ES2219685T3 - Mutante del inhibidor del tipo erythrina caffra y empleo de dicho mutante para la purificacion de las serinproteasas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN POLIPEPTIDO QUE POSEE LA ACTIVIDAD DE UN INHIBIDOR DE 3 DE ERITRINA CAFFRA Y QUE AGLUTINA, DE FORMA REVERSIBLE Y SELECTIVA, PROTEASAS DE SERINA DE UNA MEZCLA DE PROTEINAS; SE OBTIENE MEDIANTE CULTIVO DE CELULAS HUESPED PROCARIONTICAS O EUCARIONTICAS, QUE CON UN ACIDO NUCLEINICO, QUE CODIFICA PARA EL MENCIONADO POLIPEPTIDO, HAN SIDO TRANSFORMADAS O TRANSFERIDAS DE TAL MANERA QUE PERMITEN A LAS CELULAS HUESPED, SI SE DAN UNAS CONDICIONES FAVORABLES DE SUSTANCIAS NUTRITIVAS, EXPRIMIR EL POLIPEPTIDO MENCIONADO. LA INVENCION TRATA TAMBIEN DEL AISLAMIENTO DEL MENCIONADO POLIPEPTIDO, Y SE CARACTERIZA PORQUE EL POLIPEPTIDO POSEE UNA SECUENCIA DE AMINO ACIDO QUE FUNCIONALMENTE ES ANALOGA A LA SEQ ID NO:2, EN UNA ZONA PARCIAL ES HOMOLOGO EN MAS DE UN 85 % A LA ZONA DE LOS AMINO ACIDOS 39 139 DE ESTA SECUENCIA, POSEE DOS PUENTES DE DISULFUROS Y COMIENZA N TERMINAL CON SEQ ID NO:4 O CON SEQ ID NO:4 PROLONGADA N TERMINAL POR METIONINA, Y POSEE UNA CAPACIDAD DE AGLUTINAR LOS ACTIVADORES DE PLASMINOGEN DE TEJIDO DE 1,25 MU/ML O MAS. EL POLIPEPTIDO ES ESPECIALMENTE APTO PARA LA PURIFICACION DE ACTIVADORES DE PLASMINOGEN, COMO ACTIVADORES DE PLASMINOGEN DE TEJIDO (T PA Y DERIVADOS).

Description

Mutante del inhibidor del tipo Erythrina caffra y empleo de dicho mutante para la purificación de las serinproteasas.

La invención se refiere a un nuevo inhibidor del tipo Eritrina caffra y su utilización para la purificación de las serinproteasas.

Los inhibidores inmovilizados de la tripsina, obtenidos a partir de la Eritrina (ETI), son eficaces reactivos para la purificación por cromatografía de afinidad, de las serinproteasas, en particular de los activadores del plasminógeno (C. Heussen (1984) (22), \beta-tripsina, \alpha-quimotripsina y trombina (S. Onesti y col., (1992) (34). Estos inhibidores de la tripsina son ya conocidos desde hace tiempo (C. Heussen (1982 (23); F.J. Joubert (1982) (26); F.J. Joubert (1982)(27).

El inhibidor DE-3 obtenido partir de E. caffra es particularmente preferido para la apropiada purificación de los activadores del plasminógeno (F.J. Joubert (1987)(25). En esta publicación está descrita también la secuencia completa de aminoácidos de este inhibidor. El DE-3 puede aislarse de las semillas de E. caffra y purificarse (F.J. Joubert (1982)(26). Una ETI, que no es citotóxica está descrita en la patente EP-B 0 218 479 (15).

Teixeira y col. (1994) (45) describe un ETI recombinante, cuya actividad inhibidora específica para el activador del plasminógeno del tejido es de 1,7 x 10^{9}U/mmol. La actividad inhibidora específica del ETI natural es en cambio de 1,94 x 10^{9}U/mmol. Lo mismo sirve para la actividad inhibidora respecto a la tripsina (2,63 x 10^{12}/3,21 x 10^{12}). Con ello la actividad inhibidora específica del ETI obtenido recombinantemente según Teixeira para la tripsina es un 20% y para el activador del plasminógeno de tejidos en un 10% más pequeño que la actividad del ETI natural.

Teixeira y col. (1994) (46) describe una forma modificada de ETI, en la cual el Val N-terminal es intercambiado por Asp. El ETI así modificado no forma un tPA y no muestra ninguna actividad inhibidora frente a tPA. La actividad inhibidora específica frente a la tripsina es para el ETI natural y el ETI modificado con Asp prácticamente igual.

El ETI recombinante se obtiene según Teixeira por expresión y se purifica mediante precipitación con sulfato de amonio (80% de saturación), diálisis frente al agua y una escisión con bromuro de ciano en donde se escinde la secuencia N-terminal incluida la metionina. A continuación se purifica por gelfiltración (Sephadex G50).

En la patente DE-A 44 24 171.2 (9) se describe un polipéptido purificado el cual posee la actividad de un inhibidor DE-3 de Erythrina caffra (de aquí en adelante llamada también polipéptido de ETI), el cual por el contrario posee para el inhibidor aislado de fuentes naturales una especificidad claramente mayor frente a las serinproteasas.

Otro criterio esencial para la idoneidad de un polipéptido ETI para la efectiva purificación de serinproteasas es la capacidad de unión para las serinproteasas.

Es por lo tanto un objetivo de la invención el mejoramiento de la efectividad de la capacidad de unión de un polipéptido de ETI para la purificación de las serinproteasas.

Objeto de la invención es un polipéptido que posee la actividad de un inhibidor DE-3 de Erythrina caffra, que se une reversible y selectivamente a una serinproteasa de una mezcla de proteínas y en donde el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos que funcionalmente es análoga a la secuencia SEQ ID NO:2, en una región parcial que es homóloga en más del 85% a una región de aminoácidos 39 - 139, posee dos puentes de disulfuro, y el N-terminal empieza con Ser, de preferencia con la secuencia SEQ ID NO 4. La capacidad de unión de este polipéptido con los activadores del plasminógeno es de 1,25 MU/ml y mayor, y el polipéptido posee una actividad específica de 1,07 U/mg o mayor, para la tripsina.

De preferencia, se codifica un polipéptido según la invención:

a) a partir de un ácido nucleico según la secuencia SEQ ID NO 1,

b) a partir de un ácido nucleico el cual hibrida con la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO: 1, en condiciones restringidas, y el N-terminal empieza con una secuencia de ácidos nucleicos, la cual codifica la SEQ ID NO: 4.

c) a partir de un ácido nucleico el cual sin la degeneración del código genético se hibrida con una de las secuencias citadas en a) o b) bajo condiciones restrictivas.

Se ha mostrado sorprendentemente que con el intercambio del Val N-terminal por el Ser en un polipéptido de ETI, la capacidad de unión para las serinproteasas aumenta claramente. Mientras el conocido N-terminal del polipéptido ETI empieza con la secuencia de aminoácidos Val-Leu-Leu-Asp (SED-ID-NO:3), el polipéptido ETI según la invención empieza con la secuencia Ser-Leu-Leu-Asp (SEQ-ID NO:4).

Estos resultados son particularmente sorprendentes en opinión de Teixeira y col. (1994) (46). Según esta publicación, un experto debería esperar que la modificación del N-terminal de ETI condujera a que un ETI así modificado perdiera su actividad inhibidora específica frente a los activadores del plasminógeno y su actividad frente a la tripsina no variara. Para un ETI modificado según la invención, es sorprendente tanto la actividad específica para la tripsina como también la capacidad de unión para los activadores del plasminógeno, en particular los activadores del plasminógeno de tejido aumenta en considerable proporción.

Bajo la expresión "un polipéptido con la actividad de un inhibidor DE-3 de Erythrina caffra" debe entenderse un polipéptido que se une específicamente a las serinproteasas, como los activadores del plasminógeno, \beta-tripsina, \alpha-quimotripsina y/o trombina. Mediante la unión, la actividad de la serinproteasa puede inhibirse.

Mediante la expresión polipéptido ETI "funcionalmente análogo" debe entenderse un polipéptido el cual posee la actividad de un inhibidor DE-3 de Erythrina caffra. Son posibles modificaciones de la secuencia de la proteína en el marco corriente habitual del experto. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el N-terminal debe ser idéntico a SEQ ID NO:4 (N-terminal Ser) y el polipéptido debe tener dos puentes de disulfuro, para la fijación de la estructura espacial. Después de la obtención recombinante en procariotas, la proteína según la invención puede contener todavía una metionina N-terminal (SEQ ID NO:10). Con ello, estos puentes disulfuro deben corresponder en su posición, a los puentes disulfuro del polipéptido ETI (Cys 39 - Cys 83 y Cys 132 - Cys 139, Lehle, K. y col. (1994) (30). Igualmente el polipéptido ETI debe ser homólogo en una región parcial en más de un 85% a la región de la secuencia 39 - 139 de SEQ ID NO:2. Esta región parcial es de preferencia igualmente la región de secuencias 39 - 139 de la proteína según la invención, y de preferencia, es idéntica o esencialmente idéntica a la región de secuencias 39 - 139 de SEQ ID NO:2.

De forma particularmente preferida se emplea un polipéptido ETI (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido), cuya secuencia de aminoácidos es idéntica o esencialmente idéntica a la SEQ ID NO:2. Se ha demostrado de nuevo sorprendentemente que la capacidad de unión del inhibidor para las serinproteasas es particularmente alta cuando después de la obtención recombinante en procariotas se escinde la metionina del N terminal completamente o por lo menos en gran parte (de preferencia más del 85% en la preparación del polipéptido ETI). El polipéptido ETI puede ser de diferentes tamaños. De preferencia comprende sin embargo 100 - 200 aminoácidos, con particular preferencia aproximadamente 139 - 173 aminoácidos.

Con la expresión capacidad de unión del inhibidor para las serinproteasas debe entenderse la cantidad de una serinproteasa (de preferencia un activador de plasminógeno), la cual puede eliminarse de una solución mediante un inhibidor inmovilizado. La capacidad de unión se expresa habitualmente como actividad/ml de una matriz [en los activadores de plasminógeno como actividad amidolítica en U/ml de la matriz]. La actividad del activador de plasminógeno se determina convenientemente después de la elución de la serinproteasa unida anteriormente.

La determinación de la actividad tiene lugar según U. Kohnert y col., (1992) (29). Para ello se mide fotométricamente la velocidad de la escisión del dihidrocloruro de H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S2288, Kabi Vitrum, Suecia) mediante la absorción a 405 nm.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la purificación de una serinproteasa de una mezcla de proteínas mediante la unión de la serinproteasa a un polipéptido ETI inmovilizado, el cual se une selectiva y reversiblemente a las serinproteasas, se elimina la parte sin unir de la mezcla de proteínas, se separa la serinproteasa del inhibidor, se separa el inhibidor inmovilizado de la serinproteasa soluble y se aisla la serinproteasa, la cual se caracteriza porque se utiliza un polipéptido ETI según la invención, las cuales serinproteasas se unen reversible y selectivamente a partir de una mezcla de proteínas y en donde el polipéptido posee de preferencia una secuencia de aminoácidos, la cual es funcionalmente análoga a la SEQ ID NO:2, en una región parcial es homóloga en más de un 85% con la región de aminoácidos 39 – 139 de esta secuencia, posee dos puentes disulfuro, empieza con un N-terminal con la SEQ ID NO:4 o con una SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, y posee una actividad específica de 1,07 U/mg o mayor, frente a la tripsina y una capacidad de unión de 1,25 MU/ml o mayor, para los activadores del plasminógeno.

De preferencia se obtiene este polipéptido ETI mediante la expresión procariótica o eucariótica de un ADN exógeno. La purificación y aislamiento tiene lugar de preferencia cromatográficamente mediante un intercambiador de aniones, un intercambiador de cationes o una columna de quelato de níquel.

El procedimiento según la inversión es particularmente ventajoso y apropiado para la purificación de activadores de plasminógeno como los activadores del plasminógeno de tejidos (t-PA) y derivados (p. ej., mutaciones y deleciones) de los mismos. El t-PA está descrito en la patente EP-B 0 093 619 (13), y los derivados de t-PA lo están en las patentes U.S. 5.223.256 (53), WO 90/09437 (54) y T.J.R. Harris (1987) (20).

La obtención del polipéptido ETI puede efectuarse mediante los métodos utilizados habitualmente por el experto. Para ello se obtiene en primer lugar una molécula de ácido nucleico (de preferencia ADN), el cual codifica un polipéptido ETI, cuyo N-terminal empieza con la secuencia SEQ ID NO:4 o con la secuencia SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, y codifica un polipéptido ETI. El polipéptido ETI posee una secuencia de aminoácidos la cual es funcionalmente análoga a la SEQ ID NO:2, y contiene una región parcial la cual en más del 85%, de preferencia completamente, es homóloga a la región de aminoácidos 39 - 139 de la secuencia SEQ ID NO:2 y tiene dos puentes disulfuro. Además, puede también utilizarse una secuencia, que en el marco de la degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido y/o es complementaria a esta secuencia. De preferencia se emplea también un ácido nucleico que híbrida con la secuencia SEQ ID NO:1 bajo condiciones restrictivas y codifica la SEQ ID NO:4 con un N-terminal o la SEQ ID NO:4 prolongada con un N terminal de metionina. El ADN se clona en un vector que puede ser transferido a una célula anfitriona y allí es replicado. Un vector de este tipo contiene adicionalmente los elementos operadores para la secuencia del polipéptido ETI, los cuales son necesarios para la expresión del ADN. Este vector, que contiene el ADN inhibidor y los elementos operadores, se transfiere a un vector el cual es capaz de expresar el ADN del polipéptido ETI. La célula anfitriona se cultiva en condiciones que permiten la expresión del polipéptido ETI. El polipéptido ETI se separa de estas células. Además se asegura mediante medidas apropiadas, que el polipéptido ETI pueda tomar una estructura terciaria activa, en la cual muestra unas propiedades inhibidoras.

Además, como ya se ha indicado, no es necesario que el polipéptido ETI tenga exactamente la secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4. Son igualmente apropiados los polipéptidos ETI que tienen esencialmente la misma secuencia y son polipéptidos con la actividad de un inhibidor DE-3 de Erythrina caffra. Es esencial sin embargo, que en el N-terminal esté intercambiado el Val por Ser. De preferencia, se emplean las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2 y 4 en donde, en caso de la expresión en células anfitrionas procarióticas, aunque no después de la expresión eucariótica, pueda estar contenida una metionina N-terminal (SEQ ID NO:10). Habitualmente sin embargo, se escinde la metionina en E. coli, puesto que la secuencia N-terminal empieza con Met-Ser (Dalborge H. y col. (1970) (7). Se prefiere un polipéptido de este tipo, en el cual el Met se ha escindido.

Otro objeto de la invención es un ácido nucleico aislado, el cual codifica un polipéptido ETI, el cual se une selectivamente a serinproteasas reversibles a partir de una mezcla de proteínas, y en donde la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que funcionalmente es análoga a la SEQ ID NO:2, en una región parcial es homóloga en más del 85% a la región de aminoácidos 39 - 139 de esta secuencia, tiene dos puentes disulfuro y el N-terminal empieza con la secuencia SEQ ID NO:4 o con la secuencia SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina. Un tal ácido nucleico aislado es de preferencia idéntico con la SEQ ID NO:1 o con un ácido nucleico, que en el marco de la degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido. Para la expresión en células anfitrionas eucarióticas o procarióticas, el ácido nucleico tiene en el extremo 5' las señales eucarióticas o procarióticas de transcripción y traducción habituales para el experto.

De preferencia se emplea un ácido nucleico el cual bajo condiciones restrictivas híbrida con la SEQ ID NO:1 bajo condiciones estándar. Estas condiciones estándar y los procedimientos para la hibridación son ya conocidas por el experto y por ejemplo en J. Sambrook y col. (1989) (38) y B.D. Hames, S.G. Higgins (1985) (19). Los protocolos estándar descritos en los mismos se emplean aquí habitualmente. En particular se llama la atención sobre Sambrook, sección IX (40), siendo ambos documentos objeto de la publicación de esta invención. Las condiciones restrictivas estandarizadas se describen igualmente en Höltke y Kessler (1990) (24).

Las condiciones restrictivas preferidas se dan en una hibridación en presencia de 1 mol/litro de NaCl, 1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano, los subsiguientes lavados en dos veces, del filtro a temperatura ambiente durante 5 minutos con 2 x SSC y otro paso de lavado durante 30 minutos. Este otro paso de lavado puede efectuarse con 0,5 x SSC, 0,1% de SDS, de preferencia con 0,2 x SSC, 0,1% de SDS y con particular preferencia con 0,1 x SSC, 0,1% de SDS, a 65ºC.

Para facilitar la obtención de los vectores u optimizar la expresión, pueden introducirse modificaciones. Estas modificaciones son por ejemplo:

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Modificación del ácido nucleico para introducir diferentes secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción para facilitar los pasos de ligación, clonación y mutagénesis

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Modificación del ácido nucleico para la construcción de codones preferidos para la célula hospedadora

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Incorporación al ácido nucleico de elementos operadores adicionales para optimizar la expresión en la célula anfitriona.

La expresión del inhibidor tiene lugar de preferencia en microorganismos como E. coli. También es posible una expresión en células eucariotas como levaduras, células CHO o células de insectos.

Para ello se utilizan plásmidos biológicamente funcionales o vectores de ADN vírico, los cuales contienen el ácido nucleico según la invención. Con estos vectores se transforman o transfieren establemente las células anfitrionas procarióticas o eucarióticas.

Los vectores de expresión deben contener un promotor, el cual permite la expresión de la proteína inhibidora en el organisno anfitrión. Tales promotores son ya conocidos por el experto y son por ejemplo el promotor lac (Chang y col. (1977) (26)), trp (Goeddel y col. (1980) (18)), el promotor \lambdaPL (Shimatake y col. (1981) (41)) y el promotor T5 (patente US 4.689.406 (49)). Son igualmente apropiados, los promotores sintéticos como por ejemplo el promotor tac (patente US 4.551.433 (48)). Igualmente apropiados son los sistemas de promotores acoplados como por ejemplo el sistema promotor T7-ARN-polimerasa (Studier y col. (1986) (44)). Son igualmente apropiados, los promotores híbridos de un promotor bacteriófago y la región operadora del microorganismo (patente EP-A 0 267 851 (11)). Además del promotor es necesario un sitio que sea efectivo para la formación de ribosomas. Para el E. coli este sitio de formación de ribosomas recibe el nombre de secuencia de Shine-Dalgarno (SD) (Shine y col. (1975) (42); J. Sambrook y col. (1989) (39)).

Para mejorar la expresión es posible expresar la proteína inhibidora como una proteína de fusión. En este caso se fusiona habitualmente una secuencia de ADN, la cual codifica la parte N-terminal de una proteína bacteriana endógena u otra proteína estable, en el extremo 5' de la secuencia codificadora de la proteína de inhibición. Ejemplos de las mismas son lacZ, trpE.

Después de la expresión, se escinden las proteínas de fusión de preferencia con enzimas (p. ej., factor Xa) (Nagai y col. (1984). Otros ejemplo para los sitios de escisión son el sitio de escisión IgA-proteasa (WO 91/11520 (55)) y el sitio de escisión ubiquitina (Miller y col. (1989) (31). En estos casos el polipéptido ETI según la invención puede contener todavía en el N-terminal uno o varios aminoácidos adicionales. Sin embargo se prefiere utilizar un polipéptido EPI que no contenga ningún aminoácido N-terminal adicional y empiece el N-terminal con la secuencia SEQ ID NO:4.

La proteína recombinante obtenida en primer lugar como cuerpos de inclusión inactivos puede transformarse mediante procedimientos habituales para el experto, en proteína activa soluble. Para ello se solubilizan los cuerpos de inclusión por ejemplo en hidrocloruro de guanidina o urea en presencia de un medio reductor, se reduce, se elimina el medio reductor p. ej., por diálisis y se renaturaliza la proteína solubilizada, de preferencia mediante el empleo de un sistema redox, como el glutatión reducido y oxidado o mediante una mezcla de disulfuros.

Estos métodos están descritos por ejemplo en las patentes US 4.933.434 (52), EP-B 0 241 022 (16) y EP-A 0 219 874 (10).

Es igualmente posible segregar las proteínas como proteínas activas de los microorganismos. Para ello se utiliza de preferencia la proteína de fusión, la cual consta de la secuencia señal que es apropiada para la segregación de proteínas en el organismo anfitrión empleado (patente US 4.336.336 (47)) y del ácido nucleico el cual codifica la proteína de inhibición. Con ello se segrega la proteína, bien en el medio (en las bacterias gram positivas) o bien en el espacio periplasmático (en las bacterias gram negativas). Entre la secuencia señal y la secuencia codificadora del inhibidor se aplica convenientemente un sitio de escisión, el cual o bien permite el procesado o bien permite en un paso adicional la escisión de la proteína del inhibidor. Estas secuencias señal son por ejemplo ompA (Ghrayeb y col. (1984) (17)), y phoA (Oka y col. (1985) (33)).

Los vectores contienen adicionalmente, los terminadores. Los terminadores son secuencias de ADN que señalizan el final de un proceso de transcripción. Se muestran la mayor parte de las veces mediante dos peculariedades estructurales de una región inversamente repetitiva rica en G/C, la cual puede formar intramolecularmente una doble hélice, así como un número de radicales U (o respectivamente T). Ejemplos son el atenuador y terminador trp en el ADN del fago fd así como rrnB (Brosius y col. (1981) (5)).

Adicionalmente los vectores de expresión contienen habitualmente un marcador seleccionable para seleccionar las células transformadas. Estos marcadores seleccionables son por ejemplo los genes de resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina y tetraciclina (Davies y col. (1978) (8). Igualmente, son marcadores apropiados seleccionables los genes para substancias esenciales de la biosíntesis de las substancias necesarias para las células como p. ej., la histidina, el triptófano y la leucina.

Se conoce un gran número de vectores bacterianos apropiados. Por ejemplo se han descrito para vectores bacterianos, los siguientes: Bacillus subtilis (Palva y col. (1982) (35)), E. coli (Aman y col. (1985) (1)); Studier y col. (1986) (44)), Streptococcus cremoris (Powell y col. (1988) (37)), Streptococcus lividans y Streptomyces lividans (patente US 4.747.056 (50)).

La expresión de la proteína inhibidora es posible además de efectuarse en microorganismos procariotas, también en eucariotas (como por ejemplo las células CHO, levaduras o células de insectos). Como sistema de expresión eucariótica se prefieren las células de levaduras y las de insectos. La expresión en levaduras puede efectuarse mediante tres clases de vectores de levaduras (vectores YI_{p} integradores (plásmidos que integran levaduras), vectores YR_{p} replicadores (plásmidos que replican levaduras), y vectores YE_{p} episomales (plásmidos episomales de levadura)). Lo anterior se describe con más exactitud, por ejemplo, en S.M. Kingsman y col. (1987) (28).

Otros procedimientos de tecnología genética para la obtención y expresión de vectores apropiados, están descritos en J. Sambrook y col. (1989) (39).

Después de la obtención se efectúa la purificación del ETI recombinante cromatográficamente mediante un intercambiador aniónico, p. ej., una columna de Q-Sepharose®, un intercambiador catiónico (p. ej., sobre una base de sulfopropilo) o mediante una columna de quelato de níquel, como se describe por ejemplo en Porath, J. & Olin, B. (1983) (36). Sorprendentemente se ha obtenido según este procedimiento de purificación un polipéptido ETI recombinante, el cual inmovilizado en BrCN-Sepharose, posee una elevada capacidad de unión y una elevada actividad específica inhibidora para t-PA y derivados de tPA.

Un polipéptido ETI así obtenido y purificado puede obtenerse mediante el cultivo de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, las cuales con una secuencia de ADN exógena la cual codifica un polipéptido ETI, se une selectivamente a serinproteasas reversibles a partir de una mezcla de proteínas, y en donde la proteína posee una secuencia de aminoácidos la cual es funcionalmente análoga a SEQ ID NO:2, una región parcial homóloga en más del 85% a la región de aminoácidos 39 - 139 de esta secuencia, posee dos puentes disulfuro, y empieza con la secuencia SEQ ID NO:4 con un N-terminal o con una SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, las cuales se transforman o transfieren de manera que permiten a las células anfitrionas, bajo condiciones nutritivas apropiadas, expresar el polipéptido y aislar el polipéptido deseado, el cual posee frente al polipéptido ETI natural a partir de Erythrina caffra, una elevada capacidad de unión para el activador del plasminógeno de tejidos humanos. La capacidad de unión es de preferencia entre 1,25 y 1,6 MU/ml.

Un tal derivado del inhibidor posee adicionalmente de preferencia una actividad inhibidora específica de 1,07 U/mg, de preferencia de 1,5 U/mg o mayor frente a la tripsina. Esta alta actividad se obtiene mediante la purificación cromatográfica en un intercambiador aniónico, un intercambiador de cationes o una columna de quelato de níquel.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la obtención de un polipéptido ETI recombinante, mediante el cultivo de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, las cuales con una secuencia de ADN exógena que codifica un polipéptido ETI, el cual se une selectivamente a serinproteasas reversibles a partir de una mezcla de proteínas, y en donde la proteína posee una secuencia de aminoácidos la cual es funcionalmente análoga a SEQ ID NO:2, en una región parcial es homóloga en más de un 85% con la región de aminoácidos 39 - 139 de esta secuencia, posee dos puentes disulfuro y empieza con un N-terminal con la secuencia SEQ ID NO:4 y posee una actividad específica de 1,07 U/mg ó mayor, frente a la tripsina, y una capacidad de unión de 1,25 MU/ml o mayor, para los activadores del plasminógeno, se trans-forman o transfieren de manera que permiten a las células anfitrionas bajo condiciones nutritivas apropiadas, la expre-sión del polipéptido ETI y el aislamiento del polipéptido ETI de las células anfitrionas, la purificación cromatográfica con un intercambiador aniónico, un intercambiador catiónico o una columna de quelato de níquel.

La purificación de las serinproteasas mediante el empleo del polipéptido ETI recombinante tiene lugar mediante el procedimiento ya habitual para el experto (ver p. ej., F.J. Joubert (1987) (25). Para ello el polipéptido ETI se une covalentemente a una matriz (p. ej., una columna de CNBr-Sepharose) y la mezcla de proteínas que contiene la serinproteasa, se añade en condiciones neutras o ligeramente alcalinas a la columna y se efectúa la cromatografía. La elución tiene lugar mediante la disminución del pH = 5,5 o mediante el empleo de soluciones tampón que contienen agentes caótropos, como p. ej., KSCN. El eluato tiene una pureza en proteína superior al 95% referida a la serinproteasa.

La inmovilización del inhibidor y todos los otros pasos de procedimientos para la purificación de la serinproteasa y t-PA, pueden efectuarse de manera análoga al inhibidor DE-3 aislado de E. caffra. Estos procedimientos están por ejemplo descritos en las patentes EP-B 0 218 479 (15), EP-B 0 112 122 (14), patente US 4.902.623 (51). La inmovilización tiene lugar convenientemente en un soporte inerte, de preferencia en CNBr-Sepharose®.

Los microorganismos citados en la descripción, DSM 3689 y DSM 5443 fueron depositados en fecha 09.04.1986 (DSM 3689) o respectivamente 13.07.1989 (DSM 5443) en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ("Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares") GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig.

Los ejemplos siguientes, publicaciones y protocolos de las secuencias describen la invención cuya amplitud protectora se deriva de las reivindicaciones de la patente. Los procedimientos descritos deben entenderse como ejemplos, los cuales aún después de ser modificados, describen el objeto de la invención.

Ejemplo 1 Expresión del polipéptido ETI en E. coli a) Síntesis genética

Mediante la utilización del codon preferido del E. coli, se derivó de la secuencia de aminoácidos del polipéptido ETI de Erythrina caffra (Joubert, F.J. (1987) (25), la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos, la cual se preparó sintéticamente según el método de Beattie y Fowler (1991) (2). Para facilitar la clonación se añadió en el extremo 5' un sitio de corte para la enzima de restricción EcoRI, y en el extremo 3' un sitio de corte para la enzima de restricción HindIII. El ácido nucleico sintético se restringió con las enzimas EcoRI y HindIII y se ligó con el vector de clonación pBS+ (Stratagene, US, catálogo nº 211201 (43)), el derivado del fago fl y el plásmido pBS de Stratagene con el gen promotor T_{3} y T_{7}, el gen de resistencia a la ampicilina, de origen fl, de origen CoIE-1, gen lacI, gen lacZ, y un sitio múltiple de clonación), el cual fue digerido previamente también con EcoRI y HindIII. La mezcla de ligación se transformó en la Escherichia coli. Los clones obtenidos se seleccionaron con ampicilina y se analizaron mediante restricción con las enzimas EcoRI y HindIII. El clon resultante pBS+ETI contiene un fragmento adicional EcoRi/HindIII con un tamaño de aproximadamente 539 bp (SEQ ID NO:9).

b) Vector de expresión

El plásmido pBS+ETI se restringió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, y se aisló el fragmento de tamaño 539 bp. El vector de expresión pBTacI (Boehringer Mannheim GmbH catálogo nº 1081365 (3), sobre la base de pUC8, H. Haymerle y col.(1986) (21) se digirió igualmente con las enzimas EcoRI y HindIII, y se aisló el fragmento vector aproximadamente de 4,6 kb de tamaño. Ambos fragmentos se ligaron y juntamente con el plásmido auxiliar pUBS520 (Brinkmann y col. (1989) (4)), el cual contiene el gen represor lac, se transformaron en E. coli (DSM 5443). La selección de los clones se efectuó mediante la resistencia proporcionada por el plásmido a la ampicilina o respectivamente canamicina. El Palsmido obtenido pBTETI contiene, en comparación con el vector de partida pBTacI, un fragmento adicional EcoRI/ HindIII con un tamaño de 539 bp y puede utilizarse para la expresión de ETI recombinante, no modificado (recETI).

De manera análoga, puede utilizarse también en lugar del DSM 5443, el DSM 3689, el cual ya contiene el plásmido I^{q}. En este caso no es necesario el plásmido auxiliar pUBS520.

Con la finalidad de una mutación en el N-terminal e introducción de un nuevo promotor, se efectuó una PCR de fusión. Con los oligonucleótidos ETI-1 y ETI-2 se amplificó el promotor del plásmido pDS56/RBII (comercialmente obtenible de la firma Qiagen con el nombre de pQE-6) (producto de amplificación A). Empleando los cebadores de PCR, ETI-3 y ETI-4, se aisló del plásmido pBTETI la secuencia sintética la cual codifica un polipéptido ETI, en donde el cebador ETI-3 fue concebido de forma que el producto amplificado codifique un polipéptido ETI con el cambio deseado de aminoácidos (Ser) (producto de amplificación B). Los dos productos de amplificación se fusionaron mediante una PCR y con ayuda del cebador ETI-1 y ETI-4. El producto de la fusión se escindió con las dos enzimas de restricción BamHI y HindIII y se purificó. El plásmido pA27fd, EP-A 0 382 174 (USP 5.223.256) (12) se trató con las dos enzimas de restricción BamHI y HindIII (parcialmente) y se aisló el fragmento vector de un tamaño aproximado de 4600 bp. El fragmento vector y el fragmento de fusión fueron ligados y transformados juntamente con el plásmido auxiliar pUBS520 (Brinkmann y col. 1989 (4)) en E. coli C600+ (DSM 5443). La selección de los clones tuvo lugar mediante la resistencia a la ampicilina y canamicina proporcionada por el plásmido. El plásmido obtenido pE-TI-T2Lvs contiene a diferencia del plásmido de partida pBTETI un fragmento HindIII adicional de aproximadamente 350 bp.

TABLA 1 Cebador de la PCR

1

c) Expresión del polipéptido ETI recombinante (SerETI) en E. coli

Para comprobar el rendimiento de la expresión, se cultivó la cepa DSM 5443 con los plásmidos pETI-T2Lvs y pUBS520 en medio LB (Sambrook y col. (1989) (38) en presencia de ampicilina y canamicina (50 \mug/ml de concentración final cada una) hasta una densidad óptica (OD) de 0,6 a 550 nm. La expresión se inició con la adición de 5 mM de IPTG. El cultivo se incubó durante 4 horas más. Al final se reunieron las E. coli mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón (50 mM de Tris-HCl pH 8, 50 mM de EDTA); mediante ultrasonidos se provocó la lisis de las E. coli. Mediante una nueva centrifugación se reunieron las fracciones de proteínas insolubles (cuerpos de inclusión) y se resuspendieron en el tampón citado más arriba mediante ultrasonidos. La suspensión se mezcló con 1/4 de volumen de tampón de aplicación (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 0,01 M de EDTA, 5% de SDS, 5% de mercaptoetanol, 50% de glicerina y 0,005% de azul de bromofenol) y se analizó con ayuda de un 12,5% de gel de SDS-poliacrilamida. Como control se efectuó la misma preparación con un cultivo de E. coli (pETI-T2Lvs/pUBS520) que no había sido mezclada con IPTG, y se aplicó a un gel de poliacrilamida. En la preparación del cultivo inducido por IPTG se puede reconocer claramente, después de teñir el gel con 0,2% de azul de Coomassie R250 (disuelto en 30% de metanol y 10% de ácido acético) y decoloración del gel en una mezcla de metanol-ácido acético, una banda con un peso molecular de aproximadamente 22 kD. Esta banda no se encuentra en la preparación de las células de E. coli no inducidas.

Ejemplo 2 Renaturalización y purificación de SerETI

50 g de cuerpos de inclusión (IBs) se solubilizaron con 0,1 M de Tris/HCl, pH 8,5, 6 M de guanidina, 0,1 M de DTE, 1 mM de EDTA (90 minutos a 25ºC) y después de ajustar el valor del pH a 2,5 (HCl) se dializaron frente a 3 moles/litro de guanidina/HCl. El dializado se centrifugó (SS34, 13.000 rpm) y por concentración con YM 10 se ajustó a C_{Prot}.= 36,9 mg/ml. Se cargó un recipiente de reacción de 1 litro con 0,1 M de Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM de EDTA, 1 mM de GSH, 0,1 mM de GSSG. La renaturalización se efectuó a 20ºC con 16 veces la adición del dializado en períodos de tiempo de 30 minutos.

Purificación de SerETI a) Mediante intercambiadores aniónicos

SerETI se renaturaliza en 0,1 M de Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM de EDTA, 1 mM de GSH. El renaturalizado se diluye con H_{2}O 1:2, se ajusta con HCl a pH 8,0 y se aplica (5 mg proteína/ml de gel) sobre una columna de Q-Sepharose® equilibrada con 50 mM de Tris/HCl, pH 8,0. Después de lavar la columna con el tampón de equilibrado y 50 mM de Na_{2}HPO_{4}/H_{3}PO_{4}, pH 8,0 (en cada caso con cinco veces el volumen de la columna) se efectúa la elución con 50 mM de Na_{2}HPO_{4}/H_{3}PO_{4}, pH 8,0, 0,2 mM de NaCl.

b) Mediante intercambiadores catiónicos

El Ser-ETI renaturalizado se ajustó por adición de HCl a pH 4,0 y se dializó ("cross flow") frente a 50 mM de NaOAc/HCl, pH 4,0. El dializado se centrifugó (13.000 rpm, 30 minutos, SS 34) y se aplicó sobre una columna TSK-SP equilibrada con 50 mM de NaOAc/HCl, pH 4,0 (intercambiador catiónico con grupos laterales de sulfopropilo, Merck, Darmstadt, Alemania, volumen 15 ml). Después de lavar la columna con tampón de equilibrio y con 50 mM de NaOAc/HCl, pH 4,0, y 0,1 M de NaCl se efectúa la elución con 50 mM de NaOAc/HCl, pH 4,0, y 0,2 M de NaCl.

La pureza del eluato se comprobó mediante SDS-PAGE y con RP-HPLC.

Resultado

El Ser-ETI se une bajo las condiciones empleadas a la columna TSK-SP y puede eluirse con NaCl 0,2 M. El SDS-PAGE y el análisis RP-HPLC confirman una pureza > 95%.

Ejemplo 3 Comparación de la actividad específica de SerETI, recETI y de ETI a partir de la semilla de Erythrina caffra

SerETI, recETI y ETI, aislados de la semilla de E. caffra [(ETI (semillas)] se dializaron frente a 50 mM de Na_{2}HPO_{4}/H_{3}PO_{4}, pH 8,0, y 0,25 M de NaCl, y se ajustó a una concentración de proteína de 1,0 mg/ml. La concentración de proteína se determinó por medición de la absorción UV a 280 nm (\varepsilon = 1,46 cm^{2}/mg).

Determinación de la actividad de ETI

La inhibición de la tripsina mediante el ETI se mide con N-\alpha-benzoil-L-arginin-4-nitroanilida (BAPA) como substrato. Se mezclan 40 \mul de una solución de tripsina (0,13 mg/ml de HCl 2 mM) en una cubeta de cuarzo con 60 \mul de tampón de ensayo (0,1 M de Tris/HCl pH 8,0) y 100 \mul de solución de ETI, y se incuba durante 5 minutos a 30ºC. Después de la adición de 800 \mul de solución de BAPA (10 mg de BAPA x HCl/10 ml de tampón de ensayo) se determina el aumento de la extinción/minuto a 405 nm.

La actividad-ETI se determina mediante la siguiente fórmula:

U/ml = [1 - E_{muestra}/E_{tripsina}] \cdot C_{tripsina} \cdot 0,328 \cdot V

E_{muestra} : aumento de la extinción/minuto de la muestra inhibida.

E_{tripsina} : aumento de la extinción/minuto de la tripsina no inhibida.

C_{tripsina} : concentración de la tripsina en la mezcla de ensayo.

V : Previa dilución de la solución de ETI

Proteína	Actividad específica U/mg
ETI (semilla)	0,88
Ser (ETI)	1,5
rec. ETI	1,07

Resultado

La actividad específica de SerETI es aproximadamente el 50% mayor que la actividad específica del ETI aislado de la semilla de E. caffra según el procedimiento clásico.

Ejemplo 4 Acoplamiento de ETI a la CNBr-Sepharose®

170 mg de SerETI purificado o respectivamente ETI (de semilla) o ETI recombinante (obtenido análogamente al ejemplo 1 y 2) se dializaron frente a 0,05 M de H_{3}BO_{3}/NaOH, PH 8,0, 0,5 M de NaCl (tampón de acoplamiento), y se mezclaron con 7,5 g de CNBr-Sepharose® (ablandada durante la noche en 500 ml de HCl 1 mM, a continuación filtrada por aspiración y suspendida en tampón de acoplamiento). La suspensión se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente, se filtró por aspiración y se agitó durante la noche con 400 ml de Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0. La SerETI-Sepharose® se filtró por aspiración y se equilibró con 0,7 M de arginina/H_{3}PO_{4}, pH 7,5.

Ejemplo 5 Purificación de un activador recombinante rPA del plasminógeno

rPA : derivado de tPA recombinante, que consta de los dominios Kringel 2 y proteasa (obtención según la patente EP-A 0382 174 (patente US 5.223.256) (12).

54 mg del activador recombinante rPA del plasminógeno, (concentración de la proteína determinada mediante absorción a 280 nm, coeficiente de extinción 1,69 cm^{2}/mg), se añadieron a una ETI-Sepharose equilibrada con 0,7 M de arginina/H_{3}PO_{4}, pH 7,5. Después de lavar con tampón de equilibrado y con 0,3 M de arginina/H_{3}PO_{4}, pH 7,0 (con cinco volúmenes de columna cada vez) se efectuó la elución con 0,3 M de arginina/H_{3}PO_{4}, pH 4,5. El contenido de activador de plasminógeno en el eluato se determinó con S 2288 como substrato, ver ejemplo 6.

Ejemplo 6 Comparación de la capacidad de unión de SerETI-Sepharose y ETI (de semillas)-Sepharose con el r-PA

El ETI (de semillas) y Ser-ETI en correspondencia con las recomendaciones del fabricante de la Sepharose (Pharmacia, Friburgo), se acoplaron a la CNBr-Sepharose ff. Las columnas acabadas se equilibraron con 0,7 moles/litro de Arg/H_{3}PO_{4}, pH 7,5, se cargaron con 2 MU r-PA/ml de gel, y después de lavar con 5 SV 0,7 moles/litro de Arg/H_{3}PO_{4}, pH 7,5, NaCl 0,5 M y con 5 SV 0,3 moles/litro de Arg/H_{3}PO_{4}, pH 7,0, se eluyó con 0,3 moles/litro de Arg/H_{3}PO_{4}, pH 4,5. La capacidad de unión se determinó como rPA eluído (MU/ml de gel). Cada gel se cargó cinco veces y se eluyó. Entre los pasos aislados se regeneraron los geles en condiciones estándar.

2

Los datos compendiados en la tabla muestran que la Ser-ETI-Sepharose obtenida por acoplamiento de Ser-ETI a la CNBr-Sepharose, posee para r-PA una capacidad de unión de 1 a 5 veces mayor que la ETI-Sepharose de semillas, obtenida por acoplamiento de ETI de semillas a la CNBr-Sepharose.

Determinación de la actividad: (Kohnert y col. (1992) (29)

200 \mul de tampón (0,1 moles/Tris HCl pH 7,5, 0,15% de Tween 80®) y 200 \mul de solución de rPA, diluidos con tampón a una concentración de 1-12 \mug/ml, se incuban durante 5 minutos a 37ºC. El ensayo da comienzo con la adición de 200 \mul de S 2288 (6 mmoles/litro (deshidrocloruro de H-D-Ile-Pro-Arg-P-nitroanilida, Kabi Vitrum, Suecia)), el cual se ha igualmente atemperado a 37ºC. La actividad amidolítica se calcula a partir del aumento de la absorción a 405 nm durante los 2,5 primeros minutos, con un coeficiente de extinción para la p-nitroanilina de 9750 l/moles/cm.

Listado de referencias

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2) Beattie und Fowler; Nature 352 (1991) 548-549.

3) Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1081365.

4) Brinkmann et al.; Gene 85 (1989) 109-114.

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9) DE-A 44 24 171.

10) EP-A 0 219 874.

11) EP-A 0 267 851.

12) EP-A 0 382 174 (US-Patent 5,223,256).

13) EP-B 0 093 619.

14) EP-B 0 112 122.

15) EP-B 0 218 479.

16) EP-B 0 241 022.

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38) Sambrook et al.; Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

39) Sambrook et al.; "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

40) Sambrook, J. et al.; Section IX, "A hybridization of radiolabelled probes to immobilized nucleic acid", in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 947-962.

41) Shimatake et al.; Nature 292 (1981) 128.

42) Shine et al.; Nature (1975) 25434.

43) Stratagene, US, Catalogue No. 211201.

44) Studier et al.; J. Mol. Biol. 189 (1986) 113.

45) Teixeira et al.; Biochimica et Biophysica Acta 1217 (1994) 16-22.

46) Teixeira et al.; Biochimica et Biophysica Acta 1217 (1994) 23-28.

47) US-Patent 4,336,336

48) US-Patent 4,551,433

49) US-Patent 4,689,406

50) US-Patent 4,747,056

51) US-Patent 4,902,623

52) US-Patent 4,933,434

53) US-Patent 5,223,256

54) WO 90/09437

55) WO 91/11520.

a. DATOS GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

\vskip0.500000\baselineskip

1. CALLE: Sandhofer Str. 116

\vskip0.500000\baselineskip

2. POBLACIÓN: Mannheim

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: D-68305

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 08856/60-3446

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 08856/60-3451

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo inhibidor del tipo Erythrina caffra y su utilización para la purificación de serinproteasas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ORDENADOR - FORMATO DE LECTURA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release # 1,0, versión # 1.30B (EPA)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: DE 195 12 937.7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 06-ABRIL-1995

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 516 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble cadena

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1.516

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 :

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 :

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 :

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 :

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 5 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5 :

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCC TCGAGAAATC ATAAAAA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 6 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6 :

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATAAGAATT CTGTTTCCTC TTTAATGAAT TCTG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 7 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 :

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAATTCTT ATGTCATTAT TAGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 8 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE CADENA: cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8 :

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAGCTTTT ATCAGCTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 9 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 541 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: cadena doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 11..529

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9 :

8

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 10 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 :

7

Claims (11)

1. Procedimiento para la purificación de una serinproteasa a partir de una mezcla de proteínas, mediante la unión de la serinproteasa a un polipéptido inmovilizado que tiene la actividad de un inhibidor DE-3, de la Erythrina caffra, eliminación de los componentes no unidos de la mezcla de proteína, separación de la serinproteasa del inhibidor, separación del inhibidor inmovilizado de la serinproteasa soluble y aislamiento de la serinproteasa, caracterizado porque como polipéptido se utiliza un polipéptido el cual posee una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente análoga a SEQ ID NO:2, posee dos puentes disulfuro, y en una región parcial, es homóloga en más del 85%, con la región 39-139 de esta secuencia de aminoácidos, el N-terminal empieza con una SEQ ID NO:4 o con una SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, y posee una actividad específica de 1,07 U/mg o mayor, frente a la tripsina y una capacidad de unión de 1,25 MU/ml o mayor para los activadores del plasminógeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza un polipéptido cuyo N-terminal empieza con la SEQ ID NO:4.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el polipéptido es codificado:

a) por un ácido nucleico según la SEQ ID NO:1

b) por un ácido nucleico el cual hibrida con una secuencia complementaria a la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO:1, bajo condiciones restrictivas, y el N-terminal empieza con una secuencia de ácidos nucleícos que codifican la SEQ ID NO:4.

c) por un ácido nucleico, el cual híbrida sin la degeneración del código genético con una secuencia que es complementaria a la secuencia indicada en a) o b), bajo condiciones restrictivas.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la serinproteasa es un activador del plasminógeno.

5. Procedimiento para la obtención de un polipéptido que posee la actividad de un inhibidor DE-3 de la Eritrina caffra, el cual se une reversible y selectivamente a las serinproteasas a partir de una mezcla de proteínas, se obtiene mediante el cultivo de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, las cuales se transforman o transfieren con un ácido nucleico el cual codifica el citado polipéptido, de manera que permite que las células anfitrionas, bajo apropiadas condiciones nutritivas, expresen el citado polipéptido, y que se aisle dicho polipéptido, caracterizado porque el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos la cual es funcionalmente análoga a la SEQ ID NO:2, en una región parcial es homóloga en más de un 85% a la región de aminoácidos 39 - 139 de esta secuencia, posee dos puentes disulfuro, empieza con el N-terminal de la secuencia SEQ ID NO:4 o con la secuencia SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, y posee una actividad específica de 1,07 U/mg o mayor, frente a la tripsina y una capacidad de unión de 1,25 MU/ml o mayor para los activadores del plasminógeno.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido N-terminal empieza con la secuencia SEQ ID NO:4.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el polipéptido es codificado por:

a) por un ácido nucleico según la secuencia SEQ ID NO:1

b) por un ácido nucleico el cual hibrida bajo condiciones restrictivas con una secuencia la cual es complementaria a la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO:1, y empieza el terminal N con una secuencia de ácidos nucleicos la cual codifica la secuencia SEQ ID NO:4

c) por un ácido nucleico el cual, sin degeneración del código genético, hibrida bajo condiciones restrictivas con una secuencia la cual es complementaria con una de las secuencias citadas en a) o b).

8. Acido nucleico aislado según SEQ ID NO:1, el cual codifica un polipéptido que tiene la actividad de un inhibidor DE-3 de la Erythrina caffra.

9. Polipéptido, el cual posee la actividad de un inhibidor DE-3 de la @Erythrina caffra y se une reversible y selectivamente a las serinproteasas de una mezcla de proteínas, y se obtiene mediante el cultivo de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, las cuales con un ácido nucleico el cual codifica el citado polipéptido, se transforman o transfieren de manera que permite que las células anfitrionas, bajo condiciones nutritivas apropiadas, expresen el citado polipéptido, y se aisle dicho polipéptido, caracterizado porque el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos la cual es funcionalmente análoga a la SEQ ID NO:2, en una región parcial que es homóloga en más de un 85% a la región de aminoácidos 39 - 139 de esta secuencia, posee dos puentes disulfuro, el N-terminal empieza con una SEQ ID NO:4 o con una SEQ ID NO:4 prolongada con un N-terminal de metionina, y posee una actividad específica de 1,07 U/mg o mayor, frente a la tripsina y una capacidad de unión de 1,25 MU/ml o mayor para los activadores del plasminógeno.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, caracterizado porque el N-terminal empieza con la secuencia SEQ ID NO:4.

11. Polipéptido según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque posee una capacidad de unión para los activadores del plasminógeno de tejidos de 1,25 MU/ml y mayor.