CN101285069B - 细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用 - Google Patents

细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用，其特征是SEQ ID No.1所示的核苷酸和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，步骤是A.bop基因的定点突变的引物设计，B.bopG619C基因的的构建，C.bopT395C/A400T/G415A基因的构建，D.bopT395C/A400T/G415A/G619C基因的构建，E.表达载体构建，F．盐沼盐杆菌的转化，G..突变的细菌视紫红质蛋白质的表达，H.突变的细菌视紫红质蛋白质的提取，I.BRI119T/T121S/A126T/E194Q/PVA复合膜的制备，J.BR/PVA复合膜在高性能3D信息存储器的材料中的应用。本发明筛选获得0态量子效率高、0态的衰减最优化、P→Q水解效率增大、Q态的寿命延长的突变蛋白。用于3D立体光学信息存储器材料。获得的光致变色突变BR材料同时应用于全息存储器、相连存储器、光学双稳态光开关器件中。

Description

细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物分子电子学领域，具体地说，本发明涉及一种具有质子泵功能的基因，其编码的蛋白质，含有该质子泵功能基因的载体，制备突变基因、突变蛋白质的方法，以及该基因产物细菌视紫质分子作为3D立体光学信息存储材料，在制备高密度3D立体光学信息存储器的材料中的用途。 
背景技术：
信息时代对器件更小型化和更高集成度的需求，激发了人们对生物分子电子学的极大兴趣。目前计算机技术进展的主要限制是随机存储器的尺寸和数据传输带宽，而这些性质是由构成器件的材料决定的。生物分子电子学是在分子水平上研究信息的编码、处理和恢复，从而明显降低了器件特征尺寸和门传导延迟。以分子材料为基础构成的分子计算机能够2～3倍地小于由大量逻辑门所组成的半导体计算机，从而大幅度地提高计算机速度和存储密度。 
天然的和修饰的生物分子(色素或蛋白质等)已经在电子或光子器件中表现出非常大的应用前景。目前尽管已报道了几种蛋白质在器件应用上的可能性，但细菌视紫质(BR)分子是公认的最有应用前途的蛋白质。以BR为基础的蛋白质光子和电子器件有巨大的应用潜力，如用于数据存储、处理和超速光探测领域，以及作为新能源—新的光电转换材料等。特别是以BR为基础的存储介质很轻，可防辐射，有高的热稳定性(140℃)，高的空间分辨率(5000线/mm)，高的光灵敏度，高的循环次数，良好的非线性光学特性，并且比较便宜，其优势超过了现在使用的各种有机和无机材料。 
BR分子是一种膜结合的光能转换蛋白质，其功能是光驱质子泵。BR光循环的两个中间体BR和M态是形成光开关的基础。如BR分子用于2D存储器中，当存储信号的斑点为10纳米时，其存储密度为1012bits/cm2，比目前市场上的商品高4个量级。但基于B—M态的光子和全息存储也只限于二维存储体系，不能够有效的作为双稳态开关来利用。另外，M态的寿命以及破坏性写入和读出的操作问题，也是限制因素。所以，两种状态的光学体系通常不可能用于立体光学存储。而利用BR分支光循环特性构建的3D存储器与2D存储器相比，又可使同样体积内数据存储能力提高300～1000倍，因此可以称其为超高密度存储器。 
在BR的光化学反应中，分支反应对于3D存储器的运行至关重要。当BR分子吸收光子后，伴随着质子泵功能经历一个光循环过程，产生J、K、L、M、N、O一系列中间态。其中O态经光照时，出现含有P和Q态的一个称为分支光循环过程。当没有蓝光条件下，Q态非常稳定，用Q态存储的资料可保存5～20年。BR的分支光循环为实现3D信息存储提供了重要的途径，可以通过规定B态为二进制0，P和Q态为二进制1，制成BR分支光循环3D立体存储器。 
然而，天然的蛋白质对上述3D光学存储器而言，并非是最理想的。因为野生型BR虽然具有进入分支光循环的能力，但是量子效率极低，一般仅为10-3～10-4。 分支光循环3D存储系统需要解决的主要问题是提高B→O→P态的量子效率。 
至今所有的研究中，化学修饰和定点突变是最常用的用来产生优化的蛋白质的技术，然而化学方法虽然可以成功地修饰蛋白质特定的特性，但代价是损失了蛋白质的稳定性、循环周期和寿命。 
定点突变是研究蛋白质结构与功能关系最有效的方法，它也是目前优化BR的主要方法。现在已经通过单位点的定点突变产生出了几百个BR突变子。最突出的突变子是BR—D96N，可作为BR处理器材料；还有蓝色突变子BR—D85N，可作为BR存储器材料。美国康涅狄格大学化学系的Birge教授领导的研究小组，研究了用BR为材料的3D光学存储器。他们利用定点突变，产生了延长了O态寿命的突变体。还通过半随机突变获得了三个一组的突变，已经使蛋白质在3D性质上获得了700倍的改进[Wise，K.J.，et al.(2002)：Optimization of bacteriorhodopsin forbioelectronic devices.TRENDS in Biotechnol 20，387-394.]。 
但以上这些突变还不能完全满足分支光循环3D存储器材料的要求，因为对于有应用价值的3D存储器材料要求5个变量同时优化：即O态的形成时间(使最小化)，O态的衰减(使最优化)，O→P光化学转变的量子效率(使最大)，P→Q水解效率(最大化)，还有Q态的寿命(最大化)。正因为3D存储器综合体系有太多的变量，希望通过单突变或双突变能同时完成这些任务是不可能的。 
对于象BR大小的蛋白质(248个残基)，要在现有水平上获得有效的突变，总的突变数量是4712个单位点突变和11 056 708个双位点突变，这还不包括三个以上多位点突变。这一方面说明蛋白质分子有极大的可修饰空间；另一方面，如此大的突变工作量，既不可能完成，也不一定能得到符合要求的正突变。所以如何在如此大量的突变中，找出真正有益的突变位点组合，是最关键的问题。 
据目前研究表明，BR分子某些重要区域的单位点突变，可以有限地影响BR分子的功能。本研究在前期工作中发现，三位点突变子I119T/T121S/A126T和四位点突变子E204Q/I119T/T121S/A126T均比单位点突变子E204Q对BR分子功能如质子泵，光循环等物理特性的影响更大。并且发现，BR质子泵功能和M态的寿命与O态的形成量是有密切联系的。质子泵功能的下降和M态寿命的延长会导致O态形成量的增加。因此在分析内容方面，以M态的动力学和质子泵功能作为重要的参考指标，可以快速地进行有益突变的筛选。 
发明内容：
本发明的目的在于提供一种细菌视紫红质多位点突变基因，一种分离的bop基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有SEQ ID No.1所示的bop突变基因含有789bp。(该基因含有多个位点的突变的核苷酸)，能高效表达突变的细菌视紫红质分子。 
本发明的另一个目的在于提供一种突变的蛋白质细菌视紫红质分子，一种分离的bop基因，其序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该蛋白质含有多个位点的突变的氨基酸，因此具有更加优良光致变色性能，如O态形成量增加，即量子效率提高；P→Q水解效率增大；Q态的寿命延长等。 
本发明的再一个目的是提供一种制备突变的质子泵bop基因的方法，该方法简单易行，得到的bop基因重组载体对BR蛋白质表达量高。 
本发明的再一个目的是提供一种细菌视紫红质蛋白质分子在制备高性能3D光信息存储器的材料中的应用。 
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明涉及一种重组载体，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年12月19日，保藏编号：CCTCC NO：M205155，分类命名：Escherichia coli JC4/pUC18-bopT395C/A400T/G415A/G619C。 
本发明还涉及一种重组表达载体，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年12月19日，保藏编号：CCTCC NO：M205156，分类命名：Escherichia coli JC4/pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C。 
本发明还涉及一种重组表达载体为盐沼盐杆菌，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年12月19日，保藏编号：CCTCC NO：M205157，分类命名：Halobactrium salinariumL33 JC4/pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C。 
一种分离的bop基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有SEQ ID No.1所示的bop突变基因含有789bp。 
本发明还公开了一种由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码产生的一种蛋白质，一种分离的bop基因，其序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。SEQ ID No.2所示的序列编码一个由248个氨基酸组成的细菌视紫红质蛋白质分子，蛋白质分子量约为26kD。 
本发明还公开了一种制备突变的质子泵基因bop基因的方法，包括下列步骤： 
A.bop基因的定点突变的引物设计 
a)bop基因上、下游引物 
①bop基因上游引物FP：5′-CCGGGACGTGAAGATGGGGCTC-3′(方框内为BamHI酶切位点)； 
②bop基因下游引物RP：5′-TC
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000012
GTGCGATCAGTCGCTGGTCG-3′(方框内为HindIII酶切位点)； 
b)bopG619C单位点突变上、下游引物 
①bopG619C单位点突变上游引物FM1的序列为：5′-CGTGTGGCTGATCGGCAGC
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000013
AAGGTGC-3′(方框内为突变位点)； 
②bopG619C单位点突变下游引物RM1的序列为：5′-GCACCTTGCTGCCGATCAGCCACACG-3′(方框内为突变位点)； 
c)bopT395C/A400T/G415A突变基因上、下游引物 
①bopT395C/A400T/G415A突变基因上游引物FM2的序列为： 
5’TGA
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000015
CGGG
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000016
CCGGCCTGGTCGGC
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000017
CAC3’(框内为突变位点)； 
②bopT395C/A400T/G415A突变基因下游引物RM2的序列为： 
5’GTG
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D000018
GCCGACCAGGCCGGCCCG
Figure DEST_PATH_S07151819020070731D0000110
TCA3’(框内为突变位点) 
B.bopG619C基因的的构建 
a)重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)为模板，用FP和RM1作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段A，以RP和FM1作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段B。PCR的反应条件如下： 
所有的PCR反应中，Taq酶均为1.2U；引物的浓度均为10pmol/μl；模板DNA的浓度约为1～5ng/μl；且所有PCR反应中的混合液配制如下： 
  
溶液组成 Buffer MgCl2 dNTP
储存液 10× 25mM 2.5mM
使用液 1× 2mM 0.2mM
PCR反应体系为： 
混合液                6.5μl 
DNA溶液               1μl 
FP或RP                1μl 
RM1或FM1              1μl 
Taq酶                 1.2μl 
ddH2O                 14.3μl 
总体积                25μl； 
上述PCR反应条件为：95℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃10分钟； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行PCR3，合成bopG619C；重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件同上；PCR3产物即为bopG619C基因； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopG619C基因及启动子片段以1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收(DNA回收试剂盒购自MBI公司，回收方法参照试剂盒的说明书)，将回收的bop基因和质粒pUC-18(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下： 
pUC-18质粒或bop基因            10μl 
10×buffer                     2μl 
BamHI                          0.5μl(6U) 
HindIII                        0.5μl(7.5U) 
ddH2O                          7μl 
总体积                         20μl； 
然后将酶切产物回收后，按照外源片段的摩尔数是载体摩尔数的3～10倍，进行连接，连接体系如下： 
酶切的pUC-18质粒                1μl 
酶切的bop基因片段               6μl 
T4连接酶(3U(weiss)/μl)          0.5μl 
10×T4连接酶Buffer              1μl 
ddH2O                          1.5μl 
总体积                         10μl； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如下： 
①挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％的接种量转接到新鲜LB培养基中继续活化3hr，至OD600约为0.5； 
②将活化好的菌旋液于冰浴中放置10分钟，取1.5ml菌液，于4℃4000rpm离心3～5分钟，倒掉上清； 
③加入冰预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮菌体，4000rpm离心去上清，收集 菌体，再加入冰预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬细胞，于4℃放置备用； 
④取出4℃放置12-24hr的感受态细胞，加入连接产物约5μl，混匀，在冰浴中放置30分钟； 
⑤再将其立即放置于42℃的水浴锅中热激90秒； 
⑥热激后快速将试管放入到冰浴中，冷却2分钟； 
⑦取培养物涂布到含有氨苄青霉素(60μg/ml)的固体LB平板上，于37℃培养；于次日挑选转化子。 
d)PCR鉴定 
挑取在含有氨苄青霉素LB固体培养基上生长的大肠杆菌DH5α单菌落，接入含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系如下： 
混合液                     6.5μl 
菌液                       2μl 
FP                         1μl 
RP                         1μl 
Taq酶                      1.2μl 
ddH2O                      13.3μl 
总体积                     25μl 
PCR反应的条件为95℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒，共30个循环；72℃10分钟； 
PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
取PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒pUC-18-bopG619C，进行酶切鉴定；质粒提取液如下： 
溶液I：50mmol/葡萄糖；25mmol/Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/EDTA(pH8.0)； 
溶液II：1％SDS；0.2mol/LNaOH(临时配制，本领域的普通技术人员均能配制)； 
溶液III：5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；双蒸水28.5ml； 
pUC-18-bopG619C质粒的提取方法如下： 
①取大肠杆菌DH5α转化子菌液1.5ml，6000r/分钟离心5分钟，收集菌体； 
②加入150μl质粒提取溶液I，悬浮菌体，加入现配的质粒提取溶液II300μl，混匀后，放置冰上5分钟，裂解细胞至透明； 
③加入25μl质粒提取溶液III，颠倒混匀后，置于冰上5分钟； 
④10000r/分钟，10分钟离心，去除部分变性的蛋白，转移上清至另一干净小管中； 
⑤加入等体积的酚：氯仿(1：1)，振荡混匀后，10000r/分钟，离心10分钟，将上清转移到另一干净的小管中； 
⑥再加入等体积的氯仿，振荡混匀后，10000r/分钟，10分钟离心，转移上清，加入等体积的异丙醇，于4℃沉淀DNA约20分钟； 
⑦10000r/分钟离心10分钟，去上清，用500μl70％乙醇洗涤管内的沉淀两次，于室温(20-25℃，下同)干燥； 
⑧在干燥后的管中加入30μl TE溶液(1mmol/L EDTA，pH8.0；10mmol/lTris-Cl，pH8.0)，和1μlRNA酶，37℃水浴降解RNA后，于-20 ℃保存； 
将提取的pUC-18-bopG619C质粒用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下： 
pUC-18-bopG619C          5μl 
10×K buffer             1μl 
BamHI                    0.5μl 
HindIII                  0.5μl 
ddH2O                    13μl 
总体积                   20μl 
用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段。鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopG619C。送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
C.bopT395C/A400T/G415A基因的构建 
a)bopT395C/A400T/G415A基因的定点诱变 
重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop为模板，用FP和RM2作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段B，以FM2和RP作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段A。PCR的反应条件和反应体系如上述步骤B.a)所示； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行PCR3，合成bopT395C/A400T/G415A。重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件如上述步骤B.a)所示。PCR3产物即为三突变基因bopT395C/A400T/G415A； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopT395C/A400T/G415A基因用1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收，回收的产物和质粒pUC-18均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系和连接体系如上述步骤B.b)； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如上述步骤B.c)； 
d)PCR鉴定 
挑取在含有氨苄青霉素LB固体培养基上生长的大肠杆菌DH5α单菌落，接入含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如上述步骤B.d)；将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
经PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法如上述步骤B.e)所示；用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段；鉴定为含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopT395C/A400T/G415A。送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
D.bopT395C/A400T/G415A/G619C基因的构建 
重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop T395C/A400T/G415A为模板，用FP和RM1作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段A，以FM1和RP作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段B。PCR的反应条件和反应体系如上述步骤B.a)所示； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行 PCR3，合成bopT395C/A400T/G415A/G619C；重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件如上述步骤B.a)；PCR3产物即为bopT395C/A400T/G415A/G619C基因； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因及启动子片段用1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收，将回收的bop基因和质粒pUC-18均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系和连接体系如上述步骤B.b)所示； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如上述步骤B.c)所示； 
d)PCR鉴定 
挑取转化大肠杆菌DH5α后在LB固体培养基上长出的单菌落于5ml含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如发明内容B.d)，将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
将PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法上述步骤B.e)所示；用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段。鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopT395C/A400T/G415A/G619C，送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重组载体为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αJC4，(pUC-18-bopT395C/A400T/G415A/G619C)，CCTCCNO.M205155。 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重组表达载体(pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C)的构建方法，包括以下步骤： 
E.表达载体构建 
将以上测序正确的pUC-18-bopT395C/A400T/G415A/G619C重组质粒和表达质粒pXLNovR(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)用BamH和HindIII双酶切，以T4连接酶连接，酶切体系如下： 
pXLNovR      20μl               bop基因片段      16μl 
10×K buffer 4μl                10×K buffer     3μl 
BamHI        2μl                BamHI            0.8μl 
HindIII      2μl               HindIII          0.8μl 
ddH2O        12μl              ddH2O            9.4μl 
总体积       40μl              total            30μl 
然后将酶切产物回收后用1％琼脂糖电泳确定DNA的大概的浓度，按适当的比例连接，其中外源片段的摩尔数是载体摩尔数的3～10倍，连接体系如下： 
酶切的pXLNovR                     2μl 
酶切的bop基因片段                 5μl 
T4连接酶(3U(weiss)/μl)            0.5μl 
10×T4连接酶Buffer                1μl 
ddH2O                             1.5μl
总体积                              10μl 
F.转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法除固体LB平板中氨苄青霉素换为四环素(50μg/ml)外，其余如在上述步骤B.c)所述。 
G.PCR鉴定 
挑取转化大肠杆菌DH5α后在LB固体培养基上长出的单菌落于5ml含有四环素(50μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如发明内容B.d)；将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株。 
H.酶切鉴定 
将PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法如上述步骤B.e)所述； 
用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C。 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重组表达载体为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αJC4，(pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C)，CCTCC NO.M205156。 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重组表达载体为盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)L33JC4，(pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C)，CCTCC NO.M205157。 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列的重组表达载体转化方法，包括以下步骤： 
I.盐沼盐杆菌的转化 
将含有pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C的大肠杆菌接种于含四环素(50μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，用1％的琼脂糖凝胶电泳确定质粒的大概浓度，然后转化盐沼盐杆菌L33，转化方法如下： 
①按2％的接种量将盐沼盐杆菌L33细胞接种于HB培养基中活化培养至OD550为1.0～1.5，取5ml培养物，离心去上清，收集菌体； 
②用1000μl原生质形成液悬浮菌体，再加入100μl 0.5M EDTA混匀，镜检观察盐沼盐杆菌L33细胞形成原生质体的情况； 
③分别取200μl原生质体悬液转到分别含有约1～10μgpXLNovR-bopG619C、pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A和pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C质粒的试管中；同时取200μl原生质体悬液转到含有20μl蒸馏水的管中作为阴性对照，于室温放置20min； 
④再向每管中缓慢加入等体积(220μl)过滤除菌的PEG-600(浓度为60％，W/V，纯化的PEG-600/未加缓冲液的原生质形成液)，混匀，于室温放置20min； 
⑤每管加入1ml原生质体稀释液，混匀后2000rpm离心30～45min，去上清，每管加入lml的再生液体培养基重新悬浮，于37℃培养箱中静置培养过夜； 
J.阳性克隆的筛选 
将培养液分别与含新生霉素(0.3μg/ml)的再生半固体培养基混合，铺在含有同样浓度新生霉素的再生固体培养基的平板上面，于37℃避光培养，挑取紫色菌落，用液体HB培养基培养后，提取质粒并送北京三博远志生物技术有限公司测序，测序结果正确的即为阳性转化子。
K.紫膜蛋白的提取 
挑取阳性转化的盐沼盐杆菌L33单菌落于含新生霉素(1.0μg/ml)的HB液体培养基(NaCl，250g；蛋白胨，5g；酵母浸出物，3g；柠檬酸三钠，3g；KCl，2g；MgSO4·7H2O，20g，水，加至1000ml，调pH至7.0)中37℃，240rpm/min培养后，转接至新鲜的含新生霉素的HB液体培养基中继续培养，条件同前，再扩大培养。培养约50～70hr后，将摇床的转速降低至150rpm/min，继续培养4～7天后收集菌体，采用差速离心的方法提取紫膜，其操作步骤如下： 
①13000g、4℃离心15min后收集菌体； 
②将收集的菌体用基本盐培养基悬浮，并加入DNA酶I，于400ml0.1MNaCl溶液中透析过夜； 
③透析液用低温离心机，4℃，10000g离心5min后弃沉淀，取上清； 
④将上清液于40000g、4℃离心35min，去上清，用0.1M NaCl溶液悬浮沉淀； 
⑤再于40000g离心35min，去上清，重复洗涤2～3次； 
⑥再用双蒸水悬浮沉淀，40000g离心35min，去上清，重复该操作1～2次； 
⑦提取的紫膜用少许蒸馏水悬浮后，用真空冷冻干燥机冻干保存。 
L含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列表达并分离的四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA复合膜的制备方法，包括以下步骤： 
取3g PVA与0.5gHEPES混合后，在双蒸水中加热至溶解，PVA在溶液中的浓度约为15％(W/V)；取BR水溶液250μl(22mg/ml)，加入1.0mol/L磷酸缓冲液6μl和744μl上述PVA溶液，充分混匀后，测得pH＝7.0，除去气泡，将混合物涂在经强酸和酒精处理过的载玻片上，35℃下干燥3小时后，即可得BR/PVA复合膜。 
M.紫外—可见光谱测定 
将提取的BR蛋白分别命名为野生型BR蛋白BRW，单突变体BRE194Q，三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T。取待测BR的水溶液和BR/PVA复合膜，使用紫外—可见分光光度仪(HitchiU-2010)在室温下对BR蛋白进行紫外—可见吸收光谱的测定。 
P.拉曼光谱的测定 
突变体BRE194Q/1119T/T121S/A126T水溶液和PVA复合膜的共振拉曼光谱测定使用RM1000型Laser Confocal Raman Microspectroscopy(英国，Renishaw公司)，Ar+激光器，激发光波长为514.5nm，狭缝宽度50μm，扫描范围：200—3200cm-1，输出功率为4.8mW，在室温下连续扫描5次后取平均值。 
Q.M态寿命的测定 
M态寿命检测的原理：因为在激光的照射下，BR会发生光致变色现象，所以可以利用显微视频录像技术可以观测光致变色发生的时间，但显微视频技术无法观测毫秒量级的时间变化，用PVA作为介质可以将BR的M态寿命延长至秒，所以可以采用显微视频技术测定BR/PVA复合膜的M态寿命；M态寿命的检测方法是：将待测的BR样品制成PVA复合膜，制备方法如发明内容L所述，利用显微视频技术测定M态寿命，激发光波长为650nm。 
获得的BR的单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T的结构变化均对其光谱学特性和中间态寿命有明显的影响。从共振拉曼光谱可以看出，在水溶液中，本发明四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T与其他三个样品(即野生型BR、单突变体BRE194Q和三突变体BRI119T/T121S/A126T)的差别显著，主要集中在指纹区出现明显的两条带：1322cm-1和1334cm-1，以及在1654cm-1附近的两条带：1567cm-1和1573cm-1；综合比较水溶液中四个样品的拉曼光谱，可以发现，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q除了有M态的累积外，还有L态及N态的累积； 
在PVA薄膜中，虽然四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T的1564cm-1带的强度明显高于其他三个样品(即野生型BR、单突变体BRE194Q和三突变体BRI119T/T121S/A126T)，但出乎意料的是，通过显微视频记录表明，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的M态寿命反而比三突变体的短；由此可见，四突变体的M态寿命并未在单突变体和三突变体的基础上简单的累积；曾有研究发现，单突变体BRE194Q对BR的M态累积作用的影响是很小的，这与水溶液中BRE194Q突变体与WT-BR的拉曼光谱变化一致：在单突变体BRE194Q中出现了强度较弱的1564cm-1带，而野生型BR中无此带。另外，已有报道三突变体BRI119T/T121S/A126T的M态寿命比WT-BR长； 
比较四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q在水溶液和PVA膜中的共振拉曼光谱发现，在PVA膜中，指纹区的1334cm-1和1332cm-1带消失，出现与野生型BR水溶液相似的单一1329cm-1带，说明使L态稳定的因素在PVA中被消除或减弱了；再者，BR/PVA复合膜的1549cm-1带几乎消失，说明在PVA中，N态双烯键振动减小，使N态变得不稳定，由于在N态向O态的转变过程中伴随着重新质子化的视黄醛发生构型改变，双烯键的振动变弱，势必影响视黄醛的异构化，进而影响O态的形成时间和寿命；从拉曼光谱可以看出，四个样品在PVA膜中相对结构变化不大，在PVA膜中，由于N态的不稳定性，会有O态的形成的增加和寿命的改变，最终导致分支光循环量子效率的明显提高；因而，四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T可以作为制备3D立体光学信息存储材料，构建高密度3D立体光学信息存储器中的应用。 
本发明采用基因定点突变的方法，另辟蹊径，在质子途径、视黄醛结合位点、视黄醛结合区域(特别是环己烯环)和膜外环部位这些影响BR分子功能的重要结构部分引入多重位点突变，其目的是扩大变异范围和变异幅度，研究BR分子结构与分支光循环功能之间的关系，并从这些突变子中，首先筛选获得O态形成量增加(即量子效率提高)的突变子，再从上述突变子中筛选出其他性质发生改变的有益突变子，如O态的衰减最优化；P→Q水解效率增大；Q态的寿命延长。本项目的成果用作3D立体光学信息存储器的材料。获得的光致变色突变BR材料同时可应用于全息存储器、相连存储器、光学双稳态光开关等器件中。 
附图说明
图1 bop基因重叠延伸指导的定点诱变示意图 
图2 表达载体的构建流程图 
图3 为WT-BR和突变型BR在水溶液和PVA膜中的紫外可见吸收光谱 
其中：A为WT-BR，BRE194Q，BRI119T/T121S/A126T和BRI119T/T121S/A126T/E194Q在水溶液中的紫外可见吸收光谱 
B为WT-BR，BRE194Q，BRI119T/T121S/A126T和BRI119T/T121S/A126T/E194Q在PVA膜中的紫外可见吸收光谱 
1.WT-BR；2.BRE194Q；3.BRI119T/T121S/A126T；4.BRI119T/T121S/A126T/E194Q
图4 WT-BR和突变型BR在水溶液中的拉曼光谱示意图 
1：WT-BR；2：BRE194Q；3：BRI119T/T121S/A126T；4：BRI119T/T121s/A126T/E194Q
图5 WT-BR和突变型BR在水溶液共振拉曼光谱示意图 
1.WT-BR；2.BRE194Q；3.BRI119T/T121s/A126T；4.BRI119T/T121S/A126T/E194Q
图6 WT-BR和突变型BR的光致变色膜示意图 
a，b，c和d分别是WT-BR，BRE194Q，BRI119T/T121S/A126T和BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA膜在激光激发前的光致变色照片；A，B，C和D分别是WT-BR，BRE194Q，BRI119T/T121S/A126T and BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA膜在激光激发后的光致变色照片 
具体实施方式
下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中具体实验条件和方法通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。 
实施例1 bop基因的定点突变的引物设计 
a)bop基因上、下游引物 
①bop基因上游引物FP：5′-CCG
Figure S07151819020070424D000111
GACGTGAAGATGGGGCTC-3′(方框内为BamHI酶切位点)； 
②bop基因下游引物RP：5′-TC
Figure S07151819020070424D000112
GTGCGATCAGTCGCTGGTCG-3′(方框内为HindIII酶切位点)； 
b)bopG619C单位点突变上、下游引物 
①bopG619C单位点突变上游引物FM1的序列为：5′-CGTGTGGCTGATCGGCAGC
Figure S07151819020070424D000113
AGGTGC-3′(方框内为突变位点)； 
②bopG619C单位点突变下游引物RM1的序列为：5′-GCACCT
Figure S07151819020070424D000114
GCTGCCGATCAGCCACACG-3′(方框内为突变位点)； 
c)bopT395C/A400T/G415A突变基因上、下游引物 
①bopT395C/A400T/G415A突变基因上游引物FM2的序列为：5’TG
Figure S07151819020070424D000115
CGG
Figure S07151819020070424D000116
CCGGCCTGGTCGGC
Figure S07151819020070424D000117
CAC3’(框内为突变位点)； 
②bopT395C/A400T/G415A突变基因下游引物RM2的序列为：5’GTG
Figure S07151819020070424D000118
GCCGACCAGGCCG
Figure S07151819020070424D000119
CCCCA3’(框内为突变位点) 
实施例2 bopG619C基因的的构建 
a)重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)为模板，用FP和RM1作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段A，以RP和FM1作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段B。PCR的反应条件如下： 
所有的PCR反应中，Taq酶均为1.2U；引物的浓度均为10pmol/μl；模板DNA的浓度约为1～5ng/μl；且所有PCR反应中的混合液配制如下： 
  
溶液组成 Buffer MgCl2 dNTP
储存液 10× 25mM 2.5mM
使用液 1× 2mM 0.2mM
PCR反应体系为：
混合液                    6.5μl 
DNA溶液                   1μl 
FP或RP                    1μl 
RM1或FM1                  1μl 
Taq酶                     1.2μl 
ddH2O                     14.3μl 
总体积                    25μl； 
上述PCR反应条件为：95℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃10分钟； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行PCR3，合成bopG619C；重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件同上；PCR3产物即为bopG619C基因； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopG619C基因及启动子片段以1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收(DNA回收试剂盒购自MBI公司，回收方法参照试剂盒的说明书)，将回收的bop基因和质粒pUC-18(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下： 
pUC-18质粒或bop基因             10μl 
10×buffer                      2μl 
BamHI                           0.5μl(6U) 
HindIII                         0.5μl(7.5U) 
ddH2O                           7μl 
总体积                          20μl； 
然后将酶切产物回收后，按照外源片段的摩尔数是载体摩尔数的3～10倍，进行连接，连接体系如下： 
酶切的pUC-18质粒                1μl 
酶切的bop基因片段               6μl 
T4连接酶(3U(weiss)/μl)          0.5μl 
10×T4连接酶Buffer              1μl 
ddH2O                           1.5μl 
总体积                          10μl； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如下： 
①挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％的接种量转接到新鲜LB培养基中继续活化3hr，至OD600约为0.5； 
②将活化好的菌旋液于冰浴中放置10分钟，取1.5ml菌液，于4℃4000rpm离心3～5分钟，倒掉上清； 
③加入冰预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮菌体，4000rpm离心去上清，收集菌体，再加入冰预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬细胞，于4℃放置备用；
④取出4℃放置12-24hr的感受态细胞，加入连接产物约5μl，混匀，在冰浴中放置30分钟； 
⑤再将其立即放置于42℃的水浴锅中热激90秒； 
⑥热激后快速将试管放入到冰浴中，冷却2分钟； 
⑦取培养物涂布到含有氨苄青霉素(60μg/ml)的固体LB平板上，于37℃培养；于次日挑选转化子。 
d)PCR鉴定 
挑取在含有氨苄青霉素LB固体培养基上生长的大肠杆菌DH5α单菌落，接入含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系如下： 
混合液                   6.5μl 
菌液                     2μl 
FP                       1μl 
RP                       1μl 
Taq酶                    1.2μl 
ddH2O                    13.3μl 
总体积                   25μl 
PCR反应的条件为95℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒，共30个循环；72℃10分钟； 
PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
取PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒pUC-18-bopG619C，进行酶切鉴定；质粒提取液如下： 
溶液I：50mmol/葡萄糖；25mmol/Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/EDTA(pH8.0)； 
溶液II：1％SDS；0.2mol/LNaOH(临时配制，本领域的普通技术人员非常清楚配制)； 
溶液III：5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；双蒸水28.5ml； 
pUC-18-bopG619C质粒的提取方法如下： 
①取大肠杆菌DH5α转化子菌液1.5ml，6000r/分钟离心5分钟，收集菌体； 
②加入150μl质粒提取溶液I，悬浮菌体，加入现配的质粒提取溶液II300μl，混匀后，放置冰上5分钟，裂解细胞至透明； 
③加入25μl质粒提取溶液III，颠倒混匀后，置于冰上5分钟； 
④10000r/分钟，10分钟离心，去除部分变性的蛋白，转移上清至另一干净小管中； 
⑤加入等体积的酚：氯仿(1：1)，振荡混匀后，10000r/分钟，离心10分钟，将上清转移到另一干净的小管中； 
⑥再加入等体积的氯仿，振荡混匀后，10000r/分钟，10分钟离心，转移上清，加入等体积的异丙醇，于4℃沉淀DNA约20分钟； 
⑦10000r/分钟离心10分钟，去上清，用500μl 70％乙醇洗涤管内的沉淀两次，于室温干燥； 
⑧在干燥后的管中加入30μl TE溶液(1mmol/L EDTA，pH8.0； 10mmol/1Tris-Cl，pH8.0)，和1μ 1RNA酶，37℃水浴降解RNA后，于-20℃保存； 
将提取的pUC-18-bopG619C质粒用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如下： 
pUC-18-bop               5μl 
10×K buffer             1μl 
BamHI                    0.5μl 
HindIII                  0.5μl 
ddH2O                    13μl 
总体积                   20μl 
用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段。鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopG619C。送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
实施例3 bopT395C/A400T/G415A基因的构建 
a)bopT395C/A400T/G415A基因的定点诱变 
重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop为模板，用FP和RM2作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段B，以FM2和RP作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段A。PCR的反应条件和反应体系如发明内容中B.a)所示； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行PCR3，合成bopT395C/A400T/G415A。重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件如发明内容中B.a)。PCR3产物即为三突变基因bopT395C/A400T/G415A； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopT395C/A400T/G415A基因用1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收，回收的产物和质粒pUC-18均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系和连接体系发明内容中B.b)所示； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如发明内容中B.c)所示； 
d)PCR鉴定 
挑取在含有氨苄青霉素LB固体培养基上生长的大肠杆菌DH5α单菌落，接入含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如发明内容中B.d)所示；将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
经PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法发明内容中B.e)所示；用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段；鉴定为含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopT395C/A400T/G415A。送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
实施例4 bopT395C/A400T/G415A/G619C基因的构建 
重叠延伸指导的定点诱变原理如图1所示，以质粒pUC-18-bop T395C/A400T/G415A为模板，用FP和RM1作为一对引物，进行PCR1，扩增出片段A，以FM1和RP作为另一对引物，进行PCR2，扩增出片段B。PCR的反应条件和反应体系如发明内容中B.a)所示； 
然后以片段A和B作为下一轮重组PCR的模板，以FP和RP为引物，进行PCR3，合成bopT395C/A400T/G415A/G619C；重叠延伸PCR分两步进行，第一步先不加引物，4个循环，第二步加入引物FP和RP，30个循环，反应条件如发明内容中B.a)所示；PCR3产物即为bopT395C/A400T/G415A/G619C基因； 
b)克隆载体构建 
将上述扩增出来的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因及启动子片段用1％琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒回收，将回收的bop基因和质粒pUC-18均用BamHI和HindIII双酶切，酶切体系和连接体系如发明内容中B.b)所示； 
c)转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法如B.c)所示； 
d)PCR鉴定 
挑取转化大肠杆菌DH5α后在LB固体培养基上长出的单菌落于5ml含有氨苄青霉素(60μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如发明内容中B.d)所示，将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株； 
e)酶切鉴定 
将PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法B.e)所示；用1％的琼脂糖电泳检测酶切片段。鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pUC-18-bopT395C/A400T/G415A/G619C，送北京三博远志生物技术有限公司测序。 
实施例5 表达载体构建 
将以上测序正确的pUC-18-bopT395C/A400T/G415A/G619C重组质粒和表达质粒pXLNovR(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)用BamH和HindIII双酶切，以T4连接酶连接，酶切体系如下： 
pXLNovR         20μl            bop基因片段         16μl 
10×K buffer    4μl             10×K buffer         3μl 
BamHI           2μl             BamHI               0.8μl 
HindIII         2μl             HindIII             0.8μl 
ddH2O           12μl            ddH2O               9.4μl 
总体积          40μl            total               30μl 
然后将酶切产物回收后用1％琼脂糖电泳确定DNA的大概的浓度，按适当的比例连接，其中外源片段的摩尔数是载体摩尔数的3～10倍，连接体系如下： 
酶切的pXLNovR                    2μl 
酶切的bop基因片段                5μl 
T4连接酶(3U(weiss)/μl)           0.5μl 
10×T4连接酶Buffer               1μl 
ddH2O                            1.5μl 
总体积                           10μl
实施例6 转化大肠杆菌 
取适量(DNA的量<100ng)连接产物(一般取5μl)转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化方法除固体LB平板中氨苄青霉素换为四环素(50μg/ml)外，其余如在发明内容中B.c)所述。 
实施例7 PCR鉴定 
挑取转化大肠杆菌DH5α后在LB固体培养基上长出的单菌落于5ml含有四环素(50μg/ml)的LB液体培养基中培养8～12hr，取菌液进行PCR鉴定，鉴定体系和PCR反应的条件如发明内容中B.d)所示；将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化菌株。 
实施例8 酶切鉴定 
将PCR鉴定为阳性的大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，进行酶切鉴定，质粒的提取方法如发明内容中B.e)所述； 
用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，鉴定含有目的片段的阳性克隆子命名为pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C。 
实施例9 盐沼盐杆菌的转化 
将含有pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C的大肠杆菌接种于含四环素(50μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，用1％的琼脂糖凝胶电泳确定质粒的大概浓度，然后转化盐沼盐杆菌L33，转化方法如下： 
①按2％的接种量将盐沼盐杆菌L33细胞接种于HB培养基中活化培养至OD550为1.0～1.5，取5ml培养物，离心去上清，收集菌体； 
②用1000μl原生质形成液悬浮菌体，再加入100μl 0.5M EDTA混匀，镜检观察盐沼盐杆菌L33细胞形成原生质体的情况； 
③分别取200μl原生质体悬液转到分别含有约1～10μgpXLNovR-bopG619C、pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A和pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C质粒的试管中；同时取200μl原生质体悬液转到含有20μl蒸馏水的管中作为阴性对照，于室温放置20min； 
④再向每管中缓慢加入等体积(220μl)过滤除菌的PEG-600(浓度为60％，W/V，纯化的PEG-600/未加缓冲液的原生质形成液)，混匀，于室温放置20min； 
⑤每管加入1ml原生质体稀释液，混匀后2000rpm离心30～45min，去上清，每管加入1ml的再生液体培养基重新悬浮，于37℃培养箱中静置培养过夜； 
实施例10 阳性克隆的筛选 
将盐沼盐杆菌L33培养液分别与含新生霉素(0.3μg/ml)的再生半固体培养基混合，铺在含有同样浓度新生霉素的再生固体培养基的平板上面，于37℃避光培养，挑取紫色菌落，用液体HB培养基培养后，提取质粒并送北京三博远志生物技术有限公司测序，测序结果正确的即为阳性转化子。 
实施例11 紫膜蛋白的提取 
挑取阳性转化的盐沼盐杆菌L33单菌落于含新生霉素(1.0μg/ml)的HB液体培养基(NaCl，250g；蛋白胨，5g；酵母浸出物，3g；柠檬酸三钠，3g；KCl，2g；MgSO4·7H2O，20g，水，加至1000ml，调pH至7.0)中37℃，240rpm/min 培养后，转接至新鲜的含新生霉素的HB液体培养基中继续培养，条件如发明内容K中所述，再扩大培养。培养约50～70hr后，将摇床的转速降低至150rpm/min，继续培养4～7天后收集菌体，采用差速离心的方法提取紫膜，其操作步骤如下： 
①13000g、4℃离心15min后收集菌体； 
②将收集的菌体用基本盐培养基悬浮，并加入DNA酶I，于400ml 0.1MNaCl溶液中透析过夜； 
③透析液用低温离心机，4℃，10000g离心5min后弃沉淀，取上清； 
④将上清液于40000g、4℃离心35min，去上清，用0.1M NaCl溶液悬浮沉淀； 
⑤再于40000g离心35min，去上清，重复洗涤2～3次； 
⑥再用双蒸水悬浮沉淀，40000g离心35min，去上清，重复该操作1～2次； 
⑦提取的紫膜用少许蒸馏水悬浮后，用真空冷冻干燥机冻干保存。 
实施例12 BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA复合膜的制备方法 
含有突变的bopT395C/A400T/G415A/G619C基因核苷酸序列表达并分离的四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的PVA复合膜的制备方法，包括以下步骤： 
取3g PVA与0.5gHEPES混合后，在双蒸水中加热至溶解，PVA在溶液中的浓度约为15％(W/V)；取BR水溶液250μl(22mg/ml)，加入1.0mol/L磷酸缓冲液6μl和744μl上述PVA溶液，充分混匀后，测得pH＝7.0，除去气泡，将混合物涂在经强酸和酒精处理过的载玻片上，35℃下干燥3小时后，即可得BR/PVA复合膜。 
实施例13 紫外—可见光谱测定 
将提取的BR蛋白分别命名为野生型BR蛋白BRW，单突变体BRE194Q，三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T。取待测BR的水溶液和BR/PVA复合膜，使用紫外—可见分光光度仪(HitchiU-2010)在室温下对BR蛋白进行紫外—可见吸收光谱的测定。 
用BR水溶液样品测定吸收光谱，WT-BR、单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的紫外可见吸收光谱如图3(A)所示；从图中可以看出单突变体的最大特征吸收峰在574nm处，比WT-BR(图3A，曲线1)的发生了轻微红移(2nm)，这与其水溶液带较深的蓝色是相符的(图3A，曲线2)。三突变体(图3A，曲线3)和四突变体(图3A，曲线4)的最大吸收峰则分别发生了11nm和12nm明显的蓝移，说明突变以后，导致BR的三级结构发生了变化，视黄醛分子的微环境受到了干扰； 
BR/PVA复合膜的紫外可见吸收光谱如图3(B)所示。与野生型样品相比，三种蛋白的最大特征吸收峰，均发生了不同程度的蓝移，其中四突变体的的吸收峰为557nm，蓝移程度最大，达13nm。这是由于在干燥的BR/PVA复合膜中，水分子减少，使蛋白质的活动空间和视黄醛的构型变化受到限制，从而影响了希夫碱基的活动所致。 
实施例14 拉曼光谱的测定 
突变体BRE194Q/I119T/T121S/A126T水溶液和PVA复合膜的共振拉曼光谱测定使用RM1000型Laser Confocal Raman Microspectroscopy(英国，Renishaw公司)，Ar+激光器，激发光波长为514.5nm，狭缝宽度50μm，扫描范围：200—3200cm-1， 输出功率为4.8mW，在室温下连续扫描5次后取平均值。 
测定了WT-BR及三种突变体(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)水溶液的共振拉曼光谱，其结果如表1和图4所示； 
其中WT-BR的共振拉曼光谱图与文献报道的BR570共振拉曼光谱基本相符，具有光适应BR的典型拉曼谱带(见表1)； 
表1 WT-BR和突变型BR在水溶液中的拉曼光谱峰 
Figure S07151819020070424D000181
“—”表示无此峰，阴影部分为发生相对变化的拉曼峰。 
与WT-BR相比，三个突变体(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)均出现了明显的1187cm—1和1564cm—1带； 
Marcus等在测定暗适应的BR560时，能够清楚地分辩出1187cml带，而在 光适应光谱中却很难分辨出来；此带为N态的典型特征带(Coleman M，Nilsson A，Russell T S.，et al.Biochemistry[J]，1995，34，1559-15606.)。而在本研究中的三个突变体(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)的光适应光谱中，此带均表现得更加明显；说明突变后，使生色团C13的微环境发生了变化，推测导致了N态的积累明显增加；此外，三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的1549cm—1带明显，而野生型与单突变体BRE194Q在此处没有发现明显的带，此带为N态中双烯键的伸缩振动；另外，1328cm—1和1530cm—1都是N态特征带，这些带的出现，说明突变体有比野生型稳定的N态；在典型的N态中，三突变体(三突变体BRI119T/T121S/A126T)和四突变体(四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)与单突变体(单突变体BRE194Q)和WT-BR还有一个非常不同之处，就是在单突变体BRE194Q光谱中有1331cm—1带，而在三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q中各分为1328cm—1和1322cm—1带；并且在四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q和三突变体BRI119T/T121S/A126T中还分别发现了1336cm—1和1334cm—1两条带，这两条带的应为L态特征带(Sonar S，Martin T，Rath P，etal.The Journal of Biochemistry[J]，1994，269：28851-28858.)，而在野生型与单突变体BRE194Q中均未发现这些带； 
1564cm—1为M态特征带，在WT-BR的光谱中未测出此带，而在突变体的光谱中均测出此带，说明在这种测试环境中，突变体的M态较稳定；但尽管这三种突变体在此处都出现有带，它们之间也有很大区别，单突变体BRE194Q为单一的1564cm—1带，三突变体BRI119T/T121S/A126T红移至1570cm—1，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q在此处为明显的1567cm—1和1573cm—1两个带；推测1567cm—1为M态C＝C的伸缩振动，在以前的研究中均无类似的发现(Mendelsohn R.NATURE[J]，1973，243：22-24)； 
在三个突变体(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)的拉曼光谱中，均未发现1582cm—1和1602cm—1带，但出现了1593cm—1带。与WT-BR的1642cm—1带相对应的是四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q出现了1640cm—1带，但其频率明显降低，此带为希夫碱C＝N+H的拉伸振动，其频率的降低，说明希夫碱基处于质子化状态(宋景娇，钟声，张悦，曹军卫，胡坤生，生物化学与生物物理进展，2005，32(6)：529-534.)；三突变体BRI119T/T121S/A126T在相对应于WT-BR的1440cm—1带附近出现两个小带，即1451cm—1和1456cm—1，为C9和C13的非对称性甲基变形；此外，突变体的拉曼光谱未发现1582cm—1带，而1602cm—1带则移至1593cm—1带。相对应于WT-BR的1302cm—1带，在四突变体中变化为1304cm—1带； 
1100-1400cm—1区域为拉曼光谱的指纹区域，而拉曼光谱的指纹区域受BR结构变化的影响最为敏感；突变体在以上拉曼光谱指纹区域的变化和其他区域的变化显示出，突变后的BR蛋白及其视黄醛构型上的变化引起了某些中间态的变化； 
图5为WT-BR及三种突变体BR(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)在PVA薄膜中的共振拉曼光谱；可以看出，各种突变体和WT-BR在指纹区的光谱图带型没有发生明显变化，但与图4相比，都出现了较弱的1187cm—1和强度增加了的1564cm—1带，且四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的1564cm—1带的拉曼强度明显高于其它三种；由此可见，在PVA中，确实使M态寿命延长；此外，四突变体BRI119T/T121s/A126T/E194Q 在1448cm—1处的强度则明显降低，相对略有红移；四种蛋白(即WT-BR、单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)的拉曼光谱上均出现了1582cm—1、1600cm—1、1620cm—1和1642cm—1带，其中1582cm—1和1600cm—1带在不同的样品之间有相对较小的变化，而1620cm—1带在四突变中的强度显著增加，此带为C＝N未质子化的伸缩振动，而在图4中，各谱带中均未出现该带；说明在PVA膜中，水分子的减少，使与希夫碱基共价结合的质子数减少，视黄醛的构型也随之发生了改变。 
实施例15 M态寿命的测定 
M态寿命检测的原理：因为在激光的照射下，BR会发生光致变色现象，所以可以利用显微视频录像技术可以观测光致变色发生的时间，但显微视频技术无法观测毫秒量级的时间变化，用PVA作为介质可以将BR的M态寿命延长至秒，所以可以采用显微视频技术测定BR/PVA复合膜的M态寿命；M态寿命的检测方法是：将待测的BR样品制成PVA复合膜，制备方法如前发明内容Q中所述，利用显微视频技术测定M态寿命，激发光波长为650nm。 
用650nm波长的激光激发后，通过显微视频录像技术可以看到光激发样品后M态的产生和衰退变化过程；为了方便使用视频显微系统测量BR的寿命，选用了能使BR寿命延长的PVA作为载体介质，制成BR薄膜；图6为光激发前后样品的变色照片，其中WT-BR的M态寿命很短，观察不到光致变色现象，激光作用前后，样品的颜色没有发生任何变化，说明WT-BR在PVA膜中的寿命为毫秒量级，视频显微系统无法观测到这样快的过程，单突变体BRE194Q的M态寿命小于1.0s，三突变体BRI119T/T121S/A126T的M态寿命为3.0s，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的M态寿命为2.0s。 
从以上结果可见，本发明获得的三种BR的突变体(即单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)的结构变化均对其光谱学特性和中间态寿命有明显的影响。从共振拉曼光谱可以看出，在水溶液中(pH＝7.0)，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q与其他三个样品的差别显著，主要集中在指纹区出现明显的两条带：1322cm-1和1334cm-1，以及在1654cm-1附近的两条带：1567cm-1和1573cm-1；综合比较水溶液中四个样品(即WT-BR、单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)的拉曼光谱，可以发现，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q除了有M态的累积外，还有L态及N态的累积； 
在PVA薄膜中，虽然四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的1564cm-1带的强度明显高于其他三个样品，但出乎意料的是，通过显微视频记录表明，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的M态寿命反而比三突变体BRI119T/T121S/A126T的短，由此可见，四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q的M态寿命并未在单突变和三突变的基础上简单的累积；曾有研究发现，单突变体BRE194Q对BR的M态累积作用的影响是很小的，这与水溶液中BRE194Q突变体与WT-BR的拉曼光谱变化一致：在E194Q突变体中出现了强度较弱的1564cm-1带，而WT-BR中无此带。另外，已有报道三突变体BRI119T/T121S/A126T的M态寿命比WT-BR长； 
比较四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q在水溶液和PVA膜中的共振拉曼光谱发现，在PVA膜中，指纹区的1334cm-1和1332cm-1带消失，出现与WT-BR水溶液相似的单一1329cm-1带，说明使L态稳定的因素在PVA中被消除或减弱了；再者，BR/PVA复合膜的1549cm-1带几乎消失，说明在PVA中，N态双烯 键振动减小，使N态变得不稳定，由于在N态向O态的转变过程中伴随着重新质子化的视黄醛发生构型改变，双烯键的振动变弱，势必影响视黄醛的异构化，进而影响O态的形成时间和寿命；有研究表明，单突变体BRE194Q可以显著增加O态的累积，三突变体BRI119T/T121S/A126T具有比WT-BR更长的O态寿命，从拉曼光谱可以看出，四个样品(即WT-BR、单突变体BRE194Q、三突变体BRI119T/T121S/A126T和四突变体BRI119T/T121S/A126T/E194Q)在PVA膜中相对结构变化不大，在PVA膜中，由于N态的不稳定性，会有O态的形成的增加和寿命的改变。
                   SEQUENCE LISTING 
<110>武汉大学 
<120>细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用 
<130>细菌视紫红质多位点突变基因和蛋白质及制备方法和应用 
<160>2 
<170>PatentIn version 3.1 
<210>1 
<211>789 
<212>DNA 
<213>盐沼盐杆菌 
<400>1 
<210>2 
<211>248 
<212>PRT 
<213>盐沼盐杆菌 
<400>2 
Figure S07151819020070424D000231

Claims (4)

1.一种分离的bop基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1中所述的bop基因核苷酸序列的重组载体，其特征在于：重组载体为大肠杆菌(Escherichia coli)JC4/pUC18-bopT395C/A400T/ G415A/G619C，CCTCC NO：M205155。
3.一种含有权利要求1中所述的bop基因核苷酸序列的重组表达载体，其特征在于：重组表达载体为大肠杆菌(Escherichia coli)JC4/pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C，CCTCC NO：M205156。
4.一种含有权利要求1中所述的bop基因核苷酸序列的重组表达载体，其特征在于：重组表达载体为盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)L33JC4/pXLNovR-bopT395C/A400T/G415A/G619C，CCTCC NO：M205157。
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