチドトリマー）である。典型的には、このトリマーはホモトリマーである。しかし、このトリマーはヘテロトリマーでもあり得る。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体を含む液体組成物に関する。
さらなる局面において、本発明は、単離された複合体を含む液体組成物に関し、ここでこの複合体は、a）アディポネクチンポリペプチド、およびb）カルシウムイオンを含む。
さらなる局面において、本発明は、単離された複合体を含む液体組成物に関し、ここでこの複合体は、a）アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオンを含む。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが哺乳動物宿主細胞から発現および回収されるという条件で、単離された複合体を含む液体組成物に関し、ここでこの複合体は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオンを含む。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが細菌宿主細胞から発現および回収されるという条件で、単離された複合体を含む液体組成物に関し、ここでこの複合体は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオンを含む。
この液体組成物は溶液または懸濁液であり得、そして緩衝剤を含み得る。しかし、液体溶液が好ましい。従って、一つの実施態様において、この液体組成物は液体溶液、例えば水性溶液である。さらなる実施態様において、この液体組成物、例えば、液体溶液は緩衝剤を含む。この緩衝剤は、「本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドの薬学的組成物および使用」のセクションにおいて以下に言及されるもののいずれか一つのような任意の適切な緩衝剤であり得るが、しかし、リン酸緩衝液が使用されるならば、pHは低くなりすぎないようにするべきであり、好ましくは4より上、例えば、5より上、なおより好ましくは6より上であるということに注意が払われるべきである。しかし、カルシウムイオンが組成物に加えられるならば、トリマー構造は広いpH範囲、例えば、pH 2〜10、好ましくは3〜9で安定である。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、b）カルシウムイオン、ならびにc）薬学的に許容される担体、を含む薬学的組成物に関する。一つの実施態様において、このような薬学的組成物は、液体組成物、例えば、液体溶液である。さらなる実施態様において、この薬学的組成物は、緩衝剤がリン酸緩衝液でないという条件で、緩衝剤を含み、かつ2〜10のpHを有する。別の実施態様において、この薬学的組成物は、緩衝剤を含み、4〜10のpH、例えば、5〜10、好ましくは6〜9のpHを有する。さらなる実施態様において、この薬学的組成物は、緩衝剤を含み、そして2〜10、例えば3〜9のpH、およびカルシウムイオンを有する。典型的には、アディポネクチンポリペプチドと比較してモル濃度過剰のカルシウムイオンがこの組成物中に存在する。
アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体を含む単離された複合体を調製するためのカルシウムイオンの使用は、アディポネクチンポリペプチドの安定なトリマーを提供し、ここで、その複合体は生物学的活性を有する。典型的には、このような生物学的活性は、実験のセクションにおいて記載される試験アッセイ、すなわち、試験アッセイ：C2C12細胞におけるグルコースの取り込みに対するアディポネクチンの効果の測定；または、試験アッセイ：LPS-誘導性TNF-α産生の阻害の測定のいずれか一つにおいて測定され得る。さらに、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体のトリマー構造を安定化させるためのカルシウムイオンの効果は、カルシウムイオンの非存在下または存在下における緩衝剤を含むリン酸のpHを減少させることによって試験され得る。
従って、さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体を含む単離された複合体を調製するためのカルシウムイオンの使用に関し、ここで、この複合体は、LPS-誘導性TNF-α産生を阻害することができるか、または筋肉細胞におけるグルコースの取り込みを増強することができる。好ましくは、この複合体は、特に実験のセクションにおいて記載されるように、筋肉細胞におけるグルコースの取り込みを増強することができる。
アディポネクチンポリペプチドは、以下のセクション「本発明の使用のためのアディポネクチンポリペプチドを調製する方法」において記載されるように調製され得る。さらに、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体が、以下のセクション「本発明の結合体を調製する方法」において記載されるように調製され得る。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが哺乳動物宿主細胞から発現および回収されるという条件で、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体を調製する方法に関し、この方法は、カルシウムイオンをアディポネクチンポリペプチドと接触させる段階、および選択的に、アディポネクチンを第1の非ポリペプチド部分と反応させる段階を包含する。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチドが細菌宿主細胞から発現および回収されるという条件で、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体を調製する方法に関し、この方法は、カルシウムイオンをアディポネクチンポリペプチドと接触させる段階、および選択的に、アディポネクチンを第1の非ポリペプチド部分と反応させる段階を包含する。
カルシウムイオンが、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体の調製の間に、例えば、使用した培養培地（例えば、DMEM/F-12（1:1）培地カタログ番号21041（Invitrogen））もしくは懸濁液において、細胞において、存在すること、また、調製物に付加されること（例えば、塩化カルシウム（CaCl2）の形態で）を確認することによって、安定なトリマーが得られる。実際、宿主細胞の培養の間、カルシウムイオンの存在は安定なトリマーを供給する。このような安定性はネイティブゲルで確認され得る。好ましくは、カルシウムを含む培地が使用される（例えば、DMEM/F-12(1:1)カタログ番号21041（Invitrogen））。しかし、カルシウムを含まない培地でも使用され得る（例えば、DMEMカタログ番号21068）。この場合、カルシウムが調製物に好ましく付加される。
従って、さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドを発現する哺乳動物宿主細胞、およびb）カルシウムイオン、を含む培養物に関する。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドを発現する細菌宿主細胞、およびb）カルシウムイオン、を含む培養物に関する。
さらなる局面において、本発明は、a）アディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにb）カルシウムイオン、を含む単離された複合体を調製する方法に関し、この方法は、段階d）、e）、またはf）のいずれか一つがカルシウムイオン豊富な環境において実行されるという条件で、以下の段階を包含する：
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、
e）複合体を回収する段階、および選択的に、
f）アディポネクチンポリペプチドを、それが結合体化される分子と、結合体化の発生を誘導する条件下で反応させ、そして結合体を回収する段階。
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、
e）複合体を回収する段階、および選択的に、
f）アディポネクチンポリペプチドを、それが結合体化される分子と、結合体化の発生を誘導する条件下で反応させ、そして結合体を回収する段階。
用語「カルシウム豊富な環境」は、カルシウムイオン（好ましくは、アディポネクチンポリペプチドに対してモル濃度過剰）がアディポネクチンポリペプチドの調製の間に存在し、そして特に、段階d）、e）、またはf）のいずれかの間に、例えば、使用される培養培地または懸濁液において存在するか、あるいは段階d）、e）、またはf）の間に付加される（例えば、塩化カルシウム（CaCl2）の形態で）ことを意味することを意図する。
上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」、「本発明の結合体の第1の群」、「本発明の結合体の第2の群」、「本発明の結合体の第3の群」、および「本発明の結合体の第4の群」に言及される、アディポネクチンポリペプチドならびにアディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体の特定の実施態様もまた、この本発明のカルシウム組成物の局面に適用される。さらに、非ポリペプチドがポリマーである場合、ポリマーに関連する上記のセクションにおいて言及される実施態様もまた、アディポネクチンポリペプチドに結合したポリマーに適用される。従って、以下に記載した実施態様は、いかなる場合においても本発明のこの特定の局面を限定することとして見られるべきではない。
従って、上記に言及したカルシウム組成物の局面のいずれか一つの局面において、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体は、以下の実施態様から選択され得る。
一つの実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つ、および配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つと少なくとも80％の同一性を有する配列から選択される。典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5、10、11、12、または13のいずれか一つ、および配列番号：5、10、11、12、または13のいずれか一つと少なくとも80％の同一性を有する配列から選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つ、および配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つと少なくとも90％の同一性を有する配列から選択される。典型的には、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つ、および配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つと少なくとも90％の同一性を有する配列から選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つ、および配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つと少なくとも92％の同一性を有する配列から選択される。上記に言うような同一性パーセントは、CLUSTALWプログラムを使用して決定される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：2〜8、10〜12、または13のいずれか一つから選択される。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは配列番号：5である。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは配列番号：10である。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは配列番号：11である。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは配列番号：12である。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは配列番号：13から選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換のアミノ酸配列と異なる配列を含み、そして
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む。
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列、ならびに一つまたは複数の置換のアミノ酸配列と異なる配列を含み、そして
ここで、コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるようなK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：17のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；別の実施態様において、本発明は、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドに関し、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：18のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：19のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：35のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：36のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：10から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：37のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：23のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：24のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：25のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：41のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：42のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：5から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：43のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T121C（例えば、配列番号：32のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異S146C（例えば、配列番号：33のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異T243C（例えば、配列番号：34のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N127C（例えば、配列番号：50のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N141C（例えば、配列番号：51のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含み；さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：13から選択されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチドから選択され、ここでそのアディポネクチンポリペプチドは変異N228C（例えば、配列番号：52のアミノ酸配列を有するアディポネクチンポリペプチド）を含む。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異を含む。
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：17、23、26、29、または32の配列のいずれか一つである。別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：18、27、または33の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：19または28の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：35、41、44、47、または50の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：36、45、または51の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：37または46の配列のいずれか一つである。
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T121Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：17、23、26、29、または32の配列のいずれか一つである。別の実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異S146Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：18、27、または33の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異T243Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：19または28の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N127Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：35、41、44、47、または50の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N141Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：36、45、または51の配列のいずれか一つである。さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、
ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から、配列番号：1に示されるD79位に対応するアミノ酸29までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、そしてアディポネクチンポリペプチドフラグメントは変異N228Cを含む。このようなアディポネクチンポリペプチドフラグメントの例は、配列番号：37または46の配列のいずれか一つである。
アディポネクチンポリペプチドが結合体、すなわち、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体の一部である場合、第1の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分、および有機誘導体化剤から選択される。
第1の非ポリペプチド部分は、上記のセクション「本発明の結合体の第1の群」、「本発明の結合体の第2の群」、および「本発明の結合体の第3の群」において記載されるように、アディポネクチンポリペプチドにおいて天然に存在するものの一つであるアミノ酸に結合され得るか、または上記のセクション「本発明の結合体の第4の群」において記載されるように、導入されたアミノ酸に結合され得る。
アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびにカルシウムイオンを含む複合体の結合体部分をさらに例証するために、いくつかの非網羅的な実施態様が以下に開示される。
一つの実施態様において、結合体は以下を含む：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異を含む；ならびに
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分はポリマーであり、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
導入されたシステイン残基に共有結合した第1の非ポリペプチド部分。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分はポリマーであり、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
別の実施態様において、結合体は以下を含む：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異を含む；ならびに
導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分。さらなる特定の結合体は、Y111Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：53を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、Y122Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：54を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、R131Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：55を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、D144N+S146Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：56を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、H151N+N153Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：57を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、K178N+K180Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：58を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、P129Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：59を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、G145Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：60を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、P155Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：61を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、
アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分。さらなる特定の結合体は、Y111Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：53を有するアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、Y122Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：54を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、R131Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：55を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、D144N+S146Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：56を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、H151N+N153Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：57を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、K178N+K180Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：58を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、P129Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：59を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、G145Nから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：60を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。さらなる実施態様において、結合体は、P155Tから選択される変異を含む配列番号：10の配列、例えば、配列番号：61を有するアディポネクチンポリペプチドから選択されるアディポネクチンポリペプチド、および導入されたN-グリコシル化部位に共有結合した糖部分を含む。
さらなる実施態様において、結合体は以下を含む：
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、そのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分はポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメント、ここで、球状ドメインは、配列番号1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、そしてコラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるA52位に対応するアミノ酸56までを含み、ここでコラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含み、ならびに
アディポネクチンポリペプチドフラグメントに共有結合された第1の非ポリペプチド部分、
ここで、アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、そして、そのアミノ酸残基はN末端アミノ酸残基である。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分はポリマー、典型的には、直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールである。
アディポネクチンポリペプチドフラグメントのさらに好ましい実施態様は、配列番号：2、3、4、5、6、10、11、12、13、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、または61から選択される配列のいずれか一つである。これらの配列もまた、結合体の一部である場合に好ましい実施態様である。
本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントのPEG化の間、カルシウムイオンの存在下で、結合体を産生するために、本発明者らは、トリマーを破壊することなしに、ポリペプチドのトリマーに一つのPEG分子を導入することが可能であったこと、および少なくとも部分的に生物学的活性が維持されていたことを発見した。PEG分子は、アディポネクチンポリペプチドモノマーの一つのN末端残基に結合された。このように産生したトリマーは1分子のPEGを含む。さらに、本発明者らは、実施例11に示されるように、2つおよび3つのPEGをポリペプチドのトリマーに導入することに成功した。
従って、さらなる実施態様において、結合体は、アディポネクチンポリペプチドトリマー、およびアディポネクチンポリペプチドトリマーに共有結合した一つのポリマーを含む。
さらなる実施態様において、結合体は以下からなる：
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが一つのみのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した一つのポリマー。
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが一つのみのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した一つのポリマー。
なおさらなる実施態様において、結合体はアディポネクチンポリペプチドトリマー、およびアディポネクチンポリペプチドトリマーに共有結合した2つのポリマーを含む。
さらなる実施態様において、結合体は以下からなる：
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが2つのみのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した2つのポリマー。
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが2つのみのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した2つのポリマー。
さらなる実施態様において、結合体はアディポネクチンポリペプチドトリマー、およびアディポネクチンポリペプチドトリマーに共有結合した3つのポリマーを含む。
さらなる実施態様において、結合体は以下からなる：
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが3つのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した3つのポリマー。
a）アディポネクチンポリペプチドトリマー、ここで、アディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含む、および
b）アディポネクチンポリペプチドトリマーが3つのポリマーを含むような様式で、アディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーのいずれか一つに共有結合した3つのポリマー。
この実施態様はトリマー性アディポネクチンポリペプチドに関するにも関わらず、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」、「本発明の結合体の第1の群」、「本発明の結合体の第2の群」、「本発明の結合体の第3の群」、および「本発明の結合体の第4の群」に言及される特定の実施態様もまた、本発明のトリマーの実施態様に適用され、例えば、アディポネクチンポリペプチドとともに言及される実施態様もまた、トリマーの一部としてのアディポネクチンポリペプチドモノマーに適用されることが意図される。さらに、非ポリペプチドがポリマーである場合、ポリマーに関連する上記のセクションにおいて言及される実施態様もまた、アディポネクチンポリペプチドトリマーに結合した1、2、または3個のポリマーに適用される。従って、以下に記載した実施態様は、いかなる場合においても本発明のこの特定の局面を限定することとして見られるべきではない。
上記のセクション「本発明の結合体の第1の群」、「本発明の結合体の第2の群」、および「本発明の結合体の第3の群」において記載される場合、さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドモノマーは、ポリマーのための結合基を有するアミノ酸残基を含む。このようなアミノ酸残基は、ポリマー結合体化のために適切な任意のアミノ酸残基、好ましくは、リジン、システイン、またはN末端残基から選択されるアミノ酸残基であり得る。さらなる実施態様において、ポリマーのための結合基を有するアミノ酸残基はN末端残基から選択される。
さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドモノマーは、配列番号：1〜8、10〜12、または13、例えば、配列番号：2、3、4、5、6、10、11、12、または13、特に、配列番号：10、11、12、または13のいずれか一つから選択される。
上記のセクション「本発明の結合体の第4の群」において記載される場合、さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドモノマーは、ポリマーのための結合基を有するアミノ酸残基を含み、ここで、上記アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて、表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入され、このような導入されたアミノ酸は、典型的には、C、K、D、またはE、好ましくはCから選択される。
従って、さらなる実施態様において、アディポネクチンポリペプチドモノマーは、配列番号：17〜52、例えば、17、18、19、35、36、または37のいずれか一つから選択される。この点に関して、ポリマーが、導入されたシステインに結合される。
1、2、または3個のポリマーがトリマーに結合される場合、このようなポリマーはポリエチレングリコールから選択されることが好ましい。従って、さらなる実施態様において、このポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールを含む。さらなる実施態様において、このポリマーはポリエチレングリコール、例えば、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールである。
なおさらなる実施態様において、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）は、1kDa〜200kDaの分子量、例えば、1kDa〜20kDa、例えば、5 kDa 〜20kDa、例えば、5kDa、10kDa、または20kDaの分子量を有する。
本発明の結合体を含む組成物は、「本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの薬学的組成物および使用」のセクションにおいて以下で言及されるもののいずれか一つのような任意の適切な組成物であり得る。従って、その組成物は、種々の形態（例えば、液体組成物または固体組成物）で処方され得る。用語「液体」は水性を含むことが意図される。
さらなる実施態様において、その組成物は液体組成物から選択される。
さらなる実施態様において、液体組成物は、溶液または懸濁液（例えば、水性溶液）である。
本発明の上記の結合体のいずれか一つのさらなる実施態様
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することによって、分子を、選択の非ポリペプチド部分への結合体化により感受性にするためにポリペプチドを特異的に適用して、結合体化のパターンを最適化すること（例えば、アディポネクチンポリペプチドの表面での非ポリペプチド部分の最適な分布を確実にし、それによって、例えば、エピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を、その機能を有意に損なうことなく効果的に遮蔽すること）が可能である。例えば、結合基の導入によって、アディポネクチンポリペプチドは、関連する非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の含量において強化されるか、またはさもなくば変化され、それによって、より効率的、特異的、および／または広範囲な結合体化が達成される。一つまたは複数の結合基の除去によって、ポリペプチドの部分における非ポリペプチド部分への結合体化を回避することができ、ここで、例えば、ポリペプチドの機能的部位に、または機能的部位の近傍に位置するアミノ酸残基へのこのような結合体化は不利である（なぜなら、このような部位における結合体化は、レセプター認識の障害に起因して、得られる結合体の不活性化または活性の減少を生じ得るからである）。さらに、このような基への不均一な結合体化を避けるために、別の結合基に近接して位置する結合基を除去することが有利であり得る。
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することによって、分子を、選択の非ポリペプチド部分への結合体化により感受性にするためにポリペプチドを特異的に適用して、結合体化のパターンを最適化すること（例えば、アディポネクチンポリペプチドの表面での非ポリペプチド部分の最適な分布を確実にし、それによって、例えば、エピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を、その機能を有意に損なうことなく効果的に遮蔽すること）が可能である。例えば、結合基の導入によって、アディポネクチンポリペプチドは、関連する非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の含量において強化されるか、またはさもなくば変化され、それによって、より効率的、特異的、および／または広範囲な結合体化が達成される。一つまたは複数の結合基の除去によって、ポリペプチドの部分における非ポリペプチド部分への結合体化を回避することができ、ここで、例えば、ポリペプチドの機能的部位に、または機能的部位の近傍に位置するアミノ酸残基へのこのような結合体化は不利である（なぜなら、このような部位における結合体化は、レセプター認識の障害に起因して、得られる結合体の不活性化または活性の減少を生じ得るからである）。さらに、このような基への不均一な結合体化を避けるために、別の結合基に近接して位置する結合基を除去することが有利であり得る。
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基は、それが除去されるかまたは導入されるのいずれかで、非ポリペプチド部分の性質に基づいて、および大部分の場合において、使用される結合体化方法に基づいて選択されることが理解される。例えば、非ポリペプチド部分がポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイド誘導体化分子）である場合、結合基として機能し得るアミノ酸残基は、リジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンからなる群より選択され得る。非ポリペプチド部分が糖部分である場合、結合基はインビボグリコシル化部位、好ましくはN-グリコシル化部位である。
代替的に、または、さらに、修飾される位置は、アディポネクチンタンパク質配列ファミリーの分析に基づいて同定される。より詳細には、修飾される位置は、もとのアディポネクチン以外の一つまたは複数のファミリーのメンバーにおいて、関連する結合基を含むアミノ酸残基によって占められるものであり得るか（このようなアミノ酸残基が導入される場合）、またはもとのアディポネクチンにおいて、しかしファミリーの一つまたは複数の他のメンバーにおいてではなく、関連する結合基を含むアミノ酸残基によって占められるものであり得る（このようなアミノ酸残基が除去される場合）。
結合基の最適な分布を決定するために、アディポネクチンポリペプチドの表面に位置するアミノ酸残基間の距離は、アディポネクチンポリペプチドの三次元構造に基づいて計算される。より詳細には、このような結合基を含むアミノ酸のCB間の距離、または、一つの官能基（リジンについてNZ、アスパラギン酸についてCG、グルタミン酸についてCD、システインについてSG）と、結合基を含む別のアミノ酸残基のCBとの間の距離が決定される。グリシンの場合、CAがCBの代わりに使用される。本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分において、上記の距離のいずれかは、不均一な結合体化を避けるか、または減少させるために、好ましくは8Åより大きく、特に10Åより大きい。
さらに、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分において、アディポネクチンのレセプター結合部位に位置する結合基は、好ましくは、このような基を含むアミノ酸残基の置換によって、好ましくは除去される。
アディポネクチンポリペプチドを修飾するためのなおさらなる一般的に適用可能なアプローチは遮蔽することであり、それによって、非ポリペプチド部分への結合体化によって、もとのアディポネクチンに存在するエピトープを破壊するか、またはさもなくば不活性化する。ヒトアディポネクチンのエピトープは当該分野において公知の方法の使用によって同定され得、エピトープマッピングとしてもまた知られている。例えば、Romagnoliら、J. Biol Chem, 1999, 380(5): 553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96: 11-20, Van de Waterら、Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3): 229-35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1): 77-81, およびLane DP およびStephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2): 268-71を参照されたい。一つの方法は、例えば、9アミノ酸残基のランダムオリゴペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを樹立することである。ヒトアディポネクチンに対する特異的抗血清からのIgG1抗体は、免疫沈降によって精製され、そして反応性ファージがイムノブロッティングによって同定される。精製された反応性ファージのDNAを配列決定することによって、オリゴペプチドの配列が決定され得、続いてアディポネクチンの三次元構造上の配列の位置決めが行われる。代替的には、エピトープは、米国特許第5,041,376号に記載される方法に従って同定され得る。その構造上でそれによって同定される領域はエピトープを構成し、次いで、非ポリペプチド部分のための結合基の導入のための標的領域として選択され得る。好ましくは、少なくとも一つのエピトープ、例えば、2、3、または4個のヒト組換えアディポネクチンのエピトープが、本発明に従って、非ポリペプチド部分によって遮蔽される。従って、一つの実施態様において、本発明の結合体は、野生型ヒトアディポネクチンと比較して、少なくとも一つの遮蔽されたエピトープを有する。
結合基の除去の場合には、このような基を含みかつ上記に定義したような位置を占める関連するアミノ酸残基は、好ましくは、異なるアミノ酸残基で置換される。このアミノ酸残基は問題の非ポリペプチド部分のための結合基を含まない。
結合基の導入の場合には、そのような基を含むアミノ酸残基が、好ましくは、そのような位置を占めるアミノ酸残基の置換によってその位置に導入される。しかし、結合基のそのような導入はまた、本発明のポリペプチドの球状ドメイン、コラーゲンドメイン、または相同ドメインのようなポリペプチドのN末端またはC末端へのアミノ酸残基の付加を通してであり得る。
結合体化のために利用可能な結合基、およびアディポネクチンポリペプチドに存在する結合基の正確な数は、結合体化によって達成されることが所望される効果に依存する。得られる効果は、例えば、結合体化部分の性質および程度（それらが結合体化されることが当然である場合、または結合体化が回避されるべきである場合などに、例えば、非ポリペプチド部分の同定、ポリペプチドに結合体化することが所望されるかまたは可能である非ポリペプチド部分の数）に依存する。例えば、免疫原性の減少が所望される場合、結合基の数（およびその位置）は、エピトープの大部分またはすべてを遮蔽するに十分であるべきである。これは、より大きな割合のアディポネクチンポリペプチドが遮蔽される場合に、通常得られる。エピトープの効果的な遮蔽は、通常、結合体化のために利用可能な結合基の総数が1〜10結合基の範囲にある場合に、通常達成される。機能的なインビボ半減期は、特に、結合体の分子量に依存し、そして半減期の増加を提供するために必要な結合基の数は、従って、問題の非ポリペプチド部分の分子量に依存する。
一つの実施態様において、本発明の結合体は、Laemmli, U.K., Nature 227巻, (1970), 680-85頁に従うSDS-PAGEによって測定された場合に、少なくとも67kDaの分子量、特に少なくとも70kDaの分子量を有する。
もとのヒトアディポネクチンの構造および機能の行き過ぎた破壊を避けるために、本発明に従って変更されるアミノ酸残基の総数は（配列番号：6に示されるアミノ酸配列と比較して）、典型的には、15を超えない。好ましくは、類似体が所望される場合、アディポネクチンポリペプチドはアミノ酸配列を含み、この配列は、配列番号：6に示されるアミノ酸配列と1〜15アミノ酸残基、例えば、1〜11、1〜8、または2〜8アミノ酸残基、例えば、配列番号：6に示されるアミノ酸配列と1〜5または2〜5アミノ酸残基が異なる。従って、通常、アディポネクチンポリペプチドは、配列番号：6に示されるアミノ酸配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸残基で異なるアミノ酸配列を含む。典型的には、上記の数は、関連する非ポリペプチド部分のための結合基を含む、導入されたアミノ酸の総数もしくは除去されたアミノ酸の総数、または、このような基を含む、導入されたアミノ酸の総数および除去されたアミノ酸の総数のいずれかを表す。
本発明の結合体において、すべての結合基の少なくとも約50％、例えば、少なくとも約80％、および好ましくはこのような基のすべてが、関連する非ポリペプチド部分によって占められることが好ましい。従って、好ましい実施態様において、本発明の結合体は、例えば、1〜10個の非ポリペプチド部分を含む。
非ポリペプチド部分が、結合基としてリジンを有する分子である本発明の結合体
一つの実施態様において、第1の非ポリペプチド部分は結合基としてリジンを有し、従って、アディポネクチンポリペプチドは、少なくとも一つの導入されたリジン残基および／または少なくとも一つの除去されたリジン残基が野生型ヒトアディポネクチンの配列と異なるアミノ酸配列を含むものである。非ポリペプチド部分が、リジン残基、例えば、そのεアミノ基に結合するもの、例えば、ポリマー分子、親油性基、有機誘導体化剤、または炭水化物部分のいずれかであり得、それは好ましくは、「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて言及されるポリマー分子のいずれか、特に、分枝状または直鎖状のPEGまたはポリアルキレンオキサイドである。最も好ましくは、ポリマー分子はPEGであり、そして結合体化のために使用されるように活性化された分子は、Shearwater Polymers, Inc.からのSS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、Enzon, Inc.からのSC-PEG、米国特許第5,880,255号に記載されているトレシル化mPEG、またはオキシカルボニル−オキシ−N−ジカルボキシイミド−PEG（米国特許第5,122,614号）である。通常、リジン残基への結合体化のために、非ポリペプチド部分は、約5kDa、約10kDa、約20kDa、または約40kDaの分子量を有する。リジン残基は、任意の他のアミノ酸残基で置換され得るが、最小の構造的差異を生じるために、好ましくは、アルギニンまたはグルタミン残基によって置換される。
一つの実施態様において、第1の非ポリペプチド部分は結合基としてリジンを有し、従って、アディポネクチンポリペプチドは、少なくとも一つの導入されたリジン残基および／または少なくとも一つの除去されたリジン残基が野生型ヒトアディポネクチンの配列と異なるアミノ酸配列を含むものである。非ポリペプチド部分が、リジン残基、例えば、そのεアミノ基に結合するもの、例えば、ポリマー分子、親油性基、有機誘導体化剤、または炭水化物部分のいずれかであり得、それは好ましくは、「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて言及されるポリマー分子のいずれか、特に、分枝状または直鎖状のPEGまたはポリアルキレンオキサイドである。最も好ましくは、ポリマー分子はPEGであり、そして結合体化のために使用されるように活性化された分子は、Shearwater Polymers, Inc.からのSS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、Enzon, Inc.からのSC-PEG、米国特許第5,880,255号に記載されているトレシル化mPEG、またはオキシカルボニル−オキシ−N−ジカルボキシイミド−PEG（米国特許第5,122,614号）である。通常、リジン残基への結合体化のために、非ポリペプチド部分は、約5kDa、約10kDa、約20kDa、または約40kDaの分子量を有する。リジン残基は、任意の他のアミノ酸残基で置換され得るが、最小の構造的差異を生じるために、好ましくは、アルギニンまたはグルタミン残基によって置換される。
非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合する、本発明の結合体
本発明のこの局面に従う第1の非ポリペプチド部分は、所定の結合体化方法を使用する場合、結合基（例えば、炭水化物部分、親油性基、または有機誘導体化剤）としてシステインを有する任意の分子であり得るが、この非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分子は「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて言及される分子のいずれかであり得るが、好ましくは、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールまたはオイルアルキレンオキサイドからなる群より選択される。典型的には、このポリマー分子はVS-PEGである。ポリペプチドとポリマーとの間の結合体化は、例えば、「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて記載されるような、任意の適切な様式で、例えば、上記のセクションにおいて言及される、1段階の方法を使用して、または段階的な様式において達成され得る。アディポネクチンポリペプチドが一つのみの結合体化可能なシステイン残基を含む場合、これは、好ましくは、直接的に結合体化されるか、または低分子量ポリマー（国際公開公報第99/55377号に開示されるような）を通して間接的にのいずれかで、1〜20kDa、またはそれ以上の分子量を有する第1の非ポリペプチド部分に結合体化される。しかし、少なくとも5kDaの分子量を有する第1の非ポリペプチド部分へのシステインの結合体化もまた、本発明の実施態様である。本発明の結合体は、2つまたはそれ以上の第1の非ポリペプチド部分を含み、通常、これらの各々は、5、10、または20kDaの分子量を有する。
本発明のこの局面に従う第1の非ポリペプチド部分は、所定の結合体化方法を使用する場合、結合基（例えば、炭水化物部分、親油性基、または有機誘導体化剤）としてシステインを有する任意の分子であり得るが、この非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分子は「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて言及される分子のいずれかであり得るが、好ましくは、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールまたはオイルアルキレンオキサイドからなる群より選択される。典型的には、このポリマー分子はVS-PEGである。ポリペプチドとポリマーとの間の結合体化は、例えば、「ポリマー分子への結合体化」という標題のセクションにおいて記載されるような、任意の適切な様式で、例えば、上記のセクションにおいて言及される、1段階の方法を使用して、または段階的な様式において達成され得る。アディポネクチンポリペプチドが一つのみの結合体化可能なシステイン残基を含む場合、これは、好ましくは、直接的に結合体化されるか、または低分子量ポリマー（国際公開公報第99/55377号に開示されるような）を通して間接的にのいずれかで、1〜20kDa、またはそれ以上の分子量を有する第1の非ポリペプチド部分に結合体化される。しかし、少なくとも5kDaの分子量を有する第1の非ポリペプチド部分へのシステインの結合体化もまた、本発明の実施態様である。本発明の結合体は、2つまたはそれ以上の第1の非ポリペプチド部分を含み、通常、これらの各々は、5、10、または20kDaの分子量を有する。
非ポリペプチド部分が酸性基に結合する、本発明の結合体
アミノ酸残基の除去の場合において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つの除去されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基、例えば、1〜5個の除去された残基、特に1〜4個または1〜3個の除去されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基で、ヒト野生型アディポネクチンの配列と異なる。アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、任意の他のアミノ酸残基と置換され得るが、好ましくは、アルギニン残基またはグルタミン残基によって置換される。第1の非ポリペプチド部分は、このような特性を有する任意の非ポリペプチド部分であり得、非ポリペプチド部分は、結合基としてアミノ酸基を有する、ポリマー分子または有機誘導体化剤、特に、PEGのようなポリマー分子であり、そして結合体は、例えば、SakaneおよびPardridge, Pharmaceutical Research, 第14巻、第8号、1997年、1085-1091頁に記載されるように調製されることが現在好ましい。通常、酸性基への結合体化のために、非ポリペプチド部分は、約5、10、または20kDaの分子量を有する。
アミノ酸残基の除去の場合において、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つの除去されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基、例えば、1〜5個の除去された残基、特に1〜4個または1〜3個の除去されたアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基で、ヒト野生型アディポネクチンの配列と異なる。アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、任意の他のアミノ酸残基と置換され得るが、好ましくは、アルギニン残基またはグルタミン残基によって置換される。第1の非ポリペプチド部分は、このような特性を有する任意の非ポリペプチド部分であり得、非ポリペプチド部分は、結合基としてアミノ酸基を有する、ポリマー分子または有機誘導体化剤、特に、PEGのようなポリマー分子であり、そして結合体は、例えば、SakaneおよびPardridge, Pharmaceutical Research, 第14巻、第8号、1997年、1085-1091頁に記載されるように調製されることが現在好ましい。通常、酸性基への結合体化のために、非ポリペプチド部分は、約5、10、または20kDaの分子量を有する。
第2の非ポリペプチド部分を含む本発明の結合体
第1の非ポリペプチド部分に加えて（先のセクションにおいて記載されるように）、本発明の結合体は、第1の非ポリペプチド部分と比較して、異なる型の第2の非ポリペプチド部分を含み得る。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分が、例えば、PEGのようなポリマー分子である、上記に記載した結合体のいずれかにおいて、第2のポリペプチド部分は糖部分、特にN連結糖部分である。このような部位は、例えば、「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の結合体」という標題のすぐ前に先行するセクションにおいて記載されるもののいずれかである。
第1の非ポリペプチド部分に加えて（先のセクションにおいて記載されるように）、本発明の結合体は、第1の非ポリペプチド部分と比較して、異なる型の第2の非ポリペプチド部分を含み得る。好ましくは、第1の非ポリペプチド部分が、例えば、PEGのようなポリマー分子である、上記に記載した結合体のいずれかにおいて、第2のポリペプチド部分は糖部分、特にN連結糖部分である。このような部位は、例えば、「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の結合体」という標題のすぐ前に先行するセクションにおいて記載されるもののいずれかである。
結合した第1および第2の非ポリペプチド部分の最適な分布を得るために、アディポネクチンポリペプチドは、例えば、第1の非ポリペプチド部分についての少なくとも一つの除去された結合基、および第2の非ポリペプチド部分についての少なくとも一つの導入された結合基、またはその逆を有するように、第1および第2の非ポリペプチド部分についての結合基の数および分布において修飾され得ることが理解される。
非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の結合体
本発明の結合体は、インビボグリコシル化部位、特にNグリコシル化部位に結合した少なくとも一つの糖部分を含み、これは、アディポネクチンポリペプチドに導入された新規なインビボグリコシル化部位である。このインビボグリコシル化部位は、Oグリコシル化部位であり得るが、好ましくはNグリコシル化部位である。
本発明の結合体は、インビボグリコシル化部位、特にNグリコシル化部位に結合した少なくとも一つの糖部分を含み、これは、アディポネクチンポリペプチドに導入された新規なインビボグリコシル化部位である。このインビボグリコシル化部位は、Oグリコシル化部位であり得るが、好ましくはNグリコシル化部位である。
例えば、インビボグリコシル化部位は、分子の表面に露出したアミノ酸残基によって占められるもとのアディポネクチンの位置に導入され、好ましくは、溶媒に露出した側鎖の25％より多く、特に溶媒に露出した50％より多くを伴う（これらの位置は、本明細書中の実験／方法のセクションにおいて同定される）。Nグリコシル化部位は、上記の部位のN残基が上記の位置に位置するような方法で導入される。類似して、Oグリコシル化部位は、このような位置を形成するS残基またはT残基が上記の位置に位置するように導入される。なおより好ましくは、インビボグリコシル化部位は、一つのみの変異がその部位を作製するために必要とされる位置に導入される（すなわち、機能的なグリコシル化部位を作製するために必要とされる任意の他のアミノ酸残基がすでにその分子中に存在している場合）。
本発明の結合体の非ポリペプチド部分
上記でさらに示したように、本発明の結合体の非ポリペプチド部分は、好ましくは、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（インビボグリコシル化によって）、および有機誘導体化剤からなる群より選択される。これらの剤のすべては、結合体のポリペプチド部分に所望の特性、特に、免疫原性の減少、および／または機能的インビボ半減期、および／または血清半減期の増大を付与し得る。結合体のポリペプチド部分は、非ポリペプチド部分の一つの型のみに結合体化され得るが、2つまたは以上の異なる型の非ポリペプチド部分、例えば、ポリマー部分および糖部分、親油性基および糖部分、有機誘導体化剤および糖部分、親油性基およびポリマー部分などにもまた結合体化され得る。2つまたはそれ以上の異なる非ポリペプチド部分への結合体化は、同時にまたは連続的に行われ得る。非ポリペプチド部分の選択は、例えば、結合体化によって達成されるような所望の効果に依存する。例えば、糖部分は、免疫原性を減少させるために特に有用であることが見い出されてきたが、一方、PEGのようなポリマー分子は、機能的なインビボ半減期および／または血清半減期を増大させるために特に有用である。第1の非ポリペプチド部分としてポリマー分子を、および第2の非ポリペプチド部分として糖部分を使用することは、免疫原性の減少および機能的インビボ半減期および／または血清半減期の増大を生じ得る。
上記でさらに示したように、本発明の結合体の非ポリペプチド部分は、好ましくは、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（インビボグリコシル化によって）、および有機誘導体化剤からなる群より選択される。これらの剤のすべては、結合体のポリペプチド部分に所望の特性、特に、免疫原性の減少、および／または機能的インビボ半減期、および／または血清半減期の増大を付与し得る。結合体のポリペプチド部分は、非ポリペプチド部分の一つの型のみに結合体化され得るが、2つまたは以上の異なる型の非ポリペプチド部分、例えば、ポリマー部分および糖部分、親油性基および糖部分、有機誘導体化剤および糖部分、親油性基およびポリマー部分などにもまた結合体化され得る。2つまたはそれ以上の異なる非ポリペプチド部分への結合体化は、同時にまたは連続的に行われ得る。非ポリペプチド部分の選択は、例えば、結合体化によって達成されるような所望の効果に依存する。例えば、糖部分は、免疫原性を減少させるために特に有用であることが見い出されてきたが、一方、PEGのようなポリマー分子は、機能的なインビボ半減期および／または血清半減期を増大させるために特に有用である。第1の非ポリペプチド部分としてポリマー分子を、および第2の非ポリペプチド部分として糖部分を使用することは、免疫原性の減少および機能的インビボ半減期および／または血清半減期の増大を生じ得る。
本発明の結合体を調製する方法
以下のセクション「親油性化合物への結合体化」、「ポリマー分子への結合体化」、「糖部分への結合体化」、および「有機誘導体化剤への結合体化」において、特定の型の非ポリペプチド部分への結合体化が記載される。
以下のセクション「親油性化合物への結合体化」、「ポリマー分子への結合体化」、「糖部分への結合体化」、および「有機誘導体化剤への結合体化」において、特定の型の非ポリペプチド部分への結合体化が記載される。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体を調製するための方法に関し、ここで、アディポネクチンポリペプチドは、結合体化が引き起こされ、そして結合体が回収される条件下で、それが結合体化される第1の非ポリペプチド部分と反応される。
さらなる局面において、本発明は、アディポネクチンポリペプチド、およびアディポネクチンポリペプチドに共有結合した第1の非ポリペプチド部分を含む結合体を調製するための方法に関し、これは、本発明の第1、第2、第3、および第4の結合体の群と関連して、上記に記載されているようなものである。
親油性化合物への結合体化
親油性化合物への結合体化のために、以下のポリペプチドの基が結合基として機能し得る：ポリペプチドのN末端またはC末端、アミノ酸残基Ser、Thr、またはTyrのヒドロキシル基、Lysのεアミノ基、CysのSH基、またはAspおよびGluのカルボキシル基。ポリペプチドおよび親油性化合物は、直接的に、またはリンカーの使用によってのいずれかで、互いに結合体化され得る。親油性化合物は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドもしくはステロイドのような天然の化合物、または、一つまたは複数のアルキル、アリール、アルケニル、もしくは他の複数の不飽和化合物を有するカルボン酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸のような合成の化合物であり得る。ポリペプチドと親油性化合物との間の結合体化（選択的にリンカーを介する）は、当該分野で公知の方法、例えば、Bodanszky、Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976および国際公開公報第96/12505号においてによって記載されたような方法に従って行われ得る。
親油性化合物への結合体化のために、以下のポリペプチドの基が結合基として機能し得る：ポリペプチドのN末端またはC末端、アミノ酸残基Ser、Thr、またはTyrのヒドロキシル基、Lysのεアミノ基、CysのSH基、またはAspおよびGluのカルボキシル基。ポリペプチドおよび親油性化合物は、直接的に、またはリンカーの使用によってのいずれかで、互いに結合体化され得る。親油性化合物は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドもしくはステロイドのような天然の化合物、または、一つまたは複数のアルキル、アリール、アルケニル、もしくは他の複数の不飽和化合物を有するカルボン酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸のような合成の化合物であり得る。ポリペプチドと親油性化合物との間の結合体化（選択的にリンカーを介する）は、当該分野で公知の方法、例えば、Bodanszky、Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976および国際公開公報第96/12505号においてによって記載されたような方法に従って行われ得る。
ポリマー分子への結合体化
ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、例えば、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーであって、典型的には、300〜200,000Da、例えば1kDa〜200kDaの範囲の分子量を有する、任意の適切なポリマー分子であり得る。
ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、例えば、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーであって、典型的には、300〜200,000Da、例えば1kDa〜200kDaの範囲の分子量を有する、任意の適切なポリマー分子であり得る。
ホモポリマーの例には、ポリオール（すなわち、ポリ-OH）、ポリアミン（すなわち、ポリ-NH2）、およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ-COOH）が含まれる。ヘテロポリマーは、一つまたは複数の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーである。
適切なポリマー分子の例には、ポリアルキレンオキサイド（PAO）からなる群より選択されるポリマー分子（これには、ポリアルキレングリコール（PAG）、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）が含まれる）、分枝PEG、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリカルボン酸、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−リンゴ酸無水物、カルボキシルメチルデキストランを含むデキストラン、あるいは、免疫原性の減少ならびに／または機能的インビボ半減期および／もしくは血清半減期の増大のために適切な任意の他のバイオポリマーが含まれる。一般的には、ポリアルキレングリコール誘導体化ポリマーが生物適合性であり、非毒性で、非抗原性で、非免疫原性であり、種々の水溶解性特性を有し、そして生きている生物から容易に排出される。
PEGは、使用される好ましいポリマー分子である。なぜなら、これは、例えば、デキストランのようなポリサッカリドなどと比較して、架橋することが可能な反応基をほとんど有しないからである。特に、モノ官能性PEG（例えば、モノメトキシポリエチレングリコール）（mPEG）が関心対象のものである。なぜなら、そのカップリング化学は比較的単純であるからである（一つのみの官能基が、ポリペプチド上の結合基との結合体化のために利用可能である）。結果的に、架橋のリスクは除外され、得られるポリペプチド結合体はより均一であり、そしてポリペプチドを有するポリマー分子の反応は、制御することがより容易である。
ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合をもたらすために、ポリマー分子の末端のヒドロキシル基は、活性型、すなわち、反応性の官能基（その例としては、一級アミノ基、ヒドラジド（HZ）、チオール、スクシネート（SUC）、スクシニイミジルスクシネート（SS）、スクシニイミジルスクシナミド（SSA）、スクシニイミジルプロピオネート（SPA）、スクシニイミジルカルボキシメチレート（SCM）、ベンゾトリアゾールカーボネート（BTC）、N-ヒドロキシスクシニイミド（NHS）、アルデヒド、ニトロフェニルカーボネート（NPC）、およびトレシレート（TRES）が含まれる）で提供されなくてはならない。適切な活性型ポリマー分子は、例えば、Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USAから市販されている。代替的には、このポリマー分子は、当該分野で公知の従来的な方法（例えば、国際公開公報第90/13540号において開示されるようなもの）によって活性化され得る。本発明における使用のための活性化された直鎖状または分枝状ポリマー分子の特定の例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997および2000カタログにおいて記載されている（「Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives」、参照として本明細書に組み入れられる）。活性型PEGポリマーの特定の例には以下が含まれる。直鎖状PEG：NHS-PEG（例えば、SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、およびSCM-PEG）、ならびにNOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、およびMAL-PEG、ならびに、分枝状PEG（例えば、PEG2-NHSならびに米国特許第5,932,462号および同第5,643,575号に記載されるもの、これらの両方は参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、参照として本明細書に組み入れられる以下の刊行物は、有用なポリマー分子および／またはPEG化化学を開示する：米国特許第5,824,778号、米国特許第5,476,653号、国際公開公報第97/32607号、欧州特許第229,108号、欧州特許第402,378号、米国特許第4,902,502号、米国特許第5,281,698号、米国特許第5,122,614号、米国特許第5,219,564号、国際公開公報第92/16555号、国際公開公報第94/04193号、国際公開公報第94/14758号、国際公開公報第94/17039号、国際公開公報第94/18247号、国際公開公報第94/28024号、国際公開公報第95/00162号、国際公開公報第95/11924号、国際公開公報第95/13090号、国際公開公報第95/33490号、国際公開公報第96/00080号、国際公開公報第97/18832号、国際公開公報第98/41562号、国際公開公報第98/48837号、国際公開公報第99/32134号、国際公開公報第99/32139号、国際公開公報第99/32140号、国際公開公報第96/40791号、国際公開公報第98/32466号、国際公開公報第95/06058号、欧州特許第439,508号、国際公開公報第97/03106号、国際公開公報第96/21469号、国際公開公報第95/13312号、欧州特許第921,131号、米国特許第5,736,625号、国際公開公報第98/05363号、欧州特許第809,996号、米国特許第5,629,384号、国際公開公報第96/41813号、国際公開公報第96/07670号、米国特許第5,473,034号、米国特許第5,516,673号、欧州特許第605,963号、米国特許第5,382,657号、欧州特許第510,356号、欧州特許第400,472号、欧州特許第183,503号、および欧州特許第154,316号。
ポリペプチドおよび活性化されたポリマー分子の結合体化は、任意の従来の方法、例えば、以下の引用文献（これはまた、ポリマー分子の活性化のために適切な方法を記載する）に記載されるような方法の使用によって行われる：HarrisおよびZalipsky編、Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F.Taylor, (1991),「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」, CRC Press, Boca Raton; G.T.Hermansonら、(1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, Academic Press, N.Y.。当業者は、使用される活性化方法および／または結合体化化学が、アディポネクチンポリペプチドの結合基ならびにポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、またはスルフヒドリルであること）に依存することを認識している。PEG化は、ポリペプチド上のすべての利用可能な結合基（すなわち、ポリペプチドの表面に露出しているそのような官能基）への結合体化に指向され得るか、または特定の結合基（例えば、N末端アミノ基（米国特許第5,985,265号））に指向され得る。さらに、結合体化は、1段階でまたは段階的な様式で達成され得る（例えば、国際公開第公報第99/55377号に記載されるようなもの）。
PEG化は、結合されるPEG分子の数、このような分子のサイズ、および形態（例えば、それらが直鎖状であるか分枝状であるか）、ならびに、ポリペプチド中でこのような分子が結合する場所に関して、最適な分子を生成するように設計されることが理解される。例えば、使用されるポリマーの分子量は、達成される所望の効果に基づいて選択され得る。例えば、結合体化の第1の目的が、高分子量を有する結合体を達成することである場合（例えば、腎クリアランスを減少させるため）、所望の分子量を得るために、可能な限り小さな分子量のポリマー分子を結合体化させることが通常望ましい。高度なエピトープ遮蔽が所望される場合、これは、ポリペプチドのエピトープのすべてまたは大部分を有効に遮蔽するために、十分に多数の低分子量ポリマー（例えば、約5,000Daの分子量を有するもの）の使用によって得られ得る。例えば、2〜8、例えば、3〜6のこのようなポリマーが使用され得る。タンパク質への単一の結合基のみへの結合体化（米国特許第5,985,265号に記載される）に関連して、ポリマー分子（これは、直鎖状または分枝状であり得る）が高分子量、例えば、約20kDaを有することが有利であり得る。
通常、ポリマー結合体化は、すべての利用可能なポリマー結合基をポリマー分子と反応させることを目的とした条件下で実行される。典型的には、最適な反応を得るために、ポリペプチドに対する活性化されたポリマー分子のモル比は1000-1、特に200-1、好ましくは100-〜1、例えば、10-1または5-1である。しかし、等モル比もまた、使用され得る。
ポリマー分子を、リンカー分子を介してポリペプチドにカップリングすることもまた、本発明に従って意図される。適切なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は、シアヌル酸クロライドである（Abuchowskiら、(1977), J.Biol.Chem., 252, 3578-3581; 米国特許第4,179,337号; Shaferら、(1986), J. Polym. Sci.Polym. Chem. Ed., 24, 375-378）。
結合体化の後で、残渣の活性化されたポリマー分子は、当該分野で公知の方法に従って（例えば、反応混液への一級アミンの付加によって）、ブロックされ、そして得られる不活性化されたポリマー分子は適切な方法によって除去される。
国際公開公報第99/55377に記載される一般的な技術もまた、本発明の結合体を産生することに関して適用可能である。従って、さらなる局面において、本発明は、連続して、ポリエチレングリコール（PEG）部分のアディポネクチンポリペプチドへの段階的な結合のための方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
アディポネクチンポリペプチドを、以下の式:W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Xを有する、低分子量ヘテロ二官能性またはホモ二官能性PEG部分と反応させる段階であって、ここで、WおよびXは、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、またはヒドロキシル官能基と独立して反応して、低分子量PEG部分をアディポネクチンポリペプチドに結合させる基である；ならびに、アディポネクチンポリペプチドに結合した低分子量PEG部分を、モノ官能性または二官能性PEG部分と反応させて、モノ官能性または二官能性PEG部分を低分子量PEG部分の遊離の末端に結合させ、そしてPEG-アディポネクチンポリペプチド結合体を形成する段階。nは整数であり、これは、低分子量PEG部分の重量に依存する。一つの実施態様において、モノ官能性または二官能性PEG部分は、以下の式：Y-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Zを有する。ここで、Yは、アディポネクチンポリペプチドに結合した低分子量PEG部分の遊離の末端上の末端基と反応性であり、およびZは-OCH3またはXと反応性で二官能性結合体を形成する基である。さらなる実施態様において、モノ官能性または二官能性のPEG部分は、メトキシPEG、分枝状PEG、加水分解性もしくは酵素分解可能なPEG、ペンダントPEG、またはデンドリマーPEGである。さらなる実施態様において、WおよびXは、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、ヒドラジン、アルデヒド、スクシンイミジルエステル、エポキシド、アミン、チオール、カルボキシル、活性エステル、ベンゾトリアゾールカーボネート、p-ニトロフェノールカーボネート、イソシアネート、およびビオチンからなる群より独立して選択される。さらなる実施態様において、低分子量PEG部分は、約100〜500ダルトンの範囲の分子量を有し、一つの例は、OPSS-PEG-ヒドラジドである。さらなる実施態様において、モノ官能性または二官能性PEG部分は、約100ダルトン〜200キロダルトンの範囲の分子量を有する。さらなる実施態様において、低分子量PEG部分および／またはモノ官能性もしくは二官能性PEG部分は、ポリエチレングリコールのコポリマーであり、このようなポリエチレングリコールのコポリマーは、典型的には、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールコポリマーおよびポリエチレングリコール／ポリ（乳酸／グリコール酸）コポリマーからなる群より選択される。さらなる実施態様において、本発明の方法は、2つのPEG部分のアディポネクチンポリペプチドへの連続した段階的結合の後に、PEG-アディポネクチンポリペプチド結合体を精製する段階をさらに含む。上記および本明細書全体を通して使用される場合、用語「mPEG-ALDと組み合わせたOPSS-PEG-ヒドラジド」は、国際公開公報第WO99/55377に記載される段階的な技術が使用され得ることを意味することが意図される。国際公開公報第WO99/55377の開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
アディポネクチンポリペプチドを、以下の式:W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Xを有する、低分子量ヘテロ二官能性またはホモ二官能性PEG部分と反応させる段階であって、ここで、WおよびXは、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、またはヒドロキシル官能基と独立して反応して、低分子量PEG部分をアディポネクチンポリペプチドに結合させる基である；ならびに、アディポネクチンポリペプチドに結合した低分子量PEG部分を、モノ官能性または二官能性PEG部分と反応させて、モノ官能性または二官能性PEG部分を低分子量PEG部分の遊離の末端に結合させ、そしてPEG-アディポネクチンポリペプチド結合体を形成する段階。nは整数であり、これは、低分子量PEG部分の重量に依存する。一つの実施態様において、モノ官能性または二官能性PEG部分は、以下の式：Y-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Zを有する。ここで、Yは、アディポネクチンポリペプチドに結合した低分子量PEG部分の遊離の末端上の末端基と反応性であり、およびZは-OCH3またはXと反応性で二官能性結合体を形成する基である。さらなる実施態様において、モノ官能性または二官能性のPEG部分は、メトキシPEG、分枝状PEG、加水分解性もしくは酵素分解可能なPEG、ペンダントPEG、またはデンドリマーPEGである。さらなる実施態様において、WおよびXは、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、ヒドラジン、アルデヒド、スクシンイミジルエステル、エポキシド、アミン、チオール、カルボキシル、活性エステル、ベンゾトリアゾールカーボネート、p-ニトロフェノールカーボネート、イソシアネート、およびビオチンからなる群より独立して選択される。さらなる実施態様において、低分子量PEG部分は、約100〜500ダルトンの範囲の分子量を有し、一つの例は、OPSS-PEG-ヒドラジドである。さらなる実施態様において、モノ官能性または二官能性PEG部分は、約100ダルトン〜200キロダルトンの範囲の分子量を有する。さらなる実施態様において、低分子量PEG部分および／またはモノ官能性もしくは二官能性PEG部分は、ポリエチレングリコールのコポリマーであり、このようなポリエチレングリコールのコポリマーは、典型的には、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールコポリマーおよびポリエチレングリコール／ポリ（乳酸／グリコール酸）コポリマーからなる群より選択される。さらなる実施態様において、本発明の方法は、2つのPEG部分のアディポネクチンポリペプチドへの連続した段階的結合の後に、PEG-アディポネクチンポリペプチド結合体を精製する段階をさらに含む。上記および本明細書全体を通して使用される場合、用語「mPEG-ALDと組み合わせたOPSS-PEG-ヒドラジド」は、国際公開公報第WO99/55377に記載される段階的な技術が使用され得ることを意味することが意図される。国際公開公報第WO99/55377の開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
炭水化物部分の、アディポネクチンポリペプチドのアミノ酸残基への共有結合的なインビトロカップリングは、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾または増大させるために使用され得る。使用されるカップリングの様式に依存して、炭水化物は、a）アルギニンおよびヒスチジン（LundbladおよびNoyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI）、b）遊離のカルボキシル基（例えば、C末端アミノ酸残基、アスパラギンまたはグルタミンのカルボキシル基）、c）遊離のスルフヒドリル基（例えば、システインのスルフヒドリル基）、d）遊離のヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニン、チロシン、またはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基）、e）芳香族残基（例えば、フェニルアラニンまたはトリプトファンの芳香族残基）あるいは、f）グルタミンのアミド基。これらのアミノ酸残基は、炭水化物部分のための結合基の例を構成し、この炭水化物部分は、アディポネクチンポリペプチドに導入され得る。インビトロカップリングの適切な方法は、国際公開公報第WO87/05330およびAplinら、CRC Crit Rev. Biochem., 259-306頁, 1981に記載されている。炭水化物部分またはPEGの、タンパク質およびペプチド結合Gln残基へのインビトロカップリングもまた、例えば、Satoら、1996 Biochemistry 35, 13072-13080によって、または欧州特許第725145によって記載されるように、トランスグルタミナーゼ（TGアーゼ）によって実行され得る。
糖部分へのカップリング
一つまたは複数のグリコシル化部位の導入によって修飾されたアディポネクチンポリペプチドのインビボグリコシル化を達成するために（「非ポリペプチド部位が糖部分である本発明の結合体」のセクションを参照されたい）、結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化される真核生物宿主に挿入されなくてはならない。発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫、哺乳動物細胞から選択され得るか、トランスジェニック植物細胞から選択され得るか、またはトランスジェニック動物細胞から選択され得る。さらに、グリコシル化は、遺伝子治療において本発明の結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドを使用する場合、人体において達成され得る。一つの実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、CHO細胞、BHKまたはHEK細胞、例えばHEK293）、または昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）、または酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Piichia pastoris）または、他の任意の適切なグリコシル化宿主（例えば、以下にさらに記載されるもの）である。選択的に、インビボグリコシル化によってアディポネクチンポリペプチドに結合された糖部分は、グリコシルトランスフェラーゼの使用によって（例えば、Neose, Horsham, PA, USAによって市販されているglycoAdvance（商標）技術を使用することによって）さらに修飾される。それによって、例えば、CHO細胞による発現およびインビボグリコシル化の後に、グリコシル化されたアディポネクチンポリペプチドのシアリル化を増加させることが可能である。
一つまたは複数のグリコシル化部位の導入によって修飾されたアディポネクチンポリペプチドのインビボグリコシル化を達成するために（「非ポリペプチド部位が糖部分である本発明の結合体」のセクションを参照されたい）、結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化される真核生物宿主に挿入されなくてはならない。発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫、哺乳動物細胞から選択され得るか、トランスジェニック植物細胞から選択され得るか、またはトランスジェニック動物細胞から選択され得る。さらに、グリコシル化は、遺伝子治療において本発明の結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドを使用する場合、人体において達成され得る。一つの実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、CHO細胞、BHKまたはHEK細胞、例えばHEK293）、または昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）、または酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Piichia pastoris）または、他の任意の適切なグリコシル化宿主（例えば、以下にさらに記載されるもの）である。選択的に、インビボグリコシル化によってアディポネクチンポリペプチドに結合された糖部分は、グリコシルトランスフェラーゼの使用によって（例えば、Neose, Horsham, PA, USAによって市販されているglycoAdvance（商標）技術を使用することによって）さらに修飾される。それによって、例えば、CHO細胞による発現およびインビボグリコシル化の後に、グリコシル化されたアディポネクチンポリペプチドのシアリル化を増加させることが可能である。
有機誘導体化剤へのカップリング
アディポネクチンポリペプチドの共有結合的修飾は、ポリペプチドの結合基を有機誘導体化剤と反応させることによって実行され得る。適切な誘導体化剤および方法は当該分野で周知である。例えば、システニル残基は、最も一般的にはα−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応され、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システニル残基はまた、ブロモフルオロアセトン、α-ブロモ−β-（4-イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ安息香酸水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応におって誘導体化される。昼値ジル残基は、pH 5.5〜7.0で、ジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。なぜなら、この試薬はヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；その反応は好ましくは0.1M カコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ 6.0で実行される。リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応される。これらの試薬を用いる誘導体化はリジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチリソウレア；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いるトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1種または数種の従来的な試薬、中でも、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンをの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKa値のために、その反応がアルカリ条件で実行されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニングアニジノ基と反応し得る。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミルまたはC末端アミノ酸残基）は、カルボジイミド（R-N=C=N-R'）との反応によって選択的に修飾され、ここで、RおよびR'は異なるアルキル基、例えば、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリニル-4-エチル）カルボジイミドまたは1-エチル-3-（4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基またはグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル残基およびグルタミル残基に転換される。
アディポネクチンポリペプチドの共有結合的修飾は、ポリペプチドの結合基を有機誘導体化剤と反応させることによって実行され得る。適切な誘導体化剤および方法は当該分野で周知である。例えば、システニル残基は、最も一般的にはα−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応され、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システニル残基はまた、ブロモフルオロアセトン、α-ブロモ−β-（4-イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ安息香酸水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応におって誘導体化される。昼値ジル残基は、pH 5.5〜7.0で、ジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。なぜなら、この試薬はヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；その反応は好ましくは0.1M カコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ 6.0で実行される。リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応される。これらの試薬を用いる誘導体化はリジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチリソウレア；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いるトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1種または数種の従来的な試薬、中でも、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンをの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKa値のために、その反応がアルカリ条件で実行されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニングアニジノ基と反応し得る。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミルまたはC末端アミノ酸残基）は、カルボジイミド（R-N=C=N-R'）との反応によって選択的に修飾され、ここで、RおよびR'は異なるアルキル基、例えば、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリニル-4-エチル）カルボジイミドまたは1-エチル-3-（4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基またはグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル残基およびグルタミル残基に転換される。
機能的部位のブロッキング
過剰なポリマー結合体化は、ポリマーが結合体化されるアディポネクチンポリペプチドの活性の損失をもたらし得る。この問題は、例えば、機能的部位に位置する結合基の除去、または結合体化に先立って機能的部位をブロッキングすることによって除外され得る。これらの後者のストラテジーは、本発明のさらなる実施態様を構成する（第1のストラテジーは、例えば、機能的部位に近接して局在し得るリジン残基の除去によって、上記にさらに例示される）。より詳細には、第2のストラテジーに従って、アディポネクチンポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合体化は、ポリペプチドの機能的部位が、ポリペプチドの機能的部位に結合し得るヘルパー分子によってブロックされる条件で実行される。典型的には、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位を特異的に認識するもの（例えば、レセプター）である。代替的には、ヘルパー分子は、アディポネクチンを認識する抗体、特にモノクローナル抗体であり得る。特に、ヘルパー分子は、モノクローナル抗体を中和し得る。
過剰なポリマー結合体化は、ポリマーが結合体化されるアディポネクチンポリペプチドの活性の損失をもたらし得る。この問題は、例えば、機能的部位に位置する結合基の除去、または結合体化に先立って機能的部位をブロッキングすることによって除外され得る。これらの後者のストラテジーは、本発明のさらなる実施態様を構成する（第1のストラテジーは、例えば、機能的部位に近接して局在し得るリジン残基の除去によって、上記にさらに例示される）。より詳細には、第2のストラテジーに従って、アディポネクチンポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合体化は、ポリペプチドの機能的部位が、ポリペプチドの機能的部位に結合し得るヘルパー分子によってブロックされる条件で実行される。典型的には、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位を特異的に認識するもの（例えば、レセプター）である。代替的には、ヘルパー分子は、アディポネクチンを認識する抗体、特にモノクローナル抗体であり得る。特に、ヘルパー分子は、モノクローナル抗体を中和し得る。
ポリペプチドは、結合体化をもたらす前に、ヘルパー分子との相互作用が許容される。このことは、ポリペプチドの機能的部位が遮蔽または保護され、結果的に、ポリマーのような非ポリペプチド部分による誘導体化のために利用可能でないことを確実にする。ヘルパー分子からのその溶出後、非ポリペプチド部分とポリペプチドとの間の結合体は、少なくとも部分的に保存された機能的部位を伴って回収され得る。
ポリマー、親油性化合物、有機誘導体化剤、または他の任意の化合物へのブロックされた機能的部位を有するポリペプチドの引き続く結合体化は、通常の方法、例えば、上記の「...への結合体化」のセクションに記載されるように実行される。
結合体化からポリペプチドの機能的部位を遮蔽するために使用されるヘルパー分子の性質に関わらず、ヘルパー分子が、分子の一部における選り抜きの非ポリペプチド部分のための結合基を含まないか、またはほんのわずかだけ含むことが所望され得、ここで、このような基への結合体化は、ヘルパー分子から、結合体化ポリペプチドの脱離を妨害する。この結果、ポリペプチドの遮蔽されていない部分に存在する結合基への選択的結合体化が得られ、そして結合体化の反復するサイクルにおいてヘルパー分子を再利用することが可能である。例えば、非ポリペプチド部分がPEGのようなポリマー分子であり、これは、結合基としてリジンまたはN末端アミノ酸残基のεアミノ基を有する場合、ヘルパー分子は、実質的に結合体化可能なεアミノ基を含まないこと、好ましくは任意のεアミノ基を含まないことが所望される。従って、好ましい実施態様において、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位に結合し得るタンパク質またはペプチドであり、このタンパク質またはペプチドは、選り抜きの非ポリペプチド部分のための任意の結合体化可能な結合基を含まない。
さらなる実施態様において、ヘルパー分子は、カラム充填剤（例えば、Sephadexまたはアガロースビーズ）または表面（例えば、反応容器）のような固相に最初に共有結合される。続いて、ポリペプチドは、当該分野で公知の方法（例えば、上記の「...への結合体化」という標題の上記のセクションに記載されるようなもの）に従って、ヘルパー分子を有するカラム充填剤にロードされ、そして結合体化が実行される。この手順は、ポリペプチドが、溶出によってヘルパー分子から分離されることを可能にする。このポリペプチド結合体は、ポリペプチド結合体の実質的な分解をもたらさない物理化学的条件下で、従来の技術によって溶出される。ポリペプチド結合体を含む液相は、ヘルパー分子が共有結合したままで残っている固相から分離される。この分離は、他の方法において達成され得る：例えば、ヘルパー分子は、特異的結合剤（例えば、ストレプトアビジン）によって認識され得る第2の分子（例えば、ビオチン）とともに誘導体化され得る。この特異的結合剤は固相に連結され得、それによって、第2のヘルパー−固相カラムの通過を通して、ヘルパー分子−第2の分子複合体からのポリペプチド結合体の分離を可能にする。このカラムは、引き続く溶出の際に、ヘルパー分子−第2の分子複合体を保持するが、ポリペプチド結合体は保持しない。ポリペプチド複合体は、任意の適切な様式で、ヘルパー分子から遊離され得る。脱保護は、ヘルパー分子が、それが結合しているアディポネクチンの機能的部位から解離する条件を提供することによって達成され得る。例えば、ポリマーが結合体化される抗体と、抗イデオタイプ抗体との間の複合体は、pHを酸性pHまたはアルカリ性pHに調整することによって解離され得る。
タグ化されたアディポネクチンポリペプチドの結合体化
代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、タグ、すなわち、典型的には1〜30、例えば、1〜20または1〜15または1〜10アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列またはペプチドストレッチを伴う、融合タンパク質として発現される。迅速かつ容易な精製を可能にすることに加えて、このタグは、タグ化されたポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合体化を達成するための便利なツールである。特に、このタグは、マイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズのような他の担体（タグ化されたポリペプチドは、タグを介してこれに固定化され得る）における結合体化を達成するために使用され得る。例えば、マイクロタイタープレートにおけるタグ化されたポリペプチドへの結合体化は、タグ化されたポリペプチドが培養ブロスから直接的に（原則的に、いかなる精製もなしで）マイクロタイタープレートに固定化され得、そして結合体化に供され得るという利点を有する。それによって、プロセスの段階の総数（発現から結合体化まで）が減少され得る。さらに、このタグは、結合体化される固定化されたポリペプチドへの接近のしやすさの改善を確実にするスペーサー分子として機能し得る。タグ化ポリペプチドを使用する結合体化は、本明細書中に開示される非ポリペプチド部分のいずれかに、例えば、PEGのようなポリマー分子にであり得る。
代替的な実施態様において、アディポネクチンポリペプチドは、タグ、すなわち、典型的には1〜30、例えば、1〜20または1〜15または1〜10アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列またはペプチドストレッチを伴う、融合タンパク質として発現される。迅速かつ容易な精製を可能にすることに加えて、このタグは、タグ化されたポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合体化を達成するための便利なツールである。特に、このタグは、マイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズのような他の担体（タグ化されたポリペプチドは、タグを介してこれに固定化され得る）における結合体化を達成するために使用され得る。例えば、マイクロタイタープレートにおけるタグ化されたポリペプチドへの結合体化は、タグ化されたポリペプチドが培養ブロスから直接的に（原則的に、いかなる精製もなしで）マイクロタイタープレートに固定化され得、そして結合体化に供され得るという利点を有する。それによって、プロセスの段階の総数（発現から結合体化まで）が減少され得る。さらに、このタグは、結合体化される固定化されたポリペプチドへの接近のしやすさの改善を確実にするスペーサー分子として機能し得る。タグ化ポリペプチドを使用する結合体化は、本明細書中に開示される非ポリペプチド部分のいずれかに、例えば、PEGのようなポリマー分子にであり得る。
使用される特異的タグの同定は、タグがポリペプチドとともに発現され、かつ適切な表面または担体材料に固定化され得る限り、決定的ではない。多数の適切なタグが市販されている（例えば、Unizyme Laboratories, Denmarkから）。例えば、このタグは以下の配列のいずれかであり得る：
（このようなタグを供給するために有用なベクターは、Unizyme Laboratories, Denmarkから市販されている）
または以下のいずれかの配列
または以下のいずれかの配列
上記のタグに対する抗体は、例えば、ADI, Aves LabおよびResearch Diagnosticsから市販されている。
ポリペプチドからのタグの引き続く切断は、市販の酵素の使用によって達成され得る。
また、ポリペプチドは、例えば、上記の「タグ化されたアディポネクチンポリペプチドの結合体化」という標題のさらなるセクションに記載されるように、タグとともに発現され得る。
本明細書中に開示される本発明のポリペプチドのいずれかは、本発明の結合体を調製するために使用され得ること、すなわち、本明細書中に開示された非ポリペプチド部分のいずれかに共有結合的にカップリングされることが理解され得る。特に、本発明のポリペプチドがグリコシル化を行う微生物において発現される場合に、ポリペプチドはグリコシル化型で提供され得る。
本発明における使用のためのアディポネクチンポリペプチドを調製する方法
本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分（選択的にグリコシル化型）は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。このような方法には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築する段階、および適切な形質転換もしくはトランスフェクションの宿主においてその配列を発現させる段階が含まれる。しかし、本発明のポリペプチドは、より効率的でないにも関わらず、化学合成、または化学合成の組み合わせ、または化学合成および組換えDNA技術との組み合わせによって産生され得る。
本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分（選択的にグリコシル化型）は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。このような方法には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築する段階、および適切な形質転換もしくはトランスフェクションの宿主においてその配列を発現させる段階が含まれる。しかし、本発明のポリペプチドは、より効率的でないにも関わらず、化学合成、または化学合成の組み合わせ、または化学合成および組換えDNA技術との組み合わせによって産生され得る。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞、または本発明の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞、または本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
一つの実施態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号：14、15、または16のいずれか一つから選択される配列、ならびに、配列番号：14、15、または16のいずれか一つと少なくとも70％の相同性を有する配列を含む。配列番号：14、15、または16のいずれか一つと少なくとも80％の相同性、例えば、90％、92％、95％、または98％の相同性を有する配列がより好ましい。
別の実施態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つから選択される配列、ならびに、配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つと少なくとも70％の相同性を有する配列を含む。配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つと少なくとも80％の相同性、例えば、90％、92％、95％、または98％の相同性を有する配列がより好ましい。
さらなる実施態様において、宿主細胞は、酵母細胞、細菌細胞（例えば大腸菌細胞）、哺乳動物細胞（例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞）から選択される。さらなる実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えばCHO K1）から選択される。本発明の適切な宿主細胞のさらなる実施態様は、以下に記載される。
アディポネクチンポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、もとのアディポネクチンをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：6に示されるアミノ酸配列を用いて）を単離または合成すること、次いで、関連するアミノ酸残基の導入（すなわち、挿入もしくは置換）または欠失（すなわち、除去または置換）をもたらすために、ヌクレオチド配列を変化させることによって構築され得る。
本発明のヌクレオチド配列は、周知の方法に従って部位特異的変異誘発によって首尾よく修飾され得る。
代替的には、ヌクレオチド配列は、化学合成によって、例えば、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用することによって調製される。ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、好ましくは、組換えポリペプチドが生成される宿主細胞中で好まれるコドンを選択する。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され得、そしてPCR、ライゲーション、またはライゲーション鎖反応（LCR）によってアセンブリされ得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリーについての5'または3'突出を含む。
一旦アセンブリされると（合成、部位特異的変異誘発、または別の方法によって）、アディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は組換えベクターに挿入され、そして所望の形質転換された宿主細胞中でアディポネクチンの発現に必要な調節配列に作動可能に連結される。
当然、すべてのベクターおよび発現調節配列が、本明細書中に記載のポリペプチド改変体をコードしているヌクレオチド配列を発現するに十分に良好に機能するわけではないことは理解されるべきである。すべての宿主が同じ発現系を用いて等しく良好であるわけでもない。しかし、当業者は、過度の実験を伴うことなく、これらのベクター、発現調節配列、および宿主の間の選択を行い得る。例えば、ベクターを選択する際に、ベクターが宿主中で複製しなくてはならないので、または、染色体中に組み込まれなければならないので、宿主が考慮されなくてはならない。ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現（例えば、抗生物質マーカー）もまた、考慮されるべきである。発現調節配列を選択する際に、種々の因子もまた考慮されるべきである。これらには、例えば、配列の相対的な長さ、その制御可能性、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とのその適合性（特に、潜在的な二次構造に関するもの）が含まれる。宿主は、選択されたベクターとのそれらの適合性、ヌクレオチド配列によってコードされる生成物の毒性、それらの分泌特性、ポリペプチドを正確に折りたたむそれらの能力、それらの発酵または培養の要求物、およびヌクレオチドによってコードされる生成物の精製の容易さの考慮によって選択されるべきである。
組換えベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体の複製と独立している（例えば、プラスミド）。代替的には、そのベクターは、宿主細胞に導入した場合に、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体とともに複製される。
ベクターは好ましくは発現ベクターであり、そこでは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列の転写に必要とされる付加的なセグメントに作動可能に連結されている。このベクターは、典型的には、プラスミドまたはウイルスDNA由来である。本明細書中で言及された、宿主細胞中での発現のための多数の適切な発現ベクターが市販されているか、または文献に記載されている。真核細胞宿主のための有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスからの発現調節配列を含むベクターが含まれる。特定のベクターは、例えば、pCDNA3.1（+）/Hyg（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）およびpCI-neo（Promega, La Jola, CA, USA）である。細菌宿主のための有用な発現ベクターには、大腸菌からのプラスミドのような公知の細菌プラスミド（これには、pBR322、pET3a、およびpET12a（両方ともNavagen Inc., WI USAから）が含まれる）、RP4、ファージDNAのような、より広範な宿主の範囲のプラスミド、例えば、NM989および他のDNAファージ、例えば、M13および糸状菌一本鎖DNAファージが含まれる。酵母細胞のための有用な発現ベクターには、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1ベクター（米国特許第4,931,373号）、（Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996）において記載されるpJSO37ベクター、およびpPICZ A, B, またはC（Invitrogen）が含まれる。昆虫細胞のための有用なベクターには、pVL941、pBG311（Cateら、「Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells」, Cell 45, 685-98 (1986)）、pBluebac4.5およびpMelbac（両方ともInvitrogenから市販されている）。
本発明における使用のための他のベクターには、コピー数で増幅されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を可能にするものが含まれる。このような増幅可能なベクターは当該分野で周知である。これらには、例えば、DHFR増幅（例えば、Kaufman、米国特許第4,470,461号、KaufmanおよびSharp、「Construction Of Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression」, Mol. Cell. Biol., 2, 1304-19頁（1982））およびグルタミンシンテターゼ（「GS」）増幅（例えば、米国特許第5,122,463号および欧州特許第338,841号）によって増幅されることができるベクターが含まれる。
組換えベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするDNA配列をさらに含み得る。このような配列の例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）、SV40の複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターが複製することを可能にする適切な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製起点である。
ベクターはまた、選択マーカーを含み得る。これは、例えば、その遺伝子産物が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子のような宿主細胞における欠損を相補する遺伝子、または、Schizosaccharomyces pombe TPI遺伝子（P.R.Russell, Gene 40, 1985, 125-130頁に記載されている）、または薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子である。糸状菌については、選択マーカーはamdS、pyrG、arcB、niaD、sCを含む。
用語「調節配列」は、本発明のポリペプチドの発現のために必要であるか、または有利であるすべての成分を含むことと本明細書中で定義される。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブまたは外来性であり得る。各調節配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー、または上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるがこれらに限定されない。最小限、調節配列はプロモーターを含む。
広範な種々の発現調節配列が本発明において使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前述の発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列、ならびに、原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている任意の配列、およびその種々の組み合わせが含まれる。
哺乳動物細胞における転写を指向するための適切な調節配列の例には、SV40およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えば、アデノウイルス2主要後期プロモーター、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（CMV）、ヒト伸長因子１α（EF-1α）プロモーター、Drosophila最小熱ショックタンパク質70プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、ヒトユビキチンC（UbC）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウイルスE1b領域ポリアデニル化シグナルおよびKozakコンセンサス配列（Kozak, M. J.Mol.Biol. 1987年8月20日; 196(4): 947-50）が含まれる。
哺乳動物細胞における発現を改善するために、合成イントロンが、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'非翻訳領域に挿入され得る。合成イントロンの例は、プラスミドpCI-Neo（Promega Corpoation, WI, USAから市販されている）からの合成イントロンである。
昆虫細胞において転写を指向するための適切な調節配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californica多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス最初期遺伝子1プロモーター、およびバキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター、およびSV40ポリアデニル化配列が含まれる。
酵母宿主細胞における使用のための適切な調節配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター、ADH2-4cプロモーターおよび誘導性GALプロモーターが含まれる。
糸状菌細胞における使用のための適切な調節配列の例には、ADH3プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKAのアミラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、またはアルカリホスファターゼ、A.nigerのα-アミラーゼ、A.nigerまたはA.nidulansのグルコアミラーゼ、A.nidulansのアセトアミダーゼ、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、TPIIターミネーターおよびADH3ターミネーターが含まれる。
細菌宿主細胞における使用のための適切な調節配列の例には、lac系、trp系、TACまたはTRC系のプロモーター、およびλファージの主要なプロモーター領域が含まれる。
アディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、部位特異的変異誘発、合成、もしくは他の方法によって調製されたにも関わらず、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが、それが発現される細胞から分泌される場合に存在する。このようなシグナルペプチドは、存在する場合、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対して、相同であってもよいし（すなわち、ヒトアディポネクチンと通常関連する）、または非相同であってもよく（すなわち、ヒトアディポネクチン以外の別の供給源から生じる）、あるいは、宿主細胞に対して相同であってもよいし、または非相同であってもよい（すなわち、宿主細胞から通常発現したシグナルペプチドであるか、または宿主細胞から通常発現したシグナルペプチドでない）。従って、シグナルペプチドは、原核生物性（例えば、大腸菌のような細菌由来）、または真核生物性（例えば、哺乳動物、または昆虫細胞、または酵母細胞由来）であり得る。
シグナルペプチドの有無は、例えば、ポリペプチドの産生のために使用される発現宿主細胞、発現されるタンパク質（それが細胞内タンパク質であるか、または細胞外タンパク質であるか）、および分泌物を得ることが所望されるか否かに依存する。糸状菌における使用のために、シグナルペプチドは、Aspergillus sp.のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼもしくはプロテアーゼ、またはHumicola langinosaのリパーゼをコードする遺伝子から首尾よく誘導され得る。シグナルペプチドは、A.oryzae TAKAアミラーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼ、またはA.nigerグルコアミラーゼをコードする遺伝子から好ましく誘導される。昆虫細胞における使用のために、シグナルペプチドは、昆虫遺伝子（国際公開公報第90/05783を参照されたい）、例えば、lepidopteran Manduca sexta a脂肪動員ホルモン前駆体（米国特許第5,023,328号を参照されたい）、ミツバチのメリチン（Invitrogen）、エクジステロイドUDPグルコシルトランスフェラーゼ（egt）（Murphyら、Protein Expression Purification 4, 349-357 (1993)）またはヒト膵臓リパーゼ（hpl）（Methods in Enzymology 284, 262-272頁、1997）から首尾よく誘導され得る。
哺乳動物細胞における使用のための好ましいシグナルペプチドは、本明細書中以後の実施例から明らかであるヒトアディポネクチンのそれか、またはマウスIgκ軽鎖シグナルペプチド（Coloma, M (1992) J.Imm. Methods 152: 89-104）である。酵母細胞における使用のために適切なシグナルペプチドは、S.cereviciaeからのα-因子シグナルペプチド（米国特許第4,870,008号を参照されたい）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O.Hagenbuchleら、Nature 289, 1981, 887-897頁）、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Vallsら、Cell 48, 1987, 887-897頁を参照されたい）、酵母BAR1シグナルペプチド（国際公開公報第87/02670号を参照されたい）、および酵母アスパラギンプロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M.Egel-Mitaniら、Yeast 6, 1990, 127-137頁を参照されたい）であることが見い出された。
任意の適切な宿主がアディポネクチンポリペプチドを産生するために使用され得、これらには、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適切な動物細胞もしくは細胞株、ならびにトランスジェニック動物細胞または植物細胞が含まれる。細菌宿主細胞の例には、バチルス株のようなグラム陽性細菌（例えば、B.brevisもしくはB.subtilis、シュードモナスまたはストレプトマイセス）、または大腸菌株のようなグラム陰性細菌が含まれる。ベクターの細菌宿主への導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えば、ChangおよびCohen、1979, Molecular Genetics 168: 111-115を参照されたい）、コンピテント細胞（例えば、YoungおよびSpizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829、またはDubauおよびDavidoff-Abelson、1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、ShigekawaおよびDower、1988, Biotechniques 6: 742-751を参照されたい）、または結合体化（例えば、KoehlerおよびThorne、1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照されたい）を使用してであり得る。
適切な糸状菌宿主細胞の例には、アスペルギルス株（例えば、A.oryzae、A.niger、またはA.nidulans、Fusarium、またはTrichoderma）が含まれる。真菌細胞は、それ自体公知の様式で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスによって形質転換され得る。Aspergillus宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、欧州特許第238,023号および米国特許第5,678,543号に記載されている。フザリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierら、1989, Gene 78: 147-156、および国際公開公報第WO96/00787号に記載されている。酵母は、BeckerおよびGuarente、Abelson, J.N.およびSimon, M.I.編、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 第194巻、182-187頁、Academic Press, Inc., New York; Itoら、1983、Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnenら、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920によって記載されている手順を使用して形質転換され得る。
適切な酵母宿主細胞の例には、サッカロマイセス株（例えば、S.cerevisiae）、シゾサッカロマイセス株、クリュイベロマイセス株、ピヒア株（例えば、P.pastorisまたはP.methanolica）、ハンゼヌラ株（例えば、H.Polymorpha）またはヤロウィア(Yarrowia)株が含まれる。異種DNAを用いて酵母細胞を形質転換するための方法、およびそこから異種ポリペプチドを産生する方法は、Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA（Yeastmaker（商標）Yeast Transformation System Kitのための製品プロトコールにおいて）によって、ならびにReevesら、FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, 第21巻、第18号、4414-4415頁、およびGanevaら、FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164によって開示されている。
適切な昆虫宿主細胞の例には、レピドプテラ細胞株（例えば、Spodoptera frugiperda（Sf9またはSf21））またはTrichoplusioa ni細胞（High Five）(米国特許第5,077,214号)が含まれる。昆虫細胞の形質転換および異種ポリペプチドの産生は、Invitrogenによって記載されるように実行され得る。
適切な哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株（例えば、CHO-K1；ATCC CCL-61）、ミドリザル細胞株（COS）（例えば、COS1（ATCC CRL-1650）、COS7（ATCC CRL-1651））、マウス細胞（例えば、NS/O）、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞株（例えば、ATCC CRL-1632またはATCC CCL-10）、ヒト細胞（例えば、HEK 293（ATCC CRL-1573））ならびに組織培養における植物細胞が含まれる。さらなる適切な細胞株は当該分野において公知であり、そして公的な寄託機関（例えば、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）から利用可能である。また、CHO細胞のような哺乳動物細胞は、アディポネクチンポリペプチドのグリコシル化の改善を提供するために、例えば、米国特許第5,047,335号に記載されるように、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、2,3-シアリルトランスフェラーゼまたは2,6-シアリルトランスフェラーゼ）を発現するように修飾され得る。
外来性のDNAを哺乳動物宿主に導入するための方法には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、Lipofectamin 2000を使用する、Life Technologies Ltd., Paisley, UKによって記載されるウイルスベクターおよびトランスフェクション方法、ならびに、FuGENE 6を使用する、Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USAによって記載されるウイルスベクターおよびトランスフェクション方法が含まれる。これらの方法は当該分野において周知であり、そして例えば、Ausbelら（編）、1996、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAによって記載されている。哺乳動物細胞の培養は、確立された方法（Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Nigel Jenkins編、1999、Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USAおよびHarrison MA およびRae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997において開示されているもの）に従って行われる。
本発明の製造方法において、細胞は、当該分野で公知の方法を使用して、ポリペプチドの産生のために適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適切な培地中で実行される実験室用または工業用ファーメンター中で、ポリペプチドが発現および／または単離されることを可能にする条件下で、振盪フラスコ培養、小スケールまたは大スケール発酵（連続発酵、バッチ発酵、流加培養発酵、または固体発酵を含む）によって培養され得る。培養は、炭素源および窒素源、ならびに無機イオンを含む適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は、商業的な供給業者から市販されているか、または公開された組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおいて）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、そのポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、そのポリペプチドは細胞溶解物から回収され得る。好ましくは、カルシウムを含む培地（例えば、DMEM/F-12（1:1）培地カタログ番号21041（Invitrogen））が使用される。しかし、カルシウムを含まない培地（例えば、DMEMカタログ番号21068（Invitrogen））もまた使用され得る。
得られるポリペプチドは当該分野で公知の方法によって回収され得る。例えば、そのポリペプチドは、従来の方法（遠心分離、濾過、抽出、スプレードライ、エバポレーション、または沈殿を含むがこれらに限定されない）によって栄養培地から回収され得る。
ポリペプチドは、当該分野で公知の種々の手順（クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製的等電点電気泳動）、溶解性の違い（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS-PAGE、または抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. JansonおよびLars Ryden編、VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい）を含むがこれらに限定されない）によって精製され得る。
結合体、または本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントの調製に関連して、哺乳動物細胞において、所望のアディポネクチンポリペプチド（例えば、配列番号：2〜8、10〜13、および17〜61のいずれか一つ）を調製する新規な方法が確立された。基本的には、シグナルペプチドapM1（1〜17）をコードするcDNA（ここで、最後の2つのC末端アミノ酸はHDであり、そしてアディポネクチンポリペプチドはN末端アミノ酸としてGly残基を有する）が実施例に記載されるように調製された。適切なシグナルペプチドを予測するために、SignalP V1.1 World Wide Webサーバーを使用して、本発明者らは、シグナルペプチドおよび所望のアディポネクチンポリペプチドのC末端部分のHDGアミノ酸配列の作製が、HDGのGの後に切断部位を生じることを発見した。apM1のコラーゲン性ドメインにおける天然に存在するグリシンを使用して、実施例に概略されているようにcDNAを構築することによって、切断部位が、例えば、apM1のコラーゲンドメインの、G42、G45、G48、G51、G54、G57、G60、またはG63の後で確立され得る（従って、N末端アミノ酸残基：I43、H46、H49、A52、R55、R58、T61、またはE64それぞれを遊離させる）。この点に関して、シグナルペプチドは、C末端の最後の2つのアミノ酸としてHisおよびAspを含むべきであり、または代替的には、切断部位がG57またはG60の後で確立された場合には、シグナルペプチドはC末端の最後のアミノ酸としてHisを含み得、そしてAsp56またはAsp59をそれぞれ使用し得る。しかし、アディポネクチンポリペプチドの任意の所望のフラグメントが調製され得、その場合には、シグナルペプチドのC末端の最後の3つのアミノ酸はHDGであるべきであり；非限定的な例は、C末端の最後の3つのアミノ酸がHDCであるシグナルペプチドをコードするcDNA配列を調製することによるapM1（101〜244）の調製であり、従って、apM1（101〜244）は、哺乳動物細胞（例えば、上記に言及したもののいずれか一つ、好ましくはCHO細胞）が、シグナルペプチドのC末端のGと、apM1（101〜244）のK101との間を切断することを可能にする。従って、C末端の最後の3つのアミノ酸がHDCであるシグナルペプチドはまた、GまたはDGがアディポネクチンポリペプチドのN末端アミノ酸である上記に言及した状況をも網羅する。
従って、さらなる局面において、本発明は、以下を包含するアディポネクチンポリペプチドを調製する方法に関する：
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し、ここで、シグナルペプチドのC末端の最後の3アミノ酸がHDGである、段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、ならびに
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階。
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し、ここで、シグナルペプチドのC末端の最後の3アミノ酸がHDGである、段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、ならびに
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階。
さらなる局面において、本発明は、以下を包含するアディポネクチンポリペプチドを調製する方法に関する：
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し、ここで、シグナルペプチドのC末端の最後の3アミノ酸がHDGである、段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、ならびに
e）このアディポネクチンポリペプチドを入手する段階。
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製し、ここで、シグナルペプチドのC末端の最後の3アミノ酸がHDGである、段階、
b）このヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）このアディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、ならびに
e）このアディポネクチンポリペプチドを入手する段階。
一つの実施態様において、段階d）はアディポネクチンポリペプチドを発現および分泌する段階を包含する。
段階e）においてアディポネクチンポリペプチドを入手することは、典型的には、発現および選択的に分泌したアディポネクチンポリペプチドを回収および生成することを包含する。このような回収および精製の方法は当業者に利用可能であり、そして適切な例が上記に概略される。
さらなる実施態様において、ヌクレオチド配列は、RNA、DNA、またはcDNA、好ましくはcDNAから選択される。さらなる実施態様において、RNA、DNA、またはcDNAは、配列番号：9、14、15、または16から選択される配列、ならびに配列番号：9、14、15、または16のいずれか一つと少なくとも70％の相同性を有する配列を含む。配列番号：9、14、15、または16のいずれか一つと、少なくとも80％の相同性、例えば、90％、92％、95％、または98％の相同性を有する配列がより好ましい。
さらなる実施態様において、RNA、DNA、またはcDNAは、配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71から選択される配列、ならびに配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つと少なくとも70％の相同性を有する配列を含む。配列番号：62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つと、少なくとも80％の相同性、例えば、90％、92％、95％、または98％の相同性を有する配列がより好ましい。
さらなる実施態様において、シグナルペプチドは、配列
好ましくは、
から選択される。
さらなる実施態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスDNAのような発現ベクターである。
上記に言及した哺乳動物細胞のいずれかが、アディポネクチンポリペプチドを発現する宿主細胞として適切である。さらなる実施態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞から選択される。
本発明の他の方法
なおさらなる局面において、本発明は、免疫原性を減少させ、ならびに／あるいはアディポネクチンポリペプチドの機能的インビボ半減期および／または血清半減期を増大させる方法に関し、この方法は、非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基を、このような基を含まないタンパク質の表面に露出した位置に導入する段階、および非ポリペプチド部分のための結合基を構成する
アミノ酸残基を除去する段階、および得られた修飾されたポリペプチドを非ポリペプチド部分との結合体化に供する段階を包含する。
なおさらなる局面において、本発明は、免疫原性を減少させ、ならびに／あるいはアディポネクチンポリペプチドの機能的インビボ半減期および／または血清半減期を増大させる方法に関し、この方法は、非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基を、このような基を含まないタンパク質の表面に露出した位置に導入する段階、および非ポリペプチド部分のための結合基を構成する
アミノ酸残基を除去する段階、および得られた修飾されたポリペプチドを非ポリペプチド部分との結合体化に供する段階を包含する。
一つの実施態様において、非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、糖部分、親油性基、および有機誘導体化剤からなる群より選択される。
好ましくは、導入および／または除去されるアミノ酸残基は、本明細書において定義されたものである。
さらなる局面において、本発明は、上記の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントのいずれかを含む組成物に関する。このような組成物は、典型的には、以下に記載されるような薬学的組成物から選択されるが、フリーズドライしたバルク組成物、または液体組成物のようなバルク組成物であり得る。
本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの薬学的組成物および使用
以下のセクションにおいて、本発明の結合体への言及がなされるのみであるが、しかし、薬学的組成物の記載に関して、用語、結合体はまた、アディポネクチンポリペプチドならびにフラグメントを含む。本発明の結合体は、典型的には、0.001mg/kg〜0.5mg/kg体重の範囲の用量で投与される。投与される正確な用量は、状況に依存する。通常、用量は処置される状態または徴候の重篤度または伝播を予防または軽減する能力であるべきである。本発明の結合体または組成物の有効量は、特に、疾患、用量、投与スケジュール（結合体または組成物が単独で投与されるか、または他の治療剤と組み合わせて投与されるか）、組成物の血清半減期、および一般的な患者の健康に依存することは当業者に明らかである。
以下のセクションにおいて、本発明の結合体への言及がなされるのみであるが、しかし、薬学的組成物の記載に関して、用語、結合体はまた、アディポネクチンポリペプチドならびにフラグメントを含む。本発明の結合体は、典型的には、0.001mg/kg〜0.5mg/kg体重の範囲の用量で投与される。投与される正確な用量は、状況に依存する。通常、用量は処置される状態または徴候の重篤度または伝播を予防または軽減する能力であるべきである。本発明の結合体または組成物の有効量は、特に、疾患、用量、投与スケジュール（結合体または組成物が単独で投与されるか、または他の治療剤と組み合わせて投与されるか）、組成物の血清半減期、および一般的な患者の健康に依存することは当業者に明らかである。
本発明の結合体は、そのままの形態で、および／またはその塩の形態で使用され得る。適切な塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、およびマグネシウム、ならびに例えば亜鉛塩）が含まれるがこれらに限定されない。これらの塩または複合体は、結晶および／アモルファス構造として存在し得る。
本発明の結合体は、好ましくは、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物中で投与される。「薬学的に許容される」とは、それが投与される患者においていかなる有害な効果をも引き起こさない担体または賦形剤を意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該分野において周知である。
本発明の結合体は、周知の方法によって薬学的組成物に処方され得る。適切な処方は、米国特許第5,183,746号、Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin、第18版、A.R. Gennaro編、Mack Publishing Company[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. FrokjaerおよびL. Hovgaard編、Taylor＆Francis[2000]；およびHandbook of Pharmacutical Excipients, 第3版、A.Kibbe編、Pharmaceutical Press[2000]に記載されている。
本発明の結合体の薬学的組成物は、種々の形態で処方され得、これには、液体、ゲル、凍結乾燥、肺分散剤、または任意の他の適切な形態（例えば、圧縮固体として）が含まれる。好ましい形態は、処置される特定の徴候に依存し、そして当業者に明らかである。
本発明の組成物を含む薬学的組成物は、経口的、静脈内、脳内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、鼻腔内、肺内、吸入によって、または任意の他の受容可能な様式において（例えば、PowderJectまたはProLease技術を使用して）投与され得る。投与の好ましい様式は、処置される特定の徴候に依存し、かつ当業者に明らかである。
非経口投与
薬学的組成物の例は、非経口投与のために設計された溶液である。多くの場合において、薬学的組成物は即時使用のために適切である液体形態で提供されるが、このような非経口処方はまた、凍結または凍結乾燥の形態でも提供される。前者の場合において、組成物は使用前に融解されなければならない。後者の形態は、組成物に含まれる活性化合物の安定性を、種々の貯蔵条件下で高めるためにしばしば使用される。凍結乾燥した処方物が一般的にはそれらの液体の対応物よりもより安定であることが当業者に認識されているからである。このような凍結乾燥した調製物は、一つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤（例えば、注射のための滅菌水または滅菌した生理的食塩水溶液）の付加によって使用前に再構築される。
薬学的組成物の例は、非経口投与のために設計された溶液である。多くの場合において、薬学的組成物は即時使用のために適切である液体形態で提供されるが、このような非経口処方はまた、凍結または凍結乾燥の形態でも提供される。前者の場合において、組成物は使用前に融解されなければならない。後者の形態は、組成物に含まれる活性化合物の安定性を、種々の貯蔵条件下で高めるためにしばしば使用される。凍結乾燥した処方物が一般的にはそれらの液体の対応物よりもより安定であることが当業者に認識されているからである。このような凍結乾燥した調製物は、一つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤（例えば、注射のための滅菌水または滅菌した生理的食塩水溶液）の付加によって使用前に再構築される。
非経口投与の場合において、それらは、適切なように、当該分野において代表的に利用される一つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（これらのすべては、「賦形剤」と呼ばれる）、例えば、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張剤、非イオン性デタージェント、抗酸化剤、および／または他の種々の付加剤を伴う、所望の純度を有する結合体を混合することによって、貯蔵のために、凍結乾燥した処方物または水性溶液として調製される。
緩衝剤は、生理学的条件に近接する範囲にpHを維持することを補助する。これらは、典型的には、約2mMから約50mMの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するための適切な緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方およびそれらの塩が含まれ、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸一ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸―水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）である。さらなる可能性は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリメチルアミン塩（例えば、Tris）である。保存剤は、微生物増殖を抑制するために付加され、そして典型的には、約0.2％〜1％（w/v）の量で付加される。本発明との使用のために適切な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンズアルコニウムハライド（例えば、ベンズアルコニウムクロライド、ブロミド、またはヨーダイド）、ヘキサメトニウムクロライド、アルキルパラベン（例えば、メチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および3-ペンタノール）が含まれる。
等張剤は液体組成物の等張性を確実にするために付加され、これには、多価糖アルコール、好ましくは3個またはそれ以上の水酸基を含む糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール）が含まれる。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、重量で0.1％〜25％、典型的には1％〜5％の間の量で存在し得る。
安定剤は、その機能において、バルキング剤から、治療剤を可溶化するか、または変性もしくは容器壁への吸着を妨害することを補助する添加剤までの、広範な賦形剤のカテゴリーをいう。代表的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に列挙した）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖または糖アルコール（例えば、乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど（イノシトールのようなシクリトールを含む））；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜10残基）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；単糖類（例えば、キシロース、フルクトース、およびグルコース）；二糖類（例えば、乳糖、マルトース、およびショ糖）；三糖類（例えば、ラフィノース）および多糖類（例えば、デキストラン）。安定剤は、活性タンパク質重量に基づいて、重量で、典型的には、0.1〜10,000部の範囲で存在する。
非イオン性界面活性剤またはデタージェント（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤を安定化させること、ならびに攪拌によって誘導された凝集を保護することを補助するために存在し得、これはまた、ポリペプチドの変性を引き起こすことなく、処方物が、表面張力を切るように露出されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（20、80など）、ポリオキサマー（184、188など）、Pluronic（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Tween（登録商標）20、Tween（登録商標）80など）が含まれる。
さらなる種々の賦形剤には、バルキング剤または充填剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、EDTA）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）および共溶媒が含まれる、活性成分はまた、例えば、コアサーベーション（coascervation）技術または界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、またはポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにトラップされ得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 前出に開示される。
インビボ投与のために使用され得る非経口処方物は無菌でなくてはならない。これは、例えば、滅菌濾過メンブレンを通す濾過によって容易に達成される。
徐放性製剤
徐放性製剤の適切な例には、結合体を含む固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックス、フィルムもしくはマイクロカプセルのような適切な形態を有するマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、L-グルタミン酸およびエチルL-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ProLease（登録商標）技術またはLupron Depot（登録商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ-D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、長期間、例えば、100日間以上、分子の放出を可能にするのに対して、特定のハイドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが体内に長期間残存する場合、これらは、37℃への露出の結果として変性または凝集し得、生物学的活性の損失および免疫原性の変化の可能性を生じる。合理的なストラテジーは、関与するメカニズムに依存して安定化のために工夫され得る。例えば、凝集のメカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介する分子間S-S結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、湿度の含量を制御すること、適切な付加物を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
徐放性製剤の適切な例には、結合体を含む固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックス、フィルムもしくはマイクロカプセルのような適切な形態を有するマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、L-グルタミン酸およびエチルL-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ProLease（登録商標）技術またはLupron Depot（登録商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ-D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、長期間、例えば、100日間以上、分子の放出を可能にするのに対して、特定のハイドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが体内に長期間残存する場合、これらは、37℃への露出の結果として変性または凝集し得、生物学的活性の損失および免疫原性の変化の可能性を生じる。合理的なストラテジーは、関与するメカニズムに依存して安定化のために工夫され得る。例えば、凝集のメカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介する分子間S-S結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、湿度の含量を制御すること、適切な付加物を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
肺送達
噴霧器、ジェット式または超音波式のいずれかを用いる使用のために適切な結合体処方は、典型的には、例えば、溶液mLあたり約0.01〜25mgの結合体、好ましくは約0.1〜10mg/mLの濃度で水に溶解した結合体を含む。この処方物はまた、緩衝剤および単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のため）、ならびに／またはヒト血清アルブミン（0.1〜10mg/mLの濃度範囲）を含み得る。使用され得る緩衝剤の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸およびグリシンである。好ましくは、緩衝剤は、3〜9の範囲のpHに溶液を調整するのに適切な組成およびモル濃度を有する。一般的に、1mM〜50mMのモル濃度の緩衝剤がこの目的のために適切である。利用され得る糖の例は、乳糖、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常、処方物の重量で1％〜10％の範囲の量である。
噴霧器、ジェット式または超音波式のいずれかを用いる使用のために適切な結合体処方は、典型的には、例えば、溶液mLあたり約0.01〜25mgの結合体、好ましくは約0.1〜10mg/mLの濃度で水に溶解した結合体を含む。この処方物はまた、緩衝剤および単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節のため）、ならびに／またはヒト血清アルブミン（0.1〜10mg/mLの濃度範囲）を含み得る。使用され得る緩衝剤の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸およびグリシンである。好ましくは、緩衝剤は、3〜9の範囲のpHに溶液を調整するのに適切な組成およびモル濃度を有する。一般的に、1mM〜50mMのモル濃度の緩衝剤がこの目的のために適切である。利用され得る糖の例は、乳糖、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常、処方物の重量で1％〜10％の範囲の量である。
噴霧器処方物はまた、エアロゾルを形成する際に溶液の噴霧によって引き起こされるタンパク質の表面誘導された凝集を減少または妨害するための界面活性剤を含み得る。種々の従来の界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸およびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが利用され得る。量は、処方物の重量で、0.001％と4％との間の範囲にわたる。本発明の目的のための特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
特定の処方および本発明の液体粒子の適切な分散物を生成する方法は、国際公開公報第9420069号、米国特許第5915378号、同第5960792号、同第5957124号、同第5934272号、同第5915378号、同第5855564号、同第5826570号、および同第5522385号に記載され、これらは、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明の実施のために適切な市販の噴霧器の3つの特定の例は、Ultravent噴霧器（Mallinckrodt, Inc., St. Louis, MO.により製造）、AcornII噴霧器（Marquest Medical Products, Englewood, Coloradoにより製造）、およびAERx肺薬物送達システム（Aradigm Corporation, Hayward, Californiaにより製造）である。
メーター表示された用量吸入器デバイスを用いる使用のための結合体処方は、一般的に、微細に分離された粉末を含む。この粉末は、凍結乾燥すること、次いで、液体結合体処方物を製粉することによって製造され得、そしてまた、ヒト血清アルブミン（HSA）のような安定剤を含み得る。典型的には、0.5％（w/w）より多くのHSAが付加される。さらに、必要な場合、一つまたは複数の糖または糖アルコールが調製物に付加され得る。例としては、乳糖、マルトース、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが含まれる。処方物に付加する量は、存在する結合体の0.01〜200％（w/w）、好ましくは、1〜50％の範囲にわたり得る。次いで、このような処方物は凍結乾燥され、そして所望の粒子サイズに製粉される。
次いで、正確なサイズとされた粒子は、界面活性剤の補助で噴霧剤中に懸濁される。この噴霧剤は、この目的のため利用される任意の従来的な物質（例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタン、またはこれらの組み合わせ）であり得る。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンが含まれる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用であり得る。次いで、この混合物は、送達デバイスにロードされる。本発明の使用のために適切な市販のメーター表示された用量吸入器の例は、Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.によって製造された、Ventolin metered dose inhalerである。
粉末吸入器のためのこのような結合体処方物は、結合体を含む微細に分離された乾燥粉末を含み、そして乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールのようなバルキング剤もまた、デバイスからの粉末の分散を容易にするような量で、例えば、処方剤の重量で50％〜90％含み得る。粉末の粒子は、10μm未満、好ましくは0.5〜5μmの間、最も好ましくは、1.5〜3.4μmの間のメジアン直径を有する約1g/cm2の密度の粒子に対応する、肺の空気力学的な特性を有するべきである。
本明細書における教示に従う使用に適切な粉末吸入器の例は、Fisons Corp., Bedford, Massによって製造されたSpinhaler powder inhalerである。これらのデバイスのための粉末は、米国特許第5997848号、同第5993783号、同第5985248号、同第5976574号、同第5922354号、同第5785049号、および同第55654007号において開示される方法によって生成および／または送達され得る。
本発明の結合体を含む薬学的組成物は、治療的生成物（噴霧器、メーター表示された用量吸入器、および噴霧吸入器を含むがこれらに限定されない、これらのすべては当業者によく知られている）の肺送達のために設計された広範囲の機械的デバイスによって投与され得る。
本発明の実施のために適切な市販のデバイスのいくつかの特定の例は、Mallinckrodt., St.Louis, Missouriによって製造されたUltravent nebulizer；Marquwst Medical Products, Englewood, Coloradoによって製造されたAcornII nebulizer；Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolinaによって製造されたVentolin metered dose inhaler；Fisons Corp., Bedford, Massachusettsによって製造されたSpinhaler powder inhaler；Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, Californiaの「standing cloud」デバイス；Alkermes, Cambridge, Massachusettsによって製造されたAIR inhaler；Aradigm Corporation, Hayward, Carforniaによって製造されたAERx pulmonary drug delivery systemである。
本発明の薬学的組成物は、他の治療剤と組み合わせて投与され得る。これらの治療剤は、同じ薬学的組成物の一部として組み込まれ得るか、または、任意の他の受容可能な処置スケジュールと同時にもしくはそれに従うかのいずれかで、本発明の結合体とは分けて投与され得る。
さらなる局面において、本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、インスリン（例えば、ヒト組換えインスリン）とともに投与される。さらに、本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントまたは薬学的組成物は、他の治療に対する補助剤として使用され得る。
さらなる局面において、本発明は、本発明の結合体、および薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む薬学的組成物に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント、および薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む薬学的組成物に関する。
薬学的組成物の一部としてのアディポネクチンポリペプチドフラグメントは、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」および「カルシウム組成物の局面」に開示される局面または実施態様のいずれか一つから選択され得る。さらに、薬学的組成物の一部としての結合体は、上記のセクション「本発明の結合体の第1の群」「本発明の結合体の第2の群」「本発明の結合体の第3の群」および「本発明の結合体の第4の群」ならびに「カルシウム組成物の局面」において開示される局面または実施態様のいずれか一つから選択され得る。
従って、本発明は、1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；異脂肪血症；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセス；特に、IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患を有する哺乳動物を処置するための組成物および方法を提供する。
さらなる局面において、本発明は、1型糖尿病、IGT、2型糖尿病、X症候群、肥満症、または異脂肪血症、または、食物の摂取の減少を伴わない哺乳動物の体重減少を有する哺乳動物を治療する方法に関し、この方法は、本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの有効量を投与する段階を包含する。
さらなる局面において、本発明は、慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスを有する哺乳動物を治療する方法に関し、この方法は、本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの有効量を投与する段階を包含する。
さらなる局面において、本発明は、1型糖尿病の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、IGTの処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、2型糖尿病の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、X症候群の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、肥満症の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、異脂肪血症の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、敗血症性ショックの処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、食物の摂取の減少を伴わない哺乳動物の体重減少のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスを有する哺乳動物の処置のための医薬品の製造のための本発明の結合体またはアディポネクチンポリペプチドフラグメントの使用に関する。
実際、本発明者らは、本発明のアディポネクチンポリペプチド（カルシウムイオンを用いて安定化したアディポネクチンポリペプチドトリマーを含む組成物を含む）および本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメントが、TNFα阻害剤として優れた効果を有すること、そして単球細胞株においてLPS誘導性のTNFα産生を阻害することができたことを発見した。本発明のアディポネクチンポリペプチドがこの効果を有すること、およびこのことは、本発明のアディポネクチンポリペプチドが、ヒト細胞におけるTNFαの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態（例えば、敗血症性ショック）の処置における医薬品として有効であることは、全く予想できないことである。
従って、さらなる局面において、本発明は、ヒト細胞におけるTNFαの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態の処置のための医薬品の調製を目的とする、上記のセクション「本発明のアディポネクチンポリペプチドフラグメント」「本発明の結合体の第1の群」「本発明の結合体の第2の群」「本発明の結合体の第3の群」および「本発明の結合体の第4の群」ならびに「カルシウム組成物の局面」において言及されたもののいずれか一つのような、アディポネクチンポリペプチドまたは結合体の使用に関し、ここで、上記医薬品はTNFαの発現または放出を阻害する。
さらなる局面において、本発明は、
ヒト細胞におけるTNFαの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態の処置のための医薬品の調製を目的とする、
a）アディポネクチンポリペプチドトリマーを含む結合体であって、ここで、このアディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマー、およびアディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーいずれか一つに共有結合した一つの第1のポリマーを、得られるトリマーが一つのポリマーのみを含むように含む、結合体、ならびに
b）カルシウムイオン、を含み、
ここで、上記医薬品はTNFαの発現または放出を阻害する、
単離された複合体の使用に関する。
ヒト細胞におけるTNFαの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態の処置のための医薬品の調製を目的とする、
a）アディポネクチンポリペプチドトリマーを含む結合体であって、ここで、このアディポネクチンポリペプチドトリマーは、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマー、およびアディポネクチンポリペプチドトリマーの3つのモノマーいずれか一つに共有結合した一つの第1のポリマーを、得られるトリマーが一つのポリマーのみを含むように含む、結合体、ならびに
b）カルシウムイオン、を含み、
ここで、上記医薬品はTNFαの発現または放出を阻害する、
単離された複合体の使用に関する。
ヒト細胞におけるTNFαの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態は、例えば、任意の適切な動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトにおける、1型糖尿病、IGT、2型糖尿病、X症候群、肥満症、または異脂肪血症、あるいは、食物の摂取の減少を伴わない哺乳動物（特に、ヒト）の体重減少、慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスである。アディポネクチンポリペプチドを含む組成物または結合体の阻害効果を測定するための試験アッセイとして、実施例23に記載されるアッセイが使用され得る。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載される。この実施例は、いかなる様式においても、本明細書および特許請求の範囲の一般性を限定すると理解されるべきではない。
実験
構造
ヒトアディポネクチンの任意の部分の実験的構造は存在しない。マウス由来の相同タンパク質の球状部分のX線結晶学による実験的構造決定は、ShapiroおよびScherer（1998）Current Biology, 8, 335-338によって報告された。彼らは、2.1Åの解像度まで決定された、配列番号：1のV110〜N244に等価な領域の非対称ホモトリマーの構造を報告する。この領域において、マウス配列は、ヒト配列と比較して12個の違いを有する（すなわち、91％配列同一性）（スキーム1もまた参照されたい）。この構造は、βサンドイッチ構造モノマーの非対称トリマーを示し、各モノマーは、既知のTNF（腫瘍壊死因子）構造（例えば、Bannerら、（1993）Cell, 73, 431-445）と同一の10鎖のゼリーロール折りたたみトポロジーを有する。この構造において、ループ領域およびC末端に位置するこれらの領域の動的な振る舞いに大部分おそらく起因して、いくつかの領域は検出されなかった。これらの領域は以下であった（配列番号：1において示される相同ヒトタンパク質の残基の数字を使用し、そして（）内には、アクセッションコード1C28を有する、PDB（Bermanら（2000）Nucleic Acids Research, 28, 235-242）において寄託された構造ファイルからのもともとの数字を示す）：モジュールAにおいて：K192（A195）、G217（A220）-L224（A227）、N244（A247）。モジュールBにおいて：E120（B123）-V125(B128)、A181（B184）、N193（B196）、G217（B220）-N230（B233）、T243（B246）-N244（B247）。モジュールCにおいて：V125（C128）-N127（C130）、Y167（C170）-K169（C172）、Y186（C189）-D195（C198）、V215（C218）-V229（C232）、T243（C246）-N244（C247）（スキーム1もまた参照されたい）。
構造
ヒトアディポネクチンの任意の部分の実験的構造は存在しない。マウス由来の相同タンパク質の球状部分のX線結晶学による実験的構造決定は、ShapiroおよびScherer（1998）Current Biology, 8, 335-338によって報告された。彼らは、2.1Åの解像度まで決定された、配列番号：1のV110〜N244に等価な領域の非対称ホモトリマーの構造を報告する。この領域において、マウス配列は、ヒト配列と比較して12個の違いを有する（すなわち、91％配列同一性）（スキーム1もまた参照されたい）。この構造は、βサンドイッチ構造モノマーの非対称トリマーを示し、各モノマーは、既知のTNF（腫瘍壊死因子）構造（例えば、Bannerら、（1993）Cell, 73, 431-445）と同一の10鎖のゼリーロール折りたたみトポロジーを有する。この構造において、ループ領域およびC末端に位置するこれらの領域の動的な振る舞いに大部分おそらく起因して、いくつかの領域は検出されなかった。これらの領域は以下であった（配列番号：1において示される相同ヒトタンパク質の残基の数字を使用し、そして（）内には、アクセッションコード1C28を有する、PDB（Bermanら（2000）Nucleic Acids Research, 28, 235-242）において寄託された構造ファイルからのもともとの数字を示す）：モジュールAにおいて：K192（A195）、G217（A220）-L224（A227）、N244（A247）。モジュールBにおいて：E120（B123）-V125(B128)、A181（B184）、N193（B196）、G217（B220）-N230（B233）、T243（B246）-N244（B247）。モジュールCにおいて：V125（C128）-N127（C130）、Y167（C170）-K169（C172）、Y186（C189）-D195（C198）、V215（C218）-V229（C232）、T243（C246）-N244（C247）（スキーム1もまた参照されたい）。
マウスアディポネクチンの既知の構造に加えて、ヒトアディポネクチンに相同な別の分子の構造が報告された。Boginら（2002）Structure, 10, 165-173は、相同性コラーゲンXの球状部分の構造を報告する。この領域において、この分子は、ヒトアディポネクチンと59残基同一（すなわち、44％の同一性）を有する（スキーム3を参照されたい）。彼らは、十分に分解された対称型トリマーを報告し、ここで、報告されたマウスアディポネクチンに対する大部分の顕著な差異は、4つのカルシウムイオンおよび一つのナトリウムイオンの存在である。これらのイオンは、マウスアディポネクチンがこの構造中で乱れている領域に位置している。3つのカルシウムイオンは対称性によって関連付けられ、そして2つのアスパラギン酸残基（D626およびD634）の側鎖によって、E627の骨格のカルボニル酸素によって、および一つの水分子によって配位される。4つのカルシウムイオンは、3回対称軸に位置し、そしてまた、D634の3つのコピーの側鎖、ならびに、他の3つのカルシウムイオンの側鎖にもまた配意する同じ3つの水分子によって、配位される。ナトリウムイオンもまた、3コピーのQ635の基本骨格の酸素原子によって、かつ4つの水分子に配位される、中心のカルシウムイオンから5.98Åの3回対称軸上に位置する。
本発明者らの実験から（実施例24および25を参照されたい）、本発明者らは、apM1（82-244）のようなヒトアディポネクチンが、カルシウムイオンの存在下で、トリマー型で安定化されること、および、リン酸イオンの存在下でpHを低下させることによる不安定化は、不安定化されたトリマーを生じることを結論付けた。カルシウムを配位する残基がコラーゲンXとヒトアディポネクチンとの間で保存されているので、本発明者らは、ヒトアディポネクチンの球状ドメインにおけるD187およびD195がカルシウムイオンの結合に関与すること、およびこれらの位置における一つまたは両方の変異は、カルシウムイオンに対する親和性の減少を生じると結論する。理論に束縛されることなく、本発明者らは、カルシウムイオンを結合することに加えて、アディポネクチンは、おそらく、コラーゲンXと同様の様式で、ナトリウムイオンもまた結合すると考えている。金属イオンから約10Åの距離で対称軸に近接して位置する埋没した保存性ヒスチジン残基（H163）は、金属イオン結合およびトリマーの一般的な安定性において重要な役割を果たし得る。通常の条件下では、この残基は中性であるが、低pHおよび低カルシウムイオン濃度では、この残基はプロトン化され得、それによってトリマーのコアを不安定化し、実験的に決定されたマウスアディポネクチン構造に類似する構造を生じる（ここで、金属イオン結合部位を取り囲む構造部分は、フレキシブルとなり、かつ構造を取らなくなる）。他方、金属イオンの結合は（すなわち、高い金属イオン濃度）は、ヒスチジンのpKaを、これが低pHにおいてでさえプロトン化しないレベルにまで低くし得る。
コラーゲン分子のいくつかの実験的構造が存在し、これらのすべてが対称的に生じたコラーゲン様フラグメントに基づいている。既知の構造の対称性は、SCOPデータベース（Murzinら（1995）「SCOP：a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures」J. Mol. Biol. 247, 536-540）において見い出され得る。この研究において、Berisioら（2002）Protein Sci. 11, 262-270によって報告された構造が、ヒトアディポネクチンのコラーゲン部分のモデリングのために使用される。
方法
アクセス可能な表面領域（ASA）
コンピュータプログラムアクセス（B.LeeおよびF.M.Richards, J.Mol.Biol. 55: 379-400 (1971)）バージョン2（著作権（c）1983 Yale University）が使用され、構造中の個々の原子のアクセス可能な表面領域（ASA）を計算した。この方法は、典型的には、1.4Åのプローブサイズを使用し、そしてプローブの中心によって形成される領域としてアクセス可能な表面領域（ASA）を定義する。この計算の前に、すべての水分子およびすべての水素原子は、配位セットから除去されるべきである。他の原子はタンパク質に直接関連しないはずだからである。
アクセス可能な表面領域（ASA）
コンピュータプログラムアクセス（B.LeeおよびF.M.Richards, J.Mol.Biol. 55: 379-400 (1971)）バージョン2（著作権（c）1983 Yale University）が使用され、構造中の個々の原子のアクセス可能な表面領域（ASA）を計算した。この方法は、典型的には、1.4Åのプローブサイズを使用し、そしてプローブの中心によって形成される領域としてアクセス可能な表面領域（ASA）を定義する。この計算の前に、すべての水分子およびすべての水素原子は、配位セットから除去されるべきである。他の原子はタンパク質に直接関連しないはずだからである。
側鎖のフラクション性ASA
側鎖原子のフラクション性ASAは、側鎖の原子のASAの合計を、拡張されたALA-x-ALAトリペプチドにおける残基型の側鎖原子のASAを表す値で除算することにより計算した。Hubbard, Campbell, およびThornton（1991）J.Mol.Biol.220, 507-530を参照されたい。この例において、CA原子は、グリシン残基の側鎖として見なされるが、残りの残基については見なされない。以下の表は、側鎖について標準100％ASAとして使用される：
構造中に検出されない残基は、典型的には、100％の露出を有すると定義される。それらは、フレキシブルな領域中に存在していると考えられるからである。
側鎖原子のフラクション性ASAは、側鎖の原子のASAの合計を、拡張されたALA-x-ALAトリペプチドにおける残基型の側鎖原子のASAを表す値で除算することにより計算した。Hubbard, Campbell, およびThornton（1991）J.Mol.Biol.220, 507-530を参照されたい。この例において、CA原子は、グリシン残基の側鎖として見なされるが、残りの残基については見なされない。以下の表は、側鎖について標準100％ASAとして使用される：
原子間の距離の決定
原子間の距離は、分子グラフィックスソフトウェア（例えば、InsightII v98.0, MSI INC, またはInsightII v2000.1, Accelrys INC）を使用して最も容易に決定される。
原子間の距離は、分子グラフィックスソフトウェア（例えば、InsightII v98.0, MSI INC, またはInsightII v2000.1, Accelrys INC）を使用して最も容易に決定される。
相同性モデリング
一つまたは複数の既知の構造の配列との配列アラインメントに基づく相同性モデリングは、ソフトウェアModeller 98, MSI INC, またはModeller 2000.1, Accelrys INCを使用して実行する。
一つまたは複数の既知の構造の配列との配列アラインメントに基づく相同性モデリングは、ソフトウェアModeller 98, MSI INC, またはModeller 2000.1, Accelrys INCを使用して実行する。
ヒトアディポネクチンの球状部分のモデリングおよび表面アクセス可能性の決定
マウスアディポネクチン分子の球状部分の既知の構造に基づいて、ヒト配列への構造アラインメントがスキーム1に示すように構築された。このアラインメントから、一連の20のモデル構造が、スキーム2に示されるインプットファイルを使用するModeller 98を使用して構築された。V110〜N244の部分のみがモデル化された。さらなる分析を単純化するために、個々のモノマーは、サブルーチン「defsym」を使用して同一であるように制限し、それによって、相同性TNF様構造の大部分においてもまた見られるような対称性トリマーを生じる。9004の値を有する、最も低い「MODELLER OBJECTIVE FUNCTION」を伴う構造は、番号05の構造であった。この構造は、PROCHECKバージョン3.4（Laskowskiら（1993）J. Appl. Cryst. 26, 283-291）を用いる分析が、すべての残基について受容可能なジオメトリーを示した後で（Ramachandranプロットの許容されない領域の残基は伴わない）、最も代表的なものとして選択された。
マウスアディポネクチン分子の球状部分の既知の構造に基づいて、ヒト配列への構造アラインメントがスキーム1に示すように構築された。このアラインメントから、一連の20のモデル構造が、スキーム2に示されるインプットファイルを使用するModeller 98を使用して構築された。V110〜N244の部分のみがモデル化された。さらなる分析を単純化するために、個々のモノマーは、サブルーチン「defsym」を使用して同一であるように制限し、それによって、相同性TNF様構造の大部分においてもまた見られるような対称性トリマーを生じる。9004の値を有する、最も低い「MODELLER OBJECTIVE FUNCTION」を伴う構造は、番号05の構造であった。この構造は、PROCHECKバージョン3.4（Laskowskiら（1993）J. Appl. Cryst. 26, 283-291）を用いる分析が、すべての残基について受容可能なジオメトリーを示した後で（Ramachandranプロットの許容されない領域の残基は伴わない）、最も代表的なものとして選択された。
この例において、本発明者らは、インタクトなトリマーの文脈において、モデル番号005の第1のモノマー分子における側鎖の相対的な表面の接近可能性を決定した。他のモノマーについての表面の接近可能性もまた計算され、その値は、いくつかのループ領域（典型的には、残基の位置が、テンプレートのモノマーの少なくとも一つで決定された構造を有さなかったもの）を除いて、第1の分子についての値と一般的によく相関していた。これらの領域におけるモデリングの質としては、低品質であることが予測され、そして少なくとも一つのモノマーにおけるテンプレート構造におけるこれらの残基は、極度のフレキシビリティーを示したので、少なくとも一つのテンプレートモノマーにおいて決定されていない任意の位置が、100％の表面アクセス可能性を有すると規定される。これらの残基は、
である（本明細書では、残りの例と同様に、配列番号：1の残基の番号付けが使用される）。残基A108およびY109はモデルに含まれておらず、そして100％の表面アクセス可能性を有すると規定される。
表面露出
以下のリストは、表面領域計算の結果を記載し、100％の表面アクセス可能性を有すると規定された上記の残基に関して修正する。
以下のリストは、表面領域計算の結果を記載し、100％の表面アクセス可能性を有すると規定された上記の残基に関して修正する。
05モデルの第1のモノマー上のフラクション性ASA計算を実行することは、表面に露出したそれらの側鎖が0％である以下の残基を生じた：
。
以下の残基は、表面に露出したそれらの側鎖の25％より多くを有した：
。
以下の残基は、表面に露出したそれらの側鎖の50％より多くを有した：
。
以下の残基は、表面に露出したそれらの側鎖の100％を有した：
。
ヒトアディポネクチン（E82-N244）のカルシウム結合切断型のモデリングおよび表面アクセス可能性の決定
コラーゲンXの既知の構造におけるものと同様に、コラーゲン部分の文脈において、および結合した金属イオンの文脈において、ヒトアディポネクチンの球状ドメインをモデル化するために、フラグメントE82-N244のモデリングが実行された。このモデリングは、マウスアディポネクチン分子（ShapiroおよびScherer（1998）Current Biology, 8, 335-338）コラーゲンXの球状部分の既知の結晶構造（Boginら（2002）Structure, 10, 165-173）、および、Berisioら（2002）Protein Sci. 11, 262-270によって報告された、コラーゲン三重ヘリックスの結晶構造［（Pro-Pro-Gly）10］3に基づいた。
コラーゲンXの既知の構造におけるものと同様に、コラーゲン部分の文脈において、および結合した金属イオンの文脈において、ヒトアディポネクチンの球状ドメインをモデル化するために、フラグメントE82-N244のモデリングが実行された。このモデリングは、マウスアディポネクチン分子（ShapiroおよびScherer（1998）Current Biology, 8, 335-338）コラーゲンXの球状部分の既知の結晶構造（Boginら（2002）Structure, 10, 165-173）、および、Berisioら（2002）Protein Sci. 11, 262-270によって報告された、コラーゲン三重ヘリックスの結晶構造［（Pro-Pro-Gly）10］3に基づいた。
コラーゲンXの球状部分の構造は、対称型トリマー中のモノマーの一つのみを報告する。他の2つは、例えば、ソフトウェアSwiss-Pbd Viewer v.3.7（Guexら、1997、Electrophoresis 18, 2714-2723）を使用して、適切な対称性操作の適用により構築され得る。
コラーゲン構造から、A、B、およびCと標識されたモノマーは、モデリングにおいて使用された。
ヒトアディポネクチン配列に対する上記の構造のアミノ酸配列のアラインメントは、スキーム3に示されるように構築され、そしてモデリングの基礎であった。モデリングの前に、マウスアディポネクチン構造およびコラーゲンX構造は、Modeler 2000.1を使用して構造的にアラインされ、コラーゲン構造は、テンプレート構造のもともとの配置から、得られた構造に対していかなるバイアスをも最小化するように、約100Å離れた2つの他の分子に対して1の方向で配置した。
余分な制約が対称的なトリマー構造中で球状部分を保つために加えられているモデリングストラテジーは、Modelerソフトウェアにおいて、DEFINE_SYMMETRYコマンドの使用によって、同じコンホメーションにあるように、各トリマー中の残基V29-N244を制約することによって実施された。3つの個々のカルシウムイオンもまた、互いに制約された。
このアラインメントから、一連の20のモデル構造が、スキーム4に示されるインプットファイルを使用するModeller 2000.1を使用して構築された。17751の値を有する、最も低い「MODELLER OBJECTIVE FUNCTION」を伴う構造は、番号05の構造であった。この構造は、PROCHECKバージョン3.4（Laskowskiら（1993）J. Appl. Cryst. 26, 283-291）を用いる分析が、すべての残基について受容可能なジオメトリーを示した後で（Ramachandranプロットの許容されない領域の少数の残基は伴わない）、最も代表的なものとして選択された。これらの大部分はコラーゲン部分に属していた。
この例において、本発明者らは、インタクトなトリマーの文脈において、および5つの金属イオンを含める文脈において、モデル番号003の3つすべてのモノマー分子における側鎖の絶対的および相対的な表面の接近可能性を決定した。コラーゲンストークへの接触を有する残基がほとんどないことに加えて、3つのモノマーについての表面アクセス可能性は、一般的に、1.0Å2の平均の差を有する、側鎖アクセス可能表面領域の球状ドメイン（V110-N244）におけるのと全く同一であった。
表面露出
モデル03の3つのモノマー上のフラクション性ASA計算の実行は、3つすべてのモノマーにおける表面に対して露出したそれらの側鎖の0％を有する以下の残基を生じた：
モデル03の3つのモノマー上のフラクション性ASA計算の実行は、3つすべてのモノマーにおける表面に対して露出したそれらの側鎖の0％を有する以下の残基を生じた：
以下の残基は、少なくとも一つのモノマーにおいて、表面に露出したそれらの側鎖の25％より多くを有した：
。
以下の残基は、少なくとも一つのモノマーにおいて、表面に露出したそれらの側鎖の50％より多くを有した：
。
スキーム1
マウスアディポネクチンに対するヒトアディポネクチン（残基V110-N244）の球状ドメインの配列アラインメント。マウスタンパク質の構造における独立したモノマーの各々に存在する残基は、1C28_A、1C28_B、および1C28_Cと標識したラインに示される。
マウスアディポネクチンに対するヒトアディポネクチン（残基V110-N244）の球状ドメインの配列アラインメント。マウスタンパク質の構造における独立したモノマーの各々に存在する残基は、1C28_A、1C28_B、および1C28_Cと標識したラインに示される。
スキーム2
Modeler 98のためのインプットファイル
Modeler 98のためのインプットファイル
アラインメントファイル「align.pir」
スキーム3
マウスアディポネクチンおよびコラーゲンXの球状部分に対するヒトアディポネクチンの残基E82-N244の配列アラインメント。マウスタンパク質の構造中の3つの独立したモノマーの各々に存在する残基は、1C28_A、1C28_B、および1C28_Cと標識したラインに示される。コラーゲンX構造からの配列は1GR3と標識している。コラーゲンテンプレート構造の配列は1K6Fと標識している。
マウスアディポネクチンおよびコラーゲンXの球状部分に対するヒトアディポネクチンの残基E82-N244の配列アラインメント。マウスタンパク質の構造中の3つの独立したモノマーの各々に存在する残基は、1C28_A、1C28_B、および1C28_Cと標識したラインに示される。コラーゲンX構造からの配列は1GR3と標識している。コラーゲンテンプレート構造の配列は1K6Fと標識している。
スキーム4
Modeler 2000.1のためのインプットファイル
Modeler 2000.1のためのインプットファイル
アラインメントファイル「align.pir」
試験アッセイA：C2C12細胞におけるグルコースの取り込みに対するアディポネクチンの効果の測定
アディポネクチンポリペプチドまたは結合体が筋肉細胞においてグルコースの取り込みを増強することができるか否かを研究するために、基底レベルとインスリン刺激レベルの両方で、本発明者らは、C2C12細胞株（ATCC, Rockville, MD）を使用した。手短に述べると、C2C12細胞の4連の試料（105/ウェル）を、12ウェルプレートに、5％ウシ血清で補充したDMEM培地（1ml）中で、37℃、4日間、分化させた。次いで、分化したC2C12細胞を、異なる濃度のアディポネクチンポリペプチドまたは結合体中で24時間、好ましくは4時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、100nM インスリンの存在下／非存在下で30分間刺激した。ウェルを洗浄し、そして0.5μCi/ml 3H-D-グルコースの存在下で15分間インキュベートした。グルコースの取り込みを、溶液の吸引によって停止させた。次いで、細胞を3回洗浄し、そして細胞に付随する放射能を、0.1M NaOH中での細胞溶解、引き続くシンチレーション計数によって測定した。細胞溶解物のアリコートを、タンパク質定量のために使用した。
アディポネクチンポリペプチドまたは結合体が筋肉細胞においてグルコースの取り込みを増強することができるか否かを研究するために、基底レベルとインスリン刺激レベルの両方で、本発明者らは、C2C12細胞株（ATCC, Rockville, MD）を使用した。手短に述べると、C2C12細胞の4連の試料（105/ウェル）を、12ウェルプレートに、5％ウシ血清で補充したDMEM培地（1ml）中で、37℃、4日間、分化させた。次いで、分化したC2C12細胞を、異なる濃度のアディポネクチンポリペプチドまたは結合体中で24時間、好ましくは4時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、100nM インスリンの存在下／非存在下で30分間刺激した。ウェルを洗浄し、そして0.5μCi/ml 3H-D-グルコースの存在下で15分間インキュベートした。グルコースの取り込みを、溶液の吸引によって停止させた。次いで、細胞を3回洗浄し、そして細胞に付随する放射能を、0.1M NaOH中での細胞溶解、引き続くシンチレーション計数によって測定した。細胞溶解物のアリコートを、タンパク質定量のために使用した。
試験アッセイB：LPS-誘導性TNFα産生の阻害の測定
アディポネクチンポリペプチドまたは結合体がLPS-誘導性TNFα産生を阻害することができるか否かを研究するために、本発明者らは、単球細胞株THP-1（ATCC, Rockville, MD）を使用した。手短に述べると、THP-1細胞の3連の試料（105/ウェル）を、96ウェルプレート中で、滴定した量のアディポネクチン（無血清細胞培養培地中で（10mM HEPESを含むRPMI-1640）最大濃度500nM（25.5μg/ml））とともに、37℃でインキュベートした。
アディポネクチンポリペプチドまたは結合体がLPS-誘導性TNFα産生を阻害することができるか否かを研究するために、本発明者らは、単球細胞株THP-1（ATCC, Rockville, MD）を使用した。手短に述べると、THP-1細胞の3連の試料（105/ウェル）を、96ウェルプレート中で、滴定した量のアディポネクチン（無血清細胞培養培地中で（10mM HEPESを含むRPMI-1640）最大濃度500nM（25.5μg/ml））とともに、37℃でインキュベートした。
アディポネクチンとの18時間のプレインキュベーションの後に、培養物を、最終濃度0.5μg/mlのリポポリサッカリド（LPS）（List Biologicals）とともにさらに4時間インキュベートし、次いで、50μlの上清を収集し、そして引き続くTNFαの分析のために-20℃で凍結した。
希釈した細胞培養物上清を、TNFα含量について標準的なELISA（R&D）を使用して分析し、そしてアディポネクチンのIC50について、4パラメーター非線形回帰データ分析を使用して計算した。
試験アッセイC：初代肝細胞におけるグルコース産生の測定
肝細胞の単一細胞懸濁液を、BerryおよびFriend（J.Cell.Biol. 43, 506-520, 1969）の手順、およびLeffertら（Methods Enzymol. 58, 536-544, 1979）の灌流混液を使用して、Sprague-Dawleyラットの灌流から得る。代替的には、ブタ肝細胞もまた使用し得る。細胞を、ラットテールコラーゲンIでプレコートした24ウェル培養プレート中、ウェルあたり2×105細胞の密度で、6時間、組織培養プラスチック上でプレーティングする。プレーティングの間、細胞を、10％FBS、ペニシリン／ストレプトマイシン、10μg/mlインスリン、および10μMデキサメタゾンで補充したRPM1640培地中で培養する。付着が可能になった後で、培地を、5mMグルコース、0.4％FCSを有し、およびインスリンまたはデキサメタゾンを含まないRPMIに交換する。細胞を、この低グルコース培地中で一晩均衡化させる。翌朝、この培地を交換し、インスリンおよび／または本発明の結合体を加え、そして処理を次の24時間続ける。刺激後、グルコース産生は、細胞を、それぞれ5mMのアラニン、バリン、グリシン、ピルビン酸、および乳酸を含む、グルコースを含まないRPMI中で6時間インキュベートすることによって測定する。引き続いて、グルコースをTrinderアッセイ（Sigma）を用いて測定する。グルコース産生の減少は、試験した結合体がインスリン感度を増大させることの明確な指標である。
肝細胞の単一細胞懸濁液を、BerryおよびFriend（J.Cell.Biol. 43, 506-520, 1969）の手順、およびLeffertら（Methods Enzymol. 58, 536-544, 1979）の灌流混液を使用して、Sprague-Dawleyラットの灌流から得る。代替的には、ブタ肝細胞もまた使用し得る。細胞を、ラットテールコラーゲンIでプレコートした24ウェル培養プレート中、ウェルあたり2×105細胞の密度で、6時間、組織培養プラスチック上でプレーティングする。プレーティングの間、細胞を、10％FBS、ペニシリン／ストレプトマイシン、10μg/mlインスリン、および10μMデキサメタゾンで補充したRPM1640培地中で培養する。付着が可能になった後で、培地を、5mMグルコース、0.4％FCSを有し、およびインスリンまたはデキサメタゾンを含まないRPMIに交換する。細胞を、この低グルコース培地中で一晩均衡化させる。翌朝、この培地を交換し、インスリンおよび／または本発明の結合体を加え、そして処理を次の24時間続ける。刺激後、グルコース産生は、細胞を、それぞれ5mMのアラニン、バリン、グリシン、ピルビン酸、および乳酸を含む、グルコースを含まないRPMI中で6時間インキュベートすることによって測定する。引き続いて、グルコースをTrinderアッセイ（Sigma）を用いて測定する。グルコース産生の減少は、試験した結合体がインスリン感度を増大させることの明確な指標である。
実施例1
CHOK1細胞におけるapM1（100-244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の8アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G99-E106）をコードする5'プライマー
を、3'プライマー
と一緒に、QUICK-Clone cDNA（ヒト脂肪細胞由来; #7128-1, Clontech, USA）をテンプレートとして含むPCR反応において使用することにより、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）、コラーゲン領域の最後の9アミノ酸（G99-G107）、続いて全体の球状ドメイン（A108-N244）をコードするcDNAフラグメントを単離する。SignalP World Wide Webサーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）は、G99とR100との間のシグナルペプチド切断の存在および位置を予測する。PCRフラグメントをBamHIおよびHindIIIで処理後、このフラグメントを、pcDNA3.1(-)Hygro/Intronと名付けられたベクター（pcDNA3.1(-)Hygro（Invitrogen, USA）の誘導体、ここでは、pCI-neo（Promega, USA）から得られたキメライントロンが、ベクターのMCSのBamHI部位とNheI部位の間に挿入されている）に挿入する。挿入されたPCRフラグメントの正確なDNA配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerの使用によって確認する。
CHOK1細胞におけるapM1（100-244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の8アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G99-E106）をコードする5'プライマー
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。安定なCHO K1プロデューサーを選択するために、培地（ここから360μg/mlハイグロマイシン（Gibco, USA）を含む）を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間後、培養培地を収集し、そしてapM1（100-244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。PA1-054免疫ペプチドは、マウスAcro30タンパク質のアミノ酸残基18〜32および187〜200に対応する。
および
Arp30の球状ドメインに位置する免疫ペプチドは、apM1タンパク質中の対応する配列と一つの位置で異なるのみである（K195N）。抗apM1ウサギ抗血清の調製はまた、配列
を有する合成ペプチドでウサギを免疫することによって容易になされ得る。本明細書以後で、安定なプールは、最も高度に産生するCHO K1クローンを単離するために、限界希釈法によってクローニングされる。
ウェスタンブロット（図1）において、市販のポリクローナル（ウサギ）抗Acrp-30抗体（Affinity BioReagents, USA）を検出抗体として使用して、安定プール（レーン7）から、および4つの選択したクローン（レーン8〜11）からのapM1（100〜244）の発現を示すことができた。クローンB49（レーン11）を、ローラーボトルにおけるapM1（100〜244）の無血清産生のために使用した。
実施例2
CHOK1細胞におけるapM1（82〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の26アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G81-A88）をコードする5'プライマー
を、3'プライマー
と一緒に、QUICK-Clone cDNA（ヒト脂肪細胞由来; #7128-1, Clontech, USA）をテンプレートとして含むPCR反応において使用することにより、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）、コラーゲン領域の最後の27アミノ酸（G81-G107）、続いて全体の球状ドメイン（A108-N244）をコードするcDNAフラグメントを単離する。SignalP World Wide Webサーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）は、G81とE82との間のシグナルペプチド切断の存在および位置を予測する。PCRフラグメントをBamHIおよびHindIIIで処理後、このフラグメントを、pcDNA3.1(-)Hygro/Intronと名付けられたベクター（pcDNA3.1(-)Hygro（Invitrogen, USA）の誘導体、ここでは、pCI-neo（Promega, USA）から得られたキメライントロンが、ベクターのMCSのBamHI部位とNheI部位の間に挿入されている）に挿入する。挿入されたPCRフラグメントの正確なDNA配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerの使用によって確認する。
CHOK1細胞におけるapM1（82〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の26アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G81-A88）をコードする5'プライマー
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。安定なCHO K1プロデューサーを選択するために、培地（ここから360μg/mlハイグロマイシン（Gibco, USA）を含む）を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間後、培養培地を収集し、そしてapM1（82〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。PA1-054免疫ペプチドは、マウスAcro30タンパク質のアミノ酸残基18〜32および187〜200に対応する。
および
Arp30の球状ドメインに位置する免疫ペプチドは、apM1タンパク質中の対応する配列と一つの位置で異なるのみである（K195N）。抗apM1ウサギ抗血清の調製はまた、配列
を有する合成ペプチドでウサギを免疫することによって容易になされ得る。本明細書以後で、安定なプールは、最も高度に産生するCHO K1クローンを単離するために、限界希釈法によってクローニングされる。
ウェスタンブロット（図1）において、市販のポリクローナル（ウサギ）抗Acrp-30抗体（Affinity BioReagents, USA）を検出抗体として使用して、安定プール（レーン2）から、および4つの選択したクローン（レーン3〜6）からのapM1（82〜244）の発現を示すことができた。クローンB49（レーン3）を、ローラーボトルにおけるapM1（82〜244）の無血清産生のために使用した。
実施例3
CHOK1細胞におけるapM1（58〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の50アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G57-E64）をコードする5'プライマー
を、3'プライマー
と一緒に、QUICK-Clone cDNA（ヒト脂肪細胞由来; #7128-1, Clontech, USA）をテンプレートとして含むPCR反応において使用することにより、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）、コラーゲン領域の最後の51アミノ酸（G57-G107）、続いて全体の球状ドメイン（A108-N244）をコードするcDNAフラグメントを単離する。SignalP World Wide Webサーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）は、G57とR58との間のシグナルペプチド切断の存在および位置を予測する。PCRフラグメントをBamHIおよびHindIIIで処理後、このフラグメントを、pcDNA3.1(-)Hygro/Intronと名付けられたベクター（pcDNA3.1(-)Hygro（Invitrogen, USA）の誘導体、ここでは、pCI-neo（Promega, USA）から得られたキメライントロンが、ベクターのMCSのBamHI部位とNheI部位の間に挿入されている）に挿入する。挿入されたPCRフラグメントの正確なDNA配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerの使用によって確認する。
CHOK1細胞におけるapM1（58〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の50アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G57-E64）をコードする5'プライマー
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。安定なCHO K1プロデューサーを選択するために、培地（ここから360μg/mlハイグロマイシン（Gibco, USA）を含む）を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間後、培養培地を収集し、そしてapM1（58〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。PA1-054免疫ペプチドは、マウスAcro30タンパク質のアミノ酸残基18〜32および187〜200に対応する。
および
Arp30の球状ドメインに位置する免疫ペプチドは、apM1タンパク質中の対応する配列と一つの位置で異なるのみである（K195N）。抗apM1ウサギ抗血清の調製はまた、配列
を有する合成ペプチドでウサギを免疫することによって容易になされ得る。本明細書以後で、安定なプールは、最も高度に産生するCHO K1クローンを単離するために、限界希釈法によってクローニングされる。
UCOE発現ベクターの使用によるCHOK1細胞におけるapM1（58〜244）の発現／分泌
apM1（58〜244）の発現レベルを増大させるために、キメライントロンおよびapM1（58〜244）をコードするcDNAを含むフラグメントを切除するために、上記で生成した構築物をNheIおよびPmeIで消化する。次いで、このフラグメントを、発現ベクターCET720（Cobra Therapeutics Limited, UK）（これは、CMVプロモーターの前方にクロマチン群オープニングエレメント（UCOE、国際公開公報第00/05393号もまた参照されたい）を含む）のNheI部位とPmeI部位との間に挿入する。
apM1（58〜244）の発現レベルを増大させるために、キメライントロンおよびapM1（58〜244）をコードするcDNAを含むフラグメントを切除するために、上記で生成した構築物をNheIおよびPmeIで消化する。次いで、このフラグメントを、発現ベクターCET720（Cobra Therapeutics Limited, UK）（これは、CMVプロモーターの前方にクロマチン群オープニングエレメント（UCOE、国際公開公報第00/05393号もまた参照されたい）を含む）のNheI部位とPmeI部位との間に挿入する。
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。翌日、培地を、安定なクローンを選択するために、12.5μg/mlピューロマイシン（Sigma）を含む培地に交換する。次の期間、選択培地を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間の時点で、培養試料を収集し、そしてapM1（58〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。apM1（58〜244）タンパク質を表す比較的強いバンドが、この時点でウェスタンブロット上で観察される。
実施例4
CHOK1細胞におけるapM1（52〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の56アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G51-R58）をコードする5'プライマー
を、3'プライマー
と一緒に、QUICK-Clone cDNA（ヒト脂肪細胞由来; #7128-1, Clontech, USA）をテンプレートとして含むPCR反応において使用することにより、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）、コラーゲン領域の最後の57アミノ酸（G51-G107）、続いて全体の球状ドメイン（A108-N244）をコードするcDNAフラグメントを単離する。SignalP World Wide Webサーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）は、G51とA52との間のシグナルペプチド切断の存在および位置を予測する。PCRフラグメントをBamHIおよびHindIIIで処理後、このフラグメントを、pcDNA3.1(-)Hygro/Intronと名付けられたベクター（pcDNA3.1(-)Hygro（Invitrogen, USA）の誘導体、ここでは、pCI-neo（Promega, USA）から得られたキメライントロンが、ベクターのMCSのBamHI部位とNheI部位の間に挿入されている）に挿入する。挿入されたPCRフラグメントの正確なDNA配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerの使用によって確認する。
CHOK1細胞におけるapM1（52〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の56アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の8アミノ酸（G51-R58）をコードする5'プライマー
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。安定なCHO K1プロデューサーを選択するために、培地（ここから360μg/mlハイグロマイシン（Gibco, USA）を含む）を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間後、培養培地を収集し、そしてapM1（52〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。PA1-054免疫ペプチドは、マウスAcro30タンパク質のアミノ酸残基18〜32および187〜200に対応する。
および
Arp30の球状ドメインに位置する免疫ペプチドは、apM1タンパク質中の対応する配列と一つの位置で異なるのみである（K195N）。抗apM1ウサギ抗血清の調製はまた、配列
を有する合成ペプチドでウサギを免疫することによって容易になされ得る。本明細書以後で、安定なプールは、最も高度に産生するCHO K1クローンを単離するために、限界希釈法によってクローニングされる。
UCOE発現ベクターの使用によるCHOK1細胞におけるapM1（52〜244）の発現／分泌
apM1（52〜244）の発現レベルを増大させるために、キメライントロンおよびapM1（52〜244）をコードするcDNAを含むフラグメントを切除するために、上記で生成した構築物をNheIおよびPmeIで消化する。次いで、このフラグメントを、発現ベクターCET720（Cobra Therapeutics Limited, UK）（これは、CMVプロモーターの前方にクロマチン群オープニングエレメント（UCOE、国際公開公報第00/05393号もまた参照されたい）を含む）のNheI部位とPmeI部位との間に挿入する。
apM1（52〜244）の発現レベルを増大させるために、キメライントロンおよびapM1（52〜244）をコードするcDNAを含むフラグメントを切除するために、上記で生成した構築物をNheIおよびPmeIで消化する。次いで、このフラグメントを、発現ベクターCET720（Cobra Therapeutics Limited, UK）（これは、CMVプロモーターの前方にクロマチン群オープニングエレメント（UCOE、国際公開公報第00/05393号もまた参照されたい）を含む）のNheI部位とPmeI部位との間に挿入する。
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。翌日、培地を、安定なクローンを選択するために、12.5μg/mlピューロマイシン（Sigma）を含む培地に交換する。次の期間、選択培地を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間の時点で、培養試料を収集し、そしてapM1（58〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによってアッセイする。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。apM1（52〜244）タンパク質を表す比較的強いバンドが、この時点でウェスタンブロット上で観察される。
実施例5
apM1ポリペプチドフラグメントのローラーボトル播種および無血清産生
T-175フラスコ中でのコンフルエントに際して、CHO K1細胞を産生するapM1ポリペプチドフラグメントを、10％FBSおよびペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）を補充した300mlのDMEM/F-12培地（Life Technologies #31330）中で、ローラーボトル（1700cm2）に移す。培地を、ボトルがコンフルエントに近づくまで（典型的には、4日後）、一日おきに交換する。次いで、培地を、1/1000 EX-CYTE（Serologicals Proteins #81129N）およびP/Sを補充した無血清UltraCHO培地（BioWhittaker #12-724）300mlに交換する。UltraCHO培地中の比較的高いタンパク質含量（300μg/ml）に起因して、この培地は、産生培地としては使用できない。しかし、この培地の使用は、最終産生培地においてより高い収量を与える、非常に厚い細胞層をもたらすことは明らかである。4日後（ここで、培地は一日おきに交換される）、ローラーボトルは産生のために容易であり、そして培地は、産生培地：1/100 ITSA（Life Technologies #51300-044）[ITSA: インスリン（1.0g/L）−トランスフェリン（0.55g/L）−セレン（0.67mg/L）、接着培養用の補充物]、1/1000 EC-CYTE、およびP/Sを補充した、フェノールレッドを有しないDMEM/F-12培地（Life Technologies #21041；116mg/l CaCl2を含む）にシフトする。産生期間の間、培地は毎日交換される。
apM1ポリペプチドフラグメントのローラーボトル播種および無血清産生
T-175フラスコ中でのコンフルエントに際して、CHO K1細胞を産生するapM1ポリペプチドフラグメントを、10％FBSおよびペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）を補充した300mlのDMEM/F-12培地（Life Technologies #31330）中で、ローラーボトル（1700cm2）に移す。培地を、ボトルがコンフルエントに近づくまで（典型的には、4日後）、一日おきに交換する。次いで、培地を、1/1000 EX-CYTE（Serologicals Proteins #81129N）およびP/Sを補充した無血清UltraCHO培地（BioWhittaker #12-724）300mlに交換する。UltraCHO培地中の比較的高いタンパク質含量（300μg/ml）に起因して、この培地は、産生培地としては使用できない。しかし、この培地の使用は、最終産生培地においてより高い収量を与える、非常に厚い細胞層をもたらすことは明らかである。4日後（ここで、培地は一日おきに交換される）、ローラーボトルは産生のために容易であり、そして培地は、産生培地：1/100 ITSA（Life Technologies #51300-044）[ITSA: インスリン（1.0g/L）−トランスフェリン（0.55g/L）−セレン（0.67mg/L）、接着培養用の補充物]、1/1000 EC-CYTE、およびP/Sを補充した、フェノールレッドを有しないDMEM/F-12培地（Life Technologies #21041；116mg/l CaCl2を含む）にシフトする。産生期間の間、培地は毎日交換される。
実施例6
CHOK1細胞におけるapM1（101〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の7アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の6アミノ酸（K101-E106）をコードする5'プライマー
を、3'プライマー
と一緒に、全長apM1 cDNAを有する、PF466と名付けられたプラスミドをテンプレートとして含むPCR反応において使用することにより、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）、コラーゲン領域の最後の7アミノ酸（K101-G107）、続いて全体の球状ドメイン（A108-N244）をコードするcDNAフラグメントを単離する。SignalP World Wide Webサーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）は、グリシンとK101との間のシグナルペプチド切断の存在および位置を予測する。PCRフラグメントをBamHIおよびHindIIIで処理後、このフラグメントを、pcDNA3.1(-)Hygro/Intronと名付けられたベクター（pcDNA3.1(-)Hygro（Invitrogen, USA）の誘導体、ここでは、pCI-neo（Promega, USA）から得られたキメライントロンが、ベクターのMCSのBamHI部位とNheI部位の間に挿入されている）に挿入する。挿入されたPCRフラグメントの正確なDNA配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerの使用によって確認する。
CHOK1細胞におけるapM1（101〜244）の発現／分泌
ヒトアディポネクチン（apM1）の球状ドメインを得るために、コラーゲン性領域の最後の7アミノ酸に続く、CHOK1細胞から分泌される、以下のcDNAが構築される：手短に述べると、apM1のシグナルペプチド（M1-D17）およびコラーゲン領域の6アミノ酸（K101-E106）をコードする5'プライマー
apM1（101〜244）の発現レベルを増大させるために、キメライントロンおよびapM1（101〜244）をコードするcDNAを含むフラグメントを切除するために、上記で生成した構築物をNheIおよびPmeIで消化する。次いで、このフラグメントを、発現ベクターCET720（Cobra Therapeutics Limited, UK）（これは、CMVプロモーターの前方にクロマチン群オープニングエレメント（UCOE）を含む）のNheI部位とPmeI部位との間に挿入する。
次いで、このプラスミドを、トランスフェクション剤としてFugene6（Roche, USA）の使用によって、CHO K1細胞にトランスフェクトする。翌日、培地を、安定なクローンを選択するために、12.5μg/mlピューロマイシン（Sigma）を含む培地に交換する。次の期間、選択培地を、初代の安定なトランスフェクション体のコンフルエント単層が得られるまで、毎日交換する。24時間の時点で、培養試料を収集し、そしてapM1（101〜244）タンパク質の存在について、ウェスタンブロッティングによって確認する。検出抗体として、ポリクローナル（ウサギ）抗−Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; #PA1-054）を使用し得る。安定なプールを、無血清産生のために3つのローラーボトルに直接的に拡大する。次いで、このタンパク質を、特徴付けのために精製する。
実施例7
CHO発現されたapM1（100〜244）の精製
1Lの無血清産生CHO細胞培養培地を、Millipore Labscale System上で、Biomax 5メンブレンを使用して超遠心分離する。緩衝液を、20mM Tris, 50mM NaCl, pH 8.0（緩衝液A）にシフトする。最終容量100ml。この溶液を、あらかじめ5カラム容量の緩衝液Aで平衡化した20ml Q-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、カラムを、3カラム容量の緩衝液Aで洗浄し、そして緩衝液Aから500mM NaClを含む緩衝液Aの、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。2mlフラクションを収集し、そしてA280およびSDS-PAGE分析からプールする。apM1（100〜244）を含むプールを2mlまで濃縮し、そしてViva spin column（5kDaカットオフ）を使用して、緩衝液を50mM Tris, 100mM NaCl pH 7.5に交換する。代表的な収量は、1l培養培地から0.5〜2mg apM1（100〜244）の範囲である。さらなる精製は、陰イオン交換カラムからの2mlの濃縮した溶離物を、あらかじめ20mM Tris, 100mM NaClで平衡化したSephacryl S-200 HR（16/60 Hi prep material, Pharmacia）に適用する、ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる。画分をSDS-PAGEによって分析し、そして純度に従ってプールする。物質は、SDS-PAGEから判断して、＞90％純度である。プールした画分を、Viva spin column（5kDaカットオフ）で濃縮し、そして-80℃で凍結する。
CHO発現されたapM1（100〜244）の精製
1Lの無血清産生CHO細胞培養培地を、Millipore Labscale System上で、Biomax 5メンブレンを使用して超遠心分離する。緩衝液を、20mM Tris, 50mM NaCl, pH 8.0（緩衝液A）にシフトする。最終容量100ml。この溶液を、あらかじめ5カラム容量の緩衝液Aで平衡化した20ml Q-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、カラムを、3カラム容量の緩衝液Aで洗浄し、そして緩衝液Aから500mM NaClを含む緩衝液Aの、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。2mlフラクションを収集し、そしてA280およびSDS-PAGE分析からプールする。apM1（100〜244）を含むプールを2mlまで濃縮し、そしてViva spin column（5kDaカットオフ）を使用して、緩衝液を50mM Tris, 100mM NaCl pH 7.5に交換する。代表的な収量は、1l培養培地から0.5〜2mg apM1（100〜244）の範囲である。さらなる精製は、陰イオン交換カラムからの2mlの濃縮した溶離物を、あらかじめ20mM Tris, 100mM NaClで平衡化したSephacryl S-200 HR（16/60 Hi prep material, Pharmacia）に適用する、ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる。画分をSDS-PAGEによって分析し、そして純度に従ってプールする。物質は、SDS-PAGEから判断して、＞90％純度である。プールした画分を、Viva spin column（5kDaカットオフ）で濃縮し、そして-80℃で凍結する。
実施例8
CHO発現されたapM1（82〜244）の精製
無血清培養培地を0.22μmフィルターで清澄化する。その後で、培地を、Millipore Labscale System上で、Biomax 10メンブレンを使用して超遠心分離することにより10倍まで濃縮し、そして3容量の20mM Tris, pH 7.4（緩衝液A）に対してダイアフィルトレートする。最初の精製を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行する。200mLの得られる溶液を、あらかじめ5カラム容量の緩衝液Aで平衡化した25ml Q-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、このカラムを、緩衝液Aから1M NaClを含む20％緩衝液Aの、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。10mlフラクションを収集する。クロマトグラフィーシステムは、280nmで検出する、PerSeptive BiosystemsからのVision BioCADである。約11mSで溶出するクロマトグラフィーピークを、20kDaよりもわずかに小さい分子量のタンパク質を含むとしてSDS-PAGE（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）によって同定する。このタンパク質を含む画分をプールする。さらなる精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得られる。陰イオン交換カラム後のプールに、3.5Mストックから、(NH4)2SO4を0.9Mまで加え、そしてあらかじめ5カラム容量の、NaOHでpH 7.2に調整した0.9M (NH4)2SO4および20mM NaH2PO4（緩衝液A）で平衡化した8mL Butyl 650S（TosoHaas）カラムに適用する。このカラムを、緩衝液Aから緩衝液B（NaOHでpH 7.2に調整した20mM NaH2PO4）の、15カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。8mLのカラム容量の画分を収集する。約120mM (NH4)2SO4で溶出するクロマトグラフィーピークを、20kDaよりもわずかに小さい分子量のほぼ純粋なタンパク質を含むとしてSDS-PAGE（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）によって同定する。関連する画分をプールし、そしてOD280を0.33と測定し、これは、理論的なモル吸光計数1.28を使用して、0.26ml/mLの濃度に対応する。精製タンパク質を-80℃で凍結する。
CHO発現されたapM1（82〜244）の精製
無血清培養培地を0.22μmフィルターで清澄化する。その後で、培地を、Millipore Labscale System上で、Biomax 10メンブレンを使用して超遠心分離することにより10倍まで濃縮し、そして3容量の20mM Tris, pH 7.4（緩衝液A）に対してダイアフィルトレートする。最初の精製を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行する。200mLの得られる溶液を、あらかじめ5カラム容量の緩衝液Aで平衡化した25ml Q-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、このカラムを、緩衝液Aから1M NaClを含む20％緩衝液Aの、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。10mlフラクションを収集する。クロマトグラフィーシステムは、280nmで検出する、PerSeptive BiosystemsからのVision BioCADである。約11mSで溶出するクロマトグラフィーピークを、20kDaよりもわずかに小さい分子量のタンパク質を含むとしてSDS-PAGE（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）によって同定する。このタンパク質を含む画分をプールする。さらなる精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得られる。陰イオン交換カラム後のプールに、3.5Mストックから、(NH4)2SO4を0.9Mまで加え、そしてあらかじめ5カラム容量の、NaOHでpH 7.2に調整した0.9M (NH4)2SO4および20mM NaH2PO4（緩衝液A）で平衡化した8mL Butyl 650S（TosoHaas）カラムに適用する。このカラムを、緩衝液Aから緩衝液B（NaOHでpH 7.2に調整した20mM NaH2PO4）の、15カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。8mLのカラム容量の画分を収集する。約120mM (NH4)2SO4で溶出するクロマトグラフィーピークを、20kDaよりもわずかに小さい分子量のほぼ純粋なタンパク質を含むとしてSDS-PAGE（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）によって同定する。関連する画分をプールし、そしてOD280を0.33と測定し、これは、理論的なモル吸光計数1.28を使用して、0.26ml/mLの濃度に対応する。精製タンパク質を-80℃で凍結する。
実施例9
CHO発現されたapM1フラグメントおよび類似体（例えば、apM1（82〜244）、apM1（100〜244）、apM1（101〜244）、またはS146C- apM1（82〜244））の精製のための代替的な一般的方法
無血清培養培地を0.22μmフィルターで清澄化する。その後で、培地を、例えば、Millipore Labscale System上で、Biomax 10メンブレンを使用して超遠心分離することにより10倍まで濃縮し、そしてHClでpH 7.4に調整した3容量の20mM Trisに対してダイアフィルトレートする。最初の精製を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行する。10カラム容量までのダイアフィルトレート液を、あらかじめ5カラム容量の1mM CaCl2、HClでpH 7.4に調整した20mM Tris（緩衝液A1）で平衡化したQ-Sepharose FF（Amersham Biosciences）カラムに適用する。適用後、このカラムを、緩衝液A1から緩衝液B（0.2M NaClを含む緩衝液A1）の、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。約0.5カラム容量の画分を収集する。クロマトグラフィーシステムは、280nmで検出する、Akta Purifier（Amersham Biosciences）である。SDS-PAGE分析（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）を使用して、所望の化合物を含む画分を選択する。このような画分は、apM1フラグメントまたは類似体モノマーの分子量に対応するタンパク質のバンドを含む。選択した画分をプールする。さらなる精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得られる。陰イオン交換カラム後のプールに、1容量の5M NaClを、2.5M NaClの最終濃度まで加え、そして、あらかじめ5カラム容量の、HClでpH 7.6に調整した2.5M NaCl、1mM CaCl2、20mM Tris（緩衝液A2）で平衡化した同様のサイズのButyl 650S（TosoHaas）カラムに適用する。このカラムを、緩衝液A2から緩衝液B2（HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris）の、15カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。約0.5カラム容量の画分を収集する。上記のようなSDS-PAGE分析を、標的化合物を含む画分の選択のために使用する。選択した画分をプールする。次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー後のプールを所望の濃度まで濃縮し（例えば、0.5〜1mg/mL）、そして、4容量の、HClでpH 6.8に調整した2mM CaCl2、10mM クエン酸ナトリウム、150mM NaClに対してダイアフィルトレートする。すぐに使用しない場合には、精製タンパク質は-80℃で凍結する。
CHO発現されたapM1フラグメントおよび類似体（例えば、apM1（82〜244）、apM1（100〜244）、apM1（101〜244）、またはS146C- apM1（82〜244））の精製のための代替的な一般的方法
無血清培養培地を0.22μmフィルターで清澄化する。その後で、培地を、例えば、Millipore Labscale System上で、Biomax 10メンブレンを使用して超遠心分離することにより10倍まで濃縮し、そしてHClでpH 7.4に調整した3容量の20mM Trisに対してダイアフィルトレートする。最初の精製を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行する。10カラム容量までのダイアフィルトレート液を、あらかじめ5カラム容量の1mM CaCl2、HClでpH 7.4に調整した20mM Tris（緩衝液A1）で平衡化したQ-Sepharose FF（Amersham Biosciences）カラムに適用する。適用後、このカラムを、緩衝液A1から緩衝液B（0.2M NaClを含む緩衝液A1）の、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。約0.5カラム容量の画分を収集する。クロマトグラフィーシステムは、280nmで検出する、Akta Purifier（Amersham Biosciences）である。SDS-PAGE分析（非還元、SDS試料緩衝液にて95℃で5分間処理）を使用して、所望の化合物を含む画分を選択する。このような画分は、apM1フラグメントまたは類似体モノマーの分子量に対応するタンパク質のバンドを含む。選択した画分をプールする。さらなる精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得られる。陰イオン交換カラム後のプールに、1容量の5M NaClを、2.5M NaClの最終濃度まで加え、そして、あらかじめ5カラム容量の、HClでpH 7.6に調整した2.5M NaCl、1mM CaCl2、20mM Tris（緩衝液A2）で平衡化した同様のサイズのButyl 650S（TosoHaas）カラムに適用する。このカラムを、緩衝液A2から緩衝液B2（HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris）の、15カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。約0.5カラム容量の画分を収集する。上記のようなSDS-PAGE分析を、標的化合物を含む画分の選択のために使用する。選択した画分をプールする。次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー後のプールを所望の濃度まで濃縮し（例えば、0.5〜1mg/mL）、そして、4容量の、HClでpH 6.8に調整した2mM CaCl2、10mM クエン酸ナトリウム、150mM NaClに対してダイアフィルトレートする。すぐに使用しない場合には、精製タンパク質は-80℃で凍結する。
apM1（82〜244）の特徴付け
精製apM1（82〜244）を、ProSorbデバイス中で、PVDFメンブレン上への固定化の後、自動化N末端アミノ酸配列決定に供した。
以下のアミノ酸配列が見い出された：
最初に、ヒドロキシ−Proが、アミノ酸配列決定の間にポジティブに同定され、これは、グリコシル化されたヒドロキシ−Lys（グリコ−ヒドロキシ−Lys）についての場合ではないことに注目するべきである。
精製apM1（82〜244）を、ProSorbデバイス中で、PVDFメンブレン上への固定化の後、自動化N末端アミノ酸配列決定に供した。
以下のアミノ酸配列が見い出された：
このことは、（ヒドロキシ−Pro−Pro）が示される位置において、ヒドロキシ−ProとProの両方が見い出され、ポジティブに同定されることを意味する。（グリコ−ヒドロキシ−Lys?/Lys）が示される位置において、Lysが見い出されかつポジティブに同定されるのに対して、グリコ−ヒドロキシ−Lysは、付加的に特異的であるが同定できないシグナルの存在に基いて示唆される（以下を参照されたい）こともまた意味する。
上記のアミノ酸配列は、apM1（82〜244）のN末端アミノ酸配列と同一であるが、以下のコメントが必要である。
86位のPro残基は、大体においてヒドロキシ−Pro−残基としてヒドロキシル化型で見い出される。しかし、ヒドロキシル化は部分的である。Proはまた容易に検出されるが、ヒドロキシ−Proよりもより少ない量であるからである。
91位のPro残基は、ヒドロキシル化されていることは見い出されない。ヒドロキシ−Proが検出されないからである。
95位のPro残基は、ほぼ独占的にヒドロキシ−Pro−残基としてヒドロキシル化型で見い出される。しかし、Proはまた検出されるが、非常に少ない量である。
104位のPro残基は、ほぼ独占的にPro−残基として非ヒドロキシル化型で見い出される。しかし、ヒドロキシル化は存在する。ヒドロキシ−Proはまた検出されるが、非常に少ない量であるからである。
101位におけるLys残基の状態は、評価することが困難であるが、Lysの量は予想されたよりも少ない。Lysのより低いシグナルに加えて、いくつかの同定されていないシグナルが見い出され、これは、潜在的にグリコ−ヒドロキシ−Lysを表す。このデータの本発明者らの解釈は、Lys101が部分的にヒドロキシル化され、そしてヒドロキシ−Lysが引き続きグリコシル化されることである。ヒドロキシ−Lysは、通常、グリコ−ヒドロキシ−Lysとしてグリコシル化型で見られるのみである。
精製apM1（82〜244）はまた、MALDI-TOF質量分析法に供せられ、そしてそれぞれ、18457Daおよび18800Daの分子量を有する2つの成分を含むことが見い出された。分析の前に試料を還元することは、これを変化させなかった。
apM1（82〜244）の理論的分子量は18424Daであり、そして分子量18457Daを有する型に対する33Daの分子量の違いは、Pro残基のヒドロキシル化によって説明され得るのに対して、分子量18800を有する型に対する343Daのさらなる分子量の違いは、Lys残基のヒドロキシル化および引き続くグリコシル化によって説明され得る。ヒドロキシ−Lys残基は、通常、グルコース−ガラクトース二糖が結合したグリコシル化型においてのみ見い出される。
86位のPro残基は、大体においてヒドロキシ−Pro−残基としてヒドロキシル化型で見い出される。しかし、ヒドロキシル化は部分的である。Proはまた容易に検出されるが、ヒドロキシ−Proよりもより少ない量であるからである。
91位のPro残基は、ヒドロキシル化されていることは見い出されない。ヒドロキシ−Proが検出されないからである。
95位のPro残基は、ほぼ独占的にヒドロキシ−Pro−残基としてヒドロキシル化型で見い出される。しかし、Proはまた検出されるが、非常に少ない量である。
104位のPro残基は、ほぼ独占的にPro−残基として非ヒドロキシル化型で見い出される。しかし、ヒドロキシル化は存在する。ヒドロキシ−Proはまた検出されるが、非常に少ない量であるからである。
101位におけるLys残基の状態は、評価することが困難であるが、Lysの量は予想されたよりも少ない。Lysのより低いシグナルに加えて、いくつかの同定されていないシグナルが見い出され、これは、潜在的にグリコ−ヒドロキシ−Lysを表す。このデータの本発明者らの解釈は、Lys101が部分的にヒドロキシル化され、そしてヒドロキシ−Lysが引き続きグリコシル化されることである。ヒドロキシ−Lysは、通常、グリコ−ヒドロキシ−Lysとしてグリコシル化型で見られるのみである。
精製apM1（82〜244）はまた、MALDI-TOF質量分析法に供せられ、そしてそれぞれ、18457Daおよび18800Daの分子量を有する2つの成分を含むことが見い出された。分析の前に試料を還元することは、これを変化させなかった。
apM1（82〜244）の理論的分子量は18424Daであり、そして分子量18457Daを有する型に対する33Daの分子量の違いは、Pro残基のヒドロキシル化によって説明され得るのに対して、分子量18800を有する型に対する343Daのさらなる分子量の違いは、Lys残基のヒドロキシル化および引き続くグリコシル化によって説明され得る。ヒドロキシ−Lys残基は、通常、グルコース−ガラクトース二糖が結合したグリコシル化型においてのみ見い出される。
MALDI-TOF質量分析法によって得られたデータは、N末端アミノ酸配列の決定の結果によって支持される。
2つの他の断片的な情報は、MALDI-TOF質量分析法から推定され得る。
第1の観察は、apM1（82〜244）の球状ドメインのアミノ酸残基Asn230における潜在的なNグリコシル化部位は使用されていない。これは、理論的な分子量と比較して有意な分子量の増加として検出されるからである。
第2の情報は、apM1（82〜244）の152位の単一のCys残基はチオール反応性化合物の結合によって修飾されていない。apM1（82〜244）の分子量は還元の際に変化しないからである。
要約すると、apM1（82〜244）は、この分子のコラーゲン様部分において、3つのPro残基で部分的にヒドロキシル化されており、そしてLys101残基で部分的にグリコ−ヒドロキシル化されている。
興味深いことに、apM1（82〜244）フラグメントのスペクトルにおいて見られるように、ヒドロキシル化およびグリコシル化成分は、非ヒドロキシ−グリコシル化成分と比較して、約60％を構成すると見積もられる。
apM1（100〜244）の特徴付け
精製apM1（100〜244）は、MALDI-TOF質量分析法に供せられ、そして、16718Daの分子量を有する一つの主要な成分を含むことが見い出された。apM1（100〜244）は、16715Daの理論的分子量を有する。17067Daの小さな成分もまた観察され、この成分はヒドロキシル化およびグリコシル化されたK101から生じる。主要な成分（16718Da）に対して、この成分は5％未満を構成すると見積もられる。
精製apM1（100〜244）は、MALDI-TOF質量分析法に供せられ、そして、16718Daの分子量を有する一つの主要な成分を含むことが見い出された。apM1（100〜244）は、16715Daの理論的分子量を有する。17067Daの小さな成分もまた観察され、この成分はヒドロキシル化およびグリコシル化されたK101から生じる。主要な成分（16718Da）に対して、この成分は5％未満を構成すると見積もられる。
apM1（101〜244）の特徴付け
MALDI-TOF質量分析法によって、16558.7Daを有する成分が、16558.4Daの理論的分子量を有するapM1（101〜244）として同定され得る。101位においてヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを示し得る成分は観察されない。これは、N末端アミノ酸としてのK101を有することが、K101でのいかなるヒドロキシ−グリコシル化をも伴うことなく、フラグメントをもたらすことを証明する。
MALDI-TOF質量分析法によって、16558.7Daを有する成分が、16558.4Daの理論的分子量を有するapM1（101〜244）として同定され得る。101位においてヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを示し得る成分は観察されない。これは、N末端アミノ酸としてのK101を有することが、K101でのいかなるヒドロキシ−グリコシル化をも伴うことなく、フラグメントをもたらすことを証明する。
実施例10
20kDqa PEGを有するapM1（100〜244）のN末端PEG化
本実施例で使用するapM1（100〜244）は、100mM リン酸緩衝液中1.5mg/mlのタンパク質濃度である。Shearwater Polymer, Inc.より入手したPEG-アルデヒド mW 20kDaを固体として加える。100mMリン酸緩衝液中の1M NaCNBH3ストック溶液を使用する。実験を以下のように実行する：20μl 1M NaCNBH3ストック溶液を、1mlのapM1（100〜244）溶液を含むEppendorfチューブに4℃で加える。混合後、8mgのPEG-アルデヒド mW 20kDaを加え、溶液を混合する。反応を、10時間、4℃で継続させる。この時点で、反応を、200UI 100mM HClの付加により停止させる。SDS-PAGEにより判断すると、約90%のapM1（100〜244）がモノPEG化される。さらなる精製は、100mMリン酸緩衝液pH 5.0に平衡化したSuperose6カラム（Pharmacia）を使用して実行する。モノPEG化された物質を、A280およびSDS-PAGEに基づいてプールする。
20kDqa PEGを有するapM1（100〜244）のN末端PEG化
本実施例で使用するapM1（100〜244）は、100mM リン酸緩衝液中1.5mg/mlのタンパク質濃度である。Shearwater Polymer, Inc.より入手したPEG-アルデヒド mW 20kDaを固体として加える。100mMリン酸緩衝液中の1M NaCNBH3ストック溶液を使用する。実験を以下のように実行する：20μl 1M NaCNBH3ストック溶液を、1mlのapM1（100〜244）溶液を含むEppendorfチューブに4℃で加える。混合後、8mgのPEG-アルデヒド mW 20kDaを加え、溶液を混合する。反応を、10時間、4℃で継続させる。この時点で、反応を、200UI 100mM HClの付加により停止させる。SDS-PAGEにより判断すると、約90%のapM1（100〜244）がモノPEG化される。さらなる精製は、100mMリン酸緩衝液pH 5.0に平衡化したSuperose6カラム（Pharmacia）を使用して実行する。モノPEG化された物質を、A280およびSDS-PAGEに基づいてプールする。
実施例11
5および12kDqa PEGを有するapM1（82〜244）のN末端PEG化
本実施例で使用するapM1（82〜244）は、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0中1.5mg/mlのタンパク質濃度である。Shearwater Corporationからの2つの異なるPEG-アルデヒド試薬（5kDaまたは12kDa）を利用した。活性化PEGを、固体として5モル濃度過剰（モルタンパク質あたり5モルPEG）を得るようにタンパク質溶液に加える。NaCNBH3試薬を、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0中の1Mストック溶液からタンパク質溶液に加える。
5および12kDqa PEGを有するapM1（82〜244）のN末端PEG化
本実施例で使用するapM1（82〜244）は、10mM 酢酸ナトリウム緩衝液、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0中1.5mg/mlのタンパク質濃度である。Shearwater Corporationからの2つの異なるPEG-アルデヒド試薬（5kDaまたは12kDa）を利用した。活性化PEGを、固体として5モル濃度過剰（モルタンパク質あたり5モルPEG）を得るようにタンパク質溶液に加える。NaCNBH3試薬を、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0中の1Mストック溶液からタンパク質溶液に加える。
実験を以下のように実行する：10μl 1M NaCNBH3ストック溶液を、0.5ml（0.75mg）のapM1（82〜244）溶液を含むEppendorfチューブに4℃で加え、得られる溶液を混合する。次いで、1.1mgの5kDa PEG-アルデヒドまたは2.6mgの12kDa PEG-アルデヒドのいずれかを加え、そして溶液を混合する。反応混液を、4℃のロッキングプラットフォーム上に配置し、5kDa PEGを使用して6〜7時間、または12kDa PEGを使用して4〜5時間反応を継続させる。
apM1（82〜244）トリマーのPEG化の程度を、以下の緩衝液：10mM 酢酸ナトリウム緩衝液、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0を移動相として使用するネイティブ条件下で実行する分析的Superdex 200（Amersham Biosciencesからのプレパック1.0cm ID×30cmカラム）SEC法を使用して評価し得る。1ml/分の流速および214nmでのUV検出を利用する。
上記のPEG化条件を使用すると、タンパク質混合物は、PEG化されていないapM1（82〜244）トリマー（約40〜50％）、一つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマー（約40〜50％）、および2つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマー（約10〜20％）から主としてなる。
PEG化の程度は、5kDaと12kDaの両方のPEGについて4℃で反応時間に高度に依存する。3つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマーの収量は、時間とともに有意に増加する。両方のPEGのサイズについて、3つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマーの収量は、4℃で20時間の反応時間後に50％以上である。
一つ、2つ、または3つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマーは、半調製的SECカラム（2.6cm ID×60cm）上で、Superdex 200調製グレードのレジン（Amersham Biosciences）を使用してさらに精製し得る。2ml以下の試料容量を、あらかじめ平衡化したSECカラムにロードし、そして4ml/分の流速を使用する。移動相は、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0からなる。一つ、2つ、または3つのPEGを有するapM1（82〜244）トリマーを含む画分を、分析的SEC法からの結果に基づいて、各々個々にプールする。
この残渣の遊離のPEGを、陰イオン交換体上で除去し得る。第1に、試料を限外濾過し、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィー段階の前に、例えば、Vivaspin 20モジュール（Vivascienceより）を使用して、10kDaカットオフメンブレンを用いて、HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris緩衝液に対して、ダイアフィルトレートする。このダイアフィルトレート液を、あらかじめ5カラム容量の、HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris（緩衝液A）で平衡化した20ml Q-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、カラムを、緩衝液Aから緩衝液B（0.2M NaClを含む緩衝液A）の、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。PEG化されたapM1（82〜244）を含む画分を、分析的SEC法および／またはSDS-PAGE分析からの結果に基づいてプールする。SDS-PAGE分析は変性条件下（非還元、SDS試料緩衝液中、70℃で10分間処理）で行うので、この方法は、残存する遊離のPEGを有しないapM1（82〜244）試料について使用されるのみである。
実施例12
T121C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、375塩基対および390塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、T121C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをハイグロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、T121C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により検出する。
T121C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例13
S146C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、453塩基対および312塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、S146C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをハイグロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、S146C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により検出する。
S146C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例14
T243C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、PCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、735bpのフラグメントを生じる。このフラグメントを、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、T243C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、T243C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により検出する。
T243C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、PCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例15
N127C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、393塩基対および372塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、N127C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、N127C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により評価する。
N127C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例16
N141C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、435塩基対および330塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、N141C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、N141C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により評価する。
N141C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例17
N228C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、PCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、735塩基対のフラグメントをそれぞれ生じる。このフラグメントを、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、N228C-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、N228C-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により評価する。
N228C-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、PCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例18
Y111N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、345塩基対および420塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、Y111N-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。N結合グリコシル化された標題の類似体、Y111N-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により検出する。100％のグリコシル化が観察される。
Y111N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例19
Y122N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、381塩基対および384塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、Y122N-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、Y122N-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により評価する。
Y122N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例20
D144N+S146T-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、450塩基対および315塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、D144N+S146T-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。標題の類似体、D144N+S146T-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により評価する。
D144N+S146T-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例21
R131N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
および
を用いて実行し、408塩基対および357塩基対の2つのフラグメントをそれぞれ生じる。これらの2つのフラグメントを、隣接するプライマーPBR195およびPBR193を用いる第3のPCR反応においてアセンブリする。得られる遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、R131N-apM1（82〜244）をもたらすような正確な塩基の変化を有することをDNA配列決定によって確認する。このcDNAを、上流のイントロンとともに、UCOEベクターCET720に移す。この構築物をCHOK1細胞にトランスフェクションし、安定なプールをピューロマイシンを用いて選択する。N結合グリコシル化された標題の類似体、R131N-apM1（82〜244）を、ウェスタンブロット上で、ポリクローナル（ウサギ）抗Acrp30抗体（Affinity BioReagents, USA; PA1-054）の使用により検出する。
R131N-apM1（82〜244）の構築および発現
apM1（82〜244）/pcDNA3.1(-)Hygro/Intronをテンプレートとして使用して、2つのPCR反応を、2つの重なり合うプライマーセット
実施例22
導入されたCys（Cys-apM1）を有するasM1フラグメントの類似体（例えば、T121C-apM1（82〜244）、S146C-apM1（82〜244）、またはT243C-apM1（82〜244））のCys-PEG化のための一般的方法
本実施例において使用されるCys-apM1（トリマーとして）は、20mM Tris緩衝液、1mM CaCl2、100mM NaCl, pH 7.4中、0.5mg/mlのタンパク質濃度である。PEG化に先立って、Cys-apM1試料をDDTで還元し、導入したシステイン残基は反応し得、次いで、DTTを、脱塩カラム上で以下に記載するように引き続いて除去する。Shearwater Corporationからの2つの異なるCys特異的PEG試薬を利用した。異なるサイズのmPEG-OPSSおよびmPEG-ビニルスルホンが存在する（5、10、または20kDa活性化PEG）。活性化PEGを、固体としてタンパク質溶液に加えて、25モル濃度過剰を得る（モルタンパク質あたり25モルPEG）。
導入されたCys（Cys-apM1）を有するasM1フラグメントの類似体（例えば、T121C-apM1（82〜244）、S146C-apM1（82〜244）、またはT243C-apM1（82〜244））のCys-PEG化のための一般的方法
本実施例において使用されるCys-apM1（トリマーとして）は、20mM Tris緩衝液、1mM CaCl2、100mM NaCl, pH 7.4中、0.5mg/mlのタンパク質濃度である。PEG化に先立って、Cys-apM1試料をDDTで還元し、導入したシステイン残基は反応し得、次いで、DTTを、脱塩カラム上で以下に記載するように引き続いて除去する。Shearwater Corporationからの2つの異なるCys特異的PEG試薬を利用した。異なるサイズのmPEG-OPSSおよびmPEG-ビニルスルホンが存在する（5、10、または20kDa活性化PEG）。活性化PEGを、固体としてタンパク質溶液に加えて、25モル濃度過剰を得る（モルタンパク質あたり25モルPEG）。
実験を、以下のように室温（20〜25℃）で実行する：20μl 0.5M DTTストック溶液を、0.5ml（0.25mg）のCys-apM1を含むEppendorfチューブに加え、得られる溶液を混合する。室温での30分間の反応時間後、DTTを、緩衝液として20mM Tris、1mM CaCl2、100mM NaCl、pH 7.4を使用して、平衡化したNAP-5（Amersham Biosciences）脱塩カラム上で除去する。試料を、脱塩カラムで2回希釈し、全量1.0mlの溶離液を得る。PEG化の前に、試料を、Vivaspin 2mlモジュール（Vivascienceより）を使用して、10kDaカットオフメンブレンを用いて濃縮し、0.5mg/mlのタンパク質濃度を得る。次いで、Cys-apM1溶液に、1.8mgの5kDa Cys特異的PEG試薬、3.6mgの10kDa Cys特異的PEG試薬、または7.2mgの20kDa Cys特異的PEG試薬のいずれかを加え、そして溶液を混合する。反応混液をロッキングプラットフォーム上に配置し、そして1時間、室温で反応を継続させる。
Cys-apM1のPEG化の程度を、以下の緩衝液：10mM 酢酸ナトリウム緩衝液、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0を移動相として使用するネイティブ条件下で実行する分析的Superdex 200（Amersham Biosciencesからのプレパック1.0cm ID×30cmカラム）SEC法を使用して評価し得る。1ml/分の流速および214nmでのUV検出を利用する。
一つ、2つ、または3つのPEGを有するCys-apM1（82〜244）を、半調製的SECカラム（2.6cm ID×60cm）上で、Superdex 200調製グレードのレジン（Amersham Biosciences）を使用してさらに精製し得る。2ml以下の試料容量を、あらかじめ平衡化したSECカラムにロードし、そして4ml/分の流速を使用する。移動相は、1mM CaCl2、200mM NaCl pH 5.0からなる。一つ、2つ、または3つのPEGを有するCys-apM1（82〜244）を含む画分を、分析的SEC法からの結果に基づいて、プールする。
SECカラム後のPEG化試料が、痕跡量の残渣の遊離のPEGを含む場合、これを、陰イオン交換体上で除去し得る。第1に、試料を限外濾過し、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィー段階の前に、例えば、Vivaspin 20モジュール（Vivascienceより）を使用して、10kDaカットオフメンブレンを用いて、HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris緩衝液に対して、ダイアフィルトレートする。このダイアフィルトレート液を、あらかじめ5カラム容量の、HClでpH 7.4に調整した1mM CaCl2、20mM Tris（緩衝液A）で平衡化したQ-Sepharose FF（Pharmacia）カラムに適用する。適用後、カラムを、緩衝液Aから緩衝液B（0.2M NaClを含む緩衝液A）の、20カラム容量にわたる直線状グラジエントで溶出する。PEG化されたCys-apM1を含む画分を、分析的SEC法および／またはSDS-PAGE分析からの結果に基づいてプールする。SDS-PAGE分析は変性条件下（非還元、SDS試料緩衝液中、70℃で10分間処理）で行うので、この方法は、残存する遊離のPEGを有しないapM1（82〜244）試料について使用されるのみである。
実施例23
apM1（82〜244）はLPS-刺激単球細胞からのTNFα放出を阻害する
アディポネクチン（82〜244）もまたLPS-誘導性TNFα産生を阻害することができるか否かを研究するために、本発明者らは、単球細胞株THP-1（ATCC, Rockville, MD）を使用した。
apM1（82〜244）はLPS-刺激単球細胞からのTNFα放出を阻害する
アディポネクチン（82〜244）もまたLPS-誘導性TNFα産生を阻害することができるか否かを研究するために、本発明者らは、単球細胞株THP-1（ATCC, Rockville, MD）を使用した。
手短に述べると、THP-1細胞の3連の試料（105/ウェル）を、96ウェルプレート中で、滴定した量のアディポネクチン（無血清細胞培養培地中で（10mM HEPESを含むRPMI-1640）最大濃度500nM（25.5μg/ml））とともに、37℃でインキュベートした。
アディポネクチンとの18時間のプレインキュベーションの後に、培養物を、最終濃度0.5μg/mlのリポポリサッカリド（LPS）（List Biologicals）とともにさらに4時間インキュベートし、次いで、50μlの上清を収集し、そして引き続くTNFαの分析のために-20℃で凍結した。
希釈した細胞培養物上清を、TNFα含量について標準的なELISA（R&D）を使用して分析し、そしてアディポネクチンのIC50について、4パラメーター非線形回帰データ分析を使用して計算した。
結果を図2に示す。
実施例24
アディポネクチントリマー複合体はpHを低下させることによって不安定化されるが、Ca 2+ イオンの存在下ではそうならない
CHO-K1において産生された精製apM1（82〜244）は、120mM (NH4)2SO4+20mM NaH2PO4 (pH 6.8) を含む緩衝液中に存在した。Ca2+イオンの非存在下または存在下でのpHを低下させることの効果を試験するために、試料を6種の異なる緩衝液で、1容量から4容量までの緩衝液の比で希釈した。緩衝液は、酢酸、水酸化ナトリウム、および塩化カルシウムのストック溶液から、以下の比率で混合することによって調製した（pHは試料の付加の前に測定した）：
得られる6種の異なる試料を、ネイティブ条件下で泳動したCoomassie染色Novex 8-16％ Tris-グリシンゲル（Invitrogen；カタログ番号EC60452）上で調べた（図3、それぞれレーン1〜6）。
アディポネクチントリマー複合体はpHを低下させることによって不安定化されるが、Ca 2+ イオンの存在下ではそうならない
CHO-K1において産生された精製apM1（82〜244）は、120mM (NH4)2SO4+20mM NaH2PO4 (pH 6.8) を含む緩衝液中に存在した。Ca2+イオンの非存在下または存在下でのpHを低下させることの効果を試験するために、試料を6種の異なる緩衝液で、1容量から4容量までの緩衝液の比で希釈した。緩衝液は、酢酸、水酸化ナトリウム、および塩化カルシウムのストック溶液から、以下の比率で混合することによって調製した（pHは試料の付加の前に測定した）：
図3において見られるように、アディポネクチントリマー複合体は、Ca2+イオンの非存在下ではpH 3.6およびpH 4.8で不安定化されるのに対して、10mM CaCl2の存在下では、これらの低pH値では、アディポネクチントリマー複合体の安定性には厳しい効果が観察されない（図3において、MはSeeBlue Plus2）。
実施例25
不安定化されたアディポネクチントリマーはCa 2+ イオンの付加により回復し得る
CHO-K1において産生された精製apM1（82〜244）を（実施例2および8を参照されたい）、Superdex 75カラム上でゲル濾過し、緩衝液を、等張に近い緩衝液：100mM NaCl、20mM NaH2PO4、10mM NaOH (pH 6.8) に移した。数週間の-20℃での保存の後、材料を、ネイティブ条件下で泳動したCoomassie染色Novex 8-16％ Tris-グリシンゲル（Invitrogen；カタログ番号EC60452）上で、不均一な外見を有することを確認した（図4、レーン1）。材料を（不均一な外見を有する）、それぞれ、10mM CaCl2、10mM MgCl2、および10mM ZnCl2とともに供給すると、CaCl2のみがアディポネクチントリマーを再安定化できることが示された（図4、それぞれレーン2、3、および4）（図4において、MはSeeBlue Plus2）。
不安定化されたアディポネクチントリマーはCa 2+ イオンの付加により回復し得る
CHO-K1において産生された精製apM1（82〜244）を（実施例2および8を参照されたい）、Superdex 75カラム上でゲル濾過し、緩衝液を、等張に近い緩衝液：100mM NaCl、20mM NaH2PO4、10mM NaOH (pH 6.8) に移した。数週間の-20℃での保存の後、材料を、ネイティブ条件下で泳動したCoomassie染色Novex 8-16％ Tris-グリシンゲル（Invitrogen；カタログ番号EC60452）上で、不均一な外見を有することを確認した（図4、レーン1）。材料を（不均一な外見を有する）、それぞれ、10mM CaCl2、10mM MgCl2、および10mM ZnCl2とともに供給すると、CaCl2のみがアディポネクチントリマーを再安定化できることが示された（図4、それぞれレーン2、3、および4）（図4において、MはSeeBlue Plus2）。
これらの結果は、等張緩衝液中に存在するリン酸が、-20℃での貯蔵の間にアディポネクチントリマーに存在するCa2+イオンを取り除いたことを示す。凍結温度での貯蔵の間、明らかに、溶液のpHの減少も少し起こり、Ca2+イオンの容易な除去をもたらした。次いで、溶液にCa2+イオンをCaCl2の形態で供給することによって、アディポネクチントリマー複合体は再度回復する。Mg2+イオンまたはZn2+イオンの付加は効果を示さなかった。
実施例26
apM1（82〜244）フラグメントを用いるdb/dbマウスの急性処置は、血中グルコールレベルを一過性に正常化する
db/dbマウスは、実験の最初では56〜66日齢である（約36g）。すべてのマウスを、12:12の明期：暗期サイクルで維持し、標準的な齧歯類の食餌を自由に与え、そして水を無制限に利用できるようにした。t=0において、血中グルコースレベルを、尾の切れ目の試料から、Glucometer Elite Monitor（Bayer Corporation）を使用して、2つの群（群1および群2（各群についてn=3））において測定する。t=30分での、腹腔内（IP）注射は以下である：群1：ビヒクル（200μl緩衝液：2mM CaCl2、10mM クエン酸Na、150mM NaCl、pH 7.4）および群2：200μl緩衝液中、25μg apM1（82〜244）（アディポネクチン（82〜244））フラグメント。90、150、210、270分において、血中グルコースレベルを測定する。得られた血中グルコースレベルを以下のグラフに示す。
apM1（82〜244）フラグメントを用いるdb/dbマウスの急性処置は、血中グルコールレベルを一過性に正常化する
db/dbマウスは、実験の最初では56〜66日齢である（約36g）。すべてのマウスを、12:12の明期：暗期サイクルで維持し、標準的な齧歯類の食餌を自由に与え、そして水を無制限に利用できるようにした。t=0において、血中グルコースレベルを、尾の切れ目の試料から、Glucometer Elite Monitor（Bayer Corporation）を使用して、2つの群（群1および群2（各群についてn=3））において測定する。t=30分での、腹腔内（IP）注射は以下である：群1：ビヒクル（200μl緩衝液：2mM CaCl2、10mM クエン酸Na、150mM NaCl、pH 7.4）および群2：200μl緩衝液中、25μg apM1（82〜244）（アディポネクチン（82〜244））フラグメント。90、150、210、270分において、血中グルコースレベルを測定する。得られた血中グルコースレベルを以下のグラフに示す。
グラフにおいて見られるように、アディポネクチン（82〜244）フラグメントの単回用量は、t=210分で血中グルコースレベルを一過性に正常化する（6.7mmol/L）。
【配列表】
Claims (76)
- アディポネクチンポリペプチド、および該アディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体であって、該アディポネクチンポリペプチドは、該第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入されている、結合体。
- アディポネクチンポリペプチドが球状ドメインを含む、請求項1記載の結合体。
- 結合基が球状ドメインに導入される、請求項２記載の結合体。
- アディポネクチンポリペプチドがコラーゲンドメインを含む、請求項2または3に記載の結合体。
- 第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基がリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の結合体。
- 結合基を有するアミノ酸残基がシステイン残基である、請求項5記載の結合体。
- 第1の非ポリペプチド部分がポリマー分子、親油性化合物、および有機誘導体化剤から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の結合体。
- 第1の非ポリペプチド部分がポリマー、好ましくは直鎖状または分枝状のポリエチレングリコールである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体。
- ポリマーが1kDa〜200kKa、例えば5kDa〜40kDaの分子量を有する、請求項8記載の結合体。
- ポリマー分子が、mPEG-ALDと組み合わせた、mPEG(MAL)、mPEG2(MAL)、PEG-ビニルスルホン、OPSS-PEG、またはOPSS-PEG-ヒドラジドからなる群より選択される、請求項6または9に記載の結合体。
- 結合基がN-またはO-グリコシル化部位、例えばN-グリコシル化部位から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の結合体。
- 糖部分がN-またはO-グリコシル化部位、例えばN-グリコシル化部位に結合されている、請求項11記載の結合体。
- 一つの第1の非ポリペプチド部分のみがアディポネクチンポリペプチドに結合されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の結合体。
- もとのアディポネクチンポリペプチドが配列番号：1〜8、10〜12または13、例えば、配列番号：3、4、5、6、10、11、12、または13のいずれか一つから選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の結合体。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の結合体であって、アディポネクチンポリペプチドが、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、該球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、該コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から、配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、該コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
該アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異を含む、結合体。 - アディポネクチンポリペプチドフラグメントがT121C、N127C、N141C、S146C、N228C、またはT243Cのいずれか一つから選択される変異を含む、請求項15記載の結合体。
- 球状ドメインが配列番号：1に示されるA108位〜N244位のアミノ酸配列を含み、コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含む、請求項15または16に記載の結合体。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52のいずれか一つから選択される、請求項16記載の結合体。
- 請求項１〜4、または12のいずれか一項に記載の結合体であって、アディポネクチンポリペプチドが、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、該球状ドメインが配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、該コラーゲンドメインが配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、該コラーゲンドメインがヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
該アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、
のいずれか一つから選択される変異を含む、結合体。 - 球状ドメインが配列番号：1に示されるA108位〜N244位のアミノ酸配列を含み、コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含む、請求項19記載の結合体。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180T、例えば、Y111N、Y122N、R131N、D144N+S146T、H151N+N153T、K178N+K180T、好ましくはY111N、Y122N、R131N、D144N+S146Tのいずれか一つから選択される変異を含む、請求項19または20に記載の結合体。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、配列番号：53、54、55、56、57、58、59、60、または61のいずれか一つから選択される、請求項21記載の結合体。
- 第2の非ポリペプチド部分が、第1の非ポリペプチド部分と異なる場合に、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分、および有機誘導体化剤からなる群より選択される第2の非ポリペプチド部分をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の結合体。
- 第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基を含むアディポネクチンポリペプチドであって、該アミノ酸残基は、もとのアディポネクチンにおいて表面に露出したアミノ酸残基によって占められる位置に導入されている、ポリペプチド。
- 球状ドメインを含む、請求項24記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 結合基が球状ドメインに導入される、請求項25記載のアディポネクチンポリペプチド。
- コラーゲンドメインを含む、請求項25または26に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 第1の非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基がリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基から選択される、請求項24〜27のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 結合基を有するアミノ酸残基がシステイン残基である、請求項28記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 請求項29記載のアディポネクチンポリペプチドであって、該アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、該球状ドメインは、配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、該コラーゲンドメインは、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、該コラーゲンドメインは、ヒドロキシル化およびグリコシル化されているリジンを含み、
該アディポネクチンポリペプチドフラグメントは、
のいずれか一つから選択される変異を含む、アディポネクチンポリペプチド。 - アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、T121C、N127C、N141C、S146C、N228C、またはT243Cのいずれか一つから選択される変異を含む、請求項30記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 球状ドメインが配列番号：1に示されるA108位〜N244位のアミノ酸配列を含み、コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含む、請求項30または31に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、配列番号：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52のいずれか一つから選択される、請求項31記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 結合基がN-またはO-グリコシル化部位、例えばN-グリコシル化部位から選択される、請求項24〜27のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 請求項34記載のアディポネクチンポリペプチドであって、該アディポネクチンポリペプチドは、球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択され、該球状ドメインが配列番号：1のA108位〜N244位に示されるアミノ酸配列を含み、該コラーゲンドメインが配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、該アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、
のいずれか一つから選択される変異を含む、ポリペプチド。 - 球状ドメインが配列番号：1に示されるA108位〜N244位のアミノ酸配列を含み、コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含む、請求項35記載のアディポネクチンポリペプチド。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、Y111N、Y122N、P129T、R131N、D144N+S146T、G145N、H151N+N153T、P155T、K178N+K180T、例えば、Y111N、Y122N、R131N、D144N+S146T、H151N+N153T、K178N+K180T、好ましくはY111N、Y122N、R131N、D144N+S146Tのいずれか一つから選択される変異を含む、請求項35または36に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- アディポネクチンポリペプチドフラグメントが、配列番号：53、54、55、56、57、58、59、60、または61のいずれか一つから選択される、請求項37記載のアディポネクチンポリペプチド。
- アディポネクチンポリペプチドが哺乳動物細胞、例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞において産生される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体、または請求項24〜38のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチド。
- 配列番号：2、3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つ、ならびに、特定された配列のいずれか一つと、一つまたは複数、好ましくは1〜11個の置換で異なる配列を含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、該アディポネクチンポリペプチドは哺乳動物細胞、例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞において産生される、フラグメント。
- 配列番号：1と比較して、K65位、K68位、K77位、またはK101位のいずれか一つから選択される、一つから4つのリジン残基を含む、請求項40記載のアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、該リジン残基はヒドロキシル化およびグリコシル化され、例えば、配列番号：1と比較してK101から選択される一つのリジン残基がヒドロキシル化およびグリコシル化される、フラグメント。
- 球状ドメインおよびコラーゲンドメインを含むアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、該球状ドメインが配列番号：1に示されるA108位〜N244位のアミノ酸配列ならびに一つまたは複数の置換でアミノ酸配列が異なる配列を含み、かつ
該コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるG42位に対応するアミノ酸66までを含み、該コラーゲンドメインがヒドロキシル化およびグリコシル化されたリジンを含む、フラグメント。 - 請求項42記載のアディポネクチンポリペプチドフラグメントであって、コラーゲンドメインが、配列番号：1に示されるK101位に対応するアミノ酸7から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50まで、例えば、配列番号：1に示されるR100位に対応するアミノ酸8から配列番号：1に示されるR58位に対応するアミノ酸50までを含む、フラグメント。
- 配列番号：3、4、5、10、11、12、または13のいずれか一つから選択される、請求項42または43に記載のアディポネクチンポリペプチドフラグメント。
- 単離された複合体であって、
a）3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーを含むアディポネクチンポリペプチドトリマーと、
b）カルシウムイオン
とを含む、複合体。 - 単離された複合体であって、
a）アディポネクチンポリペプチドトリマーが、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーと、該3つのポリペプチドモノマーのいずれか一つに共有結合されている第1の非ポリペプチド部分とを含む、アディポネクチンポリペプチドトリマーを含む結合体、ならびに
b）カルシウムイオン、
を含む、複合体。 - アディポネクチンポリペプチドトリマーが哺乳動物宿主細胞または酵母宿主細胞から発現および回収される、請求項45または46に記載の単離複合体。
- アディポネクチンポリペプチドトリマーが細菌宿主細胞から発現および回収される、請求項45または46に記載の単離複合体。
- アディポネクチンポリペプチドがapM1（配列番号：6に示される）の球状ドメインと少なくとも80％の同一性を有する球状ドメインを有するアミノ酸配列を含み、選択的に、例えば、apM1の球状ドメインと少なくとも90％の同一性、典型的にはapM1の球状ドメインと少なくとも92％の同一性を有するコラーゲンドメインを含む、請求項45〜48のいずれか一項に記載の単離複合体。
- アディポネクチンポリペプチドが配列番号：1〜6、10〜12、または13のいずれか一つから選択され、配列が配列番号：1〜6、10〜12、または13のいずれか一つにそれぞれ少なくとも80％の同一性を有する、請求項49記載の単離複合体。
- 第1の非ポリペプチド部分がポリマーまたは糖部分から選択される、請求項46〜50のいずれか一項に記載の単離複合体。
- 単離された複合体であって、a）アディポネクチンポリペプチドトリマーが、3つのアディポネクチンポリペプチドモノマーと、該3つのポリペプチドモノマーのいずれか一つに共有結合されている一つのポリマーとを、得られるアディポネクチントリマーが一つのポリマーのみを含むような様式で含む、アディポネクチンポリペプチドトリマーを含有する結合体、ならびにb）カルシウムイオンを含む、複合体。
- ポリマーが、リジン、システイン、またはN末端アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に共有結合される、請求項52記載の単離複合体。
- ポリマーが直鎖状または分枝状ポリエチレングリコールを含む、請求項52または53に記載の単離複合体。
- 請求項45〜54のいずれか一項に記載の単離複合体を含む液体組成物。
- 請求項45〜55のいずれか一項に記載の単離複合体を調製する方法であって、カルシウムイオンをアディポネクチンポリペプチドと接触させる段階、および選択的に、該アディポネクチンポリペプチドを第1の非ポリペプチド部分と反応させる段階を含む、方法。
- アディポネクチンポリペプチドモノマーが、請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチドフラグメントから選択される、請求項45〜54のいずれか一項に記載の単離複合体。
- 請求項45〜55のいずれか一項に記載の単離複合体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドまたはアディポネクチンポリペプチドフラグメント、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 組成物が、液体溶液、例えば水溶液のような、液体組成物から選択される、請求項58〜60のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体のアディポネクチンポリペプチド部分、または請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドもしくはアディポネクチンポリペプチドフラグメントをコードする、RNA、DNA、またはcDNAのようなヌクレオチド配列。
- 配列が、配列番号：14、15、16、62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つから、ならびに、配列番号：14、15、16、62、63、64、65、66、67、68、69、70、または71のいずれか一つとそれぞれ少なくとも70％の相同性を有する配列から選択される、請求項62記載のヌクレオチド配列。
- 請求項62または63に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項62または63に記載のヌクレオチド配列、または請求項64記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 酵母細胞、細菌細胞、例えば大腸菌、哺乳動物細胞、例えば、CHO、BHK、HEK293細胞、またはSF9細胞、好ましくは哺乳動物細胞から選択される、請求項65記載の宿主細胞。
- アディポネクチンポリペプチドを、それが結合される分子と、結合化の発生を誘導する条件下で反応させ、結合体が回収される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体を調製するための方法。
- 単離複合体を調製するための方法であって、該複合体は、1）アディポネクチンポリペプチド、またはアディポネクチンポリペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドに共有結合された第1の非ポリペプチド部分を含む結合体、ならびに2）カルシウムイオンを含み、該方法は、
段階d）、e）、またはf）のいずれか一つがカルシウムイオン豊富な環境において実行されるという条件で、
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階、
b）該ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）該ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、
d）該アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌する段階、
e）複合体を回収する段階、ならびに選択的に
f）アディポネクチンポリペプチドを、それが結合される分子と、結合化の発生を誘導する条件下で反応させ、結合体を回収する段階を含む、方法。 - 段階d）、e）、またはf）のいずれか一つがアディポネクチンポリペプチドと比較してカルシウムイオンのモル濃度過剰で実行される、請求項68記載の方法。
- アディポネクチンポリペプチドを調製する方法であって、
a）シグナルペプチドおよびアディポネクチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を調製する段階であって、該シグナルペプチドの最後の3つのC末端アミノ酸がHDGである、段階、
b）該ヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階、
c）該ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階、ならびに
d）該アディポネクチンポリペプチドを発現および選択的に分泌させる段階
を含む、方法。 - e）アディポネクチンポリペプチドを入手する段階
をさらに含む、請求項70記載の方法。 - f）アディポネクチンポリペプチドを、それが結合される分子と、結合化の発生を誘導する条件下で反応させ、結合体を回収する段階
をさらに含む、請求項71記載の結合体を調製するための方法。 - IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体、または請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドもしくはアディポネクチンポリペプチドフラグメント、または請求項45〜54、もしくは57のいずれか一項に記載の複合体、または請求項55記載の組成物の使用。
- 1型糖尿病；耐糖能異常；2型糖尿病；X症候群；肥満症；アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患；異脂肪血症；または、食物の摂取の減少を伴わない体重減少；慢性関節リウマチ；クローン病；全身性エリテマトーデス；シェーグレン病；悪液質；敗血症性ショック；重症筋無力症；外傷後脳損傷；心筋梗塞；外科手術後脳損傷；および、ストレスもしくは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセス；特に、IGT、2型糖尿病、X症候群、異脂肪血症、敗血症性ショック、もしくはアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患を有する哺乳動物を処置する方法であって、請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体、または請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドもしくはアディポネクチンポリペプチドフラグメント、または請求項45〜54、もしくは57のいずれか一項に記載の複合体、または請求項55記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、方法。
- ヒト細胞におけるTNF-αの発現または放出によって引き起こされる疾患、障害、または状態を処置するための医薬品の調製を目的とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の結合体、または請求項24〜44のいずれか一項に記載のアディポネクチンポリペプチドもしくはアディポネクチンポリペプチドフラグメント、または請求項45〜54、もしくは57のいずれか一項に記載の複合体、または請求項55記載の組成物の使用であって、該医薬品は、TNF-αの発現または放出を阻害する、使用。
- 疾患、障害、または状態が、敗血症性ショック、およびストレスまたは炎症系の活性化に関連する他の破壊的プロセスから選択される、請求項75記載の使用。
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