JP3061199B2 - エリトリナ・カッフラ型インヒビターの突然変異体及びセリンプロテアーゼを精製するための前記突然変異体の利用 - Google Patents
エリトリナ・カッフラ型インヒビターの突然変異体及びセリンプロテアーゼを精製するための前記突然変異体の利用Info
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はエリトリナ・カッフラ（Erythrina caffra）
型の新規インヒビター及びセリンプロテアーゼを精製す
るためのその利用に関する。
型の新規インヒビター及びセリンプロテアーゼを精製す
るためのその利用に関する。
固定化されたエリトリナ由来のトリプシンインヒビタ
ー（ETI）はセリンプロテアーゼ、そして特にプラスミ
ノーゲンアクチベーター（C.Heussen（1984）（2
2））、β−トリプシン、α−キモトリプシン及びトロ
ンビン（S.Onestiら（1992）（34））のアフィニティー
クロマトグラフィーによる精製のために有効な試薬であ
る。このようなトリプシンインヒビターは長い間知られ
ている（C.Heussen（1982）（23）;F.J.Joubert（198
2）（26）;F.J.Joubert（1982）（27））。
ー（ETI）はセリンプロテアーゼ、そして特にプラスミ
ノーゲンアクチベーター（C.Heussen（1984）（2
2））、β−トリプシン、α−キモトリプシン及びトロ
ンビン（S.Onestiら（1992）（34））のアフィニティー
クロマトグラフィーによる精製のために有効な試薬であ
る。このようなトリプシンインヒビターは長い間知られ
ている（C.Heussen（1982）（23）;F.J.Joubert（198
2）（26）;F.J.Joubert（1982）（27））。
E.カッフラ由来のインヒビターDE−３はプラスミノー
ゲンアクチベーターの精製のために極めて好ましく適切
である。このインヒビターの完全アミノ酸配列もこの公
開物の中に記載されている。DE−３はE.カッフラの種子
から単離且つ精製できる（F.J.Joubert（1982）（2
6））。細胞障害性でないETIがEP−B O,218,479（15）
に記載されている。
ゲンアクチベーターの精製のために極めて好ましく適切
である。このインヒビターの完全アミノ酸配列もこの公
開物の中に記載されている。DE−３はE.カッフラの種子
から単離且つ精製できる（F.J.Joubert（1982）（2
6））。細胞障害性でないETIがEP−B O,218,479（15）
に記載されている。
組換ETIがTeixeiraら（1994）（45）に記載され、そ
れらの組織プラスミノーゲンアクチベーターに対する阻
害比活性は1.7×109U/mmolである。一方、天然、ETIの
阻害比活性は1.94×109U/mmolである。これはトリプシ
ンに対する阻害活性にも適用される（2.63×1012/3.2×
102）。即ち、Teixeiraに従って作られた組換ETIの阻害
比活性は、天然ETIの活性よりも、トリプシンに対して
は20％低く、そして組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーに対しては10％低い。
れらの組織プラスミノーゲンアクチベーターに対する阻
害比活性は1.7×109U/mmolである。一方、天然、ETIの
阻害比活性は1.94×109U/mmolである。これはトリプシ
ンに対する阻害活性にも適用される（2.63×1012/3.2×
102）。即ち、Teixeiraに従って作られた組換ETIの阻害
比活性は、天然ETIの活性よりも、トリプシンに対して
は20％低く、そして組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーに対しては10％低い。
ETIの修飾形態がTeixeiraら（1994）（46）に記載さ
れ、それにおいてはＮ−末端のValはAspに置き代わって
いる。かかる修飾ETIはtPAに結合せず、そしてtPAに対
して阻害活性を示さない。トリプシンに対する阻害比活
性は天然ETI及びAsp−修飾ETIに関して事実上同じであ
る。
れ、それにおいてはＮ−末端のValはAspに置き代わって
いる。かかる修飾ETIはtPAに結合せず、そしてtPAに対
して阻害活性を示さない。トリプシンに対する阻害比活
性は天然ETI及びAsp−修飾ETIに関して事実上同じであ
る。
Teixeiraによると、組換ETIは発現、次いで硫酸アン
モニウム沈殿（80％飽和）による精製、水に対する透
析、及びメチオニンを含むＮ末端配列を切断する臭化シ
アン切断により得られる。それはその後ゲル濾過により
精製される（Sephadex G50）。
モニウム沈殿（80％飽和）による精製、水に対する透
析、及びメチオニンを含むＮ末端配列を切断する臭化シ
アン切断により得られる。それはその後ゲル濾過により
精製される（Sephadex G50）。
エリトリナ・カッフラ由来のインヒビターDE−３の活
性を有する精製ポリペプチド（以降、ETIポリペプチド
とも呼ぶ）はDE−A 4424 171.2（９）に記載されてお
り、それは、天然起源より単離したインヒビターと異な
り、セリンプロテアーゼに対してかなり高い特異性を有
する。
性を有する精製ポリペプチド（以降、ETIポリペプチド
とも呼ぶ）はDE−A 4424 171.2（９）に記載されてお
り、それは、天然起源より単離したインヒビターと異な
り、セリンプロテアーゼに対してかなり高い特異性を有
する。
セリンプロテアーゼの効率的な精製のためのETIポリ
ペプチドの適切さの更なる重要な基準はセリンプロテア
ーゼに対する結合能力である。
ペプチドの適切さの更なる重要な基準はセリンプロテア
ーゼに対する結合能力である。
本発明の目的は、従って、セリンプロテアーゼの精製
のためのETIポリペプチドの結合能力の効率性を高める
ことにある。
のためのETIポリペプチドの結合能力の効率性を高める
ことにある。
本発明はエリトリナ・カッフラ由来のインヒビターDE
−３の活性を有するポリペプチドであって、タンパク質
混合物からセリンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕
獲するポリペプチドを考慮し、ここでこのポリペプチド
はSEQ ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有
し、この配列のアミノ酸39〜139の領域に対して85％以
上相同性である部分領域を有し、２本のジスルフィド結
合を有し、そしてＮ末端がSer、そして好ましくはSEQ I
D NO:4で始まる。このポリペプチドのプラスミノーゲン
アクチベーターに対する結合能力は1.25MU/ml以上であ
る。
−３の活性を有するポリペプチドであって、タンパク質
混合物からセリンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕
獲するポリペプチドを考慮し、ここでこのポリペプチド
はSEQ ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有
し、この配列のアミノ酸39〜139の領域に対して85％以
上相同性である部分領域を有し、２本のジスルフィド結
合を有し、そしてＮ末端がSer、そして好ましくはSEQ I
D NO:4で始まる。このポリペプチドのプラスミノーゲン
アクチベーターに対する結合能力は1.25MU/ml以上であ
る。
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは ａ）SEQ ID NO:1に記載の核酸により、 ｂ）ストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:1に示すDNA
配列とハイブリダイズし、且つSEQ ID NO:4をコードす
る核酸配列でＮ末端が始まる核酸により、 ｃ）ストリンジェンシー条件下で遺伝子コードの縮重の
ないａ）又はｂ）に記載の配列のいづれかとハイブリダ
イズするであろう核酸により、 コードされる。
配列とハイブリダイズし、且つSEQ ID NO:4をコードす
る核酸配列でＮ末端が始まる核酸により、 ｃ）ストリンジェンシー条件下で遺伝子コードの縮重の
ないａ）又はｂ）に記載の配列のいづれかとハイブリダ
イズするであろう核酸により、 コードされる。
驚くべきことに、セリンプロテアーゼに対する結合能
力はETIポリペプチドにおいてＮ末端のValをSerに置換
することにより著しく高まることが明らかとなった。公
知のETIポリペプチドはＮ末端がアミノ酸配列Val−Leu
−Leu−Asp（SEQ ID NO:3）で始まるが、本発明に係るE
TIポリペプチドはSer−Leu−Asp（SEQ ID NO:4）で始ま
る。
力はETIポリペプチドにおいてＮ末端のValをSerに置換
することにより著しく高まることが明らかとなった。公
知のETIポリペプチドはＮ末端がアミノ酸配列Val−Leu
−Leu−Asp（SEQ ID NO:3）で始まるが、本発明に係るE
TIポリペプチドはSer−Leu−Asp（SEQ ID NO:4）で始ま
る。
これらの結果はTeixeiraら（1994）（46）との関係で
極めて驚くべきものである。当業者はこれらの公開物か
ら、ETIのＮ末端の修飾が、プラスミノーゲンアクチベ
ーターに対する阻害比活性が失われ、そしてトリプシン
に対する活性がそのままである修飾ETIをもたらすもの
であろうと予測するであろう。従って、トリプシンに対
する比活性、及びプラスミノーゲンアクチベーター、そ
して特に組織プラスミノーゲンアクチベーターに対する
結合能力が本発明に係る修飾ETIに関して有意な度合い
に至るまで上昇することはより一層驚くべきことであ
る。
極めて驚くべきものである。当業者はこれらの公開物か
ら、ETIのＮ末端の修飾が、プラスミノーゲンアクチベ
ーターに対する阻害比活性が失われ、そしてトリプシン
に対する活性がそのままである修飾ETIをもたらすもの
であろうと予測するであろう。従って、トリプシンに対
する比活性、及びプラスミノーゲンアクチベーター、そ
して特に組織プラスミノーゲンアクチベーターに対する
結合能力が本発明に係る修飾ETIに関して有意な度合い
に至るまで上昇することはより一層驚くべきことであ
る。
「エリトリナ・カッカラ由来のインヒビターDE−３の
活性を有するポリペプチド」はセリンプロテアーゼ、例
えばプラスミノーゲンアクチベーター、β−トリプシ
ン、α−キモトリプシン及び／又はトロンビンに特異的
に結合するポリペプチドと解される。その結合はセリン
プロテアーゼの活性を阻害しうる。
活性を有するポリペプチド」はセリンプロテアーゼ、例
えばプラスミノーゲンアクチベーター、β−トリプシ
ン、α−キモトリプシン及び／又はトロンビンに特異的
に結合するポリペプチドと解される。その結合はセリン
プロテアーゼの活性を阻害しうる。
「機能的に類似」のETIポリペプチドはエリトリナ・
カッフラ由来のインヒビターDE−３の活性を有するポリ
ペプチドと解される。タンパク質配列の修飾は当業者に
周知の通常のフレームワーク内で可能である。しかしな
がら、これとの関連で、Ｎ末端はSEQ ID NO:4（Ｎ末端S
er）と同一であるべきこと、及びポリペプチドが立体構
造を固定するために２本のジスルフィド結合を有さなけ
ればならないことが理解されるべきである。原核細胞に
おける組換生産を経て、本発明に係るタンパク質はＮ末
端メチオニンを更に含みうる（SEQ ID NO:10）。かかる
ジスルフィド結合の位置はETIポリペプチドのジスルフ
ィド結合のそれに対応すべきである（Cys 39−Cys 83及
びCys 132−Cys 139、Lehle,K.ら（1994）（30））。同
様に、ETIポリペプチドの一部の領域はSEQ ID NO:2の配
列領域39〜139に対して85％以上相同性であるべきであ
る。この部分領域は好ましくは本発明に係るタンパク質
の配列領域39〜139でもあり、そして好ましくはSEQ ID
NO:2由来の配列領域39〜139に対して同一又は本質的に
同一である。
カッフラ由来のインヒビターDE−３の活性を有するポリ
ペプチドと解される。タンパク質配列の修飾は当業者に
周知の通常のフレームワーク内で可能である。しかしな
がら、これとの関連で、Ｎ末端はSEQ ID NO:4（Ｎ末端S
er）と同一であるべきこと、及びポリペプチドが立体構
造を固定するために２本のジスルフィド結合を有さなけ
ればならないことが理解されるべきである。原核細胞に
おける組換生産を経て、本発明に係るタンパク質はＮ末
端メチオニンを更に含みうる（SEQ ID NO:10）。かかる
ジスルフィド結合の位置はETIポリペプチドのジスルフ
ィド結合のそれに対応すべきである（Cys 39−Cys 83及
びCys 132−Cys 139、Lehle,K.ら（1994）（30））。同
様に、ETIポリペプチドの一部の領域はSEQ ID NO:2の配
列領域39〜139に対して85％以上相同性であるべきであ
る。この部分領域は好ましくは本発明に係るタンパク質
の配列領域39〜139でもあり、そして好ましくはSEQ ID
NO:2由来の配列領域39〜139に対して同一又は本質的に
同一である。
ETIポリペプチド（又はかかるポリペプチドをコード
する核酸）であってそのアミノ酸配列がSEQ ID NO:2と
同一又は本質的に同一のものが極めて好適に利用され
る。驚くべきことに、セリンプロテアーゼに対するイン
ヒビターの結合能力は、原核細胞の中での組換生産を経
て、Ｎ末端メチオニンが完全に切断されたとき、又は少
なくとも大半（好ましくはETIポリペプチド調製物の中
の85％以上）が切断されたとき、極めて高いことも明ら
かとなった。ETIポリペプチドはサイズで異なりうる。
しかしながら、それは好ましくは100〜200個のアミノ
酸、特に好ましくは約139〜173個のアミノ酸を含んで成
る。セリンプロテアーゼに対するインヒビターの結合能
力は、固定化インヒビターにより溶液から除去されうる
セリンプロテアーゼ（好ましくはプラスミノーゲンアク
チベーター）の量と解される。この結合能力は通常、活
性/1mlのマトリックスで表示する（プラスミノーゲンア
ンクチベーターの場合、U/1mlのマトリックスで表示す
るアミド溶解活性）。プラスミノーゲンアクチベーター
の活性は予め結合しているセリンプロテアーゼの溶離の
後に決定する。
する核酸）であってそのアミノ酸配列がSEQ ID NO:2と
同一又は本質的に同一のものが極めて好適に利用され
る。驚くべきことに、セリンプロテアーゼに対するイン
ヒビターの結合能力は、原核細胞の中での組換生産を経
て、Ｎ末端メチオニンが完全に切断されたとき、又は少
なくとも大半（好ましくはETIポリペプチド調製物の中
の85％以上）が切断されたとき、極めて高いことも明ら
かとなった。ETIポリペプチドはサイズで異なりうる。
しかしながら、それは好ましくは100〜200個のアミノ
酸、特に好ましくは約139〜173個のアミノ酸を含んで成
る。セリンプロテアーゼに対するインヒビターの結合能
力は、固定化インヒビターにより溶液から除去されうる
セリンプロテアーゼ（好ましくはプラスミノーゲンアク
チベーター）の量と解される。この結合能力は通常、活
性/1mlのマトリックスで表示する（プラスミノーゲンア
ンクチベーターの場合、U/1mlのマトリックスで表示す
るアミド溶解活性）。プラスミノーゲンアクチベーター
の活性は予め結合しているセリンプロテアーゼの溶離の
後に決定する。
活性はU.Kohnertら（1992）（29）に従って決定す
る。このため、Ｈ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−ｐ−ニトロア
ニリドジヒドロクロリドの切断速度（S2288,Kabi Vitru
m,Sweden）を405nmでの吸収を介して光学的に測定す
る。
る。このため、Ｈ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−ｐ−ニトロア
ニリドジヒドロクロリドの切断速度（S2288,Kabi Vitru
m,Sweden）を405nmでの吸収を介して光学的に測定す
る。
本発明は更にタンパク質混合物からのセリンプロテア
ーゼの精製のための方法であって、セリンプロテアーゼ
をそれに可逆的且つ選択的に結合する固定化ETIポリペ
プチドに結合させ、タンパク質混合物から未結合の画分
を除去し、セリンプロテアーゼをインヒビターから脱離
し、固定化インヒビターを可溶性セリンプロテアーゼか
ら分離し、そしてセリンプロテアーゼを単離することに
よる方法にも関連し、ここでこの方法は、タンパク質混
合物からセリンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕獲
するETIポリペプチドを使用すること、及びこのポリペ
プチドがSEQ ID NO:2に対して機能的に類似であるアミ
ノ酸配列を好適に有し、この配列のアミノ酸39〜139の
領域に対して85％以上相同性である部分領域を有し、２
本のジスルフィド結合を有し、そしてＮ末端がSEQ ID N
O:4又はメチオニンによりＮ末端が伸長したSEQ ID NO:4
で始まるものであることを特徴とする。
ーゼの精製のための方法であって、セリンプロテアーゼ
をそれに可逆的且つ選択的に結合する固定化ETIポリペ
プチドに結合させ、タンパク質混合物から未結合の画分
を除去し、セリンプロテアーゼをインヒビターから脱離
し、固定化インヒビターを可溶性セリンプロテアーゼか
ら分離し、そしてセリンプロテアーゼを単離することに
よる方法にも関連し、ここでこの方法は、タンパク質混
合物からセリンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕獲
するETIポリペプチドを使用すること、及びこのポリペ
プチドがSEQ ID NO:2に対して機能的に類似であるアミ
ノ酸配列を好適に有し、この配列のアミノ酸39〜139の
領域に対して85％以上相同性である部分領域を有し、２
本のジスルフィド結合を有し、そしてＮ末端がSEQ ID N
O:4又はメチオニンによりＮ末端が伸長したSEQ ID NO:4
で始まるものであることを特徴とする。
かかるETIポリペプチドは好ましくは外生DNAの原核系
又は真核系発現により生産される。精製及び単離は好ま
しくはアニオン交換体、カチオン交換体又はニッケルキ
レートカラムでのクロマトグラフィーにより達成され
る。
又は真核系発現により生産される。精製及び単離は好ま
しくはアニオン交換体、カチオン交換体又はニッケルキ
レートカラムでのクロマトグラフィーにより達成され
る。
本発明に係る方法はプラスミノーゲンアクチベータ
ー、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−
PA）及びその誘導体（例えば、突然変異体及び欠失体）
の精製にとって極めて好都合である。ｔ−PAはEP−B 0,
093,619（13）に記載され、ｔ−PAの誘導体は米国特許
第5,223,256号（53）、WO90/09437号（54）及びT.J.R.H
arris（1987）（20）に記載されている。
ー、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−
PA）及びその誘導体（例えば、突然変異体及び欠失体）
の精製にとって極めて好都合である。ｔ−PAはEP−B 0,
093,619（13）に記載され、ｔ−PAの誘導体は米国特許
第5,223,256号（53）、WO90/09437号（54）及びT.J.R.H
arris（1987）（20）に記載されている。
ETIポリペプチドは当業者に周知の方法に従って製造
できうる。このため、まず核酸分子（好ましくはDNA）
であって、Ｎ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長したETIをコードし、且つETIポリペプチド
をコードする分子を作る。ETIポリペプチドはSEQ ID N
O:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、そしてSEQ
ID NO:2のアミノ酸39〜139の領域に対して85％以上、
そして好ましくは完全に相同性である部分領域と２本の
ジスルフィド結合を有する。これとの関連で、遺伝子コ
ードの縮重性の範囲内で同一のポリペプチドをコードす
る配列及び／又はこの配列と相補性である配列を利用す
ることも可能である。ストリンジェンシー条件下でSEQ
ID NO:1とハイブリダイズし、そしてＮ末端がSEQ ID N
O:4をコードする又はメチオニンによりＮ末端が伸長し
たSEQ ID NO:4をコードする核酸も好適に利用される。
このDNAをベクターにクローニングし、それを宿主細胞
に導入し、そしてそこで複製させる。ETIポリペプチド
配列に加えて、かかるベクターはDNAの発現にとって必
要なオペレーター要素を含む。インヒビターDNA及びオ
ペレーター要素を含むこのベクターを、ETIポリペプチ
ドのDNAを発現できるベクターに移入する。この宿主細
胞をETIポリペプチドの発現がなされる条件下で培養す
る。ETIポリペプチドをこれらの細胞から単離する。こ
れを行うに当って、適当な手段はETIポリペプチドが、
インヒビター特性を発揮する活性四次構造をとりうるこ
とを確実にする。
できうる。このため、まず核酸分子（好ましくはDNA）
であって、Ｎ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長したETIをコードし、且つETIポリペプチド
をコードする分子を作る。ETIポリペプチドはSEQ ID N
O:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、そしてSEQ
ID NO:2のアミノ酸39〜139の領域に対して85％以上、
そして好ましくは完全に相同性である部分領域と２本の
ジスルフィド結合を有する。これとの関連で、遺伝子コ
ードの縮重性の範囲内で同一のポリペプチドをコードす
る配列及び／又はこの配列と相補性である配列を利用す
ることも可能である。ストリンジェンシー条件下でSEQ
ID NO:1とハイブリダイズし、そしてＮ末端がSEQ ID N
O:4をコードする又はメチオニンによりＮ末端が伸長し
たSEQ ID NO:4をコードする核酸も好適に利用される。
このDNAをベクターにクローニングし、それを宿主細胞
に導入し、そしてそこで複製させる。ETIポリペプチド
配列に加えて、かかるベクターはDNAの発現にとって必
要なオペレーター要素を含む。インヒビターDNA及びオ
ペレーター要素を含むこのベクターを、ETIポリペプチ
ドのDNAを発現できるベクターに移入する。この宿主細
胞をETIポリペプチドの発現がなされる条件下で培養す
る。ETIポリペプチドをこれらの細胞から単離する。こ
れを行うに当って、適当な手段はETIポリペプチドが、
インヒビター特性を発揮する活性四次構造をとりうるこ
とを確実にする。
これとの関連で、前述の通り、ETIポリペプチドがま
さにSEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:4に相当するアミノ酸配
列を有する必要はない。ETIポリペプチドは、本質的に
同一の配列を有し、且つエリトリナ・カッフラ由来のイ
ンヒビターDE−３の活性を有するポリペプチドであると
き、同等に適切である。しかしながら、Ｎ末端において
ValがSerに置き代わっていることは必須である。アミノ
酸配列SEQ ID NO:2及び４が、原核宿主細胞における発
現の場所好適に利用されるが、真核発現の後でないとき
は、Ｎ末端メチオニンを含みうる（SEQ ID NO:10）。し
かしながら、メチオニンは通常E.コリ（E.coli）では切
断され、なぜならその配列はＮ末端がMet−Serで始まる
からである（Dalborge H.ら（1990）（７））。Metが切
断されるかかるポリペプチドが好ましい。
さにSEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:4に相当するアミノ酸配
列を有する必要はない。ETIポリペプチドは、本質的に
同一の配列を有し、且つエリトリナ・カッフラ由来のイ
ンヒビターDE−３の活性を有するポリペプチドであると
き、同等に適切である。しかしながら、Ｎ末端において
ValがSerに置き代わっていることは必須である。アミノ
酸配列SEQ ID NO:2及び４が、原核宿主細胞における発
現の場所好適に利用されるが、真核発現の後でないとき
は、Ｎ末端メチオニンを含みうる（SEQ ID NO:10）。し
かしながら、メチオニンは通常E.コリ（E.coli）では切
断され、なぜならその配列はＮ末端がMet−Serで始まる
からである（Dalborge H.ら（1990）（７））。Metが切
断されるかかるポリペプチドが好ましい。
本発明は更にタンパク質混合物からセリンプロテアー
ゼを可逆的且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコ
ードする単離された核酸配列に関連し、ここでそのタン
パク質はSEQ ID NO:2と機能的に類似なアミノ酸配列を
有し、この配列のアミノ酸39〜139の領域に対して85％
以上相同性である部分領域を有し、２本のジスルフィド
結合を有し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニ
ンによりＮ末端が伸長したSEQ ID NO:4で始まるもので
ある。かかる単離された核酸は好ましくはSEQ ID NO:4
と同一であるか、又は遺伝子コードの縮重性の範囲内で
同一のポリペプチドをコードする核酸配列と同一であ
る。真核系又は原核系宿主細胞内での発現のために、こ
の核酸は当業者に周知の真核系又は原核系転写又は翻訳
シグナルを５′末端に含む。
ゼを可逆的且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコ
ードする単離された核酸配列に関連し、ここでそのタン
パク質はSEQ ID NO:2と機能的に類似なアミノ酸配列を
有し、この配列のアミノ酸39〜139の領域に対して85％
以上相同性である部分領域を有し、２本のジスルフィド
結合を有し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニ
ンによりＮ末端が伸長したSEQ ID NO:4で始まるもので
ある。かかる単離された核酸は好ましくはSEQ ID NO:4
と同一であるか、又は遺伝子コードの縮重性の範囲内で
同一のポリペプチドをコードする核酸配列と同一であ
る。真核系又は原核系宿主細胞内での発現のために、こ
の核酸は当業者に周知の真核系又は原核系転写又は翻訳
シグナルを５′末端に含む。
ストリンジェンシー条件下で、標準の条件でSEQ ID N
O:1とハイブリダイズする核酸が好適に使用される。ハ
イブリダイゼーションのためのかかる標準の条件及び方
法は当業者に公知であり、そして例えばJ.Sambrookら
（1989）（38）及びB.D.Hames,S.G.Higins（1985）（1
9）に記載されている。これらの公開物に記載の標準の
プロトコールはこの目的のために通常利用される。特に
Sambrook Section IX（40）を参照されたい。双方の公
開物は本発明の開示内容の課題となる。標準のストリン
ジェンシー条件もHoltke and Kessler（1990）（24）に
記載されている。
O:1とハイブリダイズする核酸が好適に使用される。ハ
イブリダイゼーションのためのかかる標準の条件及び方
法は当業者に公知であり、そして例えばJ.Sambrookら
（1989）（38）及びB.D.Hames,S.G.Higins（1985）（1
9）に記載されている。これらの公開物に記載の標準の
プロトコールはこの目的のために通常利用される。特に
Sambrook Section IX（40）を参照されたい。双方の公
開物は本発明の開示内容の課題となる。標準のストリン
ジェンシー条件もHoltke and Kessler（1990）（24）に
記載されている。
好適なストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼー
ション1mol/のNaCl、１％のSDS及び10％の硫酸デキス
トランの存在下で実施し、その後室温で５分間２×のSS
Cでフィルターを２回洗い、そして更に30分洗浄工程に
かけたときをいう。この更なる洗浄工程は0.5×のSSC、
0.1％のSDS、好ましくは0.2×のSSC、0.1％のSDS、そし
て特に好ましくは0.1×のSSC、0.1％のSDSで65℃で行わ
れうる。
ション1mol/のNaCl、１％のSDS及び10％の硫酸デキス
トランの存在下で実施し、その後室温で５分間２×のSS
Cでフィルターを２回洗い、そして更に30分洗浄工程に
かけたときをいう。この更なる洗浄工程は0.5×のSSC、
0.1％のSDS、好ましくは0.2×のSSC、0.1％のSDS、そし
て特に好ましくは0.1×のSSC、0.1％のSDSで65℃で行わ
れうる。
ベクターの構築を助長するため又は発現を最適化する
ために修飾が適しうる。かかる修飾は例えば下記の通り
である： −ライゲーション、クローニング及び突然変異誘発の工
程を助長するための、制限酵素にとっての様々な認識配
列を導入する核酸の修飾 −宿主細胞にとって好適なコドンを組込む核酸の修飾 −宿主細胞内での発現を最適化するための追加のオペレ
ーター要素による核酸の伸長。
ために修飾が適しうる。かかる修飾は例えば下記の通り
である： −ライゲーション、クローニング及び突然変異誘発の工
程を助長するための、制限酵素にとっての様々な認識配
列を導入する核酸の修飾 −宿主細胞にとって好適なコドンを組込む核酸の修飾 −宿主細胞内での発現を最適化するための追加のオペレ
ーター要素による核酸の伸長。
当該インヒビターは好ましくはE.コリの如き微生物に
おいて発現される。しかしながら、真核細胞、例えば酵
母、CHO細胞又は昆虫細胞における発現も可能である。
おいて発現される。しかしながら、真核細胞、例えば酵
母、CHO細胞又は昆虫細胞における発現も可能である。
本発明に係る核酸を含む生物学的に機能的なプラスミ
ド又はウイルスDNAベクターがこの目的のために使用さ
れる。原核又は真核系宿主細胞はかかるベクターにより
安定的に形質転換又はトランスフェクションされる。
ド又はウイルスDNAベクターがこの目的のために使用さ
れる。原核又は真核系宿主細胞はかかるベクターにより
安定的に形質転換又はトランスフェクションされる。
発現ベクターは宿主生物内でのインヒビタータンパク
質の発現を可能にするプロモーターを含まなければなら
ない。かかるプロモーターは当業者に公知であり、そし
て例えばlacプロモーター（Changら（1977）（26））、
trp（Goeddelら（1980）（18））、λPLプロモーター
（Shimatakeら（1981）（41））及びT5プロモーター
（米国特許第4,689,406号（49））である。合成プロモ
ーター、例えばtacプロモーター（米国特許第4,551,433
号（48））も適当である。複合プロモーター、例えばT7
−RNAポリメラーゼ／プロモーター系（Studierら（198
6）（44））も同等に適当である。バクテリオファージ
プロモーター及び微生物のオペレーター領域を含んで成
るハイブリドプロモーター（EP−A 0,267,851（11））
も適当である。プロモーターの他に、有効なリボソーム
結合部位も必要である。E.コリの場合、このリボソーム
結合部位はShine−Dalgarno（SD）配列と呼ばれている
（Shineら（1975）42;J.Sambroorら（1989）（39））。
質の発現を可能にするプロモーターを含まなければなら
ない。かかるプロモーターは当業者に公知であり、そし
て例えばlacプロモーター（Changら（1977）（26））、
trp（Goeddelら（1980）（18））、λPLプロモーター
（Shimatakeら（1981）（41））及びT5プロモーター
（米国特許第4,689,406号（49））である。合成プロモ
ーター、例えばtacプロモーター（米国特許第4,551,433
号（48））も適当である。複合プロモーター、例えばT7
−RNAポリメラーゼ／プロモーター系（Studierら（198
6）（44））も同等に適当である。バクテリオファージ
プロモーター及び微生物のオペレーター領域を含んで成
るハイブリドプロモーター（EP−A 0,267,851（11））
も適当である。プロモーターの他に、有効なリボソーム
結合部位も必要である。E.コリの場合、このリボソーム
結合部位はShine−Dalgarno（SD）配列と呼ばれている
（Shineら（1975）42;J.Sambroorら（1989）（39））。
発現性を高めるため、インヒビタータンパク質を融合
タンパク質として発現させることも可能である。この場
合、内生細菌タンパク質のＮ末端部又はその他の安定な
タンパク質をコードするDNA配列を通常インヒビタータ
ンパク質をコードする配列の５′末端に融合させる。こ
の例はlacZ,trpEである。
タンパク質として発現させることも可能である。この場
合、内生細菌タンパク質のＮ末端部又はその他の安定な
タンパク質をコードするDNA配列を通常インヒビタータ
ンパク質をコードする配列の５′末端に融合させる。こ
の例はlacZ,trpEである。
発現後、融合タンパク質を好ましくは酵素（例えばXa
因子）で切断する（Nagaiら（1984）（32））。切断部
位の更なる例はIgAプロテアーゼ切断部位（WO91/1152
0）（55）及びユビキノン切断部位（Millerら（1989）
（31））である。この場合、本発明に係るETIポリペプ
チドはＮ末端に一又は複数個の追加のアミノ酸を更に含
みうる。しかしながら、追加のＮ末端アミノ酸を含ま
ず、且つSEQ ID NO:4でＮ末端が始まるETIポリペプチド
が好ましく利用される。
因子）で切断する（Nagaiら（1984）（32））。切断部
位の更なる例はIgAプロテアーゼ切断部位（WO91/1152
0）（55）及びユビキノン切断部位（Millerら（1989）
（31））である。この場合、本発明に係るETIポリペプ
チドはＮ末端に一又は複数個の追加のアミノ酸を更に含
みうる。しかしながら、追加のＮ末端アミノ酸を含ま
ず、且つSEQ ID NO:4でＮ末端が始まるETIポリペプチド
が好ましく利用される。
不活性の封入体として最初に得られる組換タンパク質
は当業者周知の方法により可溶性活性タンパク質へと変
換されうる。この目的のため、封入体を例えば還元剤の
存在下でグアニジニウム塩酸塩又は尿素で可溶化し、還
元し、還元剤を例えば透析により除去し、そして可溶化
タンパク質を酸化還元系、例えば還元及び酸化型グルタ
チオン又は混合ジスルフィドを用いて好適に変性させ
る。
は当業者周知の方法により可溶性活性タンパク質へと変
換されうる。この目的のため、封入体を例えば還元剤の
存在下でグアニジニウム塩酸塩又は尿素で可溶化し、還
元し、還元剤を例えば透析により除去し、そして可溶化
タンパク質を酸化還元系、例えば還元及び酸化型グルタ
チオン又は混合ジスルフィドを用いて好適に変性させ
る。
かかる方法は例えば米国特許第4,933,434号（52）、E
P−B 0,241,022（16）及びEP−A 0,219,874（10）に記
載されている。
P−B 0,241,022（16）及びEP−A 0,219,874（10）に記
載されている。
当該タンパク質を微生物から活性タンパク質として分
泌させることも可能である。このためには融合タンパク
質が好適に利用され、それは利用する宿主生物において
タンパク質の分泌に適するシグナル配列（米国特許第4,
336,336号（47））と、核酸がコードするインヒビター
タンパク質とより成る。この過程において、タンパク質
は培地の中に分泌されるか（グラム陽性菌の場合）、又
はそのペリプラズマ空間の中に分泌される（グラム陰性
菌の場合）。シグナル配列とインヒビターをコードする
配列との間に、プロセシング又は追加の工程の際にイン
ヒビタータンパク質の切断を可能にする切断部位を組込
むことが適当である。かかるシグナル配列は例えはompA
（Ghrayebら（1984）（17））及びphoA（Okaら（1985）
（33））である。
泌させることも可能である。このためには融合タンパク
質が好適に利用され、それは利用する宿主生物において
タンパク質の分泌に適するシグナル配列（米国特許第4,
336,336号（47））と、核酸がコードするインヒビター
タンパク質とより成る。この過程において、タンパク質
は培地の中に分泌されるか（グラム陽性菌の場合）、又
はそのペリプラズマ空間の中に分泌される（グラム陰性
菌の場合）。シグナル配列とインヒビターをコードする
配列との間に、プロセシング又は追加の工程の際にイン
ヒビタータンパク質の切断を可能にする切断部位を組込
むことが適当である。かかるシグナル配列は例えはompA
（Ghrayebら（1984）（17））及びphoA（Okaら（1985）
（33））である。
ベクターは更にターミネーターを含む。ターミネータ
ーは転写過程を終了させるシグナルを発するDNA配列で
ある。これらは通常２種類の構造的特徴、即ちダブルヘ
リックスを分子内形成しるう反復G/Cリッチ領域と多数
のＵ（又はＴ）残基とを特徴とする。その例は、ファー
ジfd及びrrnBのDNA中のtrpアテニュエーター及びターミ
ネーターである（Brosiusら（1981）（５））。
ーは転写過程を終了させるシグナルを発するDNA配列で
ある。これらは通常２種類の構造的特徴、即ちダブルヘ
リックスを分子内形成しるう反復G/Cリッチ領域と多数
のＵ（又はＴ）残基とを特徴とする。その例は、ファー
ジfd及びrrnBのDNA中のtrpアテニュエーター及びターミ
ネーターである（Brosiusら（1981）（５））。
発現ベクターは通常、形質転換細胞の選別のための選
択マーカーを更に含む。かかる適当なマーカーは例えば
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリトロマイシ
ン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン
に対する耐性遺伝子である（Daviesら、（1978）
（８））。同等に適当な選択マーカーはヒスチジン、ト
リプトファン及びロイシンの如き細胞にとって必要な物
質の生合性のために必須な物質に関する遺伝子である。
択マーカーを更に含む。かかる適当なマーカーは例えば
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリトロマイシ
ン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン
に対する耐性遺伝子である（Daviesら、（1978）
（８））。同等に適当な選択マーカーはヒスチジン、ト
リプトファン及びロイシンの如き細胞にとって必要な物
質の生合性のために必須な物質に関する遺伝子である。
数多くの適切な細菌ベクターが公知である。例えば、
以下の細菌についてのベクターが記載されている：バチ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Palvaら、
（1982）（35））、E.コリ（Amanら（1985）（１））;S
tudierら（1986）（44））、ストレプトコッカス・クレ
モリス（Streptococcus cremoris）（Powellら（1988）
（37））；ストレプトコッカス・リビダンス（S.livida
ns）及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyc
e lividans）（米国特許第4,747,056号（50））。
以下の細菌についてのベクターが記載されている：バチ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Palvaら、
（1982）（35））、E.コリ（Amanら（1985）（１））;S
tudierら（1986）（44））、ストレプトコッカス・クレ
モリス（Streptococcus cremoris）（Powellら（1988）
（37））；ストレプトコッカス・リビダンス（S.livida
ns）及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyc
e lividans）（米国特許第4,747,056号（50））。
原核系微生物の他に、真核系においてインヒビタータ
ンパク質を発現させることも可能である（例えば、CHO
細胞、酵母又は昆虫細胞）。酵母及び昆虫細胞が真核発
現系として好ましい。酵母における発現は３タイプの酵
母ベクター、即ち組込式YIp（酵母組込プラスミド）ベ
クター、複製式YRp（酵母レプリコンプラスミド）ベク
ター及びエピソーマルYEp（酵母エピソーマルプラスミ
ド）ベクターにより達成されうる。これについての詳細
は例えばS.M.Kingsmanら（1987）（28）に記載されてい
る。
ンパク質を発現させることも可能である（例えば、CHO
細胞、酵母又は昆虫細胞）。酵母及び昆虫細胞が真核発
現系として好ましい。酵母における発現は３タイプの酵
母ベクター、即ち組込式YIp（酵母組込プラスミド）ベ
クター、複製式YRp（酵母レプリコンプラスミド）ベク
ター及びエピソーマルYEp（酵母エピソーマルプラスミ
ド）ベクターにより達成されうる。これについての詳細
は例えばS.M.Kingsmanら（1987）（28）に記載されてい
る。
適当なベクターを構築及び発現するための更なる遺伝
子操作方法はJ.Sambrookら（1989）（39）に記載されて
いる。
子操作方法はJ.Sambrookら（1989）（39）に記載されて
いる。
生産後、組換ETIをアニオン交換体、例えばＱ−Sepha
rose（登録商標）カラム、カチオン交換体（例えばスル
フォプロピルを基礎とする）又は例えばPorath,J.＆ Ol
in,B.（1983）（36）に記載の如きニッケルキレートカ
ラムでクロマトグラフィー精製する。
rose（登録商標）カラム、カチオン交換体（例えばスル
フォプロピルを基礎とする）又は例えばPorath,J.＆ Ol
in,B.（1983）（36）に記載の如きニッケルキレートカ
ラムでクロマトグラフィー精製する。
驚くべきことに、組換ETIポリペプチドはこの精製過
程の後に得られ、それは、BrCN−Sepharoseに固定化さ
れているとき、ｔ−PA及びｔ−PA誘導体に対して強めら
れた結合能力及び強められた阻害比活性を有する。
程の後に得られ、それは、BrCN−Sepharoseに固定化さ
れているとき、ｔ−PA及びｔ−PA誘導体に対して強めら
れた結合能力及び強められた阻害比活性を有する。
このようにして生産及び精製したETIポリペプチド
は、タンパク質混合物からセリンプロテアーゼを可逆的
且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコードする外
生DNA配列で形質転換又はトランスフェクションされた
原核又は真核宿主細胞を、適当な栄養条件下で、前記宿
主細胞が前記ポリペプチドを発現するように培養し、そ
してエリトリナ・カッフラ由来の天然のETIポリペプチ
ドと比べ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
対する高い結合能力を有する所望のポリペプチドを単離
することにより得られ、ここでこのタンパク質は、SEQ
ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、その
部分領域はこの配列のアミノ酸39〜139の領域に対して8
5％以上相同性であり、２本のジスルフィド結合を有
し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長されたSEQ ID NO:4で始まるものである。
その結合能力は好ましくは1.25〜1.6MU/mlである。
は、タンパク質混合物からセリンプロテアーゼを可逆的
且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコードする外
生DNA配列で形質転換又はトランスフェクションされた
原核又は真核宿主細胞を、適当な栄養条件下で、前記宿
主細胞が前記ポリペプチドを発現するように培養し、そ
してエリトリナ・カッフラ由来の天然のETIポリペプチ
ドと比べ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
対する高い結合能力を有する所望のポリペプチドを単離
することにより得られ、ここでこのタンパク質は、SEQ
ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、その
部分領域はこの配列のアミノ酸39〜139の領域に対して8
5％以上相同性であり、２本のジスルフィド結合を有
し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長されたSEQ ID NO:4で始まるものである。
その結合能力は好ましくは1.25〜1.6MU/mlである。
かかるインヒビター誘導体は好ましくは更に、トリプ
シンに対して1.07U/mg、好ましくは1.5U/mgの阻害比活
性を有する。その高い活性はアニオン交換体、カチオン
交換体又はニッケルキレートカラムでのクロマトグラフ
ィー精製を経て得られる。
シンに対して1.07U/mg、好ましくは1.5U/mgの阻害比活
性を有する。その高い活性はアニオン交換体、カチオン
交換体又はニッケルキレートカラムでのクロマトグラフ
ィー精製を経て得られる。
更に、本発明は組織ETIポリペプチドの生産のための
方法であって、タンパク質混合物からセリンプロテアー
ゼが可逆的且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコ
ードする外生DNA配列で形質転換又はトランスフェクシ
ョンさせた原核又は真核宿主細胞を、適当な栄養条件下
で、前記宿主細胞が前記ETIポリペプチドを発現するよ
うに培養し、この宿主細胞からこのETIポリペプチドを
単離し、そしてアニオン交換体、カチオン交換体又はニ
ッケルキレートカラムでクロマトグラフィー精製するこ
とによる方法に関連し、ここでこのタンパク質は、SEQ
ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、その
部分領域はこの配列のアミノ酸39〜139の領域に対して8
5％以上相同性であり、２本のジスルフィド結合を有
し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長されたSEQ ID NO:4で始まるものである。
方法であって、タンパク質混合物からセリンプロテアー
ゼが可逆的且つ選択的に捕獲するETIポリペプチドをコ
ードする外生DNA配列で形質転換又はトランスフェクシ
ョンさせた原核又は真核宿主細胞を、適当な栄養条件下
で、前記宿主細胞が前記ETIポリペプチドを発現するよ
うに培養し、この宿主細胞からこのETIポリペプチドを
単離し、そしてアニオン交換体、カチオン交換体又はニ
ッケルキレートカラムでクロマトグラフィー精製するこ
とによる方法に関連し、ここでこのタンパク質は、SEQ
ID NO:2に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、その
部分領域はこの配列のアミノ酸39〜139の領域に対して8
5％以上相同性であり、２本のジスルフィド結合を有
し、そしてＮ末端がSEQ ID NO:4又はメチオニンにより
Ｎ末端が伸長されたSEQ ID NO:4で始まるものである。
セリンプロテアーゼは当業者周知の方法に従って組換
ETIポリペプチドを利用して精製される（例えば、F.J.J
oubert（1987）（25）を参照のこと）。この目的のた
め、ETIポリペプチドをマトリックス（例えば、CNBr−S
epharoseカラム）に共有結合させ、そしてセリンプロテ
アーゼを含むタンパク質混合物を中性又は弱アルカリ性
条件下でこのカラムに載せ、そしてクロマトグラフィー
を実施する。それはpHを≦pH5.5にまで下げるか、又は
例えばKSCNの如きカオトロピック剤を含むバッファー溶
液を利用することにより溶出させる。その溶出液はセリ
ンプロテアーゼに対して95％以上のタンパク質純度を有
する。
ETIポリペプチドを利用して精製される（例えば、F.J.J
oubert（1987）（25）を参照のこと）。この目的のた
め、ETIポリペプチドをマトリックス（例えば、CNBr−S
epharoseカラム）に共有結合させ、そしてセリンプロテ
アーゼを含むタンパク質混合物を中性又は弱アルカリ性
条件下でこのカラムに載せ、そしてクロマトグラフィー
を実施する。それはpHを≦pH5.5にまで下げるか、又は
例えばKSCNの如きカオトロピック剤を含むバッファー溶
液を利用することにより溶出させる。その溶出液はセリ
ンプロテアーゼに対して95％以上のタンパク質純度を有
する。
インヒビターの固定化並びにセリンプロテアーゼ及び
ｔ−PAを精製するための全ての更なる工程段階は、E.カ
ッフラからインヒビターDE−３を単離するのと類似の方
法で実施できうる。かかる方法は例えばEP−B 0,218,47
9（15）、EP−B 0,112,122（14）、米国特許第4,902,62
3号（51）に記載されている。不活性支持体、好ましく
はCNBr−Sepharose（登録商標）に固定することが考え
られる。
ｔ−PAを精製するための全ての更なる工程段階は、E.カ
ッフラからインヒビターDE−３を単離するのと類似の方
法で実施できうる。かかる方法は例えばEP−B 0,218,47
9（15）、EP−B 0,112,122（14）、米国特許第4,902,62
3号（51）に記載されている。不活性支持体、好ましく
はCNBr−Sepharose（登録商標）に固定することが考え
られる。
本願記載の微生物DSM 3689及びDSM 5443は「Deytsche
Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb
H」Masheroder Weg 1B,D−38124 Braunschweigに1986年
４月９日（DSM 3689）及び1989年７月13日（DSM 5443）
にて寄託してある。
Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb
H」Masheroder Weg 1B,D−38124 Braunschweigに1986年
４月９日（DSM 3689）及び1989年７月13日（DSM 5443）
にて寄託してある。
以下の実施例、公開物及び配列プロトコールは請求の
範囲に由来する本発明の保護範囲の説明となる。記載の
方法は例示であり、その改良も本発明の対象となる。
範囲に由来する本発明の保護範囲の説明となる。記載の
方法は例示であり、その改良も本発明の対象となる。
実施例１ E.コリにおけるETIポリペプチドの発現 ａ）遺伝子の合成 対応の核酸配列を、E.コリにより好まれるコドンを利
用してエリトリナ・カッフラ由来のETIポリペプチドの
アミノ酸配列（Joubert and Dowdle（1987）（27））か
ら誘導し、そしてBeattie and Fowler（1991）（２）の
方法により合成した。クローニングを助長するため、制
限酵素EcoR Iのための切断部位を５′末端に挿入し、そ
して制限酵素Hind IIIのための切断部位を３′末端に挿
入した。合成した核酸を酵素EcoR I及びHind IIIで切
り、そして予めEcoR I及びHind IIIでも消化しておいた
クローニングベクターpBS＋（Stratagene,US,Catalogue
No.211201（43）;T3及びT7プロモーター遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子、f1起点、ColE−１起点、lacI遺伝
子、lacZ遺伝子及び多重クローニング部位を有するファ
ージf1とStratageneのpBSプラスミドとの誘導体）とラ
イゲーションした。そのライゲーション混合物をエッシ
ェリヒア・コリに形質転換させた。得られるクローンを
アンピシリンで選別し、そして酵素EcoR I及びHind III
による制限処理により分析した。得られるクローンpBS
＋ETIは約539pbのサイズの追加のEcoR I/Hind IIIフラ
グメントを含み、そしてSEQ ID NO:9を有する。
用してエリトリナ・カッフラ由来のETIポリペプチドの
アミノ酸配列（Joubert and Dowdle（1987）（27））か
ら誘導し、そしてBeattie and Fowler（1991）（２）の
方法により合成した。クローニングを助長するため、制
限酵素EcoR Iのための切断部位を５′末端に挿入し、そ
して制限酵素Hind IIIのための切断部位を３′末端に挿
入した。合成した核酸を酵素EcoR I及びHind IIIで切
り、そして予めEcoR I及びHind IIIでも消化しておいた
クローニングベクターpBS＋（Stratagene,US,Catalogue
No.211201（43）;T3及びT7プロモーター遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子、f1起点、ColE−１起点、lacI遺伝
子、lacZ遺伝子及び多重クローニング部位を有するファ
ージf1とStratageneのpBSプラスミドとの誘導体）とラ
イゲーションした。そのライゲーション混合物をエッシ
ェリヒア・コリに形質転換させた。得られるクローンを
アンピシリンで選別し、そして酵素EcoR I及びHind III
による制限処理により分析した。得られるクローンpBS
＋ETIは約539pbのサイズの追加のEcoR I/Hind IIIフラ
グメントを含み、そしてSEQ ID NO:9を有する。
ｂ）発現ベクター プラスミドpBS＋ETIを制限酵素EcoR I及びHind IIIで
切り、そしてサイズ539bpのフラグメントを単離した。
発現ベクターpBTacl（Boehringer Mannheim GmbH,Catal
ogue No.1081365（３）;pUC8を基礎とする:H.Haymerle
ら（1986）（21））も酵素EcoR I及びHind IIIで消化
し、そしてサイズ約4.6kbのベクターフラグメントを単
離した。双方のフラグメントをライゲーションし、そし
てlacレプレッサー遺伝子を含むヘルパープラスミドpUB
S550（Brinkmannら（1989）（４））と一緒にE.コリ（D
SM 5443）に形質転換した。クローンはプラスミドによ
り媒介されるアンピシリン又はカナマイシン耐性により
選別した。得られるプラスミドpBTETIは当初のベクター
pBTacIと比較して539bpのサイズをもつ追加のEcoR I/Hi
nd IIIフラグメントを含み、そして組換未修飾ETI（rec
ETI）を発現するのに利用できうる。
切り、そしてサイズ539bpのフラグメントを単離した。
発現ベクターpBTacl（Boehringer Mannheim GmbH,Catal
ogue No.1081365（３）;pUC8を基礎とする:H.Haymerle
ら（1986）（21））も酵素EcoR I及びHind IIIで消化
し、そしてサイズ約4.6kbのベクターフラグメントを単
離した。双方のフラグメントをライゲーションし、そし
てlacレプレッサー遺伝子を含むヘルパープラスミドpUB
S550（Brinkmannら（1989）（４））と一緒にE.コリ（D
SM 5443）に形質転換した。クローンはプラスミドによ
り媒介されるアンピシリン又はカナマイシン耐性により
選別した。得られるプラスミドpBTETIは当初のベクター
pBTacIと比較して539bpのサイズをもつ追加のEcoR I/Hi
nd IIIフラグメントを含み、そして組換未修飾ETI（rec
ETI）を発現するのに利用できうる。
Iqプラスミドを既に含んでいるDSM 3689も、DSM 5443
の代わりに類似の方法で利用できる。この場合、ヘルパ
ープラスミドpUB520は必要でない。
の代わりに類似の方法で利用できる。この場合、ヘルパ
ープラスミドpUB520は必要でない。
融合PCRをＮ末端突然変異及び新規プロモーターの導
入のために実施した。プラスミドpDS46/RB II由来のプ
ロモーター（Qiagen Companyより商品名pQE−６で入手
可能）をオリゴヌクレオチドETI−１及びETI−２を利用
して増幅させた（増幅生成物Ａ）。ETIポリペプチドを
コードする合成配列をPCRプライマーETI−３及びETI−
４を利用して単離した。プライマーETI−３は増幅生成
物が所望のアミノ酸置換（Ser）を有する。ETIポリペプ
チドをコードするようにデザインしてある（増幅生成物
Ｂ）。双方の増幅生成物をPCR並びにプライマーETI−１
及びETI−４の助けにより融合させた。融合生成物を二
種類の制限酵素BamH I及びHind IIIで切り、そして精製
した。プラスミドpA27 fd（EP−A 0,382,174（USP 5,22
3,256）（12））を２種類の制限酵素BamH I及びHind II
Iで（部分的に）処理し、そしてサイズ約4600pbのベク
ターフラグメントを単離した。このベクターフラグメン
ト及び融合フラグメントをライゲーションし、そしてヘ
ルパープラスミドpUB520と一緒にE.コリC600＋（DSM 54
43）の中に形質転換させた（Brinkmannら、1989
（４））。クローンをプラスミドにより媒介されるアン
ピシリン及びカナマイシン耐性により選別した。得られ
るプラスミドpETI−T2Lvsは当初のプラスミドpBTETIと
比べ、約350pbの追加のHind IIIフラグメントを含む。
入のために実施した。プラスミドpDS46/RB II由来のプ
ロモーター（Qiagen Companyより商品名pQE−６で入手
可能）をオリゴヌクレオチドETI−１及びETI−２を利用
して増幅させた（増幅生成物Ａ）。ETIポリペプチドを
コードする合成配列をPCRプライマーETI−３及びETI−
４を利用して単離した。プライマーETI−３は増幅生成
物が所望のアミノ酸置換（Ser）を有する。ETIポリペプ
チドをコードするようにデザインしてある（増幅生成物
Ｂ）。双方の増幅生成物をPCR並びにプライマーETI−１
及びETI−４の助けにより融合させた。融合生成物を二
種類の制限酵素BamH I及びHind IIIで切り、そして精製
した。プラスミドpA27 fd（EP−A 0,382,174（USP 5,22
3,256）（12））を２種類の制限酵素BamH I及びHind II
Iで（部分的に）処理し、そしてサイズ約4600pbのベク
ターフラグメントを単離した。このベクターフラグメン
ト及び融合フラグメントをライゲーションし、そしてヘ
ルパープラスミドpUB520と一緒にE.コリC600＋（DSM 54
43）の中に形質転換させた（Brinkmannら、1989
（４））。クローンをプラスミドにより媒介されるアン
ピシリン及びカナマイシン耐性により選別した。得られ
るプラスミドpETI−T2Lvsは当初のプラスミドpBTETIと
比べ、約350pbの追加のHind IIIフラグメントを含む。
ｃ）E.コリにおける組換ETIポリペプチド（SerETI）の
発現 発現効率を調べるため、E.コリ株DSM 5443をLB培地の
中で（Sambrookら、（1989）（38））、アンピシリン及
びカナマイシンの存在下（両者とも50μg/mlの最終濃
度）で550nmで0.6の光学密度（0D）に至るまでプラスミ
ドpETI−T2Lvs及びpUBS520と共に培養した。発現を5mM
のIPTGの添加により開発させた。培養物を更に４時間イ
ンキュベーションした。次いで、E.コリを遠心分離によ
り集め、そしてバッファー（50mMのトリス−HCl、pH8;5
0mMのEDTA）の中に再懸濁した。E.コリを音波処理によ
り溶解した。不活性タンパク質画分（封入体）を再度の
遠心分離により集め、そして音波処理により上記のバッ
ファーに再懸濁した。懸濁液を1/4容量の装填バッファ
ー（250mMのトリス−HCl、pH6.8、0.01MのEDTA、５％の
SDS、５％のメルカプトエタノール、50％のグリセロー
ル及び0.05％のブロモフェノールブルー）と混合し、そ
して12.5％のSDSポリアクリルアミドゲルにより分析し
た。コントロールとして、IPTGと混合していないE.コリ
（pET−T2Lvsp/pUBS520）の培養物を用いて同じ調製を
行い、そしてポリアクリルアミドゲルに載せた。ゲルを
0.2％のクマジーブルーR250（30％のメタノール及び10
％の酢酸で溶解）で染色し、そしてゲルをメタノール酢
酸混合物で脱色後、IPTG−誘導培養物の調製品の中で約
22kDの分子量の強いバンドが認められた。このバンドは
誘導していないE.コリ細胞の調製品においては見い出せ
なかった。
発現 発現効率を調べるため、E.コリ株DSM 5443をLB培地の
中で（Sambrookら、（1989）（38））、アンピシリン及
びカナマイシンの存在下（両者とも50μg/mlの最終濃
度）で550nmで0.6の光学密度（0D）に至るまでプラスミ
ドpETI−T2Lvs及びpUBS520と共に培養した。発現を5mM
のIPTGの添加により開発させた。培養物を更に４時間イ
ンキュベーションした。次いで、E.コリを遠心分離によ
り集め、そしてバッファー（50mMのトリス−HCl、pH8;5
0mMのEDTA）の中に再懸濁した。E.コリを音波処理によ
り溶解した。不活性タンパク質画分（封入体）を再度の
遠心分離により集め、そして音波処理により上記のバッ
ファーに再懸濁した。懸濁液を1/4容量の装填バッファ
ー（250mMのトリス−HCl、pH6.8、0.01MのEDTA、５％の
SDS、５％のメルカプトエタノール、50％のグリセロー
ル及び0.05％のブロモフェノールブルー）と混合し、そ
して12.5％のSDSポリアクリルアミドゲルにより分析し
た。コントロールとして、IPTGと混合していないE.コリ
（pET−T2Lvsp/pUBS520）の培養物を用いて同じ調製を
行い、そしてポリアクリルアミドゲルに載せた。ゲルを
0.2％のクマジーブルーR250（30％のメタノール及び10
％の酢酸で溶解）で染色し、そしてゲルをメタノール酢
酸混合物で脱色後、IPTG−誘導培養物の調製品の中で約
22kDの分子量の強いバンドが認められた。このバンドは
誘導していないE.コリ細胞の調製品においては見い出せ
なかった。
実施例２ SerETIの変性及び精製 50gの封入体（IBs）を0.1Mトリス/HCl、pH8.5、6Mの
グアニジン、0.1MのDTE、1mMのEDTA（25℃で90分）で溶
解し、そして2.5のpH値に調整後（HCl）、3mol/のグ
アニジン/HClに対して透析した。透析物を遠心分離し
（SS34,13000rpm）、そしてTM10での濃縮によりCprot＝
36.9mg/mlに調整した。１の反応槽を0.1Mのトリス/HC
l、pH8.5、1mMのEDTA、1mMのGSH、0.1mMのGSSGで充填し
た。それを16倍の透析液の添加により30分の時間間隔に
おいて20℃で変性させた。
グアニジン、0.1MのDTE、1mMのEDTA（25℃で90分）で溶
解し、そして2.5のpH値に調整後（HCl）、3mol/のグ
アニジン/HClに対して透析した。透析物を遠心分離し
（SS34,13000rpm）、そしてTM10での濃縮によりCprot＝
36.9mg/mlに調整した。１の反応槽を0.1Mのトリス/HC
l、pH8.5、1mMのEDTA、1mMのGSH、0.1mMのGSSGで充填し
た。それを16倍の透析液の添加により30分の時間間隔に
おいて20℃で変性させた。
SerETIの精製 ａ）アニオン交換体での精製 SerETIを0.1Mのトリス/HCl、pH8.5、1mMのEDTA、1mM
のGSH、0.1mMのGSSGで変性させる。この変性物をH2Oで
1:2に希釈し、HClでpH8.0に調整し、そして50mMのトリ
ス/HCl、pH8.0で平衡にしたＱ−Sepharose（登録商標）
カラムに載せる（5mgのタンパク質/1mlのゲル）。
のGSH、0.1mMのGSSGで変性させる。この変性物をH2Oで
1:2に希釈し、HClでpH8.0に調整し、そして50mMのトリ
ス/HCl、pH8.0で平衡にしたＱ−Sepharose（登録商標）
カラムに載せる（5mgのタンパク質/1mlのゲル）。
洗浄後、カラムを平衡バッファー及び50mMのNa2HPO4/
H3PO4、pH8.0で洗い（各時、５カラム容量）、50mMのNa
2HPO4/H3PO4、pH8.0、0.2MのNaClで溶出させる。
H3PO4、pH8.0で洗い（各時、５カラム容量）、50mMのNa
2HPO4/H3PO4、pH8.0、0.2MのNaClで溶出させる。
ｂ）カチオン交換体での精製 変性SerETIをHClの添加によりpH4.0に調整し、そして
50mMのNaOAc/HCl、pH4.0に対して透析した（クロスフロ
ー）。その透析液を遠心分離し（13000rpm、30分、SS3
4）、そして50mMのNaOAc/HCl、pH4.0で平衡にしておい
たTSK−SPカラム（スルフォプロピル側鎖をもつカチオ
ン交換体;Merck,Darmstadt,Germany、容量15ml）に載せ
た。カラムを平衡バッファー及び50mMのNaOAc/HCl、pH
4.0、0.1MのNaClで洗浄後、それを50mMのNaOAc/HCl、pH
4.0、0.2MのNaClで溶出させた。
50mMのNaOAc/HCl、pH4.0に対して透析した（クロスフロ
ー）。その透析液を遠心分離し（13000rpm、30分、SS3
4）、そして50mMのNaOAc/HCl、pH4.0で平衡にしておい
たTSK−SPカラム（スルフォプロピル側鎖をもつカチオ
ン交換体;Merck,Darmstadt,Germany、容量15ml）に載せ
た。カラムを平衡バッファー及び50mMのNaOAc/HCl、pH
4.0、0.1MのNaClで洗浄後、それを50mMのNaOAc/HCl、pH
4.0、0.2MのNaClで溶出させた。
溶出液のpHをSDS−PAGE及びRP−HPLCにより調べた。
結果： Ser−ETIは利用した条件下でTSK−SPカラムに結合
し、そして0.2MのNaClで溶出できた。SDS−PAGE及びRP
−HPLC分析は＞95％の純度を供した。
し、そして0.2MのNaClで溶出できた。SDS−PAGE及びRP
−HPLC分析は＞95％の純度を供した。
実施例３ SerETI,recETI及びエリトリナ・カッフラの種子由来のE
TIの比活性の比較 SerETI,recETI及びE.カッフラの種子から単離したETI
（ETI種子））を50mMのNa2HPO4/H3PO4、pH8.0、0.25Mの
NaClに対して透析し、そして1.0mg/mlのタンパク質濃度
に調整した。タンパク質濃度は280nmでのUV吸収を測定
することにより決定した（ε＝1.46cm2/mg）。
TIの比活性の比較 SerETI,recETI及びE.カッフラの種子から単離したETI
（ETI種子））を50mMのNa2HPO4/H3PO4、pH8.0、0.25Mの
NaClに対して透析し、そして1.0mg/mlのタンパク質濃度
に調整した。タンパク質濃度は280nmでのUV吸収を測定
することにより決定した（ε＝1.46cm2/mg）。
ETI活性の決定 ETIによるトリプシンの阻害は聞質としてＮ−α−ベ
ンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（BAP
A）を利用して測定する。40μのトリプシン溶液（0.1
3mg/ml;2mMのHCl）を60mlの試験バッファー（0.1Mのト
リス/HCl、pH8.0）及び100μのETI溶液と石英キュベ
ットの中で混合し、そして30℃で５分インキュベーショ
ンする。800μのBAPA溶液の添加後（10mgのBAPA×HCl
/10mlの試験バッファー）、１分当りの405nmでの吸収の
上昇を決定する。
ンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（BAP
A）を利用して測定する。40μのトリプシン溶液（0.1
3mg/ml;2mMのHCl）を60mlの試験バッファー（0.1Mのト
リス/HCl、pH8.0）及び100μのETI溶液と石英キュベ
ットの中で混合し、そして30℃で５分インキュベーショ
ンする。800μのBAPA溶液の添加後（10mgのBAPA×HCl
/10mlの試験バッファー）、１分当りの405nmでの吸収の
上昇を決定する。
ETI活性は下記の式に従って決定する： U/ml＝［１−ASample/Atrypsin］・Ctrypsin・0.328・
Ｐ ASample:阻害サンプルの吸収の上昇／分 Atrypsin:非阻害サンプルの吸収の上昇／分 Ctrypsin:試験混合物中のトリプシン濃度 結果:SerETIの比活性は、伝統的な方法によりE.カッフ
ラの種子から単離したETIの比活性よりも50％高い。
Ｐ ASample:阻害サンプルの吸収の上昇／分 Atrypsin:非阻害サンプルの吸収の上昇／分 Ctrypsin:試験混合物中のトリプシン濃度 結果:SerETIの比活性は、伝統的な方法によりE.カッフ
ラの種子から単離したETIの比活性よりも50％高い。
実施例４ CNBr Sepharose（登録商標）に対するETIのカップリン
グ 170mgの精製SerETIもしくはETI（種子）又は組換ETI
（実施例１及び２に似たようにして製造）を0.05MのH3B
O3/NaOH、pH8.0、0.5MのNaCl（カップリングバッファ
ー）に対して透析し、そして7.5gのCNBr−Sepharose
（登録商標）（50mlの1mMのHClの中に一夜膨潤させ、そ
の後吸引濾過し、そしてカップリングバッファーに懸
濁）と混合した。その懸濁物を室温で90分インキュベー
ションし、吸引濾過し、そして400mlの0.1Mトリス/HC
l、pH8.0と一夜振盪させた。SerETI−Sepharose（登録
商標）を排出し、そして0.7Mのアルギニン/H3PO4、pH7.
5で平衡にした。
グ 170mgの精製SerETIもしくはETI（種子）又は組換ETI
（実施例１及び２に似たようにして製造）を0.05MのH3B
O3/NaOH、pH8.0、0.5MのNaCl（カップリングバッファ
ー）に対して透析し、そして7.5gのCNBr−Sepharose
（登録商標）（50mlの1mMのHClの中に一夜膨潤させ、そ
の後吸引濾過し、そしてカップリングバッファーに懸
濁）と混合した。その懸濁物を室温で90分インキュベー
ションし、吸引濾過し、そして400mlの0.1Mトリス/HC
l、pH8.0と一夜振盪させた。SerETI−Sepharose（登録
商標）を排出し、そして0.7Mのアルギニン/H3PO4、pH7.
5で平衡にした。
実施例５ 組換プラスミノーゲンアクチベーターrPAの精製 rPA:クリングル２及びプロテアーゼドメインを含んで
成る組換tPA誘導体（EP−A 0,382,174（米国特許第5,22
3,256号）（12）に従って製造） 54mgの組換プラスミノーゲンアクチベーターrPA（タ
ンパク質濃度は280nmでの吸収、1.69cm2/mgの励起係数
により決定）を0.7Mのアルギニン/H3PO4、pH7.5で平衡
にしたETI−Sepharoseに載せた。平衡バッハァー及び0.
3Mのアルギニン/H3PO4、pH7.0で洗浄した後（各時、５
カラム容量）、それを0.3Mのアルギニン/H3PO4、pH4.5
で溶出させた。溶出液中のプラスミノーゲンアクチベー
ターの含有量を基質としてS2288により各ケース毎に決
定した。
成る組換tPA誘導体（EP−A 0,382,174（米国特許第5,22
3,256号）（12）に従って製造） 54mgの組換プラスミノーゲンアクチベーターrPA（タ
ンパク質濃度は280nmでの吸収、1.69cm2/mgの励起係数
により決定）を0.7Mのアルギニン/H3PO4、pH7.5で平衡
にしたETI−Sepharoseに載せた。平衡バッハァー及び0.
3Mのアルギニン/H3PO4、pH7.0で洗浄した後（各時、５
カラム容量）、それを0.3Mのアルギニン/H3PO4、pH4.5
で溶出させた。溶出液中のプラスミノーゲンアクチベー
ターの含有量を基質としてS2288により各ケース毎に決
定した。
実施例６参照。
実施例６ ｒ−PAに対するSerETI−Sepharose及びETI（種子）−Se
pharoseの結合能力の比較 ETI（種子）及びSer−ETIをSepharose製造者（Pharma
ica,Freiburg）の仕様書に従ってCNBr−Sepharose ffに
カップリングした。最終カラムを0.7mol/のArg/H3P
O4、pH7.5で平衡にし、2MU r−PA/1mlのゲルで装填し、
そして5CV（カラム容量）の0.7mol/のArg/H3PO4、pH
7.5、0.5MのNaCl及び5CVの0.3mol/のArg/H3PO4、pH7.
0で洗浄後、それらを0.3mol/のArg/H3PO4、pH4.5で溶
出させた。結合能力は溶出したtPAとして決定した（MU/
1mlのゲル）。各ゲルについて５回装填及び溶出を行っ
た。ゲルは各段階の間、標準条件下で再生させた。
pharoseの結合能力の比較 ETI（種子）及びSer−ETIをSepharose製造者（Pharma
ica,Freiburg）の仕様書に従ってCNBr−Sepharose ffに
カップリングした。最終カラムを0.7mol/のArg/H3P
O4、pH7.5で平衡にし、2MU r−PA/1mlのゲルで装填し、
そして5CV（カラム容量）の0.7mol/のArg/H3PO4、pH
7.5、0.5MのNaCl及び5CVの0.3mol/のArg/H3PO4、pH7.
0で洗浄後、それらを0.3mol/のArg/H3PO4、pH4.5で溶
出させた。結合能力は溶出したtPAとして決定した（MU/
1mlのゲル）。各ゲルについて５回装填及び溶出を行っ
た。ゲルは各段階の間、標準条件下で再生させた。
表にまとめたデータは、Ser−ETIをCNBr−Sepharose
にカップリングすることにより製造したSer−ETI−Seph
aroseは、種子−ETIをCNBr−Sepharoseにカップリング
することにより形成した種子−ETI−Sepharoseよりもｒ
−PAに対して1.5倍強い結合能力を有することを示す。
にカップリングすることにより製造したSer−ETI−Seph
aroseは、種子−ETIをCNBr−Sepharoseにカップリング
することにより形成した種子−ETI−Sepharoseよりもｒ
−PAに対して1.5倍強い結合能力を有することを示す。
活性の決定：（Kohnertら（1992）（29）） 200μのバッファー（0.1mol/のトリス−HCl pH7.
5、0.15％のTween（登録商標）80）及び１〜12μg/mlの
濃度にバッファーで希釈した200μのrPA溶液を37℃で
５分間インキュベーションする。試験は、37℃でインキ
ューベーションしておいた200μのS2288（6mmol/の
（Ｈ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリドデヒド
ロクロリド、Kabi Vitrum,Sweden））の添加により開始
した。アミド分解活性は、9750/mol/cmのｐ−ニトロ
アニリンに関する励起係数で、最初の2.5分以内での405
nmでの吸収の上昇により計算する。
5、0.15％のTween（登録商標）80）及び１〜12μg/mlの
濃度にバッファーで希釈した200μのrPA溶液を37℃で
５分間インキュベーションする。試験は、37℃でインキ
ューベーションしておいた200μのS2288（6mmol/の
（Ｈ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリドデヒド
ロクロリド、Kabi Vitrum,Sweden））の添加により開始
した。アミド分解活性は、9750/mol/cmのｐ−ニトロ
アニリンに関する励起係数で、最初の2.5分以内での405
nmでの吸収の上昇により計算する。
参考文献 １）Amanら;Gene 40（1985）183 ２）Beattie and Fowler;Nature 352（1991）548−549 ３）Boehringer Mannheim GmbH,Katalog Nr.1081365 ４）Brinkmannら;Gene 85（1989）109−114 ５）Brosiusら;J.Mol.Biol.148（1981）107−127 ６）Changら;Nature 198（1977）1056 ７）Dalborge,H.ら;FEBS Letters 266（1990）−１−３ ８）Daviesら;Ann.Rev.Microbiol.32（1978）469 ９）DE−A 44 24 171 10）EP−A 0 219 874 11）EP−A 0 267 851 12）EP−A 0 382 174（米国特許第5,223,256） 13）EP−B 0 093 619 14）EP−B 0 112 122 15）EP−B 0 218 479 16）EP−B 0 241 022 17）Ghrayebら;EMBO J.3（1984）2437 18）Goeddelら;Nuc.Acids Res.8（1980）4057 19）Hames,B.D.;Higgins,S.G.;Nucleic Acid Hybridiza
tion−A practical approach（1985）IRL Press,Oxfor
d,England 20）Harris,T.J.R.;Protein Engineering 1（1987）449
−458 21）Haymerle,H.ら;Nucl.Acid Res.14（1986）8615−86
24 22）Heussen,C.;J.Biol.Chem.259（1984）11635−11638 23）Heussen,C.;Haemostasis 11（1982）P47（Suppleme
nt） 24）Ｈltke und Kessler;「The DIG system user's g
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Mannheim GmbH,Germany. 25）Joubert.F.J.;Thrombosis and Haemostasis 57
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17 28）Kingsman,S.M.ら;Tibtech 5（1987）53−57 29）Kohnert,U.ら;Protein Engineering 5（1992）93−
100 30）Lehle,K.ら;J.Mol.Biol.239（1994）276−284 31）Millerら;Bio/Technology 7（1989）698） 32）Nagaiら;Nature 309（1984）810 33）Okaら;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）7212 34）Onesti,S.ら;J.Mol.Recogn.5（1992）105−114 35）Palvaら;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79（1982）5582 36）Porath,J.＆ Olin,B.;Biochemistry 22（1983）,16
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スターン，アンネ ドイツ連邦共和国，デー−82377 ペン ツベルク，カルベンデルシュトラーセ 10 (72)発明者 ボヅニィ，マンフレット ドイツ連邦共和国，デー−82362 バイ ルハイム，ハルダーシュトラーセ 19 (72)発明者 フィッシャー，ステファン ドイツ連邦共和国，デー−82398 ポー リンク，ヤコビフェルドベグ 11 (56)参考文献 特表 平９−503395（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ ｔａ，Ｖｏｌ．1217，Ｎｏ．１（1994) ｐ．23−28 Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖ ｏｌ．14，Ｎｏ．４（1996．Ａｐｒ．) ｐ．476−480 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/64 C07K 14/81 C12N 15/29 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (3)
- 【請求項１】タンパク質混合物からのセリンプロテアー
ゼの精製のための方法であって、エリトリナ・カッフラ
由来のインヒビターDE−３の活性を有する固定化ポリペ
プチドにセリンプロテアーゼを結合させ、前記タンパク
質混合物から未結合画分を除去し、前記セリンプロテア
ーゼを前記ポリペプチドから脱離し、前記固定化ポリペ
プチドをこの可溶性セリンプロテアーゼから分離し、そ
してこのセリンプロテアーゼを単離することによる方法
であり、ここで前記ポリペプチドとして、SEQ ID NO:2
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用するか、又
はSEQ ID NO:2に機能的に類似しているアミノ酸配列を
有し、且つ ａ）SEQ ID NO:1の核酸配列； ｂ）ストリンジェント条件下でSEQ ID NO:1に示すDNA配
列とハイブリダイズし、SEQ ID NO:4をコードする核酸
配列でＮ末端が始まる核酸；もしくは ｃ）ストリンジェント条件下でａ）もしくはｂ）に記載
の配列のいずれかとハイブリダイズする核酸； によりコードされるポリペプチドを使用する、前記方
法。 - 【請求項２】エリトリナ・カッフラ由来のインヒビター
DE−３の活性を有し、そしてタンパク質混合物からセリ
ンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕獲するポリペプ
チドの製造のための方法であって、前記ポリペプチドを
コードする核酸で形質転換又はトランスフェクションさ
れた原核宿主又は真核宿主細胞を適当な栄養条件下で前
記宿主細胞が前記ポリペプチドを発現できるようにして
培養し、そして前記ポリペプチドを単離することによる
方法であり、ここで前記ポリペプチドがSEQ ID NO:2の
アミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又はSEQ
ID NO:2に機能的に類似しているアミノ酸配列を有し、
且つ ａ）SEQ ID NO:1の核酸配列； ｂ）ストリンジェント条件下でSEQ ID NO:1に示すDNA配
列とハイブリダイズし、SEQ ID NO:4をコードする核酸
配列でＮ末端が始まる核酸；もしくは ｃ）ストリンジェント条件下でａ）もしくはｂ）に記載
の配列のいずれかとハイブリダイズする核酸； によりコードされるポリペプチドである、前記方法。 - 【請求項３】エリトリナ・カッフラに由来するインヒビ
ターDE−３の活性を有し、そしてタンパク質混合物から
セリンプロテアーゼを可逆的且つ選択的に捕獲するポリ
ペプチドであって、前記ポリペプチドをコードする核酸
で形質転換又はトランスフェクションされた原核宿主又
は真核宿主細胞を適当な栄養条件下で前記宿主細胞が前
記ポリペプチドを発現できるようにして培養し、そして
前記ポリペプチドを単離することにより獲得できるもの
であり、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドであるか、又はSEQ ID NO:2に機能的に類似してい
るアミノ酸配列を有し、且つ ａ）SEQ ID NO:1の核酸配列； ｂ）ストリンジェント条件下でSEQ ID NO:1に示すDNA配
列とハイブリダイズし、SEQ ID NO:4をコードする核酸
配列でＮ末端が始まる核酸；もしくは ｃ）ストリンジェント条件下でａ）もしくはｂ）に記載
の配列のいずれかとハイブリダイズする核酸； によりコードされるポリペプチドである、前記ポリペプ
チド。
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|---|---|---|---|
| DE19512937A DE19512937A1 (de) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | Neuer Inhibitor des Erythrina caffra Typs und dessen Verwendung zur Reinigung von Serinproteasen |
| DE19512937.7 | 1995-04-06 | ||
| PCT/EP1996/001388 WO1996031606A1 (de) | 1995-04-06 | 1996-03-29 | Mutant des inhibitors des erythrina caffra typs und dessen verwendung zur reinigung von serinproteasen |
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|---|---|
| JPH10505758A JPH10505758A (ja) | 1998-06-09 |
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|---|---|---|---|
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| ES (1) | ES2219685T3 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807772C1 (ru) * | 2023-03-14 | 2023-11-21 | Акционерное общество "Информационные спутниковые системы" имени академика М.Ф. Решетнёва" | Приборная панель космического аппарата |
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|---|---|---|---|---|
| JP3626982B2 (ja) * | 1997-08-29 | 2005-03-09 | アークレイ株式会社 | タンパク質分解酵素阻害物質の測定方法およびそれに用いる測定キット |
| AU3959499A (en) * | 1998-05-28 | 1999-12-13 | Korea Green Cross Corporation | Process of purifying angiogenesis inhibitors |
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|---|---|---|---|---|
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-
1996
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- 1996-03-29 AU AU52754/96A patent/AU5275496A/en not_active Abandoned
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- 1996-03-29 WO PCT/EP1996/001388 patent/WO1996031606A1/de active IP Right Grant
- 1996-03-29 DK DK96909149T patent/DK0819173T3/da active
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- 1996-03-29 JP JP8529957A patent/JP3061199B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-29 CA CA002215531A patent/CA2215531C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-01 IL IL11776196A patent/IL117761A/en not_active IP Right Cessation
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-
1997
- 1997-10-03 US US08/943,814 patent/US5973118A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１２１７，Ｎｏ．１（１９９４）ｐ．２３−２８ |
| Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．４（１９９６．Ａｐｒ．）ｐ．４７６−４８０ |
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| RU2807772C1 (ru) * | 2023-03-14 | 2023-11-21 | Акционерное общество "Информационные спутниковые системы" имени академика М.Ф. Решетнёва" | Приборная панель космического аппарата |
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| ZA962707B (en) | 1997-10-06 |
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