ES2273373T3 - Polipeptidos que tienen unido a su extremo n un unico polimero soluble al agua. - Google Patents
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- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Abstract
LA INVENCION SUMINISTRAN COMPOSICIONES QUE CONSTAN ESENCIALMENTE DE UN POLIPEPTIDO Y DE UN POLIMERO SOLUBLE EN AGUA COVALENTEMENTE ENLAZADO AL MISMO EN EL ATOMO DE CARBONO AL DEL TERMINAL N POR MEDIO DE UNA HIDRAZONA O DE UN ENLACE DE HIDRAZONA REDUCIDO, O DE UN OXIMO O DE UN ENLACE DE OXIMO REDUCIDO. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA PROCEDIMIENTOS PARA LA ELABORACION DE COMPOSICIONES INSTANTANEAS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN LAS MISMAS, Y EQUIPOS PARA SU USO EN LA PREPARACION DE LAS MISMAS.
Description
Polipéptidos que tienen unido a su extremo N un
único polímero soluble al agua.
La presente invención se refiere a polipéptidos
que tienen unido en su extremo N un único polímero soluble en agua.
Estos polipéptidos tienen propiedades que hacen que sean ventajosos
para ser utilizados como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. La
invención se refiere también a métodos para producir estos
polipéptidos y a composiciones farmacéuticas y kits
relacionados.
A lo largo de esta solicitud, se citan varias
publicaciones. La descripción de estas publicaciones se incorpora de
este modo a esta solicitud por referencia con el fin de describir
más a fondo el estado de la técnica a la que pertenece esta
invención.
En los años recientes, polímeros no antigénicos
solubles en agua, tales como polietilén glicol ("PEG"), han
sido utilizados para la modificación covalente de polipéptidos con
importancia terapéutica y diagnóstica. Por ejemplo, se ha descrito
que la unión covalente de PEG a polipéptidos terapéuticos tales como
interleuquinas (Knauf, M.J. y col., J. Biol. Chem. 1988, 263,
15.064; Tsutsumi, Y. y col., J. Controlled Release 1995, 33,
447), interferones (Kita, Y. y col., Drug Des. Delivery 1990,
6, 157), catalasa (Abuchowski, A. y col., J. Biol. Chem.
1977, 252, 3.582), superóxido dismutasa (Beauchamp, C.O. y col.,
Anal. Biochem. 1983, 131, 25) y adenosina desaminasa (Chen,
R. y col., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293) prolonga su
semivida in vivo y/o reduce su inmunogenicidad y
antigenicidad.
Sin embargo, tales métodos tienen serios
inconvenientes. Específicamente, en la mayoría de los casos, las
moléculas de PEG son unidas a través de los grupos amino de los
polipéptidos utilizando PEG metoxilado ("mPEG") que tiene
diferentes restos reactivos. Tales polímeros incluyen
mPEG-succinimidil succinato,
mPEG-succinimidil carbonato,
mPEG-imidato y mPEG-cloruro
cianúrico. La unión utilizando estos polímeros era normalmente no
específica, esto es, tenía lugar en varios grupos amino de los
polipéptidos de manera aleatoria y no exclusivamente en un grupo
amino particular. Tal unión no específica puede modificar los
residuos de aminoácido en sitios activos, de tal manera que elimina
la actividad biológica de los polipéptidos. Además, los conjugados
resultantes pueden contener una mezcla heterogénea de polipéptido
modificado, lo cual es indeseable para uso farmacéutico.
Para resolver estos problemas, era deseable unir
un polímero a un polipéptido específicamente en un sitio. Para el
polipéptido, el hacer esto conservaría la actividad biológica,
prolongaría el tiempo de circulación en la sangre, reduciría la
inmunogenicidad, incrementaría la solubilidad acuosa y aumentaría la
resistencia a la digestión por proteasas. Se ha llevado a cabo
pegilación específica de sitio en el extremo N, en la cadena
lateral y en el extremo C de un análogo potente del factor liberador
de la hormona de crecimiento mediante síntesis en fase sólida
(Felix, A.M. y col., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46,
253). Como la pegilación específica se llevó a cabo durante el
ensamblaje del péptido en una resina, el método no puede ser
aplicado a un péptido existente.
Un método adicional utilizado implicaba la unión
de un péptido a los extremos de cadenas de PEG injertadas en la
superficie de liposomas de una manera específica de sitio a través
de un grupo aldehído reactivo en el extremo N generado por la
oxidación con peryodato de sodio de la treonina
N-terminal (Zalipsky, S. y col., Bioconj.
Chem. 1995, 6, 705). Sin embargo, este método está limitado a
polipéptidos con residuos de serina o treonina
N-terminales.
Se han descrito también métodos asistidos por
enzimas para introducir grupos activados específicamente en el
extremo C de un polipéptido (Schwarz, A. y col., Methods Enzymol.
1990, 184, 160; Rose, K. y col., Bioconjugate Chem. 1991, 2,
154; Gaertner, H.F. y col., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224).
Típicamente, estos grupos activos pueden ser hidrazida, aldehído y
grupos amino aromáticos para la unión posterior de sondas
funcionales a polipéptidos. Sin embargo, como estos métodos están
basados en la especificidad de proteasas, requieren una precaución
extrema y el alcance de su aplicación es limitado.
La mutagénesis específica de sitio es un
abordaje más que ha sido utilizado con el fin de preparar
polipéptidos para la unión específica de sitio de un polímero. WO
90/12874 describe la pegilación dirigida a un sitio de proteínas
modificadas por la inserción de residuos de cisteína o por la
sustitución de residuos de cisteína por otros residuos. Esta
publicación describe también la preparación de
mPEG-eritropoyetina
("mPEG-EPO") mediante la reacción de un
derivado de mPEG específico para cisteína con un residuo de cisteína
introducido recombinantemente en la EPO. De manera similar, la
interleuquina-2 fue pegilada en su sitio de
glicosilación después de mutagénesis dirigida a un sitio (Goodson,
R.J. y col., Bio/Technology 1990, 8, 343).
Las glicoproteínas proporcionan carbohidratos
como sitios diana adicionales para modificación. El enzima
peroxidasa ha sido modificado con PEG-diamina a
través de su resto carbohidrato (Urrutiogoity, M. y col.,
Biocatalysis 1989, 2, 145). WO 94/28024 describe los métodos
para preparar mPEG-EPO a través de carbohidrato
oxidado con peryodato. La química implicada era la formación de
hidrazona mediante la reacción de mPEG-hidrazida con
grupos aldehído del resto carbohidrato de la EPO. Este tipo de
modificación produce grupos aldehído reactivos mediante una etapa
de oxidación, que potencialmente puede oxidar varios tipos de
residuos de azúcar del resto carbohidrato y algunos residuos de
aminoácido del polipéptido, tales como metionina. Otra desventaja de
este método deriva de la heterogeneidad de los restos carbohidrato
de la PEG. La EPO expresada por células de ovario de hámster chino
tiene cuatro cadenas de carbohidratos, que incluyen tres cadenas
ligadas a N en las asparraginas 24, 38 y 83 y una cadena ligada a O
en la serina 126. Se han identificado un total de 52 estructuras
oligosacarídicas diferentes unidas a N y al menos 6 unidas a O
(Rush, R.S. y col., Anal. Chem. 1995, 67, 1442; Linsley, K.B.
y col., Anal. Biochem. 1994, 219, 207). Por consiguiente, es
difícil controlar el número de, o los sitios de fijación de,
moléculas poliméricas cuando se modifica la EPO u otra proteína a
través de sus cadenas carbohidratadas.
En resumen, los métodos de la técnica para unir
un polímero soluble en agua a un polipéptido padecen serios
inconvenientes. Estos inconvenientes incluyen los siguientes: (a)
una falta de precisión, estequiométricamente y con respecto al
lugar de unión; (b) la necesidad de llevar a cabo técnicas difíciles
y de intenso trabajo tales como la mutagénesis específica de un
sitio; (c) la necesidad de utilizar síntesis peptídica en fase
sólida simultáneamente con la unión del polímero, en lugar de unir
un polímero a un polipéptido preexistente; y (d) el requisito
rígido de que la identidad del residuo de aminoácido
N-terminal sea treonina o serina.
Durante algún tiempo, ha existido la necesidad
de un método general para unir de manera específica de sitio un
polímero soluble en agua al residuo de aminoácido
N-terminal de un polipéptido, método que no padezca
los inconvenientes anteriormente identificados. Sin embargo, tal
método no existe.
Esta invención proporciona dos composiciones de
materia. La primera composición de materia consta esencialmente de
un polipéptido y de un polímero soluble en agua unido covalente al
mismo en el átomo de carbono \alpha N-terminal
del polipéptido a través de un enlace hidrazona o de un enlace
hidrazona reducida, con la condición de que (a) el polímero tenga
un peso molecular de 700 a 20.000 daltons, (b) la función natural
del polipéptido no sea eliminada después de la eliminación de su
grupo \alpha-amino N-terminal y
(c) el residuo de aminoácido N-terminal del
polipéptido no sea serina o treonina.
Esta invención proporciona también cuatro
métodos para unir covalentemente un polímero soluble en agua al
átomo de carbono \alpha N-terminal de un
polipéptido. El primer método, que une el polímero al átomo de
carbono a través de un enlace hidrazona, comprende las etapas de
- (a)
- la puesta en contacto del polipéptido con (i) un ión glioxilato o un derivado del mismo a una concentración de 0,1 M a 2,0 M, (ii) un ión de un metal de transición a una concentración de 10 \muM a 1 M, y (iii) una base de Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH de 5,0 a 7,0 y a una temperatura de 0ºC a 100ºC, para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo \alpha-carbonilo N-terminal; y
- (b)
- la puesta en contacto del polipéptido transaminado, a un pH de 3,0 a 5,0, con un polímero soluble en agua que tiene unido a él covalentemente un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el polímero al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido a través de un enlace hidrazona, con la condición de que el polímero tenga un peso molecular de 700 a 20.000 daltons y que la función natural del polipéptido no sea eliminada después de la eliminación de su grupo \alpha-amino N-terminal.
Esta invención proporciona también una
composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de la
presente primera composición y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Finalmente, esta invención proporciona kits para
ser utilizados en la preparación de las presentes composiciones. El
primer kit, para preparar la presente primera composición, contiene
lo siguiente:
- (a)
- un ión glioxilato o un derivado del mismo;
- (b)
- un ión de un metal de transición;
- (c)
- una base de Lewis y
- (d)
- un polímero soluble en agua con un peso molecular de 700 a 20.000 daltons, y que tiene unido covalentemente al mismo un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal de un polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el polímero al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido.
Figura 1 muestra un esquema para preparar EPO
modificada N-terminalmente. Ésta es una reacción de
dos etapas: transaminación y pegilación. Se utilizaron cuatro
derivados de mPEG5000 (esto es, mPEG con un peso molecular de 5000
daltons) con los grupos funcionales carboxilato de hidrazina (HZC),
hidrazida (HZ), semicarbazida (SCZ) y oxilamina.
Figura 2 muestra el cromatograma de filtración
en gel de mPEG-EPO con un enlace hidrazona formado
utilizando un resto carboxilato de hidrazina (HZC), EPO nativa y
mPEG5000 carboxilato de hidrazina en una columna TSK G3000SW_{XL}
(7,5 x 30 mm). La fase móvil es citrato de sodio 20 mM (pH 7,0)
conteniendo NaCl 100 mM.
Figura 3 muestra un espectro de masas con
tiempo de vuelo por desorción con láser asistido por una matriz de
mPEG5000 carboxilato de hidrazina, EPO nativa y
mPEG-EPO con un enlace hidrazona formado mediante la
utilización de un resto carboxilato de hidrazina (HZC).
Figura 4 muestra la caracterización de
mPEG-EPO mediante métodos electroforéticos: (1) SDS
4-15%-PAGE, tinción de Coomassie; (2) Transferencia
Western; (3) 4-15% SDS-PAGE, tinción
con yodo y (4) enfoque isoeléctrico (IEF, pH 3-7).
Calle 1, marcadores de peso molecular o de pI; Calle 2, EPO nativa;
Calle 3, EPO transaminada; y Calles 4 y 5, mPEG-EPO
con enlaces hidrazona formados utilizando restos carboxilato de
hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ), respectivamente.
Figura 5 muestra una gráfica de los resultados
de un ensayo de ELISA para mPEG-EPO con enlaces
hidrazona formados utilizando restos carboxilato de hidrazina (HZC)
e hidrazida (HZ).
Figura 6 muestra una gráfica de los resultados
de un ensayo de proliferación celular de EPO nativa, EPO
transaminada y mPEG-EPO con enlaces hidrazona
formados utilizando restos carboxilato de hidrazina (HZC) e
hidrazida (HZ).
Figura 7 muestra una gráfica de los resultados
de un bioensayo en ratón exhipóxico para mPEG-EPO
con enlaces hidrazona formados utilizando restos carboxilato de
hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) y semicarbazida (SCZ).
Esta invención proporciona dos composiciones de
materia. La primera composición de materia consta esencialmente de
un polipéptido y un polímero soluble en agua unido covalentemente al
mismo en el átomo de carbono \alpha N-terminal del
polipéptido a través de un enlace hidrazona o de un enlace hidrazona
reducida, con la condición de que (a) el polímero tenga un peso
molecular de 700 a 20.000 daltons, (b) la función natural del
polipéptido no sea eliminada tras la eliminación de su grupo
\alpha-amino N-terminal y (c) el
residuo de aminoácido N-terminal del polipéptido no
sea serina ni treonina.
Según se utiliza en la presente,
"polipéptido" incluye péptidos y proteínas. "Péptido"
significa un polipéptido de menos de 10 residuos de aminoácidos de
longitud, y "proteína" significa un polipéptido de 10 o más
residuos de aminoácidos de longitud. En esta invención, los
polipéptidos pueden ser polipéptidos existentes en la naturaleza o
recombinantes (esto es, producidos mediante la tecnología de ADN
recombinante) y pueden contener mutaciones (por ejemplo mutaciones
puntuales, por inserción y deleción) así como otras modificaciones
covalentes (por ejemplo glicosilación y marcaje [a través de
biotina, estreptavidina, fluoracina y radioisótopos tales como
I^{131}]). Además, cada una de las presentes composiciones puede
contener más de un único polipéptido, esto es, cada una puede ser un
monómero (un polipéptido unido a un polímero) o un multímero (dos o
más polipéptidos unidos a un polímero o
entre sí).
entre sí).
Los polipéptidos incluyen, a manera de ejemplo,
anticuerpos monoclonales y policlonales, citoquinas tales como
M-CSF y GM-CSF, linfoquinas,
IL-2, IL-3, factores de crecimiento
tales como PDGF y EGF, hormonas peptídicas tales como hGH, EPO y
derivados de las mismas, factores de coagulación de la sangre tales
como el Factor VIII, inmunógenos, enzimas, inhibidores enzimáticos
y otros ligandos. En la realización preferida de las presentes
composiciones, el polipéptido es EPO o un derivado de la misma. La
EPO puede ser la existente en la naturaleza o recombinante. Los
derivados de EPO incluyen, pero no se limitan a, los
polipéptidos
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG,
VGNYMCHFGPITWVCRPGGG,
GGVYACRMGPITWVCSPLGG,
VGNYMAHMGPITWVCRPGG,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ,
GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,
TIAQYICYMGPETWECRPSPKA,
YSCHFGPLTWVCK y
YCHFGPLTWVC,
así como los mutantes enumerados en la Tabla 1
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
‡ relativa al tipo salvaje se define según sigue: | |
++++ = actividad igual que la del tipo salvaje o mejor | |
+++ = un 75% de la actividad del tipo salvaje aproximadamente | |
++ = un 50% de la actividad del tipo salvaje aproximadamente | |
+ = un 25% de la actividad del tipo salvaje aproximadamente | |
\begin{minipage}[t]{150mm} +/- = EPO mutante que se ha informado que es activa, sin embargo, los datos no están completos para la determinación de la actividad relativa al tipo salvaje.\end{minipage} |
(1) Akai, K., Yamaguchi, K. y
Ueda, M., Modified forms of human erythropoietin and DNA
sequences encoding genes which can express them, EP 0427 189 A1.
(2) Bittorf, T., Jaster, R. y
Brock, J. (1993) FEBS Letts. 336:
133-136.
(3) Resultados de Bunn, H.F. y col.
(4) Byrne, T.E. y Elliott, S.G.,
Erythropoietin isoforms, EP 0 668 351 A1.
(5) Chern, Y., Chung, T. y
Sytkowski, A.J. (1991) Eur. J. Biochem. 202:
225-229.
(6) Funakoshi, A., Muta, H.,
Baba, T. y Shimizu, S. (1993) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 195: 717-722.
(7) Okasinski, G., Devries, P.J.,
Mellovitz, B.S., Meuth, J.L. y Schaefer, V.G.,
Erythropoietin analog compositions and methods, WO 94/25055.
(8) Grodberg, J., Davis, K.L. y
Sytkowski, A.J. (1993) Eur. J. Biochem. 218:
597-601.
(9) Resultados de Pulito, V. y col.
(10) Shoemaker, C.B., Erythropoietin
composition, U.S. 4.835.260.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se utiliza en la presente, la "función
natural" de un polipéptido significa su función antes de la
modificación covalente de su grupo \alpha-amino
N-terminal. Las funcionales naturales incluyen, por
ejemplo, actividad enzimática, unión a receptores (por ejemplo
anticuerpos), unión a ligandos e inmunogenicidad.
Los presentes métodos descritos con más detalle
posteriormente causan la pérdida del grupo
\alpha-amino N-terminal del
polipéptido que está siendo modificado covalentemente. Por
consiguiente, el polipéptido debe tener una estructura primaria de
tal manera que se conserve su función natural después de la
modificación covalente y no pueda ser eliminada. La función natural
del polipéptido es "eliminada" por la eliminación de su grupo
\alpha-amino N-terminal si tal
eliminación reduce, más de un 99%, la capacidad del polipéptido
para realizar su función natural. En una realización, la eliminación
no reduce la capacidad del polipéptido para llevar a cabo su función
natural en más de un 90%. En la realización preferida, la
eliminación no reduce la capacidad del polipéptido para llevar a
cabo su función natural en más de un 50%.
Según se utiliza en la presente, un "enlace
hidrazona" es un enlace que comprende la estructura covalente
NH-N=C, y un "enlace hidrazona reducida" es un
enlace que comprende la estructura covalente
NH-NH-C. En la presente se
proporcionan compuestos que contienen enlaces hidrazona reducida, ya
que estos enlaces poseen mayor estabilidad química.
Según se discutió anteriormente, se conocen
métodos en la técnica para unir polímeros solubles en agua al átomo
de carbono \alpha N-terminal de un polipéptido a
través de un enlace hidrazona siempre que el residuo de aminoácido
N-terminal sea serina o treonina. Estos métodos
conocidos no funcionan en polipéptidos que tengan otro residuo
N-terminal. Aunque estos métodos conocidos difieren
fundamentalmente de los presentes métodos, tienen como resultado
polipéptidos con serina y treonina N-terminales que
tienen un polímero unido en el átomo de carbono \alpha
N-terminal a través de un enlace hidrazona. Por esta
razón, la presente primera composición no incluye un polipéptido
unido a un polímero a través de un enlace hidrazona, cuando el
residuo de aminoácido N-terminal del polipéptido
sea serina o treonina.
Los polímeros solubles en agua utilizados en la
presente invención incluyen, (d) polialquilén glicol y derivados
del mismo, incluyendo PEG, mPEG, homopolímeros de PEG, homopolímeros
de polipropilén glicol, copolímeros de etilén glicol con propilén
glicol, donde dichos homopolímeros y copolímeros no están
sustituidos o están sustituidos en un extremo con un grupo alquilo.
Estos polímeros pueden ser lineales, ramificados o con forma de
estrella, con un amplio rango de pesos moleculares. En la
realización preferida, el polímero es mPEG.
Cuando las presentes composiciones van a ser
utilizadas como agentes farmacéuticos, el polímero no es tóxico.
Además, cuando se dice que un polímero tiene un peso molecular dado,
ese peso molecular puede ser únicamente aproximado, reflejando el
peso molecular medio de una población de moléculas poliméricas que
difieren unas respecto a las otras con relación al número de
subunidades presentes en cada molécula.
En la realización preferida, el PEG o derivado
del mismo tiene un peso molecular de 5.000 daltons aproximadamente.
Además, en la realización preferida de las presentes composiciones,
el polipéptido es EPO y el polímero es mPEG con un peso molecular
de 5.000 daltons aproximadamente.
\newpage
Esta invención proporciona también cuatro
métodos para unir covalentemente un polímero soluble en agua al
átomo de carbono \alpha N-terminal de un
polipéptido. El primer método, que une el polímero al átomo de
carbono a través de un enlace hidrazona, comprende las etapas de
- (a)
- la puesta en contacto del polipéptido con (i) un ión glioxilato o un derivado del mismo a una concentración de 0,1 M a 2,0 M, (ii) un ión de un metal de transición a una concentración de 10 \muM a 1 M, y (iii) una base de Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH de 5,0 a 7,0 y a una temperatura de 0ºC a 100ºC, para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo \alpha-carbonilo N-terminal; y
- (b)
- la puesta en contacto del polipéptido transaminado, a un pH de 3,0 a 5,0, con un polímero soluble en agua que tiene unido covalentemente a él un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el polímero al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido a través de un enlace hidrazona, con la condición de que el polímero tenga un peso molecular de 700 a 20.000 daltons y que la función natural del polipéptido no sea eliminada después de la eliminación de su grupo \alpha-amino N-terminal.
El tercer método comprende las etapas del primer
método, así como una etapa adicional de reducción del enlace
hidrazona formado en la etapa (b). La etapa de reducción puede ser
realizada mediante la utilización de, por ejemplo, borohidruro de
sodio (NaBH_{4}) y cianoborohidruro de sodio (NaBH_{3}CN), de
acuerdo con métodos conocidos.
Los derivados del ión glioxilato incluyen, pero
no se limitan a, iones glioxilamida y fenilglioxilo. Los iones de
metales de transición incluyen, pero no se limitan a, los iones
cúprico, níquel, cobaltoso o zinc. Las bases de Lewis incluyen,
pero no se limitan a, acetato y piridina.
Los restos que reaccionan con el grupo
\alpha-carbonilo N-terminal del
polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona incluyen,
pero no se limitan a, carboxilato de hidrazina, hidrazina,
semicarbazida, hidrazida, tiosemicarbazina, dihidrazida del ácido
carbónico, carbazida, tiocarbazida y arilhidrazida. Polímeros
solubles en agua con estos restos unidos covalentemente a los
mismos están disponibles comercialmente. Además, los restos que
reaccionan con el grupo \alpha-carbonilo
N-terminal del polipéptido transaminado para formar
un enlace oxima incluyen, pero no se limitan a, oxilamina. Polímeros
solubles en agua con oxilamina (así como con otros restos que forman
oximas) unida covalentemente a los mismos están disponibles
comercialmente.
En la realización preferida de los presentes
métodos, la proteína es EPO o un derivado de la misma.
En la realización preferida, el PEG o derivado
del mismo tiene un peso molecular de 5.000 daltons.
En una realización del primer método, el resto
unido al polímero que reacciona con el péptido transaminado es
carboxilato de hidrazina. En la realización preferida, el
polipéptido es EPO, el polímero es mPEG con un peso molecular de
5.000 daltons aproximadamente y el resto unido covalentemente al
polímero es carboxilato de
hidrazina.
hidrazina.
En cada uno de los presentes métodos, el tiempo
de contacto preferido para la etapa (a) es de 20 minutos a 2 horas,
y para la etapa (b), el tiempo de contacto y la temperatura
preferidos son de 10 a 50 horas y de 4ºC a temperatura ambiente,
respectivamente.
Con ciertos polipéptidos, el extremo N de un
polipéptido está "enterrado", esto es, no está expuesto a
solventes o reactivos, cuando el polipéptido está en su conformación
nativa. Pueden utilizarse reactivos tales como tetrametilurea o urea
para desplegar tal polipéptido con el fin de permitir que su residuo
N-terminal experimente las reacciones requeridas de
los presentes métodos.
Esta invención proporciona también una
composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de las
presentes primera o segunda composición, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. A manera de ejemplo, la presente
composición farmacéutica puede contener una cantidad de la presente
mPEG-EPO eficaz para tratar a un sujeto que padezca
anemia.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables son
bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no
se limitan a, tampón fosfato 0,01-0,1 M, y
preferiblemente 0,05 M, o solución salina al 0,8%. Adicionalmente,
tales vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones,
suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de
solventes no acuosos son propilén glicol, polietilén glicol, aceites
vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos
inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos
incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones
alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados.
Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio,
dextrosa en Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o
aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de
fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los
basados en la dextrosa en Ringer, etc. Pueden estar también
presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo,
antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes,
etc.
\newpage
Finalmente, esta invención proporciona kits para
ser utilizados en la preparación de las presentes composiciones. El
primer kit, para preparar la primera presente composición, comprende
los siguiente:
- (a)
- un ión glioxilato o un derivado del mismo;
- (b)
- un ión de un metal de transición;
- (c)
- una base de Lewis y
- (d)
- un polímero soluble en agua con un peso molecular de 700 a 20.000 daltons, y que tiene unido covalentemente al mismo un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal de un polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el polímero al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido.
Los reactivos de estos kits pueden estar
envasados en una cantidad predeterminada y pueden estar contenidos
en compartimentos separados. Alternativamente, ciertos reactivos
pueden estar contenidos en el mismo compartimento cuando las
restricciones de los presentes métodos lo permitan. Finalmente, los
kits pueden contener además reactivos reductores para generar
enlaces hidrazona reducida de acuerdo con los presentes métodos, así
como tampones y recipientes de reacción adecuados.
Esta invención será comprendida mejor mediante
referencia los Ejemplos Experimentales siguientes, pero los
expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los experimentos
específicos detallados son únicamente ilustrativos de la invención
según está descrita con más detalle en las reivindicaciones que
siguen posteriormente.
Se intercambiaron 5 mg de EPO en citrato de
sodio 20 mM (pH 6,9) y NaCl 100 mM con tampón acetato de sodio 100
mM (pH 7,0) utilizando Centricon-10 (Amicon,
Beverly, MA). Las concentraciones finales fueron ajustadas a 1
mg/ml de EPO, acetato de sodio 2 M, ácido acético 0,4 M, ácido
glioxílico 0,1 M y sulfato cúprico 10 mM (pH 5,5) (Figura 1). La
reacción se dejó 2 horas a temperatura ambiente y fue parada por la
adición de 100 ml de EDTA 0,5 M. La EPO transaminada fue purificada
a través de una columna de Sephadex G-25 (Pharmacia,
Piscataway, NJ) utilizando tampón acetato de sodio 100 mM (pH
4,5).
El grado de transaminación fue calculado por la
2,4-dinitrofenilhidrazina según está descrito en la
literatura (Fields, R. y col., Biochem. J., 1971, 121, 587).
Se midió la extinción a 370 nm después de los primeros minutos y
después de una hora. La diferencia en absorbancia es proporcional a
la cantidad de grupos carbonilo presentes en la molécula de EPO. La
EPO transaminada fue sometida también a análisis de aminoácidos en
un sistema ABI 420H (Applied Biosystems, Foster City, CA)
utilizando la química de PITC en la pre-columna. Los
resultados indican que los residuos de lisina, esto es residuos que
no son N-terminales, no estaban transaminados.
EPO transaminada (1 mg) en acetato de sodio 100
mM (pH 4,5) fue ajustada a cloruro de sodio 0,5 M para un volumen
final 1 ml, a lo cual se añadieron 10 mg de mPEG5000 carboxilato de
hidrazina (Shearwater Polymers, Hunstville, AL). La mezcla de
reacción fue agitada durante 40 horas a temperatura ambiente y
purificada a través de una columna Sephacryl S-200
(Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando un tampón citrato de sodio 20
mM (pH 7,0) conteniendo NaCl 100 mM. Adicionalmente, puede añadirse
a la mezcla de reacción un 0,1% de SDS para incrementar el
rendimiento de la conjugación.
En cromatografía de permeación en gel, el
conjugado mPEG-EPO mostraba un peso molecular
sustancialmente incrementado comparado con los de EPO y mPEG5000
carboxilato de hidrazina (Figura 2).
Se utilizó espectrometría de masas con desorción
por láser asistida por una matriz (Finnigan-MAT
LaserMAT 2000, tiempo de vuelo lineal) para caracterizar la
mPEG-EPO por determinación del peso molecular
(Figura 3). El mPEG500 carboxilato de hidrazina muestra un ión en
m/z 5157,4. La EPO muestra un monómero de dos cargas (m/z 14604), un
monómero de una carga (m/z 28569), un dímero (m/z 57208) y un
trímero (m/z 85284). De manera similar, mPEG-EPO
muestra un monómero de dos cargas (m/z 17092), un monómero de una
carga (m/z 34279), un dímero (m/z 69071) y un trímero (m/z
102955).
Un espectro de dicroísmo circular (DC)
(Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer
Instruments, SA, Edison, NJ) de mPEG-EPO mostró que
la proteína retenía la estructura del haz
\alpha-helicoidal presente en la EPO nativa
(datos no mostrados). Este resultado indica que una molécula de PEG
en el extremo N-terminal de la EPO no altera su
estructura secundaria.
EPO transaminada (1 mg) en acetato de sodio 100
mM (pH 4,5) fue ajustada a cloruro de sodio 0,5 M, SDS 0,1% para un
volumen final de 1 ml y se añadieron 10-20 mg de
mPEG5000 hidrazida. La mezcla de reacción fue agitada durante 40
horas a temperatura ambiente y purificada mediante una columna de
Sephacryl-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ)
utilizando un tampón citrato de sodio 20 mM (pH 7,0) conteniendo
NaCl 100 mM.
Los conjugados mPEG-EPO fueron
analizados mediante SDS 4-15%-PAGE
(Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) con varios métodos:
tinción de Coomassie (específica para proteínas), transferencia
Western (específica para EPO) y tinción con yodo (específica para
PEG). La distancia de migración en SDS-PAGE de los
conjugados mPEG-EPO de peso molecular más elevado
es menor que la de la EPO nativa. El patrón de enfoque isoeléctrico
indica que el punto isoeléctrico (pI) de la EPO no se ha alterado
significativamente después de la modificación. Sin embargo, la EPO
transaminada es ligeramente más ácida que la EPO nativa y que
mPEG-EPO.
Como las bandas de EPO y de
mPEG-EPO se separan bien mediante
SDS-PAGE, puede utilizarse esta técnica para
monitorizar la eficacia de la reacción de conjugación. Se observó
que la reacción de conjugación era >95% completa cuando se
utilizó mPEG5000 carboxilato de hidrazina, mientras que la reacción
era solamente un 20% completa aproximadamente cuando se utilizó
mPEG5000 hidrazida, mPEG5000-semicarbazida o
mPEG5000-oxilamina. Por tanto, el resto carboxilato
de hidrazina parece ser más reactivo hacia los grupos carbonilo que
el resto hidrazida, semicarbazida u oxilamina.
La antigenicidad de mPEG-EPO fue
estudiada utilizando un kit de ELISA para EPO Quantikine™ IVD™
(R&D Systems, Minneapolis, MN). El ensayo consta de una placa
de microvaloración revestida con un anticuerpo monoclonal hacia
EPO. Se deja interaccionar la EPO o la mPEG-EPO con
la placa revestida. Después de lavar la placa, se añade un
conjugado de anticuerpo policlonal anti-EPO y
peroxidasa de rábano picante. Después de eliminar el exceso de
conjugado, se añade a los pocillos un cromógeno y es oxidado por la
reacción enzimática para formar un complejo de color azul. Se mide
la absorbancia de este complejo a 450 nm.
Los resultados del ensayo de ELISA para
determinar mPEG-EPO con un enlace hidrazona formado
a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) están
presentados en la Figura 5. Los datos indican que incluso una
molécula de PEG unida al extremo N de la EPO reduce
significativamente la afinidad de la unión del anticuerpo monoclonal
a la EPO, debido posiblemente a impedimento estérico.
La actividad biológica in vitro de
mPEG-EPO fue evaluada mediante un ensayo de
proliferación celular utilizando células
FDC-P1/HER, una línea celular hematopoyética murina.
La línea celular expresa el receptor de EPO y es dependiente de EPO
para su crecimiento. Una vez que las células hubieron crecido en
ausencia de EPO durante 24 horas, se añadió a las células EPO o
mPEG-EPO. Las células fueron incubadas durante 42
horas y posteriormente se añadió a las células timidina tritiada.
Después de 6 horas, se determinó el crecimiento celular por la
incorporación de timidina.
Los resultados del ensayo de proliferación
celular obtenidos para la EPO transaminada y para
mPEG-EPO con enlaces hidrazona formados a partir de
carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) están presentados en
la Figura 6. La EPO transaminada presenta una actividad biológica
completa comparable a la EPO nativa, según se determinó por su
DE_{50}. Las muestras de mPEG-EPO con enlaces
hidrazona formados a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e
hidrazida (HZ) conservan solamente un 38,5% y un 25% de actividad,
respectivamente, según se determinó por su DE_{50}. Los datos
indican que una molécula de PEG unida al extremo N de la EPO reduce
significativamente la afinidad de EPO por su receptor, debido
posiblemente a impedimento estérico.
La actividad in vivo de
mPEG-EPO fue evaluada por un bioensayo en ratón
exhipóxico (Coates, P.M. y col., Nature, 1961, 191, 1065).
La formación de glóbulos rojos endógenos murinos es suprimida por la
policitemia producida mediante exposiciones a presión reducida. La
EPO o el conjugado mPEG-EPO es inyectado en una
cantidad de 1 unidad/ratón. Se administró hierro-59
48 horas después de la inyección de EPO o de
mPEG-EPO. La incorporación de
hierro-59, que indica la formación de nuevos
glóbulos rojos sanguíneos, fue medida 48, 72 y 96 horas después de
la administración de EPO o de mPEG-EPO.
Los resultados del bioensayo en ratón exhipóxico
obtenidos para mPEG-EPO con enlaces hidrazona
formados con carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) y
semicarbazida (SCZ) están presentados en la Figura 7. Las muestras
de mPEG-EPO muestran una elevada actividad in
vivo así como una mayor duración de la actividad, en comparación
con la EPO nativa. Los resultados in vivo indican que las
muestras de mPEG-EPO tienen un tiempo de
circulación mayor in vivo y una liberación mantenida de EPO
durante la circulación.
El dímero de fibrina 17-29 tiene
la estructura siguiente:
Se disolvieron 2 mg del dímero de fibrina
17-29 en 0,5 ml de acetato de sodio 2 M, ácido
acético 0,4 M, ácido glioxílico 0,1 M y sulfato cúprico 10 mM (pH
5,5). Se dejó proceder la reacción 2 horas a temperatura ambiente y
fue parada por la adición de 20 ml de EDTA 0,5 M. El dímero de
fibrina transaminado fue purificado mediante una columna de
Sephadex G-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando
un tampón acetato de sodio 100 mM (pH 4,5). El dímero de fibrina
transaminado mostraba una Gly significativamente reducida en el
análisis de aminoácidos, indicando la transaminación de la Gly
N-terminal.
Se añadió 1 mg del dímero de fibrina
transaminado en 0,5 ml de acetato de sodio 100 mM (pH 4,5) a 10 mg
de mPEG5000 carboxilato de hidrazina. La mezcla de reacción fue
agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. El
mPEG-dímero de fibrina fue purificado mediante
cromatografía de intercambio aniónico con una columna HEMA IEC BIO
CM (Alltech). La fase móvil A era acetato de sodio 20 mM (pH 5,5).
La fase móvil B era MOPS 0,2 M, fosfato de potasio monobásico 0,05
M y fosfato de potasio dibásico 0,25 M (pH 7,5). El gradiente fue de
un 100% de A durante 5 minutos, posteriormente de 0 a 100% de B en
25 minutos. Se recogió para un análisis posterior un pico nuevo a
los 14,5 minutos que aparecía antes que el dímero de fibrina sin
modificar (18 minutos). Un espectro de masas con desorción por láser
mostró el ión a m/z 8070,9, lo cual demostraba que se había unido
una molécula de PEG al dímero de fibrina (m/z 2986,8).
Claims (12)
1. Una composición de materia que consta
esencialmente de un péptido o una proteína y PEG, o un derivado del
mismo, unido covalentemente a ellos en el átomo de carbono \alpha
N-terminal del polipéptido, con la condición de que
(a) el PEG y el polipéptido estén unidos entre sí a través de un
enlace hidrazona o de un enlace hidrazona reducido, (b) el PEG
tenga un peso molecular de 700 a 20.000 daltons, (c) no se elimine
la función natural del polipéptido después de la eliminación de su
grupo \alpha-amino N-terminal y
(d) el residuo de aminoácido N-terminal de la
proteína no sea serina ni treonina.
2. La composición de la reivindicación 1, en
la que la proteína es EPO o un derivado de la misma.
3. La composición de la reivindicación 1, en
la que el PEG o el derivado del mismo tiene un peso molecular de
5000 daltons aproximadamente.
4. La composición de la reivindicación 1, en
la que la proteína es EPO y el PEG es mPEG con un peso molecular de
5.000 daltons aproximadamente.
5. Un método para unir covalentemente PEG al
átomo de carbono \alpha N-terminal de un
polipéptido, que comprende las etapas de:
- (a)
- la puesta en contacto del polipéptido con (i) un ión glioxilato o un derivado del mismo a una concentración de 0,1 M a 2,0 M, (ii) un ión de un metal de transición a una concentración de 10 \muM a 1 M, y (iii) una base de Lewis a una concentración de 10 mM a 10 M, a un pH de 5,0 a 7,0 y a una temperatura de 0ºC a 100ºC, para formar un polipéptido transaminado que tiene un grupo \alpha-carbonilo N-terminal; y
- (b)
- la puesta en contacto del polipéptido transaminado, a un pH de 3,0 a 5,0, con PEG, o un derivado del mismo, que tiene unido covalentemente a él un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal del polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el PEG al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido, con la condición de que el PEG tenga un peso molecular de 700 a 20.000 daltons y que la función natural del polipéptido no sea eliminada después de la eliminación de su grupo \alpha-amino N-terminal.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
la proteína es EPO o un derivado de la misma.
7. El método de la reivindicación 5, en el que
el PEG o el derivado del mismo tiene un peso molecular de 5.000
daltons aproximadamente.
8. El método de la reivindicación 5, en el que
el resto unido covalentemente al PEG es carboxilato de
hidrazina.
9. El método de la reivindicación 5, en el que
la proteína es EPO, el PEG es mPEG con un peso molecular de 5.000
daltons aproximadamente y el resto unido covalentemente al PEG es
carboxilato de hidrazina.
10. El método de la reivindicación 5, que
comprende además la etapa de reducción del enlace hidrazona formado
en la etapa (b) para formar un enlace hidrazona reducida.
11. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz de la composición de la reivindicación 1 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Un kit para ser utilizado en la
preparación de la composición de la reivindicación 1, que comprende
lo siguiente:
- (a)
- un ión glioxilato o un derivado del mismo;
- (b)
- un ión de un metal de transición;
- (c)
- una base de Lewis y
- (d)
- PEG, o un derivado del mismo, con un peso molecular de 700 a 20.000 daltons, y que tiene unido covalentemente al mismo un resto que reacciona con el grupo \alpha-carbonilo N-terminal de un polipéptido transaminado para formar un enlace hidrazona, uniendo de este modo covalentemente el PEG al átomo de carbono \alpha N-terminal del polipéptido.
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