JP2538541B2 - 変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組み換えＤＮＡ技術に
よる変異型ヒトリゾチームおよびその製造に関するもの
である。さらに詳しくは、天然型ヒトリゾチーム(以
下、単にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の第
７７位および第９５位のシスティンがアラニンで置き換
えられた変異型ヒトリゾチームをコードしている変異ヒ
トリゾチーム遺伝子、およびこの遺伝子を、シグナルペ
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
てなる変異型ヒトリゾチーム発現ベクターに関するもの
である。

【０００２】

【従来技術とその問題点】リゾチームは細菌細胞壁のペ
プチドグルカンに作用してＮ−アセチルムラミン酸とＮ
−アセチルグルコサミンのβ−１,４−結合を加水分解
する酵素である。該酵素を細菌に作用させると溶菌を引
き起こし、その反応生成物である少糖を同定することに
よって細胞壁の化学構造の研究における手懸かりを得る
ことができる。従って、リゾチームは、細菌学、蛋白質
化学、生化学等、様々な研究分野において有用な酵素で
ある。リゾチームは、ヒトをも含めた動物の各種組織、
分泌液、卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見
出されている。

【０００３】卵白からは比較的容易に純度の高いリゾチ
ームが単離できるため、この酵素は食品保存の目的で、
チーズ、ソーセージ、水産食品などに添加されたり、あ
るいはまた、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている
[林 勝哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂(１９７
４)]。リゾチームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗
腫瘍活性などの薬理活性を有することも知られており
(例えば“最近の新薬３４集"１０７頁、薬事日報社、東
京、１９８３)、消炎酵素剤として市販されている。

【０００４】これらニワトリ卵白由来のリゾチームを医
薬目的で使用する場合には、しばしば発疹、発赤などの
過敏症状の現れることがあり、これらは異種蛋白による
免疫応答による副作用であると考えられている。従っ
て、特に医薬用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを
使用することが好ましい。

【０００５】ヒトリゾチームのアミノ酸配列は公知であ
り(図１)、１３０個のアミノ酸からなる[日本生化学会
編:生化学データブック巻１．１８９頁(１９７９)]。ま
たこのアミノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコード
するＤＮＡが化学合成されている[Ｉkehara, Ｍ.ら、ケ
ミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテン
(Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.)３４、２２０２(１９８６)]。

【０００６】ヒトリゾチームの生産については、組み換
えＤＮＡ法を用いてムラキ(Ｍuraki)らが大腸菌での発
現を試みたが、この発現系では活性のあるヒトリゾチー
ムが得られていない[Ｍuraki,Ｍ.ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Ａgric.Ｂ
iol.Ｃhem.)５０、７１３(１９８６)]。一方、酵母を用
いて培地中にリゾチームを分泌させる分泌生産では、活
性のあるヒトリゾチームが得られることが明らかにされ
たが[Ｊigami,Ｙ．ら、ジーン(Ｇene)４３、２７３(１
９８６)]、その生産量(菌体内外の総和)は十分なもので
はなく、かつ、生産量に対する分泌量も５５〜６５％と
十分なものではない。

【０００７】この様に、ヒトリゾチームを効率良く生産
する方法がないことが、ヒトリゾチームの治療その他へ
の適用を困難にしている。その上、ヒトリゾチームに関
しては、生体内での機能等に未解明の部分が多く、研究
の促進が待たれている。これらの目的のためには、充分
な量の一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
が供給されることが必要である。

【０００８】以上から明らかなように、一定したヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を効率よく、大量に得
る方法が得られたならば、医療分野はもとより、該酵素
の生理学的役割の研究等、様々な分野に大いに貢献し得
ると考えられる。

【０００９】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、組み換
えＤＮＡ技術による分泌タンパク質の製造において、生
成したタンパク質を効率よく分泌せしめるリーダー配列
の開発研究に取り組み、その結果、卵白リゾチームのシ
グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列にあ
る種の修飾を施し、得られた改良ヌクレオチド配列をヒ
トリゾチームをコードしているヌクレオチド配列と一緒
に、自律的に複製し得るベクターに挿入し、該ベクター
を用いて酵母内でヒトリゾチームを発現させ、効率良く
分泌させることに成功した(特願昭６２−０６９７６４
号および特願昭６２−６９７６５号)。他方、本発明者
らは、ヒトリゾチームをより効率よく分泌させるため
に、ヒトリゾチームのアミノ酸配列の一部を改変する試
みも行って来た。その結果、天然型ヒトリゾチームのア
ミノ酸配列の第７７位と第９５位のシスティンをアラニ
ンで置き換えた変異型ポリペプチドをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子を調製し、該遺伝子を、シグナ
ルペプチドをコードしているヌクレオチド配列と共に、
適切な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを
酵母宿主に導入し、得られた形質転換体を適当な条件下
で培養すると、培地中に充分なリゾチーム活性を有する
タンパク質が分泌されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

【００１０】即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームの
アミノ酸配列の第７７位および第９５位のシスティンが
アラニンで置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコー
ドしている変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するもので
ある。

【００１１】更に、本発明は、該遺伝子を、シグナルペ
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
ている変異型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するも
のである。

【００１２】また本発明は、上記発現ベクターを用いて
酵母宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、
培養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタン
パク質を分離することからなる変異型ヒトリゾチームの
製造方法、およびこの様にして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。

【００１３】本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子は、後
述の実施例に記載の如く、当業者既知の方法で調製され
た。天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれを
コードしている化学合成したＤＮＡのヌクレオチド配列
を図１に示す。

【００１４】本発明の変異型ヒトリゾチーム発現ベクタ
ー、即ちプラスミドｐＥＲＩ ８７１６の構築における
出発プラスミドとして、天然のヒトリゾチームアミノ酸
配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知のプラ
スミドpＧＥＬ１２５[ヨシムラ(Ｋ.Ｙoshimura)バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション(Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.)１４５、７
１２(１９８７)]を用いた。このプラスミドpＧＥＬ１２
５は、酵母内で機能する２μ複製起源を有し、ＧＬＤプ
ロモーター、卵白リゾチームのシグナルペプチドおよび
ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチド配列をこ
の順番で含有している。このプラスミドpＧＥＬ１２５
を、ＢamＨＩによる消化に付した後、ＸhoＩで部分消化
することにより、ＧＬＤプロモーター、シグナルペプチ
ド、およびヒトリゾチームのコード領域を含んだ１.６k
bＤＮＡ断片と、プラスミドpＧＥＬ１２５の残余のヌク
レオチド配列に相当する８.３kbのＤＮＡ断片とを別個
に切り出し、ＳmaＩ認識配列(以下、単に制限部位とい
う)を有するＳmaIリンカーを用い、それぞれのＸhoＩ制
限末端をＳmaＩ制限末端に変換する。次いでこれらのＤ
ＮＡ断片を再結合させると、シグナルペプチドの上流に
のみＸhoＩ制限部位を有するプラスミドpＥＲＩ８６０
２が得られる。プラスミドpＥＲＩ ８６０２の組立て模
式図、並びにプラスミドpＧＥＬ１２５およびプラスミ
ドpＥＲＩ ８６０２の制限酵素切断地図を図２に示す。

【００１５】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
７７位および第９５位のシスティンがアラニンで置換さ
れた変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチ
ド配列を得るために、プラスミドpＥＲＩ ８６０２か
ら、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコードして
いるヌクレオチド配列を含んだＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片
を切り出し、これを、Ｍ１３mp１９ＲＦ[Ｍ１３mpファ
ージＤＮＡの複製型(ＲＦ)]にＸhoＩ制限部位を挿入し
たファージＤＮＡの大きい方のＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片
と結合(ライゲート)させることにより、シグナルペプチ
ドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖ファージ
ＤＮＡ、Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭを得る。Ｍ１３mp１９
ＸhＬＺＭの組立て模式図を図３に示す。

【００１６】一方、アミノ酸配列の第７７位および９５
位のシスティンがアラニンで置換された短いアミノ酸配
列をコードしている２本のオリゴヌクレオチドを合成
し、これら、変異を含んだオリゴマーの５'末端をりん
酸化し、Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭを含む一本鎖ＤＮＡと
混合し、常法に従い、アニーリングおよびライゲーショ
ンに付す。次いで、変異していないＤＮＡを除去した
後、得られた変異ヒトリゾチームＤＮＡを含有する混合
物を用い、大腸菌、Ｅ.coli ＴＧ１をトランスフェクシ
ョン(感染)した。プラークを形成させた後、さらにこの
プラークをＥ．coliＴＧ１に感染させ、その形質転換体
を培養し、その培養上清からＰＥＧ／ＮaＣl沈澱、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱により単鎖ＤＮＡを分離
し、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法による塩基配
列決定に付し、所望の変異ＤＮＡの生成を確認する。

【００１７】次いで、常法に従い、一本鎖ＤＮＡをＥ.c
oli ＴＧ１に導入して２本鎖ＤＮＡを得、このＤＮＡか
らシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチームをコードし
ているＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片を切り出し、上記プラス
ミドpＥＲＩ ８６０２の９.５kb ＸhoＩ−ＳmaＩ制限断
片とのライゲーション反応に付す。得られた混合物を用
いてＥ.coli ＤＨ１を形質転換し、形質転換体から所望
の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドpＥ
ＲＩ ８７１６を単離する。プラスミドpＥＲＩ ８７１
６の組立て模式図、並びに制限酵素切断地図を図４に示
す。

【００１８】以上の一連の操作における個々の操作は当
業者によく知られており、例えば、大腸菌の形質転換
は、コーエン(Ｃohen)らの方法[Ｃohen,Ｓ.Ｎ.ら、プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)６９、
２１１０(１９７２)]によって行うことができる。宿主
としてはＥ.coli２９４、Ｅ.coliＤＨ１、Ｅ.coliＷ３
１１０、Ｅ.coliＣ６００などを用いることができる。

【００１９】また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿
入されたプラスミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽
出法[Ｂirnboim,Ｈ.Ｃ.およびＤoly,Ｊ.、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)７、１
５１３(１９７９)]等を利用することができる。次い
で、プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で処理すること
によって、挿入された該遺伝子を切り出し、たとえばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離する。これらの一連の操作は公
知であり、文献、例えば「モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning)（１９８２），Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratory」に詳しく記載されている。

【００２０】またＤＮＡの化学合成は、たとえばＣrea
らの方法[Ｃrea,Ｒ.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)７５、７６５(１９７８)]などに
従って行うことができる。

【００２１】またＤＮＡの所望の部位に、特異的に変異
を起こさせるためには、市販のキット(例えばアマーシ
ャム社製キットなど)が用いられ、その配列の確認に
は、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[Ｓanger,
Ｆ．ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．)ＵＳＡ,７４、５４６３(１９７７)]が用いられる。

【００２２】発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に
複製可能な発現ベクター群の内から選択されたベクター
のプロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードし
ている遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて
挿入することにより組立てられる。本明細書中では、Ｇ
ＬＤプロモーターを用いて天然型のヒトリゾチームをコ
ードしている発現プラスミドpＥＲＩ ８６０２の構築を
用いて例示したが、その他、プラスミドpＰＨＯ１７、p
cＤＸ[Ｏkayama,Ｈ.およびＢerg,Ｐ.、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)
３、２８０(１９８３)]、pＫＳＶ−１０(ファルマシア
社製)なども好適に使用される。

【００２３】宿主として酵母を用いた場合には、プロモ
ーターとして、たとえばＰＨＯ５プロモーター、ＧＬＤ
プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモータ
ー、ＰＨＯ８１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、
ＧＡＬ１０プロモーターなどが、宿主として動物細胞を
用いた場合には、プロモーターとして、たとえばＳＶ４
０初期遺伝子プロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどがそれぞれ利用
できる。なお発現にエンハンサーの利用も効果的であ
る。

【００２４】

【発明の作用および効果】本発明のプラスミドpＥＲＩ
８７１６は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現
させ、分泌させるのに好適である。とくに好ましい宿主
はサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cere
visiae)ＡＨ２２Ｒ^-である。その外、動物細胞用ベクタ
ーを用いれば、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター
卵母細胞(ＣＨＯ)、さらには他の真核細胞も用い得る。
酵母の形質転換は当業者既知の方法のいずれによっても
行うことがてき、例えば、ヒネン(Ｈinnen)らの方法[プ
ロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)７
５,１９２７、(１９７８)]を採用することができる。

【００２５】真核細胞の形質転換も当業者に既知であ
り、例えば「蛋白質・核酸・酵素・２８巻、１９８３
年、“組み換え遺伝子の細胞への導入と発現“(共立出
版)」記載の方法で行うことができる。形質転換体の培養
は、当業者既知の方法のいずれを用いても行うことがで
きる。

【００２６】酵母を使用する場合、培地としては、例え
ばバークホルダー(Ｂurkholder)最小培地[ボスチャン
(Ｂostian,Ｋ.Ｌ.)ら、プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ,７
７、４５０５(１９８０）]が挙げられる。培養は通常１
５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜３７℃で１０〜１４
４時間、好ましくは２４〜９６時間行い、必要に応じて
通気や攪拌を加えてもよい。

【００２７】動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Ｅagle)のＭＥＭ[Ｈ.Ｅagle、サイエンス(Ｓcienc
e)１３０、４３２(１９５９)]、ダルベッコ(Ｄulbecco)
の改良イーグル培地(Ｍodified Ｅagle's Ｍedium)[Ｏr
gad ＬaubおよびＷilliam Ｊ.Ｒutter、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)
２５８、６０４３(１９８３)]などが挙げられる。培養
は通常３０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３７℃で約１
〜１０日間行う。

【００２８】培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上
清とを分離する。変異型ヒトリゾチームは上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。
さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デオキシコー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等)などに従
って精製することができる。

【００２９】このようにして得られた形質転換体培養物
から分離した培養上清並びに菌体中のヒトリゾチーム活
性を後述のアッセイ法で測定し、天然型のヒトリゾチー
ムをコードしている発現ベクターを用いて調製された形
質転換体の場合と比較すると、本発明の変異型ヒトリゾ
チーム形質転換体の培養上清には、従来のものよりもは
るかに多くのヒトリゾチーム活性を有するタンパク質が
分泌されていることが分かった。

【００３０】即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含んだ発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた
形質転換体を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を単離し、所望により
常法にしたがって精製することにより、容易かつ簡便に
一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質(変異
型ヒトリゾチーム)を得ることができる。以下、実施例
を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。尚、以下の実
施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味においても、
本発明を制限するものではない。

【００３１】実施例１ プラスミドpＥＲＩ ８６０２の
構築 i) １.６kb, ８.３kb断片の調製 ＢamＨＩ用緩衝液[６mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.９)、１
５０mＭ ＮaＣl、６mＭＭgＣl₂]１００μl中で化学合成
したヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミドp
ＧＥＬ１２５[ヨシムラ(Ｋ.Ｙoshimura)前掲]４８.５μ
gに６０ＵのＢamHI(ベーリンガーマンハイム山之内製)
を加えて３７℃で２時間反応させたのち、常法通り、冷
エタノールを加えてＤＮＡを集めた。このＤＮＡを、上
記ＢamＨＩ用緩衝液(１００μl)中で４０ＵのＸhoＩ(ベ
ーリンガーマンハイム山之内)を加えて３７℃で１５分
間部分消化したのち、６０℃で１５分間加熱して反応を
停止させた。この反応液を０.７％アガロース電気泳動
にかけ、１.６kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳動
溶出によってゲルから抽出した。

【００３２】同様の方法で４８.５μgのpＧＥＬ１２５
を６０ＵのＢamＨＩで消化し、常法に従ってエタノール
でＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡにＢamＨＩ用緩衝液
中で８０ＵのＸhoＩを３７℃で２時間作用させたのち、
前記１.６kb断片と全く同様の方法で、プラスミドpＧＥ
Ｌ１２５からプロモーター、シグナル配列、およびヒト
リゾチームコード領域が除去された８.３kbのＢamＨＩ
−ＸhoＩ制限断片を調製した。

【００３３】ii) ＳmaＩ認識配列を含む合成オリゴマー
の調製 pＧＥＬ１２５のヒトリゾチーム遺伝子の３'末
端側のＸhoＩ切断部位をＳmaＩ切断部位に変換するため
に、常法に従い、⁵'ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ³'を合成し
た。

【００３４】iii) １.６kb断片と合成オリゴマーの連結 ii)で得た合成オリゴマー(１００ng)と１.６kb断片(２
μg)を２０μlのライゲーション用緩衝液[５０mＭ Ｔri
s−ＨＣl(pＨ７.８)、１０mＭ ＭgＣl₂、２０mＭ ジチ
オスレイトール(ＤＴＴ)、１mＭ ＡＴＰ]に溶かし、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ(ＮＥＢ製)８００Ｕを加えて１４℃で
一夜反応させ、ＤＮＡを結合させた。常法に従い、エタ
ノールを加えてＤＮＡを集めたのち、１００μlのＢam
ＨＩ用緩衝液に溶かし、３６ＵのＢamＨＩを加えて３７
℃で１時間反応させ、同様にエタノールを加えてＤＮＡ
を集めた。次にこのＤＮＡを５０μlのＳmaＩ用緩衝液
[２０mＭ ＫＣl、１０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ８.０)、１
０mＭ ＭgＣl₂、１mＭ ＤＴＴ]に溶かし、２１ＵのＳma
Ｉ(宝酒造製)を加えて３０℃で１時間反応させた。これ
を０.７％アガロース電気泳動にかけ、常法通り所望の
部分を切り出し、電気泳動溶出によって１.６kbのＢam
ＨＩ−ＳmaＩ断片を得た。

【００３５】iv) ８.３kb断片と合成オリゴマーの連結 iii)と全く同様にして、１μgの８.３kb断片と１００ng
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にＢamＨＩ、
およびＳmaＩで処理して電気泳動にかけ８.３kbのＢam
ＨＩ−ＳmaＩ制限断片を得た。

【００３６】v) １.６kbＢamＨＩ−ＳmaＩ断片と８.３k
bＢamＨＩ−ＳmaＩ断片との連結 iv)で得た８.３kb断片(１２０ng)と１.６kb断片(３６０
ng)を１００μlのライゲーション用緩衝液((iii)に同
じ)中で８００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ(ＮＥＢ製)を加
えて１４℃一夜反応させた。その１／５量を用いてＥ.c
oli ＤＨ１を形質転換し、プラスミドpＥＲＩ ８６０２
を得た。プラスミドpＧＥＬ１２５およびプラスミドpＥ
ＲＩ ８６０２の制限酵素切断地図およびプラスミドpＥ
ＲＩ ８６０２の構築模式図を図２に示す。

【００３７】実施例２ Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭの構築 i) ヒトリゾチーム遺伝子を含むＸhoＩ−ＳmaＩ断片の
調製 実施例１で調製したプラスミドpＥＲＩ ８６０２ １０
０ngを実施例１記載の方法に従ってＸhoＩ、ＳmaＩで切
断し、シグナル配列コード領域およびヒトリゾチーム遺
伝子を含むＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片を調製した。

【００３８】ii) Ｍ１３mp１９へのＸhoI制限部位の導
入 Ｍ１３mp１９の複製型(ＲＦ)(宝酒造製)２.４μgを３０
μlのＨindIII用緩衝液[５０mＭ ＮaＣl、１０mＭ Ｔri
s-ＨＣl(pＨ７.５)、１０mＭ ＭgＣl₂、１mＭＤＴＴ]中
で２７ＵのＨindIII(ベーリンガーマンハイム山之内製)
と３７℃で２時間反応させたのち、常法通り冷エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈澱させた。一方、常法に従って合
成した２本のオリゴマー⁵'ＴＣＧＡＧＧＣＣＡ³'(１０
０ng)および⁵'ＡＧＣＴＴＧＧＣＣ(１００ng)をＡＴＰ
を含まないライゲーション用緩衝液(前出)２０μl中で
８０℃、５分処理したのち、室温まで徐々に冷却して二
本鎖とした。この反応液に上で得たＨindIII処理したＭ
１３mp１９ＲＦ５００ngとＡＴＰを１mＭとなるように
加え、１４℃で一夜反応させた。次にこの１／１０量を
Ｅ.coliＴＧ１に感染させ、常法に従いＸhoＩ切断部位
をもったＭ１３mp１９ＲＦを得た。この５μgを実施例
１、iii)記載の方法でＸhoＩおよびＳmaＩで処理し、エ
タノールで沈澱させた。

【００３９】iii) Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭの構築 i)で調製したＸhoＩ−ＳmaＩ断片３００ngとii)で調製
したＭ１３mp１９を含む大きいＸhoＩ−ＳmaＩ制限断片
１００ngとを５０μlのライゲーション用緩衝液(前出)
中４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ(ＮＥＢ製)と１４℃で
一夜反応させ、その１／５量をＥ.coliＴＧ１に感染さ
せ、Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭＲＦを得た。Ｍ１３mp１９Ｘ
hＬＺＭの構築模式図を図３に示す。

【００４０】実施例３ 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調
製 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレオ
チド−デイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシス
テム(アマーシャム社製キット)を用いた。また、操作方
法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従った。

【００４１】i) Ｃys⁷⁷およびＣys⁹⁵をＡlaに変換する
ためのオリゴマーの合成 常法に従って次の二本のオリゴマーを合成した。

【化１】 ×は変更後の塩基を、( )内は本来の塩基を示す。

【００４２】ii) アニーリングおよびライゲーション 実施例２で得たＭ１３mp１９ＸhＬＺＭの単鎖ＤＮＡ１
０μgを含む溶液(１３μl)、５'をリン酸化したオリゴ
マー(Ｉ)と(II)(〜１.６pmol／μl)(５μl)、緩衝液I
(７μl)および水(４μl)を混合し、８０℃で３分間処理
したのち、室温で３０分間放置した。この反応液にＭg
Ｃl₂液(１０μl)、ヌクレオチド混液１(３８μl)、水
(１２μl)、クレノーフラグメント(１２Ｕ)、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ(１２Ｕ)を加え、１４℃で一夜反応させた。
反応液をニトロセルロースフィルターで濾過し、未反応
の単鎖ＤＮＡを除去したのち、常法に従いエタノールで
ＤＮＡを沈澱させ、５０μlの緩衝液２に溶解した。

【００４３】iii) 変異ＤＮＡを含むプラスミドによる
大腸菌の形質転換 ii)で得たＤＮＡ溶液５０μlの内１０μlに、６５μlの
緩衝液３と５ＵのＮciＩを加え３７℃で９０分間反応さ
せて変異していないＤＮＡにニックを入れた。反応後さ
らに５００mＭ ＮaＣl(１２μl)、緩衝液４(１０μl)、
エキソヌクレアーゼIII(５０Ｕ)(２μl)を加えて、３７
℃で３０分間反応させ、ニックを入れたＤＮＡを消化し
た。次に７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。
冷却後、ヌクレオチド混液２(１３μl)、ＭgＣl₂液(５
μl)、ＤＮＡポリメラーゼI(３Ｕ)、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ(２Ｕ)を加えて１４℃で３時間反応させた。この反応
液１０〜２０μlを用い、Ｅ.coliＴＧ１を形質転換し
た。

【００４４】iv) 変異ＤＮＡの調製と変異の確認 iii)で得た形質転換体をＹＴ寒天培地(バクトトリプト
ン８g、バクト酵母エキス５g、ＮaＣl５g、寒天１５g、
水１l)にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、Ｅ.coliＴＧ１に感染させ、これをＹＴ培地で３７
℃において一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この
上清１mlにＰＥＧ／ＮaＣl(２０％ポリエチレングリコ
ール６０００、２.５ＭＮaＣl)２００μlを加え、よく
混合して１５分間放置したのち、遠心分離して上清を除
去した。沈澱にＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris−ＨＣl、１m
Ｍ ＥＤＴＡ、pＨ８.０)(１００μl)および、ＴＥ緩衝
液飽和フェノール(５０μl)を加えてよく攪拌したの
ち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エタノ
ールを加えて、単鎖ＤＮＡを沈澱させた。この単離ＤＮ
Ａを鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法に
よって塩基配列を決定し、目的通り変異したＤＮＡを数
種得た。

【００４５】実施例４ プラスミドpＥＲＩ ８７１６の
構築 実施例３、iv)で得た変異ＤＮＡをＥ.coliＴＧ１から常
法によって調製したのち、実施例１、iii)、記載の方法
に従ってＸhoＩおよびＳmaＩで処理して、シグナル配列
のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むＸho
Ｉ−ＳmaＩ制限断片(a)を得た。一方プラスミドpＥＲＩ
８６０２を同様にＸhoＩおよびＳmaＩで処理したの
ち、常法通り電気泳動によって９.５kbのＸhoＩ−Ｓma
Ｉ制限断片(b)を単離した。

【００４６】次いで、これらのＤＮＡ断片(a)(b)各１０
ngと３０ngを２０μlのライゲーション用緩衝液中で実
施例１、iii)と同様に反応させて連結し、このライゲー
ション反応混合物でＥ.coliＤＨ１を形質転換した。形
質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有してい
るプラスミド数種を得、その一つをpＥＲＩ ８７１６と
命名した。プラスミドpＥＲＩ ８７１６の構築模式図を
図４に示す。

【００４７】実施例５ 酵母形質転換体の調製 実施例４で得た発現プラスミドpＥＲＩ ８７１６を用
い、ヒネンらの方法(前出)に従い、Ｓ.セレビシエＡＨ
２２Ｒ^-を形質転換し、形質転換体Ｓ.セレビシエＡＨ２
２Ｒ^-／pＥＲＩ ８７１６を得た。この菌株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−９
６２１で寄託されている(寄託日:昭和６２年９月２４
日)。

【００４８】実施例６ Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／p
ＥＲＩ ８７１６の培養 実施例５で得た形質転換体Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／
pＥＲＩ ８７１６を、試験管中のバークホルダー(Ｂurk
holder)[アメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー(Ａ
mer.Ｊ.Ｂot.)３０、２０６(１９４３)]の改変培地III
(１l当たりＫＨ₂ＰＯ₄０.４g、グルコース１０g、アス
パラギン５g、シュークロース８０gを含有)５mlに接種
し、３０℃で７２時間振盪培養した。得られた培養液１
mlをそれぞれ上記培地III４mlを含む試験管へ移し、３
０℃で１日振盪培養した。この培養液２mlを上記培地II
I１８mlを含む２００ml容三角フラスコに移し、３０℃
で振盪培養し、４８、７２、９６および１２０時間後に
培養液を採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。

【００４９】実施例７ アッセイ試料の調製 実施例６で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体を分離
した。上清はアッセイに供し、菌体は１.２Ｍスクロー
スを含む５０mＭリン酸バッファー(pＨ７.０)で洗浄し
た後、ツィモリアーゼ(Ｚymolyase)[生化学工業(株)製]
を０.５mg／mlになるように加えた同バッファーに懸濁
し、室温で２時間反応させた。この反応液に４倍量の５
０mＭリン酸バッファー(pＨ７.０)[１０mＭ ＥＤＴＡ、
１mＭ ＰＭＳＦを含む]を加え、室温で１時間反応させ
たのち、上清を集めて菌体抽出液とした。

【００５０】実施例８ 変異型ヒトリゾチーム産生量の
測定 実施例７で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒ
トリゾチームのアッセイに供した。ヒトリゾチーム活性
の測定は、ほぼワーシントン・エンザイム・マニュアル
(Ｗorthigton Ｅnzyme Ｍanual、p１００、Ｗorthigton
Ｂiochemical Ｃorporation,ＵＳＡ、１９７２)によっ
た。標準ヒトリゾチームとしてはシグマ(Ｓiguma)社製
を使用した。１単位は、０.１Ｍリン酸バッファー(pＨ
６.９)中でマイクロコッカス・ルテウス(Ｍicrococcus
luteus)(生化学工業社製)を基質として２５℃で１分間
反応させ、４５０mμの吸収を０.００１減少させるに必
要な酵素量とした。同様の実験を３回行って得たヒトリ
ゾチームの産生量は、以下の表１に示す通りであった。
なお、天然型のヒトリゾチームを産生する形質転換体
Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／pＧＥＬ・ＣＬ１０(ＦＥＲ
Ｍp−９２８５)を対照として同様に培養し、ヒトリゾチ
ーム活性を有するタンパク質の産生量を比較した。結果
を表１に示す。

【００５１】

【表１】 形質転換体 ヒトリゾチーム(mg／l培養) 上清 菌体 Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^- １６.４ ０.１ ／pＥＲＩ ８７１６(No.1) Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^- １８.５ ０.１ ／pＥＲＩ ８７１６(No.2) Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^- １９.３ ０.２ ／pＥＲＩ ８７１６(No.3) Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^- １６.７ ０.１ ／pＥＲＩ ８７１６(No.4) Ｓ.cerevisiaeＡＨ２２Ｒ^- ３.５ １.５ ／pＧＥＬ・ＣＬ１０

【００５２】表１から、本発明の変異型ヒトリゾチーム
をコードしている形質転換体は、従来のものと比較し
て、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質の分泌量ま
たは分泌効率が飛躍的に改善されていることが分る。

【００５３】実施例９ 分泌された変異型ヒトリゾチー
ムの精製 実施例５で得た形質転換体Ｓ.セレビシエＡＨ２２Ｒ^-／
pＥＲＩ ８７１６を実施例６に示した培地５mlを含む試
験管３本に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。上記
培地１８mlを含有する２００ml容三角フラスコを５本用
意し、その各々に、上の培養液２mlを移し、３０℃で１
日振盪培養した。次に上記培地２００mlを含有する１l
容三角フラスコを５本用意し、その各々にこの培養液２
０mlを移し、３０℃で４日間培養した。この培養液を遠
心分離機にかけ、上清と菌体を分離した。この上清(約
１l)を５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.５)で平
衡化した陽イオン交換樹脂(ＣＭ−Ｔoyopearl ６５０
Ｃ)カラム(１.６cm×３６cm)に吸着させ、同緩衝液５０
０mlで洗浄後、０.５Ｍ ＮaＣlを含む同緩衝液で溶出し
た。溶出液を５mlずつ分取し、各フラクションについて
実施例８に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチー
ム活性が最大となるフラクションから２００μlを取
り、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＴＳＫgel ＯＤ
Ｓ１２０Ｔカラム)により、さらに精製した。溶出は、
０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの０〜
１００％の３０分間の直線濃度勾配により行い、２８０
nmの吸収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧
下、蒸発させ、乾燥粉末として変異型ヒトリゾチームの
精製標品を得た。

【００５４】実施例１０ 精製変異型ヒトリゾチームの
分析 実施例９で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品につ
いて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒト
リゾチーム(シグマ社)を標準としてプロティンアッセイ
試薬(バイオラッド社)を用いて行った。その結果、市販
の天然型ヒトリゾチームの比活性を１００としたとき、
変異型ヒトリゾチームの比活性は９０±５であった。次
に、この精製した変異型ヒトリゾチームについてＮ末端
９残基のアミノ酸配列の決定を行った。Ｎ末端配列の決
定は、精製標品７μgを用い、プロティン・シーケンサ
ー(Ａpplied Ｂiosystems社、４７７Ａ)により自動的に
行った。結果を以下の表に示す。

【００５５】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列、およ
びそれをコードしている化学合成したヌクレオチド配列
を示す配列図である。

【図２】 プラスミドpＥＲＩ ８６０２の構築模式図、
並びにプラスミドpＧＥＬ１２５およぴプラスミドpＥＲ
Ｉ ８６０２の制限酵素切断地図である。

【図３】 Ｍ１３mp１９ＸhＬＺＭの構築模式図であ
る。

【図４】 プラスミドpＥＲＩ ８７１６の構築模式図、
並びに制限酵素切断地図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
   第７７位および第９５位のシスティンがアラニンで置き
   換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾ
   チーム遺伝子。
2. 【請求項２】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
   第７７位および第９５位のシスティンがアラニンで置き
   換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾ
   チーム遺伝子と、シグナルペプチドをコードしているヌ
   クレオチド配列とを含有し、真核生物内で自律的に複製
   可能な変異型ヒトリゾチーム発現ベクター。
3. 【請求項３】 プラスミドpＥＲＩ ８７１６である請求
   項２記載の発現ベクター。