FI102386B - Plasmidit, niiden valmistus ja käyttö plasminogeenin tuottamiseksi - Google Patents

Description

102386

Plasmidit, niiden valmistus ja käyttö plasminogeenin tuottamiseksi

Plasminogeeniaktivaattorit näyttelevät merkittävää osaa fibriinin aiheuttamien veri-5 suonitukosten, kuten sydäninfarktin, keuhkoveritulpan, raajojen valtimoissa esiintyvien sulkeutumasairauksien, jne. hoidossa. Suunnilleen 50-luvun alusta lähtien on tiedetty, että ihmisen virtsa sisältää erästä proteolyyttistä entsyymiä, joka saa aikaan plasminogeenin muuntumisen plasmiiniksi eli sellaiseksi entsyymiksi, joka pilkkoo fibriinin liukoiseksi polypeptidiksi ja joka näin ollen avaa fibriinin aiheuttamia 10 tukoksia. Tätä plasminogeeniaktivaattoria kutsuttiin urokinaasiksi, ja osoittautui, että olemassa on todellakin erilaisia urokinaasimuotoja. Nämä kaikki muodot saadaan kuitenkin suoraan samasta esiastemolekyylistä, eli noin 70-luvun puolivälistä lähtien tunnetusta prourokinaasi-zymogeenista. Sen jälkeen, kun saatiin selville, että tällä prourokinaasilla on yksiketjuinen rakenne, siitä alettiin käyttää nimitystä scu-15 PA (single chain urinary plasminogen activator, eli virtsasta saatu yksiketjuinen plasminogeeniaktivaattori). Tämä scu-PA käsittää 411 aminohappoa ja luonnossa esiintyvässä muodossa sen 302. aminohappo on glykosyloitunut.

Eri julkaisujen perusteella tunnetaan scu-PA:n glykosyloitumattoman proteiiniosan 20 geeniteknologinen valmistus, josta osasta käytetään nimitystä "rscu-PA" (yhdistel-mä-scu-PA) tai triviaalinimitystä "saruplaasi". Hoitosovellutuksissa rscu-PA on osoittautunut tavanomaisia fibrinolyyttisiä aineita paremmaksi hoitovaikutuksen ja siedettävyyden suhteen (ks. Lancet 1989, sivut 863-868).

25 Glykosyloitumattoman plasminogeeniaktivaattorin rscu-PA valmistukseen käytetään prokariootteja, mihin liittyviä tietoja on myös jo esitetty kirjallisuudessa. rscu-PA.n toistaiseksi tunnetut valmistusmenetelmät perustuvat ihmiskudoksista eristetyn scu-PA.n rakennegeenin ilmentämiseen. Tällöin päästään valitettavasti kuitenkin vain pieniin ilmentymismääriin, jotka eivät salli tavoitellun tuotteen taloudellista valmis-30 tamista suurina määrinä. Täten esim. julkaisun Hibino et ai., Agric. Biol. Chem. 52 329-336 (1988) mukaan ilmentyminen oli vain 2 % tuotettaessa rscu-PA:ta E. coli-bakteerissa, bakteerien kokonaisproteiinista laskien. Toisaalta eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 92 182 A2 sekä julkaisussa Holmes et ai. (10) ei esitetä täsmällisesti saavutettuja ilmentymismääriä. Esitettyjen tietojen perusteella voitiin 35 kuitenkin todeta, että rscu-PA:ta saatiin vähemmän kuin 2 % bakteeriproteiineista eri kantoja käytettäessä.

2

Huomautettakoon tässä yhteydessä, että samoin kuin useimmissa muissakin tapauksissa, joissa eukarioottisia proteiineja ilmennetään bakteereissa, myös rscu-PA saadaan solun sisällä olevana denaturoituneena sulkeumakappaleena, joka välivaiheena toimivan eristämisen jälkeen on poimutettava uudestaan proteiinikemiallisesti rscu-5 PA:n oikeaan tertiäärirakenteeseen. Tällä tavalla saatu tuote voidaan muuntaa muodostuneen rscu-PA-määrän määrittämiseksi, esim. plasmiinia lisäämällä, kaksiket-juiseksi glykosyloitumattomaksi urokinaasiksi ("rtcu-PA"), jonka entsyymiaktiivisuus määritetään muodostuneen rscu-PA-määrän mittana. Luonnollisesti voidaan myös määrittää esiasteproteiinin tai rscu-PA:n saanto ja näin ollen myös ilmenty-10 misaste esim. siten, että elektroforeettisesti erotettu kokonaisproteiini analysoidaan densitometrisesti.

Yllättäen todettiin, että keksinnön mukaisilla plasmideilla transformoiduissa bakteereissa päästiin monta kertaa suurempaan ilmentymisasteeseen kuin tekniikan nyky-15 tason mukaisilla plasmideilla transformoiduissa, muuten samoissa isäntäkannoissa. Näin ollen keksinnön mukaiset plasmidit soveltuvat paremmin kuin kaikki tähän saakka tunnetut plasmidit rscu-PA:n tai sen esiasteproteiinin valmistamiseksi. Täydellisyyden vuoksi mainittakoon lisäksi, että nyt kun rscu-PA:ta voidaan tuottaa hyvin oheisen keksinnön avulla, niin myös rtcu-PA:ta voidaan saada teknisessä 20 mitassa sinänsä tunnetulla tavalla pilkkomalla rscu-PA:ta esim. plasmiinilla edellä analyyttisiin tarkoituksiin esitetyllä tavalla.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

; 25 Keksinnön mukaisten plasmidien tunnusomaisena piirteenä on lisäksi se, että niiden operoni käsittää säädettävän, mahdollisesti synteettisen promoottorin, ribosomien sitoutumiskohtana toimivan Shine-Dalgamo-ketjun, aloituskodonin, scu-PA:n synteettisen rakennegeenin sekä alavirran puolella tästä rakennegeenistä vähintään yhden päättäjän. Läsnä on edullisesti kaksi peräkkäistä päättäjää, jotka ovat erityisesti 30 trp A -päättäjä ja/tai tet A/orf L -päättäjä Tn 10:stä, ks. julkaisu Schollmeier et ai.

‘v (6)· Säädettävä promoottori on erityisesti Trp-promoottori tai Tac-promoottori.

35 Keksinnön mukaisen plasmidin säätelyalueessa Shine-Dalgamo-ketjun ja aloituskodonin välinen etäisyys on 6-12, edullisesti 8-10 nukleotidiä.

102386 3

Keksinnön mukaiseen plasmidiin istutettavaa rakennegeeniä muodostettaessa siihen sisällytetään edullisesti seuraavassa taulukossa esitetyt, kyseeseen tulevia aminohappoja koodaavat emäsketjut. Ei ole välttämätöntä, että nämä kaikki ominaisuudet toteutuisivat samanaikaisesti rakennegeenissä.

5

Aminohappo Tripletti

Arginiini CGT

Leusiini CTG

Väliini GTT

10 Proliini CCG

Glysiini GGT

Toisaalta rakennegeeniä koottaessa on tarkoituksenmukaista välttää mahdollisuuksien mukaan seuraavien alla mainittujen, aminohappoja koodaavien kodonien käyttöä 15 (näiden ominaisuuksien ei tarvitse nytkään toteutua samanaikaisesti kaikissa aminohapoissa): Vältettävä kodoni Aminohappo AT A Isoleusiini 20 GTC Väliini CCC Proliini AAG Lysiini AGG, AGA, CGG, CGA Arginiini GGA, GGG Glysiini 25

Stabiilien sekundäärirakenteiden muodostuminen rakennegeenin ja säätelyalueen väliin vältetään suureksi osaksi säätelyalueen edellä mainittujen ominaisuuksien avulla sekä valitsemalla rakennegeenissä yksittäisten aminohappojen kodonit keksinnön mukaisesti.

30 .· Ensin syntetoidaan yksijuosteisia, 40-80 emästä käsittäviä oligonukleotidejä syn teettisen rakennegeenin saamiseksi. Niitä valmistetaan tarkoituksenmukaisesti 1 pmol-mitassa kiinteään faasiin perustuvalla menetelmällä [Adams et 1., (7)] käyttäen DNA-syntetisaattoria (yhtiön New Brunswick Scientific Co. malli Biosearch 35 8600). Monomeerisina syntoneina voidaan käyttää kulloinkin tarvittavien deoksiri- bonukleosidien kaupallisesti saatavia, β-syanoetyylillä suojattuja di-isopropyyliami-no-fosforiamidiitteja. Kantajan pilkkomisen jälkeen päistään vielä trityylillä suoja- 102386 4 tuista juosteista poistetaan suolat geelisuodatuksella steriileissä olosuhteissa ja juos-teet esipuhdistetaan, minkä jälkeen ne erotetaan alustavasti kahdella nestekromato-grafisella ajolla käänteisfaasia käyttäen. Trityyli poistetaan kulloinkin saadusta päätuotteesta, josta saadaan kahden muun, käänteisfaasia käyttäen toteutetun HPLC-5 nestekromatografisen puhdistusvaiheen jälkeen toivottua oligonukleotidiä erittäin puhtaana, kuten geelielektroforeettinen analyysi (PAGE) osoittaa.

4-9 tällaista yksinkertaista juostetta käsittävistä tyhmistä valmistetaan sitten noin 200 nukleotidin pituisia kaksijuosteisia kappaleita siten, että muualle kuin kappaleen 10 päihin sijoittuvat yksijuosteiset oligonukleoditit fosforyloidaan 5'-päästään, ja kulloinkin toisiaan täydentävät vastinjuosteet liitetään yhteen ja ligatoidaan päihin sijoittuvien oligonukleotidien kanssa. Ligaation jälkeen muodostuneet, kloonautuvat kaksijuosteiset kappaleet istutetaan sopiviin, linearisoituihin vektoreihin. Muut toimenpiteet ilmenevät jäljempänä esitettävistä esimerkeistä.

15

Oheisessa hakemuksessa käytetyillä lyhenteillä on seuraava merkitys: bp: emäspari DE 52: yhtiön Whatman anioninvaihtaja 20 EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo IPTG: i sopropyyli- β -D-tiogalaktopyrano sidi PAGE: polyakryyliamidigeelielektroforeesi PU: Ploug-yksikköä SDS: natriumdodekyylisulfaatti 25 S.D.-ketju: Shine-Dalgamo-ketju

Tris-HCl: Trishydroksimetyyliaminometaani-hydrokloridi

Tween-80: Polyetyleenioksidi(20)sorbitaanimono-oleaatti.

Keksinnön mukaisten plasmidien valmistukseen käytetään edullisesti kaupallisesti 30 saatavaa plasmidia pBR 322 (4363 bp). Siitä eliminoidaan edullisesti nic/bom-alue ja/tai tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaava geeni. Tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavaa geeniä ei ole tällöin poistettava täydellisesti, vaan sellainen poistaminen riittää, ettei plasmidi saa enää aikaan sillä transformoidussa bakteerikannassa tetrasykliinin vastustuskykyä. Näillä toimenpiteillä (eli nic/bom-alueen poistamisella 35 ja tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin vähintään osittaisella poistamisella) saadaan nk. "erittäin turvallinen plasmidi".

5 102386

Edullinen strategia keksinnön mukaisen plasmidin muodostamiseksi, lähtien edellä kuvatulla tavalla muokatusta plasmidista pBR 322 (tai jostakin toisesta, ohessa mainitusta, jo tunnetusta plasmidista), käsittää seuraavana vaiheena synteettisen "moninkertaisen kloonauskohdan" (multi cloning site) istuttamisen Eco Rl- ja Hind III 5 -pilkkomiskohtien väliin. Tämä moninkertainen kloonauskohta (ks. kuvio 2) käsittää pilkkomiskohtia tietyssä järjestyksessä siten, että näiden pilkkomiskohtien väliset emäkset on valittu mielivaltaisesti lukuunottamatta pilkkomiskohtien Xba I ja Nde I välistä ketjua, joka sisältää ribosomien sitoutumiskohdan (Shine-Dalgamo-ketjun) B. subtilis -bakteerin Xyl-operonista 5-AAGGAG-3' (4) sekä tietyn välimatkan 10 S.D.-ketjun ja aloituskodonin ATG välissä. S.D.-ketjua seuraavat emäkset GAAAT on saatu (4):stä ja ne on liitetty CATATG-ketjulla, joka on Nde I -pilkkomiskohta. Täten S.D.-ketjun ja ATG:n välinen etäisyys on 8 emäsparia. Moninkertaiseen kloo-nauskohtaan kuuluvien yksittäisten pilkkomiskohtien välisten etäisyyksien tulisi olla kloonausteknisistä syistä vähintään noin 20 nukleotidin pituisia, mikä helpottaa 15 välikappaleiden poistamista.

Plasmidiin istutetaan näiden moninkertaisten kloonauskohtien avulla pilkkomiskohtia, jotka tekevät mahdolliseksi - tarkoituksenmukaisesti kopioinnin päättäjän istuttamisen jälkeen - scu-PA-rakennegeenin osaketjujen sisällyttämisen toinen toisensa 20 jälkeen, alkaen edullisesti tavoiteltavan proteiinin C-päätteestä, eli valmistettavan rakennegeenin DNA-juosteen 3'-päätteestä, sekä esim. synteettisen tai myös jostakin toisesta plasmidista eristetyn tai kaupallisesti saatavan Trp-promoottorin istuttamisen. Tällä tavalla saadun scu-PA-rakennegeenin täydellinen nukleotidiketju sekä yksittäisiä kodoneita vastaavat aminohapot on esitetty kuviossa 15.

25

Muita keksinnön mukaisia plasmideja saadaan edellä kuvatulla tavalla muodostetusta plasmidista esim. siten, että synteettinen scuPA-rakennegeeni otetaan talteen kaikkine säätely-yksikköineen entsyymeillä Eco Rl ja Hind III pilkkomalla, minkä jälkeen se istutetaan toiseen, enterobakteereissa, erityisesti E, coli -bakteerissa auto-30 nomisesti, lisääntymiskykyiseen plasmidiin, joka on tätä tarkoitusta varten tehty lineaariseksi ja lyhennetty entsyymeillä Eco Rl ja Hind III pilkkomalla. Keksinnön mukaisissa plasmideissa esim. Trp-promoottori voidaan korvata Tac-promoottorilla (ja päinvastoin) periaatteessa samalla tavalla, käyttäen kuitenkin Eco Rl- ja Xba I -pilkkomiskohtia.

35 102386 6

Analogisella tavalla voidaan myös lähteä muista tunnetuista plasmideista, joissa on vain yksi Eco Rl- ja Hind ΙΠ-pilkkomiskohta, ja joista voidaan mainita esim. pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 ja muut vastaavat.

5 Keksinnön mukaisia plasmideja, joissa Shine-Dalgamo-ketjun ja aloituskodonin ATG välistä etäisyyttä on pidennetty, voidaan saada siten, että edellä kuvatulla tavalla muodostettu plasmidi, jossa mainittu etäisyys on esim. 8 nukleotidiä, pilkotaan entsyymillä Nde I, tuloksena saadut leikkauskohdat täytetään ja tämän jälkeen syntyneet tylpät päät ligatoidaan, jolloin saadussa keksinnön mukaisessa 10 plasmidissa S.D.-ketjun ja aloituskodonin välinen etäisyys on esim. 10 nukleotidiä.

Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaisilla plasmideilla transformoiduilla bakteereilla päästään monta kertaa suurempaan ilmentymiseen kuin tekniikan nykytason mukaisilla plasmideilla transformoitaessa. Sopivien kyvykkäiden isäntäorganismien 15 transformoiminen tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Isäntäorganismeista, jotka sopivat erityisen hyvin keksinnön mukaisten plasmidien ilmentämiseen, voidaan mainita E. coli -bakteerin ja muiden samansukuisten enterobakteereiden, kuten Pseudomonas-. Salmonella-. Enterobacter-, Klebsiella- tai Serratia-bakteereiden eri kannat. Edullisia isäntäorganismeja ovat E. coli -kannat, kuten E. coli-GRT-1 ja 20 erityisesti alaryhmään K12 kuuluvat E. coli -kannat, kuten esim. E, coli K12 JM101 (ATCC 33876), E, coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coli K12 JM 105 (DSM 4162), E. coli K12 -kanta ATCC 31446 tai myös E. coli K12 DH1 (ATCC 33849).

Ilmentäminen voidaan käynnistää Tac-promoottorin käsittävissä E. coli -ilmentämis-• 25 järjestelmissä esim. laktoosia lisäämällä tai glukoosivajauksella, edullisesti kuiten kin lisäämällä isopropyyli-p-D-tiogalaktopyranosidia. Mikäli plasmidissa on kuitenkin Trp-promoottori, niin induktio toteutetaan edullisesti indoliakiyyli-, indolietik-ka- tai -indolipropionihapolla. Muita tunnettuja indusoivia aineita voidaan luonnollisestikin käyttää samalla tavalla.

30 . Induktion ja tietyn, edeltä käsin määrätyn solutiheyden saavuttamisen jälkeen solut erotetaan sentrifogoimalla ja sentrifugoinnilla saatu jäännös laitetaan suolan vesiliuokseen liettämisen jälkeen esim. homogenisaattoriin, jossa solut rikotaan paine-eron avulla. Toistetun sentrifugoinnin jälkeen jäännöksessä on läsnä rscu-PA:n esiaste-35 proteiinia veteen liukenemattomien solujäännösten ohella. Esiasteproteiini saadaan liukenemaan käsittelemällä sitä guanidiinihydrokloridiliuoksella, ja uuden sentriiu-goinnin jälkeen supematanttia käsitellään redox-järjestelmällä (joka sisältää esim.

102386 7 pelkistynyttä ja hapettunutta glutationia), mikä johtaa luonnollisen konformaation muodostumiseen eli tavoitellun rscu-PA:n syntymiseen. Se on läsnä reaktioseokses-sa liukoisessa muodossa, joka voidaan eristää puhtaana tavanomaisilla puhdistustoimenpiteillä (esim. kromatografisella käsittelyllä ja sitä seuraavalla pakastekuivauk-5 sella).

Analyyttisiä toimenpiteitä varten menetellään edullisesti siten, että tutkittavalla plas-midilla transformoituja E. coli-kantoia fermentoidaan ja sen jälkeen, kun on saavutettu solususpension ennalta määrätty optinen tiheys, rscu-PA-esiasteproteiinin 10 ilmentyminen indusoidaan sopivalla induktorilla. Riittävän pituisen fermentoinnin jälkeen suspensiosta otetaan pieniä näytteitä ja niistä sentrifugoinnilla erotetut solut hajotetaan lysotsyymillä (1 mg lysotsyymiä 1 ml:ssa 50 mM Tris-hydrokloridipus-kuria, pH 8,0, 50 mM EDTA ja 15 % sakkaroosia). Hajotettujen solujen homoge-naatti tehdään liukoiseksi 4-5 M guanidiniumhydrokloridiliuoksessa, joka laimenne-15 taan sitten pitoisuuteen 1,2 M guanidiniumhydrokloridia, minkä jälkeen poimuttu-misreaktion annetaan edetä 2-5 tunnin ajan pelkistävän aineen (glutationi, merkapto-etanoli tai kysteiini) läsnäollessa [ks. myös esim. julkaisu Winkler et ai. (11)]. Täten saatu yksiketjuinen rscu-PA muunnetaan plasmiinia lisäämällä kaksiketjuiseksi rscu-PA:ksi, jonka aktiivisuus määritetään substraatilla S2444 (pyroGlu-Gly-Arg-p-nitro-20 anilid; Kabi Diagnostika, Ruotsi), jota pilkkovat vain kaksiketjuiset aktiiviset uroki-naasit. Tämä rscu-PA:n aktivoiminen plasmiinilla tapahtuu seuraavassa ympäristössä: 50 mM Tris-puskuria, 12 mM natriumkloridia, 0,02 % tuotetta Tween 80, pH 7,4 ja 37 °C. rscu-PA:n ja plasmiinin välisen suhteen tulisi olla noin 100-15000:1 molaarisuuksina laskien tai noin 8000-36000:1 entsyymiyksikköinä laskien. Koein-: 25 kubointi tapahtuu olosuhteissa 50 mM Tris-puskuria, 38 mM natriumkloridia, pH

8,8, 37 °C:ssa siten, että läsnä on 0,36 μΜ aprotiinia (plasmiinin inhiboimiseksi) ja 0,27 mM substraattia S2444. Riippuen siitä, kuinka paljon näyte sisältää rscu-PA:ta, reaktio pysäytetään 5-60 minuuttia kestäneen inkuboinnin jälkeen lisäämällä siihen 90-prosenttista etikkahappoa, minkä jälkeen ekstinktio mitataan aallonpituudella 30 405 nm. Substraatin valmistajan S2444 esittämien tietojen mukaan tällä tavalla meneteltäessä ekstinktion muuttuminen nopeudella 0,05/min aallonpituutta 405 nm käytettäessä vastaa aktiivisuutta, joka on 25 Ploug-yksikköä/ml koeliuosta.

Esiasteproteiinista, jota saatiin käyttämällä erilaisia keksinnön mukaisia plasmideja 35 erilaisissa bakteereissa, peräisin olevan rscu-PA:n saannot on esitetty kuvioissa 10, 12 ja 14.

102386 8

Kuten kuvion 11 sekä jäljempänä seuraavissa esimerkeissä esitettyjen tietojen, erityisesti esimerkkiin 2 kuuluvan taulukon 1 perusteella voidaan todeta, keksinnön mukaisilla plasmideilla saavutetaan, edullisesti E, coli -kannoissa, rscu-PA-esiaste-proteiinin ilmentymisasteeksi 10-25 paino-%, erityisesti 14-20 paino-% muodostu-5 neesta kokonaisproteiinista laskien, llmentymisaste on siis keksinnön mukaisia plas-mideja käytettäessä vähintään 10-15 kertaa suurempi kuin tunnetuilla plasmideilla, esim. plasmidilla pUK 54 trp 207-1 saavutettava llmentymisaste.

Liitteenä olevissa kuvioissa: 10

Kuviot la ja Ib esittävät plasmidin pBF 158 muodostamista kaupallisesti saatavasta plasmidista pBR 322. Tällöin poistetaan peräkkäin nic/bom-alue ja suuri osa tetra-sykliinin vastustuskyvyn aikaansaavasta geenistä.

15 Kuvio 2 esittää synteettisen "moninkertaisen kloonauskohdan" nukleotidiketjua.

Kuvio 3 esittää plasmidin pBF 158-01 muodostamista. Kuviossa esitetään synteettisen moninkertaisen kloonauskohdan istuttaminen plasmidiin pBF 158 pilkkomis-kohtien Eco Rl ja Hind III väliin.

20

Kuvio 4 esittää plasmidin pBF 158-01 T muodostamista. Kappale Cla I x Hind III korvataan plasmidista pRT 61 (5) saatavalla vastaavalla "T"-kappaleella, joka käsittää tet A/orf L -päättäjän Tn 10:stä (6).

‘ 25 Kuviot 5a - 5g esittävät nukleotidiketjuja ihmisen scu-PA:ta koodaavan geenin syn teettisissä kappaleissa (joiden istuttaminen muodostamalla scu-PA:n rakennegeeni keksinnön mukaiseen plasmidiin, plasmidista pBF 158-01 T lähtien, on kuvattu esimerkeissä Id - lf ja esitetty kuvioissa 6, 7 ja 9).

30 Kuviot 6a - 6c esittävät plasmidien pBF 158-02 T - pBF 158-06 T muodostamista . istuttamalla oligonukleotidikappaleet M4-M8, lähtien tavoitellun proteiinin C-päät- teestä (joka vastaa DNA-juosteen 3-päätettä) sekä plasmidista pBF 158-01 T.

Kuviot 7a - 7c esittävät plasmidien pBF 158-08 T muodostamista käyttämällä apu-35 muodostetta plasmidissa pUC 19 (vrt. esimerkki le).

Kuvio 8 esittää nukleotidiketjua synteettisessä Trp-promoottorissa.

102386 9

Kuvio 9 esittää ihmisen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten tarkoitetun ilmentämis-plasmidin pBF 160 muodostamista. scu-PA:n rakennegeeni on esitetty mustana viivana pilkkomiskohtien Nde I ja Cla I välissä.

5 Kuvio 10 esittää ihmisen rscu-PA:n esiasteproteiinin ilmentymisasteita (määritetty rtcu-PA-aktiivisuutena poimuttamisen ja aktivoinnin jälkeen), jotka on saavutettu plasmidilla pBF 160 (o—o) tai plasmidilla pUK 54 trp 207-1 (10) (o—o) transformoiduissa E. coli -kannoissa Trp-promoottorin säätelyn alaisuudessa ajasta riippuen sen jälkeen, kun ajanhetkellä 0 indusoiminen oli toteutettu indoliakryylihapol-10 la. Kuviossa on esitetty S 2444-substraatilla saadut rtcu-PA-aktiivisuudet Ploug-yksikköinä 1 millilitrassa fermentointialustaa, jonka optinen tiheys oli 1 aallonpituudella 578 nm.

Kuvio 11 esittää plasmidilla pBF 161 transformoiduista E. coli K12 JM 103 15 -soluista saatujen proteiinien SDS-PAGE-käsittelyn densitogrammia sen jälkeen, kun soluja oli fermentoitu (A) ennen induktorin lisäämistä ja 6 tuntia (B) induktori-na käytetyn indoliakryylihapon lisäämisen jälkeen.

Kuvio 12 esittää ihmisen rscu-PA:n esiasteproteiinin ilmentymisasteita (määritetty-20 nä rtcu-PA-aktiivisuutena poimuttamisen ja aktivoinnin jälkeen) plasmidilla pBF 171 transformoiduissa E. coli K12 JM103 -soluissa, eli Tac-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Indusoiminen tapahtui ajanhetkellä 0 IPTG:llä. Kuviossa on esitetty saatu rtcu-PA-aktiivisuus substraatin S 2444 suhteen Ploug-yksikköinä 1 millilitrassa fermentointialustaa, jonka optinen tiheys oli 1 aallonpituudella 578 nm.

• 25

Kuvio 13 esittää Shine-Dalgamo-ketjun (SD) ja aloituskodonin ATG välisen etäisyyden pidentämistä 8:sta 10:een emäkseen täyttämällä Nde 1 -pilkkomiskohdat ja ligatoimalla sitten syntyneet tylpät päät.

30 Kuvio 14 esittää ihmisen rscu-PA:n esiasteproteiinin ilmentymisasteita (määritetty rtcu-PA-aktiivisuutena poimuttamisen ja aktivoinnin jälkeen), jotka on saavutettu plasmidilla pBF 161 (o—o) tai plasmidilla pBF 163 (_—_) transformoiduissa E. coli GRT-1 -soluissa Trp-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Indusoiminen toteutettiin indoliakryylihapolla välittömästi ajanhetken 0 jälkeen. Kuviossa on esitetty S 35 2444 -substraatilla saadut rtcu-PA-aktiivisuudet Ploug-yksikköinä 1 millilitrassa fer mentointialustaa, jonka optinen tiheys oli 1 aallonpituudella 578 nm.

102386 ίο

Kuviot 15a ja 15b esittävät scu-PA-rakennegeenin täydellistä nukleotidiketjua sekä yksittäisiä kodoneita vastaavia aminohappoja.

Suoritusesimerkeissä käytetyt restriktioentsyymit ovat kaupallisesti saatavia entsyy-5 mejä (vrt. esim. julkaisuNachr. Chem. Techn. Lab.. 35, 939, 1987).

Esimerkeissä kloonien valikointiin käytetty viljelyalusta sisältää yhtä litraa kohden: 7,8 g lihasta saatua peptonia; 7,8 g kaseiinista saatua peptonia, 10 g hiivauutetta, 5,6 g natriumkloridia ja 10 g glukoosia. Tähän alustaan lisätään lämmittäen 10 g 10 agaria yhtä litraa kohden, ja se valetaan maljoille.

Esimerkki 1

Ilmentämisplasmidin pBF 160 muodostaminen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten, 15 käsittäen synteettisen scu-PA-geenin Trp-promoottorin säätelyn alaisuudessa.

a) Plasmidin pBF 158 muodostaminen i) Plasmidista pBR 322 (Pharmacia, no. 27-4902, 4363 emäsparia) poistetaan emäs-20 ten 2207 ja 2263 välissä sijaitseva nic/bom-alue (1) seuraavalla tavalla (ks. myös kuvio 1): pBR 322 pilkotaan emäksen 2298 kohdalta entsyymillä Nde I, jolloin se saadaan lineaariseksi. Irralliset päät täytetään "fill in"-reaktiolla, jolloin saadaan tylppiä päitä. Sen jälkeen pilkotaan entsyymillä Pvu II emäksen 2068 kohdalta ja plasmidista pBR 322 jäljelle jääneen osan kummatkin tylpät päät ligatoidaan uudes-25 taan T4-ligaasilla tavanomaista tekniikkaa käyttäen. Sitten ligaatioseos transformoidaan kykeneviin E. coli K12 JM 103 -soluihin (ATCC 39403) (3). Transformoituja soluja viljellään alustalla, johon on lisätty ampisilliinia 150 pg/ml. Saaduista klooneista valitaan ne, jotka sisältävät plasmidin pBF 157, joka eroaa lähtöplasmidista pBR 322 228 nukleotidiä pienempien a) Pst I x BspM II-, b) Pst I x Bal I-, c) Pst I x 30 Ava I -kappaleiden suhteen. Plasmidin pBR 322 kumpikaan yksittäinen pilkkomis-kohta Pvu II ja Nde I ei ole enää läsnä plasmidissa pBF 157.

ii) Plasmidista pBF 157 poistetaan suuri osa tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavasta geenistä pilkkomalla entsyymeillä Eco RV x Nru I, minkä jälkeen muodos-

35 tuneet tylpät päät ligatoidaan. Sen jälkeen, kun plasmidi on transformoitu E. coli K12 JM 103 -soluihin ja kun soluja on viljelty 150 μg/ml ampisilliinia sisältävällä alustalla, saadaan klooneja, joista valikoidaan ne, jotka sisältävät plasmidin pBF

102386 11 158. Tämä plasmidi on 787 nukleotidiä pienempi kuin pBF 157 ja se eroaa siitä lisäksi puuttuvan Bam HI -pilkkomiskohdan suhteen. Bakteerikantojen transformoiminen plasmidilla pBF 158 ei saa niissä aikaan tetrasykliinin vastustuskykyä.

5 b)Plasmidin pBF 158-01 muodostaminen, synteettisen moninkertaisen kloona-uskohdan istuttaminen

Plasmidista pBF 158 poistetaan 31 nukleotidin pituinen kappale entsyymeillä Eco Rl x Hind III pilkkomalla ja muodostuneeseen koloon ligatoidaan synteettinen 10 moninkertainen kloonauskohta, jonka jäqestys on esitetty kuviossa 2. Ligaatioseos transformoidaan E, coli K12 JM 103-soluihin ja niitä viljellään alustalla, joka sisältää ampisilliinia 150 pg/ml, minkä jälkeen valitaan ne kloonit, jotka sisältävät plas-midin pBF 158-01. Tämä eroaa plasmidista pBF 158 ylimäääräisten yksittäisten pilkkomiskohtien Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Κρη I, Spe I sekä toisen Pst I -pilkko-15 miskohdan suhteen (kuvio 3).

c) Plasmidin pBF 158-01 T muodostaminen, kopioinnin päättäjän istuttaminen

Plasmidista pBF 158-01 poistetaan moninkertaisen kloonauskohdan Cla I x Hind III 20 -kappale, ja se korvataan plasmidista pRT 61 (5) saadulla Cla I x Hind III -kappaleella, joka käsittää tet A/orf L -päättäjän Tn 10:stä (6). Saatu plasmidi transformoidaan E. coli K12 JM 103 -kantaan ja sitä viljellään alustalla, joka sisältää ampisilliinia 150 pg/ml, minkä jälkeen valitaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pBF 158-01 T. Se eroaa plasmidista pBF-01 297 nukleotidiä suuremman Cla I x Hind III 25 -kappaleen suhteen (kuvio 4).

d) scu-PA-geeniä varten tarkoitettujen synteettisten kappaleiden M4-M8 istuttaminen, plasmidien pBF 158-02 T - pBF 158-06 T muodostaminen 30 Kaikki synteettiset kappaleet on kuvattu kuvioissa 5a-5g. Ne sijoitetaan noin 200 nukleotidin pituisina kaksijuosteisina kappaleina asianmukaisiin vektoreihin. Tätä tarkoitusta varten vektorit pilkotaan kulloinkin mainittuja pilkkomiskohtia vastaavilla restriktioentsyymeillä ja ne erotetaan poistettavasta kappaleesta agaroosielekt-roforeesilla, sähköeluutiolla ja DE 52 -puhdistuksella. Sitten toteutetaan ligaatio 35 vastaavan kaksijuosteisen synteettisen kappaleen kanssa T4-ligaasia käyttäen, transformaatio E. coli K12 JM 103 -soluihin (kuviot 6a-6c) sekä valikointi ampisilliinia sisältävällä alustalla.

102386 12 i) Kappaleen M8 ligaatio plasmidissa pBF 158-01 T kohtien Bam HI ja Cla I väliin. Tällöin saadaan plasmidi pBF 158-02 T. Oligonukleotidi 019 koodaa scu-PA:n C-päätteen ketjua. Pysäytyskodonin TAA takana on Nhe I -pilkkomiskohta, jota seuraa trpA-päättäjän (8) ylimääräiset kopioinnin päättäjäketjut kohtaan Cla I saakka.

5 ii) Kappaleen M7 ligaatio plasmidissa pBF 158-02 T kohtien Spe I ja Bam HI väliin. Tällöin saadaan plasmidi pBF 158-03 T.

iii) Kappaleen M6 ligaatio plasmidissa pBF 158-03 T kohtien Κρη I ja Spe I väliin. 10 Tällöin saadaan plasmidi pBF 158-04 T.

iv) Kappaleen M5 ligaatio plasmidissa pBF 158-04 T kohtien Eag I ja Κρη I väliin. Tällöin saadaan plasmidi pBF 158-05 T.

15 v) Kappaleen M4 ligaatio plasmidissa pBF 158-05 T kohtien Sac I ja Eag I väliin. Tällöin saadaan plasmidi pBF 158-06 T.

Saaduista klooneista valitaan kulloinkin ne, jotka eroavat kulloinkin käytetystä läh-töplasmidista istutetun uuden kappaleen, jossa on oikea tarkastettu järjestys, suh-20 teen.

e) scu-PA-geeniä varten tarkoitettujen synteettisten kappaleiden M2 ja M3 istuttaminen, plasmidin pBF 158-08 T muodostaminen • · 25 Koska kappaleiden M2 ja M3 istuttamiseen tarvitaan pilkkomista Pst I -entsyymillä ja koska tähän saakka käytetyssä plasmidissa pBF 158 on vielä jäljellä Pst I -pilkkomiskohta (ampisilliinin vastustuskyvyn aikaansaavassa geenissä), joka häiritsee kloonaamista, niin istuttamisessa menetellään seuraavalla tavalla (kuviot 7a - 7c): 30 i) Kaupallisesti saatavasta (esim. yhtiöstä Pharmacia) plasmidista pUC 19 poistetaan moninkertainen koonauskohta sekä lisäksi 212 nukleotidiä ylävirran puolelta Nde I x Hind III-kappaleena. Muodostuvaan aukkoon ligatoidaan sitten plasmidista pBF 158-04-3 T saatu synteettinen moninkertainen kloonauskohta Nde I x Hind III -kappaleena. Tämä plasmidi pBF 158-04-3 T saadaan plasmidista pBF 158-02 T (vrt. 35 esimerkki Idi) istuttamalla siihen oligonukleotidikappale M6, ja se vastaa plasmidia pBF 158-04 T ilman kappaletta M7. Plasmidi transformoidaan E. coli K12 JM 103 -soluihin, joita viljellään 150 pg ampisilliinia/ml sisältävällä alustalla, minkä jälkeen 102386 13 valikoidaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pUC 19-04-3. Se eroaa plasmidista pUC 19 läsnäolevan, 712 nukleotidin pituisen Nde I x Hind III -kappaleen suhteen.

ii) Plasmidista pUC 19-04-3 poistetaan Pst I x Sac I -kappale, linearisoitu vektori S eristetään ja se ligatoidaan oligonukleotidikappaleen M3 kanssa. Plasmidi transformoidaan E. coli K12 JM 103 -soluihin, joita viljellään 150 pg ampisilliinia/ml sisältävällä alustalla, minkä jälkeen valikoidaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pUC 19-07. Se eroaa plasmidista pUC 19-04-3 189 nukleotidin pituisen Pst I x Sac I -kappaleen suhteen, joka sisältää järjestykseltään oikeanlaisen kappaleen M3.

10 iii) Edellä kuvatusta plasmidista pUC 19-07 poistetaan Nde I x Pst I -kappale ja muodostuneeseen aukkoon ligatoidaan M2-kappale. Plasmidi transformoidaan E. coli K12 JM 103 -soluihin, joita viljellään 150 μg ampisilliinia/ml sisältävällä alustalla, minkä jälkeen valikoidaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pUC 19-08. Se 15 eroaa plasmidista pUC 19-07 läsnäolevan, 246 emäsparin pituisen Nde I x Pst I -kappaleen M2 suhteen, jonka järjestys on todettu oikeaksi.

iv) Plasmidista pUC 19-08 poistetaan kappaleet M2 ja M3 Nde I x Sac I -kappaleena ja ne ligatoidaan plasmidista pBF 158-06 entsyymeillä Nde I x Sac I pilkkomalla 20 saatuun suurempaan osaan. Plasmidi transformoidaan E, coli K12 JM 103 -soluihin, joita viljellään 150 pg ampisilliinia/ml sisältävällä alustalla, minkä jälkeen valikoidaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pBF 158-08 T. Se eroaa plasmidista pBF 158-06 T läsnäolevan, 435 nukleotidin pituisen Nde I x Sac I -kappaleen suhteen.

25 f) Plasmidin pBF 160 muodostaminen, synteettisen Trp-promoottorin istuttaminen

Julkaisussa (9) kuvattu Trp-promoottorin ketju hyväksytään pilkkomiskohtaan Xba I saakka ja sitä pidennetäään 5-päästä ketjulla 5'-AATTCTGAAAT-3'. Tällä tavalla 30 saadaan muodostetuksi Eco Rl -pilkkomiskohta. (Kuvio 8, kappale Ml.) Erilliset juosteet 021 ja 02 IA liitetään toisiinsa ja ligatoidaan entsyymeillä Eco Rl x Xba I pilkottuun plasmidiin pBF 158-08 T (kuvio 9). Plasmidi transformoidaan E, coli K12 JM 103 -soluihin, joita viljellään 150 pg ampisilliinia/ml sisältävällä alustalla, minkä jälkeen valikoidaan ne kloonit, jotka sisältävät plasmidin pBF 160. Plasmidi 35 pBF 160 eroaa kaikista edellä kuvatuista lähtömuodoista siinä suhteessa, että sillä transformoidut E. coli -bakteerikannat saadaan ilmentämään rscu-PA:n esiastepro-teiinia indoliakryylihappoa lisäämällä.

102386 14 g) Ilmentämiskoe i) Fermentointi 5 Erilaisia, plasmidilla pBF 160 transformoituja E. coli -kantoja, esim. E. coli grt-1, E. coli K12 JM 103 sekä E. coli K12 ATCC 31446, fermentoidaan kulloinkin samoissa olosuhteissa alustassa, jonka koostumus on 38 mM ammoniumsulfaattia, 56 mM fosfaattipuskuria pH 7,0, 1 mM magnesiumsulfaattia, 1 % hiivauutetta, 1 % glukoosia, ja joka sisältää ampisilliinia 150 mg/1 ja rscu-PA:n esiasteproteiinin 10 ilmentyminen indusoidaan lisäämällä indoliakryylihappoa pitoisuudeksi 62 mg/1. Vertailun vuoksi edellä mainitut kannat transformoidaan eräällä edellä kuvatulla plasmidilla, joka sisältää eräästä cDNA-pankista saadun, Detroit 562 -solujen mRNA:sta (10) peräisin olevan, ihmisen prourokinaasin geenin, ja josta käytetään nimitystä pUK 54 trp 207-1, minkä jälkeen soluja fermentoidaan ja ilmentyminen 15 indusoidaan samoissa olosuhteissa.

Ennen indusoimista ja aina tunnin välein indusoituiin jälkeen, yhteensä kuuden tunnin ajan, yhdessä millilitrassa solususpensiota, jonka optinen tiheys (OD) on 1 aallonpituudella 578 nm, läsnäolevat solut erotetaan sentrifugoimalla ja niitä käy-20 tetään ilmentymisasteen testaamiseen.

ii) Esiasteproteiinin poimuttaminen takaisin rscu-PA:ksi, sen pilkkominen rtcu-PA:ksi ja aktiivisuuden mittaaminen 25 Sentrifugoimalla erotetut solut hajotetaan edellä kuvatusti lysotsyymillä, minkä jälkeen hajotettujen solujen homogenaattia käytetään edellä kuvatulla tavalla aktiivisuuden mittaamiseen.

Kuviossa 10 on esitetty rscu-PA.sta (saatu esiasteproteiinista) muodostuneen rtcu-30 PA:n aktiivisuusmittauksesta saadut ilmentymisasteet. Näistä tuloksista nähdään, että plasmidilla pBF 160 transformoiduissa E. coli -kannoissa ilmentyneet saannot olivat 10-15-kertaa suurempia kuin muuten samoissa, mutta kirjallisuuden perusteella tunnetulla plasmidilla pUK 54 trp 207-1 (10) transformoiduissa E. coli -kannoissa. Tämän lisäksi todetaan, että jokainen transformointiin käytetty plasmidi 35 tuotti kaikissa kannoissa suunnilleen yhtä suuren ilmentyneen saannon, toisin sanoen että erityisesti plasmidilla pBF 160 transformoiduissa kannoissa (riippumatta yksittäisestä E. coli -kannasta) päästiin aina monta kertaa suurempaan ilmentymisas- 102386 15 teeseen kuin muuten samoissa, mutta tunnetulla plasmidilla pUK 54 trp 207-1 transformoiduissa kannoissa.

Esimerkki 2 5 a) Ilmentämisplasmidin pBF 161 muodostaminen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten, käsittäen synteettisen scu-PA-geenin Trp-promoottorin säätelyn alaisuudessa 10 Plasmidi pBR 322 pilkotaan entsyymeillä Eco Rl ja Hind III. Muodostuva, 31 nukleotidin pituinen kappale erotetaan preparatiivisella elektroforeesilla agaroosi-geeliä käyttäen. Plasmidista pBR 322 jäljelle jäävä osa eluoidaan sähköisesti geelistä ja se puhdistetaan kromatografisesti DE 52:11a.

15 Myös plasmidi pBF 160 (esimerkki lf) pilkotaan entsyymeillä Eco Rl ja Hind III ja 1684 nukleotidin pituinen Eco Rl x Hind III -kappale, joka sisältää synteettisen scu-PA-geenin kaikkine säätely-yksikköineen (Trp-promoottori), erotetaan elektroforeet-tisesti agaroosigeelillä ja eluoidaan ja puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla.

20 Täten saadut kappaleet ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla ja transformoidaan sitten E. coli K12 JM 103 -kantaan. Sen jälkeen, kun soluja on viljelty 150 pg/ml ampisilliinia sisältävällä alustalla, ne kloonit valikoidaan, jotka sisältävät 1684 nukleotidin pituisen Eco Rl x Hind III -kappaleen, ja jotka tuottavat indoliak-ryylihapon lisäämisen jälkeen rscu-PA-esiasteproteiinia.

25 b) Ilmentämiskoe

Kannat E. coli GRT-1, E. coli K12 JM 103 ja E. coli K12 ATCC 31446 transformoidaan plasmidilla pBF 161, minkä jälkeen fermentointi toteutetaan ja ilmentymis-30 tulos määritetään esimerkissä lg) kuvatulla tavalla. rscu-PA-esiasteproteiinin saan-not määritettynä rtcu-PA-aktiivisuutena 1-6 tunnin jälkeen indusoinnista ovat vertailukelpoisia kuviossa 10 esitettyjen saantotulosten kanssa, jotka saatiin käyttäen transformointiin plasmidia pBF 160.

35 Analogisesti esimerkissä lgi) kuvatulla tavalla sentrifugoimalla saatu solukasauma voidaan hajottaa myös siten, että sitä keitetään 0,25 M Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, joka sisältää 4 % SDS, 1 % merkaptoetanolia ja 20 % glyseriiniä. Tällä tavalla 102386 16 irronneet proteiinit erotetaan SDS-PAGE-menetelmällä ja tehdään näkyviksi värjäämällä ne Coomassiesinisellä (12). Värjätyt geelit analysoidaan densitometrisesti ja piikkien alle jääneet pinta-alat integroidaan. Indoliakryylihapolla toteutetun indusoinnin jälkeen muodostuneen rscu-PA-esiasteproteiinin osuus lasketaan siten, 5 että ennen indusoimista esiasteproteiiniksi tunnistettujen vyöhykkeiden pinta-ala vähennetään indusoinnin jälkeen saadusta vastaavasta pinta-alasta. Kuvio 11 esittää E. coli K12 JM 103 -soluista saatujen proteiinien densitogrammia. Oheisessa esimerkissä rscu-PA-esiasteproteiinin osuus indusoinnin jälkeen on 17,9 paino-% bakteerin kokonaisproteiinista. Muita esimerkkejä on esitetty taulukossa 1.

10

Taulukko 1 rscu-PA-esiasteproteiinin osuus kokonaisproteiinissa (prosentteina)

Transformoitu plasmidilla 15 E. coli-kanta pBF 161 pUK54 trp 207-1 (10) K12 ATCC 31446 14 1,5 K12 JM 103 17,9 1,9 GRT-1 17,8 1,7 20 Esimerkki 3

Ilmentämisplasmidin muodostaminen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten, käsittäen synteettisen scu-PA-geenin Trp-promoottorin säätelyn alaisuudessa plasmidissa pBR 322, josta tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaava geeni on hävitetty 25 a) Plasmidin pBR 322 del muodostaminen

Plasmidi pBR 322 pilkotaan entsyymeillä Eco RV ja Nru I. Muodostuva, 787 nukleotidin suuruinen kappale poistetaan elektroforeettisesti agaroosigeelillä, plasmi-30 din pBR 322 loppuosa eluoidaan geelistä sähköisesti ja puhdistetaan DE 52:11a. Plasmidin pBR 322 Eco RV x Nru I -loppuosan tylpät päät ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla. Sen jälkeen, kun plasmidi on transformoitu E. coli K12 JM 103 -soluihin ja kun soluja on viljelty ampisilliinia pitoisuutena 150 pg/ml sisältävällä alustalla, ne kloonit valikoidaan, joista klooneista otettu näyte ei kasva tetrasykliiniä 35 pitoisuutena 25 pg/ml sisältävällä alustalla sille siirtämisen jälkeen, eli ne, joilla ei ole tetrasykliinin vastustuskykyä. Nämä kloonit sisältävät plasmidin pBR 322 del, 102386 17 joka eroaa plasmidista pBR 322 siinä suhteessa, että se on 787 nukleotidiä pienempi kuin pBR 322 eikä sitä voida pilkkoa enää entsyymeillä Eco RV eikä Nru I.

b) Plasmidin pBF 162 muodostaminen 5 pBR 322 del pilkotaan entsyymeillä Eco Rl ja Hind III. Muodostuva, 31 nukleotidin pituinen kappale erotetaan preparatiivisella elektroforeesilla agaroosigeeliä käyttäen, pBR 322 dekin loppuosa poistetaan geelistä sähköisesti eluoimalla ja se puhdistetaan DE 52:11a.

10

Plasmidista pBF 160 otetaan talteen samalla tavalla 1684 nukleotidin pituinen Eco Rl x Hind III -kappale, joka sisältää synteettisen scu-PA-geenin kaikkine säätely-yksikköineen (Trp-promoottori).

15 Nämä kummatkin kappaleet ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla ja transformoidaan sitten E. coli K12 JM 103 -soluihin. Sen jälkeen, kun soluja on viljelty ampisilliinia pitoisuutena 150 μg/ml sisältävällä alustalla, ne kloonit valikoidaan, jotka sisältävät 1684 emäsparin pituisen Eco Rl x Hind III -kappaleen, ja jotka tuottavat rscu-PA-esiasteproteiinia sen jälkeen, kun alustaan on lisätty 62 pg/ml indoli-20 akryylihappoa. Nämä kloonit sisältävät plasmidin pBF 162.

c) Ilmentämiskoe E. coli GRT-1 transformoidaan plasmidilla pBF 162, minkä jälkeen fermentointi 25 toteutetaan ja ilmentymistulokset määritetään esimerkissä lg) kuvatulla tavalla. Kuusi tuntia indusoinnin jälkeen rtcu-PA-aktiivisuutena määritetty rscu-PA-esiaste-proteiinin saanto on 1300 PU millilitrassa solususpensiota, jonka optinen tiheys on 1, ja se on vertailukelpoinen kuviossa 10 esitettyjen saantotulosten kanssa, jotka on saatu ilmennettäessä plasmidilla pBF 160 transformoiduissa E. coli GRT-1 -soluis-30 sa.

102386 18

Esimerkki 4 a) Ilmentämisplasmidin pBF 171 muodostaminen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten, käsittäen synteettisen scu-PA-geenin Tac-promoottorin säätelyn alai- 5 suudessa

Plasmidi pBF 161 pilkotaan entsyymeillä Eco Rl ja Xba I. Muodostuva, 74 nukleotidin pituinen kappale erotetaan preparatiivisella elektroforeesilla agaroosigeeliä käyttäen, plasmidin loppuosa eluoidaan sähköisesti ja puhdistetaan DE 52:11a. Plas-10 midista ptac SDT (DSM 5018) eristetään Eco Rl x Xba I -kappale, joka sisältää Tac-promoottorin. Tätä tarkoitusta varten ptac SDT pilkotaan entsyymeillä Eco Rl x Xba I ja kappale erotetaan preparatiivisella PAGE-menetelmällä. Tämä kappale eluoidaan mekaanisesti hienonnetusta polyakryyliamidista kuumentamalla 65 °C:n lämpötilaan ammoniumasetaatti/SDS-puskurissa, pH 8,0, ja puhdistetaan uuttamalla 15 moneen kertaan fenolilla, joka on kyllästetty 1 M Tris-puskurilla, pH 8.

Nämä molemmat saadut kappaleet ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla ja transformoidaan sitten E. coli K12 JM 103 -kantaan. Sen jälkeen, kun soluja on viljelty ampisilliinia pitoisuutena 150 pg/ml sisältävällä alustalla, ne kloonit valikoi-20 daan, jotka tuottavat rscu-PA-esiasteproteiinia IPTG:n lisäämisen jälkeen. Nämä kloonit sisältävät plasmidin pBF 171.

b) Ilmentämiskoe 25 E. coli K12 JM 103 transformoidaan plasmidilla pBF 171, minkä jälkeen fermen-tointi toteutetaan ja ilmentymistulokset määritetään esimerkissä lg) kuvatulla tavalla. Indusoiminen toteutetaan kuitenkin yhdisteellä IPTG (loppupitoisuus 0,5 mM).

Kuviossa 12 on esitetty 1-6 tuntia indusoinnin jälkeen rtcu-PA-aktiivisuutena määri-30 tetyt rscu-PA-esiasteproteiinin saannot. Ne ovat vertailukelpoisia kuviossa 10 esitet-tyjen saantotulosten kanssa, jotka saatiin käyttäen plasmidia pBF 160 samassa E, coli -kannassa.

102386 19

Esimerkki S

a) Ilmentämisplasmidin pBF 172 muodostaminen rscu-PA:n esiasteproteiinia varten, käsittäen synteettisen scu-PA-geenin Tac-promoottorin säätelyn alaisuudessa plas- 5 midissa pBR 322, josta tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaava geeni on hävitetty. Plasmidi pBR 322 del (ks. esimerkki 3 a) pilkotaan entsyymeillä Eco Rl x Hind III. Muodostuva, 31 nukleotidin pituinen kappale erotetaan preparatiivisella elektroforeesilla agaroosigeeliä käyttäen, pBR 322 del.n loppuosa poistetaan geelistä sähköisesti eluoimalla ja se puhdistetaan sitten DE 52:11a.

10

Plasmidista pBF 171 (esimerkki 4a) otetaan talteen samalla tavalla Eco Rl x Hind III -kappale, joka sisältää synteettisen scu-PA-geenin kaikkine säätely-yksikköineen (T ac-promoottori).

15 Nämä kummatkin saadut kappaleet ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla ja transformoidaan sitten E. coli K12 JM 103 -soluihin. Sen jälkeen, kun soluja on viljelty ampisilliinia pitoisuutena 150 pg/ml sisältävällä alustalla, ne kloonit valikoidaan, jotka tuottavat rscu-PA-esiasteproteiinia kun läsnä on 0,5 mM IPTGrtä. Nämä kloonit sisältävät plasmidin pBF 172.

20 b) Ilmentämiskoe E, coli K12 JM 103 transformoidaan plasmidilla pBF 172, minkä jälkeen fermen-tointi toteutetaan ja ilmentymistulokset määritetään esimerkissä lg) kuvatulla taval-25 la. Indusoiminen toteutetaan kuitenkin yhdisteellä IPTG (loppupitoisuus 0,5 mM). 1-6 tuntia indusoinnin jälkeen rtcu-PA-aktiivisuutena määritetyt rscu-PA-esiaste-proteiinin saannot ovat noin 1100 PU/ml solususpensiota, jonka optinen tiheys on 1, ja ne ovat vertailukelpoisia kuviossa 10 esitettyjen saantotulosten kanssa, jotka saatiin käyttäen plasmidia pBF 160 samassa E. coli -kannassa.

30

Esimerkki 6

Shine-Dalgamo-ketjun ja aloituskodonin välisen etäisyyden muuttaminen rscu-PA-esiasteproteiinin ilmentämisplasmidissa 35

Kaikissa esimerkeissä 1-5 kuvatuissa muodosteissa aloituskodoni on Nde I -pilkko-miskohdan -CATATG- osa. Nde I katkaisee tämän heksanukleotidiketjun sen 102386 20 ensimmäisen A:n jälkeen, jolloin saadaan 5-päitä, joissa on kaksi paritonta emästä. Kim 3'-pää täytetään, eli kun muodostetaan tylppiä päitä, ja kun ketju ligatoidaan sitten uudestaan, niin kyseinen ketju on saatu 2 emäsparia pidemmäksi. Samalla Nde I -kohta on hävinnyt. Kuten kuviosta 13 nähdään, siinä esitetyssä esimerkissä S.D.-5 ketjun välimatka aloituskodoniin pidennetään 8:sta lO.ksi emäspariksi. Kokeellinen toteutus on kuvattu seuraavassa esimerkin omaisesti: a) Plasmidin pBF 163 muodostaminen 10 Plasmidi pBF 161 pilkotaan entsyymillä Nde I, minkä jälkeen irralliset päät täytetään DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaleella (2). Sitten Tämä DNA ligatoidaan tavalliseen tapaan T4-ligaasilla ja transformoidaan E. coli K12 JM 103 -soluihin. Ampisilliinia sisältävällä alustalla viljelyn jälkeen ne kloonit valikoidaan, jotka sisältävät plasmidin pBF 163. Se eroaa plasmidista pBF 161 siinä suhteessa, että 15 siitä puuttuu Nde I -kohta ja että se käsittää ylimääräiset emäkset -TA- aikaisemman Nde I -kohdan alueella (vrt. kuvio 13).

b) Ilmentämiskoe 20 E. coli GRT-1 transformoidaan plasmidilla pBF 163, minkä jälkeen fermentointi toteutetaan ja ilmentymistulokset määritetään esimerkissä lg) kuvatulla tavalla. Kuviossa 14 on esitetty rscu-PA-esiasteproteiinin saannot 1-6 tuntia 62 mg.lla indo-liakryylihappoa/1 toteutetun indusoinnin sekä sen jälkeen, kun proteiini on poimutettu uudestaan ja aktivoitu rtcu-PA-aktiivisuudeksi/ml solususpensiota, jonka optinen 25 tiheys on 1. Ne ovat vertailukelpoisia kuviossa 10 esitettyjen saantotulosten kanssa, jotka saatiin käyttäen plasmidia pBF 160 samassa E. coli -kannassa.

102386 21

Kirjallisuusviitteet ( 1) Winnacker, E.L.: "Gene und Klone"; VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1985, s. 298.

5 ( 2) Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: "Molecular Cloning", A Laboratory

Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982.

(3) Hanahan, I.: "DNA cloning", voi. I, toim. D.M. Glover, IRL Press, Oxford 1985, s. 109-135.

10 (4) Wilhelm, M., Hollenberg, C.P.: Nucl. Acids Res., 13, 5717-5722 (1985).

( 5) Jorgensen, R.A., Reznikoff, W.S.: J. Bacteriol., 138, 705-714 (1979).

15 (6) Schollmeier, K., Gärtner, D., Hiilen, W.: Nucl. Acids Res., 13, 4227-4237 (1985).

(7) Adams, S.P., Kavka, K.S., Wykes, E.I., Holder, S.B., Gallupi, G.R.: J. Am. Chem. Soc., 105, 661-663 (1983).

20 ( 8) Christie, G.E., Famham, P.J., Platt, T.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4180-4184(1981).

(9) De Boer, H.A., Comstock, L.J., Vasser, M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 25 21-25(1983).

(10) Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gunzler, W.A., Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: Biotechnol., 3, 923-929 (1985).

30 (11) Winkler, M.E., Blaber, M.:Biochem., 25, 4041-4045 (1986).

(12) Blakesley, R.W., Boezi, J.A.: Anal. Biochem., 82, 580-582 (1977).

Claims (16)

102386 22

1. Plasmider för användning vid framställning av en plasminogenaktivator, kän-netecknade av att deras operon uppvisar en Trp- eller Tac-promotor som reglerbar promoter, en som ribosombindningsställe verksam Shine-Dalgamo-sekvens, pä avständ av 6 tili 12 nukleotider frän Shine-Dalgamo-sekvensen en startkodon, en syntetisk strukturgen för den 411 aminosyrarester-innehällande enkedjiga urinplas-minogenaktivatom "scu-PA", i vilken som kodoner används för arginin tripletten CGT, för leucin tripletten CTG, för valin tripletten GTT, för prolin tripletten CCG och/eller för glycin tripletten GGT, och nedströms strukturgenen en eller tvä termi-natorer, valda ur gruppen trp A-terminator och/eller tet A/orf L-terminator ur Tn 10, och att de är lämpliga för rscu-PA-prekursorprotein-expression i stammen av Escherichia coli som hör till undergruppen K12.

1. Plasmidit plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, tunnetut siitä, että niiden operoni käsittää säädettävänä promoottorina Trp- tai Tac-promoottorin, ribosomien sitoutumiskohtana toimivan Shine-Dalgamo-sekvenssin, 6-12 nukleotidin päässä Shine-Dalgamo-sekvenssistä sijaitsevan aloituskodonin, 411 aminohappojäännöstä sisältävän yksiketjuisen, virtsasta peräisin olevan plasminogeeniaktivaattori "scu-PA":n synteettisen rakennegeenin, jossa arginiinin kodonina käytetään triplettiä CGT, leusiinin kodonina triplettiä CTG, valiinin kodonina triplettiä GTT, proliinin kodonina triplettiä CCG ja/tai glysiinin kodonina triplettiä GGT, sekä alavirran puolella tästä rakennegeenistä yhden tai kaksi päättäjää, jotka ovat trp A-päättäjä ja/tai tet A/orf L-päättäjä Tn 10:stä, ja että niitä voidaan käyttää rscu-PA-esiastepro-teiinin ilmentämiseksi alaryhmään K 12 kuuluvassa Escherichia coli -kannassa.

2. Plasmider enligt patentkrav 1, kännetecknade av att avstandet mellan Shine-Dalgamo-sekvensen och startkodonen uppgär till 8 tili 10 nukleotider.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että Shine-Dalgamo-ketjun ja aloituskodonin välinen etäisyys on 8-10 nukleotidiä.

3. Plasmider enligt patentkrav 1, kännetecknade av att den reglerbara promotom är en syntetisk Trp-promotor med nukleotidsekvensen enligt Figur 8.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että säädettävä promoottori on synteettinen TRP-promoottori, jolla on kuvion 8 mukainen nukleotidi-ketju.

4. Plasmider enligt patentkrav 1, kännetecknade av att den reglerbara promotom är Tac-promotom ur plasmiden ptac SDT (DSM 5018). 102386 25

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että säädettävä promoottori on Tac-promoottori plasmidista ptac SDT (DSM 5018).

5. Plasmider enligt patentkrav 1-4, kännetecknade av att strukturgenen har nuk-leotidsekvensen enligt figur 15.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että rakennegeenil-lä on kuvion 15 mukainen nukleotidiketju.

6. Plasmider enligt patentkrav 1-5, kännetecknade av att de har operonen i plasmiden pBR 322, Mn vilken nic/bom-regionen avlägsnats.

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että ne sisältävät operonin plasmidissa pBR 322, josta nic/bom-alue on poistettu. *

7. Plasmider enligt patentkrav 1-6, kännetecknade av att de har operonen i plasmiden pBR 322, fran vilken tetracyklinresistensgenen helt eller delvis sa längt avlägsnats att E. coli K12-stammar som transformerats med plasmiden inte kan uppvisa tetracyklinresistens.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että ne sisältävät operonin plasmidissa pBR 322, josta tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaava geeni on poistettu täydellisesti tai osittain siten, ettei tämä plasmidi saa aikaan sillä transformoiduissa E. coli K 12 -kannoissa tetrasykliinin vastustuskykyä.

8. Plasmider enligt patentkrav 1-7, kännetecknade av att de har operonen i plasmiden pBR 322, ur vilken nic/bom-regionen och minst en sadan del av tetracyklinresistensgenen avlägsnats, att med plasmiden transformerade E. coli K12-stammar inte kan uppvisa tetracyklinresistens.

8. Patenttivaatimusten 1-7 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että ne sisältävät operonin plasmidissa pBR 322, josta on poistettu nic/bom-alue ja vähintään sellai 102386 23 nen osa tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavasta geenistä, ettei tämä plasmidi saa aikaan sillä transformoiduissa E. coli K 12 -kannoissa tetrasykliinin vastustuskykyä.

9. Som plasmider enligt patentkrav 1-3, plasmidema pBF 160 med restriktions-kartan enligt figur 9, pBF 161, framställd säsom beskrivits i exempel 2, pBF 162, framställd säsom beskrivits i exempel 3, och pBF 163, framställd säsom beskrivits i exempel 6.

9. Patenttivaatimusten 1-3 mukaisina plasmideina plasmidit pBF 160, jolla on kuvion 9 mukainen restriktiokartta, pBF 161, joka on valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 2, pBF 162, joka on valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 3, ja pBF 163, joka on valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 6.

10. Som plasmider enligt patentkrav 1-4, plasmidema pBF 171, framställd säsom beskrivits i exempel 4 och pBF 172, framställd säsom beskrivits i exempel 5.

10. Patenttivaatimusten 1-4 mukaisina plasmideina plasmidit pBF 171, joka on valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 4, ja pBF 172, joka on valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 5.

11. Plasmider enligt patentkrav 1-10, kännetecknade att de ästadkommer bildning av rscu-PA-prekursorproteinet med en expressionsnivä av minst 10 viktprocent, företrädesvis av minst 14 viktprocent av det bildade totalproteinet.

11. Patenttivaatimusten 1-10 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että ne johtavat rscu-PA-esiasteproteiinin muodostumiseen siten, että proteiinin ilmentymisaste on vähintään 10 paino-%, edullisesti vähintään 14 paino-%, muodostuneesta kokonais-proteiinista.

12. Plasmider enligt patentkrav 1-11, kännetecknade att de ästadkommer bildning av rscu-PA-prekursorproteinet med en expressionsnivä av 10 till 25 viktprocent, särskilt av 14 till 20 viktprocent av det bildade totalproteinet. 102386 26

12. Patenttivaatimusten 1-11 mukaiset plasmidit, tunnetut siitä, että ne johtavat rscu-PA-esiasteproteiinin muodostumiseen siten, että proteiinin ilmentymisaste on 10-25 paino-%, erityisesti 14-20 paino-% muodostuneesta kokonaisproteiinista.

13. Förfarande för framställning av plasmider enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man i plasmiden pBR 322, ur vilken nic/bom-regionen och/eller minst en andel av tetracyklinresistensgenen avlägsnats, mellan klyvningsställena Eco Rl och Hind III inför ett multikloningssite med den i figur 2 angivna nukleotidsekvensen, vilken mellan klyvningsställena Xba I och Nde I innehäller Shine-Dalgamo-sekven-sen och pä ett avständ av 6 tili 12, företrädesvis 8 tili 10 nukleotider startkodonen ATG, och med hjälp av multikloningssitet pä i och för sig känt sätt bygger in i plasmiden transkriptionsterminator, de syntetiska delsekvensema av scu-PA-struk-turgenen, företrädesvis böijande frän 3'C-terminalen hos strukturgenen, samt en syntetisk Trp-promotor.

13. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten plasmidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että plasmidiin pBR 322, josta on poistettu nic/bom-alue ja/tai vähintään osa tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavasta geenistä, istutetaan pilkkomiskoh-tien Eco Rl ja Hind III väliin moninkertainen kloonauskohta, jonka nukleotidiketju on kuvion 2 mukainen, joka nukleotidiketju sisältää pilkkomiskohtien Xbal ja Ndel välissä Shine-Dalgamo-sekvenssin ja 6-12, edullisesti 8-10 nukleotidin päässä aloi-tuskodonin ATG, ja jonka moninkertaisen kloonauskohdan avulla plasmidiin istutetaan sinänsä tunnetulla tavalla transkription päättäjä, scu-PA-rakennegeenin syn-teettiset osaketjut, alkaen edullisesti rakennegeenin 3'C-päätteestä, sekä synteettinen Trp-promoottori.

14. Förfarande för framställning av plasmider enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man pä i och for sig känt sätt inför Eco Rl x Hind ΙΙΙ-fragmentet ur en enligt patentkrav 13 erhällen plasmid som expressionskassett i en annan i undergruppen E. coli K12 autonom förökningsbenägen plasmid.

14. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten plasmidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 13 mukaisesti saadusta plasmidista peräisin oleva Eco Rl x Hind III -kappale istutetaan ilmentämiskasettina sinänsä tunnetulla 102386 24 tavalla toiseen plasmidiin, joka kykenee lisääntymään autonomisesti alaryhmään K 12 kuuluvassa E. coli -bakteerissa.

15. Förfarande för framställning av plasmider enligt patentkrav 1 och 2, kännetecknat av att man klyver en enligt patentkrav 13 eller 14 erhällen plasmid med Nde I, ifyller de resulterande klyvningsställena och ligerar sedan de uppkomna blunt-ändama.

15. Menetelmä patenttivaatimusten 1 ja 2 mukaisten plasmidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukaisesti saatu plasmidi pilkotaan Nde 1:11a, tuloksena olevat pilkkoutumiskohdat täytetään, minkä jälkeen muodostuvat tylpät päät ligatoidaan.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukaisen plasmidin käyttö plasminogeeni-aktivaattorin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että tällä plasmidilla transformoidaan sinänsä tunnetulla tavalla alaryhmään K 12 kuuluva E. coli -kanta, scu-PA-rakenne-geenin ilmentyminen indusoidaan, muodostunut rscu-PA-esiasteproteiini erotetaan alustasta ja hajotetuista bakteerisoluista, esiasteproteiini tehdään liukoiseksi ja poimutetaan sitten uudestaan rscu-PA.ksi hapetus-pelkistys-järjestelmän avulla.

16. Användning av en plasmid enligt patentkrav 1-12 vid framställning av en plasminogenaktivator, kännetecknad av att man transformerar med plasmiden en understam K12 av E. coli, pä i och för sig känt sätt, inducerar expression av scu- «- * PA-strukturgenen, avskiljer det bildade rscu-PA-prekursorproteinet frän medium och de lyserade bakteriecellema, solubiliserar prekursorproteinet och äterveckar genom inverkan av ett redoxsystem tili rscu-PA.