JP2002511273A

JP2002511273A - 原核細胞における組換えタンパク質の制御発現のための新規な構築体

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Publication number: JP2002511273A
Application number: JP2000543627A
Authority: JP
Inventors: ローラン、シュバレ; アラン、ロベール; ジャン‐イブ、ボンフォワ; ティアン、ニョック、ニュイアン
Original assignee: ピエール、ファーブル、メディカマン
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2002-04-16
Also published as: WO1999053080A1; CN1261581C; EP1071798B9; DK1071798T3; AU768595B2; CN1303439A; FR2777292A1; DE69929590T2; ATE316579T1; PT1071798E; CA2325601A1; US6844169B1; DE69929590D1; EP1071798A1; BR9909643A; EP1071798B1; AU3154099A; ES2257853T3; FR2777292B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、原核宿主細胞におけるＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロモーターの制御下に置かれた目的とする組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現するための新規な構築体に関する。本発明は、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、この構築体がこの核酸配列を含んでなることを特徴とする。本発明は、この構築体を含むベクター、およびこのベクターで形質転換した宿主細胞にも関する。本発明は、更に上記の新規な構築体を用いて上記の組換えタンパク質を産生する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、原核宿主細胞におけるＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロモータ
ーの制御下に置かれた目的とする組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現す
るための新規な構築体であって、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝
子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、この核
酸配列を含んでなる構築体、この構築体を含むベクター、およびこのベクターで
形質転換した宿主細胞である。本発明の主題は、これらの新規な構築体を用いて
上記の組換えタンパク質を産生する方法でもある。

【０００２】本発明は、一般にいわゆる組換えＤＮＡ法による組換えポリペプチドまたはタ
ンパク質の産生に用いられる。更に詳細には、本発明は、細菌の種類でありかつ
発現がＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロモーター／オペレーターによって指
定されまたは制御されている形質転換宿主細胞による組換えポリペプチドまたは
タンパク質の産生に関する(Nichols & Yanfsky, 1983)。

【０００３】背景技術 Escherichia coli (E. coli)は、組換えタンパク質の産生の目的で最も普通に
用いられかつ最も詳細に特性決定されている生物である。様々な発現系がE. col i で用いられ、それらの中でもＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロモーターは
最も強力なものの１つであると考えられている(Yansura & Bass, 1997)。

【０００４】しかしながら、総ての組換え遺伝子が、E. coliによって同じ有効性で発現さ
れるとは限らない。形質転換宿主細胞の培養中に産生される組換えタンパク質が
蓄積されると、プラスミドが速やかに不安定になり、細胞成長が減少しまたは阻
止され、組換え生成物の総収率が減少する可能性があることが記載され、かつ観
察されている。この場合には、制御されかつ管理された発現の系を利用可能にし
て、産生過程を２つの相、すなわちプロモーターの活性が最低である第一のいわ
ゆる細胞成長期と、これに続く組換えタンパク質の発現および蓄積を促進するい
わゆる誘導または活性化期に分割できるようにすることが重要である。

【０００５】Ｐｔｒｐ、E. coliのトリプトファンオペロンプロモーターは、誘導性である
ため、組換えタンパク質の産生に適している。Ｐｔｒｐオペロンのレベルでの抑
圧は、ｔｒｐアポリプレッサーとも呼ばれるｔｒｐＲ調節遺伝子の生成物がトリ
プトファン（コリプレッサー）に結合しているとき、この生成物によって行われ
る。トリプトファンがなければ、ＴｒｐＲタンパク質はオペレーターに結合でき
なくなり、従ってトリプトファンオペロンを活性化することができない。Ｐｔｒ
ｐによって制御されている異種遺伝子の発現の様々な例は、そこからの発現の漏
出が大きすぎて、満足な条件下で組み換えタンパク質、特に細胞にとって毒性を
有するものを産生することができないことを示している(Yansura and Henner, 1
990)。

【０００６】ＴｒｐＲ調節タンパク質に自己調節機構(Kelly & Yanofsky, 1982)を行い、そ
の濃度は過剰な外来トリプトファンの存在下では１２０分子／E. coli K-12細胞
の平均値となる傾向がある(Gunsalus, Gunsalus Miguel & Gunsalus, 1986)。こ
の濃度は、単一のＰｔｒｐ染色体プロモーターの活性を正確に調節するのに十分
であるが、同じプロモーターを含む数十のベクターを考慮すれば限界的(limitin
g)であることを示すことがある。トリプトファンに関しては、これは、過剰に培
地に供給される場合には、限界因子であることもある。E. coliでは、実際にｔ
ｎａＡ遺伝子によってコードされかつトリプトファンをインドールに分解するこ
とによってその調節機能を変えることができるトリプトファナーゼ活性がある(S
nell, 1975)。更に、トリプトファナーゼをトリプトファンによって誘導して、
トリプトファンの供給増加に伴うこの分解現象を補償するいずれの試みをも無効
にすることができる。

【０００７】発現の漏出を最大限に制御するための様々な方法が予想され、報告されている
。しかしながら、実験室規模でしか応用できなかったり(Hasan & Szybalski, 19
95; Suter-Crazzolara & Unsicker, 1995)、組換え生成物の収率が減少する(Sta
rk, 1987)といった欠点を有するものもある。

【０００８】

【発明の概要】

従って、今日、大規模に用いることができかつ特に発言の漏出を制御できる目
的とする組換えタンパク質の制御発現系の開発が強く望まれている。これが、ま
さに本発明の主題である。

【０００９】本発明は、Ｐｔｒｐ発現系に基づいた新規な構築体であって、これを好ましく
は細菌型の原核宿主細胞に導入するとき、培養開始時における組換え遺伝子の残
存発現を減少させることができるものであって、組換えタンパク質の合成の制御
を向上させる新規な構築体に関する。

【００１０】本発明の主題は、原核宿主細胞におけるＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロ
モーターの制御下に置かれた目的とする組換えタンパク質をコードする遺伝子を
発現するための構築体であって、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝
子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、この核
酸配列を含んでなる、構築体である。

【００１１】

【発明の具体的説明】

「目的とする組換えタンパク質」という表現は、遺伝子組換えによって得られ
、ヒトまたは動物の健康、化粧品学、ヒトまたは動物の栄養、農工業、または化
学工業のような分野で用いることができる総てのタンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドを表すものである。目的とするこれらのタンパク質の中では、特に下
記のものを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。サイトカイン、特にインターロイキン、インターフェロン、組織壊死因子、お
よび成長因子、特に造血成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、ホルモン、例
えばヒト成長ホルモンまたはインスリン、神経ペプチド、血液凝固に関与する因子または補助因子、特にVIII因子、フォンビルブラント
因子、アンチトロンビンIII、プロテインＣ、トロンビン、およびヒルジン、酵素、特にトリプシン、リボヌクレアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ、酵素阻害剤、例えばα１−アンチトリプシン、およびウイルスプロテアーゼ阻
害剤、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現生成物のような癌のイニシエーションまたは進
行を阻害することができるタンパク質、例えばＰ５３遺伝子、免疫応答または抗体を刺激することができるタンパク質、例えばグラム陰性菌
の外膜のタンパク質またはその活性断片、特にクレブシエラのＯｍｐＡタンパク
質、またはヒト呼吸器シンシチウムウイルスプロテインＧ、ウイルス感染またはその発達を阻止することができるタンパク質、例えば当該
ウイルスの抗原性エピトープ、または生のウイルスタンパク質と競合することが
できるウイルスタンパク質の修飾変異体、サブスタンスＰまたはスーパーオキシドジスムターゼのような化粧組成物に配
合することができるタンパク質、食餌用タンパク質、化学的または生物学的化合物の合成を指示することができるまたはある種の毒
性化合物を分解することができる酵素、または任意のタンパク質を産生する微生物に対して毒性を有するタンパク質、例えば
、特にこの微生物が細菌E. coliであるときに、ＨＩＶ−１ウイルスのプロテア
ーゼ、タンパク質ＥＣＰ（ＥＣＰ：好酸球カチオンタンパク質(Eosinophil Cati
onic Protein)）、またはポリオウイルスの２Ｂおよび３Ｂタンパク質。

【００１２】「ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができ
る核酸配列を上記宿主細胞に導入するときの、この核酸配列」という表現は、上
記遺伝子を修飾することができ、修飾により上記宿主細胞のトリプトファナーゼ
活性を喪失させ、この修飾した遺伝子の発現生成物がトリプトファンをインドー
ルに分解することによりこの調節機能を変化させることができなくする、核酸配
列を表すものである。ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性
化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、この核酸配列の中
では、活性ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする攪拌配列の少なくとも１個
のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失のような突然変異によって得ら
れる不活性化したＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする核酸配列が好ましい
。

【００１３】本発明は、本発明による構築体であって、原核宿主細胞がグラム陰性菌、好ま
しくはE. coli種に属する細菌であることを特徴とする構築体を含んでなる。

【００１４】本発明は、本発明による構築体であって、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコー
ドする遺伝子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入すると
き、この核酸配列の上流に、Ｐｔｎａトリプトファナーゼオペロンプロモーター
の核酸配列の全部または一部をも含んでなる、構築体にも関する。

【００１５】好ましくは、本発明は、本発明による構築体であって、ＴｎａＡトリプトファ
ナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞
に導入するとき、この核酸配列が上記ＴｎａＡトリプトファナーゼのコード配列
の突然変異断片を含んでなる構築体に関する。

【００１６】好ましくは、本発明は、本発明による構築体であって、停止コドンをある位置
に挿入し、このようにして得られる突然変異断片の配列がトリプトファナーゼ活
性を欠くタンパク質断片をコードするようにすることによって上記突然変異断片
を得ることを特徴とする構築体に関する。

【００１７】好ましくは、本発明は、本発明による構築体であって、上記突然変異断片が上
記宿主細胞のＴｎａＡトリプトファナーゼのコード配列の突然変異断片であるこ
とを特徴とする構築体に関する。

【００１８】 E. coliのＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする核酸配列に関しては、本
発明の説明においてDeeley & Yanafsky (1981)によって公表された配列を参照す
る。

【００１９】Ｐｔｒｐトリプトファンオペロンプロモーター／オペレーターをコードする核
酸配列に関しては、Yanofsky et al. (1981)によって公表された配列を参照する
。

【００２０】本発明は、本発明による構築体であって、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコー
ドする遺伝子を不活性化することができる核酸配列を上記宿主細胞に導入すると
き、上記核酸配列が、プロモーターの配列の全部または一部を含んでなる核酸配
列に続いて、３′位において、性質がリボヌクレオチドまたはタンパク質であり
かつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする核酸配列を含
んでなる構築体にも関する。

【００２１】好ましくは、本発明は、本発明による構築体であって、３′位において、性質
がリボヌクレオチドまたはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して
負に作用する分子をコードする核酸配列が続く上記プロモーターが、E. coliの
Ｐｔｎａトリプトファナーゼオペロンプロモーターの全部または一部であること
を特徴とする構築体に関する。

【００２２】同様に好ましくは、本発明は、本発明による構築体であって、性質がリボヌク
レオチドまたはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用す
る分子をコードする上記核酸配列が、E. coliのＴｒｐＲトリプトファンオペロ
ンアポリプレッサーをコードする配列、またはその生物活性断片の１つ、例えば
Gunsalus & Yanofsky (1980)であることを特徴とする構築体を含んでなる。

【００２３】「プロモーターの配列の全部または一部を含んでなる核酸配列」という表現は
、プロモーターの総ての配列またはその生物活性断片の１つを含んでなり、それ
に機能的に結合する遺伝子の発現を指定または制御することができる核酸配列を
表すものである。

【００２４】本発明の説明において、「プロモーターの生物活性断片」という表現は、上記
プロモーターの断片の下流に位置する遺伝子の発現を指定しまたは制御すること
ができ、上記遺伝子がこの断片に機能的に結合しているものの任意の配列を表す
ものである。

【００２５】本発明の説明において、「ＴｒｐＲトリプトファンオペロンアポリプレッサー
の生物活性断片」という表現は、リプレッサー活性を保存している上記アポリプ
レッサーの任意の断片を表すものである。

【００２６】「性質がリボヌクレオチドでありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用
する分子をコードする核酸配列」という表現、好ましいリボヌクレオチドは、下
記の配列 a) 5'- AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC - 3' b) 5'- AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AGCACAACGC GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC AGG - 3' c) 5'- AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUU - 3' d) 5'- AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG UUUUCCGGUC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG - 3' e) 5'- AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUU - 3' f) 5'- AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG UUUUCCGGUC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG - 3' g) 5'- CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC - 3' h) 5'- CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC AGCACAACGC GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC AGG - 3'. から選択される。

【００２７】本発明のもう一つの態様は、本発明による構築体を含むベクターに関する。

【００２８】好ましくは、本発明によるベクターは、ベクターｐＭＡＫ７０５［ｔｎａＡｔ
］またはベクターｐＭＡＫ７０５［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ：：３′ｔｎａ］であ
ることを特徴とする。

【００２９】本発明は、原核宿主細胞、好ましくは本発明によるベクターで形質転換したE. coli 種の細菌にも関する。

【００３０】もう一つの態様では、本発明の主題は、本発明による構築体を用いて宿主細胞
中で組み換えタンパク質を産生する方法である。

【００３１】本発明の主題は、本発明による目的とする組換えタンパク質を産生する方法で
あって、上記構築体を原核宿主細胞のＤＮＡに導入することを特徴とする方法で
もある。

【００３２】好ましくは、本発明による組換えタンパク質を産生する方法であって、上記構
築体を本発明によるベクターを用いて、好ましくは例１または２に記載の染色体
組込み法に準じて、原核宿主細胞のＤＮＡに導入することを特徴とする方法であ
る。

【００３３】本発明の主題は、本発明による組換えタンパク質を産生する方法であって、上
記構築体を選択的に有利に上記構築体と関連させる任意の他のＤＮＡ要素なしに
導入することを特徴とする方法でもある。

【００３４】好ましくは、本発明は、本発明による目的とする組換えタンパク質を産生する
方法であって、上記構築体をE. coliのトリプトファナーゼオペレーター遺伝子
座、好ましくはｔｎａ遺伝子座、更に好ましくはｔｎａＡ遺伝子座に導入するこ
とを特徴とする方法である。

【００３５】好ましくは、本発明による目的とする組換えタンパク質を産生する方法であっ
て、ａ）原核細胞を本発明によるベクターで形質転換し、上記構築体を上記宿主細
胞のＤＮＡに組込み、ｂ）上記原核細胞を、目的とする上記組換えタンパク質をコードする遺伝子を
含むベクターで形質転換し、ｃ）上記形質転換細胞を、組換えタンパク質を発現する培地で培養し、ｄ）組換えタンパク質を培地からまたは上記形質転換細胞から回収する段階を含んでなる方法である。

【００３６】本発明の主題は、本発明による目的とする組換えタンパク質を産生する方法で
あって、上記方法の段階ａ）とｂ）との間に、分割およびスクリーニング段階を
さらに含んでなる方法でもある。

【００３７】本発明は、本発明による目的とする組換えタンパク質を産生する方法であって
、Ｐｔｒｐプロモーターを誘導する前に、性質がリボヌクレオチドまたはタンパ
ク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする核
酸配列が３′位において続く上記プロモーターを誘導することによって組換えタ
ンパク質の発現を制御することを特徴とする、方法にも関する。

【００３８】最後に、本発明は、本発明による産生法であって、性質がリボヌクレオチドま
たはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコ
ードする核酸配列が３′位において続く上記プロモーターを、このプロモーター
に対して阻害または活性化効果を発揮させることができる任意の手段によって誘
導することを特徴とする方法をも含んでなる。

【００３９】好ましくは、本発明は、本発明による産生法であって、性質がリボヌクレオチ
ドまたはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子
をコードする核酸配列が３′位において続く上記プロモーターを、ａ）培地に適当な炭素源を選択することによって、またはｂ）培地にトリプトファンを加えることによって、またはａ）およびｂ）の組合
せによって誘導することを特徴とする方法をも含んでなる。

【００４０】構築体およびベクター系、上記ベクターで形質転換した原核宿主細胞、および
上記されかつ以下の例に例示される本発明の方法は、原核細胞における組換えタ
ンパク質の産生の制御の文脈に含まれる。それらは、Ｐｔｒｐプロモーター／オ
ペレーターの下流に置かれた相同または異種遺伝子の発現に適している。２種類
の突然変異体を以下において更に具体的に記載し、本発明を説明する。それらは
、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００と命名されている（ＩＣＯＮＥ：過
剰および非漏出発現のための改良細胞(Improved Cells for Over- and Non-leak
y Expression)）。ＩＣＯＮＥ系に導入された修飾は、下記の特徴を有する。１）宿主の染色体に組込まれ、２）それらは、位置指定突然変異誘発法を用いて生成するので、細菌ＤＮＡの
単一部位に標的設定され、この部位はE. coli K-12ゲノムの物理的地図上の８３
ｍｉｎに位置したｔｎａオペロンであるので、完全に知られている。これに関し
て、生理学的観点から宿主についての結果は完全に同定されている。特に、ラン
ダム突然変異誘発の場合に考えられるように、染色体組込みに続いて曖昧な機能
(cryptic functions)が再活性化される可能性が除外され、３）染色体組込みについてこれらの例で用いられる手法(Hamilton et al. (19
89)）は、他の配列が細菌ＤＮＡに挿入されるという可能性を除外する。特に、
突然変異体は抗生物質に耐性の遺伝子を全く持たない。それらを工業的規模で用
いれば、生産者や立法者に、環境での偶然の散布の場合には選択的利点はなくな
ることを保証する。

【００４１】本発明の一態様によれば、ＩＣＯＮＥ１００と命名された第一の型の突然変異
体または形質転換細胞であって、ｔｎａＡ遺伝子に突然変異を有し、トリプトフ
ァナーゼ活性を喪失するものが記載される。この突然変異に関連した表現型は、
トリプトファン分解の非存在である。この種の突然変異体は、レポーターベクタ
ーで形質転換し、通常はトリプトファナーゼ活性を促進する培地で培養したとこ
ろ、突然変異体がトリプトファンによる抑制の制御に関して誘導される単離物よ
り優れていることが分かる。

【００４２】本発明のもう一つの態様によれば、ＩＣＯＮＥ２００と呼ばれる第二の型の突
然変異体が記載され、これは、ｔｎａＡ遺伝子座で組込まれるＰｔｎａトリプト
ファナーゼプロモーターの制御下でｔｒｐＲ遺伝子を発現するためのカセットを
有している。組込みの標的としてｔｎａ遺伝子座を用いることにより、宿主細菌
ではトリプトファナーゼ活性が喪失し、これにより上記のようにトリプトファン
をインドールへ転換することができなくなる。更に、染色体にＰｔｎａ：：ｔｒ
ｐＲ遺伝子カセットが存在することにより、この新規なｔｒｐＲ遺伝子にＰｔｎ
ａの特徴、すなわち異化作用抑制に対する感受性(Isaacs, Chao, Yanofsky, & S
aier, 1994; Botsford & DeMoss, 1971)およびトリプトファンによる誘導性(Ste
wart & Yanofsky, 1985)が与えられる。後者の特性は、プラスミドＰｔｒｐプロ
モーターが、これに拮抗的である染色体プロモーターＰｔｎａによって転写のレ
ベルで制御される革新を構成する。意外なことには、発現ベクターを用いる形質
転換および発酵槽での培養の後、ＩＣＯＮＥ２００は、これがトリプトファンに
よる抑制の制御に関して誘導される単離物より優れていることが分かっている。

【００４３】上記の特徴の１つを有する細菌は組換え分子の制御産生に有用であり、従って
、本発明の主題は、組換えタンパク質を産生する方法における上記の形質転換細
菌の使用でもある。

【００４４】下記の例では、２種類の突然変異体によって提供される利点を、組換えタンパ
ク質としてEscherichia coliβ−ガラクトシダーゼを用いて平明に説明する。

【００４５】本発明のもう一つの態様は、導入された突然変異の特徴にある。それらは詳細
に定義されており、遺伝学および生化学的観点から制御され、E. coliのｔｎａ
遺伝子座に標的設定され、選択マーカーを持たない。

【００４６】本発明の突然変異体または形質転換微生物は、原核生物、更に正確にはEscher ichia coli 種に属するグラム陰性菌を用いて構築される。トリプトファンによっ
て誘導することができ、異化作用抑制に感受性である）E. coliのトリプトファ
ナーゼオペロンプロモーターの特性を用いて、Ｐｔｒｐ指定発現に負に作用する
メディエーターの一過性合成を指定した。しかしながら、他の細菌種、特に動物
の腸管でコロニー形成するものは、トリプトファンによって誘導することができ
るトリプトファナーゼを合成できることが知られている(Snell, 1975)。従って
、E. coli以外の菌株が、記載した方法を行い、組換えタンパク質を産生するの
に適している。

【００４７】下記の例および図は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制
限するためのものではない。

【００４８】本発明は、宿主細胞のゲノムへの突然変異の安定な導入に基づいている。下記
の例に示される総ての修飾は、下記のシリーズから模式的になるE. coliのｔｎ
ａ遺伝子座に導入される。Ａ）Ｐｔｎａプロモーター、Ｂ）ｔｎａＡ（トリプトファナーゼ）遺伝子のコード配列、Ｃ）遺伝子間領域、Ｄ）ｔｎａＢ（トリプトファン透過酵素）遺伝子のコード配列、Ｅ）転写ターミネーター。

【００４９】更に具体的には、修飾は、要素（Ｂ）に関する。これは、要素（ｂ）の利点に
代わり、様々な構築体におけるその特徴は、下記の通りである。

【００５０】

【表１】

【００５１】例１：突然変異体ＩＣＯＮＥ１００の構築ＤＮＡ断片であるマークしたｔｎａＡＴを、ＰＣＲによって増幅する。これは
、ｔｎａＡのコード配列の第一のヌクレオチドに関して−２７５位から＋１０５
４位まで伸張する。ＰｔｎａプロモーターおよびｔｎａＡに重複しているこの断
片を、二部ＰＣＲ反応によって増幅する。Ｉ部は、−２７５位から＋２２０位ま
で伸張する。これを、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドＴｒｐ５（センス
）およびＴｒｐ２（アンチセンス）によって増幅する。 Trp5 : 5' - CGGGATCCGTGTGACCTCAAAATGGTT - 3' BamHI Trp2 : 3' - CTACGCGCCGCTGCTTCGGATTAGATCTCG - 5' (アンチセンス）停止XbaI

【００５２】 II部は、Ｉ部の３′に隣接しているｔｎａＡのコード配列に配置されている。
これは、＋２２１位から＋１０５４位まで伸張する。これを、オリゴヌクレオチ
ドＴｒｐ３およびＴｒｐ４により増幅する。 Trp3 : 5' - CGTCTAGACAGCGGCAGTCGTAGCTAC - 3' XbaI Trp4 : 3' - CCTTCTCTAACCGCAACAGTTCGAACG - 5' (アンチセンス) HindIII

【００５３】ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液(AmpliTaq Gold CETUS, 米国）中で
溶解したE. coli K-12コロニーをマトリックスとして用いて行う。

【００５４】増幅生成物をエタノールで沈澱した後、適当な制限酵素（Ｉ部にはＢａｍＨＩ
／ＸｂａＩ、II部にはＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII）で消化する。ＥＴＢで染色した
アガロースゲル上で分析することによって、これらの断片が予想サイズを有する
ことを明らかにすることができる(Deeley & Yanofsky, 1981)。２個の断片Ｉお
よびIIをＸｂａＩ部位で連結することによって、ｔｎａＡＴ断片が生成する。こ
れは、＋２２１位の停止コドンに続いてＸｂａＩ制限部位があることによって、
天然配列とは異なる。このｔｎａＡＴ断片を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII部位で
ベクターｐＲＩＴ２８(Hultman, Stahl, Hornes & Uhlen, 1989)にクローニング
し、配列決定する。ｔｎａＡＴ断片を、ベクターｐＭＡＫ７０５にサブクローニ
ングし(Hamilton, Aldea, Washburn, Babitzke & Kushner, 1989)、ｐＭＡＫ７
０５［ｔｎａＡＴ］を得る。

【００５５】 E. coliにおける遺伝子再配列を行うのに用いる方法は、Hamilton et al. (19
89)によって報告された方法である。これは、３０℃では機能するが４２℃を上
回ると不活性である複製の熱感受性源を有する自殺ベクターｐＭＡＫ７０５、お
よびクロラムフェニコール耐性遺伝子の使用に基づいている。E. coliにRV308 (
Maurer, Meyer & Ptashne, 1980)をベクターｐＭＡＫ７０５［ｔｎａＡＴ］４μ
gで形質転換し、形質転換混合物をＬＢ培地＋２０μg／mlのＣＭＰを含むプレー
トに植え付ける。３０℃で一晩インキュベーションした後、３個のクローンをＬ
Ｂ液体培地＋２０μg／mlのＣＭＰ中で継代培養し、５８０nmの吸光度が１に近
くなるまで３０℃で攪拌しながらインキュベーションする。次に、懸濁液をＬＢ
培地＋２０μg／mlのＣＭＰに植え付け、４４℃および３０℃でインキュベーシ
ョンする。４４℃で発育するコロニー（＝コインテグラント(cointegrants)）は
ベクターの染色体組込みを有しており、この組込みは、染色体とベクターによっ
て行われたインサートとの間の配列同族列の存在によって促進される。

【００５６】いわゆる分割期は、染色体上にある反復配列間の組換え機構によってベクター
の除去を促進することからなる。４４℃で単離された幾つかのクローンを、ＬＢ
液体培地＋２０μg／mlのＣＭＰ中で３０℃で３日間培地を定期的に取り換えな
がら培養する。次に、懸濁液を希釈して、ＬＢ寒天培地＋２０μg／mlのＣＭＰ
に植え付け、分離したコロニーが出現するまで３０℃でインキュベーションする
。数十個のコロニーを、ＬＢ寒天培地＋２０μg／mlのＣＭＰで３０℃および４
４℃で２個ずつ継代培養する。４４℃で成長しないコロニーを選択し、ベクター
の分割がｔｎａ遺伝子座に停止コドンとＸｂａＩ部位を保存しているかどうかを
示すＰＣＲ反応によりスクリーニングする。用いたオリゴヌクレオチドは、Ｔｒ
ｐ６（センス）およびＴｒｐ７（アンチセンス）であり、これらはそれぞれ所望
な突然変異およびｔｎａＡターミネーターの部分に対して相同性である。 Trp6 : 5' - CGACGAAGCCTAATCTAGA - 3' 停止 XbaI Trp7 : 3' - CCGATATTCCTACAATCGG - 5' (アンチセンス)

【００５７】１８個のスクリーニングを行ったクローンの中、９個が予想サイズの増幅断片
を生じ、ｔｎａ遺伝子中に停止コドンに続いてＸｂａＩ部位の存在を示している
。他の９個のクローンは増幅生成物を生じないが、これは恐らく分割段階で染色
体上に未突然変異ｔｎａＡ遺伝子を回復していることによる。９個の陽性クロー
ンの中、４個を採取して、選択圧力の非存在下で連続継代培養によりプラスミド
の除去を行う。数日間培養した後、クロラムフェニコールに再度感受性になった
クローンを得る。

【００５８】ｔｎａ−不活性化突然変異の存在を、２つの異なるやり方で確かめる。第一に
、オリゴヌクレオチドＴｒｐ５およびＴｒｐ４によるＰＣＲ増幅の後にＸｂａＩ
による消化によって、E. coli RV308にはない制限部位が、突然変異体のｔｎａ
Ａ遺伝子には存在することを示し、次に、トリプトファンリッチな培地で突然変
異体を培養した後、インドール試験（培地にコバックス試薬を加える）によって
、突然変異体はインドールを生成しなかったが、起源のＲＶ３０８株は同じ滋養
ケン化でインドールを生成することを示す。これから、導入された突然変異は、
トリプトファナーゼ活性を喪失させると考えられる。

【００５９】１個のクローンを、冷凍形態で保存する目的で選択する。これを、ＩＣＯＮＥ
１００と命名する。

【００６０】例２：突然変異体ＩＣＯＮＥ２００の構築ＤＮＡ断片を、３個のサブユニットのＰＣＲ増幅によってイン・ビトロで構築
する。

【００６１】Ｐｔｎａプロモーターに配置された第一のサブユニットは、ｔｎａＡのコード
配列の第一のヌクレオチドに関して−５１１位から＋３位まで伸張する。これを
、オリゴヌクレオチドＴｒｐＲ１（５′位がビオチニル化）およびＴｒｐＲ２を
用いて増幅する。 TrpR1 : 5' - CTGGATCCCTGTCAGATGCGCTTCGC - 3' BamHI TrpR2 : 3' - CTTCCTAATACATTACCGGGTTG - 5' (アンチセンス)

【００６２】第二のサブユニットは、E. coliのｔｒｐＲ遺伝子のコード配列に相当する。
これを、オリゴヌクレオチドＴｒｐＲ３およびＴｒｐＲ４（５′位がビオチニル
化）を用いて増幅する。 TrpR3 : 5' - GTAATGGCCCAACAATCACC - 3' start TrpR4 : 3' - CACAACGACTTTTCGCTAACTGACGTCAG - 5' (アンチセンス) PstI

【００６３】第三のサブユニットは、ｔｎａＡのコード配列の３′に隣接して配置された配
列に相当する。これは、ｔｎａオペロンとトリプトファン透過酵素をコードする
ｔｎａ遺伝子の一部との遺伝子間領域を含む。これを、ＴｒｐＲ５およびＴｒｐ
Ｒ６を用いて増幅する。 TrpR5 : 5' - CGCTGCAGTTAATACTACAGAGTGG - 3' PstI TrpR6 : 3' - CCAGCTAATGAGGTAAGTTCGAAC - 5' (アンチセンス) HindIII

【００６４】増幅断片をGeneClean法（Bio101、ジョラ、カリフォルニア、米国）に準じて
精製する。

【００６５】サブユニットＩおよびIIを、下記の方法で融合する。２個の別々の試験管で、
それぞれのサブユニットをストレプトアビジン標識ビーズ（Dynabeads、DYNAL、
ノルウェー）３０μlと共にインキュベーションする。３７℃で２０分および室
温で５分後、結合したＤＮＡを０．１５ＭＮａＯＨ５０μlで変性する。そ
れぞれの上清中で回収された一本鎖ＤＮＡを等部で混合し、５サイクルのＰＣＲ
によってＴａｑポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、CETUS、米国）の存在下にてハイ
ブリダイゼーション反応および伸張反応を行う。反応生成物を、オリゴヌクレオ
チドＴｒｐＲ１およびＴｒｐＲ４を用いるＰＣＲで増幅する。

【００６６】 GeneClean精製した増幅生成物を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化する。こ
のようにして単離した断片をベクターｐＲＩＴ２８にクローニングしてｐＲＩＴ
２８［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ］を得た後、配列決定する。

【００６７】サブユニットIIIを酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した後、ｐＲＩＴ２
８にクローニングした後、ｐＲＩＴ２８［３′ｔｎａ］を得て、次に配列をＤＮ
Ａ配列決定法によって明らかにする（ABI 373A、Perkin Elmer、米国）。

【００６８】ベクターｐＲＩＴ２８［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ］を酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎ
ｄIIIで消化した後、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII二重消化によってｐＲＩＴ２８［３
′ｔｎａ］から単離したサブユニットIIIの存在下にて連結する。生成するベク
ターを、ｐＲＩＴ２８［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ：：３′ｔｎａ］と命名する。イ
ンサートを、酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで二重消化した後に、ｐＭＡＫ
７０５に移す。生成するプラスミドを、ｐＭＡＫ７０５［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ
：：３′ｔｎａ］と命名する。

【００６９】 E. coli RV308のｔｎａ遺伝子座におけるＰｔｎａ：：ｔｒｐＲ：：３′ｔｎ
ａ融合の組込みを、例１に記載したのと同様の条件下で行う。簡単に説明すれば
、菌株をベクターｐＭＡＫ７０５［Ｐｔｎａ：：ｔｒｐＲ：：３′ｔｎａ］で形
質転換した後、組込みおよび分割段階を施す。

【００７０】分割の終了時のコロニーのスクリーニングには、例１とは若干異なる条件を用
いる。ｔｎａ遺伝子座を、オリゴヌクレオチドＴｒｐＲ１１およびＴｒｐＲ７を
用いてＰＣＲによって増幅する。 TrpR11 : 5' - GGGCAGGTGAACTGCTGGCG - 3' TrpR7 : 3' - GGTGCCGTTATAAGGGTCGGAC - 5' (アンチセンス)

【００７１】ＴｒｐＲ１１はＴｒｐＲ１の上流（５′）のＰｔｎａ配列とハイブリダイズし
、ＴｒｐＲ７はＴｒｐＲ６の下流（３′）のｔｎａＢ配列とハイブリダイズする
。増幅生成物は、Ｐｔｎａの下流に位置した遺伝子がｔｎａＡ（ＲＶ３０８で見
られる場合）またはｔｒｐＲ（突然変異体で所望な場合）であるかによって異な
るサイズを有する。ｔｎａ遺伝子座にｔｒｐＲを有するコロニーを保存し、ＩＣ
ＯＮＥ２００と命名する。その染色体配列の分析は、Ｐｔｎａプロモーターの下
流に隣接してｔｒｐＲ遺伝子を有することを示している。トリプトファンの存在
下で培養することにより、インドール形成が見られないことが確かめられ、これ
はｔｎａＡ遺伝子の喪失の論理的結果である。

【００７２】例３：スクシネート＋トリプトファンの存在下における発現の漏出この例では、Ｐｔｒｐプロモーターの制御下における組換えタンパク質の発現
を制御するためのE. coli RV308、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００の
相対容量を説明する。この目的のため、E. coliβ−ガラクトシダーゼをコード
する配列がＰｔｒｐプロモーターの下流に位置しているｐＶＡ−βｇａｌと呼ば
れる発現ベクターを構築した。この構築体に用いた起源のベクターは、ｐＶＡＡ
ＢＰ３０８である(Murby, Samuelsson, Nguyen, et al., 1995)。

【００７３】３種類の菌株のそれぞれを、ベクターｐＶＡ−βｇａｌで形質転換する。得ら
れた形質転換体を、個別に完全培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス(DIF
CO)、５ｇ／ｌ酵母エキス(DIFCO)）中で３７℃で一晩培養する。これらの予備培
養の一部を、M9.YE.SUCC培地（１×Ｍ９塩溶液(DIFCO)、５ｇ／ｌ酵母エキス(DI
FCO)、２０ｇ／ｌコハク酸ナトリウム）６０mlに移す。３７℃でインキュベーシ
ョンして指数成長期に到達させた後、試料をそれぞれの培養物から取り出す。成
長を、細菌懸濁液の５８０nmでの吸光度により算出する。β−ガラクトシダーゼ
活性のレベルを、それぞれの細胞ペレットで測定する。このため、培養物１mlを
１２０００ｇで３分間遠心分離する。細胞ペレットを緩衝液（５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５／１ｍＭＥＤＴＡ／１００ｍＭＮａＣｌ／４００μg／m
lリソソーム）９００μlに加え、３７℃で１５分間インキュベーションする。Ｓ
ＤＳ（１％５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５溶液）１００μlを加え、試
料を室温で５分間放置する。分析は、試料３０μl、緩衝液（５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１ｍＭＭｇＣｌ_２）２０４μl、およびＯＮＰＧ（４mg
／５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５１ml）６６μlを混合することによっ
て行う。反応混合物を３７℃でインキュベーションする。反応を、１ＭＮａ_２ＣＯ_３５００μlを加えて停止する。インキュベーション時間に対する４２０n
mでの吸光度は、試料中に含まれるβ−ガラクトシダーゼ活性に比例する。E. co li RV308はｌａｃオペロンを完全に欠失していることが知られているので(Mauer
, Meyer & Ptashne, 1980)、測定したβ−ガラクトシダーゼ活性はベクターｐＶ
Ａ−βｇａｌによって行った遺伝子の発現だけによるものである。

【００７４】表２に、菌株ＲＶ３０８、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００のそれぞ
れを用いて得た結果をまとめる。

【００７５】

【表２】

【００７６】表２の結果は、ＩＣＯＮＥ系の突然変異体は、これらが由来する菌株ＲＶ３０
８と少なくとも同じ程度に成長することを示している。従って、導入された突然
変異は、成長に対して負の効果を持たない。更に、測定したβ−ガラクトシダー
ゼ活性は、３種類の菌株で異なる。ＩＣＯＮＥ１００の細胞内活性は、ＲＶ３０
８の約４．５分の１である。Ｐｔｎａプロモーターの活性が最大となる「炭素源
としてのスクシネート」条件下では(Botsford & DeMoss, 1971)、トリプトファ
ナーゼ遺伝子の欠失により、恐らくは細胞内トリプトファン（コリプレッサー）
の分解が制限されることにより発現の漏出が減少する。同じ条件下では、ＩＣＯ
ＮＥ２００での発現の漏出の程度は、ＩＣＯＮＥ１００と比較して更に１０分の
１まで減少する。従って、プラスミドＰｔｒｐプロモーターの活性は、ＩＣＯＮ
Ｅ２００で最小である。第一に、トリプトファナーゼ活性の喪失により、ＩＣＯ
ＮＥ１００について示されるように、細菌にＰｔｒｐをより一層制御する可能性
が与えられる。しかしながら、ＩＣＯＮＥ２００は、遺伝学的条件でＩＣＯＮＥ
１００と識別されかつ実験的レベルで発現制御に関して一層有利な第二の特性を
有する。従って、Ｐｔｎａが活性である条件下では、ＩＣＯＮＥ２００はＴｐｒ
Ｒアポリプレッサーの過剰発現を指定する可能性を有し、従って、プラスミドＰ
ｔｒｐプロモーターのレベルで測定した発現の漏出は、起源のＲＶ３０８の菌株
に対して約５０のファクターだけ減少する。

【００７７】例４：グリセロール＋トリプトファンの存在下における発現の漏出この例では、Ｐｔｒｐ系を用いて組換えタンパク質を産生するための工業的に
用いるのと類似の発酵培地および発酵条件下で突然変異体ＩＣＯＮＥ２００によ
って提供される利点を説明する。

【００７８】３種類の菌株ＲＶ３０８、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００のそれぞ
れを、ベクターｐＶＡ−βｇａｌで形質転換する。得られた形質転換体を、個別
に完全培地（３０ｇ／ｌトリプティックソイブロス(DIFCO)、５ｇ／ｌ酵母エキ
ス(DIFCO)）２００ml中で３７℃で一晩培養する。

【００７９】得られた細胞懸濁液を、１．８リットルの下記の培地（最終培養物２リットル
に対する濃度）：９０ｇ／ｌグリセロール、５ｇ／ｌ（ＮＨ_４）２ＳＯ_４、６
ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４、４ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４、９ｇ／ｌＮａ３−クエン酸
塩・２Ｈ_２Ｏ、２ｇ／ｌＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ｌ酵母エキス、３０mg
/l ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、８ｍｇ／ｌＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、７mg/l Ｃｏ
Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、７mg/l Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１０mg/l ＭｎＳＯ_４・１Ｈ_２Ｏ、２mg/l Ｈ_３ＢＯ_３、８mg/l ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、５４mg/l
ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．０６％消泡剤、８mg/lテトラサイクリン、および２
００mg/lトリプトファンを含む発酵槽（CF300型、Chemap製、容量３．５ｌ）に
無菌的に移す。アンモニア水を加えて、ｐＨを７．０に調節する。用存酸素含量
を、攪拌速度、次に暴気流速を溶解Ｏ２を測定することにより自動的に調節する
ことによって飽和持の３０％に保持する。培養物の吸光度が４０〜４５の値に達
したならば、インドールアクリル酸(SIGMA)を加えて、誘導を行う。

【００８０】培養物（懸濁液の５８０nmにおけるＯＤ）および細胞内β−ガラクトシダーゼ
活性（例３参照）の吸光度の速度論による分析を行う。図１および２は、それぞ
れ３種類の培養物の成長曲線およびβ−ガラクトシダーゼ活性の曲線を示す。

【００８１】図１に示すデーターにより、例３での観察、すなわち３種類の菌株は類似の成
長速度論を有することが確かめられる。ＩＣＯＮＥ系の突然変異体は、この観点
からE. coli RV308の潜在的成長を保存しており、従って、それらは工業的使用
の有力な候補である。

【００８２】図２のデーターは、発酵槽でのβ−ガラクトシダーゼの発現に対するＩＣＯＮ
Ｅ菌株によって行われた突然変異の衝撃を示している。分かりやすく説明すれば
、グリセロールを基剤とする培地では、外来トリプトファンはＩＣＯＮＥ１００
よりもＲＶ３０８培養物でより速やかに消失することが観察されているが（デー
ターは示さず）、トリプトファナーゼ活性の存在または非存在はＲＶ３０８およ
びＩＣＯＮＥ１００曲線の最初の部分によって示されるように、発現の制御には
影響がない。一方、突然変異体ＩＣＯＮＥ２００は、培養の開始時には良好な発
現制御力を示し、β−ガラクトシダーゼ活性は、培養の最初の１８時間は低いま
まであり、次いで細胞外トリプトファン濃度が０になるｔ＝２０時間から増加し
始める（データーは示さず）。ＩＣＯＮＥ２００に関する曲線の第二の部分は、
β−ガラクトシダーゼ活性が一定に増加して、培養の終了時にはＲＶ３０８で得
たレベル付近にまで達する。これに関して、ＩＣＯＮＥ２００に存在する調節系
により降らすＰｔｒｐプロモーターの一過性制御が行われることを示す。トリプ
トファンおよび／または炭素源によって発揮されるこの制御は、培養の第二の部
分では無効になり、組換えタンパク質の最大発現に対して作用しない。

【００８３】例５：毒性タンパク質の発現の制御この例では、トリプトファンプロモーターの下流に毒性タンパク質の遺伝子を
有するベクターで菌株ＲＶ３０８およびＩＣＯＮＥ２００を形質転換するとき、
培養物における菌株の挙動を説明する。例えば、本発明を説明するには、目的と
する遺伝子はポリオウイルス２Ｂタンパク質をコードするものである。このタン
パク質の過剰発現により細菌(Lama et al., 1996)および真核細胞(Aldabe et al
., 1996)における膜透過性が向上し、E. coliにおける発現の漏出の結果を検討
する目的で選択されるモデルとなることが記載されている。

【００８４】２Ｂタンパク質をコードする遺伝子を、下記のオリゴヌクレオチドによるＰＣ
Ｒ反応によってベクターｐＥＴ３．２Ｂ(Lama et al., 1992)から増幅する。 PO2.1 5' - GCGAATTCTGGCATCACCAATTACATAG - 3' (センス) EcoRI PO2.21 5' - GCAAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGCTTGATGACATAA (アセチセンス) HindIII GGTATC-3'

【００８５】次に、増幅生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した後、ｐ
ＢＲ３２２由来でありかつＰｔｒｐトリプトファンプロモーターを有する発現ベ
クターにクローニングする。ｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂと命名された生成ベクター
は、Ｐｔｒｐプロモーターの制御下で、そのＣ末端でポリ（Ｈｉｓ）尾に融合し
た２Ｂタンパク質をコードする配列を有する。

【００８６】ベクターｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂを、形質転換によってE. coli RV308および
ＩＣＯＮＥ２００に導入する。次に、それぞれの構築体の組換えクローンを、例
４に記載したのと同様の条件下で培養する。

【００８７】５８０nmでの吸光度によって測定した細菌ＲＶ３０８およびＩＣＯＮＥ２００
の成長速度を、図３に示す。図から明らかなように、ＲＶ３０８はかなりの成長
の遅れを示し、培養の最初の１４時間中の発酵槽における平均発生時間は、ＩＣ
ＯＮＥ２００については１時間１７分であるのに対して１時間４５分である。２
４時間培養後、菌株ＲＶ３０８の吸光度は、１３でしかない。意外なことには、
菌株ＩＣＯＮＥ２００自身は、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を２５μg／ml
加えることによって誘導を行うときの時間である１７時間３０分の培養後には吸
光度が３７に到達している。誘導の効果は直ちに現れ、酸素消費率は急激に低下
し（データーは示さず）、成長は停止する。

【００８８】試料を様々な培養時間に採取し、その組換えタンパク質含量について分析した
。８０００ｇで遠心分離したバイオマスの試料を、Ｐ１緩衝液（２５ｍＭトリス
、１．１５ｍＭＥＤＴＡ、１mg／mlリゾチーム、ｐＨ８）に５ml／１ｇバイオ
マスの比率で加える。バイオマスを再懸濁し、室温で１５分間インキュベーショ
ンした後、２分間超音波処理を行う。溶解生成物を再度遠心分離し（１００００
ｇ、１５分、４℃）、可溶性画分（上清）と不溶性画分（Ｐ２緩衝液：２５ｍＭ
トリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８の２００μlに加えたペレット）とを得るよ
うにする。これらの試料をポリアクリルアミドゲルに載荷し、変性条件下で電気
泳動を行う（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。次に、ゲルをウェスタンブロット法に準じて
膜に移し、組換えタンパク質の存在を確かめる。用いた抗体は、ペルオキシダー
ゼとカップリングした抗ポリ（Ｈｉｓ）モノクローナル抗体(Sigma)である。検
出は、ＥＣＬ＋キット(Amersham)を用いて化学発光によって行う。図４Ａおよび
４Ｂに、それぞれＲＶ３０８およびＩＣＯＮＥ２００培養物由来の不溶性画分に
ついての免疫ブロットの結果を示す。図４Ａは、組換えタンパク質が総ての試料
に含まれており、すなわちＩＡＡを用いる誘導を行わなくとも培養の開始時から
ｔ＝２４時間の発酵時間までの試料に含まれていることを示している。反対に、
ＩＣＯＮＥ２００では、組換えタンパク質は、誘導前には検出されない（図４Ｂ
）。（不溶性画分に）２Ｂタンパク質が検出可能となり、その毒性が発現される
のは、ＩＡＡで誘導した後だけである。従って、これらの結果は、突然変異体Ｉ
ＣＯＮＥ２００は、これが由来する菌株ＲＶ３０８と比較して明らかな利点を有
し、発酵槽で発現の効果的制御を生じることができることを示している。

【００８９】例６：毒性タンパク質の産生この例では、毒性タンパク質を、E. coli ＩＣＯＮＥ２００の培養物中で、高
細胞密度、および工業的補外に適当な培養条件下で発現することができることを
示そうとするものである。この目的に対して、ベクターｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂ
で形質転換した菌株E. coli ＩＣＯＮＥ２００を評価する。例５で得た結果は、
発現によって引起される成長の即時抑制および続いて細菌の溶解を防止しようと
する場合には、誘導条件を最適にしなければならないことを示している。従って
、この例では、インデューサー濃度および誘導時の細胞密度を調整することによ
って発酵容積の単位当たりの組換えタンパク質の収率を最適にすることを目的と
する各種分析を説明する。用いた培養条件は、例４に記載したものである。

【００９０】試験した実験の組合せは、下記の通りである。実験番号１：吸光度が３２．５に等しいとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。実験番号２：吸光度が３０〜３５であるとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。実験番号３：吸光度が６０〜６５であるとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。実験番号４：吸光度が６０〜６５であるとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。

【００９１】それぞれの実験について、バイオマスの試料を誘導後の様々な時間に採取し、
下記のプロトコールに準じて分析する。バイオマス約２０ｇを、１×開始緩衝液
（８×濃縮物から調製：１．４２ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４２Ｈ_２Ｏ、１．１１ｇのＮ
ａＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２Ｏ、２３．３８ｇのＮａＣｌ、適量加えて１００ml、ｐＨ７．
４）１００mlに加える。懸濁液を３×５分間超音波処理を行った後、２００００
ｇおよび４℃で３０分間遠心分離する。ペレットを、開始緩衝液＋６Ｍグアニジ
ン−ＨＣｌ＋０．１％ＳＢ３−１４（Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Sigma) １５mlに加えた後、氷中で
１時間インキュベーションする。懸濁液を、３００００ｇおよび４℃で１時間遠
心分離する。上清を０．４５μｍで濾過し、キレート化金属アフィニティークロ
マトグラフィーによって精製する。ゲル(HiTrap Chelating、Amersham Pharmaci
a Biotech)を０．１ＭＮｉＳＯ_４１mlで載荷し、水５mlで洗浄した後、開始
緩衝液＋６Ｍグアニジン−ＨＣｌ＋０．１％ＳＢ３−１４３０mlで平衡にする
。次に、試料をカラムに載荷する。洗浄緩衝液（開始緩衝液＋６Ｍグアニジン−
ＨＣｌ＋０．１％ＳＢ３−１４＋２０ｍＭイミダゾール）６０mlで洗浄すること
により、非特異的相互作用によって結合したタンパク質の大半を除去することが
できる。組換えｐｏｌｉｏ−２Ｂタンパク質を、溶出緩衝液（開始緩衝液＋６Ｍ
グアニジン−ＨＣｌ＋０．１％ＳＢ３−１４＋３００ｍＭイミダゾール）１０×
１mlで溶出する。最高タンパク質濃度を有する画分をプールした後、Sephadex G
-25ゲル（PD10カラム、Amersham Pharmacia Biotech）上で脱塩した。このよう
にして得たｐｏｌｉｏ−２Ｂタンパク質の品質および量を、それぞれ変性条件下
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および総タンパク質の測定(BCA法、Pierce)によって算出
する。

【００９２】図５は、上記の実験１〜４に続いて抽出および精製したｐｏｌｉｏ−２Ｂタン
パク質のクマシーブルー染色したＳＤＳゲルを示す。組換えタンパク質のサイズ
は、そのコード配列から予想された理論サイズ（１１ｋＤａ）に相当する。更に
、これは、ＩＣＯＮＥ２００ E. coli×ｐＶＡｐｏｌｉｏ−２Ｂ溶解生成物にお
いて誘導後にウェスタンブロットで観察された主タンパク質のサイズに相当する
（図４Ｂ）。従って、図５で検出されるタンパク質は、ポリヒスチジン尾に融合
したポリオウイルス２Ｂタンパク質に相当するものと思われる。更に、得られた
タンパク質の品質は、試験した誘導体同条件では同一である。

【００９３】下記の表３に、誘導時の吸光度、インデューサー濃度および誘導後の培養時間
などの各種因子を組み合わせることによって得られた結果をまとめている。

【００９４】

【表３】

【００９５】実験群（１〜２）および（３〜４）の比較では、誘導を遅くすれば、発現収率
は高くなることが観察される。これにより、誘導を開始する前にバイオマスをで
きるだけ成長させることの利点が確かめられる。実験（３〜４）の場合には、炭
素基質の約７０％が、ｐｏｌｉｏ−２Ｂタンパク質の発現を開始する時に消費さ
れる。ＩＣＯＮＥ２００のような菌株では、細胞成長期および発現期は完全に分
離されており、組換えタンパク質が毒性を有していても、このタンパク質の収率
を最適にすることができる。

【００９６】誘導時間と同様に、インデューサー濃度も重要なパラメーターである。この例
で得られる発現の最良の結果は、実験番号４に相当し、細胞の個数に関連したイ
ンデューサー濃度は最低である（吸光度が６３．５の培養物については、ＩＡＡ
は５mg/l）。また、この実験では、培養物が誘導の後でも成長するが、他の総て
の実験では、成長は完全に停止するので、ｐｏｌｉｏ−２Ｂの発現の毒性効果は
ほとんど注目に値しない（図６）。従って、毒性タンパク質の誘導体同条件を調
節して、インデューサー濃度が低すぎてほとんど発現が生じない濃度と、細菌代
謝の即時停止を促進するには高すぎる濃度との間に最適値を見出すようにするこ
とが特に重要である。実験番号４と１の結果を比較すると、誘導を遅くし（ＯＤ
＝６３．５対３２．５）かつ弱くする（ＩＡＡ濃度＝５mg/l対２５mg/l）と、発
酵槽の単位当たりで得られる組換えタンパク質の量は３〜４倍とすることができ
ることが観察される。

【００９７】工業上重要な菌株の本発明による遺伝子修飾によって得られたE. coli菌株Ｉ
ＣＯＮＥ２００では、Ｐｔｒｐトリプトファンプロモーターの下流のプラスミド
ベクターにおかれた任意の遺伝子の発現を厳密に制御することができる。この制
御は、培養物で提供される外来トリプトファンによって伝達されるので、一過性
である。ＩＣＯＮＥ２００で潜在的なＰｔｒｐ誘導は保存され、ＩＡＡ濃度によ
って調節が可能なままである。これらの特性により、ＩＣＯＮＥ２００は、大規
模に補外できる培養条件下で組み換えタンパク質の発現を制御することができる
。 Aldabe, R., Barco, A. & Carrasco, L., (1996), The Journal of Biological
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ademic Press, Inc.

【図面の簡単な説明】

【図１】菌株ＲＶ３０８、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００×ｐＶＡ−βｇａ
ｌの成長曲線。ＯＤ５８０nmは、分光光度計によって測定した吸光度の特定値に相当する。

【図２】菌株ＲＶ３０８、ＩＣＯＮＥ１００およびＩＣＯＮＥ２００×ｐＶＡ−βｇａ
ｌのβ−ｇａｌ活性曲線。Ｐｔｒｐプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むベクター
で形質転換した細菌を、発酵槽で培養する。β−ガラクトシダーゼ活性は、ＯＮ
ＰＧ（β−ガラクトシダーゼ特異基質）の存在下で細胞抽出物をインキュベーシ
ョンすることによって測定する。

【図３】ベクターｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂで形質転換したE. coli菌株ＲＶ３０８およ
びＩＣＯＮＥ２００の成長速度の比較。

【図４Ａ】ベクターｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂで形質転換したＲＶ３０８およびＩＣＯＮＥ
２００の培養物の細胞内抽出物に対する免疫ブロット。ＲＶ３０８×ｐＶＡ−ｐ
ｏｌｉｏ２Ｂ。

【図４Ｂ】ベクターｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂで形質転換したＲＶ３０８およびＩＣＯＮＥ
２００の培養物の細胞内抽出物に対する免疫ブロット。ＩＣＯＮＥ２００×ｐＶ
Ａ−ｐｏｌｉｏ２Ｂ。

【図５】ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製したｐｏｌｉｏ−２
Ｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。Ａ：実験番号２：吸光度が３２．５に等しいとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。Ｂ：実験番号１：吸光度が３２．５に等しいとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。
Ｃ：実験番号４：吸光度が６３．５に等しいとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。Ｄ：実験番号３：吸光度が６２．５に等しいとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。
ＭＷ：分子量マーカー（ｋＤａ）。

【図６】ＩＣＯＮＥ２００×ｐＶＡ−ｐｏｌｉｏ２Ｂの成長曲線：誘導時間およびイン
デューサー濃度の影響。 ■ 実験番号１：吸光度が３２．５に等しいとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。
□ 実験番号２：吸光度が３２．５に等しいとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。 ● 実験番号３：吸光度が６２．５に等しいとき、ＩＡＡ２５μg／mlで誘導。
○ 実験番号４：吸光度が６３．５に等しいとき、ＩＡＡ５μg／mlで誘導。矢印は、誘導の瞬間を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月９日（２０００．６．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ティアン、ニョック、ニュイアンフランス国サン‐ジュリアン‐アン‐ジュヌボワ、ラトワ、レ、プティ、ユタン、７Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA38 BA80 CA02 CA20 DA06 EA04 FA02 FA20 GA11 GA19 GA25 4B050 CC04 DD02 EE01 LL05 4B064 AG01 AG30 CA02 CA19 CC01 CC24 CD02 CD07 CD10 CD22 CE02 CE07 CE08 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA26Y AA95Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 BB03 BB06 BB08 BB12 BB29 BC02 BC06 BC09 BD01 BD14 BD15 CA24 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】原核宿主細胞におけるＰｔｒｐトリプトファンオペロンプロモーターの制御下
に置かれた目的とする組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現するための構
築体であって、ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化する
ことができる核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、この核酸配列を含んでな
ることを特徴とする、構築体。
【請求項２】原核宿主細胞がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の構築体。
【請求項３】原核宿主細胞がE. coliである、請求項１に記載の構築体。
【請求項４】ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができる
核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、上記核酸配列の上流に、Ｐｔｎａトリ
プトファナーゼオペロンプロモーターの核酸配列の全部または一部をさらに含ん
でなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築体。
【請求項５】ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができる
核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、上記核酸配列が上記ＴｎａＡトリプト
ファナーゼのコード配列の突然変異断片を含んでなる、請求項１〜４のいずれか
一項に記載の構築体。
【請求項６】得られる突然変異断片の配列がトリプトファナーゼ活性を欠くタンパク質断片
をコードするように、停止コドンをある位置に挿入することによって上記突然変
異断片を得る、請求項５に記載の構築体。
【請求項７】上記突然変異断片が、上記宿主細胞のＴｎａＡトリプトファナーゼのコード配
列の突然変異断片である、請求項５または６に記載の構築体。
【請求項８】ＴｎａＡトリプトファナーゼをコードする遺伝子を不活性化することができる
核酸配列を上記宿主細胞に導入するとき、上記核酸配列が、プロモーターの配列
の全部または一部を含んでなる核酸配列に続いて、３′位において、性質がリボ
ヌクレオチドまたはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作
用する分子をコードする核酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に
記載の構築体。
【請求項９】３′位において、性質がリボヌクレオチドまたはタンパク質でありかつＰｔｒ
ｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする核酸配列が続く上記プロ
モーターが、E. coliのＰｔｎａトリプトファナーゼオペロンプロモーターの全
部または一部である、請求項８に記載の構築体。
【請求項１０】性質がリボヌクレオチドまたはタンパク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに
対して負に作用する分子をコードする上記核酸配列が、E. coliのＴｒｐＲトリ
プトファンオペロンアポリプレッサーをコードする配列、またはその生物活性断
片の１つである、請求項８または９に記載の構築体。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築体を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】ベクターｐＭＡＫ７０５［ｔｎａＡｔ］または、ベクターｐＭＡＫ７０５［Ｐ
ｔｎａ：：ｔｒｐＲ：：３′ｔｎａ］である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】請求項１１または１２のいずれか一項に記載のベクターを用いて形質転換した
原核宿主細胞。
【請求項１４】 E. coliである、請求項１３に記載の原核宿主細胞。
【請求項１５】宿主細胞において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築体を用いる、目
的とする組換えタンパク質の産生法。
【請求項１６】上記構築体を原核宿主細胞のＤＮＡに導入する、請求項１５に記載の、目的と
する組換えタンパク質の産生法。
【請求項１７】上記構築体を、請求項１１または１２に記載のベクターを用いて原核宿主細胞
のＤＮＡに導入する、請求項１５または１６に記載の、目的とする組換えタンパ
ク質の産生法。
【請求項１８】上記構築体を、例１または２に記載の染色体組込み法に準じて原核宿主細胞の
ＤＮＡに導入する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の、目的とする組換
えタンパク質の産生法。
【請求項１９】上記構築体を、選択的に有利に上記構築体と関連させる任意の他のＤＮＡ要素
なしに導入する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の、目的とする組換え
タンパク質の産生法。
【請求項２０】上記構築体を、E. coliのトリプトファナーゼオペロン遺伝子座において導入
する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の、目的とする組換えタンパク質
の産生法。
【請求項２１】ａ）原核細胞を請求項１１または１２に記載のベクターで形質転換して、上記
構築体を上記宿主細胞のＤＮＡに組込み、ｂ）上記原核細胞を、目的とする上記組換えタンパク質をコードする遺伝子を
含むベクターで形質転換し、ｃ）上記形質転換細胞を、組換えタンパク質を発現することができる培地で培
養し、ｄ）組換えタンパク質を培地または上記形質転換細胞から回収する段階を含んでなる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の、目的とする組換
えタンパク質の産生法。
【請求項２２】段階ａ）とｂ）との間に、分割およびスクリーニング段階をさらに含んでなる
、請求項２１に記載の、目的とする組換えタンパク質の産生法。
【請求項２３】請求項８〜１０のいずれか一項に記載の、性質がリボヌクレオチドまたはタン
パク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする
核酸配列が３′位において続く上記プロモーターを誘導することによって、Ｐｔ
ｒｐプロモーターの誘導を行う前に組換えタンパク質の発現を制御する、請求項
１５〜２２のいずれか一項に記載の、目的とする組換えタンパク質の産生法。
【請求項２４】請求項８〜１０のいずれか一項に記載の、性質がリボヌクレオチドまたはタン
パク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする
核酸配列が３′位において続く上記プロモーターを、このプロモーターに対して
阻害または活性化効果を発揮させることができる任意の手段によって誘導する、
請求項２３に記載の、目的とする組換えタンパク質の産生法。
【請求項２５】請求項８〜１０のいずれか一項に記載の、性質がリボヌクレオチドまたはタン
パク質でありかつＰｔｒｐプロモーターに対して負に作用する分子をコードする
核酸配列が３′位において続く上記プロモーターの誘導を、ａ）培地における適当な炭素源を選択する、ｂ）この培地にトリプトファンを加える、またはｃ）ａ）とｂ）の組合せを行うことによって行う、請求項２４に記載の産生法。