JPH02117386A - 変異型ヒトリゾチーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術による変異型ヒトリゾチー
ムの製造に関するものである。さらに詳しくは、本発明
は、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒトリゾチーム
ともいう）のアミノ酸配列の第１１０位のバリンがアス
パラギンで置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコー
ドしている変異ヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を真核
性宿主内で発現させるための発現ベクター、該発現ベク
ターで形質転換された真核性宿主細胞、該形質転換体を
用いてヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を製造す
る方法、並びにこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームに関するものである。

従来技術および発明が解決すべき課題 リゾチームはヒトをも含めた動物の各種組織、分泌液、
卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見出されて
いる酵素であって、細菌細胞壁のペプチドグリカンに作
用してＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサ
ミンのβ−１，４−結合を加水分解することにより溶菌
作用を現す。

この溶菌作用により生成される少糖を同定することによ
って、細胞壁の化学構造に関する手懸かりが得られるの
で、リゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様
々な研究分野において有用な酵素である。リゾチームは
ニワトリの卵白から比較的容易に高純度で単離されるた
め、ニワトリリゾチームが様々な分野で利用されている
。例えば、食品保存の目的で、チーズ、ソーセージ、水
産食品などに添加されたり、牛乳のヒト母乳化の目的で
使用されている他、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活
性などの薬理活性を有することも知られており、消炎酵
素剤として市販されている。

しかしながら、上記のニワトリ卵白由来のりゾチームを
含有する物質には不都合な点もあることが指摘されてい
る。特に医薬として用いると、異種タンパクに対する免
疫応答によると思われる発疹、発赤などの過敏症状がし
ばしば、副作用として発現する。従って、ヒトを対象と
する医薬の場合には、ヒト起源のりゾチームを使用する
ことが好ましく、ヒトリゾチームの安定した供給が待た
れている。また、リゾチームの生理学的作用に関する研
究を押し進めるためにも、ヒトリゾチームの大量供給が
必要である。

しかしながら、ヒトの人乳や涙液から単離、精製し得る
ヒトリゾチームの獄は僅かである。従って、上記の治療
、あるいは生体内機能に関する研究推進のためにも、遺
伝子組換え技術を利用したヒトリゾチーム製造手段の確
立が強く望まれている。

このような状況の下、遺伝子組換え技術を利用してヒト
リゾチームを生産し、安定供給する試みがなされてきた
。ヒトリゾチームタンパク質は１３０個のアミノ酸から
なり、その配列は公知である［日本生化学会編：生化学
データブック巻１．　１８９頁（１９７９）］。このア
ミノ酸配列に基いて、ヒトリゾチームをコードするＤＮ
Ａが化学合成されている［１　ｋｅｈａｒａ、　Ｍ、ら
、ケミカル・アンド・ファーマシコーティカル・プリテ
ン（Ｃｈｅｍ、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、）３４．
２２０２（１９８６）］。従って、この公知のＤＮＡ塩
基配列を利用してヒトリゾチーム発現ベクターを構築し
、適当な宿主に導入して得られた形質転換体を培養する
ことにより、大量にヒトリゾチームを得ることができる
と考えられる。例えば、ムラ牛（Ｍｕｒａｋｉ）らは大
腸菌を宿主としてヒトリゾチームの直接発現を試みた［
Ｍｕｒａｋｉ、Ｍ、ら、アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、）５０．７１３（１９８６）］。しかし
ながら、直接発現ではヒトリゾチーム活性を有するタン
パク質を得ることができなかった。ジガミらは、酵母を
宿主とする分泌系発現で、活性のあるヒトリゾチームを
得た［　Ｊ　ｉｇａｍｉ、　Ｙ　、　　ら、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）４３−１２７３（１９８６）］が、生産量（菌
体内外の総和）が少ない上、生産量中に占める分泌量の
比率は５５〜６５％程度であって、十分なものではなか
った。

本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
のシグナルペプチドに修飾を施し、形質転換された酵母
宿主内で発現された該タンパク質を効率よ（分泌させる
リーダー配列を得た（特願昭６２−０６９７６４号およ
び特願昭６２−６９７６５号）。

一方では、本発明者らは、天然型ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列に修飾を施し、活性の高い変異型ヒトリゾチー
ムを得ることを目的として研究を重ね、第７７位と第９
５位のシスティンをアラニンで置き換えることにより、
分泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチ
ームを得ることに成功したく特願昭６２−２４５２８４
号）。

さらに、本発明者らは、より高活性の変異型ヒトリゾチ
ームを安定して得るために継続して検討を重ねてきたが
、その過程において、１１０位のバリンが酵素活性に及
ぼす影響に着目するに至った。即ち、１１０位バリンを
他のアミノ酸に変えると、基質との結合の強さを変化さ
せずに、比活性のみを変化させ得るということを予測さ
せる実験データーを得た。この結果に基き、１１０位バ
リンを様々なアミノ酸置換し、酵素活性に及ぼす影響を
調べた。アミノ酸の置換による酵素活性の変化は、例え
ば、分子内または分子間結合の変化、タンパク質の２次
または３次構造の変化、基質との相互作用における変化
等、様々な要因が複雑に関与していると考えられる。従
って、どのような効果を有するアミノ酸を選択するかと
いうことが、この種の変異誘発を成功させる上で重要な
課題の１つである。本発明は、目的に適ったアミノ酸を
見出し、それを用いて高活性な変異型ヒトリゾチームを
得ることに成功した結果、完成されたものである。

課題を解決するための手段 即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列
の第１１０位のバリンがアスパラギンで置き換えられて
いるポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム
遺伝子を提供するものである。

また本発明は、変異りゾチーム遺伝子とシグナルペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列とを含有し、真核
生物内で自律的に複製可能な発現ベクターを提供するも
のである。

さらに本発明は、上記発現ベクターで形質転換され、変
異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る形質転換体、
並びに、該形質転換体を培養し、培養液中に分泌された
ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、所望
により精製することからなる変異型ヒトリゾチームの製
造方法、およびこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製、該遺伝子を
含有する発現ベクターの構築、該発現ベクターによる宿
主細胞の形質転換、および得られた形質転換体を用いる
変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本出願人の出願に
係る特願昭６２−２４５２８４号および特願昭６３−２
２６８７３号に開示した方法に準じて行われた。

即ち、第１図に示すように、天然のヒトリゾチームのア
ミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知
のプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨシムラ（Ｋ　、　Ｙ　
ｏｓｈ　ｉｍｕｒａ）バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　
）↓４５、？！２（１９８７）］から、シグナルペプチ
ドの上流にのみＸｈ。

ｌ認識部位を有するプラスミドｐＥＲ＋　　８６０２を
得る。

次いで、プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２から、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌクレ
オチド配列を含んだＸｈｏｌ−８ｍａｌ断片を切り出し
、これを、Ｍ１３ｅｐｌ　８ＲＦ［Ｍ１３ｍｐファージ
ＤＮＡの複製型（ＲＦ）］にＸｈｏｌ認識部位を挿入し
たファージＤＮＡの大きい方のＸｈｏｌ−３ｍａｌ断片
と連結（ライゲーション）することにより、シグナルペ
プチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖ファ
ージＤＮＡである１、ＶＩ　ｌ　３ＩＩＩｐｌ　８Ｘｈ
Ｌ　ＺＭを得る（第２図参照）。

このＭ１３＋ａｐｌ　８ＸｈＬＺＭのＥｃｏＲＩ　−Ｘ
ｈｏｌ断片を、ｐＢＲ３２２ＸのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ
断片とライゲージ＝７しテｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ
（ＢＣ）を構築する。ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）
の構築模式図を第３図に示す。

一方、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列のｍｌｌｏ
位のバリ゛ンがアスパラギンで置換されたアミノ酸配列
部分をコードしている２本鎖合成オＪ−ｆマーを合成し
、該合成オリゴマーを、ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ
）のＢａｍＨ１−Ｃ１ａｌ断片とライデー’／ｑ７して
ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｓｎ１１０）を得る。ｐＢ
　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ（Ａｓｎ口’）の構築模式図を
第４図に示す。

このＤＮＡからシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチー
ムをコードしているＸｈｏｌ　−５ｍａｌ断片を切り出
し、上記プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の９．５ｋｂ
　Ｘｈｏｌ−Ｓｆｆｌａ＋断片とライゲーションし、’
１１７４　型ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミド
ｐＥＲＩ８８６６を構築する。プラスミドｐＥ’Ｒ１　
８８６６の構築模式図、並びに制限酵素切断地図を第５
図に示す。

以上に概説した一連の操作における個々の操作は当業者
によく知られている。例えば、ＤＮＡのクローニング等
における大腸菌の形質転換は、シーエン（Ｃｏｈｅｎ）
らの方法［Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ　、Ｎ　、ら、プロシージ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ）昼旦、２１１０（１９７２）］によって行うことが
できる。大腸菌宿主としてはＥ、ｃｏｌｉ２９４、Ｅ、
ｃｏｌｉＤＨｌ　、　Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅ、ｃ
ｏｌｉＣ６００などを用いることができる。

また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプラ
スミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽出法［Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，およびＤｏｌｙ、　Ｊ　＝、ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、　）７．１５１３（１９７９）］等を利
用することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを適当
な制限酵素で処理することによって、挿入された該遺伝
子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あるい
はポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離する
。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば［モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）（１９８２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＪに詳しく記
載されている。

ＤＮＡの化学合成は、たとえばＣｒｅａらの方法［Ｃｒ
ｅａ、Ｒ，ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）７５．７６５（
１９７８）］などに従って行うことができる。

さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特異的に変異を起こさ
せるためには、市販のキット（例えばアマ−ジャム社製
キットなど）が用いられ、その配列の確認には、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｓ　ａｎｇｅｒ、　Ｆ
　、ら、プロシージング・オブ・ザ・す／ヨナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　
Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ、　７４．５４
６３（１９７７）］が用いられる。

本発明の発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製
可能な発現ベクター群の内から選択されたベクターのプ
ロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードしてい
る遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入
することにより組立てられる。本明細書では、ＧＬＤプ
ロモーターを用い、天然型ヒトリゾチームをコードして
いる発現プラスミドｐＥＲｒ　　８６０２を使用して本
発明の発現プラスミドの構築例を示したか、その他、プ
ラスミドｐＰＨＯ１７、ｐｃＤ　Ｘ　［Ｏｋａｙａｍａ
、　Ｈ、およびＢｅｒｇ、Ｐ、、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　
Ｂ　ｉｏｌ、　）　３．２８０（１９８３）］、ｐＫｓ
Ｖ−１ｏ（ファルマシア社製）なども利用し得る。

酵母宿主の場合には、プロモーターとして、たとえばＰ
Ｈ０５プロモーター、ＧＬＤプロモーター、ＰＧＫプロ
モーター、ＡＤＨプロモーターＰＨ０８１プロモーター
、ＧＡＬＩプロモーターＧＡＬＩＯプロモーターなどが
、動物細胞宿主を用いた場合には、プロモーターとして
、たとえば５Ｖ４Ｑ初期遺伝子プロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒートショックプロモーターな
どがそれぞれ利用できる。なお発現にエンハンサ−の利
用も効果的である。

本発明のプラスミドｐＥＲ１８８６６は、酵母宿主内で
変異型ヒトリゾチームを発現させ、分１必させるのに好
適である。とくに好ましい宿主はサツカロマイセス０セ
レビンエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏＩＩｌｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ−である。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を、動物細胞用ベク
ターに挿入することにより、マウスＬ細胞、チャイニー
ズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、さらには他の真核細
胞を宿主として用い得る。

真核細胞の形質転換方法は当業者既知であり、例えば酵
母の形質転換は、ヒネン（Ｈ１ｎｎｅｎ）らの方法［プ
ロシージンゲス・オブ・ザ・す／−１ナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ　１．　
Ａ　ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５．１９２７（１９７
８）］により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋白質
・核酸・酵素・２８巻、１９８３年、“組み換え遺伝子
の細胞への導入と発現°゛（共立出版）ｊ記載の方法で
行うことができる。

形質転換体の培養も、当業者既知の方法のいずれを用い
ても行うことができる。

酵母を使用する場合、培地としては、例えばパークホル
ダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［ボスチャン
（Ｂｏ−ｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、）ら、プロシージン
ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンスＵＳＡ、７ヱ、４５０５（１９８０）］が挙げら
れる。

培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２４°Ｃ〜３７
℃で１０〜１４４時間、好ましくは２４〜９６時間行い
、必要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。

動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体を
使用する場合には、培地として例えばイーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）のＭ　Ｅ　Ｍ［Ｈ，Ｅ　ａｇｌｅ、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）上３０．４３２（１９５９）コ、ダル
ベツコ（Ｄ　ｕ　１ｂｅｃｃｏ）の改良イーグル培地（
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭｅｄｉｕＩ６）
［Ｏｒｇａｄ　ＬａｕｂおよびＷｉｌｌｉａｍＪ　、　
Ｒｕｔｔｅｒ、ジャーナル・オブ・、バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２旦旦、６
０４３（１９８３）］などが挙げられる。培養は通常３
０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３７°Ｃで約ｌ〜ｌＯ
日間行う。

培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離す
る。本発明の発現ベクターによれば、生成した変異型ヒ
トリゾチームは効率良く分泌されるので、上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。

さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デオキシシー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱
、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー（夏（ＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などに
従って精製することができる。

このようにして得られた形質転換体培養物から分離した
培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを精製単離し、
その活性を後述のアッセイ法で測定し、比活性を求めた
ところ、天然型のヒトリゾチームをコードしている発現
ベクターを用いて調製された形質転換体の場合と比較す
ると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質転換体は、従
来のものよりも高い比活性を有するタンパク質を生産す
ることが分かった。

即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発現
ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を
適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を単離し、所望により常法にしたが
って精製することにより、容易かつ簡便に一定した、高
活性の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質（変異
型ヒトリゾチーム）を得ることができる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味
においても、本発明を制限するものではない。

実施例１　　クローニングベクターｐＢＲ３２２Ｘの構
築 大腸菌ベクターｐＢＲ３２２（５μｇ）に制限酵素Ｂａ
１ｌ’（１，５ユニツト）を加え、４０ｕＱの反応液Ｎ
　Ｏａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍ
ＭＭｇＣ＋、、１ｍＭジチオスレイトール］中で３７℃
、５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出し、次
いで、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡにリ
ン酸化したＸｈｏｒリンカ−ｄ［ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ］
［ニュー・イングランド・バイオラホ（ＮＥＢ）社製］
５０ｎｇを加え、常法に従ってＴ４ＤＮリガーゼで両者
を結合させた。

この反応液で大腸１ＤＨＩ株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性コロニーから、
アルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、Ｂａ１ｒ認識部
位がＸ　ｈｏ　Ｉ認識部位に変換されたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２Ｘを得た。

実施例２　プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２（７）構’
Ｊｉ）１．６ｋｂ、８．３ｋｂ断片の調製ＢａｍＨ１用
緩衝液Ｃ６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ（ｐＨ７９）、１
５’ＯｍＭ　Ｎ　ａＣＩ、６　ｍＭ　ＭｇＣｌ＊］　ｌ
　ＯＯμｇ中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含
有しているプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨシムラ（Ｋ　
、　Ｙ　ｏｓｈｉａｕｒａ）前掲］４８．５μｇに６０
ＵのＢａａＨｌ（ベーリンガーマンハイム山之内製）を
加えて３７℃で２時間反応させたのち、常法通り、冷エ
タノールを加えてＤＮＡを集めた。このＤＮＡを、上記
ＢａｍＨＩ用緩衝液（１００μ１２）中で４０ＵのＸｈ
ｏｌ（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて３７℃
で１５分間部分消化したのち、６０℃で１５分間加熱し
て反応を停止させた。この反応液を０．７％アガロース
電気泳動にかけ、１．６ｋｂ断片を含むゲルを切り取り
、電気泳動溶出によってゲルから抽出した。

同様の方法で４８．５μｇのｐＧＥＬ１２５を６００の
Ｂａａ＋ＨＩで消化し、常法に従ってエタノールでＤＮ
Ａを沈澱させた。このＤＮＡにＢａｍＨ１用緩衝液中で
８０ＵのＸｈｏｌを３７°Ｃで２時間作用させたのち、
前記１．６ｋｂ断片と全（同様の方法で、プラスミドｐ
ＧＥＬ１２５からプロモーター、シグナル配列、および
ヒトリゾチームコード領域が除去された８、３ｋｂのＢ
ａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を調製した。

１ｉ）Ｓｅａｌ認識配列を含む合成オリゴマーの調製ｐ
ＧＥＬ１２５のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のＸ
ｈｏｌ切断部位をＳｍａＩ切断部位に変換するために、
常法に従い、”　Ｔ　ＣＧΔＣＣＣＧＧＧ’。

を合成した。

１ｉｉ）　　１．６ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｉ
）で得た合成オリゴマー（１００ｎｇ）と１　、６　ｋ
ｂ断片（２μｇ）を２０μｇのライゲーション用緩衝液
［５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、１０
ｍＭＭｇＣｌ、、２０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、１ｍＭＡＴＰ］に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ＮＥＢ製）８００Ｕを加えて１４°Ｃで一夜反応させ、
ＤＮＡを結合させた。常法に従い、エタノールを加えて
ＤＮＡを集めたのち、１００μＱのＢａｗｌ（Ｉ用緩衝
液に溶かし、３６ＵのＢａｍＨＩを加えて３７℃で１時
間反応させ、同様にエタノールを加えてＤＮＡを集めた
。次にこのＤＮＡを５０μＱのＳ　ｍａ　Ｉ用緩衝液［
２０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８
，０）、　　１　０　ＩＩＩＭ　　　ＭｇＣＩｔ、　　
１ｍＭＤＴＴＩに溶かし、２１ｔＪの５ｅａｌ（宝酒造
製）を加えて３０°Ｃで１時間反応させた。これを０．
７％アガロース電気泳動にかけ、常法通り所望の部分を
切り出し、電気泳動溶出によって１．６ｋｂのＢａｍ１
ｌ　Ｉ　−３ｅａｌ断片を得た。

ＩＶ）８．３ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｉｉｉ　
）と全く同様にして、１μｇの８．３ｋｂ断片と１１０
０ｎの合成オリコマ−とを連結したのち、同様にＢａｍ
ＨＩ、およびＳ　ｍａ　Ｉで処理して電気泳動にかけ８
．３ｋｂのＢａｍＨＩ　−３ｅａｌ断片を得た。

ｖ）　　１．６ｋｂＢａｍ）Ｉ　Ｉ　−３ｅａｌ断片と
８．３ｋｂＢａｍＨ１−３ｅａｌ断片との連結 ｉｖ）で得た８、３ｋｂ断片（１２０ｎｇ）とＬ６ｋｂ
断片（３６０ｎｇ）を１００μＱのライゲーション用緩
衝液（（山）に同じ）中で８００ＵのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（Ｎ　Ｅ　Ｂ製）を加えて１４°Ｃ−夜反応させた。

その１１５ｍを用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを形質転換
し、プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を得た。

プラスミドｐＧＥＬ１２５およびプラスミドｐＥＲ１８
６０２の制限酵素切断地図およびプラスミドｐＥＲ１８
６０２の構築模式図を第１図に示す。

実施例３　　Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭの構築ｉ）ヒト
リゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｌ　−３ｅａｌ断片の調
製 実施例２で調製したプラスミドｐＥＲＩ　　８６０２　
１１００ｎを実施例２記載の方法に従ってＸｈ。

１．５ＩＩＩａｌで切断し、シグナル配列コード領域お
よびヒトリゾチーム遺伝子を含むＸ　ｈｏ　Ｓ　　Ｓ　
ｍａ　１断片を調製した。

ｉｉ）Ｍ１３ＩＩｌｐ１８へのＸｈｏｌ制限部位の導入
Ｍ１３ｍｐ１８の複製型（ＲＦＸ宝洒造製）２．４μ区
を３０μＱのＨｉｎｄｌｕ用緩衝液［５０ａＭ　ＮａＣ
Ｌ、１０ＩＩ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ７，５）
、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ３．１ｍＭＤＴＴ］中で２７Ｕ
のＨｉｎｄｕ（ベーリンガーマンハイム山之内製）と３
７°Ｃで２時間反応させたのち、常法通り冷エタノール
を加えてＤＮＡを沈澱させた。

一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー”ＴＣＧ
ＡＧＧＣＣＡ”（１００ｎｇ）および”ＡＧＣＴＴＧＧ
ＣＣ（ｌ　ＯＯｎｇ）をＡＴＰを含まないライゲーショ
ン用緩衝液（前出）２０μσ中で８０°Ｃ１５分処理し
たのち、室温まで徐々に冷却して二本鎖とした。この反
応液に上で得たＢｉｎｄｎｌ処理したＭ１３ＩＩｌｐ１
８ＲＦ５００ｎｇとＡＴＰを１ｍＭとなるように加え、
１４℃で一夜反応させた。次にこのｌ／ｌｏ量をＥ、ｃ
ｏｌｉＴＧ　ｌに感染させ、常法に従いＸ　ｈｏ　ｌ切
断部位をもったＭ１３ｍｐ１８ＲＦを得た。この５μｇ
を実施例２、ｉｉｉ　）記載の方法でＸｈｏｌｔ６よび
Ｓ　ｍａ　Ｉで処理し、エタノールで沈澱させた。

ｉｉｉ）Ｍｌ：３ｎｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築）で調製
したＸｈｏｌ−８ｍａｌ断片３００　ｎｇと１）で調製
したＭ１３ｎ＋ｐ１８を含む大きいＸｈｏｌＳ　ｍａ　
Ｉ断片１１００ｎとを５０ｕＱのライゲーション用緩衝
液（前出）中４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーセ（ＮＥＢ製
）と１４°Ｃで一夜反応させ、その１１５ｍをＥ、ｃｏ
ｌｉＴＧ　ｌに感染させ、Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭＲ
Ｆを得た。

Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭの構築模式図を第２図に示す
。

実施例４　ヒトリゾチーム遺伝子へのＢａｍＨ［および
Ｃ１ａｌ認識部位の造成 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の１１０位バリン
を他のアミノ酸に変換するために、オリゴヌクレオチド
−デイレクチイツト、インビトロ、ムタゲネシスシステ
ム（アマ−ジャム社製キット）を用い、カセット式変異
法で、上記１１０位バリンをコードするコドンの両側に
ＢａｍＨｌおよびＣ１ａｌ認識部位を造成した。

）ＢａｍＨＩ認識部位およびＣ１ａｌ認識部位造成のた
めのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリゴマー（５０マー）を合成した。

（Ｔ）　　　（Ｔ）（Ａ） ＧＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡ（ＣＸＡ） ×は変更後の塩基を、（）内は本来の塩基を示す。

また、下線は、５°側から順番に、新たに造成されたＢ
ａｍＨＩ認識部位およびＣ１ａｌ認識部位を示す。なお
、この変換でもコードするアミノ酸の種類はもとのまま
である。

上線で示したＧＴＣコドンは、１１０位バリンをコード
している。

）アニーリングおよびライゲーション 実施例３で得たＭｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの単鎖Ｄ
ＮＡｌ０μ９を含む溶液（５μＱ）、５′をリン酸化し
たオリゴマー（〜１　、６　ｐｍｏｔ／　ｉｔ　Ｑ）　
（５ｕの、緩衝液１（７μｍりおよび水（１７μのを混
合し、８０°Ｃで３分間処理したのち、室温で３０分間
放置した。この反応液にＭｇＣｔＪ（１０μＱ）、ヌク
レオチド混液１（３８，ｃｌ）、水（１０μ＆）、クレ
ノーフラグメント（１２Ｌ））、Ｔ４ＤＮΔリガーゼ（
１２Ｕ）を加え、１４℃で一夜反応させた。反応液をニ
トロセルロースフィルターで濾過し、未反応の単鎖ＤＮ
Ａを除去したのち、常法に従いエタノールでＤＮＡを沈
澱させ、５０μＱの緩衝液２に溶解した。

山）変異ＤＮＡを含むプラスミドによる大腸菌の形質転
換 ｉｉ）で得たＤＮＡ溶液５０μＱの内ｌＯμＱに、６５
ｕＱの緩衝液３と５ＵのＮａ１ｌを加え３７°Ｃで９０
分間反応させて変異していないＤＮＡに二。

りを入れた。反応後さらに５００ｍＭ　ＮａＣｌ（１２
ｕＱ）、緩衝液４（１０ｚｉ）、エキソヌクレアーゼ［
［［（５０Ｕ）（２μＱ）を加えて、３７°Ｃで３０分
間反応させ、ニックを入れたＤＮＡを消化した。

次に７０°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた。冷
却後、ヌクレオチド混液２（１３μＱ）、ＭｇＣ１，液
（５μＱ）、ＤＮＡポリメラーゼ１（３Ｕ）、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（２Ｕ）を加えて１４℃で４時間反応させた
。この反応液２０μＱを用い、Ｅ　、　ｃ。

＋１ＴＧｌを形質転換した。

ｉｖ）変異ＤＮＡの調製と変異の確認 ｉｉｉ　）で得た形質転換体をＹＴ寒天培地（バタトト
リブト７８ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、　ＮａＣ４５ｇ
、寒天１５ｇ１水１（２）にまき、プラークを生じさせ
た。プラークを採取し、Ｅ、ｃｏｌｉＴＧ　１に感染さ
せ、これをＹＴ培地で３７℃において一夜、液体培養し
、培養上清を集めた。この上清１１１Ｉ２にＰＥＧ／Ｎ
ａＣ１（２０％ポリエチレングリコール６０００．２，
５ＭＮａＣ１）２００１１Ｑを加え、よく混合して１５
分間放置したのち、遠心分離して上清を除去した。沈澱
にＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ｔｌＣＩ、ｌ
＋ｗＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）（１００μＱ）および
、ＴＥ緩衝液飽相フェ／−ル（５０μのを加えてよく攪
拌したのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に
冷エタノールを加えて、単鎖１）　Ｎ　Ａを沈澱させた
。この単離ＤＮＡを鋳型としてジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法によって塩基配列を決定し、目的通り変異
したＤＮＡを数種得た。

実施例５　変異したヒトリゾチーム遺伝子のｐＢＲ３２
２Ｘへの組み込み ）ＥｃｏＲＩ、Ｘ　ｈｏ　ｌ認識部位を末端にもつｐＢ
１犬３２２ｘの調製 実施例１で調製したｐＢＲ３２２Ｘ（３，ｉｚｇ）ｌ：
制限酵素ＥｃｏＲＩ（１５Ｕ）とＸｈｏｌ（１６Ｕ）と
を加Ｌ、Ｅ　ｃｏＲＩ　緩衝Ｍ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）１００μｇ中で３７℃において２時間反応させ
た後、フェノール抽出、エタノール沈殿に付し、ＤＮＡ
混合物を得た。

得られたＤＮＡ混合物を１．０％アガロースゲル電気泳
動にかけて大きい断片を切り出し、電気泳動溶出によっ
てゲルから抽出した。

ｉｉ）Ｍｌ　３ｎｐｌ　８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）からのＢ
ａｍ）（Ｉ。

Ｃ１ａＩ認識部位を有するヒトリゾチーム遺伝子の調製 上記ｉ）と同様にして、制限酵素処理、電気泳動溶出を
行い、実施例３で得たＭ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ
）（２０μｇ）からヒトリゾチーム遺伝子を含むＥｃｏ
ＲＩ　−Ｘｈｏｌ断片を調製した。

ｉｉｉ）ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）（７）調製）
で得たＩ）ＢＲ３２２Ｘの大きい方のＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏｌ断片（２５０ｎｇ）と１１）で得たヒトリゾチーム
遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片（１２０ｎｇ）
とをＴ４リガーゼ（８００Ｕ）の存在下、１４°Ｃで一
夜反応させてライゲート（連結）した。このライゲーシ
ョン混合物を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、プラス
ミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）を得た。プラスミ
ドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築模式図を第３
図に示す。

’Ｊ４Ｍｆｉ＋％Ｉ６　１１０位のアミノ酸がアスパラ
ギンに変換されたヒトリゾチームの遺伝子の調製）Ｖａ
ｌｌｌｏをＡｓｎ”’に変換するためのオリゴマーの合
１戊 常法に従って、以下の２本のオリゴマーを合成した。

（２）　　　　　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＡＣＣＴＴＧ　ＣＧ
Ａ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＣ”ｉｉ）ｐＢＲ３２２
ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）のＢａｍＨＩおよびＣ１ａｌ処理 実施例５で得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣＸＩｏ　
０　ｎｇ）を、Ｃ１ａ［（６０Ｕ）を含んだＴＡ緩衝液
（０’　Ｆ　ａｒｒｃｌｌら、Ｍｏ１ｃｃ、　Ｇ　ｅｎ
、　Ｇ　ｅｎｅｔ、、１７９．４２１−４３５（１９８
０））５００μＱ中、３７°Ｃで３時間反応させた後、
ＤＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡに蒸留水４
４０μＱを加えて溶解させ、ＢａｍＨＩ緩衝液（ベーリ
ンガー社製）５Ｑ　ＢＱ、Ｂａ１ｌＨＩ　ｌ　Ｏμ（２
（９０Ｕ）を加え、３０°Ｃで一夜反応させた。この半
量を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断
片を切り出し、電気泳動溶出してｐＢＲ３２２ＸｈＬＺ
Ｍ（ＢＣ）＋７）大きい断片を得た。

ｉｉｉ　）アニーリングおよびライゲーション）で得た
合成オリゴマー（１）および（２）夫々５００　ｎｇを
用い、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ２μ１２（１４Ｕ）、ｌｏｍ
Ｍ　ＡＴＰ３μ１２．ｔｏｘライゲーション緩衝液（前
出）３μＱを含む３０μσ中で、３７°Ｃにおいて３０
分間反応させた後、６５°Ｃで１５分間加熱して反応を
止めた。

次いで、このようにして得たＤ　Ｎ　Ａ断片１７ｎｇと
ｉｉ）テ得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の大きい
断片５０ｎｇとをタカラ（ＴＡＫＡＲＡ）ライゲーショ
ンキット（宝酒造製）中で１４°Ｃにおいて１時間反応
させ、この半量を使ってＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１を形質転
換した。このようにして得られたプラスミドを大腸菌か
ら抽出ＬｒｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　Ｚ　Ｍ（Ａｓｎ１１
０）と命名した。この変異ヒトリゾチーム遺伝子を常法
通りジブオキシスクレオチド合成鎖停止法でその塩基配
列を決定し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認
した。プラスミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｓｎ”’
）の構築模式図を第４図に示す。

害−鞭桝ユ　プラスミドｐＥＲＩ　　８８６６の構築実
施例６、ｉｉｉ　）で得たｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ
（Ａｓｎ１１０）を大腸菌ＤＨＩから常法に従って調製
した後、実施例２、山）に記載の方法に従ってＸｈｏｌ
およびＳ　Ｉｆｌａ　＋で処理して、シグナル配列のコ
ード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むＸｈｏ［
−３ｍａ　Ｉ断片（ａ）を得た。一方プラスミドｐＥＲ
Ｉ８６０２を同様にＸｈｏｌおよびＳ＋＋ａＩで処理し
たのち、常法通り電気泳動によって９．５ｋｂのＸｈ。

１−３ｍ３１断片（ｂ）を単離した。

次いで、これらのＤＮＡ断片（ａ）および（ｂ）のそれ
ぞれ、Ｌｏｎｇと３０ｎｇを２０ｕＱのライゲーション
用緩衝液中で実施例２、ｉｉｉ　）と同様に反応させて
連結し、この反応混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１を形質
転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含有しているプラスミド数種を得、その一つをｐＥＲ
ｌ　　８８６６と命名した。プラスミドｐＥＲ１８８６
６の構築模式図を第５図に示す。

実施例８　酵母形質転換体の調製 実施例７で得た発現プラスミドｐＥＲ１８８６６を用い
、ヒ不ンらの方法（前出）に従い、Ｓ　セレビシェＡＨ
２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体Ｓ、セレビシェＡＨ
２２Ｒ−／ｐＥＲＩ　　８８６６を得た。この菌株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ　
Ｐ−１０２６０て寄託されている（受託日：昭相６３年
８月３１日）。

実施例９　　Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ’／ｐＥＲ１８
８６６の培養 実施例８で得た形質転換体Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲ＋　　８８６６を、試験管中のハークホルダー
（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）　［アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー（Ａｍｅｒ、　Ｊ　、　Ｂｏｔ、）
３０．２゜６（１９４３）］の改変培地ＩＩ［（１（２
中、ＫＨ，Ｐｏ。

０．４ｇ、グルコース］Ｏｇ、アスパラギン５ｇ、シシ
ークロース８０ｇを含有）５−に接種し、３０℃で７２
時間振盪培養した。得られた培養液１ｍ（２をそれぞれ
上記培地［４ｍ（！を含む試験管へ移し、３０°Ｃて１
日振盪培養した。この培養液２ｍ＆を上記培地ＩＩＩ　
ｌ　８ｍＱを含む２００ｍ＆容三角フラスコに移し、３
０°Ｃで振盪培養し、７２時間後に培養液を採取し、ア
ッセイ用試料の調製に用いた。

実施例１０アッセイ試料の調製 実施例９で得た培養液を遠心分離し、上ｉＲと菌体を分
離した。上清はアッセイに供し、菌体は１゜２Ｍスクロ
ースを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐｔ＋　７　、
０　’）で洗浄した後、ライモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙ
ａｓｅ）［生化学工業（株）裂］を０．５１１９／ｄに
なるように加えた同バッファーに懸濁し、室温で２時間
反応させた。この反応液に４倍量の５０ｎＭリン酸バッ
フｙ　　（ｐＨ７，０）［１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍ
ＭＰＭＳＦを含む］を加え、室温で１時間反応させたの
ち、上清を集めて菌体抽出液とした。

実施例１１　　変異型ヒトリゾチーム産生量の測定実施
例１０で得た上清と菌体抽出液とを変−″シ型ヒトリゾ
チームのアッセイに供した。

ヒトリゾチーム活性の測定は、実質Ｌワーンントン・エ
ンザイム・マニュアル（Ｗｏｒｔｈｉｇｔｏｎ　［ミｎ
ｚｙｍｅ　ＭａｎｕａｌＳｐｌ　ＯＯｌＷｏｒｔｈｉｇ
ｔｏｎ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、　Ｕ　Ｓ　ＡＳｌ　９７２）によった。

標準ヒトリゾチームとしてはングマ（Ｓ　ｉｇｕｍａ）
社製を使用した。ｌ単１前ま、Ｏ，ＩＭリン酸ハ、ファ
ー（ｐＨ６，９）中テマイクロコツカス・ルテウス（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）（生化学工業社
製）を基質として２５°Ｃで１分間反応させ、４５０ｍ
１ｚの吸収をｏ、ｏｏｔ減少させるに必要な酵素獄とし
た。同様の実験を３回行って得たヒトリゾチーム活性で
表した産生量は、以下の表１に示す通りであった。

なお、天然型のヒトリゾチームを産生ずる形質転換体Ｓ
、セレビシェＡ　Ｈ２２Ｒ−／ｐＧ　Ｅ　Ｌ・ＣＬｌｏ
（ＦＦ、ＲＭｐ−９２８５）を対照として同様に培養し
、本発明の形質転換体におけるヒトリッチ−ム活性を有
するタンパク質の産生量と比較した。

結果を表１に示す。

表　１ ヒトリゾチーム ／ｐＥＲＩ　　８８６６ 夫廊男ユニ　分泌された変異型ヒトリゾチームの精製 実施例７で得た形質転換体Ｓ、セレビシェＡｌ１２２Ｒ
−／ｐＥＲＩ　　８８６６を実施例９に示した培地５１
１ＩＱを含む試験管に接種し、３０°Ｃで３日間振盪培
養した。次に、上記培地１８ｍ１２を含ｆ：Ｔする２０
０ｏ＋＆容三角フラスコに、上の培養？＆２ｍＱを移し
、３０°Ｃで１日振盪培養した。次に上記培地２５０ｔ
！を含有するＩＱ容三角フラスコにこの培養ｉ１に２０
　ｍＱを移し、３０°Ｃで３日間培養した。この培養液
を遠心分離機にかけ、上清と菌体を分離した。この上清
（約１１２）を５Ｑｎ＋Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）で平衡化した陽イオン交換樹脂（Ｉ　ｎｄｉ
ｏｎ）カラム（０，７ｃｓＸ　１５ｃｍ）に吸着させ、
同緩衝液３０＋１２で洗浄後、０．５Ｍ　ＮａＣｌ２を
含む同緩衝液で溶出した。溶出液を１ＩＩＩＱずつ分取
し、各フラクションについて実施例１０に従ってリゾチ
ーム活性を測定した。リゾチーム活性が最大となるフラ
クションを取り、これを高速液体クロマトグラフィー（
Ａｓａｈｉｐａｋ５０２　Ｃ）により、さらに精製した
。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む０．６Ｍ硫酸
ナトリウム０−３０％の直線濃度勾配により３０分間溶
出を行い、保持時間２２゜７１３分に現れる２８０ｎｍ
の吸収ピークを分取し、これをＮ１１０とした。この溶
出パターンを第６図に示す。

実施例１２　精製変異型ヒトリゾチームＮ１１０の分析 実施例１１で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒ
トリゾチーム（シグマ社）を標準として［３ＣＡプロテ
インアツセイ試薬（ピアス社）を用いて行った。その結
果、市販の天然型ヒトリゾチームの比活性を１００とし
たとき、変異型ヒトリゾチームの比活性は２１１と高い
ことが分かった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＥＲ１８６０２の構築模式図１．
１１２びにプラスミドｐＧＥＬＩ２５およびプラスミド
ｐＥＲＩ　　８６０２の制限酵素切断地図、第２図はＭ
ｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築模式図、第３図はプ
ラスミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築模式図
、並びに制限酵素切断地図、第４図はプラスミドｐＢＲ
３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｓｎ”’）の構築模式図、並びに
制限酵素切断地図、第５図はプラスミドｐＥＲ１８８６
６の構築模式図、並びに制限酵素切断地図、第６図はＡ
ｓａｈｉｐａｋ５０２ＣによるＮ’　ｌ　ｌ　Ｏの溶出
状態を示すグラフである。 第３図 特許出願人　　株式会社蛋白工学研究所代　理　人　　
弁理士　前出　葆（外２名）第６図 手続補正書動狗 特許庁長官殿　　　　　　　平成　１年　３　Ｊｌ　２
９日発明の名称 変異型ヒト Ｊゾチ−１１ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第１１０位
   のバリンがアスパラギンで置き換えられたポリペプチド
   をコードしている変異ヒトリゾチーム遺伝子。 ２、請求項１に記載の変異ヒトリゾチーム遺伝子と、シ
   グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列とを
   含有し、真核生物内で自律的に複製可能な発現ベクター
   。 ３、プラスミドｐＥＲＩ８８６６である請求項２に記載
   の発現ベクター。 ４、請求項２または３に記載の発現ベクターで形質転換
   されており、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得
   る宿主細胞。 ５、形質転換体サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２
   Ｒ＾−／ｐＥＲＩ８８６６である請求項４に記載の宿主
   細胞。 ６、請求項４または５に記載の形質転換体を培養し、培
   養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパ
   ク質を分離し、所望により精製することからなる変異型
   ヒトリゾチームの製造方法。 ７、請求項６に記載の方法で製造された変異型ヒトリゾ
   チーム。