NO304952B1

NO304952B1 - Plasmider for anvendelse ved fremstilling av en plasminogenaktivator og anvendelse av plasmidet

Info

Publication number: NO304952B1
Application number: NO902720A
Authority: NO
Inventors: Regina E Brigelius-Flohu; Leopold Flohu; Wolfgang Hillen; Gerd J Steffens; Wolfgang Strassburger; Martin R F Wilhelm
Original assignee: Gr Nenthal Gmbh
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1999-03-08
Also published as: YU134790A; HRP920596B1; FI102386B; DE4020438A1; AU5883290A; FI903640A0; KR0167761B1; RU2073720C1; ATE131534T1; JPH0365189A; PL166199B1; LV10120A; JP3236284B2; FI102386B1; PT94776B; US5637503A; LTIP776A; DD298426A5; HRP920596A2; HU903970D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører plasmider for anvendelse ved fremstilling av en plasminigenaktivator og anvendelse av plasmidene.

Ved behandling av tetning i kar med fibrin som for eksempel hjerteinfarkt, lungeembolier, arterielle tetningssykdommer i ekstrimetetene og så videre, spiller plasminogenaktivatorer en viktig rolle. Siden begynnelsen av 50-årene er det kjent at det i urin fra mennesker eksisterer et proteolytisk enzym som bevirker omdanning av plasminogen til plasmin, det vil si at enzymet, som bevirker spaltning av fibrin til løselige polypeptider og dermed oppløsning av gjennom fibrinbetinget tetning. Denne plasminogenaktivatoren ble betegnet urokinase, og det er blitt vist at det sannsynligvis eksisterer forskjellige urokinaseformer. Alle disse formene er direkte avledet fra samme forløpermolekyl, som siden omtrent midten av 70-årene er kjent som zymogen prourokinase. Etter at det ble klarlagt at denne prourokinasen har en enkjedet struktur ble den betegnet som scu-PA ("single chain urinary plasminogen activator"). Denne scu-PA består av 411 aminosyrer og er i naturlig forekommende form glykosilert ved aminosyre 302.

Gjennom forskjellige arbeider er den genteknologiske fremstillingen av uglykosilert proteindelen til scu-PA kjent, betegnet som "rscu-PA" (rekombinant scu-PA), eller også betegnelsen "Saruplase". Ved terapeutisk tilsetning av rscu-PA er det blitt vist at den er overlegen med hensyn på virkning og tålbarhet i forhold til konvensjonelle fibrino-lytiske midler (jfr. Lancet 1989, sidene 863-868).

For fremstilling av uglykosilert plasminogenaktivator rscu-PA blir prokarioter anvendt, som det også er blitt angitt i litteraturen. De lenge kjente fremgangsmåtene for fremstilling for rscu-PA er basert på ekspresjonen av den gjennom menneskelig vev isolerte strukturgene til rscu-PA. Det ble derimot bare oppnådd små ekspresjonshastigheter, som ikke muliggjør økonomisk fremstilling av ønsket produkt i større mengder. Hibino et al. 1 Agrlc. Biol. Chem. 52, 329-336

(1988) beskriver eksempelvis for rscu-PA produksjon i E. coli bare en 2$ ekspresjonshøyde, målt på totalproteinet til bakteriene. Derimot blir det i europeisk patentsøknad 92 182 A2 samt av Holmes et al. (10) ikke angitt nøyaktig oppnådd ekspresjonshastigheter. Etter bearbeidning av disse angivelsene ble derimot i forskjellige stammer oppnådd mindre enn 2% rscu-PA fra bakterieproteinene.

Det er å bemerke at, som i de fleste tilfellene av ekspresjon av eukariotiske proteiner i bakterier, også scu-PA oppnås i celler som denaturerte innslutningsformer, som nedenfor er betegnet som "forløperprotein", som etter intermediær isolering må bli foldet tilbake proteinkjemisk til riktig tertiær struktur for rscu-PA. Det slik isolerte produktet kan deretter for bestemming av dannet rscu-PA mengde for eksempel gjennom tilsetning av plasmin bli overført til tokjedet uglykosilert urokinase ("rtcu-PA") det enzymatiske aktiviteten bestemt å tjene som mål for dannet mengde rscu-PA. Naturligvis kan man beregne utbytte av forløperprotein henholdsvis rscu-PA og dermed også ekspresjonshastigheten for eksempel med densitometrisk vurdering av gelelektroforesisk separering av totalproteinene.

Det ble nå overraskende oppdaget at bakteriene transformert med plasmidene ifølge oppfinnelsen tilveiebragte en mange ganger høyere ekspresjonshastighet enn de identiske verts-stammene transformert med fra teknikkens stand kjente plasmider. Plasmidene ifølge oppfinnelsen er dermed bedre enn alle fra før kjente plasmider for isolering av rscu-PA henholdsvis forløperproteinet derav. Det kan derimot også nevnes, at på i seg selv kjent måte ved hjelp av ovennevnte for analytisk formål oppnådd spalting av rscu-PA, eksempelvis med plasmin, også rtcu-PA kan oppnå i teknisk målestokk, idet rscu-PA gjennom foreliggende oppfinnelse er blitt lett tilgjengelig.

Plasmidene ifølge oppfinnelsen er videre fremhevet ved at deres operon oppviser en regulerbar, eventuelt syntetisk promoter, en for ribosombindingssted virksom Shine-Dalgarno-sekvens, et startkodon, et syntetisk strukturgen for rscu-PA og nedstrøms for strukturgenet minst en terminator. Fortrinnsvis foreligger to på hverandre følgende terminatorer hvor det spesielt dreier seg om trp A terminatoren og/eller tet A/orf L terminatoren fra Tn 10, ifølge Schollmeier et al. (6).

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig plasmider for anvendelse ved fremstilling av en plasminogenaktivator, kjennetegnet ved at operonet opviser Trp-promoteren med nucleotidsekvensen ifølge fig. 8 eller Tac-promoteren fra plasmidet ptac SDT (DSM 5018) som regulerbar promoter, en som ribosom-bindende Shine-Dalgarno-sekvens, i en avstand på 8-10 nukleotider til Shine-Dalgarno-sekvensen et startkodon, det syntetiske strukturgenet for 411 aminosyrerester inneholdende en-kjedet urin-plasminogenaktivator "scu-PA" med nukleotidsekvens ifølge fig. 15, i det det som kodoner for arginin anvendes triplett CGT, for leucin triplett CTG, for valin triplett GTT, for prolin triplett CCG og/eller for glycin triplett GGT, og nedstrøms for strukturgenet en eller to terminatorer, valgt fra gruppen trp A-terminator og/eller tet /orf L-terminator fra Tn 10, og de for rscu-PA-forløps-protein-ekspresjon er undergruppen K 12 egnet i Escherichia coli .

Det er også beskrevet anvendelse av et peptid ifølge kravene ved fremstilling av en plasminogenaktivator, kjennetegnet ved at man transformerer plasmidet i en stamme av E.coli fra undergruppen K 12 på i seg selv kjent måte, induserer ekspresjonen til scu-PA-strukturgenet, separerer dannet rscu-PA-f orløperprotein fra mediet og de lyserte bakteriecellene, oppløser forløperproteinet og deretter blir det foldet tilbake til rscu-PA ved innvirkning av et Redox-system.

I den regulerbare promoteren dreier det seg spesielt om trp-promoteren eller Tac-promoteren.

I kontrollregionen til plasmidene ifølge oppfinnelsen utgjør avstanden mellom Shine-Dalgarno-sekvensen og startkodonet 6-12, fortrinnsvis 8-10 nukleotider.

For konstruksjon av innskutte strukturgener ifølge plasmidene i oppfinnelsen blir fortrinnsvis de i følgende tabell oppførte basesekvenser som koder for vanlige aminosyrer innbefattet. Derfor må alle disse trekkene ikke samtidig være oppfylt i strukturgenet.

Det er derimot hensiktsmessig ved oppbygning av strukturgenet å unngå anvendelse av følgende kodoner for de nevnte aminosyrene (idet disse trekkene ikke behøver å være oppfylt for alle aminosyrene):

Gjennom de ifølge oppfinnelsen valgte kodonene for de enkelte aminosyrene i strukturgenet, som overnevnte kontroll- region blir dannelsen av stabile sekundærstrukturer mellom strukturgenet og kontrollregionen vesentlig forhindret.

For oppnåelse av det syntetiske strukturgenet blir først oligonukleotidene i deler på 40-80 baser enkelttrådig syntetisert. De blir fortrinnsvis fremstilt i 1 >jmol-målestokk ifølge fastfasemetodene til Adams et al. (7) ved hjelp av en DNA-synthesizer (Modell Biosearch 8600 fra firma New Brunswick Scientific Co.). Som monomerinnstilling anvendes handelsoppnåelig g<->cyanoetyl-beskyttet diisopropyl-amino-fosforamidit av nødvendige desoksyribonukleosid. Etter avspaltning av bærer blir de endestående enda tritylbeskytt-ede trådene avsaltet under sterile betingelser gjennom gelfiltrering og på forhånd renset og deretter i to omganger underkastet en første separering gjennom "revers fase"-HPLC. Hovedproduktet blir detritylert og gir etter to ytterligere revers-fase-HPLC-rensningstrinn det ønskede oligonukleotid med høy renhet, som gelelektroforetisk analyse (PAGE) viser.

Fra grupper på 4 til 9 av disse enkelttrådene blir deretter ca. 200 nukleotider lange dobbelttrådede fragmenter oppnådd fra disse, idet man fosforylerer de ikke-endestående enkelttrådede oligonukleotidene ved 5'-enden og sammensmelter og legerer komplementærtrådene sammen med ende-stående oligonukleotider. Etter ligering blir de dannede klonings-dyktige dobbelttrådede fragmentene satt inn i egnede lineriserte vektorer. Ytterligere fremgangsmåter fremkommer fra nedenfor angitte eksempler.

De i foreliggende beskrivelse anvendte forkortelsene har følgende betydninger:

bp: Basepar

DE 52: Anionbytter fra firmaet Whatman

EDTA: Etylendiamintetraeddiksyre

IPTG: Isopropyl-e-D-tiogalaktopyranosid

PAGE: Polyakrylamidgelelektroforese

PU: Ploug enheter

SDS: Natriumdodecylsulfat

S.D.-sekvens: Shine-Dalgarno-sekvens

Tris-HCl: Trishydroksymetylaminometan-hydroklorid Tween-80: Polyetylenoksyd(20)sorbitanmonooleat

For konstruksjon av plasmidene ifølge oppfinnelsen begynner man fortrinnsvis fra i handelen oppnåelig plasmid pBR 322 (4363 bp). Fortrinnsvis blir nic/bom-regionen og/eller tetracyklinresistensgenet eliminert fra disse. Det er derimot ikke nødvendig å fjerne tetracyklinresistensgenet fullstendig, idet det er tilstrekkelig, at dette bare skjer slik at plasmidet som er transformert med bakteriestammene ikke tilveiebringer tetracyklin-resistens. Gjennom disse trinnene (fjerning av nic/bom-regionen og minst en del av tetracyklinresistensgenet) oppnår man et såkalt "høysikker-hetsplasmid".

Den foretrukne strategien for konstruksjon av ett plasmid ifølge oppfinnelsen, med utgangspunkt av overnevnte modifi-serte plasmid pBR 322 (eller et annet av ovenfor før kjente plasmider), omfatter neste trinnet innføring av et syntetisk "multi klonings sete" mellom spaltningssete EcoRI og Hind III. Dette multi kloningssetet (jfr. fig. 2) utviser en fastlagt rekkefølge av spaltningsseter, idet mellomliggende baser er valgt vilkårlig med unntagelse av sekvensen mellom Xba I og Nde I, som inneholder ribosombindingssete (Shine-Dalgarno-sekvensen) fra B. subtilis Xyl Operon 5'-AAGGAG-3'(4) samt en fastlagt avstand mellom S.D.-sekvensen og startkodonet ATG. De på S.D.-sekvensen følgende basene GAAAT er innbefattet gjennom (4) og forbundet med CATATG, et Nde I spaltningssete, dermed utgjør avstanden mellom S.D.-sekvensen og ATG 8 basepar. Avstanden mellom de enkelte spaltningssetene til multi kloningssetet skal av kloningstekniske grunner være minst ca. 20 nukleotider langt, idet fjerning av mellomfragmentene blir gjort lettere.

Ved hjelp av dette multikloningssetet blir det innført i plasmidet spaltningsseter som hensiktsmessig etter innføring av en transkripssjoneterminator, muliggjør den etter hverandre følgende innføring av delsekvenser til scuPA-strukturgenet, fortrinnsvis begynnende fra C-terminal ende til det tilstrebende proteinet, også fra 3'-terminale enden til DNA-tråden til fremstillende strukturgenet, samt innføring av for eksempel en syntetisk eller også en fra et av de andre plasmidene isolerte eller handelsmulige Trp-promoterene. Den fullstendige nukleotidsekvensen til det slik oppnåelige scu-PA-strukturgenet er med angivelse av de enkelte kodonene tilsvarende aminosyrene angitt i fig. 15.

Andre plasmider ifølge oppfinnelsen kan fremstilles fra et av ovennevnte konstruerte plasmid, for eksempel idet man gjennom spaltning med Eco RI og Hind III oppnår det syntetiske scu-PA-strukturgenet med alle reguleringsenheter og deretter i en annen, i enterobakteriacen, spesielt i E. coli innfører autonom formeringsdyktig plasmid, som gjennom spaltning med ECo RI og Hind III blir linearisert og forkortet. På i prinsippet lik måte, men under anvendelse av spaltningssetet Eco RI og Xbal er det også mulig å bytte Trp-promoteren mot Tac-promoteren (og omvendt) i et av plasmidene ifølge oppfinnelsen.

På analog måte kan man også gå ut ifra andre kjente plasmider, som inneholder enkeltvise Eco RI- og Hind III spaltningssteder, som eksempelvis pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 og andre.

Plasmider ifølge oppfinnelsen med en forlenget avstand mellom Shine-Dalgarno-sekvensen og startkodonet ATG er mulig å oppnå, idet man et som overfor beskrevet konstruert plasmid, hvor nevnte avstand utgjør for eksempel 8 nukleotider, spalter med Nde I, fyller opp det resulterende spaltningssetet og legerer til slutt den endestående butte enden, idet et plasmid ifølge oppfinnelsen blir dannet, hvor avstanden mellom S.D.-sekvensen og start-kodonet for eksempel utgjør 10 nukleotider.

Som angitt oppnås med bakterier transformert med plasmidene ifølge oppfinnelsen en mange ganger høyere ekspressjonshastighet enn ved transformasjon med plasmidene ifølge teknikkens stand. Transformasjon av egnede kompetente vertsorganismer foregår på i seg selv kjent måte. For ekspress jon av plasmidene ifølge oppfinnelsen utgjør spesielt egnede vertsorganismer stammer fra arten E. coli og kjente Enterobakteriaceen, som for eksempel stammer av pseudomonas, salmonella, enterobactero, klebsiella eller seratia.

Foretrukne vertsorganismer er stammer fra arten E. coli som for eksempel E. coli GRT-1 oog spesielt E. coli-stammer av undergrupe K12 som for eksempel E. coli K12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coli K12 JM105 (DSM 4162), E. coli-K12-stamme ATCC 31446 eller også E. coli K12 DH1 (ATCC 33849).

Ekspressjonsinitieringen i E. coli-ekspressjonssystemer, inneholdende Tac-promoter, kan for eksempel tilveiebringes gjennom laktosetilsetning eller glukoseinnføring, fortrinnsvis derimot ved tilsetning av isopropyl-3-D-tiogalaktopyranosid. Dersom Trp-promoteren foreligger i plasmidet foregår induksjonen fortrinnsvis med indolakrylsyre, eddiksyre eller propionsyre. Andre kjente induksjonsmidler kan selvfølgelig på lignende måte bli anvendt.

Etter induksjon og oppnåelse av en bestemt gitt celletetthet blir cellene sentrifugert ut og bunnfallet etter sentrifuger-ingen blir etter oppslemming i en vandig saltoppløsning for eksempel overført i en homogenisator, idet cellene ødelegges gjennom trykkforskjeller. Etter ny sentrifugering oppnås i bunnfallet forløperproteinet til rscu-PA sammen med vannuopp-løselige cellefragmenter og så videre. Gjennom behandling med guanidin hydrokloridoppløsning går forløperproteinet i oppløsning, og etter ny sentrifugering blir supernatant-oppløsningen behandlet med et redoxsystem (eksempelvis inneholdende redusert eller oksydert glutation), for dannelse av naturlig konformasjon, det vil si, dannelse av tilstrebet rscu-PA. Denne foreligger da i reaksjonsblandingen i oppløst form og kan ved hjelp av vanlige rensningstrinn (for eksempel kromatografi og til slutt frysetørking) bli isoleret i ren form.

For analytiske formål går man fortrinnsvis frem på en slik måte at man fermenterer E. coli-stammene som er transformert med plasmidet som undersøkes og etter oppnåelse av en på forhånd bestemt optisk tetthet av cellesuspensjonen blir ekspressjonen av rscu-PA-forløperproteinene indusert med et egnet induksjonsmiddel. Etter tilsvarende fermentasjons-varighet blir aliquote deler tatt ut og de derifra avsentrifugerte cellene blir oppslemmet med et lysozym (1 mg lysozym pr. ml 50 mM trishydrokloridbuf f er med pH 8.0, 50 mM EDTA og 115$ saccarose). Homogenatet til de lyserte cellene blir løst opp i 4 - 5 M guanidiniumhydrokloridoppløsning og etter fortynning ved 1.2 M guanidiniumhydroklorid under tilsetning av et reduksjonsmidddel (glutation, mercaptoetanol eller cystein) underkastet 12-5 timer tilbakeholdingsre-aksjonen (jfr. også for eksempel B. Vinkler et al. (11)). Den på denne måten oppnådde enkjedede rscu-PA blir ved tilsetning av plasmin omdannet til tokjedet rtcu-PA, idet aktiviteten derav deretter blir bestemt med substrat S2444

(pyroGlu-Gly-Arg-p-nitroanilid; Kabl Diagnostika, Sverige)

som bare blir spaltet av tokjedet aktive urokinaser. Denne aktivering av rcsu-PA med plasmin foregår i 50 mM tris-buf f er, 12 mM natriumklorid, 0.02 % Tween 80 ved pH 7 og 37°C. Forholdet rscu-PA og plasmin bør være omtrent 100 til 1.500 og 1, med hensyn på molaritet, eller omtrent 8.000 til 36.000 og 1, med hensyn på enzymenheter. Testinkubasjonen foregår i 50 mM tris-buffer, 38 mM natriumklorid ved pH 8.8 i nærvær av 0,38 >jM Aprotinin (for hemming av plasmidet) og 0.27 mM S 2444 ved 37°C. Alt etter innhold av probe av rscu-

PA blir reaksjonen stoppet etter 5-60 minutter inkubasjon ved tilsetning av 90 % eddiksyre og ekstinksjon ved 405 nm blir målt. Etter angivelsene til fremstillerene av sub-stratet S2444 betyr denne fremgangsmåten en ekstinksjons-endring på 0.05 pr. minutt ved 405 nm i en aktivitet på 25 Ploug-enheter/ml testoppløsning.

Utbytte av rscu-PA, som under anvendelse av forskjellige plasmider ifølge oppfinnelsen ble oppnådd som forløperprotein i forskjellige bakterier, er angitt i figurene 10, 12 og 14.

Som det fremgår av fig. 11 samt angivelsene i nedenfor angitte eksempler, spesielt tabell 1 fra eksempel 2, fører plasmidene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis i E. coli stammer til dannelsen av rscu-PA forløperproteiner med en ekspressjonshastighet på 10 til 25 vekt-%, spesielt 14 til 20 vekt-% av dannet total protein. Ekspressjonshastigheten er også ved anvendelse av plasmidene ifølge oppfinnelsen minst 10 til 15 ganger høyere enn de med kjente plasmider, som for eksempel pUK 54 trp 207-1.

De vedlagte figurene viser følgende:

Figurene la og lb: Konstruksjon av plasmid pBF 158 fra i handelen oppnåelig plasmid pBR 322. Her blir nic/bom-regionen og en stor del av tetracyklinresistensgenet fjernet. Figur 2: Nukleotidsekvens til syntetisk "multiklonings site". Figur 3: Konstruksjon av plasmid pBF 158-01. Her vises innskudd av syntetisk multiklonings site i plasmid pBF 158 mellom spaltningssetene Eco RI og Hind III. Figur 4: Konstruksjon av plasmid pBF 158-01. Fragment Cia I x Hind III ble erstattet igjennom tilsvarende fragment "T" fra plasmid pRT 61 (5), hvorpå tet A/orf L terminator fra Tn 10 (6) befinner seg. Figurene 5a til 5g: Nukleotidsekvensen til syntetiske fragmenter for det for human scu-PA kodende genet (innskudd av dette under dannelsen av strukturgenet for scu-PA i et plasmid ifølge oppfinnelsen, ut i fra plasmid pBF 158-01 T beskrevet i eksemplene ld til lf og i figurene 6, 7 og 9). Figurene 6a til 6c: Konstruksjon av plasmid pBF 158-02 T til pBF 158-06 T gjennom innskudd av oligonukleotidfragmentene A 4 til M 8, fra den C-terminale enden til proteinet som skal oppnås (tilsvarende 3'-terminale enden til DNA-tråden), begynnende med plasmid pBF 158-01 T. Figurene 7a til 7c: Konstruksjon av plasmid pBF 158-08 T over en hjelpekonstruksjon i plasmid pUC 19 (jfr. eksempel le).

Figur 8: Nukleotidsekvens til syntetisk Trp-promoter.

Figur 9: Konstruksjon av ekspressjonsplasmidet for forløper-proteinet til humant rscu-PA, pBF 160. Strukturgenet for scu-PA vises gjennom det svarte området mellom spaltningssetet Nde I og Cia I . Figur 10: Ekspressjonshastigheten til forløperproteinene til humant rscu-PA (bestemt som rtcu-PA-aktivitet rettet tilbakefalling og aktivering) i forskjellige med plasmid pBF 160 (o o) eller med plasmid pUK 54 trp 207-1 (10) (o o) transformerte E. coli-stammer under kontroll av Trp-promoteren med hensyn på tid etter induksjon med indolakrylsyre ved tidspunkt 0. Angitt er de med substrat S 2444 formidlet rtcu-PA-aktiviteter i Ploug-enheter pr. ml av et fermentasjonsmedium med optisk tetthet lik 1 ved 578 nm. Figur 11: Densitogram av SDS-PAGE av proteiner fra med pBF 161 transformerte E. coli K 12 JM 103-celler etter fermenter-ing for (A) og 6 timer etter (B) tilsetning av indolakrylsyre som induksjonsmiddel. Figur 12: Ekspressjonshastighet til forløperproteinene fra humane rscu-PA (bestemt som rtcu-PA-aktivitet etter til-bakefall ing og aktivering) i E. coli K12 JM103 transformert med pBF 171, det vil si under kontroll av Tac-promotere. Induksjonen foregår ved tidspunkt 0 med IPTG. Angitt er formidlet rtcu-PA-aktivitet overfor substrat S 2444 i Ploug-enheter pr. ml av et fermentasjonsmedium med optisk tetthet lik 1 ved 578 nm. Figur 13: Forlenging av avstanden mellom Shine-Dalgarno-sekvensen (SD) og startkodonet ATG på 8 til 10 baser gjennom oppfylling av Nde 1-spaltningsstedene og påfølgende legering av resulterende butte-ender. Figur 14: Ekspressjonshastigheten til forløperproteinene til humant rscu-PA (bestemt som rtcu-PA-aktivitet etter tilbakefalling og aktivering) under kontroll av Trp-promoteren i E. coli GRT-1 transformert med plasmid pBF 161 (o o) eller pBF 163 (a a). Induksjonen foregår med indol akrylsyre umiddelbart etter tidspunkt 0. Angitt er den med substrat S 2444 formidlet rtcuPA-aktiviteter i Ploug-enheter pr. ml av et fermenteringsmedium med optisk tetthet lik 1 ved 578 nm. Figurene 15a og 15b: Fullstendig nukleotidsekvens til scu-PA-strukturgenet med angivelse av de enkelte kodonenes tilsvarende aminosyrer.

De i utførelseseksemplene anvendte restriksjonsenzymene kan fåes i handelen (jfr. B. Nachr. Chem. Techn. Lab. 35, 939, 1987).

Kulturmediet som blir anvendt i eksemplene for seleksjon av klonene inneholder pr. 1: 7,8 g pepton fra flesk, 7,8 g pepton fra kasein, 10 g gjærekstrakt, 5,6 g natriumklorid og 10 g glukose. Dette mediet blir omsatt med 10 g agar pr. 1 i varme og helt ut på skåler.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av ekspressjonsplasmidet pBF 160 for forløper-proteinet til rscu-PA med syntetisk scu-PA-gen under kontroll av Trp-promoteren.

a) Konstruksjon av plasmid pBF 158

i) Fra plasmid pBR 322 (Pharmacia, nr. 27-4902, 4363 bp)

ble nic/bom regionen, som befinner seg mellom basene 2207 og 2263 (1) som følger fjernet (jfr. også fig.

1): pBR 322 blir ved base 2298 spaltet med Nde I og dermed linearisert. Overhengende ender blir ifylt ved hjelp av en ifyllingsreaksjon, og dermed blir butte ender oppnådd (2). Deretter blir det ved base 2068 spaltet med Pvu II og begge butte endene til gjenværende delene til pBR 322 blir ved hjelp av vanlig teknikk ligert med T4-ligase. Deretter blir legeringsblandingen transformert i kompetente E. coli K12 JM 103 celler (ATCC 39403) (3). De transformerte cellene ble dyrket i medium under tilsetning av 150 ug ampicillin/ml. Fra oppnådde kloner blir de som inneholder plasmid pBF 157 valgt som er forskjellig fra utgangsplasmid pBR 322 gjennom om 228 nukleotid mindre a) Pst I x BspM II -, b) Pst I x Bal I-, c) Pst I x Ava I-fragmenter. Begge enkeltvise spaltningssetene PvuII og Nde I til pBR 322 er ikke mere tilstede i plasmid pBF 157.

ii) Fra pBF 157 blir en større del av tetracyklinresistensgenet fjernet ved spaltning med Eco RV x Nru I og påfølgende ligering av resulterende butte ender.

Etter transformering i E. coli K12 JM 103 og dyrkning i medium med 150 ug ampicillin/ml blir kloner oppnådd, hvor de som Inneholder plasmid pBF 158 blir valgt ut. Disse har 787 nukleotider mindre enn pBF 157 og er også forskjellig på grunn av at de mangler et Barn HI-spaltningssete. Transformasjon av bakter iestammer med pBF 158 gir disse ikke tetracyklinresistens.

b) Konstruksjon av pBF 158- 01. innskudd av et syntetisk multiklonlngssete

Fra pBF 151 blir gjennom spaltning med Eco RI x Hind III et 31 nukleotid stort fragment fjernet og i hulrommet blir et syntetisk multi kloningssete legert, idet sekvensen derav er angitt i fig. 2. Etter transformasjon av ligeringsblandingene E. coli K12 JM103 og dyrkning i medium med 150 jjg ampicillin/ml blir kloner utvalgt som inneholder plasmid pBF 158-01. Disse skiller seg fra pBF 158 gjennom de ytterligere enkeltvise spaltningssetene Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Kpn I, Spe I samt et ytterligere Pst-I-spaltningssete (Fig. 3). c) Konstruksjon av pBF 158- 01 T. innskudd av en transkripsjonsterminator

Fra pBF 158-01 blir Cia I x Hind III fragmentet til multikloningsseter fjernet og erstattet med Cia I x Hind III fragmenter fra pRT 61 (5), hvor tet A/orf L terminator fra Tn 10 (6) befinner seg.

Etter transformasjon i stamme E. coli K12 JM103 og dyrkning i medium med 150 pg ampicillin/ml blir kloner som inneholder plasmid pBF 158-01 T valgt ut. Disse skiller seg fra pBF 158-01 gjennom et 297 nukleotid større Cia I x Hind III fragment (Fig. 4).

d) Innskudd av syntetisk fragment M 4 - M 8 for scu- PA-genet.konstruksjon av plasmid pBF 158- 02 T - pBF

158- 06 T

Alle syntetiske fragmenter er beskrevet i figurene 5a - 5g. De blir skutt inn som ca. 200 nukleotid lange dobbelt-trådede-fragmenter i tilhørende vektorer. Vektorene blir spaltet med reseksjonsenzymer som tilsvarer de nevnte spaltningsstedene og separert gjennom agarosegel elektroforese, elektroeluering og rensing over DE 52 for fjerning av fragmenter. Deretter følger ligering med tilhørende dobbelt-trådet syntetisk fragment ved hjelp av T4-ligase, transformasjon i E. coli K12 JM 103 (Fig. 6a-6c) og seleksjon på ampicillin-holdig medium.

i) Ligering av fragmentet M 8 mellom Bam HI og Cia I i plasmid pBF 158-01 T.

Plasmid pBF 158-02 T oppstår. Oligonukleotid 019 koder for den C-terminale sekvensen til scu-PA. Etter stopp-kodonet TAA er et Nhe I-spaltningssete, etterfulgt av ytterligere transkriptsjonsterminer-ings-sekvenser til trpA terminatorer (8) til Cia I.

ii) Ligering av fragment M 7 mellom Spe I og Bam HI 1

plasmid pBF 158-02 T.

Plasmid pBF 158-03 T oppstår.

ili) Ligering av fragment M 6 mellom Kpn I og Spe I i plasmid pBF 158-03 T.

pBF 158-04 T oppstår.

iv) Ligering av fragment M 5 mellom Eag I og Kpn I i plasmid pBF 158-04 T.

Plasmid pBF 158-05 T oppstår.

v) Ligering av fragment M 4 mellom Sac I og Eag I i plasmid pBF 158-05 T.

pBF 158-06 T oppstår.

Ut i fra oppnådde kloner i-v blir de utvalgt som skiller seg fra forløperene gjennom tilstedeværelse av innskutte nye fragmenter i overprøvd riktig sekvens.

e) Innskudd av syntetisk fragment M 2 og M 3 for scu- PA-gen konstruksjon av pBF 158- 08 T

På grunn av at det for innskudd av fragmentene M 2 og M 3 er nødvendig med en Pst-I-spaltning og det befinner seg enda et pst-I-spaltningssete (i ampicillinresistensgenet) i det heri benyttede plasmid pBF 158, som ved følgende kloning ville være i veien, utføres følgende (figurene 7a til 7c): i) Fra i handelen oppnåelig (for eksempel Pharmacia) plasmid pUC 19 blir multikloningssetet og i tillegg 212 nukleotid nedstrøms som Nde I og Hind III fragment fjernet. I det resulterende hulrommet blir deretter det syntetiske multikloningssetet fra plasmid pBF 158-04-3 T ligert som Nde I x Hind III fragment. Dette plasmidet pBF 158-04-3 T blir oppnådd fra plasmid pBF 158-02-T (jfr. eks. Idi) gjennom innskudd av ollgonukleotidfragment M 6 oppnådd og tilsvarer plasmid pBF 158-04 T uten fragment M 7. Etter transformasjon i E. coli K 12 JM 103 celler og dyrkning på medium med 150 jjg ampicillin/ml blir kloner som inneholder plasmid pUC 19-04-3 valgt ut. Dette skiller seg fra pUC 19 gjennom tilstedeværelse av et 712 nukleotid langt Nde I x Hind III fragment.

il) Fra pUC-19-04-3 blir Pst I x Sac I fragmentet fjernet, den lineariserte vektoren blir isolert og

ligert med oligonukleotidfragment M 3. Etter transformasjon i E. coli K12 JM 103 og dyrkning på mediet med 150 jjg ampicillin/ml blir kloner som inneholder plasmid pUC 19-07 valgt ut. Denne skiller seg fra pUC 19-04-3 gjennom 189 nukleotid langt Pst I x Sac I fragment som inneholder fragment M 3 med riktig sekvens.

ili) Fra ovennevnte plasmid pUC 19-07 blir fragment Nde I

x Pst I fragmentet fjernet og i åpningen til fragment M 2 ligert. Etter transformasjon i E. coli K12 JM 103 og dyrkning på medium med 150 ug ampicillin/ml blir de kloner utvalgt som inneholder plasmid pUC 19-08. Disse skiller seg fra pUC 19-07 gjennom tilstedeværelse av det 246 bp lange Nde I x Pst I framentet M 2 med riktig overprøvet sekvens.

iv) Fra plasmid pUC 19-08 blir fragmentene M 2 og M 3

fjernet som Nde I x Sac I fragment og ligert inn i den etter spaltning med Nde I x Sac I oppnådde større delen av pBF 158-06 T. Etter transformasjon i E. coli K12 JM 103 og dyrkning på mediet med 150 >jg ampicillin/ml blir de kloner som inneholder plasmid pBF 158-08 T valgt. De skiller seg fra pBF 158-06 T gjennom tilstedeværelse av et 435 nukleotid langt Nde I x Sac I fragment.

f) Konstruksjon av plasmid pBF 160.innskudd av syntetiske Trp- Promotere

De i (9) beskrevne sekvenser til Trp-promoteren blir overdratt til Xba I-spaltningsstedet og forlenget ved 5'-enden gjennom sekvensen 5 '-AATTCTGAAAT-3'. Herved blir et Eco RI-spaltningssete konstruert. (Fig. 8, fragment M 1). Enkelt-trådene 021 og 021 A blir sammensmeltet og ligert inn i Eco RI x Xba I spalte plasmid pBF 158-08 T (Fig. 9). Etter transformasjon i E. coli K12 103 og dyrkning på medium med 150 >jg ampicillin/ml blir kloner som inneholder pBF 160 utvalgt. Plasmid pBF 160 skiller seg fra alle ovenfor beskrevne forløpere idet med denne transformerte E. coli bakteriestamme med tilsetning av indolakrylsyre uttrykker forløperproteinet til rscu-PA.

g) Ekspress. 1 onstest

i ) Fermentasjon

Forskjellige, med plasmid pBF 160 transformerte E. coli stammer, for eksempel E. coli GRT-1, E. coli K12 JM103 samt E. coli K12 ATCC 31446, blir under like betingelser fermentert i et medium bestående av 38 mM ammoniumsulfat, 56 mM fosfatbuffer pH 7,0, 1 mM magnesiumsulfat, 1$ gjærekstrakt, 1% glukose som inneholder 150 mg ampicillin pr. 1 og med 62 mg indolakrylsyre/1 blir ekspressjonen til forløperpro-teinene til rscu-PA indusert. For sammenligning blir ovennevnte stammer transformert med et ovennevnt plasmid, som inneholder genet for menneskelig prourokinase fra en cDNA-bank, isolert fra Detroit 562 celle-mRNA (10) og som har betegnelsen pUK 54 trp 207-1 og deretter fermentert under like betingelser og underkastet induksjon.

Før induksjonen og hver time etter induksjonen I totalt 6 timer blir celler tilsvarende 1 ml av en cellesuspensjon med optisk tetthet (OD) på 1 ved 578 nm sentrifugert ut og anvendt for testing av ekspressj onshastigheten.

ii) Tilbakefalling av forløperproteinet til rscu/PA,

spaltning derav til rtcu-PA og aktivitetsmåling.

De avsentrifugerte cellene blir, som beskrevet ovenfor, oppslemmet med lysozym og deretter blir homogenatet til de lyserte cellene tilsatt for aktivitetsbestemning som beskrevet ovenfor.

De slik etter aktivitetsmåling fra rscu-PA (oppnådd fra forløperproteinet) dannet rtcu-PA formidlet ekspressjonshastighet er angitt i figur 10. Det viser seg at stammene til E. coli, som er blitt transformert med plasmid pBF 160, gir et 10-15 ganger høyere ekspressjonsutbytte enn de med litteraturkjent plasmid pUK 54 trp 207-1 (10) transformerte like E. coli-stammene. Ut i fra dette fremgår det at ekspressjonsutbyttene i alle stammene med hensyn på plasmidene anvendt for transformasjon ligger på omtrent like verdier, det vil si at spesielt stammer transformert med plasmid pBF 160 (uavhengig av enkelte E. coli-stammer) tilveiebringer en flere ganger høyere ekspressjonshastighet eller identiske stammer transformert med kjent plasmid pUK 54 trp 207-1.

Eksempel 2

a) Konstruksjon av ekspressjonsplasmid pBF-161 for forløper-proteinet til rscu-PA med syntetisk scu-PA-gen under

kontroll av Trp-promoteren.

Plasmid pBR 322 blir spaltet med Eco RI og Hind III. Det oppståtte 31 nukleotid lange fragmentet blir separert gjennom en preparativ agarose gelelektroforese. Den oppnådde andelen av pBR 322 blir eluert ut av gelen ved et elektroeluering og renset ved kromatografi over DE 52.

Plasmid pBF (eksempel lf) blir spaltet med Eco RI og Hind III og det 1684 nukleotid lange Eco RI x Hind III fragmentet, som inneholder det syntetiske scu-PA-genet med alle reguleringsenheter (Trp-promoter), ble separert ved agarose gelelektroforese og eluert som beskrevet ovenfor og renset.

Fragmentene oppnådd på denne måten blir på vanlig måte ligert med T4-ligase og deretter transformert i E. coli K12 JM 103. Etter dyrkning på medium med 150 jjg ampicillin/ml blir kloner som inneholder et 1684 nukleotid langt Eco RI x Hind III fragment valgt ut og de som etter tilsetning av indolakrylsyre produserer rscu-PA-forløper-protein. Disse klonene inneholder plasmid pBF 161.

b) Ekspressjonstest

E. coli GRT-1, E. coli K12 JM 103 og E. coli K 12 ATCC 31

446 blir transformert med pBF 161 og deretter transformert som beskrevet i eksempel lg) og ekspressjonsresultatet blir undersøkt. Utbyttet av rscu-PA-forløperprotein bestemt som rtcu-PA-aktivitet 1-6 timer etter induksjon kan sammenlignes med de i fig. 10 for anvendelse av plasmid pBF 160 for transformasjon av angitte utbytteverdier.

Isolert celle-pellet ved sentrifugering analogt eksempel lgi) kan også bli oppslemmet gjennom koking i 0.25M tris HCl-buffer, pH 8,0 med 4# SDS, 1% merkaptoetanol og 20% glycerin. De på denne måten oppløste proteinene blir separert ved SDS-PAGE og gjort synlig ved hjelp av Coomasssieblå-farging (12). De fargede gelene blir vurdert densitometrisk og flatene under toppene blir integrert. Andel dannet rsccu-PA-forløperproteiner etter induksjon med indolakrylsyre ble bestemt gjennom sub-traksjon av flaten til båndet identifisert som forløper-protein før induksjon i fra det som blir oppnådd etter induksjon. I fig. 11 blir et densitogram vist for protein oppnådd fra E. coli K 12 JM 103 celler. I foreliggende eksempler utgjør andelen rscu-PA-forløperprotein etter induksjon 17,9 vekt-# av bakterielt totalprotein. Ytterligere eksempler er angitt i Tabell 1.

Eksempel 3

Konstruksjon av et ekspressjonsplasmid for forløperproteiner til rscu-PA med syntetisk scu-PA-gen under kontroll av Trp-promoteren i pBR 322 med delesjon I tetracyklinresistensgenet.

a) Konstruksjon av plasmid pBR 322 del

Plasmid pBR 322 blir spaltet med Eco V og Nru I. Det 787

nukleotidstore fragmentet som oppstår blir fjernet gjennom agarose gelelektroforese, den gjenværende delen av pBR 322 blir eluert ved hjelp av elektroeluering ut av gelen og renset over DE 52. Buttendet pBR 322 Eco V x Nru I-restdeler blir på vanlig måte ligert med T4-ligase. Etter transformasjon i E. coli K 12 JM 103 og dyrkning på mediet med 150 >jg ampicillin/ml blir kloner valgt ut hvor en aliquotdel etter overføring til et medium med 25 ug tetracyklin/mll ikke vokser, det vil si ikke inneholder tetracyklinresistens. Klonene inneholder plasmid pBR 322 del, og skiller seg fra pBR 322 idet det er 787 nukleotider mindre og ikke kan bli spaltet av Eco V og Nru I.

b) Konstruksjon av plasmid pBF 162

pBR 322 blir spaltet med Eco RI og Hind III. Det

oppståtte 31 nukleotid lange fragmentet blir separert gjennom en preparativ agarose gelelektroforese, og

restdelen av pBR 322 del blir eluert ved elektroeluering ut av gelen og renset over DE 52.

Ved 1684 nukleotid lange Eco RI x Hind III fragmentet, som inneholder det syntetiske scu-PA genet med alle reguleringsenheter (Trp-promoter) blir isolert fra pBF 160 på samme måte.

Begge fragmenter blir på vanlig måte ligert med T4-ligase og deretter transformert inn i E. coli K12 JM 103 celler. Etter dyrkning på medium med 150 jjg apicillin/ml blir de kloner utvalgt som Inneholder 1684 bp langt Eco I x Hind III fragment og som produserer et rscu-PA forløperprotein etter tilsetning av 62 jjg indolakrylsyre/ml. Disse klonene inneholder plasmid pBF 162.

c) Ekspressjonstest

E. coli GRT-I blir transformert med pBF 161, deretter

fermentert som beskrevet i eksempel lg) og ekspressjons-resultåtet undersøkt. Utbyttet av rscu-PA-forløperprotein bestemt som rtcu-PA-aktivitet 6 timer etter induksjon utgjør 1300 PU/ml av en cellesuspensjon med en optisk tetthet på 1 og er sammenlignbar med utbytteverdiene i fig. 10 for ekspressjon etter transformasjon av E. coli GRT-1 mit med plasmid pBF 160.

Eksempel 4

a) Konstruksjon av plasmid pBF 171 for forløperproteinet til rscu-PA med syntetisk scu-PA-gen under kontroll av Tac

promoteren.

Plasmid pBF 161 blir spaltet med Eco I og Xba I. Det 74 nukleotid lange fragmentet som oppstår blir separert gjennom preparativ agarosegelelektroforese, restdelen av plasmidet blir eluert gjennom elektroeluering og deretter renset over DE 52.

Fra plasmid ptac SDT (DSM 5018) blir Eco RI x Xba I fragmentet, som inneholder Tac-promoteren, isolert. ptac SDT blir spaltet med Eco RI x Xba I og fragmentet blir separert igjennom preparativ PAGE. Fragmentet blir eluert igjennom oppvarming ved 65°C i ammoniumacetat/SDS-buffer, pH 8.0, fra mekanisk forminsket polyakrylamid og renset igjennom flere ganger ekstraksjon med fenol, som er mettet med 1 M Tris-buffer, pH 8.

Begge isolerte fragmenter blir på vanlig måte ligert med T4-ligase og deretter transformert inn i E. coli K 12 JM 103. Etter dyrkning i medium med 150 jjg ampicillin/ml blir kloner som etter tilsetning av ITPG escu-PA-forløper-protein valgt ut. Disse klonene inneholder plasmid pBF 171.

b) Eksepressjonstest

E. coli K12 JM 103 blir transformert med pBF 171, og

deretter fermentert som beskrevet i eksempel lg) og ekspressjonsresultatet blir undersøkt. Induksjonen foregår med IPTG (sluttkonsentrasjon 0,5 mM).

Utbytte av rscu-PA-forløperprotein, bestemt som rtcu-PA-aktivitet 1-6 timer etter induksjon er angitt i fig. 12. De er sammenlignbare med de i fig. 10 for anvendelse av plasmid pBF 160 -i lik E. coli-stamme angitte utbytteverdier.

Eksempel 5

a) Konstruksjon av ekspressjonsplasmid pBF 172 for rscu-PA forløperprotein med et syntetisk scu-PA-gen under kontroll av kontakt promoteren i pBR 322 med delesjon i tetracyklinresistensgenet .

Plasmid pBR 322 del (se eksempel 3a) blir spaltet med Eco I x Hind III. 31 nukleotid lange fragmentet som oppstår blir separert gjennom en preparativ agarose gelelektroforese, pBR 322 del-restdelen blir eluert ved elektroeluering ut av gelen og deretter renset over DE 52.

Eco I x Hind III fragmentet fra pBF 171 (eksempel 4a), som inneholder det syntetiske scu-PA-genet med alle regula-sjonsenhetene (Tac-promoter), blir isolert på samme måte.

Begge på denne måten oppnådde fragmenter blir ligert med T4 ligase på vanlig måte og deretter transformert inn i E. coli K 12 JM 103 celler. Etter dyrkning på mediet med 150 jjg ampicillin/ml blir de kloner utvalgt som i nærvær av 0,5 mM IPTG produserer rscu-PA-forløperprotein. Disse klonene inneholder plasmid pBF 172.

b) Ekspressjonstest

E. coli K12 JM 103 blir transformert med pBF 172, og

fermentert som beskrevet i eksempel lg) og ekspressjonsresultatet testet. Induksjonen foregår med IPTG (sluttkonsentrasjon 0,5 mM). Utbyttet av rscu-PA forløperpro-tein bestemt som rtcu-PA-aktivitet 1-6 timer etter induksjon utgjør omtrent 1100 PU/ml cellesuspensjon ved optisk tetthet 1 og er sammenlignbar med de i fig. 10 for anvendelse av plasmid pBF 160 i samme E. coli-stamme viste utbytteverdier.

Eksempel 6

Endring av avstanden mellom Shine Dalgarno sekvensen og startkodonet i et ekspressjonsplasmld for rscu-PA-forløper-protein .

Startkodonet ATG i alle i eksmplene 1-5 beskrevne konstruk-sjoner er bestanddeler av et Nde-I-spaltningssete -CATATG-. Nde I spalter etter første A av heksanukleotidsekvensen og gir 5'-ender, som har to ytterligere baser. Fylles 3'-enden, det vil si dersom butte-ender blir konstruert, og ligeres deretter Igjen, blir vedrørende sekvens forlenget med 2 basepar. Samtidig blir Nde I-setet eliminert. Som det fremgår av fig. 13, blir avstanden til S.D.-sekvensen til startkodonet forlenget fra 8 - 10 basepar som angitt i eksemplet. Nedenfor blir den eksperimentelle gjennomføringen i et eksempel forklart:

a) Konstruksjon av plasmid pBF 163

Plasmid pBF 161 blir spaltet med Nde I, og deretter blir

overhengende ender fyllt i med Klenow-fragment til DNA-polymerase I (2). Deretter blir DNA som vanlig ligert med T4-ligase og deretter transformert inn i E. coli K 12 JM 103. Etter dyrkning på ampicillinholdig medium blir de kloner utvalgt som inneholder plasmid pBF 163. Det skiller seg fra pBF 161 på grunn av mangel av et Nde I-sete og gjennom ytterligere base -TA- i området til tidligere Nde I-sete (jfr. fig. 13).

b) Ekspressjonstest

E. coli GRT-1 blir transformert med plasmid pBF 163, og

deretter fermentert som beskrevet i eksempel lg) og ekspressjonsresultatet blir undersøkt. Utbytte av rscu-PA-f orløperprotein , bestemt etter tilbakefalling og aktivering som rtcu-PA-aktivitet pr. cellesuspensjon med optisk tetthet 1 en til seks timer etter induksjon med 62 mg indolakrylsyre/1 er angitt i fig. 14. De er sammenlignbare med de i fig. 10 for anvendelse av plasmid pBF 160 i samme E. coli stamme angitte utbytteverdier.

Referanser

1) Winnacker, E.L.: "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellshaft, Weinheim, 1985, S. 298 2) Manlatls, T., Fritsch, E.F. Sambrook, J.: "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 3) Hanahan, I.: "DNA cloning", Vol. 1, ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford 1985, S. 109 - 135 4) Wilhelm, M. Hollenberg, C.P.: "Nucl. Acids Res." 13, 5717-5722 (1985) 5) Jorgensen, R.A. Reznikoff, W.S: "J. Bacteriol." 138. 705-714 (1979) 6) Schollmeier, K. , Gartner, D. , Hillen, W.: "Nucl. Acids Res." 13, 4227-4237 (1985) 7) Adams, S.P., Kavka, K.S., Wykes, E.I., Holder, S.B., Gallup!, G.R.: "J. Am. Chem. Soc. 105, 661-663 (1983) 8) Christie, G.E., Farnham, P.J., Platt, T. : "Proe. Nati. Acad. Sei," USA 78, 4180-4184 (1981) 9) De Boer, H.A., Comstock, L.J., Vasser, M. : "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 80, 21-25 (1983) 10) Holmes, W.E., Pennica, D., Blaber, M., Rey M.W., Gunzler, W.A. , Steffens, G.J., Heynecker, H.L.: "Biotechnol." 3, 923-929 (1985) 11) Winkler, M.E., Blaber, M.: "Biochem." 25, 4041-4045

(1986) 12) Blakesley,RW, Boezi, JA: Anaol.Biochem. 82 580-582 (1977)

Claims

1. Plasmider for anvendelse ved fremstilling av en plasminogenaktivator,karakterisert vedat operonet opviser Trp-promoteren med nucleotidsekvensen ifølge fig. 8 eller Tac-promoteren fra plasmidet ptac SDT (DSM 5018) som regulerbar promoter, en som ribosom-bindende Shine-Dalgarno-sekvens, i en avstand på 8-10 nukleotider til Shine-Dalgarno-sekvensen et startkodon, det syntetiske strukturgenet for 411 aminosyrerester inneholdende en-kjedet urin-plasminogenaktivator "scu-PA" med nukleotidsekvens ifølge fig. 15, i det det som kodoner for arginin anvendes triplett CGT, for leucin triplett CTG, for valin triplett GTT, for prolin triplett CCG og/eller for glycin triplett GGT, og nedstrøms for strukturgenet en eller to terminatorer, valgt fra gruppen trp A-terminator og/eller tet /orf L-terminator fra Tn 10, og de for rscu-PA-f orløps-protein-ekspresjon er undergruppen K 12 egnet i Escherichia coli .

2. Plasmider ifølge krav 1,karakterisert vedat plasmidene er pBF 160 med restriksjonskart ifølge figur 9, pBF 161, fremstilt som beskrevet i eksempel 2, pBF 162, fremstilt som beskrevet 1 eksempel 3 og pBR 163, fremstilt som beskrevet i eksempel 6.

3. Plasmid ifølge krav 2,karakterisert vedat plasmidet er pBF 160 med restriksjonskartet ifølge figur 9.

4. Plasmider ifølge krav 1,karakterisertved at de er plasmidene pBF 171, fremstilt som beskrevet i eksempel 4 og pBF 172, fremstilt som beskrevet i eksempel 5.

5. Plasmider ifølge kravene 1 -4,karakterisertved at de bevirker dannelsen av rscu-PA-forløperproteiner med en ekspresjonsrate på minst 10 vekt-5é, fortrinnsvis på minst 14 vekt-# av dannede totalproteiner.

6. Plasmider ifølge kravene 1 - 5,karakterisertved at de bevirker dannelse av rscu-PA-forløperproteiner med en ekspresjonsrate på 10 til 25 vekt-#, spesielt på 14-20 vekt-# av dannet totalprotein.

7. Anvendelse av et plasmid ifølge kravene 1-6, ved isolering av en plasminogenaktivator,karakterisertved at man transformerer plasmidet i en stamme av E.coli fra undergruppen K 12 på i seg selv kjent måte, induserer ekspresjonen til scu-PA-strukturgenet, separerer dannet rscu-PA-forløperprotein fra mediet og de lyserte bakteriecellene, oppløser forløperproteinet og deretter blir det foldet tilbake til rscu-PA ved innvirkning av et Redox-system.