CZ20022727A3 - Polypeptidový konjugát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Polypeptidový konjugát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových polypeptidů inhibujících faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), konjugátů mezi polypeptidem s aktivitou G-CSF a nepolypeptidovou částí, způsobu výroby těchto polypeptidů nebo konjugátů a použití těchto polypeptidů nebo konjugátů při léčení, zvláště pro léčení leukopenie.

Dosavadní stav techniky

Proces, při kterém bílé krvinky rostou, dělí se a podléhají diferenciaci v kostní dřeni, se nazývá hematopoéza (Dexter a Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3: 423, 1987). Každý z typů krevních buněk pochází z univerzálních kmenových buněk. Existují obecně tři třídy krevních buněk, které se produkují in vivo: červené krvinky (erythrocyty), krevní destičky a bílé krvinky (leukocyty), přičemž většina bílých krvinek se účastní imunitní obrany hostitele. Proliferace a diferenciace hematopoetických prekurzorových buněk jsou regulovány skupinou cytokinů, včeně faktorů stimulujících kolonie (colony stimulating factors, CSF) jako je G-CSF a interleukiny (Arai a další, Ann. Rev. Biochem., 59: 783 - 836, 1990). Hlavním biologickým účinkem G-CSF in vivo je stimulace růstu a vývoje některých bílých krvinek známých jako neutrofilní granulocyty nebo neutrofily (Welte a další, PNAS-USA 82: 1526 - 1530, 1985, Souza a další, Science, 232:

61 - 65, 1986). Při uvolnění do krevního řečiště je funkcí neutrofilních granulocytů boj s bakteriální infekcí.

Aminokyselinová sekvence lidského G-CSF (hG-CSF) byla uvedena v článku Nagata a další, Nátuře 319: 415 - 418, 1986. hG-

• ·

CSF je monomemí protein, který dimeruje receptor pro G-CSF vytvořením komplexu 2 : 2 dvou molekul G-CSF a dvou receptorů (Horan a další (1996), Biochemistry 35 (15): 4886 - 96). Aritomi a další, Nátuře 401: 713 - 717, 1999 popsali rentgenovou strukturu komplexu mezi hG-CSF a doménami BN-BC receptoru G-CSF. Tito autoři identifikovali následující zbytky faktoru hG-CSF jako součást vazebných rozhraní receptoru: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 a L124. Exprese rhG-CSF v Escherichia coli, Saccharomyces io cerevisiae a savčích buňkách byla již také popsána (Souza a další, Science 232: 61 - 65, 1986, Nagata a další, Nátuře 319: 415 - 418,

1986, Robinson a Wittrup, Biotechnol. Prog. 11: 171 - 177, 1985).

Rekombinantní lidský G-CSF (rhG-CSF) se obecně používá pro léčení různých forem leukopenie. Jsou tedy dostupné komerční is preparáty rhG-CSF pod názvy filgrastim (Gran® a Neupogen®), lenograstim (Neutrogin® a Granocyte®) a nartograstim (Neu-up®). Gran® a Neupogen® jsou neglykosylované a produkované rekombinantními buňkami E. coli. Neutrogin® a Granocyte® jsou glykosylované a produkované v rekombinantních buňkách CHO, a

Neu-up® je neglykosylovaný s pěti aminokyselinami substituovanými v N-koncové oblasti intaktního rhG-CSF produkovaného v rekombinantních buňkách E. coli.

Bylo ohlášeno několik variant hG-CSF získaných metodami proteinového inženýrství (US 5,581,476, US 5,214,132, US 5,362,853,

US 4,904,584 a Riedhaar-Olson a další, Biochemistry 35: 9034 - 9041, 1996). Modifikace faktoru hG-CSF a jiných polypeptidů s cílem zavést alespoň jeden další uhlohydrátový řetězec ve srovnání s nativním polypeptidem byla již navržena (US 5,218,092). Uvádí se, že aminokyselinová sekvence tohoto polypeptidu může být modifikována substitucí aminokyselin, delecí aminokyselin nebo inzercí aminokyselin tak, aby bylo možno přidat další uhlohydrátový řetězec. Navíc již byly popsány polymerní modifikace nativního hG-CSF včetně navázání • ·

-S skupin PEG (Satake-lshikawa a další, Cell Structure and Function 17: 157 - 160, 1992, US 5,824,778, US 5,824,784, WO 96/11953, WO 95/21629, WO 94/20069).

Bowen a další, Experimental Hematology 27 (1999), 425 - 432 popisují studii vztahu mezi molekulovou hmotností a trváním účinku muteinu G-CSF konjugovaného s PEG. Byl navržen zdánlivě inverzní vztah mezi molekulovou hmotností skupin PEG konjugovaných k proteinu a aktivitou in vitro, zatímco aktivity in vivo se stoupající molekulovou hmotností vzrůstaly. Předpokládá se, že nižší afinita ío konjugátů působí zvyšování poločasu, protože důležitým mechanismem regulujícím hladiny hematopoetických růstových faktorů je endocytóza zprostředkovaná receptory.

Komerčně dostupný rhG-CSF má krátkodobý farmakologický účinek a po dobu trvání leukopenického stavu musí být často podáván více než jedenkrát denně. Molekula s delším poločasem v oběhu by snížila počet podání nezbytných pro zmírnění leukopenie a zabránila by z toho vyplývajícím infekcím. Další problém s produkty rG-CSF dostupnými v současnosti je výskyt bolesti kostí v závislosti na dávce. Protože bolest kostí pacienti vnímají jako významný vedlejší účinek léčení rG-CSF, bylo by žádoucí poskytnout produkt rG-CSF, který nezpůsobuje bolest kostí, buď poskytnutím produktu, který tento účinek nemá jako takový, nebo produktu, který je účinný v dostatečně malé dávce, aby bolest kostí nezpůsoboval. Je tedy jasná potřeba zlepšených rekombinantních molekul podobných G-CSF.

Co se týče poločasu, jedním způsobem pro zvýšení poločasu proteinu v krevním oběhu je zajištění snížení vylučování proteinu, zvláště vylučování ledvinami a vylučování zprostředkovaného receptoru. To může být dosaženo konjugací proteinu k chemické skupině, která je schopná zvýšit jeho zdánlivou velikost, čímž je možno snížit vylučování ledvinami a zvýšit poločas in vivo. Dále může navázání chemické skupiny na protein účinně blokovat styk proteinu • · s proteolytickými enzymy, takže je možno zabránit degradaci nespecifickou proteolýzou. Polyethylenglykol (PEG) je jednou takovou chemickou skupinou, která se používá při přípravě proteinových produktů pro léčebné účely. Molekula G-CSP modifikovaná jedinou, N5 koncově navázanou skupinou PEG, nazývaná SD/01, se v současnosti klinicky testuje. I když bylo ukázáno, že PEGylovaná molekula G-CSF má zvýšený poločas ve srovnání s nePEGylovaným faktorem G-CSF, má nízkou aktivitu a musí být tedy podávána v poměrně vysokých dávkách. Výsledkem je, že výše diskutovaný problém v souvislosti s bolestí kostí nebyl touto molekulou vyřešen. Navíc existuje stále ještě značný prostor pro zlepšování známých molekul G-CSF z hlediska poločasu.

Stále existuje potřeba poskytnout nové molekuly s aktivitou GCSF, které jsou použitelné při léčbě leukopenie, a které mají zlepšené vlastnosti z hlediska zvýšeného poločasu a snížených vedlejších účinků. Předkládaný vynález se týká právě takových molekul.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se konkrétněji týká specifických konjugátů obsahujících polypeptid s aktivitou G-CSP a nepolypeptidovou část, způsobu jejich přípravy a jejich použití v lékařství a při výrobě farmaceutických prostředků. První provedení předkládaného vynálezu se tedy týká různých specifických konjugátů obsahujících polypeptid s aktivitou G-CSF, které mají aminokyselinovou sekvenci odlišnou od známé aminokyselinové sekvence lidského G-CSF, jak je ukázána v SEQ ID No. 1, v alespoň jednom specificky změněném zbytku aminokyseliny, obsahujícím vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, a obsahujících alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na vazebnou skupinu polypeptidu. Konjugát podle předkládaného vynálezu má jednu nebo více zlepšených vlastností ve srovnání s komerčně dostupným faktorem rhG-CSF, včetně zvýšeného funkčního poločasu in vivo, zvýšeného poločasu v séru, snížených vedlejších účinků, snížené imunogenicity a/nebo zvýšené biologické dostupnosti. Léčení konjugátem podle předkládaného vynálezu tedy nabízí řadu výhod ve srovnání s dosud dostupnými sloučeninami GCSF.

V dalším provedení se vynález týká polypeptidů s aktivitou GCSF, které tvoří část konjugátu podle vynálezu. Předpokládá se, že polypeptidy podle vynálezu budou použitelné jako takové pro léčebné, diagnostické nebo jiné účely, ale zvláště zajímavé budou jako meziprodukty pro přípravu konjugátu podle vynálezu.

Další provedení vynálezu se týká konjugátu polypeptidu obsahujícího polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, odlišnou od aminokyselinové sekvence hG-CSF (jehož aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No. 1) v alespoň jednom aminokyselinovém zbytku zvoleném ze zavedeného nebo odstraněného aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, a který obsahuje dostatečný počet nebo typ nepolypeptidových skupin pro poskytnutí konjugátu se zvýšeným poločasem ve srovnání se známými produkty rekombinantního G-CSF.

V ještě dalších provedeních se vynález týká způsobu přípravy konjugátu podle vynálezu, včetně nukleotidových sekvencí kódujících polypeptid podle vynálezu, expresních vektorů obsahujících takovou nukleotidovou sekvenci a hostitelských buněk obsahujících takovou nukleotidovou sekvenci nebo expresní vektor.

V posledních provedeních se vynález týká prostředku obsahujícího konjugát nebo polypeptid podle vynálezu, způsobu výroby farmaceutického prostředku, použití konjugátu nebo prostředku podle vynálezu jako léčiva a způsobu léčení savce takovým prostředkem. Polypeptid, konjugát nebo prostředek podle vynálezu

- θ· - · · ···· ··· může být použit zvláště pro prevenci infekce pacientů s rakovinou léčených některými typy radiační terapie, chemoterapie a transplantací kostní dřeně, pro mobilizaci prekurzorových buněk pro odběr prekurzorových buněk z periferní krve pro transplantace, pro léčení těžkých chronických a jiných leukopenií bez ohledu na příčinu, a pro podporu léčení pacientů s akutní myeloidní leukémií. Polypeptid, konjugát nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu mohou být použity pro léčení AIDS nebo jiných imunodeficitních onemocnění stejně jako bakteriálních infekcí.

Podrobný popis vynálezu

Definice

V rámci předkládané přihlášky a vynálezu platí následující definice:

Termín „konjugát“ označuje heterogenní molekulu vytvořenou kovalentním navázáním jednoho nebo více polypeptidů, typicky jednoho polypeptidu, na jednu nebo více nepolypeptidových částí jako jsou polymerní molekuly, lipofilní sloučeniny, uhlohydrátové skupiny nebo organické derivatizační prostředky. Termín kovalentní navázání znamená, že polypeptid a nepolypeptidová část jsou buď vzájemné přímo kovalentně navázány, nebo jiným způsobem nepřímo vzájemně kovalentně spojeny prostřednictvím vložené skupiny nebo skupin, jako je můstek, mezerník, nebo vazebná skupina nebo skupiny. Tento konjugát je s výhodou v používaných koncentracích a podmínkách rozpustný, tj. rozpustný ve fyziologických tekutinách jako je krev. Termín „nekonjugovaný polypeptid“ může být použit pro polypeptidovou část konjugátu.

Termín „polypeptid“ může být použit zaměnitelně s termínem „protein“.

• · · • · ·· • « • · „Molekula polymeru“ je molekula vytvořená kovalentní vazbou dvou nebo více monomerů, přičemž žádný z monomerů není aminokyselinový zbytek, s výjimkou případů, kde polymerem je lidský albumin nebo jiný protein přítomný ve velkém množství v plasmě.

Termín „polymer“ se může používat zaměnitelně s termínem „molekula polymeru“. Tento termín má zahrnovat uhlohydrátové molekuly, i když normálně tento termín nemá zahrnovat typ uhlohydrátové molekuly, která je na polypeptid navázána N- nebo O-glykosylací in vivo (jak bude podrobněji popsáno dále), protože taková molekula se zde io označuje jako „skupina oligosacharidů“. Kromě případů, kdy bude počet molekul polymeru výslovně uveden, má každý odkaz na „některý polymer“, „některou molekulu polymeru“, „polymer“ nebo „molekulu polymeru“ obsažené v polypeptidu podle předkládaného vynálezu, nebo použitý jinak v předkládaném vynálezu, znamenat jednu nebo více molekul polymeru.

Termín „vazebná skupina“ má označovat skupinu zbytku aminokyseliny polypeptidu schopnou navázat příslušnou nepolypeptidovou skupinu. Například v případě konjugace polymeru, zvláště k PEG, je často používanou vazebnou skupinou ε20 aminoskupina lysinu nebo N-koncová aminoskupina. Mezi další vazebné skupiny polymeru patří volná skupina karboxylové kyseliny (například C-koncová aminokyselina nebo zbytek kyseliny asparagové nebo glutamové) vhodné aktivované karbonylové skupiny, skupiny oxidovaných uhlohydrátů a merkaptoskupiny. Použitelné vazebné skupiny a jim odpovídající nepeptidové části jsou zřejmé z následující tabulky.

• 4 • · t 4 · · « · · • ·· · · * • · · · · 4 · • · · · · ·

Vazebná skupina	Amino- kyselina	Příklady nepeptidové skupiny	Metoda konjugace/aktivovaný PEG	Odkaz
-NH2	N-koncový Lys, His, Arg	Polymer, např. PEG, s amidovou nebo iminovou skupinou	mPEG-SPA tresylovaný mPEG	Shearwater Inc. Delgado a další, critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4): 249-304 (1992)
-COOH	C-koncový, Asp, Glu	Polymer, např. PEG, s esterovou nebo amidovou skupinou oligosacharidová skupina	mPEG-Hz Vazba in vitro	Shearwater Inc.
-SH	Cys	Polymer, např. PEG, s disulfidovou, maleimidovou nebo vinylsulfonovou skupinou oligosacharidová skupina	PEG- vinylsulfon PEG- maleimid Vazba in vitro	Shearwater Inc. Delgado a další, kritické přehledné články v Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4): 249 - 304 (1992)
-OH	Ser, Thr, -OH, Lys	Oligosacharidová skupina PEG s esterem, etherem, karbamátem, karbonátem	in vivo O-glykosylace
-CONH2	Asn jako součást N- glykosylač- ního místa	Oligosacharidová skupina Polymer, např. PEG	in vivo N-glykosylace
Aromatický zbytek	Phe, Tyr, Trp	Oligosacharidová skupina	Vazba in vitro
-conh2	Gin	Oligosacharidová skupina	Vazba in vitro	Yan a Wold, Biochemistry, 1984, 31 .červenec; 23(16): 3759 - 65

-9*-, • : r j • · · · • · ·* · · · 9

Aldehyd Keton	Oxidovaný oligo- sacharid	Polymer, např. PEG, PEG- hydrazid	PEGylace	Andresz a další, 1978, Makromol. Chem. 179: 301, WO 92/16555, WO 00/23114
Guanidino	Arg	Oligosacharidová skupina	Vazba in vitro	Lundblad a Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Florida, USA
Imidazolový kruh	His	Oligosacharidová skupina	Vazba in vitro	Jako pro guanidin

Pro N-glykosylaci in vivo se používá termín „vazebná skupina“ nekonvenčním způsobem pro označení aminokyselinových zbytků tvořících N-glykosylační místo (se sekvencí N-X’-S/T/C-X”, kde X’ je zbytek jakékoli aminokyseliny kromě prolinu, X” je zbytek kterékoli aminokyseliny, která může nebo nemusí být identická s X’, a která je s výhodou různá od prolinu, N je asparagin a S/T/C je buď serin, threonin nebo cystein, s výhodou serin nebo threonin, a nejvýhodněji threonin). Ačkoli zbytek asparaginu N-glykosylačního místa je místo ío připojení oligosacharidu v průběhu glykosylace, tohoto připojení nelze dosáhnout, pokud jsou přítomny jiné zbytky aminokyselin Nglykosylačního místa. Jestliže je tedy nepeptidovou skupinou skupina oligosacharidu a konjugace se má provádět N-glykosylací, termín „zbytek aminokyseliny obsahující vazebnou skupinu pro nepeptidovou skupinu“ se používá v souvislosti se změnami aminokyselinové sekvence sledovaného polypeptidů v tom smyslu, že je třeba změnit jeden nebo více aminokyselinových zbytků tvořících N-glykosylační místo takovým způsobem, že se buď do aminokyselinové sekvence zavede funkční N-glykosylační místo, nebo se takové místo z uvedené sekvence odstraní.

V rámci předkládané přihlášky jsou názvy aminokyselin a atomů (např. CA, CB, NZ, N, O, C atd.) používány v souladu s definicí Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), která je založena na nomenklatuře

- 10:

• ·· « · » · · ·♦ ««

IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names atd.), Eur. J. Biochem., 138, 9 37 (1984) včetně oprav uveřejněných v Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). Termín „aminokyselinový zbytek“ má primárně označovat zbytek aminokyseliny ze skupiny dvaceti v přírodě se vyskytujících aminokyselin, tedy ze skupiny alanin (Ala nebo A), cystein (Cys nebo C), kyselina asparagová (Asp nebo D), kyselina glutamová (Glu nebo E), fenylalanin (Phe nebo F), glycin (Gly nebo G), histidin (His nebo H), isoleucin (Ile nebo I), lysin (Lys nebo K), leucin (Leu nebo L), io methionin (Met nebo M), asparagin (Asn nebo N), prolin (Pro nebo P), glutamin (Gin nebo Q), arginin (Arg nebo R), serin (Ser nebo S), threonin (Thr nebo T), valin (Val nebo V), tryptofan (Trp nebo W) a tyrosin (Tyr nebo Y).

Terminologie používaná pro identifikaci poloh/substitucí aminokyselin je ilustrována následujícím způsobem: F13 označuje polohu č. 13 obsazenou v referenční aminokyselinové sekvenci fenylalaninovým zbytkem. F13K znamená, že zbytek fenylalaninu v poloze 13 byl substituován zbytkem lysinu. Pokud není uvedeno jinak, zde uváděné číslování aminokyselin se vztahuje k aminokyselinové sekvenci hG-CSF ukázané v SEQ ID No. 1. Alternativní substituce jsou označeny „/“, např. Q67D/E znamená aminokyselinovou sekvenci, ve které je glutamin v poloze 67 nahrazen buď kyselinou asparagovou nebo kyselinou glutamovou. Vícečetné substituce jsou označeny znaménkem „+“, např. S53N+G55S/T znamená aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje substituci serinového zbytku v poloze 53 za zbytek asparaginu a substituci glycinového zbytku v poloze 55 za serin nebo threonin.

Termín „nukleotidové sekvence“ má označovat za sebou následující sled dvou nebo více molekul nukleotidů. Nukleotidové sekvence může být genomová, cDNA, RNA, polosyntetického nebo syntetického původu, nebo jakákoli jejich kombinace.

« 9 φ · c • φ

φ • ··

ΦΦΦ · Φ 9 99

9 9 9 • Φ Φ Φ

9 9 9

Termín „polymerázová řetězová reakce“ nebo „PCR“ obecně označuje způsob amplifikace požadované ňukleotidové sekvence in vitro, jak je popsáno například v US 4,683,195. Metoda PCR obecně zahrnuje opakované cykly syntézy prodloužení primeru, při použití oligonukleotidových primerů schopných přednostně hybridizovat s templátovou nukleovou kyselinou.

Termíny „buňka“, „hostitelská buňka“, „buněčná linie“ a „buněčná kultura“ se používají v předkládané přihlášce zaměnitelně a všechny tyto termíny by měly být chápány ve smyslu zahrnutí ío potomstva získaného pěstováním nebo kultivací buňky.

„Transformace“ a „transfekce“ se používají zaměnitelně pro označení procesu zavedení DNA do buňky.

„Operativně spojený“ označuje kovalentní vazbu dvou nebo více nukleotidových sekvencí pomocí enzymatické ligace nebo jiným způsobem, v takové vzájemné konfiguraci, při které může být uskutečněna normální funkce sekvencí. Například nukleotidová sekvence kódující presekvenci nebo úvodní sekreční sekvenci je operativně navázána na nukleotidovou sekvenci polypeptidu v případě, jestliže je exprimován jako preprotein, který se účastní sekrece polypeptidu: promotor nebo zesilující sekvence jsou operativně navázány na kódující sekvenci, jestliže ovlivňují transkripci sekvence; vazebné místo ribosomu je operativně navázáno na kódující sekvenci, jestliže je umístěno tak, aby umožnilo translaci. Obecně znamená termín „operativně spojený“, že spojované ňukleotidové sekvence jsou spojité, a v případě sekreční úvodní sekvence spojité a ve správné čtecí fázi. Spojení je uskutečňováno ligací v běžných restrikčních místech. Pokud taková místa neexistují, používají se syntetické oligonukleotidové adaptorové sekvence nebo propojovací skupiny ve spojení se standardními metodami rekombinantní DNA.

Termín „zavedení“ označuje zavedení aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu nepolypeptidové části, zvláště • 4 • ·

··· fl ·· « · •

9

9 substituci existujícího aminokyselinového zbytku, nebo alternativně inzerci dalšího aminokyselinového zbytku. Termín „odstranění“ označuje odstranění aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, zvláště substitucí odstraňovaného aminokyselinového zbytku jiným zbytkem aminokyseliny, nebo alternativně delecí (bez substituce) odstraňovaného aminokyselinového zbytku.

Jestliže se provádějí substituce týkající se rodičovského polypeptidu, potom jde s výhodou o „konzervativní substituce“, jinými ío slovy substituce prováděné skupinami aminokyselin s podobnými vlastnostmi, jako jsou například malé aminokyseliny, kyselé aminokyseliny, polární aminokyseliny, bazické aminokyseliny, hydrofobní aminokyseliny a aromatické aminokyseliny.

Výhodné substituce v předkládaném vynálezu mohou být 15 zvoleny zvláště z konzervativních substitucí uvedených v následující tabulce.

Skupiny konzervativní substituce

1	Alanin (A)	Glycin (G)	Serin (S)	Threonin (T)
2	Kyselina asparagová (D)	Kyselina glutamová (E)
3	Asparagin (N)	Glutamin (Q)
4	Arginin (R)	Histidin (H)	Lysin (K)
5	Isoleucin (I)	Leucin (L)	Methionin (M)	Valin (V)
6	Fenylalanin (F)	Tyrosin (Y)	Tryptofan (W)

Termín „imunogenicita“ se používá v souvislosti s označením schopnosti dané látky indukovat odpověď imunitního systému. Imunitní odpověď může být odpověď zprostředkovaná buňkou nebo protilátkou (viz např. Roitt: Essentíal Immunology (8. vydání, Blackwell), kde se uvádí další definice imunogenicity). Snížená reaktivita s protilátkami bude za normálních okolností ukazatelem snížené imunogenicity. Snížená imunogenicita může být zjištěna použitím vhodných metod známých v oboru, např. in vivo nebo in vitro.

Termín „funkční poločas in vivo“ se používá ve svém normálním významu, tj. jako doba, ve které je v tělesném/cílovém orgánu stále ještě přítomno 50 % biologické aktivity polypeptidů nebo konjugátu, nebo doba, ve které dosáhne aktivita polypeptidů nebo konjugátu 50 % výchozí hodnoty. Jako alternativa pro určení funkčního poločasu in io vivo může být zjišťován „poločas v séru“, tj. doba, po které v plasmě nebo v krevním řečišti obíhá 50 % molekul polypeptidů nebo konjugátu před tím, než dojde k jejich vyloučení. Alternativní termíny pro označení poločasu v séru zahrnují „poločas v plasmě“, „poločas v oběhu“, „vylučování (clearance) ze séra“, „vylučování (clearance) z plasmy“ a „poločas vylučování (clearance)“. Polypeptid nebo konjugát se vylučuje působením jednoho nebo více retikuloendotheliálních systémů (RES), ledvinami, slezinou nebo játry, degradací prostřednictvím receptorů nebo specifickou nebo nespecifickou proteolýzou, zvláště působením vylučování působením receptorů (receptor-mediated clearance) a vylučování ledvinami (renal clearance). Za normálních okolností závisí vlučování na velikosti (vzhledem k prahové hodnotě glomerulární filtrace), náboji, navázaných uhlohydrátových řetězcích a na přítomnosti buněčných receptorů pro protein. Funkčnost, kterou je třeba zachovat, je normálně zvolena z proliferační aktivity nebo vazebné aktivity na receptor. Funkční poločas in vivo a sérový poločas může být zjišťován vhodnou metodou známou v oboru, jak bude dále diskutováno v části Materiály a metody, dále.

Termín „zvýšený“, jak se zde používá v souvislosti s funkčním poločasem in vivo nebo poločasem v séru, se používá pro označení příslušného poločasu konjugátu nebo polypeptidů, který je statisticky významně zvýšený vzhledem k poločasu referenční molekuly, jako je • 9 *

• 9

99 : : ρ

999 9 · φ 9 • ♦ · ·

99 hG CSF (např. Neupogen®), při porovnávání za srovnatelných podmínek. Například příslušný poločas může být zvýšen o alespoň 25 %, jako je o alespoň 50 %, např. o alespoň přibližně 100 %, 200 %, 500 % nebo 1000 %.

Termín „vylučování ledvinami“ se používá ve svém normálním významu pro označení jakéhokoli vylučování, které probíhá v ledvinách, například glomerulární filtrací, tubulární exkrecí nebo tubulární eliminací. Vylučování ledvinami (renální clearance) závisí na fyzikálních vlastnostech konjugátu, včetně velikosti (průměr), symetrii, ío tvaru/rigidity a náboje. Snížené renální vylučování je možno zjistit jakýmkoli vhodným způsobem, například testem in vivo. Vylučování ledvinami se typicky zjišťuje podáním značeného (například radioaktivně nebo fluorescenčně značeného) polypeptidového konjugátu pacientovi a měřením aktivity značky v moči shromažďované od pacienta. Snížené vylučování ledvinami se stanovuje ve srovnání s odpovídajícím referenčním polypeptidem, například odpovídajícím nekonjugovaným polypeptidem, odpovídajícím nekonjugovaným polypeptidem standardního typu nebo jiným konjugovaným polypeptidem (jako je je konjugovaný polypeptid, který není podle předkládaného vynálezu), za srovnatelných podmínek. Rychlost vylučování konjugátu ledvinami je s výhodou snížena o alespoň 50 %, s výhodou o alespoň 75 % a nejvýhodněji o alespoň 90 %, ve srovnání s příslušným referenčním polypeptidem.

Obecně je aktivace receptoru svázána s vylučováním zprostředkovaným receptorem (receptor-mediated clearance, RMC) takovým způsobem, že vazba polypeptidu na jeho receptor bez aktivace nevede k RMC, zatímco aktivace receptoru vede k RMC. Vylučování je způsobeno převedením polypeptidu navázaného na receptor do buňky (internalizace) s následnou degradací lysozomy.

Snížené RMC je možno dosáhnout takovým návrhem konjugátu, aby byl schopen vázat se a aktivovat dostatečný počet receptorů pro získání optimálního biologického účinku in vivo, a zabránit aktivaci φφ φφ φφ φ· φφ φφ • φφ φ · φφ · φ φφ · • ΦΦΦ φ Φ Φ β · · · r» φ φφφ · φ φφ φ φ · φ ·

-15-· · φφφ· ·φφ ·· ·φ 91 11 11 1111 většího počtu receptorů, než je nezbytné pro dosažení této odpovědi. To se může odrážet ve snížené biologické aktivitě in vitro a/nebo zvýšeném uvolňování z receptorů (off-rate).

Snížená biologická aktivita in vitro typicky odráží sníženou účinnost/efektivitu a/nebo sníženou schopnost působení a může být zjištěna jakýmkoli vhodným způsobem pro zjišťování kterékoli z těchto vlastností. Například biologická aktivita in vitro může být zjištěna testem založeným na luciferáze (viz Materiály a metody). Biologická aktivita in vitro konjugátu může být snížena o alespoň 30 %, jako je io o alespoň 50 %, 60 % nebo 75 %, například o alespoň 90 %, ve srovnání s biologickou aktivitou in vitro odpovídajícího referenčního polypeptidů zjišťovanou za srovnatelných podmínek. Jinaka vyjádřeno, konjugát může mít biologickou aktivitu in vitro, která je velikosti pouze 1 %, typicky alespoň přibližně 2 %, jako je alespoň přibližně 5 % aktivity odpovídajícího nekonjugovaného peptidů nebo odpovídajícího polypeptidů standardního typu. Biologická aktivita in vitro může být například v rozmezí od přibližně 1 do 50 % aktivity referenčního polypeptidů, jako je přibližně 2 až 40 %, např. přibližně 5 až 25 %, při zjišťování za srovnatelných podmínek. V případech, kde se požaduje

2o snížení biologická aktivita in vitro pro zajištění vylučování prostřednictvím receptorů, bude zřejmé, že musí být přesto zachována dostatečná biologická aktivita pro dosažení aktivace požadovaného receptorů.

Zvýšená rychlost uvolňování (off-rate) mezi konjugátem polypeptidů a jeho receptorem musí mít takovou velikost, která vede k uvolnění konjugátu polypeptidů z jeho receptorů před jakýmkoli podstatným převedením do buňky komplexu receptor - ligand. Vazebná afinita receptor - polypeptid (včetně rychlosti uvolňování) může být zjištěna podle popisu v části Materiály a metody. Hodnota

RMC in vitro může být zjištěna označením (například radioaktivním nebo fluorescenčním) konjugátu polypeptidů, stimulací buněk obsahujících receptor pro tento polypeptid, promytím buněk a měřením • 9 • 9 9 • 9 9

·· • 9 9 · • 9 99 • 9 9 9 • · · 9

99

99

9 9 9

9 9

9 9

9 9

9999 aktivity značky. Konjugát může být alternativně vystaven buňkám exprimujícím příslušný receptor. Po vhodné době inkubace se supernatant odstraní a převede do jamky obsahující podobné buňky. Biologická odezva těchto buněk na supernatant se zjistí relativně k nekonjugovanému polypeptidu nebo dalšímu referenčnímu polypeptidu, a tato aktivita je měřítkem rozsahu snížení RMC.

Snížená biologická aktivita in vitro konjugátu se za normálních okolností dosáhne jako výsledek jeho modifikace nepolypeptidovou částí. Aby však bylo možno dále snížit biologickou aktivitu in vitro nebo ío z jiných důvodů, může být zajímavé navíc modifikovat polypeptidovou část konjugátu. Například v jednom provedení může být nahrazen jeden nebo více aminokyselinových zbytků umístěných na nebo v blízkosti vazebného místa polypeptidu pro receptor jiným aminokyselinovým zbytkem ve srovnání s odpovídajícím polypeptidem standardního typu, čímž se dosáhne snížené biologické aktivity in vitro. Aminokyselinový zbytek zaváděný substitucí může být jakýkoli aminokyselinový zbytek schopný snížit biologickou aktivitu konjugátu in vitro. Zavedený aminokyselinový zbytek vhodně obsahuje vazebnou skupinu nepolypeptidové části, tak jak je zde definována. Jestliže je konkrétně nepolypeptidovou částí molekula polymeru jako je PEG, zaváděným aminokyselinovým zbytkem může být zbytek lysinu.

Termín „s aktivitou G-CSF“ má označovat, že polypeptid nebo konjugát má jednu nebo více funkcí nativního G-CSF, zvláště hG-CSF s aminokyselinou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 1, včetně schopnosti vázat se na receptor pro G-CSF (Fukunaga a další, J. Bio. Chem., 265: 14008, 1990). Aktivita G-CSF se vhodně měří použitím primárního testu popsaného v části Materiály a metody, dále. Polypeptid „vykazující“ aktivitu G-CSF je považován za peptid s touto aktivitou, jestliže prokáže měřitelnou funkci, například měřitelnou proliferační aktivitu nebo vazebnou aktivitu na receptor (například při zjištění primárním testem popsaným v části Materiály a metody).

00 9 9 9 9

9 9 9 . _· · 0 · 0

17·-· · • · 00

0«

0 *

00 0 0 9

0 9 «0 0 0 0 0

0 0

0 0

0 0

0000

Polypeptid s aktivitou G-CSF může být také označován jako „molekula G-CSF“.

Termín „rodičovský G-CSF“ nebo „rodičovský polypeptid“ má označovat molekulu, která má být modifikována podle předkládaného vynálezu. Rodičovský G-CSF je normálně hG-CSF nebo jeho varianta. „Varianta“ je polypeptid, který se od rodičovského polypeptidu liší v jedné nebo více aminokyselinách, normálně v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinových zbytcích. Příklady rhGCSF zahrnují filgrastim (Gran® a Neupogen®, lenograstim ío (Neutrogin® a Granocyte®) a nartograstim (Neu-up®).

Konjugát podle vynálezu

Jak je uvedeno výše, první provedení vynálezu se týká konjugátu obsahujícího polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, odlišnou od aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 1 v alespoň jednom aminokyselinovém zbytku zvoleném ze specifikovaných zavedených nebo odstraněných aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, a který dále obsahuje alespoň jednu nepolypeptidovou skupinu navázanou na vazebnou skupinu polypeptidu. Aminokyselinové zbytky, které jsou zaváděny a/nebo odstraňovány, jsou podrobněji popisovány v následujících částech. Bude zřejmé, že samotný konjugát má rovněž aktivitu G-CSF.

Odstraněním a/nebo zavedením aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou skupinu je možno specificky přizpůsobit polypeptid tak, aby vytvořil molekulu náchylnější ke konjugaci se zvolenou nepolypeptidovou skupinou, optimalizovat rozložení konjugace (například pro zajištění optimální distribuce nepolypeptidových skupin na povrchu molekuly G-CSF, a zajistit, aby byly v molekule přítomny pouze ty vazebné skupiny, které mají být konjugovány) a tím získat novou molekulu konjugátu, • 0

- 1£P• I

0

0 •

0» ·0

0 0 0 · 00 • 0 0 0

0 0 0

00 »0 00

0 0 0

0 ·

0 0

0 0

0000 která má aktivitu G-CSF a navíc jednu nebo více zlepšených vlastností ve srovnání s dosud dostupnými molekulami G-CSF.

I když polypeptid může být jakéhokoli původu, zvláště savčího původu, je v současnosti výhodný polypeptid lidského původu.

Ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu se mění více než jeden zbytek aminokyseliny polypeptidu s aktivitou G-CSF, přičemž tato změna například zahrnuje odstranění stejně jako zavedení aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro zvolenou nepolypeptidovou skupinu.

io Navíc ke zde popisovaným změnám aminokyselin zaměřeným na odstranění a/nebo zavedení vazebných míst pro nepolypeptidovou skupinu bude zřejmé, že aminokyselinová sekvence polypeptidu podle vynálezu může v případě potřeby obsahovat další změny, které nemusí souviset se zavedením nebo odstraněním vazebných míst, tj.

jiné substituce, inzerce nebo delece. Ty mohou například zahrnovat zkrácení N- a/nebo C-konce o jeden nebo více aminokyselinových zbytků, nebo zavedení jednoho nebo více dalších zbytků na N- a/nebo C-konci, např. přidání methioninového zbytku na N-konci.

Konjugát podle vynálezu má jednu nebo více z následujících zlepšených vlastností ve srovnání s hG-CSF, zvláště ve srovnání s rhG-CSF (např. filgrastim, lenograstim nebo nartograstim) nebo známými variantami hG-CSF: zvýšený funkční poločas in vivo, zvýšený poločas v séru, snížené vylučování ledvinami, snížené vylučování prostřednictvím receptorů, snížené vedlejší účinky jako např. bolest kostí a sníženou imunogenicitu.

Bude zřejmé, že aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu nepolypeptidové části, ať už se odstraňuje nebo zavádí, se bude volit na základě povahy zvolené nepolypeptidové skupiny, a ve většině případů na základě způsobu, kterým se má konjugace mezi polypeptidem a nepolypeptidovou skupinou dosáhnout. Jestliže je například nepolypeptidové skupina molekula polymeru jako je

99 99 94 99 ··

9 9 9 ·99< 999 9 • 999 9999 99 ·

1-9 9 999 99 99 999 9 9

9» - 9 9 9 9 9 « 999

99 99 99 9« 9999 polyethylenglykol nebo molekula odvozená od polyalkylenoxidu, aminokyselinové zbytky obsahující vazebnou skupinu mohou být zvoleny ze skupiny lysin, cystein, kyselina asparagová, kyselina glutamová, histidin a arginin. Jestliže se má dosáhnout konjugace s lysinovým zbytkem, vhodnou aktivovanou molekulou je např. mPEGSPA firmy Shearwater Polymers, lne., oxykarbonyloxy-Ndikarboxyimid-PEG (US 5,122,614) nebo PEG dostupný od firmy PolyMASC Pharmaceuticals plc. První z těchto molekul bude ilustrovaná dále.

Aby se zabránilo příliš velkému porušení struktury a funkce rodičovské molekuly hG-CSF, celkový počet aminokyselinových zbytků, které se mohou měnit podle předkládaného vynálezu, například jak se bude popisovat v následující části (ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 1) typicky 15 nepřevýší 15. Přesný počet aminokyselinových zbytků a typ zaváděných nebo odstraňovaných aminokyselinových zbytků závisí zvláště na požadované povaze a stupni konjugace (například identitě nepolypeptidové skupiny, kolik nepolypeptidových skupin je vhodné nebo možné s polypeptidem konjugovat, jestliže je konjugace žádoucí 20 nebo by bylo lépe se jí vyhnout, atd.). Polypeptidová část konjugátu podle vynálezu nebo polypeptid podle vynálezu s výhodou obsahují aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje v jednom až patnácti aminokyselinových zbytcích od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1, typicky ve 2 až 10 aminokyselinových zbytcích, např. 25 ve 3 až 8 aminokyselinových zbytcích, jako např. ve 4 až 6 aminokyselinových zbytcích, od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1. Normálně tedy polypeptidová část konjugátu nebo polypeptid podle vynálezu obsahují aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 v 1, 2, 3, 30 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinových zbytcích.

Polypeptidová část konjugátu bude typicky mít sekvenci aminokyselin s alespoň přibližně 80 % identitou se SEQ ID No. 1, • ·

• ♦» · • fcfc · • · • · fcfcfc · s výhodou alespoň 90%, jako je alespoň přibližně 95%. Homologie/identita sekvence aminokyselin se vhodně určuje z uspořádaných sekvencí použitím programu např. ClustalW program, verze 1.8, červen 1999, s použitím výchozích parametrů (Thompson a další, 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673 - 4680) nebo z databáze rodin PFAM verze 4.0 (http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res. 1999, 1. leden; 27(1): 260 - 2) použitím io GENEDOC verze 2.5 (Nicholas, K. B., Nicholas Η. B. Jr., a Deerfield,

D. W. II., 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4: 14; Nicholas, K. B. a Nicholas Η. B. Jr.,

1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation).

Ve výhodném provedení je rozdíl mezi aminokyselinovou sekvencí polypeptidu a aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 1 v tom, že do aminokyselinové sekvence byl zaveden alespoň jeden a často více, např. 1 až 15 aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, s výhodou substitucí. Typicky se tedy mění obsah specifických aminokyselinových zbytků v polypeptidové části, na které se váže zvolená nepolypeptidová skupina, čímž se dosahuje účinnější, specifické a/nebo extenzivní konjugace. Jestliže se například změní celkový počet aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro nepolypeptid podle výběru na optimalizovanou úroveň, vylučování konjugátu se typicky významným způsobem omezí v důsledku změny tvaru, velikosti a/nebo náboje molekuly dosažené konjugací. Navíc, jestliže dojde ke zvýšení celkového počtu aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro zvolenou nepolypeptidovou část, je zvolenými nepolypeptidovými skupinami stíněn větší podíl molekuly polypeptidu, což vede k nižší imunitní odpovědi.

• ·

Termín „jeden rozdíl“, jak se používá v předkládaném vynálezu, umožňuje přítomnost i dalších rozdílů. Navíc ke specifikovanému rozdílu v aminokyselině mohou být tedy mutovány jiné než uvedené aminokyselinové zbytky.

999

99 99 ·· • » · · 9 9 9 9

9 99 9 9 »

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 999 9

V dalším výhodném provedení spočívá jeden rozdíl mezi aminokyselinovou sekvencí polypeptidů a aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 1 v tom, že z aminokyselinové sekvence byl

odstraněn, s výhodou substitucí, jeden a s výhodou více,	např. 1	až 15
aminokyselinových	zbytků	obsahujících	vazebnou	skupinu	pro
ío nepolypeptidovou	část.	Odstraněním	jednoho	nebo	více
aminokyselinových	zbytků	obsahujících	vazebnou	skupinu	pro

zvolenou nepolypeptidovou část je možné zabránit konjugaci s nepolypeptidovou skupinou v těch částech polypeptidů, ve kterých je tato konjugace nevýhodná, např. na aminokyselinových zbytcích umístěných v nebo v blízkosti funkčního místa polypeptidů (protože konjugace na takovém místě může vést k inaktivaci nebo snížené aktivitě G-CSF výsledného konjugátu v důsledku nesprávného rozpoznávání receptoru). V tomto kontextu má termín „funkční místo“ označovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které jsou nezbytné nebo které se jinak účastní fungování nebo účinku hG-CSF. Takové aminokyselinové zbytky jsou částí funkčního místa. Funkční místo je možno určit způsoby známými v oboru a s výhodou je identifikováno analýzou struktury polypeptidů v komplexu s příslušným receptorem, jako je receptor hG-CSF (viz Aritomi a další, Nátuře 401:

713 - 717,1999).

V ještě dalším výhodném provedení se aminokyselinová sekvence polypeptidů liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 v tom, že a) byl odstraněn, s výhodou substitucí, alespoň jeden specifický aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část a přítomný v aminokyselinové sekvenci ukázané v SEQ ID No. 1, a b) do aminokyselinové sekvence byl zaveden, s výhodou substitucí, alespoň jeden specifický

4« • 0 0 • 0

0 0

0 0 • 0 • 0 •

>

9« • 0· 0 · 9

0 0 0 • 0 ·

0 0004 aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, přičemž specifickými aminokyselinovými zbytky jsou jakékoli zbytky popsané v následujících částech. Toto provedení je považováno za zvláště zajímavé tím, že je možno specificky navrhnout polypeptid tak, aby bylo dosaženo optimální konjugace se zvolenou nepolypeptidovou částí. Například zavedením a odstraněním zvolených aminokyselinových zbytků, jak bude popsáno v následujících částech, je možno zajistit optimální distribuci vazebných skupin pro zvolenou nepolypeptidovou část, což poskytne ío konjugát, ve kterém jsou nepolypeptidové části umístěny tak, aby a) účinně stínily epitopy a jiné části povrchu polypeptidu, a b) zajistily optimální Stokesův poloměr konjugátu, aniž by způsobily příliš velké porušení struktury a tím nesprávnou funkci polypeptidu.

Konjugát podle vynálezu bude obecně obsahovat dostatečný počet a typ nepolypeptidových částí, aby byl získán konjugát se zvýšeným funkčním poločasem a/nebo poločasem v séru in vivo ve srovnání s hG-CSF, jako je např. filgrastim, lenograstim nebo nartograstim, a s výhodou ve srovnání s rhG-CSF obsahujícím jedinou skupinu PEG s velikostí 20 kDa navázanou na N-konec. Zvýšený funkční poločas in vivo se vhodně zjišťuje metodami popsanými v části Materiály a metody.

Konjugát podle vynálezu může obsahovat alespoň jednu nekonjugovanou, konjugovatelnou vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část. V kontextu předkládaného vynálezu znamená termín „konjugovatelná vazebná skupina“ takovou vazebnou skupinu, která je umístěna v poloze na peptidu, kde je dostupná pro konjugaci, která se kromě zvláštních případů konjuguje k příslušné nepolypeptidové části, jestliže se provádí konjugace. Taková vazebná skupina může být například část aminokyselinového zbytku, který se účastní nebo který je jinak nezbytný pro vykonávání funkce polypeptidu. Vhodný způsob jak zabránit konjugaci jinak konjugovatelné vazebné skupiny je odstínit vazebnou skupinu pomocí • ·

··· ·· «· ·· 44 • ♦ » · ··«· 4 4 94 · · · • ·· ··· · · • · · · · · ·

49 49 4944 pomocné molekuly, například jak se popisuje v části „Blokování funkčního místa“. Bude zřejmé, že počet nekonjugovaných, konjugovatelných vazebných skupin závisí na specifickém polypeptidu G-SCF a umístění konjugovatelných vazebných skupin. Polypeptidový konjugát obsahuje například jednu nebo více nekonjugovaných, konjugovatelných vazebných skupin, a alespoň jednu a s výhodou dvě nebo více konjugovaných vazebných skupin.

Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je navázána na io lysin nebo N-koncovy zbytek aminokyseliny

V jednom provedení se vynález týká konjugátu polypeptidu obsahujícího

i) polypeptid s aktivitou G-CSF, obsahující aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ

ID No. 1 alespoň jednou substitucí zvolenou ze skupiny T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10K, Q11K, S12K, F13K,

LUK, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K,

E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K,

L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K,

S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K,

S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K,

S96K, I	P97K, E98K, L99K, G100K, P101K,	T102K,	D104K,	T105K,
Q107K,	L108K,	D109K,	A111K,	D112K,	F113K,	T115K,	T116K,
W118K	, Q119K,	Q120K,	M121K,	E122K,	E123K,	L124K,	M126K,
A127K,	P128K,	A129K,	L130K,	Q131K,	P132K,	T133K,	Q134K,
G135K,	A136K,	M137K,	P138K,	A139K,	A141K,	S142K,	A143K,
F144K,	Q145K,	S155K,	H156K,	Q158K,	S159K,	L161K,	E162K,

V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K a P174K, a ii) alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na lysinový zbytek polypeptidu.

• ·

- 24 hG-CSF obsahuje čtyři lysinové zbytky, z nichž K16 je umístěn ve vazebné doméně receptoru a ostatní jsou umístěny v polohách 23, 34 a 40, všechny relativně blízko vazebné doméně receptoru. Aby se zabránilo konjugaci s jedním nebo více z těchto lysinových zbytků (neboť konjugace může inaktivovat nebo podstatně snížit aktivitu výsledného konjugátu), může být žádoucí odstranit alespoň jeden lysinový zbytek, například dva, tři nebo všechny tyto zbytky. Výhodnější provedení vynálezu se tedy týká konjugátu polypeptidů definovaného výše, ve kterém byl alespoň jeden z aminokyselinových io zbytků zvolených ze skupiny K16, K23, K34 a K40 deletován nebo substituován jiným aminokyselinovým zbytkem. S výhodou je jiným aminokyselinovým zbytkem substituován alespoň zbytek K16.

Mezi příklady výhodných substitucí aminokyselin patří jedna nebo více ze substitucí Q70K, Q90K, T105K, Q120K a T133K, jako jsou dvě, tři nebo čtyři tyto substituce, například: Q70K+Q90K,

Q70K+T105K, Q70K+120K, Q70K+T133K, Q90K+T105K,

Q90K+Q120K, Q90K+T133K, T105K+Q120K, T105K+T133K,

Q120K+T133K, Q70K+Q90K+T105K, Q70K+Q90K+Q120K,

Q70K+Q90K+T133K, Q70K+T105K+T120K, Q70K+T105K+T133K,

Q70K+Q120K+T133K, Q09K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K,

Q90K+Q120K+T133K, T105K+T120K+T133K,

Q90K+TIOSK+Q120K+T133K.Q70K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+T105K+T133K nebo

Q70K+Q90K+T105K+Q120K.

Polypeptid konjugátu podle druhého z provedení popisovaných v této části (tj. alespoň jeden zavedený a/nebo odstraněný lysin) obsahuje s výhodou alespoň jednu, jako jednu, dvě, tři nebo čtyři substituce zvolené ze skupiny K16R, K16Q, K23R, K23Q, K34R, K34Q, K40R a K40Q, výhodněji alespoň jednu ze substitucí K16R a

K23R, přičemž je možno zabránit konjugaci těchto zbytků. Polypeptid s výhodou obsahuje alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny

K16R+K23R, K16R+K34R, K16R+K40R, K23R+K34R, K23R+K40R,

- 25 K34R+K40R, K16R+K23R+K34R, K16R+K23R+K40R,

K23R+K34R+K40R, K16R+K34R+K40R a K16R+K23R+K34R+K40R.

Tyto substituce pravděpodobně poskytnou nejmenší strukturní rozdíl ve srovnání s nativním nebo rodičovským polypeptidem.

Navíc k výše uvedeným substitucím může konjugát polypeptidu podle vynálezu obsahovat také jednu nebo více substitucí zvolených ze skupiny R22K, R146K, R147K, R166K a R169K.

I když nepolypeptidová část konjugátu podle tohoto provedení předkládaného vynálezu může být jakákoli molekula, která má při použití při dané metodě konjugace jako skupinu pro připojení lysin, jako je uhlohydrátová skupina, je výhodné, jestliže nepolypeptidovou částí je molekula polymeru. Tato molekula polymeru může být jakákoli z molekul uvedených v části nazvané „Konjugace s molekulou polymeru“, ale s výhodou se volí ze skupiny přímého nebo rozvětveného polyethylenglykolu nebo jiného polyalkylenoxidu. Výhodné molekuly polymeru jsou například PEG-SPA firmy Shearwater Polymers, lne. nebo oxykarbonyloxy-N-dikarboxyimid PEG (US 5,122,614).

Bude zřejmé, že jakákoli ze změn aminokyselin, zvláště substituce uvedené v této části, mohou být kombinovány s jakýmikoli změnami aminokyselin, s výhodou substitucemi, specifikovanými v jiných částech této přihlášky popisujících modifikace specifických aminokyselin včetně zavádění a/nebo odstraňování glykosylačních míst.

Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je molekula, jejíž vazebnou skupinou je cystein

V dalším provedení se vynález týká konjugátu, který obsahuje

i) polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od aminokyselinové sekvence • ·

hG-CSF ukázané v SEQ ID No. 1 v alespoň jedné substituci zvolené ze skupiny T1C, P2C, L3C, G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C,

Q11C,	S12C,	F13C,	L14C,	L15C,	E19C,	Q20C,	V21C,	R22C,	Q25C
G26C,	D27C,	A29C,	A30C,	E33C,	A37C,	T38C,	Y39C,	L41C,	H43C
P44C,	E45C,	E46C,	V48C,	L49C,	L50C,	, H52C	, S53C	, L54C,	, I56C
P57C,	P60C,	L61C,	S62C,	S63C,	P65C,	S66C,	Q67C,	A68C,	L69C
Q70C,	L71C,	A72C,	G73C,	S76C,	Q77C,	L78C,	S80C,	F83C,	Q86C
G87C,	Q90C	, E93C, G94C, S96C, P97C, E98C, L99C, G100C

P101C,	T102C,	D104C,	T105C,	Q107C,	L108C,	D109C,	A111C,
ío D112C,	F113C,	T115C,	T116C,	W118C,	Q119C,	Q120C,	M121C,
E122C,	E123C,	L124C,	M126C,	A127C,	P128C,	A129C,	L130C,
Q131C,	P132C,	T133C,	Q134C,	G135C,	A136C,	M137C,	P138C,
A139C,	A141C,	S142C,	A143C,	F144C,	Q145C,	R146C,	R147C,
S155C,	H156C,	Q158C,	S159C,	L161C,	E162C,	V163C,	S164C,
15 Y165C,	R166C,	V167C,	L168C,	R169C,	H170C,	L171C,	A172C,

Q173C a P174C, a ii) alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na cysteinový zbytek polypeptidu.

Doména hG-CSF vázající se na receptor obsahuje cysteinový 20 zbytek v poloze 17, který není součást cysteinu a který může být s výhodou odstraněn, aby se zabránilo konjugaci nepolypeptidové části k tomuto cysteinu. V dalším, výhodnějším provedení se tedy vynález týká konjugátu obsahujícího

i) polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje 25 aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 v alespoň jedné substituci zvolené ze skupiny T1C, P2C, L3C, G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C, Q11C,

S12C,	F13C,	L14C,	L15C,	E19C,	Q20C,	V21C,	R22C,	Q25C,	G26C,
D27C,	A29C,	A30C,	E33C,	A37C,	T38C,	Y39C,	L41C,	H43C,	P44C,
30 E45C,	E46C,	V48C,	L49C,	LSOC	, H52C	, S53C,	L54C	, I56C,	P57C,
P60C,	L61C,	S62C,	S63C,	P65C,	S66C,	Q67C,	A68C,	L69C,	Q70C,

• · • · * I • · • ·

- 27 L71C, A72C, G73C, S76C, Q77C, L78C, S80C, F83C, Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, P97C, E98C, L99C, G100C, P101C, T102C, D104C, T105C, Q107C, L108C, D109C, A111C, D112C,

F113C, T115C, T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C, E122C,

E123C, L124C, M126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C,

P132C, T133C, Q134C, G135C, A136C, M137C, P138C, A139C,

A141C, S142C, A143C, F144C, Q145C, R146C, R147C, S155C,

H156C, Q158C, S159C, L161C, E162C, V163C, S164C, Y165C,

R166C, V167C, L168C, R169C, H170C, L171C, A172C, Q173C a

P174C, v kombinaci s odstraněním C17, s výhodou se substitucí C17 jakýmkoli jiným aminokyselinovým zbytkem, například serinovým zbytkem, a ii) nepolypeptidovou část, která má jako vazebnou skupinu cystein.

Výhodné substituce podle tohoto provedení předkládaného vynálezu jsou substituce argininu cysteinem, například jedna nebo více ze substitucí R146C, R147C, R166C a R169C.

Bude zřejmé, že jakákoli z modifikací aminokyselin, zvláště substitucí uvedených v této části, může být kombinována s jakoukoli záměnou aminokyselin, zvláště substitucemi, specifikovanými v jiných částech popisujících specifické modifikace aminokyselin, včetně zavedení a/nebo odstranění glykosylačních míst.

Konjugát podle předkládaného vynálezu, kde nepolypeptidová část se váže na skupinu kyseliny C-koncového aminokyselinového zbytku

V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu obsahujícího

i) polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 v alespoň jedné substituci zvolené ze skupiny

T1D, P2D, L3D, G4D, P5D, A6D, S7D, S8D, L9D, P10D, Q11D, • 4

9 • · <

• 44

S12D,	F13D,	L14D,	L15D,	K16D,	Q20D,	V21D,	R22D,	K23D,	Q25D
G26D,	A29D,	A30D,	K34D,	A37D,	T38D,	Y39D,	K40D,	L41D,	H43D
P44D,	V48D,	L49D,	L50D,	H52D,	S53D,	L54D,	I56D,	P57D,	P60D
L61D,	S62D,	S63D,	P65D,	S66D,	Q67D,	A68D,	L69D,	Q70D,	, L71D
A72D,	G73D,	S76D,	Q77D,	L78D,	S80D,	F83D,	Q86D,	G87D,	Q90D
G94D,	S96D,	P97D,	L99D,	G100D, P101D, T102D, T105D, <	3107D

L108D,	All ID,	F113D,	T115D,	T116D,	W118D,	Q119D,	Q120D,
M121D,	L124D,	M126D	, A127D,	P128D	, A129D,	L130D,	Q131D,
P132D,	T133D,	Q134D,	G135D,	A136D,	M137D,	P138D,	A139D,
A141D,	S142D,	A143D,	F144D,	Q145D,	R146D,	R147D,	S155D,
H156D,	Q158D,	S159D,	L161D,	V163D,	S164D,	Y165D,	R166D,
V167D,	L168D,	R169D,	H170D,	L171D,	A172D, Q173D a	P174D;

nebo alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny T1E, P2E, L3E,

G4E,	P5E, A6E, S7E, S8E	, L9E,	P10E,	Q11E,	S12E,	F13E,	L14E
L15E,	K16E, Q20E, V21E,	R22E,	K23E,	Q25E,	G26E,	A29E,	A30E
K34E,	A37E, T38E, Y39E,	K40E,	L41E,	H43E,	P44E,	V48E,	L49E
L50E,	H52E, S53E, L54E,	I56E,	P57E,	P60E,	L61E,	S62E,	S63E
P65E,	S66E, Q67E, A68E,	L69E,	Q70E,	L71E,	A72E,	G73E,	S76E
Q77E,	L78E, S80E, F83E,	Q86E,	G87E,	Q90E,	G94E,	S96E,	P97E

L99E, G100E, P101E, T102E, T105E, Q107E, L108E, A111E, F113E,

T115E,	T116E,	W118E,	Q119E,	Q120E,	M121E,	L124E,	M126E
A127E,	P128E,	A129E,	L130E,	Q131E,	P132E,	T133E,	Q134E
G135E,	A136E,	M137E,	P138E,	A139E,	A141E,	S142E,	A143E
F144E,	Q145E,	R146E,	R147E,	S155E,	H156E,	Q158E,	S159E
L161E,	V163E,	S164E,	Y165E,	R166E,	V167E,	L168E,	R169E

H170E, L171E, A172E, Q173E a P174E; a ii) nepolypeptidovou část, která má jako vazebnou skupinu zbytek kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové.

Příklady výhodných substitucí podle tohoto provedení předkládaného vynálezu zahrnují Q67D/E, Q70D/E, Q77D/E, Q86D/E,

Q90D/E, Q120D/E, Q131D/E, Q134D/E, Q145D/E a Q173D/E.

• ·

Navíc k výše uvedeným substitucím může obsahovat polypeptid konjugátu podle některého z výše uvedených provedení odstranění, s výhodou substitucí, alespoň jednoho aminokyselinového zbytku zvoleného ze skupiny D27, D104, D109, D112, E19, E33, E45, E46,

E93, E98, E122, E123, a E163. Tyto substituce mohou být za jakýkoli jiný aminokyselinový zbytek, zvláště za zbytek asparaginu nebo glutaminu, přičemž by se mělo zabránit konjugaci těchto zbytků. Polypeptid může obsahovat zvláště alespoň jednu z následujících substitucí: D27N, D104N, D109N, D112N, E19Q, E33Q, E45Q, E46Q,

E93Q, E98Q, E122Q, E123Q a E163Q. Aminokyselinové substituce v jedné z výše uvedených poloh mohou být navíc s výhodou kombinovány s alespoň jednou z následujících substitucí: D109N, D112N, E19Q, E122Q a E123Q. Substituce jakýmkoli z těchto aminokyselinových zbytků pravděpodobně poskytne nejmenší strukturní rozdíly.

I když může být nepolypeptidová část konjugátu podle tohoto provedení vynálezu, která má jako vazebnou skupinu skupinu kyseliny, jakákoli nepolypeptidová část s touto vlastností, v současnosti je výhodné, aby nepolypeptidová část byla molekula polymeru nebo organické derivatizační činidlo, zvláště molekula polymeru, a aby se konjugát připravoval například jak se popisuje v Sakan a Pardridge, Pharmaceutical Research, díl 14, No. 8, 1997, str. 1085 - 1091.

Bude zřejmé, že jakákoli ze změn aminokyselin, zvláště substitucí uvedených v této části, může být kombinována s jakoukoli ze změn aminokyselin, zvláště substitucemi specifikovanými v jiných částech této přihlášky popisujících specifické změny aminokyselin, včetně zavedení a/nebo odstranění glykosylačních míst.

Další konjugáty podle vynálezu

Nepolypeptidové části specifikované výše, například v odstavcích nazvaných „Konjugát podle předkládaného vynálezu...“, ·

·

mohou navíc obsahovat další uhlohydrátové skupiny jako důsledek exprese polypeptidů v glykosylujících hostitelských buňkách a glykosylačních procesů uskutečněných v glykosylačních místech nebo jednom nebo více zavedených glykosylačních místech.

0

Konjugát podle předkládaného vynálezu, kde nepolypeptidová část je uhlohydrátová skupina

V dalším provedení se vynález týká konjugátu obsahujícího glykosylovaný polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 tím, že do této aminokyselinové sekvence bylo zavedeno alespoň jedno glykosylační místo, které se nevyskytuje v přírodě, prostřednictvím alespoň jedné ze substitucí zvolených ze skupiny

L3N+P5S/T, P5N, A6N, S8N+P10S/T, P10N S12N+L14S/T, F13N+L15S/T, L14N+K16S/T,

Q20N+R22S/T,

Q25N+D27S/T,

A30N+Q32S/T,

Y39N+L41S/T,

V48N+L50S/T,

S53N+G55S/T,

E19N+V21S/T,

K23N+Q25S/T,

A29N+L31S/T,

T38N+K40S/T,

E46N+V48S/T,

H52N+L54S/T,

V21N+K23S/T,

G26N+G28S/T, E33N+L35S/T, P44N+E46S/T, L49N+G51S/T, P60N, L61N,

Q11N+F13S/T,

K16N+L18S/T,

R22N+I24S/T,

D27N+A29S/T,

A37N+Y39S/T,

E45N+L47S/T,

L50N+H52S/T,

S63N+P65S/T,

P65N+Q67S/T, S66N+A68S/T, Q67N+L69S/T, A68N+Q70S/T, L69N+ L71S/T, Q70N+A72S/T, L71N+G73S/T, G73N+L75S/T, S76N+L78S/T, Q77N+H79S/T, L78N, S80N+L82S/T, F83N+Y85S/T, Q86N+L88S/T, G87N+L89S/T, Q90N+L92S/T, E93N+I95S/T, P97N+L99S/T,

L99N+P101S/T, P101N+L103S/T, T102N+D104S/T, D104N+L106S/T, T105N+Q107S/T, Q107N+D109S/T, L108N+V110S/T,

D109N+A111S/T, A111N+F113S/T, D112N+A114S/T, F113N,

T116N+W118S/T, W118N+Q120S/T,

T115N+I117S/T,

Q119N+M121S/T

E122N+L124S/T,

Q120N+E122S/T,

E123N+G125S/T,

M121N+E123S/T,

L124N+M126S/T, ··

··

M126N+P128S/T,	P128N+L130S/T,		L130N+P132S/T,
P132N+Q134S/T,	T133N+G135S/T,		Q134N+A136S/T,
A136N+P138S/T,	P138N+F140S/T,		A139N+A141S/T,
A141N+A143S/T,	S142N+F144S/T,		A143N+Q145S/T,
F144N+R146S/T,	Q145N+R147S/T,		R146N+A148S/T,
R147N+G149S/T,	S155N+L157S/T,		H156N+Q158S/T,
S159N+L161S/T,	L161N+V163S/T, E162N,	V163N+Y165S/T,
S164N+R166S/T,	Y165N+V167S/T,		R166N+L168S/T,
V167N+R169S/T,	L168N+H170S/T,	R169N+L171S/T a
H170N+A172S/T, zbytek T.	kde S/T označuje zbytek	S	nebo T, s výhodou

Bude zřejmé, že aby bylo možno připravit konjugát podle tohoto provedení, musí být polypeptid exprimován v glykosylující hostitelské buňce schopné navázat oligosacharidové skupiny v glykosylačním místě nebo místech, nebo se musí alternativně provést glykosylace in vitro. Příklady glykosylujících hostitelských buněk jsou uvedeny v části nazvané „Vazba na oligosacharidovou skupinu“.

Konjugát podle tohoto provedení obsahuje alternativně s výhodou polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, odlišnou od sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 v alespoň jedné substituci zvolené ze skupiny P5N, A6N, P10N, P60N, L61N, L78N, F113N a E162N, zvláště ze skupiny P5N, A6N, P10N, P60N, L61N, F113N a E162N, jako ze skupiny P60N, L61N, F113N a E162N.

Konjugát podle tohoto provedení obsahuje alternativně polypeptid s aktivitou G-CSF, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje od SEQ ID No. 1 v alespoň jedné substituci zvolené ze skupiny D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S,

D104N+L106T, D109N+A111S, D109N+A111T, D112N+A114S a

D112N+A114T, výhodněji ze skupiny D27N+A29S, D27N+A29T, •0 00 • 0 0 0 • · · 0

D104N+L106S, D104N+L106T, D112N+A114S a D112N+A114T, jako ze skupiny D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S a D104N+L106T.

Navíc k molekule uhlohydrátu může konjugát podle tohoto provedení vynálezu popisovaný v této části obsahovat další nepolypeptidové skupiny, zvláště molekulu polymeru jak se popisuje v předkládané přihlášce, konjugovanou k jedné nebo více vazebným skupinám přítomným v polypeptidové části konjugátu.

Bude zřejmé, že jakákoli změna aminokyselin, zvláště substituce uvedené v této části, mohou být kombinovány s jakoukoli změnou io aminokyselin, zvláště substitucemi, specifikovanými v jiných částech popisujících specifické změny aminokyselin.

Cirkulárně permutované varianty

V dalším provedení může být polypeptidová část konjugátu polypeptidu podle vynálezu ve formě cirkulárně permutované varianty polypeptidové sekvence popisované zde na jiných místech. V takovém cirkulárně permutovaném polypeptidu jsou původní N-konec a C-konec vzájemně spojeny buď přímo peptidovou vazbou nebo nepřímo peptidovou propojovací skupinou, přičemž mezi dvěma sousedícími aminokyselinovými zbytky, které byly původně spojeny peptidovou vazbou, se vytvoří nový N- a C-konec. Protože původní N- a C-konec budou normálně umístěny v určité vzdálenosti od sebe, budou typicky spojeny prostřednictvím peptidové propojovací skupiny, která má vhodnou délku a složení, aby nebyla nepříznivě ovlivněna struktura a aktivita konjugátu. Bude zřejmé, že nový N-konec a C-konec by neměl být vytvořen mezi párem aminokyselinových zbytků, u kterých by došlo k interferenci s aktivitou polypeptidu. Cirkulárně permutované varianty s agonistickými účinky na receptor G-CSF se popisují v US 6,100,070, na který se odkazuje pro další informace týkající se volby peptidových vazebných skupin a umístění nového N-konce a C-konce stejně jako způsobů výroby těchto variant.

- 33 ·· 99 ► · 9 » 9 9 • · 999 • · · ·· ·· ·« ·« • 9 · 9

9 99 ·· 9 9 9 • 9 9 · • · · ·

Ovlivnění tvorby bílých krvinek a neutrofilů konjugáty podle vynálezu

V dalším provedení může být konjugát polypeptidu podle vynálezu charakterizován jako konjugát s aktivitou G-CSF, který obsahuje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí odlišnou alespoň jedním aminokyselinovým zbytkem od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1, a který obsahuje alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na vazebnou skupinu polypeptidu, přičemž konjugát polypeptidu dále splňuje alespoň jedno z ío následujících kritérií (A) až (D):

(A) Po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti krysám (vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu):

i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek alespoň přibližně ve stejné míře a na alespoň přibližně stejnou úroveň (měřeno jako počet buněk na litr krve) jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek (měřeno jako počet buněk na litr krve) nad hladinu bílých krvinek před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod, s výhodou po dobu alespoň přibližně 120 hod.

(B) Po subkutánním podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti krysám (vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu):

i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu (měřeno jako počet buněk na litr krve) jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a

• · 9 • 9 ·· ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek (měřeno jako počet buněk na litr krve) nad hladinu bílých krvinek před podáním na dobu alespoň přibližně 72 hod, s výhodou alespoň přibližně 96 hod, výhodněji alespoň přibližně

120 hod.

(C) Po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti krysám (vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu):

i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně ío stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu (měřeno jako počet buněk na litr krve) jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů (měřeno jako počet buněk na litr krve) nad hladinu neutrofilů před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod, s výhodou alespoň přibližně 120 hod.

(D) Po jednom subkutánním podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti krysám (vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu):

i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu (měřeno jako počet buněk na litr krve) jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů (měřeno jako počet buněk na litr krve) nad hladinu neutrofilů před podáním po dobu alespoň přibližně 72 hod, s výhodou alespoň přibližně 96 hod, výhodněji alespoň přibližně 120 hod.

·0 • » · 0

0 0 0 • 0 000

♦ ♦ 00 0 * · 0

0 0

0· •00 • * ♦ 0 0 0

Nepolypeptidová část konjugátu podle vynálezu

Jak je uvedeno výše, nepolypeptidová část konjugátu podle předkládaného vynálezu se s výhodou volí ze skupiny molekuly polymeru, lipofilní sloučeniny, uhlohydrátové skupiny (například glykosylací in vivo) a organického derivatizačního činidla. Všechny tyto látky mohou propůjčit polypeptidová části konjugátu žádoucí vlastnosti, zvláště zvýšený funkční poločas in vivo a/nebo zvýšený poločas v séru. Polypeptidová část konjugátu je normálně konjugována pouze k jednomu typu nepolypeptidové části, ale může ío být také konjugována ke dvěma nebo více různým typůj nepolypeptidových částí, například k molekule polymeru a/nebo oligosacharidové skupině, k lipofilní skupině a oligosacharidové skupině, k organickému derivatizačnímu činidlu a oligosacharidové skupině, k lipofilní skupině a molekule polymeru atd. Konjugace dvou nebo více různých nepolypeptidových částí může být provedena současně nebo postupně.

Způsoby přípravy konjugátu podle předkládaného vynálezu

V následujících částech nazvaných „Konjugace k lipofilní sloučenině“, „Konjugace k molekule polymeru“, „Konjugace k oligosacharidové skupině“ a „Konjugace k organickému derivatizačnímu činidlu“ se popisuje konjugace ke specifickým typům nepolypeptidových částí. Konjugát polypeptidu podle vynálezu může být obecně vyráběn kultivací vhodné hostitelské buňky za podmínek vedoucích k expresi polypeptidu a izolací polypeptidu, kde a) polypeptid obsahuje alespoň jedno N- nebo O-glykosylační místo a hostitelská buňka je eukaryotická hostitelská buňka schopná glykosylace in vivo, a/nebo b) polypeptid je vystaven konjugaci s nepolypeptidovou skupinou in vitro.

φ φ φφ φ φ φ

- 36 φφ φφ * · φ φ • φ φ · φ φ φφφ φφ • φ Φ· * φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ ·· φφφφ

Konjugace k lipofilní sloučenině

Polypeptid a lipofilní sloučenina mohou být spolu konjugovány buď přímo nebo použitím propojovací skupiny. Lipofilní sloučenina může být přírodní sloučenina jako je nasycená nebo nenasycená mastná kyselina, diketon mastné kyseliny, terpen, prostaglandin, vitamin, karotenoid nebo steroid, nebo syntetická sloučenina jako je kyselina uhličitá, alkohol, amin a sulfonová kyselina, s jednou nebo více alkylovou, arylovou, alkenylovou skupinou nebo jiné vícenásobně nenasycené sloučeniny. Konjugace mezi polypeptidem a lipofilní sloučeninou, popřípadě prostřednictvím propojovací skupiny, se může provádět metodami známými v oboru, například jak se popisuje v Bodanszky v Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 a ve WO 96/12505.

Konjugace k molekule polymeru

Molekula polymeru pro vazbu k polypeptidů může být jakákoli vhodná molekula polymeru, jako je přírodní nebo syntetický homopolymer nebo heteropolymer, typicky s molekulovou hmotností v rozmezí přibližně 300 až 100 000 Da, jako je přibližně 500 až 20 000

Da, výhodněji v rozmezí od 1000 do 15 000 Da, ještě výhodněji v rozmezí přibližně 2000 až 12 000 Da, jako přibližně 3000 až 10 000. Jestliže se používá ve smyslu molekul polymeru, výraz „přibližně“ označuje přibližnou průměrnou molekulovou hmotnost a odráží skutečnost, že u daného preparátu polymeru se obvykle vyskytuje určitá distribuce molekulových hmotností.

Příklady homopolymerů zahrnují polyol (např. poly-OH), polyamin (tj. poly-Nhh) a polykarboxylovou kyselinu (tj. poly-COOH). Heteropolymer je polymer, který obsahuje různé vazebné skupiny, jako je hydroxylová skupina a aminová skupina.

• ·

*·

Mezi příklady vhodných molekul polymerů patří molekuly polymerů zvolené ze skupiny polyalkylenoxid (PAO), včetně polyalkylenglykolu (PAG), jako je přímý nebo rozvětvený polyethylenglykol (PEG) a polypropylenglykol (PPG), polyvinylalkohol (PVA), polykarboxylát, poly-(vinylpyrolidon), kopolymer polyethylenanhydrid kyseliny maleinové, kopolymer polystyren-anhydrid kyseliny maleinové, dextran včetně karboxymethyldextranu nebo jakýkoli jiný biopolymer vhodný pro snížení imunogenicity a/nebo zvýšení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu v séru. Další příklad molekuly polymeru je lidský albumin nebo jiný protein přítomný ve velkém množství v plasmě. Obecně jsou polymery odvozené od polyalkylenglykolu biologicky kompatibilní, netoxické, neantigenní, neimunogenní, mají různé vlastnosti z hlediska rozpustnosti ve vodě a snadno se z živých organismů vylučují.

Výhodná molekula polymeru je PEG, protože obsahuje pouze malé množství reaktivních skupin schopných zesítění v porovnání s polysacharidy jako je dextran. Zajímavý je zvláště monofunkční PEG, např. methoxypolyethylenglykol (mPEG), protože podléhá poměrně jednoduchým chemickým reakcím (pro konjugaci s vazebnými skupinami na polypeptidů je dostupná pouze jedna reaktivní skupina). Důsledkem je, že je eliminováno riziko zesítění, výsledné konjugáty polypeptidů jsou homogennější a reakci molekul polymeru s polypeptidem je možno snáze řídit.

Aby bylo možno uskutečnit kovalentní vazbu molekuly nebo molekul polymeru k polypeptidů, hydroxylové koncové skupiny molekuly polymeru jsou přítomny v aktivované formě, například s reaktivními funkčními skupinami. Vhodné molekuly aktivovaného polymeru jsou komerčně dostupné, například u firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, AL, USA nebo u firmy PolyMASC

Pharmaceuticals plc, UK. Alternativně mohou být molekuly polymeru aktivovány běžnými metodami známými v oboru, například jak se popisuje ve WO 90/13540. Specifické příklady aktivovaných molekul • · 0

00 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 • 0 04

0 0

0

0 0 0 0 0* ·«·· přímého nebo rozvětveného polymeru pro použití v předkládaném vynálezu se popisují v katalozích Shearwater Polymers, Inc. 1997 a 2000 (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, které se zařazují odkazem). Mezi specifické příklady aktivovaných polymerů PEG patří následující přímé PEG: NHS-PEG (např. SPA PEG, SSPAPEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, a SCMPEG), a NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TŘES PEG, VS-PEG, IODO-PEG, a MAL-PEG, a ío rozvětvené PEG jako je PEG2-NHS a látky popisované v US 5,932,462 a US 5,643,575, které jsou oba zahrnuty odkazem. Použitelné molekuly polymeru a/nebo PEGylační reakce se navíc popisují v následujících publikacích: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US

5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO

94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439

508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US

5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 a EP 154 316.

Konjugace polypeptidu a aktivovaných molekul polymeru se provádí použitím kterékoli běžné metody, například jak se popisuje v následujcích odkazech (kde se také popisují vhodné metody aktivace molekul polymerů): R. F. Taylor, (1991), „Protein immobilisation. Fundamental and applications“, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong (1992), „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking“, CRC

Press, Boča Raton; G. T. Hermanson a další, (1993), „Immobilized

Affinity Ligand Techniques“, Academie Press, N.Y.). Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že způsob aktivace a/nebo chemické reakce používané při konjugaci, které jsou vhodné v rámci předkládaného vynálezu, závisí na vazebné skupině nebo skupinách polypeptidu (jejich příklady jsou uvedeny dále) stejně jako na funkčních skupinách polymeru (jako je například amin, hydroxyl, karboxyl, aldehyd, sulfydryl, sukcinimidyl, maleimid, vinysulfon nebo haloacetát). PEGylace může být zaměřena na konjugaci ke všem dostupným vazebným skupinám na polypeptidu (tj. takovým vazebným skupinám, které jsou vystaveny na povrchu polypeptidu) nebo může být zaměřena na jednu nebo více specifických vazebných skupin, například N-koncovou aminoskupinu (US 5,985,265). Konjugace se může dále uskutečňovat jednostupňově nebo více stupňové (například jak se popisuje ve WO 99/55377).

Bude zřejmé, že PEGylace se navrhne tak, aby poskytla optimální molekulu s ohledem na počet navázaných molekul PEG, velikost a formu těchto molekul (například zda jsou přímé nebo rozvětvené) a na kterém místě v polypeptidu jsou tyto molekuly navázány. Molekulová hmotnost použitého polymeru se bude volit na základě požadovaného účinku. Jestliže se má například primárně dosáhnout konjugace za vytvoření konjugátu s vysokou molekulovou hmotností a velikostí (například pro snížené vylučování ledvinami), je možno zvolit konjugát buď jedné nebo několika molekul polymeru s vysokou molekulovou hmotností nebo většího počtu molekul polymeru s nižší molekulovou hmotností pro dosažení požadovaného účinku. S výhodou se však použije několik molekul polymeru s nižší molekulovou hmotností. Jestliže je žádoucí dosáhnout vysokého stupně odstínění epitopu, je možno toho dosáhnout dostatečně vysokým počtem molekul nízkomolekulárního polymeru (například s molekulovou hmotností přibližně 5000 Da) pro účinné odstínění všech nebo většiny epitopů polypeptidu. Může být použito například 2 až 8, jako je 3 až 6 těchto polymerů. Jak ilustruje příklad uvedený dále, může být výhodné připravit větší počet molekul polymeru s vyšší molekulovou hmotností (např. 4 až 6 s Mh 5000) ve srovnání s

- 40 menším počtem molekul polymeru s vyšší molekulovou hmotností (např. 1 až 3 s Mh 12 000 až 20 000), aby se dosáhlo zvýšení funkčního poločasu in vivo konjugátu polypeptidu, i když je celková molekulová hmotnost navázaných molekul polymeru v těchto dvou případech stejná. Předpokládá se, že přítomnost většího počtu malých molekul polymeru poskytne polypeptid s větším průměrem nebo zdánlivou velikostí než například jediná, i když větší molekula polymeru, alespoň v případech, kdy jsou molekuly polymeru relativně stejnoměrně rozptýleny na povrchu polypeptidu. I když konjugace io pouze jediné molekuly polymeru na jednu vazebnou skupinu na proteinu není výhodná, v případě, kdy je navázána pouze jedna molekula polymeru bude obecně výhodné, aby měla molekula polymeru, která může být přímá nebo rozvětvená, relativně vysokou molekulovou hmotnost, např. přibližně 20 kDa.

Normálně se konjugace polymeru provádí za podmínek směřujících k reakci co možná největšího počtu dostupných vazebných skupin na polymeru s molekulami polymeru. Toho se dosahuje pomocí vhodného molárního nadbytku polymeru vzhledem k polypeptidu. Typické molární poměry aktivovaných molekul polymeru k polypeptidu jsou až do přibližně 1000 : 1, jako 200 : 1 nebo 100 : 1. V některých případech může být tento poměr poněkud nižší, jako je až do přibližně 50 : 1, 10 : 1 nebo 5:1.

Podle vynálezu se také uvažuje vazba molekul polymeru k polypeptidu prostřednictvím propojovací skupiny (linkeru). Vhodné propojovací skupiny jsou odborníkům v oboru známé. Výhodným příkladem je kyanurchlorid (Abuchowski a další, (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578 - 3581; US 4,179,337; Shafer a další (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375 - 378).

Po konjugaci se zbylé aktivované molekuly polymeru blokují známými metodami, například přidáním primárního aminu do reakční ·♦ ·· • * · 9 • · · 4 • 9 444

- 41 -·».· ..·

44

4 9 4

4 4

4 4

4 4

4494 směsi, a výsledné inaktivované molekuly polymeru se odstraňují vhodným způsobem (viz část Materiály a metody).

Ve výhodném provedení obsahuje konjugát polypeptidu podle vynálezu molekulu polypeptidu navázanou na některé, nejvýhodněji s výhodou v podstatě všechny lysinové zbytky v polypeptidu dostupné pro PEGylaci, zvláště molekulu přímého nebo rozvětveného PEG, například s molekulovou hmotností přibližně 1 až 15 kDa, typicky přibližně 2 až 12 kDa, jako je přibližně 3 až 10 kDa, např. přibližně 5 nebo 6 kDa.

io Bude zřejmé, že v závislosti na okolnostech, například aminokyselinové sekvenci polypeptidu, povaze aktivované sloučeniny PEG a specifických podmínkách PEGylace včetně molárního poměru PEG k polypeptidu, může být možné získat různé stupně PEGylace, přičemž vyšší stupně PEGylace se obecně získávají s vyšším poměrem PEG k polypeptidu. PEGylované polypeptidy získané jakýmkoli uvedeným způsobem PEGylace však obvykle obsahují náhodnou distribuci polypeptidových konjugátů s mírně odlišnými stupni PEGylace.

V ještě dalším provedení může obsahovat konjugát polypeptidu podle vynálezu molekulu PEG navázanou na lysinové zbytky v polypeptidu dostupné pro PEGylaci a navíc na N-koncovou aminokyselinu polypeptidu.

Vazba na oligosacharidovou část

Konjugace k oligosacharidové části může probíhat in vivo nebo in vitro. Aby se dosáhlo glykosylace in vivo molekuly G-CSF obsahující jedno nebo více glykosylačních míst, musí být nukleotidová sekvence kódující polypeptid vložena do glykosylujícího, eukaryotického expresního hostitele. Expresní hostitelská buňka může být zvolena z houbových (vláknité houby nebo kvasinky), hmyzích nebo zvířecích

-42 buněk, nebo z buněk transgenních rostlin. V jednom provedení je hostitelskou buňkou savčí buňka, jako je buňka CHO, BHK nebo HEK, např. HEK 293, nebo hmyzí buňka, jako je buňka SF9, nebo kvasinková buňka, např. S. cerevisiae nebo Pichia pastoris, nebo jakákoli z dále uváděných hostitelských buněk. Je také možno použít kovalentní vazby in vitro glykosidů (jako je dextran) na aminokyselinové zbytky polypeptidu, např. jak se popisuje ve WO 87/05330 a v Aplin a další, CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259 - 306, 1981.

ío Vazba in vitro oligosacharidových skupin nebo PEG na zbytky

Gin navázané na protein a peptid může být prováděna pomocí transglutamináz (TGáz). Transglutaminázy katalyzují přenos donorových aminových skupin na zbytky Gin navázané na protein nebo peptid při tzv. zesíťující reakci. Donorové aminové skupiny mohou být navázány na protein nebo peptid, například jako je εaminoskupina zbytků Lys, nebo mohou být součástí malé nebo velké organické molekuly. Příkladem malé organické molekuly fungující jako donor aminoskupiny v zesítění katalyzovaném TGázou je putrescin (1,4-diaminobutan). Příkladem větší organické molekuly fungující jako donor aminoskupiny v zesíťující reakci katalyzované TGázou je PEG obsahující aminoskupiny (Sáto a další, Biochemistry 35,13072 13080).

TGázy jsou obecně vysoce specifické enzymy, a ne každý zbytek Gin exponovaný na povrchu proteinu je dostupný zesítění katalyzovanému TGázou na látky s obsahem aminoskupin. Naopak pouze malé množství zbytků Gin fungují přirozeně jako substráty pro TGázu, ale přesné parametry rozhodující, které zbytky Gin jsou vhodné jako substráty TGázy, zůstávají neznámé. Aby se tedy mohl protein převést do formy vhodné jako substrát pro zesíťující reakce katalyzované TGázou, často je nezbytným požadavkem přidat do vhodných poloh řetězce aminokyselin, o kterých je známo, že fungují velmi dobře jako substráty TGázy. O několika takových aminokyselinových sekvencích je známo, že jsou nebo že obsahují vynikající přirozené substráty TGázy, jako je například substance P, elafin, fibrinogen, fibronectin, inhibitor a2-plasminu, α-kaseiny a βkaseiny.

-43 ·· ·* • · 9 • · t • 9 9 9 • 9 99 ·»; ·« • 9 9 9 • · «« • · · 9 • · · « «< ·« » · 9

1*9 ·* 9 69 ·

Vazba na organické derivatizující činidlo

Kovalentní modifikace polypeptidu s aktivitou G-CSF může být prováděna reakcí jedné nebo více vazebných skupin polypeptidu s organickým derivatizačním činidlem. Vhodná derivatizační činidla ío a způsoby jsou v oboru dobře známé. Například cysteinylové zbytky nejběžněji reagují s α-haloacetáty (a odpovídajícími aminy), jako je kyselina chloroctová nebo chloroacetamid, za poskytnutí karboxymethylových nebo karboxyamidomethylových derivátů. Cysteinylové zbytky jsou také derivatizovány reakcí s bromtrifluoracetonem, kyselinou a-brom-p-(4-imidozoyl)propionovou, chloracetylfosfátem, N-alkylmaleimidy, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, methyl-2-pyridyldisulfidem, p-chlormerkuribenzoátem, 2-chlormerkuri-4-nitrofenolem nebo chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem. Histidylové zbytky jsou derivatizovány reakcí s diethylpyrokarbonátem při pH 5,5 až 7,0, protože toto činidlo je poměrně specifické pro histidylový postranní řetězec. Použitelný je také para-bromfenacylbromid. Reakce se s výhodou provádí v 0,1M kakodylátu sodném při pH 6,0. Lysinylové a aminokoncové zbytky reagují s anhydridem kyseliny jantarové nebo jinými anhydridy karboxylových kyselin. Derivatizace těmito činidly způsobí převrácení náboje lysinylových zbytků. Další vhodná činidla pro derívatizací zbytků s obsahem α-aminoskupin zahrnují imidoestery jako je methylpikolinimidát, pyridoxalfosfát, pyridoxal, chlorborohydrid, kyselina trinitrobenzensulfonová, O-methylisomočovina, 2,4pentandion a transaminázou katalyzované reakce s glyoxylátem. Arginylové zbytky se modifikují reakcí s jedním nebo několika běžnými činidly, jako je mj.

• · « « ·

- 44 ·· fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin.

Derivatizace argininových zbytků vyžaduje provádění reakce za alkalických podmínek pro vysokou hodnotu pKa guanidinové funkční skupiny.

• © • ·00

Tato činidla mohou dále reagovat se skupinami lysinu stejně jako guanidinovou skupinou argininu. Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl) se selektivně modifikují reakcí s karbodiimidy (R-N=C=N-R’), kde R a R’ jsou odlišné alkylové skupiny, jako je 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)karbodiimid nebo 1 -ethyl-3-(4io -azonia-4,4-dimethylpentyl)karbodiimid. Aspartylové a glutamylové zbytky se dále převádějí na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amoniovými ionty.

Blokování funkčního místa

Bylo publikováno, že nadměrná konjugace polymeru může vést ke ztrátě aktivity polypeptidu, na který je polymer konjugován. Tento problém je možno odstranit například odstraněním vazebných skupin umístěných na funkčním místě nebo blokováním funkčního místa před konjugací, takže funkční místo je blokováno v průběhu konjugace.

Tato naposleldy uvedená strategie tvoří další provedení vynálezu (první strategie již byla uvedena jako příklad výše, například odstraněním lysinových zbytků, které mohou být umístěny v blízkosti funkčního místa. Konkrétněji, podle druhé strategie se konjugace mezi polypeptidem a nepolypeptidovou částí provádí za podmínek, kdy je funkční místo polypeptidu blokováno pomocnou molekulou schopnou vázat se na funkční místo polypeptidu.

Pomocná molekula je s výhodou taková, která specificky rozpoznává funkční místo polypeptidu jako je receptor, zvláště receptor G-CSF nebo část receptoru G-CSF.

• · • · • ·

Pomocnou molekulou může být alternativně protilátka, zvláště monoklonální protilátka rozpoznávající polypeptid s aktivitou G-CSF.

Pomocnou molekulou může být zvláště neutralizující monoklonální protilátka.

Polypeptid se ponechá reagovat s pomocnou molekulou před provedením konjugace. To zajišťuje, aby bylo funkční místo polypeptidu odstíněno nebo chráněno, a aby tedy bylo nedostupné pro derivatizaci nepolypeptidovou částí, jako je polymer. Po jeho elucí z pomocné molekuly může být konjugát mezi nepolypeptidovou částí a polypeptidem izolován s alespoň částečně zachovaným funkčním místem. Následná konjugace polypeptidu s blokovaným funkčním místem k polymeru, lipofilní sloučenině, oligosacharidové části nebo organickému derivatizujícímu činidlu nebo jakékoli jiné sloučenině se provádí normálním způsobem, například jak se popisuje v částech výše, s názvy „Konjugace s ...“.

Bez ohledu na povahu pomocné molekuly, která se používá pro odstínění funkčního místa polypeptidu od konjugace, je žádoucí, aby byla pomocná molekula prostá vazebných skupin pro vybranou nepolypeptidovou část, nebo aby obsahovala pouze malé množství takových skupin v části nebo částech molekuly, kde by konjugace k takovým skupinám ohrozila desorpci konjugovaného polypeptidu z pomocné molekuly. Tím je možno dosáhnout selektivní konjugace k vazebným skupinám přítomným v neodstíněných částech polypeptidu a je možné znovu používat pomocnou molekulu pro opakované cykly konjugace. Jestliže je například nepolypeptidovou částí molekula polymeru jako je PEG, která jako vazebnou skupinu obsahuje epsilonaminoskupinu lysinu nebo N-koncovou aminokyselinu, je žádoucí, aby pomocná molekula v podstatě neobsahovala konjugovatelné epsilonaminoskupiny, s výhodou neobsahaovaia jakékoli epsilon30 aminoskupiny. Ve výhodném provedení je tedy pomocnou molekulou protein nebo peptid schopný vazby na funkční místo polypeptidu, kde tento protein nebo peptid je prostý jakýchkoli konjugovatelných vazebných skupin pro zvolenou nepolypeptidovou část.

Zvláště zajímavé v souvislosti s provedením předkládaného vynálezu, kdy polypeptidové konjugáty se připravují z diverzifikované populace nukleotidových sekvencí kódujících sledovaný polypeptid, je případ, kdy se blokování funkční skupiny uskutečňuje před konjugací v mikrotitračních destičkách, například nanesením exprimované varianty polypeptidu do mikrotitrační destičky obsahující imobilizovanou blokující skupinu jako receptor, protilátku apod.

V dalším provedení se pomocná molekula nejprve kovalentně naváže na pevnou fázi jako jsou náplně pro kolony, například Sephadex nebo kuličky agarózy, nebo na povrch, například povrch reakčni nádoby. Potom se polypeptid nanese na materiál kolony nesoucí pomocnou molekulu a způsoby známými v oboru se provádí konjugace, například jak se popisuje v částech uvedených výše, nazvaných „Konjugace k Tento postup umožní separaci polypeptidového konjugátu od pomocné molekuly elucí. Konjugát polypeptidu se eluuje běžnými způsoby za fyzikálně-chemických podmínek, které nevedou k podstatnější degradaci polypeptidového konjugátu. Kapalná fáze obsahující polypeptidový konjugát se oddělí od pevné fáze, na které zůstanou kovalentně navázané pomocné molekuly. Separace je možno dosáhnout jinými způsoby: pomocná molekula může být například derivatizována druhou molekulou (např. biotinem), která může být rozpoznána specifickým vazebným činidlem (např. streptavidin). Specifické vazebné činidlo může být navázáno na pevnou fázi a tím umožnit separaci konjugátu polypeptidu od komplexu pomocná molekula - druhá molekula pasáží přes kolonu s pevnou fází s navázanou druhou pomocnou molekulou, která zachytí po následné eluci komplex pomocná molekula - druhá molekula, ale nikoli konjugát polypeptidu. Konjugát polypeptidu může být uvolněn z pomocné molekuly jakýmkoli vhodným způsobem. Odstranění ochranných skupin se může provádět poskytnutím podmínek, při kterých pomocná » ·

Λ-f · ··· ·· · · «·· · ·

- (·“ · · · ·· · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ···· molekula disociuje od funkčního místa G-CSF, na kterém je navázána.

Například komplex mezi protilátkou, ke které je polymer konjugován, a antiidiotypickou protilátkou, může být disociován úpravou pH do kyselé nebo alkalické oblasti pH.

Konjugace polypeptidů opatřeného značkou

V alternativním provedení je polypeptid exprimován jako fúzní protein se značkou (tágem), tj. aminokyselinovou sekvencí nebo peptidovým řetězcem vytvořeným z typicky 1 až 30, jako 1 až 20 io aminokyselinových zbytků. Kromě toho, že umožňuje rychlé a snadné čištění, je značka pohodlným nástrojem pro dosažení konjugace mezi značeným polypeptidem a nepolypeptidovou částí. Značka může být použita zvláště pro dosažení konjugace v mikrotitračních destičkách nebo jiných nosičích, jako jsou paramagnetické kuličky, ke kterým může být značený polypeptid imobilizován prostřednictvím značky. Konjugace ke značenému polypeptidů například na mikrotitračních destičkách má výhodu v tom, že značený polypeptid může být v mikrotitračních destičkách imobilizován přímo z kultivační půdy (v podstatě bez jakéhokoli čištění) a může se provést konjugace. Tím

2o je možno snížit celkový počet kroků při zpracování (od exprese ke konjugaci). Navíc může značka fungovat jako mezerníková molekula, která zajistí zlepšenou přístupnost konjugovaného imobilizovaného polypeptidů. Konjugace s použitím značeného polypeptidů může probíhat s jakoukoli popisovanou nepolypeptidovou částí, například s molekulou polymeru jako je PEG.

Identita specifické použité značky není kritická, pokud je značka schopna exprese spolu s polypeptidem, a je schopna imobilizace na vhodném povrchu nosiče. Komerčně je dostupný velký počet vhodných značek, například u firmy Unizyme Laboratories, Dánsko. Značka může být tvořena například kteroukoli z následujících sekvencí:

- 4&His-His-His-His-His-His

Met-Lys-His-His-His-His-His-His

Met-Lys-His-His-Ala-His-His-GIn-His-His

Met-Lys-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn

Met-Lys-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-GIn nebo jakoukoli z následujících sekvencí:

EQKLI SEEDL (C-koncová značka popsaná v Mol. Cell. Biol. 5: 3610 - 16, 1985)

DYKDDDDK (C- nebo N-koncová značka) io YPYDVPDYA

Protilátky proti výše popsaným značkám jsou komerčně dostupné, např. u firem ADI, Aves Lab. a Research Diagnostics.

Vhodný způsob používání značeného polypeptidu pro PEGylaci se popisuje v části „Materiály a metody“, níže. Následné odštěpování značky od polypeptidu se může provádět komerčně dostupnými enzymy.

Způsoby přípravy polypeptidu podle vynálezu nebo polypeptidové části konjugátu podle předkládaného vynálezu

Polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo polypeptidové část konjugátu podle vynálezu, popřípadě v glykosylované formě, mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem známým v oboru. Tyto metody zahrnují konstrukci nukleotidové sekvence kódující polypeptid a expresi této sekvence ve vhodně transformovaném nebo transfekovaném hostiteli. Polypeptidy podle vynálezu však mohou být vyráběny, i když s nižší účinností, chemickou syntézou nebo kombinací chemické syntézy nebo kombinací chemické syntézy a rekombinantní technologie DNA.

* · • · · · · · · · · • · · · ···· ·· ·

Nukleotidové sekvence kódující polypeptid nebo polypeptidovou část konjugátu podle vynálezu může být zkonstruována izolací nebo syntézou nukleotidové sekvence kódující rodičovský G-CSF, jako je hG-CSF, s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 1, a potom změnou nukleotidové sekvence tak, aby došlo k zavedení (tj. vložení nebo substituci) nebo deleci (tj. odstranění nebo substituci) příslušného aminokyselinového zbytku nebo zbytků.

Nukleotidové sekvence se vhodně modifikuje místně specifickou mutagenezí podle běžných metod. Alternativně se nukleotidové sekvence připravuje chemickou syntézou, například použitím syntezátoru oligonukleotidů, jestliže jsou oligonukleotidy navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadovaného polypeptidu, a s výhodou s volbou kodonů tak, aby byly výhodné v hostitelské buňce, ve které se budě rekombinantní polypeptid vyrábět. Například několik malých oligonukleotidů kódujících části požadovaného polypeptidu může být syntetizováno a uspořádáno metodou PCR, ligací nebo ligační řetězovou reakcí (LCR) (Barany, PNAS 88: 189 - 193, 1991). Jednotlivé oligonukleotidy obsahují typicky 5’ nebo 3’ přesahy pro komplementární sestavení.

2o Alternativní způsoby modifikace nukleotidové sekvence jsou dostupné pro výrobu variant polypeptidů pro screening velkého množství látek, například způsoby zahrnující homologní cross-over jak se popisuje v US 5,093,257, a způsoby zahrnující míchání (shuffling) genů, tj. rekombinaci mezi dvěma nebo více homologními nukleotidovými sekvencemi vedoucí k novým nukleotidovým sekvencím obsahujícím řadu změn nukleotidů v porovnání s výchozími nukleotidovými sekvencemi. Míchání genů (známů také jako míchání DNA) zahrnuje jeden nebo více cyklů náhodné fragmentace a znovuuspořádání nukleotidových sekvencí s následným screeningem

3o pro selekci nukleotidových sekvencí kódujících polypeptidy s požadovanými vlastnostmi. Aby mohl tento proces založený na homologii nukleotidových kyselin probíhat, příslušné části

5$.

• · nukleotidových sekvencí mají s výhodou identitu alespoň 50 %, jako je alespoň 60 %, výhodněji alespoň 70 %, jako je alespoň 80 %. Rekombiňace se může provádět in vitro nebo in vivo.

Příklady vhodných metod míchání genů in vitro se popisují v publikacích Stemmer a další (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. USA; díl 91, str. 10747 - 10751; Stemmer (1994), Nátuře, díl 370, str. 389 391; Smith (1994), Nátuře díl 370, str. 324 - 325; Zhao a další, Nat. Biotechnol. 1998, Mar; 16 (3): 258 - 61; Zhao H. a Arnold F. B., Nucleic Acids Research, 1997, díl 25, No. 6, str. 1307 - 1308; Shao a ío další, Nucleic Acids Research 1998, 15. leden; 26 (2): str. 681 - 83; a WO 95/17413. Příkladem vhodné metody míchání in vivo je metoda popisovaná ve WO 97/07205. Další způsoby mutageneze sekvencí nukleových kyselin in vitro nebo in vivo rekombinací se popisují např. ve WO 97/20078 a US 5,837,458. Příklady specifických způsobů míchání zahrnují metody „family shuffling“, „synthetic shuffling“ a „in silico shuffling“. Metoda „family shuffling“ zahrnuje vystavení skupiny homologních genů od různých druhů jednomu nebo více cyklům míchání a následný screening a/nebo selekci. Tato technologie se popisuje například v Crameri a další (1998), Nátuře, díl 391, str. 288 20 291; Christians a další (1999), Nátuře Biotechnology, díl 17, str. 259 264; Chang a další (1999), Nátuře Biotechnology, díl 17, str. 793 797; a Ness a další (1999), Nátuře Biotechnology, díl 17, 893 - 896. Metoda „synthetic shuffling“ zahrnuje poskytnutí knihoven překrývajících se syntetických oligonukleotidů založených například na porovnání sekvence sledovaných homologních genů. Tyto synteticky vytvořené oligonukleotidy se rekombinují a získané rekombinantní sekvence nukleových kyselin se prozkoumávají a v případě potřeby použijí pro další cykly míchání. Tyto technologie se popisují ve WO 00/42561. Metoda „in silico shuffling“ se týká postupu míchání DNA, který se provádí nebo modeluje s použitím počítačového systému, čímž se částečně nebo zcela zabrání nutnosti fyzické manipulace s nukleovými kyselinami. Tyto technologie se popisují ve WO 00/42560.

Jakmile je sekvence uspořádána (syntézou, místně specifickou mutagenezí nebo jiným způsobem), vloží se tato nukleotidová sekvence kódující polypeptid do rekombinantního vektoru a operativně se naváže na kontrolní sekvence nezbytné pro expresi G-CSF v požadované transformované hostitelské buňce.

Mělo by být zřejmé, že ne všechny sekvence řídící expresi fungují stejně dobře pro expresi nukleotidové sekvence kódující zde popisovaný polypeptid. Všechny hostitelské buňky také nebudou stejně fungovat u stejného expresního systému. Odborník v oboru však může z těchto vektorů, expresních řídících sekvencí a hostitelů vybrat bez nadměrného experimentování. Například při volbě vektoru se musí brát v úvahu hostitel, protože vektor se musí v hostiteli replikovat nebo musí být schopen integrace do chromosomu. Počet kopií vektoru, schopnost řídit počet kopií a exprese kteréhokoli z dalších proteinů kódovaných vektorem, jako jsou antibiotické markéry, by měly být rovněž vzaty v úvahu. Při volbě sekvence řídící expresi je třeba rovněž vzít ohled na řadu faktorů. Patří sem například relativní síla sekvence, možnost jejího řízení a její kompatibilita s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid, zvláště co se týče potenciálních sekundárních struktur. Hostitelé by měli být voleni na základě jejich kompatibility s vybraným vektorem, toxicity produktu kódovaného nukleotidovou sekvencí, jejich sekrečních vlastností, jejich schopnosti správně skládat polypeptid, jejich požadavků na fermentaci nebo kultivaci a snadnosti čištění produktů kódovaných nukleotidovou sekvencí.

Rekombinantní vektor může být autonomně se replikující vektor, například vektor, který existuje jako extrachromosomální jednotka,

3o jehož replikace nezávisí na replikaci chromosomu, například plasmid. Alternativně je vektorem takový vektor, který se při zavedení do

• · · • · hostitelské buňky integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromosomem nebo chromosomy, do kterých byl integrován.

Vektorem je s výhodou expresní vektor, ve kterém je nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle vynálezu operativně spojena s dalšími úseky nezbytnými pro trnskripci nukleotidové sekvence. Vektor je typicky odvozen od plasmidové nebo virové DNA. Komerčně dostupná nebo popsaná v literatuře je celá řada vhodných expresních vektorů pro expresi v hostitelských buňkách uvedenou v tréto přihlášce. Použitelné expresní vektory pro eukaryotické hostitele zahrnují například vektory obsahující sekvence řídící expresi z viru SV40, bovinního papilomaviru, adenovirů a cytomegaloviru. Konkrétní vektory jsou například pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a pCI-neo (Stratagen, La Jolla, CA, USA).

Použitelné expresní vektory pro kvasinkové buňky zahrnují plasmid 2μ a jeho deriváty, vektor POT1 (US 4,931,373), vektor pJS037 popsaný v Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202 - 207, 1996 a vektory pPICZ A, B nebo C (Invitrogen). Vektory použitelné ve hmyzích buňkách zahrnují pVL941, pBG311 (Cate a další, „Isolation of the

Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene In Animal Celis“, Cell, 45, str. 685 - 98 (1986), pBluebac 4.5 a pMelbac (oba dostupné u firmy Invitrogen). Použitelné expresní vektory pro bakteriální hostitele zahrnují známé bakteriální plasmidy, jako plasmidy E. coli, včetně pBR322, pET3a a pET12a (oba Novagen Inc., Wl, USA), plasmidy s širším okruhem hostitelů jako je RP4, fágové DNA, např. četné deriváty fágu lambda, např. NM989, a jiné DNA fágy, jako je M13 a vláknité fágy s jednořetězcovou DNA.

Jiné vektory pro použití v rámci předkládaného vynálezu zahrnují vektory, které umožňují amplifikaci počtu kopií nukleotidové sekvence kódující polypeptid. Tyto amplifikovatelné vektory jsou dobře známé v oboru. Patří sem například vektory schopné amplifikace

53prostřednictvím amplifikace DHFR (viz např. Kaufman, US patent No. 4,470,461, Kaufman a Sharp, „Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression“, Mol. Cell. Biol., 2, str. 1304 - 19 (1982)) a amplifikace glutaminsyntetázou („GS“) (viz např. US 5,122,464 a EP 338,841).

Rekombinantní vektor může dále obsahovat sekvenci DNA umožňující replikaci vektoru v příslušné hostitelské buňce. Příkladem takové sekvence (jestliže je hostitelskou buňkou savčí buňka) je ío počátek replikace SV40. Jestliže je hostitelskou buňkou kvasinková buňka, vhodné sekvence umožňující replikaci vektoru jsou replikační geny REP 1-3 a počátek replikace kvasinkového plasmidu 2μ.

Vektor také může obsahovat markér umožňující selekci, například gen, jehož produkt nahrazuje defekt v hostitelské buňce, jako je gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR) nebo gen TPI Schizosaccharomyces pombe (popsaný v P. R. Russell, Gene 40, 1985, str. 125 - 130), nebo který propůjčuje rezistenci na léčivo, např. ampicilin, kanamycin, tetracyklin, chloramfenikol, neomycin, hygromycin nebo methotrexát. Pro Saccharomyces cerevisiae patří mezi markéry umožňující selekci ura3 a Ieu2. Pro vláknité houby zahrnují selektovatelné markéry amdS, pyrG, arcB, niaD a sC.

Termín „řídící sekvence“ se zde definuje tak, že zahrnuje všechny složky, které jsou nutné nebo výhodné pro expresi polypeptidu podle vynálezu. Každá řídící sekvence může být ve vztahu k sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid nativní nebo cizí. Mezi tyto řídící sekvence patří bez omezení úvodní sekvence, polyadenylační sekvence, propeptidová sekvence, promotor, zesilující sekvence nebo aktivační sekvence umístěná proti směru transkripce, signální peptidová sekvence a terminátor transkripce. Jako minimum zahrnují řídící sekvence promotor.

- 54»V předkládaném vynálezu může být použita široká řada sekvencí řídících expresi. Tyto použitelné sekvence řídící expresi zahrnují sekvence řídící expresi asociované se strukturními geny výše uvedených expresních vektorů, stejně jako jakoukoli sekvenci, o které je známo, že řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů, a jejich různé kombinace.

Příklady vhodných řídících sekvencí pro směrování transkripce v savčích buňkách jsou promotory rané a pozdní fáze SV40 a adenoviru, např. promotor pozdní hlavní fáze adenoviru 2, promotor

MT-1 (metalothioneinový gen), promotor genu brzé ramnné fáze cytomegaloviru (CMV), promotor lidského elongačního faktoru 1a (EF1a), promotor proteinu indukovatelného minimálním tepelným šokem Drosophila, promotor viru Rousova sarkomu (RSV), promotor lidského ubiquitinu C (UbC), terminátor lidského růstového hormonu, is polyadenylační signály SV40 nebo oblasti Elb adenoviru a Kozáková konvenční sekvence (Kozák M., J. Mol. Biol., 1987, 20. srpen; 196(4):

947 - 50).

Pro zvýšení exprese v savčích buňkách může být do 5’nepřekládané oblasti nukleotidové sekvence kódující polypeptid vložen

2o syntetický intron. Příkladem syntetického intronu je syntetický intron z plasmidu pCI-Neo (dostupný u firmy Promega Corporation, WI, USA).

Příklady vhodných řídících sekvencí pro směrování transkripce v hmyzích buňkách patří polyhedrinový promotor, promotor P10, promotor bazického proteinu polyhedrozového viru Autographa californica, promotor genu 1 brzké rané fáze bakuloviru, promotor 39K genu pozdější rané fáze bakuloviru a polyadenylační sekvence SV40. Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití ve kvasinkových buňkách zahrnují promotory systému α-mating kvasinek, promotor

3o kvasinkové triozafosfátisomerázy (TPI), promotory z kvasinkových glykolytických genů nebo genů pro alkoholdehydrogenázu, promotor • · · 0 <··· · · · 0

0 · 0 00 00 0 0 «

ADH2-4c a indukovatelný promotor GAL. Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití ve vláknitých houbových hostitelských buňkách zahrnují promotor a terminátor ADH3, promotor odvozený od genů kódujících triozafosfátisomerázu TAKA amylázy nebo alkalickou proteázu Aspergillus oryzae, α-amylázu A. niger, glukoamylázu A. niger nebo A. nidulans, acetamidázu A. nidulans, aspartátproteinázu nebo lipázu Rhizomucor miehei, terminátor TR11 a terminátor ADH3. Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití v bakteriálních hostitelských buňkách zahrnují promotory systému lac, systému trp, io systému TAC nebo TRC a hlavní promotorové oblasti tága lambda.

Přítomnost nebo nepřítomnost signálního peptidu bude například záviset na expresní hostitelské buňce použité pro produkci polypeptidu určeného k expresi (ať už jde o intracelulární nebo extracelulární polypeptid), a zda je žádoucí dosáhnout sekrece. Pro použití ve vláknitých houbách může být signální peptid vhodně odvozen od genu kódujícího amylázu nebo glukoamylázu Aspergillus sp., genu kódujícího lipázu nebo proteázu Rhizomucor miehei nebo lipázu Humicola lanuginosa. Signální peptid je s výhodou odvozený kódujícího amylázu TAKA A. oryzae, neutrální α-amylázu A. niger, amylázu stabilní v kyselém prostředí A. niger nebo glukoamylázu A. niger. Pro použití ve hmyzích buňkách může být signální peptid vhodně odvozen od hmyzího genu (srov. WO 90/05783), jako je prekurzor adipokinetického hormonu Lepidopteran manduca sexta (srov. US 5,023,328), melittin včely medonosné (Invitrogen), ecdysteroid UDPglukosyltransferáza (egt) (Murphy a další, Protein Expression and Purification 4, 349 - 357 (1993) nebo lidská pankreatická lipáza (hpl) (Methods in Enzymology 284, str. 262 - 272, 1997). Výhodný signální peptid pro použití v savčích buňkách je signální peptid hG-CSF myšího lehkého řetězce Ig kappa (Coloma, M.

(1992), J. Imm. Methods 152: 89 - 104). Pro použití ve kvasinkových buňkách bylo zjištěno, že vhodné signální peptidy jsou signální peptid α-faktoru ze S. cerevisiae (srov. US 4,870,008), signální peptid

ι

99 • 9 · ♦

9«9

9 9 « modifikované karboxypeptidázy (srov. L. A. Valíš a další, Cell 48,1987, str. 887 - 897), signální peptid kvasinkového BAR1 (srov. WO 87/02670), signální peptid kvasinkové aspartátproteázy 3 (YAP3) (srov. M. Egel-Mitani a další, Yeast 6, 1990, str. 127 - 137) a syntetická úvodní sekvence TA57 (WO 98/32867). Vhodný signální peptid pro použití v buňkách E. coli je signální peptid ompA.

Nukleotidové sekvence podle vynálezu kódující polypeptid s aktivitou G-CSF, ať už připravený místně specifickou mutagenezí, syntézou, PCR nebo jinými metodami, může také popřípadě obsahovat io nukleotidovou sekvenci, která kóduje signální peptid. Signální peptid je přítomen, jestliže má být polypeptid sekrenován z buněk, ve kterých se exprimuje. Takový signální peptid, pokud je přítomen, by měl být rozpoznáván buňkou zvolenou pro expresi polypeptidu. Signální peptid může být homologní (například normálně asociovaný s hG-CSF) nebo heterologní (tj. pocházející z jiného zdroje než hG-CSF) pro polypeptid, nebo může být homologní nebo heterologní pro hostitelskou buňku, tj. může jít o signální peptid normálně exprimovaný z hostitelské buňky, nebo který není normálně hostitelskou buňkou exprimován. Signální peptid tedy může být prokaryotický, tj. odvozený od bakterie jako je E. coli, nebo eukaryotický, například odvozený od savčí, hmyzí nebo kvasinkové buňky.

Pro produkci polypeptidu nebo polypeptidové části konjugátu podle vynálezu může být použit jakýkoli vhodný hostitel včetně bakterií, hub (včetně kvasinek), rostlinných, hmyzích, savčích nebo jiných vhodných živočišných buněk nebo buněčných linií, stejně jako transgenní zvířata nebo rostliny. Mezi příklady bakteriálních hostitelských buněk patří grampozitivní bakterie jako jsou kmeny Bacillus, např. B. brevis nebo B. subtilis, Pseudomonas nebo

Streptomyces, nebo gramnegativní bakterie jako jsou kmeny E. coli.

Zavedení vektoru do bakteriální hostitelské buňky může být například uskutečněno transformací protoplastů (viz např. Chang a Cohen,

0

- 57* »·5 < • *»

1979, Molecular General Genetics 168: 111 - 115), použitím kompetentních buněk (viz např. Young a Spizizin, 1961, Journal of

Bacteriology 81: 823 - 829, nebo Dubnau a Davidoff-Abelson, 1971,

Journal of Molecular Biology 56: 209 - 221), elektroporací (viz např.

Shigekawa a Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 - 751), nebo konjugací (viz např. Koehler a Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 - 5278). Příklady vhodných hostitelských buněk vláknitých hub zahrnují kmeny Aspergillus, např. A. oryzae, A. niger, nebo A. nidulans, Fusarium nebo Trichoderma. Houbové buňky mohou být ío transformovány procesem zahrnujícím vytvoření protoplastů, transformaci protoplastů a regeneraci buněčné stěny způsobem, který je sám o sobwě známý. Vhodné postupy pro transformaci hostitelských buněk Aspergillus se popisují v EP 238 023 a US 5,679,543. Vhodné způsoby transformace kmenů Fusarium se popisují v Malardier a další,

1989, Gene 78: 147 - 156 a WO 96/00787. Příklady vhodných kvasinkových hostitelských buněk zahrnují kmeny Saccharomyces, např. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, jako je P. pastoris nebo P. methanolica, Hansenula, jako je H. polymorpha nebo Yarrowia. Kvasinky mohou být transformovány použitím postupů popsaných autory Becker a Guarente, v Abelson, J. N. a Simon, Μ. I., ed., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, díl 194, str. 182 - 187, Academie Press, Inc., New York; Ito a další, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen a další, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:

1920; a jak se popisuje v manuálu Clontech Laboratories, Inc., Palo

Alto, CA, USA (v protokolu pro výrobek Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kit). Příklady vhodných hmyzích buněk zahrnují buněčnou linii Lepidoptora, jako je Spodoptera frugiperda (Sf9 nebo Sf21) nebo buňky Trichoplusioa ni (High Five) (US

5,077,214). Transformace hmyzích buněk a produkce heterologních polypeptidů může být prováděna podle popisu firmy Invitrogen. Mezi příklady vhodných savčích hostitelských buněk patří buněčné linie • · vaječníků čínského křečka (CHO) (např. CHO-K1; ATCC CCL-61), buněčné linie z kočkodana zeleného (COS) (např. COS 1 (ATCC CRL1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); myší buňky (např. NS/O), buněčné linie z ledviny novorozeného křečka (BHK) (např. ATCC CRL-1632 nebo ATCC CCL-10) a lidské buňky (např. HEK 293 (ATCC CRL1573)), stejně jako rostlinné buňky ve tkáňové kultuře. Další vhodné buněčné linie jsou známé v oboru a dostupné z veřejných sbírek jako je American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Způsoby zavádění exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnují io transfekci prostřednictvím fosforečnanu vápenatého, elektroporaci, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem, transfekci zprostředkovanou liposomy, virové vektory a metodu transfekce popsanou v Life Technologies Ltd., Paisley, UK použitím Lipofectaminu 2000. Tyto metody jsou v oboru dobře známé a popsané například v Ausbel a další (ed.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA. Kultivace savčích buněk se provádí zavedenými metodami, například jak se popisuje v Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, ed. Nigel Jenkins, 1999, Human Press lne., Totowa, New Jersey, USA a

Harrison M. A. a Rae I. F., General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997.

Při způsobech produkce podle předkládaného vynálezu se buňky kultivují v živném médiu vhodném pro produkci polypeptidů použitím způsobů známých v oboru. Buňka může být například kultivována na třepačkách, fermentaci v malém nebo velkém měřítku (včetně kontinuální, vsádkové, vsádkové s přívodem živin nebo fermentace na pevné fázi) v laboratorních nebo průmyslových fermentorech ve vhodném médiu a za podmínek umožňujících expresi a/nebo izolaci polypeptidů. Kultivace probíhá ve vhodném živném médiu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku a anorganické soli použitím způsobů známých v oboru. Vhodná média jsou dostupná od komerčních dodavatelů nebo mohou být připravena z publikovaných

000 ·· *·

0 · • « 0 · • 0 • « 00 0 0 složek (například podle katalogů American Type Culture Collection). Jestliže se polypeptid sekrenuje do živného média, může být izolován přímo z tohoto média. Jestliže není polypeptid vylučován, může být izolován z buněčných lyzátů.

Výsledný polypeptid může být izolován způsoby známými v oboru. Polypeptid může být například izolován ze živného média běžnými postupy včetně bez omezení centrifugace, filtrace, extrakce, rozprašovacího sušení, odpařování nebo srážení.

Polypeptidy mohou být čištěny řadou způsobů známých v oboru, io včetně bez omezení chromatografie (například iontoměničové, afinitní, hydrofobní, chromatofokusace a chromatografie size exclusion), elektroforetických postupů (například preparativní isoelektrická fokusace), diferenciální rozpustnosti (například srážení síranem amonným), SDS-PAGE, nebo extrakce (viz např. Protein Purification,

J.-C. Janson a Lars Ryden, ed., VCH Publishers, New York, 1989).

Specifické metody pro purifikaci peptidů s aktivitou G-CSF se popisují v D. Metcalf a N. A. Nicola v The hemopoietic colony-stimulating factors, str. 50-51, Cambridge University Press (1995), C. S. Bae a další, Appl. Microbiol. Biotechnol., 52: 338 - 344 (1999) a v US

4,810,643.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu a jeho použití

V dalším provedení zahrnuje předkládaný vynález prostředek obsahující polypeptid nebo konjugát popisovaný v přihlášce a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient.

Polypeptid, konjugát nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu mohou být použity pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, zvláště prevenci infekce u pacientů s rakovinou léčených některými typy chemoterapie, radiační terapie a transplantacemi kostní dřeně, mobilizaci prekurzorových buněk pro > · ·* · · ♦ · ·· »»

9 4 9 4 9 4 · 9 4 4 9

9 4 4 1 1 99 19 « βΑ · ··· * * · · 9 9 4 9 9 «· *· 49 49 99 9444 odběr prekurzorových buněk z periferní krve pro transplantace, pro léčení těžkých chronických nebo podobných leukopenií, pro léčení pacientů s akutní myeloidní leukémií, pro léčení AIDS nebo jiných imunodeficitních onemocnění a pro antifungální terapii, zvláště pro léčení systémových nebo invazivních kandidóz.

V dalším provedení se polypeptid, konjugát nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu používají při léčení savce s obecnou hematopoetickou poruchou, včetně poruch v důsledku radiační terapie nebo chemoterapie, zejména leukopenie, AIDS nebo jiných io imunodeficitních onemocnění, podáváním savci takového polypeptidu, konjugátu nebo farmaceutického prostředku v případě potřeby.

Polypeptidy a konjugáty podle vynálezu se budou pacientům podávat v „terapeuticky účinné“ dávce, tj. dávce, která je dostatečná pro dosažení požadovaných účinků v souvislosti se stavem, pro který se podává. Přesná dávka bude záviset na léčeném onemocnění a může ji určit odborník v oboru pomocí známých metod. Polypeptidy nebo konjugáty podle vynálezu se mohou například podávat v dávce podobné dávkách používaným při léčení rhG-CSF jako je Neupogen®. Vhodná dávka konjugátu podle vynálezu se uvažuje v rozmezí přibližně 5 až 300 pg/kg tělesné hmotnosti (vztaženo na hmotnost proteinové části konjugátu), např. 10 až 200 pg/kg, jako je 25 až 100 pg/kg. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že účinné množství polypeptidu, konjugátu nebo prostředku podle vynálezu závisí mj. na onemocnění, dávce, schématu podávání, přičemž polypeptid nebo konjugát nebo prostředek se podávají samostatně nebo spolu s jinými léčivými prostředky, poločasu prostředků v séru, obecném zdravotním stavu pacienta a četnosti podávání. Polypeptid, konjugát nebo prostředek podle předkládaného vynálezu se podávají v účinné dávce, zvláště dávce dostatečné pro normalizaci počtu leukocytů, zvláště neutrofilů, u dotyčného pacienta. Normalizace počtu leukocytů se může zjistit jednoduchým počítáním množství leukocytů v pravidelných intervalech podle zavedené praxe.

• · · • ··· « · *·

9 9 *

99 *

9 9 9 9

9 9

99 9 9

Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu se s výhodou podává v prostředku obsahujícím jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů nebo pomocných látek. Polypeptid nebo konjugát může být do farmaceutických prostředků formulován známým způsobem za získání polypeptidového farmaceutického prostředku, který je dostatečně stabilní při skladování a vhodný pro podávání lidem nebo zvířatům. Farmaceutický prostředek může být formulován v řadě forem, včetně kapaliny nebo gelu, nebo lyofilizovaný, nebo v jakékoli jiné vhodné formě, výhodná forma bude záviset na konkrétní indikaci a bude ío zřejmá odborníkovi v oboru.

Vynález tedy poskytuje prostředky pro léčení různých forem leukopenie. Zvláště polypeptid, konjugát nebo prostředek podle vynálezu mohou být použity pro prevenci infekce u pacientů s rakovinou léčených určitými typy raciační terapie, chemoterapie a transplantací kostní dřeně, pro mobilizaci prekurzorových buněk pro odběr prekurzorových buněk z periferní krve pro transplantace, pro léčení těžké chronické nebo jiné leukopenie a pro podporu léčby pacientů s akutní myeloidní leukémií. Polypeptid, konjugát nebo prostředek podle vynálezu mohou být navíc použity pro léčení AIDS nebo jiných imunodeficitních onemocnění a pro antifungální terapii, zvláště pro léčení systémové nebo invazivní kandidózy, a pro léčení bakteriálních infekcí.

Forma léčiva

Polypeptid nebo konjugát podle předkládaného vynálezu může být použit „jako takový“ a/nebo ve formě své soli. Vhodné soli zahrnují bez omezení soli s alkalickými kovy nebo kovy alkalických zemin, jako je sodík, draslík, vápník a hořčík, stejně jako například soli zinku. Tyto soli nebo komplexy mohou být přítomny jako krystalická a/nebo amorfní struktura.

0 0 · ·

000 • 0 00 <0

0 0 0 • 0 0

0 0

0· ·· 0 0 • 0 0 0 0 ♦ 0 0 0 0 0 0 •0 0000

Pomocné látky „Farmaceuticky přijatelný“ znamená nosič nebo pomocnou látku, které v používaných dávkách a koncentracích nezpůsobí žádné nežádoucí účinky u pacientů, kterým se podávají. Tyto farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky jsou v oboru dobře známé (viz Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer a L. Hovgaard, ed., ío Taylor & Francis [2000]; a Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3.

vydání, A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press [2000]).

Směs léčiv

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být podáván samostatně nebo spolu s jinými léčivy. Tato léčiva mohou být zahrnuta jako součást stejného farmaceutického prostředku nebo mohou být podávána odděleně od polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu, buď současně nebo podle jiného léčebného schématu. Navíc se může polypeptid, konjugát nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu používat jako adjuvans pro jiné terapie.

Pacienti

Termín „pacient“ pro účely předkládaného vynálezu zahrnuje jak člověka, tak i jiné savce. Způsoby jsou tedy použitelné jak pro léčení lidí, tak pro veterinární použití.

Způsob podávání

Podávání prostředků podle předkládaného vynálezu se může provádět řadou způsobů, včetně bez omezení orálního, subkutánního, »

- 63ί·

99 • 999 9

9 9 9 9 « 9 9 9 9

9 9 9 9

9* 99 • 9

9 · *

· ·

9 9 intravenózního, intracerebrálního, intranazálního, transdermálního, intraperitoneálního, intramuskulárního, intrapulmonárního, vaginálního, rektálního, intraokulárního nebo jakýmkoli jiným přijatelným způsobem. Prostředky mohou být podávány kontinuálně infuzí, ačkoli je přijatelná i jednorázová injekce, použitím způsobů dobře známých v oboru.

Parenterální formy

Příkladem farmaceutického prostředku je roztok navržený pro ío parenterální podávání. Ačkoli v mnoha případech se formulace farmaceutických roztoků poskytují v kapalné formě vhodné pro okamžité použití, tyto parenterální prostředky mohou být také poskytovány ve zmražené nebo lyofilizované formě. V prvním případě musí být prostředek před použitím roztaven. Ve druhém případě se forma často používá pro zvýšení stability účinné sloučeniny obsažené v prostředku v širším rozmezí podmínek skladování, jak vyplývá ze všeobecných znalostí v oboru, že lyofilizované preparáty jsou obecně stabilnější než jejich kapalné protějšky. Tyto lyofilizované preparáty se rekonstituují před použitím přidáním jednoho nebo více vhodných farmaceuticky přijatelných řediv jako je sterilní voda pro injekce nebo sterilní fyziologický roztok.

V případě parenterálních léčiv se příprava pro skladování v lyofilizované formě nebo ve formě vodných roztoků provádí mícháním podle potřeby polypeptidu s požadovaným stupněm čistoty s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, pomocnými látkami nebo stabilizátory typicky používanými v oboru (všechny se souhrnně označují jako „pomocné látky“ (excipienty), například pufry, stabilizační látky, ochranné látky, látky upravující osmotický tlak, neiontové detergenty, antioxidanty a/nebo jiná aditiva.

Pufrační látky napomáhají udržovat pH v rozmezí, které se přibližuje fyziologickým podmínkám. Typicky jsou přítomny v rozmezí ···

- 6V^: t» ·· ·· ·* • · · · · « · ο • · ·· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 · · • · t 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9 koncentrací od přibližně 2mM do přibližně 50mM. Mezi vhodné pufrační látky pro použití v rámci předkládaného vynálezu patří jak organické, tak i anorganické kyseliny a jejich soli, jako jsou citrátové pufry (například směs monosodná sůl kyseliny citrónové /dihydrogencitran sodný, směs kyselina citrónová - trisodná sůl kyseliny citrónové, směs kyselina - monosodná sůl kyseliny citrónové), sukcinátové pufry (například směs kyselina jantarová - monosodná sůl kyseliny jantarové, směs kyselina jantarová - hydroxid sodný, směs kyselina jantarová - dvojsodná sůl kyseliny jantarové atd.), tartrátové ío pufry (například kyselina vinná - vínan sodný, směs kyselina vinná vínan draselný, směs kyselina vinná - hydroxid sodný atd.), fumarátové pufry (například kyselina fumarová - monosodná sůl kyseliny fumarové, směs kyselina fumarová - dvojsodná sůl kyseliny fumarové, směs monosodná sůl kyseliny fumarové - dvojsodná sůl kyseliny fumarové atd.), glukonátové pufry (například kyselina glukonová - glukonát sodný, směs kyselina glukonová - hydroxid sodný, směs kyselina glukonová - glukonát draselný atd.), oxalátový pufr (například směs kyselina šťavelová - šťavelan sodný, směs kyselina šťavelová - hydroxid sodný, směs kyselina šťavelová 20 šťavelan draselný atd.), laktátové pufry (například směs kyselina mléčná - mléčnan sodný, směs kyselina mléčná - hydroxid sodný, směs kyselina mléčná - mléčnan draselný atd.) a acetátové pufry (například kyselina octová - octan sodný, směs kyselina octová hydroxid sodný, atd.). Další možnosti jsou fosfátové pufry, histidinové pufry a trimethylaminové soli jako je Tris.

Ochranné látky se přidávají pro zastavení růstu mikroorganismů, typicky v množství přibližně 0,2 % až 1 % (hmotnost/objem). Vhodné ochranné látky pro použití v rámci předkládaného vynálezu zahrnují fenol, benzylalkohol, meta-kresol, methylparaben, propylparaben, oktadecyldimethylbenzylamoniumchlorid, benzalkoniumhalidy (např.

benzalkoniumchlorid, bromid nebo jodid), hexamethoniumchlorid, toto to« to ·« · to toto *

63-J ··· toto ·· toto « te · to to ·· «> · ·· to • ·· <

• to ·«

to to • to to to to alkylparabeny jako je methyl- nebo propylparaben, katechol, resorcinol, cyklohexanol a 3-pentanol.

Látky upravující osmotický tlak do isotonického stavu se přidávají pro zajištění isotonicity kapalných prostředků a zahrnují polyhydroxycukerné alkoholy, s výhodou trihydroxy nebo vyšší cukerné alkoholy, jako je glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol a mannitol. Polyhydroxyalkoholy mohou být přítomny v množství mezi 0,1 % a 25 % hmotnostními, typicky 1 % až 5 %, přičemž se berou v úvahu relativní množství dalších složek.

io Stabilizátory označují širokou kategorii pomocných látek, jejichž funkce se může pohybovat od objemotvorných látek k aditivům, která solubilizují terapeutický prostředek nebo napomáhají zabránit denaturaci nebo přilnutí ke stěně nádoby. Typické stabilizátory mohou být polyhydroxycukerné alkoholy (uvedené výše); aminokyseliny jako je arginin, lysin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornithin, L-leucin, 2-fenylalanin, kyselina glutamová, threonin, atd., organické cukry nebo cukerné alkoholy jako je laktóza, trehalóza, stachyóza, mannitol, sorbitol, xylitol, ribitol, myoinisitol, galaktitol, glycerol apod, včetně cyklitolů jako je inositol; polyethylenglykol; polymery aminokyselin; redukční činidla s obsahem síry jako je močovina, glutathion, kyselina thioktová, thioglykolát sodný, thioglycerol, amonothioglycerol a thiosulfát sodný; nízkomolekulární polypeptidy (tj. <10 zbytků); proteiny jako je lidský sérový albumin, bovinní sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako je polyvinylpyrrolidon; monosacharidy jako je xylóza, mannóza, fruktóza a glukóza; disacharidy jako je laktóza, maltóza a sacharóza; trisacharidy jako je rafinóza, a polysacharidy jako je dextran. Stabilizátory jsou typicky přítomny v rozmezí 0,1 až 10 000 hmotnostních dílů, vztaženo na hmotnost účinného proteinu.

Neiontové povrchově aktivní látky nebo detergenty (známé také jako „smáčedla“) mohou být přítomny, aby pomohly solubilizovat

• 9 • 9 9 • · 9 • 99» ·

9 • 9 terapeutickou látku a chránit terapeutický polypeptid proti agregaci indukované mícháním, což také umožní vystavení prostředku namáhání střižnými povrchovými silami bez navození denaturace polypeptidu. Mezi vhodné neiontové povrchově aktivní látky patří polysorbáty (20, 80, atd.), polyoxamery (184, 188 atd.), polyoly Pluronic®, polyoxyethylensorbitanmonoethery (Tween®-20, Tween®80, atd.).

Další pomocné látky zahrnují objemotvorné látky nebo plniva (např. škrob), chelatační činidla (např. EDTA), antioxidanty (např.

ío kyselina askorbová, methionin, vitamin E) a pomocná rozpouštědla.

Účinná složka může být také zachycena v mikropouzdrech, připravených například koacervačními technikami nebo mezipovrchovou polymerací, například v mikrokapslích z hydroxymethylcelulózy, želatiny nebo poly-(methylmethakrylátu), v koloidních systémech pro dodávání léčiv (například liposomy, albuminové mikrokuličky, mikroemulze, nanočástice a nanopouzdra) nebo v makroemulzích. Tyto technologie se popisují v publikaci Remington’s Pharmaceutical Sciences, výše.

Parenterální prostředky používané pro podávání in vivo musí být sterilní. To se snadno dosáhne například filtrací přes sterilní filtrační membrány.

Prostředky s prodlouženým uvolňováním

Mezi vhodné příklady prostředků s prodlouženým uvolňováním 25 patří semipermeabilní matrice pevných hydrofobních polymerů obsahující polypeptid nebo konjugát, kde tyto matrice mají vhodnou formu jako je film nebo mikropouzdra. Příklady matric pro prodloužené uvolňování zahrnují polyestery, hydrogely (například poly(2-hydroxyethylmethakrylát) nebo poly(vinylalkohol)), polylaktidy, kopolymery kyseliny L-glutamové a ethyl-L-glutamátu, »9 « · ♦ • * ·

- 67 -ί

9· •

999 • 9

9 9

9 • · 9 • 9 9 «9 •

99 • 9 9 9

9 9

9 9

9 9 •9 99*9 nedegradovatelný ethylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyselina mléčná - kyselina glykolová jako je technologie ProLease® technology nebo Lupron Depot® (injekční mikrokuličky složené z kopolymerů kyseliny mléčné a kyseliny glykolové a acetátu leuprolidu) a kyselina poly-D-(-)-3-hydroxymáselná. Zatímco polymery jako je ethylen - vinylacetát a kyselina mléčná - kyselina glykolová umožňují uvolňování molekul dlouhodobě jako je až více než 100 dnů, některé hycrogely uvolňují proteiny po kratší časová období. Jestliže zapouzdřené polypeptidy zůstávají v těle dlouhodobě, mohou io v důsledku vystavení vlhkosti při 37 °C denaturovat nebo agregovat, což vede ke ztrátě biologické aktivity a možným změnám imunogenicity. Byly vyvinuty cílené strategie pro stabilizaci na základě mechanismů, které se v jednotlivých případech účastní. Jestliže se například zjistí, že mechanismem agregace je tvorba intermolekulární vazby S-S prostřednictvím záměny thio - disulfid, stabilizace může být dosaženo modifikací sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv a vyvinutím speciálních složení polymerních matric.

Dodávání plícemi

Formulace vhodné pro použití s nebulizérem, buď tryskovým nebo ultrazvukovým, budou typicky obsahovat polypeptid nebo konjugát rozpuštěný ve vodě v koncentraci např. přibližně 0,01 až 25 mg konjugátu na ml roztoku, s výhodou přibližně 0,1 až 10 mg/ml.

Formulace může také obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku) a/nebo lidský sérový albumin v rozmezí koncentrace od 0,1 do 10 mg/ml. Příklady použitelných pufrů zahrnují octan sodný, citran a glycin. S výhodou bude mít pufr složení a molaritu vhodnou pro nastavení pH roztoku v rozmezí od 3 do 9. Pro tento účel jsou obecně vhodné molarity pufru od 1 mM do 50 mM. Příklady cukrů, které mohou být použity, jsou «6«

006 0

0*

·* 0» · » ·

0 00 • · 6 · • · · · *· 00 *6 • · · • ·

0 0 6 • · 0

0000 laktóza, maltóza, mannitol, sorbitol, trehalóza a xylóza, obyčejně v množstvích od 1 % do 10 % hmotnostních z prostředku.

Formulace určená pro nebulizér může také obsahovat povrchově aktivní látku pro snížení nebo zabránění povrchově indukované agregaci proteinu způsobené atomizací roztoku při tvorbě aerosolu. Mohou být použity běžné povrchově aktivní látky, jako jsou polyoxyethylenové estery mastných kyselin a alkoholy a polyoxyethylensorbitanové estery s mastnými kyselinami. Množství bude obecně mezi 0,001 % a 4 % hmotnostními z celkového io prostředku. Zvláště výhodnou povrchově aktivní látkou pro účely tohoto vynálezu je polyoxyethylensorbitanmonooleát.

Konkrétní formulace a způsoby výroby vhodných disperzí kapalných částic podle vynálezu se popisují ve WO 94/20069, US 5,915,378, US 5,960,792, US 5,957,124, US 5,934,272, US 5,915,378,

US 5,855,564, US 5,826,570 a US 5,522,385, které jsou zařazeny odkazem.

Formulace pro použití s inhalačním zařízením s odměřovanou dávkou budou obecně zahrnovat jemný prášek. Tento prášek může být vyráběn lyofilizací a potom mletím kapalné formy prostředku s obsahem konjugátu, a může také obsahovat stabilizátor jako je lidský sérový albumin (HSA). Typicky se přidává více než 0,5 % (hmotn./hmotn.) HSA. Navíc je v případě potřeby možno přidat do prostředku jeden nebo více cukrů nebo cukerných alkoholů. Mezi příklady patří laktóza, maltóza, mannitol, sorbitol, sorbitóza, trehalóza, xylitol a xylóza. Množství přidávané do prostředku se může pohybovat od přibližně 0,01 do 200 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od přibližně 1 do 50 % přítomného konjugátu. Tyto formulace se potom lyofilizují a melou na požadovanou velikost částic.

Částice s vhodnou velikostí se potom suspendují v hnacím prostředku za pomoci povrchově aktivní látky. Hnacím prostředkem může být jakýkoli běžný materiál používaný pro tento účel, jako je

- 69.chlorovaný a fluorovaný uhlovodík neobsahující vodík, chlorovaný a fluorovaný uhlovodík obsahující vodík, fluorovaný uhlovodík obsahující vodík nebo uhlovodík, včetně trichlorfluormethanu, dichlordifluormethanu, dichlortetrafluorethanolu a 1,1,1,2-tetra5 -fluorethanu nebo jejich kombinací. Vhodné povrchově aktivní látky zahrnují sorbitantrioleát a sojový lecithin. Jako povrchově aktivní látka může být také použita kyselina olejová. Tato směs se potom vloží do dodávacího zařízení. Příkladem komerčně dostupného inhalátoru s odměřovanou dávkou vhodného pro použití v rámci předkládaného io vynálezu je inhalátor Ventolin metered dose inhaler, vyráběný firmou

Glaxo lne., Research Triangle Park, N.C.

Formulace pro inhalátory prášku budou obsahovat jemný suchý prášek obsahující konjugát a mohou také obsahovat objemotvorný prostředek jako je laktóza, sorbitol, sacharóza nebo mannitol v množství umožňujícím dispergaci prášku ze zařízení, například 50 % až 90 % hmotnostních z prostředku. Částice prášku budou mít aerodynamické vlastnosti v plicích odpovídající částicím s hustotou přibližně 1 g/cm², s mediánem průměru menším než 10 pm, s výhodou mezi 0,5 a 5 pm, nejvýhodněji mezi 1,5 a 3,5 pm. Příkladem inhalátoru prášku vhodného pro použití podle vynálezu je inhalátor Spinhaler powder inhaler, vyráběný firmou Fisons Corp, Bedford, Mass.

Prášky pro tato zařízení mohou být vyráběny a/nebo dodávány způsoby popsanými v US 5,997,848, US 5,993,783, US 5,985,248, US 5,976574, US 5,922,354, US 5,785,049 a US 5,654,007.

Mechanická zařízení navržená pro plicní dodávání terapeutických produktů zahrnují bez omezení nebulizéry, inhalátory s odměřovanou dávkou a inhalátory prášku, z nichž všechny jsou dobře známé odborníkům v oboru. Konkrétní příklady komerčně dostupných zařízení vhodných pro provádění tohoto vynálezu jsou zařízení Ultravent nebulizer, vyráběný firmou Mallinckrodt, lne., St.

Louis, Missouri; Acorn II nebulizer, vyráběný firmou Marquest Medical

-7Ό.• ·

Products, Englewood, Colorado; inhalátor Ventolin metered dose inhaler, vyráběný firmou Glaxo lne., Research Triangle Park, North

Carolina; inhalátor Spinhaler powder inhaler, vyráběný firmou Fisons

Corp., Bedford, Massachusetts; zařízení „standing cloud“ firmy Inhale

Therapeutic Systems, lne., San Carlos, California; inhalátor AIR inhaler vyráběný firmou Alkermes, Cambridge, Massachusetts; a zařízení AERx pulmonary drug delivery systém vyráběné firmou Aradigm Corporation, Hayward, California.

Předpokládá se také použití nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle vynálezu v aplikacích genové terapie. Může být zvláště zajímavé používat nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid popisovaný ve výše uvedené části nazvané „Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidovou částí je uhlohydrátová skupina“. Glykosylace polypeptidů se tedy dosahuje v průběhu genové terapie, tj. po expresi nukleotidové sekvence v lidském těle.

Aplikace genové terapie použitelné v rámci předkládaného vynálezu zahrnují léčení těch onemocnění, ve kterých se očekává poskytnutí účinné terapie polypeptidem. Patří sem léčení různých forem leukopenie, zvláště prevence infekce u pacientů s rakovinou léčených některými typy chemoterapie a transplantacemi kostní dřeně, mobilizace prekurzorových buněk pro odběr prekurzorových buněk z periferní krve pro transplantace, léčení těžké chronické nebo podobné leukopenie, léčení pacientů s akutní myeloidní leukémií a léčení AIDS nebo jiných onemocnění imunodeficitem.

Místní dodávání G-CSF použitím genové terapie může poskytnout terapeutický prostředek zacílený do určité oblasti, přičemž je možno se vyhnout potenciálním problémům s toxicitou spojeným s nespecifickým podáváním.

Jsou uvažovány metody genové terapie jak in vitro, tak in vivo.

Je známo několik metod pro převedení potenciálně terapeutických genů do definovaných populací buněk. Další odkazy lze ·· ·· • · · · • · · ·

• ·· · · « • · · · · · · • · · · · · ·· · · ···· nalézt např. v Mulligan, „The Basic Science Of Gene Therapy“, Science, 260, str. 926 - 31 (1993). Tyto metody zahrnují:

Přímý přenos genu (direct gene transfer), např. jak se popisuje ve Wolff a další, „Direct Gene transfer Into Mouše Muscle in vivo“,

Science 247, str. 1465 - 68 (1990);

přenos DNA pomocí liposomů (liposome-mediated DNA transfer), např. jak se popisuje v Caplen a další, „Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis“, Nátuře Med., 3, str. 39 - 46 (1995); Crystal, „The Gene As A io Drug“, Nátuře Med., 1, str. 15 - 17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian

Celíš“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, str. 280 - 85 (1991);

přenos DNA pomocí retrovirů (retrovirus-mediated DNA transfer), např. jak se popisuje v Kay a další, „In vivo Gene Therapy of

Hemophilia B: Sustained Partial Correction in Factor IX-Deficient Dogs“, Science, 262, str. 117 - 19 (1993); Anderson, „Human Gene Therapy“, Science, 256, str. 808 - 13 (1992);

přenos DNA zprostředkovaný DNA-virem (DNA virus-mediated DNA transfer). Tyto DNA viry zahrnují adenoviry (s výhodou vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpetické viry (s výhodou vektory založené na viru herpes simplex), a parvoviry (s výhodou vektory založené na „defektních“ nebo neautonomních parvovirech, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2), viz např. Ali a další, „The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy“, Gene Therapy, 1, str. 367 - 84 (1994); US 4,797,368, a US 5,139,941.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Poločasy in vivo faktoru rhG-CSF (Neupogen®) a SPAPEG 5000 - konjugovaného hG CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K

Q120K.

• ·

Obr. 2: Biologické aktivity in vivo rhG-CSF (Neupogen®), SPAPEG 5000 - konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K a

SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K

Q90K Q120K.

Obr. 3: Biologické aktivity in vivo rhG-CSF (Neupogen®), SPAPEG 12000 - konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R a různých dávek SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K.

io Výpis sekvencí

Přiložený výpis sekvencí obsahuje následující sekvence:

SEQ ID No. 1: Aminokyselinová sekvence lidského G-CSF.

SEQ ID No. 2: Syntetická sekvence DNA kódující lidský G-CSF s využitím kodonů optimalizovaných pro expresi v E. coli.

SEQ ID No. 3: Aminokyselinová sekvence signální sekvence

OmpA.

SEQ ID No. 4: Syntetická sekvence DNA kódující signální sekvenci OmpA.

SEQ ID No. 5: Syntetický histidinový tag.

SEQ ID No. 6: Syntetická sekvence DNA kódující histidinový tag

SEQ ID No. 5.

SEQ ID No. 7: Aminokyselinová sekvence lidského signálního peptidů G-CSF.

SEQ ID No. 8: Syntetická sekvence DNA kódující lidský G-CSF včetně signálního peptidů SEQ ID No. 7 s využitím kodonů optimalizovaných pro expresi v buňkách CHO.

- 73 0 0 0 0 • · · · « 0 · · • 0 0 0 0 • 0 0 ·

0000

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Metody používané pro určení aminokyselin, které je třeba modifikovat

Přístupná povrchová plocha (accesible surface area, ASA)

3D forma deseti struktur určená spektroskopií NMR (Zink a další, (1994) Biochemistry 33: 8453 - 8463) je dostupná v bance Protein Data Bank (PDB) (www, rcsb. org/pdb/). Tuto informaci je možno vložit do počítačového programu Access (B. Lee a P. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 - 400 (1971)) verze 2 (©1983 Yale ío University) a použít pro výpočet přístupné povrchové plochy (ASA) jednotlivých atomů ve struktuře. Tato metod typicky využívá sondy o velikosti 1,4 A (0,14 nm) a definuje přístupnou povrchovou plochu (ASA) jako oblast vytvořenou středem sondy. Před tímto výpočtem by měly být ze soustavy souřadnic odstraněny všechny molekuly vody a všechny atomy vodíku stejně jako jiné atomy, které s proteinem přímo nesouvisí.

Frakční ASA postranního řetězce

Frakční ASA atomů postranního řetězce se vypočítá vydělením 20 součtu ASA atomů v postranním řetězci hodnotou reprezentující ASA atomů postranního řetězce tohoto typu zbytku v prodlouženém tripeptidu ALA-x-ALA, viz Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507 - 530. Pro tento případ je atom CA považován za součást postranního řetězce glycinových zbytků, ale ne ostatních zbytků. Hodnoty v následující tabulce se používají jako standardní 100% ASA pro postranní řetězec:

Ala

Arg

69,23

200,35

A² Leu

A²

Lys

140,76

162,50

A²

A² • ·

Asn	106,25	A2	Met	156,08	A2
Asp	102,06	A2	Phe	163,90	A2
Cys	96,69	A2	Pro	119,65	A2
Gin	140,58	A2	Ser	78,16	A230
Glu	134,61	A2	Thr	101,67	A2
Gly	32,28	A2	Trp	210,89	A2
His	147,00	A2	Tyr	176,61	A2
Ile	137,91	A2	Val	114,14	a235

(1 nm² = 100 A²)

Zbytky nedetekované ve struktuře jsou definovány jako 100% exponované, protože se předpokládá, že jsou přítomny v ohebných oblastech.

Zjištění vzdáleností mezi atomy

Vzdálenost mezi atomy se nejsnadněji určuje použitím molekulárně-grafického softwaru, např. Insightll® v. 98,0, MSI INC.

io Obecné předpoklady týkající se modifikovaných aminokyselinových zbytků

Jak bylo vysvětleno výše, aminokyselinové zbytky, které mají být modifikovány podle předkládaného vynálezu, jsou s výhodou takové zbytky, jejichž postranní řetězce jsou vystaveny na povrchu, zvláště zbytky obsahující více než přibližně 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu molekuly, a výhodněji zbytky s více než 50% expozicí postranního řetězce. Další předpoklad je, že zbytky umístěné v receptorových rozhraních se s výhodou vyloučí, aby se vyloučila nebo alespoň minimalizovala možná interference s vazbou nebo aktivací receptoru. Další předpoklad je, že by měly být vyloučeny

- 75·.

·· ·· • · · « • · · 1 ·· ·· » · · 4 > · ·· také zbytky, které jsou vzdáleny méně než 10 A (1 nm) od nejbližšího Lys (Glu, Asp) CB-CB (CA pro Gly). Konečně jsou výhodné polohy pro modifikaci zvláště ty, které mají hydrofilní a/nebo nabitý zbytek, tj. Asp, Asn, Glu, Gin, Arg, His, Tyr, Ser a Thr, přičemž zvláště výhodné jsou polohy, které mají argininový zbytek.

Identifikace aminokyselin G-CSF pro modifikaci

Informace dále ilustrují faktory, které by se obecně měly brát v úvahu, jestliže se identifikují aminokyselinové zbytky, které mají být ío modifikovány podle předkládaného vynálezu.

Trojrozměrné struktury byly publikovány pro lidský G-CSF metodami rentgenové krystalografie (Hill a další (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5167 - 5171) a NMR spektroskopie (Zink a další (1994) Biochemistry 33: 8453 - 8463). Jak je uvedeno výše, Aritomi a další (Nátuře 401: 713 - 717, 1999) identifikovali následující zbytky hG-CSF jako součásti vazebných rozhraní receptoru: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, 512, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 a L124. Ačkoli je tedy možné modifikovat tyto zbytky, je výhodné, jestliže jsou tyto zbytky z modifikace vyloučeny.

Použitím 10 NMR struktur G-CSF identifikovaných autory Zink a další (1994) jako vstupních struktur a následným výpočtem průměrné hodnoty ASA postranního řetězce byly následující zbytky identifikovány jako zbytky s ASA větší než 25 %: M0, T1, P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, F13, L14, L15, K16, C17, E19,

Q20, V21, R22, K23, Q25, G26, D27, A29, A30, E33, K34, C36, A37,

T38, Y39, K40, L41, H43, P44, E45, E46, V48, L49, L50, H52, S53,

L54, I56, P57, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, L69, Q70,

L71, A72, G73, C74, S76, Q77, L78, S80, F83, Q86, G87, Q90, E93,

G94, S96, P97, E98, L99, G100, P101, T102, D104, T105, Q107, so L108, D109, A111, D112, F113, T115, T116, W118, Q119, Q120, M121, E122, E123, L124, M126, A127, P128, A129, L130, Q131, • 0

P132, T133, Q134, G135, A136, M137, P138, A139, A141, S142,

A143, F144, Q145, R146, R147, S155, H156, Q158, S159, L161,

E162, V163, S164, Y165, R166, V167, L168, R169, H170, L171, A172,

Q173, P174.

s Podobně následující zbytky mají větší než 50% ASA: MO, T1,

P2,	L3, G4	, P5,	A6,	S7, S	8, L9, P10,	, Q11;	, S12,	, F13,	, L14,	L15,	K16
C17	, E19,	Q20,	R22	, K23,	G26, D27,	A30,	E33,	K34,	T38,	K40,	L41
H43	, P44,	E45,	E46	, L49,	L50, S53,	P57,	P60,	L61,	S62,	S63,	P65
S66,	, Q67,	A68,	L69,	Q70,	L71, A72,	G73,	S80,	F83,	Q90,	G94,	P97
E98,	, P101,	D10	4, T1	05, L·	108, D112,	F113	, T115, T116, Q	119, Q120

E122, E123, L124, M126, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, A139, A141, S142, A143, F144, R147, S155, S159, E162, R166, V167, R169, H170, L171, A172, Q173, P174.

Molekulárně grafický program Insightll® v. 98.0 byl použit pro 15 určení zbytků, které mají atom CB (CA v případě glycinu) ve vzdálenosti větší než 15 A (1,5 nm) od nejbližší aminoskupiny, definované jako NZ atomy lysinu a N atom N-koncového zbytku T1. Následující seznam obsahuje zbytky, které splňují toto kritérium v alespoň jedné z deseti struktur NMR. G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10,

20 Q11,

L14,

L15,

L18,

V21,

R22,

Q25,

G26,

D27,

G28,

A29,

Q32

, L35

C36,

T38,

Y39,

C42,

H43,

P44,

E45,

E46,

L47,

V48,

L49,

L50,

G51

H52,

S53,

L54,

G55,

I56,

P57,

W58,

A59,

P60,

L61,

S62,

S63,

C64

P65,

S66,

Q67,

A68,

L69,

Q70,

L71,

A72,

G73,

C74,

L75,

S76,

Q77

L78,

H79,

S80,

G81,

L82,

F83,

L84,

Y85,

Q86,

G87,

L88,

L89,

Q90

25 A91,

L92,

E93,

G94

, I95,

S96,

P97

, E98

, L99

, G100, P101,

T102

L103, D104, ΤΊ05, L106, Q107, L108, D109, V110, A111, D112, F113,

A114,	T115,	T116,	1117,	W118,	Q119,	Q120,	M121,	E122,	E123,
L124,	G125,	M126,	A127,	, P128,	A129,	L130,	Q131,	P132,	T133,
Q134,	G135,	A136,	M137	, P138,	A139,	F140,	A141,	S142,	A143,
30 P144,	Q145,	R146,	R147,	A148,	G149,	G150,	V151,	L152,	V153,

A154, S155, H156, L157, Q158, S159, F160, L161, E162, V163, S164, Y165, R166, V167, L168, R169, H170, L171, A172, Q173, P174.

• fc ·· • · · ·

··

• · · · · • · · · • · • · • · « * · • ·

Program Insigthll® v. 98.0 byl podobně použit pro určení zbytků, které mají svůj CB atom (CA atom v případě glycinu) ve vzdálenosti větší než 10 Á (1 nm) od nejbližší skupiny kyseliny, definovaných jako CG atomy kyseliny asparagové, CD atomy kyseliny glutamové a C 5 atom C-koncového zbytku P174. Následující seznam obsahuje zbytky, které splňují toto kritérium v alespoň jedné z deseti struktur NMR. M0,

T1, P2, L3	, G4,	P5, A6, S7, S8,	L9,	P10,	Q11,	S12,	P13,	L14	, T38,
Y39,	K40,	L41,	C42, L50, G51,	H52,	S53,	L54,	G55,	I56,	P57,	W58,
A59,	P60,	L61,	S62, S63, C64,	P65,	S66,	Q67,	A68,	L69,	Q70	, L71,
A72,	G73,	C74,	L75, S76, Q77,	L78,	H79,	S80,	G81,	L82,	F83	, L84,
Y85,	Q86,	G87	, L88, 1117, M1:	26, A127,	P128,	A12	Ό, L1	I30, '	Q131,

P132, T133, Q134, G135, A136, M137, P138, A139, F140, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147, A148, G149, G150, V151, L152, V153, A154, S155, H156, L157, V167, L168, R169, H170, L171.

Kombinací a porovnáním výše uvedených seznamů je možné vybrat jednotlivé aminokyselinové zbytky určené k modifikaci za získání seznamu, který obsahuje omezený počet aminokyselinových zbytků, jejichž modifikace v daném polypeptidu G-CSF pravděpodobně poskytne požadované vlastnosti.

Metody PEGylace hG-CSF a jeho variant

PEGylace hG-CSF a jeho variant v roztoku

Lidský G-CSF a jeho varianty se PEGylují při koncentraci 250 pg/ml v 50mM fosforečnanu sodném, 100mM NaCI, pH 8,5.

Molární nadbytek PEG je stonásobný vzhledem k PEGylačním místům na proteinu. Reakční směs se umístí do termostatovaného míchadla na 30 min při 37 °C při 1200 ot/min. Po 30 min se reakce ukončí přidáním molárního nadbytku glycinu.

Kationtová výměnná chromatografie se použije pro odstranění nadbytku PEG, glycinu a jiných vedlejších produktů z reakční směsi.

7δ· • t * • ·»9 ·· ·« • · · 4 • · ·· • · · « • * · « ·· ·· ·· · 9 • · · 4 • ♦ 1

Reakční směs po PEGylaci se zředí 20mM citrátem sodným pH 2,5 až do dosažení iontové síly nižší než 7 mS/cm. pH se upraví na 2,5 použitím 5N HCI. Směs se aplikuje na materiál SP-sepharose na koloně FF ekvilibrované 20mM citrátem sodným pH 2,5. Nenavázaný materiál se z kolony vymyje použitím čtyř objemů kolony ekvilibračního pufru. PEGylovaný protein se eluuje ve třech objemech kolony přidáním 20mM citrátu sodného, 750mM chloridu sodného. Čistý PEGylovaný G-CSF se zakoncentruje a před zakoncentrováním na zařízení VivaSpin s prahovou molekulovou hmotností 10 kDa se ío provede výměna pufrů.

PEGylace v mikrotitračních destičkách značeného polypeptidu s aktivitou G-CSF

Polypeptid s aktivitou G-CSF se exprimuje s vhodnou značkou (tágem), například jakoukoli značkou uvedenou jako příklad v obecném popisu výše, a kultivační půda se převede do jedné nebo více jamek mikrotitrační destičky schopných imobilizace značeného polypeptidu. Jestliže je značka Met-Lys-His-GIn-His-GIn-His-GIn-HisGln-His-GIn-His-GIn-GIn, je možno použít mikrotitrační destičky s nikl20 nitrilotrioctovou kyselinou (Ni-NTA) HisSorb komerčně dostupné od firmy QIAGEN.

Po imobilizaci značeného polypeptidu na mikrotitrační destičku se jamky promyjí v pufru vhodném pro vazbu a následnou PEGylaci a potom se jamky inkubují se zvoleným aktivovaným PEG. Jako příklad je možno použít M-SPA-5000 firmy Shearwater Polymers. Molární poměr aktivovaného PEG k polypeptidu by měl být optimalizován, ale typicky bude vyšší než 10:1, např. až do přibližně 100 : 1 nebo vyšší. Po vhodné době reakce při laboratorní teplotě, typicky přibližně 1 hod, se reakce zastaví odstraněním aktivovaného roztoku PEG.

Konjugovaný protein se z destičky eluuje inkubací s vhodným pufrem.

Vhodné eluční pufry mohou obsahovat imidazol, nadbytek NTA nebo jiné chelatační sloučeniny. Konjugovaný protein se testuje podle potřeby na biologickou aktivitu a imunogenicitu. Značka může být případně odštěpena použitím známých metod, například použitím diaminopeptidázy je možno Gin v poloze -1 převést na pyroglutamyl pomocí GCT (glutamylcyklotransferáza) a nakonec odštěpit pomocí PGAP (pyroglutamylaminopeptidáza) za získání neznačeného proteinu. Tento způsob zahrnuje několik kroků afinitní chromatografíe s kovovými cheláty. Alternativně může být značený peptid konjugován.

PEGylace polypeptidu s aktivitou hG-CSF a blokovaným vazebným místem pro receptor

Pro optimalizaci PEGylace hG-CSF s vyloučením PEGylace lysinů účastnících se při rozpoznávání receptoru byla vyvinuta následující metoda.

Čištěný hG-CSF se získá podle popisu v příkladu 3. Vytvoří se homodimerní komplex složený z polypeptidu hG-CSF a rozpustné domény receptoru G-CSF ve stechiometrickém poměru 2 : 2 ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) při pH 7. Koncentrace polypeptidu hG-CSF je přibližně 20 pg/ml nebo 1 μΜ a receptor je přítomen v ekvimolární koncentraci.

Přidá se M-SPA-5000 firmy Shearwater Polymers, lne. při třech různých koncentracích odpovídajících 5, 20 a 100 násobnému molárnímu nadbytku polypeptidu hG-CSF. Reakční doba je 30 min při teplotě laboratoře. Po 30 min reakce se upraví pH reakční směsi na pH 2,0 a reakční směs se nanese na kolonu Vydac C18 a eluuje se acetonitrilovým gradientem v podstatě tak jak je popsáno v Utsumi a další, J. Biochem., díl 101, 1199 - 1208, (1987). Alternativně může být použit gradient isopropanolu.

Frakce se analyzují primárním sereeningovým testem popisovaným v této přihlášce a aktivní PEGylovaný polypepdit hG-CSF £?0 *0 i » 0 » · 0 ¹ · · · · • ·«· 0 0 ' «· 0» ♦ · · 0 0 · ·

J ** · · 0 • · 0«0 0 « • · · 0 0 * » · 0 0*« získaný tímto způsobem se uchovává při -80 °C v PBS, pH 7 s obsahem 1 mg/ml lidského sérového albuminu (HSA).

Způsoby použité pro charakterizaci konjugovaného a nekonjugovaného hG-CSF a jeho variant

Zjištění velikosti molekuly hG-CSF a jeho variant

Molekulová hmotnost konjugovaného nebo nekonjugovaného hG-CSF nebo jeho variant se zjišťuje buď SDS-PAGE gelovou filtrací, spektrometrickou metodou matrix assisted laser desorption mass ío spectrometry nebo rovnovážnou centrifugací.

Zjištění koncentrace polypeptidu

Koncentrace polypeptidu může být měřena použitím měření optické hustoty při 280 nm, imunoadsorpcí s navázaným enzymem (ELISA), radioimunologickým testem (RIA) nebo jinými technologiemi imunitní detekce dobře známými v oboru. Navíc je možné měřit koncentraci polypeptidu ve vzorku na zařízení Biacore® s čipem Biacore® potaženým protilátkou specifickou pro polypeptid.

Tato protilátka může být kovalentně navázána na čip Biacore® různými chemickými reakcemi. Alternativně může být protilátka navázána nekovalentně, například prostřednictvím protilátky specifické pro část Fc protilátky proti polypeptidu. Protilátka specifická pro část Fc se nejprve kovalentně naváže na čip. Protilátka proti polypeptidu se potom převádí přes čip a naváže se směrovým způsobem na první protilátku. Navíc je možno imobilizovat biotinylované protilátky použitím povrchu potaženého streptavidinem (např. Biacore Sensor Chip SA®) (Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, Nagata a Handa (ed.), 2000, Springer Verlag, Tokyo; Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB).

Jestliže přes čip protéká vzorek, polypeptid se bude vázat na potaženou protilátku a může být měřen přírůstek hmotnosti. Použitím preparátu polypeptidů o známé koncentraci je možno vytvořit standardní křivku a potom je možno zjišťovat koncentraci polypeptidů ve vzorku. Po každém nastříknutí vzorku se senzorový čip regeneruje vhodným eluentem (např. pufr s nízkým pH), který odstraňuje navázaný analyt.

Obecně budou nanesenými protilátkami monoklonální protilátky proti polypeptidů standardního typu. Zavedení mutací nebo jiné manipulace s polypeptidem standardního typu (další glykosylace nebo konjugace polymeru) mohou změnit rozpoznávání těmito protilátkami. Navíc vedou tyto manipulace, které zvýší molekulovou hmotnost polypeptidů, ke zvýšenému signálu plasmonové resonance. Je tedy nezbytné vytvořit standardní křivku pro každou testovanou molekulu.

Metody používané pro zjišťování aktivity in vitro a in vivo konjugovaného a nekonjugovaného hG-CSF a jeho variant

Primární test 1 - test aktivity G-CSF in vitro

Proliferace myší buněčné linie NFS-60 (získaná od Dr. J. Ihle, St. Jude Children’s, Research Hospital, Tennessee, USA) je závislá na přítomnosti aktivního G-CSF v růstovém médiu. Biologická aktivita in vitro hG-CSF a jeho variant může být tedy zjištěna měřením počtu dělících se buněk NFS-60 po přidání vzorku G-CSF k růstovému médiu a následné inkubaci po stanovený pevný čas.

Buňky NFS-60 se udržují v médiu Iscoves DME Medium s obsahem 10 % hmotn./hmotn. FBS (fetální bovinní sérum), 1 % hmotn./hmotn. Pen/Strep, 10 pg na litr hG-CSF a 2mM Glutamax. Před přidáním vzorku se buňky dvakrát promyjí růstovým médiem bez hGCSF a zředí se na koncentraci 2,2 x 10⁵ buněk na ml. 100 pl buněčné « · • · suspenze se přidá do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky (Corning).

Vzorky obsahující konjugovaný nebo nekonjugovaný G-CSF nebo jeho varianty se naředí na koncentrace 1,1 χ 10'⁶ M a 1,1 χ 10¹³ M v růstovém médiu. 10 pl každého vzorku se přidá do tří jamek obsahujících buňky NFS-60. Do osmi jamek na každé mikrotitrační destičce se přidá kontrola 10 μΙ růstového média pro savčí buňky. Buňky se inkubují 48 hod (37 °C, 5% CO₂) a počet dělících se buněk v každé jamce se kvantifikuje použitím činidla na proliferaci buněk WST-1 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo). 0,01 ml WST-1 se přidá do jamek a jamky se inkubují 150 min při 37 °C v atmosféře vzduchu s 5% CO2. Štěpení tetrazoliové soli WST-1 mitochondriálními dehydrogenázami v živých buňkách vede k vytvoření formazanu, který se kvantifikuje měřením absorbance při 450 nm. Tak je možno zjistit počet životaschopných buněk v každé jamce.

Na základě těchto měření se vypočtou křivky závislosti odpovědi na dávce pro každou konjugovanou a nekonjugovanou molekulu GCSF nebo její variantu, čímž je možno určit pro každou molekulu hodnotu EC50. Tato hodnota je rovná množství aktivního proteinu GCSF, které je nutné pro získání 50 % maximální proliferační aktivity nekonjugovaného lidského G-CSF. Hodnota EC50 je tedy přímým měřítkem aktivity daného proteinu in vitro.

Primární test 2 - test aktivity G-CSF in vitro

Linie myších hematopoetických buněk BaF3 se transfekuje plasmidem nesoucím lidský receptor G-CSF a promotor regulátoru transkripce, fos, před luciferázovým reportérovým genem. Po stimulaci této buněčné linie vzorkem G-CSF vede řada intracelulárních reakcí ke stimulaci exprese fos a tedy expresi luciferázy. Tato stimulace se monitoruje systémem Steady-Glo™ Luciferase Assay System • · · · · • · ··· · · • Q/J · ···· · · · — ”·· ·· 4 9 4 9 49 4 4 (Promega, Cat. No. E2510), čímž je možno kvantifikovat aktivitu vzorku G-CSF in vitro.

Buňky BaF3/hGCSF-R/pfos-lux se udržují při 37 °C ve zvlhčované atmosféře s 5 % CO₂ v kompletním kultivačním médiu (RPMI-1640/HEPES (Gibco/BRL, Cat. No. 22400), 10% FBS (HyCIone, charakterizované), 1 x penicilin/streptomycin (Gibco/BRL, Cat. No. 15140-122), 1 x L-glutamin (Gibco/BRL, Cat. No. 25030-081), 10% kondicionované médium WEHI-3 (zdroj mulL-3) a pěstují se na hustotu 5 χ 10⁵ buněk/ml (do konfluence). Buňky se znovu vysévají na koncentraci přibližně 2 χ 10⁴ buněk/ml každé 2 až 3 dny.

Jeden den před testem se buňky v logaritmické fázi resuspendují v 2 χ 10⁵ buněk/ml v médiu pro hladovění (DMEM/F-12 (Gibco/BRL, Cat. No. 11039), 1% BSA (Sigma, Cat. No. A3675), 1 x penicilin/streptomycin (Gibco/BRL, Cat. No. 15140-122), 1 x Lglutamin (Gibco/BRL, Cat. No. 25030-081), 0,1% kondicionované médium WEHI-3) a nechají se hladovět 20 hod. Buňky se dvakrát promyjí PBS a testují se na viabilitu pomocí barvení trypanovou modří. Buňky se resuspendují v testovacím médiu (RPMI-1640 (bez fenolčerveni, Gibco/BRL, Cat. No. 11835), 25mM HEPES, 1% BSA (Sigma, Cat. No. A3675), 1 x penicilin/streptomycin (Gibco/BRL, Cat. No. 15140-122), 1 x L-glutamin (Gibco/BRL, Cat. No. 25030-081) na koncentraci 4 χ 10⁶ buněk/ml a alikvoty 50 ml se pipetují do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky (Corning). Vzorky obsahující konjugovaný nebo nekonjugovaný G-CSF nebo jeho varianty se naředí na koncentrace mezi 1,1 χ 10'⁷ M a 1,1 χ 10'¹² M v testovacím médiu. 50 pl každého vzorku se přidá do tří jamek obsahujících buňky BaF3/hGCSF-R/pfos-lux. Negativní kontrola obsahující 50 μΙ média se přidá do osmi jamek na každé mikrotitrační destičce. Destičky se mírně zamíchají a inkubují 2 hod při 37 °C. Aktivita luciferázy se měří pomocí protokolu Promega Steady-Glo™ (Promega Steady-Glo Luciferase Assay System, Cat. No. E2510). 100 μΙ substrátu se přidává na jamku s následným mírným mícháním. Luminiscence se • ·

-.84 měří na luminometru TopCount luminometer (Packard) v modu SPC (single photon counting).

Na základě těchto měření je možno vypočíst křivky závislosti odpovědi na dávce pro každou konjugovanou a nekonjugovanou molekulu G-CSF nebo její variantu a tak je možno zjistit hodnotu EC50 pro každou molekulu.

Sekundární test - vazebná afinita G-CSF nebo jeho variant k receptoru pro hG-CSF

Vazba rhG-CSF nebo jeho variant na receptor hG-CSF se studuje standardními testy vazby. Receptory mohou být čištěné extracelulární receptorové domény, receptory navázané na čištěné buněčné plasmatické membrány nebo úplné buňky - zdrojem buněk jsou buď buněčné linie, které vždy exprimují receptory G-CSF (např. NFS-60) nebo buňky transfekované cDNA kódujícími receptory. Schopnost rhG-CSF nebo jeho variant soutěžit o vazebná místa s nativním G-CSF se analyzuje inkubací se značeným analogem GCSF, například biotinylovaným hG-CSF nebo hG-CSF značeným radioaktivním jódem. Příklad takového testu se popisuje v Yamasaki a další (Drugs. Exptl. Clin. Res. 24: 191 - 196 (1998)).

Extracelulární domény receptoru hG-CSF mohou být případně navázány na Fc a imobilizovány v 96-jamkových destičkách. RhG-CSF nebo jeho varianty se potom přidají a detekuje se jejich vazba použitím buď specifických protilátek proti hG-CSF nebo biotinylovaného nebo radioaktivním jodem značeného hG-CSF.

Měření poločasu in vivo konjugovaného a nekonjugovaného rhG-CSF a jeho variant

Důležitým aspektem vynálezu je prodloužený biologický poločas, kterého se dosáhne konstrukcí hG-CSF s nebo bez konjugace • · polypeptidů k polymerní části. Značné snížení koncentrací hG-CSF v séru ukázalo, že je důležité vyhodnocovat biologické odpovědi na léčení konjugovaným a nekonjugovaným hG-CSF a jeho variantami. Konjugovaný a nekonjugovaný hG-CSF a jeho varianty podle předkládaného vynálezu mají s výhodou prodloužené poločasy v séru také po i.v. podání, což umožňuje měření například metodou ELISA nebo testem primárního screeningu. Měření biologického poločasu in vivo bylo prováděno následujícím způsobem.

Byly používáni samci krys Sprague Dawley (stáří 7 týdnů). V den podání byla zvířata zvážena (280 až 310 g na zvíře). Do ocasní žíly tří krys bylo nastříknuto 100 pg na kg tělesné hmotnosti nekonjugovaných a konjugovaných vzorků hG-CSF. V čase 1 min, 30 min, 1, 2, 4, 6 a 24 hod po injekci bylo odebíráno 500 pl krve každé kryse z očí v anestézii CO2. Vzorky krve byly uchovávány při teplotě laboratoře 1 1/2 hod a potom bylo sérum izolováno centrifugací (4 °C, 18 000 x g 5 min). Vzorky séra byly uchovávány při -80 °C až do analýzy. Množství aktivního G-CSF ve vzorcích séra bylo kvantifikováno testy aktivity GCSF in vitro (viz primární testy 1 a 2) po roztáni vzorků na ledu. Další příklad testu pro měření poločasu in vivo G-CSF nebo jeho variant se popisuje v US 5,824,778, jehož obsah se tímto zařazuje odkazem.

Měření biologické aktivity in vivo konjugovaného a nekonjuqovaného hG-CSF a jeho variant

Měření biologických účinků in vivo hG-CSF v krysách SPF Sprague Dawley (získaných od firmy Μ & B A/S, Dánsko) se používá pro vyhodnocení biologické účinnosti konjugovaného a nekonjugovaného G-CSF a jeho variant.

V den dodání byly krysy náhodně rozděleny do skupin po šesti. Zvířata byla aklimatizována po dobu sedmi dnů, kdy byly vyloučeni jednotlivci ve špatném stavu nebo s extrémní hmotností. Rozmezí hmotnosti krys na začátku období aklimatizace je 250 až 270 g.

• to· 4 • · ··!

- ee to ··

V den podání zvířata 16 hod hladovějí a potom dostanou subkutánní injekci 100 pg na kg tělesné hmotnosti hG-CSF nebo jeho varianty. Každý vzorek hG-CSF se nastříkne skupině šesti náhodně vybraných krys. Vzorky krve 300 μΙ stabilizované EDTA se odebírají z ocasní žíly krys před podáním a 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 a 144 hod po podání. Vzorky krve se analyzují na následující hematologické parametry: hemoglobin, počet červených krvinek, hematokrit, střední objem krvinek, střední koncentrace hemoglobinu v krvinkách, střední obsah hemoglobinu v krvinkách, počet bílých krvinek, diferenciální io počty leukocytů (neutrofily, lymfocyty, eosinofily, basofily, monocyty). Na základě těchto měření se vyhodnocuje biologická účinnost konjugovaného a nekonjugovaného hG-CSF a jeho variant.

Další příklady testů pro měření biologické účinnosti in vivo hGCSF nebo jeho variant se popisují v US 5,681,720, US 5,795,968, US

5,824,778, US 5,985,265 a v Bowen a další, Experimental Hematology

27:425 -432 (1999).

Zjištění vazebné afinity polypeptidu na receptor (rychlost vazby a uvolňování)

2o Síla vazby mezi receptorem a ligandem může být měřena použitím enzymatického imunoadsorpčního testu (ELISA) a radioimunologickým testem (RIA) nebo jinými takovými technikami imunologické detekce dobře známými v oboru. Vazebná interakce ligand - receptor může být také měřena na zařízení Biacore®, které využívá detekce plasmonové resonance (Zhou a další, Biochemistry, 1993, 32, 8193 - 98; Faegerstram a O’Shannessy, 1993, Handbook of Affinity Chromatography, 229 - 52, Marcel Dekker, lne., NY).

Technologie Biacore® umožňuje navázat receptor na zlatý povrch a přes něj převádět ligand. Detekce plasmonové resonance poskytne přímou kvantifikaci množství hmoty navázané na povrch v reálném čase. Tato technika poskytuje rychlostní konstanty ·· ·· • · · · • · · ·· ·· • · · · • · · · ·· ·· • · · · • · ··

-.87 navazování i uvolňování a je tedy možno zjistit disociační konstantu ligand - receptor a afinitní konstantu.

Test imunogenicity in vitro konjugátů hG-CSF

Snížená imunogenicita konjugátu podle vynálezu může být zjištěna použitím metody ELISA měřící imunoreaktivitu konjugátu ve srovnání s referenční molekulou nebo preparátem. Referenční molekula nebo preparát je normálně preparát rekombinantního lidského G-CSF jako je Neupogen® nebo jiný preparát rekombinantního lidského G-CSF, například N-koncově PEGylovaná molekula rhG-CSF popsaná v US 5,824,784. Metoda ELISA je založena na protilátkách pacientů léčených jedním z těchto rekombinantních preparátů G-CSF. Imunogenicita se považuje za sníženou, jestliže má konjugát podle vynálezu statisticky významně nižší odpověď v testu než referenční molekula nebo preparát.

Neutralizace aktivity v biochemickém testu G-CSF

Použitím biochemického testu na G-CSF popsaného výše se analyzuje neutralizace konjugátů hG-CSF séry anti-G-CSF.

Používají se séra pacientů léčených referenční molekulou GCSF nebo séra imunizovaných zvířat. Séra se přidávají buď v pevné koncentraci (ředění 1 : 20 až 1 : 500 (séra pacientů) nebo 20 až 1000 ng/ml (zvířecí séra)) nebo v pětinásobných sériových ředěních sér počínaje 1 : 20 (séra pacientů) nebo 1000 ng/ml (séra zvířat).

Konjugát hG-CSF se přidává buď v sedmi následných ředěních počínaje 10 nM nebo při pevné koncentraci (1 až 100 pM) v celkovém objemu 80 média DMEM + 10 % FCS. Séra se inkubují 1 hod při 37 °C s konjugátem hG-CSF.

Vzorky (0,01 ml) se potom převedou do 96-jamkových destiček pro tkáňovou kultivaci obsahujících buňky NFS-60 v 0,1 ml média ·« 00 00 ·· ·0 · 0 00 t · · · · • · · · ·0·· 0 · · • · 000 00 00 0·0 « 0 • Q13 · ·000 000 ~0©O *· 00 00 0· 000·

DMEM. Kultury se inkubují 48 hod při 37 °C v atmosféře vzduchu s 5 % CO2. Do kultur se přidá 0,01 ml WST-1 (WST-1 cell proliferation agent, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo) a inkubuje se 150 min při 37 °C v atmosféře vzduchu s 5 % CO2. Štěpení tetrazoliové soli WST-1 mitochondriálními dehydrogenázami v živých buňkách vede ke tvorbě formazanu, který se kvantifikuje měřením absorbance při 450 nm.

Jestliže se vzorky konjugátu hG-CSF titrují v přítomnosti pevného množství séra, neutralizační účinek je definován jako násobek inhibice (fold inhibition, Fl) kvantifikovaný jako EC50 (se sérem)/EC50 (bez séra). Snížení neutralizace protilátky variantami proteinů G-CSF je definováno jako (Fl varianty - 1) (1 - ) x 100 % (Fl standard, typu - 1)

Příklad 1

Konstrukce a klonování syntetických genů kódujících hG-CSF

Následující fragmenty DNA byly syntetizovány obecným postupem popsaným autory Stemmer a další (1995), Gene 164, str. 49 - 53:

Fragment 1, který se skládá ze štěpícího místa BamHI, sekvence kódující signální peptid YAP3 (WO 98/32867), sekvence kódující vedoucí (leader) sekvenci TA57 (WO 98/32867), sekvence kódující rozpoznávací místo pro proteázu KEX2 (AAAAGA), sekvence kódující hG-CSF s optimalizovaným použitím kodonů pro expresi v E. coli (SEQ ID No. 2) a štěpicí místo Xbal.

Fragment 2, který se skládá ze štěpícího místa BamHI, sekvence kódující signální peptid YAP3 (WO 98/32867), sekvence kódující úvodní sekvenci TA57 (WO 98/32867), sekvence kódující tf ·· *· ·· ·· ·· • ♦ · · · · · · · ' · ···· · · ·· · 4 • · ····· · · ··· · • SO · · ·· · · ·

-•e& v· ·· ·· ·» _e histidinový tag (SEQ ID No. 5), sekvence kódující rozpoznávací místo proteázy KEX2 (AAAAGA), sekvence kódující hG-CSF s použitím kodonů optimalizovaných pro expresi v E. coli (SEQ ID No. 2) a štěpící místo Xbal.

Fragment 3, který se skládá ze štěpícího místa Ndel, sekvence kódující signální peptid OmpA (SEQ ID No. 3), sekvence kódující hGCSF s použitím kodonů optimalizovaných pro expresi v E. coli (SEQ ID No. 2) a štěpící místo BamHI.

Fragment 4, který se skládá ze štěpícího místa BamHI, io Kozákovy konvenční sekvence (Kozák M., J. Mol. Biol., 1987, 20. srpen; 196(4): 947 - 50), sekvence kódující signální peptid hG-CSF (SEQ ID No. 7) a hG-CSF s použitím kodonů optimalizovaných pro expresi v buňkách CHO (SEQ ID No. 8) a štěpící místo Xbal.

Fragmenty DNA 1 a 2 byly vloženy do štěpících míst BamHI a 15 Xbal v plasmidu pJS037 (Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782: 202 207, 1996) použitím standardních technik manipulace s DNA. To vedlo k plasmidům pG-CSFcerevisiae a pHISG-CSFcerevisiae.

Fragment DNA 3 byl vložen do štěpících míst Ndel a BamHI v plasmidu pET12a (Invitrogen) použitím standardních technik manipulace s DNA. To poskytlo plasmid pG-CSFcoli.

Fragment DNA 4 byl vložen do štěpících míst BamHI a Xbal v plasmidu pcDNA3.1(+) (Invitrogen) s použitím standardních technik manipulace s DNA. To poskytlo plasmid pG-CSFCHO.

Příklad 2

Exprese hG-CSF v S. cerevisiae a E. coli

Transformace kvasinky Saccharomyces cerevisiae YNG318 (dostupné u American Type Culture Collection, VA, USA jako ATCC

208973) buď plasmidem pG-CSFcerevisiae nebo pHISG30 CSFcerevisiae, izolace transformantů obsahujících jeden z obou • · • · · 0 plasmidů a následná extracelulární exprese hG-CSF s a bez HIS tágu byla prováděna použitím standardních technik popsaných v literatuře.

Transformace E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Cat. No. 69387-3) plasmidem pG-CSFcoli, izolace transformantů obsahujících plasmid a následující exprese hG-CSF v supernatantu a v periplasmě buněk byla prováděna podle popisu v pET System Manual (8. vydání), Novagen.

Exprese hG-CSP S. cerevisiae a E. coli byla ověřována analýzou westernovým přenosem s použitím soupravy ImmunoPure ío Ultra-Sensitive ABC Rabbit IgG Staining kit (Pierce) a polyklonální protilátky proti hG-CSF (Pepro Tech EC Ltd.). Bylo zjištěno, že protein měl správnou velikost.

Hladiny exprese hG-CSF s a bez N-koncové histidinové značky v S. cerevisiae a E. coli byly kvantifikovány použitím komerčně dostupného, pro G-CSF specifického kitu ELISA (Quantikin Human GCSF Immunoassay, R & D Systems Cat. No. DCS50). Naměřené hodnoty jsou uvedeny dále.

Expresní systém	Míra exprese (mg G-CSF na I)
hG-CSF v S. cerevisiae	30
hG-CSF s histidinovou značkou v S. cerevisiae	25
hG-CSF v E. coli	0,05

Příklad 3

Čištění hG-CSF a jeho variant ze supernatantů z kultivace S.

cerevisiae

Čištění hG-CSF bylo prováděno následujícím způsobem:

Buňky se odstraní centrifugací. Supernatant z buněčné kultury se potom sterilizuje filtrací přes filtr 0,22 pm. Filtrací sterilizovaný ·· ♦♦ 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 « supernatant se pětkrát naředí v 10mM octanu sodném pH 4,5. pH se nastaví přidáním 10 ml koncentrované kyseliny octové na 5 I zředěného supernatantu. Před nanesením na kationtovou iontoměničovou kolonu by měla být iontová síla nižší než 8 mS/cm.

Zředěný supernatant se nanese při lineární rychlosti toku cm/hod na kolonu SP-sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovanou 50mM octanem sodným, pH 4,5, dokud efluent z kolony nedosáhne stabilní základní hodnotu UV a vodivosti. Pro odstranění případného nenavázaného materiálu se kolona promyje použitím ekvilibračního ío pufru až do dosažení stabilních hladin z hlediska UV absorbance a vodivosti efluentu vytékajícího z kolony. Navázaný protein G-CSF se z kolony eluuje použitím lineárního gradientu; 30 objemů kolony; 0 až 80 % pufr B (50mM NaAc, pH 4,5, 750mM NaCl) při průtoku 45 cm/hod. Na základě elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu se spojí frakce obsahující G-CSF. Chlorid sodný se přidává až do dosažení iontové síly roztoku více než 80 mS/cm.

Roztok proteinu se nanese na kolonu Phenyl Toyo Pearl 650S ekvilibrovanou 50mM NaAc, pH 4,5, 750mM NaCl. Případný nenavázaný materiál se z kolony vymyje ekvilibračním pufrem. Eluce

G-CSF se provede použitím stupňovitého gradientu vody MilliQ. Frakce obsahující G-CSF se spojí. Použitím této dvoustupňové strategie postupného zpracování je možno získat G-CSF s více než 90% čistotou. Čištěný protein se potom kvantifikuje použitím spektrofotometrického měření při 280 nm a/nebo analýzou aminokyselin.

Frakce obsahující G-CSF se spojí. Výměna pufru a zakoncentrování se provede na koncentrátorech VivaSpin (práh molekulové hmotnosti: 5 kDa).

·· ··

·· ·· • ♦ · · • · · · • · · ··

-£2

Příklad 4

Identifikace a kvantifikace nekonjugovaného a konjugovaného hG-CSF a jeho variant

Elektroforéza na SDS-polvakrylamidovém gelu

Čištěný, zakoncentrovaný G-CSF byl analyzován metodou SDSPAGE. Převažoval jediný pruh se zdánlivou molekulovou hmotností přibližně 17 kDa.

Absorbance io Pro odhad koncentrace G-CSF je možno použít spektrofotometrických metod. Měřením absorbance při 280 nm a použitím teoretického extinkčního koeficientu 0,83 je možno vypočíst koncentraci proteinu.

Analýza aminokyselin

Přesnější stanovení proteinu je možno dosáhnout analýzou aminokyselin. Aminokyselinová analýza prováděná u čištěného G-CSF odhalila, že experimentálně zjištěné aminokyselinové složení je v souladu s očekávaným složením aminokyselin založeným na sekvenci DNA.

Příklad 5

Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF PEGylovaného G-CSF standardního typu a variant G-CSF

Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla použita pro vyhodnocení počtu skupin PEG navázaných na PEGylovaný G-CSF standardního typu a na vybrané varianty PEGylovaného G-CSF.

99 • ·9 9 • · · 9 • 9 9 99 ·♦ ·· ; r..

9 9 9 9 9 9 9 «9

9 9

•· 9999

G-CSF standardního typu obsahuje pět primárních aminových skupin, které jsou očekávanými vazebnými místy pro SPA-PEG (Nkoncová aminoskupina a ε-aminoskupina na K16, K23, K34 a K40). Po PEGylaci G-CSF standardního typu SPA-PEG 5000 ukázala hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF přítomnost molekul G-CSF standardního typu, ve kterých bylo navázáno hlavně 4, 5 a 6 skupin PEG. Navíc byl jasně viditelný G-CSF standardního typu s navázanými sedmi skupinami PEG, i když v menším množství.

Varianta G-CSF obsahující substituce K16R, K34R, K40R, io Q70K, Q90K a Q120K obsahuje rovněž pět primárních aminových skupin (N-koncová aminoskupina a ε-aminoskupina na K23, K70, K90 a K120). Po PEGylaci této varianty G-CSF SPA-PEG5000 ukázala hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF přítomnost molekul varianty GCSF, na které bylo navázáno zejména 4, 5 a 6 skupin PEG. Navíc byla jasně viditelná vrianta G-CSF se sedmi skupinami PEG, i když v menších množstvích.

Varianta G-CSF se substitucemi K16R, K34R a K40R obsahuje dvě primární aminové skupiny (N-koncová aminoskupina a εaminoskupina na K23). Po PEGylaci této varianty G-CSF SPA-PEG

12000 ukázala hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF přítomnost molekul varianty G-CSF s navázanými většinou dvěma a třemi skupinami PEG. Navíc byla jasně vidět varianta G-CSF s navázanými čtyřmi skupinami PEG, i když v menších množstvích.

Tato pozorování jasně ukazují, že navíc k aminokyselinovým zbytkům obsahujícím aminoskupinyse za použitých podmínek PEGylace někdy pegylují i jiné aminokyselinové zbytky. Ukazuje se také, že zavedení aminových skupin je v určité míře důležité pro PEGylaci. To bylo také pozorováno použitím analýzy SDS-PAGE GCSF standardního typu a variant G-CSF.

Jak je popsáno v příkladu 11, bylo ukázáno, že histidin 170 je úplně PEGylován, jestliže se použije chemické reakce SPA-PEG.

Navíc jsou zbytky K23 a S159 PEGylovány částečně. To vysvětluje přítomnost jednoho až dvou dalších PEGylačních míst kromě primárních aminů v hG-CSF a variantách, které byly připraveny.

Příklad 6

Mapování peptidů PEGylovaných a nePEGylovanych variant G-CSF

Aby bylo možno zmapovat další vazební místa pro SPA-PEG na G-CSF a variantách G-CSF, byla použita následující strategie.

Byla zvolena varianta G-CSF s nízkým počtem aminových skupin, aby se snížil počet očekávaných míst PEGylace na minimum. Zvolená varianta G-CSF obsahuje substituce K16R, K34R, K40R a H170Q. Kromě ε-aminoskupiny na K23, o které dosavadní údaje ukázaly, že není PEGylována ve větším měřítku, obsahuje tato varianta pouze jednu primární aminovou skupinu na N-konci. U této varianty G-CSF je tedy pozadí PEGylace na aminových skupinách výrazně sníženo. Tato varianta G-CSF byla PEGylována použitím SPA-PEG 5000. Po PEGylace byla varianta G-CSF denaturována, disulfidické vazby byly redukovány, výsledné thiolové skupiny alkylovány a alkylovaný a PEGylovaný protein byl degradován proteázou specifickou pro kyselinu glutamovou. Nakonec byly výsledné peptidy separovány HPLC s reverzními fázemi.

Paralelně s tímto experimentem byla identicky zpracována nePEGylovaná verze varianty G-CSF se substitucemi K16R, K34R a K40R, aby byl získán referenční chromatogram HPLC.

Porovnání chromatogramů HPLC z degradace PEGylované varianty G-CSF a nePEGylované varianty G-CSF by potom mělo odhalit, které peptidy po PEGylaci zmizí. Identifikace těchto peptidů sekvenováním od N-konce peptidu nePEGylované varianty G-CSF potom nepřímo ukazuje na polohy, které se PEGylují.

• · · ·< ·« > · · · > · · · ’06 ·* • * · • · ·· • · · ··

V podstatě by bylo výhodné používat nePEGylovanou verzi varianty G-CSF, která má všechny substituce K16R, K34R, K40R a H170Q, ale pro všechny praktické účely to nevadí.

Konkrétněji, přibližně 1 mg PEGylované varianty G-CSF se 5 substitucemi K16R, K34R, K40R a H170Q a přibližně 500 pg nePEGylované varianty G-CSF se substitucemi K16R, K34R a K40R byly sušeny v koncentrátoru SpeedVac. Tyto dva vzorky byly vždy rozpuštěny ve 400 pl pufru 6M guanidinium, 0,3M Tris HCI, pH 8,3 a denaturovány přes noc při 37 °C. Po denaturaci byly disulfidické vazby ío v proteinech redukovány přidáním 50 pl pufru 0,1M DTT v 6M guanidiniu, 0,3M TrisHCI, pH 8,3. Po 2 hod inkubace při laboratorní teplotě byly přítomné thiolové skupiny alkylovány přidáním 50 pl 0,6M jodacetamidu v 6M guanidiniu, 0,3M Tris-HCI, pH 8,3. Alkylace probíhala 30 min při laboratorní teplotě před výměnou pufru redukovaných a alkylovaných proteinů za 50mM NH4HCO3 použitím kolon NAP5. Objemy vzorků byly sníženy na přibližně 200 pl v koncentrátoru SpeedVac před přidáním 20 pg, popřípadě 10 pg proteázy specifické pro kyselinu glutamovou. Degradace proteázami specifickými pro kyselinu glutamovou byly prováděny 16 hod při 37 °C.

Výsledné peptidy byly děleny HPLC s reverzními fázemi použitím kolony Phenomenex Jupiter Cis column (0,2 . 5 cm) a eluovány lineárním gradientem acetonitrilu v 0,1% vodné TFA. Spojené frakce byly analyzovány hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF a následně byly vybrané peptidy podrobeny analýze N-koncové sekvence aminokyselin.

Porovnání chromatogramů HPLC degradačních produktů PEGylované varianty G-CSF a nePEGylované varianty G-CSF odhalilo, že PEGylací zmizely pouze dvě frakce. N-koncová analýza aminokyselinové sekvence těchto dvou frakcí z nePEGylované varianty G-CSF ukázala, že oba peptidy byly odvozeny od N-konce GCSF. Jeden peptid se skládal z aminokyselinových zbytků 1 až 11 vytvořených neočekávaným štěpením za Gln11. Druhý peptid se ·· «to • * · · • · to to • · ··· ·· ·· ► to* « i to ·· skládal z aminokyselinových zbytků 1 až 19 vytvořených očekávaným štěpením za Glu19.

Očekávalo se, že N-koncový peptid G-CSF by mohl být tímto způsobem identifikován, protože N-koncová aminoskupina se snadno

PEGyluje. Touto metodou však nebylo identifikováno žádné další místo připojení pro SPA-PEG 5000.

Alternativou k nepřímé identifikaci vazebných míst pro PEG 5000 je přímá identifikace vazebných míst v PEGylovaných peptidech. Frakce obsahující PEGylované peptidy se však jedna od druhé a od io několika frakcí obsahujících nePEGylované peptidy při separaci HPLC degradované PEGylované varianty G-CSF obtížně dělí. Analýza sekvence N-koncových aminokyselin těchto frakcí tedy nevedla k použitelným údajům kromě možnosti, že K23 by mohl být částečně

PEGylován.

Aby bylo možno předejít těmto problémům, byly z frakcí z první separace HPLC vytvořeny dvě zásobní množství PEGylovaných peptidů. Tato dvě množství byla sušena v koncentrátorech SpeedVac, rozpuštěna ve 200 μΙ čerstvě připraveného 50mM NH4HCO3 a dále degradována 1 pg chymotrypsinu. Výsledné peptidy byly děleny na

HPLC s reverzními fázemi s použitím kolony Phenomenex Jupiter Cis column (0,2 . 5 cm) s elucí lineárním gradientem acetonitrilu v 0,1% vodné TFA. Jímané frakce byly analyzovány hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF a potom byly vybrané peptidy analyzovány na sekvenci Nkoncových aminokyselin.

Z určení sekvence N-koncových aminokyselin mohlo být zjištěno, že K23 stejně jako S159 jsou částečně PEGylovány. Nebylo možné zjistit přesný stupeň PEGylace v těchto dvou polohách, ale PEGylace je pouze částečná, protože peptidy, ve kterých jsou K23 a S159 nemodifikované, byly identifikovány a sekvenovány z počáteční separace HPLC.

• 9 ·« • · 9 · • · 9 · • · ··· 9

-o? -..· • 9 99 • · · 9 # 99 • 9 9 9

9 9 9

99

Příklad 7

Glykosvlace G-CSF standardního typu a variant G-CSF

Při analýze čištěného G-CSF standardního typu a variant G-CSF hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF bylo stále pozorováno, že je přítomna další složka s hmotností o přibližně 324 Da vyšší než je hmotnost analyzované molekuly G-CSF. Protože složka s nejnižší hmotností má vždy hmotnost molekuly G-CSF a protože mají molekuly G-CSF správnou N-koncovou sekvenci aminokyselin, autoři došli k ío závěru, že další složkou je modifikovaná molekula G-CSF nesoucí dva hexozové zbytky. V mnoha případech poskytne nemodifikovaná molekula G-CSF nejintenzivnější signál, ale v některých případech je nejintenzivnější signál modifikované molekuly G-CSF.

V průběhu analýzy peptidů vytvořených s cílem identifikovat další PEGylační místa byly identifikovány při každé z degradací dva peptidy zajímavé pro identifikaci glykosylačních míst.

U obou separací HPLC se tyto dva peptidy eluují těsně u sebe a hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF ukazuje rozdíl hmotnostiá mezi těmito dvěma peptidy přibližně 324 Da. Údaje z hmotnostní

2o spektrometrie ukazují, že peptid zahrnuje aminokyselinové zbytky 124 až 162. Analýza N-koncové sekvence aminokyselin těchto čtyř peptidů ukázala, že toto přiřazení je správné, a jediným místem modifikace je Thr133. V peptidech s hmotností nemodifikovaného peptidů je Thr133 v sekvenci jasně viditelný, zatímco poloze 133 nelze přiřadit žádný aminokyselinový zbytek u peptidů s hmotností vyšší o 324 Da. Protože v sekvenci byly přiřazeny všechny ostatní aminokyseliny, byl vyvozen závěr, že jediným místem modifikace je Thr133. Toto glykosylační místo bylo podle dosavadních údajů používáno v rekombinantním GCSF exprimovaném v buňkách CHO, ačkoli glykan se liší od glykanu navazovaného v kvasinkách.

9 9 t

fl 9 ·· • ·

-’0βflfl ·♦ • flfl 9 « · ·· • · · · * 9 9 φ ·· 99

Neglykosylovaný G-CSF standardního typu byl oddělen od glykosylovaného G-CSF standardního typu použitím HPLC s reverzními fázemi a kolony Vydac Ci₈ column (0,21 . 5 cm) isokraticky eluované 51% acetonitrilem v 0,1% TFA jako frakce, u 5 které hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF ukázala, že obsahuje pouze neglykosylovanou formu G-CSF standardního typu.

Příklad 8

Separace molekul G-CSF s různými počty kovalentně navázaných ío molekul PEG

Separace molekul G-CSF s kovalentně navázanými 4, 5 nebo 6 skupinami PEG bylo dosaženo následujícím způsobem. PEGylovaný protein ve 20mM citrátu sodném pH 2,5 byl nanesen na kolonu SPsepharosy FF ekvilibrovanou 20mM citrátem sodným s pH 2,5.

Nenavázaný materiál byl z kolony vymyt. Eluce byla prováděna použitím gradientu pH. PEGylovaný G-CSF se začal z kolony eluovat při pH přibližně 3,8 a eluce pokračovala ve frakcích pokrývajících rozpětí pH od 3,8 do 4,5.

Tyto frakce byly analyzovány SDS-PAGE a hmotnostní spektrometrií. Analýzy ukazují, že G-CSF s nejvyšším stupněm PEGylace se nachází ve „frakcích s nízkým pH“. PEGylovaný G-CSF s nižším stupněm PEGylace se eluuje ve „frakcích s vysokým pH“.

Analýza aminokyselin prováděná na PEGylovaném G-CSF ukázala dobrý soulad mezi teoretickým a experimentálně zjištěným extinkčním koeficientem.

» ·· • « « * · · • ··· • · · · • · «· • · · · • · 9 · • 9 ·« ·« • « • · • · ·«»·

Příklad 9

Konstrukce variant hG-CSF

Specifické substituce existujících aminokyselin v hG-CSF za zbytky jiných aminokyselin, například specifické substituce diskutované výše v obecné části popisu, byly zaváděny použitím standardních technik DNA známých v oboru. Nové varianty G-CSF byly vyrobeny použitím plasmidu pG-CSFcerevisiae obsahujícího gen kódující hG-CSF bez histidinové značky jako templátu DNA při reakcích PCR. Varianty byly exprimovány v S. cerevisiae a čištěny io podle popisu v příkladu 3. Některé z uvedených variant G-CSF jsou vyjmenovány níže (viz příklady 9 a 10).

Příklad 10

Kovalentní vazba SPA-PEG na hG-CSF nebo jeho varianty

Lidský G-CSF a jeho varianty byly kovalentně vázány na SPAPEG 5000, SPA-PEG 12000 a SPA-PEG 20000 (Shearwater) jak bylo popsáno výše v části „PEGylace hG-CSF a jeho variant v roztoku“. Aktivity konjugátů in vitro jsou uvedeny v příkladu 12.

Příklad 11

Identifikace vazebných míst SPA-PEG v G-CSF místně specifickou mutagenezí s následnou PEGylací vyčištěných variant

SPA-PEG může být v G-CSF navázán na jiné aminokyselinové zbytky než je lysin. Aby bylo možno zjistit, zda byl SPA-PEG navázán na histidiny, šeřiny, threoniny a argininy, byly vyrobeny varianty, ve kterých byly tyto aminokyseliny nahrazeny lysinem, alaninem nebo glutaminem. Varianty byly exprimovány v S. cerevisiae, čištěny a PEGylovány a potom byl analyzován počet navázaných molekul SPAPEG metodou SDS-PAGE. Snížení počtu navázaných molekul SPA30 PEG po substituci dané aminokyseliny glutaminem nebo alaninem silně ukazuje, že tato aminokyselina je PEGylována prostřednictvím

SPA-PEG, a toto pozorování je navíc pozorováno nezměněným stupněm PEGylace po substituci této aminokyseliny za lysin.

Analyzované varianty jsou uvedeny dále.

0* a* • · · · 0 9 0 0 * · ··>

-Ί£ΓΟ«·

0

0 0

0

0 0 ·

0 0 · 0

0« »* 0« • · 0 0 • * β

0 0

0· »0 0 9 0 0

Varianta G-CSF	Počet navázaných skupin PEG
hG-CSF	10% 4 PEG, 75 % 5 PEG, 15% 6 PEG
K23R	10 % 4 PEG, 85% 5 PEG, 5% 6 PEG
H43Q	10% 4 PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG
H43K	10% 5 PEG, 75% 6 PEG, 15% 7 PEG
H52Q	10% 4 PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG
H52K	10% 5 PEG, 75% 6 PEG, 15% 7 PEG
H156Q	10% 4 PEG, PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG
H156K	10% 5 PEG, 75% 6 PEG, 15% 7 PEG
H170Q	10% 3 PEG, 75% 4 PEG, 15% 5 PEG
H170K	10% 4 PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG
K16/34R	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34R R22K	10% 3 PEG, 75% 4 PEG, 15% 5 PEG
K16/34R R22Q	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34R S142A	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R	10% 1 PEG, 75% 2 PEG, 15% 3 PEG
K16/34/40R S53K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S53A	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S62K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S66K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S80K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R T105K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R T133K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S142K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG

• <

0» « 0 ·

0

0 • ·

0000 '··» • »4 · 0 • *

0 0 * »0

0 0 * » 0 ♦ 0 *0

400 » ♦

«π»

-ΊΠ1

K16/34/40R R147K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S155K	10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG
K16/34/40R S159K	10% 2 PEG, 85% 3 PEG, 5% 4 PEG
K16/34/40R S170K	10% 1 PEG, 75% 2 PEG, 15% 3 PEG
K16/34/40R S170Q	5% 0 PEG, 85% 1 PEG, 15% 2 PEG

Tyto údaje ukazují, že kromě N-konce, K16, K34 a K40, je SPAPEG také kovalentně vázán na H170. Tyto údaje dále ukazují, že PEGylovaných je pouze 10 % dostupných aminokyselinových zbytků

K23, a že PEGylovaných je přibližně 10 % zbytků S159.

Příklad 12

Biologická aktivita in vitro nekonjugovaného a konjugovaného hG-CSF a jeho variant io Biologické aktivity in vitro konjugovaného a nekonjugovaného hG-CSF a jeho variant byly měřeny jak bylo popsáno výše v části nazvané „Primární test 2 - test aktivity in vitro hG-CSF“. Naměřené hodnoty EC50 pro každou variantu s a bez konjugace SPA-PEG 5000 na dostupná PEGylační místa jsou uvedeny dále. Hodnoty byly normalizovány vzhledem k hodnotě EC50 nekonjugovaného hG-CSF (Neupogen®). Tato hodnota byla měřena současně s variantami vždy za stejných podmínek testu. Hodnota EC50 pro hG-CSF v popisovaném testu je 30 pM.

Varianta G-CSF	EC50 (% hG-CSF) nekonjugovaný	EC50 (% hG-CSF) konjugovaný k SPA- PEG 5000
G-CSF s N-koncovou histidinovou značkou	10	Nebylo zjištěno
G-CSF bez N-koncové histidinové značky	100	0,1

• · * · * • · ·

-*102 ·· ··· · c· · · • · • · · • r · e«· ·· ·« ·« •t ··

16R	100	1
16Q	80	1
23Q	80	0,1
23R	100	0,1
34R	100	1
34A	80	1
34Q	70	1
40R	50	1
K16/23R	100	1
K16/23Q	80	1
K34/40R	50	5
K16/34R	100	10
K16/40R	50	5
K16/23/34R	50	10
K16/23/40R	50	5
K16/34/40R	35	30
K16/23/34/40R	20	15
K16/34/40R E45K	Nízká míra exprese	Nebylo zjištěno
K16/34/40R E46K	10	1
K16/34/40R S53K	5	0,5
K16/34/40R S62K	10	0,5
K16/34/40R S66K	20	2
K16/34/40R Q67K	10	0,2
K16/34/40R Q70K	30	20
K16/34/40R S80K	10	0,2
K16/34/40R Q90K	30	20
K16/34/40R E98K	Nízká míra exprese	Nebylo zjištěno
K16/34/40R D104K	10	0,9

-·Ί03·-

K16/34/40R Τ105Κ	30	10
K16/34/40R Q120K	30	20
K16/34/40R Q131K	Nízká míra exprese	Nebylo zjištěno
K16/34/40R Τ133Κ	30	10
K16/34/40R Q134K	10	0,2
K16/34/40R S142K	20	7
K16/34/40R R147K	20	1
K16/34/40R S155K	20	1
K16/34/40R S159K	20	3
K16/34/40R Q70K Q120K	25	15
K16/34/40R Q90K Q120K	25	15
K16/34/40RT105K Q120K	20	8
K16/34/40R Q120KT133K	20	8
K16/34/40R Q120K S142K	10	1
K16/34/40R Q70K Q90KT105K	10	2
K16/34/40R Q70K Q90K Q120K	20	10
K16/34/40R Q70K Q90K T133K	15	5
K16/34/40R Q70K T105K Q120K	10	2
K16/34/40R Q70K Q120K T133K	15	5
K16/34/40R Q70K Q120K S142K	10	1
K16/34/40R Q90K T105K Q120K	10	2
K16/34/40R Q90K T105K T133K	10	2
K16/34/40R Q90K Q120K T133K	15	5
K16/34/40R Q90K Q120K S142K	10	1
K16/34/40R T105K Q120K T133K	10	1
K16/34/40R Q120K T133K S142K	10	1

• .....

-·Ϊ04·• · · ► · · « ·· ··

Tyto údaje ukazují, že substituce K23 za arginin nezvýší aktivitu konjugovaného proteinu. To je způsobeno skutečností, že je PEGylováno pouze 10 % zbytků K23, takže konjugovaná varianta K23R má v podstatě stejný počet navázaných skupin PEG a má stejné rozmístění míst PEGylace jako hG-CSF. Odstranění zbývajících lysinů v polohách K16, K34 a K40 vedlo k variantě G-CSF s významnou aktivitou po PEGylaci. Konjugace SPA-PEG 5000 k této variantě nesnižuje ve srovnání s nekonjugovanou variantou významným způsobem aktivitu. PEGylace N-konce a H170 SPA-PEG 5000 io nesnižuje aktivitu hG-CSF. Bylo rozhodnuto používat hG-CSF K16R K34R K40R jako kostru pro vkládání nových PEGylačních míst. Do této kostry bylo zavedeno 21 nových PEGylačních míst mezi zbytky E45 a H159. Tyto zbytky jsou rozmístěny v částech hG-CSP, které neinteragují s receptorem G-CSF. Zavedení nových PEGylačních míst v polohách Q70, Q90, T105, Q120, T133 a S142 vedlo k variantám hG-CSP, které si zachovaly významné množství aktivity po PEGylaci SPA-PEG 5000. Tato nová PEGylační místa byla tedy kombinována ve variantách hG-CSF, které obsahovaly 2 nebo 3 nová PEGylační místa. Nejaktivnější z těchto variant po PEGylaci SPA-PEG 5000 byly hG20 CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K a hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K.

Navíc byly navázány SPA-PEG 5000, SPA-PEG 12000 a SPAPEG 20000 na hG-CSF K16R K34R K40R. Hodnoty EC50 in vitro byly 35 %, 10 % a 1 % nekonjugovaného hG-CSF (Neupogen®).

Příklad 13

Poločas in vivo nekonjugovaného a konjugovaného hG-CSF a jeho variant

Poločasy in vivo nekonjugovaného hG-CSF (Neupogen®) a

SPA-PEG 5000 konjugovaného k hG-CSF K16R K34R K40R Q70K

Q90K Q120K byly měřeny podle popisu výše (v části nazvané „Měření ··· · • ·ι • ·

-·*ΙΟ3·poločasu in vivo konjugovaného a nekonjugovaného rhG-CSF a jeho variant“). Výsledky jsou uvedeny na obr. 1. Poločas in vivo preparátu Neupogen® a SPA-PEG 5000 konjugovaného k hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K byl zjištěn 2,01 hod, popř. 12,15 hod.

Zavedení nových PEGylačních míst do hG-CSF a konjugace SPA-PEG 5000 k této variantě tedy vedla k podstatnému zvýšení poločasu in vivo. V dřívějším experimentu byl porovnáván poločas in vivo prostředku Neupogen® s hG-CSF s větší N-koncově konjugovanou molekulou PEG (10 kDa). V tomto případě byly nalezeny poločasy in io vivo 1,75 hod, popř. 7,01 hod. SPA-PEG 5000 konjugovaný k hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K měl tedy podstatně delší poločas než Neupogen® a hG-CSF s N-koncově konjugovanou molekulou PEG 10 kDa.

Přiklad 14

Biologická aktivita in vivo nekonjugovaného a konjugovaného hG-CSF a jeho variant

Biologické aktivity in vivo nekonjugovaného hG-CSF (Neupogen®), SPA-PEG 5000 - konjugovaného hG-CSF K16R K34R

K40R Q70K Q120K a SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K byly měřeny podle popisu v části „Měření biologické aktivity in vivo konjugovaného a nekonjugovaného hG-CSF a jeho variant“. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. 48 hod po injekci 100 pg na kg tělesné hmotnosti v čase t = 0 hod prostředku

Neupogen® nemohla být detekována žádná aktivita. Aktivita SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K mohla být detekována do 72 hod po počáteční injekci, zatímco SPA-PEG 5000 konjugovaný hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K zůstal aktivní in vivo až do 96 hod po počáteční injekci. Bylo tedy ukázáno, že obě konjugované varianty měly delší biologickou aktivitu in vivo než Neupogen®, a že SPA-PEG 5000 konjugovaný hG-CSF

K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K zůstával aktivní po dvakrát delší dobu in vivo než Neupogen®.

Dále byly měřeny biologické aktivity in vivo prostředku Neupogen®, SPA-PEG 12000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R

K40R a různých dávek SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K. Výsledky jsou ukázány na obr. 3. Jak bylo pozorováno dříve, nemohla být v případě látky Neupogen® detekována žádná aktivita 48 hod po počáteční injekci 100 pg na kg tělesné hmotnosti. Podání 5 pg na kg tělesné hmotnosti SPA-PEG ío 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K poskytlo mírně delší biologickou aktivitu in vivo než prostředek Neupogen®, zatímco podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti a 100 pg na kg tělesné hmotnosti této sloučeniny vedlo k aktivitě hG-CSF setrvávající 72, popř. 96 hod po počáteční injekci. SPA-PEG 12000 konjugovaný hG-CSF K16R K34R K40R zůstal aktivní in vivo do 72 hod po podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti. Jak bylo popsáno v příkladu 5 SPA-PEG 12000 konjugovaný hG-CSF K16R K34R K40R má navázány 2 nebo 3 skupiny SPA-PEG 12000, zatímco SPA-PEG 5000 konjugovaný hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K má navázaných 5 nebo 6 skupin SPA-PEG 5000. Molekulové hmotnosti těchto dvou sloučenin jsou tedy 42 až 54 kDa a 43 až 48 kDa. Delší biologická aktivita in vivo u SPA-PEG 5000 konjugovaného hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K ve srovnání s SPA-PEG 12000 konjugovaným hG-CSF K16R K34R K40R s v podstatě stejnou molekulovou hmotností ukazuje, že pro trvání biologického účinku in vivo je důležitá distribuce navázaných molekul PEG.

Zastupuje:

Claims (20)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. : ·♦ · • ·« ♦ • · ··· · * · · ♦ · ♦· * * · * • · · · * · · 1 ·· ·· ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek, měřeno jako počet buněk na litr krve, nad hladinu bílých krvinek před podáním na dobu alespoň přibližně 72 hod;

   (C) po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné 5 hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

   i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání io 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů, měřeno jako počet buněk na litr krve, nad hladinu neutrofilů před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod;

   1. Polypeptidový konjugát, který obsahuje:
2. 2. Konjugát podle nároku 1, obsahující deleci nebo substituci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku ze skupiny K16, K23, K34, K40 ze SEQ ID No. 1 jiným aminokyselinovým zbytkem.
3. 3. Konjugát podle nároku 2, obsahující substituci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku ze skupiny K16, K23, K34, K40 zbytkem R nebo Q.
4. 4. Konjugát podle některého z nároků 1 až 3, kde polypeptid obsahuje alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K,

   H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, 10 P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K , E98K, L99K, P101K, D104K, T105K,

   Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K,
5. 5 částí in vitro.

   21. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje konjugát podle některého z nároků 1 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku.

   22. Použití polypeptidového konjugátu podle některého z nároků 1 až 19 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 21 v lékařství.

   5 polypeptid s aminokyselinovou sekvencí odlišnou v alespoň jednom aminokyselinovém zbytku od aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 1, a který obsahuje alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na vazebnou skupinu polypeptidu, kde polypeptidový konjugát splňuje alespoň jedno z následujících io kritérií (A) - (D):

   (A) po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

   i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek alespoň přibližně

   5 hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů, měřeno jako počet buněk na litr krve, nad hladinu neutrofilů před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod;

   (D) po jednom subkutánním podání 25 pg na kg tělesné io hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

   i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání

   5 polyethylenglykol.

   5. Konjugát podle nároku 4, kde polypeptid obsahuje alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny Q70K, Q90K, T105K, Q120K a T133K.

   25

   5 i) polypeptid s aktivitou G-CSF, obsahující aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 alespoň jednou substitucí zvolenou ze skupiny T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10K, Q11K, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, o D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K,

   P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, s E98K, L99K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105K, Q107K,

   L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, :o Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K,

   S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K a P174K, a ii) alespoň jednu nepolypeptidovou část navázanou na lysinový zbytek polypeptidu.

   !5
6. 6. Konjugát podle některého z nároků 1 až 5, kde nepolypeptidové část je zvolena ze skupiny přírodních a syntetických homopolymerů a heteropolymerů.
7. 7. Konjugát podle nároku 6, kde polymerem je syntetický

   30 homopolymer nebo heteropolymer zvolený ze skupiny přímého nebo rozvětveného polyethylenglykolu, polyvinylalkoholu, polykarboxylových kyselin a poly-(vinylpyrrolidonu).

   • · · · • · · · · ’-Ί09·
8. 8. Konjugát podle nároku 7, kde polymer je přímý nebo rozvětvený
9. 9 9 9 · • ·,

   114*- ·· polypeptidu a polypeptid se izoluje, kde a) polypeptid obsahuje alespoň jedno N- nebo O-glykosylační místo a hostitelskou buňkou je eukaryotická hostitelská buňka schopná glykosylace in vivo, a/nebo b) polypeptid se konjuguje s nepolypeptidovou

   9 9 9 4

   9 9 ·* 9« » »9 9 ► * 9 9 ♦ 999

   9. Konjugát podle nároku 8, kde polyethylenglykol má molekulovou hmotnost přibližně 1000 až 15 000 Da.

   ío
10. 10. Konjugát podle nároku 8 nebo 9, který obsahuje 2 až 8 skupin polyethylenglykolu.
11. 11. Konjugát podle některého z nároků 1 až 10, kde polypeptid se odlišuje od aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 1 v 1 až 15
12. 12. Konjugát podle nároku 11, kde polypeptid se liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 1 ve dvou až deseti aminokyselinových zbytcích.
13. 13. Konjugát podle některého z nároků 1 až 12, kde polypeptid je glykosylovaný.
14. 14. Konjugát podle nároku 13, kde polypeptid obsahuje alespoň

    25 jedno glykosylační místo, které se nevyskytuje v přírodě.
15. 15 23. Použití konjugátu podle některého z nároků 1 až 19 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, zvláště pro léčení obecných hematopoetických poruch, včetně poruch v důsledku radiační terapie nebo chemoterapie, pro léčení leukopenie, AIDS nebo jiných imunodeficitních onemocnění,

    15 (D) po jednom subkutánním podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

    i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu,

    20 měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání

    100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů, měřeno jako počet buněk na litr krve, nad hladinu neutrofilů před podáním

    25 po dobu alespoň přibližně 72 hod.

    20. Způsob výroby polypeptidového konjugátu podle některého z nároků 1až19, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid za podmínek vedoucích k expresi

    15 ve stejné míře a na alespoň přibližně stejnou úroveň, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek, měřeno jako

    20 počet buněk na litr krve, nad hladinu bílých krvinek před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod;

    (B) po subkutánním podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

    i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek v alespoň 25 přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a * · « « *

    15 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny neutrofilů, měřeno jako počet buněk na litr krve, nad hladinu neutrofilů před podáním po dobu alespoň přibližně 72 hod.

    15 počet buněk na litr krve, nad hladinu bílých krvinek před podáním po dobu alespoň přibližně 96 hod;

    (B) po subkutánním podání 25 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

    i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek v alespoň

    20 přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek, měřeno jako

    25 počet buněk na litr krve, nad hladinu bílých krvinek před podáním na dobu alespoň přibližně 72 hod;

    (C) po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

    ·* ·· •to * • · · • toto· ,·· ·« ♦ · 1 » · ·· • · · to ·« · ·

    i) dojde ke zvýšení tvorby neutrofilů v alespoň přibližně stejné míře a na alespoň přibližně stejnou hladinu, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné

    15. Konjugát podle některého z nároků 1 až 14, se zvýšeným funkčním poločasem in vivo a/nebo poločasem v séru ve ·· *· ·· fl· srovnání s rhG-CSF obsahujícím jedinou N-koncově navázanou skupinu PEG 20 kDa.

    • · · · : : ··: ·

    -•*110·- • ·

    15 aminokyselinových zbytcích.

    15 M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K,

    Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K a P174K.
16. 16. Konjugát podle některého z nároků 1 až 14, který splňuje 5 alespoň jedno z následujících kritérií (A) až (D):

    (A) po jednom subkutánním podání 100 pg na kg tělesné hmotnosti krysám, vztaženo na hmotnost polypeptidové části konjugátu:

    i) dojde ke zvýšení tvorby bílých krvinek alespoň přibližně ío ve stejné míře a na alespoň přibližně stejnou úroveň, měřeno jako počet buněk na litr krve, jako při podání 100 pg nekonjugovaného hG-CSF na kg tělesné hmotnosti po dobu 12 hod po podání, a ii) dojde ke zvýšení hladiny bílých krvinek, měřeno jako
17. 17. Polypeptidový konjugát s aktivitou G-CSF, který obsahuje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí odlišnou v alespoň jednom aminokyselinovém zbytku od aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 1, a který obsahuje alespoň jednu nepolypeptidovou

    25 část navázanou na vazebnou skupinu polypeptidu, kde polypeptidový konjugát má zvýšený funkční poločas in vivo a/nebo poločas v séru ve srovnání s rhG-CSF obsahujícím jedinou N-koncově navázanou skupinu PEG 20 kDa.

    * ·
18. 18. Polypeptidový konjugát podle nároku 17, který obsahuje dvě nebo více navázaných nepolypeptidových částí.
19. 19. Polypeptidový konjugát s aktivitou G-CSF, který obsahuje
20. 20 a pro léčení bakteriálních nebo jiných infekcí.