CN101511856B - 脊椎动物细胞中抑制因子trna的转录 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于产生扩充脊椎动物细胞中遗传编码的氨基酸的数目的翻译组件的组合物和方法。所述组件包括正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶、tRNA/合成酶的正交对以及非天然氨基酸。本发明还提供具有非天然氨基酸的蛋白质和在脊椎动物细胞中产生具有非天然氨基酸的蛋白质的方法。

Description

脊椎动物细胞中抑制因子TRNA的转录
技术领域
本发明属于脊椎动物细胞中的翻译生物化学领域。本发明涉及在脊椎动物细胞中产生正交tRNA、正交合成酶和其对的方法以及正交tRNA、正交合成酶和其对的组合物。本发明还涉及非天然氨基酸的组合物、包括非天然氨基酸的蛋白质和在脊椎动物细胞中产生包括非天然氨基酸的蛋白质的方法。
背景技术
从细菌到人类，每种已知生物体的遗传密码都编码相同的二十种常见氨基酸。这相同的二十种天然氨基酸的不同组合形成进行生命的几乎所有的复杂过程(从光合作用到信号转导和免疫反应)的蛋白质。为研究和修饰蛋白质结构和功能，科学家们曾尝试操纵蛋白质的遗传密码和氨基酸序列。然而，很难消除由遗传密码所施加的使蛋白质局限于二十种遗传编码的标准结构单元(buildingblock)的限制(其中极个别例外为硒代半胱氨酸(selenocysteine)(例如参见A.Bock，(1991)，MolecularMicrobiology5：515-20)和吡咯赖氨酸(pyrrolysine)(例如参见G.Srinivasan等人，(2002)，Science296：1459-62))。
虽然已取得一些进展来消除这些限制，但这一进展受到限制且合理控制蛋白质结构和功能的能力仍处于初期阶段。举例来说，化学家们已开发出合成和操纵小分子结构的方法和策略(例如参见E.J.Corey和X.M.Cheng，TheLogicofChemicalSynthesis(Wiley-Interscience，NewYork，1995))。虽然全合成(例如参见B.Merrifield，(1986)，Science232：341-7(1986))和半合成方法(例如参见D.Y.Jackson，(1994)，Science266：243-7；以及P.E.Dawson和S.B.Kent，(2000)，AnnualReviewofBiochemistry69：923-60)已使得有可能合成肽和小蛋白质，但这些方法限制了超过10千道尔顿(kDa)的蛋白质的效用。诱变方法尽管有效，但也局限于有限数目的结构变化。在许多情况下，有可能在整个蛋白质中竞争性并入常见氨基酸的闭合结构类似物。例如参见R.Furter，(1998)，ProteinScience7：419-26；K.Kirshenbaum等人，(2002)，ChemBioChem3：235-7；和V.Doring等人，(2001)，Science292：501-4。
在尝试扩充操纵蛋白质结构和功能的能力的过程中，开发出使用化学酰化的正交tRNA的活体外方法，其使得能在活体外响应无义密码子而选择性并入非天然氨基酸(例如参见J.A.Ellman等人，(1992)，Science，255：197-200)。将具有新颖结构和物理性质的氨基酸选择性并入蛋白质中，从而来研究蛋白质的折叠和稳定性以及生物分子的识别和催化作用。例如参见D.Mendel等人，(1995)，AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure24：435-462；和V.W.Cornish等人，(1995年3月31日)，AngewandteChemie-InternationalEditioninEnglish34：621-633。然而，这个过程的化学计量性质严重限制了可生成的蛋白质的量。
非天然氨基酸已可微量注射于细胞中。举例来说，通过微量注射化学错酰化的嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)tRNA(例如，M.E.Saks等人，(1996)，AnengineeredTetrahymenatRNAGlnforinvivoincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsbynonsensesuppression，J.Biol.Chem.271：23169-23175)和相关mRNA而将非天然氨基酸引入爪蟾(Xenopus)卵母细胞的烟碱型乙酰胆碱受体中(例如，M.W.Nowak等人，(1998)，InvivoincorporationofunnaturalaminoacidsintoionchannelsinXenopusoocyteexpressionsystem，MethodEnzymol.293：504-529)。这允许通过引入具有独特物理或化学性质的含侧链氨基酸来对卵母细胞中的受体进行详细的生物物理学研究。例如参见D.A.-Dougherty(2000)，Unnaturalaminoacidsasprobesofproteinstructureandfunction，Curr.Opin.Chem.Biol.4：645-652。令人遗憾的是，这种方法局限于细胞中可进行微量注射的蛋白质，且因为相关tRNA在活体外化学酰化且不能再酰化，所以蛋白质的产率非常低。
为克服这些局限性，向原核生物大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)的蛋白质生物合成机构中添加新颖组件(例如，L.Wang等人，(2001)，Science292：498-500)，这允许在活体内遗传编码非天然氨基酸。已使用这种方法响应琥珀密码子TAG将多种具有新颖化学、物理或生物性质的新颖氨基酸有效且高保真地并入大肠杆菌的蛋白质中，所述新颖氨基酸包括光亲和标记(photoaffinitylabel)和光致异构化氨基酸、酮基氨基酸以及糖基化氨基酸。例如参见J.W.Chin等人，(2002)，JournaloftheAmericanChemicalSociety124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNASUnitedStatesofAmerica99：11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.1-10。然而，原核生物和真核生物的翻译机构并非高度保守的；因此，添加到大肠杆菌中的生物合成机构的组件通常无法用于将非天然氨基酸位点特异性并入脊椎动物细胞中的蛋白质中。举例来说，用于大肠杆菌中的詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)酪氨酰基tRNA合成酶/tRNA对在脊椎动物细胞中并不正交。另外，真核生物而非原核生物中tRNA的转录是通过RNA聚合酶III进行，且这对脊椎动物细胞中可转录的tRNA结构基因的一级序列产生限制。此外，与原核生物细胞相反，脊椎动物细胞中的tRNA需要从转录所述tRNA的核中输出到细胞质中，以进行翻译。最后，脊椎动物的80S核糖体不同于70S原核生物核糖体。因此，需要开发出改进的生物合成机构组件，以扩充脊椎动物遗传密码。阅读下列公开内容后将显而易见，本发明满足这些和其它需要。
发明内容
本发明对脊椎动物细胞提供翻译组件，所述翻译组件可用于脊椎动物蛋白质生物合成机构中以将非天然氨基酸并入脊椎动物细胞中正在生长的多肽链中，例如正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)的对和其个别组件。
本发明的组合物包括包含正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)(例如，源自诸如大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等非脊椎动物生物体)的脊椎动物细胞(例如，哺乳动物细胞、禽类细胞、鱼类细胞、爬行动物细胞、两栖动物细胞、源自非哺乳动物的细胞等)，其中O-RS在脊椎动物细胞中优先利用至少一个非天然氨基酸使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化。在给定的脊椎动物细胞中，可视情况使两个或两个以上OtRNA氨酰化。一方面，O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，这与具有(例如)如SEQIDNO.：86或45中所述的氨基酸序列的O-RS例如至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％或者甚至90％或90％以上有效。在一个实施例中，本发明的O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，这比O-RS利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化有效例如至少10倍、至少20倍、至少30倍等。
在一个实施例中，O-RS或其部分是由如SEQIDNO：3-35中任一序列所述的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列编码。在另一实施例中，O-RS包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列或其保守变异体。在又一实施例中，O-RS包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列例如至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％或99.5％以上一致且包含两个或两个以上来自群组A-E的氨基酸的氨基酸序列。群组A包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Tyr37的位置处的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。群组B包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asn126的位置处的天冬氨酸。群组C包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asp182的位置处的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。群组D包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Phe183的位置处的蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸；且群组E包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Leu186的位置处的丝氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或丙氨酸。
在另一实施例中，与天然氨基酸相比，O-RS具有一种或一种以上针对非天然氨基酸的改进或增强的酶促性质。举例来说，与天然氨基酸相比，针对非天然氨基酸的改进或增强的性质包括例如较高Km、较低Km、较高kcat、较低kcat、较低kcat/km、较高kcat/km等中的任一种。
脊椎动物细胞还视情况包括非天然氨基酸。脊椎动物细胞视情况包括正交tRNA(O-tRNA)(例如源自诸如大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等非脊椎动物生物体)，其中O-tRNA识别选择密码子(selectorcodon)且优先通过O-RS经非天然氨基酸氨酰化。一方面，O-tRNA以包含如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或在细胞中由如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列加工而成的tRNA的效率的例如至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或99％或99％以上，介导将非天然氨基酸并入蛋白质中。另一方面，O-tRNA包含SEQIDNO：65的序列，且O-RS包含选自SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列中所述的氨基酸序列的多肽序列和/或其保守变异体。
在另一实施例中，脊椎动物细胞包含包括编码所关注的多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含由O-tRNA识别的选择密码子。一方面，包含非天然氨基酸的所关注的多肽的产率为从多核苷酸缺乏选择密码子的细胞获得所关注的天然存在的多肽的产率的例如至少2.5％、至少5％、至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、50％或50％以上。另一方面，细胞在不存在非天然氨基酸的情况下以一定产率产生所关注多肽，所述产率例如为在存在非天然氨基酸的情况下多肽产率的不到35％、不到30％、不到20％、不到15％、不到10％、不到5％、不到2.5％等。
本发明也提供包含正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA(O-tRNA)、非天然氨基酸和包含编码所关注的多肽的多核苷酸的核酸的脊椎动物细胞。所述多核苷酸包含由O-tRNA识别的选择密码子。另外，O-RS在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化，且所述细胞在不存在非天然氨基酸的情况下以一定产率产生所关注的多肽，所述产率例如为在存在非天然氨基酸的情况下多肽产率的不到30％、不到20％、不到15％、不到10％、不到5％、不到2.5％等。
包括包含正交tRNA(O-tRNA)的脊椎动物细胞的组合物也是本发明的特征。O-tRNA通常介导在活体内将非天然氨基酸并入由包含由O-tRNA识别的选择密码子的多核苷酸编码的蛋白质中。在一个实施例中，O-tRNA以包含如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或在细胞中由如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列加工而成的tRNA的效率的例如至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至99％或99％以上，介导将非天然氨基酸并入蛋白质中。在另一实施例中，O-tRNA包含如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或其保守变异体，或由如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或其保守变异体加工而成。在又一实施例中，O-tRNA包含可重复利用的O-tRNA。
在本发明的一方面，O-tRNA经转录后修饰。本发明也提供编码脊椎动物细胞中的O-tRNA的核酸或其互补多核苷酸。在一个实施例中，核酸包含A盒(Abox)和B盒(Bbox)。
本发明的特征也在于产生例如O-RS或O-tRNA/O-RS对的翻译组件的方法(和由这些方法产生的翻译组件)。举例来说，本发明提供产生在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使正交tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法。例如，所述方法包括(a)在存在非天然氨基酸的情况下使第一物种的脊椎动物细胞群体经受阳性选择，其中所述脊椎动物细胞各自包含：i)氨酰基tRNA合成酶(RS)的文库的成员，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)编码阳性选择标记的多核苷酸以及iv)编码阴性选择标记的多核苷酸；其中在阳性选择中存活的细胞包含在存在非天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的活性RS。使在阳性选择中存活的细胞在不存在非天然氨基酸的情况下经受阴性选择，以去除利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的活性RS。这提供优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的O-RS。
在某些实施例中，将编码阳性选择标记的多核苷酸可操作性连接到反应元件，且所述细胞进一步包含多核苷酸，其a)编码调节从反应元件进行的转录的转录调节蛋白(modulatorprotein)(例如脊椎动物转录调节蛋白等)，和b)包含至少一个选择密码子。通过经非天然氨基酸氨酰化的O-tRNA将非天然氨基酸并入转录调节蛋白中会引起阳性选择标记的转录。在一个实施例中，转录调节蛋白为转录激活蛋白(例如GAL4等)，且选择密码子为琥珀终止密码子，举例来说，其中所述琥珀终止密码子位于编码转录激活蛋白的DNA结合域的多核苷酸的一部分中，或实质上靠近所述部分。
阳性选择标记可为多种分子中的任一种。在一个实施例中，阳性选择标记包含供生长使用的营养增补剂，且所述选择是在缺乏所述营养增补剂的培养基上进行。在另一实施例中，编码阳性选择标记的多核苷酸例如为ura3、leu2、lys2、lacZ基因、his3(例如，其中通过提供3-氨基三唑(3-AT)所检测，his3基因编码咪唑磷酸甘油酯脱水酶)等。在又一实施例中，编码阳性选择标记的多核苷酸包含选择密码子。
与阳性选择标记一样，阴性选择标记也可为多种分子中的任一种。在某些实施例中，将编码阴性选择标记的多核苷酸可操作性连接到反应元件，其中从反应元件进行的转录是通过转录调节蛋白来介导。通过经天然氨基酸氨酰化的O-tRNA将天然氨基酸并入转录调节蛋白中会引起阴性选择标记的转录。在一个实施例中，编码阴性选择标记的多核苷酸例如为ura3基因，且阴性选择是在包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上实现。在另一实施例中，用于阴性选择的培养基包含通过阴性选择标记转化为可检测物质的选择或筛选剂。在本发明的一方面，可检测物质为有毒物质。在一个实施例中，编码阴性选择标记的多核苷酸包含选择密码子。
在某些实施例中，阳性选择标记和/或阴性选择标记包含发荧光或在存在合适反应物的情况下催化发光反应的多肽。在本发明的一方面，通过荧光激活细胞分类(fluorescence-activatedcellsorting，FACS)或通过发光性来检测阳性选择标记和/或阴性选择标记。在某些实施例中，阳性选择标记和/或阴性选择标记包含基于亲和力的筛选标记或转录调节蛋白。在一个实施例中，同一多核苷酸编码阳性选择标记和阴性选择标记。
在一个实施例中，编码本发明的阳性选择标记和/或阴性选择标记的多核苷酸可包含至少两个选择密码子，所述选择密码子各自或都可包含至少两个不同选择密码子或至少两个相同选择密码子。
本发明的方法中也可使用其它水平的选择/筛选严格度。在一个实施例中，所述方法可例如包含在步骤(a)、(b)或(a)和(b)中提供不同量的无活性合成酶，其中所述不同量的无活性合成酶提供另一水平的选择或筛选严格度。在一个实施例中，产生O-RS的方法的步骤(a)、(b)或步骤(a)和(b)包括改变例如阳性和/或阴性选择标记的选择或筛选严格度。所述方法视情况包括使优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的O-RS经受另一轮选择，例如另一轮(多轮)阳性选择、另一轮(多轮)阴性选择或另一轮阳性选择和另一轮阴性选择的组合。
在一个实施例中，选择/筛选包含一种或一种以上选自例如氨基酸渗透性改变、翻译效率改变、翻译保真性改变等的阳性或阴性选择/筛选。所述一种或一种以上改变是基于编码用于产生蛋白质的正交tRNA-tRNA合成酶对的组件的一个或一个以上多核苷酸的突变。
RS的文库(例如突变RS的文库)通常包含源自至少一种例如来自非脊椎动物生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)的RS。在一个实施例中，RS的文库源自无活性RS，例如，其中无活性RS是通过使活性RS突变而生成。在另一实施例中，无活性RS包含氨基酸结合袋，且包含结合袋的一个或一个以上氨基酸经一个或一个以上不同氨基酸取代，例如所述经取代氨基酸经丙氨酸取代。
在某些实施例中，产生O-RS的方法进一步包括对编码RS的核酸进行随机突变、位点特异性突变、重组、嵌合构筑或其任何组合，从而产生突变RS的文库。在某些实施例中，所述方法例如进一步包括(c)分离编码O-RS的核酸；(d)由核酸生成一组编码突变O-RS的多核苷酸(例如通过随机诱变、位点特异性诱变、嵌合构筑、重组或其任何组合)；和(e)重复步骤(a)和/或(b)，直到获得优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的突变O-RS。在本发明的一方面，进行步骤(c)(e)至少两次。
本发明的特征也在于产生O-tRNA/O-RS对的方法。在一个实施例中，如上所述获得O-RS，且通过使第一物种的脊椎动物细胞群体(其中脊椎动物细胞包含tRNA文库的成员)经受阴性选择以去除包含经脊椎动物细胞的内源性氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文库的成员的细胞来获得O-tRNA。这提供与第一物种的脊椎动物细胞正交的tRNA池。在本发明的一方面，tRNA的文库包含源自至少一种例如来自非脊椎动物生物体的tRNA的tRNA。在本发明的另一方面，氨酰基tRNA合成酶(RS)的文库包含源自至少一种例如来自非脊椎动物生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)的RS。在本发明的另一方面，tRNA的文库包含源自至少一种来自第一种非脊椎动物生物体的tRNA的tRNA。氨酰基tRNA合成酶(RS)的文库视情况包含源自至少一种来自第二种非脊椎动物生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)的RS。在一个实施例中，第一种和第二种非脊椎动物生物体相同。或者，第一种和第二种非脊椎动物生物体可不同。本发明的特征也在于由本发明的方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。
本发明的另一特征为在一物种中产生翻译组件且在第二物种中引入所选择/筛选的翻译组件的方法。举例来说，在第一物种(例如脊椎动物物种，诸如酵母等)中产生O-tRNA/O-RS对的方法进一步包括在第二物种(例如哺乳动物、昆虫、真菌、藻类、植物等)的脊椎动物细胞中引入编码O-tRNA的核酸和编码O-RS的核酸。第二物种可使用所引入的翻译组件例如在翻译期间将非天然氨基酸在活体内并入正在生长的多肽链中。
在另一实例中，产生在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使正交tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)在存在非天然氨基酸的情况下使第一物种(例如脊椎动物物种，诸如酵母等)的脊椎动物细胞群体经受阳性选择。第一物种的脊椎动物细胞各自包含：i)氨酰基tRNA合成酶(RS)的文库的成员，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)编码阳性选择标记的多核苷酸，以及iv)编码阴性选择标记的多核苷酸。在阳性选择中存活的细胞包含在存在非天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的活性RS。使在阳性选择中存活的细胞在不存在非天然氨基酸的情况下经受阴性选择，以去除利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的活性RS，从而提供优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的O-RS。将编码O-tRNA的核酸和编码O-RS的核酸引入第二物种(例如哺乳动物、昆虫、真菌、藻类、植物等)的脊椎动物细胞中。当在第二物种中翻译时，可使用这些组件将非天然氨基酸并入第二物种中的所关注的蛋白质或多肽中。在一个实施例中，将O-tRNA和/或O-RS引入第二物种的脊椎动物细胞中。
在某些实施例中，通过使第一物种的脊椎动物细胞群体(其中脊椎动物细胞包含tRNA文库的成员)经受阴性选择以去除包含经脊椎动物细胞的内源性氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文库的成员的细胞来获得O-tRNA。这提供与第一物种和第二物种的脊椎动物细胞正交的tRNA池。
具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质(或所关注的多肽)也是本发明的特征。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含通过[3+2]环加成使包含第二反应性基团的分子(例如染料、例如聚乙二醇衍生物的聚合物、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、第二蛋白质或多肽、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如DNA、RNA等)等)与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(例如，在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)(所述基团有时也称为乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(例如，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔基部分。在某些实施例中，本发明的蛋白质包括至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(例如酮基非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分(saccharidemoiety)。在某些实施例中，翻译后修饰是在脊椎动物细胞中活体内进行。
在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由脊椎动物细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖与天冬酰胺连接(例如，其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(例如Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。
蛋白质通常与任何可利用的蛋白质(例如治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分等)例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至至少99％或99％以上一致，且其包含一个或一个以上非天然氨基酸。在一个实施例中，本发明的组合物包括所关注的蛋白质或多肽和赋形剂(例如缓冲剂、医药学上可接受的赋形剂等)。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，天然存在的蛋白质型式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸是经非天然氨基酸取代。
例如，蛋白质(或所关注的多肽)的实例包括(但不限于)细胞因子、生长因子、生长因子受体、干扰素、白细胞介素、发炎性分子、致癌基因产物、肽激素、信号转导分子、类固醇激素受体、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、胰岛素、人类生长激素、α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、载脂蛋白(Apoprotein)、心房利尿钠因子、心房利尿钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配位体、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞发炎性蛋白-1α、单核细胞发炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配位体、胶原蛋白、菌落刺激因子(Colonystimulatingfactor，CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、DHFR、上皮中性粒细胞激活肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-1α、MIP-1δ、MCP-1、表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor，FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、刺猬蛋白(Hedgehogprotein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(HepatocyteGrowthFactor，HGF)、水蛭素、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素样生长因子(Insulin-likeGrowthFactor，IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KeratinocyteGrowthFactor，KGF)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、中性粒细胞抑制因子(Neutrophilinhibitoryfactor，NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、多效营养因子(Pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、致热外毒素A、B或C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、透明质酸(hyalurin)/CD44、皮质酮、Genebank或其它可利用数据库中所存在的蛋白质等，和/或其部分。在一个实施例中，所关注的多肽包括转录调节蛋白(例如转录激活蛋白(诸如GAL4)或转录阻遏蛋白等)或其部分。
本发明的脊椎动物细胞提供合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，可在细胞提取物、缓冲剂、医药学上可接受的赋形剂等中产生蛋白质浓度为例如至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升或500微克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。在某些实施例中，本发明的组合物包括例如至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克或至少500微克或500微克以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。
在某些实施例中，所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子或甚至十个或十个以上选择密码子。
本发明还提供在脊椎动物细胞中产生至少一种包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的方法(以及由这些方法产生的蛋白质)。所述方法例如包括使包含包括至少一个选择密码子且编码蛋白质的核酸的脊椎动物细胞在适当培养基中生长。脊椎动物细胞还包含在细胞中起作用且识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)和优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)，且培养基包含非天然氨基酸。在一个实施例中，O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，这与具有(例如)如SEQIDNO：86或45中所述的氨基酸序列的O-RS例如至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至99％或99％以上有效。在另一实施例中，O-tRNA包含SEQIDNO：64或65或其互补多核苷酸序列，由SEQIDNO：64或65或其互补多核苷酸序列加工而成或由SEQIDNO：64或65或其互补多核苷酸序列编码。在又一实施例中，O-RS包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述方法进一步包括在蛋白质中并入非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(例如染料、例如聚乙二醇衍生物的聚合物、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、第二蛋白质或多肽、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如DNA、RNA等)等)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成使分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(例如，在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(例如，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔基部分。
在某些实施例中，编码蛋白包含治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分。在一个实施例中，由所述方法产生的蛋白质由非天然氨基酸进一步修饰。举例来说，通过例如亲核-亲电子反应、[3+2]环加成等来修饰非天然氨基酸。在另一实施例中，通过至少一种翻译后修饰(例如N-糖基化、O-糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等)在活体内修饰由所述方法产生的蛋白质。
也提供产生筛选或选择转录调节蛋白的方法(以及由这些方法产生的筛选或选择转录调节蛋白)。所述方法例如包括选择第一多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码核酸结合域；和使第一多核苷酸序列突变以包括至少一个选择密码子。这提供了筛选或选择多核苷酸序列。例如，所述方法还包括选择第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列编码转录激活域；提供包含可操作性连接到第二多核苷酸序列的筛选或选择多核苷酸序列的构筑体；以及在细胞中引入构筑体、非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)。利用这些组件，O-RS优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，且O-tRNA识别选择密码子且响应筛选或选择多核苷酸序列中的选择密码子将非天然氨基酸并入核酸结合域中。这提供了筛选或选择转录调节蛋白。
在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括脊椎动物细胞。本发明的脊椎动物细胞例如包括哺乳动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞等中的任一个。本发明的翻译组件可源自多种生物体，例如诸如原核生物体(例如大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等)或古细菌(archaebacterium)等非脊椎动物生物体；或例如脊椎动物生物体。
本发明的选择密码子将扩充脊椎动物蛋白生物合成机构的遗传密码子构架。本发明中可使用多种选择密码子中的任一个，包括终止密码子(例如琥珀密码子、赭石密码子(ochrecodon)或蛋白石终止密码子(opalstopcodon))、无义密码子、稀有密码子、四个(或四个以上)碱基密码子等。
可用于本文所述的组合物和方法中的非天然氨基酸的实例包括(但不限于)：对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸(phosphonoserine)、膦酰基酪氨酸(phosphonotyrosine)、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤基、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基(phospho)、膦酸基(phosphono)、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；具有光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；金属结合氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；光笼化和/或光致异构化氨基酸(photocagedand/orphotoisomerizableaminoacid)；含生物素或生物素类似物的氨基酸；含酮基的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；化学裂解或光裂解的氨基酸；具有伸长侧链的氨基酸；含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸；含碳连接的糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；氨基硫代酸(aminothioacid)；α，α-二取代氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸或组氨酸以外的环状氨基酸，除苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸以外的芳香族氨基酸等。
本发明还提供多肽(O-RS)和多核苷酸，例如O-tRNA、编码O-RS或其部分(例如合成酶的活性位点)的多核苷酸、用于构筑氨酰基tRNA合成酶突变体的寡核苷酸、编码所关注的蛋白质或多肽的包含一个或一个以上选择密码子的多核苷酸等。举例来说，本发明的多肽包括：包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列的多肽；包含由如SEQIDNO：3-35中任一序列所述的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽；以及与对包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所示的氨基酸序列的多肽或包含由如SEQIDNO：3-35中任一序列所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽具有特异性的抗体特异性免疫反应的多肽。
本发明的多肽中还包括包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列(例如SEQIDNO：2)至少90％一致且包含两个或两个以上来自群组A-E(说明如上)的氨基酸的氨基酸序列的多肽。类似地，本发明的多肽还视情况包括包含SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列的至少20个相邻氨基酸以及两个或两个以上如上文在群组A-E中所指示的氨基酸取代的多肽。也包括包含任一上述多肽的保守变异体的氨基酸序列作为本发明的多肽。
在一个实施例中，组合物包括本发明的多肽和赋形剂(例如缓冲剂、水、医药学上可接受的赋形剂等)。本发明还提供与本发明的多肽特异性免疫反应的抗体或抗血清。
本发明中也提供多核苷酸。本发明的多核苷酸包括那些编码本发明的所关注的蛋白质或多肽的具有一个或一个以上选择密码子的多核苷酸。另外，本发明的多核苷酸例如包括：包含如SEQIDNO：3-35、64-85中任一序列所述的核苷酸序列的多核苷酸；与其多核苷酸序列互补或编码其多核苷酸序列的多核苷酸；和/或编码包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或其保守变异体。本发明的多核苷酸也包括编码本发明的多肽的多核苷酸。类似地，在核酸的实质上整个长度范围内在高度严格条件下与上文所指示的多核苷酸杂交的核酸为本发明的多核苷酸。
本发明的多核苷酸也包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列(例如SEQIDNO：2)至少90％一致且包含两个或两个以上如上文在群组A-E(说明如上)中所指示的突变的氨基酸序列。本发明的多核苷酸中还包括与上文所指示的多核苷酸至少70％(或至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或99％以上)一致的多核苷酸，和/或包含上文所指示的任何多核苷酸的保守变异体的多核苷酸。
在某些实施例中，载体(例如质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、病毒等)包含本发明的多核苷酸。在一个实施例中，载体为表达载体。在另一实施例中，表达载体包括可操作性连接到本发明的一个或一个以上多核苷酸的启动子。在另一实施例中，细胞包含包括本发明的多核苷酸的载体。
另一方面，本发明提供化合物的组合物和产生这些化合物的方法。举例来说，化合物例如包括非天然氨基酸(诸如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸、叠氮基染料(诸如化学结构4和化学结构6中所示)、炔基聚乙二醇(例如，如化学结构7中所示)，其中n为例如50与10,000、75与5,000、100与2,000、100与1,000之间的整数等。在本发明的实施例中，炔基聚乙二醇具有例如约5,000到约100,000Da、约20,000到约50,000Da、约20,000到约10,000Da(例如，20,000Da)的分子量。
还提供包含这些化合物，例如具有蛋白质和细胞的各种组合物。一方面，包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(例如共价)，例如通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结，与正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共价键结等。
试剂盒也是本发明的特征。举例来说，提供在细胞中产生包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有编码O-tRNA的多核苷酸序列或O-tRNA和编码O-RS的多核苷酸或O-RS的容器。在一个实施例中，试剂盒进一步包括至少一种非天然氨基酸。在另一实施例中，试剂盒进一步包含用于产生蛋白质的说明材料。
附图说明
图1表示tRNA转录的流程1。
图2表示tRNA转录的流程2。
图3表示hGH的琥珀抑制和表达。
图4表示hGH的增加的琥珀抑制和表达。
图5表示H1启动子对hGH表达的影响。
图6表示tRNA转录的流程3。
图7表示U6启动子对hGH表达的影响。
图8表示利用来自嗜热脂肪芽孢杆菌的tRNA将亮氨酸并入多肽中的选择密码子的抑制。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于当然可变化的特定装置或生物系统。也应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的且不打算限制本发明。如本说明书和随附权利要求书中所使用，除非另外明确说明，否则单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。因此，例如提及“一细胞”包括两个或两个以上细胞的组合；提及“细菌”包括细菌的混合物等。
除非本文或本说明书的以下剩余部分中另有说明，否则本文中所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。
同源：当蛋白质和/或蛋白质序列是天然或人工地源自常见的祖蛋白质或蛋白质序列时，其是“同源”的。类似地，当核酸和/或核酸序列是天然或人工地源自常见的祖核酸或核酸序列时，其是“同源”的。举例来说，可通过任何可利用的诱变方法来修饰任何天然存在的核酸以使其包括一个或一个以上选择密码子。当这一经诱变核酸表达时，其编码包含一个或一个以上非天然氨基酸的多肽。当然，突变过程可另外改变一个或一个以上标准密码子，从而也改变所得突变蛋白质中的一个或一个以上标准氨基酸。同源性通常是从两个或两个以上核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列相似性推断得出。虽然适用于确定同源性的序列之间的相似性的精确百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但通常使用仅25％的序列相似性来确定同源性。也可使用例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或99％以上的较高水平的序列相似性来确定同源性。本文中描述用于测定序列相似性百分比的方法(例如使用默认参数的BLASTP和BLASTN)，且通常可利用所述方法。
正交：如本文中所使用，“正交”是指与细胞或翻译系统的内源性相应分子相比，以降低的效率利用细胞的内源性组件起作用；或无法利用细胞的内源性组件起作用的分子(例如正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS))。在tRNA和氨酰基tRNA合成酶的情况下，正交是指与利用内源性tRNA合成酶起作用的内源性tRNA相比，正交tRNA无法利用内源性tRNA合成酶起作用或以降低的效率(例如，低于20％的效率、低于10％的效率、低于5％的效率或低于1％的效率)利用内源性tRNA合成酶起作用；或者与利用内源性tRNA起作用的内源性tRNA合成酶相比，正交氨酰基tRNA合成酶无法利用内源性tRNA起作用或以降低的效率(例如，低于20％的效率、低于10％的效率、低于5％的效率或低于1％的效率)利用内源性tRNA起作用。正交分子在细胞内缺乏功能内源性互补分子。举例来说，当与通过内源性RS使内源性tRNA氨酰化相比时，细胞中的任何内源性RS以降低的效率或甚至为零的效率使所述细胞中的正交tRNA氨酰化。在另一实例中，当与通过内源性RS使内源性tRNA氨酰化相比时，正交RS以降低的效率或甚至为零的效率使所关注的细胞中的任何内源性tRNA氨酰化。可在细胞内引入第二正交分子，从而与第一正交分子一起作用。举例来说，正交tRNA/RS对包括所引入的在细胞中相对于相应的内源性tRNA/RS对以一定效率(例如，50％效率、60％效率、70％效率、75％效率、80％效率、90％效率、95％效率或99％或99％以上效率)共同起作用的互补组件。
互补：术语“互补”是指可共同起作用的正交对O-tRNA和O-RS(例如其中O-RS使O-tRNA氨酰化)的组件。
优先氨酰化：术语“优先氨酰化”是指与O-RS使天然存在的tRNA或用于生成O-tRNA的起始物质氨酰化相比，O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的效率，例如70％有效、75％有效、85％有效、90％有效、95％有效或99％或99％以上有效。将非天然氨基酸以高保真度并入正在生长的多肽链中，例如对给定选择密码子来说在75％以上的效率下，对给定选择密码子来说在约80％以上的效率下，对给定选择密码子来说在约90％以上的效率下，对给定选择密码子来说在约95％以上的效率下或对给定选择密码子来说在约99％或99％以上的效率下。
选择密码子：术语“选择密码子”是指在翻译过程中由O-tRNA识别且不被内源性tRNA识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择密码子且在这一位点处在多肽中并入其氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，选择密码子可包括诸如终止密码子(例如琥珀密码子、赭石密码子和蛋白石密码子)等无义密码子；四个或四个以上碱基的密码子；稀有密码子；源自天然或非天然碱基对的密码子等。
抑制因子tRNA：抑制因子tRNA为例如通过提供响应选择密码子在多肽链中并入氨基酸的机构来改变给定翻译系统中信使RNA(mRNA)的阅读的tRNA。举例来说，抑制因子tRNA可通读(例如)终止密码子、四个碱基的密码子、稀有密码子等。
可重复利用的tRNA：术语“可重复利用的tRNA”是指在翻译期间经氨酰化且可重复利用氨基酸(例如非天然氨基酸)再氨酰化以将所述氨基酸(例如所述非天然氨基酸)并入一个或一个以上多肽链中的tRNA。
翻译系统：术语“翻译系统”是指将天然存在的氨基酸并入正在生长的多肽链(蛋白质)中的组件的集合。翻译系统的组件可例如包括核糖体、tRNA、合成酶、mRNA、氨基酸等。本发明的组件(例如ORS、OtRNA、非天然氨基酸等)可添加到活体外或活体内翻译系统中，所述翻译系统例如脊椎动物细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等。
非天然氨基酸：如本文中所使用，术语“非天然氨基酸”是指不为20种常见的天然存在的氨基酸、硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种的任何氨基酸、经修饰氨基酸和/或氨基酸类似物。
源自：如本文中所使用，术语“源自”是指从指定分子或生物体分离或使用来自指定分子或生物体的信息制成的组件。
无活性RS：如本文中所使用，术语“无活性RS”是指已突变以致不能再利用氨基酸使天然的同源tRNA氨酰化的合成酶。
阳性选择或筛选标记：如本文中所使用，术语“阳性选择或筛选标记”是指当存在(例如，经表达、激活等)时导致鉴别具有阳性选择标记的细胞与不具有阳性选择标记的细胞的标记。
阴性选择或筛选标记：如本文中所使用，术语“阴性选择或筛选标记”是指当存在(例如，经表达、激活等)时允许鉴别不具有所需性质的细胞(例如与具有所需性质的细胞相比)的标记。
报告基因(reporter)：如本文中所使用，术语“报告基因”是指可用于选择所关注的系统的标靶组件的组件。举例来说，报告基因可包括荧光筛选标记(例如绿色荧光蛋白)、发光标记(例如荧火虫荧光素酶蛋白)、基于亲和力的筛选标记或诸如his3、ura3、leu2、lys2、lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(醇脱氢酶)等的可选择标记基因。
脊椎动物：如本文中所使用，术语“脊椎动物”是指属于系统发育域(phylogeneticdomain)真核域(Eucarya)的生物体，诸如动物，例如哺乳动物、爬行动物、鸟类等。
非真核生物：如本文中所使用，术语“非真核生物”是指非脊椎动物生物体。举例来说，非脊椎动物生物体可属于真细菌(Eubacteria)(例如大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)等)系统发育域或古细菌(Archaea)(例如詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌属NRC-1(HalobacteriumspeciesNRC-1)等嗜盐菌、超嗜热古菌(Archaeoglobusfulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrumpernix)等)系统发育域。
抗体：如本文中所使用，术语“抗体”包括(但不限于)特异性结合并识别分析物(抗原)的实质上由一个或一个以上免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段。实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体及单链抗体等。如本文中所使用的术语“抗体”中也包括免疫球蛋白的片段，包括Fab片段和由包括噬菌体呈现的表达文库产生的片段。关于抗体结构和术语学，例如参见Paul，FundamentalImmunology，第4版，1999，RavenPress，NewYork。
保守变异体：术语“保守变异体”是指在功能上与得到保守变异体的组件(例如O-tRNA或O-RS)一样表现但序列发生变异的翻译组件，例如保守变异体O-tRNA或保守变异体O-RS。举例来说，虽然O-tRNA和保守变异体O-tRNA不具有相同的序列，但O-RS将利用非天然氨基酸使互补O-tRNA或保守变异体O-tRNA氨酰化。例如，保守变异体的序列可具有一处变异、两处变异、三处变异、四处变异或五处或五处以上变异，只要保守变异体与相应O-tRNA或O-RS互补即可。
选择或筛选剂：如本文中所使用，术语“选择或筛选剂”是指当存在时允许从群体中选择/筛选某些组件的试剂。举例来说，选择或筛选剂例如包括(但不限于)营养物、抗生素、光波长、抗体、经表达多核苷酸(例如转录调节蛋白)等。可例如通过浓度、强度等来改变选择剂。
可检测物质：如本文中所使用，术语“可检测物质”是指当激活、改变、表达等时允许从群体中选择/筛选某些组件的试剂。举例来说，可检测物质可为化学剂，例如5-氟乳清酸(5-FOA)，其在某些情况下(例如表达URA3报告基因时)变得可检测(例如变为杀死表达URA3报告基因的细胞的有毒产物)。
突破遗传密码所施加的化学限制，直接在脊椎动物细胞中遗传修饰蛋白质结构的能力将提供探测和操纵细胞过程的强有力的分子工具。本发明提供扩充脊椎动物细胞中遗传编码的氨基酸的数目的翻译组件。这些组件包括tRNA(例如正交tRNA(O-tRNA))、氨酰基tRNA合成酶(例如正交合成酶(O-RS))、O-tRNA/O-RS对以及非天然氨基酸。
本发明的O-tRNA通常有效地经表达和加工且在脊椎动物细胞中在翻译中起作用，但不被宿主的氨酰基tRNA合成酶有效氨酰化。本发明的O-tRNA响应选择密码子在mRNA翻译期间将不编码常见的20种氨基酸中的任一种的非天然氨基酸传递到正在生长的多肽链中。
本发明的O-RS在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使本发明的O-tRNA氨酰化，但不会使任何细胞质中宿主的tRNA氨酰化。此外，本发明的氨酰基tRNA合成酶的特异性使得能接受非天然氨基酸，同时排除任何内源性氨基酸。包括例示性O-RS的氨基酸序列或其部分的多肽也是本发明的特征。另外，编码翻译组件、O-tRNA、O-RS和其部分的多核苷酸是本发明的特征。
本发明还提供利用用于脊椎动物细胞中的非天然氨基酸产生例如O-RS和/或正交对(正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶)的所需翻译组件的方法(和由这些方法产生的翻译组件)。举例来说，来自大肠杆菌的酪氨酰基tRNA合成酶/tRNACUA对为本发明的O-tRNA/O-RS对。另外，本发明的特征也在于在一种脊椎动物细胞中选择/筛选翻译组件，且当选择/筛选后将这些组件用于另一脊椎动物细胞(未用于选择/筛选的脊椎动物细胞)中的方法。举例来说，可在酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中进行产生用于脊椎动物细胞的翻译组件的选择/筛选方法，且然后可将这些所选择的组件用于另一脊椎动物细胞中，例如另一酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞等。
本发明进一步提供在脊椎动物细胞中产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质包含非天然氨基酸。所述蛋白质是使用本发明的翻译组件产生。本发明也提供包括非天然氨基酸的蛋白质(和由本发明的方法产生的蛋白质)。所关注的蛋白质或多肽也可包括翻译后修饰，其例如是通过[3+2]环加成或亲核-亲电子反应来添加，并非由原核细胞进行等。在某些实施例中，产生具有非天然氨基酸的转录调节蛋白的方法(和由这些方法产生的蛋白质)也包括在本发明内。包括包含非天然氨基酸的蛋白质的组合物也是本发明的特征。
产生具有非天然氨基酸的蛋白质或多肽的试剂盒也是本发明的特征。
正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)
为了在脊椎动物细胞中在所关注的蛋白质或多肽中特异性并入非天然氨基酸，改变合成酶的底物特异性，以致仅将所需的非天然氨基酸而不是常见的20种氨基酸中的任一种装入tRNA中。如果正交合成酶是混杂的，那么将产生在标靶位置处具有天然和非天然氨基酸的混合物的突变蛋白。本发明提供对特异性非天然氨基酸具有经修饰的底物特异性的正交氨酰基tRNA合成酶的组合物和其产生方法。
包括正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的脊椎动物细胞是本发明的特征。O-RS在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化。在某些实施例中，O-RS利用一个以上非天然氨基酸，例如两个或两个以上、三个或三个以上等非天然氨基酸。因此，本发明的O-RS可具有优先利用不同非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的能力。这允许通过选择将何种非天然氨基酸或非天然氨基酸的组合与细胞放在一起和/或通过选择不同量的非天然氨基酸与细胞放在一起以供并入来达成另一控制水平。
与天然氨基酸相比，本发明的O-RS视情况具有一种或一种以上针对非天然氨基酸的改进或增强的酶促性质。与天然存在的氨基酸(例如，20种已知的常见氨基酸中的一种)相比，针对非天然氨基酸的这些性质包括例如较高Km、较低Km、较高kcat、较低kcat、较低kcat/km、较高kcat/km等。
可视情况通过包括O-RS的多肽和/或通过编码O-RS或其部分的多核苷酸将O-RS提供给脊椎动物细胞。举例来说，O-RS或其部分是由如SEQIDNO：3-35中任一序列所述的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列编码。在另一实例中，O-RS包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列或其保守变异体。关于例示性O-RS分子的序列，例如参见本文中的表5、表6和表8以及实例6。
O-RS也可包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列(例如，如SEQIDNO：2中所述)例如至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至至少99.5％一致且包含来自群组A-E的两个或两个以上氨基酸的氨基酸序列。群组A包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Tyr37的位置处的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸；群组B包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asn126的位置处的天冬氨酸；群组C包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asp182的位置处的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；群组D包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Phe183的位置处的蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸；且群组E包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Leu186的位置处的丝氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或丙氨酸。也例如参见本文中的表4、表6和表8。
除O-RS外，本发明的脊椎动物细胞还可包括其它组件，例如非天然氨基酸。脊椎动物细胞还包括正交tRNA(O-tRNA)(例如源自诸如大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等的非脊椎动物生物体)，其中O-tRNA识别选择密码子且通过O-RS优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化。细胞中也可存在包含编码所关注的多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含由O-tRNA识别的选择密码子，或一个或一个以上所述选择密码子的组合。
一方面，O-tRNA以包含如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或由如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列加工而成的tRNA的效率的例如至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或99％或以上，介导将非天然氨基酸并入蛋白质中。另一方面，O-tRNA包含SEQIDNO：65，且O-RS包含SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的多肽序列和/或其保守变异体。关于例示性O-RS和O-tRNA分子的序列，也例如参见本文中的表5和实例6。
在一个实例中，脊椎动物细胞包含正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA(O-tRNA)、非天然氨基酸和包含编码所关注的多肽的多核苷酸的核酸，所述多核苷酸包含由O-tRNA识别的选择密码子。在脊椎动物细胞中，O-RS优先利用非天然氨基酸使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化，且所述细胞在不存在非天然氨基酸的情况下以一定产率产生所关注的多肽，所述产率例如为在存在非天然氨基酸的情况下多肽产率的不到30％、不到20％、不到15％、不到10％、不到5％、不到2.5％等。
产生O-RS的方法(其为本发明的特征)视情况包括：由野生型合成酶构架产生突变合成酶的池，且然后根据相对于常见的20种氨基酸，对非天然氨基酸的特异性选择突变RS。为分离这种合成酶，选择方法：(i)灵敏，因为由最初几轮得到的所需合成酶的活性可能较低且群体较小；(ii)“可调”，因为希望在各轮选择下改变选择严格度；以及(iii)通用，以使所述方法可用于不同非天然氨基酸。
在脊椎动物细胞中产生优先利用非天然氨基酸使正交tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法通常包括应用阳性选择、接着阴性选择的组合。在阳性选择中，在阳性标记的非必需位置处引入的选择密码子的抑制使得脊椎动物细胞在阳性选择压力下存活。因此，在存在非天然氨基酸的情况下，存活细胞编码在正交抑制因子tRNA中装入非天然氨基酸的活性合成酶。在阴性选择中，阴性标记的非必需位置处所引入的选择密码子的抑制将去除具有天然氨基酸特异性的合成酶。阴性和阳性选择的存活细胞编码只能(或至少优先)利用非天然氨基酸使正交抑制因子tRNA氨酰化(在正交抑制因子tRNA中装入非天然氨基酸)的合成酶。
举例来说，所述方法包括：(a)在存在非天然氨基酸的情况下使第一物种的脊椎动物细胞群体经受阳性选择，其中所述脊椎动物细胞各自包含：i)氨酰基tRNA合成酶(RS)文库的成员，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)编码阳性选择标记的多核苷酸以及iv)编码阴性选择标记的多核苷酸；其中在阳性选择中存活的细胞包含在存在非天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的活性RS；和(b)在不存在非天然氨基酸的情况下使在阳性选择中存活的细胞经受阴性选择，以去除利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的活性RS，从而提供利用非天然氨基酸优先使O-tRNA氨酰化的O-RS。
阳性选择标记可为多种分子中的任一种。在一个实施例中，阳性选择标记是提供供生长使用的营养增补剂的产品，且所述选择是在缺乏所述营养增补剂的培养基上进行。编码阳性选择标记的多核苷酸的实例例如包括(但不限于)基于补充细胞的氨基酸营养缺陷体的报告基因、his3基因(例如，其中通过提供3-氨基三唑(3-AT)所检测，his3基因编码咪唑磷酸甘油酯脱水酶)、ura3基因、leu2基因、lys2基因、lacZ基因、adh基因等。例如参见G.M.Kishore和D.M.Shah，(1988)，Aminoacidbiosynthesisinhibitorsasherbicides，AnnualReviewofBiochemistry57：627-663。在一个实施例中，通过邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解检测lacZ的产生。例如参见I.G.Serebriiskii和E.A.Golemis，(2000)，UsesoflacZtostudygenefunction：evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem，AnalyticalBiochemistry285：1-15。其它阳性选择标记例如包括荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的产物(例如氯霉素乙酰转移酶(CAT))、转录调节蛋白(例如GAL4)等。编码阳性选择标记的多核苷酸视情况包含选择密码子。
可将编码阳性选择标记的多核苷酸可操作性连接到反应元件。也可存在编码调节从反应元件进行的转录的转录调节蛋白且包含至少一个选择密码子的另一多核苷酸。通过经非天然氨基酸氨酰化的O-tRNA将非天然氨基酸并入转录调节蛋白中会引起编码阳性选择标记的多核苷酸(例如报告基因)的转录。选择密码子视情况位于编码转录调节蛋白的DNA结合域的多核苷酸的一部分中，或实质上靠近所述部分。
也可将编码阴性选择标记的多核苷酸可操作性连接到反应元件，其中从反应元件进行的转录是通过转录调节蛋白来介导。例如参见A.J.DeMaggio等人，(2000)，Theyeastsplit-hybridsystem，MethodEnzvmol.328：128-137；H.M.Shih等人，(1996)，Apositivegeneticselectionfordisruptingprotein-proteininteractions：identificationofCREBmutationsthatpreventassociationwiththecoactivatorCBP，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13896-13901；M.Vidal等人，(1996)，Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem，[comment]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326以及M.Vidal等人，(1996)，Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.[comment]Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10315-10320。通过经天然氨基酸氨酰化的O-tRNA将天然氨基酸并入转录调节蛋白中会引起阴性选择标记的转录。阴性选择标记视情况包含选择密码子。在一个实施例中，本发明的阳性选择标记和/或阴性选择标记可包含至少两个选择密码子，所述选择密码子各自或都可包含至少两个不同选择密码子或至少两个相同选择密码子。
转录调节蛋白是结合(直接或间接)核酸序列(例如反应元件)且调节可操作性连接到反应元件的序列的转录的分子。转录调节蛋白可为转录激活蛋白(例如GAL4、核激素受体、API、CREB、LEF/tcf家族成员、SMAD、VP16、SP1等)、转录阻遏蛋白(例如核激素受体、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可视环境而具有这两种活性的蛋白质(例如LEF/tcf、同源异型盒(homobox)蛋白等)。反应元件通常为由转录调节蛋白识别的核酸序列或与转录调节蛋白协力作用的另一试剂。
转录调节蛋白的另一实例为转录激活蛋白，GAL4。例如参见A.Laughon等人，(1984)，IdentificationoftwoproteinsencodedbytheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene，Molecular&CellularBiology4：268-275；A.Laughon和R.F.Gesteland，(1984)，PrimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene，Molecular&CellularBiology4：260-267；L.Keegan等人，(1986)，SeparationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofavertebrateregulatoryprotein，Science231：699-704；以及M.Ptashne，(1988)，Howvertebratetranscriptionalactivatorswork，Nature335：683-689。这一881个氨基酸的蛋白质的N-末端147个氨基酸形成特异性结合DNA序列的DNA结合域(DBD)。例如参见M.Carey等人，(1989)，Anamino-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer，J.Mol.Biol.209：423-432；和E.Giniger等人，(1985)，SpecificDNAbindingofGAL4，apositiveregulatoryproteinofyeast，Cell40：767-774。DBD通过插入蛋白质序列连接到当与DNA结合时可激活转录的C-末端113个氨基酸的激活域(AD)。例如参见J.Ma和M.Ptashne，(1987)，DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments，Cell48：847-853；和J.Ma和M.Ptashne，(1987)，Thecarboxy-terminal30aminoacidsofGAL4arerecognizedbyGAL80，Cell50：137-142。通过例如朝向含有GAL4的N-末端DBD和其C-末端AD的单一多肽的N-末端DBD放置琥珀密码子，可将通过O-tRNA/O-RS对执行的琥珀抑制连接到通过GAL4执行的转录激活。GAL4激活的报告基因可用以利用基因执行阳性和阴性选择。
用于阴性选择的培养基可包含通过阴性选择标记转化为可检测物质的选择或筛选剂。在本发明的一方面，可检测物质为有毒物质。编码阴性选择标记的多核苷酸例如可为ura3基因。举例来说，可将URA3报告基因放于含有GAL4DNA结合位点的启动子的控制下。当例如通过翻译编码具有选择密码子的GAL4的多核苷酸产生阴性选择标记时，GAL4激活URA3的转录。阴性选择是在包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上实现，所述5-氟乳清酸通过ura3基因的基因产物转化为可检测物质(例如，杀死细胞的有毒物质)。例如参见J.D.Boeke等人，(1984)，Apositiveselectionformutantslackingorotidine-5′-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast：5-fluorooroticacidresistance，Molecular&GeneralGenetics197：345-346)；M.Vidal等人，(1996)，Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem.[comment]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326；以及M.Vidal等人，(1996)，Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions，[comment]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10315-10320。
与阳性选择标记一样，阴性选择标记也可为多种分子中的任一种。在一个实施例中，阳性选择标记和/或阴性选择标记为发荧光或在存在合适反应物的情况下催化发光反应的多肽。举例来说，阴性选择标记例如包括(但不限于)荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的产物(例如氯霉素乙酰转移酶(CAT))、lacZ基因的产物、转录调节蛋白等。在本发明的一方面，通过荧光激活细胞分类(FACS)或发光性来检测阳性选择标记和/或阴性选择标记。在另一实例中，阳性选择标记和/或阴性选择标记包含基于亲和力的筛选标记。同一多核苷酸可编码阳性选择标记和阴性选择标记。
本发明的方法中也可使用其它水平的选择/筛选严格度。选择或筛选严格度可在产生O-RS的方法的一个或两个步骤中改变。此可例如包括改变编码阳性和/或阴性选择标记的多核苷酸中的反应元件的量，向一个或两个步骤中添加不同量的无活性合成酶，改变所使用的选择/筛选剂的量等。也可进行另外数轮阳性和/或阴性选择。
选择或筛选也可包含一种或一种以上阳性或阴性选择/筛选，所述选择/筛选例如包括氨基酸渗透性改变、翻译效率改变、翻译保真性改变等。所述一种或一种以上变化通常是基于包含或编码用于产生蛋白质的正交tRNA-tRNA合成酶对的组件的一个或一个以上多核苷酸的突变。
也可使用模型富集研究从过量无活性合成酶中快速选择活性合成酶。可进行阳性和/或阴性模型选择研究。举例来说，将包含潜在活性氨酰基tRNA合成酶的脊椎动物细胞与不同倍数过量的无活性氨酰基tRNA合成酶混合。在非选择性培养基中生长且通过例如X-GAL覆盖(X-GALoverlay)检定的细胞与在选择培养基(例如，在不存在组氨酸和/或尿嘧啶的情况下)中生长且能够在其中存活且通过例如X-GAL检定(X-GALassay)所检定的细胞之间进行比率比较。对于阴性模型选择，将潜在活性氨酰基tRNA合成酶与不同倍数过量的无活性氨酰基tRNA合成酶混合，且用例如5-FOA的阴性选择物质进行选择。
RS的文库(例如突变RS的文库)通常包含源自至少一种例如来自非脊椎动物生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)的RS。在一个实施例中，RS的文库是源自无活性RS，例如其中无活性RS例如在合成酶的活性位点处、在合成酶的编辑机制位点处、在通过组合合成酶的不同域所得的不同位点处等通过使活性RS突变而产生。举例来说，使RS的活性位点处的残基突变为例如丙氨酸残基。使用编码丙氨酸突变RS的多核苷酸作为将丙氨酸残基诱变到所有20种氨基酸中的模板。选择/筛选突变RS的文库来产生O-RS。在另一实施例中，无活性RS包含氨基酸结合袋，且包含结合袋的一个或一个以上氨基酸经一个或一个以上不同氨基酸取代。在一个实例中，经取代的氨基酸是经丙氨酸取代。视情况使用编码丙氨酸突变RS的多核苷酸作为将丙氨酸残基诱变到所有20种氨基酸中的模板，并对其加以筛选/选择。
产生O-RS的方法可进一步包括通过使用所属领域中已知的各种诱变技术产生RS文库。举例来说，可通过位点特异性突变、随机点突变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构筑或其任何组合产生突变RS。举例来说，突变RS的文库可由两个或两个以上其它(例如)较小、较少多样性的“子文库”产生。一旦使合成酶经受阳性和阴性选择/筛选策略，然后就可使这些合成酶经受进一步诱变。举例来说，可分离编码O-RS的核酸；可由核酸生成一组编码突变O-RS的多核苷酸(例如，通过随机诱变、位点特异性诱变、重组或其任何组合)；且可重复这些个别步骤或这些步骤的组合，直到获得优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的突变O-RS。在本发明的一方面，进行所述步骤至少两次。
关于产生O-RS的其它细节可见于标题为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的WO2002/086075中。也参见Hamano-Takaku等人，(2000)AmutantEscherichiacoliTyrosyl-tRNASynthetaseUtilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMoreEfficientlythanTyrosine，JournalofBiologicalChemistry.275(51)：40324-40328；Kiga等人，(2002)，AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinvertebratetranslationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem，PNAS99(15)：9715-9723；以及Francklyn等人，(2002)，Aminoacyl-tRNAsynthetases：Versatileplayersinthechangingtheateroftranslation：RNA.8：1363-1372。
正交tRNA
本发明提供包括正交tRNA(O-tRNA)的真核细胞。正交tRNA介导在活体内将非天然氨基酸并入由包含由O-tRNA识别的选择密码子的多核苷酸编码的蛋白质中。在某些实施例中，本发明的O-tRNA以包含如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列或在细胞中由如SEQIDNO：65中所述的多核苷酸序列加工而成的tRNA的效率的例如至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％或甚至90％或90％以上，介导将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见本文中的表5。
本发明的O-tRNA的实例为SEQIDNO：65。(参见本文中的实例6和表5)。SEQIDNO：65是在细胞中视情况例如使用标准内源性细胞剪接和加工机构加工且经修饰以形成活性O-tRNA的剪接前/加工前转录物。这些剪接前转录物的群体通常形成细胞中的活性tRNA群体。本发明还包括O-tRNA和其经加工的细胞产物的保守变异体。举例来说，O-tRNA的保守变异体包括那些像SEQIDNO：65的O-tRNA一样作用且在加工形式中维持tRNA的L形结构，但不具有相同序列的分子(且不为野生型tRNA分子)。本发明的O-tRNA通常为可重复利用的O-tRNA，这是因为O-tRNA可在活体内再氨酰化，从而再次介导响应选择密码子将非天然氨基酸并入由多核苷酸编码的蛋白质中。
真核生物而非原核生物中的tRNA的转录是通过RNA聚合酶III进行，这对脊椎动物细胞中可转录的tRNA结构基因的一级序列产生限制。另外，在脊椎动物细胞中，tRNA需要从转录所述tRNA的核中输出到细胞质中，以进行翻译。编码本发明的O-tRNA或其互补多核苷酸的核酸也是本发明的特征。在本发明的一方面，编码本发明的O-tRNA的核酸包括内部启动子序列，例如A盒(例如TRGCNNAGY)和B盒(例如GGTTCGANTCC，SEQIDNO：88)。本发明的O-tRNA也可经转录后修饰。举例来说，真核生物中tRNA基因的转录后修饰包括分别通过RnaseP和3′-内切核酸酶去除5′-侧接序列和3′-侧接序列。添加3′-CCA序列也是真核生物中tRNA基因的转录后修饰。
在一个实施例中，通过使第一物种的脊椎动物细胞的群体经受阴性选择获得O-tRNA，其中脊椎动物细胞包含tRNA文库的成员。阴性选择去除包含经脊椎动物细胞的内源性氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文库的成员的细胞。这提供与第一物种的脊椎动物细胞正交的tRNA池。
可替代使用或与上述将非天然氨基酸并入多肽中的其它方法组合使用反式翻译系统。这一系统包括存在于大肠杆菌中的称为tmRNA的分子。这一RNA分子在结构上与丙氨酰基tRNA相关且经丙氨酰合成酶氨酰化。tmRNA与tRNA之间的不同之处在于，反密码子环是由特定的大序列置换。这一序列允许核糖体使用tmRNA内编码的开放阅读框架作为模板在已停止的序列上重新开始翻译。在本发明中，可产生优先经正交合成酶氨酰化且加载非天然氨基酸的正交tmRNA。通过由所述系统转录基因，核糖体停在特定位点处；在这一位点处引入非天然氨基酸，且使用正交tmRNA内编码的序列重新开始翻译。
关于产生重组正交tRNA的其它方法例如可见于标题为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的国际专利申请案WO2002/086075中。也参见Forster等人，(2003)ProgrammingpeptidomimeticsynthetasesbytranslatinggeneticcodesdesigneddenovoPNAS100(11)：6353-6357；和Feng等人，(2003)，ExpandingtRNArecognitionofatRNAsynthetasebyasingleaminoacidchange，PNAS100(10)：5676-5681。
正交TRNA和正交氨酰基tRNA合成酶对
正交对包含例如抑制因子tRNA、移码tRNA等的O-tRNA和O-RS。O-tRNA未被内源性合成酶酰化且能够在活体内介导将非天然氨基酸并入由包含由O-tRNA识别的选择密码子的多核苷酸编码的蛋白质中。在脊椎动物细胞中，O-RS识别O-tRNA且优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化。本发明中包括产生正交对的方法和由所述方法产生的正交对，和用于脊椎动物细胞中的正交对的组合物。多种正交tRNA/合成酶对的研发可允许在脊椎动物细胞中使用不同密码子同时合并多个非天然氨基酸。
在脊椎动物细胞中，可通过利用无效跨物种氨酰化输入来自不同生物体的对(例如无义抑制因子对)来产生正交O-tRNA/O-RS。在脊椎动物细胞中有效表达和加工O-tRNA和O-RS，且将O-tRNA有效地从核中输出到细胞质中。举例来说，一个这样的对为来自大肠杆菌的酪氨酰基tRNA合成酶/tRNACUA对(例如参见H.M.Goodman等人，(1968)，Nature217：1019-24；和D.G.Barker等人，(1982)，FEBSLetters150：419-23)。当在酿酒酵母的细胞质中表达大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶和其同源大肠杆菌tRNACUA时，大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶有效地使其同源大肠杆菌tRNACUA氨酰化，但不会使酿酒酵母tRNA氨酰化。例如参见H.Edwards和P.Schimmel，(1990)，Molecular&CellularBiology10：1633-41；和H.Edwards等人，(1991)，PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6。另外，大肠杆菌酪氨酰基tRNACUA是酿酒酵母氨酰基tRNA合成酶的不良底物(例如参见V.Trezeguet等人，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51)，但其在酿酒酵母的蛋白质翻译中有效地起作用。例如参见H.Edwards和P.Schimmel，(1990)Molecular&CellularBiology10：1633-41；H.Edwards等人，(1991).PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6；以及V.Trezeguet等人，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51。此外，大肠杆菌TyrRS不具有校正与tRNA连接的非天然氨基酸的编辑机构。
O-tRNA和O-RS可天然存在，或可通过使来自多种生物体的天然存在的tRNA和/或RS突变而产生，所述突变产生tRNA文库和/或RS文库。参见本文中的标题为“来源和宿主”的部分。在各种实施例中，O-tRNA和O-RS是源自至少一种生物体。在另一实施例中，O-tRNA是源自来自第一种生物体的天然存在或突变的天然存在的tRNA，且O-RS是源自来自第二种生物体的天然存在或突变的天然存在的RS。在一个实施例中，第一种和第二种非脊椎动物生物体相同。或者，第一种和第二种非脊椎动物生物体可不同。
关于产生O-RS和O-tRNA的方法，参见本文中的标题为“正交氨酰基tRNA合成酶”和“O-tRNA”的部分。也参见标题为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的国际专利申请案WO2002/086075。
保真性、效率和产率
保真性是指将所需分子(例如非天然氨基酸或氨基酸)在所需位置处并入正在生长的多肽中的准确性。本发明的翻译组件响应选择密码子以高保真性将非天然氨基酸并入蛋白质中。举例来说，与在正在生长的多肽链中在所需位置处不合需要地并入特定天然氨基酸相比，使用本发明的组件将所需非天然氨基酸在所需位置处并入正在生长的多肽链中的效率(例如，响应选择密码子)例如为超过75％、超过85％、超过95％或甚至超过99％或99％以上有效。
效率也可指与相关对照相比，O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的程度。本发明的O-RS可通过其效率来定义。在本发明的某些实施例中，比较某种O-RS与另一种O-RS。举例来说，本发明的O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，这与具有(例如)如SEQIDNO：86或45中所述的氨基酸序列的O-RS或表5中的另一特定RS使O-tRNA氨酰化例如至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至99％或99％以上有效。在另一实施例中，本发明的O-RS利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，这比O-RS利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化有效至少10倍、至少20倍、至少30倍等。
使用本发明的翻译组件，包含非天然氨基酸的所关注的多肽的产率为从多核苷酸缺乏选择密码子的细胞获得所关注的天然存在的多肽的产率的例如至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、50％或50％以上。另一方面，细胞在不存在非天然氨基酸的情况下以一定产率产生所关注的多肽，所述产率例如为在存在非天然氨基酸的情况下多肽产率的不到30％、不到20％、不到15％、不到10％、不到5％、不到2.5％等。
来源和宿主生物体
本发明的正交翻译组件通常源自用于脊椎动物细胞或翻译系统中的非脊椎动物生物体。举例来说，正交O-tRNA可源自非脊椎动物生物体，例如真细菌，诸如大肠杆菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等；或古细菌，诸如詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、诸如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐菌属NRC-1等嗜盐菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌等，而正交O-RS也可源自非脊椎动物生物体，例如真细菌，诸如大肠杆菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等；或古细菌，诸如詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、诸如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐菌属NRC-1等嗜盐菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌等。或者，也可使用脊椎动物来源，例如植物、藻类、原生生物、真菌、酵母、动物(例如哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等，例如其中所述组件与所关注的细胞或翻译系统正交，或其中其经修饰(例如突变)而与细胞或翻译系统正交。
O-tRNA/O-RS对的个别组件可源自相同生物体或不同生物体。在一个实施例中，O-tRNA/O-RS对是来自相同生物体。举例来说，O-tRNA/O-RS对可源自来自大肠杆菌的酪氨酰基tRNA合成酶/tRNACUA对。或者，O-tRNA/O-RS对的O-tRNA和O-RS视情况来自不同生物体。
可选择或筛选正交O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS对和/或在脊椎动物细胞将其用于产生具有非天然氨基酸的多肽。脊椎动物细胞可来自多种来源，例如任何脊椎动物(例如哺乳动物、两栖动物、鸟类、爬行动物、鱼类等)等。具有本发明的翻译组件的脊椎动物细胞的组合物也是本发明的特征。
本发明也提供在一种物种中的有效筛选，从而任选用于所述物种和/或第二物种中(视情况无其它选择/筛选)。举例来说，在一种物种(例如容易操纵的物种(诸如酵母细胞等))中选择或筛选O-tRNA/O-RS的组件且将其引入例如植物(例如复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌、酵母、动物(例如哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等的第二脊椎动物物种中，以用于在第二物种中活体内并入非天然氨基酸。
举例来说，可选择酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)作为第一脊椎动物物种，这是因为其为单细胞物种，具有快速的世代时间和相对明确表征的遗传学。例如参见D.Burke等人，(2000)MethodsinYeastGenetics.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY。此外，因为真核生物的翻译机构高度保守(例如参见(1996)TranslationalControl.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY；Y.Kwok和J.T.Wong，(1980)，EvolutionaryrelationshipbetweenHalobacteriumcutirubrumandeukaryotesdeterminedbyuseofaminoacyl-tRNAsynthetasesasphylogeneticprobes，CanadianJournalofBiochemistry58：213-218；以及(2001)TheRibosome.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，所以可将酿酒酵母中发现的用于并入非天然氨基酸的aaRS基因引入高级脊椎动物生物体中且与同源tRNA合作(例如参见K.Sakamoto等人，(2002)Site-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinmammaliancells，NucleicAcidsRes.30：4692-4699；和C.Kohrer等人，(2001)，ImportofamberandochresuppressortRNA′sintomammaliancells：ageneralapproachtosite-specificinsertionofaminoacidanaloguesintoproteins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14310-14315)用于并入非天然氨基酸。
在一个实例中，在如本文中所述的在第一物种中产生O-tRNA/O-RS的方法进一步包括在第二物种(例如哺乳动物、昆虫、真菌、藻类、植物等)的脊椎动物细胞中引入编码O-tRNA的核酸和编码O-RS的核酸。在另一实例中，产生在脊椎动物细胞中优先利用非天然氨基酸使正交tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)在存在非天然氨基酸的情况下使第一物种(例如酵母等)的脊椎动物细胞群体经受阳性选择。脊椎动物细胞各自包含：i)氨酰基tRNA合成酶(RS)文库的成员，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)编码阳性选择标记的多核苷酸，以及iv)编码阴性选择标记的多核苷酸。在阳性选择中存活的细胞包含在存在非天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的活性RS。使在阳性选择中存活的细胞在不存在非天然氨基酸的情况下经受阴性选择，以去除利用天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的活性RS。这提供优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的O-RS。将编码O-tRNA的核酸和编码O-RS的核酸(或组件O-tRNA和/或O-RS)引入第二物种(例如哺乳动物、昆虫、真菌、藻类、植物等)的脊椎动物细胞中。通常，通过使第一物种的脊椎动物细胞的群体经受阴性选择来获得O-tRNA，其中脊椎动物细胞包含tRNA文库的成员。阴性选择去除包含经脊椎动物细胞的内源性氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文库的成员的细胞，此提供与第一物种和第二物种的脊椎动物细胞正交的tRNA池。
选择密码子
本发明的选择密码子将扩充蛋白质生物合成机构的遗传密码子构架。举例来说，选择密码子例如包括独特的三个碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，例如琥珀密码子(UAG)、蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、至少四个碱基的密码子、稀有密码子等。可将多个选择密码子引入所需基因中，例如一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上等。基因可包括给定选择密码子的多个复本，或可包括多个不同的选择密码子或其任何组合。
在一个实施例中，所述方法包括使用作为终止密码子的选择密码子，以在脊椎动物细胞中活体内并入非天然氨基酸。举例来说，产生识别例如UAG的终止密码子的O-tRNA且通过O-RS利用所需的非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化。天然存在的宿主氨酰基tRNA合成酶无法识别这一O-tRNA。可使用常规定点诱变在所关注的多肽中的所关注的位点处引入例如TAG的终止密码子。例如参见Sayers，J.R.等人，(1988)，5′，3′Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis.NucleicAcidsRes，791-802。当活体内组合O-RS、O-tRNA以及编码所关注的多肽的核酸时，响应UAG密码子并入非天然氨基酸以产生在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰脊椎动物宿主细胞的情况下进行。举例来说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(例如琥珀抑制因子tRNA)与脊椎动物释放因子(例如eRF)(其与终止密码子结合且起始正在生长的肽从核糖体中的释放)之间的竞争，所以抑制效率可例如通过增加O-tRNA(例如抑制因子tRNA)的表达水平来调节。
选择密码子还包含延长密码子，例如四个或四个以上碱基的密码子(诸如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子)。四个碱基的密码子的实例例如包括AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五个碱基的密码子的实例例如包括AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制(frameshiftsuppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子例如可将一个或一个以上非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt反密码子环)的突变O-tRNA(例如特定移码抑制因子tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子读作单个氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可例如解码至少一个四个碱基的密码子、至少一个五个碱基的密码子或至少一个六个碱基的密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四个碱基的密码子，所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参见Anderson等人，(2002)ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize，ChemistryandBiology，9：237-244；Magliery，(2001)ExpandingtheGeneticCode：SelectionofEfficientSuppressorsofFour-baseCodonsandIdentificationof“Shifty”Four-baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli，J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法利用四个碱基的密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见Ma等人，(1993)Biochemistry.32：7939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：34。使用CGGG和AGGU，从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制因子tRNA同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物并入抗生蛋白链菌素中。例如参见Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121：12194。在活体内研究中，Moore等人检查具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力且发现四联体UAGA可通过具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框架中极少解码。参见Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298：195。在一个实施例中，可在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可减少其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包括一个天然的三个碱基的密码子，其中内源性系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然的三个碱基的密码子的tRNA的系统和/或三个碱基的密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充现有的遗传代码(geneticalphabet)。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定且具选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延长。可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述例如包括Hirao等人，(2002)Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanaloguesintoprotein，NatureBiotechnology，20：177-182。其它相关公开文献列于下表中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是膜可渗透的且可磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外，增加的遗传信息是稳定的且不受细胞酶破坏。Benner和其它人先前的工作利用不同于典型Watson-Crick配对的氢键模式，其中最值得注意的实例是iso-C：iso-G配对。例如参见Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，111：8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4：602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和其同事证明碱基之间的疏水性堆积相互作用(hydrophobicpackinginteraction)可代替氢键来驱动碱基对的形成。参见Kool，(2000)Curr.Ooin.Chem.Biol.4：602；和Guckian和Kool，(1998)Aneew.Chem.Int.Ed.Engl.36，2825。在研发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和其同事系统地合成和研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS：PICS自身配对比天然碱基对稳定且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenowfragment)(KF)有效地并入DNA中。例如参见McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11586；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.122：3274。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN：3MN自身配对。例如参见Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.122：8803。然而，这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身配对。另外，也可复制7AI自身配对。例如参见Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc.123：7439。也已研发新颖的金属碱基对Dipic：Py，其在结合Cu(II)后形成稳定配对。参见Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.122：10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用这一性质产生正交tRNA供其使用。
也可使用翻译旁路系统(translationalbypassingsystem)在所需多肽中并入非天然氨基酸。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列且在插入下游重新开始翻译的提示的结构。
非天然氨基酸
如本文中所使用，非天然氨基酸是指除硒代半胱氨酸和/或吡咯赖氨酸和下列20种遗传编码的α-氨基酸以外的任何氨基酸、经修饰氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。α-氨基酸的一般结构由式I说明：
非天然氨基酸通常为任何具有式I的结构，其中R基团是除20种天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基。关于20种天然氨基酸的结构，例如参见L.Stryer，Biochemistry，第3版，1988，FreemanandCompany，NewYork。需注意的是，本发明的非天然氨基酸可为除以上20种α-氨基酸以外的天然存在的化合物。
因为本发明的非天然氨基酸不同于天然氨基酸之处通常在于侧链，所以非天然氨基酸以与天然存在的蛋白质中形成酰胺键相同的方式与其它氨基酸(例如天然或非天然)形成酰胺键。然而，非天然氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，式I中的R视情况包含烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤基、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基、磺酰基、硼酸酯(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酸基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、胺等或其任何组合。所关注的其它非天然氨基酸包括(但不限于)包含光活化交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或光致异构化氨基酸、含生物素或生物素类似物的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学裂解或光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有伸长侧链(例如聚醚或长链烃，例如约5个碳以上、约10个碳以上等)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸具有例如用于使蛋白质与固体支撑物连接的光活化交联剂。在一个实施例中，非天然氨基酸具有连接到氨基酸侧链的糖部分(例如糖基化氨基酸)和/或其它碳水化合物修饰。
除含有新颖侧链的非天然氨基酸外，非天然氨基酸还视情况包含经修饰的主链结构，例如，如式II和式III的结构所说明：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；且R和R′视情况相同或不同，通常选自与上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的组分相同的清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含如式II和III所说明的氨基或羧基的取代。这种类型的非天然氨基酸包括(但不限于)例如具有对应于常见的20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链的α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯。另外，α-碳的取代视情况包括L、D或α-α-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，诸如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。举例来说，多种非天然氨基酸是基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等的天然氨基酸。酪氨酸类似物包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸例如包含酮基(例如乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳基环。本发明的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。例示性苯丙氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸以及间位取代的苯丙氨酸，其中取代基例如包含羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(例如乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、对炔丙氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸以及异丙基-L-苯丙氨酸等。例如，多种非天然氨基酸的其它结构是提供于标题为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的WO2002/085923的图16、17、18、19、26以及29中。关于其它蛋氨酸类似物，也参见Kiick等人，(2002)IncorporationofazidesintorecombinantproteinsforchemoselectivemodificationbytheStaudingerligtation，PNAS99：19-24的图1结构2-5。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(诸如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的组合物。还提供各种包含对(炔丙氧基)-苯丙氨酸和例如蛋白质和/或细胞的组合物。一方面，包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(例如共价)，例如通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结，与正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共价键结等。
可借助于非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优点和操纵性。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许利用许多含肼或羟胺试剂中的任一个在活体外和活体内选择性修饰蛋白质。举例来说，重原子非天然氨基酸可适用于定相x射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性引入重原子还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(例如，具有二苯甲酮和叠氮芳基(例如叠氮苯)侧链的氨基酸)允许蛋白质的活体内和活体外有效光交联。光反应性非天然氨基酸的实例例如包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，可通过激发光反应性基团(提供时间(和/或空间)控制)使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学的探针(例如，使用核磁共振和振动光谱学)的同位素标记的(例如)甲基取代。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
非天然氨基酸的化学合成
以上提供的多种非天然氨基酸可例如从Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)购得。无法购得的非天然氨基酸是视情况如本文中所提供或如各种公开文献中所提供或使用所属领域技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参见Fessendon和Fessendon，OrganicChemistry(1982，第2版，WillardGrantPress，BostonMass.)；March，AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985，WileyandSons，NewYork)；以及Carey和Sundberg，AdvancedOrganicChemistry(第3版，A和B部分，1990，PlenumPress，NewYork)。描述非天然氨基酸的合成的其它公开文献例如包括：名称为“InvivoincorporationofUnnaturalAminoAcids”的WO2002/085923；Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.38，4660-4669；King，F.E.和Kidd，D.A.A.(1949)ANewSynthesisofGlutamineandofγ-DipeptidesofGlutamicAcidfromPhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc.3315-3319；Friedman，O.M.和Chatterrji，R(1959)SynthesisofDerivativesofGlutamineasModelSubstratesforAnti-TumorAgents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人，(1988)AbsoluteConfigurationoftheEnantiomersof7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.和Frappier，F.(1991)GlutamineanaloguesasPotentialAntimalarials，.Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.和Rapoport，H.(1989)Synthesisof4-SubstitutedProlinesasConformationallyConstrainedAminoAcidAnalogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.和Rapoport，H.(1985)SynthesisofOpticallyPurePipecolatesfromL-Asparagine.ApplicationtotheTotalsynthesisof(+)-ApovincaminethroughAminoAcidDecarbonylationandIminiumIonCyclization.J.Org.Chem.1989：1859-1866；Barton等人，(1987)SynthesisofNovelα-Amino-AcidsandDerivativesUsingRadicalChemistry：synthesisofL-andD-α-Amino-AdipicAcids，L-α-aminopimelicAcidandAppropriateUnsaturatedDerivatives.TetrahedronLett.43：4297-4308；以及Subasinghe等人，(1992)Quisqualicacidanalogues：synthesisofbeta-heterocyclic2-aminopropanoicacidderivativesandtheiractivityatanovelquisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem.35：4602-7。
非天然氨基酸的细胞摄取
脊椎动物细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择例如并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常需考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度提示这些化合物可能无法渗透细胞。借助于一系列基于蛋白质的转运系统将天然氨基酸吸收到脊椎动物细胞中。可进行快速筛选以评定哪些非天然氨基酸(如果有)被细胞吸收。例如，参见例如2002年12月22日申请的代理人案号为P1001US00的名称为“ProteinArrays”的申请案以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progresstowardtheevolutionofanorganismwithanexpandedgeneticcode.PNASUnitedStates96：4780-4785中的毒性检定。虽然易于利用各种检定来分析摄取，但设计适于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方案在于提供活体内产生氨基酸的生物合成途径。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已存在许多产生氨基酸和其它化合物的生物合成途径。虽然自然界中(例如脊椎动物细胞中)可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本发明提供这些方法。举例来说，在宿主细胞中通过添加新颖酶或修饰现有的宿主细胞途径而视情况产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新颖酶视情况为天然存在的酶或人工发展的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如名称为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的WO2002/085923中的实例所提供)依赖于添加来自其它生物体的已知酶的组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞而将所述基因引入脊椎动物细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促途径。视情况添加的酶的类型的实例提供于以下实例中。其它酶序列例如可见于Genbank中。也可以相同的方式视情况将人工发展的酶添加到细胞中。以此方式操纵细胞机构和细胞的资源以产生非天然氨基酸。
可利用多种方法来产生用于生物合成途径或发展现有途径的新颖酶。举例来说，视情况使用(例如)如由Maxygen，Inc.(可在万维网的www.maxygen.com上获得)研发的递归重组来研发新颖酶和途径。例如参见Stemmer(1994)，RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling，Nature370(4)：389-391；和Stemmer，(1994)，DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly：Invitrorecombinationformolecularevolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91：10747-10751。类似地，视情况使用Genencor(可在万维网的genencor.com上获得)研发的DesignPathTM进行代谢途径工程化，例如工程化在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的途径。这种技术使用例如通过功能基因组学鉴别的新颖基因的组合和分子进化和设计在宿主生物体中重新构筑现有途径。Diversa公司(可在万维网的diversa.com上获得)还提供快速筛选基因文库和基因途径(例如建立新的途径)的技术。
本发明包括通过在质粒构筑体中使用约2、3、4、5、6、7、8、9、10、40或多达约80个tRNA复本来增加琥珀抑制和选择密码子识别的方法。在本发明的一个实施例中，这些复本为杂交tRNA且可包括多种如图2和图6中所示的终止序列。本发明还包括其它转染载体(包括诸如λ噬菌体等重组噬菌体)和粘粒DNA表达载体等，且通常包括启动子序列(包括(但不限于)诸如U6和H1等PolIII启动子)。另外，噬菌体允许在转染载体中包括更多tRNA复本(多达约200个)，此增加细胞中的总tRNA复本数。
通常以足以进行有效蛋白质生物合成(例如天然细胞量)但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度来产生利用本发明的工程化生物合成途径所产生的非天然氨基酸。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞且产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽是本发明的特征。本发明还包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(例如医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。
通过在脊椎动物细胞中产生所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括脊椎动物转译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由脊椎动物细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰例如包括乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖(例如(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。也参见表7，表7列出脊椎动物蛋白质的N-连接寡糖的一些实例(也可存在其它未绘示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或者GalNAc-苏氨酸键或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(例如Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。
表7：通过GlcNAc键连接的寡糖的实例
另一方面，翻译后修饰包括前体(例如降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroidhormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，组装成多亚单元蛋白质或大分子组装物，翻译到细胞中的另一位点(例如细胞器，诸如内质网、高尔基体、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、空泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。
非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在脊椎动物细胞中活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于选择性修饰蛋白质的大多数反应包括亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，例如α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下的选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可及性决定。在本发明的蛋白质中，可在活体外和活体内使用其它更具选择性的反应，诸如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参见Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc，118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99：11020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；以及Chin等人，(2003)Science，出版中。这允许用许多试剂选择性标记几乎任何蛋白质，所述试剂包括荧光团、交联剂、糖类衍生物以及细胞毒性分子。也参见2003年10月15日申请的名称为“Glycoproteinsynthesis”的专利申请案USSN10/686,944。例如，通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过斯达汀格连接反应(Staudingerligation)(例如用三芳基膦试剂)进行。例如参见Kiick等人，(2002)IncorporationofazidesintorecombinantproteinsforchemoselectivemodificationbytheStaudingerligtation，PNAS99：19-24。
本发明提供选择性修饰蛋白质的另一种极为有效的方法，其包括响应选择密码子将例如含有叠氮部分或炔基部分的非天然氨基酸遗传并入蛋白质中。然后，可例如通过休斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应(例如参见Padwa，A.，ComprehensiveOrganicSynthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.，1，3-DipolarCycloadditionChemistry，(1984)Padwa，A.编，Wiley，NewYork，第1-176页)分别用例如炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。例如参见图16。因为这一方法包括环加成而不是亲核取代，所以可以极高选择性修饰蛋白质。可在室温下在水性条件下通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐而以极佳区域选择性(1，4＞1，5)进行这一反应。例如参见Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。可使用的另一方法为用四半胱氨酸(tetracysteine)基元对双砷化合物进行配位体交换，例如参见Griffin等人，(1998)Science281：269-272。
可通过非天然编码氨基酸的官能团添加到本发明蛋白质中的分子包括几乎任何具有互补官能团的分子。这些分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(例如聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(例如DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。另一方面，本发明提供包括这些分子的组合物和产生这些分子(例如聚乙二醇衍生物)的方法，其中n为介于例如50与10,000、75与5,000、100与2,000、100与1,000等之间的整数。在本发明的实施例中，聚乙二醇具有例如约5,000到约100,000Da，约20,000到约30,000、约40,000或约50,000Da、约20,000到约10,000Da等的分子量。
也提供包含这些化合物，例如具有蛋白质和细胞的各种组合物。在本发明的一方面，包含叠氮基染料的蛋白质(例如具有化学结构4或化学结构6)进一步包括至少一个非天然氨基酸(例如炔基氨基酸)，其中叠氮基染料通过[3+2]环加成与非天然氨基酸连接。
本发明的脊椎动物细胞提供合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括例如至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克或10毫克以上或活体内蛋白质产生方法可实现的量(本文中提供关于重组蛋白质产生和纯化的细节)的包含非天然氨基酸的蛋白质。另一方面，蛋白质视情况以在例如细胞溶解产物、缓冲剂、医药缓冲剂或其它液体悬浮液(例如，体积约为例如约1纳升到约100升)中例如每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白质的浓度存在于组合物中。在脊椎动物细胞中产生大量(例如，大于通常用其它方法、例如活体外翻译可能获得的量)蛋白质(包括至少一个非天然氨基酸)是本发明的特征。
可进行非天然氨基酸的并入，从而来例如调整蛋白质结构和/或功能的改变，例如改变大小、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点的可及性、靶向部分(例如，对于蛋白质阵列)等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增加或甚至完全新颖的催化或物理性质。举例来说，视情况通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变下列性质：毒性、生物分布(biodistribution)、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(例如血清半衰期)、与其它分子反应(例如共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于例如新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(例如抗体)以及例如蛋白质结构和功能的研究。例如参见Dougherty，(2000)UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction，CurrentOpinioninChemicalBiology.4：645-652。
在本发明的一方面，组合物包括至少一种具有至少一个，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，例如在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可相同或不同(例如，蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可相同、不同或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
基本上任何包括非天然氨基酸(和任何相应的编码核酸，例如包括一个或一个以上选择密码子)的蛋白质(或其部分)都可使用本文中的组合物和方法产生。未尝试鉴别成千上万种已知蛋白质，所述蛋白质中任一种都可例如通过调整任何可利用的突变方法以在相关翻译系统中包括一个或一个以上适当选择密码子而经修饰，从而包括一个或一个以上非天然氨基酸。已知蛋白质的常见序列谱系包括GenBankEMBL、DDBJ以及NCBI。其它谱系可通过搜索互联网容易地鉴别。
蛋白质通常与任何可利用的蛋白质(例如治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分等)例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或99％以上一致，且其包含一个或一个以上非天然氨基酸。可经修饰以包含一个或一个以上非天然氨基酸的治疗蛋白、诊断蛋白以及其它蛋白的实例包括(但不限于)例如α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体(关于抗体的更多细节可见于下文)、载脂蛋白(Apolipoprotein)、载脂蛋白(Apoprotein)、心房利尿钠因子、心房利尿钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子(例如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降钙素、CC趋化因子(例如单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞发炎性蛋白-1α、单核细胞发炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配位体、C-kit配位体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子(例如上皮中性粒细胞激活肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、M1P-1α、MIP-1δ、MCP-1)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(“EPO”，代表通过并入一个或一个以上非天然氨基酸加以修饰的优选标靶)、剥脱性毒素A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、刺猬蛋白(例如音速(Sonic)、印度(Indian)、沙漠(Desert))、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人类血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人类生长激素)、多效营养因子、蛋白质A、蛋白质G、致热外毒素A、B和C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原(即，葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE))、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克综合症毒素(TSST-1)、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子β(TGFβ)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、血管内皮生长因子(VEGEF)、尿激酶等。
可使用本文中所述的用于活体内并入非天然氨基酸的组合物和方法产生的一类蛋白质包括转录调节蛋白或其部分。例示性转录调节蛋白包括调节细胞生长、分化、调控等的基因和转录调节蛋白。转录调节蛋白可见于原核生物、病毒以及真核生物(包括真菌、植物、酵母、昆虫以及包括哺乳动物的动物)中，从而提供大量治疗性标靶。应了解表达和转录激活因子通过许多机制调控转录，例如通过与受体结合、刺激信号转导级联、调控转录因子表达、与启动子和增强子结合、与结合启动子和增强子的蛋白质结合、解开DNA、剪接前体mRNA、使RNA多腺苷酸化以及降解RNA。举例来说，脊椎动物细胞中的GAL4蛋白或其部分的组合物也是本发明的特征。GAL4蛋白或其部分通常包含至少一个非天然氨基酸。也参见本文中标题为“正交氨酰基tRNA合成酶”的部分。
一类本发明的蛋白质(例如具有一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质)包括表达激活因子，诸如细胞因子、发炎性分子、生长因子、其受体以及致癌基因产物，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-8等)、干扰素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1以及透明质酸/CD44；信号转导分子和相应致癌基因产物，例如Mos、Ras、Raf以及Met；和转录激活因子和抑制因子，例如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel以及类固醇激素受体(诸如雌激素、孕酮、睾酮、醛固酮、LDL受体配位体和皮质酮的受体)。
本发明还提供具有至少一个非天然氨基酸的酶(例如工业酶)或其部分。酶的实例包括(但不限于)例如酰胺酶、氨基酸消旋酶、酰化酶、脱卤酶、双加氧酶、二芳基丙烷过氧化物酶、表异构酶、环氧化物水解酶、酯酶、异构酶、激酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、糖基转移酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、单加氧酶(例如p450)、脂肪酶、木质素过氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酶、枯草杆菌蛋白酶、转氨酶以及核酸酶。
这些蛋白质中的多者可购得(例如参见SigmaBioSciences2002目录和价格表)，且相应蛋白质序列和基因以及通常其许多变异体也为我们所熟知(例如参见Genbank)。可通过插入本发明的一种或一种以上非天然氨基酸来修饰其中任一个，从而例如改变蛋白质的一种或一种以上所关注的治疗、诊断或酶促性质。治疗上相关的性质的实例包括血清半衰期、保存半衰期、稳定性、免疫原性、治疗活性、可检测性(例如，通过在非天然氨基酸中包括报告基团(例如标记或标记结合位点))、LD50或其它副作用的减少、通过胃道进入身体的能力(例如口服可用性)等。诊断性质的实例包括保存半衰期、稳定性、诊断活性、可检测性等。相关酶促性质的实例包括保存半衰期、稳定性、酶促活性、生产能力等。
也可修饰多种其它蛋白质以使其包括本发明的一个或一个以上非天然氨基酸。举例来说，本发明可包括利用例如以下来源的蛋白质中的非天然氨基酸取代一种或一种以上疫苗蛋白中的一个或一个以上天然氨基酸：感染性真菌，例如曲霉属、念珠菌属；细菌，尤其用作病原菌模型的大肠杆菌以及医学上重要的细菌，诸如葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(aureus))或链球菌(Streptococci)(例如肺炎链球菌(pneumoniae))；原生动物，诸如孢子虫纲(sporozoa)(例如疟原虫属(Plasmodia))、根足虫纲(rhizopods)(例如内阿米巴属(Entamoeba)以及鞭毛虫纲(flagellates)(锥虫属(Trypanosoma)、利什曼原虫属(Leishmania)、毛滴虫属(Trichomonas)、贾第鞭毛虫属(Giardia)等)；病毒，诸如(+)RNA病毒(实例包括痘病毒(Poxviruses)，例如牛痘病毒；微小RNA病毒(Picornaviruses)，例如脊髓灰质炎病毒；外衣病毒(Togaviruses)，例如风疹病毒；黄病毒(Flaviviruses)，例如HCV；以及冠状病毒)、(-)RNA病毒(例如棒状病毒(Rhabdoviruse)，例如VSV；副粘病毒(Paramyxoviruse)，例如RSV；正粘病毒(Orthomyxoviruse)，例如流感病毒；本雅病毒(Bunyaviruse)；以及沙状病毒(Arenaviruse))、dsDNA病毒(例如呼肠孤病毒(Reoviruses))、RNA变为DNA的病毒(即，逆转录病毒)(例如HIV和HTLV)以及某些DNA变为RNA的病毒(诸如乙型肝炎病毒)。
农业相关的蛋白质也是非天然氨基酸修饰的合适标靶，诸如昆虫抗性蛋白(例如Cry蛋白)、淀粉和脂质产生酶、植物和昆虫毒素、毒素抗性蛋白、霉菌毒素解毒蛋白、植物生长酶(例如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，“RUBISCO”)、脂氧合酶(LOX)以及磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶。
本发明还提供在脊椎动物细胞中产生至少一种包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的方法(和由这些方法产生的蛋白质)。举例来说，方法包括：使包含包括至少一个选择密码子且编码蛋白质的核酸的脊椎动物细胞在适当培养基中生长。脊椎动物细胞还包含在细胞中起作用且识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)和优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)，且培养基包含非天然氨基酸。
在一个实施例中，所述方法进一步包括在蛋白质中并入非天然氨基酸，其中非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使蛋白质与包含第二反应性基团的分子(例如染料、例如聚乙二醇衍生物等聚合物、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、第二蛋白质或多肽、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如DNA、RNA等)等)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成使分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(例如在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(例如在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔基部分。
在一个实施例中，O-RS以具有(例如)如SEQIDNO：86或45中所述的氨基酸序列的O-RS的效率的至少50％利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化。在另一实施例中，O-tRNA包含SEQIDNO：65或64或其互补多核苷酸序列，由SEQIDNO：65或64或其互补多核苷酸序列加工而成或由SEQIDNO：65或64或其互补多核苷酸序列编码。在又一实施例中，O-RS包含SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸。
编码蛋白可例如包含治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分。由所述方法产生的蛋白质视情况由非天然氨基酸进一步修饰。举例来说，视情况通过至少一种活体内翻译后修饰来修饰由所述方法产生的蛋白质。
还提供产生筛选或选择转录调节蛋白的方法(和由这些方法产生的筛选或选择转录调节蛋白)。举例来说，方法包括选择第一多核苷酸序列，其中多核苷酸序列编码核酸结合域；和使第一多核苷酸序列突变以包括至少一个选择密码子。这提供筛选或选择多核苷酸序列。所述方法还包括选择第二多核苷酸序列，其中第二多核苷酸序列编码转录激活域；提供包含可操作性连接到第二多核苷酸序列的筛选或选择多核苷酸序列的构筑体；以及在细胞中引入构筑体、非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)以及正交tRNA(O-tRNA)。利用这些组件，O-RS优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化，且O-tRNA识别选择密码子且响应筛选或选择多核苷酸序列中的选择密码子将非天然氨基酸并入核酸结合域中，从而提供筛选或选择转录调节蛋白。
在某些实施例中，本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域的技术人员所熟知且在本文中在“诱变和其它分子生物学技术”下描述的方法使编码所关注的蛋白质或多肽的基因诱变以例如包括一个或一个以上用于并入非天然氨基酸中的选择密码子。举例来说，使所关注的蛋白质的核酸诱变以包括一个或一个以上选择密码子，从而提供插入一个或一个以上非天然氨基酸。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变异体(例如，突变体)型式。类似地，本发明还包括相应核酸，即，任何编码一个或一个以上非天然氨基酸的具有一个或一个以上选择密码子的核酸。
纯化包含非天然氨基酸的重组蛋白
根据所属领域技术人员已知且使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(例如包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体等)部分或实质上纯化成均质。因此，可通过所属领域中熟知的许多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，所述方法例如包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。在制备正确折叠的成熟蛋白质时，必要时可使用蛋白质再折叠步骤。当需要高纯度时，在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适方法。在一个实施例中，使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质)制备的抗体作为纯化试剂，从而例如用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质的基于亲和力的纯化。必要时，在部分纯化或纯化成均质后，视情况将多肽例如用作检定组分、治疗剂或抗体产生的免疫原。
除了本文中所说明的其它参考文献外，所属领域中熟知多种纯化/蛋白质折叠方法，例如包括以下文献中所述的方法：R.Scopes，ProteinPurification.Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，MethodsinEnzymology，第182卷：GuidetoProteinPurification.AcademicPress，Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)BioseparationofProteins.AcademicPress，Inc.；Bollag等人，(1996)ProteinMethods.第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress，NJ；Harris和Angal(1990)ProteinPurificationApplications：APracticalApproachIRLPressatOxford，Oxford，England；Harris和AngalProteinPurificationMethods：APracticalApproachIRLPressatOxford，Oxford，England；Scopes(1993)ProteinPurification：PrinciplesandPractice，第3版，SpringerVerlag，NY；Janson和Ryden(1998)ProteinPurification：Principles.HighResolutionMethodsandApplications.第2版，Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress，NJ；以及其中所引用的参考文献。
在脊椎动物细胞中产生具有非天然氨基酸的所关注的蛋白质或多肽的一个优势在于，蛋白质或多肽通常将以其天然构象经折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员将认识到在合成、表达和/或纯化后，蛋白质可能具有不同于相关多肽所需的构象的构象。在本发明的一方面，视情况使所表达的蛋白质变性，且然后使其复性。这是例如通过向所关注的蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白和/或通过将蛋白质溶解于诸如盐酸胍等离液剂(chaotropicagent)中来实现。
一般来说，有时希望使所表达的多肽变性和还原，且然后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可向所关注的翻译产物中添加胍、脲、DTT、DTE和/或伴侣蛋白。所属领域技术人员熟知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参见以上参考文献，以及Debinski等人，(1993)LBiol.Chem..268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.，4：581-585；以及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。可在例如含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者可使一种或一种以上多肽或其它表达产物流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
抗体
一方面，本发明提供针对本发明的分子，例如合成酶、tRNA以及包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体。本发明的分子的抗体适用作纯化试剂，从而例如用于纯化本发明的分子。另外，抗体可用作指示试剂以指示合成酶、tRNA或包含非天然氨基酸的蛋白质的存在，从而例如追踪分子的存在或位置(例如活体内或原位)。
本发明的抗体可为包含一种或一种以上实质上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε以及μ恒定区基因以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或者λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别界定免疫球蛋白的种类IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包含四聚物。各四聚物包含两对相同的多肽链，各对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。各链的N-末端界定主要负责抗原识别的具有约100到110个或110个以上氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体是以完整免疫球蛋白或通过由各种肽酶消化产生的多个明确表征的片段形式存在。因此，举例来说，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键以下的抗体，从而产生Fab的二聚体F(ab′)2，所述Fab本身为通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab′)2以断开铰链区中的二硫键，从而使F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上为具有铰链区的部分的Fab(关于其它抗体片段的更多详细描述，参见FundamentalImmunology，第4版，W.E.Paul编，RavenPress，N.Y.(1999))。虽然各种抗体片段都是根据完整抗体的消化来定义，但技术人员应了解这些Fab′片段等可以化学方法或利用重组DNA方法重新合成。因此，如本文中所使用的术语抗体还视情况包括通过修饰整个抗体所产生或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段。抗体包括单链抗体，包括其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽连接子)形成连续多肽的单链Fv(sFv或scFv)抗体。本发明的抗体例如可为多克隆片段、单克隆片段、嵌合片段、人类化片段、单链片段、Fab片段、由Fab表达文库产生的片段等。
一般来说，本发明的抗体在多种分子生物或医药过程中作为一般试剂和治疗性试剂都极具价值。可获得产生多克隆和单克隆抗体的方法，且可将其用于产生本发明的抗体。许多基础文章描述标准抗体产生方法，所述文章例如包括Borrebaeck(编)(1995)AntibodyEngineering.第2版FreemanandCompany，NY(Borrebaeck)；McCafferty等人，(1996)AntibodyEngineering.APracticalApproachIRLatOxfordPress，Oxford，England(McCafferty)；和Paul(1995)AntibodyEngineeringProtocolsHumanaPress，Towata，NJ(Paul)；Paul(编)，(1999)FundamentalImmunology.第5版RavenPress，N.Y.；Coligan(1991)CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene，NY；Harlow和Lane(1989)Antibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborPress，NY；Stites等人(编)BasicandClinicalImmunology(第4版)LangeMedicalPublications，LosAltos，CA，和其中所引用的参考文献；Goding(1986)MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice(第2版)AcademicPress，NewYork，NY；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-497。
已研发多种不依赖于例如将抗原注射到动物中的关于抗体制备的重组技术，且可将其用于本发明的情形中。举例来说，有可能在噬菌体或类似载体中产生和选择重组抗体文库。例如参见Winter等人，(1994)MakingAntibodiesbyPhageDisplayTechnologyAnnu.Rev.Immunol.12：433-55和其中回顾的所引用的参考文献。也参见Griffiths和Duncan(1998)StrategiesforselectionofantibodiesbyphagedisplayCurrOpinBiotechnol9：102-8；Hoogenboom等人，(1998)AntibodyphagedisplaytechnologyanditsapplicationsImmunotechnology4：1-20；Gram等人，(1992)invitroselectionandaffinitymaturationofantibodiesfromanaivecombinatorialimmunoglobulinlibraryPNAS89：3576-3580；Huse等人，(1989)Science246：1275-1281；和Ward等人，(1989)Nature341：544-546。
在一个实施例中，抗体文库可包括经克隆以在丝状噬菌体表面上显示相关的重链和轻链可变域的V基因的谱系(例如从大量淋巴细胞收集或在活体外组装)。通过与抗原结合来选择噬菌体。可溶性抗体是由感染噬菌体的细菌表达且可例如借助于诱变来改进抗体。例如参见Balint和Larrick(1993)AntibodyEngineeringbyParsimoniousMutagenesisGene137：109-118；Stemmer等人，(1993)SelectionofanActiveSingleChainFvAntibodyFromaProteinLinkerLibraryPreparedbyEnzymaticInversePCRBiotechniques14(2)：256-65；Cramer等人，(1996)Constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbyDNAshufflingNatureMedicine2：100-103；以及Crameri和Stemmer(1995)CombinatorialmultiplecassettemutagenesiscreatesallthepermutationsofmutantandwildtypecassettesBioTechniques18：194-195。
也已知且利用克隆和表达重组抗体噬菌体系统的试剂盒，例如来自Amersham-PharmaciaBiotechnology(Uppsala，Sweden)的“重组噬菌体抗体系统小鼠ScFv组件”。也已产生噬菌体抗体文库以通过链改组来制备高亲和力人类抗体(例如参见Marks等人，(1992)By-PassingImmunization：BuildingHighAffinityHumanAntibodiesbyChainShufflingBiotechniques10：779-782)。也应认识到，可通过多种商务服务中的任一种(例如BethylLaboratories(MontgomeryTX)、Anawa(Switzerland)、Eurogentec(Belgium和美国的Philadelphia，PA等)等)来制备抗体。
在某些实施例中，例如当治疗性给予本发明的抗体时，适用于使所述抗体“人类化”。使用人类化抗体倾向于减少针对治疗性抗体的不合需要的免疫反应的发生率(例如当患者为人类时)。上述抗体参考文献描述人类化策略。除人类化抗体外，人类抗体也是本发明的特征。人类抗体是由特征性人类免疫球蛋白序列组成。人类抗体可使用多种方法产生(关于综述，例如参见Larrick等人的美国专利第5,001,065号)。通过三源杂交瘤(trioma)技术产生人类抗体的一般方法是由Ostberg等人，(1983)，Hybridoma2：361-367；Ostberg，美国专利第4,634,664号；以及Engelman等人，美国专利第4,634,666号描述。
已知多种使用抗体来纯化和检测蛋白质的方法，且可将其用于检测和纯化如本文中所说明的包含非天然氨基酸的蛋白质。一般来说，抗体为ELISA、Western印迹法、免疫化学、亲和色谱法、SPR以及许多其它方法的适用试剂。以上所说明的参考文献提供关于如何进行ELISA检定、Western印迹、表面等离子体共振(SPR)等的细节。
在本发明的一方面，本发明的抗体本身包括非天然氨基酸，从而提供具有所关注的性质(例如改进的半衰期、稳定性、毒性等)的抗体。也参见本文中标题为“具有非天然氨基酸的多肽”的部分。抗体占目前临床试验中的所有化合物的几乎50％(Wittrup，(1999)PhageondisplayTibtech17：423-424)且普遍使用抗体作为诊断试剂。因此，利用非天然氨基酸修饰抗体的能力提供修饰这些有价值的试剂的重要工具。
举例来说，MAb在诊断学领域中存在多种应用。检定范围从简单的斑点测试(spottest)到较为复杂的方法，诸如来自DuPontMerckCo.的用于肿瘤成像的放射性标记NR-LU-10MAb(Rusch等人，(1993)NR-LU-10monoclonalantibodyscanning.Ahelpfulnewadjuncttocomputedtomographyinevaluatingnon-small-celllungcancer.JThoracCardiovascSure106：200-4)。如所说明，MAb是ELISA、Western印迹法、免疫化学、亲和色谱法等的重要试剂。任何这种诊断抗体都可经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸，从而例如改变Ab对标靶的特异性或亲和力，或例如通过在非天然氨基酸中包括可检测标记(例如光谱、荧光、发光等)来改变一种或一种以上可检测性质。
一类有价值的抗体试剂为治疗性Ab。举例来说，抗体可为通过靶向肿瘤细胞以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞溶解(CML)破坏来阻滞肿瘤生长的肿瘤特异性MAb(Ab的这些一般类型有时称为“魔弹(magicbullet)”)。一个实例为美罗华(Rituxan)，一种治疗非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkinslymphoma)的抗-CD20MAb(Scott(1998)Rituximab：anewtherapeuticmonoclonalantibodyfornon-Hodgkin′slymphomaCancerPract6：195-7)。第二实例涉及干扰肿瘤生长的关键组分的抗体。赫赛汀是治疗转移性乳癌的抗HER-2单克隆抗体且提供具有这种作用机制的抗体的实例(Baselga等人，(1998)Recombinanthumanizedanti-HER2antibody(Herceptin)enhancestheantitumoractivityofpaclitaxelanddoxorubicinagainstHER2/neuoverexpressinghumanbreastcancerxenografts[公布的勘误表登载在CancerRes(1999)59(8)：2020中]，CancerRes58：2825-31)。第三个实例涉及将细胞毒性化合物(毒素、放射性核素等)直接传递到肿瘤或其它所关注的位点的抗体。举例来说，一种应用Mab是CYT-356，一种将辐射直接靶向前列腺肿瘤细胞的90Y连接的抗体(Deb等人，(1996)Treatmentofhormone-refractoryprostatecancerwith90Y-CYT-356monoclonalantibodyClinCancerRes2：1289-97)。第四种应用是抗体导向的酶前药疗法(antibody-directedenzymeprodrugtherapy)，其中与肿瘤共存的酶激活肿瘤附近的全身给予的前药。举例来说，正研发用于治疗结肠直肠癌的与羧基肽酶A连接的抗Ep-CAM1抗体(Wolfe等人，(1999)Antibody-directedenzymeprodrugtherapywiththeT268GmutantofhumancarboxypeptidaseA1：invitroandinvivostudieswithprodrugsofmethotrexateandthethymidylatesynthaseinhibitorsGW1031andGW1843BioconiugChem10：38-48)。其它Ab(例如拮抗剂)经设计以特异性抑制正常细胞功能，从而实现治疗益处。一个实例为OrthocloneOKT3，一种由强生公司(JohnsonandJohnson)提供的用于减少急性器官移植排斥的抗CD3MAb(Strate等人，(1990)OrthocloneOKT3asfirst-linetherapyinacuterenalallograftrejectionTransplantProc22：219-20。另一类抗体产物是激动剂。这些Mab经设计以特异性增加正常细胞功能，从而实现治疗益处。举例来说，正研发用于神经病疗法的乙酰胆碱受体的基于Mab的激动剂(Xie等人，(1997)DirectdemonstrationofMuSKinvolvementinacetylcholinereceptorclusteringthroughidentificationofagonistScFvNat.Biotechnol.15：768-71。这些抗体中的任一种都可经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸，从而增加一种或一种以上治疗性质(特异性、亲和力、血清半衰期等)。
另一类抗体产物提供新颖功能。这一组中的主要抗体是经工程化以模拟酶的催化能力的催化抗体，诸如Ig序列(Wentworth和Janda(1998)CatalyticantibodiesCurrOpinChemBiol2：138-44)。举例来说，一种引人关注的应用涉及使用用于成瘾疗法的活体内水解可卡因(cocaine)的催化抗体mAb-15A10(Mets等人，(1998)Acatalyticantibodyagainstcocainepreventscocaine′sreinforcingandtoxiceffectsinratsProcNatlAcadSciUSA95：10176-81)。催化抗体也可经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸，从而改进所关注的一种或一种以上性质。
通过免疫反应性定义多肽
因为本发明的多肽提供多种新颖的多肽序列(例如，在本文中的翻译系统中合成的蛋白质的情况下包含非天然氨基酸；或例如在本文中的新颖合成酶的情况下，包含标准氨基酸的新颖序列)，所以多肽还提供可例如在免疫学检定中识别的新颖结构特征。特异性结合本发明多肽的抗体或抗血清的产生以及这些抗体或抗血清所结合的多肽都是本发明的特征。
举例来说，本发明包括合成酶蛋白质，其特异性结合针对包含选自(SEQIDNO：36-63和/或86)中一个或一个以上序列的氨基酸序列的免疫原所产生的抗体或抗血清或与所述抗体或抗血清特异性免疫反应。为消除与其它同源物的交叉反应性，利用诸如野生型大肠杆菌酪氨酰基合成酶(TyrRS)(例如SEQIDNO：2)等可利用的对照合成酶同源物来消减抗体或抗血清。
在一种典型格式中，免疫检定使用针对一种或一种以上包含一个或一个以上对应于SEQIDNO：36-63和/或86中一个或一个以上的序列或其实质性子序列(即，所提供的全长序列的至少约30％)的多肽培养的多克隆抗血清。源自SEQIDNO：36-63和86的潜在多肽免疫原组在下文中总称为“免疫原性多肽”。视情况选择所得抗血清以针对对照合成酶同源物具有低交叉反应性，且在免疫检定中使用多克隆抗血清之前，例如通过用一种或一种以上对照合成酶同源物进行免疫吸附来去除任何这种的交叉反应性。
为产生用于免疫检定的抗血清，如本文中所述产生和纯化一种或一种以上免疫原性多肽。举例来说，可在重组细胞中产生重组蛋白。利用免疫原性蛋白以及标准佐剂(诸如弗氏佐剂(Freund′sadjuvant))和标准小鼠免疫方案(关于抗体产生、可用于确定特异性免疫反应性的免疫检定格式和条件的标准说明，例如参见Harlow和Lane(1988)Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork。本文中也可见抗体的其它参考文献和论述，且可将其用于此处以产生通过免疫反应性来定义/检测多肽的抗体)，使小鼠的近交品系(因为结果因小鼠的实际遗传一致性而更可重复，所以用于这一检定中)免疫。或者，可将一种或一种以上源自本文中所公开的序列的合成或重组多肽与载体蛋白连接并用作免疫原。
收集多克隆血清并且在免疫检定，例如，利用一种或一种以上在固体支撑物上固定的免疫原性蛋白的固相免疫检定中，针对免疫原性多肽进行滴定。选择效价为106或106以上的多克隆抗血清，汇集并利用对照合成酶多肽进行消减，以产生消减的经汇集的经滴定多克隆抗血清。
在比较免疫检定中，测试消减的经汇集的经滴定多克隆抗血清针对对照同源物的交叉反应性。在这一比较检定中，确定用于消减的经滴定多克隆抗血清的差别结合条件，这使得经滴定多克隆抗血清与免疫原性合成酶的结合的信噪比与经滴定多克隆抗血清与对照合成酶的结合相比高至少约5-10倍。也就是说，通过添加诸如白蛋白或脱脂奶粉等非特异性竞争剂和/或通过调节盐条件、温度等来调节结合/洗涤反应的严格度。后续检定中使用这些结合/洗涤条件来确定测试多肽(与免疫原性多肽和/或对照多肽相比的多肽)是否与所汇集的经消减的多克隆抗血清特异性结合。具体说来，在区别结合条件下显示信噪比比对照合成酶同源物高至少2-5倍且与免疫原性多肽相比显示至少约1/2信噪比的测试多肽与已知合成酶相比与免疫原性多肽共享实质性结构相似性，且因此，所述测试多肽为本发明的多肽。
在另一实例中，将竞争性结合格式的免疫检定用于检测测试多肽。举例来说，如所说明，通过利用对照多肽的免疫吸附从汇集的抗血清混合物中去除交叉反应性抗体。然后，使免疫原性多肽固定于暴露于消减的经汇集的抗血清的固体支撑物上。向检定中添加测试蛋白质以竞争与汇集的经消减抗血清结合。将与固定蛋白质相比，测试蛋白质竞争与所汇集的经消减抗血清结合的能力与添加到所述检定中的免疫原性多肽竞争结合的能力(所述免疫原性多肽有效地与固定的免疫原性多肽竞争与所汇集的抗血清结合)相比较。使用标准计算法计算测试蛋白质的交叉反应性百分比。
在平行检定中，视情况与免疫原性多肽竞争与抗血清结合的能力相比较，确定对照蛋白质竞争与汇集的经消减抗血清结合的能力。同样使用标准计算法计算对照多肽的交叉反应性百分比。当测试多肽的交叉反应性百分比与对照多肽相比高至少5-10倍时，和/或当测试多肽的结合大致在免疫原性多肽的结合范围内时，认为测试多肽特异性结合汇集的经消减抗血清。
一般来说，在如本文中所述的竞争性结合免疫检定中可使用经免疫吸附且汇集的抗血清来比较任何测试多肽与免疫原性和/或对照多肽。为进行这一比较，分别检定多种浓度的免疫原性、测试以及对照多肽且使用标准技术来确定抑制经消减抗血清与例如经固定对照、测试或免疫原性蛋白的结合的50％所需的各多肽的量。如果竞争检定中结合所需的测试多肽的量比所需的免疫原性多肽的量少两倍，那么只要所述量为对照多肽的量的至少约5-10倍高，就认为测试多肽特异性结合针对免疫原性蛋白所产生的抗体。
作为特异性的另一测定，视情况利用免疫原性多肽(而不是对照多肽)完全免疫吸附汇集的抗血清，直到可检测到极少所得免疫原性多肽-汇集的经消减抗血清与免疫吸附中所使用的免疫原性多肽的结合或无法检测到结合。然后，测试所述完全免疫吸附的抗血清与测试多肽的反应性。如果几乎未观察到反应性(即，不超过关于完全免疫吸附的抗血清与免疫原性多肽的结合所观察到的信噪比的2倍)，那么测试多肽与免疫原性蛋白引发的抗血清特异性结合。
医药组合物
将本发明的多肽或蛋白质(例如合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况例如与合适的医药载剂组合用于治疗用途中。这些组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。进行调配以适合给药模式。一般来说，所属领域中熟知给予蛋白质的方法，且可将其用于给予本发明的多肽。
根据所属领域中熟知的方法，视情况在疾病的一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物，从而证实功效、组织代谢并估算剂量。具体说来，最初可通过本文中非天然氨基酸同源物相对于天然氨基酸同源物(例如，比较经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的EPO与天然氨基酸EPO)的活性、稳定性或其它合适的量度(即，在相关检定中)来确定剂量。
给药是通过通常用于引导分子与血液或组织细胞紧密接触的任何途径来进行。本发明的非天然氨基酸多肽视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适的方式给予。可利用在本发明的情况下向患者给予所述多肽的合适方法，且虽然可使用一种以上途径来给予特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径更快捷且更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂是由所给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法部分地决定。因此，存在多种本发明的医药组合物的合适调配物。
多肽组合物可通过许多途径给予，所述途径包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。非天然氨基酸多肽组合物也可借助于脂质体给予。所属领域技术人员通常已知所述给药途径和适当的调配物。
非天然氨基酸多肽也可单独或与其它合适组分组合制成欲经由吸入给予的气溶胶调配物(即，其可“成喷雾状”)。气溶胶调配物可放置在加压的可接受推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
适于不经肠给药(诸如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使调配物与预期接受者的血液等张的溶质的水性和非水性等张无菌注射液和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可在诸如安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量密封容器中提供经包装核酸的调配物。
不经肠给药和静脉内给药是优选的给药方法。具体说来，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的给药途径(例如，通常用于EPO、GCSF、GMCSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学上传递的蛋白质的给药途径)和目前使用的调配物提供包括本发明的非天然氨基酸的蛋白质(例如，目前的治疗蛋白的聚乙二醇化变异体等)的优选给药途径和调配物。
在本发明的情况下，视应用而定，向患者给予的剂量足以随时间在患者体内实现有益的治疗反应，或例如抑制病原体感染或其它适当活性。通过特定组合物/调配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期以及患者的状况以及欲治疗的患者的体重或表面积来确定剂量。剂量的大小也通过特定患者中给予特定组合物/调配物所伴随的任何不利副作用的存在、性质以及程度等来确定。
在确定治疗或预防疾病(例如癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)时欲给予的组合物/调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病的进展和/或相关情形下抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
向例如70公斤患者给予的剂量通常在与针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变所调整的目前使用的治疗蛋白的剂量等效的范围内。本发明的组合物/调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，所述常规疗法包括给予抗体、给予疫苗、给予细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。
就给药来说，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50和/或(例如)当应用于患者的质量和总体健康状况时对各种浓度下的非天然氨基酸的任何副作用的观察结果所确定的速率给予。给药可借助于单次剂量或分次给药实现。
如果经历调配物输注的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。在将进行输注之前30分钟，对经历输注反应(诸如发烧、肌肉疼痛和寒战)的患者预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或例如苯海拉明(diphenhydramine)。将哌替啶(Meperidine)用于更为严重的不能快速响应解热剂和抗组胺剂的寒战和肌肉疼痛。治疗视反应的严重程度而减缓或中止。
核酸和多肽序列及变异体
如上文和下文中所述，本发明提供核酸多核苷酸序列和多肽氨基酸序列(例如O-tRNA和O-RS)以及例如包含所述序列的组合物和方法。本文中公开例如O-tRNA和O-RS的所述序列的实例(参见表5，例如SEQIDNO.3-65、86，且SEQIDNO：1和2除外)。然而，所属领域的技术人员应了解，本发明不受本文中所公开的序列(例如实例和表5)限制。所属领域的技术人员应了解，本发明也提供许多具有本文中所述的功能(例如编码O-tRNA或O-RS)的相关和甚至无关的序列。
本发明也提供多肽(O-RS)和多核苷酸，例如O-tRNA、编码O-RS或其部分(例如合成酶的活性位点)的多核苷酸、用于构筑氨酰基tRNA合成酶突变体的寡核苷酸等。举例来说，发明的多肽包括：包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列的多肽；包含由如SEQIDNO：3-35中任一序列所述的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽；以及与对包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列所示的氨基酸序列的多肽或包含由如SEQIDNO：3-35中任一序列所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽具有特异性的抗体特异性免疫反应的多肽。
本发明的多肽也包括包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列(例如SEQIDNO：2)至少90％一致且包含两个或两个以上来自群组A-E的氨基酸的氨基酸序列的多肽。举例来说，群组A包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Tyr37的位置处的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸；群组B包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asn126的位置处的天冬氨酸；群组C包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Asp182的位置处的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；群组D包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Phe183的位置处的蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸；且群组E包括在对应于大肠杆菌TyrRS的Leu186的位置处的丝氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或丙氨酸。类似地，本发明的多肽还包括包含SEQIDNO：36-63和/或86的至少20个相邻氨基酸和两个或两个以上如上文所指示的氨基酸取代的多肽。也包括包含任一上述多肽的保守变异体的氨基酸序列作为本发明的多肽。
在一个实施例中，组合物包括本发明的多肽和赋形剂(例如缓冲剂、水、医药学上可接受的赋形剂等)。本发明也提供与本发明的多肽特异性免疫反应的抗体或抗血清。
本发明中也提供多核苷酸。本发明的多核苷酸包括编码本发明的所关注的蛋白质或多肽或包括一个或一个以上选择密码子或两者的多核苷酸。举例来说，本发明的多核苷酸例如包括：包含如SEQIDNO：3-35、64-85中任一序列所述的核苷酸序列的多核苷酸；与其多核苷酸序列互补或编码其多核苷酸序列的多核苷酸；和/或编码包含如SEQIDNO：36-63和/或86中任一序列中所述的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或其保守变异体。本发明的多核苷酸也包括编码本发明的多肽的多核苷酸。类似地，在核酸的实质上整个长度范围内在高度严格条件下与上文所指示的多核苷酸杂交的核酸为本发明的多核苷酸。
本发明的多核苷酸也包括编码包含与天然存在的酪氨酰基氨酰基tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列(例如SEQIDNO：2)至少90％一致且包含两个或两个以上如以上段落11中在群组A-E中所指示的突变的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸中还包括与以上所指示的多核苷酸至少70％(或至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或99％以上)一致的多核苷酸，和/或包含以上所指示的任何多核苷酸的保守变异体的多核苷酸。
在某些实施例中，载体(例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等)包含本发明的多核苷酸。在一个实施例中，载体为表达载体。在另一实施例中，表达载体包括可操作性连接到本发明的一个或一个以上多核苷酸的启动子。在另一实施例中，细胞包含包括本发明的多核苷酸的载体。
技术人员应了解，所公开的序列的许多变异体都包括在本发明中。举例来说，产生功能相同的序列的所公开序列的保守变异体包括在本发明中。认为核酸多核苷酸序列的变异体包括在本发明内，其中所述变异体与至少一个所公开的序列杂交。如通过例如标准序列比较技术所确定的本文中所公开的序列的独特子序列也包括在本发明中。
保守变异体
由于遗传密码的简并性，所以“沉默取代”(即，不会在编码多肽中产生改变的核酸序列中的取代)是编码氨基酸的每个核酸序列的暗含特征。类似地，“保守氨基酸取代”(即，氨基酸序列中一个或一个以上氨基酸经具有极其类似性质的不同氨基酸取代)也易于鉴别为与所公开的构筑体高度相似。各公开序列的所述保守变异体是本发明的特征。
特定核酸序列的“保守变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。所属领域技术人员应认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异”，其中所述改变将导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化学上类似的氨基酸对氨基酸的取代。因此，本发明所列出的多肽序列的“保守变异”包括用具有相同保守性取代基团的保守性选择的氨基酸取代多肽序列的少量、通常少于5％、更通常少于2％或1％的氨基酸。最后，不改变核酸分子的编码活性的序列的添加(诸如，非功能性序列的添加)为基本核酸的保守变异。
所属领域中熟知提供功能类似的氨基酸的保守性取代表。下表陈述含有包括彼此互为“保守性取代”的天然氨基酸的例示性基团。
保守性取代基团
1 丙氨酸(A) 丝氨酸(S) 苏氨酸(T)
2 天冬氨酸(D) 谷氨酸(E)
3 天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)
4 精氨酸(R) 赖氨酸(K)
5 异亮氨酸(I) 亮氨酸(L) 蛋氨酸(M) 缬氨酸(V)
6 苯丙氨酸(F) 酪氨酸(Y) 色氨酸(W)
核酸杂交
可使用比较杂交来鉴别本发明的核酸，包括本发明的核酸的保守变异体，且这种比较杂交方法是区分本发明的核酸的优选方法。另外，在高、超高和极高严格条件下与由SEQIDNO：3-35、64-85表示的核酸杂交的标靶核酸是本发明的特征。所述核酸的实例包括与给定核酸序列相比具有一个或一个以上沉默或保守性核酸取代的核酸。
当测试核酸以与最佳匹配的互补标靶杂交的至少1/2水平与探针杂交时，即，以高达探针与标靶在一定条件下(其中最佳匹配的探针以关于与任何不匹配标靶核酸杂交所观察到的信噪比的至少约5-10倍高的信噪比与最佳匹配的互补标靶结合)杂交的信噪比的至少1/2信噪比杂交时，认为所述测试核酸与探针核酸特异性杂交。
当核酸缔合时，其通常在溶液中“杂交”。核酸因多种明确表征的物理化学力而杂交，所述力诸如氢键、溶剂排阻、碱基堆积等。核酸杂交的详细指南可见于Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes第I部分第2章，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays，”(Elsevier，NewYork)以及Ausubel，同上文中。Hames和Higgins(1995)GeneProbes1IRLPressatOxfordUniversityPress，Oxford，England，(Hames和Higgins1)以及Hames和Higgins(1995)GeneProbes2IRLPressatOxfordUniversityPress，Oxford，England(Hames和Higgins2)提供关于包括寡核苷酸的DNA和RNA的合成、标记、检测以及定量的细节。
在Southern或Northern印迹法中在过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的实例为在42℃下，50％福尔马林(formalin)和1mg肝素，其中杂交进行整夜。严格洗涤条件的实例为0.2×SSC洗涤，在65℃下，15分钟(关于SSC缓冲剂的描述，参见Sambrook，同上文)。通常，在高严格度洗涤后为低严格度洗涤，以去除背景探针信号。例示性低严格度洗涤为2×SSC，在40℃下，15分钟。比特定杂交检定中关于不相关探针所观察到的信噪比高5倍(或更高)的信噪比通常指示检测到特异性杂交。
在诸如Southern和Northern杂交等核酸杂交实验的情况下，“严格杂交洗涤条件”具有序列依赖性且在不同环境参数下不同。核酸杂交的全面指南可见于Tijssen(1993)，同上文以及Hames和Higgins，1和2中。任何测试核酸的严格杂交和洗涤条件都可凭经验容易地确定。举例来说，在确定高度严格杂交和洗涤条件的过程中，使杂交和洗涤条件逐渐增加(例如，通过增加温度、降低盐浓度、增加洗涤剂浓度和/或增加杂交或洗涤中诸如福尔马林等有机溶剂的浓度)，直到符合一组选定的标准。举例来说，使杂交和洗涤条件逐步增加，直到探针与最佳匹配的互补标靶以高达探针与不匹配标靶杂交所观察到的信噪比的至少5倍的信噪比结合。
选择“极严格”条件以与特定探针的热熔点(Tm)等效。Tm是50％的测试序列与最佳匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH值下)。出于本发明的目的，通常选择“高度严格”杂交和洗涤条件比规定的离子强度和pH值下特定序列的Tm低约5℃。
“超高严格度”杂交和洗涤条件是增加杂交和洗涤条件的严格度，直到探针与最佳匹配的互补标靶核酸结合的信噪比高达探针与任何不匹配的标靶核酸杂交所观察到的信噪比的至少10倍的条件。认为在所述条件下以最佳匹配的互补标靶核酸的信噪比的至少1/2的信噪比与探针杂交的标靶核酸在超高严格条件下与探针结合。
类似地，可通过逐步增加相关杂交检定的杂交和/或洗涤条件来确定甚至更高的严格水平。举例来说，增加杂交和洗涤条件的严格度，直到探针与最佳匹配的互补标靶核酸结合的信噪比高达探针与任何不匹配的标靶核酸杂交所观察到的信噪比的至少10倍、20倍、50倍、100倍或500倍或500倍以上的条件。认为在所述条件下以最佳匹配的互补标靶核酸的信噪比的至少1/2的信噪比与探针杂交的标靶核酸在极高严格条件下与探针结合。
如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上一致，那么所述核酸也实质上一致。例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸复本时，出现这种情形。
独特子序列
一方面，本发明提供包含选自本文中所公开的O-tRNA和O-RS的序列的核酸中的独特子序列的核酸。独特子序列与对应于任何已知的O-tRNA或O-RS核酸序列的核酸相比具有独特性。可使用例如设定为默认参数的BLAST进行比对。任何独特的子序列例如都适合用作鉴别本发明核酸的探针。
类似地，本发明包括包含选自本文中所公开的O-RS的序列的多肽中的独特子序列的多肽。此处，独特子序列与对应于任何已知的多肽序列的多肽相比具有独特性。
本发明也提供在严格条件下与编码选自O-RS的序列的多肽中的独特子序列的独特编码寡核苷酸杂交的标靶核酸，其中独特子序列与对应于任何对照多肽(例如，例如通过突变得到本发明的合成酶的亲本序列)的多肽相比具有独特性。独特序列是如上文所述确定。
序列比较、一致性以及同源性
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性”百分比是指当比较和比对最大对应性时，如使用下文所述的序列比较算法中的一种(或所属领域技术人员可用的其它算法)或通过目测所测量，相同或具有特定的相同氨基酸残基或核苷酸百分比的两个或两个以上序列或子序列。
在两个核酸或多肽(例如，编码O-tRNA或O-RS的DNA或O-RS的氨基酸序列)的情况下，短语“实质上一致”是指当比较和比对最大对应性时，如使用序列比较算法或通过目测所测量，具有至少约60％、优选80％、最优选90-95％的核苷酸或氨基酸残基一致性的两个或两个以上序列或子序列。在不提及实际祖先的情况下，通常认为所述“实质上一致”的序列是“同源”的。“实质一致性”优选存在于长度为至少约50个残基的序列的区内，更优选至少约100个残基的区内，且最优选，所述序列在至少约150个残基内或在欲比较的两个序列的全长内实质上一致。
为进行序列比较和同源性测定，通常使一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
可例如通过Smith和Waterman，Adv.AppI.Math.2：482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过搜索Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似方法，通过这些算法(WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)的计算机实施或通过目测检查(通常参见Ausubel等人，同下文)来进行用于比较的序列的最佳比对。
适于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一个实例为BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。执行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。所述算法涉及首先通过鉴别询问序列中长度W的短字来鉴别高得分的序列对(highscoringsequencepair，HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述HSP匹配或满足一些正值临界得分T。T是指邻近字的临界分值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上)。这些初始邻近字匹配(wordhit)充当起始搜索以发现含有其的较长HSP的种子。然后，使字匹配沿各序列的两个方向延伸直到可增加累积比对的分值。对核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基的奖励分值；通常＞0)和N(错配残基的处罚分值，通常＜0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用得分矩阵计算累积分值。当累积比对分值比其所达到的最大值低数量X；累积分值因一个或一个以上负得分残基比对的积累而为零或更低值；或到达各序列的末端时，在各个方向上的字匹配延伸停止。BLAST算法参数W、T和X将决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(expectation，E)为10、截止值为100、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)作为默认值。
除计算序列一致性百分比外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见Karlin和Altschul，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(smallestsumprobability，P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。
诱变和其它分子生物学技术
描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques.MethodsinEnzymology第152卷AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)第1-3卷.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork，1989(″Sambrook″)以及CurrentProtocolsinMolecularBiology.F.M.Ausubel等人编，CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates，Inc.与JohnWiley&Sons，Inc.合资(1999增刊)(″Ausubel″)。这些文章描述诱变、载体的使用、质粒和λ噬菌体的DNA产生、启动子以及许多其它相关主题，所述相关主题涉及例如包括产生包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因的产生。
本发明中使用各种类型的诱变，从而例如产生tRNA文库、产生合成酶文库、在所关注的蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。其包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构筑、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用缺口双螺旋DNA的诱变等，或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主品系的诱变、限制选择和限制纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。举例来说，涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明内。在一个实施例中，可通过天然存在的分子或已改变或突变的天然存在的分子的已知信息(例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等)指导诱变。
上述文章和本文中可见的实例描述这些程序。其它信息可见于下列公开文献和其中所引用的参考文献中：Ling等人，ApproachestoDNAmutagenesis：anoverview，AnalBiochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod，MethodsMol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，Invitromutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis，Science229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directedmutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis，inNucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J编，SpringerVerlag，Berlin))(1987)；Kunkel，Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection，MethodsinEnzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，MutantTrprepressorswithnewDNA-bindingspecificities，Science242：240-245(1988)；MethodsinEnzymol.100：468-500(1983)；MethodsinEnzymol.154：329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesisusingM13-derivedvectors：anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment，NucleicAcidsRes.10：6487-6500(1982)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors，MethodsinEnzymol.100：468-500(1983)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis：asimplemethodusingtwooligonucleotideprimersandasingle-strandedDNAtemplate，MethodsinEnzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，Theuseofphosphorothioate-modifiedDNAinrestrictionenzymereactionstopreparenickedDNA，Nucl.AcidsRes.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphosphorothioate-modifiedDNA，Nucl.AcidsRes.13：8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，InhibitionofrestrictionendonucleaseNciIcleavagebyphosphorothioategroupsanditsapplicationtooligonucleotide-directedmutagenesis，Nucl.AcidsRes.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，Y-TExonucleasesinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis，Nucl.AcidsRes.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strandspecificcleavageofphosphorothioate-containingDNAbyreactionwithrestrictionendonucleasesinthepresenceofethidiumbromide，(1988)Nucl.AcidsRes.16：803-814；Kramer等人，ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedmutationconstruction，Nucl.AcidsRes.12：9441-9456(1984)；Kramer和FritzOligonucleotide-directedconstructionofmutationsviagappedduplexDNA，MethodsinEnzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，ImprovedenzymaticinvitroreactionsinthegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedconstructionofmutations，Nucl.AcidsRes.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directedconstructionofmutations：agappedduplexDNAprocedurewithoutenzymaticreactionsinvitro，Nucl.AcidsRes.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，PointMismatchRepair，Cell38：879-887(1984)；Carter等人，Improvedoligonucleotidesite-directedmutagenesisusingMISvectors，Nucl.AcidsRes.13：4431-4443(1985)；Carter，Improvedoligonucleotide-directedmutagenesisusingM13vectors，MethodsinEnzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Useofoligonucleotidestogeneratelargedeletions，Nucl.AcidsRes.14：5115(1986)；Wells等人，Importanceofhydrogen-bondformationinstabilizingthetransitionstateofsubtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423(1986)；Nambiar等人，TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein，Science223：1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana，Totalsynthesisandexpressionofageneforthea-subunitofbovinerodoutersegmentguaninenucleotide-bindingprotein(transducin)，Nucl.AcidsRes.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassettemutagenesis：anefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites，Gene34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directedmutagenesisbymicroscale′shot-gun′genesynthesis，Nucl.AcidsRes.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directeddouble-strandbreakrepairinplasmidsofEscherichiacoli：amethodforsite-specificmutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：7177-7181(1986)；Arnold，Proteinengineeringforunusualenvironments，CurrentOpinioninBiotechnology4：450-455(1993)；Sieber等人，NatureBiotechnology，19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，NucleicAcidsRes.23，3067-8(1995)。关于许多上述方法的其它细节可见于MethodsinEnzymology第154卷中，所述文献还描述各种诱变方法对故障查找问题的有效控制。
本发明也涉及借助于正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的脊椎动物宿主细胞和生物体。利用本发明的多核苷酸或包括本发明的多核苷酸的构筑体(例如本发明载体，其可例如为克隆载体或表达载体)使宿主细胞遗传工程化(例如转化、转导或转染)。例如，载体可呈质粒、细菌、病毒、裸多核苷酸或结合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物，所述标准方法包括电穿孔(From等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，5824(1985))、通过病毒载体感染、由具有核酸的小粒子在小珠粒或粒子的基质内或表面上高速弹道渗透(Klein等人，Nature327，70-73(1987))。
可在经改良适用于诸如筛选步骤、激活启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程化的宿主细胞。视情况，可将这些细胞培养到转基因有机体中。关于例如细胞分离和培养(例如用于后续的核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)CultureofAnimalCells，aManualofBasicTechnique，第3版，Wiley-Liss，NewYork和其中所引用的参考文献；Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons，Inc.NewYork，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell，TissueandOrganCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual，Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)以及Atlas和Parks(编)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress，BocaRaton，FL。
本发明还涉及具有通过正交tRNA/RS对的并入一个或一个以上非天然氨基酸的能力的脊椎动物细胞系。可使用所属领域中已知的细胞培养技术在已经本发明的多核苷酸或包括本发明的多核苷酸的构筑体转化、转导或转染的宿主细胞上建立这些细胞系。将外源核酸引入宿主细胞中的方法已为所属领域中熟知且将随所使用的宿主细胞而变化。技术包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、脂质体中多核苷酸的囊封以及定向微注射。
可以允许瞬时或稳定并入DNA的方式转化或转染细胞。对于重组蛋白的长期、高产率产生来说，优选稳定表达。举例来说，可使稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。除使用含有病毒复制起点的表达载体外，可用通过适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点等)控制的DNA和可选择标记转化宿主细胞。在引入外来DNA后，可使经工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，且然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性，并且使细胞能将质粒稳定整合到其染色体组中并生长，从而形成细胞群，又可对其进行克隆并扩充成细胞系。可有利地使用所述方法来工程化表达抗体分子的细胞系。所述经工程化的细胞系尤其适用于筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。另外，诸如一些病毒介导的载体转染技术等所属领域技术人员熟知的其它技术可允许瞬时转染细胞。
可使用将标靶核酸引入细胞中的数种熟知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括：接受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectilebombardment)和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参见Sambrook)。另外，可购得试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参见都来自PharmaciaBiotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；以及来自Qiagen的QIAprepTM)。然后，进一步操纵经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，将其用于转染细胞或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定标靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(例如，穿梭载体(shuttlevector))以及用于原核系统与脊椎动物系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参见Gillam和Smith，Gene8：81(1979)；Roberts等人，Nature.328：731(1987)；Schneider，B.等人，ProteinExpr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(都同上文)。举例来说，ATCC(例如，由ATCC出版的TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage(1992)Gherna等人(编))提供可用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人，(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks，NY。另外，基本上任何核酸(和几乎任何标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland，TX，mcrc.com)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona，CA，可在万维网的genco.com上获得)、ExpressGenInc.(Chicago，IL，可在万维网的expressgen.com上获得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda，CA)和许多其它来源。
试剂盒
试剂盒也是本发明的特征。举例来说，提供在细胞中产生包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有编码O-tRNA的多核苷酸序列和/或O-tRNA和/或编码O-RS的多核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一个实施例中，试剂盒另外包括至少一个非天然氨基酸。在另一实施例中，试剂盒另外包含用于产生蛋白质的说明材料。
实例
提供以下实例来说明而非限制所主张的本发明。所属领域技术人员将认识到，在不脱离所主张的本发明的范围的情况下，可改变多个不重要的参数。
实例1：产生在脊椎动物细胞中并入非天然氨基酸的氨酰基tRNA合成酶的方法和所述氨酰基tRNA合成酶的组合物
扩充脊椎动物遗传密码以包括具有新颖物理、化学或生物性质的非天然氨基酸，将提供用于分析和控制这些细胞中的蛋白质功能的有效工具。为此，描述用于分离氨酰基tRNA合成酶的一般方法，所述氨酰基tRNA合成酶响应酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)中的琥珀密码子以高保真性并入非天然氨基酸。所述方法是建立在通过抑制GAL4的DNA结合域与转录激活域之间的琥珀密码子来激活GAL4反应性报告基因HIS3、URA3或LacZ的基础上。描述用于阳性选择活性大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶(EcTyrRS)变异体的GAL4报告基因的优化。还曾利用作为“有毒等位基因(toxicallele)”添加到培养基中的小分子，利用URA3报告基因来进行无活性EcTyrRS变异体的阴性选择。重要的是，阳性选择和阴性选择都可以多种严格度对单个细胞进行。这可有利于从大型突变合成酶文库中分离出多种氨酰基tRNA合成酶(aaRS)活性。用于分离所需aaRS表现型的方法的功效可通过模型选择来证实。
实例2
哺乳动物细胞中大肠杆菌TyrtRNA的转录
随着基于大肠杆菌Tyr-RS的肽文库的酵母基遗传选择的发展，有可能分离对将非天然氨基酸并入真核细胞中的蛋白质中的能力具有选择性的突变合成酶。鉴于酵母与哺乳动物细胞之间的同源性，预想突变合成酶将支持哺乳动物细胞中的非天然氨基酸抑制。然而，Yokoyama等人为达成此目的所进行的最初尝试碰到了关于在哺乳动物细胞中转录大肠杆菌TyrtRNA的能力的问题。真核tRNA的转录是由称为A盒和B盒的启动子驱动：这些启动子在tRNA序列自身的内部。A盒和B盒序列的其它实例可见于Geiduschek，(1988)，TranscriptionByRNAPolymeraseIII，Ann.Rev.Biochem.57：873-914中，所述文献以引用的方式并入本文中。虽然Yokoyama尝试使tRNA的A盒序列工程化以使其能够活体内转录，但未检测到相应的琥珀抑制产物。
在这一实例中，使用两个替代的polIII转录流程成功地转录琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr。在第一个流程中，使琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr突变体与哺乳动物tRNA基因(具有适当的5′和3′侧接序列的人类tRNATyr)的3′端融合。在这两个tRNA之间不放置polIII终止子。主要的哺乳动物tRNA充当启动polIII转录的“II型polIII前导启动子(TIILP)”，所述polIII转录持续到通过琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr基因。如所得转录物支持通过选择密码子抑制进行非天然氨基酸并入的能力所证明，这一转录物产生哺乳动物细胞中所产生的功能性琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr。
从具有适当的5′和3′侧接序列的人类tRNATyr的转录启动得出，也可转录数个琥珀抑制性大肠杆菌tRNA簇。琥珀抑制性大肠杆菌tRNA的团簇产生改进的非天然氨基酸抑制。(图1)
在第二个流程中，琥珀抑制性大肠杆菌的转录是由诸如U6或H1启动子等III型polIII转录启动子启动。使用这一流程来评估5′和3′侧接序列以及团簇的琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr的不同tRNA盒的效应。(图2)
实验：
构筑含有TIILP转录盒的质粒
借助于PCR产生编码单一复本的琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr突变体的DNA序列。这一插入物从5′到3′的方向包括5′限制位点(EcoRI和BglII)、人类TyrtRNA5′侧接序列(CTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC(SEQIDNO：87))、琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr、3′侧接人类tRNATyr序列(GACAAGTGCGGTTTTTTTCTCCAGCTCCCGATGACTTATGGC(SEQIDNO：88))以及3′限制位点(BamHI和HindIII)。使用下列PCR引物从已含有5′侧接人类tRNATyr序列、琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr以及3′侧接人类tRNATyr序列的模板扩增DNA序列：
FTam97短序列
GTACGAATTCCCGAGATCTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGC(SEQIDNO：89)；
FTam109
GATGCAAGCTTGATGGATCCGCCATAAGTCATCGGGAGCTGGAGAAAAAAACCGCACTTGTCTGGTGGGGGAAGGATTCG(SEQIDNO：90)。消化(EcoRI和HindIII)所得PCR产物，并使其与经相同酶消化的pUC19质粒DNA连接。
消化(EcoRI和BglII)所得质粒并使其与含有人类tRNATyr基因的插入物(在EcoRI和BamH1处切割)连接，所述人类tRNATyr基因含有5′限制位点(EcoRI和BglII)、人类5′侧接tRNATyr序列(GGATTACGCATGCTCAGTGCAATCTTCGGTTGCCTGGACTAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC(SEQIDNO：91))、人类tRNATyr、人类3′侧接序列(GACAAGTGCGG(SEQIDNO：92))以及3′限制位点(BamHI和HindIII)。
为构筑编码人类tRNATyr和大肠杆菌tRNATyr转录盒的两个级联复本的质粒，消化(EcoRI和BglII限制酶)所得质粒。通过PCR使用引物FT73-out-new(CTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTC(SEQIDNO：93))和FT76-out反向引物(ACCATGATTACGCCAAGCTTGATSEQIDNO：94))来扩增转录盒。消化(EcoRI和BamHI)PCR产物并使其与切割质粒连接。
通过遵循这种策略，构筑多种质粒(图1)。
构筑驱动大肠杆菌tRNA表达质粒的H1启动子
使用以上所构筑的大肠杆菌tRNATyr琥珀抑制性突变体作为合成不同DNA克隆插入物的模板，然后如流程2中所示用不同5′和3′序列侧接所述插入物(图2)。用于PCR反应的引物是：
形式1：FTam111(SEQIDNO：95)/FTam113(SEQIDNO：98)
形式1a：FTam111(SEQIDNO：95)/FTam13(SEQIDNO：98)
形式2：FTam102a(SEQIDNO：97)/FTam113(SEQIDNO：98)
形式3：FTam111(SEQIDNO：95)/FTam114(SEQIDNO：99)
形式4：FTam102a(SEQIDNO：97)/FTam114(SEQIDNO：99)
FTam111：GCATCGGATCCGGTGGGGTTCCCGAGCGGCC(SEQIDNO：95)
FTam112：ACGCCAAGCTTTTCCAAAATGGTGGGGGAAGGATTCGAACCTTC(SEQIDNO：96)
FTam102a：GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCG(SEQIDNO：97)
FTam113：
ACGCCAAGCTTTTCCAAAAAATGGTGGGGGAAGGATTCGAACCTTC(SEQIDNO：98)
FTam114：
ACGCCAAGCTTTTCCAAAAAACCGCACTTGTCTGGTGGGGGAAGG(SEQIDNO：99)。
消化(BamHI和HindIII)、纯化(PCR纯化试剂盒：Qiagen)插入物并使其与经相同酶消化的pSilenser载体(Ambion)连接(图2)。图2的完全构筑体的序列如下：
具有Tx4终止子的无5′和3′侧接序列的大肠杆菌形式1：
GCATCGGATCCGGTGGGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCT
GCCGTCACAGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCATTTTGGAAAAGCTT
GGCGT(SEQIDNO：100)
具有Tx6终止子的无5′和3′侧接序列的大肠杆菌形式1a：
GCATCGGATCCGGTGGGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCT
GCCGTCACAGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCATTTTTTGGAAAAGC
TTGGCGT(SEQIDNO：101)
具有5′侧接序列的大肠杆菌形式2：
GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGTG
GGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCTGCCGTCACAGACTTC
GAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCATTTTTTGGAAAAGCTTGGCGT(SEQIDNO：102)
具有3′侧接序列的大肠杆菌形式3a：
GCATCGGATCCGGTGGGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCT
GCCGTCACAGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCAGACAAGTGCGGTTT
TTTGGAAAAGCTTGGCGT(SEQIDNO：103)
具有3′和5′侧接序列的大肠杆菌形式4：
GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGTG
GGGTTCCCGAGCGGCCAAAGGGAGCAGACTCTAAATCTGCCGTCACAGACTTC
GAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCAGACAAGTGCGGTTTTTTGGAAAAGCTTGG
CGT(SEQIDNO：104)。
另外，使用嗜热脂肪芽孢杆菌tRNATyr代替大肠杆菌进行实验，其中如图6中的第三个流程所示来转录琥珀抑制性嗜热脂肪芽孢杆菌tRNATyr。第三个流程包括使用如上文所讨论的相同技术来产生质粒，且这一实验显示使用启动子(在这种情况下使用U6)会进一步增加嗜热脂肪芽孢杆菌tRNATyr的功能性琥珀抑制(图7绘示实验结果)。
图6的完全构筑体的序列如下：
无5′和3′侧接序列和3′CCA的嗜热脂肪芽孢杆菌形式1：
GCATCGGATCCGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCC
GCTCCCTTTGGGTTCGGCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCATTTTTTGGAAAAGCT
TGGCGT(SEQIDNO：105)
无5′和3′侧接序列和3′CCA的以4个T终止的嗜热脂肪芽孢杆菌形式1a：
GCATCGGATCCGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCC
GCTCCCTTTGGGTTCGGCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCATTTTGGAAAAGCTTG
GCGT(SEQIDNO：106)
具有较短5′侧接序列而无3′CCA和3’侧接序列的嗜热脂肪芽孢杆菌形式3a：
GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGAG
GGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCTTTGGGTTCG
GCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCATTTTTTGGAAAAGCTTGGCGT(SEQIDNO：107)
具有3′侧接序列、终止子且无3′CCA和5′侧接序列的嗜热脂肪芽孢杆菌形式4：
GCATCGGATCCGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCC
GCTCCCTTTGGGTTCGGCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCAGACAAGTGCGGTTTT
TTGGAAAAGCTTGGCGT(SEQIDNO：108)
具有较短5′侧接序列和正常3′侧接序列而无3′CCA的嗜热脂肪芽孢杆菌形式5a：
GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTCGGAG
GGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCTTTGGGTTCG
GCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCAGACAAGTGCGGTTTTTTGAAAAGCTTGGC
GT(SEQIDNO：109)。
H1启动子序列和U6启动子序列如下：
H1启动子：
GAATTCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAA
ACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCG
GATCC(SEQIDNO：111)
U6启动子：
CCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGC
GTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC
CATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAG
AATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAA
AGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTA
TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGGTTTATATATCTTG
TGGAAAGGACGCGGGATCC(SEQIDNO：110)。
结果
琥珀抑制性大肠杆菌TyrtRNA(图3)
在琥珀抑制检定中评估数个tRNA构筑体，即三个复本、两个复本以及一个复本的侧接有5′人类tRNATyr前导序列的琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr。将编码hGHE88琥珀突变体tRNA和大肠杆菌tRNATyr合成酶的质粒共转染到CHOK1细胞中。也进行省去合成酶的阴性对照。在转染后41小时，检定hGH的表达。在所有阴性对照实验中，几乎未检测到hGH表达(hGH特异性ELISA)。在存在大肠杆菌TyrRS且不存在人类前导序列tRNA的情况下，也几乎未检测到hGH表达。仅在存在5′端侧接有人类tRNATyr序列的大肠杆菌tRNATyr合成酶的情况下检测到hGH表达。在两个复本的琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr的情况下，hGH表达几乎比单个复本的hGH表达高3倍。这些结果证明，琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr突变体仅在存在人类前导序列tRNA的情况下具有抑制功能。
使用利用TIILP在活体内转录的琥珀抑制性大肠杆菌TyrtRNA，在存在对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)的情况下进行琥珀抑制(图4)
将编码hGHE88琥珀突变体(特定tRNA格式)和装有pAF的大肠杆菌tRNATyr合成酶突变体的质粒共转染到CHOK1细胞中。用含有1mMpAF的生长培养基更换转染培养基。在转染后42小时，检定hGH的表达。一个人类tRNA前导序列在下游与琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr的级联复本融合的tRNA格式(h-(EC)2)产生极有限的hGH表达。使用以下两个替代的tRNA格式检测到较高hGH表达：第一个含有与单一复本的琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr融合的5′人类tRNA前导序列(hEC)；第二个含有刚才描述的整个转录盒的两个复本(2×(hEC))。对于这两个构筑体，可通过使转染的tRNA质粒的量加倍(即从1微克到2微克)来进一步增加琥珀抑制产率。相反，当使转染的编码pAFRS的质粒的量加倍时，琥珀抑制产率降低。
使用利用H1启动子在活体内转录的琥珀抑制性大肠杆菌TyrtRNA，在存在pAF的情况下进行琥珀抑制(图5)
将编码hGHE88琥珀突变体(一种由H1启动子驱动的大肠杆菌Tyr琥珀抑制性tRNA)和大肠杆菌tRNATyr合成酶突变体的质粒共转染到CHOK1细胞中。作为阴性对照，使用缺乏H1启动子且由在5′和3′侧接人类TyrtRNA侧接序列的单一复本的大肠杆菌Tyr琥珀抑制性tRNA组成的质粒。用含有1mMpAF的生长培养基更换转染培养基，且在转染后42小时，通过ELISA检定hGH的表达。在琥珀抑制性大肠杆菌tRNATyr的5′端中不存在H1启动子的阴性对照实验产生极有限的hGH抑制。类似地，利用tRNA仅在5′端处侧接紧靠人类TyrtRNA上游的5′序列的tRNA转录形式2(图2)检测到hGH的极低效价。使用形式1a、3和4转录盒检测到较高水平的经抑制的hGH(图2)。总之，这些结果提示缺乏内部A盒的琥珀抑制性大肠杆菌TyrtRNA无法由CHO细胞中的polIII有效转录；此格式(即形式1)的琥珀抑制较差。然而，如在tRNA转录构筑体形式1a、形式3和形式4中所观察，在tRNA的5′端包括诸如H1等polIII启动子使得能够转录和产生功能性琥珀抑制性tRNA。构筑体形式2产生有限抑制效价的事实提示5′侧接序列对产生功能性琥珀抑制性tRNA来说很重要。
实例3
利用来自大肠杆菌的野生型LeuRS和琥珀抑制性tRNA，在CHOK1细胞中进行琥珀抑制
在这一实验中，利用来自大肠杆菌的野生型LeuRS和琥珀抑制性tRNA来抑制CHOK1细胞中的选择密码子(在这种情况下为琥珀密码子)(GCCCGGATGGTGGAATCGGTaGACACAAGGGATTCTAAATCCCTCGGCGTTCGCGCTgTGCGGGTTCAAGTCCCGCTCCGGGTA(SEQIDNO：112))。
使用嗜热脂肪芽孢杆菌对作为阳性对照，且图左侧绘示阴性对照。此处使用两组启动子来驱动tRNA表达：H1和U6(2组)，且在这种情况下，tRNA不是tRNA簇。对于改进的抑制，在转染期间使用两倍的编码tRNA的DNA。
图8中的结果绘示大肠杆菌LeuRS/tRNA对在哺乳动物细胞中正交。新颖tRNA转录流程(U6、H1驱动tRNA表达)还对另一也缺乏A盒序列的tRNA起作用。
向具有非天然氨基酸的蛋白质中添加分子。
一方面，本发明提供包含与其它取代基分子偶合的非天然氨基酸的蛋白质的方法和相关组合物。
应了解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明的目的，且将对所属领域的技术人员提示根据其作出各种修改和变化，且所述修改和变化包括在本申请案的精神和权限以及附属权利要求书的范围内。
虽然出于清楚和便于理解的目的已较详细地描述上述发明，但通过阅读本公开文献，显而易见所属领域的技术人员可在不脱离本发明的真正范围的情况下进行形式和细节的各种变化。举例来说，本文中所述的所有技术和装置都可以不同组合使用。本申请案中所引用的所有公开文献、专利、专利申请案和/或其它文献出于所有目的都是以引用的方式全部并入本文中，引用的程度就如同已个别地将各个公开文献、专利案、专利申请案和/或其它文献出于所有目的以引用的方式并入一般。
表5
a这些克隆也含有Asp165Gly突变。
P095438CN-seq.txt
序列表
<110>田锋
席雅·诺曼
斯蒂芬妮·周
<120>脊椎动物细胞中抑制因子TRNA的转录
<130>AMBX-0124.00PCT
<150>60/843,264
<151>2006-09-08
<160>112
<170>PatentInversion3.4
<210>1
<211>1275
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>1
atggcaagcagtaacttgattaaacaattgcaagagcgggggctggtagcccaggtgacg60
gacgaggaagcgttagcagagcgactggcgcaaggcccgatcgcgctctattgcggcttc120
gatcctaccgctgacagcttgcatttggggcatcttgttccattgttatgcctgaaacgc180
ttccagcaggcgggccacaagccggttgcgctggtaggcggcgcgacgggtctgattggc240
gacccgagcttcaaagctgccgagcgtaagctgaacaccgaagaaactgttcaggagtgg300
gtggacaaaatccgtaagcaggttgccccgttcctcgatttcgactgtggagaaaactct360
gctatcgcggcgaacaactatgactggttcggcaatatgaatgtgctgaccttcctgcgc420
gatattggcaaacacttctccgttaaccagatgatcaacaaagaagcggttaagcagcgt480
ctcaaccgtgaagatcaggggatttcgttcactgagttttcctacaacctgttgcagggt540
tatgacttcgcctgtctgaacaaacagtacggtgtggtgctgcaaattggtggttctgac600
cagtggggtaacatcacttctggtatcgacctgacccgtcgtctgcatcagaatcaggtg660
tttggcctgaccgttccgctgatcactaaagcagatggcaccaaatttggtaaaactgaa720
ggcggcgcagtctggttggatccgaagaaaaccagcccgtacaaattctaccagttctgg780
atcaacactgcggatgccgacgtttaccgcttcctgaagttcttcacctttatgagcatt840
gaagagatcaacgccctggaagaagaagataaaaacagcggtaaagcaccgcgcgcccag900
tatgtactggcggagcaggtgactcgtctggttcacggtgaagaaggtttacaggcggca960
aaacgtattaccgaatgcctgttcagcggttctttgagtgcgctgagtgaagcggacttc1020
gaacagctggcgcaggacggcgtaccgatggttgagatggaaaagggcgcagacctgatg1080
caggcactggtcgattctgaactgcaaccttcccgtggtcaggcacgtaaaactatcgcc1140
tccaatgccatcaccattaacggtgaaaaacagtccgatcctgaatacttctttaaagaa1200
gaagatcgtctgtttggtcgttttaccttactgcgtcgcggtaaaaagaattactgtctg1260
atttgctggaaataa1275
<210>2
<211>424
<212>PRT
<213>Escherichiacoli
<400>2
MetAlaSerSerAsnLeuIleLysGlnLeuGlnGluArgGlyLeuVal
151015
AlaGlnValThrAspGluGluAlaLeuAlaGluArgLeuAlaGlnGly
202530
ProIleAlaLeuTyrCysGlyPheAspProThrAlaAspSerLeuHis
354045
LeuGlyHisLeuValProLeuLeuCysLeuLysArgPheGlnGlnAla
505560
GlyHisLysProValAlaLeuValGlyGlyAlaThrGlyLeuIleGly
65707580
AspProSerPheLysAlaAlaGluArgLysLeuAsnThrGluGluThr
859095
ValGlnGluTrpValAspLysIleArgLysGlnValAlaProPheLeu
100105110
AspPheAspCysGlyGluAsnSerAlaIleAlaAlaAsnAsnTyrAsp
115120125
TrpPheGlyAsnMetAsnValLeuThrPheLeuArgAspIleGlyLys
130135140
HisPheSerValAsnGlnMetIleAsnLysGluAlaValLysGlnArg
145150155160
LeuAsnArgGluAspGlnGlyIleSerPheThrGluPheSerTyrAsn
165170175
LeuLeuGlnGlyTyrAspPheAlaCysLeuAsnLysGlnTyrGlyVal
180185190
ValLeuGlnIleGlyGlySerAspGlnTrpGlyAsnIleThrSerGly
195200205
IleAspLeuThrArgArgLeuHisGlnAsnGlnValPheGlyLeuThr
210215220
ValProLeuIleThrLysAlaAspGlyThrLysPheGlyLysThrGlu
225230235240
GlyGlyAlaValTrpLeuAspProLysLysThrSerProTyrLysPhe
245250255
TyrGlnPheTrpIleAsnThrAlaAspAlaAspValTyrArgPheLeu
260265270
LysPhePheThrPheMetSerIleGluGluIleAsnAlaLeuGluGlu
275280285
GluAspLysAsnSerGlyLysAlaProArgAlaGlnTyrValLeuAla
290295300
GluGlnValThrArgLeuValHisGlyGluGluGlyLeuGlnAlaAla
305310315320
LysArgIleThrGluCysLeuPheSerGlySerLeuSerAlaLeuSer
325330335
GluAlaAspPheGluGlnLeuAlaGlnAspGlyValProMetValGlu
340345350
MetGluLysGlyAlaAspLeuMetGlnAlaLeuValAspSerGluLeu
355360365
GlnProSerArgGlyGlnAlaArgLysThrIleAlaSerAsnAlaIle
370375380
ThrIleAsnGlyGluLysGlnSerAspProGluTyrPhePheLysGlu
385390395400
GluAspArgLeuPheGlyArgPheThrLeuLeuArgArgGlyLysLys
405410415
AsnTyrCysLeuIleCysTrpLys
420
<210>3
<211>1275
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成酶
<400>3
atggcaagcagtaacttgattaaacaattgcaagagcgggggctggtagcccaggtgacg60
gacgaggaagcgttagcagagcgactggcgcaaggcccgatcgcactcgtgtgtggcttc120
gatcctaccgctgacagcttgcatttggggcatcttgttccattgttatgcctgaaacgc180
ttccagcaggcgggccacaagccggttgcgctggtaggcggcgcgacgggtctgattggc240
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<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>80
cgctactctccccaaaaaaaaaaggtctccgctg34
<210>81
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>81
gccgtcacagattttttggcttcagtggagactg34
<210>82
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>82
gccgtcacagattatttggcttcagtggagactg34
<210>83
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>83
gccgtcacagattggttggcttcagtggagactg34
<210>84
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>84
gccgtcacagatgatttggcttcagtggagactg34
<210>85
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>85
gccgtcacagataaattggcttcagtggagactg34
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<211>424
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成酶
<400>86
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151015
AlaGlnValThrAspGluGluAlaLeuAlaGluArgLeuAlaGlnGly
202530
ProIleAlaLeuIleCysGlyPheAspProThrAlaAspSerLeuHis
354045
LeuGlyHisLeuValProLeuLeuCysLeuLysArgPheGlnGlnAla
505560
GlyHisLysProValAlaLeuValGlyGlyAlaThrGlyLeuIleGly
65707580
AspProSerPheLysAlaAlaGluArgLysLeuAsnThrGluGluThr
859095
ValGlnGluTrpValAspLysIleArgLysGlnValAlaProPheLeu
100105110
AspPheAspCysGlyGluAsnSerAlaIleAlaAlaAsnAsnTyrAsp
115120125
TrpPheGlyAsnMetAsnValLeuThrPheLeuArgAspIleGlyLys
130135140
HisPheSerValAsnGlnMetIleAsnLysGluAlaValLysGlnArg
145150155160
LeuAsnArgGluGlyGlnGlyIleSerPheThrGluPheSerTyrAsn
165170175
LeuLeuGlnGlyTyrGlyMetAlaCysAlaAsnLysGlnTyrGlyVal
180185190
ValLeuGlnIleGlyGlySerAspGlnTrpGlyAsnIleThrSerGly
195200205
IleAspLeuThrArgArgLeuHisGlnAsnGlnValPheGlyLeuThr
210215220
ValProLeuIleThrLysAlaAspGlyThrLysPheGlyLysThrGlu
225230235240
GlyGlyAlaValTrpLeuAspProLysLysThrSerProTyrLysPhe
245250255
TyrGlnPheTrpIleAsnThrAlaAspAlaAspValTyrArgPheLeu
260265270
LysPhePheThrPheMetSerIleGluGluIleAsnAlaLeuGluGlu
275280285
GluAspLysAsnSerGlyLysAlaProArgAlaGlnTyrValLeuAla
290295300
GluGlnValThrArgLeuValHisGlyGluGluGlyLeuGlnAlaAla
305310315320
LysArgIleThrGluCysLeuPheSerGlySerLeuSerAlaLeuSer
325330335
GluAlaAspPheGluGlnLeuAlaGlnAspGlyValProMetValGlu
340345350
MetGluLysGlyAlaAspLeuMetGlnAlaLeuValAspSerGluLeu
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GlnProSerArgGlyGlnAlaArgLysThrIleAlaSerAsnAlaIle
370375380
ThrIleAsnGlyGluLysGlnSerAspProGluTyrPhePheLysGlu
385390395400
GluAspArgLeuPheGlyArgPheThrLeuLeuArgArgGlyLysLys
405410415
AsnTyrCysLeuIleCysTrpLys
420
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<211>40
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>87
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<212>DNA
<213>Homosapiens
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<210>89
<211>42
<212>DNA
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<220>
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tctggtgggggaaggattcg80
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ctgaacctcaggggacgccgacacacgtacacgtc95
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accatgattacgccaagcttgat23
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acgccaagcttttccaaaatggtgggggaaggattcgaaccttc44
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<213>人工
<220>
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acgccaagcttttccaaaaaatggtgggggaaggattcgaaccttc46
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<211>45
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<213>人工
<220>
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acgccaagcttttccaaaaaaccgcacttgtctggtgggggaagg45
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<213>人工
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cagacttcgaaggttcgaatccttcccccaccattttggaaaagcttggcgt112
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<213>人工
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gcatcggatccggtggggttcccgagcggccaaagggagcagactctaaatctgccgtca60
cagacttcgaaggttcgaatccttcccccaccattttttggaaaagcttggcgt114
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<212>DNA
<213>人工
<220>
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gcatcggatccgtgctgaacctcaggggacgccgacacacgtacacgtcggtggggttcc60
cgagcggccaaagggagcagactctaaatctgccgtcacagacttcgaaggttcgaatcc120
ttcccccaccattttttggaaaagcttggcgt152
<210>103
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>103
gcatcggatccggtggggttcccgagcggccaaagggagcagactctaaatctgccgtca60
cagacttcgaaggttcgaatccttcccccaccagacaagtgcggttttttggaaaagctt120
ggcgt125
<210>104
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>104
gcatcggatccgtgctgaacctcaggggacgccgacacacgtacacgtcggtggggttcc60
cgagcggccaaagggagcagactctaaatctgccgtcacagacttcgaaggttcgaatcc120
ttcccccaccagacaagtgcggttttttggaaaagcttggcgt163
<210>105
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒构筑体
<400>105
gcatcggatccggaggggtagcgaagtggctaaacgcggcggactctaaatccgctccct60
ttgggttcggcggttcgaatccgtccccctccattttttggaaaagcttggcgt114
<210>106
<211>112
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒构筑体
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gcatcggatccggaggggtagcgaagtggctaaacgcggcggactctaaatccgctccct60
ttgggttcggcggttcgaatccgtccccctccattttggaaaagcttggcgt112
<210>107
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒构筑体
<400>107
gcatcggatccgtgctgaacctcaggggacgccgacacacgtacacgtcggaggggtagc60
gaagtggctaaacgcggcggactctaaatccgctccctttgggttcggcggttcgaatcc120
gtccccctccattttttggaaaagcttggcgt152
<210>108
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒构筑体
<400>108
gcatcggatccggaggggtagcgaagtggctaaacgcggcggactctaaatccgctccct60
ttgggttcggcggttcgaatccgtccccctccagacaagtgcggttttttggaaaagctt120
ggcgt125
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒构筑体
<400>109
gcatcggatccgtgctgaacctcaggggacgccgacacacgtacacgtcggaggggtagc60
gaagtggctaaacgcggcggactctaaatccgctccctttgggttcggcggttcgaatcc120
gtccccctccagacaagtgcggttttttggaaaagcttggcgt163
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>启动子
<400>110
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cgcgcgccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcata120
tacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatat180
tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaat240
tatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgg300
gtttatatatcttgtggaaaggacgcgggatcc333
<210>111
<211>105
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>启动子
<400>111
gaattcatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctt60
tggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatcc105
<210>112
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>E.coliLeu琥珀抑制性tRNA
<400>112
gcccggatggtggaatcggtagacacaagggattctaaatccctcggcgttcgcgctgtg60
cgggttcaagtcccgctccgggta84

Claims (2)

1.一种抑制因子tRNA转录盒，所述盒由5’至3’依序包含：U6或H1的polIII启动子；以及嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)或大肠杆菌(Escherichiacoli)抑制因子tRNA。
2.一种哺乳动物细胞系，其包含根据权利要求1所述的tRNA转录盒。
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