CN103820410B - 3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用 - Google Patents

3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ？ID？NO：4所示的氨基酸序列和SEQ？ID？NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ？ID？NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明提供一种3-甲硫酪氨酸翻译系统，其包含：(i)3-甲硫酪氨酸；(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

Description

3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用
技术领域
本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还涉及一种2-氨基-3-(4-羟基-3-(甲硫)苯基)丙酸(简称3-甲硫酪氨酸，简写为MtTyr)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-甲硫酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的3-甲硫酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的方法。本发明还涉及用这套翻译系统和这种方法产生的含有3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质，例如，插入3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体，以及插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的应用。
背景技术
蛋白质是所有生命体及其生命活动的主要物质基础。在整个蛋白中，约有三分之一的蛋白都是一些含金属的蛋白，称为金属蛋白(Metalloprotein)或金属酶(Metalloenzyme)。金属酶中普遍存在通过硫醚键结合的Tyr-Cys辅助因子，例如：半乳糖氧化酶(GO)，乙二醛氧化酶，半胱氨酸双加氧酶(CDO)，亚硫酸盐还原酶(NirA)以及Thioalkalivibrionitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶(TvNiR)。在上述的所有酶中，酪氨酸苯环上的C3原子与邻近半胱氨酸的S原子均能自发地形成共价键，而不需要任何外源性蛋白质催化。因此，这种Tyr-Cys辅助因子的基本功能目前已被多位合成化学家、物理化学家、酶学家和结构生物学家深入研究，并且取得了巨大的突破。尽管如此，关于该辅助因子在酶催化过程中的确切作用至今仍无人知晓，而限制其研究的瓶颈问题是无法通过传统的定点诱变方法来探测这种翻译后修饰的结构。为了克服这种限制，有人合成出模拟Tyr-Cys共价交联的化合物来进行研究。结果表明，Tyr-Cys共价交联基团可以显著降低苯环侧链的pKa值和还原电位，因此促进了酶作用底物和Tyr-Cys辅助因子之间的质子耦合电子转移，而这对优化酶活性是至关重要的因素。
本发明拟通过在肌红蛋白中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸，使其模拟Thioalkalivibrionitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶(TvNiR)活性中心的Tyr-Cys辅助因子，该研究将为金属酶中Tyr-Cys辅助因子的催化机制提供研究基础。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selectorcodon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO2002/086075，其发明名称为“METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASEPAIRS”；WO2002/085923，其发明名称为“INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS”；WO2004/094593，其发明名称为“EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE”。定点特异性插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，AngewandteChemieInt.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.OpinioninChemicalBiology9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。
发明内容
1、技术问题
本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示氨基酸和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3-甲硫酪氨酸(简写为MtTyr)优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入MtTyr。这是本发明人首次发现的，相应地，在本发明中将其命名为正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(MtTyrRS)。
本发明还提供一种酪氨酸酚裂解酶(Tyrosinephenollyase，简写为TPL)突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体可以高效地催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，其氨基酸序列为：
(1)SEQIDNO：9所示的氨基酸序列，或
(2)将SEQIDNO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQIDNO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语“能够催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体”不仅包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列，还包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQIDNO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQIDNO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
这种能够催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体是本发明人首次发现的。
在上述发现的基础上，本发明提供一种利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-甲硫酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的3-甲硫酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质及其应用。
因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-甲硫酪氨酸定点特异性插入蛋白质的3-甲硫酪氨酸翻译系统，并且提供利用该翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的方法。
本发明还提供利用本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统产生的含有至少一个3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将3-甲硫酪氨酸定点特异性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，肌红蛋白(Myoglobin)。通过本发明的方法得到的包含3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体蛋白具有亚硝酸盐还原酶活性。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法也可以用于在肌红蛋白之外的多种蛋白中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸，并不局限于该蛋白。
2、技术方案
本发明人经过筛选，获得一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示氨基酸序列和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性，在本发明中将其命名为正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(MtTyrRS)。并且，本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研发了3-甲硫酪氨酸翻译系统。
本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQIDNO：4所示的氨基酸序列之外，术语“本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”还包括SEQIDNO：4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQIDNO：4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
具体来说，本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)识别选择密码子(selectorcodon)如琥珀终止密码子(TAG)从而将非天然氨基酸3-甲硫酪氨酸定点特异性插入到多肽链中的3-甲硫酪氨酸翻译系统。所述3-甲硫酪氨酸翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会识别O-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地识别内源性tRNA。利用所述翻译系统能够产生在翻译过程中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的大量蛋白质。
在一些方面中，本发明提供3-甲硫酪氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：
(a)非天然氨基酸，即3-甲硫酪氨酸，
(b)本发明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和
(c)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-甲硫酪氨酸)，优先氨酰化所述O-tRNA。
优选地，本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即为本发明人首次发现的氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQIDNO：4所示氨基酸序列和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
在本发明的优选方面中，本发明提供一种3-甲硫酪氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)3-甲硫酪氨酸；
(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
优选地，所述3-甲硫酪氨酸翻译系统还包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)。例如，正交tRNA(O-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，优选地，O-tRNA的序列如SEQIDNO：1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶可以包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。在优选的实施方案中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示。
在一些方面中，本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
在一些方面中，本发明提供包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶和正交tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞，优选大肠杆菌。
本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的方法。所述方法利用上述3-甲硫酪氨酸翻译系统。所述方法通常包括下述步骤：
(a)提供含有以下组分的3-甲硫酪氨酸翻译系统的步骤：
(i)非天然氨基酸，即3-甲硫酪氨酸；
(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述O-tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述木匾蛋白质的翻译过程中，3-甲硫酪氨酸氨酰化的正交RNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及3-甲硫酪氨酸，从而介导3-甲硫酪氨酸定点特异性插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含有3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质。
本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可以通过常规分子克隆技术和筛选技术实现。
本领域技术人员应该理解，在步骤(b)中，将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中可以通过多种方式进行，例如，将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列分别可操作性地连接到适当的载体中，再以任意次序或三者共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中。或者，也可以将正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码目标蛋白质的核酸序列以任意适当的顺序可操作性地连接在一起，然后克隆到一个载体上，最后转化到适当的宿主细胞中。上述克隆方案都是可行的，本领域技术人员可以根据实验的需要容易地进行适当的选择。
另外，本领域技术人员还应该理解，为了避免宿主细胞对外源重组载体的“踢除”效应，往往选择用带有不同抗生素标记的载体来构建需要共同转化到同一宿主细胞中的核酸序列片段。对于适当的载体的选择、重组载体的构建、宿主细胞的转化或转染等等，都是本领域的常规技术，例如，可以参见美国冷泉港实验室出版的分子克隆手册。
在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即3-甲硫酪氨酸)优先氨酰化所述O-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体(即，本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库进行所述O-RS的正选择和负选择(参见下述实施例2)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供O-tRNA的序列，O-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA，例如，所述O-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者O-tRNA包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。
还可在宿主细胞内实施产生含有3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统(即，包含编码本发明的O-RS的核苷酸序列、O-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加3-甲硫酪氨酸等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)。
本发明还提供生产含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体的方法，其利用上述产生在至少一个所选位置定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的方法，其中所用的编码肌红蛋白突变体的核酸序列在适当的位置包含所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在肌红蛋白的翻译期间，3-甲硫酪氨酸定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体。
优选地，本发明还提供生产含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体的方法，所述方法利用上述3-甲硫酪氨酸翻译系统进行，所述方法通常包括下述步骤：
(a)提供含有以下组分的3-甲硫酪氨酸翻译系统的步骤：
(i)3-甲硫酪氨酸；
(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述O-tRNA；和
(iv)编码所述肌红蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQIDNO：5，其中所述核酸含有所述O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述目标蛋白质(即肌红蛋白)的翻译过程中，3-甲硫酪氨酸氨酰化的正交RNA识别编码肌红蛋白的mRNA上的选择密码子以及3-甲硫酪氨酸，从而介导3-甲硫酪氨酸定点插入所述目标蛋白质的特定位置(即，所述选择密码子对应的氨基酸位置)，之后通过模拟Thioalkalivibrionitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶(TvNiR)活性中心的Tyr-Cys辅助因子从而增强其酶活性。
本发明还提供利用本发明的3-甲硫酪氨酸翻译系统产生的具有亚硝酸盐还原酶活性的含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体，在野生型肌红蛋白的33位引入3-甲硫酪氨酸，同时将29位亮氨酸突变为组氨酸，所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：6。
最后，本发明人经过筛选，还获得了一种能够催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶(简写为TPL)突变体，其氨基酸序列为：
(1)SEQIDNO：9所示的氨基酸序列，或
(2)将SEQIDNO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQIDNO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
分子模型表明，与野生型酪氨酸酚裂解酶相比较，该突变体的36位氨基酸突变为亮氨酸后显著地扩大了酶口袋，使酶和底物可以更好地作用，从而高效地催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸。酶催化反应液经过HPLC纯化后产率可达到40％，最终获得较高产量的3-甲硫酪氨酸。这也是通过进化TPL突变体来扩大其底物范围的首次应用。
此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语“能够催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体”不仅包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列，还包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQIDNO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQIDNO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
3、有益效果
通过在肌红蛋白中定点特异性插入非天然的氨基酸，即3-甲硫酪氨酸(MtTyr)，我们成功地设计出了一个亚硝酸盐还原酶功能模型MtTyrMb(即，与野生型肌红蛋白相比，在氨基酸位点33位插入3-甲硫酪氨酸，同时将29位亮氨酸突变为组氨酸的肌红蛋白突变体)，它可以高效地催化强羟胺还原成铵根离子，并且其酶活性是对照的肌红蛋白突变体TyrMb(即，与野生型肌红蛋白相比，33位苯丙氨酸突变为酪氨酸，同时将29位亮氨酸突变为组氨酸的肌红蛋白突变体，其可以按照常规分子克隆和突变方法制备)的四倍。该研究首次直接证实了酪氨酸残基上的3-甲硫取代基可以显著提高酶活性。
同时，由于野生型酪氨酸酚裂解酶无法催化生成3-甲硫酪氨酸，我们通过进化酪氨酸酚裂解酶(TPL)，使其可以直接催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，得到一种酪氨酸酚裂解酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO：9，使用该酪氨酸酚裂解酶突变体只需一步反应就可以达到40％的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质。
本发明中通过TPL突变体催化合成的MtTyr，其结构与GO、CDO、NirA和TvNiR活性中心上经过翻译后修饰的Tyr-Cys辅助因子高度相似，因此可以作为模型来详细研究这些金属酶的催化机理，同时也具有在合成生物学和工业催化方面的应用潜力。目前，研究半乳糖氧化酶的定向进化并获得利用单糖作为底物的突变体已成为研究热点，而我们发明设计的3-甲硫酪氨酸翻译系统，再结合理性及计算设计方法，可能为解决半乳糖氧化酶的定向进化提供有效的途径。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1是TPL突变体(SEQIDNO：9)催化合成3-甲硫酪氨酸的反应式；
图2：图2A是野生型TPL活性中心的晶体结构图，图2B是薄层层析法筛选TLP突变体；
图3是MtTyr的HPLC纯化图谱；
图4是MtTyr的质谱图；
图5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶、肌红蛋白突变体、酪氨酸酚裂解酶(TPL)突变体的序列；
图6：图6A是4TAG-Mb(即，4位插入3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体)和MtTyrMb的SDS-PAGE电泳图，图6B是4TAG-Mb的质谱图；
图7：图7A是Wolinellasuccinogenes细胞色素c亚硝酸盐还原酶和Thioalkalivibrionitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶活性中心的晶体对比结构图；图7B是MtTyrMb的结构模型图；
图8是肌红蛋白突变体(MtTyrMb和TyrMb)和野生型肌红蛋白(wtMb)催化还原羟胺的反应对比图；
图9是MtTyrMb催化还原羟胺的核磁共振光谱图；
图10是肌红蛋白突变体(MtTyrMb和TyrMb)和野生型肌红蛋白(wtMb)催化还原羟胺的反应速率图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
实施例1：MtTyr的生物催化合成(图1-图4)
本发明采用生物酶催化的方法，利用从弗氏柠檬酸细菌(ATCC8090，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))中克隆出的酪氨酸酚裂解酶(TPL)催化2-羟基苯硫醚合成3-甲硫酪氨酸，催化反应式见图1。
但是实验结果表明，野生型TPL无法催化生成3-甲硫酪氨酸。因此，本发明人分析了TPL的晶体结构图(图2A)，挑选出448位苯丙氨酸、36位苯丙氨酸和288位甲硫氨酸，引入NNK突变(N＝A+T+C+G；K＝T+G)，构建成pEt-TPL突变库来进行TPL的定向进化。从突变库挑选出96个单克隆，用96孔板培养过夜后，加入溶菌酶裂解细胞，然后加入2-羟基苯硫醚、氯化铵和丙酮酸钠，37℃孵育4h，用茚三酮薄层色谱法检测氨基酸的形成。结果表明(图2B)，其中一个克隆成功地催化形成了3-甲硫酪氨酸。测序结果显示，该酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：9，该突变体将野生型TPL36位的苯丙氨酸突变成了亮氨酸。使用该酪氨酸酚裂解酶突变体只需一步反应就可以达到40％的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质。
我们将筛选得到的TPL突变体进行放大培养，然后收菌，离心，超声破碎，采用镍柱纯化，得到突变蛋白酶。取30mM乙酸铵、10mM2-羟基苯硫醚(购自北京百灵威公司)、60mM丙酮酸钠、50mM巯基乙醇、40μM磷酸吡哆醛和10mg突变蛋白酶，定容至1L，pH8.0，然后室温避光搅拌3天。收集水相，通过HPLC分离纯化得到白色粉末(图3，图4)，产率40％。(YMCAA12S052503WTcolumn，12ml/minflowrate，from10％to90％CH3CN，0.1％TFA(w/v)inwater，overthecourseof30min).MS：m/z：228[M+H]+；H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.35(s，3H)，3.00(m，2H)，4.12(t，1H)，6.73(d，1H，J＝8.1)，6.83(dd，J＝8.1，1.96，1H)，6.97(d，1H)，8.23(s，2H)，9.88(s，1H)。
以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自Sigma公司，均为分析纯以上级别。
另外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语“能够催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体”不仅包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列，还包括SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是将SEQIDNO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQIDNO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
实施例2：进化MtTyr特异性氨酰基-tRNA合成酶
为了在基因中位点特异性插入MtTyr，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA(MjtRNACUA Tyr)/酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列为SEQIDNO：2)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国scripps研究所PeterG.Schultz实验室)中，位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jw1库，该突变库的构建方法为：在MjTyrRS基因上挑选6个位点(Tyr32，Leu65，Phe108，Gln109，Asp158，和Leu162)引入NNK突变(N＝A+T+C+G；K＝T+G)，另外6个位点(Ile63，Ala67，His70，Tyr114，Ile159，Val164)或随机突变为Gly或保持不变(参见Xie，J.；Liu，W.S.；Schultz，P.G.Angew.Chem.，Int.Ed.2007，46，9239-9242；Wang，JY.；ZhangW.；SongWJ；eta1.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。
通过正负筛选来进化特异性识别MtTyr的氨酰基-tRNA合成酶。正筛选质粒包含MjtRNACUA Tyr，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNACUA Tyr，在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选：包含有正筛选质粒的E.coliDH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jw1库，SOC培养基(2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，20mM葡萄糖)在37℃培养1小时。之后换用极限培养基(GMML极限培养基的配方：M9盐/甘油：764gNa2HPO4.7H2O或者30gNa2HPO4，15gKH2PO4，2.5gNaCl，5gNH4Cl，50ml甘油，高压灭菌，pH7.0；1MMgSO4：高压灭菌；50mMCaCl2：高压灭菌；25mMFeCl2：过滤灭菌；0.3M亮氨酸：溶解于0.3MNaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200mlM9盐/甘油，2mlMgSO4，2mlCaCl2，2mlFeCl2，1ml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml3％琼脂粉，1mMMtTyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素)，37℃培养60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的pBK-lib-jw1转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl)。37℃培养8-12小时。共重复3轮。
最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有1mMMtTyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含MtTyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固体培养基。挑选在在1mMMtTyr100mg/L氯霉素的培养基上生长，而在0mMMtTyr20mg/L氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。最终挑出1个克隆，插入3-甲硫酪氨酸效率最高，测序表明，克隆所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(MtTyrRS)的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示，其中突变位点为Tyr32Glu，His70Gly，Asp158Ala和Leu162Pro。
本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQIDNO：4所示的氨基酸序列之外，术语“正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”还包括SEQIDNO：4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQIDNO：4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
实施例3：表达MtTyr-肌红蛋白及质谱鉴定
将正交tRNA(SEQIDNO：1)和编码肌红蛋白的核苷酸序列(4TAG或33TAG)(SEQIDNO：5和7)构建到pBAD载体(购自美国scripps研究所PeterG.Schultz实验室)上，筛选出来的编码MtTyrRS的核苷酸序列(SEQIDNO：3)构建到pBK载体(购自美国scripps研究所PeterG.Schultz实验室)上，然后共转化到DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37℃培养到OD600约等于0.5时，向LB培养基中加入1mMMtTyr及0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)培养细胞，对照不加入MtTyr。6-8小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图6A)。
我们发现，只有在存在MtTyr的培养基中才能纯化出全长的肌红蛋白，这说明筛选出来的MtTyrRS可以特异性的识别MtTyr。在LB培养基中MtTyr-肌红蛋白的产率为10mg/L，而野生型肌红蛋白的产率为50mg/L。为了检测MtTyr仅仅插入到肌红蛋白的4位琥珀突变位点，我们对4-MtTyr-肌红蛋白进行了ESI-TOF质谱检测，检测结果分子量为18476.5Da(图6B)，与计算的分子量18477.2Da吻合。
实施例4：表达MtTyr-肌红蛋白突变体作为TvNiR功能模型
我们用基因工程方法构建了肌红蛋白突变体MtTyrMb(核苷酸序列如SEQIDNO：5所示)，其中29位亮氨酸突变为组氨酸，33位苯丙氨酸突变为TAG终止密码子，然后用实施例3中的相同方法在肌红蛋白突变体的33位定点特异性插入MtTyr，表达产生MtTyrMb突变蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO：6所示)，突变的3-甲硫酪氨酸和组氨酸残基可以模拟TvNiR活性中心上的303位酪氨酸残基和316位组氨酸残基(图7)。作为对照，我们还构建了突变体TyrMb(核苷酸序列如SEQIDNO：7所示)，其中29位亮氨酸突变为组氨酸，33位苯丙氨酸突变为酪氨酸。
我们首先通过15N核磁共振光谱测试了MtTyrMb还原羟胺的活性。在500mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液中加入50mM15NH2OH(购自剑桥同位素实验室)和100mM连二亚硫酸钠(俗称保险粉)，核磁共振光谱图没有变化；接着往上述溶液中加入5μMMtTyrMb，30分钟后，发现15NH2OH在90ppm的吸收峰消失，而在21ppm处产生了一个新的吸收峰，证明羟胺已被还原成了铵根离子(图8，图9)。
为了进一步检测反应速率，我们使用0.5μM肌红蛋白突变体反应不同时间后，加入50μM三羰基氯甘氨酸钌(tricarbonylchloro(glycinato)ruthenium(II)，CORM-3)终止反应，然后通过15N核磁共振光谱测量分析90ppm和21ppm处的化学位移并进行计算，同时以20mM15N-尿素(购自剑桥同位素实验室)作为内标物。结果如图10所示，MtTyrMb可以催化95％的羟胺还原成铵根离子，反应速率为400μM/min(kcat＝800min-1)；TyrMb催化反应的速率仅为MtTyrMb的四分之一，kcat＝200min-1。而MtTyrMb和TyrMb的km值却比较近似，分别为7mM和6mM。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (8)

1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.一种3-甲硫酪氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)3-甲硫酪氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)如SEQIDNO：1所示的正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
3.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述选择密码子是琥珀密码子，并且所述翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
7.一种产生在至少一个所选位置定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供权利要求2所述的3-甲硫酪氨酸翻译系统，该系统包含：
(i)3-甲硫酪氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)如SEQIDNO：1所示的正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述目标蛋白质的翻译期间，3-甲硫酪氨酸氨酰化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及3-甲硫酪氨酸，从而介导3-甲硫酪氨酸定点特异性插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含3-甲硫酪氨酸的所述目标蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述选择密码子是琥珀密码子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105985944B (zh) * 2015-01-29 2019-05-28 中国科学院生物物理研究所 一种细胞内位点特异性共价标记rna的新方法
CN108484754B (zh) * 2018-03-26 2021-02-19 南华大学 一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用
CN111793615B (zh) * 2019-04-07 2023-03-24 宁波酶赛生物工程有限公司 工程化多肽及其在合成酪氨酸或酪氨酸衍生物中的应用
CN113444655B (zh) * 2020-03-26 2023-05-16 吉林中粮生化有限公司 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法
CN116376851A (zh) * 2022-08-25 2023-07-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 氨酰tRNA合酶突变体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101405401A (zh) * 2006-03-16 2009-04-08 斯克利普斯研究院 含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达
CN101511856A (zh) * 2006-09-08 2009-08-19 Ambrx公司 脊椎动物细胞中抑制因子trna的转录

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101405401A (zh) * 2006-03-16 2009-04-08 斯克利普斯研究院 含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达
CN101511856A (zh) * 2006-09-08 2009-08-19 Ambrx公司 脊椎动物细胞中抑制因子trna的转录

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"遗传密码扩充技术在蛋白质研究中的应用进展";刘亚光 等;《中国生化药物杂志》;20111231;第32卷(第4期);第328-331页 *

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