CN1261581C - 在原核细胞有控制地表达重组蛋白质的新构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制之下的重组目标蛋白编码基因的新构建体。本发明的特征在于该构建体包含当导入所述宿主细胞中时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。本发明还涉及含有所述构建体的载体和转化了所述载体的宿主细胞。本发明还涉及用所述新构建体产生所述重组蛋白的方法。

Description

在原核细胞有控制地表达重组蛋白质的新构建体

本发明涉及用于在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子的控制之下的重组目标蛋白编码基因的新构建体，其特征在于该构建体包含当导入所述宿主细胞中时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。本发明还涉及含有所述构建体的载体和转化了所述载体的宿主细胞。本发明的另一个主题是用所述新构建体产生所述重组蛋白的方法。

广义地讲，本发明用于通过所谓的重组DNA方法生产重组多肽或蛋白。更具体地，本发明涉及通过转化的宿主细胞生产重组多肽或蛋白，所述宿主细胞是细菌类型的，并且其中表达是由Ptrp色氨酸操纵子的启动子/操纵基因指导或控制的(Nichols和Yanofsky，1983)。

大肠杆菌(E.coli)是用于生产重组蛋白的最常用和阐述最清楚的生物。在大肠杆菌中可使用多种表达系统，其中，Ptrp色氨酸操纵子的启动子被认为是最强的启动子之一(Yansura和Bass，1997)。

但是，并非所有重组基因都可被大肠杆菌以相同效率表达。已有描述和观察称，在转化宿主细胞的培养过程中重组蛋白的积累会迅速导致质粒不稳定、细胞生长减慢甚至停滞以及重组产物总产量的降低。在这种情况下，重要的是能获得一种受控制和调节的表达系统，该系统可将生产过程划分为两个阶段：第一个称为细胞生长阶段，在该阶段中启动子活性最小，接着是所谓的诱导或去阻遏阶段，该阶段有利于重组蛋白的表达和积累。

大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子Ptrp由于具有可诱导特性，故适合生产重组蛋白。在Ptrp操纵基因水平上的阻遏是通过trpR调节基因的产物来进行的，此时该产物，也称trp阻遏物蛋白，与色氨酸(辅阻遏物)结合。色氨酸的缺乏使该TrpR蛋白不能结合操纵基因，从而引起色氨酸操纵子的去阻遏。在Ptrp控制下表达异源基因的各种例子表明，由此产生的表达渗漏太大，而不能在满意的条件下生产重组蛋白，特别是那些对细胞有毒的蛋白(Yansura和Henner，1990)。

TrpR调节蛋白遵从一种自调节机制(Kelley和Yanofsky，1982)，并且，其浓度在过量外源色氨酸存在时趋向于平均值120分子/大肠杆菌K-12细胞(Gunsalus，Gunsalus Miguel和Gunsalus，1986)。尽管该浓度足以正确调节单个Ptrp染色体启动子的活性，但对于数十个含有相同启动子的载体，该浓度可能显得有限。至于色氨酸，即使它在培养基中过量提供，它也可能是一个限制因素。事实上，大肠杆菌中存在tanA基因编码的色氨酸酶活性，该活性能将色氨酸降解成吲哚，从而改变了它的调节功能(Snell，1975)。此外，色氨酸酶可被色氨酸诱导，这使得任何用增加色氨酸供给补偿这种降解现象的尝试没有意义。

人们展望和描述了企图获得对表达渗漏的最可能的控制的各种方法。然而，有些具有只能在实验室规模上应用的缺点(Hasan和Szybalski，1995；Suter-Crazzolara和Unsicker，1995)，或具有减少重组产物产量的缺点(Stark，1987)。

因此，现在非常需要发展一种可在大规模上使用，并且特别地，可控制表达渗漏的目标重组蛋白有控制的表达系统。这正是本发明的主题。

本发明涉及基于Ptrp表达系统的多种新构建体，当导入原核宿主细胞优选细菌类型的原核宿主细胞时，该构建体可在培养开始时降低重组基因的残余表达，这些新构建体提供了对重组蛋白合成的改善的控制。

本发明的一个主题是在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制下的目标重组蛋白编码基因的构建体，其特征在于该构建体包含在被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列。

术语“目标重组蛋白”用来指所有通过遗传重组获得的、能用于例如人或动物健康、美容、人或动物营养、农用工业或化学工业等领域的蛋白质、多肽或肽。在这些目标蛋白中，可特别提及的但并非限制的包括：

-细胞因子，特别是白细胞介素、干扰素、组织坏死因子和生长因子特别是造血生长因子(G-CSF，GM-CSF)，激素例如人生长激素或胰岛素，神经肽，

-参与凝血的因子或辅因子，特别是因子VIII、von Willebrand因子、抗凝血酶III、蛋白C、凝血酶和蛭素，

-酶，特别是胰蛋白酶、核糖核酸酶和β-半乳糖苷酶，

-酶抑制剂如α1-抗胰蛋白酶和病毒蛋白酶抑制剂，

-能抑制癌的起始或发展的蛋白，如肿瘤抑制基因如P53基因的表达产物，

-能刺激免疫应答或抗体的蛋白，如革兰氏阴性细菌外膜蛋白或其活性片段，特别是克雷伯杆菌属(Klebsiella)的OmpA蛋白或人呼吸道合胞病毒蛋白G，

-能抑制病毒感染或其发展的蛋白，例如所述病毒的抗原表位或能与天然病毒蛋白竞争的病毒蛋白修饰变体，

-能在化妆品组合物中包含的蛋白质，如P物质或超氧化物歧化酶，

-食用蛋白质，

-指导化学或生物学化合物合成的酶，或能降解某些有毒化合物的酶，或

-任何对产生它的微生物有毒的蛋白质，特别是如果该微生物是大肠杆菌，所述蛋白例如但不限于HIV-1病毒的蛋白酶、蛋白质ECP(ECP即Eosinophil Cationic Protein，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白)或脊髓灰质炎病毒的2B和3B蛋白。

术语“当被导入所述宿主细胞时能灭活TanA色氨酸酶编码基因的核酸序列”是指能以如下方式修饰所述基因的核酸序列，这种方式的修饰导致所述宿主细胞的色氨酸酶活性丧失，所述修饰基因的表达产物不能将色氨酸降解成吲哚，从而改变了它的调节功能。在当被导入所述细胞时能失活TnaA色氨酸酶编码基因的所述核酸序列中，优选通过活性TnaA色氨酸酶编码核酸序列的至少一个核苷酸的突变如替代、插入和/或缺失获得的失活TnaA色氨酸酶编码核酸序列。

本发明包括一种本发明的构建体，其特征在于所述原核宿主细胞是革兰氏阴性细菌，优选属于大肠杆菌种。

本发明还涉及一种本发明的构建体，其特征在于，它还在当被导入所述宿主细胞时能失活TnaA色氨酸酶编码基因的所述核酸序列上游包含Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或部分核酸序列。

优选地，本发明涉及一种本发明的构建体，其特征在于当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的所述核酸序列包含所述TnaA色氨酸酶编码序列的突变片段。

优选地，本发明涉及一种本发明的构建体，其特征在于所述突变片段通过在某个位置插入一个终止密码子来获得，以使由此获得的突变片段的序列编码一个丧失色氨酸酶活性的蛋白片段。

还优选，本发明涉及一种本发明的构建体，其特征在于所述突变片段是所述宿主细胞TnaA色氨酸酶编码序列的一个突变片段。

在本说明书中，关于大肠杆菌TnaA色氨酸酶编码核酸序列以及它的Ptna启动子，请参考Deeley和Yanofsky(1981)发表的序列。

关于编码Ptrp色氨酸操纵子的启动子/操纵基因的核酸序列，请参考Yanofsky等(1981)发表的序列。

本发明还涉及一种本发明的构建体，其特征在于当被导入所述宿主细胞时能失活TnaA色氨酸酶编码基因的所述核酸序列包含一个含启动子的全部或部分序列的核酸序列，该启动子3’位置之后是编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质、并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列。

优选地，本发明涉及一种本发明的构建体，其特征在于在3’位置连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列的所述启动子，是大肠杆菌Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或一部分。

还优选，本发明涉及一种本发明的构建体，其特征在于编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的所述核酸序列，是编码大肠杆菌TrpR色氨酸操纵子阻遏物蛋白的序列或其一个生物学活性片段，如Gunsalus和Yanofsky(1980)所述片段。

术语“含启动子全部或部分序列的核酸序列”是指包含一个启动子的所有序列或其一个生物学活性片段、并能指导或控制与它功能性连接的基因的表达的核酸序列。

在本说明书中，术语“启动子的生物学活性片段”是指所述启动子的任何片段序列，其中所述片段能指导或控制位于所述片段下游的、与所述片段功能性连接的基因的表达。

在本说明书中，术语“TrpR色氨酸操纵子阻遏物蛋白的生物学活性片段”是指所述阻遏物蛋白的保留了其阻遏物活性的任何片段。

在术语“编码本质上是核糖核苷酸并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列”中，优选的核糖核苷酸选自下列序列：

a)5′-AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC-3′

b)5′-AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AGCACAACGC

  GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA UGAGUCCGUG

  AGGACGAAAC AGG-3′

c)5′-AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU

  UUUACGUGAA CUU-3′

d)5′-AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU

  UUUACGUGAA CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG

  UUUUCCGGUC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG-3′

c)5′-AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG

  AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUU-3′

f)5′-AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG

  AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA

  CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG UUUUCCGGUC

  UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG-3′

g)5′-CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC-3′

h)5′-CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC

  AGCACAACGC GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA

  UGAGUCCGUG AGGACGAAAC AGG-3′

本发明的另一方面涉及含有根据本发明的构建体的载体。

优选地，根据本发明的载体的特征在于它是pMAK705[tnaAt]或载体pMAK705[Ptna::trpR::3’tna]。

本发明还涉及用本发明的载体转化的原核宿主细胞，优选大肠杆菌种的细菌。

在另一方面，本发明的主题是使用根据本发明的构建体在宿主细胞中生产重组蛋白的方法。

本发明的另一个主题是根据本发明的生产重组蛋白的方法，其中所述构建体被导入至原核宿主细胞的DNA中。

优选根据本发明的产生重组蛋白的方法，其中所述构建体用根据本发明的载体导入原核宿主细胞的DNA中，优选根据实施例1或2中所描述的染色体整合法。

本发明的另一个主题是根据本发明的生产重组蛋白的方法，其中导入的所述构建体导入时没有任何赋予与其相关的选择优势的其它DNA元件。

优选地，本发明包括一种本发明的生产目标重组蛋白的方法，其中所述构建体在大肠杆菌的色氨酸酶操纵子座位导入，优选在tna基因座位，更优选在tnaA基因座位。

优选根据本发明的生产目标重组蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤：

a)用根据本发明的载体转化原核细胞，并将所述构建体整合至所述宿主细胞的DNA中；

b)用含有所述目标重组蛋白编码基因的载体转化所述原核细胞；

c)在允许重组蛋白表达的培养基中培养所述转化的细胞；和

d)从培养基或从所述转化的细胞回收重组蛋白。

本发明的另一个主题是一种本发明的生产目标重组蛋白的方法，其特征在于所述方法还在上述方法的步骤a)和b)之间包括分离和筛选步骤。

本发明还涉及一种本发明的生产目标重组蛋白的方法，其中在Ptrp启动子诱导之前重组蛋白表达的控制是通过诱导所述启动子来获得的，所述启动子在3’位置后连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列。

最后，本发明还包括一种本发明的生产方法，其中在3’位置后连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列的所述启动子的诱导是通过任何能对所述启动子发挥抑制或激活作用的方法获得的。

优选地，本发明包括一种本发明的生产方法，其中在3’位置后连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的核酸序列的所述启动子的诱导通过如下途径获得：

a)通过选择培养基中的适当碳源；或

b)通过向培养基中加入色氨酸；或

通过a)和b)的组合。

以上描述的和将在下面的实施例中举例说明的本发明构建体和载体系统、转化了所述载体的原核宿主细胞和方法都属于在原核细胞中控制重组蛋白生产的范围。它们适于表达位于Ptrp启动子/操纵基因下游的同源或异源基因。为了阐述本发明，下面更具体地描述两个突变体。它们的名称是ICONE 100和ICONE 200(ICNE是Improved Cells for Over-andNon-leaky Expression，超表达和非渗漏表达的改良细胞)。引入ICONE系的修饰具有如下特征：

1)它们整合至宿主的染色体中，

2)因为它们是采用定点诱变产生的，所以它们靶向细菌DNA中的单一位点。该位点是完全已知的，因为它是位于大肠杆菌K-12基因组物理图谱中83分钟处的tna操纵子。在这方面，对于该宿主的生理后果已被完全鉴定。特别地，排除了在染色体整合后隐藏功能再激活的可能性，正如随机诱变时可能出现的情况。

3)在这些实例中所用的染色体整合技术(Hamilton等，(1989))排除了其它序列插入细菌DNA的可能性。特别地，突变体没有携带任何抗生素抗性基因。如果它们在工业规模上应用，它们向生产者和立法者保证，万一意外散布至环境中，它们也将没有选择优势。

根据本发明的一个方面，描述了称为ICONE 100的第一类突变体或转化细胞，其在tnaA基因中携带一个突变，导致色氨酸酶活性丧失。与该突变相关的表现型是缺乏色氨酸降解。在用报告载体转化并在传统上促进色氨酸酶活性的培养基中培养之后，这种类型的突变体证明优于通过色氨酸阻遏控制得到的分离物。

根据本发明的另一个方面，描述了称为ICONE 200的第二类突变体，其携带在tnaA基因座位处整合的、处于Ptna色氨酸酶启动子控制下的trpR基因表达盒。使用tna座位作为整合靶标导致在宿主细菌中色氨酸酶活性丧失，如上所述，这会造成不能将色氨酸转变成吲哚。而且，染色体中Ptna::trpR盒的存在赋予该新trpR基因Ptna的特征，即对代谢抑制敏感(Isaacs，Chao，Yanofsky和Saier，1994；Botsford和DeMoss，1971)和可被色氨酸诱导(Stewart和Yanofsky，1985)。后一特性构成了一项创新，其中质粒Ptrp启动子在转录水平上被与之拮抗的染色体启动子Ptna所控制。令人惊奇的是，用表达载体转化和在发酵罐中培养后，ICONE 200证明优于在通过色氨酸阻遏控制时得到的分离物。

具有上述特性之一的细菌对于重组蛋白的有控制的生产是有用的，因此，本发明的另一个主题是所述转化细菌在制备重组蛋白的方法中的应用。

在下面的实施例中，采用大肠杆菌β-半乳糖苷酶作为重组蛋白清楚地证明了这两个突变体提供的优点。

本发明的另一方面在于所导入突变的特征。从遗传学和生物化学的观点来看，它们完全确定，有控制，靶向大肠杆菌的tna座位，并且没有选择标记。

本发明突变的或转化的微生物采用原核生物，更准确地是属于大肠杆菌种的革兰氏阴性细菌，来构建。利用大肠杆菌色氨酸酶操纵子的启动子的特性(可被色氨酸诱导，对代谢抑制敏感)指导对Ptrp-指导的表达起抑制作用的中介体的瞬时合成。但是，已知其它细菌种，特别是那些在动物肠道中定居的细菌，能合成可被色氨酸诱导的色氨酸酶(Snell，1975)。因此，除大肠杆菌外的其它菌株也适于进行所述方法和由此制备重组蛋白。

以下实施例和附图是用于阐述本发明的，对本发明的范围没有任何限制。

附图说明：

图1：菌株RV308、ICONE 100和ICONE 200×pVA-βgal的生长动力学。

OD 580nm相当于用分光光度法测定的光密度测量值。

图2：菌株RV308、ICONE 100和ICONE 200×pVA-βgal的β-gal活性的动力学。

将转化了含有处于Ptrp启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因的载体的细菌培养于发酵罐中。通过将细胞提取物在ONPG(β-半乳糖苷酶特异性底物)存在时孵育来测定β-半乳糖苷酶活性。

图3：转化了载体pVA-polio2B的大肠杆菌株RV308和ICONE 200的生长动力学的比较。

图4A和4B：对转化了载体pVA-polio2B的RV308和ICONE 200培养物的细胞内提取物的免疫印迹。

图4A：RV308×pVA-polio2B

图4A：ICONE 200×pVA-polio2B

图5：用镍亲和层析纯化的polio-2B蛋白的SDS-PAGE分析。

A：实验2：在光密度等于32.5时用5ug/ml的IAA诱导；

B：实验1：在光密度等于32.5时用25ug/ml的IAA诱导；

C：实验4：在光密度等于63.5时用5ug/ml的IAA诱导；

D：实验3：在光密度等于62.5时用25ug/ml的IAA诱导；

MW：分子量标准(kDa)。

图6：ICONE 200×pVA-polio2B的生长动力学：诱导时间和诱导物浓度的影响。

■实验1：在光密度等于32.5时用25ug/ml的IAA诱导；

□实验2：在光密度等于32.5时用5ug/ml的IAA诱导；

●实验3：在光密度等于62.5时用25ug/ml的IAA诱导；

○实验4：在光密度等于63.5时用5ug/ml的IAA诱导；箭头指示诱导的时刻。

本发明基于向宿主菌株基因组稳定导入突变。下列实施例中给出的所有修饰都在大肠杆菌的tna座位导入，该座位概略地包含如下系列：

A)Ptna启动子，

B)tnaA(色氨酸酶)基因的编码序列，

C)基因间隔区，

D)tnaB(色氨酸通透酶)基因的编码序列，

E)转录终止子。

更具体地，修饰涉及元件(B)。后者用元件(b)进行了替代，元件(b)在各种构建体中有如下特点：

表1：ICONE 100知TCONE 200携带突变的性质

突变体名称	元件(b)的性质
		ICONE 100	在位置+221被一个终止密码子和一个XbaI限制性位点打断的tnaA编码序列
ICONE 200	编码Ptrp阻遏物蛋白的trpR基因的编码序列

实施例1：突变体ICONE 100的构建

通过PCR扩增DNA片段tnaAT。相对于tnaA编码序列的第一位核苷酸，该片段从位置-275延伸到位置+1054。与Ptna启动子和tnaA部分重叠的该片段通过两部分PCR反应来扩增。第I部分从位置-275延伸到位置+220。它利用寡核苷酸Trp5(正义)和Trp2(反义)扩增，寡核苷酸序列是：

Trp5：5’-CG GGATCCGTGTGACCTCAAAATGGTT-3’

            BamHI

Trp2：3’-CTACGCGCCGCTGCTTCGGATT AGATCTCG-5’(反义链)                          终止密码子XbaI

第II部分位于tnaA的编码序列中紧接第I部分的3’。它从位置+221延伸到位置+1054。通过寡核苷酸Trp3和Trp4来扩增：

Trp3：5’-CG TCTAGACAGCGGCAGTCGTAGCTAC-3’

             XbaI

Trp4：3’-CCTTCTCTAACCGCAACAG TTCGAACG-5’

(反义链)                    HindIII

采用在Taq聚合酶缓冲液(AmpliTaq Gold CETUS，美国)中溶解的大肠杆菌K-12菌落作为模板进行PCR反应。

扩增产物用乙醇沉淀，然后用适当限制性酶消化(第I部分用BamHI/XbaI，第II部分用XbaI/HindIII)。琼脂糖凝胶分析ETB染色可确证这些片段具有期望大小(Deeley和Yanofsky，1981)。通过在XbaI位点连接两个片段I和II可产生tnaAT片段。它与天然序列的区别在于它在+221位置存在一个终止密码子，随后接着一个XbaI限制性位点。将该tnaAT片段克隆至载体pRIT28的BamHI/HindIII位点(Hultma，Stahl，Hornes和Uhlen，1989)，并测序。将tnaAT片段亚克隆至载体pMAK705(Hamilton，Aldea，Washburn，Babitzke和Kushner，1989)，给出pMAK705[tnaAT]。

在大肠杆菌中产生遗传重排所用的方法参见Hamilton等(1989)所述。该方法基于自杀载体pMAK705的使用，pMAK705携带一个在30℃有功能而在42℃以上失活的热敏感复制起点和一个氯霉素(CMP)抗性基因。用4ug载体pMAK705[tnaAT]转化大肠杆菌RV308(Maurer，Meyer和Ptashne，1980)，并将转化混合物在含LB培养基+20ug/ml CMP的平板上涂板。30℃培养过夜后，取3个克隆在LB液体培养基+20ug/ml CMP中传代培养，并在30℃振荡孵育直到580nm的OD接近1。然后将悬液在LB培养基+20ug/ml CMP的平板上铺板，于44℃和30℃孵育。在44℃生长的菌落(=共整合体)含有载体的染色体整合，染色体和载体携带的插入片段之间的序列同源性的存在促进该整合。

所谓的分离期(resolution phase)包括通过染色体上存在的重复序列之间的重组机制促进载体的切割。将在44℃分离的一些克隆在LB液体培养基+20ug/ml CMP中于30℃培养3天，定期更新培养基。然后稀释悬液，在LB琼脂培养基+20ug/ml CMP上铺板，并在30℃孵育直至出现分开的菌落。取几十个菌落在LB琼脂培养基+20ug/ml CMP上传代培养，30℃和44℃各一份。选取在44℃不生长的菌落，用PCR反应筛选，PCR反应可指示载体分离是否保留tna座位的终止密码子和XbaI位点。所用寡核苷酸是Trp6(正义)和Trp7(反义)，它们分别与期望突变和tnaA终止子的一部分同源：

Trp6：5’-CGACGAAGCCTAA TCTAGA-3’

               终止密码子XbaI

Trp7：3’-CCGATATTCCTACAATCGG-5’

(反义)

在18个筛选出的克隆中，9个给出了期望大小的扩增片段，表明在tnaA基因中存在终止密码子和其后的XbaI位点。其它9个克隆没有给出扩增片段，可能是因为分离步骤在染色体上恢复了未突变的tnaA基因。在9个阳性克隆中，取4个用于通过在无选择压力存在时连续传代培养清除质粒。培养数天后，获得了重新对氯霉素敏感的克隆。

tnaA-失活突变的存在通过两种方法确证：首先，用寡核苷酸Trp5和Trp4进行PCR扩增，接着用XbaI消化，显示在大肠杆菌RV308中不存在的该限制性位点存在于突变体的tnaA基因中；然后，通过将突变体在富含色氨酸的培养基中培养，再进行吲哚测定(向培养基加入Kovacs试剂)，表明突变体没有产生吲哚，而原始菌株RV308在同样条件下产生吲哚。由此推断引入的突变导致色氨酸酶活性丧失。

选择一个克隆用于冰冻形式保存。该克隆命名为ICONE 100。

实施例2：突变体ICONE 200的构建

通过3个亚单位的PCR扩增体外构建DNA片段。

位于Ptna启动子中的第一个亚单位相对tnaA编码序列的第一个核苷酸从位置-511延伸到位置+3。它用寡核苷酸TrpR1(5’位置被生物素化)和TrpR2扩增：

TrpR1：5’-CT GGATCCCTGTCAGATGCGCTTCGC-3’

            BamHI

TrpR2：3’-CTTCCTAATACATTACCGGGTTG-5’

(反义)

第二个亚单位相应于大肠杆菌trpR基因的编码序列。它用寡核苷酸TrpR3和TrpR4(5’位置被生物素化)扩增：

TrpR3：5’-CTAATGGCCCAACAATCACC-3’

           起始密码子

TrpR4：3’-CACAACGACTTTTCGCTAACT GACGTCAG-5’

(反义)                           PstI

第三个亚单位相应于紧接着tnaA编码序列3’端的序列。它含有tna操纵子的基因间隔区和编码色氨酸通透酶的tnaB基因的一部分。它用寡核苷酸TrpR5和TrpR6扩增：

TrpR5：5’-CG CTGCAGTTAATACTACAGAGTGG-3’

              PstI

TrpR6：3’-CCAGCTAATGAGGTAAG TTCGAAC-5’

(反义)                       HindIII

这些扩增片段根据GeneClean方法(Bio101，Jolla，CA，美国)纯化。

亚单位I和II以下列方式融合。在分开的两个管中，每个亚单位各自与30ul的链霉抗生物素蛋白标记的小珠(Dynabeads，DYNAL，挪威)孵育。37℃20分钟和室温5分钟之后，用50ul 0.15M NaOH将结合的DNA变性。在上清液中回收的单链DNA按等分混合，用于杂交反应和存在Taq聚合酶(AmpliTaq Gold，CETUS，美国)时按5个PCR循环进行的延伸反应。反应产物利用寡核苷酸TrpR1和TrpR4在PCR反应中进行扩增。

将该GeneClean纯化的扩增片段用BamHI和PstI消化。由此分离的片段克隆至载体pRIT28中产生pPIT28[Ptna::trpR]，并进行测序。

亚单位III用酶PstI和HindIII消化，然后克隆至pRIT28，产生pRIT28[3’tna]，然后通过DNA测序确证该序列(ABI 373A，Perkin Elmer，美国)。

用酶PstI和HindIII消化载体pRIT28[Ptna::trpR]，然后在亚单位III存在下连接，亚单位III本身是通过PstI/HindIII双酶消化从pRIT28[3’tna]分离的。产生的载体称为pRIT28[Ptna::trpR::3’tna]。用酶BamHI和HindIII双酶切后将插入片段转入pMAK705。获得的质粒称为pMAK705[Ptna::trpR::3’tna]。

Ptna::trpR::3’tna融合物在大肠杆菌RV308的tna座位的整合在实施例1所述类似的条件下进行。简而言之，用载体pMAK705[Ptna::trpR::3’tna]转化该菌株，然后进行整合和分离步骤。

分离结束时菌落的筛选采用与实施例1所述略微不同的条件。tna座位采用寡核苷酸TrpR11和TrpR7进行PCR扩增：

TrpR11：5’-GGGCAGGTGAACTGCTGGCG-3’

TrpR7：3’-GGTGCCGTTATAAGGTCGGAC-5’

(反义)

TrpR11与TrpR1上游(5’)的Ptna序列杂交，而TrpR7与TrpR6的下游(3’)的tnaB序列杂交。取决于位于Ptna下游的基因是tnaA(RV308中遇到的情形)还是trpR(在突变体中的期望情形)，扩增产物具有不同的大小。保存了一个在tna座位含有trpR的菌落，命名为ICONE 200。其染色体序列分析显示它在Ptna启动子的下游紧接着trpR基因。在色氨酸存在时培养证实没有吲哚形成，这正是tnaA基因丧失的合理结果。

实施例3：在琥珀酸盐+色氨酸存在时表达的渗漏

本实施例阐述大肠杆菌RV308、ICONE 100和ICONE 200控制处于Ptrp启动子控制下的重组蛋白表达的相对能力。为此，我们构建了称为pVA-βgal的表达载体，其中编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的序列位于Ptrp启动子的下游。用于该构建体的原始载体是pVAABP308(Murby，Samuelsson，Nguyen等，1995)。

3个菌株的都用载体pVA-βgal转化。获得的转化体各自单独在完全培养基(30g/l胰胨豆胨培养液(DIFCO)，5g/l酵母提取物(DIFCO))中37℃培养过夜。这些预培养物各取一滴转移至60ml M9.YE.SUCC培养基中(1×M9盐溶液(DIFCO)、5g/l酵母提取物(DIFCO)、20g/l琥珀酸钠)。在37℃孵育一段时间使其达到指数生长期后，从各培养物中取样。生长通过细菌悬液在580nm处的光密度来估计。测定每一细胞沉淀的β-半乳糖苷酶活性水平。为此，取1ml培养物在12,000g离心3分钟。将细胞沉淀悬浮在900ul缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.5/1mMEDTA/100mM NaCl/400ug/ml溶菌酶)，并在37℃孵育15分钟。加入100ulSDS(在50mM Tris-HCl，pH7.5中，浓度为1％)，将样品在室温下放置5分钟。通过混合30ul样品、204ul缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5/1mMMgCl₂)和66ul ONPG(在50mM Tris-HCl，pH7.5中，浓度为4mg/ml)来进行检测。将反应混合物在37℃孵育。加入500ul 1M Na₂CO₃终止反应。与孵育时间相关的420nm处OD值与样品中存在的β-半乳糖苷酶活性成比例。因为已知大肠杆菌RV308的lac操纵子完全缺失(Mauer，Meyer和Ptashne，1980)，所以检测的β-半乳糖苷酶活性只取决于载体pVA-βgal携带的基因的表达。

表2总结了用菌株RV308、ICONE 100和ICONE 200获得的结果。

表2：菌株RV308、ICONE 100和ICONE 200的生长和表达渗漏(3次实验的平均值和标准误)

	OD 580nm	β-GAL(U/ml)
			RV308	2.47±0.01	0.93±0.09
ICONE 100)	3.69±0.24	0.21±0.03
			ICONE 200	2.43±0.03	0.02±0.00

表2的结果显示ICONE系突变体的表现至少和它们来源的菌株RV308一样好。因此导入的突变对生长没有消极影响。而且，测定的β-半乳糖苷酶活性在三个菌株中是不同的。ICONE 100的细胞内活性比RV308低约4.5倍。在“琥珀酸盐作为碳源”的条件下，这时Ptna启动子的活性最大(Botsford和DeMoss，1971)，色氨酸酶基因的缺失导致表达渗漏降低，这可能是通过限制细胞内色氨酸(辅阻遏物)的降解来实现的。在相同条件下，ICONE 200中表达渗漏的程度相对ICONE 100再降低10倍。因此，质粒Ptrp启动子的活性在ICONE 200中最小。首先，色氨酸酶活性的丧失使细菌能更好地控制Ptrp，正如ICONE 100所显示的。然而，ICONE200具有第二个特性使其在遗传学上区别于ICONE 100，并在实验水平上赋予控制表达的更大的优势。因此，在Ptna有活性的条件下，ICONE 200可以指导TprR阻遏物蛋白的过表达，因此，在质粒Ptrp启动子的水平上检测的表达渗漏相对于原始RV308菌株降低近50倍。

实施例4：在甘油+色氨酸存在时表达的渗漏

本发明阐述在发酵培养基中和接近于工业上可用于以Ptrp系统生产重组蛋白的发酵条件下突变体ICONE 200所提供的优势。

用载体pVA-βgal分别转化三种菌株RV308、ICONE 100、ICONE 200。获得的转化体各自在200ml完全培养基(30g/l胰胨豆胨培养液(DIFCO)，5g/l酵母提取物(DIFCO))中37℃培养过夜。

将获得的细胞悬液无菌转移至含有1.8升下列培养基(2升终培养物的浓度)的发酵罐(Chemap的CF3000型，容量3.5升)中：90g/l甘油、5g/l(NH₄)₂SO₄、6g/l KH₂PO₄、4g/l K₂HPO₄、9g/l柠檬酸三钠.2H₂O、2g/l MgSO₄.7H₂O、1g/l酵母提取物、30mg/l CaCl₂.2H₂O、8mg/lZnO₄.7H₂O、7mg/l CoCl₂.6H₂O、7mg/l Na₂Mo0₄.2H₂O、10mg/l MnSO₄.1H₂O、2mg/l H₃BO₃、8mg/l CuSO₄.5H₂O、54mg/l FeCl₂.6H₂O、0.06％消泡剂、8mg/l四环素和200mg/l色氨酸。通过加入氨水调节pH至7.0。通过自动调节搅拌速度和通气流速以及测定溶解O₂保持溶解氧含量在30％饱和。当培养物的光密度值达到40-45之间时，加入25mg/l吲哚丙烯酸(SIGMA)进行诱导。

分析培养物的光密度(悬液580nm处的OD)动力学和细胞内β-半乳糖苷酶活性的动力学(见实施例3)。图1和2分别图示这三种培养物的生长动力学和β-半乳糖苷酶活性动力学。

图1给出的数据证实了实施例3中的观察：三种菌株具有类似的生长动力学。从该观点看，ICONE系突变体保留了大肠杆菌RV308的生长潜力，因此它们是工业应用的潜在侯选者。

图2的数据显示ICONE菌株携带的突变对β-半乳糖苷酶在发酵罐中表达的影响。很明显，在基于甘油的培养基中，色氨酸酶活性的存在与否对表达的控制没有影响，如RV308和ICONE 100曲线的第一部分所证明的，即使观察到在RV308培养物中外源色氨酸的消失比ICONE 100中的更快(数据未显示)。另一方面，突变体ICONE 200显示在培养开始时控制表达的更强的能力：在培养的头18小时中β-半乳糖苷酶活性保持较低，然后从t＝20小时开始增加，此时细胞外的色氨酸浓度变为零(数据未显示)。ICONE 200的曲线的第二部分显示β-半乳糖苷酶活性平稳增加，直到在培养结束时达到接近RV308所得到的水平。在这方面，我们证明ICONE 200中存在的调节系统提供了对质粒Ptrp启动子的瞬时控制。用色氨酸和/或碳源进行的该控制在培养的第二部分中无效，并且不会妨碍重组蛋白的最大表达。

实施例5：控制有毒蛋白的表达

本实施例阐述在转化了色氨酸启动子下游含有有毒蛋白基因的载体时，菌株RV308和ICONE 200在培养中的表现。作为例子和为了说明本发明，目标基因是编码脊髓灰质炎病毒2B蛋白的基因。已报道该蛋白的过表达改变细菌(Lama等，1992)和真核细胞(Aldabe等，1996)的膜通透性，这使它成为研究大肠杆菌中表达渗漏结果的很好模型。

通过利用下列寡核苷酸进行PCR反应从载体pET3.2B(Lama等，1992)扩增2B蛋白编码基因：

PO2.1  5’-GC GAATTCTGGCATCACCAATTACATAG-3’

(正义)       EcoRI

PO2.21  5’-GC AAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGCTTGATGACATAA

(反义)        HindIII

        GGTATC-3’

然后用EcoRI和HindIII限制酶消化扩增产物，再克隆至pBR322衍生的含有Ptrp色氨酸启动子的表达载体中。获得的载体命名为pVA-polio2B，其含有编码C末端融合了poly(His)尾的处于Ptrp启动子控制下的2B蛋白的序列。

通过转化将载体pVA-poli02B导入大肠杆菌RV308和ICONE 200细菌。然后将每一构建体的重组克隆在实施例4所述类似的条件下培养。

图3给出了用580nm处的光密度测定的RV308和ICONE 200细菌的生长动力学。看起来很明显，RV308显示出相当大的生长延迟：培养的头14小时之中，发酵罐中的平均世代时间是1小时45分钟，而ICONE 200仅为1小时17分钟。培养24小时后，菌株RV308的光密度仅为13。令人吃惊的是，在17小时30分钟后菌株ICONE 200本身达到光密度等于37。此时加入吲哚丙烯酸(IAA)至25ug/ml进行诱导。诱导的效果是迅速的：耗氧率突然下降(数据未显示)，并且生长停止。

在各种不同培养时间取样分析其重组蛋白含量。在8000g离心获得的样品生物质中以每g生物质5ml的比例加入P1缓冲液液(25mM Tris，1.15mMEDTA，lmg/ml溶菌酶，pH8)。将此生物质重悬，室温孵育15分钟然后超声处理2分钟。再次离心溶解液(10000g，15分钟，4℃)以分离可溶部分(上清液)和不溶部分(将沉淀用200ul P2缓冲液吸收：25mM Tris，1mM EDTA，pH8)。将这些样品上样至聚丙烯酰胺凝胶上，在变性条件下进行电泳(SDS-PAGE)。然后根据Western印迹技术将凝胶转移至膜上以显示重组蛋白的存在。所用抗体是过氧化物酶偶联的抗poly(His)单克隆抗体(Sigma)。采用ECL+试剂盒(Amersham)通过化学发光进行显色。图4A和4B分别给出了来自RV308和ICONE 200培养物的不溶部分的免疫印迹结果。图4A显示所有样品都存在重组蛋白，也就是说从培养开始到发酵时间t＝24h，即使还没有用IAA进行诱导，都是如此。相反，对于ICONE 200，在诱导之前则没有检测到重组蛋白(图4B)。只有在有IAA诱导之后2B蛋白才可检测到，并观察到其有毒性质的表现。因此，这些结果表明，突变体ICONE 200相对于其来源的菌株RV308有明显的优势，并可在发酵罐中产生对表达的有效控制。

实施例6：有毒蛋白的生产

本实施例旨在说明，在适于工业上外推的条件下有毒蛋白可在高细胞密度的ICONE 200大肠杆菌培养物中表达。为此，评价了转化有载体pVA-polio 2B的ICONE 200大肠杆菌菌株。实施例5中获得的结果表明如果要避免表达引起的瞬间生长停滞和细菌溶解，那么诱导条件必须优化。因此，本实施例描述了各种实验以通过调节诱导物浓度和诱导时的细胞密度来优化每单位发酵体积的重组蛋白产量。所用培养条件是实施例4所述条件。

被测的实验组合如下：

■实验1：在光密度为30-35时用25ug/ml IAA诱导；

■实验2：在光密度为30-35时用5ug/ml IAA诱导；

■实验3：在光密度为60-65时用25ug/ml IAA诱导；

■实验4：在光密度为60-65时用5ug/ml IAA诱导。

对于每一实验，在诱导后不同时间取样品生物质并按如下步骤分析。用100ml 1×起始缓冲液(Start Buffer)(从8×浓溶液制备：1.42gNa₂HPO₄.2H₂O，1.11g NaHPO₄.H₂O，23.38g NaCl，足量至100ml，pH7.4)吸收约20克生物质。将该悬液超声处理3×5分钟，然后在4℃以20000g离心30分钟。沉淀块中加入15ml起始缓冲液+6M盐酸胍+0.1％SB3-14(N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐，Sigma)，然后在冰上孵育1小时。将悬液在4℃以30000g离心1小时。上清液通过0.45um过滤以便用螯合金属亲和层析法纯化。给含有1ml胶的柱子(HiTrapChelating，Amersham Pharmacia Biiotech)上样1ml 0.1M NiSO₄，用5ml水洗，再用30ml起始缓冲液+6M盐酸胍+0.1％SB3-14平衡。然后将样品上样至柱子上。用60ml清洗缓冲液(起始缓冲液+6M盐酸胍+0.1％SB3-14+20mM咪唑)清洗以清除大部分通过非特异相互作用结合的蛋白质。重组蛋白polio-2B用10×1ml洗脱缓冲液(起始缓冲液+6M盐酸胍+0.1％ SB3-14+300mM咪唑)洗脱。汇集具有最高蛋白浓度的馏分，然后用Sephadex G-25胶(PD10柱，Amersham Pharmacia Biotech)脱盐。由此获得的polio-2B蛋白的质量和数量分别通过变性条件下电泳(SDS-PAGE)和分析总蛋白(BCA法，Pierce)估计。

图5显示在上述实验1-4之后提取和纯化的polio-2B蛋白的考马斯蓝染色的SDS胶。重组蛋白的大小符合从其编码序列预测的理论大小(11kDa)。此外，它与诱导后ICONE 200大肠杆菌×pVApolio-2B溶解物的Western印迹中观察到的主要蛋白的大小相符(图4B)。因此，图5中可见的蛋白质似相当于与聚组氨酸尾融合的脊髓灰质炎病毒2B蛋白。而且，获得的蛋白质的量在所有被测的实验条件下均相同。

下面的表3总结了组合各种因素如诱导时的光密度、诱导物浓度和诱导后培养时间等获得的结果。

表3：诱导时的光密度、诱导物浓度和诱导后时间对有毒蛋白(以polio-2B为例)的表达产量的影响

实验编号	诱导时的光密度(580nm)	诱导物浓度(mg/l IAA)	诱导后的时间(HH:MM)	提取和纯化的蛋白的量(mg/升培养基)
					1	32.5	25	00:45	3
01:45	2
		2	32.5	5				00:45	6
01:45	6
					3	62.5	25	00:45	5.5
02:45	7.5
		4	63.5	5				00:45	6
02:50	9

比较实验组(1-2)和实验组(3-4)，观察到诱导进行得越晚，表达产量越高。这证实了在引发诱导之前尽可能增多生物质的优点。在实验(3-4)的情况下，在引发polio-2B蛋白表达时已消耗了约70％的碳底物。对于菌株如ICONE 200，细胞生长期和表达期完全分开，这使得有可能优化重组蛋白的产量，即使该蛋白是有毒的。

与诱导时间一样，诱导物浓度也是一个影响参数。在本实施例中获得的最佳表达结果与实验4相当，实验4中诱导物相对细胞数的浓度是最低的(对光密度为63.5的培养物IAA为5mg/l)。也是在该实验中polio-2B表达的毒性作用最不明显，因为诱导后培养物继续生长，而在所有其它实验中生长完全停止(见图6)。因此，特别重要的是调节有毒蛋白的诱导条件，以找到诱导物的最佳浓度，因为诱导物浓度太低不能引起显著的表达，太高则引起细菌代谢的迅速停滞。比较实验4和实验1的结果，观察到较晚(OD＝63.5对32.5)和较弱(IAA浓度＝5mg/ml对25mg/ml)的诱导可使获得的每单位发酵体积的重组蛋白量翻3到4倍。

通过根据本发明的遗传修饰获得的具有工业价值的ICONE 200大肠杆菌株可严格控制任何位于质粒载体中Ptrp色氨酸启动子下游的基因的表达。该控制是瞬时的，因为它通过培养基中提供的外源色氨酸介导。ICONE 200中Ptrp诱导潜力是保守的，并仍可通过IAA浓度来调节。由于这些特性，ICONE 200允许在可外推至大规模的培养条件下有控制地表达重组蛋白。

                     参考文献目录

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Claims (17)

1.生产其基因处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制下的目标重组蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤：

a)用载体转化能够合成能被色氨酸诱导的色氨酸酶的原核宿主细胞，所述载体包含当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列，并将所述序列整合至所述宿主细胞的DNA中；并且预先、随后或同时将Ptna色氨酸酶操纵子启动子或其生物学活性片段的序列导入所述原核细胞，其中所述Ptna色氨酸酶操纵子或其生物学活性片段在3’位置后连接着编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子或其转录产物起抑制作用的分子的核酸序列，所述生物学活性片段能够指导或控制位于所述片段下游的基因的表达；

b)用含有置于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制下的所述目标重组蛋白编码基因的载体转化所述原核细胞；

c)在允许重组蛋白表达的培养基中培养所述转化细胞；和

d)从培养基或从所述转化细胞回收重组蛋白，

所述方法还在步骤a)和b)之间包括分离和筛选步骤。

2.根据权利要求1的生产目标重组蛋白的方法，其中能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列是按照染色体整合方法被导入原核宿主细胞的DNA中的。

3.根据权利要求1或2的生产目标重组蛋白的方法，其中导入至所述宿主细胞中的所述核酸序列在导入时没有任何赋子与其相关的选择优势的其它DNA元件。

4.根据权利要求1-2之一的生产目标重组蛋白的方法，其中所述Ptna色氨酸酶操纵子启动子或其生物学活性片段的诱导是通过任何能对所述启动子发挥抑制或激活作用的方法获得的。

5.根据权利要求4的生产目标重组蛋白的方法，其中所述Ptna色氨酸酶操纵子启动子或其生物学活性片段的诱导是通过如下途径获得：

a)通过选择培养基中的适当碳源；或

b)通过向培养基中加入色氨酸；或

c)通过a)和b)的组合。

6.根据权利要求1-2之一的生产目标重组蛋白的方法，其特征在于所述原核宿主细胞是能够合成能被色氨酸诱导的色氨酸酶的革兰氏阴性细菌。

7.根据权利要求1-2之一的生产目标重组蛋白的方法，其特征在于所述原核宿主细胞是大肠杆菌。

8.用于转化一种易于被转化的原核宿主细胞的构建体，其用来在原核宿主细胞中表达处于Ptrp色氨酸操纵子启动子控制之下的目标重组蛋白编码基因，其特征在于所述构建体包含当所述核酸序列被导入所述宿主细胞时能修饰TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列，其中所述修饰能导致所述宿主细胞的色氨酸酶活性丧失，所述经修饰的基因产物能降解色氨酸至吲哚且，其特征在于所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列包含所述TnaA色氨酸酶编码序列的引起色氨酸酶活性丧失的突变片段。

9.根据权利要求8的构建体，其特征在于它还在所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列的上游，包含Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或部分核酸序列。

10.根据权利要求8的构建体，其特征在于所述突变片段通过在某个位置插入一个终止密码子来获得，以使由此获得的突变片段的序列编码一个丧失色氨酸酶活性的蛋白片段。

11.根据权利要求8的构建体，其特征在于所述突变片段是所述宿主细胞TnaA色氨酸酶编码序列的突变片段。

12.根据权利要求8的构建体，其特征在于所述当被导入所述宿主细胞时能灭活TnaA色氨酸酶编码基因的核酸序列包括含全部或部分启动子序列的核酸序列，该启动子序列的3’位置之后是编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子或其转录产物起抑制作用的分子的核酸序列，并且，所述启动子是Ptna色氨酸酶操纵子的启动子的全部或具有启动子活性的一部分。

13.根据权利要求12的构建体，其特征在于编码本质上是核糖核苷酸或蛋白质并对Ptrp启动子起抑制作用的分子的所述核酸序列，是色氨酸操纵子阻遏物蛋白TrpR的编码序列或其一个生物学活性片段。

14.含有根据权利要求8的构建体的载体。

15.根据权利要求14的载体，其特征在于它是[tnaAT]片段已被亚克隆至其中的载体pMAK705或融合片段[Ptna::trpR::3’tna]已被亚克隆至其中的载体pMAK705。

16.被权利要求14的载体转化的原核宿主细胞。

17.根据权利要求16的原核宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌。

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