JPH02150282A - 修飾ヒトｐｓｔｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、修飾ヒトＰＳＴ　ＩをコードするＤＮＡ配列
および修飾ヒトＰＳＴＩに関する。

（従来の技術） 膵臓に由来するトリプシンインヒビターには。

膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ　；ｐａｎ
ｃｒｅａｔｉｃｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｔｒｙｐｓｉｎ　
１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　）および塩基性膵トリプシンイン
ヒビター（ＢＰＴＩ　；　ｂａｓｉｃ　ｐａｎｃｒｅａ
ｔｉｃｔｒｙｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ）の２種類
が知られている。これらのうちＰＳＴＩは哺乳動物全般
に存在し、膵臓の他、腎臓、肺臓、肺臓、肝臓、脳など
の臓器に分布する。ＢＰＴＩは反栃動物１例えばウシの
膵臓など各種臓器に分布するが、ヒトをはじめとするそ
の他の哺乳動物には存在しない。Ｐｕｂｏｌｓら（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋＋＋、　２４９．２２３５．１９７４）および
Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎら（Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４３．５６９．１９７４）は
それぞれヒト膵液中からヒトＰＳＴＩを分離精製し、　
Ｇｒｅｅｎｅら（ＭｅｔｈｏｄｓＢｎｚｙｍｏｌ、４５
．８１３．１９７６）はその構造を明らかにした。さら
に、白木ら（Ｂｉｏ−ｃｈｅｗ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ｒｅｓ。

Ｃｏａ＋ｍｕｎ、　１３２．６０５．１９８５）は、ヒ
トＰＳＴＩのＤＮＡ配列を明らかにした（第５図）、ヒ
トＰＳＴＩは第５図に示すように、５６個のアミノ酸か
らなる分子量６，２４２のペプチドである。このＰＳＴ
Ｉ中のＣｙｓのＳ）ｌ基は。

アミノ酸配列の９番目と３８番目、１６番目と３５番目
。

および２４番目と５６番目とでそれぞれＳ−８結合して
おり、該ＰＳＴＩ中にはＳＨ基は存在しないことが知ら
れている。

上記トリプシンインヒビターは、膵線房細胞に存在し、
健常人においては、これが膵酵素とともに膵液中に分泌
されて、膵管内で起こるトリプシンの活性化を阻止して
いる。しかし２例えば急性膵炎時には、何らかの原因で
トリプシンが活性化されると、トリプシノーゲンをはじ
めとする他の酵素前駆体の連鎖反応的活性化が起こり、
その結果、ＩｉＩ器の自己消化が起こると考えられる。

このような２．性膵炎時には、トリプシンインヒビター
を投与することが治療に有効である。トリプシンインヒ
ビターとしては、上記ウシ膵臓由来のＢＰＴＩ。

化学合成阻害剤などが現在用いられている。ヒトＰＳＴ
Ｉは、その起源から考えてこのような治療に使用するト
リプシンインヒビターとして最も適切であると考えられ
る。しかし、このＰＳＴＩは従来はヒト膵臓液中から分
離精製されていたため、治療に使用できるほど大量に得
ることができず、今まで使用されなかった。この量的問
題を解決するために１発明者らは遺伝子組換え技術を用
いてヒト　ＰＳＴＩを大量に得る方法を開発した（特開
昭６２−２５３４３７号公報）。この方法によれば、ヒ
トＰＳＴ　ＩはＡＰＩ　（アミノグリコシド３′　−ホ
スホトランスフェラーゼ■）との融合タンパクとして発
現する。このヒトＰＳＴ　Ｉ融合タンパクは、微生物宿
主で大量に生産することが可能であり、該融合タンパク
を臭化シアンで切断処理することによりヒトＰＳＴＩの
みを単離・精製することができる。この方法によって得
られたヒトＰＳＴ　Ｉは天然のヒトＰＳＴ　Ｉと同様の
アミノ酸配列を有しており、治療に用いた場合にも天然
のヒトＰｓＴＩと同様の治療効果が期待できる。しかし
。

ＰＳＴＩもペプチドであるため９時間の経過と共に徐々
にトリプシンなどのタンパク分解酵素の作用を受けて分
解されてしまうという欠点があった。そのため、トリプ
シンの阻害効果を十分に持続させるためには１時間の経
過と共に分解されたＰＳＴＩの量を調べ、その等量を追
加するなどの煩雑な検査や処置が必要であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、天然のヒトＰＳＴＩよりもト
リプシンなどのタンパク分解酵素により分解されにくい
修飾ヒトＰＳＴＩを提供することにある。本発明の他の
目的は、遺伝子組換え技術を用いて。

上記優れた性質を有する修飾ヒトＰＳＴＩをコードする
ＤＮＡ配列を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは、ヒｌ−ＰＳＴＩをコードする遺伝子に部位
特異的突然変異を導入することにより、天然に存在する
ヒトＰＳＴＩ　（天然型ヒトＰＳＴＩ　）とは特性の異
なるヒトＰＳＴＩ　（修飾ヒトＰＳＴＩ）が得られるこ
とを見い出し２本発明を完成するに至った。

本発明の修飾ヒトＰＳＴＩは、ヒトＰＳＴＩのアミノ酸
配列のＮ−末端から４２番目のアルギニンがグルタミン
に置換されたＰＳＴＩであり、そのことにより上記目的
が達成される。

本発明のＤＮＡ配列は、上記ヒト　ＰＳＴＩのアミノ酸
配列のＮ−末端から４２番目のアルギニンがグルタミン
に置換された修飾ヒトＰＳＴＩをコードし、そのことに
より上記目的が達成される。

本発明の他の修飾ヒトＰＳＴＩは、ヒトＰＳＴ■のアミ
ノ酸配列のＮ−末端から４４番目のアルギニンがセリン
に置換されたＰＳＴＩであり、そのことにより上記目的
が達成される。

本発明の他のＤＮＡ配列は、上記ヒ１−ＰＳＴＩのアミ
ノ酸配列のＮ−末端から４４番目のアルギニンがセリン
に置換された修飾ヒトＰＳＴＩをコードし、そのことに
より上記目的が達成される。

本発明の修飾ヒトＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列は。

例えば、遺伝子組換え技術を用いて、ヒ１−ＰＳＴＩを
コードする遺伝子（発明者らが特開昭６２−２５３４３
７号公報に記述した方法により得られる）を、適当なプ
ロモーターの下流に配した組換え体を調製し。

該ベクター内のヒＩ−ＰＳＴＩ遺伝子に部位特異的突然
変異を導入することにより得られる。ヒトＰＳＴＩのア
ミノ酸配列は比較的短鎖であるため、これを修飾した所
望のヒトＰＳＴＩを合成法により得ることもできる。し
かし、ヒトＰＳＴ　Ｉをコードする遺伝子を有する組換
え体が一度調製されれば、該ベクターに部位特異的突然
変異を導入して所望の修飾ヒトＰＳＴＩをコードする遺
伝子を得ることが容易であるため、この方法が好適に用
いられる。ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子は、すでに
白木ら（前出）によりヒト膵臓細胞からクローニングさ
れ、そのＤＮＡ配列も明らかになっている。この遺伝子
配列は白木らに従ってヒト膵臓細胞から調製することも
できるが、比較的短鎖であるため１合成ヒトＰＳＴＩ遺
伝子を用いるのが有利である。天然のヒトＰＳＴＩのＤ
ＮＡ配列を第５図に示す０本発明においては、第５図に
示すヒトＰＳＴＩのアミノ酸配列をコードするようなり
ＮＡ配列のいずれをも使用することが可能である。この
ヒトＰＳＴＩ遺伝子は、適当なプロモーターのもとで高
発現能を有する遺伝子との融合遺伝子とされる。例えば
、上記特開昭６２−２５３４２７号公報の方法に従って
ＡＰＲ遺伝子との融合遺伝子とするのが好適である。Ａ
ＰＩ遺伝子とは、　ＡＰＩ　　（アミノグリコシド３゛
−ホスホトランスフェラーゼ■）をコードする構造遺伝
子を包含する遺伝子をさしていい、さらにプロモーター
などを包含し得る。

ＡＰＲ遺伝子は、ネオマイシンおよびカナマイシンに対
する薬剤耐性を微生物に与える。

このＡＰＩ遺伝子の塩基配列は公知である（Ｇｅｎｅ＋
１９、３２７．１９８２）　、その塩基配列および該塩
基配列から推定されるＡＰＨのアミノ酸配列を第６図に
示す。この塩基配列を含むトランスボゾンＴｎ５および
プラスミド（例えば、　ｐＮｆ！０　（ファルマシア）
）が市販されており、　ＡＰＩ遺伝子は、これらから切
り出して得ることができる。ＡＰＩ遺伝子は天然のＡＰ
Ｉ（構造遺伝子を全て含んでいる必要はなく、Ｎ末端の
いくつかのアミノ酸をコードするものであってもよい。

例えば、　ｐＮＥＯ（ファルマシア）のＨｉｎｄｌｌＩ
石■制限断片（八Ｐ）！プロモーターとＡＰＩのＮ末端
から８２番目までのアミノ酸配列をコードするする遺伝
子；第６図中の一３５０〜２４６番目のＤＮＡ配列に対
応）が使用され得る。さらに、第６図に示す配列のみな
らず、多少の塩基が置換、欠失または挿入されたものも
同等の発現能を有するので、そのような変異ＡＰＩ遺伝
子も用いられ得る。

本発明の修飾ヒトＰＳＴＩをコードする遺伝子を得るに
は２例えばまず、ヒトＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列
の合成を行う。このようなりＮＡ配列は２例えば、第７
図に示す２０種類のフラグメント（Ｕ−１〜ｕ−ｉ。

およびＬ−１〜Ｌ−１０）を核酸自動合成機を用いて合
成し、高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーにより精製し、Ｕ−１およびＬ−１０以外のフラ
グメントにりン酸残基を付加した後にリガーゼにより連
結することにより合成される。このような方法は、　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．２９５９（
１９８５）に記載されている。連結後のＤＮＡは、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動などの常法を用いて分離される。ポリアクリル
アミドゲルからのＤＮＡの回収は１例えば。

モレキュラークローニング（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
、１９８２）に記載されている。

ＤＥＡＥ−メンブレンによる吸着および溶出により行う
ことができる。

回収されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定するためには９
例えば９Ｍ１３フアージ系ベクターに該ＤＮＡ断片を挿
入し、これにより適当な宿主を形質転換して、スクリー
ニングを行う。Ｍ１３ファージ系ベクターとしては、　
Ｍｌ、３＋＋ｐｌＯ（宝酒造）が好適に用いられる。こ
のファージベクターを適当な制限酵素で切断し、　Ｔ４
　ＤＮＡリガーゼにより上記ＤＮＡ断片を連結すること
により、ヒトＰＳＴＩをコードするＤＮＡを有する組換
え体ファージＭ１３−ＰＳＴＩが調製される。

このＭｌ３−ＰＳＴＩを適当な宿主細胞に導入する。こ
れは９例えば、モレキュラークローニング（前出。

２５０−２５１）に記載されている方法により行うこと
ができる。宿主細胞としては、大腸菌に一１２株ＪＭ１
０３が好適に用いられる。Ｍ１３ｍｐｌＯが導入された
菌は青色のプラークを形成するが、　Ｍｌ３−ＰＳＴＩ
が導入されて形質転換された菌は無色のプラークを形成
する。従って、無色のプラークから得られたファージＤ
ＮＡを大腸菌に接種し培養して増殖させることにより、
培地上清からは１本鎖が、そして菌体内からは２本鎖Ｄ
ＮＡが得られる。１本鎖ＤＮＡの調製は、メッシングの
”方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙａ＋ｏ１．１０１．
２０２８（１９８３）　）により行うことができる。こ
の１本鎖ＤＮＡをジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１
４．１２０５−１２１０（１９８１）により塩基配列決
定することにより、目的とするヒトＰＳＴＩの全構造遺
伝子が挿入されていることが確認される。この方法は一
般的であり２例えば。

市販のＭ１３シーケンシングキット（宝酒造）が利用さ
れる。菌体から２本鎖ＤＮＡを調製するには。

常法である水酸化ナトリウム−ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＯ３）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
１．１５１３−１５２３（１９７９）　）が用いられる
。この方法により得られる２本鎖ＤＮＡは２発現プラス
ミドの構築に使用される。

このようにして得られるＰＳＴＩ遺伝子を含むＭ１３フ
ァージ系組換え体からＰＳＴＩ遺伝子を切り出し。

上記ｐＮＥＯなどのＡＰＨ遺伝子を含むベクターから切
り出したＡＰ）ｌ遺伝子とともに適当なプラスミドベク
ターに組み込むことによりＰＳＴＩ発現プラスミドが得
られる。このとき、上記ヒトＰＳＴＩ遺伝子配列の５′
末端にＭｅｔをコードする配列（ＡＴＧ）　　を配して
上記ＡＰＩ遺伝子と接続するのが好適である。このよう
に、　＾ＰＨとヒ１−ＰＳＴＩの間にＭｅｔを配する融
合タンパクをコードするように遺伝子を構築すれば１発
現された融合タンパクを臭化シアンで処理することによ
りＡＰＩとＰＳＴＩ間の結合を切断し、容易にヒトＰＳ
ＴＩを単離することが可能である。発現プラスミドは１
例えば、１）上記２本鎖ＤＮＡをＡｃｃ　ＩおよびＢａ
ｎ旧で切断処理したｘｓｏｂｐのＤＮＡ断片；２）ｐＵ
ｃ１３の垣、ｎｄＩ［［−町復旧切断後の約２．８Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片；および３）ｐＮＥＯ（Ｔｎ５のＡＰＩ
遺伝子を含む）を旧ｎｄｌＩ［およびＬ徂■で消化して
得られる約６００ｂｐのＤＮＡ断片；を連結することに
より構築される（［１ＩＩＣ１３−ＰＳＴＩ　）。

この構築に用いられるプラスミドベクターは、上記２）
のｐＵｃ１３の他にｐβ−ｇａｌ１３ｃ、　ｐＯＰ２０
３−１３．　ｐＵｃ９゜ｐＬＩｃ８．　ｐＥＡ３００．
　ｐｔｒｐＬｌ、　ｐＢＮ７０．　ｐＨ７１１１，ｐＨ
７１２１゜ｐＷＴ１３１．　ｐＫＫ２２３−３．　ｐＤ
Ｒ５４０，ｐＤＲ７２０，ｐＹＥＪＯＯｌ。

ｐＰＬ−１ａｍｂｄａ、　ｐＫｃ３０．　　ｐＫｃ３１
．　ｐＡｓｌ、　ｐＬＣ２４，ｐｉ（ＵＢ４゜ｐｌＮ−
１、ｐＩＮ−■、　ｐｌＮ−１１１，ｐｃ１９４．　ｐ
ｃ２２１．　ｐＵＢ１１２゜ｐＴ１２７．　ｐｓＡＯ５
０３，ｐＨ１９４などが挙げられるが、これに限定され
ない。上記ヒトＰＳＴ■とＡＰＩＩ遺伝子との融合遺伝
子を運搬して微生物中で発現し得るものであれば、当業
者が一般に形質転換などに用いるベクターが全て使用で
きる。これらのベクターを宿主に応じて適当に選択し、
上記融合遺伝子を適切なプロモーターの制御下に配すれ
ば、　ＡＰＩとヒトＰＳＴＩの融合タンパクを発現しう
る組換え体を構築することができる。３）のｐＮＥｏを
消化して得られるＤＮＡ断片には、　ＡＰＩ（遺伝子の
プロモーターが含まれるが、このプロモーターを他のプ
ロモーターに変換したり、あるいは、　ＡＰＩ遺伝子を
さらに強力なプロモーターの下流に配してもよい。使用
され得るプロモーターには、　　Ｉａｃ系プロモーター
Ｔｒｐ系プロモーター、　Ｔａｃ系プロモーターなどが
ある。

上記１）、　２）および３）のＤＮＡ断片から得られる
発現プラスミドは、適当な宿主に導入され、宿主がＰＳ
ＴＩを生産することにより確認される。例えば。

上記発現プラスミドｐＵｃ１３−ＰＳＴＩを、モレキュ
ラークローニング（前出）の方法に従って適当な宿主細
胞に導入して形質転換することにより、ヒトＰｓＴ■が
ＡＰＨとの融合タンパクとして発現することが確認され
る。宿主細胞としては、大腸菌（例えば。

Ｋ−１２株ＪＭ１０３．　Ｃ６００，ＡＧ−１など）、
枯草菌などを用いれば、ヒトＰＳＴＩを効率よく産生で
きる。天然ヒトＰＳＴＩは糖鎖を持たないため、これら
の原核細胞中において天然と同様のヒトＰｓＴＩが産生
される。

形質転換された宿主細胞は、アンピシリン耐性を指標に
選択される。さらに、この細胞に含まれるプラスミドを
旧ｎｄ　■、　Ｂａｍ旧およびＰｓｔｌで切断し。

水酸化ナトリウム−３ＤＳ法により分析して約３．６Ｋ
ｂｐのＤＮＡバンドとして得られるプラスミドを選択す
る。このようにして選択されたプラスミドを含む宿主細
胞をアンピシリン存在下で培養し、菌体を集めて可溶化
した後５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析すると、ヒトＰＳＴＩとＡＰＩと
の融合タンパクである分子量１５．０００に対応するバ
ンドが検出され、該融合タンパクが宿主細胞内で発現し
ていることが確認される。

融合タンパクからヒトＰＳＴＩを採取するには、上述の
ようにＭｅｔが挿入されているので、臭化シアンで処理
することにより容易にヒトＰＳＴＩを分離できる。この
方法以外にも２両タンパク間にＣｙｓを挿入して２−ニ
トロ−５−チオシアノ安息香酸で切断する方法、　　Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙを挿入してヒドロキシルアミンで切断する
方法、　　Ｔｒｐを挿入して２−（２−ニトロフェニル
スルフェニル）−３−メチル−３−フロモインドールで
切断する方法、　ＬｙｓまたはＡｒｇを挿入してトリプ
シンで切断する方法、　−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−を挿入して血液凝固因子Ｘａで切断する方法など
が一般的に用いられており、ヒトＰＳＴＩのアミノ酸組
成を考慮して、これらの方法を適宜用いることが可能で
ある。

融合タンパクから切断されたヒトＰＳＴＩは、常法通り
、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、遠心分離
操作などを適当に組み合わせて精製できる。精製された
ＰＳＴＩのアミノ酸分析を行うと、天然のアミノ酸組成
と完全に一致するヒトＰＳＴ　Ｉが産生されたことが確
認される（実施例１゜表１）。

次いで１本発明の修飾ヒトＰＳＴＩを得るために。

上述の発現プラスミドｐＵｃ１３−ＰＳＴＩを利用して
ヒトＰＳＴＩ遺伝子に部位特異的突然変異を導入する。

このことにより、所望の修飾ヒトＰＳＴ　Ｉをコードす
るＤＮＡを有する組換え体が得られる。この部位特異的
突然変異処理とは、　ＤＮＡの化学合成技術と［ｌＮＡ
複製の酵素反応を巧みに組合わせたものである。

この処理を行うにはまず、　ＤＮＡ配列のうち変更しよ
うとする部位の塩基のみが他の塩基に変更され。

該塩基を含みかつ他の塩基は目的のＤＮＡと相補的なオ
リゴヌクレオチド（短いＤＮＡ断片）を化学合成する。

このＤＮＡ断片と変異処理をしようとするＤＮＡ　　（
あらかじめ１本鎖にしておく）を対合させる。その後、
このＤＮＡ断片をブライマーとしてＤＮＡ合成酵素を作
用させると、変更した塩基配列を持つ化学合成オリゴヌ
クレオチドを含み、他の部分は元のＤＮＡと相補的なり
ＮＡが合成できる。つまり。

所望の部分に変異が導入されたＩＩＮＡの分子が、この
方法で任意に合成できる。上記部位特異的突然変異の手
法により修飾ヒトＰＳＴ　ＩをコードするＤＮＡを有す
る組換え体を調製するには２例えばまず。

ｐＵｃ１３−ＰＳＴＩをＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ旧
などの制限酵素を用いて切断し、ヒトＰＳＴＩとＡＰＩ
との融合遺伝子を得る。これをＭ１３ファージ系ベクタ
ーであるＭ１３＋ａｐｌＯに連結させ、ファージ組換え
体Ｍ１３−ＡＰＨ／ＰＳＴＩを調製する。他方２例えば
、以下の（１）〜（３）のような化学合成オリゴヌクレ
オチドを核酸自動合成機を用いて調製する。

Ｓｅｔ　（４４）　−ＰＳＴ　１ ５”−ＡＡＴ　　ＣＧＧ　　ＡＡＡ　　ＡＧＣＣＡＧ　
　ＡＣＴ　　Ｔ−３’Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ
　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　　　　　　（１）Ｇｉｎ（４２）−
ＰＳＴＩ ５’−ＴＴ　　ＧＡＡ　　ＡＡＴ　　ＣＡＧ　　ＡＡＡ
　　ＣＧＣＣＡ−３’Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　　　　　　　　　（２）Ｔｈｒ（４３）−Ｐ
ＳＴＩ ５“−ＡＡ　ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＣＧＣＣＡＧ　
ＡＣ−３’八ｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　
Ｇｉｎ　　　　　　　　　　　　　（３）合成されたオ
リゴヌクレオチド（１）〜（３）は、ゲル濾過、高速液
体クロマトグラフィーなどの適当なりロマトグラフィー
を組合わせることによりそれぞれ精製される。これらの
精製合成オリゴヌクレオチドをリン酸化した後、上記組
換え体Ｍ１３−ＡＰ）Ｉ／ＰＳＴＩ（あらかじめ、１本
鎖にしておく）にアニールさせる。このアニール混合物
からクレノーフラグメント（クレノー酵素）およびＤＮ
Ａ　リガーゼにより２本鎖ＤＮＡを合成し、ニトロセル
ロース・フィルターなどを用いて未反応の１本鎖ＤＮＡ
を除去する。

この２本鎖ＤＮＡから、修飾ヒトＰＳＴＷ　（Ｓｅｔ（
４４）−ＰＳＴＩ。

Ｇｉｎ（４２）−ＰＳＴＩおよびＴｈｒ（４３）−ＰＳ
ＴＩ）をコードするＤＮＡを有する組換え体が調製され
る。

ジデオキシ法によりこれらの組換え体に含まれる修飾Ｐ
ＳＴ　ＩのＤＮＡ配列を決定すると、目的とする修飾ヒ
トＰＳＴＩの構造遺伝子の全域を含んでいることが確認
される。発明者らは、このようにして。

ヒトＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列の５゛−末端から
１２５２５番目アニンがアデニンに変化したＤＮＡ配列
（対応するアミノ酸のＮ−末端から４２番目のアルギニ
ンがグルタミンに変化したタンパクＧｉｎ（４２）−Ｐ
ＳＴＩに相当）；５′−末端から１３０３０番目トシン
がアデニンに変化したＤＮＡ配列（対応するアミノ酸の
Ｎ−末端から４４番目のアルギニンがセリンに変化した
タンパク５ｅｔ（４４）−ＰＳＴＩに相当）；および５
“末端から１２８２８番目デニンがシトシンに変化した
ＤＮＡ配列（対応するアミノ酸のＮ−末端から４３番目
のりシンがトレオニンに変化したタンパクＴｈｒ（４３
）−ＰＳＴＩに相当）を得た。これらのうちＧＩｒ＋（
４２）ＰＳＴＩおよび５ｅｔ（４４）−ＰＳＴＩの塩基
配列およびそれに相当するアミノ酸配列を第１図および
第２図にそれぞれ示す。

次いで、修飾し）ＰＳＴＩを発現させるために発現プラ
スミドを構築する。それにはまず、上記ＡＰＨおよび修
飾ヒトＰＳＴＩをコードする融合遺伝子を含む組換え体
を制限酵素り夕ＲＩおよび坦ｎｄｌｌｌで処理すること
により該融合遺伝子を切り出す、このＤＮＡ断片をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動などにより分離し、適当な
プラスミドベクターに挿入する。

プラスミドベクターとしては、上述のヒトＰＳＴＩを発
現するための発現ベクターに用いられるプラスミドがい
ずれも使用され得、　　ｐＵｃ１３が特に好適に使用さ
れる。

このようにして調製された発現プラスミドを。

上述のし）ＰＳＴＩを得る場合と同様に、適当に微生物
宿主に導入することにより、修飾ヒトＰＳＴＴとＡＰｔ
ｌとの融合タンパクが生産される。修飾ヒトＰＳＴＩタ
ンパクはこのように、融合タンパクとして発現するため
、該微生物により生産されるプロテアーゼで分解される
のが回避される。得られた融合タンパクは、上記適当な
方法により切断され、修飾ヒトＰＳＴＩが得られる。得
られた修飾ヒトＰＳＴＩ　（Ｓｅｔ（４４）−ＰＳＴＩ
、　Ｔｈｒ（４３）−ＰＳＴＩおよびＧ　１　ｎ　（４
２）　−ＰＳＴ　Ｉ）のアミノ酸分析を行うと、各修飾
ヒトＰＳＴＩにはもとのＰＳＴ　Ｉから予想されるアミ
ノ酸残基の増減が起こっていることが示される（実施例
２１表２）。

各修飾ヒトＰＳＴＩのヒトトリプシンに対する阻害活性
を調べると、　Ｇｉｎ（４２）−ＰＳＴＩおよびＳｅｒ
　（４４）　−ＰＳＴ　Ｉでは、天然のヒトＰＳＴＩで
観察されるＰＳＴＩの一時阻害が天然のヒトＰＳＴＩに
比べて弱くなり、トリプシンインヒビターとしての活性
の持続性が増していることがわかる（実施例２．第３図
および第４図）。

このように２本発明によれば、優れた特性を有する修飾
ヒトＰＳＴＩが得られる。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

天然ヒ１−ＰＳＴＩ遺伝子のＯＮ＾塩基配列は、白木ら
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏａ＋ｍｕｎ、、１３２，６０５（１９８５））によっ
て決定された配列を採用した。このヒトＰＳＴ　１成熟
型タンパクの構造遺伝子をコードするＤＮＡ配列を合成
し、該配列の５°−末端にはＭｅｔをコードするＡＴＧ
を、そして３°−末端には終止コドンＴＡＧを結合させ
た。さらに、この開始コドンと終止コドンを含むＤＮＡ
配列の５゛−末端には制限酵素Ａｃｃ　■の認識部位を
、そして３゛−末端には制限酵素Ｂａｎ＋ＨＩの認識部
位を有するように塩基配列を付加し、鎖長１７９と１８
１の２本鎖を形成するように設計した。

次に、適切な配列順序で結合させた場合にヒトＰＳＴＩ
のアミノ酸配列をコードするような塩基配列を含むＤＮ
Ａ鎖（第７図、　ｌｌ−１〜Ｕ−１０）　、および該ｏ
Ｎａ鎖に相補的なりＮＡ鎖（第７図、　Ｌ−１〜Ｌ−１
０）をそれぞれ形成する２群の短鎖ＤＮＡフラグメン１
−２０種の化学合成を試みた。これらのフラグメントは
、全種類を混合した場合、互いに相補的部分で水素結合
を形成し、制限酵素の認識部位となる粘着末端を有する
２本鎖構造を形成しうる（第７図）。

まず、上記２０種の短鎖ＤＮＡフラグメント（Ｕ−１〜
Ｕ−１０およびＬ−１〜Ｌ４０）を、核酸自動合成機Ｇ
ＢＮＥＴＡ−１１（日本ゼオン株式会社製）を用いて調
製した。

得られた各フラグメントはセファデックスＧ−５０を用
いるゲルクロマトグラフィー、および逆相系シリカゲル
カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１０ＣＩ８．１０Ｘ２５
０ｎ＋ｍ）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより
精製した。

合成された２０種のオリゴヌクレオチドは、５′末端に
リン酸残基をもたないので、そのままＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行うことができない。

そこで、上記の２０種の合成オリゴヌクレオチドのうち
、Ｕ−１およびＬ−１０以外の１８種の合成オリゴヌク
レオチドについて、５”−末端へのリン酸残基の酵素的
付加反応を行った。このリン酸残基付加反応はＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて行った。各オ
リゴヌクレオチド約３００ｐｓ＋ｏｌを２５μｌのキナ
ーゼ反応溶液（５０ｄ）リス塩酸緩衝液、　１０ｍＭ塩
化マグネシウム、　１０＋ｍＭ　’ｌ−メルカプトエノ
クール、　　ＡＴＰ約１０００ｐ＋ｗｏｌ、　ｐ）１７
．６）に溶解し。

３単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを反応溶液に加
えて反応を開始した０反応は３７°Ｃにて１時間行った
。この反応溶液を熱処理（６５°Ｃｌ２Ｏ分間）するこ
とによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた後
、該溶液をそのまま連結反応に用いた。

リン酸残基を付加されたＵ−２〜Ｕ−１０，Ｌ−１〜Ｌ
−９の１８種の合成オリゴヌクレオチドと、リン酸残基
の付加を行っていないロー１．およびＬ−１０の合成オ
リゴヌクレオチドとを各５０ｐｍｏｌずつ混合し、連結
反応溶液を調製した。連結反応溶液をまず８０’Ｃにて
２分間処理し、　２０℃まで徐冷した。その後、ジチオ
スレイトール、　　ＡＴＰおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ
を加え、連結反応を４°Ｃにて５日間行った。この連結
反応溶液（２００μ２）は、最終的に６６ｍＭ　）リス
塩酸緩衝液、　６．６ｍＭ塩化マグネシウム、　ＩＯＴ
ＩＭジチオスレイトール、　　１＋Ｍ　ＡＴＰ、　７０
０単位（７）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を含有し
た。これらの操作は基本的に、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５−１３＋　２９５９＋　（１９８５）に
記載の方法に従って行った。連結反応後、フェノール抽
出、エタノール沈殿を常法により行い、その後トリスー
ホウ酸緩衝液を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、目的とする１８０ｂｐ付近のＤＮＡ断片を分離
した。ゲル上で分離されたＤＮＡをエチジウムブロマイ
ドにより染色し、目的とするＤＮＡバンドの近傍のゲル
にＤＥＡＥ−メンブレン（Ｓｃｈ　ｌ　ｌｅ　１ｃｈｅ
ｒ＆　５ｃｈｕｅｌ１社）を挿入した。次いで、電気泳
動的にＤＮＡバンドをＯＦ！ＡＥ−メンブレンへ吸着さ
せることにより、該ＤＮ＾を回収した。ＤＮＡバンドの
ＤＥＡｔ！　−メンブレンへの移動が終了した後、　１
．０Ｍ塩化ナトリウム−１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）　　Ｉ　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡを用いて１）ＮＡ
を該メンブレンより？容出した。この溶出液からエタノ
ール沈殿によりＤＮＡを回収した。

ここで用いた方法は一般的であり９例えばモレキュラー
クローニング（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１
９８２）に詳細に記述されている。

回収されたＤＮＡ断片を、　　ＤＮＡ塩基配列決定のた
めに９Ｍ１３フアージ系ベクターに挿入した。それには
まず、　Ｍ１３ｓｉｐＩＯファージベクター（宝酒造）
を制限酵素伯：ｃＩ、Ｂｃ徂ＩＩで切断し、直鎖状とし
た。

この直鎖状Ｍ１３ａ＋ｐｌＯベクターと上記回収したＤ
ＮＡ断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。

連結反応は１反応温度および時間のみを１２℃と１６時
間にした以外は、前述の合成オリゴヌクレオチドの連結
反応とほぼ同じ条件で行った。連結反応後のＤＮＡを、
モレキュラークローニング（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）
１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ＋　２５０−２５１＋　１９８２）に記載の方法
に従って、大腸菌宿主を形質転換するのに用いた。

対数増殖期の大腸菌に一１２株ＪＭ１０３の培養液を０
°Ｃで塩化カルシウム処理して得られるＤＮＡ受容菌と
、上記連結反応後のＤＮＡとを混合し、水中でインキュ
ベートした。その後、４２℃にて２分間処理することに
より形質転換を行った。Ｍ１３ｎｐｌＯファージに感染
した大腸菌は９次の方法によりプラークとして検出され
る。まず、　ＤＮＡが導入されたＪＭ１０３の菌体を、
　１００ｍＭイソプロとルーβ−Ｄ−千オガラクトシト
２０μ！、２％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−ガラクトシド５０μｆｆｉ、　　ＪＭ１０３菌
の対数増殖期の菌体液０．２ｄ、および軟寒天液（０，
６％寒天液）３ｄの混合物に加え、あらかじめ固化して
おいた１、５％平板寒天上に添加した。ここで使用した
寒天には、　ＴＹ培地（トリプトン８ｇ。

酵母エキス５ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを水１２に溶
かしたもの）が含まれる。３７°Ｃで一晩培養後、形質
転換された菌はプラークを形成した。目的のＤＮＡ断片
が挿入されたＭｔ３ｍｐｌＯファージ（以下。

Ｍ１３−ＰＳＴＩとする）により形質転換された菌は無
色のプラークを形成するが、　該ＤＮＡ断片が挿入され
ていないＭ１３ｍｐｌＯファージにより形質転換された
菌は青色のプラークを形成した。

メッシングの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１
．１０１＋　２Ｏ−２８（１９８３））に従い、上記の
無色のプラークから１本鎖ファージＤＮＡを以下のよう
にして調製した。

大腸菌に一１２株ＪＭ１０３の一晩培養液ｌｌ１１を、
２ＸＴＹ培地１００ｄ　（２Ｘ　ＴＹ培地；１６ｇバタ
トトリブトン。

１０ｇ酵母エキスおよび５ｇ塩化ナトリウムを水１１に
溶かしたもの）に植菌し、３７°Ｃで２時間振盪培養し
た。この培養液を５Ｉｄずつ分注し、プラークが形成さ
れた寒天をキャピラリーピペットで切りだして該培養液
に接種した。その後、さらに培養液を３７°Ｃで５時間
培養し、　Ｗ１３−ＰＳＴＩファージの感染および培地
への放出を行わせた。この培養液中の菌体を複製型２本
鎖ＤＮＡの調製に用い、菌体を除去した培地上清は１本
鎖ファージＤＮＡの調製に用いた。

培地上清４ｄに２０％ポリエチレングリコールを含有す
る２、５Ｍ塩化ナトリウム溶液を８００μ！加え。

遠心分離操作によりファージを集めた。このファージを
５００μｌの１１０１１Ｉトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴ＾）に溶か
し。

フェノール抽出、エタノール沈殿により１本鎖ファージ
ＤＮＡを回収した。ファージ感染菌からの複製型２本鎖
環状ＤＮＡの調製は、常法の水酸化ナトリウム−ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ、工、　１５１３−１５２３（１９７９）
）により次のように行った。まず、５ｄの培養液から得
た菌体を。

１００　μｌの２５１１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０；　
５０ｍＭグルコース、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよびリゾ
チーム４■／ｄを含む）に懸濁し、室温で５分間放置し
た。これに２００μｌの０．２Ｍ水酸化ナトリウム−１
％ＳＯ５を加え。

穏やかに混合した後水中で５分間放置した。その後、１
５０μ尼の５４酢酸カリウム溶液（ｐＨ５，２）を加え
て混合し、水中で５分間以上放置した。遠心分離後、上
清に２倍体積のエタノールを加え、沈殿を回収した。こ
れをさらに７０％エタノールで洗浄した後、遠心し回収
した。この方法により無色のプラークから複製型２本鎖
ＤＮ＾を調製した。これを倶に■および現復旧で二重切
断し、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片が生じることを確認し
た。その後、その同じプラークにより調製した１本鎖フ
ァージＤＮＡを。

ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４．１２０５−１
２１０（１９８１））によるＤＮＡ塩基配列決定に用い
た。塩基配列の決定は２Ｍ１３シーケンーシングキツト
（宝酒造）を用いて行った。このことにより、得られた
クローンが目的とするＰＳＴＩの構造遺伝子の全域を含
んでいゐことが確認できた。塩基配列のｆ！認された複
製型２本鎖ＤＮＡは７次のＰＳＴＩ発現プラスミドの構
築に用いた。

ＰＳＴ　Ｉの発現プラスミドは、以下の３つの断片を連
結することにより構築した： ｌ）上述の合成オリゴヌクレオチドの連結反応により得
られ、塩基配列の確認された約１８０ｂｐのＡｃｃ　Ｉ
−Ｂａｍ旧断片； ２　）　ｐｔｌｃ１３（宝酒造）をＨｉｎｄｌＩＩおよ
び現復旧で切断した後の約２．８ＫｂｐのＤＮＡ断片；
および３　）　ｐＮＥｏ（Ｔｎ５のＡＰＲ遺伝子を含む
、ファルマシア社）をＨｉｎｄｌｌｌで消化し、さらに
Ｌ狙Ｉで消化することにより得られる約ｅｏｏｂｐのＤ
ＮＡ断片（第６図中の一３５０〜２４６番目のＤＮＡ配
列に相当、第８図参照）。

これらのＤＮＡ断片のうち、１）および３）はポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分離し、　ＤＥＡＥメン
ブレンを用いて回収し、連結反応に用いた。

２）の断片は、二重切断を確認した後にフェノール抽出
およびエタノール沈殿することにより回収し、連結反応
に用いた。この３つの断片の連結反応により得られたＰ
ＳＴＩ発現プラスミド（ｐＵｃ１３−ＰＳＴＩ）は、ト
ランスボゾンＴｎ５中にコードされるＡＰ）ｌのアミノ
末端から８２残基下流にＰＳＴ　Ｉが連結されており、
融合タンパクを発現する。この３つの断片の連結反応も
上述の場合と同様に、　Ｔ４　ＯＮＡリガーゼを用いて
行った。連結反応後のＤＮＡは、モレキュラークローニ
ング（前記）に記載の方法に従い。

形質転換に用いた。大腸菌に一１２株Ｃ６００またはＡ
Ｇ−１をＤＮＡ受容菌として用い、形質転換を行った。

形質転換菌はアンピシリンに対する抵抗性を獲得するの
で、アンピシリン含有寒天平板（ＬＢ培地；トリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを１
１中に含む）上でコロニーを形成したものについて選択
した。形成されたコロニーのうち１２個を、アンピシリ
ン４０μｇ／ｒｔｄｌを含むＬＢ培地５ｒｄに白金耳で
植菌し、３７°Ｃで１６時間培養した。

その後、遠心分離操作により菌体を集め、先に述べた水
酸化ナトリウム−３ＤＳ法によりプラスミドの分析を行
った。目的とするプラスミド（ｐＵｃ１３−ＰＳＴＩ）
は、　ＨｉｎｄＩ［Ｉ、町復旧、Ｐｓｔｌに対する切断
部位をそれぞれ−ケ所ずつしか含まないので、該プラス
ミドは各制限酵素消化で直鎖状の約３．６ＫｂのＤＮＡ
バントとして観察された。目的のプラスミドを有するク
ローンを次の発現に用いた。

目的とするプラスミドを持つことが確認されたクローン
は、　ＬＢ培地（アンピシリン４０μｇ７ｍｌを含む）
で培養後、５０％グリセリン存在下−７０°Ｃで保存し
た。この菌体保存液１０μ２をアンピシリンを含む５　
ＪＩＩｌのＬＢ培地へ加え、３７°Ｃで８時間培養した
。

この培養液１００μ２をアンピシリンを含む５ｄのＭ９
培地（Ｍ９培地ニリン酸酸水素子トリウム６ｇ。

リン酸二水素カリウム３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、
塩化アンモニウム１ｇをＩＩｌに溶かし、滅菌後、硫酸
マグネシウムおよび塩化カルシウムをそれぞれ最終濃度
が２ａ＋Ｍおよび０．１ｍＭとなるように加える。さら
に、アンピシリン４０μｇ／ｒｒｄｌ、グルコース０．
５％、カザミノ酸０．５％を含む）に加え。

３７°Ｃで２４時間培養を続けた。培養終了後、遠心分
離操作により菌体を集め、以下の分析に用いた。

少量の菌体をとり、　　ＳＤＳ存在下のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）で分析するため
の試料とした。菌体タンパクを０．１Ｍｌ−リス塩酸緩
衝液（ｐＨ６，８）、　１％ＳＯＳ、　　１％２−メル
カプトエタノール、　２０％グリセリンにより可溶化し
、抽出した後、ゲル電気泳動で分析した。　ＰＳＴＩを
含む融合タンパクは、予想される分子量１５．０００に
対応する位置に主要バンドの１つとして出現し、大腸菌
中で発現されていることが判った。さらに、大腸菌を超
音波処理などで破壊し、遠心分離操作により可溶性タン
パク画分と不溶性タシバク画分とに分画し、これらの両
分を５ＯＳ−ＰＡＧＥ！により調べると、この融合タン
パクは不溶性タンパク画分に主に存在することが判った
。

上記菌体６ｇを２０ＩＩ１１ノｏ、１Ｍトリス塩酸（ｐ
Ｈ７，０゜５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む）に懸濁し、　
１２．０００ｘ　ｇ　ニて１０分間遠心分離した。同様
の操作を繰り返した後。

菌体を１５ｄ（７）０．１Ｍ　）　ＩＪ　ス塩酸（ｐＨ
７，ｏ；　５ｍＭ　ＢＤＴＡ。

５０ｃｍＭベンズアミジンおよび１ｓ＋Ｍフェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む）に懸濁し
、フレンチプレスを用いて４００Ｋｇ／ｃｄの圧力で３
回破砕した。２３，０ＯＯＸ　ｇにて２０分間遠心分離
して得たペレット１．０５ｇを、１０ｉｆｆｉの０．１
？ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０；２ＯＬＬＩＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）およびタンパク変成剤を含む
）に溶解し、セファクリル８２００カラム（２，６Ｘ　
７９ｃｍ　）でのゲル濾過を行った。

溶出は、０．１Ｍ）リス塩酸（ｐＨ７，２；　１ｍＭ　
ＤＴＴおよび７Ｍ尿素を含む）を用いて行った。分子置
駒１７，０００の両分を集め、蒸留水に対して透析した
後凍結乾燥し、１６０■の臭化シアンを含む２ｍｉの７
０％ギ酸を加えて室温で６時間反応させた。その後、蒸
留水１８ｄを加えて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物
を２Ｊ！ｌ！の０．５Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８，ｌ；　２
ｓ＋Ｍ　ＢＤＴＡおよび６Ｍグアニジン塩酸を含む）に
溶解し、１００μ２の２−メルカプトエタノールを加え
、窒素気流下、３７℃で４時間反応させた後、蒸留水に
対して透析した。１０．０００Ｘ　ｇで１分間遠心分離
することにより得られた上清６ｊｄ！に１食塩１７２■
、　　１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）　３２０μｌを加
え、ウシトリプシン−ＣＩ−セファロース４Ｂを充填し
たアフィニティーカラム（２Ｍ３ｃｍ）に吸着させた。

このカラムを、　０．５Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　？−
リス塩酸（ｐＨ８，０）。

さらに蒸留水で順次洗浄した後、　１０ｎ＋Ｍ塩酸でＰ
ＳＴＩを溶出させ、凍結乾燥し、精製品１．５５■を得
た。

得られたヒトＰＳＴＩ　（１２Ｍｇ）を試験管（１０Ｘ
９０ｍｍ）にとり、　４Ｍメタンスルホン酸（０，２％
３−（２−アミノエチル）インドールを含有）５０Ｍ℃
を加え。

減圧下、１１０°Ｃで２４時間加水分解した。この加水
分解物のアミノ酸分析を９日立８３５型アミノ酸分析計
を用いて行った。この結果を表１に示す。表１から明ら
かなように、得られたＰＳＴＩのアミノ酸組成は天然の
ヒトＰＳＴＩ　（理論値）と完全に一致した。また、Ｎ
−末端から３残基のアミノ酸配列をＥｄｍａｎ法（Ｉｗ
ａｎａｇａらの変法、　Ｉ！ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｌ　１８９−１９９、１９６９）で調べたとこ
ろ、　Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｅｕとなり天然のヒトＰＳＴ
Ｉに一致した。さらに、得られたヒトＰＳＴＩは、ウシ
のトリプシンをｌ：ｌのモル比で化学量論的に阻害し、
天然ヒトＰＳＴＩの抗体（ウサギ抗血清ポリクローナル
抗体）との免疫反応性も天然ヒトＰＳＴＩと同じであっ
た（希釈曲線が天然ヒトＰＳＴ　Ｉの挙動に一致した）
。

アミノ酸 Ａｓｐ ｈｒ Ｓｅｔ １ｕ Ｐｒ。

１ｙ ｌａ １／２Ｃｙｓ ａ１ ｅｔ １ｅ Ｌｅｕ ｙｒ ｈｅ ｙｓ ｉｓ ｒｐ 表１ 実験値 ７．８ ３．８ ２．８ ６．２ ２．９ ５．２ １．４ ５．６ ２．０ ０．０ ２．８ ４．０ ２．９ １．２ ３．８ ０．０ ０．０ 実ＪＩＬ１ １．５ｅｒ（４４）−ＰＳＴＩの調製 修飾ヒトＰＳＴＩ　（Ｓｅｔ（４４）−ＰＳＴＩ）の調
製は、　ＡＰＲとＰＳＴＩとの融合タンパクをコードす
る遺伝子を含む１本鎖のＭ１３−＾ＰＨ／ＰＳＴＩ組換
え体を調製して鋳型とし、下記の合成りＮＡオリゴマー
をプライマーとして用いる部位特異的突然変異処理によ
り行った。この操作は、　ＡｍｅｒｓｈａｍのＯｌｉ　
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　ｍｕｔａ　ｅｎｅｓｉｓ　ｓ　ｓｔｅｍのマ
ニュアルに従って行った。

ａ）　ＡＰＨとＰＳＴ　Ｉとの融合タンパクをコードす
る遺伝子を含む１本鎖ＤＮＡの調製 実施例１で得られたＰＳＴＩ発現プラスミドｐｔｌＣ１
３−ＰＳＴＩを含む大腸菌の、　ＬＢ培地での培養液５
Ｍｌから菌体を遠心分離操作により集め、水酸化ナトリ
ウム−３ＯＳ法によりプラスミドを得た。このプラスミ
ドｐＵｃ１３−ＰＳＴＩを２０μｌの１０ｍＭ　ｌ−リ
ス塩酸（ｐＨ８，０；１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する）に
溶解し、制限酵素ＢｉｎｄｕおよびＲａｍ旧とともに３
７℃にて１．５時間反応させて切断した。得られたＤＮ
Ａ断片をアガロース電気泳動により分離し、　ＤＥＡＥ
メンブレンを用いて回収した。ｑのＤＮＡ断片を、　Ｈ
ｉｎｄｌｌｒおよびＢａｎ＋旧で切断処理したファージ
Ｍ１３ｍｐｌＯにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
、　　ＡＰＲとＰＳＴＩとの融合タンパクをコードする
ＤＮＡを含む組換え体（Ｍ１３−ＡＰＨ／ＰＳＴＩ　）
を作製した。この組換え体を用いて、０°Ｃ処理後の４
２°Ｃでの処理時間を１．５分にしたこと以外は実施例
１と同様の条件で、大腸菌に一１２株ＪＭ１０３を形質
転換した。Ｍ１３−ＡＰＨ／ＰＳＴＩが導入されたＪＭ
１０３の菌体を、実施例１と同様に平板寒天で一晩培養
し、この−晩培養液２ｍｌを使用して無色のプラークを
生じた菌から１本１ｊＤＮＡを調製した。

ｂ）プライマーの合成 部位特異的変異処理のプライマーとして用いるために、
以下の塩基配列（１）で示されるＤＮＡフラグメントを
核酸自動合成機Ｇｌｌ！ＮＥＴ　Ａ−ＩＩ　（日本ゼオ
ン株式会社製）を用いて合成した。このＤＮＡフラグメ
ントは、天然型ヒトＰＳＴＩのアミノ酸配列の４４番目
のＡｒｇをＳｅｒに置換した。修飾ヒトＰＳＴ　Ｉの４
０〜４４番目までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を含む。

５’−ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＡＡＡ　ＡＧＣＣＡＧ　ＡＣＴ
　Ｔ−３’＾５ｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　
Ｔｈｒ　　　　　　（１）得られたＤＮＡフラグメント
を、セファデックスＧ５０を用いるゲルクロマトグラフ
ィーおよび逆相系シリカゲル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ
１８；１０μｍ、　１０Ｘ１０Ｘ２５０を用いた高速液
体クロマトグラフィーにより精製した。

Ｃ）インビボでの部位特異的変異処理 ２）項で精製したＤＮＡフラグメント（１）の２００ｐ
ｎｉｏｌを、１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
；　１０ｍＭ　ＭｇＣ１□。

１０ｍＭ　ＤＴＴおよび０．５ｍＭ　ＡＴＰを含有する
）に溶解し。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＬ　ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ）１０単位とともに３７°Ｃにて１時間反応さ
せてリン酸化を行った。その後、６５°Ｃにて１０分間
熱処理することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。５倍希釈した緩衝液１　（Ａｍｅｒｓｈａ
ｗ）　１１ｕ　ｌ中で、上記リン酸化されたＤＮＡフラ
グメントの５ｐｍｏ　１と、　ａ）項で得られた１本鎖
組換え体（Ｍ１３−＾ＰＨ／ＰＳＴＩ、　１．５　ｐｍ
ｏｌ）とをアニールさせた。この反応は、７０°Ｃにて
１０分間に次いで３７°Ｃにて３０分間インンキュベー
トすることにより行った。このアニール混合物１７μｌ
に、　１００ｍＭ　ＭｇＣｌ４５μ２．ヌクレオチド混
合物（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘ　１；　Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）１９μ２．水６μｆ、　　ＤＮＡポリメラー
ゼＩクレノー断片（３，８単位／μｆｆ１）１．６μ！
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（２，５単位／μｌ＞２．４
μ２を添加し、１６°Ｃにて１晩（１９〜２１時間）反
応させて２本鎖ＤＮＡを合成した。

次いで、この混合液をニトロセルロースフィルターで処
理することにより２本鎖にならなかった１本鎖ＤＮＡを
除去した。２本鎖ＤＮＡを含有する溶液に１／１０体積
の３Ｍ酢酸アンモニウム、および２．５倍体積のエタノ
ールを添加してＤＮＡを沈澱させた。

得られたＤＮＡ沈澱物を緩衝液２　（Ａ＋＋＋ｅｒｓｈ
ａａ＋）　２５μｍに溶解し、その１０μ！に緩衝液３
　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　６５μ２および制限酵素Ｎｃ
ｉｌ（８単位／μｆｆｉ、０．７μりを添加し、３７°
Ｃにて９０分間反応させた。この反応混合物６５．７ｕ
ｆに、　　５００ｍＭ　ＮａＣ１１２ｕ　ｌ。

緩衝液４　（Ａ＋ｍｅｒｓｈａ醜）１０μ２およびエキ
ソヌクレアーゼ■（２５単位／μり２μ２を添加し、３
７’Ｃにて２８分間反応させた。この反応液を７０℃に
て１５分間熱処理して酵素反応を停止させた。その後。

１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　５　ｕ　ｌ　、ヌクレオチド
混合物２　（Ｎｕ−ｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘ　２）　
１３μｌ　、　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（３，５単位／
μｆｆｉ　）　０．８６μ！およびＴ４　ＤＮＡリガー
ゼ（２，５単位／μｍ　）　０．８μｌを添加し、１６
°Ｃにて４時間反応させた。このようにして５ｅｔ（４
４）−ＰＳＴＩ遺伝子を含む２本鎖ＤＮＡを調製し、以
下のような形質転換に用いた。

対数増殖期の大腸菌に一１２株ＪＭ１０３の培養液を０
°Ｃにて塩化カルシウム処理して得られるＤＮＡ受容菌
と２上記５ｅｔ（４４）−ＰＳＴＩ遺伝子を含む２本鎖
ＤＮＡとを混合した。この混合液を０℃にて２０分間イ
ンキュベートし、その後４２°Ｃにて１．５分間処理す
ることにより大腸菌の形質転換を行った。

上記ＤＮＡが導入されたＪＭ１０３の菌体を、実施例１
と同様に平板寒天で培養し、無色のプラークを生じた菌
から１本鎖ＤＮＡを調製した。複製型２本鎖環状ＤＮＡ
のファージ感染面からの調製も、実施例１と同様に水酸
化ナトリウム−３ＯＳ法で行った。

４−の培養液から得た菌体を、　　１００μ２の２５１
μｌＭトリス塩酸（ｐＨ８，０，５０ｍＭグルコース、
　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

リゾチーム４■／ｄを含む）に懸濁し、室温で５分間放
置した。これに２００μｌの０．２Ｍ水酸化ナトリウム
−１％ＳＯＳを加え、穏やかに混合した後水中で５分間
放置した。その後、１５０μ２の５Ｍ酢酸カリウム溶液
（ｐＨ５，２）を加えて混合し、水中で１０分間以上放
置した。遠心分離後、上清をフェノール抽出し、さらに
エタノール沈殿を行うことにより複製型２本鎖ＤＮＡを
回収した。その後、その同じプラークにより調製した１
本鎖ファージＤＮＡを、実施例１と同様にジデオキシ法
によりＤＮＡ塩基配列を決定した。このことにより、得
られたクローンが目的とする修飾ＰＳＴＩ　（Ｓｅｔ（
４４）−ＰＳＴＩ）の構造遺伝子の全域を含んでいるこ
とが確認できた。

塩基配列の確認された複製型２本鎖ＤＮＡは２次の発現
プラスミドの構築に用いた。

ｄ）発現プラスミドの構造 上記Ｃ）項で得られた複製型２本鎖ＤＮＡ　（約３．５
μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで切
断し、こ（７）ＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ断片をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、　ＤＥＡ
Ｒメンブレンを用いて回収した。このＤＮＡ断片（ＡＰ
Ｉ／Ｓｅｔ　（４４）−ＰＳＴＩ融合タンパクをコード
する遺伝子（約７００ｂｐ）が含まれる）を、ＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄｍで切断処理したプラスミドｐＵｃ１
３（宝酒造）にＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し２
発現プラスミドｐＵｃ１３　（Ｓｅｒ　（４４）　−Ｐ
ＳＴ　Ｉ　）を構築した。このプラスミドを用い、モレ
キュラークローニング（前出）の方法に従って大腸菌の
形質転換を行った。

ｅ）Ｓｅｔ（４４）−ＰＳＴＩの発現 大腸菌に一１２株Ｃ６００または＾Ｇ−１をＤＮＡ受容
菌として用い、形質転換を行った。形質転換菌はアンピ
シリンに対する抵抗性を獲得するので、アンピシリン含
有寒天平板（ＬＢ培地；トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを１２中に含む）上でコ
ロニーを形成したものについて選択した。形成されたコ
ロニーのうち８個を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを
含むＬＢ培地５ｄに滅菌した竹串で植菌し、３７°Ｃで
１８時間培養した。その後。

遠心分離操作により菌体を集め、上記Ｃ）項で述べたの
と同様の方法でプラスミドを回収した。

目的とするプラスミドｐＵｃ１３（Ｓｅｔ（４４）−Ｐ
ＳＴＩ）を持つことが確認されたクローンを、５０％グ
リセリン存在下−７０°Ｃで保存した。この菌体保存液
０１ｌ−をアンピシリン１００　μｇ／−を含む１００
ＩｎＩｌのＬＢ培地へ加え、３７°Ｃで一晩培養した。

この培養液３７．５−をアンピシリン１００μｇ／−を
含む１．５ｆのＬＢ培地に加え、さらに３７°Ｃで一晩
培養した。培養終了後、遠心分離操作により菌体を集め
、−２０°Ｃで保存した。

ｆ　）　Ｓｅｔ　（４４）　−ＰＳＴ　Ｉの精製上記ｄ
）項で得た菌体２．２ｇを１０ｍ２の０．１Ｍ１−リス
塩酸（ｐＨ７−０＋　５ｔｓＭ　ＥＤＴＡを含む）に懸
濁し、　１２．ｏｏＯＸｇにて１０分間遠心分離した。

同様の操作を繰り返した後、菌体を１０１１１の０．１
Ｍトリス塩酸（ｐ）１７．０；　５＋ｍＭ　ｔ！ＤＴＡ
、　　５０ｍＭベンズアミジンおよび１　ｍＭ　ＰＭＳ
Ｆを含む）に懸濁し、フレンチプレスを用いて４００Ｋ
ｇ／ｃ４の圧力で３回破砕した。　２３．０ＯＯＸ　ｇ
にて３０分間遠心分離して得たペレット０．４４ｇを、
１０ｄの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０；　８
Ｍ塩酸グアニジンおよび２０ｍＭ　ＤＴＴを含む）に溶
解し、セファクリルＳ−２００カラム（２，６Ｘ　７９
ｃｍ　）でのゲル濾過を行った。溶出は、０．１Ｍ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，２；　１ｍＭ　ＤＴＴおよび岨尿素を
含む）を用いて行った。　ＡＰＩ／ＰＳＴＩ融合タンパ
クを示す分子量的１７，０００の両分（３５ｄ）を集め
、このうち２０ｄを蒸留水に対して透析した後凍結乾燥
した。この凍結乾燥物を０．３ｄの７０％ギ酸に溶解し
、２００μｆｆｉのＣＮＢｒ　（２００ｍｇ／　ｍｌ　
）を加えて室温で６時間反応させた。その後、１０倍量
の蒸留水１８　ｒａｌを加えて凍結乾燥した。得られた
凍結乾燥物を２ＩＩ１１の０．０５Ｍ　　）リス塩酸（
ｐＨ８，ｏ：　０．５ＭＮａＣ１を含む）に溶解し、　
１０，０ＯＯＸｇで１分間遠心分離した。得られた上清
をウシトリプシン−〇〇−セファロース４Ｂを充填した
アフィニティーカラム（ＩＸ３ｃｍ）に吸着させた。こ
のカラムを、　０．５Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　トリス
塩酸（ｐＨ８，０）、さらに蒸留水で順次洗浄した後、
　１２ｍＭ塩酸で修飾ＰＳＴ　Ｉを溶出させ、凍結乾燥
し、精製品４１５μｇを得た。

２、　Ｇｉｎ（４２）−ＰＳＴＩおよびＴｈｒ　（４３
）−ＰＳＴＩの調製Ｇｉｎ（４２）−ＰＳＴＩおよびＴ
ｈｒ（４３）−ＰＳＴＩを、それぞれ次に示す（２）お
よび（３）のＤＮＡオリゴマーを合成してプライマーと
して使用することにより、　Ｓｅｔ　（４４）ＰＳＴＴ
と同様の方法で調製した。

Ｇｔｎ（４２）−ＰＳＴＩ ５’−ＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＧＣ
ＣＡ−３’Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　
　　　　　　（２）Ｔｈｒ（４３）−ＰＳＴＩ ５１〜八Ａ　　ＡＡＴ　　ＣＧＧ　　ＡＣＡ　　ＣＧＣ
ＣＡＧ　　ＡＣ−３’Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ
　　Ｇｉｎ　　　　　　　　（３）３、各修飾ヒトＰＳ
ＴＩの性質 ａ）アミノ酸組成 各修飾ヒトＰＳＴＩ　（Ｓｅｔ（４４）−ＰＳＴＩ、　
Ｇｌｎ（４２）−ＰＳＴＩおよびＴｈｒ（４３）−ＰＳ
ＴＩ）の約１０μｇを試験管（ＩＯ×９０ｍｍ　）にと
り、　４Ｍメタンスルホン酸（０，２％３−（２−アミ
ノエチル）インドールを含有する）を５０ｕｌ添加し、
減圧下、１１０°Ｃにて２４時間加水分解した。

アミノ酸分析には２日立８３５型アミノ酸分析計を用い
た。各ＰＳＴＩのアミノ酸組成を、天然型ヒトＰＳＴ　
Ｉの理論値とともに表２に示す。表２から明らかである
ように、各修飾ヒトＰＳＴＩにはもとのヒトＰＳＴＩか
ら予想されるアミノ酸残基の増減が起こっており、所望
の修飾ヒトＰＳＴＩが得られたことが示された。

（以下余白） Ａｓｐ　　　７．７（８） Ｔｈｒ　　　　３．８（４） Ｓｅｔ　　　　２．８（３） Ｇｌｕ　　　　７．Ｈ７） Ｐｒｏ　　　　２．８（３） Ｇｌｙ　　　５．１（５） ＾１ａ　　　　１．３（１） １／２Ｃｙｓ　５．２（６） Ｖａｔ　　　　２．１　（２） Ｎｅｔ　　　　０．０（０） １１ｅ　　　　２．９（３） しｅｕ　　　　　４．２（４） Ｔｙｒ　　　２．９（３） Ｐｈｅ　　　　１．Ｈｌ） Ｌｙｓ　　　４．０（４） Ｈｉｓ　　　Ｏ，０（０） Ｔｒｐ　　　Ｏ，０（０） ７．５（８） ４．５（５） ２．７　（３） ６．２（６） ２．７（３） ５．０（５） １．４　（１） ５、１　（６） ２．１（２） ０．０（０） ２．７（３） ４．０（４） ２．７（３） １．３（１） ３．２（３） ０．０（０） ０．０（０） ７．８（８） ３．７（４） ３．５（４） ６．４（６） ２．９（３） ４．９（５） １．３（１） ５．０（６） ２．０（２） ０．０（０） ２．８（３） ４．２（４） ２．９（３） １．２（１） ３．８（４） ０．０（０） ０．０（０） 合計　　５６ ｂ）修飾ＰＳＴＩのヒトトリプシン阻害活性各修飾ＰＳ
ＴＩのヒトトリプシンに対する阻害活性を調べたところ
、該ＰＳＴＩはヒトトリプシンを１：１のモル比で化学
量論的に阻害した。次に各修飾ヒ１−ＰＳＴＩについて
、　ＰＳＴＩの一時阻害を調べた。ここで、　ＰＳＴＩ
の一時阻害とは、最初はヒトトリプシンを阻害するが２
時間とともにトリプシン活性が回復、Ｌ、　ＰＳＴＩは
失活することを意味する。天然のＰＳＴ　Ｉでは、この
−時阻害が起こることが知られている。

ヒトトリプシン（１ｎｍｏｌ）と、天然ヒトＰＳＴＩま
たは上述のようにして得られた３種類の修飾ＰＳＴＩの
それぞれ（２ｎｍｏｌ）とを、　　２００μｆｆｉの０
．１Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，０または８．０　；　２
０ｍＭ　ＣａＣ１ｇおよび０．００４％トリトンＸ−１
００を含む）中で３７°Ｃにてインキュベートした。一
定時間ごとに２０μ！をとり、　０．５Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８，０）　１５０μｌ　；、　５ｍＭベンゾイル−
し−アルギニン　ｐ−ニトロアニリド２００ｕ！および
蒸留水５００μｌのはいった試験管に移し、３７℃で５
分間インキュベートした。３０％酢酸５ｏｏＩｌｌを添
加して反応を停止させ、　　４１０ｎｍの吸光度を測定
し、トリプシン阻害活性を計算した。この結果を第３図
（ｐＨ７，０における結果）および第４図（ｐＨ８，０
における結果）に示す。

第３図および第４図から明らかであるように。

ｐＨ７，０およびｐＨ８，０のいずれの場合も、４２番
目のＡｒｇがＧｉｎに置換されたＧｉｎ（４２）−ＰＳ
ＴＩおよび４４番目のＡｒｇがＳｅｔに置換されたＳｅ
ｔ　（４４）　−ＰＳＴ　Ｉはいずれも天然のヒＩ−Ｐ
ＳＴＩに比べて一時阻害が弱くなり、トリプシンインヒ
ビターとしての活性の持続性が増していることがわかっ
た。特に、　Ｇｉｎ（４２）−ＰＳＴＩは。

ｐＨ７，０においては２４時間たってもトリプシン阻害
活性を失わなかった。一方、４３番目のＬｙｓがＴｈｒ
に置換されたＴｈｒ　（４３）　−ＰＳＴ　ＩはＰＨ７
，０では天然ヒトＰＳＴ　１とほぼ同じ一時阻害を示し
たが、　ｐＨ８，０ではより活性の持続性がなくなった
。

（発明の効果） 本発明によれば、天然型ヒトＰＳＴＩよりもトリプシン
などのタンパク分解酵素により分解されにく（安定性に
優れた修飾ヒト　ＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列、お
よび該ＤＮＡ配列を発現することにより得られる修飾ヒ
トＰＳＴＩが提供される。この修飾ヒトＰＳＴＩは遺伝
子組換え技術を用いて生産されるので。

大量・安価に得ることができる。しかも天然ヒトＰＳＴ
Ｉとアミノ酸配列が−ケ所しか違わないので。

膵疾患の治療に用いた場合に、従来使用されていたウシ
由来のＢＰＴＩや化学合成阻害剤に比べてアレルギー反
応が起こる心配がほとんどない。さらに。

天然型ヒトＰＰＴ　Ｉよりもトリプシンなどのタンパク
分解酵素により分解されに＜＜、安定性に優れた持続的
な阻害を示すので、膵炎の治療薬として有用である。

４、　゛　　の　　　なｉ′日 第１図は２本発明の修飾ヒトＰＳＴＩであるＧｉｎ（４
２）ＰＳＴＩのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す配
列図；第２図は１本発明の修飾ヒトＰＳＴＩであるＳｅ
ｒ　（４４）　−ＰＳＴＩのＤＮＡ配列およびアミノ酸
配列を示す配列図；第３図は、天然ヒｔ−ｐｓｒｔおよ
び本発明の３種類の修飾ヒトＰＳＴＩ　（Ｓｅｔ（４４
）−ＰＳＴＩ、Ｔｈｒ（４３）−ＰＳＴＩおよびＧｉｎ
（４２）−ＰＳＴＩ）の、　ｐＨ７，０でのトリプシン
処理における安定性の比較を示すグラフ；第４図は、天
然ヒトＰＳＴＩおよび本発明の３種類の修飾ヒトＰＳＴ
Ｉ　（Ｓｅｒ（４４）−ＰＳＴＩ、　Ｔｈｒ（４３）−
ＰＳＴＩおよびＧｌｎ　（４２）　−ＰＳＴＩ　）の、
　ｐＨ８，０でのトリプシン処理における安定性の比較
を示すグラフ；第５図は、天然ヒトＰＳＴＩのＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を示す配列図； 第６図は、　ＡＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列および該配列か
ら推定されるアミノ酸配列を示す配列図：第７図は２本
発明で使用した合成ヒ１−ＰＳＴＩ遺伝子のＤＮＡ配列
および該配列に対応するアミノ酸配列を示す配列図； 第８図は、　　ＡＰ）ｌ遺伝子および該遺伝子近辺の制
限酵素切断部位を示す制限酵素切断地図；そして。

第９図は９本発明で使用する。天然型ヒ１−ＰＳＴＩと
ＡＰＩＩとの融合タンパクをコードするＤＮＡを有する
発現プラスミドｐｌＪｃ１３−ＰＳＴＩの構築の概略を
示す説明図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＰＳＴＩのアミノ酸配列のＮ−末端から４２番
   目のアルギニンがグルタミンに置換された修飾ヒトＰＳ
   ＴＩ。 ２、請求項１に記載の修飾ヒトＰＳＴＩをコードするＤ
   ＮＡ配列。 ３、ヒトＰＳＴＩのアミノ酸配列のＮ−末端から４４番
   目のアルギニンがセリンに置換された修飾ヒトＰＳＴＩ
   ４、請求項３に記載の修飾ヒトＰＳＴＩをコードするＤ
   ＮＡ配列。