CN108484754B

CN108484754B - 一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用

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Publication number: CN108484754B
Application number: CN201810251841.8A
Authority: CN
Inventors: 林英武; 史振华; 杜可杰
Original assignee: Nanhua University
Current assignee: Nanhua University
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: CN108484754A

Abstract

本发明涉及蛋白质与生物技术领域，尤其涉及一种基于金属离子‑肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用。本发明以肌红蛋白为蛋白质分子设计骨架，在活性中心血红素周围引入谷氨酸，加入Mn^Ⅱ或Co^Ⅱ离子，形成金属离子‑蛋白质复合物，构建具有催化功能的人工金属酶，即一种新型的人工金属水解酶。本发明中的L29E Mb+Mn^II(或Co^II)金属蛋白酶与文献报道的野生型Mb或单独L29E Mb蛋白相比，对DNA具有更好的水解断裂能力，催化效率大大提高，而且催化功能不受空气中O₂的干扰。

Description

一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用

技术领域

本发明涉及蛋白质与生物技术领域，尤其涉及一种肌红蛋白突变体与金属离子复合物作为核酸水解酶的应用。

背景技术

核酸是生物体中最重要的组成物质，是由核苷酸通过磷酸二酯键聚合形成的多核苷酸长链。核酸的切割是通过化学反应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片。人工核酸切割剂的研究是上世纪八十年代发展起来的生物无机化学领域的重要分支，人工核酸切割试剂可作为多种天然核酸酶的模型，也可作为化疗药物用于治疗肿瘤及遗传疾病，还可以作为DNA结构探针用于研究DNA结构及蛋白质与DNA的相互作用等。

在体外重新组合成具有某种新功能或比原DNA序列更为有效的重组DNA分子的过程，涉及到对DNA序列进行切割、修饰和连接等复杂操作。然而在生理和非酶条件下，DNA的磷酸二酯键非常稳定，不易被水解。在过去的几十年，基因工程和蛋白质工程技术的迅猛发展，多核金属配合物用作核酸切割试剂的研究取得了引人注目的进展。据研究，约1/3蛋白质与特定金属离子结合来维持其结构和生物功能，这类蛋白称之为金属蛋白。金属酶的活性部位一般都含有两个或多个协同作用的金属离子，这些金属蛋白的金属中心一般都具有独特的配位方式和配位集合结构，而正是由于配位后的这种特殊的结构和排列，使金属蛋白和金属酶具有特殊的功能和活化中心。天然金属酶的高催化活性，归因于其活性中心金属离子与周边的氨基酸残基的协同作用。因此，模拟天然金属蛋白和金属酶中的多核活性中心结构，能够合成具有降解核酸功能的人工金属水解酶。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种肌红蛋白突变体与金属离子复合物作为核酸水解酶的应用，本发明提供的金属离子-肌红蛋白突变体复合物对DNA有很好的水解断裂能力。

本发明提供的肌红蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的肌红蛋白突变体是在野生型肌红蛋白的氨基酸序列中，第29位氨基酸由L突变为E。实验结果表明，该突变体蛋白结合金属离子后，能快速催化水解DNA分子的基本单元核苷酸中的3′,5′-磷酸二酯键，其水解效率受温度、反应时间的影响。实验结果表明，Mn^II(或Co^II)-L29E Mb复合物，通过水解机制将双链DNA断裂成线状和开环缺口状态，具有类似于天然核酸内切酶性质。而且，这一催化活性远远高于野生型Mb或单独L29E Mb蛋白。

本发明提供的肌红蛋白突变体在制备裂解核酸的制剂中的应用。

本发明提供的肌红蛋白突变体与金属离子复合物在制备裂解核酸的制剂中的应用。

本发明中，所述核酸为DNA。

本发明提供了一种裂解核酸的制剂，包括SEQ ID NO:1所述的肌红蛋白突变体和金属离子，所述金属离子为Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Mn²⁺。

本发明中，肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。

一些具体实施例中，肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:2。

本发明中，肌红蛋白突变体的终浓度为10μmol/L，金属离子的终浓度为5～20μmol/L。

一些具体实施例中，金属离子的终浓度为20μmol/L。

本发明还提供了一种裂解核酸的方法，将核酸溶液与本发明提供的裂解核酸的制剂混合，20～40℃反应10～40min。

本发明中，所述的温度为20～40℃。

一些具体实施例中，温度为37℃。

本发明中，所述的反应时间为10～40min。

一些具体实施例中，反应时间为30min。

本发明中，核酸溶液中核酸的浓度为0.01μg/μL。

本发明中，核酸溶液与所述制剂的体积比为1:1。

本发明以肌红蛋白为蛋白质分子设计骨架，在活性中心血红素周围引入谷氨酸，加入Mn^Ⅱ或Co^Ⅱ离子，形成金属离子-蛋白质复合物，构建具有催化功能的人工金属酶，即一种新型的人工金属蛋白水解酶。本发明中的L29E Mb+Mn^II(或Co^II)金属蛋白酶与文献报道的野生型Mb或单独L29E Mb蛋白相比，对DNA具有更好的水解断裂能力，催化效率大大提高，而且催化功能不受空气中O₂的干扰。

附图说明

图1示Mn^II滴定各蛋白的ITC数据:WT Mb(A)，L29E Mb(B)；

图2示Co^II滴定各蛋白的ITC数据:WT Mb(A)，L29E Mb(B)；

图3示L29E Mb与不同金属离子结合水解断裂DNA，lane 1:DNA；lane 2:L29E Mb+Zn²⁺(1:2)；lane 3:L29E Mb+Cu²⁺(1:2)；lane 4:L29E Mb+Ni²⁺(1:2)；lane 5:L29E Mb+Co²⁺(1:2)；lane 6:L29E Mb+Mn²⁺(1:2)；

图4示L29E Mb+Mn²⁺水解断裂DNA，lane 1:DNA；lane 2:L29E Mb lane 3:L29E Mb+Mn²⁺(1:0.5)；lane 4:L29E Mb+Mn²⁺(1:1)；lane 5:L29E Mb+Mn²⁺(1:1.5)；lane 6:L29E Mb+Mn²⁺(1:2)；lane 7:Mn²⁺(20μM)；

图5示L29E Mb+Mn²⁺(1:2)随时间变化水解断裂DNA；

图6示L29E Mb+Mn²⁺(1:2)隔绝氧气条件下随时间变化水解断裂DNA；

图7示L29E Mb+Co²⁺(1:2)随时间变化水解断裂DNA；

图8示L29E Mb+Co²⁺(1:2)隔绝氧气条件下随时间变化水解断裂DNA；

图9示WT Mb+Mn²⁺(1:2)随时间变化水解断裂DNA；

图10示WT Mb+Mn²⁺(1:2)隔绝氧气条件下随时间变化水解断裂DNA；

图11示WT Mb+Co²⁺(1:2)随时间变化水解断裂DNA；

图12示WT Mb+Co²⁺(1:2)隔绝氧气条件下随时间变化水解断裂DNA；

图13示DNA水解片段重连细菌转化实验：(a)感受态细胞XL-10Gold转化于氨苄培养皿,(b)pUC19DNA转化于氨苄培养皿,(c)L29E Mb+Mn²⁺(1:2)断裂后DNA的产物不加T4连接酶转化于氨苄培养皿,以及(d)加T4连接酶转化于氨苄培养皿。

具体实施方式

本发明提供了一种肌红蛋白突变体与金属离子复合物作为核酸水解酶的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

基于基因工程和蛋白质工程，运用定点突变技术，在肌红蛋白血红素空腔29位引入谷氨酸，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并通过离子交换、柱层析等方法，进行蛋白质分离纯化，获得L29E Mb突变体蛋白。

实施例2

配制20μM的WT Mb(野生型肌红蛋白)、L29E Mb。配制600μM的MnCl₂、CoCl₂水溶液。

Mn^II滴定WT Mb及L29E Mb ITC测试，如图1。

Co^II滴定WT Mb及L29E Mb ITC测试，如图2。

实施例3

配制200μM的L29E Mb。

配制400μM的ZnCl₂、CuCl₂、NiCl₂、CoCl₂、MnCl₂水溶液。

移取上述的L29E Mb分别与不同金属离子溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液与DNA(0.01μg/μL)混匀后置于37℃恒温水浴槽中，反应体系终体积保持在10μL。反应40min后，向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图3。结果显示，当L29E Mb与Mn^II或Co^II离子摩尔当量为1:2时，断裂DNA效果最好。

实施例4

配制200μM的L29E Mb。

配制100μM、200μM、300μM、400μM的MnCl₂水溶液。

移取上述的L29E Mb分别与不同浓度的MnCl₂溶液等体积混合(摩尔当量分别为：1:0.5、1:1、1:1.5、1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液与DNA(0.01μg/μL)混匀后置于37℃恒温水浴槽中，反应体系终体积保持在10μL。反应10min后，向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图4。结果显示，当L29E Mb与Mn^II离子摩尔当量为1:2时，断裂DNA效果最好。

实施例5

配制200μM的L29E Mb。配制400μM的MnCl₂水溶液。

分别移取上述的L29E Mb和MnCl₂溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液5份分别与DNA(0.01μg/μL)混匀后置于37℃恒温水浴槽中，各终体积保持在10μL。反应时间分别为10、20、30、40min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图5。结果显示，L29E Mb与Mn^II离子摩尔当量为1:2，反应时间为30min时，DNA已基本断裂完全。

实施例6

配制200μM的L29E Mb。配制400μM的MnCl₂水溶液。

分别移取上述的L29E Mb和MnCl₂溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液5份分别与DNA(0.01μg/μL)混匀后充入氮气，置于37℃恒温水浴槽中，各终体积保持在10μL。反应时间分别为10、20、30、40min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图6。结果显示，L29EMb与Mn^II离子摩尔当量为1:2，隔绝氧气，反应时间为30min时，DNA已基本断裂完全，与实施例5结果基本相同。

实施例7

配制200μM的L29E Mb。配制400μM的CoCl₂水溶液。

分别移取上述的L29E Mb和CoCl₂溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液5份分别与DNA(0.01μg/μL)混匀后置于37℃恒温水浴槽中，各终体积保持在10μL。反应时间分别为10、20、30、40min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图7。结果显示，L29E Mb与Co^II离子摩尔当量为1:2，反应时间为30min时，DNA已有部分降解。

实施例8

配制200μM的L29E Mb。配制400μM的CoCl₂水溶液。

分别移取上述的L29E Mb和CoCl₂溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液5份分别与DNA(0.01μg/μL)混匀后充入氮气，置于37℃恒温水浴槽中，各终体积保持在10μL。反应时间分别为10、20、30、40min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×TAE电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75V恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于EB溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图8。结果显示，L29EMb与Co^II离子摩尔当量为1:2，隔绝氧气，反应时间为30min时，DNA已基本断裂完全。

实施例9

配制200μM的WT Mb。配制400μM的MnCl₂水溶液。

实验步骤如实施例5，实验结果如图9。结果显示，WT Mb与Mn^II离子摩尔当量为1:2，反应时间为40min时，DNA几乎没有断裂。

实施例10

配制200μM的WT Mb。配制400μM的MnCl₂水溶液。

实验步骤如实施例6，实验结果如图10。结果显示，WT Mb与Mn^II离子摩尔当量为1:2，隔绝氧气，反应时间为40min时，DNA几乎没有断裂。

实施例11

配制200μM的WT Mb。配制400μM的CoCl₂水溶液。

实验步骤如实施例7，实验结果如图11。结果显示，WT Mb与Co^II离子摩尔当量为1:2，反应时间为40min时，DNA几乎没有断裂。

实施例12

配制200μM的WT Mb。配制400μM的CoCl₂水溶液。

实验步骤如实施例8，实验结果如图12。结果显示，WT Mb与Co^II离子摩尔当量为1:2，隔绝氧气，反应时间为40min时，DNA几乎没有断裂。

实施例13

将蛋白与DNA培育一定时间后的产物进行电泳凝胶实验。在紫外灯下，切下含有开环缺口和线状DNA片段的凝胶，并用胶回收试剂盒回收片段。分离提取出的DNA片段用于下一步T4连接酶连接实验，未进行处理的超螺旋DNA分子分别进行对照。回收后的DNA片段用T4连接酶于16℃连接18h。重连实验结束后，DNA用于质粒转化。将DNA质粒转化到XL-10Gold感受态细菌中，37℃恒温培养箱中培育10h，并显影成像，如图13。结果显示，该人工金属水解酶断裂后DNA的产物，能在T4连接酶作用下，重新连接成质粒DNA分子。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> 一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用

<130> MP1803865

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Ser Glu Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu His Val Trp Ala Lys

1 5 10 15

Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Asp Ile Glu Ile Arg Leu

20 25 30

Phe Lys Ser His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Arg Phe Lys His

35 40 45

Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys His

50 55 60

Gly Val Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Ala Ile Leu Lys Lys Lys Gly

65 70 75 80

His His Glu Ala Glu Leu Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr Lys

85 90 95

His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile

100 105 110

His Val Leu His Ser Arg His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln

115 120 125

Gly Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Lys Asp Ile Ala Ala

130 135 140

Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Tyr Gln Gly

145 150

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肌红蛋白突变体与金属离子复合物在制备裂解核酸的制剂中的应用，所述金属离子为Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Mn²⁺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种裂解核酸的制剂，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肌红蛋白突变体和金属离子，所述金属离子为Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Mn²⁺。

4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。

5.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肌红蛋白突变体的终浓度为10μmol/L，金属离子的终浓度为5～20μmol/L。

6.一种裂解核酸的方法，其特征在于，将核酸溶液与权利要求3～5任一项所述的制剂混合，20～40℃反应10～40min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应温度为37℃，反应时间为30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸溶液中核酸的浓度为0.01μg/μL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸溶液与所述制剂的体积比为1:1。