LT3611B

LT3611B - Method for the preparation of the new plasmides and their use for the preparation of plasminigen activator

Info

Publication number: LT3611B
Application number: LTIP776A
Authority: LT
Inventors: Regina Elfried Brigelius-Flohe; Leopold Flohe; Wolfgang Hillen; Gerd Josef Steffens; Wolfgang Strassburger; Martin R F Wilhelm
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1993-07-12
Publication date: 1995-12-27
Also published as: PL286087A1; AU5883290A; HRP920596A2; HU903970D0; NO902720L; HUT54211A; DK0408945T3; PT94776A; SI9011347A; IL94529A0; HK1005193A1; FI102386B; YU48371B; KR910003105A; JPH0365189A; IE901849A1; CA2020656C; EP0408945B1; US5637503A; SI9011347B

Description

Išradimas priklauso biotechnologijos sričiai ir gali būti naudojamas naujų plazmidžių su sintetine DNR seka gavimui.

Gydant užsikimšiusias fibrinu kraujagysles, pvz. širdies infarktą, plaučių emboliją, galūnių arterinių kraujagyslių susirgimus ir kt., plazminogeno aktyvatoriai vaidina svarbų vaidmenį. Jau penktojo dešimtmečio pradžioje buvo žinoma, kad plazmonogenas virsta plazminu, t. y. fermentu, kuris sąlygoja fibrino skaidymą į tirpius polipeptidus ir, tokiu būdu, fibrino sąlygojamų trombų ištirpinimą. Šis plazminogeno aktyvatorius buvo pavadintas urokinaze ir pasirodė, kad iš tikrųjų egzistuoja skirtingos urokinazės formos. Tačiau visos šios formos gaunamos tiesiogiai (betarpiškai) iš vienos molekulės - pirmtako, žinomos maždaug nuo 70-jų metų vidurio kaip prourokinazės cimogenas. Tada buvo nustatyta, kad ši prourokinazė pasižymi viengrande struktūra ir ji buvo pavadinta scu-PA (viengrandis šlapimo plazminogeno aktyvatorius). Ši scu-PA sudaryta iš 411 aminorūgščių ir glikozilinta gamtinėje pirminėje formoje iki 302 aminorūgščių.

Iš įvairių darbų žinomas genotechnologinis baltymo scu-PA, kuris pavadintas kaip rscu-PA (rekombinantinis scu-PA) arba turi trivialinį saruplazės pavadinimą, negliozilintos dalies gavimas. Naudojant rscu-PA gydymui pasirodė, kad stebimas jo veikimas ir suderinamumas viršija naudojamus fibrinolitikus (žr. Lancet, 1989 m., 863868 psl.).

Neglikozilinto plazminogeno aktyvatoriaus rscu-PA gavimui naudoja prokariotus, apie ką liudija kai kurie duomenys literatūroje. Žinomi scu-PA gavimo būdai pagrįsti struktūrinio geno scu-PA, išskirto iš žmogaus audinių, pasireiškimu. Gaila, tačiau taip pasiekiamas tik nežymus ekspresijos laipsnis, kuris neužtikrina šio proLT 3611 B dūkto gavimo dideliais kiekiais. Taip, pavyzdžiui, aprašytas Nibino ir kt., rscu-PA gavimas iš E. coli duoda ekspresijos laipsnį tik 2 %, kuris išmatuotas nuo bendro bakterijos baltymo kiekio (Agric. Biol. Chem. 52, 1988 m.

psl. 329-336). Iš kitos pusės, paraiškoje Europos patentui Nr. 92 182 A2, o taip pat (Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gunzler, W.A., Steffens, G. J., Heynecker, H.L.: Biotechnol. 3, 923-929 1985) pasiekiamas ekspresijos laipsnis tiksliai nenurodomas. Ta10 čiau tikrinant šiuos duomenis įvairiuose kamienuose buvo gauta mažiaus nei 2 % bakterijos baltymo rscu-PA.

Daugeliu atveju eukariotinio baltymo ekspresija bakterijose gaunama taip pat ir rscu-PA ląstelėje, kaip de15 natūruotas įjungtas kūnas, toliau vadinamas išankstinės stadijos baltymus, kuris po tarpinio išskyrimo turi būti proteinochemiškai grąžintas į teisingą ketvirtinę rscu-PA struktūrą. Tokiu būdu gautą produktą po to galima pervesti susidariusio rscu-PA kiekio nustatymui, pavyzdžiui, pridedant plazminą, į dvigrandinę neglikozilintą urokinazę (rtcu-PA), kurios aktyvumas nustatytas ir kuri gali būti susidariusio rscu-PA kiekio matu. Galima nustatyti išankstinės baltymo arba rscu-PA išeigą ir, tokiu būdu, ekspresijos laipsnį, pavyzdžiui, viso baltymo galinės elektroforezės densitometrinio įvertinimo pagalba.

Netikėtai buvo pastebėta, kad bakterijos, transformuotos pagal išradimą gautomis plazmidėmis, duoda daug kartų didesnę ekspresiją, nei kamienas šeimininkas, žinomais būdais identiškai transformuotas plazmidėmis. Todėl atitinkamai pagal išradimą gautos plazmidės tinkamesnės baltymo gavimui negu visos iki šiol žinomos rscu-PA plazmidės arba jų išankstinės stadijos. Žinomu būdu aukščiau minėto analitiniams tikslams rscu-PA skaidymo, pavyzdžiui, plazminu, pagalba gali būti gau3 tas taip pat ir rtcu-PA techniniais kiekiais. Dėka pasiūlyto išradimo rscu-PA tapo labai prieinamas.

Plazmidės, naudojamos gaunant plazminogeno aktyvatorių, gautos atitinkamai pagal išradimą, skiriasi tuo, kad jų operonai turi reguliuojamą sintetini, promotorių, aktyvią, kaip ribosomų surišimo vietą, Šain-Dalgarno seką, startini, kodoną, sintetini, struktūrini, geną scu-Pa-eiir priešingai struktūrinio geno atžvilgiu išsidėsčiusi,, bent jau vieną terminato'rių. Pirmenybė teikiama vienas paskui kitą einantiems terminatoriams, dalinai kalbant apie trp A terminatorių ir/arba tet A/orf L terminatorių iš Tn 10*.

* (Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W.: Nucl. Acids Res. 13, 4227 - 4237 1985).

Reguliuojamojo promotoriaus atveju kalba eina, dalinai, apie trp-promotorių arba tac-promotorių.

Kontrolinėje zonoje gautos atitinkamai pagal išradimą plazmidės turi atstumą tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono 6-12, geriausiai 8-10, nukleotidų.

Konstruojant naudojamą naujose plazmidėse struktūrinį geną, įstatomos, geriausiai, užkoduotos atitinkamoms aminorūgštims bazinės sekos, pateiktos sekančioje lentelėje. Be to, struktūriniame gene visi šie skiriamieji požymiai neturi būti išpildyti vienu metu.

Aminorūgštis

Argininas

I.eicinas

Valinas

Prolinas

Glicinas

Tripletas

CGT

CTG

GTT

CCG

GGT

Iš kitos pusės, konstruojant struktūrinį geną pagal galimybes tikslinga išvengti sekančio kodono atitinkamoms išvardintoms aminorūgštims naudojimo (tačiau vėl gi nereikia išpildyti vienu metu visų šių skiriamųjų požymių visoms aminorūgštims).

Kodonas, kurio reikėtų vengti

ΑΤΆ

GTC

CCC

AAG

AGG, AGA, CGG, CGA GGA, GGG

Aminorūgštis

Izoleicinas

Valinas

Prolinas

Lizinas

Argininas

Glicinas

Atitinkamai pagal išradimą atskiroms aminorūgštims struktūriniame gene pasirenkant kodoną, o taip pat aukščiau išvardintus kontrolinio geno skiriamuosius požymius, pilnai išvengiama stabilių antrinių struktūrų tarp struktūrinio geno ir kontrolinio regiono susidarymo.

Sintetinio struktūrinio geno gavimui iš pradžių sintezuojami turintys 40-80 bazių vienoje grandinėje oligonukleotidai. Juos tikslinga gauti 1 mm/mol masteliu kietų fazių metodu (Adams, S.P., Kavka, K.S., Wykes, E.I., Holder, S.B., Gallupi, G.R.: J. Am. Chem. Soc. 105, 661-663 1983). New Brunswick Scientific Co. firmos

Biosearch 8600 modelio DNR sintezatoriumi. Kaip monomerinis sintomas naudojami esantys pardavime βciano-etildiizopropilamino-fosfoamidai atitinkamiems būtiniems dezoksiribonukleozidams. Atskėlus nešiklį esančios galuose tritil pakeistos grandinės gelfiltracijos būdu steriliose sąlygose nudruskinamos, o po to dviem stadijomis pirmą kartą atskiriamos atvirkščių fazių didelio efektyvumo skyščių chromatografija (HPLC). Atitinkamas pagrindinis produktas detritilinamas ir po dviejų papildomų atvirkščių fazių HPLC valymo stadijų gaunamas labai švarus norimas oligonukleotidas, ką parodo gelelektroforezės analizė (PAGE).

Iš 4-9 šių atskirų grandinių gauna apie 200 nukleotidų ilgio dvigubų grandinių fragmentus, kad negalinius atskirus oligonukleotidus 5'-gale fosforilintų ir atitinkamas komplementarias grandines kartu su galiniais oligonukleotidais renatūruotų ir liguotų. Po ligavimo susidarę tinkami klonavimui dvigubi fragmentai po to panaudojami tinkamuose linearizuotuose vektoriuose. Papildomos priemonės išvardintos pateiktuose pavyzdžiuose .

Paraiškoje naudojami šie sutrumpinimai:

b.p. - bazių poros

DE 52 - firmos Watman anioninių mainų kolonėlė

EDTA - etilendiamintetraacto rūgštis

IPTG - izopropil-p-D-ticgalaktopiranozidas

PAGE - poliakrilamidgelektroforezė

PU - Ploug vienetai

SDS - natrio dodecilsulfatas

Š.D. seka - Šain-Dalgarno seka

Tris-HCl - trihidroksimetilaminometano hidrochloridas

Tween-80 - polietilenoksido (20) sorbitanmonooleatas

Konstruojant atitinkamai pagal išradimą naujas plazmides, pirmenybė teikiama esamai pardavimo plazmidei pBR 322 (4363 b.p.). Geriausiai iš pradžių eliminuoti nic/bom sritį ir/arba tetraciklinui atsparų geną. Be to, nebūtina pilnai pašalinti atsparų tetraciklinui geną, o dažniausiai pakanka, kad plazmidė neperduotų tokiu būdu transformuotam bakterijos kamienui atsparumo tetraciklinui. Šių priemonių (nic/bom srities ir dalies atsparumo tetraciklinui geno pašalinimas) pagalba gaunama taip vadinama aukšto patikimumo plazmidė.

Konstruojant naują plazmidę atitinkamai pagal išradimą, remiantis modifikuota kaip buvo minėta aukščiau, plazmide pBR 322 (arba kita žinoma anksčiau plazmidė), pirmenybė teikiama būdui, kuriame sekanti stadija yra sintetinės multiklonavimo vietos tarp Eco Rl ir Hind III kirpimo vietų Įstatymas. Ši multiklonavimo vieta (fig. 2) turi nustatytą kirpimo vietų eilę (seką), esančios tarp šių kirpimo vietų bazės yra laisvai pasirinktos, išskyrus sekas tarp Xba I ir Nde I, kurios turi ribosomų surišimo vietas (Šain-Dalgarno seka) iš Xyl-operono 5'-AAGGAG-3' B subtilis*, (Wilhelm, M., Hollenberg, C.P.: Nucl. Acids Res. 13. 5717 - 5722 (1985), o taip pat nustatytą atstumą tarp Š.D. sekos ir startinio kodono ATG. Einančios po Š.D. sekos bazės GAAAT perneštos iš minėto straipsnio ir surištos su CATATG,' Nde I kirpimo vietoje. Tokiu būdu, atstumas tarp Š.D. sekos ir ATG yra 8 bazių poros. Atstumas tarp multiklonavimo vietos atskirų kirpimo vietų pagal klonavimo technologiją turi būti mažiausiai apie 20 nukleotidų, todėl palengvinamas tarpinių fragmentų pašalinimas.

Šios multiklonavimo vietos pagalba į plazmidę Įvedamos kirpimo vietos, kurios, tikslingai Įstačius transkripcijos terminatorių, Įgalina sėkmingai Įstatyti sekančią viena paskui kitą struktūrinio geno scu-PA dalinę seką, geriausiai, prasidedančią norimo baltymo C-galu, t.y. nuo 3'-DNR galo gaunamo struktūrinio geno, o taip pat Įstatyti, pavyzdžiui, sintetiną arba taip pat išskirtą iš kitos plazmidės, arba esanti perdavime trp-promotorių. Fig. 15 pateikta šiuo būdu gauto scu-PA struktūrinio geno pilna nukleotidų seka su atskiram kodonui atitinkančiomis aminorūgštimis.

Iš sukonstruotos, kaip aprašyta išradime, plazmidės gali būti gautos kitos naujos plazmidės. Pavyzdžiui, kerpant Eco Rl ir Hind III gaunamas sintetinis scu-PA struktūrinis genas su visais reguliavimo vienetais ir po to jis įstatomas į kitą, į enterobakterijos, dalinai, ^E·coli, automatiškai besidauginančią plazmidę, kurią po to linearizuoja arba sutrumpina kirpimo Eco Rl ir Hind III pagalba. Tokiu būdu, tik naudojant ECo Rl ir XBa I kirpimo vietas, gautoje atitinkamai pagal išradimą plazmidėje galima pakeisti taip pat, pavyzdžiui, trp-promotorių tac-promotoriumi (ir atvirkščiai) .

Analogiškai galima naudoti ir kitas žinomas plazmidės, kurios pasižymi vienintele Eco Rl ir Hind III kirpimo vieta, pavyzdžiui, pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 ir kt.

Naujas plazmidės su padidintu atstumu tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono ATG galima gauti atitinkamai pagal išradimą taip, kad sukonstruota, kaip aprašyta aukščiau, plazmidė, kurioje minėtą atstumą, pavyzdžiui, 8 nukleotidų, kerpa Nde I, kuri užpildo gautą kirpimo vietą ir betarpiškai po to sujungia gautus galus, dėl ko susidaro pageidaujama nauja plazmidė, kurioje atstumas tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono yra, pavyzdžiui, 10 nukleotidų.

Kaip jau buvo minėta, su bakterijomis, transformuotomis plazmidėmis, gautomis pagal išradimą, gali būti pasiektas daug kartų didesnis ekspresijos laipsnis, negu naudojant žinomas plazmidės. Tinkančių kompetentingų organizmų - šeimininkų transformacija vykdoma žinomu būdu. Gautų pagal išradimą plazmidžių pasireiškimui ypatingai tinkami organizmai - šeimininkai yra E. coli tipo kamienai ir giminingos enterobakterijos, pavyzLT 3611 B džiui, kamienai Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella arba Serratia.

Geriausi organizmai - šeimininkai yra E. coli tipo kamienai, pavyzdžiui, E. coli GRT-1 ir dalinai K 12 progrupio E. coli kamienai kaip, pavyzdžiui, E. coli K 12 JM 101 (ATCC 33876) . E. coli K 12 JM 103 (ATCC 39403), E. coli K 12 JM 105 (DSM 4162). E. coli K 12 ATCC 31446 arba E. coli K 12 DH1 (ATCC 33849).

Ekspresijos įvedimą į E. coli ekspresinę sistemą, kuri turi tac-promotorių, galima Įvykdyti, pavyzdžiui, pridedant laktozės arba atimant gliukozę, bet geriausiai pridedant izopropil-p-D-tiogalaktopiranozido. Tačiau, jei plazmidėje yra trp-promotorius, tai indukciją vykdo geriausiai indolakrilacto arba indolakrilpropiono rūgštimi. Savaime aišku, kad gali būti taip pat panaudoti kiti žinomi induktoriai.

Po indukcijos pasiekus tam tikrą aukščiau minėtą ląstelės tankį, ląstelės atskiriamos centrifūguojant, o nuosėdos po centrifugavimo ir suspendavimo vandeniniame druskų tirpale, sudedamos, pavyzdžiui, į homogenizatorių, kuriame ląstelės dėl slėgio skirtumo atsiduria tam tikroje vietoje. Po naujo centrifugavimo nuosėdose gaunamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas kartu su vandenyje netirpstančiomis ląstelių nuolaužomis ir kt. Paveikus guanidino hidrochlorido tirpalu, išankstinės stadijos baltymas pereina į tirpalą, po naujo centrifugavimo nusistovėjęs tirpalas paveikiamas red-oks sistema (pavyzdžiui, turinčia redukuotą ir oksiduotą glutationą), todėl susidaro natūrali konformacij a, t.y. susidaro norimas rscu-PA. Tirpioje formoje jis yra reakcijos mišinyje ir paprastomis valymo stadijomis (pavyzdžiui, chromatografija ir tolesniu džiovinimu užšaldant) gali būti išskirtas grynas.

Analitiniams tikslams tikslinga fermentuoti transformuotą reikalinga ištyrimui plazmidė S. coli kamieną ir, pasiekus aukščiau minėtą ląstelių suspensijos optimalų tankį, tinkamu induktoriumi indukuoti išankstinės sta5 dijos rscu-PA-baltymo ekspresiją. Pasibaigus atitinkamam fermentacijos laikui atrenkamos lygios dalys ir išcentrifuguotos iš jų ląstelės ištirpinamos lizocime (1 mg lizocimo 50 mmol trihidrochlorido buferio su pH ¹ 8,0, 50 mmol etilendiaminotetraacto rūgšties ir 15 % sacharozės) . Lizuotų ląstelių homogenatas soliubilizuojamas 4-5 mol guanidinhidrochlorido tirpale ir praskiedus 1,2 mol guanidinhidrochlorido, pridėjus redukuojančios medžiagos (glutationo, merkaptoetanolio arba cisteino) po 2-5 valandų veikiamas atvirkštine reakcija (žr. taip pat Winkler, M.E., Blaber, M.: Biochem. 25, 4041-4045, 1986). Tokiu būdu gautas viengrandis rscuPA, pridėjus plazmidę, paverčiamas į dvigrandinį rscuPA, kurio aktyvumas nustatomas substrato S 2444 (piro Glu-Glu-Arg-p-nitroanilidas; Kabi diagnostika, Švedija) pagalba, kuris (substratas) skaidomas tik nuo dvigrandinės aktyvios urokinazės. Šis rscu-PA aktyvuojamas plazminu 50 mmol tris-buferyj e, 12 mmol natrio chlorido, 0,02 % tvino-80; prie pH - 7,4 ir 37°C. Rscu-PA ir plazmino santykis turi būti apytikriai 100-1500:1, skaičiuojant moliaringumui, arba 8000-36000:1, skaičiuojant fermentiniam vienetui. Testuojamą inkubacija atlieka 50 mmol tris-buferyje, 38 mmol natrio chlorido prie pH 8,8, esant 0,36 mml aprotinimo (plazmino stabdymui) ir 0,27 mmol S 2444 prie 37°C. Priklausomai nuo mėginio rscu-PA turinio po 5-60 minučių inkubacijos pridedant 90 % acto rūgšties reakciją sustabdo ir matuoja absorbciją 405 nm ilgio bangoje. Pagal substrato S 2444 gamintojo nurodymus, kai šios išankstinės stadijos atveju ekstinkcijos pokytis yra 0,05 per minutę ties 405 mm, tai testuojamo tirpalo aktyvumas yra 25 PU/ml.

io

Rscu-PA, gautų iš išankstinės stadijos baltymo išeigos įvairiose bakterijose, naudojant pagal išradimą pagamintas plazmidės, pateiktos fig. 10, 12 ir 14.

Išradimą iliustruoja brėžiniai:

Fig. Ia ir Ib. Plazmidės BF 158 konstrukcija iš pardavime esančios pBR 322 plazmidės. Šiuo atveju nuosekliai pašalintos nic/bom sritis ir didelė atsparumo tetraciklinui geno dalis.

Fig. 2. Sintetinės multiklonavimo vietos nukleotidų seka.

Fig. 3. Plazmidės pBF 158-01 konstrukcija. Parodytas sintetinės multiklonavimo vietos įvedimas į pBF 158 plazmidę tarp EcoR I ir Hind III kirpimo vietų.

Fig. 4. Plazmidės pBF 158-01T konstrukcija. Cla I x Hind III fragmentą pakeičia atitinkamu fragmentu T iš plazmidės pRT 61 (Jorgensen, R.A., Reznikoff, W.S.: J. Bacteriol. 138, 705 - 714, 1979), kurioje yra tetA/orf L terminatorius iš Tn 10 (Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W. : Nucl. Acids Res. 13, 4227 4237 1985) .

Fig. 5a-5g. Sintetinių geno, koduojančio žmogaus scuPA, fragmentų nukleotidų sekos, jų įvedimas į plazmidę susidarant struktūriniam genui scu-Pa-ei, pagal išradimą, aprašytą ld-lf pavyzdžiuose ir pavaizduotą fig. 6, 7, 9, plazmidėje pBF 158-01T.

Fig. 6a-6c. Plazmidės pBF 158-02T - pBF 158-06T konstrukcija, įvedant oligonukleotidinį fragmentą M4-M8 pradedant plazmidė pBF 158-01T, remiantis norimo baltymo C galu (atitinkamai DNR grandinės 3' galo).

u

Fig. 7a-7c. Plazmidės pBF 158-08T konstrukcija per pagalbinę konstrukciją plazmidėje pUC 19 (žiūr. fig. lc).

Fig. 8. Sintetinio trp-promotoriaus nukleotidinė seka.

Fig. 9. Ekspresinės plazmidės pBF 160, skirtos išankstinės stadijos žmogaus baltymui rscu-PA, konstrukcija. Scu-PA struktūrinis genas pavaizduotas stora juoda linija tarp Nde 1 ir Cla I kirpimo vietų.

Fig. 10. Išankstinės stadijos žmogaus baltymo rscu-PA ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rscu-PA aktyvumas pagal grąžtamą reakciją ir aktyvavimą) Įvairiuose transformuotuose plazmidė pBF 160 (o--o) arba plazmide pUK 54 trp 207-1 (Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gunzler, W.A., Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: biotechnol. 3, 923 - 929, 1985) (Δ- - -Δ) E. coli kamienuose, kontroliuojant trp-promotoriui, priklausomai nuo laiko po indukcijos su indolakriline rūgštimi iki nulinio (0) laiko momento. Nurodytas substrato S 2444 pagalba nustatytas tcu-PAaktyvumas PU/fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 mm ilgio bangai lygus 1.

Fig. 11. SDS-PAGE baltymų, gautų iš transformuotų pBF 161 pagalba E. coli K 12 JM 103 ląstelių, densitograma po jų fermentacijos prieš induktoriaus indolakrilinės rūgšties Įvedimą (A) ir praėjus 6 valandoms (B).

Fig. 12. Išankstinės stadijos žmogaus rscu-PA baltymo ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rtcu-PA aktyvumas po grįžtamos reakcijos ir aktyvavimo) , E. coli K 12 JM 103 ląstelėse, transformuotose pBF 171 pagalba, t.y. kontroliuojant tac-promotoriui. Indukcija buvo vykdoma 0 laiko momentu su izopropil-p-D-tiogalaktopiranozidu. Nurodytas rtcu-PA - aktyvumas nustatytas pagal substraLT 3611 B tą S 2444 PU fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 mm ilgio bangai lygus 1.

Fig. 13. Atstumo tarp Š.D. sekos ir startinio kodono ATG padidinimas nuo 8 iki 10 bazių papildant Nde 1 kirpimo vieta ir toliau sujungiant atitinkamus bukus galus .

Fig. 14. Išankstinės stadijos žmogaus rscu-PA baltymo ekspresijos laipsnis (nustatytas kaip rscu-PA aktyvumas po grįžtamos reakcijos ir aktyvavimo), kontroliuojant trp-promotoriui E. coli GRT-I bakterijose, transformuotose plazmidžių pBF 161 (o--o) arba pBF 163 (Δ- - -Δ)pagalba. Indukcija vykdoma indolakriline rūgštimi betarpiškai po 0 laiko momento. Nurodyti nustatyti substratu S 2444 tcu-PA aktyvumai PU fermentinės terpės mililitrui, kai optinis tankis esant 578 nm bangos ilgiui lygus 1.

Fig. 15a ir 15b. Scu-PA-struktūrinio geno pilna nukleotidinė seka, nurodant aminorūgštis, atitinkančias atskirą kodoną.

Reakcijos sistemos, analizuojamos išradimą iliustruojančiuose pavyzdžiuose, yra žinomos (žr. pav. Nachr. Chem. Tech. Lb. 35, 939, 1987).

Kultūrinės terpės, naudojamos pavyzdžiuose klonų selekcijai, sudėtis (1 litrui): 7,8 g peptono iš žuvies, 7,8 g peptono iš kazeino, 10 g mielių ekstrakto, 5,6 g natrio chlorido, 10 g gliukozės. Ši terpė šilumoje sumaišoma su 10 g/1 agaro ir išpilstoma į lėkšteles.

pavyzdys.

Ekspresinės plazmidės pBF 160 išankstinės stadijos rscu-PA baltymui su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant trp-promotoriui, konstravimas.

a) Plazmidės pBF 158 konstravimas

i) Iš plazmidės pBR 322 (Pharmacia, Nr. 27-4902, 4363 b.p.) iškerpama nic/bom sritis, kuri yra tarp 2207 ir 2263 bazių (Winnacker E.L.: Gene ųnd Klone, VCH Verlagsgesellshaft, Weinheim, S. 298, 1985), pašalinama (žr. taip pat fig. 1) pBR 322 prie 2298 bazės su Nde I ir tokiu būdu linearizuojama. Išlindę galai užpildomi užpildymo reakcija ir, tokiu būdu, gaunami buki galai (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J.: Molecular Cloning, A A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Po to prie 2068 bazės kerpama Pvu II pagalba ir likusios pBR 322 dalies abu buki galai įprastine technika T4-ligazės pagalba vėl liguojami. Betarpiškai po šio ligavimo intarpas atitinkamose E.coli K 12 JM 103 ląstelėse (ATCC 39403) transformuojasi (Hanahan I.: DNA cloning, Vol. 1, ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, S. 109-135, 1985). Transformuotos ląstelės kultivuojamos terpėje, pridėjus 150 ųg/ml ampicilino. Iš gautų klonų atrenkami tokie, kurie turi plazmidę pBF 157, kuri skiriasi nuo pradinės plazmidės pBF 322 228 nukleotidais a) Pst I x BspM II-,

b) Pst I x Bai I-, C) Pst I x Ava I - fragmentais. Abiejų vienintelių kirpimo vietų Pvu II ir Nde I pBR 322 nėra plazmidėje pBF 157.

turinčioje kurių atii) Iš pBF 157 pašalinama didžioji tetraciklino sekos dalis, kerpant EcoRV x Nru I pagalba ir atsiradusius bukus galus toliau liguojant. Po E. coli K 12 JM 103 transformavimo ir kultivavimo terpėje,

150 ųg/ml ampicilino, gaunami klonai, iš renkami tie, kurie turi plazmidę pBF 158. Ji 787 nukleotidais trumpesnė nei pBF 157 ir skiriasi tuo, kad neturi Bam H I kirpimo vietos. Bakterijų kamienų transformacija pBF 158 pagalba nesuteikia joms rezixtentiškumo tetraciklinui.

b) pBF 158-01 konstravimas, sintetinės multiklonavimo vietos įvedimas.

Kerpant Eco R I x Hind III pagalba, iš pBF 158 pašalinamas 31 nukleotido fragmentas ir liguojama sintetinė multiklonavimo vieta, kurios seka pateikta fig. 2. Po ligacijos intarpo transformacijos į E.coli K 12 JM 103 ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 158-01. Jie skiriasi nuo pBF 158 papildomomis vienintelėmis Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Κρη I, Spe I kirpimo vietomis, o taip pat antra Pst I kirpimo vieta (fig. 3).

c) pBF 158-01 T konstravimas, transkripcijos terminatoriaus įvedimas.

Iš pBF 158-01 pašalinamas multiklonavimo vietos Cla I x Hind III fragmentas ir pakeičiamas Cla I x Hind III fragmentu iš pRT 61 (Jorgensen, R.A., Reznikoff, W.S.: J. Bacteriol. 138, 705 - 714, 1979), kuriame yra tet

A/orf L terminatorius iš Th 10 (Schollmeier, K., Gartner, D., Hillen, W. : Nucl. Acids Res. 13, 4227 4237, 1985).

Po transformacijos E. coli K 12 Jm 103 kamiene ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, buvo atrinkti tie klonai, kurie turėjo plazmidę pBF 158-01 T. Ji skiriasi nuo pBF 158-01 plazmidės Cla I x Hind III fragmentu, kuris 297 nukleotidais didesnis (fig. 4).

d) Sintetinio fragmento M4-M8 scu-PA-genui įvedimas, plazmidžių pBF 158-02 T - pBF 158-06 T konstrukcija.

Visi sintetiniai fragmentai pavaizduoti fig. 5a-5g. Jie įvedami į atitinkamus vektorius kaip maždaug dvigubos 200 nukleotidų ilgio spiralės fragmentai. Šiam tikslui vektoriai kerpami liekamaisiais fermentais, kurie atitinka paminėtas kirpimo vietas, ir elektroforezės agaroziniame gelyje, elektroeliuavimo ir valymo pagalba atskiriami per DE 52 nuo skirtų pašalinimui fragmentų. Po to T4-ligazės pagalba liguojama priskirtu jam sintetiniu dvigubos grandinės fragmentu, vykdoma transformacija E. coli K 12 JM 103 (fig. 6a-6c) ir selekcija terpėje, turinčioje ampiciliną.

i) M 8 fragmento tarp Bam H I ir Cla I ligavimas plazmidėje pBF 158-01 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-02 T.

019 oligonukleotidas koduojamas scu--PA C-terminalinei sekai. Už stop kodono TAA yra Nhe I kirpimo vieta, kuri tęsiasi nuo papildomos trpA-terminatoriaus transkripcijos sekos (Christie, G.E., Farnham, F.J., Platt, T.: Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78, 4180-4184, 1981) iki Cla I.

ii) M 7 fragmento tarp Spe I ir Bam Hl ligavimas plazmidėje pBF 158-02 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-03 T.

iii) M 6 fragmento tarp Κρη I ir Spe I ligavimas plazmidėje pBF 158-03 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-04 T.

iv) M 5 fragmento tarp Eag I ir Κρη I ligavimas plazmidėje pBF 158-04 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-05 T.

v) M 4 fragmento tarp Sac I ir Eag I ligavimas plazmidėje pBF 158-05 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-06 T.

Iš gautų i-v klonų atrenkami atitinkamai tie, kurie skiriasi nuo atitinkamo pirmtako papildomoje patikrintoje teisingoje sekoje Įvestu nauju fragmentu.

e) Sintetinių M2 ir M 3 fragmentų scu-PA genui įvedimas, pBF 158-08 T konstravimas.

Kadangi M 2 ir M 3 fragmentų įvedimui būtinas Pst-I kirpimas ir šiam tikslui naudojamoje pBF 158 plazmidėje yra dar Pst-I kirpimo vieta (ampicilino sekoje), kuri trukdytų tolimesniam klonavimui, todėl elgiamasi fig. 7a7c pavaizduotu būdu.

i) Iš esamos pardavime (pvz. Pharmacia) pUC 19 plazmidės pašalinama multiklonavimo vieta ir papildomai 212 nukleotidų į viršų nuo Nde I x Hind III fragmento. Po to gautame tarpe liguoja sintetinę multiklonavimo vietą iš pBF 158-04-3 T kaip Nde I x Hind III fragmentą. Ši pBF 158-04-3 T plazmidė gaunama iš pBF 158-02 T (žr. fig. I di), įvedant M 6 oligonukleotidinį fragmentą, ir atitinka plazmidę pBF 158-04 T be M 7 fragmento. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 pg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-04-3 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19 plazmidės tuo, kad turi Nde I x Hind III 712 nukleotidų ilgio fragmentą.

ii) iš pUC 19-04-3 plazmidės pašalinamas Pst I x Sac I fragmentas, išskiriamas linearizuotas vektorius, ir liguojamas oligonukleotidinis M 3 fragmentas. Po transformacijos E. coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-07 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19-04-3 plazmidės Pst I x Sac I 189 nukleotidų ilgio fragmentu, kuris turi M 3 fragmentą su teisinga seka.

iii) Iš aukščiau aprašytos pUC 19-07 plazmidės pašalinamas Nde I x Pst I fragmentas ir tarpas liguojamas M 2 fragmentu. Po transformacijos E.coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pUC 19-08 plazmidę. Ji skiriasi nuo pUC 19-07 plazmidės Nde I x Pst I 246 b.p. fragmentu, kuris turi M 3 fragmentą su teisinga papildomai patikrinta seka.

iv) Iš pUC 19-08 plazmidės pašalinami M 2 ir M 3 fragmentai kaip Nde I x Sac I fragmentas ir liguojama gauta po kirpimo Nde I x Sac I pagalba didelė pBF 158-06 T dalis. Po transformacijos E.coli K 12 JM 103 ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 158-08 T. Ji skiriasi nuo pBF 158-06 T Nde I x Sac I 435 nukleotidų ilgio fragmentu.

f) Plazmidės pBF 160 konstravimas, sintetinio trp-promotoriaus įvedimas.

Aprašyta (De Boer, H.A., Comstock, L.J., Vasser, M. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983) trp-promotoriaus seka yra iki Xba I kirpimo vietos ir ilginama nuo 5' galo sekos 5'-AATTCTGAAAT-3' pagalba. Taip konstruojama Eco R I kirpimo vieta (fig., M 1 fragmentas). Atskiros grandinės 021 ir 021 A renatūruo j amos ir IiLT 3611 B jguojamos į pBF 158-08 T plazmidę, kuri kirpta Eco R I x -ba .1 (fig. 9) . Po transformacijos E.coli K 12 JM 103 .ląstelėse ir kultivavimo terpėje, turinčioje 150 gg/ml ^ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi pBF 160.

;5 įPlą.zmidė pBF 160 skiriasi nuo visų aukščiau aprašytų ^pirmtakių tuo, kad, tokiu būdu transformuotų E.coli -bakterijų kamienai, pridėjus indolakrilinės rūgšties, ęękspręs.uoja išankstinės stadijos rscu-PA baltymą.

g) Ekspresinis testas:

i) -Fermentacija

-Transformuoti pBF 160 plazmidė įvairūs E.coli kamienai,

1- 5 .pavyzdžiui, E. coli GRT-I, E. coli K 12 JM 103, o taip pat E.coli K 12 ATCC 31446, atitinkamose vienodose ^sąlygose fermentuojami terpėje, turinčioje 38 mmolio amonio sulfato, 56 mmolio fosfatinio buferio -su pH 7,0, 1 _:mmolio magnio sulfato, 1 % mielių ekstrakto, 1 % gliukozės, 150 mg ampicilino litrui ir 62 mg/1 indolakrilinės rūgšties pagalba indukuojama išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresija. Palyginimui išvardinti kamienai transformuojami aukščiau aprašyta plaz_;mide., kuri turi žmogaus prourokinazės geną iš cDNR

2- 5 banko, gautą iš Detroito 562 mRMR ląstelių (Holmes,

W..E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gunzler, W.A., Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: Biotechnol.3, 923-929, 1983), pažymėtą pUK 54 trp 207-1, po to vienodose sąlygose fermentuojami ir indukuojami.

Prieš indukciją ir 6 valandas po indukcijos kiekvieną valandą atitinkamai centrifuguoja 1 ml ląstelių suspensijos, kai optinis tankis lygus 1, 578 nm bangos ilgyje ir naudoja ekspresijos laipsnio testavimui.

ii) Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo grįžtamoji reakcija, jo suskaidymas iki rtcu-PA ir aktyvumo matavimas .

Ląstelės, atskirtos centrifuguojant aprašytu būdu, sujungiamos su lizocimu ir šis lizuotų ląstelių homogenatas naudojamas aktyvumo aprašytu būdu nustatymui.

Fig. 10 pateikti ekspresijos laipsniai, nustatyti išma10 tavus rtcu-PA, susidariusios iš rscu-PA, gautos iš išankstinės stadijos baltymo, aktyvumą. Iš čia matyti, kad E.coli kamienai, kurie buvo transformuoti plazmidės pBF 160 pagalba, duoda 10-15 kartų didesnę ekspresijos išeigą, nei pUK 54 trp 207-1 plazmidė (Holmes ir kt. ) transformuoti tokie pat E.coli kamienai. Pasirodė, kad visuose kamienuose priklausomai nuo transformacijai naudotos plazmidės ekspresijos išeiga yra apytiksliai vienoda, t. y. nepriklausomai nuo atskirų E.coli kamienų, transformuoti pBF plazmidė kamienai visada duoda daug didesnį ekspresijos laipsnį nei identiški kamienai, transformuoti žinoma plazmidė pUK 54 trp 207-1.

pavyzdys

Ekspresinių plazmidžių išankstinės stadijos rscu-PA baltymui su sintetiniu scu-PA-genu, kontroliuojant trppromotoriui, konstravimas.

a) pBF 161 plazmidės konstravimas.

Plazmidė pBR 322 kerpama Eco ir Hind III pagalba. Gautas 31 nukleotidų ilgio fragmentas atskiriamas paruošiamosios elektroforezės agaroziniame gelyje pagalba. Likusi pBR 322 dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio būdu ir valoma DE 52 chromatografijos pagalba.

Plazmidė pBF 160 (fig. lf) taip pat kerpama Eco R I ir Hind III pagalba, 1684 nukleotidų ilgio Eco Rl x Hind III fragmentas, kuris turi sintetinį scu-PA-geną su visais reguliavimo vienetais (trp-promotorius), atskiriamas elektroforezės agaroziniame gelyje pagalba ir, kaip aprašyta aukščiau, eliuojamas bei valomas.

Tokiu būdu gauti fragmentai įprastu būdu T4-ligazės pagalba liguojami ir po to transformuojami į E.coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi 1684 nukleotidų ilgio Eco R I x Hind III fragmentą ir pridėjus indolakrilinės rūgšties, atrenkamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas. Šie klonai turi plazmidę pBF 161.

b) Ekspresinis testas

E.coli GRT-I, E.coli K 12 JM 103 ir E.coli ATCC 31 466 transformuojamos pBF 161 pagalba, fermentuojamos (kaip fig. lg) ir išmėginamas ekspresijos rezultatas. Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 1-6 valandas po indukcijos ir palyginama su pateiktomis fig. 10 išeigos reikšmėmis, naudojamomis plazmidės pBF 160 transformacijai.

Centrifiguoj ant gautos analogiškai fig I gi ląstelių nuosėdos gali būti ištirpintos virinant 0,25 mol tris HCl-buferyje, pH 8,0 su 4 % natriododecilsulfato, 1 % merkaptoetanolio ir 20 % glicerino. Tokiu būdu ištirpinti baltymai atskiriami SDS-PAGE pagalba ir išryškinami Coomassie-Blue (Blakesley, R.W., Boezi, J.A.: Anai. Biochem. 82, 580 - 582, 1977). Nudažyti geliai įvertinami densimetriškai ir integruojamos dėmės tarp pikų. Po indolakrilinės rūgšties indukcijos susidaręs išankstinės stadijos rscu-PA baltymo kiekis nustatomas dėmių ekstrakcijos pagalba, identifikuotų kaip išankstinės stadijos baltymo juostų, gautų, prieš ir po

T indukcijos. Fig. 11 pateikta iš E. coli K 12 JM 103 ląstelių gauto baltymo densitograma. Šiame pavyzdyje išankstinės stadijos rscu-PA baltymo kiekis po indukcijos sudaro 17,9 masės % nuo viso bakterinio baltymo.

Kiti pavyzdžiai nurodyti lentelėje.

Išankstinės stadijos baltymo rscu-PA kiekis nuo bendro baltymo kiekio (procentais)

E. coli	kamienas	Transformuotas
pBF 161	pUK 54 trp 207-1* (žinomas)
K 12 ATCC 31446	14	1,5
K 12 JM	103	17, 9	1,9
GRT-1		17,8	1,7

* Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, H., Rey M.W., Gunzler. W.A. Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: Biotechnol.3, 923-929, 1985.

3 pavyzdys

Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scuA-genu, kontroliuojant trp-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas plazmidėje pBR 322 su geno20 resistentiškume trūkumu tetraciklinui.

a) Plazmidės pBR 322 dėl konstravimas

Plazmidė pBR 322 kerpama Eco RV ir Nru I pagalba. 25 Gautas 787 nukleotidų ilgio fragmentas pašalinamas agarozgelektroforezės pagalba, likęs pBR 322 kiekis elektroeliuavimo pagalba iš gelio eliuojamas ir valomas per DE 52. Likusios pBR 322 Eco RV x Nru I dalies buki galai įprastu būdu liguojami T4-ligazės pagalba. Po transformacijos E.coli K 12 JM 103 ląstelėje ir kultiLT 3611 B vavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, iš kurių lygi dalis po pernešimo ą terpę, turinčią 25 ųg/ml tetraciklino, neišauga, t.y., nepasižymi tetraciklinine rezistencija. Klonai turi plazmidę pBR 322 dėl, kuri skiriasi nuo pBR 322 tuo, kad yra 787 nukleotidais trumpesnė, todėl daugiau negali būti kerpama Eco RV ir Nru I pagalba.

b) Plazmidės pBF 162 konstravimas

Plazmidė pBR 322 dėl kerpama Eco Rl ir Hind III pagalba. Tokiu būdu gautas 31 nukleotido ilgio fragmentas atskiriamas preparatyvinės agarozgelelektroforezės pagalba, o likusi pBR 322 dėl dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio pagalba ir valoma DE 52.

Tokiu būdu iš pBF 160 gaunamas 1684 nukleotidų ilgio Eco R I x Hind III fragmentas, kuris turi sintetiną scu-PA-geną su visais reguliavimo vienetais (trp-promotorius).

Abu fragmentai įprastu būdu liguojami T4-ligaze ir po to transformuojami ą E. coli K 12 JM 103 ląsteles. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi 1684 nukleotidų ilgio Eco Rl x Hind III fragmentą ir, pridėjus 62 ųg/ml indolakrilinės rūgšties, gaunamas išankstinės stadijos rscu-PA baltymas. Šie klonai turi plazmidę pBF 162.

c) Ekspresinis testas

E.coli GRT-1 transformuojama pBF 162 pagalba, po to fermentuojama, kaip aprašyta lg pav., ir išmėginamas ekspresijos rezultatas. Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 6 valandas po indukcijos, kuri sudaro 1300 PU/ml ląstelės suspensijos, kai optinis tankis 1, ir palyginama su fig. 10 pateiktomis ekspresijos išeigos reikšmėmis po E.coli GRT-1 transformacijos pBF 160 plazmide.

pavyzdys 5

Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scuPA-genu, kontroliuojant tac-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas

a) Plazmidės pBF 171 konstravimas

Plazmidė pBF 162 kerpama Eco Rl ir Xba I pagalba. Gautas 74 nukleotidų ilgio fragmentas atskiriamas preparatyvinės agarozgelelektroforezės pagalba, likusi plazmidės dalis eliuojama elektroeliuavimo pagalba ir po to valoma DE 52.

Iš plazmidės p tac SDT (DSM 5018) išskiriamos Eco Rl x Xba I fragmentas, kuris turi tac-promotorių. Šiam tiks20 lui Eco Rl x Xba I pagalba kerpama p tac SDT ir fragmentas atskiriamas preparatyvinės PAGE pagalba. Pašildžius iki 65°C amonio acetato/SDS buferyje prie pH 8,0 iš mechaniškai susmulkinto poliakrilamido fragmentas eliuojamas ir valomas daug kartų ekstraguoj ant fenolu, prisotintu 1 mol tris-buferių, pH 8,0.

Tokiu būdu gauti abu fragmentai įprastu būdu liguojami T4-ligaze ir transformuojami į E.coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkant tokie klonai, kurie pridėjus IPTG, produkcija išankstinės stadijos rscu-PA baltymą. Šie klonai turi plazmidę pBF 171.

b) Ekspresinis testas

E. coli K 12 JM 103 transformuojama pBF 171 pagalba, fermentuojama, kaip aprašyta Ig pavyzdyje ir ištiriamas ekspresijos rezultatas. Indukcija vykdoma su IPTG (galutinė koncentracija 0,5 mmol).

Išankstinės stadijos rscu-PA-baltymo išeiga nustatyta 5 kaip rtcu-PA aktyvumas per l-β valandas po indukcijos ir pateikta fig. 12. Ją galima lyginti su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis vienoduose

E.coli kamienuose panaudojus plazmidę pBF 160.

5 pavyzdys

Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo su sintetiniu scuPA-genu, kontroliuojant tac-promotoriui, ekspresinės plazmidės konstravimas plazmidėje pBR 322 su rezisten15 tiškumo tatracklinui trūkumu gene.

a) Plazmidės pBF 172 konstravimas.

Plazmidė pBR 322 dėl (žr. fig. 3a) kerpama Eco Rl x

Hind III pagalba. Gautas 31 nukleotido ilgio fragmentas atskiriamas preparatyvinės agarozgelinės elektroforezės pagalba, likusi pBR 322 dėl dalis eliuojama elektroeliuavimo iš gelio pagalba ir po to valoma DE 52.

Tokiu pat būdu iš pBF 171 (fig. 4a) gaunamas Eco Rl x Hind III fragmentas, kuris turi sintetinį scu-PA geną su visais reguliavimo vienetais (tac-promotorius).

Abu fragmentai liguojami įprastu būdu T4-ligaze ir po to transformuojami į E. coli K 12 JM 103. ląsteles. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 pg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie esant 0,5 mmol IPTG produkcija išankstinės stadijos rscu-PA baltymą. Šie klonai turi plazmidę pBF 172.

b) Eskpresinis testas

E. coli K 12 JM 103 transformuojama pBF 172 pagalba, fermentuojama, kaip aprašyta Ig pav. ir ištiriamas ekspresijos rezultatas. Indukcija,· tačiau vykdoma su IPTG (galutinė koncentracija 0,5 mmol). Išankstinės stadijos rscu-PA-baltymo išeiga nustatoma kaip rtcu-PA aktyvumas per 1-6 vai. po indukcijos ir tai sudaro apytiksliai 1100 PU/m.l ląstelės suspensijos, kai optinis tankis 1. Šį rezultatą palygina su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis tame pačiame E.coli kamiene panaudojus plazmidę pBF 160.

pavyzdys

Atstumo tarp Š.D. sekos ir startinio kodono išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresinėje plazmidėje pakeitimas. ' '

Visose 1-5 pavyzdžių konstrukcijose aprašytas startinis kodonas ATG yra Nde I kirpimo vietos - CATATG - sudėtinė dalis. Nde I kerpa už pirmojo A heksonukleotidinę seką ir duoda 5' galus, kurie perkloja 2 bazes. Užpildomi 3' galai, t.y., konstruojami buki galai, ir po to vėl liguojama taip, kad atitinkama seka pailginama bazių poromis. Tuo pat metu pašalinama Nde I kirpimo vieta. Kaip matyti fig. 13 pateiktame pavyzdyje atstumas nuo Š.D. sekos iki startinio kodono pailgėja nuo 8 iki 10 bazių porų. Tolimesni eksperimentai aiškinami pavyzdyje.

a) Plazmidės pBF 163 konstrukcija

Plazmidė pBF 161 kerpama Nde I pagalba, po to išsikišę galai užpildomi I DNR polimerazės Klionovo fragmentu (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular

Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, 1982). Po to DNR įprastu būdu liguojama T4ligaze ir transformuojama į E.coli K 12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, turinčioje 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pBF 163. Ji skiriasi nuo pBF 161, nes neturi vienos Nde I kirpimo vietos ir ankstesnės Nde I (vietos srityje turi papildomas-TA-bazes (fig. 13).

b) Ekspresinis testas

E.coli GRT-I transformuojama plazmidę pBF 163, fermentuojama, kaip aprašyta Ig pav. ir ištiriamas ekspresijos rezultatas. Išankstinės stadijos rscu-PA baltymo išeigos, nustatytos po grįžtamos reakcijos ir· aktyvavimo, kaip rtcu-PA aktyvumas mililitrui ląstelės suspensijos, kai optinis tankis 1, per 1-6 valandas po indukcijos su 62 mg/1 indolakrilinės rūgšties, pateiktos fig. 14. Rezultatus galima palyginti su fig. 10 pateiktomis išeigos reikšmėmis, gautomis tame pačiame E.coli kamiene panaudojus plazmidę pBF 160.

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Naujų plazmidžių, naudojamų gaunant plazminogeno aktyvatorių, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į plazmidę pBR 322, iš kurios pašalinta nic/bom sritis ir/arba bent rezistentiškumo tetraciklinui dalis, tarp multiklonavimo vietos Xba I ir Nde I kirpimo vietų įveda nurodytą fig. 2 nukleotidų seką (fig. 2 yra šio apibrėžties punkto dalis), kuri tarp Xba I ir Nde I kirpimo vietų turi Šain-Dalgarno seką, ir 6-12, geriausiai 8-10, nukleotidų atstumu startinį kodoną ATG ir jo pagalba žinomu būdu į vieną arba du transkripcijos terminatorius įstato scu-PA struktūrinio geno sintetinę dalinę seką, geriausiai prasidedančią nuo struktūrinio geno 3' galo, o taip pat reguliuojamą promotorių, ir tokiu būdu gauna plazmidės, kurios pasižymi šiais skiriamaisias požymias:

a) plazmidės operonas turi reguliuojamą promotorių, kaip ribosomų surišimo vietą - Šain-Dalgarno seką, startinį kodoną, viengrandžio uroplazminogeno scu-PA sintetinį struktūrinį geną, turintį 411 aminorūgšių liekanų ir žemiau nuo struktūrinio geno vieną-du terminatorius;

b) plazmidės tinka išankstinės stadijos rscu-PA baltymo ekspresijai su ekspresijos laipsniu, mažiausiai 10 nuo viso susidariusio enterobakterijos baltymo, geriausiai Escherichia coli kamienuose.
2. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliuojamą promotorių multiklonavimo vietos pagalba įstato trp arba tac- promotorius.
3. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad kaip reguliuojamą

LT 3311 B promotorių įstato sintetinį trp-promotorių, kurio nukleotidų seka pateikta fig.8, o fig. 8 yra šios apibrėžties punkto dalis.
5 4. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 ir 2 punktus, besiskiriantis tuo, kad kaip reguliuojamą promotorių įstato tac- promotorių iš plazmidės ptac SDT (DSM 5018).

10 5. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad į naujų plazmidžių operoną kaip einančius vienas paskui kitą transkripcijos terminatorius įstato trp A terminatorių ir/arba tet A/'orf L terminatorių iš Tn 10.
6. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad rnultiplikavimo vietos pagalba tarpinėje stadijoje įstato struktūrinį geną, kurio nukleotidų seka nurodyta fig. 15, o fig 15 yra

20 šios apibrėžties punkto dalis.
7. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad Eco RI Hind III fragmentą iš gautos atitinkamai pagal 1-6 punktus

25 plazmidės panaudoja kaip ekspresinę kasetę kitoje, enterobakaterinėje, geriausiai galinčioje automatiškai daugintis Escherichia coli plazmidėje.
8. Naujų plazmidžių gavimo būdas pagal 1 punktą, b e 30 siskiriantis tuo, kad gautoje atitinkamai pagal 1-7 punktus plazmidėje atstumą tarp Šain-Dalgarno sekos ir startinio kodono padidina kerpant Nde I pagalba, užpildant gautas kirpimo vietas ir sujungiant bukus galus.

35 , .
9. Plazmidės, gautos pagal 1-8 punktus panaudojimas plazminogeno aktyvatoriaus gavimui, besiski29

LT *>,< ' .·? [3

I . _ r i a n t i s tuo, kad šia plazmidė žinomu būdu transformuoja enterobakterinį, geriausiai, Escherichia coli kamieną, indukuoja scu-PA struktūrinio geno ekspresiją, susidariusį tarpinės stadijos rscu-PA baltymą 5 atskiria nuo terpės, ir lizuotas bakterines ląsteles, išankstinės stadijos baltymą soliubilizuoja ir po to paveikiant red-oks sistema, atlieka grįžtamąją reakciją iki rscu-PA.
10 10. Plazmidės, gautos pagal 1-8 punktus panaudojimas pagal 9 punktą, besi s kiriantis tuo, kad prieš įgyvendinant 9 punktą, šia plazmidė transformuoja Escherichia coli tipo, geriausiai, Escherichia coli K 12 kamieną.