JPH0817704B2 - 外来遺伝子産物の生産方法 - Google Patents
外来遺伝子産物の生産方法Info
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- JPH0817704B2 JPH0817704B2 JP62152359A JP15235987A JPH0817704B2 JP H0817704 B2 JPH0817704 B2 JP H0817704B2 JP 62152359 A JP62152359 A JP 62152359A JP 15235987 A JP15235987 A JP 15235987A JP H0817704 B2 JPH0817704 B2 JP H0817704B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラ
スミド［ハイプリッドプラスミド（以後Hi−プラスミド
と称する）］を導入した大腸菌を、該外来遺伝子の発現
を効果的に制御しながら効率良く増殖させ、菌体の増殖
と外来遺伝子の発現の時期を分離したHi−プラスミド導
入大腸菌の培養による外来遺伝子産物の生産方法に関す
る。
スミド［ハイプリッドプラスミド（以後Hi−プラスミド
と称する）］を導入した大腸菌を、該外来遺伝子の発現
を効果的に制御しながら効率良く増殖させ、菌体の増殖
と外来遺伝子の発現の時期を分離したHi−プラスミド導
入大腸菌の培養による外来遺伝子産物の生産方法に関す
る。
近年、遺伝子組換え技術の発達により、宿主菌での外
来遺伝子の形質発現を可能とする発現ベクターに、動
物、植物、微生物等から得た所望の外来ポリペプチドを
コードする製造遺伝子を組み込んで、Hi−プラスミドを
構築し、そのHi−プラスミドを導入した宿主菌を培養し
て、宿主菌に所望の外来ポリペプチドを生産させる方法
が開発されてきている。
来遺伝子の形質発現を可能とする発現ベクターに、動
物、植物、微生物等から得た所望の外来ポリペプチドを
コードする製造遺伝子を組み込んで、Hi−プラスミドを
構築し、そのHi−プラスミドを導入した宿主菌を培養し
て、宿主菌に所望の外来ポリペプチドを生産させる方法
が開発されてきている。
この技術により、例えばヒトインシュリン、ヒト成長
ホルモン等の有用物質の大量生産が可能となりつつあ
る。
ホルモン等の有用物質の大量生産が可能となりつつあ
る。
このような遺伝子組換え技術を用いた外来遺伝子産物
を生産するために用いる宿主菌としては、その生物学的
特性の解析が十分になされており、また病原性を持た
ず、簡単な組成の培地で容易に培養可能であるという点
から大腸菌が広く用いられている。
を生産するために用いる宿主菌としては、その生物学的
特性の解析が十分になされており、また病原性を持た
ず、簡単な組成の培地で容易に培養可能であるという点
から大腸菌が広く用いられている。
ところが、一般にHi−プラスミドの大腸菌内での安定
性は必ずしも高くなく、それを導入した大腸菌の培養で
は、菌の増殖にともなって、Hi−プラスミドの構造的変
化やHi−プラスミド自体の消滅により外来遺伝子の発現
能を失ったのHi−プラスミド脱落菌が出現してくる。
性は必ずしも高くなく、それを導入した大腸菌の培養で
は、菌の増殖にともなって、Hi−プラスミドの構造的変
化やHi−プラスミド自体の消滅により外来遺伝子の発現
能を失ったのHi−プラスミド脱落菌が出現してくる。
例えば、大量培養を行なう工業的規模での生産では、
一般に本培養に必要な菌体量や菌体活性を得るための種
培養を含めて培養期間が比較的長くなり、上記のような
Hi−プラスミド脱落菌の出現が避けられず、しかも全培
養菌あたりのHi−脱落菌の割合が高くなると、最終的に
得られる培養物中の所望の外来遺伝子産物の濃度の低下
を招き、効率良い外来遺伝子の生産ができない。
一般に本培養に必要な菌体量や菌体活性を得るための種
培養を含めて培養期間が比較的長くなり、上記のような
Hi−プラスミド脱落菌の出現が避けられず、しかも全培
養菌あたりのHi−脱落菌の割合が高くなると、最終的に
得られる培養物中の所望の外来遺伝子産物の濃度の低下
を招き、効率良い外来遺伝子の生産ができない。
そこで、このようなHi−プラスミドを用いた培養にお
ける問題点を解決する手段の一つとして、菌の増殖と外
来遺伝子の発現期間とを分離させる方法が検討されてい
る。
ける問題点を解決する手段の一つとして、菌の増殖と外
来遺伝子の発現期間とを分離させる方法が検討されてい
る。
具体的には、まず導入されたHi−プラスミドの外来遺
伝子の発現を制御しつつ該プラスミド導入菌を培養し、
所望の菌体量が得られたところで、発現の制御を緩和し
て外来遺伝子を発現させて、Hi−プラスミド脱落菌の発
生を極力抑え、より効率良く外来遺伝子産物を生産しよ
うとするものである。
伝子の発現を制御しつつ該プラスミド導入菌を培養し、
所望の菌体量が得られたところで、発現の制御を緩和し
て外来遺伝子を発現させて、Hi−プラスミド脱落菌の発
生を極力抑え、より効率良く外来遺伝子産物を生産しよ
うとするものである。
このような方法に用いられる外来遺伝子の発現制御方
法としては、例えば、Hi−プラスミドに、大腸菌ラムダ
ファージのPLプロモーター（PLラムダプロモーター）・
オペレーターや大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーター（trpプロモーター）・オペレーター等のレプレ
ッサーを不活性化する誘導試薬の添加によって任意の時
期に外来遺伝子の発現を誘発できる誘導型発現プロモー
ターを用いる方法や、温度依存性を有する複数開始領域
を持つ（すなわちその複製開始に必要な所定の温度もし
くは温度範囲を有する）温度制御型のベクターを用い、
培養温度を調節して、ヒートショックを与えることによ
って外来遺伝子の発現を制御する方法が知られている。
法としては、例えば、Hi−プラスミドに、大腸菌ラムダ
ファージのPLプロモーター（PLラムダプロモーター）・
オペレーターや大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーター（trpプロモーター）・オペレーター等のレプレ
ッサーを不活性化する誘導試薬の添加によって任意の時
期に外来遺伝子の発現を誘発できる誘導型発現プロモー
ターを用いる方法や、温度依存性を有する複数開始領域
を持つ（すなわちその複製開始に必要な所定の温度もし
くは温度範囲を有する）温度制御型のベクターを用い、
培養温度を調節して、ヒートショックを与えることによ
って外来遺伝子の発現を制御する方法が知られている。
しかしながら、誘導型発現プロモーターを用いた方法
では、発現誘導のための誘導試薬が高価であるため生産
コストの上昇を招き、更に、Hi−プラスミド脱落菌の出
現、増加を十分に抑えられないという問題があり、工業
的な規模での培養には適用しにくい。
では、発現誘導のための誘導試薬が高価であるため生産
コストの上昇を招き、更に、Hi−プラスミド脱落菌の出
現、増加を十分に抑えられないという問題があり、工業
的な規模での培養には適用しにくい。
また、従来の、温度制御型のベクターを用いた方法で
も、Hi−プラスミド脱落菌の出現防止効果が十分でな
い。
も、Hi−プラスミド脱落菌の出現防止効果が十分でな
い。
本発明者らは、以上述べたような問題点に鑑み、より
効率良い外来遺伝子産物の生産を実現するために、Hi−
プラスミド導入大腸菌の培養工学的特性について種々検
討を加えたところ、Hi−プラスミド導入大腸菌の培養温
度を調節するだけで、大腸菌での外来遺伝子の発現を効
果的に制御できることを新たに見い出した。
効率良い外来遺伝子産物の生産を実現するために、Hi−
プラスミド導入大腸菌の培養工学的特性について種々検
討を加えたところ、Hi−プラスミド導入大腸菌の培養温
度を調節するだけで、大腸菌での外来遺伝子の発現を効
果的に制御できることを新たに見い出した。
更に、Hi−プラスミド導入菌を培養して外来遺伝子産
物を生産する際に、このような培養濃度の調整による発
現制御方法を用いて外来遺伝子の発現制御時期を操作し
て、菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離すれば、
Hi−プラスミド脱落菌の発生が十分に抑えられた良好な
菌体増殖と、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能とな
るとの結論を得た本発明を完成した。
物を生産する際に、このような培養濃度の調整による発
現制御方法を用いて外来遺伝子の発現制御時期を操作し
て、菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離すれば、
Hi−プラスミド脱落菌の発生が十分に抑えられた良好な
菌体増殖と、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能とな
るとの結論を得た本発明を完成した。
本発明の目的は、Hi−プラスミドが導入された大腸菌
の培養または保存において、Hi−プラスミドに挿入され
た外来遺伝子の発現を簡易な操作によって効果的に制御
できる方法を提供することにある。
の培養または保存において、Hi−プラスミドに挿入され
た外来遺伝子の発現を簡易な操作によって効果的に制御
できる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、培養物に高濃度で所望の外来遺
伝子産物を効率良く生産することができ、特に工業的規
模でのHi−プラスミド導入大腸菌による外来遺伝子産物
の生産に好適な方法を提供することにある。
伝子産物を効率良く生産することができ、特に工業的規
模でのHi−プラスミド導入大腸菌による外来遺伝子産物
の生産に好適な方法を提供することにある。
本発明の外来遺伝子の発現制御方法は、発現ベクター
に所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラスミドを導
入して該外来遺伝子の発現を可能とした大腸菌の増殖菌
体の調製や植え継ぎ保存のための培養において、該大腸
菌の培養温度を40℃以上に維持することにより前記外来
遺伝子の発現を抑制することを特徴とする。
に所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラスミドを導
入して該外来遺伝子の発現を可能とした大腸菌の増殖菌
体の調製や植え継ぎ保存のための培養において、該大腸
菌の培養温度を40℃以上に維持することにより前記外来
遺伝子の発現を抑制することを特徴とする。
本発明の方法に用いられるHi−プラスミド（組換え体
プラスミド）とは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能
とする構成を有する発現ベクターに所望の外来遺伝子を
挿入して得られるものである。
プラスミド）とは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能
とする構成を有する発現ベクターに所望の外来遺伝子を
挿入して得られるものである。
Hi−プラスミドを構成する発現ベクターとしては、大
腸菌で複数可能なベクターと、該ベクターに結合させ
た、PLダムダプロモーター、trpプロモーター、と大腸
菌ラクトースオペロンのプロモーター（lacプロモータ
ー）の融合プロモーター（tacプロモーター）とPLラム
ダプロモーターの連結プロモーターとを有する構成のも
のなどを挙げることができる。また、Hi−プラスミドを
導入する宿主大腸菌としては、例えばcIリプレッサーの
ような40℃未満の温度で発現するリプレッサーを有しな
い大腸菌、例えばMC1061株等が用いられる。
腸菌で複数可能なベクターと、該ベクターに結合させ
た、PLダムダプロモーター、trpプロモーター、と大腸
菌ラクトースオペロンのプロモーター（lacプロモータ
ー）の融合プロモーター（tacプロモーター）とPLラム
ダプロモーターの連結プロモーターとを有する構成のも
のなどを挙げることができる。また、Hi−プラスミドを
導入する宿主大腸菌としては、例えばcIリプレッサーの
ような40℃未満の温度で発現するリプレッサーを有しな
い大腸菌、例えばMC1061株等が用いられる。
なお、ここでいう外来遺伝子とは、例えば真核細胞由
来のポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有す
る非大腸菌由来のポリペプチドなどの野性型大腸菌では
通常生産されないポリペプチドをコードする構造遺伝子
をいう。
来のポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有す
る非大腸菌由来のポリペプチドなどの野性型大腸菌では
通常生産されないポリペプチドをコードする構造遺伝子
をいう。
本発明のポイントである発現制御は、Hi−プラスミド
導入大腸菌の培養温度を調製することによってHi−プラ
スミドに組込まれた外来遺伝子の発現を制御するもので
ある。
導入大腸菌の培養温度を調製することによってHi−プラ
スミドに組込まれた外来遺伝子の発現を制御するもので
ある。
具体的には、外来遺伝子の発現を抑制したい場合に
は、Hi−プラスミド導入大腸菌の培養温度を40℃以上と
し、また、外来遺伝子を発現させたい場合には、40℃未
満とする。
は、Hi−プラスミド導入大腸菌の培養温度を40℃以上と
し、また、外来遺伝子を発現させたい場合には、40℃未
満とする。
このように培養温度を40℃以上に維持してHi−プラス
ミド導入菌の培養を行なうと、外来遺伝子の発現を効果
的に抑制でき、良好な菌体増殖が得られ、しかも所望の
菌体量が得られるまでの培養期間を通してHi−脱落菌の
出現を効果的に抑えることができ、また、40℃以上での
植え継ぎ培養での保持により、Hi−プラスミド脱落菌の
出現を抑えたまま大腸菌を保存しておくことも可能であ
る。その上、本発明の外来遺伝子の発現制御は、培養温
度の調節という簡易な操作で、外来遺伝子の発現を制御
できるので、先に述べたような発現誘導試薬などのよう
な特別高価を試薬を使用しなくてもすむ。
ミド導入菌の培養を行なうと、外来遺伝子の発現を効果
的に抑制でき、良好な菌体増殖が得られ、しかも所望の
菌体量が得られるまでの培養期間を通してHi−脱落菌の
出現を効果的に抑えることができ、また、40℃以上での
植え継ぎ培養での保持により、Hi−プラスミド脱落菌の
出現を抑えたまま大腸菌を保存しておくことも可能であ
る。その上、本発明の外来遺伝子の発現制御は、培養温
度の調節という簡易な操作で、外来遺伝子の発現を制御
できるので、先に述べたような発現誘導試薬などのよう
な特別高価を試薬を使用しなくてもすむ。
このような本発明の外来遺伝子の発現制御方法を、Hi
−プラスミド導入大腸菌を培養してHi−プラスミドに組
込んだ外来遺伝子由来の外来遺伝子産物を生産する方法
に適用すれば、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能と
なる。
−プラスミド導入大腸菌を培養してHi−プラスミドに組
込んだ外来遺伝子由来の外来遺伝子産物を生産する方法
に適用すれば、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能と
なる。
すなわち、上述した本発明の発現制御方法を用いたHi
−プラスミド導入大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法
は、大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法において、 ａ） PLラムダプロモーター、trpプロモーター、また
はtacプロモーターとPLラムダプロモーターとの連結プ
ロモーターを有する発現ベクターの該プロモーターによ
ってその発現が支配される位置に前記外来遺伝子産物を
コードする外来遺伝子を挿入した構成の組換え体プラス
ミドを調製する過程と、 ｂ） 該組換え体プラスミドを、40℃未満で発現する温
度感受性のリピレッサーを有しない大腸菌に導入する過
程と、 ｃ） 該組換え体プラスミドが導入された大腸菌を、培
養温度を40℃以上で該大腸菌の増殖可能な温度に維持し
て前記外来遺伝子の発現を抑制しつつ培養する第１の培
養過程と、 ｄ） 該第１の培養過程で増殖した大腸菌を40℃未満で
該大腸菌の培養が可能な培養温度で培養する第２の培養
過程 とを有することを特徴とする。
−プラスミド導入大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法
は、大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法において、 ａ） PLラムダプロモーター、trpプロモーター、また
はtacプロモーターとPLラムダプロモーターとの連結プ
ロモーターを有する発現ベクターの該プロモーターによ
ってその発現が支配される位置に前記外来遺伝子産物を
コードする外来遺伝子を挿入した構成の組換え体プラス
ミドを調製する過程と、 ｂ） 該組換え体プラスミドを、40℃未満で発現する温
度感受性のリピレッサーを有しない大腸菌に導入する過
程と、 ｃ） 該組換え体プラスミドが導入された大腸菌を、培
養温度を40℃以上で該大腸菌の増殖可能な温度に維持し
て前記外来遺伝子の発現を抑制しつつ培養する第１の培
養過程と、 ｄ） 該第１の培養過程で増殖した大腸菌を40℃未満で
該大腸菌の培養が可能な培養温度で培養する第２の培養
過程 とを有することを特徴とする。
本発明の方法における第１の培養過程では、培養温度
が40℃以上に維持されて、Hi−プラスミドに組み込まれ
て大腸菌内に導入された外来遺伝子の発現が抑制され
る。その結果、第１の培養過程では、良好な菌の増殖が
得られ、効率良く所望とする菌体量を得ることができ
る。その上、所望とする菌体量を得るまでにHi−プラス
ミド脱落菌の出現はほとんど無視できる程度に抑えられ
る。また、菌体の増殖活性を維持しつつ長期にわたって
植え継ぎ培養を行なう場合でもこのように発現を制御す
ることによって同様に、Hi−プラスミド脱落菌の出現を
抑えることができる。
が40℃以上に維持されて、Hi−プラスミドに組み込まれ
て大腸菌内に導入された外来遺伝子の発現が抑制され
る。その結果、第１の培養過程では、良好な菌の増殖が
得られ、効率良く所望とする菌体量を得ることができ
る。その上、所望とする菌体量を得るまでにHi−プラス
ミド脱落菌の出現はほとんど無視できる程度に抑えられ
る。また、菌体の増殖活性を維持しつつ長期にわたって
植え継ぎ培養を行なう場合でもこのように発現を制御す
ることによって同様に、Hi−プラスミド脱落菌の出現を
抑えることができる。
本発明における第２の培養過程では、培養温度が40℃
未満とされ、Hi−プラスミド保持菌での外来遺伝子の発
現の制御が解除される。すると、Hi−プラスミド保持菌
で外来遺伝子が発現し、外来遺伝子産物の生産が行なわ
れる。その際、第１の培養過程で得られた全培養菌に占
めるHi−プラスミド脱落菌の割合はほとんど無視できる
程度に小さいので、全培養菌のほとんどで効率良く外来
遺伝子が発現され、十分に高い濃度で外来遺伝子産物を
培養中に得ることができる。
未満とされ、Hi−プラスミド保持菌での外来遺伝子の発
現の制御が解除される。すると、Hi−プラスミド保持菌
で外来遺伝子が発現し、外来遺伝子産物の生産が行なわ
れる。その際、第１の培養過程で得られた全培養菌に占
めるHi−プラスミド脱落菌の割合はほとんど無視できる
程度に小さいので、全培養菌のほとんどで効率良く外来
遺伝子が発現され、十分に高い濃度で外来遺伝子産物を
培養中に得ることができる。
なお、第１の培養過程での培養温度と第２の培養過程
での培養温度の組み合わせとしては、例えば40〜45℃と
30〜38℃の組み合わせなどを用いることができる。
での培養温度の組み合わせとしては、例えば40〜45℃と
30〜38℃の組み合わせなどを用いることができる。
このような本発明の方法によって、菌体を大量に培養
して培養物を大量に生産すれば、培養物中に外来遺伝子
産物を高濃度で得られるので、外来遺伝子産物の生産量
を相乗的に増加させることができる。
して培養物を大量に生産すれば、培養物中に外来遺伝子
産物を高濃度で得られるので、外来遺伝子産物の生産量
を相乗的に増加させることができる。
しかも、先に述べたように外来遺伝子の発現をともな
う菌体の増殖過程では、例えば植え継ぎ培養期間が長く
なるほどHi−プラスミド脱落菌の培養菌に占める割合が
増加するので、その培養期間をあまり長くとることがで
きなかったが、本発明の方法においては、第１の培養過
程で、必要に応じて、十分に長い培養期間をとることが
できるので、本発明の方法は、所望の菌体量を得るため
の培養を十分に長い期間効果的に行なうことができ、比
較的長い前培養期間が必要とされる工業的規模での大量
培養に特に好適である。
う菌体の増殖過程では、例えば植え継ぎ培養期間が長く
なるほどHi−プラスミド脱落菌の培養菌に占める割合が
増加するので、その培養期間をあまり長くとることがで
きなかったが、本発明の方法においては、第１の培養過
程で、必要に応じて、十分に長い培養期間をとることが
できるので、本発明の方法は、所望の菌体量を得るため
の培養を十分に長い期間効果的に行なうことができ、比
較的長い前培養期間が必要とされる工業的規模での大量
培養に特に好適である。
なお、第１の培養過程と、第２の培養過程との切換え
時期は、用いるHi−プラスミド導入菌の種類や第１およ
び第２の培養過程に用いる培養方法にもよるが、例え
ば、小容量での種菌を得る前培養と、大容量でのバッチ
式による本培養を行なう際に本発明の方法を適用する場
合、前培養と本培養における対数増殖期の前期までを本
発明の第１の培養過程とし、それ以降を第２の過程とす
れば良いが、所望に応じて適宜選択し得る。また、第１
の培養過程と第２の培養過程は、時間的な開きがあって
も構わない。
時期は、用いるHi−プラスミド導入菌の種類や第１およ
び第２の培養過程に用いる培養方法にもよるが、例え
ば、小容量での種菌を得る前培養と、大容量でのバッチ
式による本培養を行なう際に本発明の方法を適用する場
合、前培養と本培養における対数増殖期の前期までを本
発明の第１の培養過程とし、それ以降を第２の過程とす
れば良いが、所望に応じて適宜選択し得る。また、第１
の培養過程と第２の培養過程は、時間的な開きがあって
も構わない。
また、本発明の方法について、フェニルアラニン・ア
ンモニアリアーゼ（PAL）での例を参考例、実施例およ
び比較例により以下に示す。
ンモニアリアーゼ（PAL）での例を参考例、実施例およ
び比較例により以下に示す。
以下に参考例として、大腸菌でのPAL発現用組換え体
プラスミドの構築例を示す。
プラスミドの構築例を示す。
参考例１ 1.mRNA（PAL）の単離および精製 ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium t
oruloides IFO 559、この菌はATCC 10788としても収載
されている。）を２％グルコースを含む合成培地（表
１）で、27℃で通気攪拌培養を行い、培養初期に添加し
たグルコースを全て消費した直後に、菌体を遠心分離し
て集菌し、湿菌体を滅菌した0.85％食塩水で洗浄後再度
遠心分離を行い、湿洗浄菌体を得た。
oruloides IFO 559、この菌はATCC 10788としても収載
されている。）を２％グルコースを含む合成培地（表
１）で、27℃で通気攪拌培養を行い、培養初期に添加し
たグルコースを全て消費した直後に、菌体を遠心分離し
て集菌し、湿菌体を滅菌した0.85％食塩水で洗浄後再度
遠心分離を行い、湿洗浄菌体を得た。
該湿洗浄菌体は直ちにPAL誘導培地［２％Lpheを含む
0.17％Yeast Nitrogen Base（Difco社製、無硫安および
無アミノ酸タイプ）］に菌体濃度0.5〜0.8％になるよう
に懸濁し、27℃にて震盪攪拌を行いPALを誘導した。
0.17％Yeast Nitrogen Base（Difco社製、無硫安および
無アミノ酸タイプ）］に菌体濃度0.5〜0.8％になるよう
に懸濁し、27℃にて震盪攪拌を行いPALを誘導した。
２時間誘導処理を行った菌体はPAL誘導培地から遠心
分離で回収し、得られた湿菌体は等量の滅菌水に懸濁
後、該懸濁液を液体窒素中に滴下して凍結菌体とした。
分離で回収し、得られた湿菌体は等量の滅菌水に懸濁
後、該懸濁液を液体窒素中に滴下して凍結菌体とした。
凍結菌体10gを液体窒素中で乳鉢で粉砕を行い、50ml
の５％のSDSを添加した緩衝液Ｃ（0.1MNa2HPO4（pH7.
4）、0.15M食塩、１％デオキシコール酸ナトリウム、１
％Tritonx-100）を加え、緩やかに30分間攪拌した。
の５％のSDSを添加した緩衝液Ｃ（0.1MNa2HPO4（pH7.
4）、0.15M食塩、１％デオキシコール酸ナトリウム、１
％Tritonx-100）を加え、緩やかに30分間攪拌した。
30分後、50mlのフェノール・クロロホルム混液（フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合容量
比25:24:1）50mlを加え、15分間攪拌混合した。
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合容量
比25:24:1）50mlを加え、15分間攪拌混合した。
該混合液を遠心分離し水層を回収し、この水層に新た
に50mlのフェノール・クロロホルム混液を加え、15分間
攪拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェノール
・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。
に50mlのフェノール・クロロホルム混液を加え、15分間
攪拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェノール
・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。
最後に得られた水層に食塩の終濃度が0.2Mになるよう
に滅菌した5M食塩水を加え、さらに2.5容の冷エタノー
ルを加え、−20℃以下に保存して核酸成分を沈澱させ
た。
に滅菌した5M食塩水を加え、さらに2.5容の冷エタノー
ルを加え、−20℃以下に保存して核酸成分を沈澱させ
た。
この沈澱物を遠心分離により回収し、冷エタノールで
洗浄しその後、減圧乾燥を行なった。
洗浄しその後、減圧乾燥を行なった。
該乾燥物を10mlの滅菌水に溶解し、65℃、５分間加熱
処理を行い、オリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いたmRNAの
公知のマニアティス法［Maniatis.T.et al.,“Molecula
r Cloning"（1982）］に準じてmRNAを単離した。
処理を行い、オリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いたmRNAの
公知のマニアティス法［Maniatis.T.et al.,“Molecula
r Cloning"（1982）］に準じてmRNAを単離した。
得られたmRNAをサンプル緩衝液（5M尿素、1mM EDTA、
0.05％Bromophenolblue）に溶解後、65℃、２分間加熱
処理を行いRNAの高次構造を変性させた後、8M尿素−ア
クリルアミドスラブゲル（アクリル濃度３％、8M尿素存
在）を用いて泳動用緩衝液（89mM Tris,89mMホウ酸、2m
M EDTA）中で、100ボルト1.5時間電気泳動に供した。
0.05％Bromophenolblue）に溶解後、65℃、２分間加熱
処理を行いRNAの高次構造を変性させた後、8M尿素−ア
クリルアミドスラブゲル（アクリル濃度３％、8M尿素存
在）を用いて泳動用緩衝液（89mM Tris,89mMホウ酸、2m
M EDTA）中で、100ボルト1.5時間電気泳動に供した。
泳動後、アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド
処理し、紫外線下でmRNAのバンドを発色させてmRNAの大
きさで2.0〜3.0kbの範囲を長さで三等分に分割し、スラ
ブゲルから各ゲル断片を切り出した。
処理し、紫外線下でmRNAのバンドを発色させてmRNAの大
きさで2.0〜3.0kbの範囲を長さで三等分に分割し、スラ
ブゲルから各ゲル断片を切り出した。
各ゲル断片を透析チューブに封入し、泳動用緩衝液に
沈め、mRNAをゲルから電気的に溶出した。
沈め、mRNAをゲルから電気的に溶出した。
透析チューブ内液にフェノール・クロロホルム混液を
加え抽出操作を２回繰り返し、残フェノールをエーテル
抽出後、水層の1/10容の3M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
2）を加え、さらに2.5容の冷エタノールを添加して−20
℃に保存し、mRNAを沈澱させた。
加え抽出操作を２回繰り返し、残フェノールをエーテル
抽出後、水層の1/10容の3M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
2）を加え、さらに2.5容の冷エタノールを添加して−20
℃に保存し、mRNAを沈澱させた。
上記で得られたmRNAがPALmRNAを含有するものである
ことを確認するために、各mRNA画分から蛋白質に翻訳さ
せ、生産蛋白質をPAL特異抗体を用いて同定する方法を
行なった。
ことを確認するために、各mRNA画分から蛋白質に翻訳さ
せ、生産蛋白質をPAL特異抗体を用いて同定する方法を
行なった。
すなわち、各分画mRNAはウサギの網状赤血球溶解物を
用いた無細胞系の翻訳キットに供した［（Pelham.H.R.e
t al.,European J.Biochem.,67,247-256,（1976）］。
用いた無細胞系の翻訳キットに供した［（Pelham.H.R.e
t al.,European J.Biochem.,67,247-256,（1976）］。
ウサギの網状赤血球in vitro翻訳キットは、Promega
Biotec社のものを用い、標識アミノ酸としては35S−メ
チオニン（Amersham社）を用いた。
Biotec社のものを用い、標識アミノ酸としては35S−メ
チオニン（Amersham社）を用いた。
ウサギの網状赤血球in vitro翻訳システムで翻訳され
た蛋白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝液Ｃを加
えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、上清に自製のウ
サギの抗PAL・IgGを加えて、氷上で30分間反応させ、反
応液に羊の抗ウサギIgG（自製）を加えて、氷上で30分
間反応させ、ウサギ抗体と沈澱させた。
た蛋白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝液Ｃを加
えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、上清に自製のウ
サギの抗PAL・IgGを加えて、氷上で30分間反応させ、反
応液に羊の抗ウサギIgG（自製）を加えて、氷上で30分
間反応させ、ウサギ抗体と沈澱させた。
沈澱物を遠心分離して回収し、緩衝液Ｃで２回洗浄を
行い、該沈澱物を２％SDS、10％β−メルカプトエタノ
ール混液と0.1M Tris−リン酸（pH6.8）、１％SDS、50
％グリセリン混液とを3:1の容量で混合した溶液に溶解
し、95℃、２分間処理を行い、蛋白質のジスルフィド結
合を切断し、SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気
泳動（アクリルアミド濃度10％）をレムリの方法［Laem
mli,Nature,227,680-685,（1970）］に準じて行い、泳
動後のゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーによりPA
Lの同定を行った。
行い、該沈澱物を２％SDS、10％β−メルカプトエタノ
ール混液と0.1M Tris−リン酸（pH6.8）、１％SDS、50
％グリセリン混液とを3:1の容量で混合した溶液に溶解
し、95℃、２分間処理を行い、蛋白質のジスルフィド結
合を切断し、SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気
泳動（アクリルアミド濃度10％）をレムリの方法［Laem
mli,Nature,227,680-685,（1970）］に準じて行い、泳
動後のゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーによりPA
Lの同定を行った。
2.PALmRNAの二本鎖cDNA（ds-cDNA）への変換 PAL誘導処理２時間後の細胞から得たmRNAを上記の方
法で精製し、得られたmRNAに、Awv逆転写酵素を作用さ
せて、１本鎖cDNA分子を合成した［Gugger,U.,et al.,G
ene,25,263-269,（1983）］。
法で精製し、得られたmRNAに、Awv逆転写酵素を作用さ
せて、１本鎖cDNA分子を合成した［Gugger,U.,et al.,G
ene,25,263-269,（1983）］。
該一本鎖cDNA-mRNAハイブリットに、RNaseH、DNAポリ
メラーゼＩおよびリガーゼを作用させて、mRNAをとりの
ぞき二本鎖cDNA（ds-cDNA）を構築した。
メラーゼＩおよびリガーゼを作用させて、mRNAをとりの
ぞき二本鎖cDNA（ds-cDNA）を構築した。
3.3′末端にオリゴdC尾を有するds-cDNAの構築 上記第２項で得られたds-cDNAに末端デオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（TdT）を作用させてds-cD
NAの３′末端にオリゴdCを付加させた。
オチジルトランスフェラーゼ（TdT）を作用させてds-cD
NAの３′末端にオリゴdCを付加させた。
即ち、３μg ds-cDNAをTdT緩衝液〔100mMカコジル酸
カリウム（pH7.2）,2mM塩化コバルト、0.2mMジチオスレ
ィトール〕と0.2mM dCTPを含む反応液に溶解し、37℃５
分間前処理を行い、次いで50単位のTdTを加え、37℃15
分間反応を進行させ、その後EDTAが終濃度40mMになるよ
うに加え、氷上に置き、フェノール・クロロホルム混液
を加えて、TdTを変性失活させ、変性不溶化蛋白質を遠
心除去し、上清をフェノール抽出、冷エタノール沈澱操
作後、該沈澱物を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥を行
い、３′末端にオリゴdC付加ds-cDNAを得た。
カリウム（pH7.2）,2mM塩化コバルト、0.2mMジチオスレ
ィトール〕と0.2mM dCTPを含む反応液に溶解し、37℃５
分間前処理を行い、次いで50単位のTdTを加え、37℃15
分間反応を進行させ、その後EDTAが終濃度40mMになるよ
うに加え、氷上に置き、フェノール・クロロホルム混液
を加えて、TdTを変性失活させ、変性不溶化蛋白質を遠
心除去し、上清をフェノール抽出、冷エタノール沈澱操
作後、該沈澱物を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥を行
い、３′末端にオリゴdC付加ds-cDNAを得た。
4.ハイブリッドプラスミドの構築 ［pUC9（オリゴdc尾を有する）分子とds-cDNA（オリ
ゴdc尾を有する）分子との結合］ 上記第３項で得られたオリゴdC付加ds-cDNAとプラス
ミドpUC9［オリゴdG尾付加。Pharmacia社（スゥエーデ
ン）より容易に入手可能］分子とをdC-dGホモポリマー
法として公知の方法であるマニアティス法に準ずる方法
で結合させた。
ゴdc尾を有する）分子との結合］ 上記第３項で得られたオリゴdC付加ds-cDNAとプラス
ミドpUC9［オリゴdG尾付加。Pharmacia社（スゥエーデ
ン）より容易に入手可能］分子とをdC-dGホモポリマー
法として公知の方法であるマニアティス法に準ずる方法
で結合させた。
5.形質転換およびクローンの選択 上記4.で得られたハイブリッドプラスミド（オリゴdG
付加pUC9分子とオリゴ付加ds-cDNA分子とからなる）をC
aCl2処理した大腸菌にコンピテント法で導入した。
付加pUC9分子とオリゴ付加ds-cDNA分子とからなる）をC
aCl2処理した大腸菌にコンピテント法で導入した。
約４万個の形質転換体のコロニーを得た後、前記の第
２項においてPALmRNAから一本鎖cDNAを合成するに際し
て、反応液中のdcTPのかわりにα−32P‐dcTPを用い
て、32Pで標識した一本鎖cDNAをプローブとして、グル
ンステインらの方法［Grunstein,M.et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA.,72,3961（1971）］に準じたコロニーハイ
ブリダイゼイション法で、細胞の選択を行った。
２項においてPALmRNAから一本鎖cDNAを合成するに際し
て、反応液中のdcTPのかわりにα−32P‐dcTPを用い
て、32Pで標識した一本鎖cDNAをプローブとして、グル
ンステインらの方法［Grunstein,M.et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA.,72,3961（1971）］に準じたコロニーハイ
ブリダイゼイション法で、細胞の選択を行った。
その結果、陽性のコロニーの中から、プラスミドを抽
出して精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動によってDNA断片の大きさを調べた。
出して精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動によってDNA断片の大きさを調べた。
6.完全なPAL構造遺伝子を含有するds-cDNAの構築 上記第５項で得られた形質転換体からプラスミドpSW2
およびpSW11を得た。
およびpSW11を得た。
つまりPALmRNAの完全なcDNAは、pSW2およびpSW11を組
み合わせることにより構築可能なことが明らかとなった
ので、それぞれを含有する形質転換細胞からプラスミド
を抽出し、精製し、制限酵素BanIIIで切断後、pSW2にお
いては、制限酵素HindIIIで切断し、アガロースゲル電
気泳動による分画を行ない、4.2kbの大きさのDNA断片を
回収し、フェノール・クロロホルム混液処理及び冷エタ
ノール沈澱操作をそれぞれ数回繰返して該DNA断片を精
製した。
み合わせることにより構築可能なことが明らかとなった
ので、それぞれを含有する形質転換細胞からプラスミド
を抽出し、精製し、制限酵素BanIIIで切断後、pSW2にお
いては、制限酵素HindIIIで切断し、アガロースゲル電
気泳動による分画を行ない、4.2kbの大きさのDNA断片を
回収し、フェノール・クロロホルム混液処理及び冷エタ
ノール沈澱操作をそれぞれ数回繰返して該DNA断片を精
製した。
一方、pSW11は制限酵素BanIIIおよびHindIIIで切断
後、電気泳動により0.9kbのDNA断片を回収し精製した。
後、電気泳動により0.9kbのDNA断片を回収し精製した。
4.2kbおよび0.9kbのおのおのDNA断片をリガーゼによ
り環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換した。
り環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換した。
マーカーとしたアンピシリン耐性の転換体からプラス
ミドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を
作成し、第１図に示した制限酵素切断地図の構造を有す
る正しいPAL構造のpSW13を選択した。
ミドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を
作成し、第１図に示した制限酵素切断地図の構造を有す
る正しいPAL構造のpSW13を選択した。
7.クローン化DNAの塩基配列の決定 上記のプラスミドpSW13を含むクローンからプラスミ
ドpSW13を単離し、そのクローン化DNA断片を種々の制限
酵素で分解し、適当な制限酵素断片について、それぞれ
DNAのヌクレオチド配列分析をマクサムーギルバート法
（化学分解法）により、またマート法［Maat,J.et al.,
Nucleic Acids Research,5,4537-4545,（1978）］によ
るDideoxy法により生化学的に行った。得られたそれぞ
れのDNA断片の塩基配列の結果を三井情報開発（株）製
のGENASプログラムによりDNA編集を行ない、その塩基配
列は第２図（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおりであった。
ドpSW13を単離し、そのクローン化DNA断片を種々の制限
酵素で分解し、適当な制限酵素断片について、それぞれ
DNAのヌクレオチド配列分析をマクサムーギルバート法
（化学分解法）により、またマート法［Maat,J.et al.,
Nucleic Acids Research,5,4537-4545,（1978）］によ
るDideoxy法により生化学的に行った。得られたそれぞ
れのDNA断片の塩基配列の結果を三井情報開発（株）製
のGENASプログラムによりDNA編集を行ない、その塩基配
列は第２図（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおりであった。
なお、この塩基配列の2151bpまでが開始コドンをよび
終了コドンを含むPAL構造遺伝子であった。
終了コドンを含むPAL構造遺伝子であった。
8.pSW101の構築（第３図参照） プラスミドpUC13（Pharmacia社製）0.9μｇに10単位
の制限酵素Sal Iを14μｌの反応液［7mM Tris-HCl（pH
7.5）、0.7mM EDTA,7mM MgCl2、175mM NaCl、7mM 2−メ
ルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミン（以下
BSAと略す）］中で、37℃16時間作用させ、フェノール
・クロロホルム混液処理、エタノール沈澱操作を行い、
開環線状DNAを得た。
の制限酵素Sal Iを14μｌの反応液［7mM Tris-HCl（pH
7.5）、0.7mM EDTA,7mM MgCl2、175mM NaCl、7mM 2−メ
ルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミン（以下
BSAと略す）］中で、37℃16時間作用させ、フェノール
・クロロホルム混液処理、エタノール沈澱操作を行い、
開環線状DNAを得た。
該線状DNAをニック・トランスレーション緩衝液［50m
M Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl2、0.1mMジチオスレ
イトール、２％BSA、80μMdATP、80μM dGTP、80μM dT
TP、80μM dCTP］の存在下で、DNAポリメラーゼクレノ
フ断片（宝酒造（株）製）を室温で30分間作用させ、粘
着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白を行
い、冷エタノールでDNAを沈澱回収した。このDNA断片に
子牛脾臓由来リン酸ジエステラーゼ（CIP:ベーリンガ社
製）を作用させ、５′末端のリン酸基を除去し、線状pU
G13の自己閉環を防いだ。
M Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl2、0.1mMジチオスレ
イトール、２％BSA、80μMdATP、80μM dGTP、80μM dT
TP、80μM dCTP］の存在下で、DNAポリメラーゼクレノ
フ断片（宝酒造（株）製）を室温で30分間作用させ、粘
着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白を行
い、冷エタノールでDNAを沈澱回収した。このDNA断片に
子牛脾臓由来リン酸ジエステラーゼ（CIP:ベーリンガ社
製）を作用させ、５′末端のリン酸基を除去し、線状pU
G13の自己閉環を防いだ。
一方pSW13を含有する細胞から、このプラスミドを抽
出し精製し、制限酵素Dralを反応液Ａ（4mM Tris-HCl
（pH 7.5）、0.4mM EDTA、50mM NaCl）中37℃で28時間
作用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を100mMと
し、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを37℃で16時間作用さ
せた。
出し精製し、制限酵素Dralを反応液Ａ（4mM Tris-HCl
（pH 7.5）、0.4mM EDTA、50mM NaCl）中37℃で28時間
作用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を100mMと
し、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを37℃で16時間作用さ
せた。
反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供
し、2.3kbの大きさのDNA断片をゲル中から回収し、フェ
ノール抽出、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱をそれぞれ３回繰返した後にPALcDNA断片
を得た。
し、2.3kbの大きさのDNA断片をゲル中から回収し、フェ
ノール抽出、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱をそれぞれ３回繰返した後にPALcDNA断片
を得た。
該cDNA断片に前述のニック・トランスレーション緩衝
液を加え、DNAポリメラーゼクレノフ断片を室温で45分
間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱操作をそれぞれ３回繰返し、平滑末端を両
端に有するcDNA断片を得た。
液を加え、DNAポリメラーゼクレノフ断片を室温で45分
間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱操作をそれぞれ３回繰返し、平滑末端を両
端に有するcDNA断片を得た。
平滑末端を有するpUC13断片と平滑末端を有するcDNA
断片とをリガーゼで結合し、環状プラスミドpSW101を構
築した。
断片とをリガーゼで結合し、環状プラスミドpSW101を構
築した。
このハイブリッドプラスミドDNAで大腸菌を公知の方
法で形質変換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞
（MT-10410,FERM P−8834）を選び出出し、PAL活性を測
定した。
法で形質変換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞
（MT-10410,FERM P−8834）を選び出出し、PAL活性を測
定した。
9.pYtrp6の構築及び形質転換 上記第８項に記載した方法で構築したpSW101をPstI及
びBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動後、370bpの
DNA断片を回収し、それを２分割し、それぞれBanIおよ
びBbeIで消化した。
びBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動後、370bpの
DNA断片を回収し、それを２分割し、それぞれBanIおよ
びBbeIで消化した。
消化後アクリルアミドゲル電気泳動により、BanI消化
のものからは70bpの大きさの断片を回収し、BbeI消化の
ものからは280bpの大きさのDNA片を回収した。
のものからは70bpの大きさの断片を回収し、BbeI消化の
ものからは280bpの大きさのDNA片を回収した。
70bpの断片はDNAポリメラーゼで平滑末端にして、こ
れらにClaI（BanIII）リンカーをリガーゼで結合させ
た。
れらにClaI（BanIII）リンカーをリガーゼで結合させ
た。
こうして得られたClaIリンカーを両端に結合したDNA
断片をBan III及びBbeIで消化し、先に調製したBbeI断
片（280bp）およびpBR322をBan IIIおよびBamHIで消化
して、アガロースゲル電気泳動により4.0kbのDNA断片を
回収したものとをリガーゼで結合し、pSYA1を得、これ
で大腸菌を公知のカルシウム法で形質転換した。
断片をBan III及びBbeIで消化し、先に調製したBbeI断
片（280bp）およびpBR322をBan IIIおよびBamHIで消化
して、アガロースゲル電気泳動により4.0kbのDNA断片を
回収したものとをリガーゼで結合し、pSYA1を得、これ
で大腸菌を公知のカルシウム法で形質転換した。
上記第６項で構築したpSW13をXbaIで消化し、粘着末
端をDNAポリメラーゼで埋めて平滑末端とし、HindIIIリ
ンカーをリガーゼで結合して、pSW13Hを構築し、これで
大腸菌を公知の方法で形質転換した。
端をDNAポリメラーゼで埋めて平滑末端とし、HindIIIリ
ンカーをリガーゼで結合して、pSW13Hを構築し、これで
大腸菌を公知の方法で形質転換した。
pSYA1を含む大腸菌から公知の方法でpSYA1を抽出し、
BamHIおよびBan IIIで消化し、350bpの大きさのDNA断片
を回収した。
BamHIおよびBan IIIで消化し、350bpの大きさのDNA断片
を回収した。
pSW13Hを含む大腸菌から公知の方法でpSW13Hを抽出
し、抽出したpSW13HをBamHIおよびHindIIIで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により1.0kbの大きさのDNA断片を
回収した。
し、抽出したpSW13HをBamHIおよびHindIIIで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により1.0kbの大きさのDNA断片を
回収した。
次に、大腸菌のtrpオペロンの一部を含有するプラス
ミドpVV1［Brian P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Metho
ds in Enzymology,101,155,（1983）］に制限酵素Hinf
Iを作用させて、プラスミドpVV1を消化した。
ミドpVV1［Brian P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Metho
ds in Enzymology,101,155,（1983）］に制限酵素Hinf
Iを作用させて、プラスミドpVV1を消化した。
該消化プラスミドDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で分離した0.9kbの大きさのDNA断片をゲルから先に述べ
た方法で回収した。
で分離した0.9kbの大きさのDNA断片をゲルから先に述べ
た方法で回収した。
0.9kbのDNA断片のHinf Iで生じた粘着末端を先の第８
項に記載した方法で平滑末端とした後、EcorRIリンカー
（GGAATTCC）をリガーゼで平滑末端の５′末端に結合し
た。
項に記載した方法で平滑末端とした後、EcorRIリンカー
（GGAATTCC）をリガーゼで平滑末端の５′末端に結合し
た。
EcoRIリンカー結合DNA断片に制限酵素EcoRIを作用さ
せ、EcoRI切断粘着末端付加DMA断片を創製した［Brian
P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Methods in Enzymolog
y,101,155,（1983）］。
せ、EcoRI切断粘着末端付加DMA断片を創製した［Brian
P.Nicols ＆ Charles Yanofsky,Methods in Enzymolog
y,101,155,（1983）］。
該EcoRI粘着末端付加DNA断片とpBR322のEcoRI消化物
を前期第８項に記載の方法でCIP処理を行なったものを
リガーゼにより結合し、該結合精製物を制限酵素EcoRI
およびBg1IIで消化し、消化生成物をアガロースゲル電
気泳動で分離して、0.4kbの大きさをもつDNA断片を回収
した。
を前期第８項に記載の方法でCIP処理を行なったものを
リガーゼにより結合し、該結合精製物を制限酵素EcoRI
およびBg1IIで消化し、消化生成物をアガロースゲル電
気泳動で分離して、0.4kbの大きさをもつDNA断片を回収
した。
該DNA断片には制限酵素TaqIの断片箇所が３箇所含ま
れるが、該DNA断片をTaqIで部分的に消化して345bpの大
きさのDNA断片を回収した。
れるが、該DNA断片をTaqIで部分的に消化して345bpの大
きさのDNA断片を回収した。
該345bP DNA断片をpBR322をEcoRIおよびClaIで消化し
て得られる4.3kbのDNA断片と結合し、trpプロモーター
を含有するプラスミドpFtpr2を得た。
て得られる4.3kbのDNA断片と結合し、trpプロモーター
を含有するプラスミドpFtpr2を得た。
このようにして構築されたpFtrp2をBan IIIおよびHindI
IIで消化し、アガロースゲル電気泳動により4.7kbの断
片を回収し、この4.7kb断片と先に得た350bpのBamHI＋B
am III断片および1.9kbのBamHI＋HindIII断片をリガー
ゼで閉環し、pSYA2を構築した。
IIで消化し、アガロースゲル電気泳動により4.7kbの断
片を回収し、この4.7kb断片と先に得た350bpのBamHI＋B
am III断片および1.9kbのBamHI＋HindIII断片をリガー
ゼで閉環し、pSYA2を構築した。
pSYA2をBam IIIで部分消化して生じた粘着末端をDNA
ポリメラーゼを用いて埋めて平滑末端としてリガーゼで
開環し、Nru I切断点を有するpYtrp6を構築した。
ポリメラーゼを用いて埋めて平滑末端としてリガーゼで
開環し、Nru I切断点を有するpYtrp6を構築した。
このpYtrp6で大腸菌を公知の方法で形質転換し、アン
ピシリン耐性のコロニーから細胞を選び出し、PAL活性
を測定した。pYtrp6の構築のフローシートを第４図に、
またその詳細を第３図〜第５図に示す。ここで られた
PAL活性を示す大腸菌形質転換株をMT-10414（FERM P−8
876）とした。
ピシリン耐性のコロニーから細胞を選び出し、PAL活性
を測定した。pYtrp6の構築のフローシートを第４図に、
またその詳細を第３図〜第５図に示す。ここで られた
PAL活性を示す大腸菌形質転換株をMT-10414（FERM P−8
876）とした。
参考例２ なお、本参考例における各プラスミドの構築工程の概
略図を第８図に示してある。
略図を第８図に示してある。
［プラスミドpSW115の構築］ （１） 第９図に示した工程に従ったプラスミドpTac11
の構築 まず、参考例１に記載の方法に従って得られたロドス
ポリジウム・トルロイデスのPAL構造遺伝子がクローン
化されているプラスミドpYtrp 6を有する大腸菌MT 1041
4（FERMP-8876）株より抽出したプラスミドを制限酵素N
ruIとHindIIIで消化して得たDNA断片混合物から電気泳
動法によって2.4kbpの大きさのDNA断片を分離回収し
た。
の構築 まず、参考例１に記載の方法に従って得られたロドス
ポリジウム・トルロイデスのPAL構造遺伝子がクローン
化されているプラスミドpYtrp 6を有する大腸菌MT 1041
4（FERMP-8876）株より抽出したプラスミドを制限酵素N
ruIとHindIIIで消化して得たDNA断片混合物から電気泳
動法によって2.4kbpの大きさのDNA断片を分離回収し
た。
これとは別に、tacプロモーターを有するプラスミドp
KK223−３（ファルマシア社製）を制限酵素EcoRIで消化
して、DNA断片を得た後、これらDNA断片の粘着末端をDN
Aポリメラーゼを用いて平滑化した。
KK223−３（ファルマシア社製）を制限酵素EcoRIで消化
して、DNA断片を得た後、これらDNA断片の粘着末端をDN
Aポリメラーゼを用いて平滑化した。
次に、このようにして得られた平滑末端を有するDNA
断片と、先に得た2.4kbpのDNA断片とを、リガーゼの存
在下で反応させた後、得られた反応生成物を大腸菌にS.
N.Cohenらの方法によって導入した。
断片と、先に得た2.4kbpのDNA断片とを、リガーゼの存
在下で反応させた後、得られた反応生成物を大腸菌にS.
N.Cohenらの方法によって導入した。
続いて、この反応生成物が導入された大腸菌を、アン
ピシリンプレート｛LB培地［バクトトリプトン（商品
名;Bacto-trytone 、Difco社製）10g;バクトイースト
エキストラクト（Bacto-yeast extract 、Difco社製）
5g;グルコース1g;蒸留水１（NaOHでpH7.5に調整）］
にアンピシリンを50μg/mlの濃度で添加した培地に寒天
を1.5％の濃度で含有させたもの｝で培養した。培養
後、プレート上に出現したアンピシリン耐性の各コロニ
ーのそれぞれから個々のプラスミドを抽出し、各プラス
ミドの制限酵素地図を作製して、目的とする第９図に示
したような構成のプラスミドpTac11を有するコロニーを
同定し、更に該コロニーからプラスミドpTac11を単離し
た。
ピシリンプレート｛LB培地［バクトトリプトン（商品
名;Bacto-trytone 、Difco社製）10g;バクトイースト
エキストラクト（Bacto-yeast extract 、Difco社製）
5g;グルコース1g;蒸留水１（NaOHでpH7.5に調整）］
にアンピシリンを50μg/mlの濃度で添加した培地に寒天
を1.5％の濃度で含有させたもの｝で培養した。培養
後、プレート上に出現したアンピシリン耐性の各コロニ
ーのそれぞれから個々のプラスミドを抽出し、各プラス
ミドの制限酵素地図を作製して、目的とする第９図に示
したような構成のプラスミドpTac11を有するコロニーを
同定し、更に該コロニーからプラスミドpTac11を単離し
た。
（２） 第10図の工程に従ったプラスミドpPL−PAL-hea
dの構築 プラスミドpPL−λ（ファルマシア社製）を制限酵素E
coRIとHpaIで消化して、得られたDNA断片混合物から電
気泳動法により470bpのDNA断片を分離回収した。この47
0bpのDNA断片を次に制限酵素HinfIで部分消化し、得ら
れたDNA断片混合物から電気泳動法により370bpのDNA断
片を分離回収した。
dの構築 プラスミドpPL−λ（ファルマシア社製）を制限酵素E
coRIとHpaIで消化して、得られたDNA断片混合物から電
気泳動法により470bpのDNA断片を分離回収した。この47
0bpのDNA断片を次に制限酵素HinfIで部分消化し、得ら
れたDNA断片混合物から電気泳動法により370bpのDNA断
片を分離回収した。
更に、この370bpのDNA断片の末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端化してから、それをリガーゼの存在下
でCla Iリンカー（宝酒造社製）と反応させた。反応終
了後、得られた反応生成物を制限酵素Ecor IとCla Iで
消化してEcoRI-Cla I DNA断片を含む混合物を得た。
を用いて平滑末端化してから、それをリガーゼの存在下
でCla Iリンカー（宝酒造社製）と反応させた。反応終
了後、得られた反応生成物を制限酵素Ecor IとCla Iで
消化してEcoRI-Cla I DNA断片を含む混合物を得た。
これとは別に、先に示した参考例１におけるロドスポ
リジウム トルロイデスの構造遺伝子のクローニング過
程で構築したプラスミドpSYA 2を、制限酵素EcoRIで消
化した後、得られたDNA断片を、更に制限酵素Cla Iで部
分消化し、得られた大小２種のDNA断片の混合物から電
気泳動法によって大DNAを抽出分離した。
リジウム トルロイデスの構造遺伝子のクローニング過
程で構築したプラスミドpSYA 2を、制限酵素EcoRIで消
化した後、得られたDNA断片を、更に制限酵素Cla Iで部
分消化し、得られた大小２種のDNA断片の混合物から電
気泳動法によって大DNAを抽出分離した。
次に、このようにして得られたプラスミドpSYA 2由来
の大DNA断片と、先に得たEcoRI-Cla I断片を含む混合物
とをT4リガーゼの存在下で反応させ、得られた反応生成
物を大腸菌に導入し、これをアンピシリンプレートで培
養した。アンピシリンプレート上に出現した各コロニー
からプラスミドを調製し、その制限酵素地図を作製し
て、目的とする第10図に示す構成のプラスミドpSYPL−
３を有するコロニーを同定し、該コロニーからプラスミ
ドpSYPL−３を単離した。
の大DNA断片と、先に得たEcoRI-Cla I断片を含む混合物
とをT4リガーゼの存在下で反応させ、得られた反応生成
物を大腸菌に導入し、これをアンピシリンプレートで培
養した。アンピシリンプレート上に出現した各コロニー
からプラスミドを調製し、その制限酵素地図を作製し
て、目的とする第10図に示す構成のプラスミドpSYPL−
３を有するコロニーを同定し、該コロニーからプラスミ
ドpSYPL−３を単離した。
更に、このようにして得られたプラスミドpSYPL−３
をEcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA断
片から電気泳動法によって小DNA断片を分離回収した。
をEcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA断
片から電気泳動法によって小DNA断片を分離回収した。
次に、プラスミドpBR322（ファルマシア社製）を制限
酵素EcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA
断片から電気泳動法によって大DNA断片を分離回収した
後、この大DNA断片と先に得たプラスミドpSYPL−３由来
の小断片とを、リガーゼの存在下で反応させ、第９図の
構成のプラスミドpPL‐PAL-headを得た。なお、ここで
目的のプラスミドが得られたかどうかは、リガーゼを用
いた反応で生成された反応生成物を大腸菌に導入し、こ
れをアンピシリンプレートで培養し、アンピシリンプレ
ート上に出現した各コロニーからプラスミドを調製し、
その制限酵素地図を作成することで確認した。
酵素EcoRIとBamHIとで消化し、得られた大小２種のDNA
断片から電気泳動法によって大DNA断片を分離回収した
後、この大DNA断片と先に得たプラスミドpSYPL−３由来
の小断片とを、リガーゼの存在下で反応させ、第９図の
構成のプラスミドpPL‐PAL-headを得た。なお、ここで
目的のプラスミドが得られたかどうかは、リガーゼを用
いた反応で生成された反応生成物を大腸菌に導入し、こ
れをアンピシリンプレートで培養し、アンピシリンプレ
ート上に出現した各コロニーからプラスミドを調製し、
その制限酵素地図を作成することで確認した。
（３） 第11図に示した工程に従ったプラスミドpSW115
の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドpTac11を制限酵
素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のDNA断片の
混合物から電気泳動法により大DNA断片を分離回収し
た。
の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドpTac11を制限酵
素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のDNA断片の
混合物から電気泳動法により大DNA断片を分離回収し
た。
次に、前記（２）項で得たプラスミドpPL‐PAL-head
を制限酵素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のD
NA断片混合物から電気泳動法により小DNA断片を分離回
収した。
を制限酵素EcoRIとAatIで消化し、得られた大小２種のD
NA断片混合物から電気泳動法により小DNA断片を分離回
収した。
最後に、このようにして得たプラスミドpTac11由来の
大DNA断片とプラスミドpPL‐PAL-head由来の小DNA断片
とをT4リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラス
ミドpSW115を得た。
大DNA断片とプラスミドpPL‐PAL-head由来の小DNA断片
とをT4リガーゼの存在下で反応させて結合させ、プラス
ミドpSW115を得た。
なお、目的とするプラスミドが得られたかどうかは、
得られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株を
アンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有
する各形質転換株からプラスミドを調製して、それらの
制限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のPAL活
性を後述する方法によって測定して確認した。ここで得
られたPAL活性を有する形質転換大腸菌株をMT-10423株
（FERM P−9023）とした。
得られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株を
アンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有
する各形質転換株からプラスミドを調製して、それらの
制限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のPAL活
性を後述する方法によって測定して確認した。ここで得
られたPAL活性を有する形質転換大腸菌株をMT-10423株
（FERM P−9023）とした。
（４） プラスミドpSW115によるPALの発現 上記（３）項で得たプラスミドpSW115が導入された形
質転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用い
たLB培地（pH7.5）にアンピシリンを50μg/mlの濃度で
天下した培地に接種し、これを30℃で振とう培養した。
質転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用い
たLB培地（pH7.5）にアンピシリンを50μg/mlの濃度で
天下した培地に接種し、これを30℃で振とう培養した。
20時間の培養により660nmでのODが5.40を示す培養菌
体濃度が得られたので、培養液から菌体を遠心分離によ
って集め、得られた菌体のPAL活性を後述の方法に従っ
て測定し、乾燥菌体重量あたりの比活性を算出したとこ
ろ、630 U/乾燥菌体重量（ｇ）であった。
体濃度が得られたので、培養液から菌体を遠心分離によ
って集め、得られた菌体のPAL活性を後述の方法に従っ
て測定し、乾燥菌体重量あたりの比活性を算出したとこ
ろ、630 U/乾燥菌体重量（ｇ）であった。
なお、上記の乾燥菌体重量は、洗浄菌体を乾燥して測
定した。
定した。
なお、以上の参考例２における組換え体プラスミドの
大腸菌への導入は、S.N.Cohenらの方法［S.N.Cohenら;P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110（1972）］を用いて
行なった。また、制限酵素、リガーゼ、T4リガーゼ、DN
Aポリメラーゼを用いたプラスミドやDNA断片の処理およ
び菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている
場合以外は通常用いられている方法によって行なった。
更に、宿主大腸菌としては、MC1061株［Δ（lacIPOZY
A）F-、araD139、Δ（ara leu）7697×74gal U gal K s
trA］［M.J.Casadaban,J.Mol.Biol.,138,179,（198
0）］を用いた。なお、制限酵素類、リガーゼ、T4リガ
ーゼ、DNAポリメラーゼは特に指定しない限り宝酒造社
製を用いた。
大腸菌への導入は、S.N.Cohenらの方法［S.N.Cohenら;P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110（1972）］を用いて
行なった。また、制限酵素、リガーゼ、T4リガーゼ、DN
Aポリメラーゼを用いたプラスミドやDNA断片の処理およ
び菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている
場合以外は通常用いられている方法によって行なった。
更に、宿主大腸菌としては、MC1061株［Δ（lacIPOZY
A）F-、araD139、Δ（ara leu）7697×74gal U gal K s
trA］［M.J.Casadaban,J.Mol.Biol.,138,179,（198
0）］を用いた。なお、制限酵素類、リガーゼ、T4リガ
ーゼ、DNAポリメラーゼは特に指定しない限り宝酒造社
製を用いた。
以下本発明の実施例及び比較例を示す。
なお、以下の実施例及び比較例で用いられる培地は次
のようにして調製した。
のようにして調製した。
LB-AP培地； 以下の組成のLB培地を120℃、15分の条件でオートク
レーブで処理した後、アンピシリン（AP）を無菌的に50
μg/mlの濃度で添加して調製した。
レーブで処理した後、アンピシリン（AP）を無菌的に50
μg/mlの濃度で添加して調製した。
LB培地組成； トリプトン 10g 酵母エキス 5g グルコース 1g NaCl 5g 蒸留水 １ （KOHによりpH7.2に調整） LB寒天培地； 上記組成のLB培地に寒天を15g/lの割合で加え、これ
をオートクレーブで処理（120℃、15分）し、シャーレ
に流し込みプレートにした。
をオートクレーブで処理（120℃、15分）し、シャーレ
に流し込みプレートにした。
LB-AP寒天培地； 上記組成のLB培地に寒天を15g/lの割合で加え、これ
をオートクレーブで処理（120℃、15分）した後、更にA
Pを20μg/mlの濃度で無菌的に添加してからシャーレに
流し込みプレートにした。
をオートクレーブで処理（120℃、15分）した後、更にA
Pを20μg/mlの濃度で無菌的に添加してからシャーレに
流し込みプレートにした。
合成培地； 以下の各成分を蒸留水１に加え、更にKOHでpHを7.2
に調整した。
に調整した。
リン酸一カリウム 3g リン酸二カリウム 7g 硫酸マグネシウム・７水和物 0.5g 硫酸アンモニウム 1.5g 塩化カルシウム・２水和物 0.02g 硫酸第一鉄・７水和物 0.02g クエン酸ナトリウム 1g ガザミノ酸 12g Ｌ−トリプトファン 0.1g 実施例１ LB-AP寒天培地に、参考例２で得たAP耐性をコードす
る遺伝子を含むベクターにtacプロモーターとその下流
に連結されたPLラムダプロモーターとの連結プロモータ
ーを結合させた発現ベクターの該連結プロモーター下流
にPAL構造遺伝子が挿入された構成のHi−プラスミドpSW
115を保持する大腸菌MT10423株（FERM P−9023）を塗布
して、37℃で培養した。
る遺伝子を含むベクターにtacプロモーターとその下流
に連結されたPLラムダプロモーターとの連結プロモータ
ーを結合させた発現ベクターの該連結プロモーター下流
にPAL構造遺伝子が挿入された構成のHi−プラスミドpSW
115を保持する大腸菌MT10423株（FERM P−9023）を塗布
して、37℃で培養した。
出現したコロニーから菌体を綿栓付き試験管中のAP含
有LB培地（5ml）に接種し、これを42℃、12時間、110ス
トローク／分で振とう培養した。培養終了後、培養液
（培養菌体を含む）の15μｌを種培養液として２本の綿
栓付き試験管内に用意した新たな5mlのAP含有LB培地の
それぞれに接種し、一方を41℃で、他方を30℃で上記と
同様の条件でそれぞれ振とう培養して、培養液No.1−１
（41℃、12時間培養）、培養液No.1−２（30℃、20時間
培養）を得た。
有LB培地（5ml）に接種し、これを42℃、12時間、110ス
トローク／分で振とう培養した。培養終了後、培養液
（培養菌体を含む）の15μｌを種培養液として２本の綿
栓付き試験管内に用意した新たな5mlのAP含有LB培地の
それぞれに接種し、一方を41℃で、他方を30℃で上記と
同様の条件でそれぞれ振とう培養して、培養液No.1−１
（41℃、12時間培養）、培養液No.1−２（30℃、20時間
培養）を得た。
次に、培養液No.1−１から培養液（培養菌体を含む）
の15μｌを種培養液として２本の綿栓付き試験管内に用
意した新たな5mlのAP含有LB培地のそれぞれに接種し、
一方を42℃で、他方を30℃で上記と同様の条件でそれぞ
れ振とう培養して、培養液No.1−３（42℃、12時間培
養）、培養液No.1−４（30℃、20時間培養）を得た。更
に、第12図に示したような条件で行なう以外は上記と同
様の培養操作を繰り返し、培養液No.1−５、培養液No.1
−６、No.1−７をそれぞれ得た。
の15μｌを種培養液として２本の綿栓付き試験管内に用
意した新たな5mlのAP含有LB培地のそれぞれに接種し、
一方を42℃で、他方を30℃で上記と同様の条件でそれぞ
れ振とう培養して、培養液No.1−３（42℃、12時間培
養）、培養液No.1−４（30℃、20時間培養）を得た。更
に、第12図に示したような条件で行なう以外は上記と同
様の培養操作を繰り返し、培養液No.1−５、培養液No.1
−６、No.1−７をそれぞれ得た。
なお、培養液（No.1−２、No.1−４、No.1−６、No.1
−７）においては、培養終了後ただちに遠心分離によっ
て集菌し、これを0.85％NaCl水溶液に懸濁して洗浄後、
再度遠心分離で回収した菌体を凍結保存しておいた。
−７）においては、培養終了後ただちに遠心分離によっ
て集菌し、これを0.85％NaCl水溶液に懸濁して洗浄後、
再度遠心分離で回収した菌体を凍結保存しておいた。
次に、各凍結保存菌体を解凍し、菌体抽出液を調製し
て、それぞれのPAL比活性を以下のようにして求めた。
その結果を表２に示す。
て、それぞれのPAL比活性を以下のようにして求めた。
その結果を表２に示す。
菌体抽出液の調製； 凍結菌体を湿菌体濃度１％の菌体濃度となるように0.
05M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）に懸濁させた状態で超音
波処理して菌体を破砕し、さらに該溶液から遠心分離に
よって細胞残渣等を取り除いて菌体抽出液を調製した。
05M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）に懸濁させた状態で超音
波処理して菌体を破砕し、さらに該溶液から遠心分離に
よって細胞残渣等を取り除いて菌体抽出液を調製した。
PAL活性の測定； 各抽出液のPAL活性は、Ｌ−フェニルアラニンから桂
皮酸を生成する酵素反応を利用しては以下の操作に従っ
て求めた。
皮酸を生成する酵素反応を利用しては以下の操作に従っ
て求めた。
まず、菌体抽出液を25mM Tris-HCl緩衝液（pH8.8）で
湿菌体濃度１％程度に希釈し、その1.0mlを、31・25mM
のＬ−フェニルアラニンを含む4.0mlの31.25mMTris-HCl
緩衝液に加え、30℃、20分間反応させた。1mlのIN-HCl
の添加によって反応を終了させ、反応液中に生成した桂
皮酸量を、以下の条件での液体クロマトグラフィーによ
り分析してその活性を測定した。
湿菌体濃度１％程度に希釈し、その1.0mlを、31・25mM
のＬ−フェニルアラニンを含む4.0mlの31.25mMTris-HCl
緩衝液に加え、30℃、20分間反応させた。1mlのIN-HCl
の添加によって反応を終了させ、反応液中に生成した桂
皮酸量を、以下の条件での液体クロマトグラフィーによ
り分析してその活性を測定した。
なお、ここでの1U（ユニット）は１分間当りに１マイ
クロモルの桂皮酸を生成する酸素量に相当する。
クロモルの桂皮酸を生成する酸素量に相当する。
液体クロマトグラフィー操作条件； 分離カラムYMCパックＡ−312（山村化学研製）を用
い、移動相にメタノール：水：リン酸＝50:41:0.08v/v
を使用し、桂皮酸の検出を紫外分光光度計（検出波長26
0nm）で行なった。
い、移動相にメタノール：水：リン酸＝50:41:0.08v/v
を使用し、桂皮酸の検出を紫外分光光度計（検出波長26
0nm）で行なった。
また、PAL比活性の算出に用いた菌体量は洗浄菌体を
乾燥して求めた。
乾燥して求めた。
比較例１ 実施例１における40℃以上での培養を第13図に示した
温度に変更する以外は、実施例１と同様にして培養操作
を繰り返し、培養液No.2−１〜２−７を得た。
温度に変更する以外は、実施例１と同様にして培養操作
を繰り返し、培養液No.2−１〜２−７を得た。
更に培養液No.2−２、No.2−４、No.2−６、No.2−７
から実施例１と同様にして凍結保存菌体をそれぞれ調製
し、更にPAL比活性を求めた。その結果を表２に示す。
から実施例１と同様にして凍結保存菌体をそれぞれ調製
し、更にPAL比活性を求めた。その結果を表２に示す。
実施例２ 大腸菌MT-10423株の代りに、参考例２で得たAP耐性を
コードする遺伝子を含むベクターに、PLラムダプロモー
ター・オペレーターが結合した発現ベクターの該プロモ
ーター・オペレーター下流にPAL構造遺伝子が挿入され
た構成のHi−プラスミドpSYPL−３を保持する大腸菌MT-
10424株（FERM P−9024）を用い、第14図に示す培養温
度で培養する以外は実施例１と同様にして、培養液No.3
−１〜３−７を得た。
コードする遺伝子を含むベクターに、PLラムダプロモー
ター・オペレーターが結合した発現ベクターの該プロモ
ーター・オペレーター下流にPAL構造遺伝子が挿入され
た構成のHi−プラスミドpSYPL−３を保持する大腸菌MT-
10424株（FERM P−9024）を用い、第14図に示す培養温
度で培養する以外は実施例１と同様にして、培養液No.3
−１〜３−７を得た。
更に培養液No.3−２、No.3−４、No.3−６、No.3−７
から実施例１と同様にして凍結保存菌体を調製し、更に
PAL比活性を求めた。その結果を表３に示す。
から実施例１と同様にして凍結保存菌体を調製し、更に
PAL比活性を求めた。その結果を表３に示す。
比較例２ 大腸菌MT-10423株の代りに、実施例２で用いたHi−プ
ラスミドpSYPL−３を保持する大腸菌MT-10424株を用
い、第15図に示す培養温度で培養する以外は、比較例１
と同様にして、培養液No.4−１〜４−７を得た。
ラスミドpSYPL−３を保持する大腸菌MT-10424株を用
い、第15図に示す培養温度で培養する以外は、比較例１
と同様にして、培養液No.4−１〜４−７を得た。
更に培養液No.4−２、No.4−４、No.4−６、No.4−７
から実施例１と同様にして凍結保存菌体を調製し、更に
PAL比活性を求めた。その結果を表３に示す。
から実施例１と同様にして凍結保存菌体を調製し、更に
PAL比活性を求めた。その結果を表３に示す。
表２及び表３の結果から明らかなように、実施例１お
よび実施例２における培養温度40℃以上での植え継ぎ培
養の後に培養温度30℃で培養した、すなわち本発明でい
う第１及び第２の培養過程を経て得られた培養菌では、
第１の培養過程における植え継ぎ回数が増加してもPAL
比活性の低下は認められなかった。
よび実施例２における培養温度40℃以上での植え継ぎ培
養の後に培養温度30℃で培養した、すなわち本発明でい
う第１及び第２の培養過程を経て得られた培養菌では、
第１の培養過程における植え継ぎ回数が増加してもPAL
比活性の低下は認められなかった。
これに対して、比較例１および比較例２における培養
温度40℃未満での植え継ぎ培養後に、培養温度30℃で培
養した培養菌では、植え継ぎ回数が増加するにしたがっ
てPAL比活性が著しく低下した。
温度40℃未満での植え継ぎ培養後に、培養温度30℃で培
養した培養菌では、植え継ぎ回数が増加するにしたがっ
てPAL比活性が著しく低下した。
更に、各例で得られた各培養液から菌体をLB-AP寒天
培地とLB寒天培地にそれぞれ同量塗布し、これらを37℃
で培養し、生じたコロニー数を比較して、培養菌あたり
のAP耐性消失菌（Hi−プラスミド脱落菌）の割合を調査
した。
培地とLB寒天培地にそれぞれ同量塗布し、これらを37℃
で培養し、生じたコロニー数を比較して、培養菌あたり
のAP耐性消失菌（Hi−プラスミド脱落菌）の割合を調査
した。
その結果、40℃以上での植え継ぎ培養における培養菌
当りのAP耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で１％以下
であったのに対して、40℃未満での植え継ぎ培養におけ
る培養菌当りのAP耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で
80％に達した。
当りのAP耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で１％以下
であったのに対して、40℃未満での植え継ぎ培養におけ
る培養菌当りのAP耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で
80％に達した。
実施例３ 参考例１で得たAP耐性をコードする遺伝子を含むベク
ターにtrpプロモーターを連結した発現ベクターの該プ
ロモーター下流にPAL構造遺伝子が挿入された構成のHi
−プラスミドpYtrp6を保持する大腸菌MT10410株（FERM
P−8876）を肩付きフラスコ内のLB-AP培地50ml中で、42
℃、12時間振とう培養した。
ターにtrpプロモーターを連結した発現ベクターの該プ
ロモーター下流にPAL構造遺伝子が挿入された構成のHi
−プラスミドpYtrp6を保持する大腸菌MT10410株（FERM
P−8876）を肩付きフラスコ内のLB-AP培地50ml中で、42
℃、12時間振とう培養した。
次に、合成培地1.0lを2lのミニジャーファーメンター
に入れて、殺菌処理後、更にAPを50mg無菌的に添加した
後、更に上記の大腸菌MT 10414株の培養液の30mlを添加
し、培地を通気攪拌しつつ培養を開始した。
に入れて、殺菌処理後、更にAPを50mg無菌的に添加した
後、更に上記の大腸菌MT 10414株の培養液の30mlを添加
し、培地を通気攪拌しつつ培養を開始した。
その際、42℃で培養を開始し、菌の増殖が対数期中期
にさしかかる６時間後に培養温度を30℃とし、更に18時
間培養した。また、培養期間を通じて培地のpHは7.0に
調整した。
にさしかかる６時間後に培養温度を30℃とし、更に18時
間培養した。また、培養期間を通じて培地のpHは7.0に
調整した。
培養終了後、培養菌体を遠心分離で集菌し、更に0.85
％NaCl水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で集菌
し、これを湿菌体濃度１％の菌体濃度となるように0.05
M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）に懸濁させ、以下実施例１
と同様にして菌体抽出液を調整し、PAL比活性を求めた
ところ、270U/g・cellであった。
％NaCl水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で集菌
し、これを湿菌体濃度１％の菌体濃度となるように0.05
M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）に懸濁させ、以下実施例１
と同様にして菌体抽出液を調整し、PAL比活性を求めた
ところ、270U/g・cellであった。
比較例３ 各培養操作における培養温度を全て30℃とする以外は
実施例３と同様にして培養を行ない、培養菌体のPAL比
活性を求めたところ、45U/g・cellであった。
実施例３と同様にして培養を行ない、培養菌体のPAL比
活性を求めたところ、45U/g・cellであった。
また、先に述べた方法と同様にして、Hi−プラスミド
脱落菌の発生について調査したところ、24時間培養後の
培養菌当りのAP耐性消失菌の割合は実施例３では10％程
度であったのに対して、比較例３においては85％程度で
あった。
脱落菌の発生について調査したところ、24時間培養後の
培養菌当りのAP耐性消失菌の割合は実施例３では10％程
度であったのに対して、比較例３においては85％程度で
あった。
実施例４ 実施例１で用いたHi−プラスミドpSW115を保持する大
腸菌株MT 10423株（FERM P−9023）をLB-AP寒天培地に
塗布して、これを37℃で培養した。
腸菌株MT 10423株（FERM P−9023）をLB-AP寒天培地に
塗布して、これを37℃で培養した。
出現したコロニーから菌体を殺菌済の試験管中のAP含
有LB培地（0.5ml）に懸濁させ、この菌体懸濁液を50μ
ｌづつ５本の新たな5mlのAP含有LB培地入り綿栓付き試
験管にそれぞれ分注し、表３に示す各温度で24時間110
ストローク／分で振とう培養を行ない、培養終了後ただ
ちに遠心分離によって集菌し、これを0.85％NaCl水溶液
に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で回収した菌体を凍結
保存しておき、解凍後そのPAL活性を実施例１と同様に
して求めた（表４）ところ、培養温度を調節することに
より外来遺伝子の発現が制御できることが確認できた。
有LB培地（0.5ml）に懸濁させ、この菌体懸濁液を50μ
ｌづつ５本の新たな5mlのAP含有LB培地入り綿栓付き試
験管にそれぞれ分注し、表３に示す各温度で24時間110
ストローク／分で振とう培養を行ない、培養終了後ただ
ちに遠心分離によって集菌し、これを0.85％NaCl水溶液
に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で回収した菌体を凍結
保存しておき、解凍後そのPAL活性を実施例１と同様に
して求めた（表４）ところ、培養温度を調節することに
より外来遺伝子の発現が制御できることが確認できた。
〔発明の効果〕 本発明によれば、培養温度を調節するという簡易な操
作で、Hi−プラスミド導入大腸菌における外来遺伝子の
発現を所望に応じて効果的に制御可能である。
作で、Hi−プラスミド導入大腸菌における外来遺伝子の
発現を所望に応じて効果的に制御可能である。
また、Hi−プラスミド導入大腸菌の培養による外来遺
伝子産物の生産方法に、本発明の発現制御方法を用い、
菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離し、これらを
効率良く行なうことによって、Hi−プラスミド脱落菌の
発生を十分に抑えた良好な菌体増殖が達成でき、しかも
培養物中に高濃度で所望の外来遺伝子産物が得られ、効
率良い外来遺伝子産物の生産が可能となった。
伝子産物の生産方法に、本発明の発現制御方法を用い、
菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離し、これらを
効率良く行なうことによって、Hi−プラスミド脱落菌の
発生を十分に抑えた良好な菌体増殖が達成でき、しかも
培養物中に高濃度で所望の外来遺伝子産物が得られ、効
率良い外来遺伝子産物の生産が可能となった。
特に、本発明の方法では、外来遺伝子の発現制御を培
養温度の調節という簡易な操作によって行なうので、誘
導型プラスミドを用いる場合のように高価な誘導試薬を
用いる必要がない。
養温度の調節という簡易な操作によって行なうので、誘
導型プラスミドを用いる場合のように高価な誘導試薬を
用いる必要がない。
更に、Hi−プラスミド脱落菌の出現をより効果的に抑
えることができるので、大腸菌を植え継ぎ保存する場合
に大変有効であり、また、本発明の方法によれば、工業
的規模での大量培養による外来遺伝子の生産性の向上が
容易に図れる。
えることができるので、大腸菌を植え継ぎ保存する場合
に大変有効であり、また、本発明の方法によれば、工業
的規模での大量培養による外来遺伝子の生産性の向上が
容易に図れる。
第１図はpSwW11、pSW2およびpSW13のPAL構造遺伝子に関
わる部分の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、参考例でクローン化したフェニルアラニン・
アンモニアリアーゼをコードスル領域を含むDNA配列の
一方の鎖の有する塩基配列を示したものである。 第３図はpSW101を構築する手順のフローチャート、第４
図はpYtrp6を構築する手順のフローチャートのであり、
第５図〜第７図はそれぞれ第４図に示したフローチャー
トの内の一部を詳しく示したものである。 第８図は参考例２で構築された各組換え体プラスミドの
構築工程の概略図であり、第９図はプラスミドpTac11
の、第10図はプラスミドpPL‐PAL-headの、第11図はプ
ラスミドpSW115の構築工程を具体的に示した図である。 第12図は実施例１、第13図は比較例１、第14図は実施例
２、第15図は比較例２におけるそれぞれの培養操作の流
れを示した図である。
わる部分の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、参考例でクローン化したフェニルアラニン・
アンモニアリアーゼをコードスル領域を含むDNA配列の
一方の鎖の有する塩基配列を示したものである。 第３図はpSW101を構築する手順のフローチャート、第４
図はpYtrp6を構築する手順のフローチャートのであり、
第５図〜第７図はそれぞれ第４図に示したフローチャー
トの内の一部を詳しく示したものである。 第８図は参考例２で構築された各組換え体プラスミドの
構築工程の概略図であり、第９図はプラスミドpTac11
の、第10図はプラスミドpPL‐PAL-headの、第11図はプ
ラスミドpSW115の構築工程を具体的に示した図である。 第12図は実施例１、第13図は比較例１、第14図は実施例
２、第15図は比較例２におけるそれぞれの培養操作の流
れを示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中島 祥行 神奈川県横浜市栄区飯島町2070番地 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，15〔1981〕Ｐ．81−93
Claims (12)
- 【請求項１】発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入し
た組換え体プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現を
可能とした大腸菌の増殖菌体の調製や植え継ぎ保存のた
めの培養において、 前記組換え体プラスミドが、PLラムダプロモーター、tr
pプロモーター、またはtacプロモーターとPLラムダプロ
モーターとの連結プロモーターを有する発現ベクターの
該プロモーターによってその発現が支配される位置に前
記外来遺伝子を挿入した構成を有し、 かつ、前記大腸菌が40℃未満で発現する温度感受性のリ
プレッサーを有しないものであり、 更に、該大腸菌の培養温度を40℃以上に維持することに
より前記外来遺伝子の発現を抑制する ことを特徴とする大腸菌の培養方法。 - 【請求項２】前記外来遺伝子がＬ−フェニルアラニン・
アンモニアリアーゼ構造遺伝子である特許請求の範囲第
１項に記載の大腸菌の培養方法。 - 【請求項３】前記Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリ
アーゼが以下に示すアミノ酸配列を有するものである特
許請求の範囲第２項に記載の大腸菌の培養方法。 - 【請求項４】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSYPL−
３を保持する大腸菌MT 10424株である特許請求の範囲第
１項に記載の大腸菌の培養方法。 - 【請求項５】前記大腸菌が組換え体プラスミドpYtrp6を
保持する大腸菌MT 10414株である特許請求の範囲第１項
に記載の大腸菌の培養方法。 - 【請求項６】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSW 115
を保持する大腸菌MT 10423株である特許請求の範囲第１
項に記載の大腸菌の培養方法。 - 【請求項７】大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法にお
いて、 ａ） PLラムダプロモーター、trpプロモーター、また
はtacプロモーターとPLラムダプロモーターとの連結プ
ロモーターを有する発現ベクターの該プロモーターによ
ってその発現が支配される位置に前記外来遺伝子産物を
コードする外来遺伝子を挿入した構成の組換え体プラス
ミドを調製する過程と、 ｂ） 該組換え体プラスミドを、40℃未満で発現する温
度感受性のリプレッサーを有しない大腸菌に導入する過
程と、 ｃ） 該組換え体プラスミドが導入された大腸菌を、培
養温度を40℃以上で該大腸菌の増殖可能な温度に維持し
て前記外来遺伝子の発現を抑制しつつ培養する第１の培
養過程と、 ｄ） 該第１の培養過程で増殖した大腸菌を40℃未満で
該大腸菌の培養が可能な培養温度で培養する第２の培養
過程 とを有することを特徴とする大腸菌での外来遺伝子産物
の生産方法。 - 【請求項８】前記外来遺伝子産物がＬ−フェニルアラニ
ン・アンモニアリアーゼである特許請求の範囲第７項に
記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。 - 【請求項９】前記Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリ
アーゼが以下に示すアミノ酸配列を有するものである特
許請求の範囲第８項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物
の生産方法。 - 【請求項１０】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSYPL
−３を保持する大腸菌MT 10424株である特許請求の範囲
第７項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。 - 【請求項１１】前記大腸菌が組換え体プラスミドpYtrp6
を保持する大腸菌MT 10414株である特許請求の範囲第７
項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。 - 【請求項１２】前記大腸菌が組換え体プラスミドpSW 11
5を保持する大腸菌MT 10423株である特許請求の範囲第
７項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62152359A JPH0817704B2 (ja) | 1987-06-18 | 1987-06-18 | 外来遺伝子産物の生産方法 |
| US07/156,814 US5043277A (en) | 1987-02-19 | 1988-02-17 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| CA000559127A CA1320922C (en) | 1987-02-19 | 1988-02-17 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| EP88301356A EP0279665B1 (en) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | A method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| ES88301356T ES2043805T3 (es) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | Un metodo para regular la expresion de un gen extra\o controlando la temperatura del cultivo y procedimiento para producir un producto de gen extra\o por este metodo. |
| DE8888301356T DE3877012T2 (de) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | Verfahren zur regulierten expression eines fremdgens durch kontrolle der kulturtemperatur und ein prozess, dadurch ein fremdgenprodukt herzustellen. |
| DK088488A DK88488A (da) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | Fremgangsmaade til styring af ekspression af et fremmed gen i escherichia coli og fremgangsmaade til fremstilling af et fremmed genprodukt |
| MX010485A MX168908B (es) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | Metodo para regular la expresion de un gen exterior controlando la temperatura de cultivo y el procedimiento para producir un producto de gen exterior |
| KR1019880001742A KR910001812B1 (ko) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | 외래유전자의 발현제어방법 및 그 방법을 사용한 외래유전자산물의 생산방법 |
| US07/798,044 US5322786A (en) | 1987-02-19 | 1991-11-27 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62152359A JPH0817704B2 (ja) | 1987-06-18 | 1987-06-18 | 外来遺伝子産物の生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63317088A JPS63317088A (ja) | 1988-12-26 |
| JPH0817704B2 true JPH0817704B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=15538818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62152359A Expired - Lifetime JPH0817704B2 (ja) | 1987-02-19 | 1987-06-18 | 外来遺伝子産物の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0817704B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63202386A (ja) * | 1987-02-19 | 1988-08-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法 |
-
1987
- 1987-06-18 JP JP62152359A patent/JPH0817704B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，１５〔１９８１〕Ｐ．８１−９３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63317088A (ja) | 1988-12-26 |
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