CN1308449C

CN1308449C - 表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体及工程菌

Info

Publication number: CN1308449C
Application number: CNB2005100877211A
Authority: CN
Inventors: 向华; 周利刚; 周梅先; 孙超岷; 周坚
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2007-04-04
Anticipated expiration: 2025-08-05
Also published as: CN1746303A

Abstract

本发明公开了一种表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体及工程菌与应用。本发明所提供的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体pNB-bopD96N，是将具有序列表中序列1的核苷酸序列的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体编码基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI识别位点间得到的表达质粒。本发明所提供的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌，是将pNB-bopD96N导入盐沼盐杆菌BRD，得到的可表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌；所述盐沼盐杆菌BRD是将盐沼盐杆菌AS1.2061的bop基因编码序列敲除后得到的菌株。本发明工程菌表达的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的表达量为3-5mg/L，该工程菌表达的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体在光学信息存储、防伪材料制作等方面有很好的应用前景。

Description

表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体及工程菌

技术领域

本发明涉及一种表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体及工程菌与该工程菌在表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体中的应用。

背景技术

菌视紫红质(BR)是极端嗜盐古菌盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)中发现的一种膜结合蛋白，具有光驱动的质子泵功能(Biochim.Biophy.Acta.1979，505：215-278)。该蛋白分子量约27kDa，以其216位的赖氨酸上的ε-氨基基团共价结合全反式视黄醛生色团。在盐沼盐杆菌细胞膜中，BR形成三聚体，沿细胞膜二维方向有规律的排列，形成人们所说的紫膜(PM)。

紫膜这一高度特化的生物学结构，由于其天然的质子泵功能，以及光电响应和光至变色特性，其各类突变体被认为是目前可用于研制生物计算机，进行海量信息处理，全息图像储存，以及人工视网膜，光电响应等领域的，最具开发潜力的生物纳米材料。

人工遗传工程改造是获得优良紫膜突变体的主要途径，通过不同的技术途径人们已得到了一些有应用前景的突变体。这些突变体一般有较长的M、O、P或Q态，具有良好的光致变色和光电响应等特性，在信息存储和光电控制元件等方面有一定应用前景。另外通过结合X射线晶体衍射，核磁共振等手段研究突变体的结构变化，对各个重要氨基酸在紫膜功能活性中的作用作了深入的了解，也反过来对更有应用前景的BR突变体的获得起到了重要指导作用。

通过基因工程方法对紫膜蛋白基因(bop)突变后，一般有两种表达方法。一种是在将bop基因或突变基因在异源宿主如大肠杆菌中表达，经纯化后与视黄醛在脂类或去污剂形成的泡囊中重建，得到有功能活性的紫膜突变体(J.Biol.Chem.1988，263：7439-7442)，但该种方法获得的紫膜突变体组成中因缺少极端嗜盐古菌特异的脂成分等，因而在结构及理化性质方面均存在不足；另一种方法是构建能在极端嗜盐古菌中复制的表达载体或整合表达载体，直接在嗜盐古菌中表达突变体，然后通过超速离心等方法纯化，得到有功能活性的突变体(Proc.Natl.Acad.Sci.1991，88：859-863)。第二种方法可以得到天然状态的紫膜，以便于体内研究紫膜突变体的功能，并有利于筛选新的优良突变体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体。

本发明所提供的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体，名称为pNB-bopD96N；pNB-bopD96N是将具有序列表中序列1的核苷酸序列的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体编码基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI识别位点间得到的表达质粒。

所述极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体，名称为D96N突变体，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

序列表中的序列2由248个氨基酸残基组成，自氨基端第96位的天门冬酰胺残基(N)由天门冬氨酸残基(D)突变而来。

具有序列表中序列1的核苷酸序列的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体编码基因的名称为bopD96N。

序列表中的序列1由1035个脱氧核苷酸组成，自5′端第507位脱氧核苷酸a由g突变而来；自5′端第1位至第182位脱氧核苷酸为启动子序列；自5′端第183位至第968位脱氧核苷酸为D96N突变体的原蛋白的编码序列，其中222位至第965位脱氧核苷酸编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的紫膜蛋白D96N突变体成熟肽；在翻译后加工形成成熟肽的过程中，由于极端嗜盐古菌自身机制，由序列1中222-224cag编码谷氨酰胺(Q)被加工为谷氨酸(E)，而由序列1中966-968为gac编码的最后一个氨基酸D则被切除，因此最终可形成序列2的D96N成熟肽氨基酸序列；自5′端第972位至第1035位脱氧核苷酸为终止子序列。

pNB-bopD96N含氨苄青霉素抗性和莫维诺林抗性编码基因，大肠杆菌和极端嗜盐古菌复制子，可在大肠杆菌和极端嗜盐古菌之间穿梭。该质粒中bopD96N基因含其自身启动子和终止子序列，受染色体上反式作用元件的调控，可用光照和低氧条件来诱导紫膜蛋白的产生。并且在启动子区与染色体具有415bp的同源片段，所以除了利用自身复制子复制外，该质粒可通过同源重组整合到染色体上。

本发明的第二个目的是提供一种表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌。

本发明所提供的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌，是将pNB-bopD96N导入盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)BRD，得到的可表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌；所述盐沼盐杆菌(Halobacteriumsalinarium)BRD是将盐沼盐杆菌(嗜盐杆菌)(Halobacterium salinarium)AS1.2061的bop基因编码序列敲除后得到的菌株。

盐沼盐杆菌H.salinarum AS1.2061，由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保存和出售。该菌可在培养基AS-169(每升培养基成分：酪蛋白氨基酸7.5g，酵母抽提物10g，柠檬酸钠3g，硫酸镁20g，氯化钾2g，氯化钠250g，二价Fe及Mn痕量(10^-10～10^-12g)，pH7.4)上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，37℃生长7-10天菌落为粉红色至紫色。

H.salinarum BRD，也在培养基AS-169上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，37℃-40℃生长7-10天菌落为黄色或略显红色。

所述bop基因可通过缺失bop基因编码区而不再表达野生型极端嗜盐古菌紫膜蛋白。所述bop基因的编码区是由GenBank号为AE005062的第7089位至第7877位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。

所述盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)BRD可按照如下方法获得：将pBRD101转化盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS1.2061，筛选得到不表达bop基因的菌株即为盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)BRD；所述pBRD101按照如下方法构建：

1)将具有序列表中序列3的核苷酸序列的由656bp组成的DNA片段插入pUCm-T，得到含有该656bp序列的重组载体pbopP；

2)将具有序列表中序列4的核苷酸序列的由641bp组成的DNA片段用Xba I和Hind III酶切后插入pbopP的Xba I和Hind III识别位点之间，得到重组载体pbopPT；

3)将莫维诺林(Mevinolin)抗性基因片段插入pbopPT的EcoR I和Kpn I识别位点间，得到bop基因敲除载体pBRD101。

序列表中序列4的自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为Xba I识别序列，自5′端第636位至第641位脱氧核苷酸为Hind III识别序列。

所述表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌优选为盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N。

盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N已于2005年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1415。

盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415也在培养基AS-169上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，37℃-40℃生长7-10天菌落为淡紫色。

盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415是质粒pNB-bopD96N单交换整合到盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)BRD的染色体上的工程菌；传代证明，盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCCNo.1415具有极好的稳定性(在不含莫维诺林(Mevinolin)的AS-169培养基中传代培养60代，整合的质粒仍稳定存在)。该工程菌经光照和低氧诱导培养，紫膜蛋白产量与野生菌相当。

本发明的另一个目的是提供一种表达并纯化极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的方法。

本发明所提供的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的方法，是将盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415在含10μg/ml的莫维诺林(Mevinolin)的AS-169培养基中，培养至对数期后，再诱导3-4天至培养物成淡紫色，收集菌体，将菌体悬浮于基本盐溶液中，加入DNaseI，透析7-10小时，通过超速离心和蔗糖密度梯度离心分离得到纯的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体。

所述基本盐溶液为：硫酸镁20g，氯化钾2g，柠檬酸三钠3g，氯化钠250g，加水定容至1L。

本发明表达的紫膜蛋白D96N突变体除在560nm左右有最大吸收峰外，还在410nm处有吸收峰，对应光照产生的M中间态的存在；在光循环中出现具有长达5分钟以上的M态(野生型仅为毫秒级)，可观察到经光照后由紫色(B态)变为黄色(M态)。盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的紫膜蛋白D96N突变体(26KDa)的表达量为3-5mg/L，本发明表达的D96N突变体在光学信息存储、防伪材料制作等方面有很好的应用前景。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。例如，下面实施例是只将紫膜蛋白基因进行一个点突变并构建表达载体，用于工程菌的构建，实现了紫膜蛋白突变体在工程菌胞内的高效表达。将实施例稍加修改(按本领域常规技术)，即可将该基因其他突变体克隆到本发明所设计的表达载体上，转化本发明所构建的受体菌细胞(或其它生境来源的极端嗜盐古菌盐沼盐杆菌，并经相同技术改造的受体菌细胞)，实现新的紫膜蛋白突变体在工程菌中的表达。

附图说明

图1为bopD96N基因获得方法示意图

图2为表达载体pNB-bopD96N构建过程示意图

图3为pBRD101构建过程示意图

图4为基因敲除载体pBRD101与H.salinarum AS1.2061双交换示意图

图5A为表达载体pNB-bopD96N与H.salinarum BRD染色体单交换示意图

图5B为工程菌的Southern杂交结果

图6为盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415表达紫膜蛋白D96N突变体的SDS-PAGE检测

图7为野生型紫膜蛋白与紫膜蛋白D96N突变体的300-700nm吸收光谱曲线

图8为用D96N突变体制作的干膜片用刻字板遮盖，经光照后留下的数字图案

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、紫膜蛋白突变体(D96N突变体)的表达

一、盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的获得

1、bop基因的获得

根据H.salinarum NRC-1 bop基因编码序列，从保守区域设计引物，以部分嗜盐菌的总DNA为模板进行PCR筛选。发现分离自我国盐湖及海水晒盐场并保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心的6株极端嗜盐古菌H.halobiumAS1.1952，H.halobium AS1.1959，H.cutirubrum AS1.1962，H.cutirubrumAS1.2060，Halobacterium sp.strain AS1.2061，Halobacterium sp.strainAS1.2062含有bop编码基因。在此基础上，设计一对引物：

bopF 5’agg cag cgg gca ttt cac 3’

bopR 5’gtg ggg gac tca tcg tgt 3’

以bopF，bopR扩增包含bop编码基因开放阅读框，启动子，终止子序列的1035bp片段，分别回收六株菌的PCR产物，插入T载体pUCm-T(上海生工产品)进行测序。测序结果与H.salinarumNRC-1中bop基因序列(GenBank号：AE005062)比对(ClustalW，EMBL)，结果显示来自AS1.1959和AS1.2061与对照bop基因序列与对照序列100％一致，其它bop基因DNA序列中均有少数点突变，但是这些基因编码紫膜蛋白序列与对照序列仅一到两个氨基酸的差别。

2、bop基因的定点突变与表达载体的构建

基本原理是以AS1.2061的bop基因为模板，进行点突变，bop基因阅读框内第325位g(即GenBank号AE005062的第7413位，序列1中的507位)变为a，使密码子由gac变为aac，从而实现其编码的紫膜成熟蛋白的第96位天冬氨酸(D)突变为天冬氨酰胺(N)(序列2)。(紫膜成熟蛋白是由bop基因编码的原蛋白剪切掉N端13个氨基酸残基后，再经修饰加工，即切除后的N端第一个氨基酸由Q变为E，并同时去除C端最后一个氨基酸D后获得如序列2示的成熟肽)。方法如下：

设计一对overlapping PCR引物如下：

D96NF 5’gtt gtt gtt a a cct cgc gtt gct cgt tg 3’

D96NR 5’gcg agg t

t aac aac aac agc ggc g 3’

然后以图1策略对AS1.2061的bop基因进行点突变，第1步：分别用bopF和D96NR，或者bopR和D96NF两对引物以AS1.2061基因组DNA为模板进行PCR扩增。其中，25μl PCR反应体系：AS1.2061基因组DNA 100-500ng，1×PCR缓冲液(来自上海生工公司的试剂盒)，dNTPs各0.2mM，引物对1(bopF和D96NR)或引物对2(bopR和D96NF)各引物10pmol，Taq DNA聚合酶1-3U；反应条件为：先94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃45s进行25个循环；再72℃延伸7min。结果得到大小分别为510bp和530bp的片段。第2步：分别从凝胶回收该510bp和530bp片段，以回收的两个片段互为模板和引物进行PCR扩增。其中25μl PCR反应条件为基本同上，只是DNA模板改为上述两PCR片段(各1μL，约50-200ng)，引物改为bopR和bopF(各10pmol)。反应条件为：先94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃90s进行25个循环；再72℃延伸7min。结果得到1035bp片段。第3步：将1035bpPCR片段插入到T载体得到pbopD96N，经测序得到正确的突变基因bopD96N，即序列表中序列1的DNA序列。

序列表中的序列1自5′端第507位脱氧核苷酸a由g突变而来；自5′端第1位至第182位脱氧核苷酸为启动子序列；自5′端第183位至第968位脱氧核苷酸为D96N突变体的原蛋白的编码序列，其中222位至第965位脱氧核苷酸编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的紫膜蛋白D96N突变体成熟肽；自5′端第972位至第1035位脱氧核苷酸为终止子序列。

用EcoRI和ClaI将bopD96N从质粒pbopD96N切下，插入中国发明专利ZL02100714.4保护的pNB101的衍生载体pNB102(pNB102构建过程的详见Biotechnol Lett，2004，26：1107-1113)中的EcoRI和ClaI识别位点间，得到含有bopD96N的表达质粒载体pNB-bopD96N(图2)。该质粒含氨苄青霉素抗性和莫维诺林抗性编码基因，大肠杆菌和极端嗜盐古菌复制子，可在大肠杆菌和极端嗜盐古菌之间穿梭。该质粒中bopD96N基因含其自身启动子和终止子序列，受染色体上反式作用元件的调控，可用光照和低氧条件来诱导紫膜蛋白的产生。并且在启动子区与染色体具有415bp的同源性，所以除了利用自身复制子复制外，该质粒可通过同源重组整合到染色体上。

3、bop基因缺失的嗜盐杆菌菌株的构建

为获得bop基因缺失的嗜盐杆菌受体菌株，构建了基因敲除载体pBD101。pBD101构建方法为：

首先扩增bop基因上下游序列，设计两对引物：

bopPF：5’ccg atc acc gac ctc cac 3’

bopPR：5’cca tac ccc agc agc atc 3’

bopTF：5’ct tct aga tcg cac acg cag gac agc 3’(带下划线的序列为XbaI识别位点)

bopTR：5’tca aag ctt gcg ggg gga ggt cga tct 3’(带下划线的序列为Hind III识别位点)

以AS1.2061基因组DNA为模板，用bopPF和bopPR扩增包含启动子的bop基因上游656bp序列(序列3)，插入T载体pUCm-T，得到含有该656bp序列的重组载体pbopP；再用bopTF和bopTR作引物扩增bop基因下游641bp序列(序列4)，Xba I和Hind III酶切后插入pbopP的Xba I和Hind III位点之间，得到含有bop基因上游656bp序列和bop基因下游641bp序列的重组载体pbopPT；最后用EcoRI和KpnI酶切pUBP2(BlaseioU，Pfeifer F.Transformation of halobacteriumhalobium：Development of vectors and investigation of gas vesicle synthesis.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：6772-6776)，得到3.6kb的Mevinolin抗性基因片段，插入pbopPT的EcoRI和KpnI识别位点间，得到bop基因敲除载体pBRD101(图3)。

用pBRD101转化AS1.2061，方法参见(Zhou M，Xiang H，Sun C，Tan H.Construction of a novel shuttle vector based on an RCR-plasmid from ahaloalkaliphilic archaeon and transformation into other haloarchaea.Biotechnol Lett，2004，26：1107-1113)。由于pBRD101没有嗜盐菌复制子，只能通过同源序列重组到AS1.2061染色体上，转化后在含莫维诺林(Mevinolin)10μg/m1的AS-169平板上筛选转化子。在得到的转化子中质粒通过单交换整合到染色体上，将其在不含莫维诺林的AS-169液体培养基中反复传代培养120代，最后涂平板筛选不具备莫维诺林抗性的克隆，挑选不能被光照诱导呈浅紫色的克隆，按照如下方法进行PCR验证：提取基因组DNA，以bopPF和bopTR为引物作PCR反应，25μL反应体系为：基因组DNA 100-500ng，1×PCR缓冲液(来自上海生工试剂盒)，dNTPs各0.2mM，bopPF和bopTR各10pmol，Taq DNA聚合酶1-3U；反应条件为先94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s进行25个循环；再72℃延伸7min。结果只得到阅读框部分缺失后的1.3kb的带，而不能得到含完整阅读框1.84kb的带，说明不能被光照诱导呈浅紫色的克隆为双交换后bop基因编码区按预先设计被敲除的菌株H.salinarumBRD(图4)。H.salinarumBRD在不含莫维诺林的AS-169培养基中传代培养60代，该遗传性状仍然保持稳定不变。经传代培养和莫维诺林抗性确认该菌株具备较好的遗传稳定性的突变株，即可作为表达bop及其突变基因的受体菌株。

4、嗜盐菌的转化与工程菌的筛选

由于pNB-bopD96N含有嗜盐古菌复制子，将pNB-bopD96N转化H.salinarumBRD，能得到两种转化子。一种是质粒游离于染色体自主复制，其中突变的bop基因的拷贝数比较高。另一种是质粒通过染色体上仍保留的bop启动子同源序列发生单交换整合到染色体上，其外源片段的稳定性好，且突变的bop基因具有与野生型bop基因一样的基因座位。这样菌株突变的bop基因为单拷贝数，与野生型菌株在紫膜蛋白的表达机制相同，紫膜蛋白的表达受其上游增强子和调控蛋白的调控。质粒pNB-bopD96N单交换整合到染色体上的工程菌的制备方法如下：

从得到的转化子中筛选能诱导变为紫色的，提取其基因组DNA，用限制酶BamHI，KpnI，SacI分别酶切处理5小时，用pNB101的Rep蛋白编码序列750bp片段(序列5)作为探针进行Southern杂交。选择质粒pNB-bopD96N整合到染色体上的菌株作为工程菌，工程菌的Southern杂交结果如图5B所示，泳道1为BamHI处理，得到约14.3kb的带；泳道2为KpnI处理，因为嗜盐菌中位点较少且此酶易受高盐影响失活，总DNA故没有切开；泳道3为SacI处理，得到5.8kb左右的带，在较大分子量处有杂带为基因组DNA酶切不完全所致。酶切结果与交换图分析(图5A)结果一致。共筛选得到5株工程菌，将其中的一株即盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1415。

含游离或整合型表达质粒的转化子都能表达紫膜蛋白，但是整合的表达质粒由于bop突变体基因与野生型bop基因的位置及拷贝数完全相同，因而不会对受体菌生长产生负面影响。同时含有嗜盐菌复制子，即使被重新环化从染色体上掉下来，质粒也不会丢失，因为其在复制过程中，又会整合到染色体上，所以具有更好的稳定性，这样的工程菌是很好的紫膜生产菌株。

二、紫膜蛋白突变体(D96N突变体)的表达

1、紫膜蛋白的诱导表达

挑取盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415单菌落接种到含莫维诺林10μg/ml的AS-169液体培养基的试管中37℃，200rpm震荡培养直到对数中期。以试管中的菌液作为种子接种到装有35mL含莫维诺林10μg/ml的AS-169液体培养基的容积为250mL三角瓶中，37℃，200rpm培养直到对数中期，再将菌液接种到装有200mL含莫维诺林10μg/ml的AS-169液体培养基的容积为500mL三角瓶中，37℃，200rpm培养至对数期后将转速降至150rpm，并将瓶口密闭，同时用100W philips白炽灯距离50cm持续照射，诱导3-4天。

2、紫膜蛋白D96N突变体的分离纯化

操作在室温中，离心在4C进行。

诱导后的培养物在12000rpm离心5min收集菌体，将菌体悬浮于50mL基本盐溶液(每升基本盐溶液成分：硫酸镁20g，氯化钾2g，柠檬酸钠3g，氯化钠250g)，加入2-5毫克的DNaseI，置于冰上于水平摇床中轻摇1小时，然后对10mMTris-Cl(pH7.2)透析过夜。将透析物12000rpm离心10min，去除杂质，上清为紫色。取上清50000g(20000rpm)离心40min，上清为无色，沉淀悬浮于去离子水，置于30-50％蔗糖密度梯度上，100000g离心2小时。吸出紫色带，对ddH₂O透析过夜，再次50000g(20000rpm)离心40min，弃上清，将沉淀悬浮于少量ddH₂O，4℃保存。

取保存液5μL作SDS-PAGE检测蛋白分子量大小与纯度，结果如图6所示，纯化的紫膜蛋白D96N突变体在26KDa处有较浓的带，为细胞内主要功能蛋白；在接近22KDa处有一条较弱的带为细胞内对紫膜蛋白进一步加工产生。将电泳图谱进行扫描后利用Image Master软件分析计算得到紫膜蛋白D96N突变体表达水平，盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的紫膜蛋白D96N突变体(26KDa)的表达量为3-5mg/L。

三、紫膜蛋白D96N突变体的光致变色特性

1、紫膜蛋白D96N突变体的吸收光谱检测

将紫膜蛋白D96N突变体悬浮于10mM pH7.0的磷酸钠缓冲液中，并调整浓度使其ODλmax在0.8左右，在DU800紫分光光度仪上进行300nm-700nm波长的吸光值检测。结果如图7所示，表明野生型紫膜蛋白和紫膜蛋白D96N突变体都在560nm左右有最大吸收峰，不同的是紫膜蛋白D96N突变体在410nm处还有个吸收峰，对应光照产生的M中间态的存在。

2、光致变色特性的检测

因为D96N突变体质子转移过程关键氨基酸被突变，转运过程被减速，使在光循环中出现具有长达5分钟以上的M态(野生型仅为毫秒级)，所以可观察到经光照后由紫色(B态)变为黄色(M态)，本发明用制作干膜的方法检测其光致变色特性。方法如下：

将紫膜蛋白D96N突变体去离子水悬浮液加入到10％非变性凝胶液中，配成总体积5mL的凝胶液中含1.7mL 30％丙烯酰胺-0.8％甲叉双丙烯酰胺、1.3mL 1.5MTris-HCl、1mL紫膜蛋白D96N突变体去离子水悬浮液、1mL ddH₂O。混匀后加入50μL10％过硫酸铵，5μL TEMED，灌注到1mm间隙的两块玻璃板之间，最后在凝胶液上覆盖一层水。胶凝后倒掉覆盖水，揭开玻璃板，将凝胶取下夹在两张玻璃纸之间，用木框固定，室温晾干，即可得到紫色干膜。由于紫色干膜中含有紫膜蛋白突变体，用镂刻有数字“863”的板盖在膜片上，在强光照射下照射5分钟。此时，未被遮盖的紫膜蛋白受光激发图案变为黄色(M态)，而被遮盖的蛋白没有光激发仍为紫色(B态)，所以揭开板可观察到明显的数字图案留在膜片上，可分辨的数字能维持5分钟左右(图8)。而野生型紫膜蛋白由于光循环过程只有几毫秒，无法观察到中间态的存在，在光照后观察不到颜色的变化。因此具有如此独特光致变色特性的D96N突变体在光学信息存储、防伪材料制作等方面有很好的应用前景。

序列表

<160>5

<210>1

<211>1035

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aggcagcggg catttcacag ccgctgtggc ccacacactc ggtggggtgc gctattttgg 60

tatggtttgg aatccgcgtg tcggctccgt gtctgacggt tcatcggtct aaattccgtc 120

acgagcgtac catactgatt gggtcgtaga gttacacaca tatcctcgtt aggtactgtt 180

gcatgttgga gttattgcca acagcagtgg agggggtatc gcaggcccag atcaccggac 240

gtccggagtg gatctggcta gcgctcggta cggcgctaat gggactcggg acgctctatt 300

tcctcgtgaa agggatgggc gtctcggacc cagatgcaaa gaaattctac gccatcacga 360

cgctcgtccc agccatcgcg ttcacgatgt acctctcgat gctgctgggg tatggcctca 420

caatggtacc gttcggtggg gagcagaacc ccatctactg ggcgcggtac gctgactggc 480

tgttcaccac gccgctgttg ttgttaaacc tcgcgttgct cgttgacgcg gatcagggaa 540

cgatccttgc gctcgtcggt gccgacggca tcatgatcgg gaccggcctg gtcggcgcac 600

tgacgaaggt ctactcgtac cgcttcgtgt ggtgggcgat cagcaccgca gcgatgctgt 660

acatcctgta cgtgctgttc ttcgggttca cctcgaaggc cgaaagcatg cgccccgagg 720

tcgcatccac gttcaaagta ctgcgtaacg ttaccgttgt gttgtggtcc gcgtatcccg 780

tcgtgtggct gatcggcagc gaaggtgcgg gaatcgtgcc gctgaacatc gagacgctgc 840

tgttcatggt gcttgacgtg agcgcgaagg tcggcttcgg gctcatcctc ctgcgcagtc 900

gtgcgatctt cggcgaagcc gaagcgccgg agccgtccgc cggcgacggc gcggccgcga 960

ccagcgactg atcgcacacg caggacagcc ccacaaccgg cgcggctttt caacgacaca 1020

cgatgagtcc cccac 1035

<210>2

<211>248

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Glu Ala Gln Ile Thr Gly Arg Pro Glu Trp Ile Trp Leu Ala Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ala Leu Met Gly Leu Gly Thr Leu Tyr Phe Leu Val Lys Gly Met

20 25 30

Gly Val Ser Asp Pro Asp Ala Lys Lys Phe Tyr Ala Ile Thr Thr Leu

35 40 45

Val Pro Ala Ile Ala Phe Thr Met Tyr Leu Ser Met Leu Leu Gly Tyr

50 55 60

Gly Leu Thr Met Val Pro Phe Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp

65 70 75 80

Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn

85 90 95

Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Gln Gly Thr Ile Leu Ala Leu Val

100 105 110

Gly Ala Asp Gly Ile Met Ile Gly Thr Gly Leu Val Gly Ala Leu Thr

115 120 125

Lys Val Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Trp Trp Ala Ile Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Met Leu Tyr Ile Leu Tyr Val Leu Phe Phe Gly Phe Thr Ser Lys Ala

145 150 155 160

Glu Ser Met Arg Pro Glu Val Ala Ser Thr Phe Lys Val Leu Arg Asn

165 170 175

Val Thr Val Val Leu Trp Ser Ala Tyr Pro Val Val Trp Leu Ile Gly

180 185 190

Ser Glu Gly Ala Gly Ile Val Pro Leu Asn Ile Glu Thr Leu Leu Phe

195 200 205

Met Val Leu Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Phe Gly Leu Ile Leu Leu

210 215 220

Arg Ser Arg Ala Ile Phe Gly Glu Ala Glu Ala Pro Glu Pro Ser Ala

225 230 235 240

Gly Asp Gly Ala Ala Ala Thr Ser

245

<210>3

<211>656

<212>DNA

<213>盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)

<400>3

ccgatcaccg acctccactg tccgcggtgc ggatccgacg tgaagatggg gctcccgatg 60

ggtgcaaccg tgaagtccgt cacggctgcg tcacgacagg agccgaccag cgacacccag 120

aaggtgcgaa cggttgagtg ccgcaacgat cacgagtttt tcgtgcgctt cgagtggtaa 180

cacgcgtgca cgcatcgact tcaccgcggg tgtttcgacg ccagccggcc gttgaaccag 240

caggcagcgg gcatttcaca gccgctgtgg cccacacact cggtggggtg cgctattttg 300

gtatggtttg gaatccgcgt gtcggctccg tgtctgacgg ttcatcggtc taaattccgt 360

cacgagcgta ccatactgat tgggtcgtag agttacacac atatcctcgt taggtactgt 420

tgcatgttgg agttattgcc aacagcagtg gagggggtat cgcaggccca gatcaccgga 480

cgtccggagt ggatctggct agcgctcggt acggcgctaa tgggactcgg gacgctctat 540

ttcctcgtga aagggatggg cgtctcggac ccagatgcaa agaaattcta cgccatcacg 600

acgctcgtcc cagccatcgc gttcacgatg tacctctcga tgctgctggg gtatgg 656

<210>4

<211>641

<212>DNA

<213>盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)

<400>4

tctagatcgc acacgcagga cagccccaca accggcgcgg cttttcaacg acacacgatg 60

agtcccccac tcggtcttgt actcgcacga tcgcgcgacg acggcgacgc cgacggcgac 120

tttccagcgt cgctcaacag gctggctgtc gtcgcgctcg ctggtgcggc tctcgtcggt 180

gcggcgggtc tgttcgccgt gccgttcctg cggtcgttcg gcatgacgtt ttgggaagcg 240

ttcaccgttg ttggtgtctc cgagttcgtc tcggccatcg tggcggccct cgcgggctac 300

cacctctaca ccacgcccga cgactagcag ggcccgctgg cgagccatca ctcccgctgt 360

ggcgaggcga cggccgttct gtaccgctac cgccggcccg gagtccggga catcggcggg 420

gcgatgcgca tcgaacggtc accccacgat tgccggcatg caccgggcgc cgggtcggtt 480

cgtccggccg agacgcgctg tcgatcccgg cgagacgaca ctgatttacc cgcggtcggc 540

gtactgccgt cccgacatgg aggaacggac ccgtgcgtat ctccgggggc ggttcggcga 600

cgtgtaccgc cgtgcggaga tcgacctccc cccgcaagct t 641

<210>5

<211>750

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

atgaacaacc gtccagacgc gagagagggc gtcagccgcc gggtttcgga actcgacccg 60

tccgcccttc ccgacggcac cgcgttccgc ccgatctccg tcaccgaggg caccggcctg 120

cgcgacgagg ccgtgctggt ccgcaccgag aacgggcacc gggcaccgct ggacacgttc 180

gagtcggtgc cagatggcgc agaactgcag gcacggtccg tctaccgggt gctgaacgca 240

tggcgggact ggttcgatgg ctaccggaac gcgcacatcg agtacgagga cccggacggg 300

aaaaccgtac gcacaccgct tgagaacagc tatcagccgg agtacgggaa acgctactac 360

gcgaagatca aggactggga gcgtggcata gaacgggcgt atcaggcccc gacgatggtg 420

atggtgacac tttcagcatc gagcgagaac gcgaagggtg ggcgacggtg cccggccgat 480

cacatgcgcg acatcgccag aggctggaac agcgcgagaa aggcgctaca ccgcgtactc 540

gacggtttcg agtgggagta cgcgaaggtc tgggagcctc accagagcgg ctacggtcac 600

atgcacgtcg cggtcgccgt cgacgacccg gccgacgaga tcgagggcga gacgttccgg 660

ccggtggtcc ggtcgcacgt cgagaacgtg gaaccggcag gatcggccgc acacggcctg 720

aacgccgtgg gcatgggcga tacggtgagc 750

Claims

1、表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的载体pNB-bopD96N，是将具有序列表中序列1的核苷酸序列的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体编码基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI识别位点间得到的表达质粒。

2、表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌，是将权利要求1所述的载体pNB-bopD96N导入盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)BRD，得到的可表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌；所述盐沼盐杆菌BRD是将盐沼盐杆菌AS1.2061的bop基因编码序列敲除后得到的菌株。

3、根据权利要求2所述的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌，其特征在于：所述盐沼盐杆菌BRD按照如下方法获得：将pBRD101转化盐沼盐杆菌AS1.2061，筛选得到不表达bop基因的菌株即为盐沼盐杆菌BRD；所述pBRD101按照如下方法构建：

3)将莫维诺林抗性基因片段插入pbopPT的EcoR I和Kpn I识别位点间，得到bop基因敲除载体pBRD101。

4、根据权利要求2所述的表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌，其特征在于：所述表达极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的工程菌为盐沼盐杆菌AS-D96NCGMCC No.1415。

5、表达纯化极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体的方法，是将盐沼盐杆菌AS-D96NCGMCC No.1415在含10μg/ml的莫维诺林的AS-169培养基中，培养至对数期后，再诱导3-4天至培养物成淡紫色，收集菌体，将菌体悬浮于基本盐溶液中，加入DNaseI，透析7-10小时，通过超速离心和蔗糖密度梯度离心分离得到纯的极端嗜盐古菌紫膜蛋白突变体。