SK280028B6 - Plazmidy, spôsob ich výroby a ich použitie na získ - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových plazmidov, spôsobu ich výroby a ich použitia na výrobu aktivátora plazminogénu.

Podstata vynálezu

Pri liečení upchávania ciev, podmieneného fibrínom, ako napríklad infarktu srdca, pľúcnych embólií, ochorení končatín spojených s upchávaním artérií atď., majú aktivátory plazminogénu významnú úlohu. Asi od začiatku päťdesiatych rokov je známe, že v ľudskom moči je obsiahnutý proteolytický enzým, ktorý vyvoláva premenu plazminogénu na plazmín, to znamená na enzým, ktorý spôsobuje štiepenie fibrínu na rozpustné polypeptidy, a tým uvoľnenie upchatí podmienených fibrínom. Tento aktivátor plazminogénu bol nazvaný urokináza a ukázalo sa, že skutočne existujú rôzne formy urokinázy. Všetky tieto formy sa ale odvodzujú priamo od rovnakého predchodcu molekuly zymogénu prourokinázy, známeho asi od polovice 70-tych rokov. Potom, čo sa ukázalo, že táto prourokináza má štruktúru s jedným reťazcom, bola označená ako scu-PA (Single Chain Urinary Plasminogen Activator). Tento scu-PA pozostáva zo 411 aminokyselín a je v prirodzene sa vyskytujúcej forme glykozylovaný na aminokyseline 302.

Z rôznych prác je známa génovo technologická výroba neglykozylovanej časti proteínu scu-PA, ktorá bola označená ako ,,rscu-PA (rekombinantný scu-PA), alebo tiež voľným názvom „sarupláza,,. Pri terapeutickom nasadení rscu-PA sa ukázalo, že tento vzhľadom na účinok a znášanlivosť prekoná tradičné fibrinolytiká (porov. Lancet 1989, str. 863 - 868).

Na výrobu neglykozylovaného aktivátora plazminogénu rscu-PA sa používajú prokaryonty, o čom už bolo v literatúre uvedených niekoľko údajov. Až doteraz známe postupy pre rscu-PA spočívajú v expresii štruktúrneho génu scu-PA, izolovaného z ľudských tkanív. Bohužiaľ, pri tom sa dosiahli len nízke výnosy expresie, ktoré nedovoľujú vyrábať hospodárne žiadaný produkt vo väčších množstvách. Tak opisuje napríklad Hibino a kol. v Agric. Biol. Chem. 52, 329 - 336 (1988) pre rscu-PA výrobu v E. coli len 2 % výnos expresie, merané na celkovom proteine baktérií. Na druhej strane nie sú v európskej patentovej prihláške 92 182 A2 ani Holmesom et al. (10) dosiahnuté výnosy expresie presne uvádzané. Pri dopracovaní týchto údajov sa ale získalo pri rôznych kmeňoch menej ako 2 % výnosu rscu-PA v proteine baktérií.

Je potrebné poukázať na to, že rovnako ako v mnohých prípadoch expresie eukaryontických proteínov v baktériách i rscu-PA v bunke, ktorý sa tu ďalej označuje ako „proteín predstupňa,, - vzniká vo forme denaturovaného vstavbového telesa, ktoré sa po intermediámej izolácii musí proteinochemicky spätne zostaviť na správnu terciárnu štruktúru rscu-PA. Takto získaný produkt sa môže potom kvôli zisteniu vytvoreného množstva rscu-PA previesť napríklad prídavkom plazmínu na neglykozylovanú urokinázu s dvoma reťazcami (,,rscu-PA„), ktorej enzymatická aktivita sa zisťuje a môže slúžiť ako miera vzniknutého množstva rscu-PA. Prirodzene sa ale môže zistiť výťažok proteínu predstupňa, prípadne rscu-PA, a tým i výnos expresie, napríklad denzitometrickým vyhodnotením elektroforetického gelového delenia všetkých proteínov.

Podstata vynálezu

V súčasnosti sa s prekvapením zistilo, že pomocou plazmidmi transformovaných baktérií podľa vynálezu sa dosiahne oveľa vyššia úroveň expresie ako s identickými hostiteľskými kmeňmi transformovanými plazmidmi známymi zo stavu techniky. Plazmidy podľa vynálezu sú v súlade s tým, čo bolo uvedené, vhodnejšie ako doteraz všetky známe plazmidy na získavanie rscu-PA, prípadne jeho proteínu predstupňa. Kvôli úplnosti je nutné sa zmieniť o tom, že sa známym spôsobom pomocou už na analytické účely uvedeným štiepením rscu-PA, napríklad s plazmínom, môže získať rtcu-PA i v technickom meradle, potom čo sa v dôsledku predloženého vynálezu stal rscu-PA dobre prístupný.

Predmetom predloženého vynálezu sú teda nové plazmidy, ktorých operón obsahuje Trp-promótor alebo Tac-promótor ako regulovateľný promótor, Shine - Dalgamovu sekvenciu účinnú ako väzobné miesto ribozómov, štartovací kodón v odstupe 6 až 12 nukleotidov k Shine - Dalgamovej sekvencii, syntetický štruktúrny gén pre urín - plazminogénový aktivátor „scupA,, s jedným reťazcom obsahujúcim 411 zvyškov aminokyselín, v ktorom sa použije ako kodón pre arginin triplet CGT, pre leucín triplet CTG, pre valin triplet GTT, pre prolín triplet CCG a/alebo pre glycin triplet GGT a v smere po prúde dole od štruktúrneho génu jeden alebo dva terminátory, zvolené zo skupiny zahrnujúcej trp A terminátor a/alebo tet A/orf L-terminátor z Tn 10 a že sú vhodné na expresiu rscu-PA proteínu predstupňa v Enterobakteriaceae, výhodne v kmeňoch Eschericia coli.

Ako regulovateľný promótor je výhodne vložený promótor Trp alebo Tac pomocou Multi cloning site, syntetický promótor Trp s nukleotidovou sekvenciou podľa obr. 8 alebo promótor Tac z plazmidu ptac SDT (DSM 5018).

Ako po sebe nasledujúce transkripčné terminátory je vložený terminátor trp A a/alebo tet A/orf L z Tn 10 do operónu nových plazmidov.

Pomocou Multi cloning site je výhodne vložený v čiastkových krokoch štruktúrny gén so sekvenciou nukleotidov podľa obr. 15.

Predmetom predloženého vynálezu je ďalej spôsob výroby nových plazmidov, pri ktorom sa do plazmidu pBR 322, z ktorého bol odstránený nie,'bom - región a/alebo aspoň časť génu rezistentného proti tetracyklínu, medzi miesta rezu Eco Rl a Hind III vloží „multi cloning site,, so sekvenciou nukleotidov uvedenou na obr. 2, ktorá má medzi miestami štiepenia Xba I a Nde I Shine - Dalgamovu sekvenciu a vo vzdialenosti 6 až 12, výhodne 8 až 10 nukleotidov, obsahuje štartovací kodón ATG a s ich pomocou sa známym spôsobom vložia jeden alebo dva transkripčné terminátory, syntetické čiastkové sekvencie scu-PA štruktúrneho génu, výhodne začínajúc od konca 3' štruktúrneho génu, ako aj regulovateľný promótor.

Pod pojmom „multi cloning site,, sa chápe úsek sekvencie vplazmide, ktorý obsahuje rozpoznávacie miesta pre rôzne triedy reštrikčných endonukleáz. Rozpoznávacie miesta spôsobujú, že sekvencia DNA môže byť štiepená reštrikčnými enzýmami. „Nic/bom - región,, môže spôsobiť výmenu úsekov sekvenciou dvoch DNA - plazmidov. Odstránením nic/bom - regiónu z plazmidu sa táto výmena potlačí a zvýši sa biologická bezpečnosť.

Výhodne sa Eco Rl x Hind III fragment z plazmidu vložia známym spôsobom ako expresná kazeta do iného plazmidu, schopného autonómneho rozmnožovania v Enterobakteriaceae, výhodne v E, coli.

Výhodne sa v plazmide predĺži vzdialenosť medzi Shine - Dalgamovou sekvenciou a štartovacím kodónom štiepením sNde I, vyplnením vzniknutých miest štiepenia a nasledujúcou ligáciou vzniknutých tupých - koncov.

Plazmidy, ktoré možno získať podľa vynálezu, sa ďalej vyznačujú tým, že ich operón má regulovateľný, prípadne syntetický promótor, Shine - Dalgarnovu sekvenciu, účinnú ako väzobné miesto ribozómov, štartovací kodón, syntetický štruktúrny gén pre scu-PA a smerom dole do štruktúrneho génu aspoň jeden terminátor. Výhodne sú prítomné dva po sebe nasledujúce terminátory, pri ktorých hlavne ide o trp A terminátor a/alebo tct A/orf L terminátor z Tn 10, porovnaj Schollmeier et al. (6).

V kontrolnom regióne plazmidu vyrobeného podľa vynálezu je vzdialenosť medzi Shine - Dalgamovou sekvenciou a štartovacím kodónom 6-12, výhodne 8-10 nukleotidov.

Pri konštrukcii štruktúrneho génu, ktorý možno zavádzať do nových plazmidov, sa vkladajú výhodne sekvencie báz kódujúce práve prítomné aminokyseliny, uvedené v nasledujúcej tabuľke. Pritom nemusia byť v štruktúrnom géne splnené súčasne všetky tieto znaky.

Ďalej je predmetom predloženého vynálezu spôsob získavania aktivátora plazminogénu a použitie plazmidu podľa vynálezu, pri ktorom sa plazmidom transformuje kmeň Enterobakteriaceae, výhodne kmeň E. coli, indukuje sa expresia scu-PA štruktúrneho génu, vzniknutý rscu-PA proteín predstúpila sa oddelí od média a rozložených buniek baktérií, proteín predstupňa sa solubilizuje a potom sa pôsobením redox systému skladá na rscu-PA formu.

Výhodne sa plazmidom transformuje kmeň species E. coli, výhodne kmeň E. coli KÍ2.

Tabuľka 1

Aminokyseliny	Triplet
arginín	CGT
leucín	CTG
valín	GTT
prolín	CCG
glycín	CGT

Na druhej strane je pri výstavbe štruktúrneho génu výhodné zabrániť tak ďaleko, ako je to len možné, použitiu nasledujúcich kodónov pre ďalej uvedené aminokyseliny (pričom opäť nemusia byť splnené tieto znaky pre všetky aminokyseliny):

Tabuľka 2

Kodón, ktorému je potrebné sa vyhnúť	Aminokyselina
ATA	izoleucín
GTC	valín
ccc	prolín
AAG	lyzín
AGG, AGA, CGG, CGA	arginín
GGA, GGG	glycín

Výberom kodónov podľa vynálezu pre jednotlivé aminokyseliny v štruktúrnom géne, ako i uvedených znakov kontrolného regiónu sa čo možno najviac zabráni vytvoreniu stabilných sekundárnych štruktúr medzi štruktúrnym génom a kontrolným regiónom.

Kvôli získaniu syntetického štruktúrneho génu sa najprv syntetizujú ako monoreťazec oligonukleotidy v úsekoch so 40 až 80 bázami. Výhodne sa tieto vyrobia v lumolekulovom meradle metódou pevných fáz opísanou Adamsom et al. (7) pomocou DNA - syntetizéra (model Biosearch 8600 firmy New Brunswick Scientifíc Co.). Ako monomerizačné syntóny sa pritom používajú v obchode bežné beta-kyanoetylom chránené diizopropylaminofosforamidity teraz potrebných dezoxyribonukleotidov. Po odštiepení od nosiča sa koncové reťazce chránené ešte tritylom deionizujú za sterilných podmienok gélovou filtráciou a predčistia a potom sa v dvoch krokoch podrobia prvému deleniu pomocou HPLC s obrátenými fázami („reversed phase,, - HPLC). Získaný hlavný produkt sa detrityluje a po dvoch ďalších čistiacich krokoch pomocou HPLC s obrátenými fázami („reversed phase,, - HPLC) sa získa požadovaný oligonukleotid vysoko čistý’, ako to ukazuje gélová elektroforctická analýza (PAGE).

Zo skupiny 4 až 9 týchto jednotlivých reťazcov sa potom získa asi 200 nukleotidov dlhých dvojreťazcových fragmentov tým, že sa jednoreťazcové oligonukleotidy, ktoré nestoja na konci 5', fosforylujú a teraz získané komplementárne reťazce sa anelujú a ligujú s oligonukleotidmi, ktoré stoja na konci. Po ligácii sa vytvorené klonovania schopné dvojreťazcové fragmenty použijú potom vo vhodných linearizovaných vektoroch. Ďalší postup vyplýva z uvedených príkladov.

Skratky použité v predloženej prihláške vynálezu majú nasledujúci význam: bp párové bázy

DE 52 aniónomenič firmy Whatman

EDTA etyléndiamíntetraoctová kyselina

IPGT izopropyl-beta-D-tiogalaktopyranozid

PAGE polyakrylamidová gélová elektroforéza

PU Ploug units

SDS nátriumdodecylsulfát

S.D.-sekvencia: Shine - Dalgarnova sekvencia Tris - HC1 trishydroxymetylaminometánhydrochlorid.

Pre konštrukciu nových plazmidov podľa vynálezu sa vychádza výhodne z komerčného plazmidu pBR 322 (4363 bp). Výhodne sa z tohto eliminuje nic/bom - región a/alebo gén rezistentný proti tetracyklínu. Pritom nie je potrebné gén s rezistenciou proti tetracyklínu dokonale odstrániť, skôr stačí, keď sa odstráni do tej miery, že plazmid neprepožičia ním transformovaným kmeňom baktérií žiadnu rezistenciu proti tetracyklínu. Pomocou týchto opatrení - odstránením nic/bom regiónu a aspoň časti génu rezistentného proti tetracyklínu sa získa tzv. „vysoko bezpečný plazmid,,.

Výhodná stratégia konštrukcie nového plazmidu podľa vynálezu, vychádzajúca, ako je uvedené, od modifikovaného plazmidu pBR 322 (alebo iného uvedeného známeho plazmidu) vidí ďalší krok vo vostavbe syntetického „Multi cloning site,, medzi miesta rezu Eco RI a Hind III. Tento multi cloning site (porov. obr. 2) má pevne určený sled miest rezu, medzi zbernou jamkou sekvencie medzi Xba I a Nde I, ktorá obsahuje väzobné miesto ribozómov (Shine - Dalgarnova sekvencia) z B. subtilie Xyl operónu 5 '-AAGGAG-3' (4) ako i pevne stanovenú vzdialenosť medzi S. D. sekvenciou a štartovacím kodónom ATG. Bázy GAAAT nasledujúce po sekvencií S. D. sú prevzaté zo (4) a pomocou CATATG miesta rezu Hde I spojené. Tým teda vytvára vzdialenosť medzi S. D. sekvenciou a ATG 8 párových báz. Vzdialenosti medzi jednotlivými miestami rezu Multi cloning site by mali vzhľadom na technickoklonova cie dôvody mať dĺžku minimálne asi 20 nukleotidov, čím sa uľahči oddialenie medzifragmentov.

Pomocou tohto Multi cloning site sa do plazmidu zavedú rezné miesta, ktoré výhodne po vstavbe transkripčného terminátora - uľahčia po sebe nasledujúcu stavbu čiastkových sekvencii scu-PA štruktúrneho génu, výhodne začínajúc od konečného C požadovaného proteínu, teda od konca 3' reťazca DNA štruktúrneho génu, ktorý sa má vyrobiť, ako i vstavbu napríklad syntetického plazmidu alebo i plazmidu izolovaného z iného plazmidu, alebo i komerčného Trp promótora. Dokonalá sekvencia nukleotidu takto získaného scu-PA štruktúrneho génu je s údajom aminokyselín zodpovedajúcich jednotlivému kodónu znázornená na obr. 15.

Iné z nových plazmidov sa dajú podľa vynálezu získať z plazmidu konštruovaného ako bolo uvedené, napríklad tým, že sa rezmi s Eco RI a Hind III získa syntetický scu-PA štruktúrny gén so všetkými regulačnými jednotkami a potom sa vstavia do iného plazmidu, ktorý je schopný sa v Enterobakteriaceách, najmä v E. coli autonómne rozmnožovať a ktorý sa s týmto cieľom linearizuje a skráti rezy s Eco RI a Hind III. V princípe rovnakým spôsobom, ale s využitím miest rezu Eco RI a Xba sa dá vymeniť napríklad Trp promótor za Tac promótor (a obrátene) v plazmide získanom podľa vynálezu.

Analogicky sa môže vyjsť tiež z iných plazmidov, ktoré obsahujú singuláme Eco RI a Hind III miesta rezu, ako napríklad pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 a iné.

Nové plazmidy s predĺženou vzdialenosťou medzi Shine - Dalgamovou sekvenciou a štartovacím kodónom ATG sa dajú podľa vynálezu získať tým, že sa plazmid, konštruovaný ako bolo opísané, v ktorom uvedená vzdialenosť je napríklad 8 nukleotidov, reže s Nde I, rezultujúce miesta rezu sa doplnia a potom sa vznikajúce blunt - konce ligujú, čím sa vytvorí požadovaný nový plazmid, v ktorom vzdialenosť medzi S.D. - sekvenciou a štartovacím kodónom je napríklad 10 nukleotidov.

Ako už bolo povedané, majú baktérie transformované plazmidmi vyrobenými podľa vynálezu mnohonásobne vyšší expresný výťažok ako bolo možné dosiahnuť pri tých, pri ktorých bola transformácia vykonávaná plazmidmi známymi zo stavu techniky. Obzvlášť vhodné hostiteľské organizmy pre plazmidy, ktoré možno získať podľa vynálezu, sú kmene druhu E. coli a príbuzných Enterobakteriaceae, ako napríklad kmene Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella alebo Serratia.

Výhodné hostiteľské organizmy sú kmene druhu E. coli ako napríklad E. coli GRT-1 a hlavne kmene E. coli podskupiny KÍ2 ako napríklad E. coli K12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coli K12 JM105 (DSM 4162), E. coli - KÍ2 - kmeň ATCC 31446 alebo i E. coli K12 DP1 (ATCC 33849).

Zavedenie expresie do expresných systémov E. coli, ktoré obsahujú Tac promótor, sa môže vykonávať napríklad prídavkom laktózy alebo odobratím glukózy, výhodne ale prídavkom izopropyl-beta-D-tiogalaktopyranozidu. Ak je ale v plazmide prítomný Trp promótor, potom sa indukcia vykonáva výhodne kyselinou indolylakrylovou, indolyloctovou alebo indolylpropiónovou. Samozrejme sa môžu použiť rovnakým spôsobom i iné známe induktory.

Po indukcii a dosiahnutí vopred stanovenej hustoty buniek sa bunky odstredia a zvyšok po odstredení sa po rozmiešaní vo vodnom roztoku soli prevedie napríklad do homogenizátora, v ktorom sa bunky pomocou tlakového rozdielu nechajú popraskať. Po opakovanom odstredení sa získa vo zvyšku proteín rscu-PA predstupňa okrem vo vode nerozpustných zlomkov buniek atď. Spracovaním s roztokom guanidhydrochloridu prejde proteín predstupňa do roztoku a po novom odstredení sa zvyšný roztok spracuje s redox systémom (napríklad obsahujúcim redukovaný a oxidovaný glutatión), čím sa vytvorí prirodzená konformácia, t. j. vyvolá sa tvorba požadovaného rscu-PA. Tento je potom prítomný v reakčnej zmesi v rozpustenej forme a môže sa izolovať bežnými čistiacimi krokmi (napríklad chromatografiou a nasledujúcou lyofilizáciou) v čistej forme.

Na analytické účely sa výhodne postupuje tak, že sa kmene E. coli transformované plazmidom, ktorý sa má skúmať, fermentujú a po dosiahnutí vopred stanovenej optickej hustoty suspenzie buniek sa expresia rscu-PA proteínu predstupňa indukuje vhodným induktorom. Po zodpovedajúcom čase trvania fermentácie sa alikvotné časti odoberú a z týchto častí odstredené bunky sa potom rozložia lyzozýmom (1 mg lyzozýmu pre 50 ml 50 mM Tris-hydrochloridového pufra s pH 8,0, 50 mM EDTA a 15 % sacharózy). Homogemzát lyzovaných buniek sa solubilizuje v 4 až 5 M roztoku guanidínhydrochloridu a po zriedení na 1,2 M guanidinhydrochlorid sa za prídavku redukčného činidla (glutatiónu, merkaptoetanolu alebo cysteínu) podrobia počas 2 až 5 hodín reakcii spätného zriasenia (porov. B. Winkler et al. in (11)). Takto získaná rscuPA s jedným reťazcom sa po prídavku plazmínu prevedie na rtcu-PA s dvoma reťazcami, ktorých aktivita sa potom určuje so substrátom S2444 (pyroGlu-Gly-Arg-p-nitroanilid, Kabi Diagnostika, Švédsko), ktorý sa dá odštiepiť iba aktívnymi urokinázami s dvoma reťazcami. Táto aktivácia rscu-PA plazmínom sa vykonáva v 50 mM Tris-pufra, 12 mM nátriumchloridu, 0,02 % Tween pri pH 7,4 a 37 °C. Pomer rscu-PA k plazmínu by mal byť asi 100 až 1500 k 1, vzťahujúc na molaritu, alebo asi 8 000 až 36 000 k 1 vzťahujúc na jednotky enzýmu. Testovacia inkubácia sa vykonáva v 50 mM Tris-pufra, 38 mM nátriumchloridu pri pH 8,8 a v prítomnosti 0,36 μΜ aprotínu (pre inhibíciu plazmínu) a 0,27 mM S 2444 pri 37 °C. Vždy podľa obsahu rscu-PA vo vzorke sa reakcia zastaví po 5 až 60-minútovej inkubácii prídavkom 90 % kyseliny octovej a pri 405 nm sa zmeria extinkcia. Podľa údajov výrobcu substrátu S 2444 predstavuje pri tomto postupe zmena extinkcie 0,05 za minútu pri 405 nm aktivitu 25 Ploug - jednotiek/ml testovaného roztoku.

Výťažky rscu-PA, ktoré sa získajú pri použití rôznych plazmidov vyrobených podľa vynálezu v proteíne predstupňa získanom pri rôznych baktériách, boli reprodukované na obr. 10, 12 a 14.

Ako vyplýva z obr. 11, ako i uvedených údajov nasledujúcich príkladov - hlavne tabuliek - vyvolávajú plazmidy, ktoré možno získať podľa vynálezu výhodne v kmeňoch E. coli tvorbu predstupňa proteínu rscu-PA s výťažkom expresie 10 až 25 % hmotn., hlavne 14 až 20 % hmotu, vytvoreného celkového proteínu. Výťažok expresie je teda pri použití nových plazmidov prinajmenšom 10 až 15-krát vyšší ako výťažok získaný so známymi plazmidmi, ako napríklad pUK 54 trp 207-1.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Priložené výkresy znázorňujú:

Obr. la a lb: konštrukciu plazmidu pBF 158 z komerčného plazmidu pBR 322. Pritom sa po sebe oddiali nic/bom - región a veľká časť génu rezistentného proti tetracyklínu.

Obr. 2: sekvenciu nukleotidu syntetického „multicloning site,,.

Obr. 3: konštrukciu plazmidu pBF 158-01. Znázornená je vstavba syntetického multi cloning site do plazmidu pBF 158 medzi miestami rezu Eco Rl a Hind III.

Obr. 4: konštrukciu plazmidu pBF 158-01 T. Fragment Cla I x Hind III sa nahradí zodpovedajúcim fragmentom „I„ z plazmidu pRT 61 (5), na ktorom sa nachádza tct A/orf L terminátor z Τη 10 (6).

Obr. 5a až 5g: sekvencie nukleotidu syntetických fragmentov pre gén kódujúci humánnu scu-PA (ktorých vstavba je opísaná za vytvorenia štruktúrneho génu pre scu-PA v plazmide podľa vynálezu, vychádzajúc od plazmidu pBF 158-01 T v príkladoch ld až lf a znázornená na obr. 6, 7 a 9)·

Obr. 6a až 6c: konštrukciu plazmidu pBF 158-02 T až pBF 158-06 T vstavbou fragmentov oligonukleotidu M 4 až M 8, počínajúc C-koncom požadovaného proteínu (v súlade s 3' koncom DNA reťazca) začínajúc plazmidom pBF 158-01 T.

Obr. 7a až 7c: konštrukciu plazmidu pBF 158-08 T pomocou pomocnej konštrukcie v plazmide pUC 19 (porovnaj príklad lc).

Obr. 8: sekvenciu nukleotidu syntetického Trp - promótora.

Obr. 9: konštrukciu expresného plazmidu pre proteín predstupňa humánnej rscu-PA, pBF 160. Štruktúrny gén pre scu-PA je znázornený čiernym pruhom medzi miestami rezu Nde I a Cla I.

Obr. 10: výťažky expresie proteínu predstupňa humánnej rscu-PA (stanovené ako aktivita rtcu-PA po spätnom zriasení a aktivácii) v rôznych kmeňoch E. coli transformovaných pBF 160 (o—o) alebo plazmidom pUK 54 trp 207-1 (10) (o—o) za kontroly Trp - promótora v závislosti od času po indukcii kyselinou indolakrylovou k časovému okamihu O. Udané sú aktivity rscu-PA zistené so substrátom S 2444 v Ploug - Units na ml fermentačného média s optickou hustotou rovnajúcou sa 1 pri 578 nm.

Obr. 11: denzitogram SDS-PAGE proteínov z E. coli transformovaných pBF 161 KÍ2 JM 103 - buniek po fermentácii pred (A) po 6 hodín po prídavku (B) kyseliny indolakrylovej ako induktora.

Obr. 12: výťažky expresie proteínu predstupňa humánneho rscu-PA (stanovené ako rtcu-PA aktivita po spätnom zložení s aktiváciou) v E. coli K 12 JM103 transformované pBF 171, t.j. za kontroly Tac - promótora. Indukcia sa vykonávala v čase O IPTG. Uvedená je zistená aktivita rtcu-PA proti substrátu S v Ploug - Units na 1 ml fermentačného média s optickou hustotou rovnajúcou sa 1 pri 578 nm.

Obr. 13: predĺženie vzdialenosti medzi Shine - Dalgarnovou sekvenciou (SD) a štartovacím kodónom ATG z 8 na 10 báz vyplnením miest rezu Nde I nasledujúcou ligáciou vzniknutých blunt - koncov.

Obr. 14: výťažky expresie proteínu predstupňa humánneho rscu-PA (stanovené ako rtcu-PA aktivita po spätnom zriasení a aktivácii) za kontroly promótora Trp v E. coli GRT-1 transformované plazmidom pBF 161 (o—o) alebo pBF 163 (—). Indukcia sa vykonávala kyselinou indolakrylovou bezprostredne po časovom okamihu O. Uvedené sú rtcu-PA aktivity zistené so substrátom S 2444, v Ploug

- Units na ml fermentačného média s optickou hustotou rovnajúcou sa 1 pri 578 nm.

Obr. 15a a 15b: dokonalá nukleotidová sekvencia scu-PA štruktúrneho génu s údajom aminokyselín zodpovedajúcich jednotlivým kodónom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Reštrikčné enzýmy používané v príkladoch vyhotovenia sa bežne predávajú (porov. napr. Nachr. Chem. Techn., Lab. 35,939, 1987).

Kultivačné médium používané v príkladoch na selekciu klonov obsahuje v litri: 7,8 g peptonu z mäsa, 7,8 g peptónu z kazeínu, 10 g extraktu kvasníc, 5,6 g nátriumchloridu a 10 g glukózy. Toto médium za tepla doplní 10 g agaru na liter a naleje sa na dosky.

Príklad 1

Konštrukcia expresného plazmidu pBF 160 pre proteín predstupňa rscu-PA so syntetickým scu-PA - génom za kontroly Trp promótora

a) Konštrukcia plazmidu pBF 158

i) Z plazmidu pBR 322 (Pharmacia, č. 27-4902, 4363 bp) sa nic/bom región, ktorý sa nachádza medzi bázami 2207 a 2263 (1) oddiali nasledovne (porov. i obr. 1) pBR 322 sa pri báze 2298 rozreže Nde 1, a tým linearizuje. Prečnievajúce konce sa vyplnia pomocou „fill in„ reakcie, a tým sa získajú blunt - konce. Potom sa rozštiepi pri báze 2068 a Pvu II a oba blunt - konce zvyšnej časti pBR 322 sa opäť ligujú pomocou bežnej techniky s T4 ligázou. Potom sa ligovaný podiel transformuje na kompetentné bunky E. coli KÍ 2 103 (ATCC 39403) (3). Transformované bunky sa kultivujú na médiu za prídavku 150 pg ampicilínu/ml. Zo získaných klonov sa vyberú tie, ktoré obsahujú plazmid pBF 157, ktorý sa odlišuje od východiskového plazmidu pBR 322 a) Pst 1 x BspM 11 -, b) Pst I x Bai x Bal-, c) Pst I x Ava I-fra-gmentmi menšími o 228 nukleotidov. Obe singuláme miesta rezu Pvu II a Nde I obsiahnuté v pBR 322 nie sú už v plazmide pBF 157 prítomné.

ii) z pBF 157 sa oddiali veľká časť génu rezistentného proti tetracyklínu rezaním s Eco RV x Nru I a nasledujúcou ligáciou vznikajúcich blunt - koncov. Po transformácii v E. coli KÍ2 JM 103 a kultiváciou na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa získajú klony, z ktorých sa vyberú tie, ktoré obsahujú plazmid pBF 158. Tento je o 787 nukleotidov menší ako pBF 157 a odlišuje sa okrem toho tým, že chýba miesto rezu Bam Hl. Transformácia kmeňov baktérií pBF 158 neposkytuje týmto žiadnu rezistenciu proti tetracyklínu.

b) konštrukcia pBF 158-01, vstavba syntetického site s veľkým počtom klonov

Z pBF 158 sa rezom s Eco Rl x Hind III oddiali fragment obsahujúci 31 nukleotidov a do medzery sa liguje syntetický multi cloning site, ktorého sekvencia je znázornená na obr. 2. Po transformácii podielu ligácie v E. coli K12 JM 103 a kultivácii na médiu 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pBF 158-01. Tento sa odlišuje od pBF 158 prídavnými singulámymi miestami rezu Xba I, Nde I, Sac I, Hag I, Κρη I, Spe I, ako i druhým Pst-I miestom rezu (obr. 3).

c) konštrukcia pBF 158 01 T, vstavba transkripčného terminátora

ZpBF 158-01 sa oddiali fragment Cla I x Hind III multi cloning site a nahradí sa fragmentom Cla I x Hind III z pRT 61 (5), na ktorom sa nachádza tet A/orf L terminátor zTn 10(6).

Po transformácii do kmeňa E. coli K12 JM 103 a kultivácii na médiu 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pBF 158-01 T. Tento sa odlišuje od pBF 158-01 fragmentom Cla I x Hind III, ktorý' je väčší o 297 nukleotidov (obr. 4).

d) vstavba syntetického fragmentu M 4 - M 8 pre scu-PA -

- gén, konštrukcia plazmidu pBF 158-02 T - pBF 158-06-T

Všetky syntetické fragmenty sú opísané na obr. 5 a -

- 5g. Tieto sú vložené do príslušných vektorov ako fragmenty dvojitých reťazcov s dĺžkou asi 200 nukleotidov. Na tieto účely sa vektory s reštrikčnými enzýmami, zodpovedajúce práve uvedeným miestam rezu, rozrežú a oddelia sa od fragmentu, ktorý sa má oddialiť elektroforézou na agarázovom géli, elektroeluáciou a čistením cez DE 52. Potom nasleduje ligácia s príslušným dvojreťazcovým syntetickým fragmentom pomocou T4 ligázy, transformácia v E. coli KÍ2 103 (obr. 6a až 6c) a selekcia na médiu obsahujúcom ampicilín.

f) Ligácia fragmentu M 8 medzi Bam Hl a Cla I v plazmide pBF 158-01 T

Vznikne plazmid pBF 158-02 T.

Oligonukleotid 019 kóduje C-terminálnu sekvenciu scu-PA. Za Stop - kodónom TAA sa nachádza miesto rezu Nde I, nasledované prídavnými transkripčnými terminálnymi sekvenciami trp A terminátora (8) až Cla I.

ii) Ligácia fragmentu M 7 medzi Spe I a Bam Hl v plazmide pBF 158-02 T

Vznikne plazmid pBF 158-03 T.

iii) Ligácia fragmentu M 6 medzi Κρη I a Spe I v plazmide pBF 158-03 T.

Vznikne pBF 158-04 T.

iv) Ligácia fragmentu M 5 medzi Kag I a Κρη I v plazmide pBF 158-04 T.

Vznikne plazmid pBF 158-05 T.

v) Ligácia fragmentu M 4 medzi Sac I a Kag I v plazmide pBF 158-05 T.

Zo získaných klonov i - v sa vyberú tie, ktoré sa od predchodcov odlišujú prítomnosťou vstavaného nového fragmentu v preskúšanej správnej sekvencií.

c) vstavba syntetických fragmentov M 2 a M 3 pre scu-PA gén, konštrukcia pBF 158-08 T

Vzhľadom na to, že pre vstavbu fragmentov M 2 a M 3 je nevyhnutný Pst I - rez a na plazmide pBF 158 až doteraz na tento účel používanom sa nachádza ešte jedno miesto rezu Pst I (v géne rezistentnom proti ampicilínu), ktoré by pri nasledujúcom klonovaní rušilo, postupuje sa nasledovne (obr. 7a až 7c).

i) Z plazmidu pUC 19, ktorý sa zvyčajne predáva (napr. Pharmacia) sa multi cloning site a dodatočne 212 nukleotidov v smere nahor po prúde oddiali ako fragment Nde I x Hind III. Do vzniknutej medzery sa potom liguje syntetický multi cloning site z plazmidu pBF 158-04-3T ako fragment Nde 1 x Hind III. Tento plazmid pBF 158-04-3T sa získa z plazmidu pBF 158-02 T (porov. príklad Idi) vstavbou fragmentu M 6 oligonukleotidu a zodpovedá plazmidu pBF 158-04 T bez fragmentu M 7. Po transformácii v bunkách E. coli K 12 JM 103 a kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pUC 19-04-3. Tento sa odlišuje od pUC 19 prítomnosťou fragmentu Nde I x Hind III s dĺžkou 712 nukleotidov.

ii) Z pUC 19-04-3 sa oddiali fragment Pst 1 x Sac 1, izoluje sa linearizovaný vektor a liguje sa s fragmentom oligonukleotidu M 3. Po transformácii v E. coli K12 JM 103 a kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pUC 19-07. Tento sa odlišuje od pUC 19-04-3 fragmentom Pst I x Sac s dĺžkou 189 nukleotidov, ktorý obsahuje fragment M 3 so správnou sekvenciou.

iii) Z plazmidu pUC 19-07, ktorý bol opísaný, sa oddiali fragment I x Pst a do medzery sa liguje fragment M 2. Po transformácii v E. coli K 12 JM 103 a kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pUC 19-08. Tento sa odlišuje od pUC 19-07 prítomnosťou Nde I x Pst I fragmentu M 2 s dĺžkou 246 bp so správne preskúmanou sekvenciou.

iv) Z plazmidu pUC sa oddialia fragmenty M 2 a M 3 ako fragment Nde I x Sac I a do väčšej časti pBF 158-06-T získanej po reze s Nde I x Sac I sa liguje. Po transformácii v E. coli K12 JM 103 a kultivácii na mcdiu so 150 pg ampicilínu sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú plazmid pBF 158-08 T. Tento sa odlišuje od pBF 158-06 prítomnosťou Nde 1 x Sac I s dĺžkou 435 nukleotidov.

f) Konštrukcia plazmidu pBF 160, vstavba syntetického Trp promótora

Sekvencia Trp promótora opísaná pod (9) sa prevezme až k miestu rezu Xba I a na konci 5’ sa predĺži sekvenciou 5 - AATTCTGAAAT-3'. Tým konštruuje miesto rezu Eco-RI (obr. 8, fragment M 1). Jednotlivé reťazce 021 a 021 A sa anelujú a ligujú do plazmidu pBF 158-08 T zrezaného Eco RI x Xba I (obr. 9). Po transformácii do E. coli KÍ2 JM 103 a kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú pBF 160. Plazmid pBF 160 sa odlišuje od všetkých opísaných predchodcov tým, že ním transformované kmene baktérií E. coli za prídavku kyseliny indolakrylovej exprimujú proteín predstupňa rscu-PA.

g) Test na expresiu

Rôzne kmene E. coli transformované plazmidom pBF 160, napríklad E. coli GRT-1, E. coli K12 JM 103, ako i E. coli K12 ATCC 31446, sa za rovnakých podmienok fermentujú v médiu pozostávajúcom z 38 mM amóniumsulfátu, 56 mM fosforečnanového pufra pH 7,0, 1 mM magnéziumsulfátu, 1 % kvasničného extraktu, 1 % glukózy, ktorá obsahuje 150 mg ampicilínu na liter a indukuje so 62 mg kyseliny indolakrylovej expresia proteínu predstupňa rscu-PA. Kvôli porovnaniu sa uvedené kmene transformujú predpísaným plazmidom, ktorý obsahuje gén pre ľudskú prourekinázu z banky cDNA, získaný z Dctroit 562 buniek mRNA (10), a nesie označenie pUK 54 trp 207-1 a potom sa za rovnakých podmienok fermentuje a podrobí indukcii.

Pred indukciou a každú hodinu po indukcii sa v čase celkom 6 hodín bunky zodpovedajúce suspenzii buniek s optickou hustotou (OD) 1 odstred’ujú pri 578 nm a na testovanie sa použije výťažok expresie.

ii) spätné zriasenie proteínu predstupňa na rscu-PA, jeho štiepenie na rtcu-PA a meranie aktivity

Odstredené bunky sa, ako je tu ďalej opísané, rozložia lyzozýmom a potom sa homogenát rozložených buniek použije, ako je opísané, nameranie aktivity.

Zistené výťažky expresie po meraní aktivity rtcu-PA vytvoreného z rscu-PA (získaného z proteínu predstupňa) sú znázornené na obr. 10. Z toho vyplýva, že kmene E. coli, ktoré boli transformované plazmidom pBF 160, poskytujú 10 až 15-krát vyšší výťažok expresie ako rovnaké kmene E. coli transformované plazmidom pUK 54 trp 207-1 (10) známym z literatúry. Okrem toho vyplýva z toho, že výťažok expresie vo všetkých kmeňoch sa v závislosti od plazmidu použitého pre transformáciu pohybuje pri približne rovnakých hodnotách, t.j. že najmä kmene transformované plazmidom pBF 160 (nezávisle od jednotlivého kmeňa E. coli) poskytujú vždy niekoľkonásobne vyšší výťažok expresie ako identické kmene transformované známym plazmidom pUK 54 trp 207-1.

Príklad 2

a) Konštrukcia expresného plazmidu pBF-161 pre proteín predstupňa rscu-PA so syntetickým scu-PA génom za kontroly promótora Trp

Plazmid 322 sa reže Eco RI a Hind III. Vznikajúci fragment s dĺžkou 31 nukleotidov sa oddelí preparatívnou elektroforézou na agarózovom géli. Zvyšný podiel pBR 322 sa eluuje z gélu elektroeluáciou a čistí chromatografiou cez DE 52.

Plazmid pBF 160 (príklad 1 f) sa rovnako reže Eco RI a Hind III a fragment Eco RI x Hind II s dĺžkou 1684 nukleotidov, ktorý obsahuje syntetický scu-PA gén so všetkými jednotkami regulácie (promótor Trp) sa oddelí elektroforézou na agarózovom géli a čistí ako je opísané.

Takto získané fragmenty sa ligujú zvyčajným spôsobom ligázou T4 a potom sa v E. coli K12 JM 103 transformujú. Po kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, ktoré obsahujú fragment Eco RI x x Hind III s dĺžkou 1684 nukleotidov a po prídavku kyseliny indolakrylovej produkujú proteín predstupňa rscu-PA. Tieto klony obsahujú plazmid pBF 161.

b) Test na expresiu

E. coli CRT-I, E. coli KÍ2 JM 103 a E. coli K 12 ATCC 31446 sa transformujú pBF 161 a potom sa fermentujú spôsobom opísaným v príklade l.g) a výsledok expresie sa testuje. Výťažky proteínu predstupňa rscu-PA sa určujú ako rtcu-PA aktivita, po 1 až 6 hodinách po indukcii sú porovnateľné s hodnotami výťažku znázornenými na obr. 10 na použitie plazmidu pBF 160 na transformáciu.

Bunková peleta získaná odstreďovaním analogicky ako v príklade l.gi) sa môže rozložiť i varením v 0,25 M Tris HC1 pufra, pH 8,0 so 4 % SDS, 1 % merkaptoetanolu a 20 % glycerínu. Takto rozpustené proteiny sa oddelia SDS-PAGE a zviditeľnia sa ofarbením Coomasieblue. Ofarbené gély sa vyhodnotia denzitometricky a plochy pod pikmi sa integrujú. Podiel proteínu predstupňa rscu-PA vytvorený po indukcii s kyselinou indolakrylovou sa zisťuje odpočítaním plochy pásu identifikovaného ako proteín predstupňa pred indukciou od pásu zisteného po indukcii. Na obr. 11 je znázornený denzitogram proteínov získaných z buniek E. coli K 12 JM 103. V predloženom príklade je podiel proteínu predstupňa rscu-PA po indukcii 17,9 % hmotn. všetkého bakteriálneho proteínu. Ďalšie príklady sú uvedené v tabuľke.

Tabuľka 3 Podiel proteínu predstupňa rscu-PA v celkovom proteíne v percentách

Kmeň E. coli	Transformované
	pBF 161	pUK 54 trp 207-1 (10)
K 12 ATCC 31446	14,0	1,5
K 12 JM 103	17,9	1,9
GRT-1	17,8	1,7

Príklad 3

Konštrukcia expresného plazmidu pre proteín predstupňa rscu-PA so syntetickým scu-PA génom za kontroly promótora trp v pBR 322 s deléciou v géne rezistentnom proti tetracyklínu

a) konštrukcia plazmidu pBR 322 del

Plazmid pBR 322 sa reže Eco RV a Nru I. Vznikajúci fragment veľkosti 787 nukleotidov sa oddiali elektroforézou na agarózovom géli, zvyškový podiel pBR 322 sa eluuje z gélu elektroeluáciou a čisti sa cez DE 52. Konce blunt pBR 322 Eco RV x Nru I zvyškového podielu sa ligujú bežným spôsobom T4 ligázou. Po transformácii v E. coli K12 JM 103 a po kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú tie klony, z ktorých alikvotná časť po prenesení na médium s 25 pg tetracyklinu/ml na tomto nerastie, t.j. nemá rezistenciu proti tetracyklínu. Klony obsahujú plazmid pBR 322 del, ktorý sa odlišuje od pBR 322 tým, že je o 787 nukleotidov menši a nemožno ho už rezať Eco RV a Nru I.

b) Konštrukcia plazmidu pBF 162 pBR 322 del sa reže Eco RI a Hind III. Vznikajúci fragment s dĺžkou 31 nukleotidov sa oddelí preparatívnou elektroforézou na agarózovom géli, zvyšný podiel pBR 322 del sa eluuje z gélu elektroeluáciou a čistí sa cez DE 52.

Z pBF sa získa rovnakým spôsobom Eco RI x Hind III fragment s dĺžkou 1684 nukleotidov, ktorý obsahuje syntetický scu-PA gén so všetkými regulačnými jednotkami (promótor trp).

Oba fragmenty sa ligujú zvyčajným spôsobom T4 - ligázou a potom sa transformujú v bunkách E. coli K 12 JM 103. Po kultivácii na médiu 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú klony, ktoré obsahujú fragment Eco RI x Hind III s dĺžkou 1684 bp a po prídavku 62 pg indolakrylovej kyseliny/ml produkujú proteín predstupňa rscu-PA. Tieto klony obsahujú plazmid pBF 162.

c) Test expresie

E. coli GRT-1 sa transformuje pBF 162, a potom sa fermentuje spôsobom opísaným v príklade l.g) a výsledok expresie sa stanoví testom. Výťažok proteínu predstupňa rscu-PA stanovený 6 hodín po indukcii je 1300 PU/ml bunkovej suspenzie s optickou hustotou 1 a je porovnateľný s hodnotami výťažku znázornenými na obr. 10 pre expresiu po transformácii E. coli GRT-1 a plazmidom pBF 160.

Príklad 4

a) Konštrukcia expresného plazmidu pBF 171 pre proteín predstupňa rscu-PA so syntetickým scu-PA génom za kontroly promótora Tac

Plazmid pBF 164 sa reže Eco RI a Xba I. Vznikajúci fragment dlhý 74 nukleotidov sa oddelí preparatívnou elektroforézou na agarózovom géli, zvyškový podiel plazmidu sa eluuje elektroeluáciou a potom sa čistí cez DE 52.

Z plazmidu ptac SDT (DSM 5018) sa izoluje fragment Eco Rl x Xba I, ktorý obsahuje promótor Tac. K tomu sa ptac SDT rozreže Eco Rl x Xba I a fragment sa oddelí preparativnou PAGE. Fragment sa eluuje zahriatím na 65 °C v amónium-acetátovom/SDS pufre, pH 8,0, z mechanicky rozdrveného polyakrylamidu a čistí sa viacnásobnou extrakciou fenolom, ktorý je nasýtený 1 N Tris - pufrom, pH

8.

Oba takto získané fragmenty sa ligujú zvyčajným spôsobom T4 ligázou a potom sa transformujú v E. coli K 12 JM 103. Po kultivácii na médiu 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú klony, ktoré po prídavku IPTG produkujú rscu-PA proteín predstupňa. Tieto klony obsahujú plazmid pBF 171.

b) Test expresie

E. coli K 12 JM 103 sa transformuje pBF 171a potom sa fermentuje spôsobom opísaným v príklade 1 .g) a výsledok expresie sa testuje. Indukcia sa vykonáva ale s IPTG (konečná koncentrácia 0,5 mM).

Výťažky rscu-PA proteínu predstupňa, stanovené ako aktivita rtcu-PA 6 hodín po indukcii sú znázornené na obr.

12. Tieto sú porovnateľné s hodnotami výťažkov znázornenými na obr. 10 na použitie plazmidu pBF 160 v rovnakom kmeni E coli.

Príklad 5

a) Konštrukcia expresného plazmidu pBF 172 pre proteín predstupňa rscu-PA so syntetickým scu-PA génom za kontroly promótora Tac v pBR 322 s deléciou v géne rezistentnom proti tetracyklínu

Plazmid pBR 322 del (pozri príklad 3.a)) sa reže Eco Rl x Hind III. Vznikajúci fragment s dĺžkou 31 nukleotidov sa oddelí preparatívnou elektroforézou na agarózovom géli, zvyškový podiel pBR 322 del sa eluuje z gélu elektroeluáciou a potom sa čistí cez DE 52.

Z pBF 171 (príklad 4.a)) sa rovnakým spôsobom získa syntetický scu-PA gén so všetkými regulačnými jednotkami (promótor Tac).

Oba takto získané fragmenty sa ligujú bežným spôsobom ligázou T4 a potom sa transformujú v bunkách E. coli K 12 JM 103. Po kultivácii na médiu so 150 pg ampicilínu/ml sa vyberú klony, ktoré produkujú v prítomnosti 0,5 mM ITPG rscu-PA proteín predstupňa. Tieto klony obsahujú plazmid pBF 172.

b) Test expresie

E. coli K12 JM 103 sa transformuje pBF 172, a potom sa fermentuje spôsobom opísaným v príklade l.g) a testuje sa výsledok expresie. Indukcia sa vykonáva ale s IPGT (konečná koncentrácia 0,5 mM). Výťažky rscu-PA proteínu predstupňa stanovené ako aktivita rtcu-PA 1 až 6 hodín po indukcii je asi 1 100 PU/ml bunkovej suspenzie s optickou hustotou 1 a sú porovnateľné s hodnotami výťažkov znázornenými na obr. 10 na použitie plazmidu pBF 160 v rovnakom kmeni E. coli.

Príklad 6

Zmena vzdialenosti medzi Shine - Dalgamovou sekvenciou a štartovacím kodónom v expresnom plazmide pre rscu-PA proteín predstupňa

Štartovací kodón ATG vo všetkých konštrukciách opísaných v príkladoch 1 až 5 je súčasťou Nde I - miesta rezu -CATATG-. Nde I reže za prvým A hexanukleotidovú sekvenciu a poskytuje 5' konce, ktoré prečnievajú o dve bázy. Ak sa koniec 3' doplní, t. j. konštruujú sa tak blunt - konce a potom sa znova liguje, predĺži sa dotyčná sekvencia o 2 páry báz. Súčasne sa eliminuje Nde I miesto. Ako je zrejmé z obr. 13, predĺži sa v tam znázornených príkladoch vzdialenosť od S.D. sekvencie až k štartovaciemu kodónu o 8 až 10 párov báz. Ďalej je vysvetlené experimentálne vyhotovenie najednom príklade.

a) Konštrukcia plazmidu pBF 163

Plazmid pBF 161 sa reže Nde I a potom sa prečnievajúce konce vyplnia Klenovým fragmentom polymerizáciou DNA I (2). Potom sa DNA liguje ako zvyčajne ligáciou T4 a potom sa transformuje v E. coli E 12 JM 103. Po kultivácii na médiu obsahujúcom ampicilín sa vyberú klony, ktoré obsahujú plazmid pBF 163. Tento sa odlišuje od pBF 161 tým, že chýba miesto Nde I a prídavnými bázami v oblasti vodiaceho miesta Nde I (porov. obr. 13).

b) Test expresie

E. coli GRT 1 sa transformuje plazmidom pBF 163, a potom sa fermentuje spôsobom opísaným v príklade l.g) a výsledok expresie sa testuje. Výťažky rscu-PA proteínu predstupňa, stanovené po spätnom zriasení a aktivácii ako aktivita rtcu-PA pre ml bunkovej suspenzie s optickou hustotou 1 až 6 hodín po indukcii 62 mg kyseliny indolakrylovej, sú uvedené na obr. 14. Tieto sú porovnateľné s hodnotami výťažku znázornenými na obr. 10 na použitie plazmidu pBF 160 v rovnakom kmeni E. coli.

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Plazmidy na použitie pri získavaní aktivátora plazminogénu, vyznačujúce sa tým, že ich operón obsahuje:

   Trp - promótor alebo Tac - promótor ako regulovateľný promótor, Shine - Dalgarnovu sekvenciu účinnú ako väzobné miesto ribozómov, štartovací kodón v odstupe 6 až 12 nukleotidov od Shine Dalgamovej sekvencie, syntetický štruktúrny gén pre urín - plazminogénový aktivátor „scuPA,, s jedným reťazcom obsahujúcim 411 zvyškov aminokyselín, v ktorom sa použije ako kodón pre arginin triplet CGT, pre leucin triplet CTG, pre valín triplet GTT, pre prolín triplet CCG a/alebo pre glycín triplet GGT a v smere po prúde dole od štruktúrneho génu jeden alebo dva terminátory, zvolené zo skupiny zahrnujúcej trp A terminátor a/alebo tet A/orf L terminátor zTn 10 a žc sú vhodné na expresiu rscu-PA proteínu v Enterobakteriaceae, výhodne v kmeňoch Eschericia coli.
2. 2. Plazmidy podľa nároku 1,vyznačujúce sa t ý m , že odstup medzi Shine - Dalgamovou sekvenciou a štartovacím kodónom je 8 až 10 nukleotidov.
3. 3. Plazmidy podľa nároku 1,vyznačujúce sa t ý m , že regulovateľný promótor je syntetický Trp- promótor s nuklcotidovou sekvenciou podľa obr. 8.
4. 4. Plazmidy podľa nároku 1,vyznačujúce sa t ý m , že regulovateľný promótor je Tac- promótor z plazmidu ptac SDT (DSM 5018).
5. 5. Plazmidy podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúce sa tým, že štruktúrny gén má sekvenciu nukleotidov podľa obr. 15.
6. 6. Plazmidy podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že v plazmide pBR 322 nesú operón, z ktorého je odstránený nic/bom - región.
7. 7. Plazmidy podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa tým, že v plazmide pBR 322 nesú operón, z ktorého je celkom alebo čiastočne odstránený gén tetracyklínovej rezistencie až pokým plazmid, ním transformovaným bakteriálnym kmeňom, neprepožičiava žiadnu tetracyklínovú rezistenciu.
8. 8. Plazmidy podľa nárokov 1 až 7, vyznačujúce sa tým, že v plazmide pBR 322 nesú operón, z ktorého je odstránený nic/bom - región a aspoň časť génu tetracyklínovej rezistencie až pokým plazmid, ním transformovaným bakteriálnym kmeňom, neprepožičiava žiadnu tetracyklínovú rezistenciu.
9. 9. Plazmidy podľa nárokov 1 a 3, ktorými sú plazmid pBF 160 s reštrikčnou mapou podľa obr. 9, pBF 161, vyrobený podľa príkladu 2, pBF 162, vyrobený podľa príkladu 3 a pBF 163, vyrobený podľa príkladu 6.
10. 10. Plazmidy podľa nárokov 1 a 4, ktorými sú plazmid pBF 171, vyrobený podľa príkladu 4 a pBF 172, vyrobený podľa príkladu 5.
11. 11. Plazmidy podľa nárokov 1 až 10 s ďalším znakom, že spôsobujú v kmeňoch E. coli, výhodne podskupine E. coli K12, tvorbu rscu-PA predstupňa proteínu s hodnotou expresie aspoň 10 % hmotnostných, výhodne aspoň 14 % hmotnostných vytvoreného celkového proteínu.
12. 12. Plazmidy podľa nárokov 1 až 11 s ďalším znakom, že spôsobujú v kmeňoch E. coli, výhodne podskupine E. coli K 12, tvorbu rscu-PA predstupňa proteínu s hodnotou expresie 10 až 25 % hmotnostných, výhodne 14 až 20 % hmotnostných vytvoreného celkového proteínu.
13. 13. Spôsob výroby plazmidov podľa nároku 1, vyzná í u j ú c i sa tým, že sa do plazmidu pBR 322, z ktorého bol odstránený nic/bom - región a/alebo aspoň časť génu tetracyklínovej rezistencie, medzi miesta štiepenia Eco RI a Hind III vloží „multi cloning site,, so sekvenciou nukleotidov uvedenou na obr. 2, ktorá má medzi miestami štiepenia Xba I a Nde I Shine - Dalgarnovu sekvenciu a vo vzdialenosti 6 až 12, výhodne 8 až 10 nukleotidov, obsahuje štartovací kodón ATG a s ich pomocou sa známym spôsobom vložia jeden alebo dva transkripčné terminátory, syntetické čiastkové sekvencie scu-PA štruktúrneho génu, výhodne začínajúc od konca 3' štruktúrneho génu, ako aj regulovateľný promótor.
14. 14. Spôsob výroby plazmidov podľa nároku 1, vyzná i u j ú c i sa tým, že sa Eco RI x Hind III fragment z plazmidu získaného podľa nároku 13, známym spôsobom vloží ako expresná kazeta do iného plazmidu, schopného autonómneho rozmnožovania v Enterobakteriaceae, výhodne v E. coli.
15. 15. Spôsob výroby plazmidov podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že sa plazmid, získaný podľa nárokov 13 alebo 14, štiepi pomocou Nde I, vyplnia sa vzniknuté miesta štiepenia a nasleduje ligácia vzniknutých tupých koncov.
16. 16. Použitie plazmidov podľa nárokov 1 až 12 pri získavaní aktivátora plazminogénu, vyznačujúce sa t ý m , že sa týmto plazmidom známym spôsobom transformuje kmeň Enterobakteriaceae, výhodne kmeň E. coli, indukuje sa expresia scu-PA štruktúrneho génu, vzniknutý rscu-PA proteín predstupňa sa oddelí od média a rozložených buniek baktérií, proteín predstupňa sa solubilizuje a potom sa pôsobením redox systému skladá späť na rscu-PA formu.
17. 17. Použitie podľa nároku 16, vyznačujúce sa t ý m , že sa týmto plazmidom transformuje kmeň species E. coli, výhodne kmeň E. coli K12.