CZ20032526A3 - Nové molekuly podobné interferonu beta - Google Patents
Nové molekuly podobné interferonu beta Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032526A3 CZ20032526A3 CZ20032526A CZ20032526A CZ20032526A3 CZ 20032526 A3 CZ20032526 A3 CZ 20032526A3 CZ 20032526 A CZ20032526 A CZ 20032526A CZ 20032526 A CZ20032526 A CZ 20032526A CZ 20032526 A3 CZ20032526 A3 CZ 20032526A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- ifnb
- amino acid
- variant
- peg
- Prior art date
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims abstract description 329
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims abstract description 324
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims abstract description 177
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 154
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 154
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 144
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 80
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 52
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 192
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 140
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 116
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 90
- 102220519361 Coatomer subunit alpha_C17S_mutation Human genes 0.000 claims description 83
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 42
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 38
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 35
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 102220476665 Dynein axonemal assembly factor 10_S75T_mutation Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 102220104696 rs879253900 Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 claims description 9
- 102220486979 Sodium-dependent phosphate transport protein 1_S76N_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220487674 Uridine diphosphate glucose pyrophosphatase NUDT22_K19N_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 102220035366 rs281865432 Human genes 0.000 claims description 4
- 102200080720 rs4077515 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 102220594474 Annexin-2 receptor_L88T_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 102220209765 rs1057523510 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220580583 NEDD4-binding protein 2-like 1_K33R_mutation Human genes 0.000 claims 2
- 102220067563 rs200327756 Human genes 0.000 claims 2
- 102220142342 rs779117189 Human genes 0.000 claims 2
- 102220010923 rs371877084 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 298
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 292
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 288
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 65
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 61
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 59
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 54
- 102220480920 Nicotinate phosphoribosyltransferase_K45R_mutation Human genes 0.000 description 53
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 49
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 49
- 101100179429 Homo sapiens IFNB1 gene Proteins 0.000 description 46
- 102220542512 Vascular endothelial growth factor B_K19R_mutation Human genes 0.000 description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 34
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 34
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 description 29
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 28
- -1 Arg) Chemical compound 0.000 description 27
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 27
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 27
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 27
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 23
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 21
- 102220363508 c.98A>G Human genes 0.000 description 21
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 21
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 20
- 102220480985 Nicotinate phosphoribosyltransferase_Q51N_mutation Human genes 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 19
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 102220105332 rs879254444 Human genes 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 102220281563 rs1555462067 Human genes 0.000 description 15
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 14
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 13
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 13
- 102200088455 rs2071543 Human genes 0.000 description 13
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 13
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 13
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 12
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 10
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 10
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 10
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 10
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 102220195584 rs1057517932 Human genes 0.000 description 9
- 102220220102 rs549598534 Human genes 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 229940093476 ethylene glycol Drugs 0.000 description 8
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 7
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 6
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 6
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 6
- 102220065374 rs199943048 Human genes 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 6
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102200067034 rs80356913 Human genes 0.000 description 5
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000004229 Alkannin Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 101000858060 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 4
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 4
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 102220553025 Proenkephalin-A_D39S_mutation Human genes 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 102220603542 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein_R27N_mutation Human genes 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 102220472118 Transmembrane protein_Q48N_mutation Human genes 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 102200057424 rs138789658 Human genes 0.000 description 4
- 102220244835 rs1554042187 Human genes 0.000 description 4
- 102200105133 rs28929768 Human genes 0.000 description 4
- 102220020523 rs397508412 Human genes 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 4
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 3
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220466793 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 5 chain_L28S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 3
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 3
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 3
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 102220481482 eIF5-mimic protein 2_R11K_mutation Human genes 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 3
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 239000004172 quinoline yellow Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 102200118184 rs33924775 Human genes 0.000 description 3
- 102200075749 rs397514044 Human genes 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 3
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 3
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 3
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyacetic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound OCC(O)=O.CC(O)C(O)=O XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102220585547 D site-binding protein_K52Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical compound CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 102220617511 Gamma-interferon-inducible protein 16_K99Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 2
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102220520996 N-chimaerin_D54T_mutation Human genes 0.000 description 2
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 2
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220516730 Protease-associated domain-containing protein 1_L21S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 239000001744 Sodium fumarate Substances 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102220603146 Transcription factor SOX-4_I59S_mutation Human genes 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031904 Tumor protein D54 Human genes 0.000 description 2
- 102220527902 Tumor protein D54_K33Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- BNPSSFBOAGDEEL-UHFFFAOYSA-N albuterol sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.CC(C)(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(CO)=C1.CC(C)(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(CO)=C1 BNPSSFBOAGDEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102200094703 c.232G>A Human genes 0.000 description 2
- 102220389089 c.33G>T Human genes 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 208000020023 cytomegalovirus pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical class FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940013688 formic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- KQTSOJHOCCWAEH-UHFFFAOYSA-N n'-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NN1C(=O)CCC1=O KQTSOJHOCCWAEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKXGHXHZNCJMSV-UHFFFAOYSA-N nitro phenyl carbonate Chemical compound [O-][N+](=O)OC(=O)OC1=CC=CC=C1 OKXGHXHZNCJMSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N phenylglyoxal Chemical compound O=CC(=O)C1=CC=CC=C1 OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 206010063401 primary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 2
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 102220236328 rs1131691720 Human genes 0.000 description 2
- 102200088023 rs1554239543 Human genes 0.000 description 2
- 102220014798 rs56204273 Human genes 0.000 description 2
- 102200027869 rs62517167 Human genes 0.000 description 2
- 102220319623 rs71559180 Human genes 0.000 description 2
- 102220096704 rs876658653 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 2
- 201000008628 secondary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- 229940005573 sodium fumarate Drugs 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940070384 ventolin Drugs 0.000 description 2
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N (R)-lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEQDJSLRWYMAQI-UHFFFAOYSA-N 2,3,9,10-tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5H-isoquinolino[2,1-b]isoquinoline Chemical compound C1CN2CC(C(=C(OC)C=C3)OC)=C3CC2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2 AEQDJSLRWYMAQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHANCCMWYDZQOR-UHFFFAOYSA-N 2-(methyldisulfanyl)pyridine Chemical compound CSSC1=CC=CC=N1 BHANCCMWYDZQOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTCSFFGLRQDZDE-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-2-phenylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)(C)C1=CC=CC=C1 HTCSFFGLRQDZDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQPFYXFVUKHERX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-cyclohexen-1-one Natural products OC1=CCCCC1=O JQPFYXFVUKHERX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJINKBZUJYGZGP-UHFFFAOYSA-N 3-(1-aminopropylideneamino)propyl-trimethylazanium Chemical compound CCC(N)=NCCC[N+](C)(C)C VJINKBZUJYGZGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONZQYZKCUHFORE-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-1,1,1-trifluoropropan-2-one Chemical compound FC(F)(F)C(=O)CBr ONZQYZKCUHFORE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHSXWDVVFHXHHB-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-2-[(3-nitropyridin-2-yl)disulfanyl]pyridine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN=C1SSC1=NC=CC=C1[N+]([O-])=O QHSXWDVVFHXHHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220491096 ADP-ribosylation factor 6_H97N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220586182 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial_F50S_mutation Human genes 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710082738 Aspartic protease 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010057645 Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000030939 Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102220627590 Coagulation factor IX_K45N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220627589 Coagulation factor IX_L20S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 102220545082 Far upstream element-binding protein 1_L89S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102220576032 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain_Q94S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220541980 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain_Y92N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001134456 Homo sapiens Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical class CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150030057 IFNB gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102220548011 Inducible T-cell costimulator_Q10S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010022095 Injection Site reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102220471658 Interleukin-10 receptor subunit alpha_Q42N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N L-glutamine amide Chemical group NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010023849 Laryngeal papilloma Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100179431 Mus musculus Ifnb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100300839 Mus musculus Rai14 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N N-acetyl-s-geranylgeranyl-l-cysteine Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M Potassium gluconate Chemical compound [K+].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 206010061494 Rhinovirus infection Diseases 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220524764 Ribosomal protein S6 kinase delta-1_K115Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004147 Sorbitan trioleate Substances 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101100028273 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) argF gene Proteins 0.000 description 1
- 102220577394 Stromal cell-derived factor 1_K45S_mutation Human genes 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102220566198 Survival motor neuron protein_F70S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N alpha-Lipoic acid Natural products OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150032882 arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 229960002233 benzalkonium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M benzododecinium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical group OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 102220353736 c.130A>C Human genes 0.000 description 1
- 102220354160 c.245C>A Human genes 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001244 carboxylic acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical group ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003999 cyclitols Chemical class 0.000 description 1
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical compound O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002526 disodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000019262 disodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxymethyl)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229960000961 floxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000046759 human PNLIP Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 1
- 208000009000 laryngeal papillomatosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N leuprolide acetate Chemical compound CC(O)=O.CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 229940071648 metered dose inhaler Drugs 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- RMAHPRNLQIRHIJ-UHFFFAOYSA-N methyl carbamimidate Chemical compound COC(N)=N RMAHPRNLQIRHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- NEGQCMNHXHSFGU-UHFFFAOYSA-N methyl pyridine-2-carboximidate Chemical compound COC(=N)C1=CC=CC=N1 NEGQCMNHXHSFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 101150048280 ocd gene Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920005646 polycarboxylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000004224 potassium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000013926 potassium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003189 potassium gluconate Drugs 0.000 description 1
- PHZLMBHDXVLRIX-UHFFFAOYSA-M potassium lactate Chemical compound [K+].CC(O)C([O-])=O PHZLMBHDXVLRIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001521 potassium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011085 potassium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001304 potassium lactate Drugs 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000004800 psychological effect Effects 0.000 description 1
- 101150047781 ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012383 pulmonary drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical group 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 102200163539 rs121912965 Human genes 0.000 description 1
- 102200127580 rs121918001 Human genes 0.000 description 1
- 102200080066 rs122460151 Human genes 0.000 description 1
- 102220288073 rs151218932 Human genes 0.000 description 1
- 102220281547 rs1555514410 Human genes 0.000 description 1
- 102220039277 rs199473352 Human genes 0.000 description 1
- 102220268018 rs201210997 Human genes 0.000 description 1
- 102220005499 rs33938574 Human genes 0.000 description 1
- 102200150393 rs34477820 Human genes 0.000 description 1
- 102220036093 rs515726130 Human genes 0.000 description 1
- 102220265294 rs567877611 Human genes 0.000 description 1
- 102200021380 rs727504457 Human genes 0.000 description 1
- 102220232854 rs766277488 Human genes 0.000 description 1
- 102220063379 rs786204912 Human genes 0.000 description 1
- 102220071751 rs794728024 Human genes 0.000 description 1
- 102220018673 rs80358415 Human genes 0.000 description 1
- 102220097735 rs876659105 Human genes 0.000 description 1
- 102220114657 rs886038944 Human genes 0.000 description 1
- 102220137564 rs886055455 Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000000176 sodium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000012207 sodium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005574 sodium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- ZNCPFRVNHGOPAG-UHFFFAOYSA-L sodium oxalate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C([O-])=O ZNCPFRVNHGOPAG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940039790 sodium oxalate Drugs 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000019337 sorbitan trioleate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000391 sorbitan trioleate Drugs 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 208000014794 superficial urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004441 surface measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical class CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N vinblastine Chemical compound C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000007279 water homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nových molekul interferonu beta (IFNB), způsobů jejich přípravy a použití při terapii, zvláště při léčbě roztroušené sklerózy, virových infekcí nebo zhoubného buj ení.
Dosavadní stav techniky
Interferony jsou důležité cytokiny charakterizované antivirovými, antiproliferačními a imunomodulačními aktivitami. Tyto aktivity tvoří základ pro klinické účinky, které se pozorovaly v případě řady onemocnění, která zahrnují hepatitidu, různé druhy zhoubného bujení a roztroušenou sklerózu. Interferony se dělí do tříd typu I a II. IFNB patří do třídy interferonů typu I, které také zahrnují interferony α, τ, a ω, zatímco interferon γ je jediným členem třídy typu II .
Lidský IFNB je regulační peptid s molekulovou hmotností 22 000 obsahující 166 aminokyselinových zbytků. IFNB produkuje většina buněk v lidském těle, zvláště fibroblasty, jako odezvu na virovou infekcí nebo působení jiných biologických agens. Uvedená angens se váží na multimérní receptor na buněčném povrchu a produktivní vazba s receptorem vede k vytvoření kaskády vnitrobuněčných jevů, přičemž dochází k expresi indukovatelných genů IFNB, který naopak vykauje účinky, které se mohou klasifikovat jako antivirové, antiproliferační a imunomodulační.
Aminokyselinová sekvence lidského IFNB se popisuje v dokumentu Taniguchi, Gene 10: 11-15, 1980 a v dokumentu EP
83069, EP 41313 a US 4686191.
• · · · · · · · • · · ······ · · • · · · · ···· • · · · · · ·· · · ··
V případě lidského a myšího IFNB se popisují krystalické struktury (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818, 1997.
J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995). Uvedené struktury se také popisují v publikaci Cell Mol. Life Sci. 54: 1203-1206, 1998.
Několik variant upraveného proteinu IFNB se popisuje v dokumentech WO 9525170, WO 9848018, US 5545723, US 4914033, EP 260350, US 4588585, US 4769233 a v publikaci Stewart et al., DNA Vol. 6 no: 2 1987. pp 119-128, Runkel et al., 1998, Jour. Biol. Chem.273, No. 14, pp.8003-8008).
Exprese IFNB v buňkách CHO se popisuje v patentovém dokumentu US 4966843, US 5376567 a US 5795779.
V publikaci Redlich et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, vol. 88, pp. 4040-4044, 1991 se popisuje imunoreaktivita protilátek proti syntetickým peptidům, které odpovídají peptidovým pruhům rekombinantního lidského IFNB s mutací C17S.
Popisují se molekuly IFNB s určitým glykosylačnim paternem a způsoby jejich přípravy (popisují se v patentovém dokumentu EP 287075 a EP 529300).
Různé publikace popisují úpravy polypeptidů konjugací Dolymeru nebo glykosylací. V patentových dokumentech EP 229108, US 5382657, EP 593868, US 4917888 a WO 99/55377 se popisují polymérní úpravy přirozeného IFNB nebo jeho varianty 317S. Patentový dokument US 4 904 584 popisuje polypeptidy jpravené pomocí PEG, kde se odstranil alespoň jeden lyzinový zbytek nebo se nahradil jiným aminokyselinovým zbytkem. Patentový dokument WO 99/67291 proteinů s PEG, přičemž se aminokyselinový zbytek proteinu popisuje postup konjugace odstranil alespoň jeden a protein se dostal do • · · · • · · · • · · · · · · popisuj ί obsahuj ί kontaktu s PEG za podmínek, které jsou dostatečné pro dosažení konjugace s proteinem. V patentovém dokumentu WO 99/03887 se varianty polypeptidu konjugované s PEG, které nezbytný aminokyselinový zbytek lokalizovaný ve specifikované oblasti polypeptidu. IFNB se zmiňuje jako jeden příklad polypeptidu, který patří do super rodiny růstových hormonů. Patentový dokument WO 00/23114 popisuje glykosylovaný IFNB a IFNB upravený pomocí PEG. V dokumentu WO 00/23472 se popisují fúzní proteiny IFNB. V dokumentu 00/26354 se popisuje způsob produkce glykosylovaného polypeptidu s redukovanou schopností vyvolat alergii ve srovnání s odpovídajícím předchůdcem, který obsahuje alespoň jedno další glykosylační místo. Patentový dokument US 5 218 092 popisuje úpravu faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF) a jiných polypeptidů, jako je zavedení alespoň jednoho dalšího sacharidového řetězce ve srovnání s přirozeným polypeptidem. IFNB se zmiňuje jako jeden příklad mezi mnoha polypeptidy, které údajně mohou být modifikovány technologií popsanou v patentovém dokumentu US 5 218 092.
Běžné přípravky IFNB se prodávají pod názvem Betaseron® (také se nazývají jako interferon pib, který není glykosylován, připravuje se použitím rekombinantních bakteriálních buněk, vykazuje deleci N-termínálního zbytku metionin a mutaci C17S) a Avonex® a Rebif® (také se nazývá interferon pia, který je glykosylován, produkuje se za použití rekombinantních savčích buněk). Tyto přípravky se používají při léčbě pacientů s roztroušenou sklerózou, jsou účinné při redukci frekvence exacerbace a více pacientů zůstává po dlouhou dobu bez exacerbace ve srovnání s pacienty, kterým se aplikuje placebo. Dále se také snižuje výskyt invalidních jedinců (popisuje se v publikaci Neurol. 51: 682-689,1998).
I» · ·· · · · ♦ · · · · φ · ······· • · ·····*·+· · • · ·· · · · · · ···· · · · · ·· ♦ ·
Porovnání molekul interferon pia a £lb s ohledem na strukturu a funkci se popisuje v publikaci Pharmaceut. Res.
15: 641-649, 1998.
IFBN je první terapeutická intervence vykazující oddálení postupu roztroušené sklerózy, která přechází do progresivního zánětlivého degenerativního onemocnění centrálního nervového systému. Jeho mechanizmus působení zůstává nejasný. Je zřejmé, že IFNB má inhibiční účinky na proliferací leukocytů a prezentaci antigenu. IFNB může modulovat profil produkce cytokinů proti zánětlivému fenotypu. Nakonec IFNB může redukovat migraci T buněk inhibici aktivity matricových metaloproteáz T buněk. Tyto aktivity pravděpodobně přispívají k mechanizmu IFBN v MS (popisuje se v publikaci Neurol. 51:
682-689, 1998) .
IFBN se navíc může použít při léčbě osteosarkomu, karcinomu bazálních buněk, displázii děložního čípku, gliomu, akutní myeloidní leukémie, mnohotného myelomu, Hodgkinovy nemoci, karcinomu prsu, melanomu a virových infekcí, jako jsou infekce papilomaviry, virová hepatitida, opar genitálií, pásový opar, herpetická keratitida, herpes simplex, virová encefalitida, zápal plic způsobený cytomegalovirem a infekce rhinovirem. Různé vedlejší účinky se spojují s použitím současných přípravků IFNB, které zahrnují reakci v místě aplikace injekce, horečku, zimnici, myalgii, bolest kloubů a jiných symptomů, které se podobají symptomům chřipky (popisuje se v publikaci Clin. Therapeutics, 19: 883-893, 1997).
Vedle toho u 6 až 40 % pacientů se vytvořily neutralizační protilátky proti IFNB (Int. Arch. Allergy Immunol. 118: 368371, 1999) . Ukázalo se, že vývoj protilátek, které neutralizují IFBN zvyšují biologickou odezvu vůči IFBN a zesilují léčebný účinek (popisuje se v publikaci Neurol. 50:
9999 99 99 99 9999
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 999 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1266-1272, 1998). Neutralizující protilátky pravděpodobně taky brání terapeutickému využití IFBN při léčbě jiných onemocnění (Immunol. Immunther. 39: 263-268, 1994).
Síla vedlejších účinků produktů IFNB, jejich spojení s častou aplikací injekcí, nebezpečí vývoje neutralizačních protilátek, které omezují požadovaný terapeutický účinek IFNB a potenciál pro získání optimální terapeutické hladiny IFNB s průvodním jevem, kterým je zesílení terapeutického účinku, vede k požadavku vytvoření upravených molekul podobných IFNB.
Dokument PCT/DK00/00471 popisuje nové konjugáty IFNB, které obsahují části, kterými nejsou polypeptidy, zachycené na polypeptidu IFNB, které se upravily zavedením a/nebo delecí míst záchytu pro část, kterou není polypeptid, jako je místo pro konjugaci s PEG nebo glykosylační místo. Molekuly mají zlepšené vlastnosti, jako je zlepšený poločas rozpadu a/nebo omezená reaktivita s neutralizujícími protilátkami, které vznikly proti produktům IFNB.
Podstata vynálezu
Popisují se zdokonalené molekuly IFNB, které vykazují požadované vlastnosti.
Vynález popisuje glykosylovanou variantu mateřského polypeptidu IFNB, která obsahuje alespoň jedno glykosylační místo in vivo, kde aminokyselinový zbytek uvedeného mateřského polypeptidu, které se nachází blízko uvedeného místa glykosylace, se upravil tak, aby se získala varianta polypeptidu, která vykazuje zvýšenou glykosylaci ve srovnání s glykosylaci mateřského polypeptidu IFNB.
• · · · • · · · · · · · · · • · ······· • · · · ······ · · • · ·· · ···· ···· · · · · · · ··
Vynález dále popisuje způsob zesílení glykosylace in vivo mateřské molekuly IFNB, které obsahují alespoň jedno glykosylační místo in vivo, zahrnující
i) substituci aminokyselinového zbytku, který leží v první poloze lokalizované blízko in vivo místa glykosylace mateřské molekuly IFNB, druhým aminokyselinovým zbytkem za vzniku varianty molekuly IFNB, ii) měření stupně glykosylace varianty vzhledem ke glykosylaci mateřské molekule IFNB, jak se získala expresí v glykosylující hostitelské buňce za srovnatelných podmínek, iii) jestliže je nezbytné opakovat krok popsaného v odstavci i), aby došlo k substituci druhého aminokyselinového zbytku třetím aminokyselinovým zbytkem a/nebo substituci aminokyselinového zbytku lokalizovaného ve druhé poloze blízko místa glykosylace druhým aminokyselinovým zbytkem a opakování kroku popsaného v odstavci ii) buď v případě mateřské molekuly nebo varianty molekuly, která vzniká v kroku i) , kroky popsané v odstavci i) až iii) se opakují do té doby, dokud nedojde ke zvýšení glykosylace in vivo.
Vynález dále popisuje polypeptid ínterferonu beta, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od sekvence ínterferonu beta divokého typu s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 2 a tím, že obsahuje jednu z následujících uvedených mutací:
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+F111N+R113T;
C17S+D110F+F111N+R113T;
• · · · · · · • ·· ······ ·
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S-Í-K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R; or
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T,
Může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Vynález dále popisuje polypeptid interferonu beta, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci:
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDIPEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, která může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Vynález dále popisuje polypeptid interferonu beta, který má aminokyselinovou sekvenci:
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDIPEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETFVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, která může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Vynález dále popisuje glykosylovanou variantu polypeptidů interferonu beta, která vykazuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence lidského interferonu
MM fi ·· 9 9 9 9 9 9 9 v · · ········· · • 9 · · 9 9 9 9 9
999 · ·· 99 99 99 beta uvedenou v SEQ ID NO: 2, a obsahuje jednu z následujících sad mutací:
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
-DCTTSíTniW^WT;-:C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+F111N+R113T;
C17S+D110F+F111.N+R113T;
Cl 7S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R; or
C17S+K.19R+IC33R+K45R+Q49N+ Q51 T+Dl 10F+ F111N+ R113T, která může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Vynález popisuje glykosylovanou variantu polypeptidu interferonu beta, která má aminokyselinovou sekvenci:
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDIPEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, která může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
V jiném provedení vynálezu se popisuje glykosylovaná varianta polypeptidu interferonu beta, která má aminokyselinovou sekvenci:
·· 0 · 0 · · · · · • · ♦······ • 0 · · <00000 Φ 0 • · 00 0 0 0 0 0 000 0 00 00 >0 ··
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDIPEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, která může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Dále vynález polypeptidu podle expresívní vektory přípravy polypeptidu popisuj e vynálezu, kóduj ící způsoby přípravy varianty která zahrnuje sekvence a polypeptid stejně jako metody
Vynález popisuje terapeutický prostředek obsahující variantu podle vynálezu, prostředek podle vynálezu pro použití při terapii, použití prostředku při terapii nebo při výrobě léčebného prostředku pro léčbu onemocnění.
Části příbuzného patentového dokumentu PCT/DK00/00471 jsou podstatné pro úplný popis vynálezu a začleňují se do popisu. Tyto části jsou odkazem PCT/DKOO/0O471. Rozumí se, že tyto části tvoří část vynálezu do té míry, že například varianty polypeptidu popsané v dokumentu PCT/DK00/00471 se mohou použít jako mateřské polypeptidy 1FNB pro zde popsané úpravy. Tento patentový dokument také popisuje provedení vynálezu založený na konjugátech nebo polypeptidech popsaných v dokumentu PCT/DK00/00471.
Definice
V souladu s patentovým dokumentem a vynálezem (a co se týká vynálezu podle PCT/DK00/00471) se aplikovaly následující definice.
Termín „konjugát („konjugované polypeptidy) znamená heterogenní (ve smyslu složená nebo chimérická) molekula ···· • · · ····« vytvořená kovalentním zachycením jednoho nebo více polypeptidu na jedné nebo více částí, které nejsou polypeptidy. Termín kovalentní zachycení znamená, že polypeptid a část, kterou není polypeptid, jsou buď přímo kovalentně navzájem spojeny nebo jsou spojeny nepřímo prostřednictvím účinné části nebo částí, jako je můstek, mezerník nebo vazebná část, nebo části za použití vazebné skupiny přítomné v polypeptidu. Konjugát se s výhodou rozpouští v odpovídajících koncentracích a podmínkách. To znamená, že jsou rozpustné ve fyziologických tekutinách, jako je krev. Příklady konjugovaných polypeptidu podle vynálezu zahrnují glykosylováné polypeptidy a/nebo polypeptidy upravené PEG. Termín „nekonjugovaný polypeptid se může použít v případě polypeptidové části konjugátu.
Termín „část, kterou není polypeptid znamená molekulu, která je schopna konjugovat s vazebnou skupinou polypeptidu podle vynálezu. Výhodné příklady takové molekuly zahrnují polymery, cukerné části, lipofilní sloučeniny nebo organická derivatizační činidla. Když se tento termín používá v souvislosti se zde popsaným konjugátem, rozumí se, že část, kterou není polypeptid, je spojena s polypeptidovou částí konjugátu prostřednictvím vazebné skupiny polypeptidu.
Termín „polymerní molekula znamená molekulu tvořenou kovalentním spojením dvou nebo více monomerů, přičemž žádný z monomerů není aminokyselinový zbytek mimo případu, kdy polymer je lidský albumin nebo jiný plazmový protein. Termín „polymer je možné zaměnit za termín „polymerní molekula. Uvedený termín znamená molekuly sacharidů zachycené in vitro glykosylací, to znamená syntetickou glykosylaci provedenou in vitro, která v normálním případě zahrnuje kovalentní navázání molekuly sacharidu na vazebnou skupinu polypeptidu, přičemž je možné použít řetězící činidlo. Molekuly sacharidů zachycené in vivo glykosylací, jako je N-glykosylace nebo O-glykosylace • «· ·
11 • 9 * · 1 · 9
19 11 1 · ··· 1 · 1 1
1 1111
11 19 11 (jak se popisuje dále v textu), se zde nazývají „cukerné části. Mimo to, kde počet nepolypeptidových částí, jako je polymerní molekula nebo cukerné části obsažené v konjugátu, je výslovně uveden, pak v každém odkazu „část, kterou není polypeptid obsaženou v konjugátu nebo jinak užívanou, by měl znamenat jednu nebo více nepolypeptidových částí, jako je polymerní molekula nebo cukerná složka v konjugátu.
Termín „vazebná skupina znamená skupinu aminokyselinových zbytků polypeptidu schopnou spojit se s odpovídající částí, kterou není polypeptid. Například v případě polymeru, zvláště pak v případě spojení s PEG, je často používanou vazebnou skupinou ε-aminoskupina lyzinu nebo N-terminální aminoskupina. Jiné polymerní vazebné skupiny zahrnují volnou skupinu karboxylové kyseliny (jako je například skupina C-terminálního aminokyselinového zbytku nebo kyseliny asparágová nebo zbytek kyselina glutamová), vhodně aktivované karbonylové skupiny, merkaptoskupiny (například cysteinového zbytku), zbytky aromatických kyselin (například Phe, Tyr, Trp), hydroxyskupiny (například ty Ser, Thr nebo OH-Lys) , guanidin (například Arg), imidazol (například His) a oxidované cukerné části.
V případě N-glykosylace ín vivo termín vazebná skupina znamená aminokyselinové zbytky obsahující místo N-glykosylace (se sekvencí N-X'-S/T/C-X, kde symbol X' je libovolný aminokyselinový zbytek s výjimkou prolinu, symbol X'' je libovolný aminokyselinový zbytek, který může být nebo nemusí být shodný se symbolem X' as výhodou je jiný než prolin, symbol N je asparagin a S/T/C je buď serin, threonin nebo cystein, s výhodou serin nebo threonin a nejvýhodnější je threonin). Ačkoli aspariginový zbytek místa N-glykosylace je ten, na kterém je zachycena během glykosylace cukerná část, tak není možné dosáhnout zachycení, pokud nejsou přítomné další aminokyselinové zbytky místa N-glykosylace. Když částí,
0··· · ·
0 0 0 · · • 0 · · ♦ 0
00 0 000 · 0
0 0 0 · • 00 00 4 kterou není polypeptid, je cukerná část spojená s N-koncem, termín „aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, jak se používá ve spojení se změnami aminokyselinové sekvence mateřského polypeptidů, znamená, že aminokyselinové zbytky obsahující N-glykosylační místo se upraví takovým způsobem, že se buď do aminokyselinové sekvence zavede funkční N-glykosylační místo nebo se z uvedené sekvence odstraní. V případě „místa O-glykosylace vazebnou skupinou je skupina OH šeřinu nebo threoninu.
Termín „rozdíl nebo „lišit se používaný ve spojení se specifickými mutacemi bere v úvahu další rozdíly, které se vyskytují nezávisle na specifikovaném rozdílu aminokyseliny. Vedle odstranění a/nebo zavedení aminokyselinových zbytků, které obsahují vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, polypeptid IFNB může obsahovat další substituce, které nesouvisí se zavedením a/nebo odstraněním takových aminokyselinových zbytků. Termín „alespoň jeden se používá v případě části, kterou není polypeptid, aminokyselinového zbytku, substituce atd. a znamená jeden nebo více. Termíny „mutace a „substituce se mohou zaměnit.
V tomto dokumentu se používají názvy aminokyselin a atomů (například CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, 0, C, atd..), jak se definuje v proteinové databance (PDB) (www.pdb.org), založené na názvosloví IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (názvy zbytků, názvy atomů, atd..), Eur. J. Biochem. , 138, 9-37 (1984) spolu s jejich úpravami uvedenými v publikaci Eur. někdy také nazývá Ca, „aminokyselinový zbytek
J. Biochem., 152, 1 (1985)
CA se
Termín zbytek
CB může také být Οβ.
znamená aminokyselinový
obsažený | ve | skupině, která zahrnuje alanin | (Ala | nebo | A) , |
cystein | (Cys | nebo C), kyselinu asparágovou | (Asp | nebo | D) , |
kyselinu | glutamovou (Glu nebo E) , fenylalanin | (Phe | nebo | F) , |
9 · • 9 9 ·
9 9 9 • 9 999 • 9 9
99 ·· 9 ·· · glycin (Gly nebo G), histidin (His nebo Η) , izoleucin (Ile nebo I), lysin (Lys nebo K) , leucin (Leu nebo L) , metionin (Met nebo Μ) , asparagin (Asn nebo Ν) , prolin (Pro nebo P) , glutamin (Gin nebo Q) , arginin (Arg nebo R) , serin (Ser nebo S) , threonin (Thr nebo T) , valin (Val nebo V) , tryptofan (Trp nebo W) a tyrosin (Tyr nebo T) . Terminologie používaná při identifikaci poloh aminokyselin nebo substitucí je následující: C17 (označuje polohu č. 17 obsazenou cysteinem v aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO: 2). C17S (označuje cysteinový zbytek v poloze 17, který se nahradil serinem). Číslování aminokyselinových zbytků se provádí ve vztahu k aminokyselinové sekvenci zobrazené v sekvenci SEQ ID NO: 2. „Mldel se používá v případě delece metioninu, který se nachází v poloze 1. Vícenásobné substituce jsou označeny „+, například R71N+D73T/S znamená aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje substituci argininu v poloze 71 asparaginem a substituci kyseliny asparágové v poloze 73 treoninem nebo serinem, s výhodou s treoninem. T/S jak se používá v případě dané substituce, znamená zbytek buď T nebo S, s výhodou T.
Termín „nukleotidová sekvence znamená úsek dvou nebo více po sobě jdoucích molekul nukleotidů. Nukleotidová sekvence může být genomová, cDNA, RNA, semisyntetická, syntetického původu nebo jejich libovolná kombinace.
Termín „rodina sekvencí proteinu IFNB znamená skupinu polypeptidu s dostatečně homologními aminokyselinovými sekvencemi, což umožňuje uspořádání sekvenci za použití například programu CLUSTALW. Rodina sekvencí IFNB je dostupná například z rodiny PFAM, verze 4.0 nebo se může připravit použitím vhodného počítačového programu, jako je CLUSTALW verze 1.74 za použití výchozích parametrů (popisuje se v publikaci Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through φφφφ
ΦΦ φφ φ φφφφ φ « φ φφφφ φ « > φφφ ΦΦΦ Φ Φ 1 » φ φ φ φ «
I ΦΦ ΦΦ φφ φφ φφφφ sequence weightining, position-specific gap penalties and wight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680).
Termíny „buňka, „hostitelská buňka a „buněčná kultura je možné zaměnit a zahrnovat potomstvo, buňky. Termíny „transformace rozumí se, že tento termín může také které jsou výsledkem růstu a kultivace a „transfekce se mohou zaměňovat a popisují postup zavedení DNA do buňky.
Termín „operativně spojený znamená kovalentní spojení dvou nebo více nukleotidových sekvencí způsobem enzymatické ligace nebo jiným způsobem ve vzájemně relativní konfiguraci tak, že se může uskutečnit normální funkce sekvencí. Například nukleotidová sekvence kódující pre-sekvenci nebo vedoucí sekvenci sekrece je operativně spojená s nukleotidovou sekvencí polypeptidu, jestliže se exprimuje jako pre-protein, který se účastní vylučování polypeptidu: promotor nebo zesilovač je operativně spojen s kódující sekvencí, jestliže ovlivňuje transkripci sekvence, místo navázání na ribozóm je operativně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěn tak, že umožňuje translaci. V obecném případě termín „operativně spojen znamená, že nukleotidové sekvence jsou spojeny spojitě a, v případě sekreční vylučovací sekvence, spojitě a ve čtecí fázi. Spojení se uskuteční ligací ve vhodných restrikčních místech. Jestliže taková místa neexistují, pak se používají syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery ve spojení se standardními metodami rekombinace DNA.
Termín „zavedení primárně znamená substituci existujícího aminokyselinového zbytku, ale také může znamenat začlenění dalších aminokyselinových zbytků. Termín „odstranění primárně znamená substituci aminokyselinového zbytku jiným ·♦ •4 4444
4 4444 44 4
4 4444 44 4
4 4 4 ··· 4 4 · ·
4 4 4 4444 • 44 · 44 44 44 44 aminokyselinovým zbytkem, ale může také znamenat deleci (bez substituce) aminokyselinového zbytku.
Termín „imunogennost” se používá ve spojení s danou látkou a označuje schopnost látky vyvolat odezvu imunitního systému. Imunitní odezva může být buněčná nebo humorální (popisuje se například Roitt: Essential Immunology (8thEdition, Blackwell).
Imunogennost se může stanovit použitím libovolné vhodné metody, která je známa v oboru, například in vivo nebo in vitro, například použitím testu imunogennosti in vitro popsaném v sekci Materiály a metody dále v textu. Termín „omezená imunogennost” se používá v případě daného polypeptidů nebo konjugátu a znamená, že konjugát nebo polypeptid vyvolá měřitelně nižší imunitní odezvu ve srovnání s referenční molekulou, jako je lidský IFNB divokého typu, například Rebif nebo Avonex nebo varianta lidského IFBN divokého typu, jako je Betaseron, jak se stanovilo za porovnatelných podmínek. Když se v tomto dokumentu použije termín běžně dostupné produkty IFBN (to znamená Betaseron, Avonex a Rebif) rozumí se buď vytvořený produkt nebo IFBN polypeptidová část produktu. V normálním případě omezená protilátková reaktivita (například reaktivita protilátek přítomných v séru, které pochází z pacientů ošetřených běžnými produkty IFNB) je indikace omezené imunogennosti.
Termín „funkční poločas in vivo znamená doba, po kterou se uchovává 50 % funkčnosti polypeptidů nebo konjugátu (stejně jako doba, po kterou je stále přítomno v těle nebo v cílovém orgánu 50 % biologické aktivity polypeptidů nebo konjugátu, nebo doba, po kterou aktivita polypeptidů nebo konjugátu dosahuje 50 % počáteční hodnoty). Jako alternativu stanovení funkčního poločasu in vivo je možné stanovit „poločas přeměny v séru”, to je doba, po kterou 50 % molekul polypeptidů nebo »♦ ·» • · · · · · · < • · · · · · · · « · · · ··· · · · ( • · · · · · · 1 • ·· ·· ·· ·· ··♦· ·· ··· · konjugátu cirkuluje v plazmě nebo v krvi, dřivé než se rozpadne. Stanoveni poločasu séra je často jednodušší, než stanovení funkčního poločasu in vivo a hodnota poločasu přeměny v séru je obvykle dobrá indikace hodnoty funkčního poločasu in vivo. Alternativní termíny poločasu přeměn v séru jsou „poločas přeměny v plazmě, „cirkulační poločas, „clearance v séru, „clearance v plazmě a „poločas clearance. Funkčnost, která se má zachovat, se vybrala ze skupiny zahrnující antivirovou, antiproliferační, imunomodulační aktivitu nebo aktivitu navázání receptoru. Funkční poločas in vivo a poločas přeměny v séru se stanovil libovolnou vhodnou metodou, která je známa v oboru a popisuje se v sekci Materiály a metody dále v textu.
Polypeptid nebo konjugát se v normálním případě rozpadá působením jednoho nebo více retikuloendoteliálních systémů (RES), ledvin, sleziny nebo jater nebo specifickou nebo nespecifickou proteolyzí. Clearance probíhající v ledvinách je možné také nazvat jako „renální clearance a například se provádí glomerulární filtrací, tubulární exkrecí nebo tubulární eliminací. V normálním případě clearance závisí na fyzikálních charakteristikách polypeptidu nebo které zahrnují molekulovou hmotnost, velikost (vztaženo k velikosti k možnosti oddělení glomerulární filtrací), náboj, symetrii, tvar/rigiditu, zachycené sacharidové řetězce a přítomnost buněčných receptorů vhodných pro protein. Molekulová hmotnost přibližně 67 000 je důležitá hodnota oddělení v případě renální clearance.
konj ugátu, (poloměr)
Redukovanou renální clearance je možné zavést libovolným vhodným testem, například in vivo test. V typickém případě se renální clearance stanoví aplikací značeného (například radioaktivní zněčení nebo fluorescenční značení) polypeptidu nebo polypeptidového konjugátu pacientovi a měřením aktivity • ΜΙ» 44 44 44 4444
4 4444 44 4
Π Π · · 4444444
X / 4 4 4 4 4 444 4 4 4 4
44 4 4444
444 4 44 44 44 44 značení ve shromážděné moči pacienta. Redukovaná renální clearance se stanovila ve vztahu k odpovídajícímu nekonjugovanému polypeptidu nebo nekonjugovanému odpovídajícímu polypeptidu divokého typu nebo běžnému produktu IFNB za porovnatelných podmínek.
Termín „prodloužený, když se používá v případě funkčního poločasu in vivo nebo poločasu přeměny v séru znamená, že relevantní poločas funkčností nebo přeměny konjugátu nebo polypeptidu je statisticky podstatně delší ve vztahu k referenční molekule, jako je nekonjugovaný lidský IFNB divokého typu (například Avonex nebo Rebit) nebo nekonjugovaná varianta lidského IFNB (například Betaseron), jak se stanovilo za srovnatelných podmínek.
Termín „redukovaná imunogennost a/nebo delší funkční poločas in vivo a/nebo delší poločas přeměny v séru zahrnuje jednu, dvě nebo všechny uvedené vlastnosti. Zde popsaný konjugát nebo polypeptid s výhodou obsahuje alespoň dvě z uvedených vlastností, to znamená redukovanou imunogennost a delší funkční poločas in vivo, redukovanou imunogennost a delší poločas přeměny v séru nebo delší funkční poločas in vivo a delší poločas přeměny v séru. Nejvýhodnější je, když konjugát nebo polypeptid má všechny vlastnosti.
Termín „za porovnatelných podmínek, když se používá při měření relativních (spíše než absolutních) vlastností molekuly podle vynálezu a referenční molekuly znamená, že relevantní vlastnost dvou molekul se testuje za použití stejného testu (to znamená, že test se provede za stejných podmínek, které zahrnují stejný vnitřní standard) a stejný typ zvířat.
Termín „vykazující aktivitu IFNB znamená, že polypeptid nebo konjugát vykazuje jednu nebo více funkcí přirozeného
00 • 0 0 0000 00 0
0 0000 00 0
000 000 000 0
00 0 0000
000 · 0· 00 0· 00
0000 *·« ·
IFNB, zvláště lidského IFNB divokého typu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 (což je zralá sekvence), který se může exprimovat v glykosylující hostitelské buňce, nebo libovolný z běžně dostupných produktů IFBN. Takové funkce zahrnují schopnost vázat se na receptor interferonu, který je schopný vázat IFNB a iniciovat vnitrobuněčnou signalizaci. Zvláště pak jde o interferonový receptor typu I tvořený receptorovými podjednotkami IFNAR-2 a IFNAR-1 (popisuje se v publikaci Domanski et al., The Journal of Bilogical Chemistry, Vol. 273, No 6, pp 3144-3147, 1998, Mogensen te al., Journal of Interferon and Cytkine Research, 19: 10691098, 1999), a antivirovou, antiproliferativní nebo imunomodulační aktivitu (kterou je možné stanovit za použití testů známých v oboru (například ty, co se popisují dále v textu)). Aktivita IFBN se může testovat způsoby, které jsou dobře známy v oboru a popisují se v sekci Materiál a metody.
Polypeptid nebo konjugát „vykazující nebo „mající aktivitu IFNB má takovou aktivitu, když vykazuje měřitelnou funkcí, například měřitelnou aktivitu vázat se na receptor a stimulační aktivitu (jak se napíklad stanoví primárním nebo sekundárním testem popsaným v sekci Materiál a metody). Polypeptid vykazující aktivitu IFNB se může také nazývat „molekula IFNB, „varianta polypeptidu IFNB nebo „polypeptid IFNB. Termíny „polypeptid IFNB, „varianta IFNB a „varianta polypeptidu se primárně používají v souvislosti s upravenými polypeptidy podle vynálezu.
Termín „mateřský IFNB znamená počáteční molekula, která se zdokonalí v souladu s vynálezem nebo v případě, že je to relevantní, v souladu s dokumentem PCT/DK00/00471. Mateřský IFNB patří do rodiny sekvencí IFNB. Mateřský IFNB může být libovolného původu. Může pocházet z obratlovce nebo savce (libovolného původu definovaného v dokumentu WO 00/23472).
• 44 4
4 44 4 • 4 · · 4 · 4 4 4 4
4 ·<·»···
4 44 *44444 > 4 · 44 4 4 4 4 4
444 4 44 44 4« 44
Mateřský IFNB je s výhodou lidský IFNB divokého typu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo jeho varianta. Co se týká mateřského polypeptidu IFNB termín „varianta je polypeptid, který se liší jedním nebo více aminokyselinovými zbytky od mateřského polypeptidu, v normálním případě 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinovými zbytky. Příklady lidského IFNB divokého typu zahrnují polypeptidovou část přípravku Avonex nebo Rebif. Příkladem mateřské varianty IFNB je Betaseron. V jiném případě mateřský polypeptid IFNB může obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která je hybridní molekulou mezi IFNB a jiným homologním polypeptidem, jako je interferon alfa, který může obsahovat jednu nebo více dalších substitucí zavedených do hybridní molekuly. Taková hybridní molekula může obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která se liší více jak deseti aminokyselinovými zbytky od aminokyselinové sekvence zobrazené v SEQ ID NO: 2. Aby bylo možné hybridní molekulu použít jako mateřský polypeptid, vykazuje uvedená molekula aktivitu IFNB (například jak se stanovilo v sekundárním testu popsaném v sekci Materiály a metody dále v textu). Jiné příklady variant lidského IFNB divokého typu, které mohou sloužit jako mateřské molekuly IFNB podle vynálezu jsou varianty popsané v dokumentu PCT/DK0O/OO471, které mají zavedené a/nebo odstraněné aminokyselinové zbytky obsahující vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, nebo libovolná molekula IFNB popsaná v dokumentu WO 00/23114, WO 00/23472, WO 99/3887 nebo jinak dostupná v oboru.
Termín „funkční místo, když se používá v případě polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 nebo podle zde popsaného vynálezu, popisuje jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které jsou podstatné nebo se jinak podílejí na funkci nebo činnosti IFNB. Funkčním místem je například místo vázající se na receptor a
ΦΦΦΦ φ φφφφ · φ < «φφφφ
φφφφ «
může se stanovit způsoby známými v oboru, s výhodou analýzou struktury polypeptidu, který tvoři komplex s relevantním receptorem, jako je interferonový recepotr typu I tvořený
IFNAR-1 a IFNAR-2.
Varianty polypeptidu podle vynálezu
Varianty se zvýšenou glykosylací
Překvapivě se zjistilo, že glykosylace v daném glykosylačním místě molekuly IFNB se může zesílit úpravou jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, které se nacházejí blízko uvedeného glykosylačního místa, ať už je to zavedené místo nebo přirozeně se vyskytující místo.
Vynález popisuje glykosylační variantu mateřského polypeptidu IFNB obsahující alespoň jedno glykosylační místo in vivo, kde aminokyselinový zbytek uvedeného mateřského polypeptidu lokalizovaného blízko uvedeného glykosylačního místa se upravil, aby se získala varianta polypeptidu, která vykazuje zesílenou glykosylací ve srovnání s glykosylací mateřského polypeptidu.
Termín „varianta se používá k označení aminokyselinových zbytků mateřského polypeptidu, který se musí vyměnit. Glykosylovanou variantou se může také nazývat konjugát IFNB (obsahující část, kterou není polypeptid, ale cukerná část zachycená k polypeptidové části konjugátu).
V normálním případě glykosylační místo in vivo je místo Nglykosylace, ale také místo O-glykosylace se zvažuje jako relevantní podle vynálezu.
Termín „zesílená glykosylace označuje zvýšené množství zachycených sacharidových molekul, což se v normálním případě • 4
I · 4 4 » » » · > 4 «4·
♦ «4 »4 ·» 999 9
9 4 · » • · · • »4 4 «4 dosáhlo na základě zvýšeného (nebo lepšího) využití glykosylačního místa(míst). Zesílená glykosylace může být stanovena libovolnou vhodnou metodou, která je známa v oboru, jako vhodná pro analýzu zachycených sacharidových struktur. Jedním vhodným testem pro stanovení zachycených sacharidových struktur je způsob popsaný v příkladu 7 a 8.
Aminokyselinový zbytek „lokalizovaný blízko glykosylačního místa se obvykle nachází v poloze -4, -3, -2, 1, +1, +2, +3 nebo +4 vzhledem k aminokyselinovému zbytku glykosylačního místa, na kterém je zachycen sacharid, zvláště v poloze -2, -1, +1 nebo +2, stejně jako v poloze -1 nebo +1. Pak aminokyselinový zbytek umístěný blízko N-glykosylačního místa (vykazuje sekvenci N-X'-S/T/C-X'') se může nacházet v poloze -4, -3, -2, -1 vzhledem N-zbytku v poloze X'nebo X'' (v tomto případě aminokyselinový zbytek, který se má zavést je s výhodou jiný než prolin) nebo v poloze +1 vzhledem ke zbytku
Úprava aminokyseliny probíhá v normálním případě substitucí. Substituce se provádí libovolným jiným aminokyselinovým zbytkem, který vede k zesílené glykosylaci varianty IFNB ve srovnání s glykosylaci mateřského polypeptidů IFNB. Takový jiný aminokyselinový zbytek se může stanovit metodou pokusů a omylů (to je substitucí aminokyselinového zbytku relevantní polohy za libovolný jiný aminokyselinový zbytek a stanovením výsledné glykosylace výsledné varianty).
V zásadě, mateřským polypeptidem IFNB, který se bude upravovat v souladu s,vynálezem, může být libovolný polypeptid vykazující aktivitu IFNB a mající alespoň jedno glykosylační místo, zvláště N-glykosylační místo. Vhodné mateřské polypeptidy se popisují v sekci „definice a mohou zahrnovat IFNB divokého typu, například lidský IFNB divokého typu nebo nepřirozeně se vyskytující polypeptid IFNB, například variantu nebo fragment lidského IFNB divokého typu.
ΦΦ •
φ φφφ φφφφ φφ • φ φ φ φ φ • φ φ φ φ φφ φφ •
φ φφφ φ φ φφ φφ φφφ« φ φ φ • φ φ φ φ φ φ φ φ · φφ φφ
Mateřský polypeptid IFNB může obsahovat více než jedno glykosylační místo, například 2 až 10, jako 2 až 7 nebo 2 až 5 glykosylačních míst. Glykosylační místo může být přirozeně se vyskytující glykosylační místo nebo zavedené glykosylační místo, s výhodou N-glykosylační místo. N-glykosylační místo definované N80 a T82 lidského IFNB divokého typu je příklad přirozeně se vyskytujícího glykosylačního místa.
V případě, že mateřský polypeptid IFNB obsahuje alespoň jedno zavedené N-glykosylační místo, uvedené místo se s výhodou nachází v poloze, která je ekvivalentní té popsané v sekcí „konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 nebo „konjugát podle vynálezu popsané v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid je sacharidová část nebo je to libovolná poloha popsaná v uvedených sekcích.
Termín „ekvivalentní poloha označuje polohu v aminokyselinové sekvenci daného polypeptidu IFNB, která je homologní (to je odpovídající v poloze buď primární nebo terciální struktury) s relevantní polohou v aminokyselinové sekvenci uvedené v SEQ ID NO: 2. Termín „ekvivalentní poloha se běžně stanoví na základě uspořádání členů rodiny proteinových sekvencí IFNB, například použitím programu CLUSTALW verze 1.74 za použití nastavených parametrů (popisuje se v publikaci Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap panalties and weight matrix choíce, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680) nebo z publikovaného uspořádání.
• · • · · · • ·
Ve specifickém provedení vynálezu mateřský polypeptid IFNB je lidský IFNB divokého typu bsahující jeden nebo více glykosylačních míst. Uvedené místo(a) se zavedla substitucí, jak se definuje v sekci „konjugát podle vynálezu popsané v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid, je sacharidová část. Když se mateřský polypeptid IFNB odvodí od lidského IFNB divokého typu, tak v normální případě také obsahuje přirozeně se vyskytující glykosylační místo v poloze N80.
Mateřský polypeptid IFNB obsahuje zavedené glykosylační místo v poloze ekvivalentní k alespoň jedné z následujících poloh 2, 49, 51 nebo 111 aminokyselinové sekvence lidského IFNB divokého typu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 (jak se definovalo substitucemi aminokyselin S2N+N4T/S, Q49a+Q51T/S, Q51N+E53T/S nebo F111N+R113T/S) a/nebo obsahuje glykosylační místo v odpovídající poloze sekvence lidského IFNB divokého typu definované N80+T82. Varianta podle vynálezu připravená z takového mateřského polypeptidu IFNB dále zahrnuje substituci aminokyseliny v poloze umítěné blízko N-glykosylačního místa, například v poloze odpovídající 1, 48, 50, 79 nebo 110 sekvence SEQ ID NO: 2. Substituce se provede aminokyselinovým zbytkem, který se liší od zbytku v relevantní poloze mateřského polypeptidu, a umožňuje zesílit glykosylaci v relevantním glykosylačním místě ve srovnání s mateřským polypeptidem IFNB.
V souladu s jedním provedením vynálezu se varianta připravila z mateřského polypeptidu IFNB, který obsahuje zavedené glykosylační místo definované subitucí ekvivalentní Q49N+Q51T/S sekvence SEQ ID NO: 2, varianta dále obsahuje substituci aminokyselinového zbytku lokalizovaného v poloze ekvivalentní k K45, Q46, L47, Q48, F50 nebo K52 sekvence SEQ ID NO: 2. Substituce se provedla aminokyselinovým zbytkem, který zesiluje glykosylaci v uvedeném zavedeném glykosylačním místě ve srovnání s mateřským polypeptidem IFNB. Substituovaný aminokyselinový zbytek se s výhodou nachází v poloze ekvivalentní poloze Q48.
4 44444
V jiném z mateřského glykosylační se varianta připravila který obsahuje zavedené substitucí ekvivalentní provedení vynálezu polypeptidů IFNB, místo definované
F111N+R113T/S sekvence SEQ ID NO: 2. Varianta dále obsahuje substituci aminokyselinového zbytku umístěného v poloze ekvivalentní poloze E107, K108, E109, DUO, T112 nebo G114 sekvence SEQ ID NO:2. Substituce se provedla aminokyselinovým zbytkem, který zesiluje glykosylaci v uvedeném zavedeném glykosylačním místě ve srovnání s mateřským polypeptidem IFNB. Substituovaný aminokyselinový zbytek se s výhodou nachází v poloze ekvivalentní k poloze DUO.
V jiném z mateřského glykosylační se varianta připravila který obsahuje zavedené substitucí ekvivalentní provedení vynálezu polypeptidů IFNB, místo definované k Q51N+E53T/S sekvence SEQ ID NO: 2. Varianta dále obsahuje substituci aminokyselinového zbytku lokalizovaného v poloze ekvivalentní k L47, Q48, Q49, F50, K52 nebo D54 sekvence SEQ
ID NO: 2. substituce se provedla aminokyselinovým zbytkem, který zvyšuje glykosylaci v uvedeném glykosylačním místě ve mateřského polypeptidů IFNB.
srovnání s glykosylaci Substituovaný aminokyselinový zbytek ekvivalentní k Q49.
se nachází v poloze
V dalším z mateřského glykosylační provedení vynálezu se polypeptidů IFNB, místo definované k S2N+N4T/S sekvence SEQ ID NO:
varianta připravila který obsahuje zavedené substitucí ekvivalentní 2. Varianta dále obsahuje substituci aminokyselinového zbytku lokalizovaného v poloze • · ·· · 0 0
ekvivalentní k Ml, Y3 nebo L5 sekvence SEQ ID NO: 2. Substituce se provedla v aminokyselinovém zbytku, který zesiluje glykosylaci v uvedeném zavedeném glykosylačním místě ve srovnání s glykosylaci mateřského polypeptidů IFNB. Substituovaný aminokyselinový zbytek se nachází v poloze ekvivalentní k poloze Ml. Použitím http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/ se ověřilo, že všechny aminokyselinové substituce je možné provést v poloze 1 sekvence SEQ ID NO: 2 (to znamená, že umožňuje správné štěpení signálního peptidu).
V jiném provedení vynálezu se varianta připravila z mateřského polypeptidů IFNB, který obsahuje přirozeně se vyskytující glykosylační místo umístěné v poloze ekvivalentní poloze N80 a T82 sekvence SEQ ID NO: 2. Varianta dále obsahuje substituci aminokyselinového zbytku umístěného v poloze ekvivalentní k poloze S76, T77, E78, W79, E81 nebo 183 sekvence SEQ ID NO: 2. Substituce se provedla aminokyselinovým zbytkem, který zesiluje glykosylaci v uvedeném glykosylačním místě ve srovnání s glykosylaci mateřského polypeptidů ISBN. Substituovaný . aminokyselinový zbytek se nachází v poloze ekvivalentní k poloze W79.
Varianta podle vynálezu obsahuje alespoň jednu z následujících sad mutací:
Q48F,V,W,Y+Q49N+Q51T/S,
D110F,V,Y+F111N+R113T/S přičemž všechny mutace jsou označeny vzhledem k aminokyselinové sekvenci uvedené v SEQ ID NO: 2.
Rozumí se, že glykosylace z glykosylačních míst zavedených v jiných polohách než jsou ty, které se uvádějí shora v textu (například v poloze obsazené libovolným aminokyselinovým zbytkem exponovaným na povrchu, jak se definuje v dokumentu • · · · · ·· · • · · ······ · · • · · · «··· • ·· ·· ·· · ·
PCT/DKOO/004Ί1) se může upravovat analogickým způsobem, který se popisuje shora v textu.
Dále je výhodné, že mateřský upravovaný polypeptid IFNB podle vynálezu neobsahuje cysteínový zbytek, například cysteinový zbytek lokalizovaný v poloze 17 sekvence SEQ ID NO: 2. V případě, že mateřský polypeptid se získal z lidského IFNB divokého typu obsahuje aminokyselinový zbytek v poloze 17, kterým není cystein, například mutaci C17S vzhledem k aminokyselinové sekvenci uvedené v SEQ ID NO: 2.
V jiném provedení vynálezu mateřský polypeptid IFNB, aby se upravil v souladu s vynálezem, obsahuje alespoň jeden zavedený a/nebo odstraněný aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu vhodnou pro druhou část, kterou není polypeptid. Zavedený a/nebo odstraněný aminokyselinový zbytek se popisuje například v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid je molekula, která má jako vazebnou skupinu lyzin, „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid se váže na cysteinový zbytek, nebo „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DKOO/00471, kde část, kterou není polypeptid se váže na kyselou skupinu a tak mateřský polypeptid IFNB je polypeptidová část konjugátu, jak se popisuje v libovolné z těchto sekcí.
Aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, je například lyzinový zbytek. Ve specifickém provedení vynálezu mateřský polypeptid IFNB obsahuje alespoň jednu substituci aminokyselinového zbytku lokalizovaného v poloze ekvivalentní ke K19, K33, K45 a K123. Lysin se přednostně substituuje zbytkem R.
• · • · 4 · • 4 4444 44 • · 4 · 444444 4
4 4 4 4 4 4
4444 4444 44
Mateřský polypeptid z následujících sad mutací ID NO: 2):
IFNB může obsahovat jednu (označeno ve vztahu k sekvenci SEQ
C17S+Q49N+Q51 T+Fl 1 IN-tRl 13T;
S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T;
C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51TtFl 11N+R113T+K123R;
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R; S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53 T+K123R; S2N+N4T+C17S+K19R+K33R+K45R+Q51N+E53T+K123R; S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R; S2N+N4T+C17S+K19R1-K33R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R.
V případě, že polypeptid IFBN obsahuje mutaci Q49N+Q51T/S, varianta podle vynálezu s výhodou dále obsahuje substituci Q48F,V,W,Y. V případě, že mateřský polypeptid IFNB obsahuje mutace F111N+R113T/S, varianta s výhodou dále obsahuje substituci D110F,V,Y.
Rozumí se, že když mateřský polypeptid IFNB a tak i varianta obsahuje zavedený a/nebo odstraněný aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro druhou část, kterou není polypeptid, varianta není s výhodou pouze glykosylovaná, ale také konjugovaná s druhou částí, kterou není polypeptid, prostřednictvím alespoň jedné zavedené a/nebo odstraněné vazebné skupiny. Druhá část, kterou není polypeptid, se obvykle liší od cukerné části a v normálním případě je to polymer, jako je PEG. Sekce „Část konjugátu podle vynálezu, kterou není polypeptid popisuje vhodné polymery a jiné typy částí, kterými nejsou polypeptidy, jenž se mohou použít jako druhé části, kterými není polypeptid, pro konjugací variant podle vynálezu.
Vynález dále popisuje polypeptid interferonu beta, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci, jenž se liší od polypeptidu lidského interferonu beta divokého typu s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 2, a obsahuje následující sady mutací:
* ·· ·
D110F;
C17S+D110F;
;C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+FlllN+Rn3T;
D110F+F111N+R113T;
C17S+D110F+F111N+R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F1ΠΝ+ R113T;
Cl 7S+K19R;.
C17S+K33R;
C17S.+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R; or
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T, a který může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG. Každá z těchto sad mutací se považuje za jednotlivé provedení vynálezu a může být předmětem nároku.
Specifické provedení vynálezu také popisuje polypeptid interferonu beta, který má aminokyselinovou sekvenci
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDIPEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLK.T VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI ' LRNEYEINRL TGYLRN,
·· 9 99 9
99
9 9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9
999999 · · • · · · · · ·
9 9 9 9 9· a který může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
Vynález dále popisuje polypeptid interferonu beta, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci:
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDIPEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, a který obsahuje jeden nebo více polymerů, napíklad jednu nebo více molekul PEG.
V dalším provedení vynálezu polypeptid interferonu beta dále obsahuje molekulu PEG, zvláště PEG s molekulovou hmotností 12 000 nebo 20 000, například mono-PEG s molekulovou hmotností 20 000. V případě, že molekula interferonu beta je upravena PEG, je obvyklé, že obsahuje 1 až 5 molekul polyetylenglykolu (PEG). V jiném provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 5 000 až 100
000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 10 000 až 40 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 12 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 20 000. Molekula interferonu s výhodou obsahuje 1 až 3 molekuly PEG, přičemž každá vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 12 000, nebo 1 molekulu PEG, která vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 20 000. Vhodné molekuly PEG je možné získat u firmy Shearwater Polymers, lne. a Enzon, lne. a mohou se vybrat z SS-PEG, NPCPEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, tresylovaný mPEG (popisuje se v dokumentu USA 5 880 255) nebo
9999
9 9 9 • 9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9
999999 9 ·
9 9 9 9 9 9
99 99 9· oxykarbonyl-oxy-N-dikarboxyimid-PEG (popisuje se v dokumentu USA 5 122 614) .
Vynález dále popisuje způsob zesílení glykosylace in vivo mateřského polypeptidu IFNB, který obsahuje alespoň jedno in vivo glykosylační místo, přičemž způsob zahrnuje:
i) substituci aminokyselinového zbytku, který se nachází v první poloze blízko in vivo glykosylačního místa mateřského polypeptidu IFNB, druhým aminokyselinovým zbytkem, přičemž se produkuje varianta polypeptidu IFNB, ii) měření stupně glykosylace varianty vzhledem ke glykosylací mateřského polypeptidu IFNB, získaných expresí glykosylující hostitelské buňky za srovnatelných podmínek, iii) jestliže je nezbytné opakovat krok popsaný v odstavci i), aby došlo k substituci druhého aminokyselinového zbytku třetím aminokyselinovým zbytkem a/nebo substitucí aminokyselinového zbytku lokalizovaného ve druhé poloze blízko místu glykosylace druhým aminokyselinovým zbytkem a opakování kroku popsaného v odstavci ii) buď v případě mateřské molekuly nebo varianty molekuly, která vzniká v kroku i), kroky popsané v odstavci i) až iii) se opakují do té doby, dokud nedojde ke zvýšení glykosylace in vivo.
Mateřský polypeptid může obsahovat přirozeně se vyskytující nebo nepřirozeně se vyskytující glykosylační místo a mohou to být například mateřské polypeptidy definované shora v textu. Aminokyselinový zbytek, který se nachází blízko glykosylačního místa, je například libovolný z těch uvedených v této sekci.
Vynález dále popisuje glykosylovanou variantu polypeptidu interferonu beta, který má aminokyselinovou sekvenci odlišnou • 4444 4· 44 44 ··♦·
4 4 4 4 4 4 4 4
4 4·44···
4 B 4 444 444 4 ·· 4 4444
444 4 44 44 44 4· od lidského interferonu beta divokého typu, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 2, a který obsahuje jednu z následujících sad mutací:
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+F111N+R113T;
C17S+D110F+F111N+R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ Rl 13T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R; '
C17S+K19R+K33R+K45R; or
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T, a který může obsahovat jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG. Každá z těchto sad mutací se uvažuje jako individuální provedení vynálezu a může být předmětem nároku.
Vynález dále popisuje glykosylovanou variantu polypeptidu interferonu beta, který má aminokyselinovou sekvenci:
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDIPEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN, • · · * · φφ φφφφ a který obsahuje jeden nebo více polymerů, například jednu nebo více molekul PEG.
V jiném specifickém provedení vynálezu se popisuje glykosylovaná varianta polypeptidu interferonu β, který má aminokysleinovou sekvenci
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDIPEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN,
V jednom provedení vynálezu je molekula interferonu glykosylovaná a upravená PEG. V jiném provedení vynálezu molekula interferonu je glykosylovaná.
V dalším provedení vynálezu glykosylovaný polypeptid interferonu beta obsahuje jednu až pět cukerných složek, jednu až tři cukerné složky. Když je molekula interferonu glykosylovaná, je s výhodou N-glykosylovaná. Když je molekula interferonu glykosylovaná, obvykle obsahuje 1 až 5 sacharidových částí, jako je 1 až 3 cukerných částí. V dalším provedení vynálezu je molekula interferonu N-glykosylovaná a obsahuje 1 až 5 cukerných částí, jako 1 až 3 cukerné části. V jiném provedení vynálezu je molekula interferonu N-
glykosylovaná | a | obsahuje | 3 | sacharidové části. | Polypeptid |
interferobu beta | obsahuje | tři | sacharidové části, | které jsou | |
v poloze N49, | N80 | a Nlll. | |||
V dalším | provedení | vynálezu glykosylovaný | polypeptid |
interferonu beta dále obsahuje molekulu PEG, zvláště PEG s molekulovou hmotností 12 000 nebo 20 000, například mono-PEG s molekulovou hmotností 20 000. V případě, že molekula interferonu je upravena PEG, obvykle obsahuje 1 až 5 molekul polyetylenglykolu (PEG). V dalším provedení vynálezu molekula »0 0000 • ·0·0
0 ·«
0· 0
0 0 ·
0 000
0 0
0«
0 0 «
interferonu obsahuje 1 až 5 molekul PEG, jako 1, 2 nebo 3 molekuly PEG. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 5 000 až 100 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 10 000 až 40 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 12 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 20 000. Molekula interferonu s výhodou obsahuje 1 až 3 molekuly PEG, přičemž každá vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 12 000, nebo 1 molekulu PEG, jejíž molekulová hmotnost je přibližně 20 000. V dalším provedení vynálezu polypeptid interferonu beta obsahuje 1 až 3 molekuly PEG s molekulovou hmotností 12 000. V určitém provedení vynálezu polypeptidu interferonu beta obsahuje jednu molekulu PEG s molekulovou hmotností 20 000. Vhodné molekuly PEG jsou dostupné u firmy Shearwater Polymers, lne. a Enzon, lne. a mohou se vybrat z SS-PEG, NPC-PEG, aldehyd-PEG, mPEGSPA, mPE-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, tresylovaný mPEG (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 5 880 255) nebo oxykarbonyl-oxyN-dikarboxyímid-PEG (popisuje se v dokumentu USA č. 5 122 614) .
Glykosylované varianty podle vynálezu se exprimovaly rekombinatně v glykosylující hostitelské buňce, kterou je s výhodou savčí buňka, jak se popisuje v sekci „Spojení se sacharidovou částí.
Varianta podle vynálezu se exprimuje skoro nebo úplně stejně silně jako mateřský polypeptid IFNB (IU/ml). Když dojde k silnému zesílení glykosylace substitucí aminokyselinového zbytku lokalizovaného blízko místa glykosylace, zeslabení exprese může být přijatelné pokud je účinnost varianty zlepšena ve srovnání s mateřským polypeptidem IFNB.
vynálezu v normálním případě • 4 ··4 ·
4
4 4 > «4
Rozumí se, že varianty podle vykazují libovolnou ze zlepšených vlastností, které se popisují v případě konjugátů podle dokumentu PCT/DK00/00471, například libovolná ze zlepšených vlastností popsaná dále v textu v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471.
Varianty se substitucemi specifických aminokyselin.
V dalším provedení vynálezu je varianta, která obsahuje mutaci L98P vzhledem k mateřské molekule IFNB, zvláště s lidským IFNB divokého typu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1. Varianta může obsahovat L98P, jako jedinou mutaci, nebo může obsahovat další mutace, například libovolnou z mutací popsanou v sekcích, jejichž název začíná „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/0047 °.... nebo v sekci nazvané „Varianty se zesílenou glykosylaci. Varianta může například obsahovat následující mutace:
Q49N+Q51T+L98P+F111N+R113T C17S+Q49N+Q51T+L98P+F111N+R113T
Další specifické glykosylované varianty podle vynálezu zahrnují následující aminokyselinové substituce (vztažené k sekvenci SEQ ID NO: 2):
Cl 7S+Q49N+Q51T+F111N+R113T S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T+F111N+R113T
Další specifické glykosylované varianty podle vynálezu zahrnují následující substituce aminokyselin (vztaženo k sekvenci SEQ ID NO: 2):
·««· ·· · *· · ·· · ♦ · · · · · ··» * ·· ·· ·· ··
S2N+N4T+C17S+K19R+Q51N+E53T+K123R
S2N+N4T+C17S+K19R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R
Tyto varianty se v typickém případě konjugovaly s druhou částí, kterou není polypeptid, jako je polymer, například PEG.
Rozumí se, že varianty podle vynálezu v normálním případě vykazují libovolnou ze zlepšených vlastností, které se popisují v případě konjugátů popsaných v dokumentu PCT/DK00/00471, například libovolná ze zlepšených vlastností popsaných dále v textu v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471.
Varianty, kterými jsou fúzní proteiny.
Vynález dále popisuje variantu polypeptidu IFNB, kterým je fúzní protein obsahující a) polypeptid IFNB a b) polypeptid lidského sérového albuminu (HSA). Varianta polypeptidu IFNB je například polypeptidová část konjugátu, jak se popisuje v dokumentu pCT/DK00/00471 nebo glykosylovaná varianta podle vynálezu. HSA je například lidský sérový albumin divokého typu nebo jeho fragment nebo jeho varianta. Může to být například libovolný z fragmentů lidského sérového albuminu popsaného v dokumentu WO 97/24445. Fúze s lidským sérovým albuminem se také popisuje v dokumentu WO 93/15199, WO 93/15200 a EP 413 622.
Polypeptid IFNB a část fúzního proteinu tvořená lidským sérovým albuminem se může vázat přímo nebo prostřednictvím linkeru, jak se například popisuje v dokumentu WO 97/24445. HSA se může spojit s C-terminálním koncem polypeptidu IFNB nebo s N-terminálním koncem. Spojení je možné také prostřednictvím línkerového peptidu.
•0 0*00 • 00«
Uvažuje se, že fúze polypeptidu IFNB s lidským sérovým albuminem nebo jeho variantou nebo fragmentem vede ke zvýšeni stability výsledného fúzního proteinu.
0· 00 » 0 0 · · »00« · • 0 000 0 0 • · · ·
00 <
0 4 ··
Rozumí se, že varianty podle vynálezu v normální případě vykazují libovolnou ze zdokonalených vlastností uvedených dále v textu v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/0047.
Části sekce podstata vynález z dokumentu pct/dk00/00471
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471
Předmětná věc vynálezu popsaná v dokumentu PCT/DK00/00471 se vztahuje ke konjugátu, který vykazuje aktivitu IFNB a obsahuje alespoň jednu první část, kterou není polypeptid, kovalentně zachycenou na polypeptidu IFNB, aminokyselinovou sekvenci, která se liší od lidského IFNB divokého typu alespoň jedním zavedeným a alespoň jedním odstraněným aminokyselinovým zbytkem obsahující vazebnou skupinu pro uvedenou první část, kterou není polypeptid.
Odstraněním a/nebo zavedením aminokyselinových zbytků, které obsahují vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, je možné specificky adaptovat polypeptid tak, že molekula je náchylnější ke konjugaci se zvolenou částí, kterou není polypeptid, aby se optimalizoval konjugační patern (například zajistit optimální distribuci částí, které nejsou polypeptidem, na povrchu molekuly IFNB a tak například účinně zastínit epitopy a jiné částí na povrchu polypeptidu, aniž se podstatně poruší jejich funkce). Zavedením vazebných skupin se polypeptid posiluje nebo jinak upravuje, co se týká obsahu specifických aminokyselinových zbytků, na které se váže relevantní část, kterou není polypeptid, přičemž se dosáhne
444
4 9 99 9 • 44·· 4 4 4 • · » 444444 · 4
44 4 «444
4444 44 4 4 «4 44 účinnější, specifičtější a/nebo silnější konjugace. Odstraněním jedné nebo více vazebných skupin je možné zabránit konjugaci s částí, kterou není polypeptid, v částech polypeptidů, kdy taková konjugace je nevýhodná, například v případě, kdy aminokyselinový zbytek lokalizovaný ve funkčním místě polypeptidů nebo v jeho blízkosti (protože konjugace v takovém místě může vést k deaktivaci nebo k zeslabení aktivity IFNB výsledného konjugátu, což je způsobeno porušeným rozeznáváním receptorů). Dále může být výhodné odstranit vazebnou skupinu lokalizovanou blízko jiné vazebné skupiny za účelem zabránit heterogenní konjugaci takových skupin.
Rozumí se, že aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid, a který bude buď odstraněn nebo zaveden, se vybral na základě podstaty části, kterou není polypeptid, a v mnoha případech na základě metody použité konjugace. Když částí, kterou není polypeptid, je molekula polymeru, jako je polyetylénglykol nebo molekula odvozená z polyalkylenoxidu, pak aminokyselinové zbytky schopné fungovat jako vazebná skupina se vybraly z skupiny obsahující lysin, cystein, kyselinu asparágovou, glutamovou a arginin. Když částí, kterou není polypeptid, je sacharidová část, pak vazebnou skupinou je in vivo glykosylační místo, s výhodou místo N-glykosylace.
Jakmile se vazebná skupina pro část, kterou není polypeptid, bude zavádět do polypeptidů IFNB nebo se z něho odstraní v souladu s vynálezem popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471, upravovaná poloha polypeptidů IFNB se vybrala následujícím způsobem:
Poloha se s výhodou nachází na povrchu polypeptidů IFNB a výhodněji je obsazena aminokyselinovým zbytkem, který má více než 25 % postranního řetězce vystaveného působení řetězce
AAAA
Α· Α·*Α
A A * A
AA A AAAA AA A
A · AAAAA· A
DQ · A * A A AAA A A A *
O a A AA AAAAA
AA-i A AA AA ·♦ »A rozpouštědla, výhodněji více než 50 % řetězce. Takové polohy se identifikovaly na základě analýzy struktury 3D molekuly lidského IFNB, jak se popisuje v sekci Metody.
V jiném případě nebo navíc poloha, která se bude upravovat, se identifikovala na základě analýzy rodiny proteinových sekvencí IFNB. Poloha, která se bude upravovat může být jedna, která v případě jednoho nebo více členů rodiny jiných než mateřská IFNB, je obsazena aminokyselinovým zbytkem obsahující relevantní vazebnou skupinu (když se takový aminokyselinový zbytek bude zavádět) nebo která v mateřském IFNB, ale nikoliv v případě jednoho ani více jiných členů rodiny, je obsazena aminokyselinovým zbytkem obsahujícím relevantní vazebnou skupinu (v případě, že se takový aminokyselinový zbytek odstraní).
Za účelem stanovit optimální distribuci vazebných skupin, se vypočítala vzdálenost mezi aminokyselinovými zbytky umístěnými na povrchu molekuly IFNB na základě struktury 3D polypeptidu IFNB. Stanovila se vzdálenost mezi CB aminokyselinových zbytků obsahující takové vazebné skupiny nebo vzdálenost mezi funkční skupinou (NZ v případě lyzinu, CG v případě kyseliny asparágové, CD v případě kyseliny glutamové, SG v případě cysteinu) jednoho a CB jiného aminokyselinového zbytku obsahující vazebnou skupinu. V případě glycinu se používá CA místo CB. V případě polypeptidové části IFNB konjugátu podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 je libovolná uvedená vzdálenost s výhodou větší než 8 Á, zvláště větší než 10 Á za účelem zabránit nebo omezit heterogenní konjugaci.
Dále v polypeptidové části konjugátu podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 se vazebné skupiny lokalizované v místě navázání na receptor IFNB s výhodou odstranily substituci aminokyselinového zbytku obsahujícího takovou skupinu.
*· ···· 9 9 9 9 99 · • 9 9 9 9 9 *
9 9 999 999 9
9 9 9 9 9 9
99 99 99
Dalším obecně aplikovatelný přístupem pro úpravu polypeptidu IFNB je zastínit a tak porušit nebo jiným způsobem deaktivovat epitop přítomný v mateřském IFNB konjugací s částí, kterou není polypeptid. Epitopy lidského IFNB se mohou identifikovat použitím metod známých v oboru, které jsou také známy jako mapování epitopu (popisuje se například v publikaci Romagnoli et al., Biol. Chem., 1999, 380(5):553-9, Biol., 1999, 96: 11-20, Van de Water Immunopathol., 1997, 85(3): 229-35,
Saint-Remy JM., Toxicology, 1997, 119(1):77-81 a Lané DP a
Stephen CW, Curr. Opin. Immunol., 1993, 5(2):268-71). Jednou metodou je připravit fágovou knihovnu exprimující náhodné oligopeptidy, které obsahují například 9 aminokyselinových zbytků. Protilátky IgGl ze specifického antiséra vůči lidskému IFNB se čistily imunologickým srážením a reaktivní fágové se
DeLisser HM, Methods Mol et al., Clin. Immunol.
identifikovaly imunobloty. Sekvenováním DNA izolovaných reaktivních fágů se může stanovit sekvence oligopeptidu a pak následuje lokalizace sekvence struktury 3D IFNB. V jiném případě se mohou identifikovat epitopy způsobem popsaným v dokumentu USA č. 5 041 376. Identifikovaná oblast na struktuře tvoří epitop, který se pak může vybrat jako cílová oblast pro zavedení vazebné skupiny pro část, kterou není polypeptid. S výhodou alespoň jeden epitop, jako jsou dvě, tři nebo čtyři epitopy lidského rekombinantního obsahovat mutaci C17S) jsou stíněny částí, polypeptid podle vynálezu popsaného
PCT/DK00/00471. V jednom provedení podle vynálezu konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 má alespoň jeden zastíněný epitop ve srovnání s lidským IFNB divokého typu, který může obsahovat mutaci C17S, zahrnující libovolný běžně dostupný IFNB. Konjugát podle vynálezu popsaný
IFNB (mohou kterou není v dokumentu • ·· · ·· · · · « · · · · λ r\ · · ·······
U · · ········· · • · · · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ·· v dokumentu PCT/DKOO/00471 s výhodou obsahuje polypeptid, který se upravil tak, že je zastíněn epitop lokalizovaný v blízkosti aminokyselinového zbytku Q49 a/nebo Fill. To je možné provést zavedením vazebné skupiny pro část, kterou není polypeptid do polohy lokalizované v blízkosti Q49 (to je 4 aminokyselinové zbytky v primární sekvenci nebo přibližně 10 Á v terciální sekvenci) a/nebo Fill. Vzdálenost 10 Á se měří mezi CB (CA v případě glycinu). Takové specifické zavedení se popisuje v následujících sekcích.
V případě odstranění vazebné skupiny relevantní aminokyselinový zbytek obsahující takovou skupinu a obsazující polohu, jak se definuje shora v textu, se přednostně substituje odlišným aminokyselinovým zbytkem, který neobsahuje vazebnou skupinu pro část, kterou není polypeptid.
V případě zavedení vazebné skupiny se aminokyselinový zbytek obsahující takovou skupinu zavede do polohy substitucí aminokyselinového zbytku, který obsadil takovou polohu.
Skutečný počet vazebných skupin dostupných pro konjugaci a přítomných v polypeptidů IFNB závisí na požadovaném účinku, kterého se má dosáhnout konjugací. Účinek, kterého se má dosáhnout je například závislý v podstatě na stupni konjugace (například identita části, kterou není polypeptid, na počtu částí, kterými není polypeptid nutných k tomu, aby došlo ke konjugaci polypeptidů, případě, že by konjugace měla proběhnout nebo v případě, že by se konjugaci mělo zabránit, atd..). Jestliže například je nutná omezená imunogennost, pak počet (a poloha) vazebných skupin by měla být dostatečná k zastínění většiny nebo všech epitopů. Toho je možné dosáhnout v případě, že větší podíl polypeptidů IFNB je zastíněn. Účinného stínění epitopů se v normálním případě dosáhne, když celkový počet vazebných skupin, které jsou «9 9 9999 99 9
Λ η 9 9 9999999 *1 -L 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9
99 9 9999
9999 99 99 99 99 dostupné pro konjugaci je v rozmezí 1 až 10, zvláště v rozmezí až 8, jako 3 až 7.
Funkční poločas in vivo je závislý na molekulové hmotnosti konjugátu a počet vazebných skupin potřebných pro prodloužení poločasu tak závisí na molekulové hmotnosti části, kterou není polypeptid. V jednom provedení vynálezu konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 vykazuje molekulovou hmotnost alespoň 67 000, zvláště alespoň 70 000, jak se měřilo SDS-PAGE podle publikace Laemmli, U.K., Nátuře, Vol. 227 (1970), p680-85. IFNB má molekulovou hmotnost přibližně 20 000 a proto je potřeba dalších přibližně 50 000, aby se dosáhlo požadovaného účinku. To je možné například provést molekulami PEG, jejichž molekulová hmotnost je 5 000, 10 000, 12 000 nebo 20 000 nebo jiným zde popsaným způsobem.
Za účelem zabránit velkému poškození struktury a funkce molekuly mateřského lidského IFNB se celkový počet aminokyselinových zbytků změnil v souladu s vynálezem popsaným v dokumentu PCT/DK00/00471 (jak se porovnává s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2) .
V typickém případě nepřekročil počet 15. Polypeptid IFNB s výhodou obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší 1 až 15 aminokyselinovými zbytky od aminokyselinové sekvence uvedené SEQ ID NO: 2, 1 až 8 nebo 2 až 8 aminokyselinových zbytků, například 1 až 5 nebo 2 až 5 aminokyselinových zbytků od aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2. Tak v normálním případě polypeptid IFNB obsahuje aminokyselinovou sekvencí, která se liší od aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinovými zbytky. Shora v textu uvedené počty reprezentují buď celkový počet zavedených nebo celkový počet odstraněných aminokyselinových zbytků, které obsahují vazebnou skupinu pro relevantní část, kterou není polypeptid, nebo
celkový počet zavedených nebo odstraněných aminokyselinových zbytků obsahujících takovou skupinu.
V případě konjugátu podle vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 je výhodné, že alespoň přibližně 50 % všech konjugovatelných vazebných skupin, jako alespoň 80 % a s výhodou všechny takové skupiny, jsou obsazeny relevantní částí, kterou není polypeptid. Ve výhodném provedení vynálezu konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje alespoň například 1 až 10 částí, které nejsou polypeptid, jako 2 až 8 nebo 3 až 6 částí.
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 vykazuje jednu nebo více z následujících zdokonalených vlastností (stanovených za porovnatelných podmínek):
Redukovaná imunogennost znamená redukci například alespoň 25 %, alespoň 50 % a výhodněji alespoň 75 % při srovnání s lidským IFNB divokého typu (například Avonex nebo Rebif) nebo Betaseron.
Prodloužený funkční poločas in vivo a/nebo prodloužený poločas přeměny v séru se porovnává s lidským IFNB divokého typu (například Avonex nebo Rebif) nebo Betaseron.
Redukovaná nebo žádná reakce s neutralizujícími protilátkami, které pochází z pacientů ošetřených lidským IFNB divokého typu (například Rebif nebo Avonex) nebo přípravkem Betaseron, například neutralizace alespoň 25 %, alespoň 50 % a s výhodou alespoň 75 %, se porovnává s lidským IFBN divokého typu.
Hodnota antivirové aktivity konjugátu podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 nemůže být kritická a tak • · · · 0 ·
00·· ·· 0 0····· φ
Λ Q · · ······» “ 0 0 00 0 00···· ·
00 · · 0 · · •000 00 00 ·· ·· bude redukována (například až ze 75 %) nebo bude zesílena (například alespoň z 5 %) nebo rovná aktivitě lidského IFNB divokého typu (například Avonex nebo Rebif) nebo přípravku
Betaseron, jak se stanovilo za porovnatelných podmínek.
Stupeň antivirové aktivity, jak se porovnává s antiproliferační aktivitou konjugátu podle vynález popsanou v dokumentu PCT/DK00/00471 může kolísat a tak může být vyšší, nižší nebo rovný aktivitě lidského IFNB divokého typu.
Konjugáty podle vynálezu popsané v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid, je molekula, jenž obsahuje lysin jako vazebnou skupinu
Ve výhodném provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 první část, kterou není polypeptid, vykazuje jako vazebnou skupinu lysin a tak polypeptid IFNB je ten, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od lidského IFNB divokého typu alespoň jedním zavedeným a/nebo alespoň jedním odstraněným lysinovým zbytkem. Zatímco část, kterou není polypeptid, může být libovolná z těch, které se váží na lysinový zbytek, například na jeho ε-aminoskupinu, tak jako molekula polymeru, lípofílní skupina, organické derivatizační činidlo nebo sacharidová část. Je to s výhodou libovolná molekula polymeru uvedená v sekci „Konjugace s molekulou polymeru zvláště pak větvený nebo lineární PEG nebo polyalkylenoxid. Nejvýhodnější je, když polymerni molekulou je PEG a aktivovaná molekula, která se použije při konjugaci, je SS-PEG, NPC-PEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC od firmy Shearwater polymers, lne., SC-PEG od firmy Enzon lne., tresylovaný mPEG, jak se popisuje v dokumentu USA č. 5 880 255 nebo oxykarbonyl-oxy-N-dikarboxyimid-PEG (jak se popisuje v dokumentu USA č. 5 122 614) . V normálním případě při konjugaci na lysinový zbytek má část, kterou není • 444 • 4 4 4 4 4 4 • 4 4*4 4 4 · • 444 444 444 4
44 4 444*
4 44 44 4 4 44 polypeptid, molekulovou hmotnost přibližně 5 000, 10 000, 12
000 nebo 20 000.
V jednom provedení vynálezu popsané v dokumentu PCT/DK00/00471 aminokyselinová sekvence polypeptidů IFNB se liší od aminokyselinové sekvence IFNB divokého typu alespoň jedním odstraněným zbytkem, 1 až 5 odstraněnými lysinovými zbytky, zvláště pak 1 až 4 nebo 1 až 3 odstraněnými lysinovými zbytky. Lysinový zbytek(zbytky) , které se odstraní s výhodou nahrazením, se vybraly ze skupiny zahrnující K19, K33, K45,
K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 a K136. Lysinový zbytek se může nahradit libovolným jiným aminokyselinovým zbytkem, ale je s výhodou nahrazen argininem nebo glutaminem, aby vznikl alespoň strukturní rozdíl. Polypeptidovou částí může být ta, kde se K19, K45, K52 a/nebo K123, s výhodou K19, K45 a/nebo K123 nahradil libovolným jiným aminokyselinovým zbytkem, s výhodou argininem nebo glutaminem. IFNB polypeptidová část konjugátu podle vynálezu popsaná v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje kombinaci substitucí aminokyselin vybraných z následujícího seznamu:
K19R+K45R+K123R;
K19Q+K45R+K123R;
K19R+K45Q+K123R;
K19R+K45R+K123Q;
K19Q+K45Q+K123R;
K19R+K45Q+K123Q;
K19Q+K45R+K123Q;
K19Q+K45Q+K123Q;
K45R+K123R;
K45Q+K123R;
K45Q+K123Q;
K45R-PK123Q;
K19R+K123R;
K19QTK123R;
K19R+K123Q;
K19Q-fK123Q;
K19R-K45R;
K19Q+K45R;
K19R+K45Q;
K19Q+K45Q.
·* ·<·· • · · » ·* ·· uvedených obsahovat
Navíc nebo místo substitucí aminokyselin v seznamu shora v textu, polypeptidová část může alespoň jednu substituci vybranou ze skupiny zahrnující K33R, K33Q, K52R, K52Q, K99R, K99Q, K105Q, K108Q, K115R, K115Q,
K134R, K134Q, K136R a K136Q, například alespoň jednu z následujících substitucí:
K52R+K134R;
K99R+K136R;
K33R+K105R+K136R;
K52R+K108R+K134R;
K99R+K115R+K136R;
. K19R+IC33R+K45R+K123R;
K19R+K45R+K52R+K123R;
K19R+K33R+K45R+K52R+K123R;
K19R4-K45R+K52R+K99R+K123R.
V dalším provedení vynálezu popsaném v dokumentu
PCT/DK00/00471 se aminokyselinová sekvence polypeptidu IFNB liší od sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 tím, že lysinový zbytek se zavedl substitucí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku, který obsadil polohu, která je v mateřské molekula IFNB obsazena aminokyselinovým zbytkem exponovaným na povrchu, s výhodou aminokyselinovým zbytkem, který vykazuje alespoň 25 %, tak jako alespoň 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu. Substituovaný aminokyselinový zbytek se s výhodou vybral ze skupiny zahrnující 'N4, F8, L9, Rll, S12, F15, Q16, Q18, L20, W22, Q23, G26, R27, L28,
E29, Y30, L32, R35, M36, N37, D39, P41, E42, E43, L47, Q48, Q49, T58, Q64, N65, F67, A68, R71, Q72, D73, S75, S76, G78, N80, ESI, 183, E85, N86, A89, N90, Y92, H93, H97, T100, L102, E103, L106, E107, E109, D110, Fill, Rl 13, G114, LI 16, Ml 17, L120, H121, R124, G127, R12S, L130, H131, E137, Y138, H140,1145, R147, V148, E149, R152, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163, R165 a; N166 'SEQ ID NO 2.
• · · · • · · ♦ · · • · · · · · • ·· · 99999 • · · · · • · · · · ·· ··· ·
Výhodněji aminokyselinová sekvence polypeptidu IFNB se liší od aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 tím, že lysinový zbytek se zavedl substitucí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku, který se nachází v poloze vybrané ze skupiny obsahující
N4, F8, L9, Rll, S12, G26, R27, E29, R35, N37, D39, E42, L47, Q48, Q49, A68, R71, Q72, D73, S75, G78, N80, E85,N86, A89, Y92, H93, DUO, Fill, R113, LI 16, H121, R124, G127, R128, R147, V148, Y155, N158, R159, G162 ά R165, dokonce výhodněji se vybralo ze skupiny obsahující
N4, Rll, G26, R27, Q48, Q49, R71, D73, S75, N80, E85, ' A89, Y92, H93, Fill, R113, L116, R124, G127,R128, Y155,N158 a. G16_, a nejvynodnéji se vybralo ze skupiny obsahující Rll, Q49, R71, S75, N80, E85, A89, H93, Fill, R113, L116 a Y1555 a zcela nejvýhodněji Q49 a Fill.
V souladu s provedením vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 polypeptid IFNB obsahuje substituci lysinu v jedné nebo více shora uvedených poloh, zvláště v 1 až 15 polohách, tak jako 1 až 8 nebo 1 až 5 polohách a s výhodou alespoň ve dvouch polohách, jako ve 2 až 8 nebo 2 až 5 polohách.
V dalším provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 aminokyselinová sekvence IFNB polypeptidové částí konjugátu se liší alespoň jedním odstraněným a alespoň jedním zavedeným lysinovým zbytkem, tak jako 1 až 5 nebo 2 až 5 odstraněných lysinových zbytků a 1 až 5 nebo 2 až 5 zavedených lysinových zbytků. Rozumí se, že odstraněné a zavedené lysinové zbytky se vybraly z těch popsaných podle vynálezu.
V souladu s tímto vynálezem popsaným v dokumentu PCT/DK00/00471 celkový počet konjugovatelných lysinových λ η Σ * · · · · · / · · · · · ··· * # • · · · · · ··· · ·· .. ..
zbytků je s výhodou v rozmezí 1 až 10, tak jako 2 až 8 nebo 3 až 7 .
IFNB polypeptidová část konjugátu podle uvedeného provedení vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DKOO/O0471 může obsahovat alespoň jednu z následujících substitucí R11K, Q48K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K, výhodněji R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K,
H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K, v kombinací s alespoň jednou substitucí: K19R/Q K33R/Q K45R/Q, K52R/Q, K99R/Q,
K105/R/Q, K108R/Q, K115R/Q, K123R/Q, K134R/Q a K136R/Q, kde
R/Q označuje substituci zbytku R nebo Q, s výhodou zbytku R. Polypeptid IFNB s výhodou obsahuje alespoň jednu z následujících substitucí R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K, zvláště Q49K, F111K a/nebo N80K, v kombinaci se substitucí alespoň jedné z K19, K45, K52 a/nebo K123, s výhodou zbytku R nebo Q. Polypeptid
IFNB zvláště obsahuje alespoň jednu ze substitucí Q49K, F111K a N80K v kombinaci s alespoň s jednou ze substitucí uvedených shora v textu pro odstranění lysinového zbytku. Polypeptid IFNB může obsahovat následující substituce:
Y+Z+Kl 9R+K45R+K123R;
Y+Z+Kl 9Q+K45R+K123R;
Y+Z+Kl 9R+K45Q+K123R;
Y+Z+Kl 9R+K45R+K123Q;
Y+Z+Kl 9Q+K45Q+K123R;
Y+Z+Kl 9R+K45Q+K123Q;
Y+Z+Kl 9Q+K45R+K123Q;
Y+Z+Kl 9Q+K45Q+K123Q;
Y+Z+K45R+K123R;
Y+Z+K45Q+K123R;
Y+Z+K45Q+K123Q;
Y+Z+K45R+K123Q;
Y+Z+Kl 9R+K123R;
Y+Z+Kl 9Q+K123R;
Y+Z+K19R+K123Q;
Y+Z+K19Q+K123Q;
Y+Z+K19R+K45R;
Y+Z+K19Q+K45R;
-^4-Z+KW+K4éQ·;Y+Z+K19Q+K45Q, kde symbol Y se vybral ze skupiny Q49K, F111K, N80K,
Q49K+F111K, Q49K+N80K, F111K+N80K a Q49K+F111K+N80K a symbol
Z není přítomen nebo obsahuje alespoň jednu substituci vybranou ze skupiny zahrnující K33R, K33Q, K52R, K52Q, K99R,
K99Q, K105R, K105Q, K108R, K108Q, K115R, K115Q, K134R, K134Q,
K136R a K136Q. Polypeptid IFNB obsahuje následující substituci Y+Z+K19R+K45Q+K123R, kde Y a Z mají shora popsaný význam.
V provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 polypeptid IFNB může obsahovat jednu z následujících substitucí:
K19R+K45R4-F111K+K123R; K19R+K45R4-Q49K+F111K+K123R; KI 9R+K45R+Q49K+K123R; K19R+K45R+F111K; K19R+K45R+Q49K+F111K; K19R+Q49K4-K123R;
K19R+Q49K+F111K+K123R; K45Q+F111KPK123Q; K45R+Q49K4-K123R; or K45R+Q49K+F111K+K123R.
4 44 4
• · 4 • 4 4 • · · • 4 4 4
4 4
Zvláště v případě exprese v neglykosylujícím hostiteli, jako je E.coli, polypeptid IFNB může obsahovat substituci N80K nebo C17S+N80K, který může být v kombinaci s jednou nebo více substitucí K19R/Q, K45R/Q, K52R/Q nebo K123R/Q. Substituce
N80K je zvláště zajímavá, když se polypeptid IFNB exprimoval v neglykosylující hostitelské buňce, protože N80 obsahuje část inherentního glykosylačního místa lidského IFNB a konjugace v takovém místě může napodobovat přirozenou glyosylaci.
Je výhodné, že konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje alespoň dvě první nepolypeptidové části, jako je 2 až 8 částí.
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde se část, kterou není polypeptid, váže na cysteinový zbytek
Vynález popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 popisuje konjugát vykazující aktivitu IFNB a obsahuje alespoň jeden první nepolypeptid konjugovaný s alespoň s jedním cysteinovým zbytkem polypeptidů IFNB, jehož aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence lidského IFNB divokého typu tím, že se zavedl alespoň jeden cysteinový zbytek, s výhodou substitucí, do polohy, která je v mateřské molekule IFNB obsazená aminokyselinovým zbytkem, který se nachází na povrchu molekuly a vykazuje alespoň 25 %, tak jako alespoň 50 % jeho postranního řetězce vystaveného na povrchu. Aminokyselinový zbytek se například vybral ze skupiny obsahující
F8, L9, Rll, S12, F15, Q16, Q18, L20,
W22, L28, L32, M36, P41, T58, Q64, N65, F67, 183, ES5, N86, A89, N90, Y92, H93, H97,
T100, L102, El03, L106, Ml 17, L120, H121, R124, G127, R128, L130, H131, H140,1145,
R147, V148,E149,R152,Y155,m F156 SEQ ID NO 2.
•4 44··
Dále, substituce se s výhodou provede v poloze obsazené treoninovým nebo serinovým zbytkem. Taková poloha se například vybrala ze skupiny obsahující S2, S12, S13, T58, S74, S75,
S76, T77, T82, T100, T112, S118, S119, S139, T144 a T161, výhodněji S2, S12, S13, S74, S75, S76, T77, T82, T100, T112,
S118, S119, S139 a T144 (postranní řetězec exponovaný na povrchu), výhodněji S2, S12, S75, S76, T82, T100, S119 a S139 (exponuje se alespoň 25 % postranního řetězce) a dokonce výhodněji S12, S75, T82 a T100 (exponuje se alespoň alespoň 50 % postranního řetězce) .
Ze shora v textu popsané substituce treoninu nebo šeřinu je výhodnější substituce šeřinu.
Ve více výhodných provedeních vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 se poloha vybrala ze skupiny zahrnující S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 a S139, výhodněji S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 a S139, dokonce výhodněji S2, S12, S75, S76, S119 a S139 a stále výhodněji S12 a S75.
V jednom provedení vynálezu se do polypeptidu IFNB zavedl pouze jeden cysteinový zbytek za účelem zabránit tvorbě disulfidových můstků mezi dvěmi nebo více zavedenými cysteinovými zbytky. V tomto spojení C17 přítomné v lidském IFNB divokého typu se může odstranit s výhodou substitucí, zvláště pak substitucí s S nebo A. V jiném provedení vynálezu se zavedly dva nebo více cysteinových zbytků, jako 2 až 6 nebo 2 až 4 cysteinové zbytky. IFNB polypeptidová část konjugátu podle vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje mutací L47C, Q48C, Q49C, D110C, F111C nebo R113C, zvláště pak pouze jednu z těchto mutací. Mutace se mohou vyskytovat v kombinaci s mutací C17S. Polypeptid IFNB může také obsahovat substituci C17S+N80C.
• · · podle vynálezu být molekula, si :
• · ·
Zatímco první část, kterou není polypeptid, popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 může také která v případě, že se používá daná konjugační metoda obsahuje jako vazebnou skupinu cystein (sacharidová část, lipofilní skupina nebo organické derivatizační činidlo). Je výhodné, když část, kterou není polypeptid je polymerní molekula. Polymerní molekulou může být libovolná z molekul uvedených v sekci „Konjugace s polymerní molekulou, ale s výhodou se vybrala ze skupiny zahrnující lineární nebo větvený polyetylenglykol nebo polyalkylenoxid. Nejvýhodnější je, když polymerní molekulou je VS-PEG. Konjugace mezi polypeptidem a polymerem je možné dosáhnout libovolným vhodným způsobem, například, jak se popisuje v sekci „Konjugace s polymerní molekulou, například při použití metody s jedním krokem nebo jiným způsobem, který se popisuje v uvedené sekci. V případě, že polypeptid IFNB obsahuje pouze jeden konjugovatelný cysteinový zbytek, je s výhodou konjugován s první částí, kterou není polypeptid s molekulovou hmotností alespoň 20 000. Může být konjugovaný buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím polymeru s nízkou molekulovou hmotností (jak se popisuje v dokumentu WO 99/55377). V případě, že konjugát obsahuje dvě nebo více prvních částí, které nejsou polypeptid, pak v normálním případě každý z nich má molekulovou hmotnost 5 000 až 10 000.
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid, se váže na kyselinovou skupinu.
V dalším provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 se popisuje konjugát vykazující aktivitiu IFNB a obsahující alespoň jednu první část, kterou není polypeptid, a vykazuje jako vazebnou skupinu kyselinovou skupinu. Tato • 99 · • · · · • 9 9 9 • · · 9 • 9 9 9 9 • · 9
9 · ·
•9 9« část je konjugována s alespoň jedním zbytkem kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové polypeptidu IFNB, jehož aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence polypeptidu IFNB divokého typu alespoň jedním zavedeným a/nebo alespoň jedním odstraněným zbytkem kyseliny asparagové nebo glutamové. Relevantní aminokyselinový zbytek se může zavést v libovolné poloze obsazené aminokyselinovým zbytkem exponovaným na povrchu. Je výhodné, aby aminokyselinový zbytek vykazoval více než 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu. Alespoň jeden aminokyselinový zbytek, který se s výhodou nachází v poloze vybrané ze skupiny obsahující
N4, L5, L6, F8, L9, Q10, Rll, S12, S13, F15, Q16, Q18, K19, L20, W22,
Q23, L24, N25, G26, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49,166, F67, A68,169, F70, R71, S75, T82, 183, L87, A89, N90, V91, Y92, H93, Q94,195,N96, H97, K108,Fill, LI 16, L120, K123, R124, Y126, G127, R128, L130, H131, Y132, K134, A135, H140, T144, R147, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163 m R165 se substituoval zbytkem kyseliny asparagové nebo glutamové.
Výhodnější je, když se poloha vybrala ze skupiny obsahující
Rll, S12, F15, Q16, Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, A68, R71, S75, T82, A89,N90, Y92, H93,N96, H97, K108, Fill, LI 16, L120, K123, R124, G127,
R128, L130, H131, K134, A135, H140, Y155, N158, R159, G162, Y163 a R165,
N4, L5, F8, L9, jako ze skupiny obsahující
N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, M36, Q46,
Q48, Q49, R71, S75, T82, A89, Y92, H93, K108, Fill, LI 16, K123, R124, G127, H131, K134, A135, Y155 a R165, stále výhodnější je když se vybrala ze skupiny obsahuj ící N4, L5, F8,
S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, Q46, Q4S, Q49, S75, T82, A89, Y92, H93, K108,
F111, LI 16, R124, G127, H131, K134, Y155 and R165, • ♦ »·
4· ···· tak jako ze skupiny obsahující
L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, Q48, Q49, ¥92, H93, R124, G127, H131 a Y155, dokonce výhodněji ze skupiny obsahující S12, Q16, K19, Q23,
Q48, Q49, Y92, H93, R124, G127, H131 a Y155, tak jako ze skupiny obsahující S12, Q16, K19, Q23, Q48, Y92, H93, R124, G127, H131 a Y155, zvláště ze skupiny obsahující S12, Q16,
K19, Q23, Q48, H93 a H131, dokonce výhodněji ze skupiny obsahující Q16 a Q48.
Za účelem získat dostatečný počet částí, které nejsou polypeptidem, je výhodné, zavést alespoň dva zbytky kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové s výhodou do dvou poloh vybraných z libovolné uvedené v seznamu shora v textu. Také je výhodné, když konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje alespoň dvě první části, které nejsou polypeptidem.
V případě odstranění aminokyselinového zbytku aminokyselinová sekvence polypeptidů IFNB se liší od sekvence lidského IFNB divokého typu alespoň jedním odstraněným zbytkem kyseliny asparagové nebo glutamové, tak jako 1 až 5 odstraněných zbytků, zvláště pak 1 až 4 nebo 1 až 3 odstraněné zbytky kyseliny asparágové nebo glutamové. Zbytky, které se budou odstraňovat se s výhodou nahrazují a vybraly se ze skupiny obsahující D34, D39, D54, D73, DUO, E29, E42, E43,
E53, E61, E81, E85, E103, E104, E107, E109, E137 a E149.
Kyselina asparagové a glutamové se může nahradit libovolným jiným aminokyselinovým zbytkem, ale je s výhodou nahrazena zbytkem arginin a glutamin. Zatímco první část, kterou není polypeptid, může být libovolná nepolypeptidová část, která vykazuje takovou vlastnost, je výhodné, že část, kterou není polypeptid je polymerní molekula nebo organické derivatizační činidlo vykazující jako vazebnou skupinu kyselinovou skupinu, polymerní molekulou je zvláště PEG. Konjugát se připravil například, jak se popisuje v publikaci Sakane and Pardridge,
Pharmaceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, pp.1085-1091.
V normálním případě pří konjugaci s kyselinovou skupinou část, kterou není polypeptid, má molekulovou hmotnost přibližně 5
000 nebo 10 000.
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahující druhou část, kterou není polypeptid
Vedle první části, kterou není polypeptid (jak se popisuje v předchozích sekcích) konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 může obsahovat druhou nepolypeptidovou část odlišného typu ve srovnání s první částí, kterou není polypeptid.
V libovolném se shora popsaných konjugátu, kde první část, kterou není polypeptid, je například polymerní molekula, jako je PEG, druhá část, kterou není polypeptid, je cukerná část, zvláště pak N-vázaná cukerná část. Druhá část, kterou není polypeptid, může být zachycena na přirozeném glykosylačním místě lidského IFNB, například N-vázané glykosylační místo definované polohou N80. V normálním případě je výhodné zavést do polypeptidu IFNB alespoň jedno další glykosylační místo. Takové místo je například libovolné z těch popsaných v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde částí, kterou není polypeptid je cukerná část. Dále v případě, že se zavedlo alespoň jedno další glykosylační místo, může dojít k odstranění existujícího glykosylačního místa, jak se popisuje dále v textu.
Rozumí se, že za účelem dosažení optimální distribuce zachycené první a druhé části, kterou není polypeptid, se může polypeptid IFNB upravit počtem a rozložením vazebných skupin v případě první stejně jako druhé části, kterou není * · · · • ·· · polypeptid tak, že musí mít například alespoň jednu odstraněnou vazebnou skupinu pro první část, kterou není polypeptid, a alespoň jednu vazebnou skupinu pro druhou část, kterou není polypeptid nebo naopak. Polypeptid IFNB obsahuje alespoň dvě (například 2 až 5) odstraněné vazebné skupiny pro první část, kterou není polypeptid, a alespoň jednu (například 1 až 5) zavedených vazebných skupin pro druhou část, kterou není polypeptid nebo naopak.
Velká pozornost se věnuje konjugátu, kde první část, kterou není polypeptid, je polymerní molekula, tak jako PEG, která vykazuje jako vazebnou skupinu lysin, a druhá část, kterou není polypeptid je N-vázaná cukerná část.
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 může vykazovat aktivitu IFNB a obsahovat alespoň jednu polymerní molekulu, s výhodou PEG, a alespoň jednu sacharidovou část kovalentně vázanou na polypeptid IFNB. Aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence lidského IFNB divokého typu
a) alespoň jedním zavedeným a/nebo alespoň jedním odstraněným aminokyselinovým zbytkem obsahujícím vazebnou skupinu pro polymerní molekulu a
b) alespoň jedním zavedeným a/nebo alespoň jedním odstraněným glykosylačním místem in vivo, zvláště místem N-glykosylace.
Ve specifickém provedení vynálezu polypeptid IFNB obsahuje jednu z následujících sad mutací:
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
K19R+K45R-5 Q49N+Q51T+F111N+R113T;
K19R+K45R-PQ49N+Q51T+ K123R.
·· ···* . :
Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid, je cukerná část.
Když konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 obsahuje alespoň jednu cukernou část zachycenou na glykosylačním místě in vivo, zvláště na N-glykosylačním místě, pak jde buď o přirozené N-glykosylační místo lidského IFNB divokého typu v poloze N80, to je definované aminokyselinovými zbytky N80, N81, T82 a 183, nebo nové glykosylační místo in vivo zavedené do polypeptidu IFNB. Glykosylační místo in vivo může být O-glykosylační místo, ale je to s výhodou N-glykosylační místo.
Předmětná věc vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 popisuje konjugát vykazující aktivitu IFNB a obsahující polypeptid IFNB, jehož aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence lidského IFNB divokého typu alespoň jedním zavedeným glykosylačním místem. Konjugát dále obsahuje alespoň jednu cukernou část, která není upravena PEG, zachycenou na zavedeném glykosylačním místě.
V dalším provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 se popisuje konjugát vykazující aktivitu IFNB a obsahující polypeptid IFNB, jehož aminokyselinová sekvence se liší od aminokyselinové sekvence lidského IFNB divokého typu tím, že se zavedlo a odstranilo glykosylační místo.
Glykosylační místo in vivo se zavedlo do polohy mateřské molekuly IFNB obsazené aminokysleinovým zbytkem exponovaným na povrchu molekuly, přičemž více jak 25 % postranního řetězce je vystaveno působení rozpouštědla, vystaveno působení rozpouštědla v sekci Metody). N-glykosylační zvláště více než 50 % je (tyto polohy jsou označeny místo se zavedlo takovým ·· ···· způsobem, že N-zbytek uvedeného místa se nachází v uvedené poloze. Analogicky, O-glykosylační místo se zavedlo tak, že zbytek S nebo R tvořící takové místo je lokalizováno v uvedené poloze. Dále za účelem potvrdit účinnost glykosylace, je výhodné, když in vivo glykosylační místo, zvláště pak N-zbytek N-glykosylačního místa nebo zbytek S nebo R O-glykosylačního místa se nachází mezi prvními 141 aminokyselinovým zbytkem polypeptidu IFNB, výhodněji mezi prvními 116 aminokyselinovými zbytky. Ještě výhodnější je, když glykosylační místo in vivo se zavedlo do polohy, kde je nutná pouze jedna mutace, aby došlo k vytvoření místa (to znamená, aby v molekule už byly přítomné libovolné další aminokysleinové zbytky nutné pro vytvoření funkčního glykosylačního místa).
Substituce, které vedou k zavedení dalšího místa Nglykosylace v polohách exponovaných na povrchu molekuly IFNB a obsazených aminokyselinovými zbytky, které mají více než 25% postranního řetězce exponovaného napovrchu zahnrují:
S2N+N4S/T, L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, R1 IN, R11N+S13T, S12N+N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, Q18N+L20S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T. R27N+E29S/T, L28S+Y30S/T, Y30N+L32S/T, L32N+D34S/T, K33N+R35S/T. R35N+N37S/T, M36N+F38S/T, D39S/T, D39N4-P41S/T, E42N+I44S/T, Q43N+K45S/T, K45N+L47S/T, Q4ÓN+Q48S/T, L47N+Q49T/S, Q48N+F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, Q64N+I66S/T, A68N+F70S/T, R71N+D73S/T, Q72N, Q72N-S74T, D73N, D73N+S75T, S75N+T77S, S75N, S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, ES5N+L87S/T, L88S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T, L9SS/T, H97N+K99S/T, K99N+V101S/T, T100N+L102S/T, E103N+K105S/T, E104N+L106S/T, K10SN+E107S/T, E107N+E109S/T, K108NED110S/T, E109N+F111S/T, DU0N+T112S, Dl ION, F111N+R113S/T, R113N-tK115S/T, G114N+L116S/T, K115N+M117S/T, L116N, L116N+S118T, S119N+H212S/T, L120N-ŤL122S/T, H121N+K123S/T, K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T, R128N+L130S/T, L130N+Y132S/T, H131N+L133S/T, ♦ ♦o ♦ · ♦·«·
K134N+K136S/T, A135N+E137S/T, K136N+Y138S/T, E137N, Y138N+H140S/T, H140N+A142S/T, V148N+I150S/T, R152N+F154S/T, Y155N+I157S/T, L160S/T, R159N+T161S, R159N, G162N+L164S/T, a Y163N+R165S/T. '
Substituce, které vedou k zavedení dalšího Nglykosylačního místa v polohách exponovaných na povrchu molekuly IFNB, které mají více než 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu zahrnují:
L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, S12N-N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T, R27N+E29S/T, Y30N+L32S/T, K33N+R35S/T, R35N+N37S/T, M36N+F38S/T, D39S/T, D39N+P41S/T, E42N+I44S/T, Q46N+Q48S/T, Q48N-F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, R71N+D73S/T, D73N, D73N+S75T, S75N+T77S, S75N, S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, E85N+L87S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T, T100N+L102S/T, E103N+K105S/T, E104N+L106S/T, E107N+E109S/T, K108N+D110S/T, D110N+T112S, DllON, F111N+R113S/T, R113N4-K115S/T, L116N, L116NFS118T, K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T, H131N+L133S/T, K134N+K136S/T, A135N+E137S/T, E137N, V148N+I150S/T, a Y155N+I157S/T.
Mezi substituce uvedené na seznamech shora v textu, jsou výhodné ty, které mají N-zbytek zavedený mezi 141 Nterminálních aminokysleinových zbytků, zvláště mezi 116 Nterminálních aminokyselinových zbytků.
Substituce, které vedou k zavedení místa N-glykosylace susbtítucí pouze jedné aminokyseliny zahrnují L6S/T, RUN, D39S/T, Q72N, D73N, S75N, L88S/T, Y92S/T, L98S/T, DllON,
L116N, E137N, R159N a L160/T. Je výhodná ta substituce, která se vybrala ze skupiny obsahující L6S/T, RUN, D39S/T, Q72N,
D73N, S75N, L88S/T, Y92S/T, L98S/T, DUO a L116N, výhodněji ze skupiny obsahující L6S/T, D39S/T, D73N, S75N, L88S/T, D110N,
L116a a E137a a nejvýhodněji se vybrala ze skupiny obsahující
L6S/T, D39S/T, D73N, S75N, L88S/T, D110N a L116N.
V současné době nejvýhodnější polypeptid IFNB podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 zahrnuje alespoň jednu z následujících substitucí:
S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R11N, S12N+N14T/S, F15NFC17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N-L47T/S, Q46N+Q4ST/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F111N+R113T/S, L116N, výhodněji alespoň jedna z následujících substitucí:
S2N+N4T, L9N+R11T, 49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T, zvláště 49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T. Polypeptid IFNB například obsahuje jednu z následujících sad substitucí:
Q49N+Q51T+F111N+R113T;
Q49N+Q51T+R71N+D73T+ FI 11N+ Rl 13T;
S2N+N4T+ F111N+R113T;
S2N+N4T+Q49N+Q51T;
S2N+N4T+Q49N+Q51THF111N+R113T;
^2N3^4I±L9N±RimQ49N+Q51T ;____
S2N+N4T4-L9N+R11T+F111N+R113T;
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
L9N+R11T+Q49N+Q51T;
L9N+R11T+Q49N-PQ51T+F111N+R113T ;
L9N+R11T+F111N+R113T ·* 9«·9 *9 9 * 9*9 • ·
Rozumí se, že za účelem zavedené funkčního glykosylačního místa in vivo aminokyselinový zbytek mezi N-zbytkem a zbytkem S/T se liší prolinem. V normálním případě prostřední aminokyselinový zbytek bude ten, který obsazuje relevantní polohu v aminokyselinové sekvenci uvedené v SEQ ID NO: 2. Například v polypeptidu obsahujícím substituce Q49N+Q51S je prostřední polohou poloha 50.
IFNB polypeptidová část konjugátu podle vynálezu popsaná v dokumentu PCT/DK00/00471 může obsahovat jediné in vivo glykosylační místo. Za účelem získání účinného stínění epitopů přítomných na povrchu mateřského polypeptidu je často nutné, aby polypeptid obsahoval více než jedno in vivo glykosylační místo, zvláště 2 až 7 glykosylačních míst, tak jako 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 in vivo glykosylačních míst. Polypeptid IFNB může obsahovat jedno další glykosylační místo nebo může obsahovat dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm nebo více zavedených in vivo glykosylačních míst, s výhodou zavedených jednou nebo více substitucemi popsanými v libovolném seznamu shora v textu.
Jak se uvádí shora v textu vedle jednoho nebo více zavedených glykosylačních míst, mohou být z polypeptidu IFNB odstraněna existují glykosylační místa. Libovolná susbtituce ze ze shora uvedených substitucí vhodná pro zavedení glykosylačního místa se může kombinovat se substitucí, aby se odstranilo přirozené N-glykosylační místo lidského IFNB divokého typu. Polypeptid IFNB může například obsahovat substituci N80, například jednu ze substituci N80K/C/D/E, kdy první část, kterou není polypeptid, je ta, která má jako vazebnou skupinu jednu z K, C, D, E. Polypeptid IFNB může obsahovat alespoň jednu z následujících substitucí:
S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R1 IN, S12N+N14T/S, F15N+C17S/T, ♦+«· ♦ ♦♦«
Q16N+Q1ST/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S,
L28N+Y30T/S, D39T/S, K.45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S,
Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S,
N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S,
K1O8N+D11OT/S,D11ON,F111N+R113T/S, L116N v kombinaci s N80K/C/D/E. Polypeptid IFNB může obsahovat substituci: Q49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T, zvláště Q49N+Q51T+F111N+R113T nebo Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T v kombinaci s N80K/C/D/E.
Libovolné glykosylační varianty popsané v sekci vykazují zavedené a/nebo odstraněné alespoň jedno glykosylační místo, tak jako varianta obsahující substituce Q48N+F50T/S, Q48N+F50T/S+F111N+R113T/S, Q49N+Q51T/S, F111N+R113T/S nebo
Q49N+Q51T/S+F111N+R113T/S, může dále být konjugována s polymerní molekulou, jako je PEG, nebo s libovolnou jinou částí, kterou není polypeptid. Pro tyto účely konjugace je možné dosáhnout použitím vazebných skupin, které jsou už přítomny v polypeptidu IFNB nebo vazebné skupiny se mohou zavést a/nebo odstranit zvláště tak, že pro konjugaci je dostupný celkový počet je 1 až 6, zvláště 3 až 4 nebo 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 vazebných skupin. Pří konjugaci podle vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471, kde polypeptid IFNB obsahuje dvě glykosylační místa, počet a molekulová hmotnost částí, kterou není polypeptid, se vybral tak, že celková molekulová hmotnost přidaná částí, kterou není polypeptid, je v rozmezí 20 000 až 40 000, zvláště přibližně 20 000 nebo 30 000.
Glykosylovaná varianta může být konjugována s částí, kterou není polypeptid prostřednictvím lysinové vazebné skupiny a jeden nebo více lysinových zbytků mateřské molekuly se může odstranit, například libovolnou substitucí uvedenou v sekci „Konjugát podle vynálezu, kde část, kterou není • 9 ·*♦·
9 9
9 9
9 9 9
9 9 9
99 • * 9 9 9 9 9 · · 9 9 9 9 » 9 9 9 9 99·
9 9 9 9
999 9 99 99 polypeptid je molekula, která má lysin jako vazebnou skupinu, zvláště substituce K19R+K45R+K123R. V jiném případě nebo navíc lysinový zbytek se může zavést například libovolnou ze substitucí uvedenou v uvedené sekci, zvláště substitucí R71K. Jeden specifický konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 je ten, který obsahuje glykosylovaný polypeptid IFNB obsahující mutace Q49N+Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R nebo Q49N+Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R+R71K se dále konjuguje s PEG. Glykosylovaná polypeptidová část uvedeného konjugátu se s výhodou připravuje v buňkách CHO a následně po izolaci se upraví PEG za použití například SS-PEG, NPC-PEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC od firmy Shearwater Polymers, lne., SC-PEG od firmy Enzon, lne., tresylovaný mPEG, jak se popisuje v dokumentu USA č.5 880 255 nebo oxykarbonyloxy-N-dikarboxyimid-PEG (popisuje se v dokumentu č. USA 5 122 614) .
Vedle úpravy pomocí PEG prostřednictvím lysinové skupiny, glykosylovaný konjugát v provedení vynálezu popsaném v dokumentu PCT/DK00/00471 se může provést úprava pomocí PEG prostřednictvím cysteinové skupiny popsané v sekci „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid, je molekula, která má jako vazebnou skupinu cystein (pro tyto účely může polypeptid IFNB například obsahovat alespoň jednu z mutací N80C, R71C a C17S), prostřednictvím kyselinové skupiny, jak se popisuje v sekci „Konjugace podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471, kde část, kterou není polypeptid se váže na kyselinovou skupinu, nebo prostřednictvím libovolné jiné vhodné skupiny.
Jiné konjugáty podle vynálezu popsané v dokumentu
PCT/DK00/00471
His-14, • ·♦· • » · » · • · · » · » · · ·*♦ · · • · · ♦ ** I ···· ♦
• « • «
Mimo zavedení a/nebo odstranění aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro zvolenou část, kterou není polypeptid, (jak se popisuje v libovolné sekci nazvané „Konjugát podle vynálezu popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471
.....) IFNB polypeptidová část konjugátu může obsahovat další substituce. Výhodným příkladem je substituce libovolného ze zbytků, Ml, C17, N80 nebo V101, například jedna nebo více z následujících substitucí: C17S, N80K/C/D/E, V101Y/W/F/H, delece Ml nebo MIK. Substituce MIK je zvláště zajímavá, když polypeptid IFNB se exprimuje se značkou, jako je například možné značku odstranit pomocí DAP kde (díaminopeptidáza) po izolaci a/nebo konjugaci.
Část konjugátu podle vynálezu, kterou není polypeptid, a vynález popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471
Jak je uvedeno shora v textu, část konjugátu, kterou není polypeptid, podle vynálezu a podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 se přednostně vybralo ze skupiny obsahující polymerní skupinu, lipofilní sloučeninu, cukernou část (způsobem in vivo glykosylace) a organické derivatizační činidlo. Všechny tyto činidla mohou potvrdit požadované vlastnosti polypeptidové části konjugátu, zvláště redukovanou imunogennost a/nebo prodloužený funkční poločas ín vivo a/nebo prodloužený poločas přeměn v séru. Polypeptidová část konjugátu se může konjugovat pouze s jedním typem části, kterou není polypeptid, ale může se také konjugovat se dvěma nebo více různých typů částí, kterou není polypeptid, například s polymerní. molekulou a cukernou částí, s lipofilní skupinou a cukernou částí, s organickým derivatizačním činidlem a cukernou částí, s lipofilní skupinou a polymerní molekulou, atd.. Konjugace se dvěmi nebo více různými částmi, kterými nejsou polypeptidy, se může provést současně nebo postupně. Volba části, kterou není polypeptid, závisí r-4-4 4 • 4 • · 4 44 4
444
4 například na účinku, kterého je nutné konjugací dosáhnout. Zjistilo se například^ že cukerné části je možné zvláště použít při snížení ímunogennosti, zatímco polymerní molekuly, jako je PEG, je možné zvláště použít při prodloužení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu přeměny v séru. Použitím polymerní molekuly jako první části, kterou není polypeptid, a cukerné části jako druhé části, kterou není polypeptid, může vést k omezené Ímunogennosti a k prodloužení funkčního poločasu in vivo a poločasu přeměny v séru.
Způsoby přípravy konjugátu podle vynálezu a podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471
V následujících sekcích „Konjugace s lipofilní sloučeninou, „Konjugace s polymerní molekulou, Konjugace s cukernou částí a „Konjugace s organickým derivatizačním činidlem se popisuje konjugace se specifickými typy částí, kterými nejsou polypeptidy. Obsah těchto sekcí je relevantní s vynálezem stejně jako s vynálezem popsaným v dokumentu PCT/DK00/00471 (jak se zde popisuje).
Konjugace s lipofilní sloučeninou
V případě konjugace s lipofilní sloučeninou následující polypeptidové skupiny mohou fungovat jako vazebné skupiny: Nterminální nebo C-terminální polypeptid, hydroxyskupiny aminokyselinových zbytků Ser, Thr nebo Tyr, ε-aminoskupina Lys, skupiny SH aminokyselinového zbytku Cys nebo karboxylová skupina Asp a Glu. Polypeptid a lipofilní sloučenina se mohou vzájemně konjugovat buď přímo nebo použitím linkeru. Lipofilní sloučenina může být přirozená sloučenina, jako je saturovaná nebo nesaturovaná mastná kyselina, diketon mastných kyselin, terpen, prostaglandin, vitamín, karotenoid nebo steroid nebo syntetická sloučenina, jako je kyselina uhličitá, alkohol, φ
φφ ··♦· • φ ·· • · · φ • · · · » · φ φφφ φ φ · • Φ φφ amin a kyselina sulfonová s jedním nebo více alkylů, arylů, alkenylů nebo jiných nesaturovaných sloučenin. Konjugace mezi polypeptidem a lipofilní sloučeninou (možné pomocí linkeru) se může provést metodami popsanými například v dokumentu Bodanzsky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 a v patentovém dokumentu WO 96/12505.
Konjugace s polymerní molekulou
Polymerní molekula, aby se spojila s polypeptidem může být libovolná vhodná polymerní molekula, jako je přirozený nebo syntetický homopolymer nebo heteropolymer, v typickém případě s molekulovou hmotností v rozmezí 300 až 100 000, jako 300 až 20 000, výhodněji v rozmezí 500 až 10 000, dokonce výhodněji v rozmezí 500 až 5 000.
Příklady homopolymerů zahrnují polyol (to je poly-OH), polymamin (to je poly-NH2) a polykarboxylovou kyselinu (to je poly-COOH). Heteropolymer je polymer, který obsahuje jednu nebo více různých spojovacích skupin, jako je například hydroxylová skupina a aminoskupina.
Příklady vhodných polymernich molekul zahrnují polymerní molekuly vybrané ze skupiny obsahující polyalkylenoxid (PAO), zahrnující polyalkylenglykol (PAG), jako je polyetylenglykol (PEG) a polyperopylenglykol (PPG), větvené PEG, polyvinylalkohol (PVA), polykarboxylát, polyvinylpyrolidon), anhydrid kyseliny polyetylenkomaleinové, anhydrid kyseliny polystyrenkomaleinové,. dextran zahrnující karboxymetyldextran nebo libovolný jiný biopolymer vhodný pro snížení imunogennosti a/nebo prodloužení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu přeměn v séru. Jiným příkladem polymerní molekuly je lidský albumin nebo jiný abundantní plazmatický protein. V obecném případě polymery získané ·»·· ·* · ·· ·
4« 4*
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4
4 444 444 4 • · · · · 4 β ♦ · 44 44 44 z polyalkylenglykolu jsou biokompatibilní, neantigenní, neimunogenní a vykazují různé netoxické, vlastnosti rozpustnosti ve vodě a živé organizmy je jednoduše vylučují.
PEH je výhodná polymerní molekula, protože vykazuje pouze několik reaktivních skupin schopných řetězení ve srovnání s polysacharidy, jako je dextran a podobně. Zvláště zajímavým je monofunkční PEG, například monometoxypolyetylenglykol (mPEG), protože princip jeho spojování je relativně jednoduchý (v případě konjugace s vazebnými skupinami na polypeptidů je dostupná pouze jedna reaktivní skupina) . Nebezpečí řetězení se eliminuje, přičemž výsledné polypeptidové konjugáty jsou více homogenní a reakce polymerních molekul s polypeptidem se řídí jednodušeji. Když molekula interferonu je upravena PEG, obvykle obsahuje 1 až 5 molekul polyetylenglykolu (PEG). V dalším provedení vynálezu molekula interferonu obsahuje 1 až 5 molekul PEG, jako je 1, 2 nebo 3 molekuly PEG. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 5 0000 až 100 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG má molekulovou hmotnost přibližně 10 000 až 40 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 12 000. V dalším provedení vynálezu každá molekula PEG vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 20 000. Molekula interferonu s výhodou obsahuje přibližně 1 až molekul PEG, přičemž každá vykazuje molekulovou hmotnost přibližně 12 000, nebo jednu molekulu PEG, která má molekulovou hmotnost přibližně 20 000. Vhodné molekuly PEG jsou dostupné u firmy Shearwater Polymers, lne. a Enzon, lne. a mohou se vybrat ze skupiny zahrnující SS-PEG, NPC-PEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, tresylovaný mPEG (popisuje se v dokumentu USA 5 880 255) nebo oxykarbonyl-oxy-N-dikarboxyimid-PEG (popisuje se v dokumentu USA 5 122 614).
* *·· *# ··· ·
Aby se ovlivnilo kovalentní zachycení polymerní molekuly na polypeptid, hydroxylový konec skupiny polymerní molekuly je ** «· * · * · * · · • · · · » · · • * * *«« · v · « • · · · · 4 · ·* ♦· 44 44 je s reaktivními zahrnují primární připraven ve své aktivované formě, to funkčními skupinami (jejichž příklady aminoskupiny, hydrazid (HZ), thiol, sukcinát (SUC), sukcínimidylsukcinát (SS) , sukcinimídylsukcinamid (SSA) , sukcinímidylproprionát (SPA), sukcinimidylkarboxymetylát (SCM), benzotríazolkarbonát (BTC), N-hydroxysukcínimid (NHS), aldehyd, nitrofenylkarbonát (NPC) a tresylát (TŘES). Vhodně aktivované polymerní molekuly jsou běžně dostupné, například u firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, AL, USA nebo PolyMasc, UK. V jiném případě polymerní molekuly se mohou aktivovat běžnými metodami známými v oboru, jak se například příklady
90/13540. Specifické aktivovaných nebo větvených polymerních molekul vhodných pro použití podle vynálezu se popisují v dokumentu Shearwater 2000 Catalogs (Functionalized popisuje v dokumentu
WO
Polmars, lne Biocompatíble
1997
Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives) . Specifické příklady aktivovaných polymerů PEG zahrnují následující lineární PEG: NHS-PEG (například SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSAPEG, SC-PEG, SG-PEG a SCM-PEG) a NOR-PEG) , BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG a MAL-PEG a větvené PEG, jako je PEG2-NHS a ty, které se popisují v dokumentu USA č. 5 932 462 a USA č. 5 643 575.
V následujících publikacích se popisují použitelné polymerní molekuly a/nebo úpravy pomocí PEG:
US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 Ά EP 154 316.
4999
9«
9 V « « 9 rp · · · · * **· * · · ·
Ό O ♦ 9 9 9 « « 9 9 · ··* · ·# 9* «9 «·
Konjugace polypeptidu a aktivovaných polymerních molekul se provedla použitím libovolné běžné metody, jak se popisuje v následujících publikacích (které také popisují vhodné metody pro aktivaci polymerních molekul): Harris and Zalipsky, eds. , Póly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington, R. F. Tazlor, (1991), „Protein immobilisation. Fundamental and applications, Marcel Dekker, N.Y., S.S. Wong (1992), „Chemistry o Protein Conjugation and Crosslinkíng, CRC Press, Boča Raton, G. T. Hermansonet al., (1993), „Immobilized Afinity Ligand Techniques, Academie Press, N.Y.). Je zřejmé, že používaná aktivační metoda a/nebo chemie konjugace závisí na vazebné skupině(ách) polypeptidu IFNB, stejně jako funkčních skupinách polymeru (například aminoskupina, hydroxyl, karboxyl, aldehyd nebo sulfydryl). Úprava molekulou PEG může být řízena směrem ke konjugaci se všemi dostupnými vazebnými skupinami na polypeptidu (to jsou takové vazebné skupiny, které jsou exponované na povrchu polypeptidu) nebo mohou být řízeny vůči specifickým vazebným skupinám, například N-terminální aminoskupina (popisuje se v dokumentu USA č. 5 985 265) . Konjugace může být dosaženo v jednom kroku nebo postupným způsobem (například jak se popisuje v dokumentu WO 99/55377).
Rozumí se, že úprava molekulou PEG se navrhla tak, aby se produkovala optimální molekula s ohledem na počet vázaných molekul PEG, velikost a formu (například zda jsou lineární nebo větvené) takových molekul a kde v polypeptidu takových molekul jsou zachyceny. Molekulová hmotnost použitého polymeru se může vybrat na základě požadovaného účinku, kterého je nutno dosáhnout. Jestliže primárním účelem konjugace je dosažení konjugátu s vysokou molekulovou hmotností (například za účelem snížení renální clearance), je obvykle nutné konjugovat několik polymerních molekul s vysokou molekulovou hmotností, aby bylo možné dosáhnout požadované molekulové ·♦ ···· ·· · * · · · · · ·« · · * · ·· «· ·· hmotností. Jestliže je nutný vysoký stupeň stínění epitopů, je možné toho dosáhnout použitím dostatečně vysokého počtu polymerů s nízkou molekulovou hmotností (například s molekulovou hmotností přibližně 5 000), aby se dosáhlo účinného stínění všech nebo části epitopů polypeptidu. Může se použít například 2 až 8, tak jako 3 až 6 uvedených polymerů.
Ve spojení s konjugací s pouze jednou vazebnou skupinou na proteinu (jak se popisuje v patentovém dokumentu USA 5 985 265), může být výhodné, že polymerní molekula, která může být linerání nebo větvená, vykazuje vysokou molekulovou hmotnost, například přibližně 20 000.
V normálním případě konjugace polymeru se provedla za podmínek, při kterých reagují všechny dostupné polymerní vazebné skupiny s polymerními molekulami. V typickém případě molární poměr aktivovaných polymerních molekul ku polypeptidu je 1 000 až 1, zvláště pak 200 až 1, s výhodou 100 až 1, tak jako 10 až 1 nebo 5 až 1 za účelem získání optimální reakce. Mohou se také použít ekvimolární poměry.
Na základě vynálezu a vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471 se také předpokládá spojení polymerních molekul s polypeptidem prostřednictvím linkeru. Vhodné linkery jsou dobře známy v oboru. Výhodným příkladem je kyanurchlorid (popisuje se v publikaci Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581, Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378 v dokumentu USA 4 179 337).
Po konjugaci se zbylé molekuly aktivovaného polymeru blokují způsoby známými v oboru, například přidáním primárního aminu do reakční směsi a výsledné deaktivované polymerní molekuly se odstranily vhodnou metodou.
···« ♦♦ ·«··
Kovalentní spojení in vitro sacharidové části s aminokyselinovými zbytky IFNB se mohou použít k úpravě nebo ke zvýšení počtu nebo profilu sacharidových substituentů. V závislosti na použitém modu spojení, se sacharidy zachytí na
a) argininu a histidinu (Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRP Press lne., Boča Raton, FI)
b) volných karboxylových skupinách (například Cterminálního aminokyselinového zbytku, asparaginu, glutaminu)
c) volných sulfohydrylových skupinách, jako jsou uvedené skupiny cysteinu
d) volných hydroxylových skupinách, jako jsou uvedené skupiny šeřinu, threoninu, tyrosínu nebo hydroxyprolinu
e) aromatických zbytcích, jako jsou zbytky fenylalaninu nebo tryptofanu nebo
f) amidových skupinách glutaminu.
Tyto aminokyselinové zbytky obsahují příklady vazebných skupin pro sacharidové části, které mohou být zavedeny a/nebo odstraněny v polypeptidu IFNB. Vhodné metody in vitro spojování jsou popsány v dokumentu WO 87/05330 a v publikaci Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981. In vitro spojení sacharidových částí nebo PEG se zbytky Gin vázanými na proteinu a peptidu se může také provést transglutaminázou (Tgázou), jak se popisuje v publikaci Sáto et al., 1996, Biochemistry 35, 13072-13080 nebo v dokumentu EP 725145.
Spojení s cukernou částí
Za účelem dosažení in vivo glykosylace polypeptidu IFNB, je možné například polypeptid upravit zavedením jednoho nebo více glykosylačních míst (uvádí se v sekci „Konjugáty podle vynálezu popsaného v dokumentu PCT/DK00/00471, kde částí, ···· ·· ·· ·· «··· • ···· ·· « • ······· • · · · ··· · · · · • · · ····« • ·· ·· ·· ·· kterou není polypeptid, je cukerná část) nebo úpravou aminokyselinového zbytku lokalizovaného blízko glykosylačního místa (jak se popisuje v sekci „Varianty se zvýšenou glykosylací). Nukleotidová sekvence kódující polypeptidovou část konjugátu eukaryotického se musí začlenit do glykosylujíciho, exprimujíciho hostitele. Exprimující hostitelská buňka se může vybrat z buněk hub (vláknité houby nebo kvasinky), hmyzích, savčích, zvířecích a transgenických rostlinných buněk nebo z transgenických zvířat. Glykosylace se může dosáhnout v lidském těle, když se použije nukleotidové sekvence kódující polypeptid popsaný v genové terapii. V jednom provedení vynálezu je hostitelskou buňkou savčí buňka, jako je buňka CHO, BHK nebo HEK, například HEK293 nebo hmyzí buňka, jako je buňka SF9 nebo kvasinková buňka, například Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris nebo libovolný jiný glykosylační hostitel, například jak se popisuje dále v textu. Cukerné části zachycené na polypeptidu
IFNB glykosylací in glykosyltranferázy, (tm) vivo se dále upravují použitím například použitím technologie glykoAdvance tm od firmy Neose, Horsham, PA, USA. Čímž je možné například zesílit sialyaci glykosylovaného polypeptidu IFNB, která následuje po expresi a in vivo glykosylací buněk CHO.
Spojení s organickým derivatizačním činidlem
Kovalentní úprava poylpeptidu IFNB se může uskutečnit reakcí vazebné skupiny(skupin) polypeptidu s organickým derivatizačním činidlem. Vhodná derivatizační činidla a metody jsou dobře známy v oboru. Například cysteinylové zbytky nejběžněji reagují s α-haloacetáty (a s odpovídajícími aminy), jako je kyselina chloroctová nebo chloracetamid za vzniku derivátů karboxymetylu nebo karboxyamidometylu. Cysteinylové zbytky jsou také derivatizovány reakcí s bromtrifluoracetonem, a-bromo-β-(4-imidozoyl)propionovou kyselinou, chloracetyl72 fosfátem, N-alkylmaleimidem, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, metyl-2-pyridyldisulfidem, p-chlormerkuribenzoátem, 2chloromerkuri-4-nitrofenolem nebo chlor-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-dazolem. Zbytky histidylu se derivatizovaly s dietylpyrokarbonátem pH 5,5 až 7,0, protože toto činidlo je relativně specifické pro postranní řetězec histidylu. Je možné také použít parabromfenacylbromid. Reakce se s výhodou uskuteční v 0,1 M kokadylátu sodném při pH 6,0. Lysinyl a zbytky N-konce reagují s anhydridem kyseliny jantarové nebo s anhydridy jiných karboxylových kyselin. Derivatizace těmito činidly mění náboj lysinylových zbytků na opačný náboj. Jinými vhodnými činidly pro derivatizaci zbytků obsahující aaminoskupinu jsou ímidoestery, jako je metylpikolinimidát, pyridoxalfosfát, pyridoxal, hydrid chlor-boritý, trinitrobenzensulfonová kyselina, O-metylizomočovina, 2,4pentandion; a transminázou katalyzovaná reakce s glyoxylátem. Arginylové zbytky se upravily reakcí s jedním nebo několika běžných činidel, mezi ně patří fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizace argininu vyžaduje, aby uvedená reakce proběhla v alkalickém prostředí vzhledem k vysokého hodnotě konstanty pKa funkční skupiny guanidinu. Dále tato činidla mohou reagovat se skupinami lysinu, stejně jako guanidinoskupinou argininu. Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl nebo C-terminální aminokyselinový zbytek) se selektivně upravily reakcí s karbodiimidy (R-N=C=N-Ry) , kde symbol R a R' jsou různé alkylové skupiny, jako je l-cyklohexyl-3-(2~morfolinyl-4etyl)karbodiimid nebo l-etyl-3-(4-azonia-4,4dimetylpentyl)karbodiimid. Dále zbytky aspartyl a glutamyl se přeměnily na zbytky asparaginyl a glutaminyl reakcí s ionty amonia.
Metody přípravy, polypeptidu IFNB podle vynálezu (nebo jak se popisuje v dokumentu PCT/DK00/00471) podle vynálezu nebo popsaný v dokumentu který se může vyskytovat v glykosylované ····
Polypeptid
PCT/DK00/00471, formě, se může připravit libovolnou vhodnou metodou známou v oboru. Takové metody zahrnují konstrukci nukleotidové sekvence kódující polypeptid a expresi sekvence ve vhodném transformovaném nebo transfekovaném hostiteli. Polypeptidy podle vynálezu se mohou připravovat, i když méně účinně, chemickou syntézou nebo kombinací chemické syntézy a technologie rekombinace DNA.
Nukleotidové sekvence podle vynálezu kódující polypeptid IFNB se může zkonstruovat izolací nebo syntézou nukleotidové sekvence kódující mateřskou IFNB, například s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2 a pak se změní nukleotidové sekvence tak, že dojde k účinnému zavedení (to je inzerce nebo substituce) nebo k deleci (to je odstranění nebo substituce) relevantního aminokyselinového zbytku.
Nukleotidové sekvence se upravuje běžným způsobem místně řízenou mutagenezí v souladu s dobře známými metodami (popisuje se například v publikaci Mark et al., „Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, PP. 5662-66 (1984) a v patentovém dokumentu USA 4 588 585) .
V jiném případě se nukleotidové sekvence připravuje chemickou syntézou, například použitím oligonukleotidového syntetizéru, přičemž oligonukleotidoá sekvence se navrhla na základě aminokyselinové sekvence požadovaného polypeptidu a s výhodou se vybere ten kodon, který preferuje hostitelská buňka, ve které se bude produkovat rekombinantní polypeptid. Může se syntetizovat několik malých nukleotidů, které kódují části požadovaného polypeptidu, mohou se uspořádat pomocí PCR, • ·· ·
ligací nebo lígační řetězcovou reakcí (LCR). Jednotlivé oligonukleotidy v typickém případě obsahují přesahy 5'nebo
3'konců za účelem komplementárního uspořádání.
Když jsou uspořádány (syntézou, místně řízenou mutagenezí nebo jinou metodou), nukleotidová sekvence kódující polypeptid IFNB se začlení do rekombinantního vektoru a je operativně spojena s řídící sekvencí, která je nezbytná pro expresi IFNB v požadované transformované hostitelské buňce.
Samozřejmě se rozumí, že ne všechny vektory a sekvence řídící expresi fungují stejně dobře při expresi nukleotidové sekvence kódující zde popsanou variantu polypeptidu. Ani všichni hostitelé se stejným expresívním systémem nebudou fungovat stejně. Odborník si však může mezi těmito vektory, sekvencemi řídícími expresi a hostiteli vybrat, aniž musí provést experimenty. Při výběru vektoru se musí zvažovat hostitel, protože vektor se v něm musí replikovat nebo musí být schopen se integrovat do jeho chromozómu. Musí také zvažovat počet kopií vektoru, schopnost řízení počtu kopií vektorů a exprese libovolného jiného proteinu kódovaného vektorem, jako jsou antibiotikové markéry. Při výběru sekvence řídící expresi se musí zvažovat různé faktory. Ty zahrnují například relativní pevnost sekvence, možnost kontroly a její kompatibilitu s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid, zvláště s ohledem na potencionální sekundární struktury. Hostitelé by se mohly vybrat na základě jejich kompatibility s vybraným vektorem, toxicitou produktu kódovaného nukleotidovou sekvencí, jejich charakteristikami sekrece, jejich schopností sbalit správně polypeptid, na základě požadavku na fermentaci a kultivaci a jednoduchosti izolace produktů kódovaných nukleotidovou sekvencí.
• ·
Rekombinantním vektorem může být samostatně se replikující vektor, to znamená vektor, který existuje jako extrachromozomální entita a jeho replikace nezávisí na replikaci chromozómu. Může to být například plazmid. V jiném případě se vektor, když se zavede do hostitelské buňky, začlení do genomu hostitelské buňky a replikuje se dohromady s chromozomem(y), do něhož je začleněn.
Vektorem je s výhodou expresívní vektor, ve kterém je nukleotídová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu operativně spojena s dalšími segmenty nutnými pro transkripci nukleotidové sekvence. Vektor se v typickém případě získal z plazmidu nebo virové DNA. Řada zde uvedených expresívních vektorů vhodných pro expresi v hostitelských buňkách je běžně dostupných nebo popsaných v literatuře. Použitelné expresívní vektory pro eukariotické hostitele zahrnují například vektory obsahující sekvence řídící expresi z SV40, bovinního papilomaviru, adenoviru a cytomegaloviru. Specifické vektory jsou například pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a pCI-neo (Stratagene, La Jola, CA, USA). Použitelné expresívní vektory pro bakteriální hostitele zahrnují známé bakteriální plazmidy, jako jsou plazmidy z buněk E.coli, které zahrnují pBR322, pET3a a pET12a (oba jsou od firmy Novagen lne., WI, USA), širší hostitelské rozmezí plazmidů, jako je RP4, fágová DNA, například řada derivátů fágu lambda, například NM989 a DNA jiných fágů, jako je M13 a jednořetězcová DNA vláknitých fágů. Použitelné expresívní vektory pro kvasinkové buňky zahrnují plazmid 2μ a jeho deriváty, vektor POTÍ (popisuje se v dokumentu USA 4 931 373), vektor pJSO37 (popisuje se v publikaci Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996) a pPICZ A, B nebo C (Invitrogen). Použitelné vektory hmyzích buněk zahrnují pVL941, pBG311 (popisuje se v publikaci Cate et al., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting
Substance and Expression of the Human Gene In Animal Cells,
Cell, 45, pp. 685-98 (1986)) pBluebac 4.5 a pMelbac (oba je možné získat od firmy Invitrogen).
Jiné vektory vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují ty, které umožňují nukleotidové sekvenci kódující variantu polypeptidu amplifikovat v určitém počtu kopií. Takové amplifikovatelné vektory jsou dobře známy v oboru. Zahrnují například vektory schopné být amplifikovány amplifikaci DHFR (popisuje se například v dokumentu USA č. 4 470 461 (Kaufmanú, Kaufman and Sharp, „Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: Analysis of signals utilized for effícíent expression, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) a amplifikaci za použití glutaminové syntetázy („GS) (popisuje se například v dokumentu USA č. 5 122 464 a EP 338 841) .
Rekombinantní vektor může dále obsahovat sekvenci DNA umožňující replikaci vektoru v hostitelské buňce. Příkladem takové sekvence (když hostitelskou buňkou je savčí buňka) je počátek replikace SV40. V případě, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka, vhodné buňky umožňující replikaci vektoru jsou replikační geny REP 1-3 kvasinkového plazmidu 2μ a počátek replikace.
Vektor může také obsahovat selekční markér, například gen produktu, který doplňuje defekt v hostitelské buňce, jako je gen kódující dihydrofolátovou reduktázu (DHFR) nebo gen TPI Schizosaccharomyces pombe (popsaný v publikaci P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 123-130) nebo ten, co udílí rezistenci na lék, jako je ampicilin, kanamycin, tetracyklin, chloramfenikol, neomycin, hygromycin nebo methotrexát. V případě vláknitých hub, selektivní markéry zahrnují amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.
9 99 9 ····
999 9 a9 . * * ♦ · 9
Termín „řídící sekvence zahrnuje všechny komponenty, které jsou nezbytné nebo výhodné pro expresi polypeptidu IFNB. Každá řídící sekvence může být přirozená nebo cizorodá vůči sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid. Taková řídící sekvence zahrnuje, ale není omezena na vedoucí sekvenci, polyadenylační sekvenci, propeptídovou sekvenci, promotor, zesilovač nebo aktivační sekvenci proti směru exprese genu, signální peptidová sekvence a transkripční terminátor. Řídící sekvence zahrnuje minimálně promotor.
Podle vynálezu je možné použít široké rozmezí sekvencí, které řídí expresí. Takové použitelné řídící sekvence zahrnují expresívní sekvence řídící expresi spojené se strukturálními geny předchozích expresívních vektorů stejně jako sekvence, o kterých je známo, že řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů a jejích různých kombinací.
Příklady vhodných řídících sekvencí při řízení transkripce v savčích buňkách zahrnují časný a pozdní promotor SV40 a adenovirus, například hlavní pozdní promotor adenovíru 2, promotor MT-1 (metalothionein), středně časný genový promotor lidského cytomegaloviru (CMV), promotor lidského elongačního faktoru la (EF-la), promotor proteinu minimálního teplotního šoku 70 organizmu Drosophíla, promotor viru Rousova sarkomu (RSV), lidský všudypřítomný promotor C (UbC), terminátor lidského růstového hormonu, oblast polyadenylačních signálů SV40 a adenoviru Elb a Kozáková konvenční sekvence (popisuje se v dokumentu Kozák, M. J. Mol. Biol. 1987 Aug 20, 196(4):947-50).
Za účelem zlepšit expresi v savčích buňkách může, se může zavést do 5'nepřekládané oblasti nukleotidové sekvence • A ··· · • AAA ·· A A A · · • A · • A A A • · ·· A A kódující polypeptid syntetický intron. Příklad syntetického intronu je syntetický intron z plazmidu pCI-Neo (dostupný od firmy Promega Corporation, WI, USA).
Příklady vhodných řídících sekvencí pro řízení transkripce v hmyzích buňkách zahrnují promotor polyhedrinu, promotor P10, promotor základního proteinu viru Autographa californica, středně časný promotor genu 1 bakuloviru, zpožděný časný promotor genu bakuloviru 39K a polyadenylační sekvence SV40.
Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách zahrnují promotory systému páření alfa kvasinek, promotor kvasinkové triózafosfátové izomerázy (TPI), promotory z kvasinkových glykolytických genů nebo genů alkoholové dehydrogenázy, promotor ADH2-4c a indukovatelného promotoru GAL.
Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití v hostitelských buňkách vláknitých hub zahrnují promotor a terminátor ADH3, promotor odvozený z genů, které kódují amylázovou triózafosfátovou izomerázu TAKA organizmu Aspergillus oryzae nebo alkalickou proteázu, alfa-amylázu organizmu A. niger, glukoamylázu organizmu A. niger nebo A. nidulans, asparágovou proteinázu nebo lipázu organizmu Rhizomucor miehei, terminátor TPI1 a terminátor ADH3.
Příklady vhodných řídících sekvencí při použiti v bakteriálních hostitelských buňkách zahrnují promotory systému lac, systému trp, sytému TAC nebo TRC a hlavní promotorové oblasti fágu lambda.
Nukleotidová sekvence podle vynálezu kódující polypeptid IFNB, jestliže se připraví místně řízenou mutagenezí, syntézou nebo jinými metodami, mohou nebo nemusí také zahrnovat ·· ··*·
ΜΗ • · · • · · • ·«· nukleotídovou sekvenci, která kóduje signální peptid. Signální peptid je přítomen, když se polypeptid bude vylučovat z buněk, ve kterých je exprimován. Takový signální peptid, jestliže je přítomen, by měl být rozeznáván buňkou vybranou pro expresi polypeptidu. Signální peptid může být homologní (například může být normálně spojen s lidským IFNB) nebo heterologní (to znamená, že pochází z jiného zdroje, než je lidský IFNB) s polypeptidem nebo může být homologní nebo heterologní s hostitelskou buňkou, to znamená, že je signálním peptidem normálně exprimovaným z hostitelské buňky nebo signálním peptidem, který se normálně z hostitelské buňky neexprimuje. Signální peptid může být prokaryotický, například odvozený z bakterií, jako je E. coli nebo eukaryotický, například získaný ze savčích nebo hmyzích nebo kvasinkových buněk.
Přítomnost nebo absence signálního peptidu bude například záviset na expresi hostitelské buňky používané při produkci polypeptidu, na proteinu, který se bude exprimovat (zda jde o vnitrobuněčný nebo extrabuněčný protein) a zda je nutné dosáhnout vylučování. V případě použití ve vláknitých houbách, signální peptid může být získán z genu, který kóduje amylázu nebo glukoamylázu organizmu Aspergillus sp., z genu, který kóduje lipázu nebo proteázu organizmu Rhizomucor miehei nebo lipázu organizmu Humicola lanuginosa. Signální peptid se s výhodou odvodil z genu, který kóduje amylázu ΤΆΚΑ organizmu A. oryzae, neutrální alfa-amylázu organizmu A. niger, amylázu stabilní v kyselém prostředí organizmu A. niger nebo glukoamylázu organizmu A. niger. V případě použití ve hmyzích buňkách se může signální peptid získat z hmyzího genu (popisuje se v dokumentu WO 90/05783), jako je prekurzor adipokínetíckého hormonu organizmu Manduca sexta (popisuje se v dokumentu USA 5 023 328), včelí melittin (Invitrogen), ekdysteroid UDPglukosyltranferázy (egt) (popisuje se v publikaci Murphy et al., Protein Expression and Purification
4, 349-357 (1993)) nebo lidská pankreatická lipáza (hpl) (popisuje se v publikaci Methods in Enzymology 284, pp. 262272, 1997) .
** 0 000 • 0· • * * 0 »00 0 • ·*· » 0
Výhodný signální peptid vhodný pro použití v savčích buňkách je ten lidského IFNB, který se uvádí v příkladech, nebo signální peptid lehkého řetězce kappa myšího Ig (popisuje se v publikaci Coloma, M(1992ú J. Imm. Methods 152: 89-104). V případě použití v kvasinkových buňkách je vhodnými signálními peptidy signální peptid faktoru alfa z organizmu S. cereviciae (popisuje se v dokumentu USA 4 870 008), signální peptid myší salivární amylázy (popisuje se v publikaci O. Hagenbuchle et al., Nátuře 289, 1981, pp. 643-646), upravený signální peptid karboxypeptidázy (popisuje se v publikaci L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), kvasinkový signální peptid BARI (popisuje se v dokumentu WO 87/02670) a signální peptid kvasinkové asparágové proteázy 3 (YAP3) (popisuje se v publikaci M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127137) .
K produkci polypeptidu IFNB je možné použít libovolného vhodného hostitele, který zahrnuje bakterii, houby (zahrnující kvasinky), rostlinné buňky, hmyzí buňky, savčí nebo jiné vhodné zvířecí buňky nebo buněčné linie stejně jako transgenická zvířata nebo rostliny. Příklady bakteriálních hostitelských buněk zahrnují grampozítivní bakterie, jako jsou kmeny Bacillus, například B. brevis nebo B. subtilis, Pseudomonas nebo Streptomyces, nebo gramnegativní bakterie, jako jsou kmeny E. coli. Zavedení vektoru do bakteriální hostitelské buňky může například být ovlivněno transformací protoplastů (popisuje se například v publikací Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), za použití kompetentních buněk (popisuje se například v publikaci Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ···»
9 • 9 nebo Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular
Biology 56: 209-220), elektroporací (popisuje senapříklad v publikaci Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742751) nebo konjugací (popisuje se například v publikaci Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) .
• 9999 *9 · • 9 • 9 9 ·
• 9« · «9
9 9
9 9 ť
9 ·· •
• 99 9
9<
Příklady vhodných hostitelských buněk vláknitých hub zahrnují kmeny Aspergillus, například A. oryzae, A. niger nebo A. nidulans, Fusarium nebo Trichoderma. Buňky hub se mohou transformovat způsobem, který zahrnuje tvorbu protoplastů, transformaci protoplastů a regeneraci buněčné stěny. Vhodné postupy transformace hostitelských buněk jsou popsány v dokumentu EP 238 023 a USA 5 679 543. Vhodné metody pro transformaci druhů Fusarium jsou popsány v publikaci Malardier et al., 1989, Gene 78 : 147-156 a v dokumentu WO 96/00787. Kvasinky se mohou transformovat za použití postupu popsaného v publikaci Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, Μ. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academie Press, lne. New York, Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163 a Hinnen et al. , 1978, Porceeding of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Příklady takových vhodných kvasinkových hostitelských buněk zahrnují kmeny Saccharomyces, například S.cerevisia, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, jako je P.pastoris nebo P.methanolica, Hansenula, jako je H.Polymorpha nebo Yarrowia. Metody transformující kvasinkové buňky s heterologní DNA a produkující z nich heterologní polypeptidy se popisuje firma Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA (v protokolu pro sadu Yeastmaker<tm) Yeast Transformation Systém K it) a v publikaci Reeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids
Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415 a Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164).
• 9
I 9
I 9
9 9
Příklady vhodných hmyzích hostitelských buněk zahrnují buněčnou linii Lepidoptera, jako je Spodoptera frugiperda (Sf9 nebo Sf21) nebo buňky Trichoplusioa ni (High Five) (popisuje se v dokumentu USA č. 5 077 214). Transformace v hmyzích buňkách a produkce heterologních polypeptidů se může uskutečnit, jak popisuje firma Invitrogen.
Příklady vhodných savčích hostitelských buněk zahrnují linie buněk vaječníků čínských křečků (CHO) (například CHO-K1, ATCC CCL-61), buněčná linie COS (například COS 1 (ATCC CRL1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)), myší buněčné linie (například NS/O), linie buněk ledvin mláďat křečků (BHK) (například ATCC CRL-1632 nebo ATCC CCL-10) a lídsckých buněk (například HEK 293 (ATCC CRL-1573)), stejně jako rostlinných buněk v tkáňové kultuře. V oboru jsou známy další vhodné buněčné linie a jsou dostupné ve veřejných sbírkách, jako je instituce „American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Také savčí buňky, jako jsou buňky CHO, se mohou upravit, aby exprimovaly sialyltransferázu, například 1,6-sialyltransferázu, jak se například popisuje v dokumentu USA č. 5 047 335 za účelem poskytnout zdokonalenou glykosylaci polypeptidu IFNB.
Způsoby zavedení exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnují transformaci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým, elektroporací, transfekcí zprostředkovanou DEAEdextranem, transfekcí zprostředkovanou lipozomem, virové vektory a transfekční metody popsané firmou Life Technologies Ltd, Paisley, Velká Británie za použití přípravku Lipofectamin 2000 a Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA za použití přípravku FuGENE 6. Tyto metody jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Ausbel et al.,
(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, USA. Kultvace savčích buněk se provedla podle zavedených metod, například popsaných v publikaci Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, (ed.) Nigel Jenkins, 1999, Human Press lne, Totowa, New Jersey, USA a Harrison M.A. and Rae I.F., Genral Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
Při produkcí podle vynálezu se buňky kultivují v nutričním kultivačním médiu vhodném pro produkci polypeptidů za použití metody známých v oboru. Buňka může být například kultivována kultivací v míchané nádobě, fermentací v malém a velkém měřítku (zahrnující kontinuální, vsádkovou fermentací, nátokové kvašení nebo fermantaci v pevné fázi) v laboratorních a průmyslových fermentorech ve vhodném kultivačním médiu a za podmínek, které umožňují expresi a/nebo izolaci polypeptidů. Kultivace probíhá ve vhodném nutričním kultivačním médiu, který obsahuje zdroje uhlíku a dusíku a anorganické sole za použití postupů známých v oboru. Vhodné kultivační médium je dostupné z běžných zdrojů nebo se mohou připravit podle publikovaného složení (například v katalogu instituce American Type Culture Collection). Jestliže se polypeptid vylučuje do nutričního kultivačního média, polypeptid se může izolovat z kultivačního média. Jesltiže se polypeptid nevylučuje, může se izolovat z buněčného lyzátu.
Výsledný polypeptid se může získat metodami známými v oboru. Polypeptid je možné například získat z nutričního kultivačního média běžnými postupy, které zahrnují, ale nejsou omezeny na centrifugaci, filtraci, extrakci, sprejové sušení, odpaření nebo srážení.
Polypeptidy se mohou čistit různými postupy známými v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na chromatografií ► 4 · · · · hydrofobní, velikosti), •44 4
4 (například s výměnou iontů, afinitní, chromatofokusující a s exkluzí podle elektroforetické postupy (například preparativní izoelektrická fokusace), diferencionální rozpustnost (například srážení síranem vápenatým) , SDS-PAGE nebo extrakcí (popisuje se například v publikaci Protein Purification, J.-C- Janson and Lars Ryden, ed., VCH Publishers, New York, 1989). Specifické metody pro čištění polypeptidů vykazující aktivitu IFNB se popisují v dokumentech USA č. 4 289 689, USA 4 359 389, USA 4 172 071, USA 4 551 271, USA 5 244 655, USA 4 485 017, USA 4 257 938 a USA 4 541 952. Specifická metoda izolace je založena na imunoafinitní izolaci (popisuje se například v publikaci Okamura et al., „Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography and N-Terminal Amino Acid Sequence, Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980)). Může se také použít hydroxyapatitová chromatografie.
Další čištění může být založeno na použití IFNAR 1 a/nebo IFNAR 2, zvláště pak IFNAR 2.
Bilogická aktivita polypeptidů IFNB se může testovat libovolnou vhodnou metodou známou v oboru. Takové testy zahrnují protilátky neutralizující antivirovou aktivitu, indukci proteinové kinázy, oligoadenylátové 2,5-A syntetázy nebo fosfodiestarázových aktivit, jak se popisuje v dokumentu EP 41313B1. Takové testy také zahrnují imunomodulační testy (popisuje se například v dokumentu USA č. 4 753 795) , testy inhibice růstu a stanovení navázání na buňky, které exprimuji interferonové receptory. Specifické testy pro stanovení biologické aktivity polypeptidů nebo konjugátů podle vynálezu se popisují v sekci Materiály a Metody.
Farmaceutický prostředek a použití konjugátu podle vynálezu
Molekula IFNB se aplikuje v dávce, která je prakticky paralelní dávce používané při terapii lidským IFNB, jako je Avonex, Rebif a Betaseron nebo ve vyšších dávkách. Skutečná dávka se aplikuje v závislosti na okolnostech. V normálním případě by měla být dávka schopná předcházet nebo zeslabit vážnost nebo rozšířenost stavu nebo indikací, které se léčí. Je zřejmé, že účinné množství molekuly IFNB závisí mimo jiné na onemocnění, na dávce, aplikačním rozvrhu, zda se molekula aplikuje samotná nebo ve spojení s jiným terapeutickým činidlem, poločas přeměny prostředků v séru a obecné podmínky pacienta.
Molekuly IFNB podle vynálezu se mohou použít tak, jak jsou, a/nebo ve formě jejich solí. Vhodné sole zahrnují, ale nejsou omezeny na sole alkalických kovů a kovů alkalických zemin, takové jako je sodík, draslík, lítium, vápník a hořčík, stejně jako například sole zinku. Tyto sole nebo komplexy mohou být přítomny v krystalické a/nebo amorfní struktuře.
Molekula podle vynálezu se s výhodou aplikuje ve formě prostředku, který dále zahrnuje „farmaceuticky přijatelný nosič, což znamená nosič nebo ekcipient, který nezpůsobuje pacientům, jimž se aplikuje, žádné nežádoucí účinky. Takové farmaceuticky přijatelné nosiče a ekcipienty jsou dobře známy v oboru.
Molekula podle vynálezu se může připravit jako farmaceutické prostředky pomocí dobře známých metod. Vhodné přípravky se popisují v dokumentu USA č. 5 183 746 a v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990), Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, eds., Taylor and • ·· ·
Francis (2000) a Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press (2000)).
Molekula podle vynálezu se může přidávat do farmaceutického prostředku v různých formách, které zahrnují kapalinu, gel, lyofílizovanou formu, pulmonární dizperzi nebo libovolnou další vhodnou formu, například jako stlačená pevná látka. Výhodná forma závisí na určité léčené indikaci a je odborníkovi zřejmá.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu se může aplikovat parenterálně (například intravenózně, intramuskulárně, intraperitoneálně nebo subkutánně), orálně, intracerebrálně, intradermálně, intranasálně, intrapulmonárně, inhalací nebo libovolným jiným přijatelným způsobem, například použitím technologie PowderJect nebo ProLeasy. Výhodný postup aplikace závisí na určité léčené indikaci.
Farmaceutický prostředek obsahující polypeptid IFNB bez volného cysteinu
Překvapivě se zjistilo, že polypeptidy IFNB, které nevykazují volný cystein, například C17 polypeptidů získaných z lidského IFNB mají podstatně redukovanou tendenci agregace ve srovnání s polypeptidy IFNB obsahujícími volný cystein. Toto pozorování má důležitý důsledek ne pouze při produkci polypeptidů IFNB (které jsou méně komplikované), ale také s ohledem na použití stabilizátorů minimalizujících agregaci polypeptidů IFNB, když tvoří farmaceutické produkty.
Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující glykosylovaný polypeptid IFNB, který obsahuje substitucí C17S (vztaženo k sekvenciSEQ ID NO: 2). Tento prostředek obsahuje omezené množství stabilizátorů ve srovnání s množstvím nutným
4 4 4 · 4 4
4 »· obsahuj e jinak má pro přípravu farmaceutického prostředku, který glykosylovaný polypeptid IFNB zahrnující C17, ale stejnou aminokyselinovou sekvenci. Množství stabilizátoru se může například redukovat alespoň z 50 % tak, jako alespoň ze 75 % nebo je možné ho redukovat vyšším procentem.
Středem zájmu je farmaceutiký prostředek obsahující polypeptid IFNB, který obsahuje substituci C17S (vztaženo vůči sekvenci SEQ ID NO: 2), přičemž prostředek je v podstatě bez stabilizátoru.
Polypeptid IFNB podle vynálezu může být libovolný glykosylovaný IFNB bez volného cysteinu a může to například být libovolná z mateřských molekul IFNB, polypeptidová část konjugátu (glykosylovaná a může být konjugovaná s druhou částí, kterou není polypeptid) nebo zde popsaná glykosylovaná varianta (jako například v sekcích „Konjugát podle vynálezupopsaný v dokumentu PCT/DK00/00471,. kde částí, kterou není polypeptid, je cukerná část nebo varianty se zvýšenou glykosylací) . V případě, že polypeptid IFNB se získal z lidského IFNB, vykazuje aminokyselinový zbytek odlišný od aminokyselinového zbytku odlišný od cysteinu v poloze 17 a obsahuje například mutaci v C17S.
Stabilizátor, který je omezen nebo není přítomen, může být libovolný z těch zmiňovaných v sekcích dále v textu. Stabilizátorem je například HAS nebo neionogenní povrchově aktivní činidlo, jako je Tween, například Tween 20 nebo 80.
Parenterální činidla
Příkladem farmaceutického prostředku je roztok navržený pro parenterální aplikaci. Ačkoliv v mnoha případech přípravky farmaceutických roztoků se připravují v kapalné formě, vhodné ·* ··· ♦ pro okamžíké použití, pak parenterální přípravky se mohou také připravit ve zmražené nebo lyofilizované formě. Zmrazený prostředek se musí před použitím rozmrazit. Lyofilizovaná forma se často používá k zesílení stability aktivní sloučeniny obsažené v prostředku za různých podmínek uchovávání. Jak je známo v oboru lyofilizované přípravky jsou v obecném případě více stabilní ve srovnání s kapalnými složkami. Takové lyofilizované přípravky se rekonstituují, dříve než se použijí, přidáním jednoho nebo více vhodných farmaceuticky přijatelných ředidel, jako je sterilní voda pro přípravu injekcí nebo sterilní fyziologický roztok.
V případě parenterálních přípravků se připravují pro uchovávání ve formě lyofilizovaných přípravků nebo ve formě vodných roztoků smícháním polypeptidů, který je má požadovaný stupěň čistoty s jedním nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, ekcipientů nebo stabilizátorů, které se v typickém případě používají v oboru (všechny se nazývají „ekcipienty), například pufrující činidla, stabilizační činidla, konzervační činidla, činidla upravující izotonicitu, neionogenní detergenty, antioxidanty a/nebo jiná různorodá přídavná činidla.
Pufrující činidla napomáhají udržování pH v rozmezí, které přibližně odpovídá fyziologickým podmínkám. V typickém případě se vyksztují v koncentracích, která jsou v rozmezí přibližně 2 mM až přibližně 50 mM. Vhodná pufrující činidla pro použití podél vynálezu zahrnují organické a anorganické kyseliny a jejich sole, jako jsou citrátové pufry (například směs citrátu sodného a citrátu disodného, směsi kyseliny citrónové a citrátu trisodného, směsi kyseliny citrónové a citrátu sodného atd..), sukcinátové pufry (například směs kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, směsi kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, směsi kyseliny jantarové a hydroxidu sodného, směsi ♦ ·♦<
kyseliny jantarové a sukcinátu disodného), tartarátových pufrů (například směs kyseliny vinné a tartarátu sodného, směsi kyseliny vinné a tratarátu draselného, směsi kyseliny vinné a hydroxidu sodného), fumarátových pufrů (například směs kyseliny mravenčí a fumarátu sodného, kyseliny mravenčí a fumarátu sodného, glukonátové pufry (například směs glukonové kyseliny a glukonátu sodného, kyselina glukonová a hydroxid sodný, směs kyseliny glukonové a glukonátu draselného atd..), oxalátový pufr (například směs kyseliny šťavelové a šťavelanu sodného, kyseliny šťavelové ahydroxidu sodného, směs kyseliny šťavelové a šťavelanu draselného atd..), laktátové pufry (například kyseliny mléčná a laktát sodný, kyselina mléčná a hydroxid sodný, směs kyseliny mléčné a laktátu draselného, atd..) a acetátových pufrů (například směs kyseliny octové a acetátu sodného a směs kyseliny octové a hydroxidu sodného atd. . ) .
Další možnosti jsou fosfátové pufry, histidinové pufry a trimetylaminové sole, jako je Tris.
Aby se zpomalil mikrobiální růst, přidala se konzervační činidla a v typickém případě se přidávají v množství přibližně 0,2 % až 0,1 % (hmotnost/objem). Konzervační činidla vhodná pro použití podle vynálezu zahrnují fenol, benzylalkohol, meta-krezol, metylparaben, propylparaben, oktadecyldimetylbenzylamoniumchlorid, halídy benzalkonia (například chlorid benzalkonia, bromid benzalkoni a jodid benzalkonia), chloridhexamethonia, alkylparabeny, jako je metylparaben nebo propylparaben, katechol, resorcinol, cyklohexanol a 3-pentanol.
Činidla upravující izotonicitu se přidávají, aby se zajistila izotonicita kapalných prostředků a zahrnují polyhydrické cukerné alkoholy, s výhodou trihydrické cukerné • · · 0
0· · 0 • · ·
0 0 • 000 alkoholy nebo vyšší cukerné alkoholy, jako je glycerin, erytritol, arabitol, xylitol, sorbitol a manitol. Polyhydrícké alkoholy se mohou vysyktovat v množství mezi 0,1 % a 25 % (hmotnost) , v typickém případě 1 % až 5 %, přičemž se bere v úvahu relativní množství jiných složek.
Stabilizátory označují širokou kategorii ekcipientů, jejichž funkce je od objemového činidla do doplňku, které rozpouští terapeutické činidlo nebo pomáhá předcházet denaturaci nebo adherenci stabilizátory mohou být
Typické alkoholy arginin, organické trehalóza, thioglykolát a thiosulfát sodný, sodný, na stěnu kontejneru, polyhydrické cukerné (vyjmenované shora v textu), aminokyseliny, jako je lysin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, amitin, L-leucin, 2-fenylalanin, glutamová kyselina, threonin atd..
cukry a cukerné alkoholy, jako je laktóza, stachyóza, manitol, sorbitol, xylitol, ribitol, myoinisitol, galaktitol, glycerol a podobně, přičemž zahrnují cyklitoly, jako je inositol, polyetylenglykol, aminokyselinvé polymery, redukční činidla obsahující síru, jako je močovina, glutathion, kyselinu thioktová, thioglycerol, alfa-monothioglycerol polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností (to je méně než 10 zbytků), proteiny, jako je lidský sérový albumin, bovinní sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny, hydrofilní polymery, jako je polyvinylpyrrolidon, monosacharidy, jako je xylóza, maóza, fruktóza a glukóza, disacahridy, jako je laktóza, maltóza a sacharóza a polysacharidy, jako je dextran. Neionogenní povrchově aktivní činidla nebo detergenty (také známé jako „zvlhčovad.la), které mohou napomáhat rozpustnosti terapeutického činidla, stejně jako chrání polypeptid proti agregaci vyvolané mícháním, umožňuje, aby dovoloval přípravku, který se bude exponovat, uvolnit povrchový stres, aniž způsobí denaturaci polypeptidu. Vhodné neionogenní povrchově aktivní . činídlazahrnují terapeutický které také ♦ ··<
188 atd.), (Tween®-20, polysorbáty (20, 80 atd..), polyoxaméry (184, Pluronic®polyoly, polyoxyetylensorbitanmonoetery Tween®-80 atd.).
Stabilizátory jsou v typickém případě přítomny v rozmezí 0,1 až 10 000 hmotnostních podílů založených na aktivním proteinu. Jeho množství může být redukováno nebo nemusí být přítomen v případě farmaceutického prostředku podle vynálezu, jak se definuje v sekci Farmaceutický prostředek obsahující polypeptid IFNB bez volného cysteinu.
Další různorodé ekcipienty zahrnují objemová činidla nebo plnidla (například škrob), chelatační činidla (například EDTA), antioxidanty (například kyselina askorbová, methionin, vitamin E) a současně použitá rozpouštědla. Aktivní složka se například interfaciální může také připravuj í být uzavřena v kapsulích, které koascervačními postupy nebo polymerizací, jako například v případě hydroxymetylcelulózy, želatiny nebo poly-metylmetacylátové mukrokapsule, v systémech zavádějící koloidní léky (například lipozomy, albuminové mikrokulíčky, nanočástice a nanokapsule) nebo v makroemulzi. Takové metody se popisují v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, 18th edítíon, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990), Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, eds., Taylor and Francis (2000).
Parenterální formulace, které se budou používat v případě in vivo aplikace, musí být sterilní. Toho je možné dosáhnout například filtrací přes sterilní filtrační membránu.
Přípravky pro nepřerušované uvolnění
4··« • ·· ♦
Vhodné příklady přípravků pro nepřerušované uvolnění zahrnují semipermeabilní matrice pevných hydrofóbních polymerů, které obsahují molekulu podle vynálezu, matrice mají vhodnou formu, jako film nebo mikrokapsule. Příklady matric pro nepřerušované uvolňování zahrnují polyestery, hydrogely (například póly(2-hydroxyetyl-metakryláty) nebo polyvinylalkohol)), polylaktidy, kopolymery L-glutamové kyseliny a etyl-L-glutamát, nedegradovatelný etylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyselina mléčnákyselina glykolová, jako je technologie ProLease® nebo Lupron Depot® (částice, které je možné zavést injekcí a jsou tvořeny kopolymery kyselina mléčná-kyselina glykolová a acetát leurpolidu) a kyselina poly-D-(-)-3-hydroxymáselná. Zatímco polymery, jako je etylenvinylacetát a kyselina mléčná-kyselina glykolová umožňují uvolnění molekul pro dlouhý časový úsek až 100 dní nebo více jak 100 dní. Jisté hydrogely uvolňují proteiny po kratší časový úsek. V případě, že polypeptidy uzařené v kapsulí zůstávají v těle po dlouhou dobu, mohou denaturovat nebo agregovat, jako výsledek expozice vlhkosti při teplotě 37 °C, což vede ke ztrátě biologické aktivity a možným změnám imunogennosti. Mohou se navrhnout racionální strategie stabilizace závislé na použitém mechanizmu. Jestliže se například zjistilo, že agregační mechanizmus je íntermolekulární vazba S-S prostřednictvím thio-disulfidové výměny, stabilizace je možné dosáhnout úpravou sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv a vývojem specifických prostředků pro polymerní matrice.
Pulmonární zavedení
Konjugátové nebo polypeptidové přípravky vhodné pro použití s rozprašovačem buď tryskovým nebo ultrazvukovým budou v typickém případě obsahovat molekulu rozpuštěnou ve vodě
99·· ♦ 9 · 99 9
9# • · ♦ 9 • 9 až 25 mg konjugátu koncentraci 0,1 až 10 • 9 ··· 9 v koncentrací například, přibližně 0,01 v jednom mililitru roztoku, s výhodou v mg/ml. Přípravek může také zahrnovat pufr a jednoduchý cukr (například pro proteinovou stabilizaci a regulaci osmotického tlaku) a/nebo lidský sérový albumin, jehož koncentrace je v rozmezí 0,1 až 10 mg/ml. Příklady používaných pufrů jsou acetát sodný, citrát a glycin. Pufr má s výhodou složení a koncentrace vhodné pro úpravu pH roztoku v rozmezí 3 až 9. V obecném případě koncentrace pufru vhodné pro tyto účely jsou od 1 mM do 50 mM. Příklady cukrů, které se mohou použít jsou laktóza, maltóza, manitol, sorbitol, trahalóza a xylóza, obvykle v množství, které je v rozsahu 1 až 10 hmotnostních procent přípravku.
Přípravek vhodný pro rozprašování může také obsahovat povrchově aktivní činidlo, aby se zabránilo nebo předešlo agregaci proteinu na povrchu vyvolané atomizací roztoku při tvorbě aerosolu. Mohou se použít různá běžná povrchově aktivní činidla, jako jsou estery a alkoholy polyoxyetylenmastných kyselin a estery polyoxyetylensorbitan mastných kyselin. Množství se v obecném případě pohybuje v rozmezí mezi 0,001 a 4 % (hmotnostní) přípravku. Zvláště výhodné povrchově aktivní činidlo pro účely vynálezu je polyoxyetylensorbitanmonooleát.
Specifické přípravky a metody tvořící vhodné disperze kapalných částic podle vynálezu se popisují v dokumentu WO 9420069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 a US 5522385.
Tři specifické příklady běžně dostupných zmlžovačů vhodných pro praktické využití vynálezu jsou zmlžovače Ultravent vyrobené firmou Mallinckrodt, lne. St. Louis, Mo. a zmlžovač Acorn II, vyrobený firmou Marquest Medical Products, ·» 1111
Englewood, Colorado a pulmonární zaváděcí systém léků AERx vyrobený firmou Aradigm Corporation, Hayward, California.
····
Přípravky podle vynálezu pro použití s dávkou odměřenou inhalačním zařízením v obecném případě obsahují jemný prášek. Tento prášek může vznikat lyofilizací a pak mletím kapalného přípravku a může také obsahovat stabilizátor, jako je lidský sérový albumin (HSA). V typickém případě se přidává více jak 0,5 % (hmotnostní) HSA. Jestliže je nezbytné, může se do přípravku přidat jeden nebo více cukrů nebo cukerné alkoholy. Příklady zahrnují laktózu, maltózu, manitol, sorbitol, sorbítózu, trehalózu, xylitol a xylózu. Množství přidané do přípravku může být v rozmezí přibližně 0,01 až 200 % (hmotnostní) , s výhodou od přibližně 1 do 50 % přítomného konjugátu. Takové formulace se pak lyofilizují a melou na částice požadované velikosti.
Částice správné velikostí se pak suspendovaly v hnací látce s podporou povrchově aktivního činidla. Hnací látkou může být libovolný běžný materiál používaný pro tyto účely, jako je freon, chlorovaný fluorouhlovodík, fluorouhlovodík nebo uhlovodík dichlordifluormetan, tetrafluormetan nebo zahrnující trichlorfluormetan, dichlortetrafluormetan a 1,1,1,2jejich kombinace. Vhodné povrchově aktivní činidla zahrnují sorbitantrioleát a sojový lecitin. Jako povrchově aktivní činidlo se může také použít olejová kyselina. Tato směs se pak nanese do zaváděcího zařízení. Příkladem běžně dostupných inhalátorů, které odměřují dávky, vhodných pro použití podle vynálezu jsou Ventolin vyráběný firmou Glaxo lne., Research triangle Park, N.C..
Takové přípravky pro práškové inhalátory budou obsahovat jemně rozemletý suchý prášek obsahující molekuly IFNB a mohou také zahrnovat objemové činidla, jako je laktóza, sorbitol, • 4 ·« ·♦··
444 • 4
4 4 • 4 4
444 • 4 44
4 • 4 • 4 • 4 • · 4 • 4 sacharóza nebo manitol v množství, které umožňuje rozptýlení prášku ze zařízení, například 50 % až 90 % (hmotnostní) formulace. Částice prášku by měly mít v plicích aerodynamické vlastnosti odpovídající částicím s hustotou přibližně 1 g/cm2, které mají střední průměr menší než 10 mikrometrů, s výhodou mezi 0,5 až 5 mikrometrů, nejvýhodněji mezi 1,5 a 3,5 mikrometrů.
Příkladem práškového inhalátoru vhodného pro použití podle vynálezu je práškový inhalátor Spinhaler vyrobený u firmy Fisons Corp., Bedford, Mass.
Prášek pro tato zařízení je možné připravit a/nebo zavést metodami popsanými v dokumentech US 5997848, US 5993783, US 5976574, US 5922354, US 5785049, US 6,123,936 US 55654007.
Farmaceutický prostředek obsahující molekulu podle vynálezu se může aplikovat mechanickými zařízeními navrženými pro pulmonární zavedení terapeutických produktů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na zmlžovače, inhalátory s odměřováním dávky a práškové inhalátory, kdy všechny z nich jsou známé v oboru.
Některé specifické příklady běžně dostupných zařízení pro praktické využití vynálezu jsou zmlžovač Ultravent vyrobený firmou Mallínckrodt, lne., St. Louis, Missouri, zmlžovač Acorn II vyrobený firmou Marquest Medical Porducts, Englewood, Colorado, inhalátor s odměřovačem dávky Ventolin vyrobený firmou Glaxo lne., research Triangle Park, Notrh Carolina, práškový inhalátor Spinhaler vyrobený firmou Fisons Corp., Bedford, Massachusetts, zařízení od firmy Inhale Therapeutic Systems, lne., San Carlos, California, inhalátor AIR vyrobený Alkermes, Cambridge, Massachusetts a systém pro zavedení léků do plic AERx vyrobený firmou Aradigm Corporation, Hayward,
Calífornia.
aaaa
A · A A A
A
A A
A
A • •A A A
A A
Farmaceutický prostředek podle vynálezu a vynález popsaný v dokumentu pCT/DK00/00471 se může aplikovat ve spojení s jinými terapeutickými činidly. Tato činidla se mohou začlenit jako část stejného farmaceutického prostředku nebo se mohou aplikovat odděleně od molekuly IFNB podle vynálezu buď souběžně nebo v souladu s libovolným jiným přijatelným léčebným plánem. Molekula nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu je možné použít jako doplněk jiné terapie.
Vynález popisuje prostředky a metody léčby většiny typů virové infekce, zhoubného bujení nebo nádorů nebo nádorové angiogeneze, Crohnovy nemoci, ulcerativní kolitídy, GuillainBarré syndromu, gliomu, idiopatické pulmonární fibrózy, abnormálního růstu buněk nebo je možné použít libovolné vhodné zvíře, přednostně savce a zvláště člověka. Molekula nebo prostředek podle vynálezu nebo vynálezu popsaného podle dokumnetu PCT/DK00/00471 se může použít k léčbě osteosarkomu , karcinomu bazálních buněk, karcinomu vaječníků, cervikální dysplazie, karcinomu děložního čípku, laryngeální papilomatózy, mykózy fungoides, gliomu, akutní myeloidní leukemie, mnohotného myelomu, Hodgkinova onemocnění, melanomu, karcinomu prsu, karcinomu plicních buněk, maligního melanomu (adjuvans, pozdní stádium stejně jako profylakce), karcínoidního nádoru, lymfomu B buněk, lymfomu T buněk, folikulárního lymfomu, Kaposiho sarkomu, chronické myelogenní leukémie, karcinomu renálních buněk, rekurentního superficíálního zhoubného bujení močového měchýře, kolorektálního karcinomu, leukémie vlasových buněk a virových infekcí, jako je papilomavirová infekce, virová hepatítida, herpes genitalis, herpes zoster, herpetická keratitida, herpes simplex, virová encefalitida, cytomegalovirová pneumonie, persistentní hepatitida, chronická chronická aktivní HCV (typ II) a • 4 ·· - * ***: : :: i · : ·.
• . Ϊ · ··· · 1 * « ♦ • · : - ··,.»* • · ·· ·« rhinovirová chronická aktivní HCV (typ I), chronická hepatitida B.
V tomto spojení se konjugát popsaný v dokumentu PCT/DK00/00471 nebo varianta podle vynálezu může použít při monoterapii nebo v kombinaci s přípravkem cytarabne v případě monoterapie lymfomu B buněk nebo v kombinaci se systémy založenými na doxorubicinu v případě terapie folikulárního lymfomu, jako doplněk systému podobnému CHOP v případě monoterapie hepatitidy C nebo v kombinaci s ribavirinem v případě monoterapie mnohotného myelomu nebo v kombinaci s VBMCP, BCNU nebo VBMCP+HiCy nebo v případě monoterapie renálního karcinomu nebo v kombinaci s přípravkem Vinblastin, floxuridinu, 5-fluoruracilu nebo IL-10.
Molekula nebo prostředek podle vynálezu se může zvláště použít při léčbě roztroušené sklerózy (MS), jako jsou obecně rozeznávané čtyři typy (benigní, recidivující ustupující MS (RRMS), primární progresivní MS (PPMS) a sekundární porgresivní MS (SPMS)) a monosymptomatická MS), zhoubného bujení nebo nádorů, hepatitidy, například hepatitidy B a C nebo herpesové infekce (pozdější léčba se může kombinovat s léčbou s IL-10).
Vynález popisuje způsob léčby savce, který vykazuje cirkulující protilátky proti IFNB la, jako je Avonex<tm> nebo Rebif® nebo lb, jako je Betaseron®. Tento způsob zahrnuje aplikaci varianty podle vynálezu, která vykazuje redukovanou nebo žádnou reakci s uvedenými protilátkami. Sloučenina se aplikovala v účinném množství. Savcem je přednostně člověk. Léčení savci mohou trpět libovolným onemocněním uvedeným na seznamu shora v textu, kdy interferon beta se používá k účinné léčbě. Vynález se zvláště používá při léčbě roztroušené
0000 ·· 0 0* 0 • ί • · ί 00 00 sklerózy (libovolného typu uvedeného na seznamu shora v textu), hepatitidy nebo zhoubného bujení. Vynález dále popisuje způsob přípravy farmaceutického produktu pro použití při léčbě savců, které vykazují cirkulující protilátky proti interferonu beta la, jako je Avonex(tm) nebo Rebif(tm) nebo IB, jako je Betaseron®, kde varianta podle vynálezu, která vykazuje redukovanou reakci nebo žádnou reakci s takovými cirkulujícími protilátkami (například reakce se redukuje alespoň 25 %, jako alespoň 50 % a s výhodou s alespoň 75 %, jako přibližně ze 100 % (to znamená, že nedochází k reakci), se připravila ve formě přípravku, který se může aplikovat injekcí nebo jiným způsobem, jak se popisuje dále v textu. Termín „cirkulující protilátky označuje protilátky, zvláště neutralizační protilátky, tvořené v savci jako odezva na léčbu libovolným běžně dostupným přípravekem IFNB (Rebif, Betaseron, Avonex).
Vynález dále popisuje způsob léčby pacienta, který potřebuje léčbu, farmaceutickým prostředkem s alespoň s některými terapeuticky výhodnými vlastnostmi IFNB (například pacient trpící libovolným zde zmíněným onemocněním, které je léčitelné IFNB). Způsob zahrnuje aplikaci prostředku obsahující variantu vynálezu, přičemž uvedená léčba vykazuje redukované nebo odstraněné nežádoucí psychologické účinky ve srovnání s léčbou se současnými běžnými produkty IFNB. Vynález dále popisuje farmaceutický protsředek použitelný při léčbě.
Také se zvažuje použití nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidu podle vynálezu při aplikacích genové terapie. Zvláště se může použít nukleotidová sekvence kódující polypeptid, jak se popisuje v sekci „Varianty se zvýšenou glykosylací nebo „Varianty se substitucemi specifických aminokyselin nebo „Varianty, které jsou fúzními proteiny. Glykosylace polypeptidů se tak dosáhne během průběhu genové terapie, to je po expresi nukleotidové sekvence v lidském těle.
• φφφ ·· «φφφ φφφ φ
φ φ
Aplikace genové terapie zahrnuje léčbu uvedených onemocnění, přičemž se očekává, že polypeptid poskytne účinnou terapii způsobenou svou antivirovou aktivitou, například virovým onemocněním zahrnující hepatitidu, jako je hepatitida C a zvláště HPV nebo jiné infekční onemocnění, které je odpovědné z IFNB nebo infekční agens citlivé vůči IFNB. Dále konjugát nebo polypeptid podle vynálezu se může použít pří léčbě chronické zánětlivé demyelinizující polyradikuloneuropatie a vážných nekrotizujících kutánních lézí. Při léčbě libovolného typu MS se zvažuje spojení léčby pomocí uvedených prostředků s uvedenou genovou terapií. Podobně tento vynález zvažuje aplikace genové terapie při imunomodulaci, stejně jako při léčbě uvedených onemocnění, pří které se očekává, že IFNB poskytuje účinnou terapii způsobenou svou antiproliferativní aktivitou. Mohou se tak léčit například nádory a zhoubné bujení nebo jiné stavy charakterizované nežádoucí buněčnou proliferaci, jako je restenóza. Další popis takové genové terapie je v dokumentu WO 95/25170.
Lokální zavedení IFNB použitím genové terapie se může provést terapeutickým činidlem do cílové oblasti, přičemž se zabrání potencionálním problémům toxicity spojenými s nespecifickou aplikací.
Zvažuje se metodologie genové terapie in vitro a in vivo.
Je známo několik metod pro přenos potencionálních terapeutických genů do definovaných buněčných populací (popisuje se například v publikací Mulligan, „The Basic «
100 • 4 4 · • » 4 4 • 4·· 4 « • 9 9
4
Science Of Gene Therapy, Science, 260, pp. 926-31 (1993).
Tyto metddy zahrnují:
Přímý přenos genu, jak se například popisuje v publikaci
Wolf et al., „Direct Gene transfer Into Mouše Muscle In vivo,
Science 247, pp. 1465-68 (1990).
Transfer DNA zprostředkovaný liposomy, jak se popisuje v pudblikaci Caplen et al., „Liposome-madiated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis Nátuře Med., 3, pp. 39-46 (1995) a Crystal, „The
Gene As A Drug, Nátuře Med., 1, pp. 15-17 (1995), Gao and Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells, Biochem. Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991).
Transfer DNA zprostředkovaný retrovirem, jak se například popisuje v publikaci Kay et al., „In vivo GeneTherapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IXDeficient Dogs, Science, 262, pp. 117-19 (1993), a Anderson, „Human Gene Therapy, Science, 256, pp. 808-13 (1992).
Transfer DNA zprostředkovaný DNA virem. Takové DNA viry zahrnují adenoviry (s výhodou vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpesové viry (s výhodou vektory založené na viru herpes simplex) a parvoviry (s výhodou vektory založené na defektních nebo neautonomních parvovirech, výhodněji vektory založené na adeno-asociovaných virech, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2 (popisuje se například v publikaci Ali et al., „The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy, GeneTherapy, 1, pp. 367-84 (1994), US 4 797 368 a US 5 139
941.
Materiál a metody »· 9999 » ·
Tato sekce je relevantní s částmi popsanými v dokumentu
PCT/DK00/00471 stejně jako s popisem tohoto vynálezu.
101
9 • ·· • * ·
Cl « • ··· • >
» «· • c • 9 • « • * · ··
Materiály
Buňky HeLA (dostupné u instituce American Collection (ATCC))
ISRE-Luc (Stratagene, La Jolla, USA) pCDNA 3.1/hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA) základní vektor pGL3 (Promega) lidská genomová DNA (ClonTech, USA) kultivační médium DMEM: Dulbeccovo upravené (DMEM), 10 % fetální bovinní sérum (dostupné
Technologies A/S, Copenhagen, Dánsko)
Type Culture
Eagle médium u firmy Life
Testy
Interferonový test
Dříve se uvádí, že IFNB reaguje s receptory interferonu typu I na buňkách HeLa a aktivuje je. Následně se transkripce aktivuje v promotorech, které obsahují responzivní element stimulovaný interferonem (ISRE). Tak je možné sledovat agonisty interferonových receptorů použitím ISRE spojených s luciferázovým reportním genem (ISRE-luc) umístěným v buňkách HeLa.
Primární test
Buňky HeLa se transfekovaly společně s ISRE-Luc a pCDNA 3.1/hygro a buněčné klony se získaly selekcí v kultivačním médiu DMEM obsahujícím Hygromycin B. U buněčných klonů se testovala luciferázová aktivita v přítomnosti nebo v nepřítomnosti IFNB. Ty klony, který vykazují nejvyšší poměr ·· ·· ·· ···· aktivitě, se ····
102
Λί Η..:,: : ·.' • * ·· · ·· · ·· ·· ·· ·· stimulované ku nestimulované luciferázové používají dále v testu.
Za účelem monitorovat muteiny se vneslo do jedné prohlubně na destičkách s 96 prohlubněmi 15 000 buněk a inkubovaly se přes noc v kultivačním médiu DMEM. Příští den se k buňkám přidaly muteiny stejně jako známé standardy v různých koncentracích. Destičky se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % 002. Pak se do každé prohlubně přidá substrát LucLite (Packard Bíoscience, Groningen, Holandsko). Destičky se zatavily a měřila se luminiscince na luminometru TopCount (Packard) v módu SPC (počítání jednotlivých fotonů). Každá jednotlivá destička obsahuje prohlubně, kde slouží IFNB jako stimulovaná kontrola a v dalších prohlubních je normální kultivační médium jako nestimulovaná kontrola. Poměr mezi stimulovanou a nestimulovanou luciferázovou aktivitou slouží jako vnitřní standard pro obě muteinové aktivity a liší se v různých experimentech.
Sekundární test
Existuje 18 nealelických genů interferonu alfa a jeden gen IFNB. Tyto proteiny vykazují překrývající se aktivity a tak je nutné zabezpečit, aby si tyto muteiny uchovaly selektivitu a speicfitu IFNB.
Gen β-Rl se aktivoval IFNB, ale ne jinými interferony. Transkripce β-Rl tak slouží jako sekundární markér aktivace IFNB a používá se k zajištění skutečnosti, že muteiny si uchovávají aktivitu IFNB. Fragment promotoru genu β-Rl o velikosti 300 bp, který řídí transkripci interferonu (popisuje se v publikaci (Rani M. R. et al., (1996) JBC 271 22878-22884) se izoloval pomocí PCR z lidské genomové DNA a začlenil se do • ·· · · ·· · ·· · • ···· ·· · základního vektoru pGL3 (Promega) . Výsledný gen βRl:luciferáza se používá v testech podobným způsobem jako v případě primárního testu popsaného shora v textu. Popisuje se, že v buňkách astrocytomu výsledný gen β-Rl:luciferáza vykazuje 250 krát vyšší citlivost k IFNB než k interferonů alfa (popisuje se v publikaci Rani M. R. et al., (1996) JBC 271 22878-22884).
Test ELISA
Koncentrace IFNB se stanoví použitím běžného sendvičového imunologického testu (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ, USA). Sada je založena na testu ELISA s monoklonálními myšími protilátkami proti IFN-beta pro záchyt a detekci IFN-beta v testovaných vzorcích. Detekční protilátky jsou konjugovány s biotinem.
Testované vzorky a rekombinantní lidský standard IFN-beta se do mikrotitračních destiček potažených zachytávacími portilátkami nanesl v objemu 0,1 ml a v koncentraci 10 až 0,25 ng/ml. Destičky se inkubovaly při teplotě místnosti po dobu 1 hodina. Vzorky a standard se ředil v ředícím pufru obsaženým v sadě.
Destičky se promyly v pufru obsaženém v sadě a inkubovaly se detekčními protilátkami spojenými s biotinem v množství 0,1 ml po dobu jedné hodiny a při teplotě místnosí
Reakce se vizualizovala přidáním 0,1 ml tetrametylbenzidinového substrátu (TMB) pro chromogen. Destičky se inkubovaly po dobu 15 minut ve tmě při teplotě místnosti a reakce se zastavila přidáním stop roztoku. Absorbance se odečítala při vlnové délce 450 nm za použití čtecího zařízení pro test ELISA.
• ·· · • · · ·· ·
104 • · · · · · · · • ······· • ·· ······ · ·
Test navázání na receptor
Schopnost polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu vázat se na receptor se může stanovit použitím testu popsaného v dokumentu WO 95/25170 nazvaném „Analýza schopnosti IFNP(Pheioi) vázat se na receptor (založený na buňkách Daudi a A549). Rozpustné oblasti IFNAR1 a IFNAR2 se mohou získat v podstatě stejným způsobem, jak se popisuje v publikaci Arduini et al., Protein Science, 1999, vol. 8, 1867-1877 nebo jak se popisuje v příkladu 9 tohoto vynálezu.
V jiném případě se schopnost vázat se na receptor stanoví použitím řetězícího činidla, jako je disukcinimidylsuberát (DSS) dostupného u firmy Pierce, Rockford, IL, USA, následujícím způsobem:
Polypeptid a konjugát se inkubuje s rozpustným receptorem IFNAR-2 v přítomnosti a v nepřítomnosti DSS v souladu s instrukcemi výrobce. Vzorky se separovaly testem SDS-PAGE a a provedl se westernový přenos za použiti protilátek proti IFNB nebo IFNAR2. Intereakce funkčního polypeptidu IFNB/konjugát s receptorem se projeví zvyšující se molekulovou velikostí receptoru a IFNB v přítomnosti DSS.
Test křížení za použití polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu a obou receptorových podjednotek (IFNAR-1 a IFNAR-2) může stanovit vazebnou schopnost interferonového receptoru 1. V tomto spojení se publikovalo, že IFNAR-1 se váže pouze tehdy, jestliže se vytvoří komplex interferon β:IFNAR-2 (popisuje se v publikaci Mogensen et al., Journal of Interferon and Cytokine Research, 19: 1069-1098, 1999).
In vitro testy konjugátů interferonu β
105 ··· · ·
Redukovaná imunogennost konjugátu nebo polypeptidu podle vynálezu se stanovila použitím testu ELISA, přičemž se měří ímunoreaktivita konjugátu a polypeptidu vůči referenční molekule nebo přípravku. Referenční molekula nebo přípravek je v normálním případě rekombinantní lidský IFNB, jako je Avonex, Rebif nebo Betaseron nebo jiný přípravek rekombinantního lidského IFNB připraveného způsobem, který je ekvivalentní se způsobem přípravy uvedených produktů. ELISA je založena na protilátkách pocházejících z pacientů ošetřených jedním z těchto přípravků rekombinantní IFNB. Uvažuje se, že imunogennost se snižuje, když konjugát nebo polypeptid podle vynálezu vykazuje statisticky významně nižší odezvu v testu ve srovnání s referenční molekulou nebo přípravkem.
Další metodou stanovující imunogennost je použití séra pocházejícího z pacientů ošetřených IFNB (to je libovolným běžným produktem IFNB) analogickým způsobem, jako je ten popsaný v dokumentu Ross et al., J. Clin. Invest. 95, 1974-78, 1995. V antivirovém neutralizačním biologickém testu snížená imunogennost vede ke snížené inhibice konjugátu podle vynálezu sérem pacienta ve srovnání s referenční molekulou IFNB divokého typu. Dále v biochemickém vazebném testu IFN menší množství imunogenního konjugátu se váže na IgG pacienta v menším rozsahu ve srovnání s referenčními molekulami IFNB.
V případě neutralizačního testu se přidávají referenční a konjugátové molekuly v koncentrací, která produkuje přibližně 80 % ochrany proti viru v antivirovém neutralizačním biologickém testu. Proteiny IFNB se míchají se sérem pacienta v různých ředěních (zažínající 1:20).
Antivirový test se uskutečnil za použití buněk A549 (CCL
185, instituce „American tissue culture collection) a viru encefalomyokarditidy (EMC) (VR-129B, instituce „American tissue culture collection).
106
0 0
0 0 0 • 0 00
Buňky se nanesly do 96 prohlubní na destičky pro tkáňové kultury v koncentraci 10 000 buněk na jednu prohlubeň a inkubovaly se při teplotě 37°C v 5% atmosféře CO2. Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu se přidal v koncentraci 100 až 0,0001 IU/ml do celkového množství 100 μΐ kultivačního média DMEM, které obsahuje fetální telecí sérum a antibiotika.
Po 24 hodinách se odstranilo kultivační médium a do každé prohlubně se přidalo 0,1 ml čerstvého kultivačního média obsahující virus EMC. Virus EMC se přidal v koncentraci, která způsobuje 100 % odumření buněk v buněčných kulturách, které neobsahují IFN-β, po 24 hodinách kultivace.
Po dalších 24 hodinách se měří antivirový účinek polypeptidu nebo konjugátu za použití testu WST-1. Do 0,1 ml kultury se přidá 0,01 ml WST-1 (WST-1 je buněčné proliferační činidlo, Roche Diagnostics GmbH, Mennheim, Německo) a směs se inkubovala po dobu 30 minut až 2 hodiny při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Štěpení The tetrazoiové soli WST-1 pomocí mitochondriální dehydrogenázy v živých buňkách vede k tvorbě formazanu, jehož množství se stanoví měřením absorbance při vlnové délce 450 nm.
Neutralizační aktivita v testu responzivního elementu stimulovaného interferonem (ISRE)
Neutralizační účinek anti-IFNB séra se analyzoval za použití testu aktivity ISRE-luciferázy.
Použila se séra získaná z pacientů ošetřených IFNB nebo z imunizovaných zvířat. Séra se přidala buď v konstantní • ·· · koncentraci (ředění 1:20 až 1:500 pt. séra) nebo 200 až 600 ng/ml (zvířecího séra)) nebo v pěti násobném sériovém ředění séra, které začíná na hodnotě 1/20 (pt. séra) a 600 ng/ml (zvířecího séra). IFNB se používá v pětinásobném ředění, které začíná v koncentraci 25 000 IU/ml nebo v konstanntí koncentraci (0,1 až 10 IU/ml) v celkovém objemu 80 μΐ kultivačního média DMEM plus 10 % FCS. Sérum se ínkubovalo po dobu jedné hodiny pří teplotě 37 °C s IFN-beta.
Vzorky se pak přenesly na destičky pro tkáňové kultury s 96 prohlubněmi, které obsahují buňky HeLa transfekované ISRELuc kultivované po dobu 24 hodin (15 000 buněk v jedné prohlubni) v kultivačním médiu DMEM. Kultury se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C v 5% atmosféře CO2. Do každé prohlubně se následně přidal substrát LucLite (Packard Bioscience, Groningen, Holandsko). Destičky se zatavily a luminiscence se měřila pomocí luminomeru TopCount (Packard) v módu SPC (požítání jednotlivých fotonů).
Když se titrují vzorky IFNB v přítomnosti konstantního množství séra, neutralizační účinek se definoval jako násobná inhibice (FI) kvantifikovaná jako EC50 (hm. séra)/EC50 (hm./obj. séra). Redukce protilátkové neutralizace proteinů variant IFNB se definovala jako varianta FI (1- ---------------) X 100 %
FI divokého typu
Měření biologického poločasu konjugátu PEG-IFNB nebo glykosylovaných variant IFNB
Měření biologického poločasu se může provést řadou způsobů popsaných v literatuře. Jeden způsob se popisuje v publikaci Munafo et al., European Journal of Neurology, 1998, col. 5,
No. 2. p. 187-193) , kde se používá test ELISA pro stanovení množství IFNB v séru po subkutánní a intramuskulární aplikaci
00 0
108 ··
0 0 0 0 ·
0 0 0 ·0
0 00000 0
00 00 00
IFNB.
Rychlé snížení koncentrací IFNB v séru po intravenózní aplikaci ji činí důležitou pří hodnocení biologické odezvy na léčbu IFNB. Uvažuje se však, že konjugát ypodle vynálezu budou prodlužovat poločasy přeměny v séru také po intravenózní aplikací, což je možné měřit například testem ELISAnebo primární monitorovacím testem.
Také se studovaly různé farmakodynamické markéry (například sérový neupterin a beta2 mikroglobulin) (popisuje se v publikaci Clin. Drug. Inest. (1999( 18(1): 27-34). Tyto markéry je možné dobře použití pro hodnocení prodlouženého biologického účinku. Tyto experimenty je také možné provádět na vhodných zvířecích druzích, například krysách.
Spolu se zde popsanými primárními a sekundárními monitorovacími testy se pro hodnocení biologické účinnosti konjugátu v porovnání s IFNB divokého typu použily tetsy k odhadnutí biologických účinků IFNB, jako je antivirový, antiproliferativní a imunomodulační účinek.
Nakonec zvířecí model, jako je běžně používaný experimentální model autoimunní encefalomyelitidy (EAE) se může použít ke stanovení účinnosti konjugátu nebo polypeptidu podle vynálezu. V modelu EAE pro imunizaci s myelinem nebo s proteiny odvozenými od myelinu se vyvolá onemocnění napodobuj líc většinu zánětlivých a neurologických rysů roztroušené sklerózy u lidí. Model EAE se používá u myší, krys a králíků (popisuje se v publikací Cannella et al., PNAS, 95, 10100-5, 1998, Zaprianova et al., Morfologia, 112, 25-8, 1997, Hassouna et al., J. Urology, 130, 806-10, 1983, Genain and • 999 •9 9999
109
99
9 4 4 4 9 9 « » ·
9 9999 999 • · 99 999999 9 9 •9 99 9 9999 • · · 4 ·♦ 99 94 99
Hauser, J. Mol. Med. 75, 187-97, 1997). Jiné modely zahrnují model viru Theilerovy myší encefalomyelitidy (TMEV) (popisuje se v publikaci Murray et al., J. Neurosci. 18, 7306-14, 1998) se používají ke stanovení účinnosti konjugátu IFNB.
Dostupná povrchová plocha (ASA)
Počítačový program Access (popisuje se v publikaci B. Lee and F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)) verze 2 (Copyright© 1983 Yale University) se používá pro výpočet dostupné povrchové plochy (ASA) ve struktuře jednotlivých atomů. Tato metoda v typickém případě používá velikost sondy 1,4 Á a definuje dostupnou povrchovou plochu (ASA), jako plochu vytvořenou středem sondy. Před výpočtem se ze sady koordinát odstranily všechny molekuly vody a atomy vodíku, stejně jako jiné atomy, které se přímo netýkají proteinu. Pro výpočet ASA jsou dostupné alternativní programy, například J. Mol. Graph. (1990) 8, 52-56, program Whatlf G. Vriend, dostupný na WWW http://swift.emblstránkách heidelberg.de/servers2/ (R. Rodriguez et al., CABIOS (1998)
14, 523-528) používající možné dostupností.
Částečná ASA postranního řetězce
Částečná ASA atomů postraního řetězce se vypočítala dělením součtu atomů ASA ve postranním řetězci hodnotou reprezentující ASA atomů postranního řetězce tohou typu zbytku v rozšířeném tripeptidu ALA-x-ALA (popisuje se v publikaci Hubbard, Campbell and Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507530). V tomto příkladu atom CA se považuje za část postranního řetězce glycinových zbytků, ale nikoliv zbývajících zbytků. Následující tabulka indikuje 100% standard ASA v případě postranního řetězce:
991
1111
110
Ala | 69.23 Á2 |
Arg | 200.35 Á2 |
Asn | 106.25Á2 |
Asp | 102.06 Á2 |
Cys | 96.69 Á2 |
Gin | 140.58 Á2 |
Glu | 134.61 Á2 |
Gly | 32.28 Á2 |
His | 147.00 Á2 |
He ' | 137.91 Á2 |
Leu | 140.76 Á2 |
Lys | 162.50 Á2 |
Met | 156.08 Á2 |
Phe ' | 163.90Á2 |
Pro | 119.65 Á2 |
Ser | 78.16 Á2 |
Thr | 101.67Á2 |
Tip | 210.89 Á2 |
Tyr | 176.61 Á2 |
Val | 114.14 Á2 |
Stanovení povrchu exponovaných aminokyselinových zbytků
Třírozměrná krystalická struktura lidského IFNB v rozlišení 2,2 Á (popisuje se v publikaci Karpusas et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94: 11813-11818) je dostupná v instituci „Protein Data Bank (PDB) (popisuje se v publikaci Bernstein et al., J. Mol. Biol. (1977) 112 pp. 535) a v elektronické formě prostřednictvím The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB http://www.pdb.org/ z přístupovým kódem 1AU1. Tato krystalická
4444 44 ·· 44 4444 * 4 4 4 4 · · · * · · · · 4 4 4 • · · 4····· 4 ·
44 · 4444
111 struktura obsahuje dvě nezávislé molekuly lidského IFNB a v tomto příkladu se používá molekula A.
Expozice povrchu
Za použití programu Whatlf, jak se popisuje shora v textu, se zjistilo, že následující zbytky vykazují nulovou přístupnost povrchu atomů postranních řetězců (v případě zbytku Gly se používá přístupnost atomu CA):
G7, N14, 07, L21,144, A55, A56, T58,159, M62, L63, L98, L122, Y125,1129, L133, A142, W143, V146,1150, N153,1157, LI60, T161, a L164.
Expozice částečného povrchu
Za účelem další analýzy bylo nezbytné, kvůli prostorové kolizy, upravit postranní řetezce R71, R113, K115, L116, M117. Úprava se provedla za použití zařízení Modeler 98, MSI, INC. . Výpočty částečné ASA za použití počítačového programu Access s upravenou molekulou IFNB (zahrnuje pouze aminokyselinové zbytky a vylučuje N-spojenou cukernou část) ukázaly, že následující zbytky mají více jak 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu:
S2, N4, L5, F8, L9, RI 1, S12, F15, Q16 Q18, K19, W22, Q23, G2Ó,
R27, L28, E29, Y30, L32, K33, R35, M36, N37, D39, E42, K45, Q46, L47, Q48, Q49, Q51, K52, Q64, A68, R71, Q72, D73, S75, S76, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, N96, H97, K99, T100, E103, E104, K105, E107, K108, El09,D110, Fill, RI 13, G114, K115, LI 16, Sl 19, L120, H121, K123, R124, G127, R128, L130, H131, K134, A135, K136, E137, Y138, Sl39, H140, V148, R152, Y155, NI 58, G162, Y163, RI65, and NI 66, a následující zbytky mají více než 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu: N4, L5, F8,
S12, F15, Q16, K19, W22, G26, R27, E29, Y30, K33, R35, N37, D39, E42, Q46, Q48, Q49, Q51, K52, R71, D73, S75, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, K99, TI00, E103, E104, E107, K108, Dl 10, Fill, LI 16, K123, R124, G127, H131, K134, E137, V148, Y155, R165, a NI 66.
112
ΦΦ φφ • ΦΦΦ ♦ · φ φ ΦΦΦ···· • φ · · φφφ · · φ · • φφ Φ···· ···· φφ ···*
Přehled obrázků na výkrese
Obr. 1 znázorňuje westernův přenos optimalizovaných glykosylačních varant hIFNB (jak se popisuje v příkladech 7 a 8). Dráha 1: hIFNB divokého typu, dráha 2: [Q49N, Q51T]hIFNB, dráha 3: [Q48F, Q49N, Q51T]hIFNB, dráha 4: [Q48V, Q49N,
Q5lT]hIFNB, dráha 5[Q48W, Q49N, Q51T]hIFNB, dráha 6: markér, dráha 7: [F111N, R113T ]hIFNB, dráha 8: [D110F, F111N, R113T]hIFNB a dráha 9: [D110V, F111N, R113T]hIFNB.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Návrh expresívní kazety pro expresi IFNB v savčích a hmyzích buňkách (odpovídá příklad 1 uvedeném v dokumentu PCT/DK00/00471)
Sekvence DNA (GenBank, přístupové číslo M28622, zobrazena jako SEQ ID NO: 1)) zahrnující celou délku cDNA kódující lidský IFNB s jeho přirozeným signálním peptidem se upravila za účelem dosáhnout silné exprese v savčích buňkách.
1) Startovací kodon ATG se upravil podle Kozákovi konvenční sekvence (popisuje se v publikaci Kozák, M., J. Mol. Biol. 1987 Aug. 20, 196 (4):947-50) tak, že se správně páruje s konvenční sekvencí proti směru exprese genu od startovacího kodonu ATG.
2) Kodony přirozeného lidského IFNB se upravily vytvořením tendence v použití kodonu směrem ke kodonům, které se často používají v silně exprimovaných lidských genech.
3) Jisté nukleotidy sekvence se substituovaly jinými za účelem zavést místo, které je rozeznáváno restrikčními endonukleázami DNA (to umožňuje jednoduší pozdější úpravu sekvence DNA) a dále se navrhly primery tak, že by se mohl syntetizovat gen:
113 • ·Α · ·« ··
I 9 9 » 9 9 1 • ·· ·
CBProFprl:
5’GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAAGTGCCTGCTCCAGA
TCGCCCTGCTCCTGT-3’,
CBProFprl:
5’ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGAAGCTCCT
GTGGCAGCTGAACGG-3’,
CBProFpr3:
5’GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGA CGCCGCTCTGACCATC-3 ’,
CBProFpr4
5’TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCATCGTGGAGAACCTGC
TGGCCAACGTGTACC-3
CBProFpr5
5’AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGC
ACCTGAAGCGCTACTA-3
CBProFpró
5’GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGAGATCCTGCGCAACTTC TACTTCATCAACCGC-3 ’,
CBProFpr9
5’CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGGT TGATGAAGTAGAAGT-3 ’,
CBProFprl O
5’AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAGGATGCGGCCATAGTA
GCGCTTCAGGTGCAG-3
CBProFprll
5’CTCCTTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGTTGATCTGGTGGTACA CGTTGGCCAGCAGG-3 ’,
CBProFprl2 ’ GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCATCTCGTAGATG GTCAGAGCGGCGTCCT-3 \
ΦΦ φφ φφφφ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφφφφφφ φ φ · φ φφφφ φφ φφ φφ ·· «
114 φφφφ φφ ·φφ ·
CBProFprl3 ’ CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTC AGGC AGTACTCC AGGCGCCCGTT C AGCTGCCAC AGGAG-3 ’,
CBProFprl 4 ’ C AGGAAGCCGAGC AGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGTGGTGCTGAAGC ACAG GAGCAGGGCGATCTGG-3
Primery se uspořádaly do syntetického genu pomocí PCR s jedním krokem za použití sady Platinum Pfx-polymeráza (od frimy Life Technologies) a parametrů standardní cyklické PCR se třemi kroky. Takto uspořádaný gen se amplifikoval PCR za použití stejných podmínek.
Syntetizovala se cDNA kódující formu lidského IFNB prodlouženou na N-konci za použití stejných podmínek PCR, jak se popisuje shora v textu, ale s primery CBProFprl a -14 substituovanými s primery:
CBProFpr7
5’CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGGCCCTATCGATGAAGC
ACCAGCACCAGCATC-3
CBProFpr8
5’CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT
GGCTAGCGTTTAAAC-3
CBProFprl5 ’ C AGGAAGCCGAGC AGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGATGTTGGTGCTGATGC
TGGTGCTGGTGCTTC-3’,
CBProFprl 6
5’AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTGGCGAAGCTTAAGTTTA
AACGCTAGCCAGCTT-3’, ·♦· ·· ···· ·· 9 9 9 9 9 9 9 ♦ • 9 9 9 9 9 9 9 9
11C ·· · · · 999 999 9
-I—L '-s 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 99 99 9 9 za účelem začlenit izolovaný TAG do molekuly IFNB.
Syntetizované geny se se klonovaly do pcDNA3.1/Hygro (od firmy Invitrogen) mezi restrikční místo Hind III na 5'konci a BamHI na 3'konci, přičemž vzniká pCBProFl a pCBProF2.
Syntetitcký intron z pCI-Neo (od firmy Promega) se amplífikoval za použití standardních podmínek PCR, jak se popisuje shora v textu a primerů:
CBProFpr37 5 ’-CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC-3 CBProFpr38 5’-GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT-3 což vede ke vzniku fragmentu PCR o velikosti 332 pb, který se štěpil restrikčními enzymy Nhel a HindlII a začlenil se do 5'UTR plzmidů pCBProFl a pCBProF2 za vzniku pCBProF4 a pCBProF5.
Kodony jednotlivých aminokyselin se změnily amplifikací relevantních oblastí kódující oblasti pomocí PCR takovým způsobem, že změny zavedené do sekvence pomocí PCR se mohou zavést do expresívních plazmidů klasickými klonovacími metodami. Například primery
Lys45arg-5 'primer (Narl/Kasl):
’ GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGATGAACTTCGACATCCC CGAGGAAATCCGCCAGCTGCAGC-3’, '
Lys45mut-3 'primer (BsiWI): 5’TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG-3’, se používaly k zavedení substituce K45R do fragmentu PCR, který překrývá oblast od polohy 1055 do 1243 v pCBProFl. Fragment PCR a pCBProFl se štěpily restrikčními enzymy Narl a BsiWI. Fragment PCR a vektorová kostra pCBProFl se čistila a ligovala za vzniku substituce kodonu AAG Lys45 s kodonem CGC Arg v pCBProFl.
4444
116
4* 4* • · · 4 4 4 <
• » 4 · 4 4 4
444444 4 <
• · 4 4 4 4 « *4 44 4« 44 «4 4444
Dále se použila pro zavedení substitucí aminokyselin SOE
PCR (extenze přesahu sekvence). V případě SOE-PCR N-terminální částí a C-terminální části molekuly IFNB se nejdříve amplifikovala primárními PCR.
Za účelem provedení primárních PCR se syntetizovaly centrální komplementární pimery tak, že kodon(y) aminokyseliny(aminokyselin) , která se budou substituovat se změnily na požadovaný kodon(y). Terminální primery byly standardní primery definující N-konec a C-konec molekuly IFNp. Dále terminální primery poskytovaly místa rozeznávaná restrikčními enzymy vhodná pro následné klonování produktu PCR v celé délce. Pak centrální primer a N-terminální primer se použily k amplifikaci N-terminální částí kódující oblasti ΙΝΕβ v jedné z primárních PCR a stejně tomu je v případě Cterminální části. Jednou amplifikovaná N-terminální a Cse uspořádaly a klonovaly délky verze do produktu plné se do upravené terminální část v sekundární PCR pCDNA3.1/Hygro, jak se popisuje shora v textu. Následující primery se například použily při zavedení mutací pro substituce F111N a R113T:
CBProFprimer9(SQnsé): .
CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGGTTG ATG AAGTAGAAGT,
CBProFprímer231 (Antisense):
CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC,
CBProFprimer230 (S ense):
GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG,
CBProFprimer42 (Antisense):
CACACTGGACTAGTAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC,
V případě, že zavedená(é) mutace byly dostatečně blízko jedinému místu v expresívním plazmidu rozeznávaném restrikční endonukleázou, zkonstruovala se varianta genů za použití postupu zahrnující PCR s jedním krokem a následné klonování.
Například substituce K19R se zavedla použitím primeru PCR:
CBProFpr58’.
GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAACG, a CBProFprimer9.
Produkt PCR se následně klonoval za použití míst rozeznávaných restrikčními endonukleázami BsiWI a BstBI.
Příklad 2: Konstrukce a exprese varianty IFNB s jedním zavedeným glykosylačním místem (tento příklad odpovídá příkladu 5 z dokumentu PCT/DK00/00471)
Za účelem začlenit další N-spojené glykosylační místo do polohy 111 do hINF-β, se syntetický gen (hinf-β) kódující hINF-β (popsaný v příkladu 1) upravil místně řízenou PCR mutagenezí. Za použití BIO-X-ACT (Bioline, Velká Británie) a plazmidu PF050 [hinf-β)/pcDNA3.1(-)Hygro/Intron (derivát pcDNA3.1(-)Hygro (Invitrogen, USA), do kterého se začlenil mezi restrikční místa BamHI a Nhel v MCS vektoru chimérický intron získaný z pCI-neo (Promega, USA)), jako templátu se provedly dvě reakce PCR se dvěmi překrývajícími se sadami primerů [CB41 (5’TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3’)
ICB55 (5’-CGGCCATAGT
AGCGCTTCAGGTGCAGGGAGCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3’) a CB42/ CB86(5'GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTAC TATGGCC G-3’) přičemž vznikají dva fragmenty o velikosti 446 a 184 párů
9999
118 • 9 9 · 9
9 9 9 <
* * · ·«· · 9 • · 9 9
9« <
*9 9999 uspořádaly ve třetí PCR Výsledný gen se začlení do pcDNA3.1(-)Hygro/Intron a baží. Tyto dva fragmenty se s lemujícími primery CB41 a CB42 savčího expresívního vektoru sekvenováním DNA se potvrdilo, že vykazuje správné změny baží vedoucí k substitucím F111N a R113T v hINF-β (plazmid se označil jako PF085).
Za účelem testování aktivity varianty [F111N+R113T]hINF-β se PF085 transfekoval do buněčné linie CHO K1 (ATCC#CCL-61) za použití přípravku Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) jako transfekčního činidla. O 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita INF-p/koncentrace:
aktivita: 56046 IU/ml (primární test)
ELISA 80 ng/ml specifická aktivita 7xl08 IU/mg
Jak je možné vidět varianta [F111N+R113T]hINF-β vykazuje velmi vysokou specifickou aktivitu, což je přibližně dvojnásobek specifické aktivity hINF-β divokého typu.
Příklad 3: Konstrukce a exprese IFNB s dalším zavedeným glykosylačním místem [Q49N+Q51T] (příklad odpovídá příkladu 6 uvedeném v dokumentu PCT/DK00/00471)
Obdobně k tomu, co bylo popsáno v příkladu 5, se do polohy 49 zavedlo další N-spojené glykosylační místo substitucemi Q49N a Q51T. Za použití PF043 (hinf-)3/pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) jako templátu se provedly dvě reakce PCR dvěmi sadami přesahujících primerů [PBR7] /PBR78 (5’-
119
GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTCTGCAGCTG-3 ’) a PBR8 (5
ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT-3’) 1PBR77 (5’CAGCTGCAGAACTTCACCAAGGAGGACGCC-3’) což vede ke vzniku dvou fragmentů obsahujících 228 a 369 párů baží. Tyto dva fragmenty se uspořádaly třetí PCR s lemujícími prímery PBR7 a PBR8. Výsledný gen se začlenil do savčího expresívního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/Intron a sekvenováním
DNA se potvrdily správné změny vedoucí ke vzniku [Q49N+Q51T]hINF-β (plazmid označený PF104;
Za účelem testovat aktivitu varianty [Q49N+Q51T]hINF-β se PF104 transfekovaly do buněčné linie CHO K1 použitím přípravku Lipofectamin 2000 (Life Technologies, USA) jako transfekčního činidla. O 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita INF-p/koncentrace:
aktivita 17 639 IU/ml (primární test)
ELISA 10 ng/ml specifická aktivita 1,7 x 10® IU/ml
Jak se pozorovalo varianta [Q49N+Q51T]hINF-β má vysokou specifickou aktivitu. To může způsobovat slabým rozeznáváním jednou z monoklonálních protilátek používaných testu ELISA.
Příklad 4: Konstrukce a exprese IFNB se dvěmi zavedenými glykosylačními místy (příklad odpovídá příkladu 7 v dokumentu PCT/DK00/00471)
Další glykosylační místa popsaná v příkladu 5 a 6 se zavedla do lidského IFNB substitucemi Q49N, Q51T, F111N a
R113T.
120
0 0
Za použití PF085 (popsaný v příkladu 5) jako templátu se. provedly dvě reakce PCR dvěmi sadami přesahujících primerů [PBR89 (5 ’ CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/
PBR78 a PBR8/PBR77] což vede ke vzniku dvou fragmentů obsahujících 228 a 369 párů baží.
Tyto dva fragmenty se uspořádaly třetí PCR s lemujícími primery PBR89 a PBR8. Výsledný gen se začlenil do savčího expresívního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/Intron a sekvenováním DNA se potvrdily správné změny vedoucí k [Q49N,Q51T,F111N,R113T]hINF-β (plazmid označený PF123).
PF123 se transfekovaly do buněčné linie CHO K1 použitím přípravku Fugene 6 (Roche) jako transfekčního činidla. O 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita INF-p/koncentrace:
aktivita 29 401 IU/ml (primární test)
ELISA 14 ng/ml specifická aktivita 2,1 χ 109 IU/ml
Jak se pozorovalo varianta [Q49N+Q51T+F111N+R113T]hINF-β má vysokou specifickou aktivitu.
Zjistilo se, že tato varianta vykazuje vazebnou aktivitu vůči receptorů v testu navázání na receptor popsaném v sekci Metariály a metod, který je založen na použití řetězícího činidla DSS.
Příklad 5: Produkce glykosylační varianty [Q49N+Q51T+F111N +R113TJINFB v otáčivých nádobách
121 • · • · · · · · • ·
Subklon CH0K1 (5/G-10) produkující glykosylační variantu [Q49N+Q51T+F111N+R113T] se vnesl do dvou otáčivých nádob v 200 ml kultivačního média DMEM/F-12 (LifeTechnologies, kat.č. 31330) doplněném 10 % FBS a penicilinem/streptomycinem (P/S). Každá nádoba vykazuje expandovaný povrch 1 700 cm2 (Corning, USA). Po dvou dnech kultivace se vyměnilo kultivační médium. Po dalších dvou dnech dvě otáčivé nádoby vykazovaly skoro 100 % konfluentnost a jako kultivační médium se použilo 300 ml UltraCHO bez séra (BioWhittaker, Kat. č. 12-724) doplněné 1/500 EX-Cyte (Serologicals Proteins, Kat. č. 81129a) a P/S. Rostoucí buňky v tomto kultivačním médiu produkují větší množství buněčné hmoty než se dosáhne v kultivačním médiu, které obsahuje sérum. Po dvou dnech kultivace se kultivační médium vyměnilo. Po dalších dvou dnech kultivace se jako kultivační médium použilo DMEM/F-12 (LifeTechnologies, Kat. č. 21041) doplněné 1/100 ITSA (LifeTechnologies, Kat. č. 51300044) (ITSA tvoří inzulín (v koncentraci 1,0 g/1)-transferin (v koncentraci 0,55 g/1)-selenium (v koncentraci 0,67 mg/1) doplněnek pro adherentni kultury) a 1/500 EC-CYTE a P/S. Shromážděné kultivační médium ze dvou otáčivých lahví se slilo a pak se odebraly vzorky za účelem stanovení IFNB aktivity.
Příklad 6: Produkce, izolace a úprava pomocí PEG varianty K19R+K45R+K123R IFNB (uvedený příklad PCT/DK00/00471) odpovídá příkladu z dokumentu
Tři nádoby T-175 obsahující 100 ml kultivačního média bez séra s variantou IFNB K19R+K45R+K123R se osadily buňkami COS-7 v kultivačním médiu DMEM (LifeTechnologies, Kat.č. 21969-035) doplněném 10 % FBS plus glutaminem a směsí penicilin/streptomycin. V den transfekce 4 až 5 antibiotik hodin před
0000 • 00 0
122 • 0 0 0 0 0 0 0
0000 00 0 • 00 000000 0 0
00 0 0000
00 00 00 00 transfekcí (buňky se blíží 100 % konřluentnosti) se kultivační médiu nahradilo 30 ml čerstvého kultivačního média. Za účelem připravit transfekcí se 1 890 μΐ kultivačného média DMEM bez doplňků se rozdělilo do alikvotů do polypropylenových zkumavek o objemu 14 ml (Corning). Přípravek Fugene 6 (Roche) o objemu 210 μΐ se přidal přímo do kultivačního média a směs se inkubovala po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Mezitím se 168 pg plazmidové DNA ([K19R, K45R, K123R]INF-p/pcDNA3.1()Hygro, PF#161) se rozdělil do jiných polypropylenových zkumavek o objemu 14 ml. Po 5 minutách inkubace se přípravek Fugene 6 smíchal přímo s roztokem DNA a inkuboval se po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Po inkubaci se přibližně 700 μΐ přidalo po kapkách do každého ze tří buněčných medií.
Další den se transfekční médium nahradilo 35 ml produkčního média bez séra. Médium bez séra je založeno na kultivačním médiu DMEM (Life Technologies, Kat. č. 31053-028) doplněné glutaminem, pyruvátem sodným a směsí antibiotik penicilin/streptomycin, 1 % ITSA (LifeTechnologies, Kat. č.
51300-044) a 0,2 % Ex-Cyte (Serologicals Proteins, Kat. č. 81129) . Dříve než se přidalo produkční médium buněčné vrstvy se promyly dvakrát v kultivačním médiu DMEM bez pomocných látek.
Tři dni po tranfekci se shromáždilo 100 ml kultivačního média bez séra za účelem izolace a úpravou pomocí PEG varianty IFNB.
Hodnota pH se upravila na 6,8 a konduktivita se upravila na hodnotu nižší než 10 mS/cm vodou Milli Q. Pak se půda nanesla na 1 ml pryskyřice s výměnou kationtů SP 550 (TosoHaas), která se předem uvedla do rovnováhy pufrem A (20 mM fosforečnan, 100 mM NaCl, pH 7) . Po 2 hodinách otáčení se nechala pryskyřice sedimentovat a přenesla se na kolonu. Pryskyřice se promyla 5 objemy kolony pufru A a eluovala se 2 ♦ 4 #··· ·««· « 9 9
99 9
123 • · ·
4 4 • 4 » • 9 · ·
4 · * ml pufru Β (20 mM fosforečnan, 800 mM NaCI, pH 7) . Objem eluátu se po přidání 5 % etylenglykolu snížil na 500 μΐ na zařízení VivaSpin (oddělují se částice o molekulové hmotnosti 10 000) . Koncentrace se upravila na 50 mM fosforečnan, 0,3 M NaCI, 20 % etylenglykol, hodnota pH je 8 v konečném objemu 2 ml a koncentrace směsí se dále upravila na objem 0,5 ml.
Konečný koncentrát se upravil PEG následujícím způsobem: Ke 100 μΐ konečného koncentrátu se přidalo 25 μΐ aktivovaného mPEG-Spa (molekulová hmotnost 5 000, Shearwate, Alabama) čerstvě připraveného ve fosforečnanovém pufru tak, aby konečná koncentrace aktivovaného PEG byla 0, 5, 10, 25 nebo 50 mg/ml. Reakce se nechala pokračovat po dobu 30 minut při teplotě místnosti a pak se ukončila přidáním 50 mM glycinového pufru. Vzorky se bezprostředně zamrazily při teplotě -80 °C a měřila se bioaktivita (primární test). Provedly se westernový přenosy každého vzorku za účelem hodnotit množství nezreagované varianty IFNB přítomné ve vzorku upraveném PEG.
Výsledky ukazují, že při koncentraci 25 mg/ml aktivovaného PEG, není přítomna varianta IFNB upravená PEG, jak se potvrdilo westernovým přenosem a varianta se uchovávala 50 % své bioaktivity ve srovnání s kontrolním vzorkem (ošetřeným stejným způsobem, ale s 0 mg/ml aktivovaného PEG) .
Příklad 7: Varianty, které mají zvýšený záchyt sacharidů v poloze 49.
Začleněné N-spojené glykosylační místo v poloze 49 ve variantě IFNB [Q49N, Q51T] popsané v příkladu 6 dokumentu
PCT/DK00/00471 se používá pouze přibližně ze 60 %. Za účelem zvýšit množství zachyceného sacharidu se glutaminový zbytek v poloze 48 vyměnil za fenylalanin (Q48F), valin (Q48V) a tryptofan (Q48W) místně řízenou PCR mutagenezí. Použitím BIO*··· «···
X-ACT (Bioline, UK) a PF185 (PF185 obsahuje stejnou sekvenci cDNA jako PF104 popsanou v příkladu 6 navzdory skutečnosti, že
Kozáková sekvence se začlenila před startovací kodon ATG) jako templátu se provedly reakce PCR se sadou překrývajících se primerů:
Q48F, Q49N, Q51T
PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR148 (5’GTCCTCCTTGGTGAAGTTGAACAGCTGCTT) a: PBR8 ((5’ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT-3 ’))/ PBR147 (5’AAGCAGCTGTTCAACTTCACCAAGGAGGAC)
Q48V, Q49N, Q51T
PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR150 (5’GTCCTCCTTGGTGAAGTTCACCAGCTGCTT) a PBR8 /PBR149 (5 ’AAGCAGCTGGTGAACTTCACCAAGGAGGAC)
Q48W, Q49N. Q51T
PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR152 (5 ’ GTCCTCCTTGGTGAAGTTCCACAGCTGCTT) a PBR8 ZPBR151 (5’AAGCAGCTGTGGAACTTCACCAAG GAGGAC)
Fragmenty se uspořádaly v reakcích PCR s lemujícími primery PBR89 a PBR8. Výsledné geny se začlenily do savčího expresívního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/Intron a sekvenováním se potvrdilo, že mají správné změny báze vedoucí ke vzniku [Q48F, Q49N, Q5lT]hINF-p (plazmid označený PF305), [Q48V, Q49N, Q5lT]hINF-p (plazmid označený PF306) a [Q48W, Q49N, Q5lT]hINFβ (plazmid označený PF307).
PF305, PF306, PF307 a PF185 (kódující [Q49N, Q51T]hINF-β) se transfekoval do buněk CHO K1 použitím přípravku Fugene 6
125 «9 9 99999 4
9 9 9 4
9 9 » 9 9 (Roche), jako transfekčního činidla. 0 24 hodin později se shromáždilo kultivačně médium a testovala se aktivita INF-β:
PF185 | 134 | 713 | IU/ml |
PF305 | 53 | 122 | IU/ml |
PF306 | 65 | 949 | IU/ml |
PF307 | 45 | 076 | IU/ml |
Za účelem hodnotit množství zachyceného sacharidu ve třech nových glykosylačních variantách se provedl westernův přenos se stejným množstvím aktivity v káždé dráze (Obr. 1, dráhy 2,
3, 4
5)
Jak je možné vidět na Obr. změna aminokyselin (Q48F, Q48V, Q48W) před zavedeným glykosylačním místem (Q49N, Q51T) vede ke zvýšení množství zcela glykosylovaného materiálu.
V jednom experimentu je možné vidět, že začlenění tyrosinu do polohy 48 vede ke zvýšení množství zachyceného sacharidu na N-spojené glykosylační místo v poloze 49.
Příklad 8: Varianty, které mají zvýšené zachycení sacharidů v poloze 111
Začleněné N-spojené glykosylační místo v poloze 111 ve variantě IFNB [F111N, R113T] popsané v příkladu 5 dokumentu PCT/DK00/00471 se používá pouze přibližně z 50 %. Za účelem zvýšit množství zachyceného sacharidu se zaměnil zbytek kyseliny asparágové v poloze 110 za fenylalanin (D110F) a valin (D110V) místně řízenou PCR mutagenezí. Za použití BIO-XACT (Bioline, Velká Británie) a PF085 (popsaný v příkladu 5 dokumentu PCT/DK00/00471) jako templátu se provedly reakce PCR se sety překrývajících se primerů:
P110F.F111N.R113T
PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR154 (5’CAGCTTGCCGGTGGTGTTGAACTCCTTCTC) a PBR8 /PBR153 (GAGAAGGAGTTCAACACCACCGGCAAG CTG)
126
D110V, F111N, R113T
PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR156 (5’CAGCTTGCCGGTGGTGTTCACCTCCTTCTC) a PBR 8 /PBR 155 (5’GAGAAGGAGGTGAACACCACCGGCAAGCTG)
Fragmenty se uspořádaly v reakcích PCR s lemujícími primery PBR89 a PBR8. Výsledné geny se začlenily do savčího expresívního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/Intron a sekvenováním se potvrdily správné změny vedoucí ke vzniku [D110F, F111N,
R113T]hINF-β (plazmid označený PF308) a [D110V, F111N,
R113T]hINF~3 (plazmid označený PF309).
PF308, PF309 a PF085 (kódující [F111N, R113T]hINF-β) se transfekovaly do buněk CHO K1 použitím přípravku Fugene 6 (Roche), jako transfekčního činidla. Po 24 hodinách se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita INF-β:
PF085 58 615 IU/ml
PF308 50 900 IU/ml
PF309 15 063 IU/ml
Za účelem hodnotit množství zachyceného sacharidu ve dvou nových glykosylačních variantách se provedl westernův přenos se stejným množství aktivity v každé dráze (Obr. 1, dráha 1, 8, 9) . Jak je možné vidět na Obr. změny aminokyselin (D110F a D110V) před zavedeným glykosylačním místem (F111N, R113T) vedou k podstatně zvýšenému množství zcela glykosylovaného materiálu.
V jiném experimentu je možné vidět, že začlenění tyrosinu do polohy 110 vede ke zvýšenému množství zachyceného sacharidu na začleněném N-spojeném glykosylačním místě v poloze 111.
Příklad 9: Oddělení glykoforem polypeptidu IFNB • · · · 4 • · · · · • · · · · ·· · · · · · · • · · · ·· · ·
Hydroxyapatitová chromatografie je účinný způsob separace glykoforem IFNB a získávají se například glykoformy s plně využívanými glykosylačními místy. To je zobrazeno v tomto příkladu.
Varianta IFNB [Q49N + Q51T + F111N + R113T] vznikla, jak se popisuje v příkladu 8 dokumentu PCT/DK00/00471 a izolovala se postupem ve třech krocích:
127 tt 9·
Shromážděné kultivační médium získané z otáčivých nádob se centrifugovalo a filtrovalo přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm (PVDF). Filtrované kultivační médium se podrobilo diafiltraci za použití systému Vuvaflow 200 vybaveným polyetersulfonovou membránou, který odděleju molekuly s molekulovou hmotností 10 000 a naneslo se na S-sefarózovou kolonu (od firmy Pharmacia), která se uvedla do rovnovážného stavu 50 mM acetátem sodným, 50 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Varianta interferonu vázaná na koloně se eluovala 50 mM acetátem sodným, 0,5 M chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Koncentrace chloridu sodného v eluátu ze S-sefarózové kolony se upravila na hodnotu 1 M a vzorek se aplikoval na vysoce výkonnou fenyl-sefarózovou kolonu (Pharmacia), která se uvedla do rovnovážného stavu 50 mM acetátem sodným, 1M chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Kolona se pak promyla vodou Milli Q. Varianta IFNB se eluovala gradientem v rozsahu od čisté vody Milli Q do 60 % etylenglykolu, 50 mM acetátem sodným, hodnota pH je 5,5 a použilo se 30 objemů kolony. Shromáždily se frakce obsahující zcela glykosylovanou variantu IFNB a pufr v eluátu se vyměnil za pufr obsahující 15 mM fosforečnan sodný s hodnotou pH 7,2. Vzorek se aplikoval na hydroxyapatitovou kolonu (CHT II, keramický hydroxyapatit typ II od firmy Biorad). Kolona se uvedla do rovnováhy 15 mM fosforečnanem sodným. Plně glykosylovaná forma prošla kolonou, kde se jako glykosylovaná forma s jedním volným glykosylačním místem,
128 • · · ♦ · ··· 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 99 99 99 99 vázala na kolonu a pak se eluovala lineárním gradientem fosforečnanu sodného od 15 mM do 200 mM ve 20 objemech kolony.
Čistota zcela glykosylované formy [Q49N + Q51T + F111N + R113TJIFNB se stanovila vyšší než 95 % na základě SDS-PAGE.
Příklad 10: Úprava pomocí PEG IFNB se zavedenými glykosylačními místy
Před každým experimentem se připravil čerstvý zásobní roztok SCM-PEG (sukcinimidylester karboxymetylovaného PEG od firmy Shearwater, Alabama, molekulová hmotnost 5 000 nebo 12 000) .
100 mikrolitrů 0,3 mg/ml roztoku glykovarianty [Q49N +
Q51T + F111N + R113T]IFNB v 50 mM fosforečnanu sodném, 100 mM chloridu sodném, hodnota pH 7,0 se upravilo pomocí PEG s SCMPEG s molekulovou hmotností 5 000 nebo 12 000 dvojnásobným molárním nadbytkem PEG vůči dostupným PEGylačním místům, to jsou lysiny a N-konec. Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se reakce ukončila přidáním 5 μΐ 20 mM glycinu, přičemž hodnota pH je 8,0. V tomto stádiu reakční směs obsahovala minoritní část neupraveného proteinu, která se odhadla na základě SDS-PAGE. Testování in vitro za použití primárního monitorovacího testu ukázalo, že materiál upravený PEG si uchovával 40 % aktivity s 1 až 3 skupinami zachycenými skupinami PEG s molekulovou hmotností 12 000. Materiál obsahující 1 až 3 zachycené skupiny PEG s molekulovou hmotností 5 000 si uchoval biologickou aktivitu 25 %.
V jiném exprimentu se 50 μΐ izolovaného [Q49N + Q51T + F111N + R113T]IFNB s koncentrací proteinu 0,1 mg/ml upravilo PEG v 50 mM fosforečnanu sodném, 100 mM chloridu sodném s hodnotou pH 8,0 s SCM-PEG s molekulovou hmotností 5 000 s
129
4· 44
4 4 44*4 4 4 4 • 4 4444 4 · 4
4 44 444444 V 4
44 4 4444
444 4 44 44 44 44
20-ti násobným molárním nadbytkem PEG vůči možným PEGylačním místům, což je lysin a N-konec. Po inkubaci po dobu 30 minut pří teplotě místnosti se reakce ukončila přidáním 5 μΐ 20 mM glycinu s hodnotou pH 8,0. V tomto stádiu reakční směs obsahovala minoritní část neupraveného proteinu, jak se odhadlo pomocí SDS-PAGE.
Testování in vitro za použití primárního monitorovacího testu ukázalo, že materiál upravený PEG si uchovává 45 % aktivitu s 1 až 3 zachycenými molekulami PEG o molekulové hmotnosti 5 000. K úpravě variant pomocí PEG, ve kterých se jeden až několik lysinů substituovalo jinými aminokyselinovými zbytky, je potřeba vyšší molární nadbytek PEG.
Materiál upravený PEG se oddělil od materiálu, který není upravený PEG, a nadbytku PEG za použití chromatografie s exkluzí na základě velikosti nebo chromatografií s výměnou kationtů nebo kombinací obou chromatografií. Chromatografie s exkluzí podle velikosti se provedla na koloně Superose 12 nebo Superdex 75 od firmy Pharmacia upravenou pufrem PBS s hodnotou pH 12. Chromatografie s výměnou kationtů se provedla na koloně SP-Sepharose HP (od-firmy Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 20 mM citrátem s hodnotou pH 2,7. Eluce z kolony SP-Sepharose HP se provedla buď zvyšující se koncentrací sole (například chloridem sodným) nebo zvyšující se hodnotou pH pufru (například acetátu sodného a fosforečnanu sodného).
Příklad 11: Hyperglykosylovaná varianta INF-β se stabilizovala substitucí cysteinu v poloze 17 serinem.
Buňky CHOK1 se transfekovaly plazmidy, které kódují dvě hyperglykosylovaná varianty INF-β: [S2N, N4T, Q51N, E53T]INF-β (PF276) N [S2N, N4T, C17S, Q51N, E53T]INF-β (PF279).
130 • · · · · · · « • ·· ·♦···· · · • · · · · · · · • · * «· ·· · ·
Konfluentní stabilní primární transfekční spojené kultury se každá nechala pomnožit ve čtyřech nádobách T-175. Při dosažení konfluentnost! kultury se místo kultivačního média se sérem použilo kultivační médium bez s-éra zalžené na DMEM/F-12 (LifeTechnologies, kat. č. 21045-025) doplněné 1/100 ITSA (LifeTechnologies, Kat. č. 51300-044) a l/100Ex-Cyte (Serologicals Corp., kat. č. 81-129). Každý den během 15-ti dní se shromáždilo 120 ml každé varianty a zamrazilo se při teplotě -80 °C.
Shromáždily se supernatanty s denních odběrů a filtrovaly se přes filtr s velikostí pórů 0,22 mikrometrů (založený na PVDF) . Koncentrace supenratantu se zvýšila přibližně 15 krát pomocí sytému Vivaflow 200 vybaveným polyetersulfonovou membránou, která odděluje molekuly s molekulovou hmotností 10 000 a koncentrovaný vzorek se aplikoval na S-sefarózovou kolonu, která se uvedla do rovnováhy 50 mM acetátem sodným, 50 mM NaCl s hodnotou pH 5,5. Varianta IFNB se eluovala 50 mM acetátem sodným, 0,5 M NaCl s hodnotou pH 5,5.
Koncentrace chloridu sodného v eluátu z kolony S-sefarózy se upravila na hodnotu 1,0 M a vzorek se aplikoval na fenylsefarózovou kolonu, která se uvedla do rovnováhy 50 mM acetátem sodným, 1,0 M chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Dříve, než se varianta IFNB eluovala 60 % etylenglykolem v 50 mM acetátu sodném s hodnotou pH 5,5, se provedlo extenzivní promývání pufrem pro ustanovení rovnováhy.
SDS-PAGE za neredukčních podmínek následující po izolaci jasně ukázala tvorbu dimeru s [S2N, N4T, Q51N, E53T]INF-β, kde nebyl přítomen žádný dimer s [S2N, N4T, C17S, Q51N, E53T]INFβ· • 0
131 • 0 0 0000 00 0 • 0 0000 000 • 0 «0 000000 0 0 ·0 0 0000
0000 00 00 00 00
Příklad 12: Produkce a izolace glykosylační varianty [C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T] INFB a její úprava pomocí PEG
Sub-klon CHOK1 (5/G-10) produkující glykosylační variantu [C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]INFB se vnesl do 6 rotačních lahví, kdy každá vykazuje expandovaný povrch 1 700 cm2 (Corning, USA), ve 200 ml kultivačního média DMEM/F-12 (Life technologies, Kat. č. 31330) doplněném 10 % FBS a směsí penicilin/streptomycin (P/S). Po dvou dnech kultivace se vyměnilo kultivační médium. Po dalších dvou dnech dvě otáčivé nádoby vykazovaly skoro 100 % konfluentnost a jako kultivační médium se použilo 300 ml UltraCHO bez séra (BioWhittaker, Kat. č. 12-724) doplněné 1/500 EX-Cyte (Serologicals Proteins, Kat. č. 81129a) a P/S. Rostoucí buňky v tomto kultivačním médiu produkují větší množství buněčné hmoty než se dosáhne v kultivačním médiu, které obsahuje sérum. Po dvou dnech kultivace se kultivační médium vyměnilo. Po dalších dvou dnech kultivace se jako kultivační médium použilo DMEM/F-12 (LifeTechnologies, Kat. č. 21041) doplněné 1/100 ITSA (LifeTechnologies, Kat. č. 51300-044) (ITSA tvoří inzulín (v koncentraci 1,0 g/1)-transferin (v koncentraci 0,55 g/1)selenium (v koncentraci 0,67 mg/1) doplněnek pro adherentní kultury) a 1/500 EC-CYTE a P/S. Shromážděné kultivační médium ze dvou otáčivých lahví se slilo a pak se odebraly vzorky za účelem stanovení IFNB aktivity. Každý den po dobu 21 dní se shromáždilo 1,8 1 kultivačního média a zamrazilo se při teplotě -80 °C.
Shromážděné kultivační médium získané z otáčivých nádob se centrifugovalo a filtrovalo přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm (PVDF). Filtrované kultivační médium se podrobilo diafiltraci za použití systému Vivaflow 200 vybaveným • ··· • · · ·
132 •9 ·· ·· « · · · · · * · • ···· ·« « • · · 999999 9 9
9 9 9 · · · ♦
9 9 9 99 9 9 · · polyetersulfonovou membránou, který odděleju molekuly s molekulovou hmotností 10 000 a naneslo se na S-sefarózovou kolonu (od firmy Pharmacia).
S-sefarózová kolona se uvedla do rovnovážného stavu 50 mM acetátem sodným, 50 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Varianta interferonu vázaná na koloně se eluovala 50 mM acetátem sodným, 0,5 M chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Koncentrace chloridu sodného v eluátu se upravila na hodnotu 1 M.
Eluát ze S-sefarózové kolony se aplikoval na vysoce výkonnou fenyl-sefarózovou kolonu (Pharmacia) , která se uvedla do rovnovážného stavu 50 mM acetátem sodným, 1M chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Kolona se pak promyla 50 mM acetátem sodným, 1,0 M chloridem sodným, hodnota pH je 5,5. varianta IFNB se eluovala gradientem od 50 mM acetátu sodného, 50 mM chloridu sodného s hodnotou pH 5,5 do 60 % etylenglykolu, 50 mM acetátu sodného s hodnotou pH 5,5, přičemž se použilo 30 objemů kolony. Shromáždily se frakce obsahující zcela glykosylovanou variantu IFNB.
Etylenglykol v eluátu z fenyl-sefarózy se odstranil tak, že eluát se aplikoval na S-sefarózovou kolonu, která se uvedla do rovnováhy 50 mM acetátem sodným, 50 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Etylenglykol byl v toku, kde se varianta interferonu váže na kolonu. Po aplikace se kolona promyla 20 mM acetátem sodným s hodnotou pH 5,5 a varianta interferonu se eluovala 100 mM fosforečnanenm sodným s hodnotou pH 7,5.
Koncentrace fosforečnanu v eluátu se upravila na hodnotu 1 mM pufrem fosforečnanu sodného s hodnotou pH 7,2 a aplikoval se na hydroxyapatitovou kolonu (CHT II, keramický hydroxyapatit typ II od firmy Biorad). Kolona se uvedla do ··♦· • · ···♦
133 • 4 4 · 4 44 · • 44 444444 4 4 4 44 4 4444 4 44 44 44 *4 rovnováhy 15 mM fosforečnanem sodným s hodnotou pH 7,2. Plně glykosylovaná forma prošla kolonou, kde se jako glykosylovaná forma s jedním volným glykosylačním místem, vázala na kolonu a pak se eluovala lineárním gradientem fosforečnanu sodného od 15 mM do 200 mM s hodnotou pH 6,8 ve 20 objemech kolony.
Čistota zcela glykosylovaná formy [C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]INFB se stanovila vyšší než 95 % na základě SDS-PAGE.
Po izolaci se varianta upravila PEG. Před každým experimentem se připravil čerstvý zásobní roztok SCM-PEG (sukcinimidylester karboxymetylovaného PEG od firmy Shearwater, Alabama, molekulová hmotnost 12 000 nebo 20 000) v koncentraci 10 mg/ml v 96 % etanolu.
Roztok proteinu v koncentraci 0,1 mg/ml ve 20 mM fosforečnanu sodném s hodnotou pH 7,0 se PEGyloval pomocí SCMPEG s molekulovou hmotností 20 000 s 0,75 molárním nadbytkem PEG vůči PEGylačním místům, to je lysin a N-konec. Po inkubaci po dobu 30 minut pří teplotě místnosti se reakce zastavila přidáním nadbytku 20 mM glycinu s hodnotou pH 8,0. Reakční směs obsahovala směs materiálu s jednou a dvěmi skupinami PEG a materiálu bez skupiny PEG. Materiál s jednou skupinou PEG se oddělil od jiných druhů použitím chromatografie s výměnou katíontů nebo chromatografií s exkluzí podle velikosti nebo kombinací obou metod. pH PEGylačního roztoku se upravilo na hodnotu 2,7 a vzorek se aplikoval na kolonu SP-Sefaróza HR (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 20 mM citrátem sodným s hodnotou pH 2,7. Protein upravený PEG se eluoval z kolony 50 mM acetátem sodným, který obsahuje 1 M chlorid sodný a aplikoval se na kolonu s exkluzí podle velikosti Sephacryl S-100 ((16/60) Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 100 mM acetátem sodným, 200 mM chloridem sodným
0000 • · ·· 0000
134 · 0 » · · 0 0 0 0000 «0 0 0 00 000000 0 0 • 00 0 0000 ···* 00 Μ ·0 00 s hodnotou pH 5,5. Shromáždily se frakce obsahující materiál obsahující jednu skupinu PEG a dále se charakterizovaly.
V jiném experimentu se roztok proteinu v koncentraci 0,16 mg/ml v 20 mM fosforečnanu sodném s hodnotou pH 7,0 PEGyloval pomocí SCM-PEG s molekulovou hmotností 12 000 s 2 násobným molárním nadbytkem PEG vůči možným PEGylačním místům, to je lysin a N-konec.
Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se reakce zastavila přidáním nadbytku 20 mM glycinu s hodnotou pH 8,0. Reakční směs obsahovala směs materiálu s jednou, dvěmi a třemi skupinami PEG a materiálu bez skupiny PEG. Materiál upravený PEG se oddělil od jiných druhů použitím chromatografie s výměnou kationtů nebo chromatografií s exkluzí podle velikosti nebo kombinací obou metod. pH PEGylačního roztoku se upravilo na hodnotu 2,7 a vzorek se aplikoval na kolonu SP-Sefaróza HR (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 20 mM citrátem sodným s hodnotou pH 2,7. Protein upravený PEG se eluoval z kolony 50 mM acetátem sodným, který obsahuje 1 M chlorid sodný a aplikoval se na kolonu s exkluzí podle velikostí Sephacryl S-100 ((16/60) Pharmacia) , která se uvedla do rovnováhy 100 mM acetátem sodným, 200 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Shromáždily se frakce obsahující materiál obsahující jednu, dvě a tři skupiny PEG a dále se charakterizovaly.
Příklad 13: Produkce a izolace glykosylační varianty [C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113 T]INFB a její úprava pomocí PEG v rotačních lahvích
Sub-klon CHOK1 (5/G-10) produkující glykosylační variantu [C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]INFB se *000 připravil v 6 rotačních lahví, jak se popisuje v příkladu 12 a izoloval se podle protokolu popsaném v příkladu 12. Čistota zcela glykosylované formy [C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F +F111N+R113T]INFB se stanovila vyšší než 95 % na základě SDSPAGE.
135 ( 0 00 0
Po izolaci se varianta upravila PEG. Před každým experimentem se připravil čerstvý zásobní roztok SCM-PEG (sukcinimidylester karboxymetylovaného PEG od firmy Shearwater, Alabama, molekulová hmotnost je 12 000 nebo 20
000) v etanolu.
Roztok proteinu v koncentraci 0,1 mg/ml ve 20 mM fosforečnanu sodném s hodnotou pH 7,0 se PEGyloval pomocí SCMPEG s molekulovou hmotností 20 000 s 3 násobným nadbytkem PEG vůči PEGylačním místům, to je lysin a N-konec. Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se reakce zastavila přidáním nadbytku 20 mM glycinu s hodnotou pH 8,0. Reakční směs obsahovala směs materiálu s jednou a dvěmi skupinami PEG a materiálu bez skupiny PEG. Materiál s jednou skupinou PEG se oddělil od jiných druhů použitím chromatografie s výměnou kationtů nebo chromatografií s exkluzí podle velikosti nebo kombinací obou metod. pH PEGylačního roztoku se upravilo na hodnotu 2,7 a vzorek se aplikoval na kolonu SP-Sefaróza HR (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 20 mM citrátem sodným s hodnotou pH 2,7. Protein upravený PEG se eluoval z kolony 50 mM acetátem sodným, který obsahuje 1 M chlorid sodný a aplikoval se na kolonu s exkluzí podle velikosti Sephacryl S-100 ( (16/60) Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 100 mM acetátem sodným, 200 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Shromáždily se frakce obsahující materiál obsahující jednu skupinu PEG a dále se charakterizovaly.
ΦΦΦΦ • φ φφφφ
136 *φ · φφφφ · · φ φ φ φφφφ φφφ • φ φφφ φφφ φφφ φ φφ φφ φφφφφ φφφ φ ·♦ ·· »» Φ·
V jiném experimentu se roztok proteinu v koncentraci 0,1 mg/ml v 20 mM fosforečnanu sodném s hodnotou pH 7,0 PEGyloval pomocí SCM-PEG (v koncentraci 10 mg/ml) s molekulovou hmotností 12 000 s 5 násobným molárním nadbytkem PEG vůči možným PEGylačním místům, to je lysin a N-konec. Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se reakce zastavila přidáním nadbytku 20 mM glycinu s hodnotou pH 8,0. Reakční směs obsahovala směs materiálu s jednou, dvěmi a třemi skupinami PEG a materiálu bez skupiny PEG. Materiál upravený PEG se oddělil od jiných druhů použitím chromatografie s výměnou kationtů nebo chromatografií s exkluzí podle velikosti nebo kombinací obou metod. pH PEGylačního roztoku se upravilo na hodnotu 2,7 a vzorek se aplikoval na kolonu SPSefaróza HR (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 20 mM citrátem sodným s hodnotou pH 2,7. Protein upravený PEG se eluoval z kolony 50 mM acetátem sodným, který obsahuje 1 M chlorid sodný a aplikoval se na kolonu s exkluzí podle velikosti Sephacryl S-100 ((16/60) Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 100 mM acetátem sodným, 200 mM chloridem sodným s hodnotou pH 5,5. Shromáždily se frakce obsahující materiál obsahující jednu, dvě a tři skupiny PEG a dále se charakterizovaly.
4444
137 ·« 44 ► 4 4 4 » 4 4 4 » 4 44 4 > 4 4
44
4444 »4 · ·· 44
Seznam sekvencí
SEQ ID NO: 1
acattctaac 60 | tgcaaccttt | cgaagccttt | gctctagcac | aacaggtagt | aggcgacact |
gttcgtgttg 120 | tcaacatgac | caacaagtgt | ctcctccaaa | ttgctctcct | gttgtgcttc |
tccactacag 180 | ctctttccat | gagctacaac | ttgcttggat | tcctacaaag | aagcagcaat |
tttcagtgtc 240 | agaagctcct | gtggcaattg | aatgggaggc | ttgaatactg | cctcaaggac |
aggatgaact 300 | ttgacatccc | tgaggagatt | aagcaactgc | agcagttcca | gaaggaggac |
gccgcattga 360 | ccatctatga | gatgctccag | aacatctttg | ctattttcag | acaagattca |
tctagcactg 420 | gctggaatga | gactattgtt | gagaacctcc | tggctaatgt | ctatcatcag |
ataaaccatc 480 | tgaagacagt | cctggaagaa | aaactggaga | aagaagattt | caccagggga |
aaactcatga 540 | gcagtctgca | cctgaaaaga | tattatggga | ggattctgca | ttacctgaag |
gccaaggagt 600 | acagtcactg | tgcctggacc | atagtcagag | fcggaaatcct | aaggaacttt |
tacttcatta 660 | acagacttac | aggttacctc | C 5 3- 2. S C u. CJ 3.2. | gatctcctag | cctgtgcctc |
tgggactgga 720 | caattgcttc | aagcattctt | caaccagcs.g | atgctgttta | agtgactgat |
ggctaatgta 760 | ctgcatatga | aaggacacta | gaagattttg | aaatttttat | taaattatga |
gttattttta | tttatttaaa | ttttattttg | gaaaacaaaL | tatttttggt | gcaaaagtca |
840 ···
138 • 9 · · • 99 • 9 9 9
9 9
9 ·
9 9
9 9
99 9 *
♦Φ ·*·· • 9
9
9
9 ··
SEQ ID NO: 2
MSYNLLGFLQ RSSNFQCQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQQF QKEDAALTIY
EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKED FTRGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN »*··
9« 99
9999
Claims (27)
1. Varianta lidského interferonu-β divokého typu, která má aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2, přičemž aminokyselinová sekvence uvedené varianty se liší od aminokyselinové sekvence lidského interferonu β divokého typu jedním až patnácti aminokyselinovými zbytky a aminokyselinová sekvence uvedené varianty obsahuje substituci aminokyseliny v poloze -1 vztažené ke zbytku asparagin místa N-glykosylace, na kterém je zachycena cukerná část.
2. Varianta podle nároku 1, která obsahuje alespoň jedno zavedené místo N-glykosylace.
3. Varianta podle nároku 2, kde uvedené alespoň jedno zavédéné místo N-glykosylace se zavede do polohy obsahující aminokyselinový zbytek, který vykazuje alespoň 25 % svého postranního řetězce exponovaného rozpouštědlu.
4. Varianta podle nároku 3, kde uvedené alespoň jedno zavedené místo N-glykosylace se zavedlo substitucí vybranou ze skupiny obsahující S2N+N4T/S, L9N+R11T/S,
R11N, S12N+N14T/S, F15N+C17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S,
E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F1 ΠΝ+Rl 13T/S a LllóN.
• 44«
44 4444
140
44 44
4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4
44 4 444 444 4
4 4 4 4 4 4 4
44 44 4· 44
5. Varianta podle nároku 4, kde uvedené alespoň jedno zavedené místo N-glykosylace se zavedlo substitucí vybranou ze skupiny Q49N+Q51T a F111N+R113T.
6. Varianta podle nároku 5, kde se uvedené místo N-glykosylace se zavedlo substitucemi Q49N+Q51T a kde uvedená substituce aminokyseliny v poloze -1 vztaženo ke zbytku asparagin zavedeného místa N-glykosylace se vybrala ze skupiny obsahující Q48F, Q48V, Q48W a Q48Y.
7. Varianta podle nároku 5 nebo 6, kde uvedené místo Nglykosylace se zavedlo substitucemi F111N+R113T a kde substituce aminokyseliny v poloze -1 vztaženo ke zbytku asparagin zavedeného místa N-glykosylace se vybralo ze skupiny obsahující D110F, D110V a D110Y.
D110F+F111N+R113T, C17S+D110F+F111N+R113T nebo
C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T.
11. Varianta podle nároku 10, která obsahuje následující sady mutací C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T.
12. Varianta podle libovolného z nároků 1 až 11, která se konjugovala s polymerní molekulou.
13. Varianta podle nároku 12, kde uvedená polymerní molekula je kovalentně zachycena na ε-aminoskupinu lysinového zbytku.
♦ 9 4
4 4 4
4 494 9
4 9
99 49 • 999
141
94 9999
9 9 4
4 4 4
4 4 4 4
4* 94
14. Varianta podle nároku 12, kde uvedená polymerní molekula je kovalentně zachycena na N-terminální aminoskupinu.
15. Varianta podle libovolného z nároků 12 až 14, kde uvedená polymerní molekula je lineární nebo větvený polyetylenglykol.
16. Varianta podle libovolného z nároků 12 až 15, kde se odstranil alespoň jeden lysinový zbytek.
17. Varianta podle nároku 16, kde uvedený alespoň jeden odstraněný lysinový zbytek se vybral ze skupiny obsahující K19, K33, K45 a K123.
18. Varianta podle nároku 17, kde uvedený lysinový zbytek se odstranil substitucí vybranou ze skupiny zahrnující K19R, K33R, K45R a K123R.
19. Varianta podle libovolného z nároků 12 až 15 obsahující následující sady mutací C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T.
20. Varianta podle libovolného z nároků 12 až 18 obsahující následující sady mutací C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+ D110F+F111N+R113T.
21. Varianta podle nároku 19 nebo 20, kde uvedená polymerní molekula je lineární polyetylenglykol, který má molekulovou hmotnost přibližně 20 000.
22. Varianta podle nároku 19 nebo 20, kde kde uvedená polymerní molekula je lineární polyetylenglykol, který má molekulovou hmotnost přibližně 12 000.
·♦·« • 9 ·«·9
142 ·« ·· • · 9 · 9 • 9 9 9 9 • 9 9 · »·· 9 • 9 9 9 »9« * 99 ♦♦
23. Nukleotidová sekvence kódující variantu podle libovolného z nároků 1 až 22.
24. Expresívní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle nároku 23.
25. Glykosylující hostitelská buňka obsahující nukleotidovou sekvenci podle nároku 23 nebo expresívní vektor podle nároku 24.
26. Hostitelská buňka podle nároku 25, kterou je buňka CHO.
27. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje variantu podle libovolného z nároků 1 až 22 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo adjuvans.
28. Varianta podle libovolného z nároků 1 až 22 pro použití jako léčebný prostředek.
29. Použití varianty podle libovolného z nároků 1 až 22 pro výrobu léčebného prostředku pro léčbu roztroušené sklerózy.
30. Způsob zesílení glykosylace in vivo mateřské molekuly interferonu β (IFNB), která obsahuje alespoň jedno .místo glykosylace, vyznačující se tím, že zahrnuj e:
i) substituci aminokyselinového zbytku, který se nachází v první poloze lokalizované v poloze -1 vztažené k asparaginovému zbytku místa N-glykosylace, na kterém je zachycena cukerná část, druhým aminokyselinovým zbytkem za vzniku varianty molekuly IFNB, • ·» «
143 • · • « »· · * • · ·<* « ·
999 9 9 « » ·* ··« · • · · • 9 ·« li) měření stupně glykosylace varianty vztaženo ke glykosylaci mateřské molekuly IFNB, získané expresí v glykosylující hostitelské buňce za srovnatelných podmínek.
iii) jestliže je to nezbytné, opakování kroku popsaného v odstavci i) , aby došlo k substituci druhého aminokyselinového zybtku třetím aminokyselinovým zbytkem, a opakování kroku popsaného v odstavci ii) buď mateřské molekuly nebo molekuly varianty, která je výsledkem kroku popsaného v odstavci i) a iv) jestliže je to nezbytné, opakování kroků popsaných v odstavci i) až iii) až do dosažení zvýšené glykosylace ín vivo.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200100323 | 2001-02-27 | ||
DKPA200100333 | 2001-03-01 | ||
DKPA200101040 | 2001-06-29 | ||
DKPA200101277 | 2001-08-30 | ||
DKPA200101954 | 2001-12-21 | ||
DKPA200200257 | 2002-02-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20032526A3 true CZ20032526A3 (cs) | 2003-12-17 |
Family
ID=27545246
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20032526A CZ20032526A3 (cs) | 2001-02-27 | 2002-02-26 | Nové molekuly podobné interferonu beta |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2080771A3 (cs) |
JP (1) | JP2004534523A (cs) |
AT (1) | ATE432288T1 (cs) |
BR (1) | BR0207576A (cs) |
CA (1) | CA2469846A1 (cs) |
CZ (1) | CZ20032526A3 (cs) |
DE (1) | DE60232434D1 (cs) |
HU (1) | HUP0303251A2 (cs) |
IL (1) | IL156059A0 (cs) |
IS (1) | IS6927A (cs) |
MX (1) | MXPA03007619A (cs) |
NO (1) | NO20033781D0 (cs) |
PL (1) | PL367154A1 (cs) |
RU (1) | RU2003128955A (cs) |
SK (1) | SK11882003A3 (cs) |
WO (1) | WO2002074806A2 (cs) |
YU (1) | YU48703A (cs) |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
EP2279755B1 (en) | 2001-10-10 | 2014-02-26 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Fibroblast Growth Factor (FGF) |
US7297511B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-11-20 | Neose Technologies, Inc. | Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha |
US7265085B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7399613B2 (en) | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
US7439043B2 (en) | 2001-10-10 | 2008-10-21 | Neose Technologies, Inc. | Galactosyl nucleotide sugars |
US7179617B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
US7226903B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-06-05 | Neose Technologies, Inc. | Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta |
US7265084B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7125843B2 (en) | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
US7473680B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
WO2003061577A2 (en) | 2002-01-18 | 2003-07-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound |
AU2003254641A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
EA009289B1 (ru) * | 2002-09-27 | 2007-12-28 | Байоджен Айдек Ма Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩЕЙ ПОЛИНЕВРОПАТИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ β-ИНТЕРФЕРОНА |
RS20050502A (en) * | 2002-12-26 | 2007-08-03 | Mountain View Pharmaceuticals Inc., | Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency |
BRPI0408358A (pt) | 2003-03-14 | 2006-03-21 | Neose Technologies Inc | polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
EP1613261A4 (en) | 2003-04-09 | 2011-01-26 | Novo Nordisk As | INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES |
AU2004240553A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-12-02 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US7842661B2 (en) | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20070254834A1 (en) | 2003-11-24 | 2007-11-01 | Defrees Shawn | Glycopegylated Erythropoietin |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
CN1913917B (zh) * | 2003-12-31 | 2012-02-01 | 正统逻辑公司 | 凝血酶肽衍生物的药物组合物 |
CA2552892C (en) | 2004-01-08 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
DE602005019038D1 (de) | 2004-05-04 | 2010-03-11 | Novo Nordisk Healthcare Ag | O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
US8268967B2 (en) | 2004-09-10 | 2012-09-18 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated interferon α |
EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
US20080255026A1 (en) | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
CA2611836A1 (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-21 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Transmucosal delivery of peptide derivatives |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20080219952A1 (en) * | 2005-08-26 | 2008-09-11 | Ares Trading S.A. | Process For the Preparation of Glycosylated Interferon Beta |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
CA2658715A1 (en) * | 2006-08-08 | 2008-02-21 | Novartis Ag | Recombinant interferon-beta with enhanced biological activity |
WO2008057683A2 (en) | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
KR20100016160A (ko) | 2007-04-03 | 2010-02-12 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코페길화 g―csf를 이용하는 치료 방법 |
WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
US7625555B2 (en) | 2007-06-18 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human interferon-like proteins |
US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
ES2476690T3 (es) | 2008-02-27 | 2014-07-15 | Novo Nordisk A/S | Moléculas conjugadas del Factor VIII |
IN2014CN02982A (cs) | 2011-10-01 | 2015-07-03 | Glytech Inc | |
WO2014049588A1 (en) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | University College Dublin, National University Of Ireland, Dublin | A method for treatment of pulmonary fibrosis and diagnosis or prognosis of an aggressive pulmonary fibrosis phenotype |
BR112015024423B1 (pt) * | 2013-03-29 | 2023-04-25 | Glytech, Inc | Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado |
US9579628B2 (en) | 2015-04-15 | 2017-02-28 | Air Products And Chemicals, Inc. | Perforated adsorbent particles |
Family Cites Families (118)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
FR2351665A1 (fr) | 1976-05-21 | 1977-12-16 | Elf Aquitaine | Procede de purification de preparations possedant notamment une activite interferon, preparations purifiees ainsi obtenues et leur application en tant que medicament |
JPS5564799A (en) | 1978-11-07 | 1980-05-15 | Toray Ind Inc | Multi-stage concentration and purification of interferon originated from human fibroblast |
US4289689A (en) | 1980-03-14 | 1981-09-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Preparation of homogeneous human fibroblast interferon |
NL7907791A (nl) | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
JP2687995B2 (ja) | 1980-04-03 | 1997-12-08 | バイオゲン インコーポレイテッド | Dna配列、組替えdna分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 |
JPS58110600A (ja) | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
JPS58201794A (ja) | 1982-05-17 | 1983-11-24 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
US4470461A (en) | 1982-09-30 | 1984-09-11 | Phillips Petroleum Company | Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes |
US4588585A (en) | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
US4966843A (en) | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
US4485017A (en) | 1982-12-22 | 1984-11-27 | Cetus Corporation | Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography |
CA1231306A (en) | 1983-03-03 | 1988-01-12 | Erich Hochuli | Purification of interferon |
GB8317880D0 (en) | 1983-07-01 | 1983-08-03 | Searle & Co | Structure and synthesis of interferons |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
GB8412564D0 (en) | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
US4931373A (en) | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
GB8430252D0 (en) | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
WO1987000056A1 (en) | 1985-06-26 | 1987-01-15 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5679543A (en) | 1985-08-29 | 1997-10-21 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi |
EP0243465A1 (en) | 1985-10-25 | 1987-11-04 | Vivian L. Mackay | Method of using bar1 for secreting foreign proteins |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
JPS63502716A (ja) | 1986-03-07 | 1988-10-13 | マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー | 糖タンパク安定性の強化方法 |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
EP0260350B1 (en) | 1986-09-05 | 1992-02-12 | Cetus Oncology Corporation | Oxidation-resistant interferon-beta muteins and their production; formulations containing such muteins |
US5183746A (en) | 1986-10-27 | 1993-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- |
DE3712564A1 (de) | 1987-04-14 | 1988-11-24 | Bioferon Biochem Substanz | Verfahren zur konstruktion einer animalen zellinie fuer die herstellung von humanem interferon-beta |
US4904584A (en) | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
GB8809129D0 (en) | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Celltech Ltd | Recombinant dna methods vectors and host cells |
US5218092A (en) | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
US5349052A (en) | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
GB8824591D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
AU4647889A (en) | 1988-11-18 | 1990-06-12 | Cetus Corporation | Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins |
US5041376A (en) | 1988-12-09 | 1991-08-20 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Method for identifying or shielding functional sites or epitopes of proteins that enter the exocytotic pathway of eukaryotic cells, the mutant proteins so produced and genes encoding said mutant proteins |
US5047335A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | The Regents Of The University Of Calif. | Process for controlling intracellular glycosylation of proteins |
ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
US4902502A (en) | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US5122614A (en) | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
EP0470128B2 (en) | 1989-04-19 | 2003-08-13 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
ES2085297T3 (es) | 1989-05-27 | 1996-06-01 | Sumitomo Pharma | Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada. |
US5077214A (en) | 1989-07-07 | 1991-12-31 | The Texas A&M University System | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells |
FR2650598B1 (fr) | 1989-08-03 | 1994-06-03 | Rhone Poulenc Sante | Derives de l'albumine a fonction therapeutique |
US5023328A (en) | 1989-08-04 | 1991-06-11 | The Texas A&M University System | Lepidopteran AKH signal sequence |
US5219564A (en) | 1990-07-06 | 1993-06-15 | Enzon, Inc. | Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon |
WO1992008790A1 (en) | 1990-11-14 | 1992-05-29 | Cargill, Incorporated | Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins |
US5404871A (en) | 1991-03-05 | 1995-04-11 | Aradigm | Delivery of aerosol medications for inspiration |
US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
JPH06506217A (ja) | 1991-03-18 | 1994-07-14 | エンゾン,インコーポレーテッド | ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体 |
US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
US5281698A (en) | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
DE4128319A1 (de) | 1991-08-27 | 1993-03-04 | Bioferon Biochem Substanz | Neues rekombinantes human-ifn-beta, verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
EP0551535A1 (en) | 1992-01-13 | 1993-07-21 | SCLAVO S.p.A. | Process for the purification of recombinant human beta interferon, beta interferon thus purified, and pharmaceutical compositions which contain them |
FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
FR2686901A1 (fr) | 1992-01-31 | 1993-08-06 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
ZA933926B (en) | 1992-06-17 | 1994-01-03 | Amgen Inc | Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules |
US5785049A (en) | 1994-09-21 | 1998-07-28 | Inhale Therapeutic Systems | Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments |
WO1994004193A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Enzon, Inc. | Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances |
US5382657A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
NZ250375A (en) | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
US5298643A (en) | 1992-12-22 | 1994-03-29 | Enzon, Inc. | Aryl imidate activated polyalkylene oxides |
US5349001A (en) | 1993-01-19 | 1994-09-20 | Enzon, Inc. | Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides |
US5915378A (en) | 1993-01-29 | 1999-06-29 | Aradigm Corporation | Creating an aerosolized formulation of insulin |
US5934272A (en) | 1993-01-29 | 1999-08-10 | Aradigm Corporation | Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug |
US5558085A (en) | 1993-01-29 | 1996-09-24 | Aradigm Corporation | Intrapulmonary delivery of peptide drugs |
US5321095A (en) | 1993-02-02 | 1994-06-14 | Enzon, Inc. | Azlactone activated polyalkylene oxides |
IL104734A0 (en) | 1993-02-15 | 1993-06-10 | Univ Bar Ilan | Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds |
WO1994028024A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
WO1995000162A1 (en) | 1993-06-21 | 1995-01-05 | Enzon, Inc. | Site specific synthesis of conjugated peptides |
GB9317618D0 (en) | 1993-08-24 | 1993-10-06 | Royal Free Hosp School Med | Polymer modifications |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
DK0730470T3 (da) | 1993-11-10 | 2002-06-03 | Enzon Inc | Forbedrede interferonpolymerkonjugater |
US5951974A (en) | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
US5446090A (en) | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
KR100419037B1 (ko) | 1994-03-07 | 2004-06-12 | 넥타르 테라퓨틱스 | 폐를통한인슐린의전달방법및그조성물 |
US5545723A (en) | 1994-03-15 | 1996-08-13 | Biogen Inc. | Muteins of IFN-β |
US5473034A (en) | 1994-03-18 | 1995-12-05 | Hyogo Prefectural Government | Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby |
US5629384A (en) | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
CN1073119C (zh) | 1994-05-18 | 2001-10-17 | 吸入治疗系统公司 | 干扰素干粉配方的方法及组合物 |
WO1995033490A1 (en) | 1994-06-02 | 1995-12-14 | Enzon, Inc. | Method of solubilizing substantially water insoluble materials |
US5730990A (en) | 1994-06-24 | 1998-03-24 | Enzon, Inc. | Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates |
WO1996000787A1 (en) | 1994-06-30 | 1996-01-11 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
WO1996006181A1 (fr) | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Drug Delivery System Institute, Ltd. | Procede de modification de proteine |
US5650234A (en) | 1994-09-09 | 1997-07-22 | Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. | Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces |
US5522385A (en) | 1994-09-27 | 1996-06-04 | Aradigm Corporation | Dynamic particle size control for aerosolized drug delivery |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
DE4437604A1 (de) | 1994-10-21 | 1996-04-25 | Basf Ag | Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung |
WO1996041813A2 (en) | 1994-11-09 | 1996-12-27 | Offord Robin E | Functionalized polymers for site-specific attachment |
US5738846A (en) | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5780014A (en) | 1995-04-14 | 1998-07-14 | Inhale Therapeutic Systems | Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin |
US5654007A (en) | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Inhale Therapeutic Systems | Methods and system for processing dispersible fine powders |
AU5893696A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
US5747639A (en) | 1996-03-06 | 1998-05-05 | Amgen Boulder Inc. | Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols |
TW517067B (en) | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
WO1998005363A2 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer |
US5976574A (en) | 1996-12-31 | 1999-11-02 | Inhale Therapeutic Systems | Processes for spray drying hydrophobic drugs in organic solvent suspensions |
AU5773798A (en) | 1997-01-29 | 1998-08-18 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Pegylation process |
DE19717864C2 (de) | 1997-04-23 | 2001-05-17 | Fraunhofer Ges Forschung | Humanes rekombinantes Interferon-beta, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
JP4187277B2 (ja) | 1997-04-30 | 2008-11-26 | エンゾン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 |
US6583267B2 (en) | 1997-06-06 | 2003-06-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Chemically modified polypeptides |
EP1012184B1 (en) * | 1997-07-14 | 2007-10-10 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US5855564A (en) | 1997-08-20 | 1999-01-05 | Aradigm Corporation | Aerosol extrusion mechanism |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US5981709A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
JP4574007B2 (ja) | 1998-04-28 | 2010-11-04 | メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム | ポリオール−ifn−ベータ複体 |
US6451986B1 (en) | 1998-06-22 | 2002-09-17 | Immunex Corporation | Site specific protein modification |
DE69930015T2 (de) | 1998-10-16 | 2006-10-12 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Polymerkonjugate von interferon-beta-1a und deren verwendungen |
BR9915548A (pt) | 1998-10-16 | 2001-08-14 | Biogen Inc | Proteìnas de fusão de interferon-beta e usos |
DE69936351T2 (de) | 1998-10-30 | 2008-02-21 | Novozymes A/S | Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität |
JP2003527090A (ja) | 1999-08-27 | 2003-09-16 | マキシゲン・エイピーエス | 新規なインターフェロンベータ様分子 |
-
2002
- 2002-02-26 AT AT02702228T patent/ATE432288T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-26 RU RU2003128955/13A patent/RU2003128955A/ru not_active Application Discontinuation
- 2002-02-26 PL PL02367154A patent/PL367154A1/xx unknown
- 2002-02-26 MX MXPA03007619A patent/MXPA03007619A/es unknown
- 2002-02-26 EP EP09075066A patent/EP2080771A3/en not_active Withdrawn
- 2002-02-26 WO PCT/DK2002/000128 patent/WO2002074806A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-02-26 CA CA002469846A patent/CA2469846A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-26 BR BR0207576-8A patent/BR0207576A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-02-26 HU HU0303251A patent/HUP0303251A2/hu unknown
- 2002-02-26 IL IL15605902A patent/IL156059A0/xx unknown
- 2002-02-26 DE DE60232434T patent/DE60232434D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 YU YU48703A patent/YU48703A/sh unknown
- 2002-02-26 EP EP02702228A patent/EP1366075B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 CZ CZ20032526A patent/CZ20032526A3/cs unknown
- 2002-02-26 JP JP2002573813A patent/JP2004534523A/ja active Pending
- 2002-02-26 SK SK1188-2003A patent/SK11882003A3/sk unknown
-
2003
- 2003-08-26 NO NO20033781A patent/NO20033781D0/no not_active Application Discontinuation
- 2003-08-26 IS IS6927A patent/IS6927A/is unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002074806A2 (en) | 2002-09-26 |
BR0207576A (pt) | 2004-04-27 |
PL367154A1 (en) | 2005-02-21 |
EP2080771A2 (en) | 2009-07-22 |
MXPA03007619A (es) | 2003-12-04 |
IS6927A (is) | 2003-08-26 |
RU2003128955A (ru) | 2005-04-10 |
CA2469846A1 (en) | 2002-09-26 |
NO20033781L (no) | 2003-08-26 |
NO20033781D0 (no) | 2003-08-26 |
DE60232434D1 (de) | 2009-07-09 |
JP2004534523A (ja) | 2004-11-18 |
EP2080771A3 (en) | 2010-01-06 |
IL156059A0 (en) | 2003-12-23 |
WO2002074806A3 (en) | 2003-05-01 |
ATE432288T1 (de) | 2009-06-15 |
SK11882003A3 (sk) | 2004-03-02 |
EP1366075A2 (en) | 2003-12-03 |
HUP0303251A2 (hu) | 2003-12-29 |
YU48703A (sh) | 2006-05-25 |
EP1366075B1 (en) | 2009-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ20032526A3 (cs) | Nové molekuly podobné interferonu beta | |
US7338788B2 (en) | Interferon-β variants and conjugates | |
US7504237B2 (en) | Polynucleotides encoding interferon gamma polypeptides | |
US7144574B2 (en) | Interferon β variants and conjugates | |
US20090030183A1 (en) | Interferon Beta-Like Molecules | |
US20030186386A1 (en) | Interleukin 10 | |
WO2001015736A2 (en) | Interferon-beta conjugates | |
US7230081B1 (en) | Interferon gamma conjugates | |
US20020169290A1 (en) | New multimeric interferon beta polypeptides | |
US7524931B2 (en) | Full-length interferon gamma polypeptide variants | |
WO2002036628A2 (en) | New multimeric interferon beta polypeptides | |
AU2002235727A1 (en) | New interferon beta-like molecules | |
ZA200303964B (en) | New interferon beta-like molecules. | |
ZA200200337B (en) | New interferon beta-like molecules. | |
AU1270101A (en) | Interferon gamma conjugates | |
CZ20033016A3 (cs) | Varianty polpeptidu interferonu gamma |