MXPA02006795A - Conjugados g-csf. - Google Patents

Conjugados g-csf.

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MXPA02006795A
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Abstract

La presente invencion se relaciona con polipeptidos conjugdos que comprenden un polipeptido que presenta actividad G-CSF y que tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de aminoacidos del G-CSF humano en por lo menos un residuo de aminoacidos especifico introducido y/o suprimido que comprende un grupo de union para una porcion no polipeptidica y que tiene por lo menos una porcion no polipeptidica unida a un grupo de union del polipeptido. El grupo de union puede ser, por ejemplo, un residuo lisina, cisteina, acido aspartico o acido glutamico o un sitio de glucosilacion y la porcion no polipeptidica puede ser, por ejemplo, un polimero tal y como polietilenglicol o un oligosacarido. El conjugado presenta una o varias propiedades mejoradas, tal como una mayor vida media biologica y efectos secundarios reducidos.

Description

CONJUGADOS G-CSF Campo del Invento La presente invención se relaciona con nuevos polipéptidos que presentan actividad del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , con conjugados entre un polipéptido que tiene actividad G-CSF y una porción no polipept idica , con métodos para preparar dichos polipéptidos o conjugados y con el uso de dichos polipéptidos o conjugados en una terapia, en particular para el tratamiento de la leucopenia. Antecedentes del Invento El proceso por el cual los glóbulos objetivos crecen, se dividen y diferencian en la médula espinal se denomina hematopoyesis (Dexter y Spooncer, Ann . Rev. Cell. Biol., 3: página 423, 1987) . Cada uno de los tipos de células sanguíneas se origina a partir de células sanguíneas producidas in vivo: glóbulos rojos (eritrocitos), plaquetas y glóbulos objetivos (leucocitos), donde la mayor parte de éstas últimas están involucradas en la defensa inmunológica del huésped. La proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas precursoras están reguladas por un familia de citocinas, incluyendo factores estimulantes de colonias (CSF) tal como G-CSF e interleucinas (Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59: páginas 783 a 836, 1990) . El principal efecto biológico del G-CSF in vivo consiste en estimular el crecimiento y el desarrollo de ciertos leucocitos conocidos como granulocitos neutrof ilicos o neutrófilos (Welte et al., PNAS-EE.UU. 82: páginas 1526 a 1530, 1985, Souza et al., Science, 232: páginas 61 a 65, 1986) . Cuando se liberan en el flujo sanguíneo, los granulocitos neutrofil icos funcionan para combatir infecciones bacterianas. La secuencia de aminoácidos del G-CSF humano (hG-CSF) fue descrita por Nagata et al. Nature 319: páginas 415 a 418, 1986. El hG-CSF es una proteína monomérica que se dimeriza en el receptor G-CSF por formación de un complejo 2:2 de 2 moléculas de G-CSF y 2 receptores (Horan et al. (1996), Biochemistry 35(15) : páginas 4886 a 4896) . Aritomi et al. Nature 401: páginas 713 a 717, 1999 describieron la estructura por rayos X de un complejo entre el hG-CSF y los dominios BN-BC del receptor del G-CSF. Ellos identificaron los siguientes residuos hG-SCF como parte de la inferíase de unión del receptor: G4, P5, A6, S7, S8, L9, PIO, Qll, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 y L124. Se ha descrito la expresión de rhG-CSF en células de E. coli, S. cerevisiae y de mamíferos (Souza et al., Science 232: páginas 61 a 65, 1986, Nagata et al., Natura 319: páginas 415 a 418, 1986, Robinson y ittrup, Biotechnol. Prog. 11: páginas 171 A 177, 1985) .
El G-CSF recombinante humano (rhG-CSF) se utiliza en general para el tratamiento de diversas formas de leucopenia. De esta manera, existen preparaciones comerciales de rhG-CSF con los nombres de filgrastim (Gran® y Neupogen®) , lenograstim (Neutrogin® y Granocyte®) y nartograstim (Neu-up®) . Los productos Gran® y Ne pogen® no están glucosilados y se producen en células recombinantes de E. coli. Los productos Neutrogin® y Granocyte® están glucosilados y se producen en células recombinantes CHO y el producto Neu-up® no está glucosilado y tiene una sustitución de cinco aminoácidos en la región N-termínal con respecto al rhG-CSF intacto producido en células recombinantes de E. coli. Se han descrito relativamente pocas variantes de proteínas manipuladas genéticamente del hG-CSF (Patente Norteamericana No. 5.581.476, Patente Norteamericana No. 5.214.132, Patente Norteamericana No. 5.362.853, Patente Norteamericana No. 4.904.584 y Riedhaar-Olson et al. Biochemistry 35: páginas 9034 a 9041, 1996) . Se ha sugerido modificar el hG-CSF y otros polipéptidos con el fin de introducir por lo menos una cadena de carbohidratos adicional con relación al polipéptido nativo (Patente Norteamericana No. 5.218.092) . Se ha determinado que es posible modificar la secuencia de aminoácidos del polipéptido por sustitución de aminoácidos, supresión de aminoácidos o inserción de aminoácidos para poder agregar una cadena de carbohidratos adicional. Además, se han descrito modif caciones poliméricas del hG-CSF nativo ( Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function 17: páginas 157 a 160, 1992, Patente Norteamericana No. 5.824.778, Patente Nor eamericana No. 5.824.784, documento WO 96/11953) . Bowen et al., Experimental Hematology 27 (1999), páginas 425 a 432, describen un estudio de la relación entre la masa molecular y la duración de la actividad de la muteina G-CSF conjugada con PEG . Se sugirió la existencia de una aparente correlación inversa entre el peso molecular de los grupos PEG conjugados con la proteina y la actividad in vitro, en tanto las actividades in vivo aumentaban con un peso molecular creciente. Se supone que la menor afinidad de los conjugados causa un incremento en la vida media, determinado que la endocitosis transmitida por receptores es un mecanismo importante para regular los niveles de los factores de crecimiento hematopoyéticos . Los rhG-CSF disponibles comercialmente tiene un efecto farmacológico de corto plazo y a menudo deben ser administrados más de una vez por dia durante el estado leucopénico. Una molécula con una vida media en circulación más prolongada disminuiría la cantidad de administraciones necesarias para aliviar la leucopenia y prevenir las infecciones consecuentes. Otro problema de los productos con rG-CSF disponibles actualmente es la aparición de dolor de huesos dependiendo de la dosis. Determinado que los pacientes experimentan dolor de huesos como un efecto secundario significativo del tratamiento con el rG-CSF, seria deseable proveer un producto con rG-CSF que no causara dolor de huesos, ya sea por medio de un producto que de forma inherente no presenta este efecto o que sea afectivo en una dosis suficientemente pequeña como para no causar dicho dolor de huesos. Por consiguiente, existe claramente una necesidad de moléculas tipo G-CSF recombinantes mejoradas. Con respecto a la vida media, una manera de incrementar la vida media en circulación de una proteína consiste en asegurar que se reduzca la depuración de dicha proteína, en particular la depuración renal y la depuración transmitida por receptores. Esto se puede lograr conjugando la proteína con un grupo químico que tenga la capacidad de incrementar el tamaño aparente, lo cual reduce la depuración renal e incrementa la vida media in vivo. Aún más, la unión de un grupo químico a la proteína puede bloquear de forma efectiva las enzimas proteolíticas del contacto físico con la proteína, impidiendo de esa manera la degradación debida a una proteólisis no especifica. El polietilenglicol (PEG) es uno de dichos grupos químicos que se ha utilizado en la preparación de productos protéicos terapéuticos. Actualmente, se están efectuando estudios clínicos con una molécula de G-CSF modificada con un solo grupo PEG ligado en el extremo N-terminal, denominado SD/01. Si bien se ha demostrado que esta molécula de G-CSF polietilenglucosilada presenta una mayor vida media en comparación con un G-CSF no polietilenglucosilado, presenta una baja actividad y por ello debe ser administrada en dosis bastante altas. Como resultado de ello, el problema del dolor de huesos mencionado anteriormente no se pudo resolver con esta molécula. Aún más, todavía existe la necesidad substancial de mejorar, las moléculas G-CSF conocidas en términos de vida media. Por ello persiste la necesidad de proveer moléculas novedosas que presenten actividad G-CSF de utilidad para el tratamiento de leucopenia y que sean mejores en términos de una vida media incrementada y una reducción de los efectos secundarios. La presente invención se relaciona con dichas moléculas. Sumario del Invento Más específicamente, la presente invención se relaciona con conjugados específicos que comprenden un polipéptido con actividad G-CSF y un grupo no polipeptídico, con los métodos para la preparación de los mismos y con su uso en tratamientos médicos y en la preparación de productos farmacéuticos. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con diversos conjugados específicos que comprenden un polipéptido con actividad G-CSF y cuya secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos conocidos de G-CSF humano que se demuestra en la SEQ ID No. 1 en por lo menos un residuo de aminoácidos alterado específico, que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica y que tiene por lo menos una porción no polipeptídica unida a la porción de unión del polipéptido. El conjugado de la presente invención presenta una o varias propiedades mejoradas en comparación con el rhG-CSF disponible comercialmente, incluyendo una mayor vida media funcional in vivo, una mayor vida media en suero, efectos secundarios reducidos, inmunogenicidad reducida y/o una mayor biodisponibilidad. En consecuencia, el tratamiento médico con el conjugado de la presente invención ofrece una cantidad de ventajas con respecto a los compuestos de G-CSF disponibles actualmente . En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con polipéptidos que presentan actividad G-CSF y que forman parte del conjugado de la presente invención.
Se considera que los polipéptidos de la presente invención son útiles para fines terapéuticos, diagnósticos u otros propósitos, pero son de particular interés como productos intermediarios para la preparación de un conjugado de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un polipéptido conjugado que contiene un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de hG-CSF (con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1) en por lo menos un residuo de aminoácidos seleccionado entre un residuo de aminoácidos introducido o suprimido que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptidica y una cantidad suficiente, o un tipo de porción no polipeptidica, como para proveer un conjugado con una mayor vida media en comparación con los productos con G-CSF recombinantes conocidos . En aún otros aspectos, la presente invención se relaciona con métodos para preparar un conjugado de la presente invención, incluyendo secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de la misma, vectores de expresión que comprenden tal secuencia de nucleótidos, y células huésped que comprenden tales secuencia de nucleótidos o vector de expresión.
En aspectos finales, la presente invención se relaciona con una composición que comprende un conjugado o un polipéptido de la presente invención, un método para preparar una composición farmacéutica, el uso de un conjugado o comósición de la pésente invención como un farmacéutico y un método para tratar un mamífero con dicha composición. En particular, el polipéptido, el conjugado o la composición de la presente invención se puede usar para prevenir infecciones en pacientes con cáncer bajo tratamiento con ciertos tipos de terapia de radiación, quimioterapia y transplantes de médula ósea, para movilizar células progenitoras con el fin de recogerlas para transplantes de células progenitoras en sangre periférica, para el tratamiento de leucopenia crónica severa o relativa, independientemente de la causa y para brindar soporte en el tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda. Además, el polipéptido, conjugado o la composición de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia, así como en infecciones bacterianas . Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 : vidas medias in vivo rhG-CSF (Neupogen®) y hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000.
La figura 2 : actividades biológicas in vivo de rhG-CSF (Neupogen®) , hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K conjugados con SPA-PEG 5000. La figura 3: actividades biológicas in vivo de rhG-CSF (Neupogen®), hG-CSF K16R 34R K40R conjugados con SPA-PEG 12000 y diferentes dosis de hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K, conjugado con SPA-PRG 5000.
Descripción Detallada del Invento Definiciones En el contexto de la presente solicitud e invención se aplican las siguientes definiciones: El término "conjugado" se propone para indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de uno o varios polipéptidos , típicamente un solo polipéptido, a uno o varios grupos no polipeptídicos , tal como moléculas poliméricas, compuestos lipofilicos, porciones de hidratos de carbono o agentes derivantes orgánicos. El término unido de manera covalente significa que el polipéptido y la porción no polipeptídica están unidas, una con otra, de manera covalente en forma directa, o adem's unidas de manera covalente de manera indirecta a través de una porción o porciones que intervienen, tal como un puente, un espaciador o una porción o porciones ligadoras. Preferentemente, es soluble a concentraciones y condiciones apropiadas, por ejemplo, soluble en fluidos fisiológicos tal como la sangre. El término "polipéptido no conjugado" se puede utilizar respecto de la parte polipeptidica del conjugado. El término "polipéptido", se uede utilizar de manera intercambiable en la presente invención con el término "proteina" . El término "molécula polimérica" es una molécula formada por enlaces covalentes de dos o varios monómeros, donde ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácidos, excepto cuando el polímero es albúmina humana u otra proteína abundante del plasma. El término "polímero" se puede utilizar indistintamente con el término "molécula polimérica". El término está propuesto para abarcar moléculas de carbohidratos, no obstante que normalmente, el término pretende cubrir el tipo de molécula de carbohidrato que está adherida al polipéptido mediante glucosilación-N u -0 (tal como se describirá de manera adicional más adelante) , ya que tal molécula es referida en la presente invención como "una porción de oligosacárido" . Excepto en donde el número de molécula (s) de polímero se indique de manera expresa, cada referencia a "un polímero", "una molécula de polímero", "el polímero" o "la molécula de polímero" contenidas en un polipéptido de la presente invención u que se utilice de cualquier otra manera en la misma, deberá ser una referencia a una o más moléculas poliméricas. El término "grupo de unión", pretende indicar un grupo de residuo de aminoácidos del polipéptido, con la capacidad de acoplar el grupo no polipeptidico relevante. Por ejemplo, para conjugación polimérica, en particular a PEG, un grupo de unión utilizado de manera frecuente es el grupo e-amino de lisina o el grupo amino de terminal-N. Otros grupos de unión polimérica, incluyen un grupo de ácido carboxilico libre (por ejemplo, el del residuo de aminoácido de terminal-C o de un residuo de ácido aspártico o ácido grutámico), grupos carbonilo activados de forma adecuada, porciones de carbohidrato oxidadas y grupos mercapto. Los grupos de unión útiles y sus grpos no peptidicos de coincidencia son apreciados en la tabla que se encuentra a continuación.
Grupo de Aminoácido Ejemplos de Método dé Referencia unión grupos no con ugación PEG peptidicos activado -NH2 N-terminal, Polímero, por mPEG-spa mPEG Shearwater Inc. Lys, His, ejemplo PEG, trisilado Delgado et al. , Arg con un grupo revisión critica amida ó imina en Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4) :249-304 (1992) . -COOH C-terminal, Polímero, por mPEG-Hz Shearwater Inc.
Asp, Glu ejemplo> con Acoplamiento ii un grupo vitro éster 0 amida Grupo oligosacárido -SH Cys Polímero, por PEG-visulfona Shearwater Inc. ejemplo, con PEG^maleimida Delgado et al. , un grupo Acoplamiento in revisiones disulfuro,. vitro criticas en maleimida 0 Therápeutic Drug vinilsulfóna Cairrier Systems Grupo 9(3,4).:249-304 oligosacárido (1992) . -OH Ser, Thr, Glupo Glucosilación in OH-, lys oligosacárido vivo ligado en O PEG con éster, éter, carbamato, carbonato -CONH2 Asn Gano Grupo N-glucosilación parte de uní oligosacárido vivo sitio de N- Polímero, por glucosilaci ejemplo, PEG En el caso de la N-glucosilación in vivo, el término "grupo de unión" se utiliza de manera no convencional para indicar los residuos de aminoácidos que constituyen un sitio de N-glucosilación (con la secuencia N-Xr -S/T/C-X", donde X' es cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina, X" es cualquier residuo de aminoácidos que puede, o no, ser idéntico a X' y que preferentemente es distinto de prolina, N es asparagina y S/T/C es serina, treonina o cisteína, preferentemente serina o treonina y con mayor preferencia treonina) . Si bien el residuo asparagina del sitio de N-glucosilación es el sitio donde se une el ol igosacárido durante la glucosilación, dicha unión no se puede lograr a menos que también estén presentes los otros residuos de aminoácidos del sitio de N-glucosilación. Por consiguiente, cuando la porción no peptidica es un grupo oligosacárido y la conjugación se realiza por N-glucosilación, el término "residuo de aminoácidos que comprende un grupo de unión para la porción no peptidica" como se usa con relación a las alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés significa que uno o varios residuos de aminoácidos que constituyen un sitio de N-glucosilación serán alterados de manera tal que cualquier sitio de N-glucosilación funcional es introducido en la secuencia de aminoácidos o es suprimido de dicha secuencia. En la presente solicitud, los nombres de los aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo, CA, CB, NZ, N, O, C, etc.,) se utilizan como se define en Protein DataBank (PDB) ( www . db . org ) , que se basa en la nomenclatura IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (nombres de residuos, nombres de átomos, etc, ) , Eur. J. Biochem., 138, páginas 9 a 37 (1984) junto con sus respectivas correcciones en Eur. J. Biochem. , 152, página 1 (1985) . El término "residuo de aminoácidos" pretende indicar principalmente un residuo de aminoácidos contenido en el grupo formado por los 20 aminoácidos naturales, es decir, residuos de alanina (Ala ó A) , cisteina (Cys ó C) , ácido aspártico (Asp ó D) , ácido glutámico (Glu ó E), fenilalanina (Phe ó F) , glicina (Gly ó G) , histidina (his ó H) , isoleucina (lie 6 1), lisina (Lys ó K) , leucina (Leu ó L), metionina (Met ó M) , arparagina (Asn ó N), prolina (Pro ó P), glutamina (Gln ó Q), arginina (Arg ó R), serina (Ser ó S), treonina (Thr ó T), valina (Val ó V), triptofano (Trp ó W) y tirosina (Tyr ó Y) . La terminología utilizada para identificar posiciones/sustituciones en los aminoácidos se ilustra de la siguiente manera: F13 indica que la posición número 13 está ocupada por un residuo fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de referencia. F13K indica que el residuo fenilalanina de la posición 13 ha sido sistituido por un residuo lisina, a menos que se indique lo contrario. La numeración de los residuos de aminoácidos en este documento es relativa a la secuencia de aminoácidos de hG-CSF que se muestra en la SEQ ID NO. 1. Las sustituciones alternativas se indican con "/", por ejemplo, Q67D/E, significa una secuencia de aminoácidos en la cual la glutamina en la posición 67 se sustituye ya sea con ácido aspártico o ácido glutámico. Las sustituciones múltiples se indican con un signo " +", por ejemplo, S53N+G22S/T significa una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución del residuo glicina en la posición 55 por un residuo serina o treonina. El término "secuencia de nucleótidos" está propuesto para indicar un tramo consecutivo de dos o varias moléculas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser genimica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualquier de combinación de éstas. El término "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere en general a un método para la amplificación, ín vitro, de una secuencia de nucleótidos deseada, como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4.683.195. En general, el método de PCR involucra ciclos repetidos de síntesis por extensión del cebador, utilizando cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridar preferentemente con un ácido nucléico de plantilla .
Los términos "célula", "célula huésped", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan aquí indistintamente y se comprenderá que la totalidad de tales términos incluye a la progenie resultante del crecimiento o cultivo de una célula. Los términos "transformación" y "transfección" se utilizan de forma indistinta para hacer referencia al proceso de introducir ADN en un célula. El término "ligado operativamente" se refiere a una unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, ligándolos enzimáticamente o de otra manera, en una configuración relativa entre una y otra, de manera tal que la secuencia pueda realizar la función normal. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una pre-secuencia o un líder secretor está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos para un polipéptido en el caso que se exprese como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido: un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si éste afecta la transfección de la secuencia; un sitio de unión a ribosomas está ligado operativamente a una secuencia codificadora si éste está ubicado de manera tal que facilita la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" significa que las secuencias de nucleótidos que están siendo ligadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, son contiguas y en fase de lectura. La unión se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o ligandoes de oligonucleótidos sintéticos, junto con métodos estándares de ADN recombinante . El término "introduce" se refiere a la introducción de un residuo de aminoácidos que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptidica , en particular, por sustitución de un residuo de aminoácidos existente o, como alternativa, por inserción de un residuo de aminoácidos adicional. El término "suprimir" significa la eliminación de un residuo de aminoácidos que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptidica , en particular, por sustitución del residuo de aminoácidos a suprimir por otro residuo de aminoácidos o, como alternativa, por supresión (sin sustitución) del residuo de aminoácidos a eliminar. Cuando se efectúan sustituciones con relación a un polipéptido relacionado, son preferentemente "sustituciones conservadoras", en otras palabras, sustituciones ralizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminioácidos pequeños, aminoácidos de ac'dio, aminioácidos polares, aminoácidos base, aminoácidos hdrofóbicos y aminoácidos aromáticos.
Las sustituciones preferidas de la presente invención se enumeran en la Tabla 1 a continuación.
Grupos de sustitución conservadora iAlanina (A) Glicina (G) Serina (?) Treonina (T) :Acido Aspártíco Acido Glutámico :Asparagina (N) Glutamina (Q) Arginina (R) Histidina (H) Lisina (K) Isoleuciina (I) Leucina (L) Metionina Valina (V) iFenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptofan El término "inmunogenicidad" tal como se utiliza con relación a una sustancia determinada pretende indicar la capacidad de una sustancia para inducir una respuesta del sistema inmunológico . La repuesta inmunlógica puede ser una respuesta transmitida por una célula o un anticuerpo (véase, por ejemplo: Roitt: Essential Immunology (8a Edición, Blackwell) para una definición adicional de inmunogenicidad) . Habi tualmente , una reactividad reducida del anticuerpo será un indicio de una inmunogenicidad reducida. La imunogenicidad reducida se puede determinar utilizando cualquier método adecuado conocido en el arte, por ejemplo in vivo o in vitro. El término "vida media funcional in vivo" se utiliza con su significado normal, es decir, como el momento en que el 50% de la actividad biológica del polipéptido o del conjugado aún está presente en el cuerpo/órgano objetivo o como el momento en el que la actividad del polipéptido o conjugado presenta un 50% del valor inicial. Como una alternativa a la determinación de la vida media funcional in vivo, se pude determinar la "vida media en suero", es decir, el momento en que un 50% de las moléculas de polipéptido o de conjugado circula en el plasma o el flujo sanguíneo antes de su depuración. Los términos alternativos de vida media en suero incluyen "vida media plasmática", "vida media en circulación", "depuración del suero", "depuración del plasma" y "vida media de depuración". El polipéptido o conjugado es depurado por acción de uno o varios de los sistemas reticuloendoteliales (RES), riñon, bazo o hígado, por degradación transmitida por receptores o por proteólisis específica o no específica, en particular por acción de una depuración transmitida por receptores y una depuración renal. Habitualmente , la depuración depende del tamaño (con relación al nivel de corte para la filtración glomerular), la carga, las cadenas de carbohidratos unidas y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad a retener se selecciona habitualmente entre una actividad proliferativa o de unión de receptores. La vida media funcional in vivo y la vida media en suero se pueden determinar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, como se describirá adicionalmente en la sección de Materiales y Métodos más adelante . El término "incrementado" tal y como se utiliza con referencia a la vida media funcional in vivo o la vida media en suero, se utiliza para indicar que la vida media correspondiente al conjugado o al polipéptido está incrementada de manera estadísticamente significativa con relación a una molécula de referencia, tal como un hG-CSF no conjugado (por ejemplo, Neupogen®), determinado bajo condiciones comparables. Por ejemplo, la vida media relevante puede estar incrementada por lo menos en un 25% aproximadamente, tal como en por lo menos 50% aproximadamente, por ejemplo, en por lo menos 100%, 200%, 500% ó 1000% aproximadamente. El término "depuración renal" se utiliza con su significado normal para indicar toda depuración que tiene lugar por los ríñones, por ejemplo, por filtración glomerular, excreción tubular o eliminación tubular. La depuración renal depende de las característica físicas del conjugado, incluyendo el tamaño (diámetro) , la simetría, la forma/rigidez y la carga. Se puede establecer una depuración renal reducida mediante cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo establecido in vivo. Típicamente, la depuración renal se determina por administración de un polipéptido conjugado marcado (por ejemplo, marcado radioactivamente o marcado con fluorescencia) a un paciente y la medición de la actividad de la marca en la orina recogida del paciente. La depuración renal reducida se determina con relación a un polipéptido de referencia correspondiente, un polipéptido no conjugado de tipo natural correspondiente u otro polipéptido conjugado (tal como un polipéptido conjugado que no es de acuerdo con la presente invención), bajo condiciones comparables. Pref rentemente, la velocidad de depuración renal del conjugado está reducida en por lo menos un 50%, preferentemente en por lo menos un 75% y con mayor preferencia en por lo menos un 90% en comparación con un polipéptido apropiado de referencia. En general, la activación del receptor está acoplada a la depuración transmitida por un receptor (RMC) de manera tal que la unión de un polipéptido a su receptor sin activación no conduce a una RMC, en tanto la activación del receptor sí conduce a una RMC. La depuración se debe a la internalización del polipéptido unido al receptor con una subsiguiente degradación lisosómíca. La RMC reducida se puede lograr diseñando el conjugado de manera tal que se pueda unir y activar la cantidad suficiente de receptores como para obtener una respuesta biológica ín vivo óptima y evitar la activación de más receptores que los necesarios para obtener dicha respuesta. Esto se puede reflejar en una bioactividad in vitro reducida y/o una velocidad de disociación incrementada . Típicamente, una bioactividad in vitro reducida refleja una eficacia/eficiencia reducida y/o una potencia reducida y se puede determinar mediante cualquier método adecuado para la determinación de estas propiedades. Por ejemplo, la bioactividad in vitro se puede determinar con un ensayo basado en luciferasa (véase Materiales y Métodos) . La bioactividad in vitro del conjugado se puede reducir en por lo menos un 30%, tal como en por lo menos un 50% ó un 75%, por ejemplo, en por lo menos un 90%, en comparación con la bioactividad in vitro de un polipéptido correspondiente de referencia, determinado bajo condiciones comparables. En otras palabras, el conjugado puede tener una bioactividad in vitro que es tan pequeña como aproximadamente 1%, normalmente al menos aproximadamente de por lo menos 2%, tal como al menos aproximadamente 5% de la polipéptido no conjugado correspondiente o del polipéptido de tipo natural correspondiente. Por ejemplo, la bioactividad in vitro se puede encontrar en el rango de aproximadamente 1-50% con respecto a la del polipéptido relacionado, tal como por lo menos aproximadamente un 2-40%, por ejemplo 5-25%, determinada bajo condiciones comparables. En casos en donde se desea la bioactividad reducida in vitro, con el objeto de reducir la depuración transmitida por el receptor, será claro que se debe mantener la suficiente bioactividad para obtener la activación deseada del receptor. Preferentemente, la velocidad de disociación incrementada entre el polipéptido conjugado y su receptor, es de una magnitud que da como resultado la liberación del polipéptido conjugado de su receptor antes que se produzca una internalización sustancial del complejo receptor-ligando. La afinidad de unión del receptor-polipéptido (incluyendo velocidad de disociación) se puede determinar como se describe en la sección de Materiales y Métodos en este documento. La R C in vitro se puede determinar marcando (por ejmplo, con una marca radioactiva o fluorescente) el polipéptido conjugado, estimulando las células que comprenden al receptor para el polipéptido, lavando las células y midiendo la actividad de la marca. Como alternativa, se puede exponer al conjugado a células que expresan al receptor relevante. Después de un tiempo de incubación apropiado se retira el sobrenadante y se transfiere a una cavidad que contiene células similares. Luego se determina la respuesta biológica de estas células al sobrenadante con relación a la del polipéptido no conjugado u otro péptido de referencia y esto constituye una medida del grado de RMC reducida. Habitualmente , se obtiene una bioactividad in vitro reducida del conjugado como consecuencia de su modificación con una porción no polipeptidica . Sin embargo, con el fin de reducir aún más la bioactividad in vitro o por otros motivos, puede ser de interés modificar adicionalmente la parte polipeptidica del conjugado. Por ejemplo, en una modalidad se ha sustituido por lo menos un residuo de aminoácidos ubicado en o cerca del sitio de unión al receptor del polipéptido por otro residuo de aminoácidos en comparación con el correspondiente polipéptido de tipo natural con el fin de obtener una bioactividad in vitro reducida. El residuo de aminoácidos que será introducido por sustitución puede ser cualquier residuo de aminoácidos capaz de reducir la bioactividad in vitro del conjugado. Convenientemente, el residuo de aminoácidos introducido comprende un grupo de unión para la porción no polipeptidica definido anteriormente en este docuemnteo. En particular, cuando la porción no polipeptidica es una molécula polimérica, tal como PEG, el residuo de aminoácidos a introducir puede ser lisina. El término "que presenta actividad G-CSF" indica que el polipéptido o conjugado tienen una o varias de las funciones del G-CSF nativo, en particular el hG-CSF con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, incluyendo la capacidad de unirse a un receptor de G-CSF (Fukunaga et al., J. Bio. Chem 265: página 14008 , 1990) . La actividad G-CSF se evalúa convenientemente usando el ensayo primario que se describe más adelante en la sección de Materiales y Métodos. Se considera que el polipéptido que "presenta" actividad G-CSF tiene dicha actividad cuando tiene una función medible, por ejemplo, una actividad proliferativa medible o una actividad de unión al receptor (por ejemplo, determinado con el ensayo primario que se describe en la sección de Materiales y Métodos) . El polipéptido que presenta actividad de G-CSF también denominada como "molécula G-CSF" en este documento . El término "G-CSF paterno" o "polipéptido paterno" indica la molécula que ser modificada de acuerdo con la presente invención. El G-CSF paterno es habitualmente el hG-CSF o una variante del mismo. Una "variante" es un polipéptido que difiere en uno o varios residuos de aminoácidos de un polipéptido relacionado, habitualmente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 residuos de aminoácidos. Los ejemplos de rhG-CSF incluyen filgrastim (Gran® y Neupogen®) , lenograstim (Neutrogin® y Granocyte®) y nartograstim (New-up®) .
Conjugado del Invento Como se indicó anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1, en por lo menos un residuo de aminoácidos seleccionado entre residuos de aminoácidos introducidos o suprimidos específicos que contienen un grupo de unión para la porción no polipetídica y por lo menos una porción no polipeptidica unida al grupo de unión del polipéptido. Los residuos de aminoácidos que serán introducidos y/o suprimidos se describen con mayor detalle en las siguientes secciones. Se comprenderá que el propio conjugado también presenta actividad G-CSF. Al suprimir y/o introducir un residuo de aminoácidos que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptidica, es posible adaptar específicamente al polipéptido para que la molécula sea más susceptible a la conjugación con la porción no polipeptidica de elección, con el fin de optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo, para asegurar una distribución óptima de las porciones no pol ipeptídicas sobre la superficie de la molécula del G-CSF y para asegurar que solamente los grupos de unión que serán conjugados están presentes en la molécula) y de esa manera obtener una nueva molécula conjugada que tiene actividad G-CSF y además una o varias propiedades mejoradas en comparación con las moléculas de G-CSF disponibles hoy en día. En tanto el polipéptido puede ser de cualquier origen, en particular de origen mamífero, se prefiere actualmente que sea de origen humano. En modalidades preferidas de la presente invención se altera más de un residiuo aminoacídico del polipéptido con actividad G-CSF, por ejemplo, la alteración comprende la supresión, así como la introducción de residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptídica de elección. Además de las ateraciones de aminoácido aquí descritas con el objeto de eliminar y/o introducir sitios de unión para el grupo no polipeptídico , quedará entendido que la secuencia de aminoácido del polipéptido de la presente invención, puede, si se desea, contener otras alteraciones que no necesitan estar relacionadas con la introducción o eliminación de los sitios de unión, por ejemplo, otras sustituciones, inserciones o supresiones, Estas pueden incluir por ejemplo, truncado del término -N y/o -C mediante uno omás residuos de aminoácido, o la adición de uno o más residuos extra en el término-N y/o -C, por ejemplo la adición de un residuo de metionina en el té rmino-N . El conjugado de la presente invención presenta una o varias de la siguientes propiedades mejoradas comparadas con hG-CSF, en particular comparadas con rhG-CSF (por ejemplo, filgrastim, lenograstim o nartograstim) o variantes hG-CSF conocidas: una mayor vida media in vivo funcional, una mayor vida media en suero, una depuración renal reducida, una depuración transmitida por receptores reducida, efectos secundarios reducidos, tal como dolor de huesos e inmunogenicidad reducida. Aún más, se comprenderá que el residuo de aminoácidos que contiene un grupo de unión para un grupo no polipeptidico, ya sea si será suprimido o introducido, se selecciona sobre la base de la naturaleza de la porción no polipeptidica de elección y, en la mayoría de los casos, sobre la base del método por el cual se logrará la conjugación entre el polipéptido y la porción no polipeptidica. Por ejemplo, cuando la porción no polipeptidica es una molécula polimérica, tal como una molécula derivada de polietilenglicol o de óxido de polialquileno, los residuos de aminoácidos que contienen al grupo de unión se pueden seleccionar del grupo formado por lisisna, cisteina, ácido aspártico, ácido glutámico y arginina. Cuando se desea una conjugación con un residuo de lisina, una molécula de actividad adecuada es, por ejemplo, mPEG-SPA de Shearwater Polymers, Inc., oxicarbonil-oxi-N-dicarboxiimida-PEG (Patente Norteamericana No. 5.122.614) o PEG disponible de PolyMASC Pharmaceutical pie. La primera de ellas se ilustrará más adelante . Con el fin de evitar demasiada ruptura en la estructura y función de la molécula de hG-CSF relacionada, la cantidad total de residuos de aminoácidos a alterar de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, como se describe en las siguientes secciones de este documento, (en comparación con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1) no excede típicamente un valor de 15. La cantidad de residuos de aminoácidos y el tipo de residuo de aminoácidos que será introducido o suprimido depende particularmente de la naturaleza y el grado de conjugación deseado (por ejemplo, la identidad de la porción no polipeptí dica, la cantidad de porciones no polipeptidicas que se desea o que es posible conjugar con el polipéptido, cuándo se debe evitar la conjugación o cuándo es deseada, etc.) . preferentemente, la parte polipeptidica del conjugado de la presente invención o el polipéptido de la presente invención, comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 1-15 residuos amino de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, normalmente 2-10 residuos de aminoácidos, por ejemplo en 3-8 residuos de aminoácidos, tal como 4-6 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminioácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1. Por consiguiente, la parte polipeptidica del conjugado o el polipéptido de la presente invención comprende habitualmente una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácidos. La parte de polipéptido del conjugado, normalmente tendrá una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80% de identidad con SEQ ID NO: 1, preferentemente de al menos el 90%, tal como al menos el 95%. La homología/identidad de la secuencia de aminoácidos, se determina de manera conveniente a partir de secuencias alineadas, utilizando por ejemplo el programa ClustalW, versión 1.8, Junio 1999, utilizando parámetros por omisión (Thompson, y asociados, 1994, ClustalW; Improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680) o a partir de PFAM families datábase versión 4.0 (htt : //pf m. wustl . edu/ ) (Nucleic Acid Res. 199, Junio 1; 27 ( 1 ) : 260 -2 ) , mediente el uso de GENEDOC versión 2.5 (Nicholas, K.B., Nícholas H.B. Jr y Deerfield, D.W. 11,1997 GeneDoc : Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW . NEWS 4:14; Nicholas K.B. y Nicholas H.B. Jr . 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation) . En una modalidad preferida, una diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1 es que se ha introducido por lo menos uno, y a menudo más, por ejemplo 1-15, residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica , preferentemente por sustitución, en la secuencia de aminoácidos. De esta manera, la parte polipeptidica está alterada en el contenido de residuos de aminoácidos específicos a los cuales se une la porción no polipeptidica de elección, con lo cual se logra una conjugación más eficiente, específica y/o extensa. Por ejemplo, cuando se altera la cantidad total de residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica de elección hasta un nivel optimizado, la depuración del conjugado se reduce típicamente de forma significativa, debido a la forma, tamaño y/o carga alterada de la molécula lograda con la conjugación. Aún más, cuando se incrementa la cantidad total de residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica de elección, una mayor proporción de la molécula polipeptidica es protegida por la porción no polipeptí dica de elección, lo cual conduce a una disminución en la respuesta inmunológica . El término "una diferencia", tal y como se utiliza en la presente solicitud, significa que hay que tener en cuenta la presencia de diferencias adicionales. Por consiguiente, además de la diferencia de aminoácidos especificada, pueden ser mutados otros residuos de aminoácidos que los especificados. En una modalidad más preferida, una diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1 es que se ha suprimido por lo menos uno, y preferentemente más, por ejemplo, 1-15 residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica, preferentemente por sustitución, de la secuencia de aminoácidos . Al suprimir uno o varios residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica de elección, es posible evitar la conjugación con la porción no polipeptidica en partes del polipéptido donde dicha conjugación resulta desfavorable, por ejemplo, en residuos de aminoácidos ubicados en o cerca de un sitio funcional del polipéptido (determinado que una conjugación en dicho sitio puede dar como resultado la inactivación de una actividad G-CSF reducida del conjugado resultante debido a un empeoramiento en el reconocimiento del receptor) . En el presente contexto, el término "sitio funcional" indica uno o varios residuos de aminoácidos que es o son esenciales o involucrados de otra manera en la función o el rendimiento del hG-CSF. Dichos residuos de aminoácidos forman parte del sitio funcional. El sitio funcional se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica y se identifica preferentemente por análisis de la estructura del polipéptido complejo con el receptor apropiado, tal como el receptor del hG-CSF (Véase Aritomi et al Nature 401: páginas 713 a 717, 1999) .
En aún otra modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO .1 en que: a) se ha suprimido por lo menos un residuo de aminoácidos especificado que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptídica y que está presente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, preferentemente por sustitución; y b) se ha introducido por lo menos un residuo de aminoácidos especificado que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptidica en la secuencia de aminoácidos, preferentemente por sustitución, siendo los residuos de aminoácidos especificados cualquiera de los que se describen en las siguientes secciones en este documento. Esta modalidad se considera de particular interés por cuanto es posible diseñar específicamente al polipéptido para poder obtener una conjugación óptima con la porción no polipeptidica de elección. Por ejemplo, al introducir y suprimir residuos de aminoácidos seleccionados como se describe en las siguientes secciones, es posible asegurar una distribución óptima de los grupos de unión para la porción no polipeptidica de elección, lo cual da lugar a un conjugado en el cual los grupos no polipeptídicos están ubicados como para: a) proteger de forma efectiva a los epítopes y otras partes de la superficie del polipéptido; y b) asegurar un radio de Stokes óptimo para el conjugado, sin causar demasiada ruptura estructural y de esa manera dañar la función del polipéptido. El conjugado de la presente invención comprende en general un tipo y una cantidad suficiente de porciones no polipeptídicas como para proporcionarle al conjugado una vida media in vivo y/o una vida media en suero funcional incrementada encomparación con el hG-CSF, por ejemplo, filgrastim, lenograstim o nartograstim, y preferentemente en comparación con el rhG-CSF que comprende un solo grupo PEG de 20 kDa unido al extremo N-terminal. La mayor vida media in vivo funcional se determina convenientemente como se describe en la sección de Materiales y Métodos en este documento . El conjugado de la presente invención puede comprender por lo menos un grupo de unión no conjugado, conjugable para la porción no polipeptidica. En el presente contexto, el término "grupo de unión conjugable"' indica un grupo de unión ubicado en una posición del polipéptido que sea accesible para la conjugación, y que salvo precauciones especiales es conjugado con la porción no polipeptidica apropiada cuando es sometida a conjugación. Por ejemplo, dicho grupo de unión forma parte de un residuo de aminoácidos involucrado o esencial de otra manera para el polipéptido para ejercer su actividad. Una manera conveniente de evitar la conjugación de un grupo de unión por lo demás conjugable consiste en proteger a dicho grupo de unión por medio de una molécula auxiliar, por ejemplo, como se describe en la sección con el título "Bloqueo del sitio funcional". Se comprenderá que la cantidad de grupos de unión no conjugados, conjugables depende del polipéptido G-CSF específico y de la ubicación de los grupos de unión conjugables. Por ejemplo, el polipéptido conjugado comprende uno o dos grupos de unión no conjugados, conjugables, y por lo menos uno, y preferentemente dos o varios grupos de unión conjugados.
Conj ugado de la presente invención r donde la porción no polipeptídica está unida a una Usina o al residuo de aminoácidos N-terminal En un aspecto, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende: i) un polipéptido que presenta actividad G-C3F, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado po : T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K , L9K, P10K, Q11K, ?12?, F13K, L14K, L15K , E19K, Q20K, V21K, R22 , Ü25 , G26K, D27K, A29K, A30K , E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43 , P44K, E45K, E46K , V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K , L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, R146K, R147K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, R166K, V167K, L168K, R169K, H170K, L171K, A172K, , Q173K y P174K, y ii) al menos un grupo no polipeptí dico unido a un residuo de lisina del polipéptido . El hG-CSF contiene cuatro residuos lisina, de los cuales K16 está ubicado en el dominio de unión-receptor y los demás se ubican en las posiciones 23, 34 y 40, respecti amente, todos relativamente cerca del dominio de unión-receptor. Con el fin de evitar la conjugación con uno o varios de estos residuos lisina (determinado que esto puede desactivar o reducir severamente la actividad del conjugado resultante) puede ser conveniente suprimir por lo menos un residuo lisina, por ejemplo, dos, tres o todos estos residuos. Por consiguiente, en otro aspecto más preferido la presente invención se relaciona con un polipéptido conjugado tal como se definió anteriormente, en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de K16, K23, K34 Y K40 ha sido suprimido o sustituido con otro residuo de aminoácidos. Preferentemente, al menos K16 es sustituido con otro residuo de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones preferidas de aminoácidos incluyen uno o mas de Q70K, Q90K, T105K, Q120K Y T133K, tales como dos, tres o cuatro de estas sustituciones, por ejemplo: Q70K+Q90K, Q70K+T105K, Q70K+120K, Q70K+T133K, Q90K+T105K, Q90K+Q120K, Q90K+T133K, T105K+Q120K, T105K+T133K, Q120K+T133K, Q70K+Q90K+T105K, Q70 +Q90K+Q120K, Q 0K+Q90K+T133K, Q7 OK+T105K+T120?, Q70K+T105K+T133K, Q70K+Q12 ??+? 133?, QO 9?+?105K+Q12 ??, Q90K+T105K+T133K, Q90K+Q120K+T133K, ?1 O5?+?12 ??+?133?, Q90K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+T1 O 5K+Q120K+T133?, Q70K+Q90K+Q120K+T133K, Q70K+Q9 ??+? 1 O5K+T133? ó Q70 +Q90K+T105K+Q120K. El polipéptido del conjugado de acuerdo con elsegundo de los aspectos descritos en la presente sección (por ejemplo, al menos una lisina introducida y una eliminada) , comprende preferentemente al menos uno, tal como uno, dos tres o cuatro de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de K16R, K16Q, K23R, K23Q, K34R, K34Q,K40R Y K40Q, más preferentemente al menos una de las sustituciones K16R Y K23R, por lo que se puede evitar la conjugación de estos residuos. Preferentemene el polipéptido comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de K16R+K23R, K16R+K34R, K16R+K40R, K23R+K34R, K23R+K40R, K34R+K40R, K16R+K23R+K34R, Kl 6R+K23R+K40R, K23R+K3 +K40R, K16R+K34R+K40R y Kl 6R+K23R+K3 R+K40R . Es probable que estas sustituciones originen la diferencia menos estructural en comparación con el polipéptido nativo o relacionado .
Además de las sustituciones descritas anteriormente, el polipéptido conjugado de la presente invención también puede incluir una o más sustituciones seleccionadas de R22K, R146K, R147K, R166K y R169K. En tanto la porción no polipeptídica del conjugado de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede ser cualquier molécula que al utilizar el método de conjugación determinado tiene lisina como grupo de unión, tal como un grupo de hidrato de carbono, se prefiere que la porción no polipeptídica sea una molécula polimérica. La molécula polimérica puede ser cualquiera de las moléculas mencionadas en la sección con el título "Conjugación con una molécula polimérica", pero se selecciona preferentemente del grupo formado por: polietilenglicol lineal o ramificado u otro óxido de polialquileno . Las moléculas poliméricas preferidas son, por ejemplo, mPEG-SPA de Shearwater Polymers, Inc. u oxicarbonil-oxi-N-dicarboxiimida-PEG (Patente Norteamericana No. 5.122.614) . Se comprenderá que cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular sustituciones, especificados en esta sección se pueden combinar con cualquier cambio de aminoácidos, preferentemente las sustituciones especificadas en las otras secciones en este documento que describen modificaciones de aminoácidos específicas, incluyendo introducción y/o supresión de sitios de glucosilacion. Conjugado de la presente invención, donde la porción no polipeptídica es una molécula que tiene cisterna como grupo de unión En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: TIC, P2C, L3C, G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C , P10C, Q11C, S12C, F13C, L14C, L15C, E19C, Q20C, V21C, R22C, Q25C, G26C, D27C, A29C, A30C, E33C, A37C, T38C, Y39C, L41C, H43C, P44C, E45C, E46C, V48C, L49C, L50C, H52C, S53C, L54C, I56C, P57C, P60C, L61C, S62C, S63C, P65C, S66C, Q67C, A68C, L69C, Q70C, L71C, A72C, G73C, S76C, Q77C, L78C, S80C, F83C, Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, P97C, E98C, L99C, G100C, P101C, T102C, D104C, T105C, Q107C, L108C, D109C, A111C, D112C, F113C, T115C, T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C, E122C, E123C, L124C, M126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C, P132C, T133C, Q134C, G135C, A136C, 137C, P138C, A139C, A141C, S142C, A143C, F144C, Q145C, R146C, R147C, S155C, H156C, Q158C, S159C, L161C, E162C, V163C, S164C, Y165C, R166C, V167C, L168C, R169C, H170C, L171C, A172C, Q173C y P174C, y ii) al menos uno grupo no polipeptldico unido a un residuo de cisteina del polipéptido .. El dominio de unión-receptor de hG-CSF contiene un residuo cisteina en la posición 17 que no interviene en una cistina y que conviene suprimir con el fin de evitar la conjugación de un grupo no polipeptldico a dicha cisteina. Por consiguiente, en otro aspecto más preferido, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: TIC, P2C, L3C, G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C, Q11C, S12C, F13C, L14C, L15C, E19C, Q20C, V21C, R22C, Q25C, G26C, D27C, A29C, A30C, E33C, A37C, T38C, Y39C, L41C, H43C, P44C, E45C, E46C, V48C, L49C, L50C, H52C, S53C, L54C, I56C, P57C, P60C, L61C, S62C, S63C, P65C, S66C, Q67C, A68C, L69C, Q70C, L71C, A72C, G73C, S76C, Q77C, L78C, S80C, F83C, Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, P97C, E98C, L99C, G100C, P101C, T102C, D104C, T105C, Q107C, L108C, D109C, A111C, D112C, F113C, T115C T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C, E122C, E123C, L124C M126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C, P132C, T133C, Q134C, G135C, A136C, M137C, P138C, A139C, A141C, S142C, A143C, F144C, Q145C, R146C, R147C, S155C, H156C, Q158C, S159C, L161C, E162C, V163C, S164C, Y165C, R166C, V167C, L168C, R169C, H170C, L171C, A172C, Q173C y P174C, y ii) un grupo no polipeptí dico, que tiene un residuo cisteina como grupo de unión. Las sustituciones preferidas de acuerdo con este aspecto de la presente invención, son sustituciones de arginina con cisteina, por ejemplo una o más de R146C, R147C, R166C y R169C. Se comprenderá que se puede combinar cualquiera de las modificaciones de aminoácidos, en particular sustituciones, especificadas en esta sección con cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular sustituciones especificadas en las demás secciones de este documento que describen modificaciones de aminoácidos específicas, incluyendo la introducción y/o supresión de sitios de glucosilación . Conjugado de la presente invención , donde la porción no polipeptídica se une a un grupo ácido o al residuo de aminoácidos C-terminal En aún otro aspecto, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1 f en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: T1D, P2D, L3D, G4D, P5D, A6D, S7D, S 8 D , L9D, P10D, Q11D, S12D, F13D, L14D, L15D, E19D, Q20D, V21D, R22D, Q25D, G26D, D27D, A29D, A30D, E33D, A37D, T38D, Y39D, L41D, H43D, P44D, E45D, E46D, V48D, L49D, L50D, H52D, S53D, L54D, I56D, P57D, P60D, L61D, S62D, S63D, P65D, S66D, Q67D, A68D, L69D, Q70D, L71D, A72D, G73D, S76D, Q77D, L78D, S80D, F83D, Q86D, G87D, Q90D, E93D, G94D, S96D, P97D, E98D, L99D, G100D, P101D, T102D, D104D, T105D, Q107D, L108D, D109D, A111D, D112D, F113D, T115D, T116D, W118D, Q119D, Q120D, M121D, E122D, E123D, L124D, M126D, A127D, P128D, A129D, L130D, Q131D, P132D, T133D, Q134D, G135D, A136D, M137D, P138D, A139D, A141D, S142D, A143D, F144D, Q145D, R146D, R147D, S155D, H156D, Q158D, S159D, L161D, E162D, V163D, S164D, Y165D, R166D, V167D, L168D, R169D, H170D, L171D, A172D, Q173D y P174D, o al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de T1E, P2Er L3E, G4E, P5E , A6E, S7E, S8E, L 9E , P10E, QUE, S12E, F13E, L14E, L15E, E19E, Q20E, V21E, R22E, Q25E, G26E, D27E, A29E, A30E, E33E, A37E, T38E, Y39E, L41E, H43E, P44E, E45E, E46E, V48E, L49E, L50E, H52E, S53E, L54E, I56E, P57E, P60E, L61E, S62E, S63E, P65E, S66E, Q67E, A68E, L69E, Q70E, L71E, A72E, G73E, S76E, Q77E, L78E, S80E, F83E, Q86E, G87E, Q90E, E93E, G94E, S96E, P97E, E98E, L99E , G100E, ¦ P101E, T102E, D104E, T105E, Q107E, L108E, D109E, A111E, D112E, F113E, T115E, T116E, W118E, Q119E, Q120E, M121E, E122E, E123E, L124E, 126E, A127E, P128E, A129E, L130E, Q131E, P132E, T133E, Q134E, G135E, A136E, M137E, P138E, A139E, A141E, S142E, A143E, F144E, Q145E, R146?, R147E, S155E, H156E, Q158E, S159E, L161E, E162E, V163E, S164E, Y165E, R166E, V167E, L168E, R169E, H170E , L171E, A172E, Q173E y P174E, y i) un grupo no polipeptidico, que tiene un residuo ácido glutámico o ácido aspártico como grupo de unión. Los ejemplos de sustituciones preferidas acordes con este aspecto de la presente invención incluyen Q67E, Q70E, 077E, Q86E, Q90E, Q120E, Q131E, Q134E, Q145E, y Q173E. Además de la o las sustituciones enumeradas anteriormente, el polipéptido del conjugado de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede comprender la supresión, preferentemente por sustitución, de por lo menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionado del grupo formado por: D27, D104, D109, D112, E19, E33, E45, E46, E93, E98, E122, E123 y E163. La sustitución puede ser para cualquier otro residuo de aminoácidos, en particular para un residuo asparagina o glutamina, con lo cual se puede evitar la conjugación de estos residuos. En particular, el polipéptido puede comprender por lo menos una de las siguientes sustituciones: D27N, D104N, D109N, D112N, E19Q, E33Q, E45Q, E46Q, E93Q, E98Q, E122Q, E123Q y E163Q. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos en una o varias de las posiciones anteriores se puede combinar además con por lo menos una de las siguientes sustituciones: D109N, D112N, E19Q, E122Q y E123Q. Es probable que la sustitución por cualquiera de estos residuos de aminoácidos origine la menor diferencia estructural . En tanto la porción no polipeptidica del conjugado de acuerdo con este aspecto de la presente invención, que tiene un grupo ácido como grupo de unión, puede ser cualquier porción no polipeptidica con dicha propiedad, ahora se prefiere que la porción no polipeptidica sea una molécula polimérica o un agente de derivación orgánica, en particular una molécula polimérica, y el conjugado se prepara, por ejemplo, como describen Sakane y Pardridge, Pharmaceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, páginas 1085 a 1091. Se comprenderá que cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular las sustituciones, especificadas en esta sección se puede combinar con cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular las sustituciones especificadas en las demás secciones de este documento que describen cambios de aminoácidos especificos, incluyendo la introducción y/o supresión de sitios de glucosilación . Otros conj ugados del invento Además de los grupos no polipeptidicos especificados anteriormente, por ejemplo, en las secciones con el titulo "Conjugado de la presente invención el conjugado de la presente invención puede contener otros grupos de hidratos de carbono como consecuencia del polipéptido que se expresa en una célula huésped glucosilante y la glucosilación se logra en los sitios de glucosilación o en el o los sitios de glucosilación introducidos. Conjugado- de la presente invención , donde la porción no pol ipeptidica es un grupo de hidrato de carbono En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un conjugado que comprende un polipéptido glucosilado que presenta actividad G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la que se muestra en la SEQ ID NO. 1 en que se ha introducido por lo menos un sitio de glucosilación no natural en la secuencia de aminoácidos por medio de por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: L3N+P5S/T, P5N, A6N, S8N+P10S/T, PION, Q11N+F13S/T, S12N+L14S/T, F13N+L15S/T, L14N+K16S/T, K16N+L18S/T, E19N+V21S/T, Q20N+R22S/T, V21N+K23S/T, R22N+I24S/T, K23N+Q25S/T, Q25N+D27S/T, G26N+G28S/T, D27N+A29D/T, A29N+L31S/T, A30N+Q32S/T, E33N+L35S/T, A37N+Y39S/T, T38N+K40S/T, Y39N+L41S/T, P44N+E46S/T, E45N+L47S/T, E46N+V48S/T, V48N+L50S/T, L49N+G51S/T, L50N+H52S/T, H52N+L54S/T, S53N+G55S/T, P60N, L61N, S63N+P65S/T, P65N+Q67S/T, S66N+A68S/T, Q67N+L69S/T, A68N+Q70S/T, L69N+L71S/T, Q70N+A72S/T, L71N+G73S/T, G73N+L75S/T, S76N+L78S/T, Q77N+H79S/T, L78N, S80N+L82S/T, F83N+Y85S/T, Q86N+L88S/T, G87N+L89S/T, Q90N+L92S/T, E93N+I95S/T, P97N+L99S/T, L99N+P101S/T, P101N+L103S/T, T102N+D104S/T, D104N+L106S/T, T105N+Q107S/T, Q107N+D109S/T, L108N+V110S/T, D109N+A111S/T, A111N+F113S/T, D112N+A114S/T, F113N, T115N+I117S/T, T116N+W118S/T, W118N+Q120S/T, Q119N+M121S/T, Q120N+E122S/T, M121N+E123S/T, E122N+L124S/T, E123N+G125S/T, L124N+M126S/T, 126N+P128S/T, P128N+L130S/T, L130N+P132S/T, P132N+Q134S/T, T133N+G135S/T, Q134N+A136S/T, A136N+P138S/T, P138N+F140S/T, A139N+A141S/T, A141N+A143S/T, S142N+F144S/T, A143N+Q145S/T, F144N+R146S/T, Q145N+R147S/T, R146N+A148S/T, R147N+G149S/T, S155N+L157S/T, H156N+Q158S/T, S159N+L161S/T, L161N+V163S/T, E162N, V163N+Y165S/T, S164N+R166S/T, Y165N+V167S/T, R166N+L168S/T, V167N+R169S/T, L168N+H170S/T, R169N+L171S/T y H170N+A172S/T, donde S/T indica un residuo S o un residuo T, preferentemente un residuo T. Se comprenderá que con el fin de preparar un conjugado de acuerdo con este aspecto, que el polipéptido se debe expresar en una célula huésped glicosilante capaz de ligar grupos de oligosacáridos en el o los sitios de glucosilacion o como alternativa debe ser sometido a una glucosilacion in vitro. Los ejemplos de células huésped glucosilantes se muestran más adelante en una sección con el titulo "Acoplamiento con un grupo olígosacárido" . Como alternativa, el conjugado de acuerdo con este aspecto comprende un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que contiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la que se muestra en la SEQ ID NO. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: P5N, A6N , PION, P60N, L61N, L78N, F113N y E162N, en particular del grupo formado por P5N, A6N, PION, P60N, L61N, F113N y E162N, tal y como del grupo formado por P60N, L61N, F113N y E162N. Como alternativa, el conjugado de acuerdo con este aspecto comprende un polipéptido que presenta actividad G-CSF, que contiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la que se muestra en la SEQ ID No. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T, D109N+A111S, D109N+A111T, D112N+A114S, y D112N+A114T, más preferentemente del grupo formado por: D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106P, D112N+A114S y D112N+A114T, tal como del grupo formado por: D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S y D104N+L106T. Además de una molécula de hidrato de carbono, el conjugado de acuerdo con el aspecto de la presente invención que se describe en esta sección puede contener grupos adicionales no polipeptídicos , en particular, una molécula polimérica, descrita en la presente solicitud, conjugados con uno o varios grupos de unión presentes en la parte polipeptídica del conjugado. Se comprenderá que cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular las sustituciones, especificadas en esta sección se pueden combinar con cualquiera de los cambios de aminoácidos, en particular las sustituciones, especificadas en las demás secciones en este documento que describen cambios de aminoácidos específicos . Variantes permutadas en forma circular En una modalidad adicional, la parte pol ipeptí dica del polipéptido conjugado de la presente invención se puede encontrar en la forma de una variante permitida en forma circular de la secuencia de polipéptidos descrita en otra parte de este documento. En dicho polipéptido permutado en forma circular, los extremos N-terminal y C-terminal originales están unidos ya sea directamente mediante un enlace peptidico o indirectamente por medio de un ligando peptidico, en tanto se forman nuevos extremos N- y C-terminales entre los dos residuos de aminoácidos adyacentes que originalmente estaban unidos por un enlace peptidico. Determinado que los extremos N- y C-terminales originales habitualmente están ubicados a cierta distancia entre si, típicamente están unidos por medio de un ligando peptidico de una longitud y composición adecuadas, de manera que la estructura y la actividad del conjugado no son afectadas de manera adversa. Resulta evidente que los nuevos extremos N-terminal y C-terminal no se deben formar entre un par de residuos de aminoácidos cuando esto pudiera interferir con la actividad del polipéptido. Los agonistas de receptores del G-CSF permutados de forma circular se describen en la Patente Norteamericana No. 6.100.070, a la cual se hace referencia por información adicional sobre la selección de ligandoes peptidicos y la ubicación de los nuevos extremos N-terminal y C-terminal, asi como por métodos para producir dichas variantes. Formación de leucocitos y neutrófilos de conjugados de la presente invención En una modalidad adicional, el polipéptido conjugado de la presente invención puede ser caracterizado como un conjugado que presenta actividad G-CSF y comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos un residuo de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que tiene al menos un grupo no polipeptiricc unido a un grupo de unión del polipéptido, cumpliendo además el polipéptido conjugado con al menos uno de los siguientes criterios (A) -(D) (A) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte del polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de leucocitos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un período de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de leucocitos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un período de al menos aproximadamente 96 horas, preferentemente durante al menos aproximadamente 120 horas; (B) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de leucocitos con al menos el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un período de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de leucocitos {medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un período de al menos aproximadamente 72 horas, preferentemente al menos aproximadamente 96 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 120 horas; (C) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 mg de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un período de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 96 horas, preferentemente al menos aproximadamente 120 horas; (D) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la arte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kilogramo de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 72 horas, preferentemente al menos aproximadamente 96 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 120 horas. Grupo no pol ipeptídico del conjugado de la presente invención Como se indicó anteriormente, la porción no polipeptidica del conjugado de la presente invención se selecciona preferentemente del grupo formado por: una molécula polimérica, un compuesto lipofílico, una porción de carbohidrato (por ejemplo, por medio de una glucosilación in vivo) y un agente de derivación orgánica. Todos estos agentes pueden conferir las propiedades deseadas a la parte polipeptídica del conjugado, en particular, una mayor vida media funcional in vivo y/o una mayor vida media en suero. La parte polipeptidica del conjugado habítualmente está conjugada a un solo tipo de grupo no polipeptidico, pero también puede estar conjugado a dos o varios tipos diferentes de grupos no polipeptídicos , por ejemplo, a una molécula polimérica y un grupo oligosacárido, a un grupo lipofílico y un grupo oligosacárido, a un agente de derivación orgánica y un grupo oligosacárido, a un grupo lipofílico y una molécula polimérica, etc. La conjugación con dos o varios grupos no polipeptidicos diferentes se puede efectuar simultánea o consecutivamente. Métodos para preparar un conjugado del invento En las siguientes secciones de "Conjugación con un compuesto lipofílico", "Conjugación con una molécula polimérica", "Conjugación con un grupo oligosacárido" y "Conjugación con un agente de derivación orgánica" se describe la conjugación a tipos específicos de grupos no polipeptidicos. En general, un polipéptido conjugado de acuerdo con la presente invención puede ser producido mediante el cultivo de una célula huésped adecuada bajo condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, y recuperación del mismo, en donde a) el polipéptido comprende al menos un sitio de glusilación-N u -0 y la célula huésped es una célula huésped eucarionte con la capacidad de glucosilación in vivo y/o b) el polipéptido es sometido a conjugación para un grupo no polipeptídico in vitro. Conjugación con un compuesto llpofilico El polipéptido y el compuesto lipofílico se pueden conjugar entre sí ya sea de forma directa o mediante un ligando. El compuesto lipofílico puede ser un compuesto natural, tal como un ácido graso saturado o insaturado, una dicetona de un ácido graso, un terpeno, una prostaglandina , una vitamina, un carotenoide o esteroide o un compuesto sintético, tal como un ácido carbónico, un alcohol, una amina y ácido sulfónico con uno o varios compuestos alquilo, arilo, alquenilo u otros diversos compuestos insaturados. La conjugación entre el polipéptido y el compuesto lipofílico, optativamente por medio de un ligando, se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como desciben Bodanszky en Peptide Síntesis, John Wiley, Nueva York, 1976 y en el docueir.ento O 96/12505. Conjugación con una molécula polimérica La molécula polimérica que será acoplada al polipéptido puede ser cualquier molécula polimérica adecuada, tal como un homopolimero o heteropolimero, natural o sintético, típicamente con un peso molecular en el rango de aproximadamente 300-100.000 Da, tal como aproximadamen e 500-20,000 Da, más preferentemente en elrango de aproximadamente 2000-12,000 Da, tal como aproximadamente 3000-10,000. Cuando se utilizaron aproximadamente moléculas de polímero en la presente invención, la palabra "aproximadamente" indica un peso molecular promedio aproximado y refleja el hecho de que exitirá normalmente una cierta distribución de pesomolecular en una preparación de pol' limero determinada . Entre los ejemplos de homopolímeros , se incluye, un poliol (es decir, poli-OH) , una poliamina (es decir, poli-NH2) y un ácido policarboxí lico (es decir, poli-COOH) . Un heteropolimero es un polímero que comprende uno o varios grupos de acoplamiento diferentes, tal como, por ejemplo, un grupo idroxilo y un grupo amina. Entre los ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas se incluyen las moléculas poliméricas seleccionadas del grupo compuesto por óxido de polialquileno (PAO), incluyendo el polialquilenglicol (PAG), tal como el polietilenglicol lineal o ramificado (PEG), y polipropilenglí col (PPG), los PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, poli- ( inilpirrolidona ) , anhídrido de ácido polietilen-co-maléico, anhídrido de ácido poliestiren-co-málico, dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la inmunogenicidad y/o aumentar el promedio de vida media funcional ín vivo y/o la vida media funcional sérica. Otro ejemplo de una molécula polimérica es la albúmina humana u otra proteína plasmática abundante. Generalmente, los polímeros derivados de polialquí lenglicol son biocompatibles , no tóxicos, no antigénicos, no inmunogéni eos , tienen diversas propiedades de solubilidad en agua y son excretados fácilmente de los organismos vivos. El PEG es la molécula polimérica que se prefiere usar, puesto que tiene solamente unos pocos grupos reactivos capaces de un enlace cruzado, en comparación con, por ejemplo, los polisacáridos tales como el dextrano. En particular, es de interés un PEG monofuncional , por ejemplo, el monometoxipolietilenglicol (mPEG) , puesto que su química de acoplamiento es relativamente simple (hay un solo grupo reactivo disponible para conjugarse con grupos de unión en el polipéptido) . En consecuencia, se elimina el riesgo de reticulación, los conjugados polipeptídicos resultantes son más homogéneos y la reacción de las moléculas del polímero con el polipéptido es más fácil de controlar. Para efectuar la unión covalente de las moléculas poliméricas al polipéptido, los grupos del extremo hidroxilo de la molécula polimérica deben estar activados, es decir, con grupos funcionales reactivos. Existen moléculas poliméricas activadas adecuadas disponibles comercialmente , por ejemplo de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos, o de PolyMASC Pharmaceuticals pie, Reino Unido. Como alternativa, las moléculas se pueden activar por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo tal como se describe en el docuemnto WO 90/13540. En los catálogos de 1997 y 2000 de Shearwater Polymers, Inc., se describen ejemplos específicos de moléculas poliméricas lineales o ramificadas activadas para uso en la presente invención ("Funcionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals, Poliethylene glycol and Derivatives, incorporada a la presente descripción a modo de referencia) . Entre los ejemplos de polímeros PEG activados se incluyen los siguientes PEG lineales : NHS-PEG (por ejemplo, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG y SCM-PEG) , y NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG y AL-PEG, y PEG ramificados tales como PEG2-NHS y los que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5.932.462 y 5.463.575, ambas incorporadas a la presente descripción a modo de referencia. Además, las siguientes publicaciones, incorporadas a la presente descripción como referencia, divulgan moléculas poliméricas útiles y/o químicas de polietilenglicol útiles: Patente Norteamericana No. 5.824.778, Patente Norteamericana No. 5.476.653, documento WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, Patente Norteamericana No. 4.902.502, Patente Norteamericana No. 5.281.698, Patente Norteamericana No. 5.122.614, Patente Norteamericana No. 5.219.564, documento WO 92/16555, documento WO 94/04193, documento WO 94/14758, documento WO 94/17039, documento WO 94/18247, documento WO 94/28024, documento WO 95/00162, documento WO 95/11924, documento WO 95/13090, documento WO 95/33490, documento WO 96/00080, documento WO 97/18832, documento WO 98/41562, documento WO 98/48837, documento WO 99/32134, documento WO 99/32139, documento WO 99/32140, documento WO 96/40791, documento WO 98/32466, documento WO 95/06058, EP 439 508, documento WO 97/03106, documento WO 96/21469, documento WO 95/13312, EP 921 131, Patente Norteamericana No. 5,736,625, documento WO 98/05363, EP 809 996, Patente Norteamericana No. 5.629.384, WO 96/41813, documento WO 96/07670, Patente Norteamericana No. 5.473.034, Patente Norteamericana No. 5.516.673, EP 605 963, Patente Norteamericana No. 5.382.657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316. La conjugación del polipéptido y las moléculas poliméricas activadas se realiza utilizando cualquier método convencional, por ejemplo, según la descripción contenida en las siguientes referencias (que también describen métodos adecuados para la activación de las moléculas poliméricas) : R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and Applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking" , CRC Press, Boca Ratón; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techiques", Academic Press, N.Y.) . El experto sabrá que el método de activación y/o la química de conjugación a emplear depende del grupo o de los grupos de unión del polipéptido (de los cuales se ofrecieron ejemplos anteriormente), así como de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, si son amino, hidroxilo, aldehido, sulfhidrilo, succinimidilo , maleimida, vinílsulfona o haloacetato) . La polietilenglucosilación puede estar orientada hacia la conjugación de todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, los grupos de unión que están expuestos en la superficie del polipéptido) o puede estar orientada hacia grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal (Patente Norteamericana No. 5.985.265). Además, la conjugación se puede lograr en un paso o en forma de pasos (por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/55377) . Se comprenderá que la polietilenglucosilación está diseñada de manera tal para producir una molécula óptima con respecto a la cantidad de moléculas PEG unidas, el tamaño y la forma de dichas moléculas (por ejemplo, si son lineales o ramificadas) y la ubicación en el polipéptido donde dichas moléculas están unidas. El peso molecular del polímero a utilizar se selecciona teniendo en cuenta el efecto deseado a lograr. Por ejemplo, si el propósito principal de la conjugación consiste en lograr un conjugado con un alto peso molecular y un tamaño mayor (por ejemplo, para reducir la depuración renal), se puede elegir conjugar una o unas pocas moléculas poliméricas de alto peso molecular o una cantidad de moléculas poliméricas con un peso molecular menor para obtener el efecto deseado. Sin embargo, preferentemente se utilizarán algunas moléculas poliiméricas con un peso molecular más pequeño. Cuando se desea un alto grado de protección del epítope, esto se puede lograr utilizando una cantidad suficientemente alta de moléculas poliméricas de bajo peso molecular (por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente 5.000 Da) con el fin de proteger efectivamente todos o la mayoría de los epitpoes del polipéptido. Por ejemplo, se pueden emplear de 2-8, tal como 3-6 de dichos polímeros. Tal como lo ilustran los siguientes ejemplos, puede resultar ventajoso contar con una gran cantidad de moléculas poliméricas con un peso molecular menor (por ejemplo 4-6 con un PM de 5000) en comparación con una cantidad menor de moléculas poliméricas con un peso molecular más alto (por ejemplo, de 1-3 con un PM de 12.000-20.000) con el fin de mejorar la vida media funcional ín vivo del polipéptido conjugado, aún cuando el peso molecular total de las moléculas poliméricas unidas es el mismo en ambos casos. Se considera que la presencia de una gran cantidad de moléculas poliméricas más pequeñas provee un polipéptido con un mayor diámetro o tamaño aparente que por ejemplo, una sola molécula polimérica más larga, por lo menos cuando las moléculas poliméricas están distribuidas de forma relativamente uniforme sobre la superficie del pol ipéptido . Aunque no se prefiere la conjugación de únicamente una sola molécula polimérica a un solo grupo de unión en la proteína, en elcaso de que se una únicamente una molécula polimérica, será conveniente que la molécula polimérica que puede ser lineal o ramificada, tenga un peso molecular relativamente alto, por ejemplo, aproximadamente 20 kDa . Habitualmente , la conjugación del polímero se lleva a cabo bajo condiciones destinadas a hacer reaccionar la mayor cantidad de grupos de unión poliméricos disponibles como sea posible con las moléculas poliméricas . Esto se logra pormedio de un excesomolar adecuado del polímero en relación con el polipéptido. Las relaciones molares típicas de moléculas poliméricas activadas a polipéptidos son de hasta aproximadamente 1000-1, tal como hasta aproximadamente 200-1 o hasta aproximadamente 100-1. En algunos casos, la relación puede ser algo menor, no obstante, tal como hasta de aproximadamente 50-1, 10-1 ó 5-1. De acuerdo con la presente invención también se contempla acoplar las moléculas poliméricas al polipéptido a través de un ligando. Los ligandos adecuados son bien conocidos por los expertos. Un ejemplo preferido es el cloruro cianúrico (Abuchowski et al., (1977). J. Biol .. Chem. , 252, páginas 3578 a 3581; Patente Norteamericana No. 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, páginas 375 a 378. Después de la conjugación, las moléculas poliméricas activadas residuales se bloquean de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por adición de amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas poliméricas inactivadas resultantes se eliminan siguiendo un método adecuado (véase Materiales y Métodos) . En una modalidad preferida, el polipéptido conjugado de la presente invención comprende una molécula PEG unida a algunos residuos, la mayoría o preferentemente todos residuos de lisina, en el polipéptido disponible para la polietilenglucosilación, en particular una molécula PEG lineal o ramificada, por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente 1-5 kDa, normalmente aproximadamente 2-12 kDa, ta como aproximadamente 3-10 kDa, por ejemplo aproximadamente 5 ó 6 kDa . Se comprenderá que según las circunstancias, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del polipéptido, la naturaleza del compuesto PEG activado en uso y las condiciones específicas del polietilenglucosilación, incluyendo la relación molar de PEG a polipéptido, se pueden obtener grados variables de polietilenglucosilación, obteniéndose en general un grado más alto de polietilenglucosilación con una mayor relación de PEG a polipéptido. Los polipéptidos polietilenglucosilados resultantes de cualquier proceso de polietilenglucosilación determinado comprenderán habitualmente, no obstante, una distribución estequiométr ica de conjugados polipeptidicos con grados de polietilenglucosilación ligeramente diferentes. En aún otra modalidad, el polipéptido conjugado de la presente invención puede comprender una molécula PEG unida a los residuos lisina en el polipéptido disponible para la polietilenglucosilación y además del residuo de aminoácidos N-terminal del polipéptido. Acoplamiento con un grupo oligosacárido La conjugación con un grupo oligosacárido puede tener lugar in vivo o in vitro. Con el fin de lograr una glucosilación in vivo de la molécula del G-CSF que comprende uno o varios sitios de glucosilación, la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido se debe insertar en un huésped de expresión glicosilante, eucariote. La célula de expresión huésped se puede seleccionar entre células fúngicas (hongos filamentosos o levadura) , de insectos o animales o entre células vegetales transgénicas . En una modalidad, la célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula CHO, BHK o HEK, por ejemplo HEK 293 o una célula de insecto, tal como una célula SF9 o una célula de levadura, por ejemplo, de S. cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera de las células huésped mencionadas de aquí en adelante en este documento.
También se puede emplear un acoplamiento covalente in vltro de glucósidos (tal como dextrano) con los residuos de aminoácidos del polipéptido, por ejemplo, como se describe en el documento WO 87/05330 y en Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem. , páginas 259 a 306, 1981. El acoplamiento in vitro de grupos de oligosacáridos o PEG a residuos Gln unidos a proteínas y péptidos se puede llevar a cabo utilizando transglutaminasas (TG' asas) . Las transglutaminasas catalizan la transferencia de grupos amina donantes a residuos Gln unidos a proteínas y péptidos en una reacción denominada de reticulación. Los grupos amina donantes pueden estar unidos a proteínas o a péptidos, por ejemplo, como el grupo e-amino en los residuos Lys, o puede formar parte de una molécula orgánica grande o pequeña. Un ejemplo de una molécula orgánica pequeña que funciona como donante del grupo amino en un reticulación catalizado por TG' asa es la putrescina ( 1 , 4 -diaminobutano ) . Un ejemplo de una molécula orgánica más grande que funciona como donante del grupo amino en un reticulación catalizado por TG' asa es PEG que contiene amina (Sato et al., Biochemistry 35, páginas 13072 a 13080) . Las Tg'asas son en general enzimas altamente específicas y no cualquier residuo Gln expuesto sobre la superficie de una proteína que es accesible al reticulación, catalizado por TG'asas, con sustancias que contienen amina. Por el contrario, solamente unos pocos residuos Gln funcionan naturalmente como sustratos para las TG'asas, pero los parámetros exactos que permiten definir cuáles son los residuos Gln buenos como sustratos para las TG'asas aún se desconoce. Por consiguiente, con el fin de lograr que una proteína se vuelva susceptible a las reacciones de reticulación catalizadas por TG'asas a menudo constituye un prerrequisito para agregar extensiones de secuencias de aminoácidos conocidos por su capacidad funcionar muy bien como sustratos para TG'asas en ubicaciones convenientes. Se conocen diversas secuencias de aminoácidos que son o que contienen excelentes sustratos naturales para las TG'asas, por ejemplo, la sustancia P, elafina, fibrinógeno, fibronectina , inhibidor de a2-plasmina, a-caseínas y ß-caseínas . Acoplamiento con un agente de derivación orgánica La modificación covalente del polipéptido que presenta actividad G-CSF se puede llevar a cabo haciendo reaccionar uno o varios grupos de unión del polipéptido con un agente de derivación orgánica. Los agentes y métodos derivantes adecuados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los residuos de cisteinilo con mucha frecuencia se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida , para obtener los derivados corboximetilo o carboximidometilo . Los residuos de cisteinilo también se derivan por reacción con bromotrifluoroacetona , ácido a-bromo-ß- ( 4-imidoxoil ) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas , 3-nitro-2-piridildisulfuro , 2-piridildisulfuro de metilo, p-cl omercu ibenzoato , 2-cloromercuri-4-nitrofenol ó cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l , 3-diazol. Los residuos de histidilo se derivan por reacción con dietilpirocarbonateato a un pH de 5,5-7,0, porque este agente es relativamente especifico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; La reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a un pH de 6,0. Los residuos terminales de lisinilo y amino se hacen reaccionar con anhídrido de ácido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílieos . La derivación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contengan a-amino incluyen imidoésteres , tales como picolinimidato de metilo; fosfato piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro ; ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea; 2 , 4-pentadiona; y la reacción catalizada por transaminasa con glicoxilato. Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxalo, 2 , 3-butandiona , 1 , 2-ciclohexandiona y ninhidrina. La derivación de residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional guanididna. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina asi como los grupos arginina guanidino. Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo o residuos de aminoácidos C-terminales ) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N^C=N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como l-ciclohexil-3- ( 2-morfolinil-4 -eti 1 ) carbodiimida ó 1-etil-3- (4-azonia-4, -dimetilpentil ) carbodiimida . Además , los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio . Bloqueo del sitio funcional Se ha descrito que una conjugación excesiva del polímero puede conducir a una pérdida de actividad del polipéptido al cual el polímero está conjugado. Este problema se puede eliminar, por ejemplo, por supresión de grupos de unión ubicados en el sitio funcional o por bloqueo del sitio funcional antes de la conjugación de manera tal que el sitio funcional se encuentre bloqueado durante la conjugación. Esta última estrategia constituye una modalidad adicional de la presente invención (un ejemplo de la primera estrategia se mostró anteriormente, por ejemplo, por supresión de residuos lisina que pueden estar ubicados cerca del sitio funcional) . Más específicamente, de acuerdo con la segunda estrategia, la conjugación entre el polipéptido y la porción no polipeptídica se lleva a cabo bajo condiciones donde el sitio funcional del polipéptido es bloqueado por una molécula auxiliar capaz de unirse al sitio funcional del polipéptido . Preferentemente, la molécula auxiliar es una molécula que reconoce específicamente un sitio funcional del polipéptido, tal como un receptor, en particular el receptor del G-CSF o una parte del receptor del G-CSF. Como alternativa, la molécula auxiliar puede ser un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer un polipéptido que presenta actividad G-CSF. En particular, la molécula auxiliar puede ser un anticuerpo monoclonal neutralizante. Se deja que el polipéptido interactúe con la molécula auxiliar antes de efectuar la conjugación. Esto asegura la protección del sitio funcional del polipéptido y, en consecuencia, no está disponible para la derivación por parte de la porción no polipeptídica tal como un polímero. Después de su elución de la molécula auxiliar, el conjugado entre la porción no polipeptídica y el polipéptido se puede recuperar con un sitio funcional por lo menos parcialmente conservado. La conjugación posterior del polipéptido que tiene un sitio funcional bloqueado con un polímero con un compuesto lipofílico, con un agente de derivación orgánica o con cualquier otro compuesto se realiza de manera normal, por ejemplo, en la forma descrita en las secciones precedentes tituladas "Conjugación con Cualquiera que sea la naturaleza de la molécula auxiliar a usar para proteger el sitio funcional del polipéptido de una conjugación, es conveniente que la molécula auxiliar se encuentre libre de grupos de unión o que comprenda solamente unos pocos grupos de unión para la porción no polipeptídica de elección en una o varias partes de la molécula, donde la conjugación de estos grupos obstaculizará la desorción del polipéptido conjugado de la molécula auxiliar. De este modo, se puede obtener una conjugación selectiva con los grupos de unión presentes en las partes no protegidas del polipéptido y es posible volver a utilizar la molécula auxiliar para ciclos de conjugación repetidos. Por ejemplo, si la porción no polipeptídica es una molécula polimérica tal como PEGf que tiene el grupo amino épsilon de una lisina o el residuo de aminoácidos N-terminales como grupo de unión, es conveniente que la molécula auxiliar se encuentre sustancialmente libre de grupos amino épsilon conjugables, preferentemente libre de cualquier grupo amino épsilon. En consecuencia, en una modalidad preferida, la molécula auxiliar es una proteína o un péptido capaz de ligarse con un sitio funcional del polipéptido, estando la proteína o el péptido libre de cualquier grupo de unión conjugable respecto de la porción no polipep ídica de elección. De particular interés con relación a la modalidad de la presente invención donde los polipéptidos conjugados se preparan a partir de una población diversificada de secuencias de nucleótidos codificadoras del polipéptido de interés, es el bloqueo del grupo funcional que se lleva a cabo en placas para microtitulación antes de la conjugación, por ejemplo, plaqueando la variante del polipéptido expresado en una placa para microtitulación que contiene un grupo de bloqueo inmovilizado, tal como un receptor, un anticuerpo o similares. En otra modalidad, la molécula auxiliar se liga en primer lugar de forma covalente con una fase sólida tal como materiales para empaquetar columnas, por ejemplo, Sephadex o bolitas de agarosa, o una superficie, por ejemplo, el recipiente de reacción. Posteriormente, el polipéptido se carga sobre el material de la columna que lleva la molécula auxiliar y la conjugación se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como los descritos en las secciones precedentes tituladas "Conjugación con Este procedimiento permite que el polipéptido conjugado se separe de la molécula auxiliar por elución. El polipéptido conjugado se eluye mediante técnicas convencionales bajo condiciones fisico-químicas que no conduzcan a una degradación sustancial de dicho polipéptido conjugado. La fase fluida que contiene el polipéptido conjugado se separa de la fase sólida a la que la molécula auxiliar sigue ligada de forma covalente. La separación se puede lograr de otras maneras: por ejemplo, la molécula auxiliar se puede derivatizar con una segunda molécula (por ejemplo, biotina) que puede ser reconocida por un ligando especifico (por ejemplo, estreptovidina ) . El ligando especifico puede estar ligado a una fase sólida, permitiendo asi la separación del polipéptido conjugado del complejo molécula auxiliar - segunda molécula mediante el pasaje sobre una segunda columna de fase sólida -auxiliar que retendrá, luego de una elución, al complejo de molécula auxiliar - segunda molécula, pero no asi el polipéptido conjugado. El conjugado de polipéptido puede ser liberado de la molécula auxiliar de cualquier manera apropiada. La desprotección se puede lograr proporcionando condiciones en las que la molécula auxiliar se disocie del sitio funcional del G-CSF al que está ligado. Por ejemplo, un complejo entre un anticuerpo al que está conjugado un polímero y un anticuerpo anti-idiotípico se puede disociar ajustando el pH a un pH ácido o alcalino. Conjugación de un polipéptido marcado En una modalidad alternativa, el polipéptido se expresa como una proteína de fusión con una marca, es decir, una secuencia de aminoácidos o una extensión de péptido que típicamente consta de 1-30, tal como 1-20 residuos de aminoácidos. Además de permitir una purificación rápida y sencilla, la marca constituye una herramienta conveniente para lograr la conjugación entre el polipéptido marcado y el grupo no polipeptídico . En particular, se puede utilizar la marca para lograr la conjugación sobre placas para microtitulación u otros transportadores, tales como perlas paramagnéticas , sobre las cuales se puede inmovilizar el polipéptido marcado a través de la marca. La conjugación con el polipéptido marcado sobre, por ejemplo, placas para microtitulación, presenta la ventaja de que el polipéptido marcado puede ser inmovilizado sobre dichas placas para microtitulación directamente desde el caldo de cultivo (en principio sin ninguna purificación) y sometido a conjugación. De esta manera, se puede reducir la cantidad total de pasos del proceso (desde la expresión hasta la conjugación) . Además, la marca puede funcionar como una molécula espadadora, lo cual asegura un mejor acceso al polipéptido inmovilizado a conjugar. La conjugación con un polipéptido marcado puede ser con cualquiera de los grupos no polipeptidicos descritos en este documento, por ejemplo, con una molécula polimérica tal como PEG. La identidad de la marca especifica a utilizar no es crítica, en tanto dicha marca se pueda expresar con el polipéptido y se pueda inmovilizar sobre una superficie o material transportador adecuado. Existe una cantidad de marcas adecuadas disponibles comercialmente, por ejemplo, de Unizyme Laboratories, Dinamarca. Por ejemplo, la marca puede ser cualquiera de las siguientes secuencias: His-His-His-His-His-His Met-Lys-His-His-His-His-His-His Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln o cualquiera de las siguientes: EQKLI SEEDL (Una marca C-terminal descrita en Mol. Cel. Biol.. 5: páginas 3610 a 3616, 1985) DYKDDDDK (Una marca C- ó N-terminal) YPYDVDPDYñ Los anticuerpos contra las marcas anteriores se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, de ADI, Aves Lab and Research Diagnostics. Un método adecuado para el uso de un polipéptido marcado en la polietilenglucosilación se describe en la sección de Materiales y Métodos más adelante. La subsiguiente disociación de la marca del polipéptido se puede lograr utilizando enzimas disponibles comercialmente. Métodos para preparar un polipéptido de la presente invención o el polipéptido conjugado de la presente invención El polipéptido de la presente invención o la parte polipeptidica de un conjugado de la presente invención, opcionalmente en su forma glucosilada, se puede producir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos incluyen la construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y expresa la secuencia en un huésped apropiado transformado o transfectado . No obstante, los polipéptidos de la presente invención se pueden producir, aunque con menor eficiencia, por síntesis química o una combinación de síntesis química o una combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante.
La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o 1 parte de polipéptido de un conjugado de la presente invención se puede construir aislando o sintetizando la secuencia codificadora de nucleótidos del G-CSF relacionado, tal como hG-CSF, que presenta la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO. 1, y cambiando después la secuencia de nucleótidos con el fin de llevar a cabo la introducción (es decir, inserción o sustitución) o supresión (es decir, eliminación o sustitución) del o de los residuos de aminoácidos apropiados . La secuencia de nucleótidos se modifica de manera conveniente mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con los métodos convencionales. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos se prepara mediante síntesis química, por ejemplo, utilizando un sintetizador de oligonucleótidos , donde el diseño de los ol igonucleótidos se basa en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y se seleccionan preferentemente aquellos codones que están favorecidos en la célula huésped en la cual se producirá el polipéptido recombinante . Por ejemplo, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado y luego se pueden ensamblar por PCR, ligación o reacción en cadena de ligación (LCR) (Barany, PNAS 88: páginas 189 a 193, 1991).
Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente superposiciones 5' ó 3' para el ensamblaje complementario.
Están disponibles métodos alternativos de modificación de secuencia de nucleótidos para producir variantes de polipéptido para una clasificación de alto rendimiento, por ejemplo métodos que comprenden la reticulación homologa tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,093,257 y métodos que comprenden el arrastre de genes, por ejemplo, recombinación entre dos o más secuencias de nucleótidos homologas que dan como resultado nuevas secuencias de nucleótidos que tienen un número de alteraciones de nucleótidos cuando se comparan con las secuencias de nucleótidos de partida. El arrastre de genes (también conocido como arrastre de ADN) comprende uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y se asemeja a las secuencias de nucleótidos, seguida de la clasificación para seleccionar secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos con propiedades deseadas. Con el objeto de que tenga lugar el arrastre de ácido nucleico a base de homología, las partes relevantes de las secuencias de nucleótidos son preferentemente al menos el 50% idénticas, al menos 60% idénticas, más preferentemente al menos 70% idénticas, al menos 80% idénticas. La recombinación se puede llevar a cabo in vitro o in vivo.
Los ejemplos de métodos de arrastre de gen in vitro se describen en la Publicación de Stemmer y Asociados (1994), Proc. Nati. Acad. Sci . EUA; vol . 91, páginas 10747-10751; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, páginas 389-391; Smith (1994), Nature vol. 370, páginas 324-325; Zhao y Asociados, Nat. Biotech-nol. 1998, Mar; 16(3); 258-61; Zhao H. y Arnold, FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. No. 6 páginas 1307-1307; Shao y Asociados, Nucelic Acids Rsearch 1998, Jan 15; 26(2): páginas 681-83; y WO 95/17413. Un ejemplo de un método de arrastre in vivo adecuado se describe en la Publicación WO 97/07205. Otras técnicas de mutagénesis de secuencias de ácido nucleico mediante recombinación in vitro o in vivo se describen por ejemplo en la publicación WO 97/20078 y en la Patente Norteamericana No. 5,837,458. Los ejemplos de técnicas de arrastre especifico incluyen "arrastre de familia", "arrastre sintético" y "arrastre in silico" . El arrastre en familia comprende el someter a una familia de genes homólogos de diferentes especies a uno o más ciclos de arrastre y a la subsecuente clasificación o selección. Las técnicas de arrastre en familia se describen por ejemplo, en la Publicación de Crameri y Asociados (1998), Nature, vol. 391, páginas 288-291; Crhistians y Asociados, (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, páginas 259-264; Chang y Asociados, (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, páginas 793-797 ; y Ness y Asociados, (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, 893-896. El arrastre sintético comprende proporcionar bibliotecas de oligonucleótidos sintéticos de traslape con base, en por ejemplo, una alineación de secuencia de genes homólogos de interés. Los oligonucleótidos generados en forma sintética son recombinados, y las secuencias de ácido nucleico recombinantes resultantes son clasificadas, y si se desea, utilizadas para ciclos de arrastre adicionales. Las técnicas de arrastre sintético se describen en la publicación WO 00/42561. El arrastre in silico se refiere a un procedimiento de arrastre de ADN el cual se lleva a cabo o se modela utilizando un sistema de computadora, evitando de este modo parcial o totalmente la necesidad de manipulación física de ácidos nucleicos . Las técnicas para arrastre in silico se describen en la publicación WO 00/42560. Una vez efectuado el ensamblaje (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y se liga operati amente para controlar las secuencias necesarias para la expresión del G-CSF en la célula huésped transformada deseada. Se comprenderá, por supuesto, que no todos los vectores y las secuencias de control de expresión funcionan igualmente bien para expresar las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos descritos en este documento. Tampoco todos los huéspedes funcionan igualmente bien con el mismo sistema de expresión. No obstante, un experto en la técnica puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes sin demasiada experimentación. Por ejemplo, al seleccionar un vector, deberá considerarse el huésped ya que el vector se debe replicar en él o estar en condiciones de integrarse en el cromosoma. También se debe considerar la cantidad de copias del vector, la capacidad de controlar dicha cantidad de copias y la expresión de cualquier otra proteina codificada por el vector, como por ejemplo, los marcadores de antibióticos. Al seleccionar una secuencia de control de expresión también deberá considerarse una variedad de factores. Estos factores incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa de la secuencia, su capacidad de control y su compatibilidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, particularmente, en lo que respecta a las potenciales estructuras secundarias. Los huéspedes deberán seleccionarse considerando su compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado para la secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, la capacidad de plegarse correctamente del polipéptido, sus requerimientos de fermentación o cultivo y la facilidad de purificación de los productos codificados por la secuencia de nucleótidos.
El vector recombinante puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, como existe como una entidad extracromosómica , cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que al ser introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. El vector es preferentemente un vector de expresión, en el cual la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido de la presente invención está ligada operativamente a segmentos adicionales necesarios para la transcripción de la secuencia de nucleótidos. El vector deriva típicamente de ADN plásmido o viral . Una cantidad de los vectores de expresión adecuados era una expresión en las células huésped mencionadas en este documento se encuentra disponible comercialmente o está descrita en la literatura. Los vectores de expresión de utilidad para huéspedes eucariontes incluyen, por ejemplo, los vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores específicos son, por ejemplo, pCDNA3.1 (+ ) /Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.) y pCI-neo (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.) . Los vectores de expresión de utilidad en células de levadura incluyen el plásmido 2µ y derivados del mismo, el vector P0T1 (Patente Norteamericana No. 4.931.373), el vector pJS037 descrito en Okkels, Ann . Nueva York Acad. Sci 782, páginas 202 a 207, 1996 y pPICZ A, B ó C (Invitrogen) . Los vectores de utilidad para células de insectos incluyen pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, páginas 685 a 698 (1986), pBluebak 4.5 y pMelbac (ambos disponibles de Invitrogen) . Los vectores de expresión de utilidad para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos baterianos conocidos, tal como los plásmidos de E. coli, incluyendo PBR322, pET3a y pET12a (de Novagen Inc., WI, E.U.A. ), plásmidos de un rango de huéspedes más amplio, tal como RP4, ADN fagos, por ejemplo, los numerosos derivados del fabo lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, tal como M13 y fagos de ADN de una sola cadena filamentosa. Otros vectores que se pueden utilizar en esta invención incluyen aquellos que permiten que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sea amplificada en cuanto a cantidad de copias . Dichos vectores ampliables son bien conocidos en el arte. Incluyen, por ejemplo, los vectores capaces de ser amplificados mediante una amplificación DHFR (véase, por ejemplo, Kaufman, Patente Norteame icana No. 4.470.461, Kaufman y Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolato Reducíase cDNA Gene: Análisis Of Sign is Utilized For Efficient Expresión", Mol. Cell. Biol-, 2, páginas 1304 a 1319 (1982)) y amplificación por glutamina sintetasa ("GS") (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5.122.464 y EP 338.841) . El vector recombinante puede comprender además una secuencia de ADN que permita la replicación del vector en la célula huésped en cuestión. Un ejemplo de esta secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamíferos) es el origen de replicación SV40. Cuando la célula huésped es una célula de levadura, las secuencias apropiadas para permitir la replicación del vector son los genes de replicación REP 1-3 del plásmido de levadura 2µ y el origen de replicación del mismo. El vector también puede comprender un marcador seleccionable , por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como el gen que codifica para el dihidrofolato reductadsa (DHRF) o el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene 40, 1985, páginas 125 a 130), o uno que confiere resistencia a una droga, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina , cloranfenicol , neomicina, higromicina o metotresato. Para Saccharomyces cerevlsiae, los marcadores seleccionadles incluyen ura3 y leu2. Para los hongos filamentosos, los marcadores sel eccionabl es incluyen amdS , pyrG, arcB, niaD, sC . En este documento, el término "secuencias de control" significa que incluye todos los componente que son necesarios o ventajosos para la expresión del polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Dichas secuencias de control incluyen, pero sin limitarse a, una directriz, una secuencia de poliadenilacion, secuencias de pro-péptidos , promotores, potenciadores o secuencias de activación 5', secuencias de péptidos señal y terminadores de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor. En la presente invención puede utilizarse una amplia variedad de secuencias de control de la expresión. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con los genes estructurales de los vectores de expresión mencionados anteriormente, al igual que cualquier secuencia conocida por controlar la expresión de genes de células procariontes o eucariontes o los virus de las mismas y varias combinaciones de las mismas. Los ejemplos de secuencias de control apropiadas para dirigir la transcripción en las células de mamíferos incluyen los promotores temprano y tardío de SV40 y adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus 2, el MT-1 (gen de la metalotioneina] , el promotor temprano inmediato del gen de citomegalovirus humano (CMV) , el promotor del factor de elongación humana la (EF-loc) , el promotor mínimo de la proteína del shock de calor 70 de Drosophila , el promotor del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) , el promotor de la ubiquitina C humana (UbC) , el terminador de la hormona del crecimiento humano, las señales de poliadenilación de la región de Elb de SV40 o adenovirus y la secuencia consenso de ozak (Kozak, M. J. Mol Biol. 1987 agosto 20; 196(4) : páginas 947 a 950) . Con el objeto de mejorar la expresión en las células de los mamíferos puede insertarse un intrón sintético en la región no traducida 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés. Un ejemplo de un intrón sintético es el intrón sintético a partir del plásmido pCI-Neo (de Promega Corporation, Wisconsin, E .U.A. ) . Los ejemplos de secuencias apropiadas de control para dirigir la transcripción en células de insectos incluyen el promotor de la polihedrina, el promotor PIO, el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis Autographa californica , el promotor temprano inmediato del gen 1 del baculovirus y el promotor temprano demorado del gen del baculovirus 39K, y la secuencia de poliadenilación SV40. Los ejemplos de secuencias apropiadas de control para utilizar en las células huéspedes de levadura incluyen los promotores de levadura del sistema de apareamiento , el promotor de la trios fos fato isomerasa de la levadura (TPI), los promotores de los genes glicoliticos de la levadura o los genes del alcohol deshidrogenasa, el promotor de ADH2-4c y el promotor inducible de GAL. Los ejemplos de secuencias de control apropiadas para utilizar en células huéspedes de hongos filamentosos incluyen el promotor y el terminador de ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican la amilasa triosafosfato isomerasa TAKA o la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, una a-amilasa A. niger, glucoamilasa de A.niger o A. nidulans, acetamidasa de A. nidulans, proteinaza aspártica o lipasa de Rhizomucor miehei, el terminador de TPI y el terminador de ADH3. Los ejemplos de secuencias apropiadas de control para utilizar en las células huéspedes bacterianas incluyen los promotores del sistema Tac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC y las regiones promotoras principales de los fagos lambda. La presencia o ausencia de un péptido señal dependerá, por ejemplo, de la expresión de la célula huésped utilizada para producción del polipéptido, el péptido a expresar (ya sea un péptido intra o extracelular ) y si es deseable para obtener secreción. Para su uso en hongos ilamentosos, el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen que codifique una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus s . , un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizo ucor iehei o una lipasa lanuginosa de Humicola. El péptido señal deriva preferentemente de un gen que codifica una TAKA amilasa de A. oryzae, -amilasa neutral de A. níger, amilasa estable en presencia de ácidos de A. niger, o glucoamilasa de A. niger. Para su uso en células de insectos, el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen de insectos (cf. WO 90/05783), tal como el precursor de la hormona adipocinét ica de la lepidóptera Manduca sexta, (cf. Patente Norteamericana No. 5.023.328), la melitina de la abeja melífera ( Invitrogen) , el ecdisteroide UDP-glucosiltransferasa (egt) (Murphy y otros, Protein Expresión and Purification, 4, páginas 349 a 357 (1993) o lipasa pancreática humana (hpl) (Methods in Enzymology 284, páginas 262 a 272, 1997). Un péptido señal preferido para utilizar en células de mamíferos es el del hG-CSF o el péptido señal de cadena liviana Ig (cappa de los múridos (Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: páginas 89 a 104) . Se ha descubierto que los péptidos señal apropiados para utilizar en células de levaduras son los péptidos señal de factor a de S. cerevíciae. (cf. Patente Norteamericana No. 4.870.008), un péptido señal modificado de carboxipeptidas (cf. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, páginas 887 a 897), el péptido señal BARI de levadura (cf. WO 87/02670), y el péptido señal aspártico proteasa 3 de levadura (???3) (cf. M. Egel-Mitani y otros, Yeast 6, 1990, páginas 127 a 137), y la secuencia directriz sintética TA57 (documento WO 98/32867) . Para su uso en células de E. coli se ha encontrado que un péptido señal adecuado es el péptido señal ompA (EP 581821) . La secuencia de nucleótidos de la presente invención que codifica un polipéptido que presenta actividad G-CSF, ya sea preparada por mutagénesis dirigida al sitio, síntesis, PCR u otros métodos, también puede incluir optativamen e una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. El péptido señal está presente cuando el polipéptido debe ser secretado de las células en las cuales se expresa. La célula elegida para la expresión del polipéptido debe poder reconocer a dicho péptido señal, si está presente. El péptido señal puede ser homólogo (por ejemplo, puede ser el que habitualmente está asociado con el hG-CSF) o heterólogo (es decir, que se originó de otra fuente que el hG-CSF) para el polipéptido o puede ser homólogo o heterólogo para la célula huésped, es decir, puede ser un péptido señal que habitualmente se expresa en la célula huésped o uno que no se expresa habitualmente en la célula huésped. Por consiguiente, el péptido señal puede ser procarionte, por ejemplo, derivado de una bacteria tal como E. coli, o eucarionte, por ejemplo, derivado de una célula de mamífero o de insecto o de levadura. Se puede utilizar cualquier huésped adecuado para producir el polipéptido o la parte pol ipeptidica del conjugado de la presente invención, incluyendo células de bacterias, hongos (incluyendo levaduras), plantas, insectos, mamíferos u otras células o líneas celulares de animales adecuadas, así como plantas o animales t ansgénicos . Los ejemplos de células huésped bacterianas incluyen bacterias gram-positivas , tal como cepas de Bacillus, por ejemplo, B. brevís o B . subtilis, Pseudomonas o Streptomyces, o bacterias gram-negativas , tal como cepas de E. coli. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: páginas 111 a 115), utilizando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Eacteriology 81: páginas 823 a 829, o Dubnau y Davidoff-Avelson, 1971, Journal of Molecular Biology 65: páginas 209 a 221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigeka a y Dower, 1988, Biotechniques 6: páginas 742 a 751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: páginas 5771 a 5278) . Los ejemplos de células huésped adecuadas de hongos filamentosos incluyen cepas de Aspergíllus , por ejemplo, A. ory?aef A. niger, o A nigulans r Fusariu o ri choder a . Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que comprende la formación de protoplastos , transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergíllus se describen en la publicación EP 238 023 y en la Patente Norteamericana No. 5.679.543. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium fueron descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: páginas 147 a 156 y el documento WO 96/00787. Los ejemplos de células huésped de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces , por ejemplo S. cerevlsiae , Schizosaccharomyces , Klyveromyces , Pichia, tal como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula, tal como H. Polymorpha o Yarrowia. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Carente, En Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1993, Journal of Bacteriology 153: página 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A. 75: página 1920; y como describen Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, E.U.A. (en el protocolo de producto para Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kit) . Los ejemplos de células huésped de insecto adecuadas incluyen una linea celular de Lepidoptera, tal como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 ó Sf21) o de Tric oplusia ni (High Five) (Patente Norteamericana No. 5.077.214) . La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos heterólogos en las mismas, se puede llevar a cabo tal y como se describe Invitrogen. Los ejemplos de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen lineas de células del ovario del hámster chino (CHO) , (por ejemplo, CH0-K1; ATCC CCL-61), líneas celulares del Mono verde (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratones (por ejemplo, NS/O), líneas celulares de riñon de hámster neonato (BHK) (por ejemplo ATCC CRL-1632 ó ATCC CCL-10) y células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC CRL 1573)), asi como células vegetales en cultivo de tejido. En el arte, se conocen otras lineas celulares adecuadas y se encuentran disponibles en depósitos públicos, tal como American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Los métodos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamífero incluyen transfección medida por fosfato de calcio, electroporacion, transfección transmitida por DEAE-dextrano , transfección transmitida por liposomas, vectores virales y el método de transfección descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido, usando Lipofectamina 2000. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y fueron descritos, por ejemplo, por Ausubel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, E.U.A. El cultivo de células de mamífero se lleva a cabo de acuerdo con los métodos establecidos, por ejemplo, como se describe en (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, Nueva Jersey, E.U.A. y Harrison MA y Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Prensa de la Universidad de Cambridge, 1997) . En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo apto para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada mediante cultivo en frascos con agitación, fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote de alimentación, o fermentaciones en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales efectuadas en un medio apropiado y en condiciones que permiten la expresión y/o el aislamiento del polipéptido. El cultivo se realiza en un medio nutritivo apto que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados se pueden adquirir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en un medio nutritivo, el polipéptido puede recuperarse directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede recuperarse de los Usados celulares. El polipéptido resultante puede ser recuperado mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación, filtración, extracción, deshidratación por aspersión, evaporación o precipitación.
Los polipéptidos se pueden purificar mediante diversos procedimientos conocidos en el arte incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforét icos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Puriflcation, J . -C- Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) . Los métodos específicos para purificar los polipéptidos que presentan actividad G-CSF fueron descritos por D. Metcalf y N. A. Incola en The hemopoietic colony-stimulating factors, páginas 50 a 51, Prensa de la Universidad de Cambridge (1995), por C. S. Bae et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 52: páginas 338 a 344 (1999) y en la Patente Norteamericana No. 4.810.643. Composición farmacéutica del invento y uso de la misma En un aspecto adicional, la presente invención comprende una composición que contiene un polipéptido o un conjugado descrito en este documento y por lo menos un vehículo o excipiente aceptable para uso farmacéutico. El polipéptido, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, en particular, la prevención de infecciones en pacientes con cáncer sometidos a ciertos tipos de quimioterapia, terapia de radiación y transplantes de médula ósea, movilización de células progenitoras para su recolección en transplantes de células progenitoras de sangre periférica, tratamiento de leucopenia relativa o crónica severa, tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda, tratamiento de SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia y para una terapia antifúngica, en particular, para el tratamiento de candidiasis sistémica o invasiva. En otro aspecto, el polipéptido, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utilizan en un método para el tratamiento de un mamífero que padece un trastorno hematopoyético general, incluyendo aquellos que se originan por una terapia con radiación o por una quimioterapia, en particular, leucopenia, SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia , que comprenden la administración de dicho polipéptido, conjugado o composición farmacéutica a un mamífero que lo necesita. Los polipéptidos y conjugados de la presente invención serán administrados a pacientes en una dosis "terapéuticamente efectiva" por ejemplo, una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados con relación a la condición para la cual se administra. La dosis exacta dependerá del padecimiento que será tratado, y será discernióle por un experto en la materia que utilice técnicas conocidas. Los polipéptidos o conjugados de la presente invención, pueden ser administrados por ejemplo, en una dosis similar a la empleada en terapia con rhG-CSF tal como Neupogen®. Una dosis adecuada de un conjugado de la presente invención, se contempla dentro del rango de aproximadamente 5-300 microgramos/kg peso corporal (con base en el peso de la parte de proteina del conjugado), por ejemplo 10-200 microgramos/kg, tal como 25-100 microgramos/kg. Los expertos en la materia apreciarán que una cantidad efectiva de un polipéptido, conjugado o composición de la presente invención depende, Ínter alia, de la enfermedad, la dosis, el programa de administración, si el polipéptido o conjugado o composición se administra sólo o junto con otros agentes terapéuticos, de la vida media de suero de las composiciones, de la salud general del paciente y la frecuencia de administración-Preferentemente, el polipéptido, conjugado, preparación o composición de la presente invención se administra en una dosis efectiva, en particular una dosis que es suficiente para normalizar el número de leucocitos, en particular neutrófilos, en el paciente en cuestión. La normalización del número de leucocitos se puede determinar contando simplemente el número de leucocitos a intervalos regulares de acuerdo con la práctica establecida. El polipéptido o conjugado de la presente invención se administra preferentemente en una composición que incluye uno o más transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. El polipéptido o conjugado puede ser formulado en composiciones farmacéuticas en una forma conocida per se en el arte, para dar como resultado un polipéptido farmacéutico que es lo suficientemente almacenable y es adecuado para la administración a humanos o animales. La composición farmacéutica puede ser formulada en una variedad de formas, incluyendo en la forma de un liquido o gel, o liofilizada, o cualquier otra forma adecuada. La forma preferida dependerá de la indicación particular que esté siendo tratada y será apreciada por el experto en la materia. Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar varias formas de leucopenia. En particular, el polipéptido, conjugado o composición de la presente invención se pueden utilizar para evitar infecciones en pacientes con cáncer que pasan por ciertos tipos de terapia de radiación, quimioterapia y transplantes de médula ósea, para movilizar las células progenitoras para la recolección en transplantes de célula progenitora de la sangre periférica, para el tratamiento de leucopenia crónica severa o relativa y para soportar el tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda. Además, el polipéptido, conjugado o composición de la presente invención se puede utilizar para tratamiento de SIDA u otras enfermedades de inmunodef iciencia y para terapia antifúngica, en particular para el tratamiento de candidiasis sistémica o invasiva, y para el tratamiento de infecciones bacterianas. Forma del Fármaco El polipéptido conjugado de la presente invención, se puede utilizar "como tal" y/o en una forma de sal del mismo. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales con metales álcali o metales de tierra alcalina, tal como sodio, potasio, calcio y magnesio, asi como por ejemplo sales de zinc. Estas sales o complejos pueden presentarse como una estructura cristalina y/o amorfa. Excipientes El término "farmacéuticamente aceptable" significa un transportador o excipiente que en las dosis y concentraciones empleadas no causa cualquier efecto fuera de lo común en pacientes a los cuales se administra. Tales transportadores y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (ver Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds . , Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] ) . Mezcla de Fármacos La composición f rmacéutica de la presente invención, puede ser administrada sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden ser incorporados como parte de la misma composición farmacéutica, o pueden ser administrados por separado a partir del polipéptido o conjugado de la presente invención, ya sea en forma concurrente o de acuerdo con otro programa de tratamiento. Además, el polipéptido, conjugado o composición farmacéutica de la presente invención se puede utilizar como un adyuvante para otras terapias. Pacientes Un "paciente" para los propósitos de la presente invención, incluye tanto humanos como otros mamíferos. Por lo tanto, los métodos se aplican tanto para terapia humana como para aplicaciones veterinarias. Ruta de Administración La administración de las formulaciones de la presente invención se puede llevar a cabo en una variedad de formas, incluyendo pero sin limitarse a, forma oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral , intranasal, transdérmica , intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular o en cualquier otra forma aceptable. Las formulaciones pueden ser administradas en forma continua mediante infusión, no obstante que también es aceptable la inducción de bolo, utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Parenteral Un ejemplo de una composición farmacéutica es una solución designada para administración parenteral. Aunque en muchos casos las formulaciones de solución farmacéutica se proporcionan en forma liquida, adecuadas para el uso inmediato, tales formulaciones parenterales también se pueden proporcionar en forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición debe ser congelada antes de utilizarse. La última forma se utiliza con frecuencia para aumentar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición bajo una amplia variedad de condiciones de almacenamiento, ya que como se reconoce por los expertos en la materia, las preparaciones liofilizadas generalmente son más estables que sus contrapartes liquidas. Tales preparaciones liofilizadas son reconstituidas antes de utilizarse mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados, tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril .
En el caso de parenterales, se preparan para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando, según sea adecuado, el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con uno o más transportadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables empleados normalmente en la técnica (los cuales todos son denominados "excipientes"), por ejemplo agentes de amortiguación, agentes estabilizadores, conservadores, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y/o otros aditivos misceláneos . Los agentes de amortiguación ayudan a mantener el pH dentro del rango que se aproxima a condiciones fisiológicas. Normalmente están presentes en una concentración que fluctúa desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 50 mM . Los agentes de amortiguación adecuados para utilizarse con la presente invención, incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como amortiguadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-disódico , mezcla de ácido citrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), amortiguadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succinico-succinato monosódico, mezcla de ácido succinico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succinico-succinato disódico, etc.) amortiguadores de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartarí co-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), amortiguadores de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumá ico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), amortiguadores de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico, etc.), amortiguador de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), amortiguadores de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido lactico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y amortiguadores de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.) . Las posibilidades adicionales son amortiguadores de fosfato, amortiguadores de histidina y sales de trimetilamina tal como Tris. Se agregan conservadores a crecimiento microbiano retardado, y normalmente se agregan en cantidades de aproximadamente 0.2%-l% (p/v) . Los conservadores adecuados par utilizarse con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, parabeno metílico, parabeno propílico, cloruro de amonio octadecildi-metilbencílico, haluros benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio) , cloruro de hexametonio, parabenos de alquilo tal como parabén de metilo o propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol . Se agregan isotonificadores para asegurar la isotonicidad de composiciones líquidas e incluyen alcoholes de azúcar polihídrica, preferentemente alcoholes de azúcar trihídrica o superiores, tal como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol o manitol. Los alcoholes polihídricos pueden estar presentes en una cantidad entre 0.1% y 25% por peso, normalmente de 1% a 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de otros ingredientes. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden fluctuar en función desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o adherencia a la pared del contenedor. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídrica (descritos anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, omitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicas o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trealosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol , galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilénglicol ; polímeros de aminoácido, agentes de reducción que contienen azufre, tales como urea, glutatiana, ácido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, <10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero de bovina, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; monosacárídos tales como xilosa, mañosa, fructuosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizadores normalmente están presentes dentro del rango de desde 0.1 hasta 10,000 partes por peso con base en el peso de la proteína activa. Los tensioacti os no iónicos o detergentes (también conocidos como "agentes de humedecimiento" ) pueden estar presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger el polipéptido terapéutico de la agregación inducida por la agitación, lo cual también permite que la formulación sea expuesta a tensión de superficie de corte sin originar la desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.)/ polioxámeros (184, 188 etc.), polioles, monoéteres de sorbitano de polioxietileno Pluronic® (Tween®-20, T een®-80, etc.) . Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de volumen o rellenadores (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA) , antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes . El ingrediente activo puede estar atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo y microcápsulas de metilcelulosa , gelatina o poli-(metilmetacilato) , en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en la publicación de Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones parenterales que se utilizarán para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Preparaciones de liberación sostenida Los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido o conjugado, teniendo las matrices una forma adecuada tal como una película o microcápsulas . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinilalcohol )) , polilactidos , copolimeros de ácido-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vini 1 no degradables, copolíemros degradables de ácido láctico-ácido glucólico tales como la tecnología de ProLease® o Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glucólico y acetato de leuprolido), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y el ácido láctico-ácido glucólico hacen posible la liberación de moléculas durante períodos largos, tales como hasta o alrededor de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a una temperatura de 37°C, que da como resultado la pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Se pueden considerar estrategias para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es descubierto como una formación de unión S-S intermoleculada a través de intercambio de tio-di sul furo , la estabilización se puede lograr modificando los residuos de sulfidrilo, liofilizando a partir de soluciones de ácido, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas. Administración pulmonar Las formulaciones adecuadas para utilizarse con un nebulizador, ya sea a chorro o ultrasónico, normalmente comprenderán el polipéptido conjugado disuelto en agua a una concentración de por ejemplo, aproximadamente 0.01 a 25 mg de conjugado por mL de solución, preferentemente de aproximadamente 0.1 a 10 mg/mL. La formulación también puede incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización de proteína y regularización de presión osmótica), y/o albúmina de suero humano que fluctúa en concentración de 0.1 a 10mg/ml. Los ejemplos de amortiguadores que se pueden utilizar son acetato sódico, citrato y glicina. Preferentemente, el amortiguador tendrá una composición y molaridad adecuado para ajustar la solución a un pH dentro del rango de 3 a 9. Generalmente, las molaridades del amortiguador de desde 1 raM a 50 inM son adecuados para este propósito. Los ejemplos de azúcares que se pueden utilizar son lactosa, maltosa, manitol, sorbitol, trealosa y xilosa, normalmente en cantidades que fluctúan del 1% al 10% por peso de la formulación. La formulación de nebulizador también puede contener un tensioactivo para reducir o evitar la agregación inducida de la superficie de la proteína causada por atomización de la solución al formar el aerosol. Se pueden emplear varios tensioactivos convencionales, tales como ésteres de ácido graso de polioxietileno y alcoholes, y ásteres de ácido graso de sorbitano de polioxietileno. Las cantidades generalmente fluctuarán entre 0.001% y 4% por peso de la formulación. Un tensioactivo especialmente preferido para los propósitos de la presente invención es monooleato de sorbitano de polioxietileno. Las formulaciones y métodos específicos para generar dispersiones adecuadas de partículas líquidas de la presente invención, se describen en la Publicación WO 94/20069, y en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,915,378, 5,960,792, 5,957,124, 5,934,272, 5,915,378, 5,855,564, 5,826,570 y 5,522,385 que están incorporadas a la presente invención como referencia. Las formulaciones para utilizarse con el aparato de inhalación de dosis medida generalmente comprenderán un polvo finamente dividido. Este polvo puede ser producido liofilizando y posteriormente moliendo una formulación de conjugado líquido y también pueden contener un estabilizador tal como albúmina de suero humano (HSA) . Normalmente, se agrega más del 0.5% (p/p) de HSA. Además, si es necesario se pueden agregar uno o más azúcares o alcoholes de azúcar a la preparación. Los ejemplos incluyen maltosa de lactosa, manitol, sorbitol, sorbitosa, trealosa, xilitol y xilosa. La cantidad agregada en la formulación puede fluctuar desde aproximadamente 0.01% hasta 200% (p/p), preferentemente desde aproximadamente 1 hasta 50% del conjugado presente. Tales formulaciones posteriormente son liofilizadas y molidas hasta el tamaño de partícula deseado. Las partículas de tamaño adecuado posteriormente son suspendidas en un impulsor con ayuda de un tensioactivo . El impulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono , o un hidrocarbo.no, incluyendo trifluorometano, diclorodifluorometano , diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen triolato de sorbitano y lecitina de soya. El ácido oleico también puede ser útil como un tensioactivo. Posteriormente, esta mezcla es cargada en el aparato de administración. Un ejemplo de un inhalador de dosis medida comercialmente disponible adecuado para utilizarse en la presente invención, es el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C. Las formulaciones para inhaladores de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el conjugado y también puede incluir un agente de volumen, tal como lactosa, sorbitol sacarosa o manitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el aparato, por ejemplo del 50% al 90% por peso de la formulación. Las partículas del polvo deberán tener propiedades aerodinámicas en el pulmón, que corresponden a partículas con una densidad de aproximadamente 1 g/cm2 que tienen un diámetro promedio menor a 10 mícrómetros, preferentemente entre 0.5 y 5 mícrómetros, m s preferentemente entre 1.5 y 3.5 mícrómetros. Un ejemplo de un inhalador de polvo adecuado para utilizarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, es el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Berford ass . Los polvos para estos aparatos pueden ser generados y/o suministrados a través de los métodos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,997,848, 5,993,783, 5,985,248, 5,976,574, 5,922,354, 5,785,049 y 5,654,007. Los aparatos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de aparatos terapéuticos, incluyen, pero no se limitan a, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, los cuales todos son familiares para los expertos en la materia. Los ejemplos específicos de aparatos comercialmente disponibles adecuados para la práctica de la presente invención, son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt , Inc., St . Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Engle ood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts; el aparato "de nube permanente" de Inhale Therapeulic Systems, Inc., San Carlos, California; el inhalador AIR fabricado por Alkermes, Cambridge, Massachusetts; y el sistema de administración pulmonar de fármaco AERx fabricado por Aradigm Corporation, Hayward, California. También se contempla el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención en aplicaciones de terapia genética. En particular, puede ser de interés utilizar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, tal como se describe en la sección anterior titulada "Conjugado del invento en donde el grupo no polipeptidico es una porción de carbohidrato". Por lo tanto, la glucosilación de los polipéptidos se logra durante el transcurso de la terapia genética, por ejemplo, después de la expresión de la secuencia de nucleótidos en el cuerpo humano. Las aplicaciones de terapia genética contempladas incluyen tratamiento de aquellas enfermedades en las cuales se espera que el polipéptido proporcione una terapia efectiva. Estas incluyen el tratamiento de varias formas de leucopenia en particular, la prevención de infección en pacientes con cáncer que pasan por ciertos tipos de quimioterapia y trasplantes de médula ósea, movilización de células progenitoras para recolección en transplantes de célula progenitora de la sangre periférica, tratamiento de leucopenia crónica severa o relativa, tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda, y tratamiento de SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia. La administración local de G-CSF utilizando terapia genética, puede proporcionar al agente terapéutico al área objetivo mientras que evita problemas de toxicidad potenciales asociados con administración no especifica. Se contemplan metodologías de terapia genética tanto in vitro como in vivo. Se conocen varios métodos para transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones de células definidas. Para referencias adicionales se debe consultar por ejemplo, la Publicación de ulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260, páginas 926-31 (1993) . Estos métodos incluyen: Transferencia directa de genes, por ejemplo, tal como se describe en la Publicación de Wolff y Asociados, "Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In vivo", Science 247, páginas 1465-68 (1990); La transferencia de ADN transmitida por liposomas, se describe por ejemplo, en la Publicación de Caplen y Asociados, "Lipo-some-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis" Nature Med., 3, páginas 39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med., 1, páginas 15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of ammalian Cells", Biochem Biophys Res. Coom., 179, páginas 280-85 (1991); La transferencia de ADN transmitida por retrovirus, se describe por ejemplo en la Publicación de Kay y Asociados, "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B : Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science, 262, páginas 117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, páginas 808-13 (1992); La transferencia de ADN transmitida por virus de ADN; tales viruses de ADN incluyen adenoviruses (preferentemente vectores a base de Ad-2 ó Ad-5), viruses de herpes (preferentemente vectores a base de virus de herpes simple) y parvoviruses (preferentemente vectores a base de parvovirus "defectuoso" o no autónomo, más preferentemente vectores a base de virus adeno-asociados , lo más preferentemente vectores a base de AAV-2) . Ver por ejemplo la Publicación de Al i y Asociados, "The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, páginas 367-84 (1994); Patentes Norteamericanas Nos. , 797, 368 y 5, 139, 941. LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias anexo contiene las siguientes secuencias : SEQ ID NO: 1: La secuencia de aminoácidos de G-CSF humano . SEQ ID NO: 2: La secuencia de ADN sintética que codifica G-CSF humano, con el uso de un codón optimizado para expresión en E. coli. SEQ ID NO: 3: La secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal OmpA. SEQ ID NO: 4: La secuencia de ADN sintética que codifica la secuencia de señal OmpA. SEQ ID NO: 5: Una marca de histidina sintética. SEQ ID NO: 6: Una secuencia de ADN sintética que codifica la marca de histidina de SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 7: La secuencia de aminoácidos de un péptido de señal G-CSF humano.
SEQ ID NO: 8: Una secuencia de ADN sintética que codifica G-CSF humano, que incluye el péptido de señal de SEQ ID NO: 7, con el uso de un codón optimizado para la expresión en células CHO . MATERIALES Y MÉTODOS Métodos usados para determinar los aminoácidos a modificar Área de Superficie Accesible (ASA) Se puede obtener un conjunto tridimensional de 10 estructuras determinadas por espectroscopia RMN (Zink y asoleados, (1994) Biochemistry 33:8453-8 63) está dispoonible en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) . Esta información se puede ingresar en el programa para computadora Access (B. Lee y F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: páginas 379 a 400 (1971) ) versión 2 (© 1983 Yale üniversisty) y se puede emplear para calcular el área de superficie accesible (ASA) de los átomos individuales de la estructura. Este método emplea típicamente una sonda de 1.4Á y define el Área de Superficie Accesible (ASA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de efectuar este cálculo, se deben eliminar todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno del conjunto coordinado, así como otros átomos no relacionados directamente con la proteína. ASA fraccional de la cadena lateral El ASA fraccional de los átomos de la cadena lateral se calcula mediante la división de la suma del ASA de los átomos en la cadena lateral por un valor que representa el ASA de los átomos de la cadena de ese tipo de residuo en un tripéptido extendido ALA-x-ALA. Véase Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, páginas 507 a 530. Para este ejemplo, el átomo CA se considera como una parte de la cadena lateral de residuos de Glicina pero no para los residuos restantes. Los valores en la tabla que se encuentra a continuación, se utilizan como ASA 100% estándar para la cadena lateral: Ala 69, 23 A2 Le u 140,76 A2 Arg 200, 35 Á2 Lys 162, 50 Á2 Asn 106,25 A2 Met 156, 08 Á2 Asp 102, 06 A2 Phe 163,90 A2 Cys 96, 69 Á2 Pro 119, 65 A2 Gln 140, 58 A2 Ser 78,16 Á2 Glu 134, 61 Á2 Thr 101, 67 Á2 Gly 32,28 Á2 Trp 210,89 Á2 His 147,00 Á2 Tyr 176, 61 A2 lie 137, 91 Á2 Val 114,14 Á2 Los residuos no detectados en la estrui definen como un 100% de exposición ya que se considera que están ubicados en regiones flexibles. Determinación de las distancia entre átomos: La distancia entre átomos se determina con mayor facilidad usando un software de gráfica molecular, por ejemplo, InsightlI® v. 98.0, MSI INC. Consideraciones generales con respecto a los residuos de aminoácidos a modificar Como se explicó anteriormente, los residuos de aminoácidos a modificar de acuerdo con la presente invención son preferentemente aquellos cuyas cadenas laterales están expuestas en la superficie, particularmente aquellas con más de un 25% aproximadamente de la cadena lateral expuesta en la superficie de la molécula, y más preferentemente aquellos con más de un 50% de exposición de la cadena lateral. Otra consideración a tener en cuenta es que se prefieren excluir los residuos ubicados en la interfase del receptor con el fin de evitar, por lo menos minimizar, una posible inte ferencia con la unión o activación del receptor. Otra consideración es que también se deben excluir los residuos que están a menos de 10Á del residuo Lys (Glu, Asp) CB-CB (CA por Gly más cercano. Finalmente, las posiciones preferidas para la modificación son particularmente aquellas que presentan un residuo hidrofílico y/o cargado, es decir, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, His, Tyr, Ser y Thr, siendo especialmente preferidas las posiciones que tienen un residuo arginina.
Identificación de residuos de aminoácidos del G-CSF para la modificación La siguiente información ilustra los factores que se deberían tener en cuenta en general al identificar residuos de aminoácidos a modificar de acuerdo con la presente invención. Se han descrito estructuras tridimensionales para el G-CSF humano por cristalografía de rayos X y por espectroscopia de RMN, respectivamente (Proc. Nati. Acad . Sci. E.U.A. 90: páginas 5167 a 5171, 1993; Biochemistry 33: páginas 8453 a 8463, 1994). Tal como se mencionó anteriormente Aritomi et al., Natura 401: páginas 713 a 717, 1999, identificaron los siguientes residuos del hG-CSF como parte de las interfases de unión del receptor: G4, P5, A6, S7, S8, L9, PIO, Qll, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 y L124. Por consiguiente, si bien es posible modificar estos residuos, se prefiere excluir estos residuos de la modificación . El uso de 10 estructuras por RMN del G-CSF identificado por Zink y asociados (1994) como estructuras de entrada seguidas de un cálculo de ASA promedio de la cadena lateral, permitió identificar los siguientes residuos como poseedores de más de un 25% de ASA: M0, T1,P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, PIO, Qll, S12, F13, L14, L15, K16, C17, El9, Q20, V21, R22, K23, Q25, G26, D27, A29, A30, E33, K34, C36, A37, T38, Y39, K40, L41, H43, P44, E45, E46, V48, L49, L50, H52, S53, L54, 156, P57, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71, A72, G73, C74, S76, Q77, L78, S80, F83, Q86, G87, Q90, E93, G94, S96, P97, E98, L99, G100, P101, T102, D104, T105, Q107, L108, D109, Allí, D112, F113, T115, T116, W118, Q119, Q120, M121, E122, E123, L124, M126, A127, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, M137, P138, A139, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147, S155, H156, Q158, S159, L161, E162, V163, S164, Y165, R166, V167, L168, H170, L171, A172, Q173, P174. De manera similar, los siguientes residuos tienen más de un 50% de ASA: MO, Ti, P2 , L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, PIO, Qll, S12, F13, L14, L15, K16, C17, E19, Q20, R22, K23, G26, D27, A30, E33, K34, T38, K40, L41, H43, P44, E45, E46, L49, L50, S53, P57, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71, A72, G73, S80, F83, Q90, G94, P97, E98, P101, D104, T105, L108, D112, F113, T115, T116, Q119, Q120, M121, E122, E123, L124, M126, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, A139, A141, S142, A143, F144, 147, S155, S159, E162, R166, V167, R169, H170, L171, A172, Q173, P174. Se utilizó el programa para modelación molecular InsightlI® v. 98.0 para determinar los residuos que presentaban su átomo CB (CA en el caso de glicina) a una distancia de más de 15Á del grupo amina más cercano, definido como los átomos NZ de lisina y el átomo de N del residuo N-Terminal TI. La siguiente lista incluye los residuos que cumplen con este criterio en por lo menos en una de las 10 estructuras R : G4, : P5, A6, S7 , S8 PIO, Qll, L14, L18, V21, R22, Q25, G26, D27 , G28, Q32, L35, C36, A37, T38, Y39, C42, H43, P44, E45, L47 , V48 , L49, L50 , G51, H52 , S53 , L54, G55 , 156, W58, A59, P60, L61, S62 , S63, C64, P65, S66, Q67, L69, Q70, L71, A72 , G73, C74 , L75, S76, Q77, L78, S80, G81, L82 , F83, L84 , Y85 , Q86, G87, L88 , L89, A91, L92, E93, G94, 195, S96, P97, E98, L99, G100, T102, L103, D104, T105, L106, Q107, L108, D109, Allí, D112, F113, A114, T115, T116, 1117, W118, Q120, M121 , E122, E123, L124, G125, M126, A127, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, P138 , A139 , F140, A141, S142, A143, F144 , Q145, R147, A148, G149, G150, V151, L152, V153, A154,S155, H156, L157, Q158, S159, F160, L161, E162, V163, S164, Y165, R166, V167, L168, R169, H170, L171, A172, Q173, P174. El programa InsightlI® v. 98.0 se utilizó de manera similar para determinar los residuos que tienen su átomo CB (el átomo CA en el caso de glicina) a una distancia de más de 10Á del grupo acidico más cercano, definido como átomos CG de ácido aspártico, los átomos CD de ácido glutámico y el átomo C del residuo C-terminal P174. La siguiente lista incluye los residuos que cumplen con este criterio en por lo menos una de las 10 estructuras de la RM : M0, 1 T1,P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, PIO, Qll, S12, F13, L14, T38, Y39, K40, L41, C42, L50, G51, H52, S53, L54 , G55, 156, P57, W58 , A59, P60, L61, S62, S63, C64 , P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71, A72, G73, C74, L75, S76, Q77, L78, H79, S80, G81, L82, F83, L84 , Y85, Q86, G87, L88, 1117, M126, A127, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, M137, P138, A139, F140, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147, A148, G149, G150, V151, L152, V153, A154, S155, H156, L157, V167, L168, R169, H170, L171. Al combinar y comparar las listas anteriores, es posible seleccionar residuos de aminoácidos individuales para la modificación obteniéndose como resultado una lista que contiene una cantidad limitada de residuos de aminoácidos cuya modificación en un polipéptido G-CSF determinado, probablemente dé como resultado las propiedades deseadas.
Métodos para la polietilenglucosilación del G-CSF y variantes del mismo Polietilenglucosilación del hG-CSF y variantes del mismo en solución El G-CSF humano y variantes del mismo son polieti 1 englucosilados a una concentración de 250 µg/ml en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. El exceso molar de PEG es de 100 veces con respecto a los sitios de polietilenglucosilación de la proteina. La mezcla de reacción se coloca en un termomezclador durante 30 minutos a 37°C a 1200 r.p.m. Una vez transcurridos los 30 minutos, la reacción es detenida por adición de un exceso molar de glicina. Se aplica cromatografía de intercambio catiónico para eliminar el exceso de PEG, glicina y otros productos secundarios de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción para la polietilenglucosilación se diluye con citrato de sodio 20 mM pH 2,5 hasta que la fuerza iónica es menor que 7 mS/cm. El valor del pH se ajusta en 2,5 usando HC1 5 N. La mezcla se aplica sobre una columna FF SP-sepharose equilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 2,5. El material no unido se eliminó de la columna por lavado usando 4 volúmenes de columna de amortiguador de equilibrio. La proteina polietilenglucosilada se eluye con tres volúmenes De columna por adición de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 750 mM . El G-CSF puro polietilenglucosilado se encuentra y se cambia el amortiguador usando dispositivos de concentración VivaSpin, con un corte de peso molecular (mwco) de 10 kDa. Polietilenglucosilacion en placas para microtitulación de un polipéptido marcado con actividad G-CSF El polipéptido que presenta actividad G-CSF es expresado con una marca adecuada, por ejemplo, cualquiera de los ejemplos de marcas mencionados en la descripción general anterior, y transifiriendo caldo de cultivo a una o varias cavidades de una placa para microtitulación capaz de inmovilizar el polipéptido marcado. Cuando la marca es Mey-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln, se puede emplear una placa para microtitulación HisSorb de niquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) disponible comercialmente de Qiagen. Después de inmovilizar el polipéptido marcado en la placa para microtitulación, las cavidades se lavan con un amortiguador adecuado para la unión y la subsiguiente polietilenglucosilacion seguido de incubación de las cavidades con el PEG activado de elección. A modo de ejemplo se utiliza M-SPA-5000 de Shearwater Polymers. Es necesario optimizar la relación molar de PEG activado con respecto al polipéptido pero típicamente será mayor que 10:1/ más típicamente mayor que 100:1. Después de un tiempo de reacción adecuado a temperatura ambiente, típicamente de aproximadamente 1 hora, la reacción es detenida por eliminación de la solución de PEG activado. La proteina conjugada se eluye de la placa por incubación con un amortiguador adecuado. Los amortiguadores de elusión adecuados pueden contener imidazol, exceso de NTA u otro compuesto quelante. Se evalúa la actividad biológica e inmunogenicidad de la proteína conjugada según corresponda. La marca se puede eliminar, optativamente, por disociación utilizando un método conocido en la técnica, por ejemplo, con diaminopeptidasa y el residuo Gln en pos -1 será convertido en piroglutamilo con GCT (glutamilciclotransferasa) y finalmente se cliva con PGAP (pi o-glutamil-aminopeptidasa ) , con lo cual se obtiene la proteína nativa. El proceso comprende varios pasos de cromatografía de afinidad con quelatos metálicos. Como alternativa, se puede conjugar el polipéptido marcado. Folietilenglucosilación de un polipéptido que presenta actividad hG-CSF y que tiene un sitio de unión-receptor bloqueado Con el fin de optimizar la polietilenglucosilación del hG-CSF de una manera que excluya la polietilenglucosilación de las lisinas involucradas en el reconocimiento del receptor, se desarrolló el siguiente método: El hG-CSF purificado se obtiene como se describe en el ejemplo 3. Se forma un complejo homodimérico que consiste de un polipéptido hG-CSF y el dominio soluble del receptor de G-CSF con una relación estequiométrica de 2:2 en amortiguador PBS a un pH de 7. la concentración del polipéptido hG-CSF es de aproximadamente 20 µ9/p?1 o 1 µ? y el receptor está presente a una concentración equimolar. Se agregó M-SPA-5000 de Shearwater Polymers, Inc., a 3 niveles de concentración diferentes correspondientes a un exceso molar de polipéptido hG-CSF de 5, 20 y 100. El tiempo de reacción fue de 30 minutos a temperatura ambiente. Después de un periodo de reacción de 30 minutos, se ajustó el pH de la mezcla de reacción en pH 2,0 y la mezcla de reacción se aplicó a una columna Vydac C18 y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo esencialmente como está descrito en la literatura (Utsumi et al., J. Biochem., Vol. 101, páginas 1199 a 1208, (1987)) . Como alternativa, se puede emplear un gradiente de isopropanol. Se analizaron las fracciones usando el ensayo de análisis primario que se describe en este documento y el polipéptido hG-CSF polietilenglucosilado activo por este método se guardó a -80°C en PBS, pH 7, que contenia 1 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA) .
Métodos usados para caracterizar el hG-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo Determinación del tamaño molecular del hG-CSF y de las variantes del mismo El peso molecular de hG-CSF conjugado o no conjugado o variantes del mismo se determinó mediante SDS-PAGE, filtración por gel, espectrometría de masa por desorción con láser asistido por una matriz o centrifugación de equilibrio . Determinación de la concentración del polipéptido La concentración de un polipéptido se puede medir usando mediciones de densidad óptica a 280 nm, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) u otras técnicas de inmunodeteccion semejantes bien conocidas en la técnica. Además, se puede medir la concentración del polipéptido en una muestra con el instrumento Biacore® utilizando un chip Biacore® recubierto con un anticuerpo especifico para el pol ipéptido . Tal anticuerpo puede ser acoplado en forma covalente al Biacore® mediante diversas estrategias químicas. Como alternativa, se puede ligar el anticuerpo de forma no covalente, por ejemplo, por medio de un anticuerpo específico para la porción Fe del anticuerpo anti-polipéptido. El anticuerpo específico de Fe se acopla primero de forma covalente con el chip . Luego se hace fluir el anticuerpo anti-polipéptido sobre el chip y éste es ligado por el primer anticuerpo de una manera dirigida. Aún más, se pueden inmovilizar anticuerpos biotinilados usando una superficie cubierta con estreptavidina (por ejemplo, Biacore Sensor Chip SA®) (Real-Time Análisis of Biomolecular Interactions , Nagata y Handa (Eds.), 2000, Springer Verlag, Tokio, Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB) . Cuando la muestra se hace fluir sobre el chip, el polipéptido se unirá al anticuerpo recubierto y se puede medir el incremento en la masa. El uso de una preparación de polipéptido a una concentración conocida permite definir una curva estándar y a continuación se puede determinar la concentración del polipéptido presente en la muestra. Después de cada inyección de muestra, se regenera el chip sensor con un eluyente adecuado (por ejemplo, un amortiguador de pH bajo) que elimine el material para análisis ligado. En general, los anticuerpos aplicados son anticuerpos monoclonales generados contra el polipéptido de tipo natural. La introducción de mutaciones u otras manipulaciones del polipéptido de tipo natural ( glicolaciones adicionales o conjugaciones con polímeros) puede alterar el reconocimiento por parte de dichos anticuerpos. Además, las manipulaciones que originan un polipéptido de mayor peso molecular darán como resultado un aumento en la señal de resonancia del plasmón. Como consecuencia, es necesario definir una curva estándar para cada molécula a evaluar. Métodos usados para determinar la actividad in vi tro e n vivo del hG-CSF conjugado y no conjugado y de las variantes del mismo Ensayo primarlo 1: Prueba de actividad G-CSF in vitro La proliferación de la línea de célullas de múridos NFS-60 (obtenida del Dr. J. Ihle, St Jude Childen' s Research Hospital, Tennessee, E.U.A.) depende de la presencia de G-CSF activo en el medio de cultivo. Por consiguiente, se puede determinar la actividad biológica in vitro del hG-CSF y de las variantes del mismo midiendo la cantidad de células NFS-60 en división después de la adición de una muestra de G-CSF al medio de cultivo, seguido de incubación sobre un período de tiempo fijo. Las células NFS-60 se mantuvieron en medio DME Iscoves que contenía FBS 10% p/p (suero de bovino fetal), Pen/Strep 1% p/p, 10 µg por litro de hG-CSF y Glutamax 2 inM . Antes de agregar la muestra, las células se lavaron dos veces con medio de crecimiento sin hG-CSF y se diluyeron hasta una concentración de 2,2 x 105 células por mi. Se agregaron 100 µ? de suspensión de células a cada cavidad de una placa para micro-titulación de 96 cavidades ( Corning ) . Las muestras que contenían el G-CSF conjugado o no conjugado o variantes del mismo se diluyeron hasta concentraciones entre 1,1 x 10"6 M y 1,1 x 10"13 M en el medio de crecimiento. Se agregaron 10 µ? de cada muestra a 3 cavidades que contenían células NFS-60. Se agregó un control que consistía de 10 µ? de medio de crecimiento de mamífero a 8 cavidades de cada placa para mi crotitulación . Las células se incubaron durante 48 horas (37°C, C02 5%) y se cuantificó la cantidad de células en división en cada cavidad usando el agente de proliferación celular WST-1 (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania). Se agregaron 0,01 mi de WST-1 a las cavidades, seguido de incubación durante 150 mm a 37°C bajo atmósfera de aire con C02 al 5%. La disociación de la sal tetrazolio de WST-1 por deshidrogenasas mitocondriales en células viables dio como resultado la formación de formazán, que se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm. De esta manera, se cuantificó la cantidad de células viables en cada cavidad. Sobre la base de estas mediciones, se calcularon las curvas de dosis-respuesta para cada molécula de G-CSF conjugado y no conjugado, o variantes del mismo, después de lo cual se pudo determinar el valor EC50 para cada molécula. Este valor es igual a la cantidad de proteína tipo G-CSF activa necesaria para obtener un 50% de la actividad de proliferación máxima del G-CSF humano no conjugado. Por consiguiente, el valor EC50 constituye una medición directa de la actividad in vitro de una proteína determinada . Ensayo primario 2 - Prueba de actividad G-CSF in vitro Se transfectó la línea de células hematopoyéticas BaF3 de múridos con un plásmido portador del receptor G-CSF humano y el promotor del amortiguador de la transcripción, fos, enfrentado con el gen informante luciferasa. Después de estimular dicha línea celular con una muestra de G-CSF, una cantidad de reacciones intracelulares condujeron a la estimulación de la expresión de .fos y, en consecuencia, a la expresión de luciferasa. Esta estimulación se monitoreó con el Sistema para Ensayo con Luciferasa Steady-Glo™ (Promega, No. Cat E2510) por el cual se puede cuantificar la actividad in vitro de la muestra de G-CSF. Las células BaF3 /hG-CSF-R/pfos-lux se mantuvieron a 37°C en atmósfera humedecida CO2 al 5% en medio de cultivo completo (RPMI-1640/HEPES (Gibco/BRL. No. Cat 22400), FBS al 10% (Hyclone, caracterizado), penicilina/estreptomicina lx (Gibco/BRL, No. Cat 15140-122), L-glutamina lx (Gibco/BRL, No. Cat 25030-081), medio acondicionado WEHI-3 al 10% (fuente de muIL-3) y se dejó que crecieran hasta una densidad de 5 x 105 células/ml (confluencia) . Las células se volvieron a sembrar a razón de 2 ? 104 células/ml aproximadamente cada 2-3 días. Un día antes del ensayo, las células en fase logarítmica se volvieron a suspender a razón de 2 x 105 células/ml en medio de arresto (D EM/F-12 (Gibco/BRL No. Cat. 11039), BSA 1% (Sigma, No. Cat . A3675) penicilina/estreptomicina lx (Gibco/BRL, No. Cat. 15140-122), L-glutamina lx (Gibca/BRL, No. Cat. 25030-081), medio acondicionado WEHI-3 0,1%) y se arrestaron durante 20 horas. Las células se lavaron dos veces con PDS y se evaluó su viabilidad usando coloración de viabilidad Trypan Blue. Las células se volvieron a suspender en el medio de prueba (RPMI-1640 (libre de rojo fenol, Gibco/BRL, No. Cat. 11835), HEPES 25 mM, BSA 1% (Sigma No. Cat. A3675), penicilina/estreptomicina lx (Gibco/BRL, No. Cat. 15140-122), L-glutamina lx (Gibco/BRL, No. Cat. 25030-081) a razón de 4 x 106 células/ml, y se agregaron alícuotas de 50 µ? a cada cavidad de una placa para microtitulacion de 96 cavidades (Corning) . Las muestras que contenían el G-CSF conjugado o no conjugado, o variantes del mismo, se diluyerona hasta concentraciones de entre 1,1 x 10~7 M y 1,1 x 10~12 M en el medio de prueba. Se agregaron 50 µ? de cada muestra a 3 cavidades que contenían células BaF3/hG-CSF-F/pfos-lux . Se agregó un control negativo que consistía de 50 µ? de medio a 8 cavidades de cada placa para microtitulación . Las placas se mezclaron suavemente y se incubaron durante 2 horas a 37°C. La actividad luciferasa se midió utilizando el protocolo de Promega SEADI-Glo™, No. Cat. E2510). Se agregaron 100 µ? de sustrato por cavidad seguido de mezclado suave. La luminiscencia se midió con un luminómetro TopCount (Packard) en modalidad SPC (recuento individual de fotones). Sobre la base de estas mediciones, se calcularon las curvas de dosis-respuesta para cada molécula de G-CSF conjugado y no conjugado, o variantes del mismo, después de lo cual se puede determinar el valor EC50 para cada molécula. Ensayo secundario: afinidad de unión del G-CSF, o variantes del mismo, por el receptor de hG-CSF La unión de rhG-CSF, o variantes del mismo, con el receptor de hG-CSF se estudió utilizando ensayos de unión estándar. Los receptores pueden ser dominios de receptores extracelulares purificados, receptores unidos a membranas plasmáticas purificadas o células completas, siendo las fuentes celulares líneas celulares que expresan a los receptores G-CSF de forma inherente (por ejemplo, NFS-60) o células transíectadas con ADNc codificadores de los receptores. La capacidad del rhG-CSF, o variantes del mismo, para competir por los sitios de unión con el G-CSF nativo se analizó por incubación con un análogo marcado del G-CSF, por ejemplo, hG-CSF biotinilado o hG-CSF marcado con yodo radioactivo. Un ejemplo de dicho ensayo fue descrito por Yamasaki et al. (Drugs. Exptl. Clin. Res. 24: páginas 191 a 196 (1998) ) . Los dominios extracelulares del receptor hG-CSF se pueden acoplar optati amente con Fe e inmovilizar en placas de 96 cavidades. A continuación se agrega el rhG-CSF, o variantes del mismo, y se detecta la unión de los mismos usando, ya sea anticuerpos anti-hG-CSF o hG-CSF biotinilado o marcado con yodo radioactivo. Medición de la vida media in vivo del rhG-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo Un aspecto importante de la presente invención es la vida media biológica prolongada que se obtiene con la construcción de un hG-CSF con o sin conjugación del polipéptido con la porción polimérica. Determinada la disminución rápida de las concentraciones séricas de hG-CSF se ha vuelto importante evaluar las respuestas biológicas al tratamiento con un hG-CSF conjugado y no conjugado, y variantes del mismo de la presente invención han prolongado la vida media en suero también después de una administración i.v., permitiendo la medición, por ejemplo, con un método de ELISA o con el ensayo de análisis primario. La medición de la vida media biológica in vivo se llevó a cabo como se describirá más adelante. Se utilizaron ratas Sprague Dawley de sexo masculino (de 7 semanas) . El día de la administración, se registraron los pesos de los animales (280-310 gramos por animal) . Se inyectaron 100 µ9 por kg de peso corporal de muestras de hG-CSF no conjugado y conjugado por vía intravenosa en la vena de la cola de tres ratas. Al cabo de 1 minuto, 30 minutos, 1, 2, 4, 6 y 24 horas después de la inyección, se extrajeron 500 µ? de sangre de los ojos de cada rata, que estaban bajo anestesia con C02. Las muestras de sangre se guardaron a temperatura ambiente durante 1 ½ horas seguido de aislamiento del suero por centrifugación (4°C, 18000 xg durante 5 minutos) . Las muestras de suero se guardaron a -80°C hasta el día del análisis. Se cuantificó la cantidad de G-CSF activo en las muestras de suero con los ensayos de actividad G-CSF in vitro (véanse los ensayos primarios 1 y 2) después de descongelar las muestras sobre hielo. Otro ejemplo de ensayo para la medición de la vida media in vivo del G-CSF, o variantes del mismo, se describe en la Patente Norteamericana No. 5.824.778, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia.
Medición de la actividad biológica in vivo del hG-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo La medición de los efectos biológicos in vivo del hG-CSF en ratas SPF Sprague Dawley (adquiridos de M & B A/S, Dinamarca) se utiliza para evaluar la eficacia biológica del G-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo. El dia de llegada, las ratas se agruparon de manera aleatoria en grupos de 6. Los animales se aclimataron sobre un periodo de 7 días, durante cuyo transcurso se rechazaron los individuos en pobre estado o con pesos extremos. El rango de peso de las ratas en el momento de comenzar el periodo de aclimatación fue de entre 250-270g.
El dia de la administración, las ratas ayunaron durante 16 horas seguido de inyección subcutánea de 100 µg por kg de peso corporal de hG-CSF o una variante del mismo. Cada muestra de hG-CSF se inyectó en un grupo de 6 ratas randomi zadas . Se extrajeron 300 µ? de muestras de sangre estabilizada con EDTA de la vena de la cola de las ratas antes de aplicar la dosificación y 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 y 144 horas después de la dosificación. Se analizaron los siguientes parámetros hematológi eos en las muestras de sangre: hemoglobina, recuento de glóbulos rojos, hematocrito, volumen celular medio, concentración media de hemoglobina celular, hemoglobina celular media, recuento de glóbulos objetivos, recuento diferencial de leucocitos (neutrófilos , linfocitos, eosinófilos, basófilos, monocitos) . Se evaluó la eficacia biológica del hG-CSF conjugado y no conjugado, y variantes del mismo, sobre la base de estas mediciones. Otros ejemplos de ensayos para medir la actividad biológica in vivo del hG-CSF, o variantes del mismo, se describen en la Patente Norteamericana No. 5.681.720, Patente Norteamericana No. 5.795.968, Patente Norteamericana No. 5.824.778, Patente Norteamericana No. 5.985.265 y en la publicación de Bown et al., Experimental Hematology 27: páginas 425 a 432 (1999). Determinación de Ja afinidad de unión del polipéptido-receptor (velocidad de asociación y disociación) La fuerza de la unión entre un receptor y su ligando se puede medir usando un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) u otra de tales técnicas de inmunodetección bien conocidas en la técnica. También se puede medir la interacción de la unión ligando-receptor con el instrumento Biacore®, que emplea detección por resonancia del plasmón (Zhou et al., Biochemistry , 1993, 32, páginas 8193 a 8198; Faegerstram y O'Shannessy, 1993, en Handbook of Chromatography Affinity, páginas 229 a 252, arcel Dekker, Inc., N.Y.).
La tecnología Biacore® permite unir el receptor a una superfice de oro y dejar fluir al ligando sobre la misma. La detección por resonancia de plasmón permite obtener una cuanti ficación directa de la cantidad de masa unida a la superficie en tiempo real. Esta técnica da como resultado las constantes de la velocidad de asociación disociación y, por consiguiente, se pueden determinar directamente la constante de disociación ligando-receptor y la constante de afinidad. Prueba de inmunogenicidad in vitro de los conjugados hG-CSF La inmunogenicidad reducida de un conjugado de la presente invención se puede determinar usando un método ELISA midiendo la inmunoreactividad del conjugado con relación a una molécula o preparación de referencia. La molécula o preparación de referencia es habitualmente una preparación de G-CSF humano recombinante, tal como Neupogen® u otra preparación de G-CSF humano recombinante, por ejemplo, una molécula de rhG-CSF polietilenglucosilada en el extremo N-terminal, como se describe en la Patente Norteamericana No. 5.824.784. El método de ELISA se basa en anticuerpos de pacientes tratados con una de estas preparaciones de G-CSF recombinante. Se considera que la inmunogenicidad está reducida cuando el conjugado de la presente invención presenta una respuesta estadísticamente significativa menor en el ensayo que la molécula o preparación de referencia. Neutralización de la actividad en un bioensayo G-CSF La neutralización de los conjugados hG-CSF por sueros anti-G-CSF se analiza usando el bioensayo G-CSF descrito anteriormente. Se utilizan sueros de pacientes tratados con la molécula de G-CSF de referencia o de animales inmunizados. Los sueros se agregan ya sea a una concentración fija (dilución 1:20-1:500 (sueros de pacientes) ó 20-1000 ng/ml (sueros de animales) ) o en diluciones seriadas al quinto comenzando con 1:20 (suero de pacientes) o 1000 ng/ml (suero de animales) . El conjugado hG-CSF se agrega ya sea en diluciones al séptimo comenzando con 10 nM o a una concentración fija (1-100 pM) en un volumen total de 80 µ? de medio DMEM + FCS al 10%. Los sueros se incuban durante 1 hora a 37°C con el hG-CSF conjugado. A continuación, las muestras (0,01 mi) se transfieren a placas para cultivo de tejido de 96 cavidades que contienen células NFS-60 en 0,1 mi de medio DMEM. Los cultivos se incuban durante 48 horas a 37°C en atmósfera con C02 al 5%. Se agrega 0,01 mi de WST-1 (agente de proliferación celular WST-1, Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania) a los cultivos y se incuban durante 150 min a 37°C en atmósfera con CO2 al 5%. La disociación de la sal tetrazolio de WST-1 por deshidrogenasas mitocondriales en células viables da como resultado la formación de formazán, que se cuantifica midiendo la absorbencia a 450 nm. Cuando las muestras de hG-CSF conjugado se titulan en presencia de una cantidad fija de suero, el efecto neutralizante se define con la magnitud de inhibición (FI) cuantificada como EC50 (con suero) /EC50 (sin suero) . La reducción en la neutralización de anticuerpos de las variantes de proteínas G-CSF se define de la siguiente manera : (Variante FI-1) (1 ) x 100% (peso FI-1) EJEMPLO 1 Construcción y clonación de genes sintéticos codificadores de hG-CSF Los siguientes fragmentos de ADN se sintetizaron utilizando el procedimiento general descrito por Stemmer et al. (1995), Gene 164, páginas 49 a 53. Fragmento 1, consistía de un sitio de digestión Bam HI, una secuencia codificadora de un péptido señal YAP3 (WO 98/32867), una secuencia codificadora de la secuencia directriz TA57 (WO 98/32867), una secuencia codificadora de un sitio de reconocimiento de proteasa EX2 (AAAAGA) , una secuencia codificadora del hG-CSF con la utilización de codones optimizada para la expresión en E. col!, (SEQ ID NO. 2) y un sitio de digestión Xba I. Fragmento 2, consistía de un sitio de digestión Bam HI, una secuencia codificadora del péptido señal YAP3 (WO 98/32867), una secuencia codificadora de la secuencia directriz ??57 (documento WO 98/32867), una secuencia codificadora de una marca de histidina (SEQ ID NO. 5), una secuencia codificadora de un sitio de reconocimiento de proteasa KEX2 (AAAAGA) , una secuencia codificadora del hG-CSF con la utilización de codones optimizada para la expresión en E. coli, (SEQ ID NO. 2) y un sitio de digestión Xba. I. Fragmento 3, consistía de un sitio de digestión Nde 1, una secuencia codificadora del péptido señal OMPA (SEQ ID NO. 3), una secuencia codificadora del hG-CSF con la utilización de codones optimizada para la expresión en E. coli, (SEQ ID NO. 2) y un sitio de digestión Bam HI. Fragmento 4, consistía de un sitio de digestión Bam HI, la secuencia consenso Kozak (Kozac, M. J. Mol. Biol. Ago 1987, 20: 196(4) páginas 947 a 950), una secuencia codificadora del péptido de señal hG-CSF (SEQ ID NO. 7) y el hG-CSF con la utilización de codones optimizada para la expresión en células CHO, (SEQ ID NO. 8) y un sitio de digestión Xba I.
Los fragmentos de ADN 1 y 2 se insertaron en los sitios de digestión Bam HI y Xva I en el plásmido pJS037 (Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782: páginas 202 a 207, 1996) utilizando técnicas de ADN estándar. Esto dio como resultado los plásmidos pG-CSFcerevisiae y pHISG-CSFcereviasiae . El fragmento de ADN 3, se insertó en los sitios de digestión Nde I y Bam HI en el plásmido pET12a (Invitrogen) utilizando técnicas de ADN estándar. Esto dio como resultado el plásmido pG-CSFcoli. El fragmento de ADN 4, se insertó en los sitios de digestión Bam HI y Xba I en el plásmido pcDNA3.1(+) (Invitrogen) utilizando técnicas de ADN estándar. Esto dio como resultado el plásmido pG-CSFCHO. EJEMPLO 2 Expresión de hG-CSF en Saccharomyces cerevisiae y E. coli La transformación de S. cerevisiae YNG318 (disponible de la American Type Culture Collection, VA, E.U.A. con la denominación ATCC 208973) con los plásmidos pG-CSFcerevisiae o pHISG-CSFcereviasiae, el asilamiento de los transformantes que contenían cualquiera de los dos plásmidos y la subsiguiente expresión extracelular del hG-CSF sin o con la marca HIS, respectivamente, se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar descritas en la literatura. La transformación de E . coli BL21 (DE3) (Novagen, No. Cat. 69387-3) con pG-CSFcoli, el aislamiento de los transformantes que contenían al plásmido y la subsiguiente expresión del hG-CSF en el sobrenadante y en el periplasma de la célula se llevó a cabo como se describe en el Manual del pET system (8a edición) de Novagen . La expresión del hG-CSF por S. cerevisiae y E. coli se verificó mediante análisis de transferencia Western usando el juego de coloración immunoPure Ultra-Sensitive ABC Rabbit IgG (Pierce) y un anticuerpo policlonal contra el hG-CSF (Pepro Tech EC LTD) . Se observó que la proteina era del tamaño correcto. Se cuantificaron los niveles de expresión del hG-CSF con y sin la marca de histidina N-terminal en S. cerevisiae y E. coli utilizando un juego para ELISA específico de G-CSF disponible comercialmente (Quantikine G-CSF humano Immunoassay, R&D Systems No. Cat. DCS50). Los valores medidos se muestran a continuación. hG-CSF en E. coli 0.05 EJEMPLO 3 Purificación del hG-CSF, y variantes del mismo, a partir de sobrenadantes de cultivos de S. cerevisiae Las células se separaron por centrifugación. El sobrenadante libre de células se filtra con esterilización a través de un filtro de 0,22 µp?. El sobrenadante filtrado estéril se diluyó 5 veces en acetato de sodio 10 mM pH 4,5. El valor del pH se ajustó por adición de 10 mi de ácido acético concentrado por cada 5 litros de sobrenadante diluido. La fuerza iónica debe ser menor que 8mS/cm antes de la aplicación a la columna de intercambio de cationes. El sobrenadante diluido se cargó a una velocidad de flujo lineal de 90 cm/h sobre una columna de SP-sepharose FF (Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 50 mM, pH de 4,5, hasta que el efluente de la columna había alcanzado una línea basal de conductividad y UV estables. Para eliminar todo el material no unido, la columna se lavó usando el amortiguador de equilibrio hasta que el efluente de la columna alcanzó un nivel estable con respecto a la absorbancia UV y la conductividad. La proteína G-CSF unida se eluyó de la columna usando un gradiente lineal; 30 volúmenes de columna; 0-80% de amortiguador B (NaAc 50 mM, pH 4,5, NaCl 750 mM) a una velocidad de flujo de 45 cm/h. Las fracciones que contenían G-CSF se agruparon sobre la base de una electroforesi s sobre gel de SDS-poliacrilamida . Se agregó cloruro de sodio (s) hasta que la fuerza iónica de la solución era mayor que 80mS/cm. La solución con la proteína se aplicó sobre una columna Phenyl Toyo Pearl 650S equilibrada con NaAc 50 mM, pH 4.5, NaCI 750 mM . Todo el material no unido se eliminó por lavado de la columna usando el amortiguador de equilibrio. La elusión del G-CSF se llevó a cabo por aplicación de un gradiente de pasos que consiste de agua milliQ. Se agruparon las fracciones que contenían G-CSF. Con el uso de esta estrategia de procesamiento de 2 pasos descendentes, se obtuvo un G-CSF con más de un 90% de pureza. La proteína purificada se cuantificó después usando mediciones espectrofotométricas a 280 ni y/o mediante análisis de aminoácidos. Se agruparon las fracciones que contenían al G-CSF. La concentración y el cambio de amortiguador se llevaron a cabo usando concentradores VivaSpin (mwco: 5 kDa) EJEMPLO 4 Identificación y cuantificación del hG-CSF no conjugado y conjugado y variantes del mismo Electro oresis sobre el de SDS-poliacrilamida El G-CSF purificado, concentrado se analizó por SDS-PAGE . Se observó una sola banda dominante con un peso molecular aparente de aproximadamente 17 KDa. Absorbancia Se obtuvo una estimación de la concentración del G-CSF mediante métodos espectrofotométricos . La concentración de la proteina se pudo calcular por medición de la absorbancia' a 280 ni y usando un coeficiente de extinción teórico de 0.83. Análisis de aminoácidos Se obtuvo una determinación más precisa de la proteina mediante el análisis de aminoácidos. Dicho análisis de aminoácidos con un G-CSF purificado reveló que la composición de aminoácidos determinada experimental está de acuerdo con la composición esperada de aminoácidos basada en la secuencia de AD . EJEMPLO 5 Espectometrí a de masa MALDO-TOF del G-CSF de tipo natural y variantes del G-CSF polietilenglucosilados . Se ha empleado la espectrometría de masa MALDI-TOF para evaluar la cantidad de grupos PEG unidos al G-CSF de tipo natural polietilenglucosilado y con variantes seleccionadas de G-CSF polietilenglucosilado.
El G-CSF de tipo natural contiene 5 aminas primarias que constituyen los sitios de unión esperados para SPA-PEG ( El grupo amino N-teriainal y el grupo e-amino en K16, K23, K34 y K40). Después de la polietilenglucosilación del G-CSF de tipo natural con SPA-PEG 5000, la espectrometría de masa MALDI-TOF mostró la presencia de especies de G-CSF de tipo natural que contenían principalmente 4, 5 y 6 grupos PEG unidos. Además, se observó claramente un G-CSF de tipo natural con 7 grupos PEG unidos, si bien en cantidades menores. La variante del G-CSF con las sustituciones K16R, K34R y K40R contiene 2 aminas primarias (el grupo amina N-terminal y el grupo e-amina en K23) . Después de la polietilenglucosilación de esta variante del G-CSF con SPA-PEG 12000, la espectrometí de masa MALDI-TOF mostró la presencia de especies de la variante del G-CSF con principalmente 2 y 3 grupos PEG unidos. Además se observó claramente una variante del G-CSF con 4 grupos PEG unidos, si bien en cantidades menores. Estas observaciones muestran claramente que además de los residuos de aminoácidos que contienen grupos amina, a veces hay otros residuos de aminoácidos que son afectados por el PEG bajo las condiciones de polietilenglucosilación empleadas. También muestran que la introducción de grupos amina es de cierta importancia para la polietilenglucosilación . Esto también se ha observado cuando se utiliza análisis por SDS-PAGE del G-CSF de tipo natural y variantes de los G-CSF. Como se describe en el ejemplo 11, se ha demostrado que la Histidina 170 está completamente polietilenglucosilada cuando se emplea química de SPA-PEG. Además, K23 y S159 están parcialmente polietilenglucosiladas . Esto explica la presencia de 1-2 sitios adicionales de polietilenglucosilación además de las aminas primarias en el hG-CSF y las variantes que se obtuvieran . EJEMPLO 6 Mapeo de péptidos de variantes del G-CSF tratados y no polietilenglucosilados Con el fin de tratar de mapear los sitios de unión adicionales para SPA-PEG en el G-CSF y las variantes del G-CSF, se utilizó la siguiente estrategia. Se eligió una variante del G-CSF con una baja cantidad de grupos amina con el fin de reducir la cantidad de sitios para la polietilenglucosilación esperada a un mínimo. La variante del G-CSF elegido tiene las sustituciones K16R, K34R, K40R y H170Q. Aparte del grupo E-amina en K23, que según datos previos no eran demasiado afectado por la polietilenglucosilación, esta variante solamente contenía una amina primaría en el extremo N-terminal. Por consiguiente, el tratamiento basal con PEG de los grupos amina está significativamente reducido en esta variante del G-CSF. La variante del G-CSF era polietilenglucosilada utilizando SPA-PEG 5000. Después de la polietilenglucosilación, se desnaturalizó la variante del G-CSF, se redujeron los enlaces disulfuro, los grupos tiol resultantes eran alquilados y la proteina alquilada y polietilenglucosilada era degradeterminada con una proteasa especifica de ácido glutámico. Finalmente, se separaron los péptidos resultantes por HPLC de fase inversa . En forma paralela a esto, la versión no polietilenglucosilada de la variante del G-CSF con las sustituciones K16R, K34R y K40R se trató de manera idéntica con el fin de crear un cromatograma de HPLC de referencia . La comparación de los cromatogramas de la HPLC de la degradación de la variante del G-CSF polietilenglucosilada y la variante del G-CSF no polietilenglucosilada debería revelar entonces qué péptidos desaparecían después de la polietilenglucosilación. La identificación de estos péptidos por secuencia de los aminoácidos N-terminales del péptido de la variante del G-CSF no polietilenglucosilada indica entonces de forma indirecta las posiciones que fueron polietilenglucosiladas .
En principio, hubiera sido preferible utilizar la versión no polietilenglucosilada de la variante del G-CSF que presenta todas las sustituciones K16R, K34R, K40R y H170Q, pero para efectos prácticos esto no es importante. Con mayor detalle, se secaron aproximadamente 1 mg de la variante del G-CSF polietilenglucosilado con las sustituciones K16R, K34R, K40R y H170Q y aproximadamente 500 µg de la variante del G-CSF no polietilenglucosilado con las susttuciones K16R, K34R, y K40R en un concentrador SpeedVac. Las dos muestras se disolvieron cada una en 400 µ? de guanidinio 6 M, Tris-HCI 0,3 M, pH 8.3, y se desnaturalizaron durante toda la noche a 27°C. Después de la desnatulalización, los enlaces disulfuro en las proteínas fueron reducidos por adición de 50 µ? de DTT 0.1 M en guanidinio 6 M, Tris-HCI 0,3 M, pH 8.3. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los grupos tiol presentes fueron alquilados por adición de 50 µ? de yodoacetamida 0,6 en guanidinio 6 M, Tris-HCI 0,3 M, pH 8.3. La alquilación tuvo lugar durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de cambiar el amortiguador de las proteínas reducidas y alquiladas por NH4HCO3 50 inM usando columnas NAP5. Los volúmenes de las muestras se redujeron hasta aproximadamente 200 µ? en un concentrador SpeedVac antes de la adición de 20 µg y 10 µg de proteasa específica de ácido glutámico, respectivamente. Las degradaciones con proteasa específica de ácido glutámico se llevaron a cabo durante 16 horas a 37°C. Los péptidos resultantes se separaron por HPLC de fase inversa empleando una columna Phenomenex Júpiter Cíe (0.2 * 5 cm) eluída con un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA acuoso 0.1%. .Las fracciones recolectadas se analizaron por espectrometría de masa ALDI-TOF y a continuación los péptidos seleccionados fueron sometidos a análisis de secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal. La comparación de los cromatogramas de HPLC de las degradaciones de la variante del G-CSF polietilenglucosilado y la variante del G-CSF no polietilenglucosilado reveló que solamente dos fracciones desaparecen con la polietilenglucosilación . El análisis de secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de las dos fracciones de la variante del G-CSF no polietilenglucosilado mostró que ambos péptidos derivaban del extremo N-terminal del G-CSF. Uno de los péptidos consistía de los residuos de aminoácidos 1-11 generados por una disociación inesperada después de un Glnll. El otro péptido consistía de los residuos de aminoácidos 1-19 generados por una disociación esperada después del Glul9. Se esperaba poder identificar al péptido N-terminal del G-CSF utilizando este enfoque, ya que el grupo amino N-terminal es fácilmente polietilenglucosilado . Sin embargo, ninguno de los sitios de unión adicionales para SPA-PEG 5000 fueron identificados usando este enfoque. Una alternativa para la identificación indirecta de los sitios de unión de PEG 5000 es la identificación directa de los sitios de unión en los péptidos polietilenglucosilados . Sin embargo, se logra una separación por HPLC de las fracciones que contienen a los péptidos polietilenglucosilados de la variante del G-CSF polietilenglucosilado degradeterminado , tanto entre si como de las diversas fracciones que contienen péptidos no polietilenglucosilados. Por consiguiente, el análisis de secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de estas fracciones no dio como resultado datos que fueran de utilidad, excepto por una indicación que la K23 podía ser parcialmente polieti lenglucosilada . Para superar estos problemas se obtuvieron dos agrupaciones de péptidos polietilenglucosilados a partir de las fracciones de la primera separación por HPLC. Estas dos agrupaciones se secaron en un concentrador SpeedVac. Se disolvieron en 200µ1 de NH4HC03 50 mM recién preparado y se degradaron adicionalmente con 1 µg de quimiotripsina . Los péptidos resultantes se separaron por HPLC de fase inversa empleando una columna Phenomenex Júpiter Ci8 (0.2 * 5Cm) eluída con un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA acuoso 0,1%. Las fracciones recolectadas fueron analizadas mediante espectrometría de masa MALDI-TOF y a continuación los péptidos seleccionados fueron sometidos a análisis de secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal . A partir de las determinaciones de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal se pudo determinar que la K23 asi como la S159 son parcialmente polietilenglucosiladas. No fue posible determinar el grado exacto de polietilenglucosilación en estas dos posiciones, pero la polietilenglucosilación solamente era parcial, determinado que fueron identificados y secuenciados los péptidos de las K23 y S159 a partir de la separación inicial por HPLC. EJEMPLO 7 Glucosilaclón del G-CSF de tipo natural y variantes del G-CSF Una observación persistente al analizar el G-CSF de tipo natural purificado y las variantes del G-CSF por espectrometría de masa MALDI-TOF, es la presencia de un componente adicional con una masa aproximadamente 324 Da mayor que la masa de la molécula G-CSF analizada. Determinado que el componente con la menor masa inva iablemente tiene la masa de la molécula de G-CSF analizada y debido a que las moléculas de G-CSF tienen la secuencia correcta de aminoácidos del extremo N-terminal, es muy probable que el componente adicional sea una molécula G-CSF modificada que lleva a una modificación que consiste de dos residuos hexosa. En muchos casos, la molécula de G-CSF no modificada origina la señal más intensa, pero en algunos casos la intensidad de la señal para la molécula de G-CSF modificada es la más intensa. Durante el análisis de los péptidos generados con la finalidad de identificar los sitios de polietilenglucosilación adicionales, se identificaron dos péptidos de interés para la identificación del sitio de glucosilación en cada una de las degradaciones. En ambas separaciones por HPLC, los dos péptidos se eluyeron uno a continuación del otro y la espectrometría de masa MALDI-TOF muestra una diferencia de masa entre los dos péptidos de aproximadamente 324 Da. Los datos de espectrometría de masa indican que el péptido abarca los residuos de aminoácidos 124 - 1 62 . El análisis de secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de los cuatro péptidos muestra que esta presunción es correcta y que Thrl33 es el único sitio de modificación. En los péptidos que tienen la masa del péptido no modificado, se observa claramente el Thrl33 en la secuencia en tanto no es posible asignar un residuo de aminoácidos en la posición 133 en los péptidos con una masa adicional de 324 Da.
Como se pudo asignar a todos los demás residuos de aminoácidos en la secuencia, el Thrl33 es el único sitio de modificación. Este sitio de glucosilación fue descrito anteriormente para su uso en un G-CSF recombínate expresado en células CHO, si bien el glicano es diferente del que es ligado en levadura. El G-CSF de tipo natural no glucosilado fue separado del G-CSF de tipo natural glucosilado empleando HPLC de fase inversa usando una columna Vidac C18 (0,21 * 5 cm) eluida isocráticamente con acetonitrilo al 51% en TFA al 0,1% como una fracción que según se determinó por espectrometría de masa MALDI-TOF solamente contiene la forma no glicolada del G-CSF de tipo natural . EJEMPLO 8 Separación de moléculas de G-CSF con cantidades diferentes de moléculas PEG unidas de forma covalente La separación de moléculas G-CSF unidas de forma covalente a 4, 5 ó 6 grupos de PEG se obtuvo de la siguiente manera. La proteína polietilenglucos ilada en citrato de sodio 20 mM, pH 2,5 se aplicó a una columna SP-sepharose FF equilibrada con citrato de sodio 20 mM, pH 2,5. Todo el material no ligado se eliminó por lavado de la columna. La elución se llevó a cabo usando un gradiente de pH. El G-CSF polietilenglucosilado comenzó a eluir de la columna aproximadamente a un pH de 3,8 y continuó eluyendo en fracciones que abarcaban un rango de pH de 3,8 a 4,5. Las fracciones fueron sometidas a análisis por SDS-PAGE y espectrometría de masa. Estos análisis indican que el G-CSF que tiene el grado más alto de polietilenglucosilación está ubicado en las "fracciones de pH bajo". El G-CSF polietilenglucosilado que tiene un grado menor de polietilenglucosilación es eluído en las "fracciones de pH más altas". El análisis de aminoácidos llevado a cabo con G-CSF polietilenglucosilado mostró una buena coherencia entre el coeficiente de extinción teórico y el experimental. EJEMPLO 9 Construcción de variantes del hG-CSF Se introdujeron sustituciones específicas de aminoácidos existentes en el hG-CSF por otros residuos de aminoácidos, por ejemplo, las sustituciones específicas descritas anteriormente en la memoria descriptiva, utilizando técnicas de ADN estándar conocidas en la técnica. Las nuevas variantes del G-CSF se elaboraron utilizando el plásmido pG-CSFcerevisiae, que contenía al gen codificador del hG-CSF sin la marca HIS, como templado de ADN en las reacciones de PCR. Las variantes fueron expresadas en S. cerevisiae y purificadas como se describe en el ejemplo 3. Algunas de las variantes construidas del G-CSF se muestran más adelante (véase el ejemplo 9 y 10) . EJEMPLO 10 Unión covalente de SPA-PEG al hG-CSF o a variantes del mismo El G-CSF humano y variantes del mismo fueron ligados de forma covalente a SPA-PEG 5000, SPA-PEG 12000 y SPA-PEG 20000 (Shear ater) como se describió anteriormente ( "pol ietilenglucosilaci ón de hG-CSF y variantes del mismo en solución") . Las actividades in vitro de los conjugados se enumeran en el ejemplo 9. EJEMPLO 11 Identificación de sitios de unión SPA-PEG en el G-CSF por mutagénesis dirigida al sitio seguido de polietilenglucosilación de las variantes purificadas El SPA-PEG se puede unir a otros residuos de aminoácidos que la lisina en el G-CSF. Con el fin de determinar si el SPA-PEG se unía a histidinas, serinas, treoninas y argininas, se elboraron variantes en los cuales estos aminoácidos hablan sido sustituidos por lisina, alanina o glutamina. Las variantes se expresaron en S. cerevisiae se purificaron y fueron polietilenglucosiladas , seguido de análisis de la cantidad de moléculas SPA-PEG unidas por SDS-PAGE. Una reducción en la cantidad de moléculas SPA-PEG unidas después de la sustitución de un aminoácido determinado por glutamina o alanina indica fuertemente que este aminoácido es polietilenglucosilado por SPA-PEG y esta observación es fundamentada además por un grado de polietilenglucosilación sin cambios después de la sustitución del aminoácido por lisina. Las variantes analizadas se muestran a continuación.
H170Q 10% 3 PEG, 75% 4 PEG, 15% 5 PÉG H170K 10% 4 PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG K16/34R 10% 2 PEG, 75% 3 PES, 15% 4 PEG K16/34R R22K 10% 3 PEG, 75% 4 PBG, 15% 5 PEG 16/34R R22Q 10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG 16/34R S142A 10% 2 PEG, 75% 3 PÉG, 15% 4 PEG K16/34/40R 10% 4 PEG, 75% 5 PEG, 15% 6 PEG 16/34/40R S53 10% 2 PEG r 75% 3 PEG, 15% 4 PEG 16/34/40R S53A 10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG 16/34/40RS62K 10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4 PEG K16/34/40R S66K 10% 2 PEG, 75% 3 PEG, 15% 4, PEG K16/34/40R S80 10% 2 PEGc 75% 3 PEG, 15% 4 PEG Los datos muestran que además del extremo N-terminal, K16, K34 y K40, el SPA-PEG, también se une de manera covalente a H170. Aún más, los datos muestran que solamente un 10% de los residuos de aminoácidos K23 disponibles están polietilenglucosilados y que aproximadamente un 10% de S159 está polietilenglucosilado. EJEMPLO 12 Actividad biológica in vitro del hG-CSF no conjugado y conjugado y variantes del mismo Las actividades biológicas in vitzo del hG-CSF conjugado y no conjugado de las variantes del mismo se midieron como se describió anteriormente en "Ensayo primario 2: Ensayo de actividad hG-CSF in vitro" . Los valores del EC50 medidos para cada variante con y sin conjugación de SPA-PEG 5000 con los sitios de polietilenglucosilación disponibles se enumeran a continuación. Los valores se normalizaron con respecto al valor EC50 del hG-CSF no conjugado (Neupogen®). Este valor se midió cada vez y de forma simultánea con las variantes bajo condiciones de ensayo idénticas. El valor EC50 del hG-CSF en el ensayo descrito es de 30 pM .
Variante del G-CSF EC50 (% de hG- EC50 (%. de hG- CSF) no CSF) conjugado •conjugado con SPA-PEG 5000 G-CSF con marca de 10 No determinado histidina N-torminal G-CSF sin marca de 100 0,1 histidina N—'terminal 16R 100 1 16Q 80 1 23Q 80 0,1 2'3R 100 0,1 34R 100 1 34a 80. 1 34Q 70 1 40R 50 1 16/23R 100 1 K16/23Q 80 1 34/40R 50 5 K16/34R 100 10 K16/40R 50 5 K16/23/34R 50 10 K16/23/40R 50 5 K16/34/40R 35 30 16/23/34/40R 20 15 16/34/40R E45 Expresado a No determinado niveles bajos K16/34/40R E46 10 1 16/34/40R S53K 5 0.5 K16/34 40R S62K 10 .0.5 K16/34/40R S66K ¦20 2 K16/34/40R Q67K 10 0.2 K16/34/40R Q70K 30 20 K16/34/40R S80K 10 .0.2 K16/34/ 0R Q120K 10 1 T133K S142 Los datos muestran que la sustitución K23 por arginina no incrementa la actividad de la proteina conjugada. Esto se debe al hecho que solamente un 10% de K23 está polietilenglucosilada , por lo cual, la variante K23R conjugada tiene la misma cantidad de grupos PEG unidos a él y los sitios de polietilenglucosilación tienen la misma ubicación que en el hG-CSF. La eliminación de las Usinas restantes en la posición K16, K34 y 40 dio como resultado una variante del G-CSF con una actividad significativa después de la polietilenglucosilación. La conjugación de SPA-PEG 5000 con esta variante no disminuye la actividad de forma significativa en comparación con la variante no conjugada. Por consiguiente, la polietilenglucosilación del extremo N-terminal y H170 con SPA-PEG 5000 no disminuye la actividad del hG-CSF. Se decidió emplear hG-CSF K16R K34R K40R como estructura básica para la inserción de nuevos sitios de polietilenglucosilación. Se introdujeron 21 sitios nuevos de polietilenglucosilación entre los residuos E45 y H159 en esta estructura básica. Los residuos están distribuidos en toda la parte del hG-CSF que no interacúa con el receptor del G-CSF. La introducción de nuevos sitios de polietilenglucosilación en las posiciones Q70, Q90, T105, Q120, T133 y S142 dio como resultado variantes del hG-CSF que retenían una cantidad significativa de actividad después de la polietilenglucosilación con SPA-PEG 5000. Por lo tanto, se combinaron estos nuevos sitios de polietilenglucosilación en las variantes del G-CSF que tenía 2 ó 3 nuevos sitios de polietilenglucosilación. La más activa de estas variantes después de la polietilenglucosilación con SPA-PEG 5000 fueron hG-CSF K15R K40R Q70K Q120K y hG-CSF 16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K. Aún más, los compuestos SPA-PEG 5000, SPA-PEG 12000 y SPA-PEG 20000 se unieron al hG-CSF K16R K34R K40R. Los valores EC50 in vitro eran del 35%, 10% y 1%, respectivamente, con relación al hG-CSF no conjugado (Neupogen®) . EJEMPLO 13 Vida medía in vivo del hG-CSF no conjugado y conjugado y variantes del mismo La vida media in vivo del hG-CSF no conjugado (Neupogen®) y del hG-CSF K16R, 34R, K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 se midieron como se describió anteriormente ("Medición de la vida media in vivo del rhG-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo") . Los resultados se muestran en la figura 1. Se determinó que la vida media in vivo de Neupogen® y del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 era de 2,01 horas y 12,15 horas, respectivamente. Por consiguiente, la introducción de nuevos sitios de polietilenglucosilación en el hG-CSF y la conjugación con SPA-PEG 5000 en los mismos, dio como resultado un incremento significativo en la vida media in vivo. En un experimento anterior, se comparó la vida media in vivo de Neupogen® con un hG-CSF que presentaba una molécula PEG conjugada en el extremo N-terminal más grande (Patente Norteamericana No. 5.824.778) . En este caso, se determinó que los valores de vida media in vivo eran de 1,75 horas y de 7,01 horas, respectivamente. Por consiguiente, el hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 tiene una vida media significativamente más larga que Neupogen® y el hG-CSF con una molécula PEG conjugada en el extremo N-terminal. EJEMPLO 14 Actividad biológica in vivo del hG-CSF no conjugado y conjugado y variantes del mismo Las actividades biológicas in vivo del hG-CSF no conjugado (Neupogen®), del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 y del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 se midieron como se describió anteriormente ("Medición de la actividad biológica in vivo del hG-CSF conjugado y no conjugado y variantes del mismo") . Los resultados se muestran en la figura 2. No se pudo detectar actividad de Neupogen® transcurridas 48 horas después de la inyección de 100 µg por kg peso corporal a t = 0 horas. La actividad del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 se pudo detectar hasta 72 horas después de la inyección inicial, en tanto el hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 permaneció activo in vivo hasta 96 horas después de la inyección inicial. Por consiguiente, se demostró que ambas variantes conjugadas tenían una actividad biológica in vivo más prolongada que Neupogen® y que el hG-CSF K16R K34R 40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 permaneció activo por el doble de tiempo in vivo que Neupogen® . Además, se midieron las actividades biológicas in vivo de Neupogen®, del hG-CSF K16R K34R K40R conjugado con SPA-PEG 12000 y de diferentes dosis del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120 conjugado con SPA-PEG 5000. Los resultados se muestran en la figura 3. como se observó anteriormente, no se pudo detectar actividad alguna de Neupogen® una vez transcurridas 48 horas después de la inyección inicial de 100 µg por kg peso corporal. La administración de 5 µg por kg peso corporal del hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000 dio como resultado una actividad biológica in vivo ligeramente más prolongada que con Neupogen®, en tanto la administración de 25 g por kg peso corporal y 100 µg por kg peso corporal del compuesto dio como resultado una actividad del hG-CSF de hasta 72 y 96 horas, respectivamente, después de la inyección inicial. El hG-CSF K16R K34R K40R conjugado con SPA-PEG 12000 permaneció activo in vivo hasta 72 horas después de la administración de 100 µg por kg de peso corporal. Como se describe en el ejemplo 5, el hG-CSF K16R K34R K40R conjugado con SPA-PEG 12000 tiene 2 y 3 grupos SPA-PEG 12000 unidos, en tanto el hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000, tiene 5 y 6 grupos SPA-PEG 5000 unidos. Por consiguiente, los pesos moleculares de los dos compuestos son de 42-54 kDa y 43-48 kDa, respectivamente. La mayor actividad biológica in vivo del hG-CSF K16R K34R K40R Q70 Q90K Q120 conjugado con SPA-PEG 5000 en comparación con la del hG-CSF K16R K34R K40R conjugado con SPA-PEG 12000 muestra que la ubicación de las moléculas de PEG unidas es importante para la duración de la actividad biológica in vivo .
Listado de secuencias <110> Maxygen ApS <120> Conjugados G-CSF <130> 8wo02 <150> DK PA 2000 00024 <151> 2000-01-10 <150> DK PA 2000 00341 <151> 2000-03-02 <150> DK PA 2000 00943 <151> 2000-06-16 <160> <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys lie Gln Gly Asp Glv Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly lie Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr lie Trp Gln Gln Met Glu Glu Elu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 525 <112> ADN <213> construcción sintética <400> 2 acccctctgg gcccggccag cagtctgcct cagagttttt tactgaaatg cttagaacag 60 gtgcgtaaaa tccagggcga tggcgcggcc ctgcaggaaa aactgtgcgc gacctataaa 120 ctgtgccatc ctgaagaact ggtcctgtta ggccatagct taggcatccc gtgggcgcct 180 ctgagtagct gcccgagtca ggccctgcag ctggccggct gcctgagtca gttacatagt 240 ggcttatttt tatatcaggg cttactgcag gcgttagaag gcattagtcc ggaactgggc 300 ccgaccctgg ataccttaca gttagatgtc gcggattttg ccaccaccat ttggcagcag 360 atggaagaat taggcatggc gcctgcgtta cagcctaccc agggcgccat gcctgcgttt 420 gcgagtgcgt ttcagcgtcg cgccggcggc gtgttagtgg ccagccatct gcagagcttt 480 ctggaagtga gttatcgtgt gttacgccat ctggcccagc cttaa 525 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Lys Lys Thr Ala lie Ala lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr VI Ala Gln Ala 20 <210> 4 <211> 63 <212> ADN <213> construcción sintética <400> 4 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggct gtttcgctac cgtagcgcag 60 gcc 63 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> construcción sintética <400> 5 Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> construcción sintética <400> 6 atgaaacacc aacaccaaca tcaacatcaa catcaacatc aacag 45 <210> 7 <211> 30 <212> P T <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 615 <212> ADN <213> construcción sintética <400> 8 atggccggcc ctgccacaca gtcccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60 cactccgccc tgtggacagt gcaggaggcc acccctctgg gccccgccag ctccctgcct 120 cagtccttcc tgctgaagtg cctggagcag gtgagaaaga tccagggcga cggcgccgcc 180 ctgcaggaga agctgtgcgc cacatacaag ctgtgccacc ctgaggagct ggtgctgctg 240 ggccacagcc tgggcatccc ctgggcccct ctgtccagct gcccctccca ggccctgcag 300 ctggccggct gcctgtccca gctgcactcc ggcctgttcc tgtaccaggg cctgctgcag 360 gccctggagg gcatctcccc ggagctgggc cccacactgg ataccctgca gctggacgtg 420 gccgatttcg ccaccacaat ctggcagcag atggaggagc tgggcatggc ccctgccctg 480 cagcctaccc agggcgccat gcctgccttt gcctccgcct ttcagagacg ggccggcggc 540 gtgctggtgg ccagccacct gcagagcttt ctggaggtgt cctacagagt gctgcggcac 600 ctggcccagc cttg 615

Claims (35)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido conjugado, en dondecomprende : i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10 , Q11K, S12K, F13K,
  2. L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E46K, V48K, L49K, L50 , H52K, S53K, L54K, I56K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105 , Q107 , L108K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K y P174K, y ii) por la menos una porción no polipeptídica unida a un residuo lisina del polipéptido. 2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos K16, K23, ?34 y ?40 de la SEQ ID No. 1, ha sido suprimido o sustituido por otro residuo de aminoácidos .
  3. 3. El conjugado de conformidad con la reivindicación 2, en donde al menos uno de los residuos de aminoácidos K16, K23, K34 y K40, ha sido sustituido por un residuo R ó Q.
  4. 4. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido comprende por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por P5K, 7A6K, S7K, S8K, L9K, P44K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, P101K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120 , M121K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, P132K, T133 , Q134K, G135K, A136 , M137K, P138K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, S159K, L161K, E162 , V163K, S164K, Y165K, V167 , H170K, L171K, A172K, Q173K y P174K.
  5. 5. El conjugado de conformidad con la reivindicación 4, en donde el polipéptido comprende por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por Q70K, Q90K, T105K, Q120K y T133K.
  6. 6. Un conjugado, caracterizado porque: i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos del hG-CSF que se muestra en la SEQ ID No. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: TIC, P2C, L3C , G4C , P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C, Q11C, F13C, L14C, L15C, E19C, Q20C, V21C, R22C, Q25C, D27C, A29C, A30C, E33C, A37C, T38C, Y39C, L41C, P44C, E45C, E46C, V48C, L49C, L50C, H52C, S53C, I56C, P57C, P60C, L61C, S62C, S63C, P65C, S66C, A68C, L69C, Q70C, L71C, A72C, G73C, S76C, Q77C, S80C, F83C, Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, E98C, L99C, G100C, P101C, T102C, D104C, T105C, L108C, D109C, A111C, D112C, F113C, T115C, T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C, E122C, E123C, L124C, 126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C, P132C, T133C, Q134C, G135C, A136C, 137C, P138C, A139C, A141C, S142C, A143C, F144C, Q145C, R146C, R147C, S155C, H156C, Q158C, S159C, L161C, E162C, V163C, S164C, Y165C, R166C, V167C, L168C, R169C, H170C, L171C, A172C, Q173C y P174C, y ii) por lo menos una porción no polipeptidica unida a un residuo cisteina del polipéptido.
  7. 7. Un conjugado, en dondecomprende : i) un polipéptido que presenta actividad G-CSF, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1, en por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por T1D/E, P2D/E, L3D/E, G4D/E , P5D/E, A6D/E, S7D/E, S8D/E, L9D/E, P10D/E, Q11D/E, S12D/E, F13D/E, L14D/E, L15D/E, K16D/E, Q20D/E, V21D/E, 22D/E, K23D/E, Q25D/E, G26D/E, A29D/E, A30D/E, K34D/E, A37D/E, T38D/E, Y39D/E, K40D/E, L41D/E, H43D/E, P44D/E, V48D/E, L49D/E, L50D/E, H52D/E, S53D/E, L54D/E, I56D/E, P57D/E, P60Ü/E, L61D/E, S62D/E, S63D/E, P65D/E, S66D/E, Q67D/E, A68D/E, L69D/E, Q70D/E, L71D/E, A72D/E, G73D/E, S76D/E, Q77D/E, L78D/E, S80D/E, F83D/E, Q86D/E, G87D/E, Q90D/E, G94D/E, S96D/E, P97D/E, L99D/E, G100D/E, P101D/E, T102D/E, T105D/E, Q107D/E, L108D/E, A111D/E, F113D/E, T115D/E, T116D/E, W118D/E, Q119D/E, Q120D/E, M121D/E, L124D/E, M126D/E, A127D/E, P128D/E, A129D/E, L130D/E, Q131D/E, P132D/E, T133D/E, Q134D/E, G135D/E, A136D/E, M137D/E, P138D/E, A139D/E, A141D/E, S142D/E, A143D/E, F144D/E, Q145D/E, R146D/E, R147D/E, S155D/E, H156D/E, Q158D/E, S159D/E, L161D/E, V163D/E, S164D/E, Y165D/E, R166D/E, V167D/E, L168D/E, R169D/E, H170D/E, L171D/E, A172D/E, Q173D/E y P174D/E, y ii) por lo menos una porción no polipeptidica unida a un residuo ácido aspártico o ácido glutámico del pol ipéptido .
  8. 8. El conjugado de conformidad con la reivindicación 7, en dondeel polipéptido comprende por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por Q67D/E, Q70D/E, Q77D/E, Q86D/E, Q90D/E, Q120D/E, Q131D/E, Q134D/E, Q145D/E y Q173D/E; y/o por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por D27N, D104N, D109N, D112N, E19Q, E33Q, E45Q, E46Q, E93Q, E98Q, E122Q, E123Q y E163Q.
  9. 9. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la porción no polipeptidica se selecciona del grupo formado por homopolímeros y heteropolimeros naturales y sintéticos.
  10. 10. El conjugado de conformidad con la reivindicación 9, en donde el polímero es un homopolimero o heteropolímero sintético seleccionado del grupo formado por polietilenglicol, alcohol polivinílico (PVA) , ácidos policarboxilicos y poli (vinilpirrolidona ) lineal o ramificado .
  11. 11. El conjugado de conformidad con la rei indicación 10, en donde el polímero es un polietilenglicol lineal o ramificado.
  12. 12. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de 1000 a 15.000 Da aproximadamente. 13. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, que comprende de 2 a 8 grupos de polietilenglicol . 14. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el polipéptido difiere en 1-15 residuos de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1. 15. El conjugado de conformidad con la reivindicación 14, en donde el polipéptido difere en 2-10 residuos de aminoácidos con respecto a la secuencia que se muestra en la SEQ ID No. 1. 16. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el polipéptido está glucosilado. 17. El conjugado de conformidad con la reivindicación 16, en donde el polipéptido comprende por lo menos un sitio de glucosilación no natural. 18. Un conjugado, que comprende un polipéptido glucosilado que presenta actividad G-CSF, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No. 1, en que se ha introducido por lo menos un sitio de glucosilación no natural en la secuencia de aminoácidos por medio de por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por: L3N+P5S/T, P5N, A6N , S8N+P10S/T, PION,
  13. Q11N+F13S/T, S12N+L14S/T, F13N+L15S/T, L14N+K16S/T, K16N+L18S/T, E19N+V21S/T, Q20N+R22S/T, V21N+K23S/T, R22N+I24S/T, K23N+Q25S/T, Q25N+D27S/T, G26N+G28S/T, D27N+A29D/T, A29N+L31S/T, A30N+Q32S/T, E33N+L35S/T, A37N+Y39S/T, T38N+ 40S/T, Y39N+L41S/T, P44N+E46S/T, E45N+L47S/T, E46N+V48S/T, V48N+L50S/T, L49N+G51S/T, L50N+H52S/T, H52N+L54S/T, S53N+G55S/T, P60N, L61N, S63N+P65S/T, P65N+Q67S/T, S66N+A68S/T, Q67N+L69S/T, A68N+Q70S/T, L69N+L71S/T, Q70N+A72S/T, L71N+G73S/T,
  14. G73N+L75S/T, S76N+L78S/T, Q77N+H79S/T, L78N, S80N+L82S/T, F83N+Y85S/T, Q86N+L88S/T, G87N+L89S/T, Q90N+L92S/T,
  15. E93N+I95S/T, P97N+L99S/T, L99N+P101 S /T , P101N+L103S/T, T102N+D104S/T, D104N+L106S/T, T105N+Q107S/T, Q107N+D109S/T, L108N+V110S/T, D109N+A111S/T, A111N+F113S/T, D112N+A114S/T, F113N, T115N+I117S/T, T116N+W118S/T, W118N+Q120S/T, Q119N+ 121S/T, Q120N+E122S/T, 121N+E123S/T, E122N+L124S/T, E123N+G125S/T, L124N+M126S/T, M126N+P128S/T, P128N+L130S/T, L130N+P132S/T, P132N+Q134S/T, T133N+G135S/T, Q134N+A136S/T, A136N+P138S/T, P138N+F140S/T, A139N+A141S/T, A141N+A143S/T, S142N+F144S/T, A143N+Q145 S /T , Fl N+R146? / ,
  16. Q145N+R147S/T, R1 6N+A148 S /? , R147N+G1 9S /? ,
  17. S155N+L157S/T, H156N+Q158 S /? , S159N+L161S/T,
  18. L161N+V163S/T, E162N, VI 63N+Y165S/ , S164N+R166S/T, Y165N+V167S/T, R166N+L168S/T, VI 67N+R169S/T ,
  19. L168N+H170S/T, Rl 69N+L1 1S/T y H170N+A172S/T . 19. El conjugado de conformidad con la reivindicación 18, que comprende por lo menos una sustitución seleccionada del grupo formado por P5N, A6N, PION, P60N, L61N, L78N, F113N y E162N; o del grupo formado por D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T, D109N+A111S, D109N+A111T, D112N+A114S y D112N+A114T.
  20. 20. El conjugado de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, en donde se han introducido dos o varios sitios de glucosilación .
  21. 21. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que comprende además al menos una porción no polipeptidica unida a un residuo de aminoácidos del polipéptido, donde dicha porción no polipeptidica es diferente de un grupo carbohidrato N- u 0- ligado.
  22. 22. El conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que presenta una mayor vida media in vivo y/o vida media en suero funcional en comparación con el rhG-CSF que comprende un solo grupo PEG de 20 kDa unido por el extremo N-terminal .
  23. 23. El conjugado de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a la 22, que cumple con al menos uno de los siguientes criterios (A)-(D) : (A) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte del polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de leucocitos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de leucocitos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 96 horas; (B) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de leucocitos con al menos el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de leucocitos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 72 horas, preferentemente al menos aproximadamente 96 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 120 horas; (C) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 mg de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 96 horas, preferentemente al menos ap oximadamente 120 horas; (D) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la arte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kilogramo de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 72 horas, preferentemente al menos aproximadamente 96 horas, más preferentemente al menos aproximadamen e 120 horas.
  24. 24. Un polipéptido conjugado que presenta actividad G-CSF, que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que difieren al menos un residuo de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que tiene al menos un grupo no polipeptidico unido a un grupo de unión del polipéptido, en donde el polipéptido conjugado tiene una vida media in vivo y/o media vida de suero funcional incrementada comparado con rhG-CSF que comprende una sola porción PEG 20 kDa unida a N.
  25. 25. El polipéptido conjugado de conformidad con la reivindicación 24, que comprende dos o más grupos no polipeptidicos unidos.
  26. 26. Un polipéptido conjugado que presenta actividad G-CSF, que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que difieren al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que tiene al menos un grupo no pol ipeptidico unido a un grupo de unión del polipéptido, estando caracterizado el polipéptido conjugado porque cumple con al menos uno de los siguientes criterios (A) -(D): (A) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte del polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de leucocitos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de leucocitos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un período de al menos aproximadamente 96 horas, preferentemente durante al menos aproximadamente 120 horas; (B) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: (i) incrementa la formación de leucocitos con al menos el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y (ii) incrementa el nivel de leucocitos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de leucocitos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 72 horas; (C) después de una administración subcutánea a ratas de 100 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la parte de polipéptido del conjugado) se: (i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 mg de hG-CSF no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y (ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 96 horas;
  27. (D) después de una administración subcutánea a ratas de 25 microgramos por kg de peso corporal (con base en el peso de la arte de polipéptido del conjugado) se: i) incrementa la formación de neutrófilos con al menos aproximadamente el mismo rango y al menos aproximadamente el mismo nivel (medido como el número de células por litro de sangre) que con la administración de 100 microgramos de hG-CSF no conjugado por kilogramo de peso corporal durante un periodo de 12 horas después de la administración, y ii) incrementa el nivel de neutrófilos (medido como el número de células por litro de sangre) arriba del nivel de neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al menos aproximadamente 72 horas. 27. Un polipéptido que presenta actividad G-CSF, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácido tal como se define en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8.
  28. 28. Una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 27.
  29. 29. Un vector de expresión que protege la secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 28.
  30. 30. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 28 o un vector de expresión de conformidad con la rei indicación 29.
  31. 31. Un método para producir un polipéptido conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26, que comprende el cultivo de una célula huésped de conformidad con la reivindicación 30, bajo condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, y a la recuperación del polipéptido, en donde a) el polipéptido comprende al menos un sitio de glucosilación-0 0 -N y la célula huésped es una célula huésped eucarionte con la capacidad de glucosilación in vivo, y/o b) el polipéptido se somete a conjugación para un grupo no polipeptidico in vitro.
  32. 32. Una composición que comprende un conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26 y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  33. 33. El uso de un polipéptido conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26 o una composición de conformidad con la reivindicación 32, para utilizarse como un farmacéutico.
  34. 34. El uso de un conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26 o un polipéptido de conformidad con la reivindicación 27, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, en particular para el tratamiento de padecimientos hematopoiéticos generales, que incluyen padecimientos que surgen de terapia de radiación o quimioterapia , tratamiento de leucopenia, SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia, y el tratamiento de infecciones bacterianas u otras .
  35. 35. Un método para tratar a un mamífero que tiene un padecimiento hematopoiéti co general, que incluye padecimientos que surgen de terapia de radiación o de quimioterapia, tratamiento de leucopenia, SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia , y el tratamiento de infecciones bacterianas u otras, que comprende la administración a un mamífero que necesita del mismo, de una cantidad efectiva de un conjugado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26 o de una composición de conformidad con la reivindicación 32.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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GB0022877D0 (en) * 2000-09-18 2000-11-01 Isis Innovation Analogues
DE60236522D1 (de) 2001-07-11 2010-07-08 Maxygen Inc G-csf konjugate
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
ES2516041T3 (es) * 2001-10-10 2014-10-30 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH)
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
GB0130720D0 (en) * 2001-12-21 2002-02-06 Serono Internat S A Proteins
AU2003210052A1 (en) * 2002-03-20 2003-09-29 Biopolymed Inc. Preparation of g-csf stoichiometrically conjugated with biocompatible polymers at cystein residue
AU2003267827A1 (en) * 2002-08-31 2004-03-19 Cj Corp. Glycosylated human granulocyte colony-stimulating factor (g-csf) isoform
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
ES2420581T3 (es) 2003-03-14 2013-08-26 Biogenerix Gmbh Polímeros solubles en agua ramificados y sus conjugados
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
AR044315A1 (es) * 2003-05-16 2005-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk Agente para prevenir y/o tratar enfermedades acompañadas de alteraciones de tejidos que comprende un polipeptido
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US7220407B2 (en) 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
JP5743368B2 (ja) 2004-01-08 2015-07-01 ラショファーム ゲーエムベーハー ペプチドのｏ結合型グリコシル化
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
AU2005306894B2 (en) 2004-11-05 2011-11-24 Northwestern University Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders
JP2006137678A (ja) * 2004-11-10 2006-06-01 Shionogi & Co Ltd インターロイキン−２組成物
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
RU2007149238A (ru) * 2005-06-01 2009-07-20 Максиджен Холдингз Лтд. (Ky) Пегилированные полипептиды гксф и способы их получения
KR100694994B1 (ko) 2005-06-13 2007-03-14 씨제이 주식회사 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
KR100735784B1 (ko) 2005-07-20 2007-07-06 재단법인 목암생명공학연구소 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 화학적 접합물
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
WO2008147534A1 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Maxygen Holdings Ltd. Method for the treatment of neutropenia by administration of a multi-pegylated granulocyte colony stimulating factor (g-csf) variant
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
DE202008017456U1 (de) 2007-08-27 2009-08-27 Biogenerix Ag Flüssig-Formulierung von G-CSF-Konjugaten
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
ES2523030T3 (es) 2008-02-18 2014-11-20 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
EP2444491B1 (en) 2008-04-21 2016-11-16 Novo Nordisk Healthcare Ag Hyperglycosylated human coagulation factor IX
WO2010001414A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Lupin Limited Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag
WO2010037855A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Octagene Gmbh Improved processing of recombinant human g-csf
US20150166629A1 (en) * 2012-04-17 2015-06-18 Aarhus Universitet SorCS1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OBESITY AND OVERWEIGHT
KR101623906B1 (ko) * 2014-07-23 2016-05-24 주식회사 이큐스앤자루 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
CN107916257B (zh) * 2018-01-09 2020-07-28 华南理工大学 T1脂肪酶突变体和应用
CA3151471A1 (en) * 2019-10-08 2021-04-15 Gesa VOLKERS Modified extracellular domain of granulocyte colony-stimulating factor receptor (g-csfr) and cytokines binding same

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0208491B1 (en) 1985-07-03 1993-08-25 Genencor International, Inc. Hybrid polypeptides and process for their preparation
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
JP2523562B2 (ja) 1985-10-25 1996-08-14 ザイモジェネティックス インコーポレーテッド 外来タンパク質を分泌することを目的としたｂａｒ１の使用法
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5681720A (en) 1986-12-23 1997-10-28 Kyowa Hakko Co., Ltd. DNA encoding human granulocyte colony stimulating factor plasmids and host cells comprising same, and methods of expressing the encoded polypeptide
US5214132A (en) 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
JP2928287B2 (ja) * 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4647889A (en) 1988-11-18 1990-06-12 Cetus Corporation Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins
WO1990006952A1 (en) * 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
DE69033192T3 (de) 1989-04-19 2004-05-19 Enzon, Inc. Aktive karbonate von polyalkylenoxyden zur modifizierung von polypeptiden
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE69026306T2 (de) 1989-05-27 1996-10-17 Sumitomo Pharma Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US5023328A (en) 1989-08-04 1991-06-11 The Texas A&M University System Lepidopteran AKH signal sequence
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5915378A (en) 1993-01-29 1999-06-29 Aradigm Corporation Creating an aerosolized formulation of insulin
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5558085A (en) 1993-01-29 1996-09-24 Aradigm Corporation Intrapulmonary delivery of peptide drugs
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
ES2159630T3 (es) 1994-02-08 2001-10-16 Amgen Inc Sistema de administracion por via oral de proteinas g-csf quimicamente modificadas.
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
AU689217B2 (en) 1994-03-07 1998-03-26 Novartis Ag Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
CN1151762A (zh) 1994-06-30 1997-06-11 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5522385A (en) 1994-09-27 1996-06-04 Aradigm Corporation Dynamic particle size control for aerosolized drug delivery
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE4437604A1 (de) 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5780014A (en) 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5654007A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DK0843725T3 (da) 1995-08-11 2002-08-12 Novozymes As Fremgangmåde til fremstilling af polypeptidvarianter
US6100070A (en) 1995-10-05 2000-08-08 G. D. Searle & Co. G-CSF receptor agonists
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP1731174A3 (en) 1996-08-02 2007-01-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a covalently bound N-terminal polyethylene glycol via hydrazone or oxime bond
JP2001507701A (ja) 1996-12-31 2001-06-12 インヘイル・セラピューティック・システムズ・インコーポレーテッド 親水性賦形剤を有する疎水性薬剤の溶液を噴霧乾燥するための方法及びその方法によって作製された組成物
JP2001527387A (ja) 1997-01-24 2001-12-25 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 合成リーダーペプチド配列
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
JP4187277B2 (ja) 1997-04-30 2008-11-26 エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
EP0921131B1 (en) 1997-06-06 2010-05-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
US5855564A (en) 1997-08-20 1999-01-05 Aradigm Corporation Aerosol extrusion mechanism
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
EA003789B1 (ru) 1998-04-28 2003-10-30 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН
EP1108783A3 (en) 1999-01-19 2001-09-05 Maxygen, Inc. Oligonucleotide-mediated nucleic acid recombination
AR027509A1 (es) * 2000-01-10 2003-04-02 Maxygen Aps Conjugados g-csf

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