RU2199347C2 - Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером - Google Patents

Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером Download PDF

Info

Publication number
RU2199347C2
RU2199347C2 RU99103679/14A RU99103679A RU2199347C2 RU 2199347 C2 RU2199347 C2 RU 2199347C2 RU 99103679/14 A RU99103679/14 A RU 99103679/14A RU 99103679 A RU99103679 A RU 99103679A RU 2199347 C2 RU2199347 C2 RU 2199347C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polypeptide
terminal
epo
peg
polymer
Prior art date
Application number
RU99103679/14A
Other languages
English (en)
Other versions
RU99103679A (ru
Inventor
Зипинг ВЕЙ
Санита МЕНОН-РУДОЛЬФ
Прадип ГОШ-ДАСТИДАР
Original Assignee
Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. filed Critical Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк.
Publication of RU99103679A publication Critical patent/RU99103679A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2199347C2 publication Critical patent/RU2199347C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении созданы композиции, по существу состоящие из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому через гидразоновую или восстановленную гидразоновую связь. В настоящем изобретении созданы также способы изготовления композиций настоящего изобретения, фармацевтических композиций, включающий их же, и наборы, используемые для их получения. Изобретение позволяет точнее и проще осуществлять сложные методики получения ковалентно связанных полипептидов. 4 c. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые связаны на своих N-концах с единственным водорастворимым полимером. Эти полипептиды обладают свойствами, которые придают им преимущества при использовании в качестве фармацевтических и диагностических агентов. Настоящее изобретение относится также к способам создания этих полипептидов и связанным с ними фармацевтическим композициям и наборам.
Предпосылки изобретения
В данной заявке приводятся ссылки на различные публикации. Раскрытие этих публикаций включено, таким образом, в виде ссылок в данную заявку для того, чтобы полнее описать известный уровень техники, в котором применимо данное изобретение.
В последние годы для ковалентной модификации терапевтически и диагностически важных полипептидов стали использовать неантигенные водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль ("PEG"). Сообщали, например, о ковалентном присоединении PEG к терапевтическим полипептидам, таким как интерлейкины (Knauf M.J. с соавт., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15,064; Tsutsumi Y. с соавт., J. Controlled Release 1995, 33, 447), интерфероны (Kita Y. с соавт., DrugDes. Delivery 1990, 6,157), каталаза (Abuchowski А. с соавт., J. Biol. Chem. 1977, 252, 3, 582), супероксиддисмутаза (Beauchamp С.О. с соавт. Anal. Biochem. 1983, 131, 25) и аденозиндезаминаза (Chen R. с соавт., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293), чтобы увеличить время их полужизни in vivo и/или уменьшить их иммуногенность и антигенность.
Однако такие способы страдают серьезными недостатками. В частности, в большинстве случаев PEG-молекулы присоединяются через аминогруппы на полипептидах с помощью метоксилированных PEG ("mPEG"), обладающих разными реакционноспособными составляющими. Такими полимерами являются mPEG-сукцинимидилсукцинат, mPEG-сукцинимидилкарбонат, mPEG-имидат и mPEG-цианурхлорид. Присоединение с помощью этих полимеров обычно не является специфичным, т.е. оно происходит по разным аминогруппам полипептидов случайным образом, а не исключительно по конкретной аминогруппе. Такое неспецифическое присоединение может модифицировать аминокислотные остатки в активных участках таким образом, что утрачивается биологическая активность этих полипептидов. Полученные в результате конъюгаты могут также содержать гетерогенную смесь модифицированного полипептида, который нежелателен для фармацевтического применения.
Чтобы преодолеть эти трудности, желательно сайт-специфическое присоединение полимера к полипептиду. Данный полипептид делают таким образом, чтобы сохранить биологическую активность, продлить время циркуляции в крови, уменьшить иммуногенность, увеличить растворимость в воде и повысить устойчивость к протеазному расщеплению. Сайт-специфическое присоединение (pegylation) на N-конце, боковой цепи и С-конце мощного аналога фактора, высвобождающего гормон роста, осуществляли путем твердофазного синтеза (Felix А.М. с соавт., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46, 253). Так как эту специфическую фиксацию осуществляли во время сборки пептида на смоле, данный способ не может быть применен к существующему пептиду.
Используемый дополнительный способ включает в себя сайт-специфическое присоединение пептида к концам присоединенных к поверхности липосомы PEG-цепочек через реакционную альдегидную группу на N-конце, образованном путем натрийперйодатного окисления N-концевого треонина (Zalipsky S. с соавт., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705). Однако данный способ ограничен полипептидами с N-концевыми сериновым или треониновым остатками.
Были также описаны способы по специфическому интродуцированию активированных групп на С-конце полипептида с помощью фермента (Schwartz А. с соавт. , Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose К. с соавт., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaertner H.F. с соавт., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224). Обычно этими активными группами могут являться гидразид, альдегид и ароматические аминогруппы для последующего присоединения функциональных проб к полипептидам. Однако, поскольку данные способы основаны на специфичности протеаз, они требуют крайней осторожности и объем их применения ограничен.
Кроме того, сайт-специфический мутагенез представляет собой подход, который использовали для получения полипептидов для сайт-специфического присоединения полимера. WO 90/12874 описывает сайт-направленное присоединение белков, модифицированных путем вставки цистеиновых остатков или замены других остатков на цистеиновые остатки. Данная публикация описывает также получение mPEG-эритропоэтина ("mPEG-ЕРО") в реакции производного цистеин-специфичного mPEG с рекомбинантно-интродуцированным цистеиновым остатком в ЕРО. Подобным образом интерлейкин-2 присоединяли по его сайту гликозилирования после сайт-направленного мутагенеза (Goodson R.J. с соавт., Вio/Technology 1990, 8, 343).
Гликопротеины снабжены углеводами в качестве дополнительных сайтов-мишеней для модификации. Фермент пероксидаза был модифицирован с помощью PEG-диамина через его углеводную составляющую (Urrotiogoity М. с соавт., Biocata-lysis 1989, 2, 145). WO 94/28024 описывает способы получения mPEG-EPO через перйодатное окисление углевода. Данный химизм подразумевает образование гидразона путем реагирования mPEG-гидразида с альдегидными группами углеводной составляющей ЕРО. Этот вид модификации образует реакционные альдегидные группы через стадию окисления, которые потенциально могут окислять различные виды сахарных остатков в углеводной составляющей и некоторые аминокислотные остатки данного полипептида, такие как метионин. Другой недостаток этого способа происходит от гетерогенности углеводных составляющих ЕРО. ЕРО, экспрессированный в клетках яичника китайского хомячка, обладает четырьмя углеводными цепями, которые включают три N-сцепленные цепочки по аспарагину 24, 38 и 83 и одну 0-сцепленную цепочку по серину 126. В общей сложности было идентифицировано 52 разных N-сцепленных и, как минимум, 6 0-сцепленных олигосахаридных структур (Rush R.S. с соавт., Anal Chem. 1955, 67, 1442; Linsley К. В. с соавт., Anal. Biochem. 1994, 219, 207). Поэтому трудно контролировать число полимерных молекул или присоединение сайтов при модификации ЕРО или других белков через их углеводные цепочки.
Одним словом, способы в данной области по присоединению водорастворимого полимера к полипептиду страдают серьезными недостатками. Эти недостатки включают в себя следующие: (а) отсутствие точности, что касается стехиометрии и позиции присоединения; (b) необходимость осуществлять сложные и трудоемкие методики, такие как сайт-специфический мутагенез; (с) необходимость использовать твердофазный пептидный синтез одновременно с присоединением полимера вместо присоединения полимера к уже существующему полипептиду и (d) жесткое требование тождественности треонина или серина N-концевому аминокислотному остатку.
Некоторое время существовала потребность в общем методе сайт-специфического присоединения водорастворимого полимера к N-концевому аминокислотному остатку полипептида, который бы не страдал от вышеуказанных недостатков. Однако такого метода не существует.
Краткое изложение существа изобретения
В настоящем изобретении разработали две композиции. Первая композиция состоит по существу из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому полипептида через гидразоновую связь или восстановленную гидразоновую связь, при условии, что (а) полимер обладает молекулярным весом приблизительно от 200 до 200000 дальтон, (b) природная функция полипептида не ограничивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы и (с) полипептидный N-концевой аминокислотный остаток не представляет собой серии или треонин.
Вторая композиция состоит по существу из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому полипептида через оксимовую связь или восстановленную оксимовую связь, при условии, что (а) полимер обладает молекулярным весом приблизительно от 200 до 200000 дальтон и (b) природная функция полипептида не ограничивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
В настоящем изобретении разработали также четыре способа ковалентного связывания водорастворимого полимера с N-концевым α-углеродным атомом полипептида. Первый способ, который связывает полимер с углеродным атомом через гидразоновую связь, включает в себя следующие стадии:
(a) контактирование полипептида с (i) глиоксилатным ионом или его производным в концентрации примерно от 0,1 до 2,0 М, (ii) ионом переходного металла в концентрации примерно от 10 мкМ до 1 М и (iii) основанием Льюиса в концентрации примерно от 10 мМ до 10 М при рН примерно от 3,0 до 8,0 и температуре примерно от 0 до 100oС так, чтобы образовать трансаминированный полипептид, обладающий N-концевой α-карбонильной группой;
(b) контактирование полученного трансаминированного полипептида при рН примерно от 1,0 до 7,5 с водорастворимым полимером, обладающим составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывая таким образом полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида через гидразоновую связь при условии, что полимер обладает молекулярным весом приблизительно от 200 до 200000 дальтон и природная функция полипептида не ограничивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
Второй способ, который связывает полимер с углеродным атомом через оксимовую связь, включает следующие стадии:
(а) контактирование полипептида с (i) глиоксилатным ионом или его производным в концентрации приблизительно от 0,1 до 2,0 М, (ii) ионом переходного металла в концентрации примерно от 10 мкМ до 1 М и (iii) основанием Льюиса в концентрации примерно от 10 мМ до 10 М при рН примерно от 3,0 до 8,0 и температуре примерно от 0 до 100oС так, чтобы образовать трансаминированный полипептид, обладающий N-концевой α-карбонильной группой;
(b) контактирование полученного трансаминированного полипептида при рН примерно от 1,0 до 7,5 с водорастворимым полимером, обладающим составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием оксимовой связи, ковалентно связывая таким образом полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида через оксимовую связь при условии, что полимер обладает молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и природная функция полипептида не ограничивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
Третий способ включает в себя стадии первого способа, а также дополнительную стадию восстановления гидразоновой связи, образованной на стадии (b). Четвертый способ включает в себя стадии второго способа, а также дополнительную стадию восстановления оксимовой связи, образованной на стадии (b).
В настоящем изобретении создали также фармацевтическую композицию, которая включает в себя эффективное количество первой или второй композиции настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
Наконец, в настоящем изобретении создали набор, используемый для получения композиций настоящего изобретения. Первый набор для получения первой композиции настоящего изобретения включает в себя нижеследующее:
(a) глиоксилатный ион или его производное;
(b) ион переходного металла;
(c) основание Льюиса;
(d) водорастворимый полимер, обладающий молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и обладающий составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывая таким образом полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида.
Второй набор, используемый для получения второй композиции настоящего изобретения, включает нижеследующее:
(a) глиоксилатный ион или его производное;
(b) ион переходного металла;
(c) основание Льюиса;
(d) водрастворимый полимер, обладающий молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и обладающий составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием оксимовой связи, связывая таким образом полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида.
Краткое описание рисунков
На фигуре 1 показана схема получения N-концевого модифицированного ЕРО. Она представляет собой двухстадийную реакцию: трансаминирование и присоединение (pegylation). Использовали четыре производные mPEG5000 (т.е. mPEG, обладающий м. м. 5000 дальтон) с гидразинкарбоксилатной (HZC), гидразидной (HZ), семикарбазидной (SCZ) и оксиламинной функциональными группами.
На фигуре 2 показана хроматограмма гель-фильтрации mPEG-ЕРО с гидразоновой связью, образованная с использованием гидразинкарбоксилатной (HZC) составляющей, нативного ЕРО и тРЕС5000-гидразинкарбоксилата на колонке TSK G3000SWXL, (7,5 х 30 мм). Подвижная фаза представляет собой 20 мМ цитрат натрия (рН 7,0), содержащий 100 мМ NaCI.
На фигуре 3 показана матрично-ассоциированная лазерная десорбция времяпролетных масс-спектров mPEG5000-гидразинкарбоксилата, нативного ЕРО и mPEG-EPO с гидразоновой связью, образованная с использованием гидразинкарбоксилатной (HZC) составляющей.
Фигура 4 характеризует mPEG-EPO с помощью методов электрофореза: (1) 4-15% SDS-PAGE, окрашивание Кумасси; (2) вестерн-блот; (3) 4-15% SDS-PAGE, окрашивание йодом и (4) изоэлектрическое фокусирование (IFF, рН 3-7). Дорожка 1, маркеры MW или рI; дорожка 2, нативный ЕРО; дорожка 3, трансаминированный ЕРО и дорожки 4 и 5, mPEG-EPO с гидразоновой связью с использованием соответственно гидразинкарбоксилатной (HZC) и гидразидной (HZ) составляющими.
На фигуре 5 графически показаны результаты анализа ELISA для mPEG-EPO с гидразоновыми связями, образованными с помощью гидразидкарбоксилатной (HZC) и гидразидной (HZ) составляющих.
На фигуре 6 графически показаны результаты анализа клеточной пролиферации нативного ЕРО, трансаминированного ЕРО и mPEG-EPO с гидразоновыми связями, образованными с помощью гидразидкарбоксилатной (HZC) и гидразидной (HZ) составляющих.
На фигуре 7 графически показаны результаты постгипоксийного биоанализа мыши по mPEG-EPO с гидразоновыми связями, образованными с помощью гидразинкарбоксилатной (HZC) и семикарбазидной (SCZ) составляющих.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении созданы две композиции. Первая композиция состоит, по существу, из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому данного полипептида через гидразоновую связь или восстановленную гидразоновую связь при условии, что (а) данный полимер обладает молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон, (b) природная функция данного полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы и (с) N-концевой аминокислотный остаток данного полипептида не представляет собой серин или треонин.
Вторая композиция состоит, по существу, из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому данного полипептида через оксимовую связь или восстановленную оксимовую связь при условии, что (а) данный полимер обладает молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и (b) природная функция данного полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
В том смысле, как здесь используется, "полипептид" включает и пептиды, и протеины. "Пептид" подразумевает полипептид менее, чем из 10 аминокислотных остатков в длину, а "протеин" подразумевает 10 или более аминокислотных остатков в длину. В настоящем изобретении полипептиды могут быть природными или рекомбинантными (т. е. полученными по технологии рекомбинантной ДНК) и могут содержать мутации (например, точковую, инсерционную или делеционную мутации), а также другие ковалентные модификации (например, гликозилирование и мечение (с помощью биотина, стрептавидина, флуорацина и радиоизотопов, таких как I131). Кроме того, каждая композиция настоящего изобретения может содержать более чем один полипептид, т.е. каждая может быть мономером (один полипептид, связанный с полимером) или мультимер (два или более полипептидов, связанных с полимером или друг с другом).
Для примера, полипептиды включают моноклональные и поликлональные антитела, цитокины, такие как M-CSF и GM-CSF, лимфокины, IL-2, IL-3, факторы роста, такие как PDGF и EGF, пептидные гормоны, такие как hGH, EPO и его производные, факторы свертывания крови, такие как Фактор VIII, иммуногены, ферменты, ингибиторы ферментов и другие лиганды. В предпочтительном варианте осуществления композиций настоящего изобретения данный полипептид представляет собой ЕРО или его производное. ЕРО может быть естественно встречаемым или рекомбинантным. Производные ЕРО включают, но не ограничиваются ими, следующие полипептиды:
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG,
VGNYMCHFGPITWVCRPGGG,
GGVYACRMGPITWVCSPLGG,
VGNYMAHMGPITWVCRPGG,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ,
GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,
TIAQYICYMGPETWECRPSPKA,
YSCHFGPLTWVCK и
YCHFGPLTWVC,
а также мутанты, перечисленные ниже в таблице 1.
Цитированные ссылки
1) Akai, К., Yamaguchi, К. and Ueda, М., Modified forms of human erythropoietin and DNA sequences encoding genes which can express them, EP 0427 189 Al.
2) Bittorf, Т., Jaster, R. and Brock, J. (1993) FEBS Letts. 336: 133-136.
3) Results of Bunn, H.F. et al.
4) Byrne, Т.Е. and Elliott, S.G., Erythropoietin isoforms, EP 0 668 351 Al.
5) Chern, Y., Chung, T. and Sytkowski, A.J. (1991) Eur. J. Biochem. 202: 225-229.
6) Funakoshi, A. , Muta, H., Baba, Т. and Shimizu, S. (1993) Biochem. Biophys. Res. Cononun. 195: 717-722.
7) Okasinski, G. , Devries, P. J. , Mellovitz, B.S., Meuth, J.L. and Schaefer, V.G., Erythropoietin analog compositions and methods, WO 94/25055.
8) Grodberg, J., Davis, K.L. and Sytkowski, A.J. (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601.
9) Results of Pulito, V. et al.
10) Shoemaker, С.В., Erythropoietin composition, U.S. 4,835,260.
В том смысле, как здесь используется, "природная функция" полипептида подразумевает его функцию до ковалентной модификации его N-концевой α-аминогруппы. Природные функции включают, например, ферментативную активность, связывание рецептора (например, антител), связывание лиганда и иммуногенность.
Способы настоящего изобретения, описанные более полно ниже, вызывают потерю N-концевой α-аминогруппы ковалентно модифицированного полипептида. В соответствии с этим данный полипептид должен обладать первичной структурой, такой что его природная функция после ковалентной модификации сохраняется и не может быть утрачена. Природная функция полипептида утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы, если такое удаление уменьшает более чем на 99% способность полипептида осуществлять свою природную функцию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное удаление не уменьшает способность данного полипептида осуществлять свою природную функцию более чем на 90%. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное удаление не уменьшает способность данного полипептида осуществлять свою природную функцию более чем на 50%.
В том смысле, как здесь используется, "гидразоновая связь" представляет собой связь, включающую ковалентную структуру NH-N=C, "оксимовая связь" представляет собой связь, включающую ковалентную структуру О-N=C, "восстановленная гидразоновая связь" представляет собой связь, включающую ковалентную структуру NH-NH-C, а "восстановленная оксимовая связь" представляет собой связь, включающую ковалентную структуру О-NH-C. Здесь созданы соединения, содержащие восстановленную гидразоновую и оксимовую связи, поскольку эти связи обладают повышенной химической стабильностью.
Как рассмотрено выше, в данной области известны способы для связывания водорастворимых полимеров с N-концевым α-углеродным атомом полипептида через гидразоновую связь при условии, что N-концевой аминокислотный остаток представляет собой серин или треонин. Эти известные способы не пригодны в отношении полипептидов, обладающих каким-либо иным N-концевым остатком. Хотя эти известные способы коренным образом отличаются от способов настоящего изобретения, они результативны для N-концевого серина и треонина полипептидов, обладающих полимерной связью по N-концевому α-углеродному атому через гидразоновую связь. По этой причине первая композиция настоящего изобретения не включает полипептид, связанный с полимером через гидразоновую связь, где N-концевой аминокислотный остаток полипептида представляет собой серин или треонин.
Водорастворимые полимеры, используемые в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь ими, (а) декстран и производные декстрана, включающие декстрансульфат, поперечно сшитый декстрин и карбоксиметилдекстрин; (b) целлюлозу и производные целлюлозы, включающие метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу; (с) крахмал и декстрины и его производные; (d) полиалкиленгликоль и его производные, включая PEG, mPEG, гомополимеры PEG, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры этиленгликоля с пропиленгликолем, где указанные гомополимеры и сополимеры представляют собой незамещенные или замещенные по одному концу алкильной группой; (е) гепарин и фрагменты гепарина; (f) поливиниловый спирт и поливинилэтилэфиры; (д) поливинилпирролидон; (h) а,b-поли[(2-гидроксиэтил)-DL-аспартамид и (i) полиоксиэтилированные полиолы. Эти полимеры могут быть линейными, разветвленными или звездообразными с широким диапазоном молекулярных весов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полимер представляет собой mPEG.
При использовании композиций настоящего изобретения в качестве фармацевтических препаратов полимер не является токсичным. Более того, если говорят, что указанный полимер обладает данным молекулярным весом, этот молекулярный вес является лишь приблизительным, отражающим средний молекулярный вес популяции полимерных молекул, отличающихся друг от друга по числу субъединиц, представленных в каждой молекуле.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения PEG или его производные обладают молекулярным весом примерно от 700 до 20000 дальтон. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения PEG или его производные обладают молекулярным весом около 5000 дальтон. Также в предпочтительном варианте осуществления композиций настоящего изобретения полипептид представляет собой ЕРО, а полимер представляет собой mPEG, обладающий молекулярным весом около 5000 дальтон.
В настоящем изобретении создали также четыре способа ковалентного связывания водорастворимого полимера с N-концевым α-углеродным атомом полипептида. Первый способ, который связывает полимер с указанным углеродным атомом через гидразоновую связь, включает следующие стадии:
(a) контактирование полипептида с (i) глиоксилатным ионом или его производным в концентрации примерно от 0,1 до 2,0 М, (ii) ионом переходного металла в концентрации примерно от 10 мкМ до 1 М и (iii) основанием Льюиса в концентрации примерно от 10 мМ до 10 М при рН примерно от 3,0 до 8,0 и температуре примерно от 0 до 100oС так, чтобы образовать трансаминированный полипептид, обладающий N-концевой α-карбонильной группой;
(b) контактирование полученного трансаминированного полипептида при рН примерно от 1,0 до 7,5 с водорастворимым полимером, обладающим составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывая таким образом полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида через гидразоновую связь при условии, что полимер обладает молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и природная функция полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой аминогруппы.
Второй способ, который связывает полимер с углеродным атомом через оксимовую связь, включает следующие стадии:
(a) контактирование полипептида с (i) глиоксилатным ионом или его производным в концентрации примерно от 0,1 до 2,0 М, (ii) ионом переходного металла в концентрации примерно от 10 мкМ до 1 М и (iii) основанием Льюиса в концентрации примерно от 10 мМ до 10 М при рН примерно от 3,0 до 8,0 и температуре примерно от 0 до 100oС так, чтобы образовать трансаминированный полипептид, обладающий N-концевой α-карбонильной группой;
(b) контактирование трансаминированного полипептида при рН примерно от 1,0 до 7,5 с водорастворимым полимером, обладающим составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием оксимовой связи, ковалентно связывая таким образом, полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида через оксимовую связь при условии, что полимер обладает молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и природная функция полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
Третий способ включает в себя стадии указанного первого способа, а также дополнительную стадию восстановления гидразоновой связи, образованной на стадии (b). Четвертый дополнительный способ включает в себя стадии указанного второго способа, а также дополнительную стадию восстановления оксимовой связи, образованной на стадии (b). Восстановительную стадию осуществляли путем использования, например, натрийборогидрида (NaBH4) и натрийцианоборогидрида (МаВН3СN) в соответствии с известными способами.
Производные глиоксилатного иона включают, не ограничиваясь ими, глиоксиламидный и фенилглиоксильный ионы. Ионы переходного металла включают в себя, не ограничиваясь ими, ионы меди, никеля, кобальта или цинка. Льюисовские основания включают в себя, но не ограничиваются ими, ацетат и пиридин.
Составляющие, которые реагируют с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, включают, но не ограничиваются ими, гидразинкарбоксилат, гидразин, семикарбазид, гидразид, тиосемикарбазид, дигидразид угольной кислоты, карбазид, тиокарбазид и арилгидразид. Водорастворимые полимеры с этими составляющими, ковалентно связанными с ними, коммерчески доступны. Кроме того, составляющие, которые реагируют с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием оксимовой связи, включают, но не ограничиваются, оксиламин. Водорастворимые полимеры с оксиламином (а также с другими оксимобразующими составляющими), ковалентно связанные с ним, коммерчески доступны.
В предпочтительном варианте способов согласно изобретению рН на стадии (а) составляет примерно от 5,0 до 7,0, рН на стадии (b) составляет примерно от 3,0 до 5,0, а белок представляет собой ЕРО или его производное.
В одном варианте способов согласно изобретению полимер представляет собой PEG или его производное. В другом варианте PEG или его производное обладает молекулярным весом примерно от 700 до 20000 дальтон. В предпочтительном варианте PEG или его производное обладает молекулярным весом порядка 5000 дальтон.
В одном варианте осуществления первого способа составляющая, связанная с полимером, которая реагирует с данным трансаминированным полипептидом, представляет собой гидразинкарбоксилат. В предпочтительном варианте полипептид представляет собой ЕРО, полимер представляет собой mPEG, обладающий молекулярным весом около 5000 дальтон, а составляющая, ковалентно связанная с полимером, представляет собой гидразинкарбоксилат.
В одном варианте осуществления второго способа составляющая, связанная с полимером, который реагирует с трансаминированным полипептидом, представляет собой оксиламин.
В каждом способе настоящего изобретения время предпочтительного контактирования на стадии (а) составляет от 20 минут до 2-х часов, а на стадии (b) время предпочтительного контактирования и температура составляют соответственно от 10 минут до 50 часов и от 4oС до комнатной температуры.
У некоторых полипептидов N-конец полипептида "утоплен", т.е. не подвергается действию растворителей или реагентов, когда полипептид представлен в своей нативной конформации. Реагенты, такие как тетраметилмочевина или мочевина, могут применяться для разворачивания такого полипептида с тем, чтобы дать возможность подвергнуть его N-концевой остаток нужным реакциям способов настоящего изобретения.
В настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция, которая включает эффективное количество первой или второй композиции и фармацевтически приемлемый носитель. Для примера, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать с себя количество mPEG-EPO настоящего изобретения, эффективного для лечения субъекта, страдающего анемией.
Фармацевтически приемлемые носители также хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, 0,01-0,1 М и предпочтительно 0,05 М фосфатного буфера или 0,8% физиологического раствора. Кроме того, такие фармацевтически приемлемые носители могут быть водными или неводными растворами, суспензиями и эмульсиями. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, спиртово-водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие в себя физиологический раствор и забуференную среду. Парентеральные носители включают в себя раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу или хлорид натрия, молочнокислый раствор Рингера/или нелетучие масла. Внутривенные носители включают в себя жидкие и питательные подкрепляющие добавки, электролитные подкрепляющие добавки, такие которые основаны на декстрозе Рингера, и тому подобное. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие, например, как противомикробные, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное.
Наконец, в настоящем изобретении созданы наборы для применения в получении композиций согласно изобретению. Первый набор для получения первой композиции настоящего изобретения включает в себя нижеследующее:
a) глиоксилатный ион или его производное;
b) ион переходного металла;
c) основание Льюиса;
d) водорастворимый полимер, обладающий молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и обладающий составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывающейся таким образом с полимером по N-концевому α-углеродному атому полипептида.
Второй набор для применения в получении второй композиции настоящего изобретения включает в себя нижеследующее:
a) глиоксилатный ион или его производное;
b) ион переходного металла;
c) основание Льюиса;
d) водорастворимый полимер, обладающий молекулярным весом примерно от 200 до 200000 дальтон и обладающий составляющей, ковалентно связанной с ним, которая реагирует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием оксимовой связи, ковалентно связывающейся таким образом с полимером по N-концевому α-углеродному атому полипептида.
Реагенты в этих наборах могут быть упакованы в заранее предопределенном количестве и могут находиться в отдельных ячейках. С другой стороны, некоторые реагенты могут содержаться в одной и той же ячейке в соответствии со способами настоящего изобретения. Наконец, наборы могут дополнительно включать в себя реагенты для образования восстановленной гидразоновой и оксимовой связей в соответствии со способами настоящего изобретения, а также подходящие буферы и реакционные сосуды.
Настоящее изобретение будет лучше всего понято при ссылке на нижеследующие экспериментальные примеры, однако специалистам в данной области необходимо иметь ввиду, что конкретные эксперименты детализированы лишь для иллюстрации настоящего изобретения, которое наиболее полно описано в следующей за ними формуле изобретения.
Экспериментальные примеры
1. Получение трансаминированного ЕРО
5 мг ЕРО в 20 мМ цитрате натрия (рН 6,9) и 100 мМ NaCl меняли на 100 мМ натрийацетатного буфера (рН 7,0) с использованием Centricon-10 (Amicon, Beverly, МА). Конечные концентрации доводили до 1 мг/мл ЕРО 2 М ацетатом натрия, 0,4 М уксусной кислоты, 0,1 М глиоксалевой кислоты и 10 мМ сульфатом меди (рН 5,5) (фигура 1). Данную реакцию осуществляли в течение 2-х часов при комнатной температуре и останавливали добавлением 100 мл 0,5 М ЭДТА. Трансаминированный ЕРО выделяли очисткой на колонке с Сефадексом G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) с использованием 100 мМ натрийацетатного (рН 4,5) буфера.
Продолжительность трансаминирования определяли с помощью 2,4-динитрофенилгидразина, как описано в литературе (Fields R. с соавт., Biochem. J., 1971, 121, 587). Экстинкцию при 37 нм измеряли после первых нескольких минут и через один час. Разница в абсорбции пропорциональна количеству карбонильных групп, представленных в молекуле ЕРО. Полученный трансаминированный ЕРО подвергали также аминокислотному анализу в системе ABI 420Н (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием предваряющей PITC-химии на колонке. Полученные результаты свидетельствуют, что лизиновые остатки, т.е. не N-концевые остатки, не трансаминировались.
2. Получение mPEG-EPO с mPEG-гидразинкарбоксилатом
Трансаминированный ЕРО (1 мг) в 100 мМ ацетате натрия (рН 4,5) доводили 0,5 М хлоридом натрия до конечного объема 1 мл, к которому добавляли 10 мг mРЕG5000-гидразинкарбоксилата. Данную реакционную смесь перемешивали в течение 40 часов при комнатной температуре и выделяли очисткой на колонке с Сефакрилом S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) с использованием 20 мМ натрийцитратного (7,0) буфера, содержащего 100 мМ NaCl. Кроме того, к данной реакционной смеси может быть добавлен 0,1% SDS для увеличения конъюгатного выхода.
При гель-проникающей хроматографии конъюгат выявил значительно увеличенный молекулярный вес в сравнении с ЕРО и mРЕG5000-гидразинкарбоксилатом (фигура 2).
Матрично-ассоциированную лазерно-десорбционную масс-спектрометрию (Finnigan-MAT LaserMAT 2000, линейный времяпролетный) использовали для характеристики mPEG-EPO для определения молекулярного веса (фигура 3). mPEG5000-гидразинкарбоксилат показывает ион при m/z 5157,4. ЕРО показывает двухзарядный мономер (m/z 14604), однозарядный мономер (m/z 28569), димер (m/z 57208) и тример (m/z 85284). Аналогично, mPEG-EPO показывает двухзарядный мономер (m/z 17092), однозарядный мономер (m/z 34279), димер (m/z 69071) и тример (m/z 102955).
Спектр кругового дихроизма (CD) (Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer Instruments, SA, Edison, NJ) mPEG-EPO показывает, что данный белок сохраняет свернутую α-спиральную структуру, присутствующую в нативном ЕРО (данные не приведены). Данный результат означает, что молекула PEG на N-конце ЕРО не нарушает его вторичную структуру.
3. Получение mPEG-EPO с mPEG-гидразидом, mPEG-семикарбазидом и оксиламином
Трансаминированный ЕРО (1 мг) в 100 мМ ацетате натрия (рН 4,5) доводили до 0,5 М хлоридом натрия, 0,1% SDS до конечного объема 1 мл и добавляли 10-20 мг mРЕG5000-гидразида, семикарбазида или оксиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение 40 часов при комнатной температуре и выделяли очисткой на колонке с Сефакрилом S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) с использованием 20 мМ натрийцитратного (7,0) буфера, содержащего 100 мМ NaCl.
Конъюгаты mPEG-EPO анализировали с помощью SDS-PAGE (Bio-RAD, Herculus, СА) различными методами: окраской Кумасси (специфичной для белков), вестерн-блоттинг (специфичным для ЕРО) и окраской йодом (специфичной для PEG). Миграционное расстояние конъюгатов mPEG-EPO с большим молекулярным весом в SDS-PAGE меньше, чем у нативного ЕРО. Полученный образец изоэлектрического фокусирования свидетельствует, что изоэлектрическая точка (рI) ЕРО существенно не меняется при модификации. Однако трансаминированный ЕРО несколько более закислен, чем нативный ЕРО и mPEG-EPO.
Так как полосы ЕРО и mPEG-EPO хорошо разделялись в SDS-PAGE, данную методику можно было использовать для эффективного мониторинга реакции конъюгации. Наблюдали, что реакция конъюгации достигала >95% полноты при использовании mРЕG5000-гидразидкарбоксилата, тогда как данная реакция составляла лишь около 20% полноты при использовании mРЕG5000-гидразида, mРЕG5000-семикарбазида или mPEG5000-оксиламина. Следовательно, гидразидкарбоксилатная составляющая является более реакционноспособной в отношении карбонильных групп, чем гидразидная, семикарбазидная или оксиламинная составляющая.
4. Реакционная способность mPEG-EPO с антителом анти-ЕРО
Антигенность mPEG-EPO изучали с использованием набора QuantikineTM IVDTM ЕРО ELISA (R& D systems, Minneapolis, MN). Данный анализ состоит из плашки для микротитрования, покрытой моноклональным антителом к ЕРО. ЕРО или mPEG-EPO давали возможность реагировать с покрытой плашкой. После отмывания плашки добавляли конъюгат поликлонального антитела анти-ЕРО и пероксидазы хрена. После удаления избытка конъюгата в лунки добавляли хромоген и окисляли с помощью ферментативной реакции с образованием комплекса, окрашенного в голубой цвет. Абсорбцию данного комплекса измеряли при 450 нм.
Результаты, полученные в анализе ELISA, для mPEG-EPO с гидразоновой связью, образованной из гидразинкарбоксилата (HZC) и гидразида (HZ), представлены на фигуре 5. Эти данные свидетельствуют о том, что даже одна молекула PEG, присоединенная по N-концу ЕРО, существенно уменьшает сродство моноклональных антител к связыванию с ЕРО, что, вероятно, обусловлено стерическим препятствием.
5. Активность mPEG-EPO in vitro
Биологическую активность mPEG-EPO in vitro оценивали на основании анализа клеточной пролиферации с использованием клеток FDC-P1/HER, мышиной гемопоэтической клеточной линии. Эта линия клеток экпрессирует рецептор ЕРО, и ее рост зависит от ЕРО. После того как клетки растили в отсутствие ЕРО в течение 24 часов, к этим клеткам добавляли ЕРО или mPEG-EPO. Клетки инкубировали в течение 42 часов, а затем к клеткам добавляли меченный по тритию тимидин. Через 6 часов определяли клеточный рост по включению тимидина.
Результаты анализа клеточной пролиферации, полученные для трансаминированного ЕРО и mPEG-EPO с гидразоновой связью, образованной из гидразинкарбоксилата (HZC) и гидразида (HZ), представлены на фигуре 6. Трансаминированный ЕРО демонстрирует полную биологическую активность, сопоставимую с нативным ЕРО, что определено по его ED50. Образцы mPEG-EPO с гидразоновыми связями, образованными из гидразинкарбоксилата (HZC) и гидразида (HZ), сохраняют соответственно лишь 38,5 и 25% активности, как определено по их ED50. Полученные данные свидетельствуют о том, что одна молекула PEG, присоединенная по N-концу ЕРО, существенно уменьшает сродство ЕРО к своему рецептору, что, вероятно, обусловлено стерическим препятствием.
6. Активность mPEG-EPO in vivo
Активность mPEG-EPO оценивали с помощью постгипоксийного биоанализа мыши (Coates P.M. с соавт., Nature, 1961, 191, 1065). Эндогенное образование мышиных эритроцитов супрессировали с помощью полицитемии, полученной при воздействии пониженного давления. ЕРО или конъюгат mPEG-EPO инъецировали на уровне 1 единицы/мышь. Железо-59 вводили через 48 часов после инъекции ЕРО или mPEG-EPO. Включение железа-59, которое указывает на образование новых эритроцитов крови, измеряли через 48, 72 и 96 часов после введения ЕРО или mPEG-EPO.
Результаты постгипоксийного биоанализа мыши для mPEG-EPO с гидразоновой связью, образованной с гидразинкарбоксилатом (HZC), гидразидом (HZ) и семикарбазидом (SCZ), представлены на фигуре 7. Образцы mPEG-EPO обнаруживают высокую активность in vivo, а также более продолжительную активность в сравнении с нативным ЕРО. Результаты in vivo свидетельствуют о том, что образцы mPEG-EPO обладают более продолжительным временем кровотока in vivo и поддерживают высвобождение ЕРО в течение кровотока.
7. Получение mPEG-фибринового димера 17-29
Фибриновый димер 17-29 обладает нижеследующей структурой:
Figure 00000002

2 мг фибринового димера 17-29 растворяли в 0,5 мл 2 М ацетата натрия, 0,4 М уксусной кислоты, 0,1 М глиоксалевой кислоты и 10 мМ сульфата меди (рН 5,5). Данную реакцию осуществляли в течение 2-х часов при комнатной температуре и останавливали добавлением 20 мл 0,5 М ЭДТА. Трансаминированный фибриновый димер выделяли очисткой с помощью колонки с Сефадексом G-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) с использованием 100 мМ натрийацетатного (рН 4,5) буфера.
Трансаминированный фибриновый димер обнаруживает существенное уменьшение Gly в аминокислотном анализе, что свидетельствует о трансаминировании N-концевого Gly.
1 мг трансаминированного фибринового димера в 0,5 мл 100 мМ ацетата натрия (рН 4,5) добавляли к 10 мг mPEG5000-гидразинкарбоксилата. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. mPEG-фибриновый димер выделяли очисткой с помощью анионобменной хроматографии на колонке НЕМА IEC BIO CM (Alltech). Подвижная фаза А представляет собой 20 мМ ацетата натрия (рН 5,5). Подвижная фаза В представляет собой 0,2 М MOPS, 0,05 М одноосновного фосфата калия и 0,25 М двухосновного фосфата калия (рН 7,5). Градиент составлял 100% А в течение 5 минут, затем 0-100% В в течение 25 минут. Новый пик на 14,5 минутах, возникающий перед немодифицированным фибриновым димером (18 минут), собирали для дальнейшего анализа. Масс-спектр лазерной десорбции обнаруживает ион на m/z 8070,9, который доказывает, что одна молекула PEG была присоединена к фибриновому димеру (m/z 29,86,8).

Claims (12)

1. Композиция, состоящая по существу из пептида или белка и PEG или его производного, ковалентно связанного с ним по N-концевому α-углеродному атому полипептида, при условии, что (а) PEG и полипептид связаны друг с другом через гидразоновую связь или восстановленную гидразоновую связь, (b) PEG обладает молекулярной массой примерно 700-20000 дальтон, (с) природная функция полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы, и (d) N-концевой аминокислотный остаток белка не является серином или треонином.
2. Композиция по п. 1, в которой белок представляет собой ЕРО или его производное.
3. Композиция по п.1, в которой PEG или его производное обладает молекулярной массой около 5000 дальтон.
4. Композиция по п.1, в которой белок представляет собой ЕРО, а полимер представляет собой mPEG, обладающий молекулярной массой около 5000 дальтон.
5. Способ ковалентного связывания водорастворимого полимера с N-концевым α-углеродным атомом полипептида, который включает в себя нижеследующие стадии: (а) контактирование полипептида (i) с глиоксилатным ионом или его производным в концентрации примерно 0,1-2,0 М, (ii) с ионом переходного металла в концентрации примерно 10 мкМ-1 М, и (iii) с основанием Льюиса в концентрации примерно 10 мМ-1,0 М, при рН примерно 5,0-7,0 и температуре примерно 0-100oС, так, чтобы образовался трансаминированный полипептид, обладающий N-концевой α-карбонильной группой; и (b) контактирование указанного трансаминированного полипептида при рН примерно 3,0-5,0 с PEG или его производным, обладающим составляющей, ковалентно связанной с ним, которая взаимодействует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывающей PEG с N-концевым α-углеродным атомом полипептида, при условии, что PEG обладает молекулярной массой примерно 700-20000 дальтон, а природная функция полипептида не утрачивается при удалении его N-концевой α-аминогруппы.
6. Способ по п.5, в котором белок представляет собой ЕРО или его производное.
7. Способ по п.5, в котором PEG или его производное обладает молекулярной массой примерно 5000 дальтон.
8. Способ по п.5, в котором составляющая, ковалентно связанная с полимером, представляет собой гидразинкарбоксилат.
9. Способ по п.5, в котором белок представляет собой ЕРО, полимер представляет собой mPEG, обладающий молекулярной массой около 5000 дальтон, и составляющая, ковалентно связанная с полимером, представляет собой гидразинкарбоксилат.
10. Способ по п.5, который дополнительно включает в себя стадию восстановления гидразоновой связи, образованной на стадии (b), так, чтобы образовалась восстановленная гидразоновая связь.
11. Фармацевтическая композиция, которая включает в себя эффективное количество композиции по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Набор для применения при получении композиции по п.1, который включает в себя нижеследующее: (а) глиоксилатный ион или его производное, (b) ион переходного металла, (с) основание Льюиса и (d) PEG или его производное, обладающее молекулярной массой примерно 700-20000 дальтон и обладающее составляющей, ковалентно связанной с ним, которая взаимодействует с N-концевой α-карбонильной группой трансаминированного полипептида с образованием гидразоновой связи, ковалентно связывая полимер с N-концевым α-углеродным атомом полипептида.
RU99103679/14A 1996-08-02 1997-08-01 Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером RU2199347C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2305096P 1996-08-02 1996-08-02
US60/023,050 1996-08-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU99103679A RU99103679A (ru) 2001-01-27
RU2199347C2 true RU2199347C2 (ru) 2003-02-27

Family

ID=21812842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU99103679/14A RU2199347C2 (ru) 1996-08-02 1997-08-01 Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6077939A (ru)
EP (2) EP0964702B1 (ru)
JP (1) JP4410852B2 (ru)
KR (1) KR20000029673A (ru)
CN (1) CN100471521C (ru)
AT (1) ATE341344T1 (ru)
AU (1) AU3908597A (ru)
BR (1) BR9711009A (ru)
CA (1) CA2262994A1 (ru)
DE (1) DE69736780T2 (ru)
DK (1) DK0964702T3 (ru)
ES (1) ES2273373T3 (ru)
IL (2) IL128229A0 (ru)
NO (1) NO990465L (ru)
NZ (1) NZ333993A (ru)
PT (1) PT964702E (ru)
RU (1) RU2199347C2 (ru)
SI (1) SI0964702T1 (ru)
WO (1) WO1998005363A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2423380C2 (ru) * 2004-11-12 2011-07-10 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи Сайт-направленная модификация fviii

Families Citing this family (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100361933B1 (ko) * 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
EP1525889A1 (en) 2000-05-15 2005-04-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
AU2001268228A1 (en) 2000-06-08 2001-12-17 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
AU2001273387A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-21 Gryphon Therapeutics, Inc. Polymer-modified bioactive synthetic chemokines, and methods for their manufacture and use
CN1454097A (zh) * 2000-09-08 2003-11-05 格莱风治疗公司 聚合物修饰的合成的蛋白质类
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
JP5170931B2 (ja) * 2000-10-16 2013-03-27 中外製薬株式会社 Ｐｅｇ修飾エリスロポエチン
MXPA03005406A (es) 2000-12-20 2003-09-25 Hoffmann La Roche Conjugados de eritropoyetina.
KR100896971B1 (ko) 2001-02-02 2009-05-14 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 프락토피라노오스 설파메이트 및 에리트로포이에틴을포함하는 신경계 기능장애 치료법
ATE432288T1 (de) 2001-02-27 2009-06-15 Maxygen Aps Neue interferon-beta-ähnliche moleküle
US20040077835A1 (en) * 2001-07-12 2004-04-22 Robin Offord Chemokine receptor modulators, production and use
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
JP2005530678A (ja) 2001-11-28 2005-10-13 オーソーマクニール ファーマシューティカル， インコーポレイテッド 貧血治療用のエリスロポエチン投与療法
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2003078959A2 (en) 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
CN1671420A (zh) 2002-06-21 2005-09-21 诺和诺德医疗保健公司 Peg化因子ⅶ糖型
EP1534269B1 (en) 2002-07-19 2013-10-30 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
US20040091961A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
RS20050502A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency
WO2004061094A1 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Water-soluble thioester and selenoester compounds and methods for making and using the same
BRPI0408358A (pt) 2003-03-14 2006-03-21 Neose Technologies Inc polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
ES2395413T3 (es) * 2003-05-12 2013-02-12 Affymax, Inc. Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina
ES2323465T3 (es) * 2003-05-12 2009-07-16 Affymax, Inc. Peptidos novedosos que se unen al receptor de la eritropoyetina.
MXPA05012314A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Radical separador para peptido modificado con polietilenglicol.
WO2004101600A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
JP2007537986A (ja) * 2003-05-30 2007-12-27 セントカー・インコーポレーテツド トランスグルタミナーゼを用いる新規なエリトロポエチン複合体の形成
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP2263684A1 (en) 2003-10-10 2010-12-22 Novo Nordisk A/S IL-21 derivatives
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
US7842661B2 (en) 2003-11-24 2010-11-30 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin formulations
US20070254834A1 (en) 2003-11-24 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US7368169B2 (en) * 2003-12-01 2008-05-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Hydrazide compounds with angiogenic activity
CA2552892C (en) 2004-01-08 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
US20070105770A1 (en) * 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
RU2385879C2 (ru) 2004-01-21 2010-04-10 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Способ конъюгации пептидов, опосредованной трансглутаминазой
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005253979A1 (en) * 2004-06-08 2005-12-29 Alza Corporation Preparation of macromolecular conjugates by four-component condensation reaction
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
EP1836298B1 (en) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
DK1828224T3 (en) 2004-12-22 2016-07-18 Ambrx Inc Compositions containing, methods including, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES
US7816320B2 (en) * 2004-12-22 2010-10-19 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid at position 35
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP1848461A2 (en) * 2005-02-16 2007-10-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
WO2007010552A2 (en) * 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
CA2602654A1 (en) 2005-04-05 2006-10-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Method for shielding functional sites or epitopes on proteins
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
ATE529442T1 (de) 2005-06-03 2011-11-15 Ambrx Inc Verbesserte humane interferon-moleküle und ihre verwendungen
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
CA2611836A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Transmucosal delivery of peptide derivatives
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
RU2008105545A (ru) * 2005-08-30 2009-10-10 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) Жидкие препараты пэгилированного гормона роста
AU2006304856A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Synageva Biopharma Corp. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
PT2339014E (pt) 2005-11-16 2015-10-13 Ambrx Inc Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
RU2008150314A (ru) * 2006-05-19 2010-06-27 Гликофи, Инк. (Us) Композиции эритропоэтина
EP2029738A2 (en) 2006-05-24 2009-03-04 Novo Nordisk Health Care AG Factor ix analogues having prolonged in vivo half life
EP2040757A2 (en) * 2006-07-07 2009-04-01 Novo Nordisk Health Care AG New protein conjugates and methods for their preparation
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
EP2054074B8 (en) 2006-08-04 2014-11-12 Prolong Pharmaceuticals, LLC Modified erythropoietin
DK2615108T3 (en) 2006-09-08 2017-01-30 Ambrx Inc Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their applications
WO2008030613A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Hybrid suppressor trna for vertebrate cells
WO2008030614A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
WO2008094275A1 (en) 2007-01-30 2008-08-07 New York University Peptides for treatment of conditions associated with nitric oxide
EP2118127A4 (en) * 2007-01-31 2010-12-01 Affymax Inc NICKET-BASED LINKER FOR BONDING MODIFYING GROUPS OF POLYPEPTIDES AND OTHER MACROMOLECULES
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
CN103965347B (zh) 2007-05-02 2017-07-18 Ambrx公司 经修饰干扰素β多肽和其用途
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US20110159523A1 (en) * 2007-06-27 2011-06-30 Cedars-Sinai Medical Center N-terminal specific chemical labeling for proteomics applications
AU2008326324B9 (en) 2007-11-20 2012-11-15 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
CN101456911A (zh) * 2007-12-12 2009-06-17 江苏豪森药业股份有限公司 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途
WO2009073977A1 (en) * 2007-12-13 2009-06-18 Biovectra Inc. Polypeptides modified by protein trans-splicing technology
EP3103880A1 (en) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
UA118536C2 (uk) 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
EP2157432A1 (en) * 2008-08-15 2010-02-24 Qiagen GmbH Method for analysing a complex sample by mass spectrometry
MX348657B (es) 2008-09-26 2017-06-21 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
EP3216800A1 (en) 2008-09-26 2017-09-13 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
JP5751641B2 (ja) 2009-05-06 2015-07-22 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド メラノコルチン受容体結合コンジュゲート
SG10201401194VA (en) * 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
CN102753573A (zh) 2009-12-21 2012-10-24 Ambrx公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011107591A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
BR112013003522B1 (pt) 2010-08-17 2021-05-25 Ambrx, Inc. polipeptídeos relaxina modificados compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente, seu método de preparação e seu uso, bem como ácido nucleico e célula hospedeira
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN102652836A (zh) * 2011-03-03 2012-09-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 靶向释药的抗癌蛋白质或多肽聚合物前药及其制备方法
BR112014000055A2 (pt) 2011-07-01 2017-06-13 Bayer Ip Gmbh polipeptídeos de fusão de relaxina e usos dos mesmos
PL2717917T3 (pl) 2011-07-05 2016-12-30 Koniugaty p97 - przeciwciało
EP3505534A1 (en) 2012-06-08 2019-07-03 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising sitespecific nonnatural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
ES2611788T3 (es) 2012-06-26 2017-05-10 Sutro Biopharma, Inc. Proteínas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoácidos no naturales específicos del sitio, conjugados de las mismas, métodos para su preparación y métodos para su uso
JP6433424B2 (ja) 2012-07-31 2018-12-05 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド 脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法
BR112015004022B1 (pt) 2012-08-31 2023-04-25 Sutro Biopharma, Inc Aminoácidos modificados compreendendo um grupo azido
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
CA2890906A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Pictet-spengler ligation for protein chemical modification
CN102935236B (zh) * 2012-11-21 2015-08-26 武汉平华生物医药科技有限公司 一种具有p-糖蛋白抑制功能的抗肿瘤前药
BR112015022416A2 (pt) 2013-03-13 2017-10-24 Bioasis Technologies Inc fragmentos de p97 e seus usos
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
WO2015031673A2 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
CA2921707C (en) 2013-10-15 2023-03-28 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
WO2015081282A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
SG11201807827VA (en) 2016-03-25 2018-10-30 Seattle Genetics Inc Process for the preparation of pegylated drug-linkers and intermediates thereof
JP7244987B2 (ja) 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
CN110637027A (zh) 2017-02-08 2019-12-31 百时美施贵宝公司 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途
IL269398B2 (en) 2017-03-24 2024-05-01 Seagen Inc A process for the preparation of glucuronide-drug binders and their intermediates
US11492493B2 (en) 2017-12-26 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Deep ultraviolet-excitable water-solvated polymeric dyes
EP3775052B1 (en) 2018-03-30 2024-06-05 Becton, Dickinson and Company Water-soluble polymeric dyes having pendant chromophores
TW202015740A (zh) 2018-06-07 2020-05-01 美商西雅圖遺傳學公司 喜樹鹼結合物
CA3107332A1 (en) 2018-07-22 2020-01-30 Bioasis Technologies Inc. Treatment of lymphatic metastases
US20220056093A1 (en) 2018-09-11 2022-02-24 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
EP3867265A1 (en) 2018-10-19 2021-08-25 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CN109400695B (zh) * 2018-10-31 2020-06-30 中南大学湘雅医院 一种多肽的修饰方法及应用
BR112021015832A2 (pt) 2019-02-12 2022-01-18 Ambrx Inc Composições que contêm conjugados de anticorpo-agonista de tlr, métodos e usos dos mesmos
CA3152316A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Scott C. Jeffrey Camptothecin peptide conjugates
KR20220151202A (ko) 2020-03-11 2022-11-14 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 사용 방법
US20230173093A1 (en) 2020-04-10 2023-06-08 Seagen Inc. Charge variant linkers
US20210355468A1 (en) 2020-05-18 2021-11-18 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating lewy body dementia
US20210393787A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating frontotemporal dementia
JP2023538071A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 アンブルックス，インコーポレイテッド 抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲート、その方法及び使用
BR112023014128A2 (pt) 2021-01-15 2023-10-31 Seagen Inc Conjugados de anticorpo-fármaco imunomodulatórios
KR20230152679A (ko) 2021-02-03 2023-11-03 씨젠 인크. 면역자극 화합물 및 접합체
CA3213805A1 (en) 2021-04-03 2022-10-06 Feng Tian Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2022283467A1 (en) 2021-05-28 2023-12-07 Seagen Inc. Anthracycline antibody conjugates
EP4155349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-29 Becton, Dickinson and Company Water-soluble yellow green absorbing dyes
AU2022385379A1 (en) 2021-11-09 2024-06-20 Forschungsverbund Berlin E.V. Conjugates comprising a phosphorus (v) and a drug moiety
CA3237379A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Marc-Andre Kasper Conjugates comprising a phosphorus (v) and a camptothecin moiety
TW202400137A (zh) 2022-03-17 2024-01-01 美商思進公司 喜樹鹼偶聯物
WO2023215740A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Seagen Inc. Immunomodulatory antibody-drug conjugates
WO2024007016A2 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Beckman Coulter, Inc. Novel fluorescent dyes and polymers from dihydrophenanthrene derivatives
WO2024030577A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Seagen Inc. Immunostimulatory anti-pd-l1-drug conjugates
EP4321522A1 (en) 2022-08-12 2024-02-14 Seagen Inc. Cytotoxic compounds and conjugates thereof
WO2024044327A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Beckman Coulter, Inc. Dhnt monomers and polymer dyes with modified photophysical properties
US20240190958A1 (en) 2022-10-18 2024-06-13 Tubulis Gmbh Novel antibody drug conjugates with novel napi2b antibodies, therapeutic methods and uses thereof
WO2024083953A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Tubulis Gmbh Novel anti-tpbg antibody and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024129756A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Seagen Inc. Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4835260A (en) 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5267142A (en) 1989-04-26 1993-11-30 Fanuc Ltd. Method for phase-synchronized spindle rotation control
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
JPH03151399A (ja) * 1989-11-07 1991-06-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 変異ヒトエリスロポエチン
JPH06506217A (ja) * 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
CZ286046B6 (cs) 1993-04-29 1999-12-15 Abbott Laboratories Přípravky na bázi analogů erythropoietinu a způsoby jejich přípravy a farmaceutické přípravky s jejich obsahem
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
ATE171650T1 (de) 1993-06-03 1998-10-15 Beckman Coulter Inc Probentraeger
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. of Protein Chemistry. 1984, v. 3/1. *
БЕРЕЗИН И.В., МАРТИНЕК К. Введение в прикладную энзимологию. - М.: Из-во Московского ун-та, 1982, с.103. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2423380C2 (ru) * 2004-11-12 2011-07-10 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи Сайт-направленная модификация fviii

Also Published As

Publication number Publication date
CN1226176A (zh) 1999-08-18
CN100471521C (zh) 2009-03-25
EP1731174A3 (en) 2007-01-17
DE69736780T2 (de) 2007-09-06
CA2262994A1 (en) 1998-02-12
NO990465D0 (no) 1999-02-01
US6077939A (en) 2000-06-20
AU3908597A (en) 1998-02-25
BR9711009A (pt) 1999-08-17
SI0964702T1 (sl) 2007-02-28
ES2273373T3 (es) 2007-05-01
JP2000515553A (ja) 2000-11-21
EP0964702A2 (en) 1999-12-22
DE69736780D1 (de) 2006-11-16
NO990465L (no) 1999-03-23
IL128229A0 (en) 1999-11-30
WO1998005363A3 (en) 1998-05-07
KR20000029673A (ko) 2000-05-25
EP1731174A2 (en) 2006-12-13
ATE341344T1 (de) 2006-10-15
DK0964702T3 (da) 2007-01-08
JP4410852B2 (ja) 2010-02-03
EP0964702B1 (en) 2006-10-04
IL128229A (en) 2007-07-04
PT964702E (pt) 2006-12-29
NZ333993A (en) 2000-01-28
WO1998005363A2 (en) 1998-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2199347C2 (ru) Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером
JP6581157B2 (ja) エリスロポエチンの多糖誘導体
US6451986B1 (en) Site specific protein modification
JP4656814B2 (ja) エリスロポエチンコンジュゲート
US20090239790A1 (en) Novel recombinant proteins with n-terminal free thiol
JP2005509609A (ja) Ｐｅｇ化およびジグリコシル化されたエリスロポエチン
AU778790B2 (en) Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
MXPA99001184A (en) Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer