KR0167761B1 - 플라스미드, 이의 작제방법 및 플라스미노겐 활성자 제조에 있어서의 이의 용도 - Google Patents

플라스미드, 이의 작제방법 및 플라스미노겐 활성자 제조에 있어서의 이의 용도 Download PDF

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플로어 레오폴트
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요오트 스테펜스 게르트
스트라스부르거 볼프강
알.에프.빌헬름 마르틴
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프란쯔 비르츠, 지그프리드 헤르링
그뤼넨탈 게엠베하
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Abstract

내용 없음.

Description

플라스미드, 이의 작제방법 및 플라스미노겐 활성자 제조에 있어서의 이의 용도
제1a도 및 1b도는 시판되는 플라스미드 pBR 322를 출발물질로 사용한, 플라스미드 pBF 158의 작제도이다.
제2도는 합성 다중 클로닝 부위의 뉴클레오타이드 서열도이다.
제3도는 플라스미드 pBF 158-01의 작제도이다.
제4도는 플라스미드 pBF 158-01 T의 작제도이다.
제5a도 내지 5g도는 실시예 1d 내지 1f에 기술되고 제 6, 7 및 9도에 나타낸 사람 scu-PA-암호화 유전자를 작제하기 위한 합성 단편의 뉴클레오타이드 서열도이다.
제6a도 내지 6c도는 올리고뉴클레오타이드 단편 M4 내지 M8 (DNA 쇄의 3' 말단에 상응하는 목적 단백질의 C-말단에서 시작)을 플라스미드 pBF 158-01-T로 삽입시킨 플라스미드 pBF 158-02 T pBF 158-06 T의 작제도이다.
제7a도 내지 7c도는 플라스미드 pUC 19에서의 보조적 작제를 이용한 플라스미드 pBF 158-06 T의 작제도이다(실시예 1e 참조).
제8도는 합성 Trp-프로모터의 뉴클레오타이드 서열도이다.
제9도는 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현에 적당한 발현 플라스미드 pBF 160의 작제도이다.
제10도는 trp-프로모터의 조절하에 있는 플라스미드 pBF160(ㅇ―ㅇ) 또는 플라스미드 pUK 54 trp 207-1 (10) (●―●)로 형질전환된 상이한 에스케리키아 콜라이 균주에서의 인돌아크릴산으로 유도한후 시간의 함수로서 나타낸 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현도이다.
제11도는 유도체로서 인돌아크릴산을 첨가하기전(A) 및 첨가한지 6시간후 (B)에 pBF 161로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포로부터 수득한 단백질의 SDS-PAGE 덴시토그램이다.
제12도는 Tac-프로모터 조절하에 있는 플라스미드 pBF 171로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103에서의 사람 rscu-PA의 중간체 단백질 발현도이다.
제13도는 NdeI 제한부위를 충전시킨 후 형성된 평활 말단을 연결시킴으로써 샤인-달가노 서열(SD)과 개시 코돈 ATG사이의 거리가 8 내지 10개의 염기로 확장됨을 보인다.
제14도는 Trp 프로모터 조절하에 있는 플라스미드 pBF 161(ㅇ―ㅇ) 또는 pBF 163 (△. . . .△)으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 GRT-1에서의 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현도이다.
제15a도 및 15b도는 scu-PA 구조 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열도이다.
본 발명은 플라스미노겐 활성자의 제조에 사용하기 위한 플라스미드, 이의 작제방법 및 용도에 관한 것이다.
플라스미노겐 활성자는 급성 심근경색, 폐동맥 색전증, 동맥혈전색전증 및 기타 임상적인 증상에서와 같이 피브린 응괴에 의한 혈관의 폐쇄증을 치료하는데에 아주 중요하다. 약 1951년 이래로, 사람의 소변에는 제한된 단백질분해에 의해 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 단백질분해 효소, 즉 피브린을 가용성의 폴리펩타이드로 분해시켜서 응혈물의 피브린 성분의 용해를 일으키는 효소가 함유되어 있다는 것이 알려졌다. 1951년에 소변에서 처음으로 분리된 플라스미노겐 활성자는 유로키나제로 명명되었다. 후에 몇가지 상이한 형태의 유로키나제가 분리되었는데 이들 모두는 동일한 전구제 분자와 관련되어 있다는 것이 판명되었다. 전구효소 프로유로키나제는 1977에야 알려졌다. 2가지 주요 형태의 유로키나제 및 프로유로키나제의 1차 구조가 각각 1982년과 1984년에 규명되었다. 프로유로키나제는 단일쇄 구조를 가졌기 때문에 scu-PA(single chain urinary-Plasminogen Activator)라고 기술된다. 이 scu-PA는 411개의 아미노산으로 이루어져 있고 이의 천연형은 단백질 쇄의 302 위치의 아미노산이 당화되어 있다.
rscu-PA (재조합 scu-PA : 제안된 INN Saruplase)로 표시되는, 에스케리키아 콜라이내에서 재조합 기술에 의한 scu-PA의 비당화된 단백질 잔기의 제조가 몇몇 논문에 발표되어 있다. 401명의 환자에 대한 무작위 이중맹정 치료시험에서, rscu-PA가 기존의 피브린 용해제 보다 잘 허용되고 혈전용해에 효과적임이 밝혀졌다[참조문헌 : The Lancet. April 22, 1989, pp. 863 to 868].
몇몇 출간문에 기술된 것처럼 원핵세포들은 비당화된 플라스미노겐 활성자 rscu-PA를 생산하는데 이용된다. rscu-PA의 생산에 있어 공지된 방법은 사람 조직으로부터 수득된 scu-PA 구조 유전자를 발현시키는 것이다. 불행히도 이러한 방법의 경우, 발현율이 아주 낮아 목적생성물의 경제적인 대량생산이 불가능하다. 예를 들면, 히비노 [참조문헌 : Hibino et al. in Agric. Biol. Chem. 52 (1988) pp. 329 to 336]등은 총 세균 단백질 양에 대해 계산한 결과 재조합체 에스케리키아 콜라이로부터 단지 2%의 발현율을 얻었다. 유럽 특허원 공개번호 제00 92 182 A2호와 홀름스(Holmes)등의 논문(10)같은 기타 출간물에는 수득된 발현율의 정확한 값이 나와있지 않다. 그러나, 다른 세균주에서도 이 실험법에 의해 rscu-PA이 세균단백질의 2% 미만으로 발현되었다.
(진핵세포 단백질을 세균내에서 발현시키는 대부분의 경우) rscu-PA 단백질쇄는 형질전환된 세균 세포에 의해(이하에서 중간체 단백질로서 기술되는) 변성 단백질로 이루어진 봉입체 형태로 생산됨에 주목해야 한다. 상기 중간체 단백질은 분리후에 혈전 용해제로서 사용하기에 적합한 rscu-PA의 정확한 3차 구조를 형성하도록 화학처리에 의해 재생(재폴딩)시킨다. rscu-PA의 형성량을 측정하기 위해, 이와같이 수득한 생성물을 플라스민으로 처리하여 rscu-PA를 재조합(비당화) 이쇄 유로키나제(rtcu-PA)로 전환시키고 이의 효율활성을 측정할 수 있으며 이는 rscu-PA의 형성량에 대한 측정치로서의 역할을 할 수 있다. 물론, 예를 들면 전기영동 분리후 총 세균 단백질을 덴시토미터법으로 스캐닝하여 각각 형성된 중간체 단백질의 양 및 rscu-PA의 양( 및 이로써 발현율)이 직접적으로 결정될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 플라스미드로 형질전환된 세균의 발현율은 당해 분야에 공지된 플라스미드로 동일 숙주를 형질전환시킨 후에 측정된 발현율 보다 수배 더 은 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명에 따른 플라스미드는 이전의 공지된 어떠한 플라스미드 보다도 중간체 단백질 또는 rscu-PA를 제조하는데에 더욱 적합하다. 완성을 위해서, 공지된 방법(예를 들면 분석 목적으로 전술한 바와 같은 플라스민 처리)으로 rscu-PA를 절단하여 고분자량 또는 저분자량의 rscu-PA를 산업규모로 형성시킬 수 있다. 이는 본 발명에 의해 충분한 양의 rscu-PA를 용이하게이용할 수 있게 됨으로써 처음으로 가능해졌다.
본 발명에 따른 플라스미드는, 이의 오페론에 조절 프로모터, 리보소옴 결합부위로서 작용하는 샤인-달가노 서열, 개시 코돈, scu-PA의 합성 구조유전자 및 구조 유전자의 아래에 위치하는 최소한 1개의 터미네이터를 함유함을 특징으로 한다. 바람직 하게는, 2개의 연속적인 터미네이터가 오페론에 존재하며, 바람직한 터미네이터는 Tn 10으로 부터의 tet A/orf L 터미네이터 및/또는 trp A 터미네이터이다[참조 : Schollmeier et al, (6)].
조절 프로모터는 바람직하게는 Trp-프로모터 또는 Tac-프로모터이다.
본 발명에 따른 플라스미드의 조절 영역에서 샤인-달가노 서열과 개시코돈 사이의 거리는 6 내지 12, 바람직하게는 8 내지 10개의 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따른 플라스미드에 도입된 구조 유전자의 작제에서, 각각의 아미노산과 이를 암호화하는 삼중자를 아래에 기재하였다. 본 발명을 실시하기 위하여 이러한 양상 모두가 구조 유전자의 작제에서 실현되는 것은 아니다.
Figure kpo00002
한편, 구조 유전자의 작제에 있어서 가능한한 전술한 아미노산에 대해 다음과 같은 코돈의 사용은 피하는 것이 좋다(다시 한번 언급하지만 이러한 양상 모두가 동일한 작제에서 실시되는 것은 아니다).
Figure kpo00003
본 발명에 따라서, 구조 유전자와 조절 영역 사이의 목적하지 않는 안정된 이차 구조물의 형성이 구조 유전자내의 특정 아미노산에 대한 선택된 코돈의 사용 및 오페론내의 조절 영역의 특징을 이용함으로써 거의 완전히 억제된다.
합성 구조 유전자를 제조하기 위해, 우선 40 내지 80개의 염기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 일본쇄 형태로 합성한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 DNA 합성기(New Brunswick Scientific Co. 회사의 모델 Biosearch 8600 모델)를 사용하여 아담스(Adams) 등 (7)의 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 의해 1㎛ol 규모로 수득된다. 선택된 단량체 빌딩 블록으로서 각각의 데옥시리보뉴클레오타이드의 시판 β-시아노에틸-보호된 디이소프로필아미노 포스포르아미다이트를 합성에 사용한다. 고체 지지물로부터 절단시킨 후에 조물질과 트리틸-함유 쇄를 탈염시키고 멸균 조건하에서 겔 여과로 예비정제한 다음 역상 HPLC를 2회 수행한다. 각각의 주 생성물을 탈트리틸화시킨후 다시 역상 HPLC를 2회 수행하여 겔 전기 영동 분석(PAGE)에 의해 측정시 매우 순수한 형태의 목적하는 올리고뉴클레오타이드를 수득한다.
이어서, 이러한 일본쇄 올리고뉴클레오타이드중 4 내지 9개의 그룹을 사용하여 약200개의 염기쌍을 함유하는 이본쇄 단편을 수득한다. 이는, 목적하는 단편의 말단을 형성하도록 내정된 것이 아닌 일본쇄 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 인산화시키고(예를 들면, T-4-폴리뉴클레오타이드 키나제 처리), 말단을 형성하는 비인산화된 월리고뉴클레오타이드와 각각의 상보쇄를 어닐링시킨다음 연결시킴으로써 달성된다. 이렇게 형성된 이본쇄 클론화 단편들은 적절한 선형화된 벡터에 삽입시킨다. 추가의 과정은 하기의 실시예에 자세히 설명되어 있다. 하기에 사용된 약자는 다음의 의미를 갖는다.
bp 염기쌍
DE 52 Whatman 사의 음이온 교환기
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
IPTG 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드
PAGE 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동
PU 플러그 단위
SDS 나트륨 도데실설페이트
S.D.-서열 샤인-달가노 서열
Tris-HCI 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드
Tween 80 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노-올리에이트
본 발명에 따른 플라스미드의 작제를 위한 출발물질로써 바람직하게는 시판도는 플라스미드 pBR 322(4363 bp)가 사용되었다. 본 발명의 바람직한 양태에서 nic/bom 영역 및/또는 테트라사이클린 내성 유전자는 이 플라스미드에서 제거된다. 테트라사이클린 내성 유전자를 완전히 제거시킬 필요는 없으며, 플라스미드가 이로 형질전환된 세균에 더 이상 테트라사이클린 내성을 부여하지 않도록 그 유전자의 일부만을 제거하는 것으로도 충분하다. 이러한 방법(nic/bom 영역과 적어도 테트라사이클린 내성 유전자의 일부 제거)에 의해, 이른바 고안전성 플라스미드가 얻어진다.
본 발명에 따른 플라스미드 작제를 위한 바람직한 방법에서, 다음 단계는(상기에서 설명된 바와 같이 결실물을 갖는) 변형된 플라스미드 pBR 322 또는 다음에 명명된 공지의 다른 플라스미드의 EcoRI과 HindIII 제한부위 사이에 합성 다중 클로닝 부위를 삽입시키는 과정이다. 이와 같은 다중 클닝 부위(제2도 참조)는 연속되는 제한부위가 지정된 순서로 나열되는 것이 특징적이다. 제한 부위를 연결시켜주는 염기들은, 바실루스 서브틸리스 Xy1 오페론 5'-AAGGAG-3'(4)로부터의 리보소옴 결합부위(샤인-달가노 서열) 및 S.D.-서열에서부터 예정된 거리에 해독 개시 코돈 ATG를 함유하는 Xbal와 Ndel 사이의 서열을 제외하고는 임의로 선택된다. S.D.-서열 다음에 오는 GAAAT 염기들은 빌헬름(Wilhelm) 등의 방법(4)에 따라 사용되고 Nde I 제한 부위인 CATATG 서열과 연결된다. 따라서, S.D.-서열과 개시코돈 ATG 사이의 거리는 8개 염기쌍에 이른다. 기술적 이유에서 몇몇 제한부위들 사이의 거리는 최소한 약 20개의 뉴클레오타이드가 되어야 하며 이러한 크기는 다음 단계에서 형성되는 원하지 않는 단편들의 제거를 용이하게 한다.
다중 클로닝 부위를 이용하여, (적절하게는 전사 터미네이터를 삽입시킨 후) 바람직하게는 목적 단백질의 C-말단, 즉 제조되는 DNA 쇄의 3' 말단으로 개시되는 scu-PA 구조 유전자의 부분 서열 및 Trp-프로모터를 연속해서 삽입시킬 수 있는 제한부위를 플라스미드에 삽입시킨다. Trp-프로모터는 합성되거나 시판되어지거나 다른 플라스미드로 부터의 분리에 의해 수득된다. 이와 같은 수행하여 제조한 scu-PA 구조 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 제 15도에 나타나 있으며 각 코돈에 대응하는 아미노산도 3개의 문자코드로 나타나있다.
상기에서 기술된 바와 같이 작제된 플라스미드로부터, 본 발명에 따른 다른 플라스미드는, 모든 조절인자들과 함께 합성 scu-PA 구조 유전자를 포함하는 단편들을 분리하기 위해 상기 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI과 HindIII로 절단한 다음 상기 단편을 장내세균류, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 내에서 자가복제가능하고 EcoRI과 HindIII로 절단시켜 선형화하고 짧아진 다른 플라스미드에 삽입시킴으로써 제조할 수 있다. 제한 부위 EcoRI와 Xbal를 사용하는 외에는 원칙적으로 같은 방법에 의해서, 본 발명에 따른 플라스미드에 예를 들면 Tac-프로모터 대신 Trp-프로모터의 교환( 및 이의 반대)이 가능하다.
본 발명에서 출발물질들로서 적합한 기타 공지되고 시판되는 플라스미드는 예를 들면, pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 등과 같이 단일의 EcoRI과 HindIII 제한부위를 포함하는 것이다.
샤인-달가노 서열과 개시 코돈 ATG 간의 거리가 확장된 본 발명에 따른 플라스미드는, 상술한 것과 같이 Ndel에 의한 절단, 생성된 절단부위의 충전 및 형성된 평활말단의 연결에 의하여 전술한 바와 같이 작제한 플라스미드(S.D 서열과 개시코돈 사이의 거리 : 약 8개 뉴클레오타이드)로부터 수득할 수 있으며, 이로써 S.D. 서열과 개시 코돈 사이의 거리가 확장되어 그 거리가 예를 들어 10개의 뉴클레오타이드에 이르는 목적 플라스미드가 수득된다.
이미 언급한 바와 같이, 세균을 본 발명에 따른 플라스미드로 형질전환시키면 당해 분야에서 공지되어 있고 지금껏 사용되어온 플라스미드들로 형질전환시켜 수득할 수 있는 것보다 수배 더 높은 발현율을 얻는다.
본 발명에 따른 플라스미드를 사용한적절한 컴피턴트 숙주세포의 형질전환은 공지된 방법으로 수행된다. 본 발명에 따른 플라스미드 발현용의 적합한 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 균주 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클렙시엘라(Klebsiella) 또는 세라티아(Serratia) 종의 한 균주와 같은 관련 장내세균이다.
바람직한 숙주 세포들은 에스케리키아 콜라이 GRT-1와 같은 에스케리키아 콜라이종 및 특히 에스케리키아 콜라이 K12 JM 101 (ATCC 33876), 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 (ATCC 39403), 에스케리키아 콜라이 K12 JM 105 (DSM 4162), 에스케리키아 콜라이 K12 (ATCC 31446), 에스케리키아 콜라이 K12 DM1 (ATCC 33849) 등과 같은 K12 서브 그룹 들이다.
Tac-프로모터를 포함하는 에스케리키아 콜라이 발현 시스템에서의 발현은 예를들면 락토오즈의 첨가나 클루코스의 제거, 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드의 첨가등에 의해 유도된다. 그러나, 플라스미드가 Trp-프로모터를 함유하는 경우, 바람직하게는 인돌아크릴산, 인돌 아세트산, 또는 인돌 프로피온산을 첨가함으로써 유도된다. 물론, 당 분야에서 알려진 다른 유도제들도 사용될 수 있다.
세포 매당(mass)의 밀도가 원하는 정도로 되고 발현이 유도되는 경우, 원심 분리에 의해 세포들을 수거한다. 세포 매쓰를 수용성의 염 용액에 현탁시키고 압력자에 의해 세포를 파괴하는 마쇄기로 균질화한다. 혼합물의 불용성 성분을 분리해내기 위해 이것을 다시 원심분리시키면 rscu-PA의 중간체 단백질과 불용성 세포 단편으로 구성된 잔사가 얻어진다. 이 잔사를 구아니딘 하이드로클로라이드 용액으로 처리하면 중간체 단백질은 용해되고, 정확한 천연 구조, 즉 목적하는 rscu-PA의 정확한 구조가 형성되도록(예를 들면, 환원 및 산화된 글루타티온을 함유하는) 산화환원 시스템으로 처리한다. 이렇게 얻어진 혼합물은 용해된 형태의 rscu-PA를 함유한다. 이 용액으로부터 rscu-PA가 일반적인 방법, 예를 들면 크로마토그래피에 이은 동결건조에 의해 순수한 형태로 분리될 수 있다.
분석을 위해서, 시험대상 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 균주를 형질전환시키고 세포 현탁액이 미리 예정된 흡광도가 이를 때까지 이들 균주를 배양시킨다음 적절한 유도제의 첨가에 의해 rscu-PA 중간체 단백질의 발현을 유도하는 것이 편리하다. 일정 시간 배양후 발효 혼합물의 분취량을 수거한 후 원심분리로 얻어진 세포들을 라이소자임(pH8.0의 50mM 트리스-HCI 완충액, 50mM EDTA 및 15% 사카로즈 ㎖당 라이소자임 1㎎) 처리로 파괴시킨다. 분해된 세포들의 균질물은 4 내지 5몰의 구아니딘 하이드로클로라이드 용액으로 처리하여 용해시킨다. 1.2몰 구아니딘 하이드로클로라이드가 되게 희석한 후, 이 용액에 글루타티온, 머캡토에탄올 또는 시스테인과 같은 환원제를 첨가하여 2 내지 5시간 동안 재폴딩시킨다[참조 문헌 : Winkler et al. (11)]. 수득된 단일쇄 rscu-PA는 플라스민을 첨가하여 이쇄 rtcu-PA로 전환시킨다. 이어서, rtcu-PA의 활성을 활성 이쇄 유로키나제에 의해 분해되는 기질 S 2444(파이로 Glu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드; Kabi Diagnostika, 스웨덴)을 사용하여 분석한다. rscu-PA에서 rtcu-PA로의 활성화는 50mM 트리스 완충액, 12mM 염화나트륨, 0.02% Tween 80 (pH 7.4) 및 37℃에서 수행한다. 플라스민에 대한 rscu-PA의 관계는 ℓ당 약 100에서 1,500(몰농도 기준) 또는 ℓ당 8,000에서 36,000(효소 단위 기준)이어야 한다. 이 분석은 38mM 염화나트륨, 0.36μM 아프로티닌(플라스민 활성 억제) 및 0.27mA S 2444을 포함하는 pH 8.8의 50mM 트리스 완충액중 37℃에서 수행된다. 시험 시료중 rscu-PA 함량에 따라, 5 내지 60분간 항온처리 한후 50% 아세트산을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음, 405㎜ 에서의 흡광도를 측정한다. 기질 S 2444의 제조자에 따르면, 이러한 조건하에서 405㎚에서의 분당 0.05 흡광도 변화는 시험 용액의 ml당 25 플러그 단위의 활성을 나타낸다.
상이한 세균에서 수개의 다른 플라스미드들을 사용하여 제조한 중간체 단백질로부터 획득된 rscu-PA의 수율이 제10, 12 및 14도에 나타나있다.
제11도 및 하기의 실시예, 특히 실시예 2의 표1로부터, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이내에서 본 발명에 따른 플라스미드는 형성된 총 단백질중 10 내지 25 중량%, 특히 14 내지 20중량%의 발현율로 rscu-PA의 중간체 단백질 생성을 유도한다. 따라서, 본 발명에 따른 플라스미드를 사용했을 때의 발현율은 pUK 54 trp 207-1과 같이 당해 분야에 공지된 플라스미드를 사용하여 수득할 수 있는 발현율보다 적어도 10 내지 15배 높다.
제1a도 및 1b도는 시판되는 플라스미드 pBR 322를 출발물질로 사용한, 플라스미드 pBF 158의 작제도이다. 이러한 작제과정에서 nic/bom 영역과 테트라사이클린 내성 유전자의 많은 부분이 연속적으로 제거된다.
제2도는 합성 다중 클로닝 부위의 뉴클레오타이드 서열이다.
제3도는 플라스미드 pBF 158-01의 작제도이다. 플라스미드 pBF 158의 제한부위 EcoRI와 HindIII 사이에 합성 다중 클로닝 부위가 삽입된다.
제4도는 플라스미드 pBF 158-01 T의 작제도이다. 단편 ClaI x HindIII가 Tn10(6)으로부터의 tet A/ort L 터미네이터를 함유하는 플라스미드 pRT 61 (5)로부터의 대응하는 단편 T와 교환된다.
제5a도 내지 5g도는 실시에 1d 내지 1f도에 기술하고 제6, 7 및 9도에 나타낸 사람 scu-PA 암호화 유전자를 작제하기 위한 합성 단편의 뉴클레오타이드 서열도이다.
제6a도 내지 6c도는 올리고뉴클레오타이드 단편 M4 내지 M8 (DNA 쇄의 3' 말단에 상응하는 목적 단백질의 C-말단에서 시작)을 플라스미드 pBF 158-01-T로 삽입시킨 플라스미드 pBF 158-02 T 내지 pBF 158-06 T의 작제도이다.
제7a도 내지 7c도는 플라스미드 pUC 19에서의 보조적 작제를 이용한 플라스미드 pBF 158-08 T의 작제도 이다(실시예 1e 참조).
제8도는 합성 Trp-프로모터의 뉴클레오타이드 서열도이다.
제9도는 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현에 적합한 발현 플라스미드 pBF 160의 작제도이다. scu-PA에 대한 구조 유전자는 제한부위 Nde I 및 Cla I 간에 7나타냈다.
제10도는 trp-프로모터의 조절하에 있는 플라스미드 pBF 160(ㅇ―ㅇ) 또는 플라스미드 pUK 54 trp 207-1 (10) (●―●)로 형질전환된 상이한 에스케리키아콜라이 균주에서의 인돌아크릴산으로 유도한후 시간의 함수로서 나타낸 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현도(중간체 단백질을 재폴딩시키고 생성된 rscu-PA를 플라스민으로 활성화시킨후의 tscu-PA 활성으로 측정)이다. 기질 S 2444로 검정한 rtcu-PA 활성은 578㎚에서의 흡광도가 1인 배양 배지 ml당 플러그 단위로 나타냈다.
제11도는 유도제로서 인돌아크릴산을 첨가하기전 (A) 및 첨가한지 6시간 후 (B)에 pBF 161로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세로부터 수득한 단백질의 SDS-PAGE 덴시토그램이다.
제12도는 Tac-프로모터 있는 조절하에 플라스미드 pBF 171로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103에서의 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현도(전술한 바와 같이 재폴딩시키고 활성화시킨후의 rtcu-PA 활성으로 측정)이다. 유도과정은 시간 0에서 IPTG를 가하여 수행한다. rtcu-PA 활성은 S2444로 검정한 578㎚에서의 흡광도가 1인 배양 배지 ml당 플러그 단위로 나타냈다.
제13도는 Ndel 제한 부위를 충전시킨 후 형성된 평활 말단을 연결시킴으로써 샤인-달가노 서열(SD)과 개시 코돈 ATG사이의 거리가 8 내지 10개의 염기로 확장됨을 보인다.
제14도는 Trp 프로모터 조절하에 있는 플라스미드 pBF 161(ㅇ―ㅇ) 또는 플라스미드 pBF 163(△. . . △)으로 형질전환된 이. 콜라이 GRT-1에서의 사람 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현도이다. 유도과정은 시간 0에서 인돌아크릴산을 가하여 수행한다. rtcu-PA 활성은 기질 S2444로 검정한 578㎚에서의 흡광도가 1인 배양 배지 ml당 플러그 단위로 나타냈다.
제15a도 및 15b도는 scu-PA 구조 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열도이다. 각자의 코돈에 상응하는 아미노산은 3문자 코드로 나타냈다.
다음의 실시예에서 사용된 제한 효소들은 시판품이다(Nachr. Chem. Techn. Lab. 35 939, 1987에서 주어진 조사표 참조).
클론 선별용으로 실시예에서 사용된 배양 배지에는 ℓ당 고지(meat)로부터의 펩톤 7.8g, 카제인으로부터의 펩톤 7.8g, 효모 추출물 10g, 염화나트륨 5.6g 및 글루코스 10g을 함유한다. 이 배지를 한천 1ℓ당 10g의 비로 혼합하고 열에 의해 살균 처리한 후 페트리 디쉬에 붓는다.
달리 언급하지 않는한, 엠피실린-함유 배지라는 용어는 ml 당 150㎍의 엠피실린이 첨가된 전술한 배양 배지를 포함한다.
[실시예 1]
Trp-플로모터의 조절하에 있는 합성 scu-PA 유전자를 포함하는 rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 플라스미드 pBF 160의 작제
a) 플라스미드 pBF 158의 작제
i) 플라스미드 pBR 322(Pharmacia, Nr. 27-4902, 4363 염기쌍)로부터 nic/bom 영역(염기 2207와 2263 사이에 위치(1))을 다음과 같이 제거시킨다 :
pBR 322를 제한 엔도뉴클레아제 Nde I으로 절단한 후 선형화환다. 점성 말단은 충전시켜 평활말단이 되게 한다(2). 이어서, 이러한 쇄를 Pvu II로 염기 2068에서 절단하고 pBR 322의 나머지 부분의 2개의 평활말단을 T4-리가제를 사용하여 공지 방법으로 연결한다. 그 후 연결 생성물로 컴피턴트 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포(ATCC 39403)를 형질전환시킨다(3). 형질전환된 세포들은 엠피실린-함유 배지에서 배양한다. 수득된 클론중에서 플라스미드 pBF 157을 함유하는 클론을 선별한다. 상기 플라스미드 pBF 157은, 단편 PstI x BspM II, PstI x Ball 및 PstI x AvaI 가 출발 플라스미드 pBR 322에 함유된 것에 비해 228개 염기쌍이 단축되고 pBR 322의 단일 제한 부위 PvuII 및 NdeI을 더 이상 함유하지 않는다는 점에서 출발 플라스미드와 상이하다.
ii) Eco RV X NruI으로 절단한 다음 생성된 평활 말단을 연결시킴으로써, pBF 157로부터 테트라사이클린 내성 유전자의 대부분을 제거시킨다. 에스케리키아콜라이 K12 JM 103 세포를 연결 생성물로 형질전환시키고 엠피실린-함유 배지에서 배양한다. 수득된 클론중에서, 뉴클레오타이드 크기가 pBF 157 보다 적은 787개이고 BamHI 제한부위가 결실된, pBF 157과 상이한 플라스미드 pBF 158을 함유하는 클론을 선별한다. pBF 158로 세균 균주를 형질전환시킴으로써 테트라사이클린 내성이 세균에 부여되지 않는다.
b) pBF 158-01의 작제; 합성 다중 클로닝 부위의 삽입
Eco RI x HindIII 절단에 의해 pBF 158로 부터 31bp 단편을 제거시킨 후, 제2도에서 나타낸 서열을 갖는 다중 클로닝 부위를 이들 제한 부위 사이에 연결시킨다. 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포를 연결 생성물로 형질전환시킨 후, 엠피실린함유 배지에서 배양하여 플라스미드 pBF158-01을 함유하는 클론을 선별한다. 이 플라스미드는, 단일 제한 부위인 XbaI, Ndel, SacI, EagI, KpnI 및 SpeI 뿐 아니라 제2의 PstI 제한부위를 추가로 포함한다는 점에서 pBF 158과 다르다(제3도 참조).
c) pBF 158-01 T의 작제; 전사 터미네이터의 삽입
pBF 158-01로부터, 다중 클로닝 부위의 ClaI x HindIII 단편을 각각의 제한 효소분해에 의해 제거하고 Tn10(6)으로부터 tet A/orf L 터미네이터를 포함하는 pRT 61(5) 의 ClaI x HindIII 단편으로 교체한다.
에스케리키아 콜라이 K12 JM 103을 형질전환시키고 엠피실린-함유 배지에서 배양한 후에 플라스미드 pBF 158-01 T를 함유하는 클론을 선별한다. 플라스미드 pBF 158-01 T는 ClaI x HindIII 단편이 297개 뉴클레오타이드로 확장된다는 점에서 pBF 158-01과 상이하다(제4도 참조).
d) 플라스미드 pBF 플라스미드 158-02 T 내지 pBF 158-06 T의 작제; scu-PA 유전자의 합성 단편 M4 내지 M8의 삽입
합성 단편들은 제 5a도 내지 5g도 나타내었다. 합성된 단편들은 약 200개 염기쌍을 갖는 이본쇄 단편 형태로 각각의 벡터에 삽입된다. 이 과정을 수행하기 위해, 벡터들을 하기에 지정된 제한 부위에 상응하는 제한 효소로 절단한 후 아가로즈 전기영동, 전기용출 및 DE 52상에서의 크로마토그래피 정제에 의해 제거될 단편으로부터 분리한다. 그 다음, 벡터의 수득 부분을 T4-리가제를 사용하여 각각의 이본쇄 합성단편과 연결시키고 연결 생성물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 K 12 JM 103을 형질전환시킨다. 형질전환된 균주들을 엠피실린-함유배지에서 선별한다. 개개의 플라스미드 pBF 158-02 T 내지 pBF 158-06 T를 아래와 같이 작제한다 :
i) 플라스미드 pBF 158-01 T의 Bam HI와 ClaI 사이에 M8 단편을 연결시켜 플라스미드 pBF 158-02 T를 형성한다.
올리고뉴클레오타이드 019는 scu-PA의 C-말단을 암호화한다.
정지 코돈 TAA의 하부에 Nhe I 제한 부위에 이어 trp A 터미네이터(8)의 부가적인 전사 종결 서열들이 Cla I 까지 뒤따른다.
ii) 플라스미드 pBF 158-02 T의 SpeI 및 BamHI 사이에 단편 M7을 연결시켜 플라스미드 pBF 158-03 T를 수득한다.
iii) 플라스미드 pBF 158-03 T의 KpnI과 SpeI 사이에 단편 M6을 연결시켜 플라스미드 pBF 158-04 T를 수득한다.
iv) 플라스미드 pBF 158-04 T의 EagI과 KpnI 사이에 단편 M5을 연결시켜 플라스미드 pBF 158-05 T를 수득한다.
v) 플라스미드 pBF 158-05 T의 SacI과 EagI 사이에 단편 M4을 연결시켜 플라스미드 pBF 158-06 T를 수득한다.
i) 내지 v)에 따라 수득되는 클론은, DNA-서열 분석에 의해 입증되는 정확한 서열을 갖는 새로이 삽입된 단편의 준재에 의해 각각의 선행 클론으로부터 선별된다.
e) 플라스미드 pBF158-08 T의 작제; scu-PA 유전자의 합성 단편 M2와 M3의 삽입
단편 M2와 M3을 삽입시키기 위해서는 PstI으로 절단시켜야 한다. 플라스미드 pBF158(및 상기 실시예에서 제조된 이의 유도체)은 엠피실린 내성 유전자 내에 PstI 제한 부위를 함유하여 연속적인 클로닝 단계를 다루기 어렵게 하므로 플라스미드 pUC 19에서 보조적 작제를 수행해야한다(제7a도 내지 7c도 참고).
i) 시판되는 플라스미드 pUC 19로부터 다중 클로닝 부위 및 이의 상부에 존재하는 추가의 212개 뉴클레오타이드를 NdeI x HindIII 단편으로서 제거한다.
플라스미드 pBF158-02 T(실시예 1di 참고)에 올리고 뉴클레오타이드 단편 M6을 삽입시킴으로써 단편 M7이 없는 플라스미드 pBF 158-04 T에 상응하는 플라스미드 pBF 158-04-3 T를 수득한다.
플라스미드 pBF 158-04-3 T에서 다중 클로닝 부위를 NdeI x HindIII 단편으로서 분리한 다음 pUC 19/NdeI X Hind III와 연결시킨다. 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포를 연결 생성물로 형질전환시키고 엠피실린-함유 배지에서 배양한 후에 클라스미드 pUC 19-04-3을 함유하는 클론을 선별한다. 이것은 712개 염기쌍의 NdeI x HindIII 단편이 존재하므로 PuC 19와 상이하다.
ii) PstI X SacI 단편을 pUC 19-04-3으로부터 제거하고, 선형 벡터를 분리한 다음 올리고뉴클레오타이드 단편 M3과 연결시킨다. 에스케리키아 콜라이 K 12 JM 103 세포를 연결 생성물로 형질전환시키고 엠피실린-함유 배지에서 선별한다. 선별된 클론은, 정확한 서열을 갖는 M3 단편을 포함하는 189개 염기쌍의 PstI x SacI 단편에 의해 pUC 19-04-3 과 상이한 플라스미드 pUC-07을 함유한다.
iii) 상기에서 수득된 플라스미드 pUC-07로부터 NdeI x PstI 단편을 제거한 후 올리고뉴클레오타이드 M2 단편을 이들 제한 부위 사이에 연결시킨다. 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포들을 연결 생성물로 형질전환시키고 엠피실린 함유배지에서 배양한 후 플라스미드 pUC 19-08을 함유하는 클론을 선별한다. PUC 19-08을 입증된 서열을 갖는 NdeI x PstI 단편 M2(246개 염기쌍 포함)가 존재하므로 플라스미드 pUC 19-07과 다르다.
iv) 단편 M2와 M3을 플라스미드 pUC 19-08로부터 NdeI x SacI 단편으로서 분리하고, NdeI과 SacI으로의 절단에 의해 전술한 플라스미드로부터 수득한 pBF 158-06 T의 대단편에 연결시킨다. 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포를 연결생성물로 형질전환시킨 후 엠피실린-함유 배지에서 선별한다. 435bp의 NdeI x SacI 단편이 존재하여 pBF 158-06 T와 상이한 플라스미드 pBF 158-08 T를 함유하는 클론을 선별한다.
f) 플라스미드 pBF 160의 작제; 합성 Trp-프로모터의 삽입
문헌 [참조 : De Boer et al. (9)]에 기술된 Trp-프로모터의 서열을 XbaI 제한 부위까지 사용한다. 5'-AATTCTGAAT-3' 서열을 5'-말단에 첨가하여 EcoRI 제한부위를 작제한다(제 8도 단편 M1 참고). 단일쇄의 021과 021 A를 하이브리드화한 후 EcoRI x XbaI으로 분해된 pBF 158-08 T에 결합시킨다. 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 세포를 연결 생성물로 형질전환시킨후 엠피실린-함유 배지에서 배양하여 pBF 160을 함유하는 클론을 선별한다. 이 플라스미드 pBF 160은, 이로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 균주가 인돌아크릴산의 첨가시 rscu-PA의 중간체 단백질을 생산한다는 점에서 실시 1에서 기술한 모든 플라스미드와 상이하다.
g) 발현시험
i) 발효
플라스미드 pBF 160으로 형질전환된 몇몇 에스케리키아 콜라이 균주(예를 들면 에스케리키아 콜라이 GRT-1, 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 및 에스케리키아 콜라이 K12 ATCC 31446)를 38mM의 황산암모늄, pH 7.0인 56mM의 포스페이트 완충액, 1mM의 황산마그네슘, 10g/ℓ의 효모 추출물, 10g/ℓ의 글루코스 및 150㎎/ℓ의 엠피실린이 포함된 배지에서 동일조건하에 배양후, 62㎎/ℓ의 인돌아크릴산을 첨가하여 rscu-PA의 중간체 단백질의 발현을 유도한다.
비교를 위해, 동일한 에스케리키아 콜라이 균주를 디트로이트(Detroit) 562 세포 mRNA(10)를 사용하여 수득되고 pUK 54 trp207-1이란 명칭으로 알려져 있는, cDNA 뱅크로부터의 사람 프로유로키나제를 암호화하는 유전자는 포함하는 당 분야에 공지어 있는 플라스미드로 형질전환시킨다. 이어서, 이러한 형질전환된 균주들을 본 발명에 따른 플라스미드로 형질돤환된 균주에 대하여 전술한 바와 동일한 조건하에서 배양하고 유도시킨다.
유도전과 유도후 6시간 동안 매 시간마다, 578㎚에서의 흡광도(OD)가 1인 세포 현탁액 1ml에 상응하는 세포 샘플을 분리하여 발현율을 측정한다.
ii) rscu-PA의 중간체 단백질의 재폴딩, rtcu-PA를 형성하기 위한 절단 및 활성 검정.
원심분리에 의해 분리된 세포들을 상기에 기술된 바와 같이 라이소자임 처리에 의해 분해시킨 후 분해된 세포의 균질물은 전순환 바와 같이 검정에 사용한다.
rscu-PA로부터 수득된 rtcu-PA(중간체 단백질의 재폴딩에 의해 제조)의 활성을 검정하여 측정된 발현율을 제10도에 나타내었다. 이로부터 알 수 있는 바와같이, 플라스미드 pBF 160으로 형질전환된 균주의 발현율은 문헌(10)에 공지된 플라스미드 pUK 54 trp 207-1로 형질전환된 동일한 에스케리키아 콜라이 균주를 사용하여 수득되는 것 보다도 10배 내지 15배 더 높았다. 더구나, 이들 실험으로부터 동일한 플라스미드로 형질전환된 상이한 균주에서의 발현율은 거의 같은 값을 갖는 것은 분명하다. 플라스미드 pBF 160으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 균주는(특정 에스케리키아 콜라이 균주에 관계없이) 각각의 경우 그의 발현율이 공지된 플라스미드 pUK 54 trp 207-1로 형질전환된 균주로 부터의 발현율보다 수배 높았다.
[실시예 2]
a) Trp-프로모터 조절하에 있는 합성 scu-PA 유전자를 포함하는 rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 플라스미드 pBF 161의 작제
플라스미드 pBR 322를 제한효소 EcoRI와 HindIII로 절단한다. 생성된 31개 염기쌍의 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 제거시킨다. pBR 322의 남은 부분을 전기용출에 의해 겔로부터 용출시킨후 DE-52 상에서 크로마토그래피로 정제한다.
플라스미드 pBF 160(실시 1f)를 EcoRI과 HindIII로 절단한다. 1684개 염기쌍으로 이루어지고 모든 조절단위(Trp-프로모터)와 함께 합성 scu-PA 유전자를 포함하는 EcoRI x HindIII 단편을 아가로즈 겔-전기영동으로 분리한 후 전기용출에 의해 겔로부터 용출시키고 DE-52를 사용하여 정제한다.
이렇게 하여 수득된 2개의 정제 단편들을 T4-리가제로 일반적인 방법에 의해 연결시킨 다음, 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103을 연결 생성물로 형질전환시킨다. 엠피실린-함유 배지에서 배양한후, 1684개 염기쌍의 EcoRI x HindIII 단편을 포함하고 인돌아크릴산의 첨가시 rscu-PA의 중간체 단백질을 생성하는 클론을 선별한다. 이러한 클론은 플라스미드 pBF 161을 함유한다.
b) 발현시험
에스케리키아 콜라이 GRT-1, 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103 및 에스케리키아 콜라이 K12 ATCC 31446을 플라스미드 pBF 161로 형질전환시키고 발효시킨 후 발현을 실시예 1g에서 기술된 방법으로 검정한다. 유도한지 1 내지 6시간후 rtcu-PA 활성으로 측정되는 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율은, 제10도에 나타낸 플라스미드 pBF 160으로 형질전환된 동일한 균주에서 생산된 양에 필적한다.
원심준리(즉, 실시예 1gi에서 기술한 바와 같은 방법)로 얻어진 세포 매쓰를 4%의 SDS, 1% 머캡토에탄올 및 20% 글리세롤 존재하에 pH 8.0인 0.25M 트리스 HCl 완충액 중에서 가열하여 분해시킨다. 용해된 형태로 얻어진 단백질을 SDS-PAGE로 분리시키고 쿠마시 블루로 염색하여 겔에서 가시화시킨다. 염색되 겔을 덴시토미터법으로 측정하고 피크 아래 면적을 적분한다. rscu-PA의 중간체 단백질의 양은, 인돌아크릴산으로 유도후 나타나는 밴드를 적분하여 측정한다(유도전 동일 영역에서 검출된 단백질에 대해 보정됨). 제11도는 pBF 161로 형질전환된 이. 콜라이 K12 JM103 세포로부터 수득한 단백질의 덴시토그램을 나타낸다. 본 실시예에서, 유도후 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율은 총 세균 단백질의 17.9중량%에 이른다.
추가의 예를 표1에 나타내었다.
Figure kpo00004
[실시예 3]
테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 플라스미드 pBR322에 Trp-프로모터 조절하에 있는 합성 scu-PA 유전자를 포함하는 rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 플라스미드의 작제
a) 플라스미드 pBR 322 del의 작제
플라스미드 pBR 322를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRV와 NruI로 절단한다. 생성된 787개 염기쌍 단편을 아가로즈 겔-전기 영동으로 제거시킨다. pBR 322의 나머지 부분을 전기용출에 겔로부터 용출시킨 후 DE 52 상에서 크로마토그래피로 정제한다. 나머지 부분인 pBR 322/EcoRV x NruI의 평활말단을 T4-리가제를 사용하여 일반적 방법으로 연결시킨다. 연결 생성물로 에스케리키아 콜라이 K12 JM 103을 형질전환시키고 엠피실린-함유 배지에서 배양시킨 후, 25㎍/㎖의 테트라사이클린이 함유된 배지에 옮겼을 때 성장하지 않는, 즉 테트라사이클린 내성이 없는 클론을 선별한다. 이러한 클론은 787개 염기쌍이 적고 EcoRV와 NruI에 의해 절단할 수 없다는 점에서 pBR 322와 상이한 플라스미드 pBR 322 del을 함유한다.
b) 플라스미드 pBF 162의 작제
플라스미드 pBR 322 del을 EcoRI과 HindIII로 절단한다. 이로써 형성된 31개 염기쌍 단편을 제조적(preparative) 아가로즈 겔-전기영동으로 제거시키고, pBR 322 del의 나머지 부분을 전기용출에 의헤 겔로부터 용출시킨후 DE 52상에서 크로그래피로 정제한다.
pBR 160을 출발물질로 사용하는 것을 제외하고는 전술한 동일한 방법으로 1684개 염기쌍으로 이루어지고 모든 조절단위(Trp-프로모터)를 갖는 합성 scu-PA 유전자를 함유하는 EcoRI x HindIII 단편을 수득한다.
실시예 3b에서 제조한 두 단편을 T4-리가제를 사용하여 통상적인 방법으로 연결시키고, 연결 생성물로 이, 콜라이 K12 JM 103 세포를 형질전환시킨 후 엠피실린-함유 배지에서 배야한다. 그후 1684개 염기쌍의 EcoRI x HindIII 단편을 포함하고, 62㎍/㎖의 인돌아크릴산의 첨가시 rscu-PA의 중간체 단백질을 생성하는 클론을 선별한다. 이러한 클론은 플라스미드 pBF 162를 포함한다.
c) 발현 시험
에스케리키아 콜라이 GRT-1을 pBF 162로 형질전환시키고 발효시킨 후 실시예 1g에서 기술한 바와 같이 발현을 검정한다. 유도한지 6시간후 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율(rtcu-PA 활성으로 결정됨)은 흡광도가 1인 세포현탁액 ml당 1,300PU이고, 이것은 (제10도에 나타낸) 플라스미드 pBF 160으로 에스케리키아 콜라이 GRT-1를 형질전환시킨 후의 발현수율에 필적한다.
[실시예 4]
a) Tac-프로모터 조절하에 있는 합성 scu-PA 유전자를 포함하는 rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 프라스미드 pBF 171의 작제
플라스미드 pBF 161을 EcoRI과 XbaI으로 절단한다. 생성된 74개 염기쌍의 단편을 제조적 아가로즈 겔-전기영동으로 제거시키고 플라스미드의 나머지 부분을 전기 용출에 의해 겔로부터 용출시킨 후 DE 52 상에서 크로마토그래피로 정제한다.
플라스미드 ptac SDT(DSM 5018)로부터, ptac SDT를 EcoRI x XbaI로 절단하고 목적 단편을 제조적 PAGE로 분리하여 Tac 프로모터를 함유하는 EcoRI x XbaI 단편을 분리한다. 암모늄 아세테이트/SDS 완충액(pH 8.0)중에서 65℃로 가열함으로써 기계적으로 붕괴시킨 폴리아크릴아마이드로부터 상기 단편을 용출시키고, 페놀로 반복 추출하여 정제한 다음, 1M 트리스-완충액(pH 8)으로 포화시킨다.
실시예 4a에서 수득된 두 단편을 T4-리가제를 사용하여 통상의 방법으로 연결시킨 다음 연결생성물로 이.콜라이 K12 JM 103을 형질전환시킨다. 엠피실린-함유 배지에서 배양한 후, IPTG 첨가시 rscu-PA의 중간체 단백질을 생성하는 클론을 선별한다. 이러한 클론은 플라스미드 pBF 171을 포함한다.
b) 발현시험
에스케리키아 콜라이 K12 JM 103을 pBF 171로 형질전환시킨 후 발효시키고 실시예 1g에서 기술한 바와 같이 발현을 검정한다. 단, 유도용으로는 IPTG(최종 농도 0.5mM)을 사용한다.
유도한지 1 내지 6시간후 rtcu-PA 활성으로서 측정한 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율이 제12도에 나타나 있다. 이 수율은, (제10도에 나타낸) 동일한 에스케리키아 콜라이 균주에서 플라스미드 pBF160을 사용하여 수득한 수율에 필적한다.
[실시예 5]
a) 합성 scu-PA 유전자가 테트라사이클린 내성 유전자가 결실된 pBR 322 내의 Tac-프로모터 조절하에 있는 rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 플라스미드 pBF 172의 작제
플라스미드 pBR 322 del(실시예 3a에 기술)을 EcoRI x HindIII로 절단한다. 생성된 31개 염기쌍 단편을 제조적 아가로즈 겔-전기영동으로 제거시키고, pBR 322의 나머지 부분을 전기용출에 의해 겔로부터 용출시킨 후 DE 52상에서 클로마토그래피로 정제한다.
같은 방법으로 진행하나 플라스미드 pBF 171(실시예 4a 에서 수득됨)을 사용하여, 모든 조절단위(Tac-프로모터)를 갖는 합성 scu-PA 유전자를 함유하는 EcoRI x HindIII 단편을 수득한다.
이렇게 수득된 두 단편을 T4-리가제를 사용하여 통상의 방법으로 연결시킨후 연결 생성물로 이.콜라이 K12 JM 103 세포를 형질전환시킨다. 엠피실린-함유 배지에서 배양한 후, 0.5mM IPTG의 존재하에서 rscu-PA의 중간체 단백질을 생성하는 클론을 선별한다. 이 클론은 플라스미드 pBF 172를 함유한다.
b) 발현시험
에스케리키아 콜라이 K12 JM 103을 pBF 172로 형질전환시킨 후 발효시키고 실시예 1g에서 기술한 바와 같이 발현을 검정하되, 단 유도물질로 IPTG(최종농도 0.5mM)을 사용한다. 유도한지 1 내지 6시간 후 rtcu-PA 활성으로써 측정된 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율은, 흡광도가 1인 세포 현탁액 ml 약 1,100PU이며 이것은 (제10동서 나타낸) 동일한 에스케리키아 콜라이 균주에서 플라스미드 pBF 160을 사용하여 얻은 수율에 필적한다.
[실시예 6]
rscu-PA의 중간체 단백질에 대한 발현 플라스미드에서 샤인-달가노 서열과 개시코돈 사이의 거리 변형
실시예 1 내지 5에서 기술한 모든 작제에 있어서 개시 코돈 ATG는 NdeI 제한부위인 -CATATG-의 일부를 형성한다. NdeI는 첫번째 A뒤에서 이러한 헥사뉴클레오타이드 서열을 절단함으로써 5'-돌출 말단이 형성된다. 3'-말단의 충전, 즉 평활말단을 작제하고 문제의 서열을 재연결시키면 두개의 염기쌍이 확장된다. 이 공정에 따라 NdeI 제한 부위도 제거된다. 제13도에서 알 수 있는 바와 같이 S.D 서열로부터 개시코돈까지의 거리가 8개 염기쌍에서 10개 염기쌍으로 확장된다. 이러한 실험의 실현은 다음 실시예로 설명된다.
a) 플라스미드 pBF 163의 작제
플라스미드 pBF 161을 NdeI으로 절단한 다음, 점성말단을 DNA-폴리머라제 I의 클레노우 단편(2)으로 채운다. 그후, DNA를 T4-리가제를 사용하여 통상적인 방법으로 연결시키고, 연결 생성물로 에스케리키아 코라이 K12 JM 103을 형질전환시킨 후 엠피실린-함유 배지에서 선별한다. 플라스미드 pBF 163을 갖는 클론을 선별한다. 이 플라스미드는, Ndel 제한 부위가 없고 원래의 NdeI 제한 부위 영역에 추가의 염기 -TA-가 존재함으로써 pBF 161과 상이하다(제13도).
플라스미드 pBF 163으로 에스케리키아 콜라이 GRT-1을 형질전환시킨 다음 발효시키고 실시예 1g에서 기술한 바와 같이 발현을 검정한다. 리터당 62㎎의 인돌아크릴산으로 유도한지 1 내지 6시간후 rscu-PA의 중간체 단백질의 수율(재폴딩 후 흡광도가 1인 세포 현탁액 ml당 rtcu-PA 활성으로 측정)이 제14도에 나타나 있다. 이 수율은, (제10도에 나타낸) 동일한 에스케리키아 콜라이 균주에서 플라스미드 pBF 160을 사용하여 수득한 수율에 필적한다.
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Claims (17)

  1. 조절 프로모터로서 Trp 또는 Tac 프로모터; 리보소음 결합 부위로서 작용하는 샤인-달가노 서열; 샤인-달가노 서열로부터 6 내지 12개의 뉴클레오타이드가 떨어져 있는 개시 코돈; 411개의 아미노산 잔기를 포함하는 단일쇄 소변 플라스미노겐 활성자 scu-PA:의 합성 구조 유전자(여기서, CGT 삼중자는 아르기닌에 대한 코돈, CTG 삼중자는 루이신에 대한 코돈, GTT 삼중자는 발린에 대한 코돈, CCG 삼중자는 프롤린에 대한 코돈 또는 GGT 삼중자는 글라이신에 대한 코돈으로 사용된다; 및 구조 유전자 아래에 위치하고 trp A 터미네이터 및 Tn 10으로부터의 tet A/orf L 터미네이터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1개 또는 2개의 터미네이터를 포함하는 오페론을 갖고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주에서 rscu-PA(recombinant single chain urinary-Plasminogen Activator)의 중간체 단백질을 발현시키기에 적합함을 특징으로 하는, 플라스미노겐 활성자 제조에 사용하기 위한 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서, 조절 프로모터가 제8도에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 합성 Trp-프로모터인 플라스미드.
  3. 제1항에 있어서, 조절 프로모터가 플라스미드 ptac SDT(DSM 5018)로 부터의 Tac-프로모터인 플라스미드.
  4. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 구조유전자가 제15도에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 플라스미드.
  5. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, nic/bom 영역이 제거된 플라스미드 pBR 322에 오페론을 갖는 플라스미드.
  6. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 이로 형질전환된 세균 균주에 테트라사이클린 내성을 부여할 수 없도록 테트라사이클린 내성 유전자가 전부 또는 일부분이 제거된 플라스미드 pBR 322에 오페론을 함유하는 플라스미드.
  7. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 세균 균주에 테트라사이클린 내성을 부여할 수 없도록 테트라사이클린 내성 유전자의 일부분 이상과 nic/bom 영역이 제거된 플라스미드 pBR 322에 오페론을 함유하는 플라스미드.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 합성 Trp-프로모터의 조절하에 있는 합성 scu-PA-유전자를 갖는 플라스미드 pBF 160, pBF161, pBF 162 및 pBF 163 중에서 선택되는 플라스미드.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 플라스미드 ptac SDT(DSM 5018)로 부터의 Tac-프로모터 조절하에 있는 합성 scu-PA 유전자를 갖는, 플라스미드 pBF 171 및 pBF 172 중에서 선택되는 플라스미드.
  10. 제1항에 있어서, 제9도에 따른 제한지도를 갖는 플라스미드 pBF 160인 플라스미드.
  11. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 K12 균주에서 형성된 총 단백질중 10중량% 이상의 발현율로 rscu-PA의 중간체 단백질을 합성하는 플라스미드.
  12. 제11항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 K12 균주에서 형성된 총 단백질중 14중량% 이상의 발현율로 rscu-PA의 중간체 단백질을 합성하는 플라스미드.
  13. 제11항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 K12 균주에서 형성된 총 세균 단백질중 10 내지 25중량%의 발현율로 rscu-PA의 중간체 단백질을 합성하는 플라스미드.
  14. 플라스미드 pBR 322로부터 nic/bom 영역 및 테트라 사이클린 내성 유전자의 일부분 이상을 제거시키고, 제2도에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다중-클로닝 부위를 제한 부위 EcoRI과 HindIII 사이에 삽입시킴으로써 다중-클로닝 부위에 의해 공지된 방법으로 전사 터미네이터, 구조유전자의 3' 말단으로부터 개시하는 scu-PA 구조 유전자의 합성 부분 서열 및 합성 Trp-프로모터를 삽입시킴을 특징으로 하여, 제1항에 다른 플라스미드를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 따른 방법으로 수득한 플라스미드의 EcoRI x HindIII 단편을 발현 카세트로서 공지된 방법에 따라 에스케리키아 콜라이에서 자가 증식할 수 있는 다른 플라스미드에 삽입시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따른 플라스미드를 제조하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 따른 방법으로 수득한 플라스미드를 제한효소 NdeI으로 절단하고 생성된 점섬 말단을 충전시킨 다음 수득된 평활말단을 연결시킴을 특징으로 하여, 샤인-달가노 서열과 개시 코돈사이의 공간을 확장시킴으로써 제1항에 따른 플라스미드를 제조하는 방법.
  17. 에스케리키아 콜라이 균주를 제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 플라스미드로 형질전환시키고, scu-PA 구조 유전자의 발현을 유도한 후, 생성된 rscu-PA의 중간체 단백질을 배지 및 분해된 세균 세포로 부터 분리하고, 중간체 단백질을 가용화한 다음, 산화환원 작용에 의해 중간체 단백질을 rscu-PA로 재폴딩시킴을 특징으로 하는, 플라스미노겐 활성자의 제조에 있어서 제1항, 제2항, 제3항 및 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드의 용도.
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