JP2774803B2 - Ｄ−ヘリックス欠失型ホスホリパーゼａ▲下２▼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ホスホリパーゼA₂誘導体、詳しくは、天然
型（野生型）ウシホスホリパーゼA₂からＤ−ヘリックス
を欠失した変異型ホスホリパーゼA₂を遺伝子組換技術を
用いて製造するための、該Ｄ−ヘリックス欠失型ホスホ
リパーゼA₂をコードしている（暗号化している）DNA断
片、該DNA断片を発現可能な形で組み込んだ発現プラス
ミド、該発現プラスミドで形質転換された酵母細胞、お
よび該酵母形質転換株を用いたＤ−ヘリックス欠失型ホ
スホリパーゼA₂の製造法、並びにＤ−ヘリックス欠失型
ホスホリパーゼA₂に関するものである。

［従来技術とその課題］ ホスホリパーゼA₂（EC3,1,1,4）（以下PLA₂と略す）
は、1,2−ジアシルグリセロリン脂質のＣ−２位の脂肪
酸エステルを特異的に加水分解し、リゾグリセロリン脂
質と脂肪酸とを生成する酵素である。本酵素は動物の膵
臓やヘビ毒、ハチ毒などの毒液中に細胞外酵素として比
較的多量に存在するほか、おもに細胞内酵素として、高
等動物から微生物に至るまで広く生物界に分布してい
る。

PLA₂はその酵素反応の特異性を利用し、Ｃ−２位脂肪
酸エステルを脱アシル化したリン脂質の調製や、研究用
の試薬として利用されている（小林（1987）蛋，核，酵
31,1661〜1667）。この酵素は、主として脂肪の代謝に
関連した医療分野での研究および治療に用いられること
が予想され、将来その重要性が一層増大すると考えられ
る。

ところで、天然型のPLA₂をより簡便に、安定して供給
するために、遺伝子組換技術を利用して、天然型PLA₂を
コードしているDNA断片を含有するプラスミドpBSPLA₂−
4.2−７を構築し、次いで、該DNA断片を適当な酵母の発
現ベクターに組み込むことにより、酵母でPLA₂を発現す
る発現ベクターが構築されている［タナカら（Tanaka）
（1988）Gene64257−264］。この発現ベクターに係る発
明はまた、本出願人により、特願昭62−200307（62年８
月11日出願）の下で特許出願された。

上記発明では、化学合成したウシPLA₂遺伝子をクロー
ニングして酵母の分泌ベクターに挿入し、酵母の培養液
中に天然のものと同じウシPLA₂を分泌生産させている。
本発明者らは、PLA₂の広範な用途を想定し、上記天然型
のPLA₂に変異を生じさせることにより、様々な誘導体を
開発することを目的として、鋭意研究を重ねてきた。

通常、天然型のポリペプチドのアミノ酸配列における
変異には、アミノ酸配列の欠失、置換または挿入が含ま
れる。そのような変異によって導かれ得る効果として
は、活性の増大、変化、安定性の増大あるいは精製の容
易化、さらには収率の向上等がある。近年の遺伝子組換
技術の発達により、分子の任意の箇所に様々な変異を導
入する方法は当業者に既知であり、通常の手法を用いて
達成することができる。しかしながら、目的に応じた適
切な変異を導入することが重要な課題である。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、PLA₂のアミノ酸配列に適切な変異を導
入するために種々検討を加える過程において、ウシ由来
のPLA₂とヘビ由来のPLA₂との構造上の相異に着目するに
至った。即ち、ウシPLA₂にはＡ、Ｂ、Ｃ、D4個のα−ヘ
リックスが存在していることが知られている［ジキスト
ラら（B.W.Dijkstra）J.Mol.Biol.（1978）124、53−6
0］。他方、ある種のヘビ、例えばエラブ海ヘビのPLA₂
はＤ−ヘリックスが欠如していることが示されている
［ニシダら（S.Nisida）Biochem.J.（1982）207、589−
594］。このようなＤ−ヘリックスの欠如は、分子量の
低下をもたらし、その構造を幾分簡単にするので、ウシ
PLA₂からＤ−ヘリックスを欠如させることができれば、
抗原性が低下する可能性もあり、医薬として体内に投与
する上で好ましい性質が付与されると考えられる。しか
もウシ由来であるため、哺乳類への使用に適すると考え
られる。また、分子量の低下による精製の容易化も期待
され、より大量に高純度のPLA₂を得、供給することがで
きると考えられる。

即ち、本発明は、Ｄ−ヘリックスが欠如されたウシホ
スホリパーゼA₂を得ることを目的とするものである。

本発明の上記目的を達成するために、まず、上記の天
然型PLA₂をコードするDNA断片含有プラスミドpBSPIA₂−
4.2−７を制限酵素Hind IIIおよびNsp（7524）Ｖで消化
して、第２図記載の天然型PLA₂のアミノ酸配列から、ウ
シPLA₂のＤ−ヘリックス（59番目から64番目のアミノ酸
配列に相当、第５図参照）を含む59番目から67番目まで
のアミノ酸を欠如したアミノ酸配列をコードするDNA断
片を得、このDNA断片に、対応する上記エラブ海ヘビのP
LA₂のアミノ酸配列、即ち、第59番目から第61番目まで
のアミノ酸配列（同様に第５図参照）をコードしている
DNA断片（第６図参照）を結合することにより、所望の
欠失を有するDNAを含有するプラスミド、pBSPLA−△Ｄ
を構築した。このプラスミドにコードされているアミノ
酸配列をコンピューターシュミレーションで分析した結
果は、このアミノ酸配列に対応するPLA₂が、Ｄ−ヘリッ
クスを欠失したものであることを支持していた。なお、
第５図の配列式は、上限が天然型PLA₂の57番から79番の
アミノ酸配列を表し、下段が、対応するＤ−ヘリックス
欠失型PLA₂のアミノ酸配列を表している。

即ち、本発明は、Ｄ−ヘリックス欠失型ホスホリパー
ゼA₂を製造するための、Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗
号化しているDNA断片、該断片を組み込んだ酵母を宿主
とする発現プラスミド、該プラスミドで形質転換された
酵母形質転換体、該形質転換体を用いたＤ−ヘリックス
欠失型PLA₂の製造方法、ならびにＤ−ヘリックス欠失型
ホスホリパーゼA₂を提供するものである。

本発明に於いて、PLA₂という用語は、ウシの天然のPL
A₂を包含するあらゆる哺乳動物起源のPLA₂を意味すると
共に、遺伝子操作により作られる、それらの天然のPLA₂
の変異体も含まれるものとする。この天然型PLA₂をコー
ドするDNA配列および対応するアミノ酸配列は第２図に
示されている。

このアミノ酸配列に所望のＤ−ヘリックス欠失を有す
る変異型PLA₂を上記の如く構築した。得られたDNA配列
およびアミノ酸配列は第１図に示されている。

このようにして得たＤ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗号
化するDNA断片を酵母を宿主として発現させるために
は、その前に、mRNA合成とmRNAからのタンパク質翻訳を
行わせるための遺伝子発現系を連結しておく必要があ
る。酵母においては、遺伝子発現系として、それ自身の
菌体内で機能している遺伝子のプロモーター活性と翻訳
能を持つDNA断片を用いることが多い。このような例と
して、３−ホスホグリセレート・キナーゼ遺伝子（PG
K）、エノラーゼ遺伝子（ENO1）、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子（GP
D）、メイティングタイプα遺伝子（MF1）、リプレッシ
ブル・アシッド・ホスファターゼ遺伝子（PHO5）、ガラ
クトキナーゼ遺伝子（GAL1）、などの発現を制御してい
るDNA断片が良く用いられている（中尾、松原（1986）
日本生化学会編“遺伝子研究法II"pp171〜172、東京化
学同人）。これらのDNA断片をPLA₂を暗号化するDNA断片
の前に連結すれば、その制御下にPLA₂は酵母内で発現さ
れることとなる。また同様の活性を有する他のDNA断片
を用いてもよい。

上に述べたＤ−ヘリックス欠失型PLA₂を酵母内で発現
できるように構成されたDNA断片を酵母に導入するに
は、YEp型、YRp型、YCp型に分類されている大腸菌と酵
母とのシャトルベクター（東江（1981）松原、矢野編
“遺伝子操作"pp205〜207、共立出版）に該DNA断片を連
結すればよい。また酵母内で増殖できないYIp型のベク
ター（同上文献参照）を用いても、該DNAを酵母内に導
入することができる。本発明においては、プロモーター
断片をすでに連結しているYEp型ベクター、pAT405また
はpMFα−８を用いることが好ましいが、これに限定さ
れるものではない。

このように連結したDNAを用いて直接酵母を形質転換
し、目的物を得ることもできるが、一般的には一度大腸
菌を形質転換して目的物を取得した後、酵母を形質転換
する。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書（Maniatis
ら（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Co
ld Spring Harbor Laboratory）に詳述されている。酵
母の形質転換は、コンピテント・セル法（RodriguezとT
ait（1983）Recombinant DNA Techniques:An introduct
ion pp.186〜187、Addison−Wesley publishing C
o.）、プロトプラスト法（Beggs（1978）Nature275,104
〜108）、電気穿孔法（稲葉ら（1987）蛋，核，酵32,10
〜21）により達成できる。宿主としてはサッカロマイセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いる
ことが好ましいが、他の種類の酵母を用いることもでき
る。

得られた形質転換体を公知の培地を用いて培養すれ
ば、Ｄ−ヘリックスを欠失したPLA₂を得ることができ
る。該Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂を菌体外に分泌生産さ
せる場合には、イースト・ミニマル・メディウム（Yeas
t Minimal Medium）やYNBD培地（RodriguetzとTait（19
83）Recombinant DNA Techniques:An introduction,pp1
51〜153、Addison−Wesley Publishing Co.）のような
最少培地を用いることが好ましい。またPHO5やGAL1のプ
ロモーターを用いた場合には、それぞれ培養液からリン
を除いたり、炭素源をガラクトースにすることによって
PLA₂生産を誘導することができる。PLA₂を分泌生産させ
た場合には、この培養液から酵母を除いた後、通常のタ
ンパク質精製法、たとえば塩析、限外濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法、あるい
はこれらを組合わせることにより純粋なＤ−ヘリックス
欠失型PLA₂標品を得ることができる。本発明において
は、実施例に記載したように、SP−セファデックスおよ
びpEAEセルロースを用いて単一の標品を得た。なお、菌
体内に蓄積されたＤ−ヘリックス欠失型PLA₂は、酵母を
細胞壁消化酵素やガラスビーズで処理することによって
破砕した後、前に述べた方法により抽出、精製できる。

［発明の効果］ 本発明は、酵母を宿主としてＤ−ヘリックスを欠失し
たPLA₂を分泌生産する方法を提供するものであり、従来
の天然型PLA₂の医療および研究分野での用途をさらに発
展させるものと言える。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、マニュアル書
（Maniatisら（1982）、Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Laboratory）および試
薬の仕様書に従った。

実施例１ ウシPLA₂を暗号化するDNA断片の調製 公知のウシPLA₂アミノ酸配列（Fleerら（1978）Eur.
J.Biochem.82,261〜269）を基に、それを暗号化するDNA
断片を第２図のように設計した。このDNA断片には活性
型のウシPLA₂タンパク質を暗号化する部分だけでなく、
その前部に前駆体PLA₂のもつ７残基のアクティベーショ
ン・ペプチド（activation peptide）（Dutilhら（197
5）Eur.J.Biochem.53,91〜97）を暗号化するDNAを連結
し、さらにその前にイヌPLA₂のシグナルペプチドを暗号
化するDNA（Oharaら（1986）J.Biochem.99,733〜739）
を連結している。また後部には終始コドンTAAおよびTAG
を連続して付加し、さらに全DNA断片の５′側および
３′側にはそれぞれEcoR IおよびSal Iの粘着末端を設
けた。設計にあたってコドンの使用頻度が酵母のそれに
近くなるよう留意し、さらに遺伝子の随所に特有の制限
酵素切断部位が存在するよう配慮した。

このように設計したDNA断片を第３図に示すように平
均鎖長42merのDNAオリゴマー22本に分けて合成した。DN
AオリゴマーはApplied Bio Instrument381A型全自動DNA
合成装置を使用し、ホスホアミダイド法で合成した後、
トリエチルアンモニウム、チオフェノキサイド、ジオキ
サン溶液で室温にて１時間処理し、次に濃アンモニア水
を用いて室温で１時間、さらに55℃で６時間処理した。
この標品を逆相HPLCにかけて目的物を分取した後、80％
酢酸で処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAG
E）により純化し、さらに逆相HPLCで精製したものを凍
結乾燥し、25nmol/mlの蒸留水に溶解したものをDNA断片
作製用のオリゴマーとした。

DNAオリゴマーからの、PLA₂を暗号化するDNA配列作成
法の概略を第４図に示す。

まず最初にＡ、Ｂ、Ｃの３断片を組立てた。Ａブロッ
クについては〜、Ｂブロックは〜、Ｃブロック
は〜の各オリゴマー250pmol（ピコモル）ずつを混
合し70℃で３分間加熱した後冷水で急激に冷却し、再度
70℃で３分間加熱した後約３時間かけて徐々に室温まで
放冷することにより、アニーリングした。次にこの溶液
にキナーゼ緩衝液と終濃度5mMのDTT、1mMのATPを加えた
後、ポリヌクレオチドキナーゼ20単位を加え、37℃で１
時間反応させた。さらに70℃で３分間加熱した後、ブロ
ックＡのサンプルにはのオリゴマーを、ブロックＣに
はのオリゴマーをそれぞれ250pmol加え、さらに各サ
ンプルについて終濃度1mMのATPとT4DNAリガーゼを添加
し８℃で終夜反応した。

以上のサンプルを８％ゲル濃度、2mm厚のPAGEにか
け、80〜120Vで４時間泳動した。得られたゲルをEtBr
（0.5μg/ml）を含むTBE緩衝液中で20分間染色し、紫外
線照射することによりDNAのバンドを検出した。同時に
泳動した分子量マーカーの値を参照して、Ａブロックの
ものについては約160bp、Ｂブロックについては約170b
p、Ｃブロックについては約130bpあたりのバンドを切り
出し、DNA断片を溶出、回収し、20μのTE緩衝液に溶
解した。各ブロック10μのDNAを混合し、T4DNAリガー
ゼを用いて８℃で一夜反応させて連結した後、3.5％ゲ
ル濃度、2mm厚のPAGEにかけ、60〜100Vで３時間泳動し
た。同時に泳動した分子量マーカーの値を参照し、約46
0bp付近のDNAバンドを切り出し、DNA断片を溶出した。
得られたDNA断片をさらにNACS PREP AC（BRL社製）を
用い、説明書の方法に従って精製し、エタノール沈殿
後、20μのTEに溶解した。

次にプラスミドpUC119（宝酒造より購入）をEcoR I、
Sal Iで完全に消化し、このDNA20ngと合成したDNA断片
５μを混合し、T4DNAリガーゼを用いて８℃で16時間
ライゲーションした。このライゲーション混合物５μ
を用いてＥ．coli JM105（アマシャム・ジャパン（株）
より入手）を形質転換した。得られた、アンピシリン耐
性を示す形質転換株の中から200株を選択し、ワットマ
ン541のフィルターにコロニーを移しとった後、常法に
従いコロニーハイブリダイゼーションを行った（Gergen
ら（1979）Nucleic Acids Res.７,2115〜2136）。プロ
ーブとしてはT4ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて
５′末端をラベルした後、スパン・カラムクロマトグラ
フィーにより精製した、およびのDNAオリゴマー
（第３図）を用いた。６×SSC、0.1％SDS、１×Denhard
t's、25μg/mlサケDNAを含む溶液中、42℃で、４時間プ
レハイブリダイゼーションした後、同じ溶液に各プロー
ブを７〜８×10⁵cpm/mlとなるように加え、42℃で一夜
ハイブリダイゼーションを行った。その後、42℃で２×
SSC、0.1％SDSを含む溶液を用いてフイルターを２回洗
浄し、さらに２×SSC溶液を用いて42℃で２回洗浄した
（30分間）。その後フイルターを室温で乾燥させ、オー
トラジオグラフィーを行った。３つのプローブに対し陽
性を示した９個のクローンについて、ヘルパーファージ
M13K07を用いる公知の方法（宝酒造、PUC119説明書）に
従い、１本鎖DNAを分取し、M13シークエンシングキット
（アマシャム・ジャパン社製）を用いて塩基配列を決定
したところ、５′末端200残基については目的物である
ことを確認した。さらに合成遺伝子内のEcoR I、Sal
I、Xho I部位を利用して、各DNA断片をM13mp11にクロー
ン化し、全領域の塩基配列を決定したところ、全てのク
ローンについて塩基配列の欠失あるいは置換が認められ
た。そこで５′末端から数えて370残基目のＧが欠失し
た合成遺伝子を持つプラスミドpBSPLA₂−4.2を用いて欠
失部分を正しい配列に入れかえた。まずpBSPLA₂−4.2を
Stu IおよびXba Iで消化した後、アガロースゲル電気泳
動により約3.7kbのDNA断片を分取した。また欠失部分を
再構成するため、〜のオリゴマー各250pmolを混合
し、前に述べたのと同様に５′末端のリン酸化、アニー
リング、ライゲーションを行った後、Xba IおよびStu I
で消化し、12％PAGEにより約80bpのDNA断片を取得し
た。このDNA断片約2pmolとpBSPLA₂−4.2のStu IおよびX
ba I断片約100ngを混合し、T4DNAリガーゼを用いて連結
し、Ｅ．coil MC1061（Casadabanら（1980）J.Mol.Bio
l.138,179−207）を形質転換した。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換株の中から68株を選び、プラスミドDN
Aを抽出し、Stu IおよびXba Iで消化したところ、28株
が約80bpのDNA断片を組み込んでいた。そこで代表８株
についてそのPst I−Xba I断片をM13mp11のXba Iおよび
Pst Iに再クローン化し、塩基配列を決定した。その結
果４クローンについては欠失部分が回復され、他の部分
も正しい塩基配列を維持していた。さらに正しい配列の
遺伝子を有していたクローンのうち、代表としてpBSPLA
₂−4.2−７を選び、これについてPLA₂を暗号化する部分
の全塩基配列を決定したところ、第１図に示す配列と完
全に一致し、目的のウシPLA₂を暗号化するDNA断片を取
得することができた。

実施例２ Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗号化するDNA
断片 Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗号化する遺伝子は、実
施例１で調製した野生型ウシPLA₂を暗号化する合成遺伝
子のHind III−Nsp（7524）Ｖ間のDNA配列を、欠失型を
暗号化する配列に置き換えることにより得られた。欠失
部分のアミノ酸配列を第５図に、塩基配列を第６図に示
す。またＤ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗号化する遺伝子
の作製法の概略を第７図に示す。

欠失部分を第６図に示す〜の４本のDNAオリゴマ
ーに分けて合成した。DNAオリゴマーはApplied Bio Ins
trument 381A型全自動DNA合成装置を使用しホスホアミ
ダイド法で合成した後、トリエチルアンモニウム、チオ
フェノキサイド、ジオキサン溶液で室温にて１時間処理
し、次に濃アンモニア水を用いて室温で１時間、さらに
55℃で６時間処理した。この標品を逆相HPLCにかけて目
的物を分取した後、80％酢酸で処理し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（PAGE）により純化し、さらに逆相HP
LCで精製したものを凍結乾燥し、25nmol/mlの蒸留水に
溶解したものをDNA断片作製用のオリゴマーとした。

次に各オリゴマー250pmolをキナーゼ緩衝液中で混合
し、70℃で３分間加熱した後冷水で急冷し、再度70℃で
３分間加熱した後約３時間かけて、徐々に室温まで冷却
することによりアニーリングした。次にこの溶液に終濃
度5mMのDTT、2.5mMのATPを加えた後ポリヌクレオチドキ
ナーゼ20単位を加え37℃で40分間反応させた。この反応
液を70℃で３分間加熱した後、2mMのATPとT4DNAリガー
ゼを添加し20℃で２時間反応させた。この反応液をフェ
ノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿した後、回
収されたDNA断片をさらにNsp（7524）Ｖ消化したものを
合成DNA断片として用いた。最終産物はフェノールクロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱後10μのTE緩衝液に溶
解して用いた。

次に実施例１で得たpBSPLA₂−4.2−73μｇをHind II
I、Nsp（7524）Ｖで消化し、１％アガロースゲル電気泳
動によりベクターDNA断片と約280bpのDNA断片を切り出
し、電気溶出法によりDNAを回収した。このうちベクタ
ーDNA断片については細菌性アルカリホスファターゼ（b
acterial alkaline phospatase.）（BAP）処理を行った
後、10μのTE緩衝液に溶解した。また他のDNA断片に
ついてはそのまま10μのTE緩衝液に溶解した。

次に、合成したDNA断片１μと約280bpの断片５μ
を混合し、T4DNAリガーゼを用いて連結した後、Hind II
I消化した。この反応液を８％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ330bp付近のDNAバンドを切り出し、電気
溶出法によりDNAを回収、最終的に５μのTE緩衝液に
溶解した。次にこの回収したDNA断片５μとBAP処理し
たベクターDNA1μを混合、T4DNAリガーゼを用いて連
結した後、E.coli JM105を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性を示す形質転換株約860株についてワット
マン541フィルターにコロニーを移しとった後、常法に
従いコロニーハイブリダイゼーションを行った［ゲルゲ
ンら（Gergen）（1979）Nucleic Acids Res.1 2115〜21
36］。プローブとしてはT4ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて、５′末端をラベルした後、スパン・カラムクロ
マトグラフィーにより精製した第６図に示すのDNAオ
リゴマーを用いた。

６×SSC、0.1％SDS、１×デンハルト溶液、25μg/ml
サケDNAを含む溶液中で37℃４時間プレハイブリダイゼ
ーションした後、同じ溶液にプローブを５×10⁵cpm/ml
となるように入れ、37℃で一夜ハイブリダイゼーション
した。その後、６×SSC、0.1％SDSを含む液で室温で２
回フィルターを洗浄し、さらに3M塩化テトラメチルアン
モニウムを含む溶液［ウッドら（Wood）（1985）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 82 1585−1588］で37℃15分、50℃15
分で２回洗った。次にこのフィルターを室温で乾燥さ
せ、オートラジオグラフィーを行った。38コの陽性株が
得られた。このうち12株についてプラスミドDNAを調製
し、Sca I、Nsp（7524）Ｖ、Pst Iを用いて制限酵素地
図を作製したところ、３株が目的とするパターンを示し
た。更にこの３株からヘルパーファージM13K07を用いる
公知の方法（宝酒造puc119説明書）に従い、１本鎖DNA
を分取し、M13シークエンシングキット（宝酒造製）を
用いて塩基配列を決定したところ、２株について、欠失
部位周辺50bpに関しては目的の配列を有することを確認
し、Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂を暗号化する遺伝子を組
み込んだ組換体プラスミドpBSPLA−△Ｄを得た。

実施例３ 酵母でのＤ−ヘリックス欠失型PLA₂発現プラ
スミドpEK201−△Ｄの構築 酵母でのＤ−ヘリックス欠失型PLA₂発現プラスミドpE
K201−△Ｄ構築の概略を第８図に示す。pAT405は公知
（Tanakaら（1988）Gene 64 257−264）であり、東江
教授（広島大学工学部第３類醗酵工学教室）より入手可
能である。

実施例２で取得したpBSPLA−△ＤをEcoR IおよびSal
Iで消化した後、Ｅ．coli DNAポリメラーゼＩのKlenow
断片（以下Klenowと略す）を用いて突出末端を平滑末端
とし、アガロースゲル電気泳動により約450bpのDNA断片
を分取した。次にpAT405をXho I消化した後、Klenow処
理し、突出末端を平滑末端とした。この２つのDNA断片
をTADNAリガーゼを用いて連結し、このライゲーション
・ミックスチャーを用いてＥ．coli MC1061を形質転換
した。得られたアンピシリン耐性を示す形質転換株の中
から200株について、実施例２に示したのと同様の方法
でコロニー・ハイブリダイゼーションを行った。プロー
ブは５′−CTCATGACAACTGCTACAAGCで示されるオリゴマ
ーを用いた。陽性を示した31株からプラスミドDNAを抽
出し、Pst I消化により目的方向にPLA₂を暗号化するDNA
断片を挿入しているプラスミドを検索したところ８株が
目的の構造のプラスミド、pEK201−△Ｄを保持してい
た。

実施例４ pEK201−△Ｄを用いたＤ−ヘリックス欠失型
PLA₂の生産および精製 1.D−ヘリックス欠失型PLA₂の生産 実施例３で得られたpEK201−△Ｄを用いて公知のプロ
トプラスト法（Beggs（1978）Nature 275,104−108）に
よりサッカロマイセス・セレビシエDC−５（Broachら
（1979）Gene ８,121−133）を形質転換した。選択培地
としてはＬ−ヒスチジン20μg/ml、1.2Mソルビトールを
含むYNBD培地を用いた。得られたLeu⁺形質転換株につい
て、公知の方法（Tanakaら（1988）Gene 64 257−264）
で培養し、PLA₂を含む培養上清を得た。

2.D−ヘリックス欠失型PLA₂の精製 酵母培養上清2.9のpHを4.0に合わせ、50mM酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.0）で平衡化したSP−セファデック
スＣ−25（ファルマシア社製）カラム（1.5×9cm）にか
け、０から0.5Mまでの塩化ナトリウムの直線濃度勾配を
かけることにより溶出を行った（図９）。図中斜線で示
した部分を凍結乾燥し、0.1M酢酸を展開溶媒としてセフ
ァデックスＧ−25カラムにより脱塩した後、再度凍結乾
燥して約20mgの粗画分を得た。

得られた粗画分のうち、約8mgを5mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0）10mlに溶解し、同緩衝液で平衡化したDE52
（Whatman社製）カラム（1.5×4cm）にかけ、０から0.3
Mまでの塩化ナトリウムの直線濃度勾配溶出法により溶
出した（［図10］）。ピークａ、ｂはそれぞれ、△Ｄの
活性型および前駆体であり、両者は完全に分離できた。
図中斜線で示した部分を前駆体画分として集め、凍結乾
燥後、脱塩、再度凍結乾燥して前駆体3.1mgを得た。得
られた前駆体は15％ポリアクリルアミドを支持体とした
SDS−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−PAGEと略す）
（Laemmli,U.K.（1970）Nature 227,680−685）で単一
のバンドを示し、活性型を全く含まず、純粋であった。

尚、Ｄ−ヘリックスを欠失していないウシホスホリパ
ーゼA₂を酵母により産生させ、培養上清をSP−Sephadex
カラムに上述の方法でかけて得られた画分を同じ条件で
DE52カラムにかけた場合には前駆体と活性型は分離せ
ず、同一ピークとして溶出した（［図11］）。

次に、Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂の前駆体の活性化は
以下のように行った。前駆体1.5mgを10mM塩化カルシウ
ムを含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）1.5mlに溶解
度、トリプシンを３μｇ加え、０℃で90分間消化した。
消化後、0.1Mフルオロりん酸ジイソプロピル（DFP）イ
ソプロパノール溶液を15μ添加してトリプシン活性を
停止させ、0.1M酢酸を展開溶媒として、セファデックス
Ｇ−25カラム（1.2×25cm）で脱塩すると同時に、トリ
プシンにより切断されたペプチド断片も除去した後、凍
結乾燥して活性型のＤ−ヘリックス欠失型PLA₂1.5mgを
得た。

得られた活性型Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂はSDS−PAG
Eで前駆体よりも低分子量の単一のバンドを示し、純粋
であった。また、¹⁴Cでラベルしたジパルミトイルホス
ファチジルコリンを用いた活性測定（Tanakaら，（198
8）Gene,64,257−264）では、活性型△DAは天然型ウシ
ホスホリパーゼA₂と同程度の活性を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤ−ヘリックス欠失型ウシPLA₂アミノ酸配列を
暗号化するDNA断片およびそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示す模式図、第２図は天然型のウシPL
A₂アミノ酸配列を暗号化するDNA断片を含んでいる該ウ
シPLA₂の発現に有用な合成遺伝子および該遺伝子によっ
てコードされている有意なアミノ酸配列を示す模式図、
第３図は第２図に示すDNA断片を合成するための22本のD
NAオリゴマーの構成を示す模式図、第４図はプラスミド
pBSPLA₂−4.2−７の構築模式図、第５図は第１図に示す
Ｄ−ヘリックス欠失型PLA₂の、欠失部分のアミノ酸配列
を、天然型のPLA₂のアミノ酸配列（57〜79番）と対比さ
せて示した模式図、第６図は第５図に示す欠失部分のDN
A断片を合成するためのDNAオリゴマーの構成を示す模式
図、第７図はプラスミドpBSPLA−△Ｄの構築模式図、第
８図はプラスミドpEK201−△Ｄの構築模式図、第９図は
サッカロマイセス・セレビシエDC5pEK201−△Ｄの培養
液をセファデックスカラムにかけ、流出するフラクショ
ンの溶出パターンを示すグラフ、第10図は、第９図に於
けるPLA₂に富むフラクションDE52カラムクロマトグラフ
ィーにかけたクロマトグラフを示すグラフであり、第11
図は、天然型PLA₂を同様に酵母で発現させて処理し、DE
52カラムにかけて得たクロマトグラムを示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｖ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（1978）Ｖｏ ｌ．124，Ｐ53−60 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（1987）Ｖｏ ｌ．916，Ｐ94−97 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （1985）Ｖｏｌ．260，Ｎｏ．21，Ｐ 11627−11634 Ｔｏｘｉｃｏｎ，（1986）Ｖｏｌ. 24，Ｎｏ．６，Ｐ．527−541

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第２図における第59番目から64番目のアミ
   ノ酸配列に相当するＤ−ヘリックスを欠失した変異型ホ
   スホリパーゼA₂をコードしているDNA断片。
2. 【請求項２】第１図記載の第１番から第117番までのア
   ミノ酸配列をコードしているDNA配列からなる請求項１
   に記載のDNA断片。
3. 【請求項３】請求項１に記載のDNA断片を酵母の遺伝子
   発現系の制御下に含有している組換え体プラスミド。
4. 【請求項４】pEK201−△Ｄである請求項３に記載のプラ
   スミド。
5. 【請求項５】請求項３または４に記載のプラスミドで形
   質転換された酵母株。
6. 【請求項６】サッカロマイセス・セレビシエDC5（pEK20
   1−△Ｄ）である請求項５に記載の酵母株。
7. 【請求項７】請求項５または６に記載の形質転換された
   酵母株を培養して培養媒質中にＤ−ヘリックス欠失型ホ
   スホリパーゼA₂を蓄積せしめ、該培養媒質からＤ−ヘリ
   ックス欠失型ホスホリパーゼA₂を回収することを特徴と
   するＤ−ヘリックス欠失型ホスホリパーゼA₂の製造法。
8. 【請求項８】第１図に記載の第１番から第117番までの
   アミノ酸配列からなるＤ−ヘリックス欠失型ホスホリパ
   ーゼA₂ポリペプチド。