CN110483645B

CN110483645B - 线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用

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Publication number: CN110483645B
Application number: CN201810456360.0A
Authority: CN
Inventors: 康建胜; 杨润舟
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2038-05-14
Also published as: CN110483645A

Abstract

本发明提供了一种线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用，具体地，本发明提供一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白为GPR蛋白突变体，并且本发明还提供了一种突变型嵌合蛋白，本发明的嵌合蛋白和突变型嵌合蛋白均具有(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化的特性。

Description

线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用。

背景技术

视紫红质蛋白(rhodospin)是存在于自然界中含量丰富的感光蛋白，从古细菌到高等哺乳动物都有分布。视紫红质蛋白在结构上非常相似，都由7次跨膜α螺旋(A-G)构成，N末端在胞外，C末端在胞质侧。在第7段跨膜螺旋(helix G)上有保守的赖氨酸残基，与视黄醛分子共价结合。视黄醛是视紫红质的辅基，对视紫红质的感光功能起关键作用。

视紫红质蛋白按其来源可以分为两大超家族，I型和II型。I型视紫红质来源于微生物，这一类视紫红质包括：光驱动的离子泵(bact eriorhodopsin,halorhodopsin,proteorhodopsin,xanthorhodopsin)、光激活的离子通道(channelrhodopsin)及感光受体蛋白(sensory rhodopsin)。光驱动的离子泵可以利用光能，使H⁺、Cl^-或Na⁺逆浓度梯度运输。光激活的离子通道在光照下，通道开放，引起离子顺电化学梯度跨膜运输。感光蛋白在特定波长的光照下，能引起细菌的趋光或避光运动，或启动特定基因的转录。利用不同的菌视紫红质离子泵或离子通道的特性，结合遗传学手段导入神经细胞，实现对某一特定细胞类群的去极化或超极化，对神经回路的阐明、神经及心理疾病的治疗都具有重要作用。将菌视紫红质导入非兴奋性细胞，能够影响细胞的生理活动。Adams等在爪蟾中表达质子泵型视紫红质Archaerhodopsin 3，将爪蟾尾部损伤处理后，利用光照损伤区域使细胞膜超极化能够促使组织再生。在癌症及先天性缺陷等病理过程常伴有离子流动的异常，而目前缺乏利用菌视紫红质对这一类非兴奋性细胞的研究。

ATP(三磷酸腺苷)作为细胞中的能量货币，参与各种细胞生理活动，如神经元动作电位的产生及静息电位的维持，肌细胞的收缩及蛋白的合成。哺乳动物细胞主要依赖氧化磷酸化产生足够的ATP供细胞的生理活动。当细胞能量缺乏(energy failure)时，细胞不能产生足够的ATP来维持细胞功能及应对胁迫。在许多疾病中都可以观察到线粒体功能的缺陷引起供能下降，从而引发细胞发生凋亡或其它细胞死亡途径，最终导致细胞功能受损，。

质子泵型菌视紫红质(Proton-pumping microbial rhodopsins，PPRs)在光照射下，能够进行质子的定向运输，产生跨膜pH梯度，从而驱动ATP合成或驱动物质的二级主动转运。

微生物视紫红质在1970年代在盐湖中被发现以后，很长一段时间被认为这些视紫红质需要在极高的盐浓度中才能发挥作用，而在动物细胞中可能不会有功能，因此限制了对菌型视紫红质的应用。

因此，本领域需要对微生物视紫红质进行更多的研究和改造，以获得具有线粒体定位和更优异的质子泵活性的视紫红质及其突变蛋白。

发明内容

本发明提供了一种具有线粒体定位和更优异的质子泵活性的视紫红质及其突变蛋白。

本发明的第一方面提供了一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白为GPR蛋白突变体，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的选自下组的一个或多个跨膜区发生替换：

4-5号跨膜区；和/或

4-6号跨膜区；和/或

1-2号跨膜区。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的4-5号跨膜区被APR蛋白的第4-5号跨膜区替换。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的4-6号跨膜区被APR蛋白的4-6号跨膜区替换。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的1-2号跨膜区被APR蛋白的1-2号跨膜区替换。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的4-5号跨膜区的第114-165位发生替换。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的4-6号跨膜区的第114－195位发生替换。

在另一优选例中，所述GPR突变体在野生型的GPR蛋白的对应于登录号为AF349993_1的1-2号跨膜区的第33—91位发生替换。

在另一优选例中，所述APR蛋白的第4-5号跨膜区对应于登录号为WP_014952819的蛋白序列的第120-170位。

在另一优选例中，所述APR蛋白的第4-6号跨膜区对应于登录号为WP_014952819的蛋白序列的第120-201位。

在另一优选例中，所述APR蛋白的第1-2号跨膜区对应于登录号为WP_014952819的蛋白序列的第38-96位。

在另一优选例中，所述嵌合蛋白包含从N端到C端的式I结构：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，Z1为GPR蛋白的第一跨膜区；

Z2为APR蛋白的跨膜区；

Z3为GPR蛋白的第二跨膜区；

其中，各“-”独立地为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述Z1元件对应于登录号为AF349993_1的蛋白序列的第1-114位。

在另一优选例中，所述Z2元件对应于登录号为WP_014952819的蛋白序列的第120-170位或120-201位。

在另一优选例中，所述Z3元件对应于登录号为AF349993_1的蛋白序列的第166-249位或196-249位。

在另一优选例中，所述嵌合蛋白包含从N端到C端的式IV结构：

P0-P1-P2 (IV)

式中，

P0为任选的GPR蛋白的信号肽；

P1为APR蛋白的跨膜区；

P2为GPR蛋白的跨膜区；

其中，各“-”独立地为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述P0元件对应于登录号为AF349993_1的蛋白序列的第1-32位。

在另一优选例中，所述P1元件对应于登录号为WP_014952819的蛋白序列的第38-96位。

在另一优选例中，所述P2元件对应于登录号为AF349993_1的蛋白序列的第92-249位。

在另一优选例中，所述嵌合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1或5或6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1或5或6所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有线粒体定位及质子泵活性；

(C)将SEQ ID NO:1或5或6中任一所示氨基酸序列经过1-15个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有线粒体定位及质子泵活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或5或6所示。

在另一优选例中，所述嵌合蛋白具有线粒体定位及质子泵活性。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述序列编码本发明第一方面所述的嵌合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列。

在另一优选例中，所述的DNA序列选自下组：基因组序列、cDNA序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为mRNA或cDNA，并且所述多核苷酸具有式II或式III所示结构：

A1-A2-A3 (II)

式中，A1为编码上述Z1元件的核苷酸序列；

A2为编码上述Z2元件的核苷酸序列；

A3为编码上述Z3元件的核苷酸序列；

“-”为元件A1、A2和A3之间的连接键；

B0-B1-B2 (III)

式中，B0为编码上述P0元件的核苷酸序列；

B1为编码上述P1元件的核苷酸序列；

B2为编码上述P2元件的核苷酸序列；

“-”为元件B1和B2之间的连接键。

在另一优选例中，所述A1元件为对应于登录号为AF349993_1的第1-342位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述A2元件为对应于登录号为WP_014952819的第358-510位或358-603位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述A3元件为对应于登录号为AF349993_1的第496-747位或586-747位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述B0元件为对应于登录号为AF349993_1的第1-96位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述B1元件为对应于登录号为WP_014952819的第112-288位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述B2元件为对应于登录号为AF349993_1的第274-747位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1或5或6所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:4或7或8所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:4或7或8所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:1或5或6任一所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明第三方面提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述的嵌合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的嵌合蛋白；和

分离所述嵌合蛋白。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，包括：

本发明第一方面所述的嵌合蛋白；和药学上可接受的载体。

本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的嵌合蛋白的用途，用于制备一药物或制剂，所述药物或制剂用于(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化。

在另一优选例中，所述神经退行性疾病选自下组：帕金森氏疾病、线粒体脑肌病、脊髓性肌萎缩症、或其组合。

本发明第八方面提供了一种(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的嵌合蛋白。

在另一优选例中，所述的嵌合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。

在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性目的。

在另一优选例中，所述方法在光照下进行。

本发明第九方面提供了一种突变型嵌合蛋白，所述的突变型嵌合蛋白为非天然蛋白，且所述突变型嵌合蛋白在对应于SEQ ID NO.:1的本发明第一方面所述嵌合蛋白的选自下组的一个或多个与线粒体定位和质子泵活性相关的核心氨基酸发生突变：

第196位甘氨酸(G)；和/或

第137位甘氨酸(G)。

在另一优选例中，所述第196位甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)；和/或

第137位甘氨酸(G)突变为苏氨酸(T)。

在另一优选例中，所述突变型嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如196位、137位氨基酸)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变型嵌合蛋白仍具有线粒体定位及质子泵活性。

在另一优选例中，与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

在另一优选例中，所述突变型嵌合蛋白具有选自下组的一个或多个特征：

(a)与野生型的GPR蛋白或APR蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白在原核细胞(如大肠杆菌)中的质子泵活性提高了1.2-2倍。

(b)与嵌合蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白在原核细胞(如大肠杆菌)中的质子泵活性提高了1-2倍。

(c)与嵌合蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白在真核细胞(如HEK293t细胞)中的质子泵活性提高了1-2倍；

(d)与野生型APR蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白在真核细胞(如HEK293t细胞)中，在光照下的光电流提高了1-2倍；

(e)与嵌合蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白在真核细胞(如HEK293t细胞)中，在光照下的光电流提高了1-2倍；

(f)与嵌合蛋白相比，所述突变型嵌合蛋白显著提高了对神经元动作电位的抑制作用。

本发明第十方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第九方面所述的突变型嵌合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:1或5或6或2任一所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在突变型嵌合蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。

本发明第十一方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明第十二方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第十一方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第十方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如人细胞、酵母细胞或植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为人细胞(如HEK293t细胞)。

本发明第十三方面提供了一种产生本发明第九方面所述突变型嵌合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第十二方面所述的宿主细胞，从而表达出突变型嵌合蛋白；和

分离所述突变型嵌合蛋白。

本发明第十四方面提供了一种蛋白制剂，所述蛋白制剂包含本发明第九方面所述的突变型嵌合蛋白。

在另一优选例中，所述蛋白制剂包括酶制剂。

在另一优选例中，所述的蛋白制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

本发明第十五方面提供了一种本发明第九方面所述的突变型嵌合蛋白或本发明第十二方面所述的宿主细胞的用途，用于制备一药物或制剂，所述药物或制剂用于(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化。

本发明第十六方面提供了一种(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第九方面所述的突变型嵌合蛋白。

在另一优选例中，所述的突变型嵌合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。

在另一优选例中，所述的对象是人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性目的。

在另一优选例中，所述方法在光照下进行。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同质子泵型视紫红质的定位情况。(A)显示了用于筛选的不同来源的质子泵型视紫红质的进化树分析；(B)显示了构建线粒体定位质子泵型视紫红质的策略，以皮尔森共定位系数衡量其定位线粒体的效率；(C)显示了不同视紫红质的定位视紫红质的定位系数，非线粒体定位的共定位系数小于0.6，线粒体定位的定位系数大于0.6。

图2显示了不同GPR和APR嵌合体的质子泵活性及线粒体定位的效率。(A)不同嵌合体的构建策略；(B)显示了嵌合体的质子泵活性及其对应的线粒体定位的效率；(C)比较了不同嵌合体的综合质子泵活性及其对应的线粒体定位的效率。

图3显示了突变型嵌合蛋白在原核细胞、真核细胞及神经元中相比于APR及嵌合体蛋白光质子泵活性的增强作用。(A)突变型嵌合蛋白相比于APR及GPR所改变的4-5号跨膜区序列。(B)双突变型嵌合蛋白相比于APR，GPR，嵌合体蛋白及其单突变在大肠杆菌中的质子泵活性的增强；(C)突变型嵌合蛋白相比于嵌合体蛋白及嵌合体蛋白单突变在293t中的质子泵活性的增强；(C)突变型嵌合蛋白相比于嵌合体蛋白在神经元中的质子泵活性的增强。

图4显示了线粒体定位的突变型嵌合蛋白在真核细胞系中代谢增强和调亡抑制作用。(A-C)显示了线粒体定位的突变型嵌合蛋白在COS7中表达能够保持线粒体的正常形态和膜电压，提示突变型嵌合蛋白没有细胞毒性作用；(D)显示了转染突变型嵌合蛋白细胞纯化的线粒体在体外仍具有光质子泵活性；(E)显示了转染突变型嵌合蛋白细胞在光照刺激下能够提高线粒体的膜电压；(F)显示了转染突变型嵌合蛋白细胞在无糖和高糖培养条件下，光照对其胞内ATP的影响；(G)显示了转染突变型嵌合蛋白细胞鱼藤酮处理条件下，光照对细胞LDH释放的影响；(H)未转染突变型嵌合蛋白细胞在无糖和高糖培养条件下，光照对其胞内ATP的影响；(I)转染突变型嵌合蛋白细胞在无糖和高糖培养条件下，光照对细胞LDH释放的影响。

图5显示了线粒体定位的突变型嵌合蛋白在线虫中保护多巴胺能神经元及缓解线虫帕金森氏疾病表型。(A)线粒体定位的突变型嵌合蛋白在线虫多巴胺能神经元中的表达；(B)鱼藤酮处理条件下线虫头部神经元(CEPs)数目的百分比。光照并补充反式视黄醛下，线虫头部神经元平均值高于黑暗下补充反式视黄醛及光照下无反式视黄醛下的线虫CEP数目；(C)光照对鱼藤酮处理的mt-EcGPAR线虫在2min内运动轨迹长度的影响。

具体实施方式

通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，意外的筛到了具有线粒体定位和更优异的质子泵活性的视紫红质及其突变蛋白。并且本发明人还发现，本发明的视紫红质及其突变蛋白还具有以下特性：(i)促进线粒体定位；(ii)促进质子泵活性；(iii)治疗神经退行性疾病；和/或(iv)降低多巴胺神经元的退化。此外，本发明人还发现，在光照下，还可减缓在mt-EcGAPR线虫中鱼藤酮诱导的帕金森疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“L87I”表示第87位的氨基酸L突变为I，以此类推。

GPR基因和蛋白

在本发明中，GPR可来自非人哺乳动物(如灵长目或啮齿动物)或人。一种代表性的GPR基因及其所编码GPR蛋白的氨基酸序列见AF349993_1(genbank登录号)。以人GPR基因为例，它编码一个具有249个氨基酸的膜蛋白，该蛋白具有光质子泵活性。

APR基因和蛋白

在本发明中，APR可来自非人哺乳动物(如灵长目或啮齿动物)或人。一种代表性的APR基因及其所编码APR蛋白的氨基酸序列见WP_014952819(genbank登录号)。以人APR基因为例，它编码一个具有255个氨基酸的膜蛋白，该蛋白具有光质子泵活性。

嵌合蛋白、基因和转录本

在本发明中，“嵌合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明嵌合蛋白”可互换使用，指具有人嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1或5或6)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的本发明的嵌合蛋白。

在本发明中，代表性的所述嵌合蛋白为GPR蛋白突变体，所述GPR突变体中的4-5号跨膜区被APR蛋白的第4-5号跨膜区替代，或所述GPR突变体中的4-6号跨膜区被APR蛋白的4-6号跨膜区替代；或所述GPR突变体中的1-2号跨膜区被APR蛋白的1-2号跨膜区替代，在一优选实施方式中，本发明的嵌合蛋白如式I或式IV所示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的嵌合蛋白或多肽”是指本发明的嵌合多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明的嵌合蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的嵌合多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人嵌合蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人嵌合蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人嵌合多肽”指具有人嵌合蛋白活性的SEQ ID NO:1或5或6序列的多肽。该术语还包括具有与人嵌合蛋白相同功能的、SEQ ID NO:1或5或6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人嵌合蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人嵌合DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人嵌合多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人嵌合多肽或其片段与其他多肽所形成的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人嵌合多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人嵌合多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人嵌合蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人嵌合多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人嵌合蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1或5或6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表I

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:4或7或8所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1或5或6的蛋白质，但与SEQ ID NO:4或7或8所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1或5或6的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明蛋白的制备

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人嵌合核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或嵌合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的嵌合多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人嵌合多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

肽接头

本发明提供了一种嵌合，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对嵌合蛋白的稳定性的影响。

连接肽的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地1-5个氨基酸。

药物组合物及施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的嵌合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的嵌合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对肿瘤患者，通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明突变蛋白及其编码核酸

如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明突变型嵌合蛋白”、“突变型嵌合蛋白”可互换使用，均指非天然存在的突变型嵌合蛋白，且所述突变蛋白为基于SEQ ID NO.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与线粒体定位及质子泵活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有催线粒体定位及质子泵活性。

术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO.:1，且与SEQ ID NO.:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO.:1所示的序列，核心氨基酸为：

第196位甘氨酸(G)；和/或

第137位甘氨酸(G)。

优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变：

所述第196位甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)；和/或

第137位甘氨酸(G)突变为苏氨酸(T)。

应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.:1)的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似功能的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据上述表I进行氨基酸替换而产生。

本发明的活性突变蛋白具有线粒体定位和质子泵活性。

优选地，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:2所示。应理解，本发明突变蛋白与SEQ IDNO.:2所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQID NO.:2所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

表达载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；人细胞如HEK293t细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明的主要优点包括：

(i)经大量筛选和改造，本发明首次发现了本发明的突变型嵌合蛋白的具有线粒体定位和质子泵活性的活性位点，并且改造了相关位点后，能够显著提高质子泵活性，降低多巴胺神经元的退化，缓解鱼藤酮诱导的帕金森疾病，治疗神经退行性疾病。

(ii)本发明首次发现将APR蛋白的4-5号或4-6号或1-2号跨膜区替换GPR蛋白的4-5号或4-6号或1-2号跨膜区，可显著促进线粒体定位，提高质子泵活性，降低多巴胺神经元的退化，缓解鱼藤酮诱导的帕金森疾病，治疗神经退行性疾病。

(iii)本发明还发现在本发明的嵌合蛋白基础上进行一个或多个与线粒体定位和质子泵活性相关的核心氨基酸的突变(如G196S、和/或G137T等)，可显著提高质子泵活性，降低多巴胺神经元的退化，缓解鱼藤酮诱导的帕金森疾病，治疗神经退行性疾病。

(iv)本发明首次发现G196S和G137T同时突变对于增强质子泵活性有协同作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

材料和方法

1.分子生物学与定点突变

根据Homo sapiens的密码偏好性，全合成了bacteriorhodopsin(BR,AccessionID:P02945),deltarhodopsin(HtdR,Accession ID:O93740),xanthorhodopsin(WP_007675008),Gloeobacter rhodopsin(GR,Accession ID:WP_011140202)和Alphaproteorhodopsin(APR,Accession ID:WP_014952819)的DNA序列。Archaerhodopsin T(ArchT,Accession ID:ABT17417.1)和Green absorbing proteorhodopsin(GPR,Accession ID:AF349993_1)的基因序列来自于Addgene。Coccomyxa rhodopsin(CsR,Accession ID:I0YUS5)基因由Arend Vogt教授(Insitut für Biologie ExperimentelleBiophysik)赠送。

利用SalI和BamHI将菌视紫红质基因克隆至pEGFPN1载体，构建细胞膜定位的菌视紫红质质粒。为使菌视紫红质定位至线粒体，利用NheI和Sal I将4段重复的线粒体内膜蛋白细胞色素氧化酶c(cox8，NP_004065)的1-29氨基酸残基序列与菌视紫红质N末端融合。为使菌视紫红质在E.coli中表达，利用NcoI和BamHI将菌视紫红质基因克隆至pet28c(+)载体。APR和GPR的嵌合体通过重叠PCR(overlapping-PCR)的方法进行克隆。为了使菌视紫红质在C.elegans中表达，利用SalI和BamHI将dat-1启动子(-1326～-1)克隆至ppd95.75载体中，再用BamHI和AgeI将mt-EcGAPR或4cox8序列插入载体中。点突变采用megaprimer两步PCR法。

2.膜片钳记录

利用Axopatch 200B放大器(Molecμlar Devices)在室温下以全细胞膜片钳方式记录HEK293t细胞及神经元的电流或电压,信号经数模转换器DigiData1440A(MolecμlarDevices)输送至电脑，数据采样频率为10000Hz。用水平拉针仪拉制带芯毛细管(SutterInstrument，内径0.86mm，外径1.5mm)至电阻为3-6MΩ的玻璃微电极。玻璃微电极内灌注细胞内液：potassium gluconate 120mM,KCl 3mM,HEPES 10mM,NaCl 8mM,CaCl₂ 0.5mMEGTA5mM,ATP-Mg 2mM,GTP 0.3mM,pH 7.2。玻璃微电极用微操纵仪MP-285(SutterInstrument)定位。用于记录的细胞外液为Tyrode’s buffer：NaCl 145mM,KCl 3mM,HEPES10mM,glucose 10mM,pH 7.4。磷酸钙沉淀法转染HEK293t细胞后1h加入1μM全反式视黄醛，37℃,5％CO2/95％air培养箱中培养12-16h后，记录细胞电流。如未特别指出，HEK293t细胞的光电流均钳制在0mV下记录。神经元在体外培养第4天或第5天(div 4-5)进行磷酸钙沉淀法转染，培养至体外第8-12天后(div 8-12)用于实验。神经元钳制在-70mV,利用电流钳模式记录膜电位。通过氙灯产生的光源经单色仪(Cairn Research Ltd.,UK)处理后产生的特定波长的光用于刺激细胞。设置protocol促发单色仪实现带宽20nm，波长由350nm至750nm连续变化的300ms的光脉冲，单色仪的光通过40倍镜头照射至细胞上，光照强度为3.315mWmm^-2，记录在不同光谱下的光电流。记录绝对光电流时，设置protocol促发532nm激光(Dreamlasers)产生500ms，间隔500ms的10个光脉冲，光通过40倍镜头照射至细胞上，光强度为130mW mm^-2，记录光电流的大小。记录不同膜电压下的光电流时，设置protocol使电压由40mV降至-80mV，每次下降20mV，每次记录时促发532nm激光产生1s，间隔1s的10个光脉冲，记录光电流的大小。记录光诱导的神经元动作电位抑制时，注射电流以引起动作电位的产生，记录时同时促发532nm激光产生1s，间隔1s的10个光脉冲，记录光下膜电压的变化。

3.菌视紫红质在大肠杆菌中的异源表达

菌视紫红质表达质粒(pet28c载体)转化E.coli(stain BL21,DE3)，挑转化子至2ml含30ug/ml kanamycin的LB培养基中，37℃摇床培养，直至菌液在600nm的吸光度达到0.8。加入诱导剂IPTG(1mM)和全反式视黄醛(10uM)，28℃摇床培养18h。将菌液离心，若菌视紫红质表达，则菌沉淀呈现红色至紫红色，以此判断菌视紫红质是否正确表达，不能正确表达的菌视紫红质呈现菌自身的淡黄色。

4.光照下菌液pH变化的测定

室温8000g离心10min收集表达菌视紫红质的大肠杆菌，将其重悬至无缓冲能力的溶液(150mM NaCl,50mM MgSO₄)中，调整浓度使其达到0.1g/ml。利用532nm激光照射至菌液上，控制激光强度，使照射至菌液的光强度为37.18mW mm^-2。菌液中插入微小pH电极，并同时用温度探头测量温度变化，以进行温度矫正。温度探头与温度控制器(Warner)连接，pH电极输出模拟电压值，信号经数模转换器DigiData1440A传递至电脑，记录溶液的pH及温度的变化。通过AxoScope 10.4(Axon Instruments)软件控制，数据采样频率为1000Hz。pH值通过以下公式进行计算：

V_ref表示溶液pH为7.0时电极的模拟电压值；V_pH表示被测溶液的pH的模拟电压值；R为气体常数；T为所测得的摄氏温度；F为法拉第常数。

通过532nm激光产生3个光脉冲(532nm,37.18mW cm^-2,pμlse duration:2min,pμlse interval:2min)，测量在2min光照下菌液pH的变化大小来衡量不同菌视紫红质的光质子泵活性。通过比较不同菌视紫红质pH的变化与APR pH的变化确定其质子泵相对强度。对于CCCP实验，菌液中加入10μM CCCP黑暗室温放置20min后再记录pH变化。

5细胞系培养与转染

HEK293t和COS7胞在10％FBS DMEM(Dμlbecco’s modified Eagle medium)，37℃，5％CO2下培养。

利用磷酸钙沉淀法进行瞬时转染。将待转染的细胞转移至无血清DMEM中处理40min。配置钙转体系：质粒10μg，2.5M CaCl₂ 5μl，ddH₂O补充至40μl。将40μl 2xHEBS在漩涡混匀器上加入质粒中，向混合液中吹入气泡，静置13min。将混合液滴入培养基中，轻轻混匀后37℃，5％CO2下放置1h。吸走无血清DMEM培养基，加入15％甘油(in PBS，v/v)作用30s，PBS洗一遍，加入10％FBS DMEM 37℃，5％CO₂下培养。

利用电穿孔法稳定转染COS7。细胞用胰酶消化后重悬至700μl PBS中成单细胞悬液，移入4mm电转杯，加入20ug高纯度质粒，冰浴5min，电转条件：175V，100ms，2pluse，1sinteval。电转后细胞在37℃，5％CO2下培养。2d后加入0.7～1mg/ml Geneticin，5d后未转染的对照细胞全部死亡，转染后的细胞有细胞存活。将存活的单克隆消化，并在96孔板中稀释至单细胞，在0.7～1mg/ml Geneticin 10％FBS DMEM中继续培养，每3d换一次液。当单细胞生长至一定密度后，转移至24孔板，继续培养，维持G418筛选浓度，荧光显微镜检查其表达情况，选取表达量最高，传代比率最高的细胞克隆，在0.7mg/ml Geneticin 10％FBSDMEM继续培养，直至4周以上仍具有较好的表达,则认为稳定转染成功。稳定转染的细胞系在10％FBS DMEM中培养，外源基因不会丢失。

6共聚焦成像与共定位分析

实验室拍照所用激光共聚焦系统FLUOVIEW(Cat No：FV1000)和倒置显微

镜(Olympus，Cat No：IX81)。活细胞图像采集所用溶液为Tyrode：NaCl，8.4738g，KCl，3ml(1mol/L)，HEPES，2.383g，Glucose，1.8g，溶于1L ddH2O中，pH7.4。所用试剂均购自Sigma公司。

线粒体共定位用image J插件colocal ization indices进行分析。

7细胞线粒体分离

采用差速离心法提取细胞线粒体。细胞用胰酶消化后，1000rpm离心5min,PBS洗2遍。用线粒体提取buffer(250mM sucrose,5mM HEPES,1mM EGTA,pH7.4)重悬线粒体，置于4℃下玻璃匀浆器中手动匀浆，台盼蓝检测细胞破碎的程度，当染色后90％的细胞都呈蓝色时，停止匀浆，过度匀浆可能会造成线粒体膜的破损，必须避免，一般下上匀浆30次即可。将匀浆后的溶液转移至EP管，3000rpm 4℃离心5min。吸取上清，丢弃未破碎的细胞及细胞核。上清可再次3000rpm 4℃离心5min，以进一步去除沉淀。最后得到的上清在13000rpm 4℃离心30min，得到粗线粒体。粗线粒体可用于pH的测定。

8光照下线粒体pH变化的测定

将得到的粗线粒体用重悬至无缓冲能力的溶液(150mM NaCl,50mM MgSO4)中。利用532nm激光照射至溶液上，控制激光强度，使照射至菌液的光强度为37.18mW mm^-2。溶液中插入微小pH电极，并同时测量温度变化，以进行温度矫正，通过digiData将信号传递至电脑，记录溶液的pH变化。通过测量在2min光照下溶液pH的变化。

9ATP含量的测定

稳转细胞系和对照细胞系在35mm dish，10％FBS DMEM中培养直至汇合度达到70％-80％。将10％FBS DMEM换成含1μM反式视黄醛的高糖或无糖DMEM培养基，37℃继续培养18h。检测前将培养基替换为Tyrode或PBS溶液(加入12μM CaCl₂，12μM MgCl₂)，在室温(25℃)下光照2h。裂解细胞，检测细胞中总的ATP水平。

ATP合成检测采用荧光素酶-荧光素的方法，具体操作按照ATP Assay Kit(Beyotime)说明书进行。将酶溶液与荧光素溶液以1：5混合成工作液。工作液加入96孔黑色微孔板，每个样品设置3个副孔，以1：10(V/V)加入细胞裂解液，酶标仪检测化学发光强度，独立重复3次实验。

10鱼藤酮处理及细胞LDH释放的测定

LDH的检测是利用乳酸脱氢酶催化乳酸和NAD⁺生成丙酮酸和NADH，生成的NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)的催化下生成NAD⁺和生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。

稳转细胞系和对照细胞系接种在2个96孔板中，直至细胞密度达到60％-70％。在鱼藤酮处理前，将10％FBS DMEM培养基替换为100μl含1μM反式视黄醛的1％FBS DMEM，加入1μM鱼藤酮或相同体积的DMSO作为对照，每个处理都设置3个副孔，37℃继续培养18h。检测前，光照组在培养箱中用白光照射2h，后黑暗静止30min。光照结束后，400g离心5min，吸取80μl上清，加入至新96孔版中，每孔加入现配好的工作液40μl，室温摇床孵育30min。检测上清中细胞释放的LDH水平。具体操作按照LDH assay kit(Beyotime)说明书进行，独立重复3次实验。

11线虫的培养、传代与冻存

11.1培养基(NGM)的配制

线虫生长培养基(NGM)的配制(700ml)：

Peptone 1.8g

NaCl 2.1g

Agar 11.9g

121℃灭菌20min,后加入

1M KPO₄buffer 17.5ml

1M MgSO₄ 350μl

1M CaCl₂ 350μl

5mg/ml胆固醇 350μl

其中1M KPO₄buffer(1000ml)：

KH₂PO₄ 10.839g

K₂HPO₄ 3.569g

pH 6.0

摇匀后在无菌操作下倒入培养皿中(60mm平板需NGM培养基8ml),室温(20-25℃)放置2天后涂菌。

11.2加药NGM的配制

给药组NGM培养基的配制与对照组相同,但在配制培养基中加入4uM鱼藤酮,其它与对照组相同。给药组NGM平板在涂菌时按照比例在菌液中加入4uM鱼藤酮,使菌液中的鱼藤酮浓度与NGM中的鱼藤酮浓度一致,涂菌方法与对照组相同。

11.3涂菌

E.coli OP50大肠杆菌菌株的单克隆于2ml的低盐LB液体培养基中,37℃过夜培养。然后按l:10的比例扩大至新的低盐LB液体培养基中,37℃继续培养至OD600至0.4-0.6。在NGM平板上加入大肠杆菌菌液(60mm平板加200μl),缓慢转动平板使菌液散开，并要注意菌液不要碰到平板的边缘,涂菌后,NGM平板在室温下放置2天后可使用。不使用的平板放在4℃冰箱中保存，以防平板水分蒸发而干裂。每次用前先取出平板,于室温中放置1小时后可使用。

11.4线虫的培养

线虫的生命周期可分为胚胎期、生长期、生殖期和生殖后期四个时期。从受精卵发育成幼虫L1期的过程称为胚胎发育期。而胚胎后期发育包括了Ll、L2、L3、L4四个幼虫期,最后蜕皮变成成虫。20℃下，线虫的发育周期约为3.5d。25℃条件下不到3d,在15℃条件下需要约6d。当线虫处在缺乏食物等不利环境时,会在幼虫L2期进入dauer期而不进入L3期。Dauer现象是线虫抵御不利环境的一种方式,dauer期的线虫比L3期幼虫瘦小一些,并可以长时间(几个月)保持这种滞育状态。当环境恢复后,dauer期的线虫可以经过蜕皮直接进入到幼虫L4期。实验中用野生型雌雄同体线虫,线虫于NGM平板上,在20℃恒温培养箱中培养。

11.5线虫的转基因

从食物充足NGM平板上挑取50条左右的无卵的L4线虫至新的NGM平板上。显微注射2h前，准备好固定线虫用的琼脂糖板。将加热融化好的2％Agarose(溶于ddH₂O)，滴在24x50mm盖玻片上，用另一个盖玻片覆盖，待琼脂糖凝固后，揭去盖玻片，放置在37℃下待用。用水平拉针仪拉制带芯毛细管(内径0.5mm，外径1mm)至末端封闭的玻璃微注射针。配制转基因质粒体系：10ng/μl目的基因质粒，10ng/μl marker质粒，90ng/μl ppd95.75空载质粒，ddH₂O补至10μl。转基因体系Mix在13000rpm 4℃离心10min，使体系中杂质沉降，并注意不要振动离心好的混合体系，以防溶液中细小的杂质堵塞玻璃微注射针。滴1滴硅油至盖玻片，将另一盖玻片覆盖，使两片盖玻片相互部分重叠。将拉制好的玻璃微注射针末端(非尖端)浸入混合体系中，使溶液通过毛细作用吸至尖端。将微注射针固定在微操作仪持针器上，打开气阀，调节压力至60psi。在低倍镜下找到微注射针尖端，使其与盖玻片相互部分重叠形成的缝隙位于同一平面，用微注射针尖端撞击盖玻片缝隙，使尖端断开，按动气压踏板，使液滴通过气压打出，调节压力，使打出的液滴直径大约与线虫直径相同。在准备好的固定线虫用的琼脂糖板上滴一滴硅油，将待注射的线虫用毛笔挑在油中，用毛笔将线虫固定在琼脂板上，使其两端性腺暴露。在高倍镜找到线虫，微注射针刺入性腺，按动气压踏板，通过气压将质粒打入性腺中。打完的线虫滴一滴M9buffer，让其恢复一段时间后挑至新的NGM平板上20℃培养，每个平板4～5条线虫。4d后，在荧光体式镜下找有荧光的F1线虫，并将其挑至新的NGM平板上，每个平板挑1条带荧光线虫。4d后，观察F2线虫的传代情况，选取传代比率最高的一株线虫，进行后续实验。将传代较好的线虫，扩大培养并冻存。

线虫的冻存:通过培养使线虫处于轻微饥饿状态并处在L2期(这种线虫在冷冻的条件下存活率高)。在培养线虫的平板上加M9缓冲液,并使缓冲液在培养基表面上流动,则线虫都处在缓冲液中。在冻存管中加入600μl含有线虫的缓冲液,再加入600μl冻存缓冲液混匀。冻存管可保存于-80℃冰箱中,如果在液氮中则能保存更长时间。

M9缓冲液:

Na₂HPO₄ 0.6g

KH₂PO₄ 0.3g

NaCl 0.5g

MgSO₄ 0.025g

加水至100ml

线虫冻存缓冲液:

KH₂PO₄ 1.36g

NaCl 1.17g

甘油 60ml

加蒸馏水至200ml,灭菌后加入

0.1M MgSO₄ 0.6ml

11.6线虫的同步化

为了保证实验时线虫处于同一生长时期，需要对线虫进行同步化处理。小规模线虫同步化方法(也可用于去除杂菌、霉菌等污染)：将10μl碱性次氯酸钠溶液(bleach液)滴在新的NGM平板无菌处，挑取10～20只产卵期线虫至液滴中，几分钟过后，线虫裂开，卵释放至体外。bleach液滴会很快蒸发干，由于虫卵对bleach液不敏感，虫卵孵化后即为为同一发育时期的线虫。大规模线虫同步化方法：培养大批产卵期线虫。用蒸馏水冲洗平板上的线虫,将液体收集于管中。放置或轻微离心后吸走上清,合并各管的线虫,转移至1.5ml EP管中,轻微离心后留10μl上清,其余的上清吸走。EP管中加600μl蒸馏水和300μl线虫裂解液。室温放置10min,期间每2min涡旋一次。10min后8000rpm离心5min,去上清。无菌操作下向EP管中加l ml灭过菌的蒸馏水或M9缓冲液,涡旋后离心,重复洗两遍。冲洗完毕的虫卵重新以M9缓冲液悬浮,混匀后将悬浮液分到数个平板上。NGM平板中的卵孵化后即为同一发育时期的线虫。

线虫裂解液:

NaOH 0.29

lml 蒸馏水溶解

10％NaClO 2ml

11.7线虫的光照处理与神经元退化的检测

在4uM鱼藤酮NGM平板上涂含4μM鱼藤酮和500μM ATR的E.coli OP50菌液。未整合入视蛋白的视黄醛对光及温度都极敏感，因此含视黄醛的平板应现用现配，以防视黄醛失效，视黄醛整合入视蛋白就比较稳定。同步化线虫在4uM鱼藤酮NGM培养基上生长5-7d。线虫接种至含反式视黄醛的平板后，在黑暗处放置18h，使线虫充分吸收视黄醛。在光照下培养线虫2d，光照条件为,绿光(532nm)。

成像时，将线虫挑至滴有2％叠氮化钠琼脂糖板的液滴中，使线虫麻醉，用挑虫针摆正线虫，荧光共聚焦显微镜成像。计数头部CEP神经元，正常线虫含4个对称分布的神经元，其树突从神经环延伸至头部最前端。每个实验组统计约20条线虫。

11.8线虫行为学实验

比较光照和黑暗下，在鱼藤酮和ATR的NGM平板上生长的转基因线虫的运动情况。分析运动前，每个平板分别挑10～20条线虫至新的正常NGM平板上，使其适应1～2h。分析运动时，每条线虫单独调至未涂菌的NGM平板，使其适应后，用体式显微镜拍摄其在2min内的运动情况。ImageJ分析线虫的运动轨迹，统计10～20条线虫在2min内运动轨迹的长度。

实施例1质子泵型视紫红质的分子筛选

对8个来自于不同谱系的质子泵型视紫红质进行了研究。根据一级序列可以将其分为3个家族，Bacteriorhodopsin(BR),Archearhodopsin T(ArchT),deltarhodopsin(HtdR)属于噬盐古菌，Coccomyxa rhodopsin(CsR)属于北极淡水胶球藻属。Xanthorhodopsin(XR)和Gloeobacter rhodopsin(GR)属于噬盐真细菌，Greenproteorhodopsin(GPR)和alpha proteorhodopsin(APR)属于海洋变形杆菌(图1A)。为了衡量其质子泵活性，在293t细胞上记录了其电流光谱和光电流大小。8个质子泵型视紫红质都能在光照下抑制神经元动作电位的发放。

视紫红质是高度疏水的膜蛋白，之前的研究指出，视紫红质可以与囊泡蛋白或溶酶体蛋白融合从而定位至囊泡或溶酶体。由于视紫红质的疏水性，SRP识别从核糖体上新合成的肽链，当识别到信号序列(疏水区)时，SRP中止肽链合成，SRP与内质网上的SRP受体结合，将合成的蛋白转移至转运通道(translocon),肽链继续合成，膜蛋白以囊泡的形式运输至靶区域。一般认为线粒体蛋白都是通过后转移进入线粒体，在胞质核糖体上合成的线粒体蛋白，在伴侣蛋白的帮助下，被线粒体外膜上的受体识别后，通过线粒体蛋白上的蛋白转运复合体，进入线粒体。

为了使视紫红质定位线粒体，4次重复的线粒体内膜蛋白细胞色素c氧化酶VIII信号肽序列(mt,4cox8)与视紫红质N端融合，进而分析视紫红质与线粒体的共定位(图1B)。BR,HtdR,ArchT,CsR,GR,XR均不能定位线粒体，皮尔森共定位系数在0.6以下，这些视紫红质定位在内质网、高尔基体及质膜。变形菌视紫红质(APR,GPR)具有最高的线粒体定位，皮尔森共定位系数大于0.6。为了评价视紫红质的细胞器定位，我们对不同细胞器定位的标记蛋白与线粒体的定位系数进行了比较，非线粒体定位的共定位系数小于0.6，线粒体定位的定位系数大于0.6(图1C)。

实施例2菌视紫红质嵌合体的构建

构建同一家族蛋白的嵌合体被用于研究蛋白质内部的长程作用。为了找到使变形菌视紫红质定位线粒体的原因，本发明构建了不同视紫红质与GPR的嵌合体，并研究其线粒体定位与质子泵活性。替换ArchT或GR与GPR的1-3号跨膜区构成的嵌合蛋白在E.coli中表达不能形成具有功能的蛋白，提示嵌合蛋白可能由于两种视紫红质的差异，不能够很好地折叠。通过大量筛选，筛到了APR与GPR的嵌合体。通过替换GPR和APR的不同跨膜区，构建了21个不同的嵌合体(图2A)，并研究其线粒体定位与质子泵活性。其中157嵌合体不能形成具有功能的蛋白，可能与其不能够很好地折叠有关。

通过在E.coli中表达不同的嵌合体蛋白，给予光照，利用pH计测定其在2min内pH的变化，根据APR的pH的变化进行标准化，比较不同嵌合体蛋白的质子泵活性。通过信号肽与嵌合体N端的融合蛋白在COS7细胞中的定位，比较不同嵌合体蛋白的线粒体定位。

在21个嵌合体中，只有6个嵌合体定位至线粒体，大部分的嵌合体都定位在内质网，高尔基体。根据其定位情况可以将其分为4个类群。在定位线粒体的视紫红质中，大部分的嵌合体蛋白质子泵活性相比于APR和GPR都下降。利用加权指数(以质子泵活性(pH变化相对值)与皮尔逊共定位系数的权重比设置为1：2)来综合衡量嵌合体的质子泵活性与其相对的线粒体定位效率，嵌合体1467、0127和1457的指数值高于GPR，说明这几个嵌合体同时具有较好的线粒体定位及较高的质子泵活性，其中嵌合体1457(GPR的4-5号跨膜区被相对应的APR的跨膜区所替换)的加权指数最高，将其命名为cGAPR(chimeric GPR and APR)(图2，B-C)，氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示，嵌合体1467(GPR的4-6号跨膜区被相对应的APR的跨膜区所替换)，将其命名为cGAPR46，其氨基酸序列如SEQID NO.:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示，嵌合体0127(GPR的1-2号跨膜区被相对应的APR的跨膜区所替换)，将其命名为cGAPR12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

不同的嵌合体线粒体的定位表明，视紫红质定位线粒体是一个复杂的问题，替换单独的一段跨膜区都有可能影响线粒体定位。在所有定位线粒体的嵌合体中，helix A和helix G均为GPR的跨膜区，提示GPR的这两段跨膜区可能对于线粒体定位具有重要作用。

实施例3联合点突变提高嵌合体菌视紫红质的光质子泵活性

为了进一步提高嵌合体cGAPR的质子泵活性，对视黄醛附近的51个氨基酸残基进行了研究，发现嵌合体的双突变cGAPR(G137T,G196S)能够显著提高其光电流(光电流反映了质子泵活性),将其命名为EcGAPR(enhanced chimeric GPR and APR)(图3A)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。EEcGAPR在E.coli和293t细胞中均表现为比cGAPR具有更高的光质子泵活性(图3，B-C)。在小鼠海马神经元中表达cGAPR，在光照下不能抑制神经元动作电位的发放，而在神经元中表达EcGAPR，能够在光照下抑制神经元动作电位的发放(附图3，D-E)(图中绿色短线表示给予光照)。同时，EcGAPR相比于cGAPR其线粒体定位没有明显改变。因此本发明用EcGAPR进行进一步的研究。

实施例4 EcGAPR在线粒体内膜上能够保持其光质子泵活性

在COS7细胞中构建了mt-EcGAPR的稳转细胞系，并在光照下研究其特性。mt-EcGAPR稳转细胞系具有正常的线粒体形态及膜电压。图4的A-C显示了线粒体定位的突变型嵌合蛋白在COS7中表达能够保持线粒体的正常形态和膜电压，提示突变型嵌合蛋白没有细胞毒性作用。为了验证其在线粒体上的功能，我们提取了稳转细胞系的线粒体，并在光照下用pH计测定其pH的变化，利用不表达的细胞系作为对照。在光照下，mt-EcGAPR线粒体外pH下降，说明EcGAPR在线粒体上仍能保持其光质子泵活性(图4D)。用Rodamin 800检测mt-EcGAPR稳转细胞系在光照下线粒体膜电压的变化。光照后，线粒体膜电压发生超极化，超极化程度与细胞初始线粒体膜电压有关。初始线粒体膜电压越高(接近0mV)，超级化程度越高(图4E)。根据化学渗透学说，在光照下EcGAPR产生的质子动力势应该能够转化为ATP。因此我们测定了mt-EcGAPR稳转细胞系在光照下ATP的含量。在正常细胞培养条件下(高糖培养基)，ATP含量在光照情况下并没有明显地上升。而在饥饿条件下(无糖培养基)，ATP含量在光照下明显提高。在正常培养条件下，利用复合体I的抑制剂鱼藤酮处理mt-EcGAPR稳转细胞系，使细胞处于能量缺乏状态，细胞发生调亡，细胞膜破裂，释放LDH。光照后，mt-EcGAPR稳转细胞系释放的LDH明显下降，而不含mt-EcGAPR的细胞系无明显变化。说明在光照下，mt-EcGAPR能够通过光获得能量，使细胞不进入调亡(图4F-I)。

实施例5光照能够减缓在mt-EcGAPR线虫中鱼藤酮诱导的帕金森疾病表型

雌雄同体线虫拥有8个多巴胺神经元：4个对称分布的头部神经元(2个位于腹侧，2个位于背侧)，2个位于头部前端突起，2个位于腹部后端突起。鱼藤酮，作为线粒体复合体I的抑制剂，能够在哺乳动物中诱导帕金森疾病模型。在线虫中，鱼藤酮慢性暴露能够导致多巴胺神经元的退化、线粒体mtDNA的丢失等现象。利用多巴胺能神经元特异性表达的启动子dat-1在多巴胺能神经元中表达mt-EcGAPR，利用鱼藤酮诱导帕金森疾病模型，观察光照对疾病模型的恢复作用。由于线虫自身不能合成视黄醛，在OP50E.coli中加入全反式视黄醛(ATR)，并以不加视黄醛的线虫作为对照。暴露在鱼藤酮中的线虫，5-7d以后，头部神经元(CEP)发生丢失，运动性明显下降。而在补充视黄醛的mt-EcGAPR线虫，在光照下，头部神经元(CEP)丢失相比于对照组显著下降，运动性明显上升。说明光照能够减缓在mt-EcGAPR线虫中鱼藤酮诱导的帕金森疾病表型(图5，A-E)。

针对其他嵌合蛋白，如cGAPR46和cGAPR12做了类似cGAPR的相同的功能研究(比如对cGAPR46和cGAPR12进行突变)，结果表明，对其他嵌合蛋白如cGAPR46和cGAPR12进行突变后得到的效果与cGAPR突变蛋白相当或更显著。

讨论

视紫红质是高度疏水的膜蛋白，在真核细胞中通过分泌合成途径在附着型核糖体上合成。信号识别颗粒(SRP)识别从核糖体上新合的肽链，当识别到信号序列(疏水区)时，SRP中止肽链合成，SRP与内质网上的SRP受体结合，将合成的蛋白转移至转运通道(translocon),肽链继续合成，膜蛋白以囊泡的形式运输至细胞膜。来自于微生物的视紫红质蛋白在真核细胞中表达时，常常会出现在内质网和高尔基体中滞留，而很少表达在质膜上。通过本发明的分析发现，视紫红质本身的序列对于其输入线粒体具有重要影响。

视黄醛周围的残基突变能够影响视紫红质的吸收光谱，以及光敏感性。本发明中的EcGAPR作为GPR和APR的嵌合体，保持了GPR和APR各自的优点，同时具有来自于GR的两个点突变,嵌合体1457的单点突变不能显着增加其质子泵活性，说明Ser196和Thr137对于增强质子泵活性有协同作用。

本发明通过将改造的PPRs表达在线粒体内膜上，发现在营养丰富的高糖培养基下，光照并不能提高细胞内ATP的含量，而在无糖培养基下，光照却能显著提高细胞内ATP的水平，这与在细菌上只有在营养缺乏的条件下光照才能提高细菌的生长速率是相吻合的。由于在营养丰富的高糖培养基中，细胞线粒体膜电压处于正常水平，光照后，通过EcGAPR质子泵的作用，使膜电压进一步上升幅度较低。而无糖培养条件下，细胞线粒体膜电压处于低水平，光照使膜电压上升幅度高。

中脑中的多巴胺能神经元在许多基础和高级脑活动中都具有重要作用，如：自主运动、认知、情绪、奖赏、工作记忆、学习和决策等生理和心理活动。DA中脑系统的功能缺陷与许多神经及心理疾病有关，如：精神分裂、成瘾、多动症及帕金森氏疾病。帕金森氏疾病(PD)是发病率仅次于阿尔茨海默症的第二大神经退行性系统疾病，表现为运动障碍、自主神经功能失调以及心理和认知行为的改变。运动上表现为静息震颤、行动缓慢及间歇性、僵直及平衡性下降。帕金森氏疾病并不能进行诊断测试，只有当黑质致密部60％的多巴胺神经元缺失以后才会表现出运动上的变化。多巴胺神经元的轴突没有髓鞘包裹，对于能量的需求更高，因此相比于其它神经元更易受到环境因素的影响。在帕金森氏疾病中，由线粒体功能的受损导致的ATP下降是多巴胺神经元对PD易感性的关键因素。

帕金森氏疾病的发生是由基因和环境共同相互作用导致的结果。现已表明至少有15个基因与PD有关，然而PD的患者中，基因的突变只占发病人群中的极小一部分。流行病学研究表明，PD的发生与接触某些环境毒物有关，如：杀虫剂(包括鱼藤酮、百草枯、有机氯化合物等)、溶剂(三氯乙烯、四氯乙烯)、重金属元素(铁、铅、锰、汞)及空气污染(Goldman,2014)。1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro-pyridine(MPTP)最早是在哌替啶类似物合成过程中发现的，在松猴中静脉注射MPTP能够导致黑质多巴胺神经元的破坏。MPTP能够穿透血脑屏障，被胶质细胞单胺氧化酶B转化为MPP⁺。MPP⁺被多巴胺运载体运输至多巴胺能神经元，MPP+在细胞中被线粒体吸收，抑制呼吸链复合体I，导致ATP的产生下降，同时产生自由基，导致膜结构的破坏，最终引起细胞能量缺乏及细胞死亡。鱼藤酮和MPTP作用一样，也能导致黑质多巴胺神经元的缺失，胞浆内α-synuclein的聚集，诱导与PD相似的运动缺陷。鱼藤酮具有有限的环境半衰期，并不会通过生物积累，但在生物体中短暂的暴露就能导致进行性疾病。鱼藤酮作为线粒体呼吸链复合体I的抑制剂，能够抑制细胞的呼吸作用，并引起细胞内ATP含量的下降，引起细胞内活性氧的增加，诱导细胞凋亡。加入线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮后能够导致线粒体膜电压的下降，而光照后，EcGAPR通过泵质子，能够形成质子梯度，对线粒体膜电压具有一定的恢复作用，因此能够缓解由鱼藤酮引起的细胞凋亡。在多巴胺神经元线粒体上表达EcGAPR，通过光照能够缓解鱼藤酮处理所导致的PD相似的运动缺陷及多巴胺神经元的退化。EcGAPR在光照下能够形成质子梯度，对线粒体膜电压具有一定的恢复作用，质子梯度通过ATP合酶合成ATP，能够缓解由鱼藤酮引起的细胞能量缺乏状态。

综上所述，通过将光驱动的质子泵表达在线粒体上，可以和线粒体呼吸链复合体一样能够向膜间隙泵质子，不同的是呼吸链复合体泵质子的能量来自于营养物质氧化产生的化学能，需要在有氧条件下才能运转，而EcGAPR泵质子的能量来自于光能，不依赖于O₂，因此在无氧条件下也能够发挥作用。EcGAPR除了能够补充由于线粒体呼吸链复合体缺陷造成的能量缺乏，也可以在细胞缺氧条件下为细胞提供能量。EcGAPR能够在呼吸链蛋白受损伤的情况下在光下为线粒体提供质子动力势，以改善细胞的能量缺乏状态。在环境营养贫瘠的状态下，通过光为细胞提供生长所需能量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 线粒体定位质子泵型视紫红质、其突变蛋白及其应用

<130> P2017-1621

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ser Val Ile Ala Leu Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly Asp Leu Asp Ala Ser Asp Tyr Thr Gly Val Ser

20 25 30

Phe Trp Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ser Thr Val Phe Phe Phe

35 40 45

Val Glu Arg Asp Arg Val Ser Ala Lys Trp Lys Thr Ser Leu Thr Val

50 55 60

Ser Gly Leu Val Thr Gly Ile Ala Phe Trp His Tyr Met Tyr Met Arg

65 70 75 80

Gly Val Trp Ile Glu Thr Gly Asp Ser Pro Thr Val Phe Arg Tyr Ile

85 90 95

Asp Trp Leu Leu Thr Val Pro Leu Leu Ile Cys Glu Phe Tyr Leu Ile

100 105 110

Leu Ala Ala Val Asn Lys Ser Asp Ser Gly Ile Phe Trp Arg Leu Met

115 120 125

Ile Gly Thr Leu Val Met Leu Val Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Ala Gly

130 135 140

Tyr Ile Asn Ala Thr Leu Gly Phe Ile Ile Gly Met Ala Gly Trp Val

145 150 155 160

Tyr Ile Leu Tyr Glu Leu Trp Ala Gly Glu Gly Lys Ser Ala Cys Asn

165 170 175

Thr Ala Ser Pro Ala Val Gln Ser Ala Tyr Asn Thr Met Met Tyr Ile

180 185 190

Ile Ile Phe Gly Trp Ala Ile Tyr Pro Val Gly Tyr Phe Thr Gly Tyr

195 200 205

Leu Met Gly Asp Gly Gly Ser Ala Leu Asn Leu Asn Leu Ile Tyr Asn

210 215 220

Leu Ala Asp Phe Val Asn Lys Ile Leu Phe Gly Leu Ile Ile Trp Asn

225 230 235 240

Val Ala Val Lys Glu Ser Ser Asn Ala

245

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Lys Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ser Val Ile Ala Leu Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly Asp Leu Asp Ala Ser Asp Tyr Thr Gly Val Ser

20 25 30

Phe Trp Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ser Thr Val Phe Phe Phe

35 40 45

Val Glu Arg Asp Arg Val Ser Ala Lys Trp Lys Thr Ser Leu Thr Val

50 55 60

Ser Gly Leu Val Thr Gly Ile Ala Phe Trp His Tyr Met Tyr Met Arg

65 70 75 80

Gly Val Trp Ile Glu Thr Gly Asp Ser Pro Thr Val Phe Arg Tyr Ile

85 90 95

Asp Trp Leu Leu Thr Val Pro Leu Leu Ile Cys Glu Phe Tyr Leu Ile

100 105 110

Leu Ala Ala Val Asn Lys Ser Asp Ser Gly Ile Phe Trp Arg Leu Met

115 120 125

Ile Gly Thr Leu Val Met Leu Val Thr Gly Tyr Leu Gly Glu Ala Gly

130 135 140

Tyr Ile Asn Ala Thr Leu Gly Phe Ile Ile Gly Met Ala Gly Trp Val

145 150 155 160

Tyr Ile Leu Tyr Glu Leu Trp Ala Gly Glu Gly Lys Ser Ala Cys Asn

165 170 175

Thr Ala Ser Pro Ala Val Gln Ser Ala Tyr Asn Thr Met Met Tyr Ile

180 185 190

Ile Ile Phe Ser Trp Ala Ile Tyr Pro Val Gly Tyr Phe Thr Gly Tyr

195 200 205

Leu Met Gly Asp Gly Gly Ser Ala Leu Asn Leu Asn Leu Ile Tyr Asn

210 215 220

Leu Ala Asp Phe Val Asn Lys Ile Leu Phe Gly Leu Ile Ile Trp Asn

225 230 235 240

Val Ala Val Lys Glu Ser Ser Asn Ala

245

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgaaattat tactgatatt aggtagtgtt attgcacttc ctacatttgc tgcaggtggt 60

ggtgaccttg atgctagtga ttacactggt gtttcttttt ggttagttac tgctgcttta 120

ttagcatcta ctgtattttt ctttgttgaa agagatagag tttctgcaaa atggaaaaca 180

tcattaactg tatctggtct tgttactggt attgctttct ggcattacat gtacatgaga 240

ggggtatgga ttgaaactgg tgattcgcca actgtattta gatacattga ctggttacta 300

acagttcctc tattaatatg tgaattctac ttaattcttg ctgccgtgaa caaaagcgac 360

agcggcatct tctggaggct gatgattggc accctggtga tgctcgtgac cggctacctg 420

ggagaggccg gctacatcaa tgccaccctg ggcttcatta ttggcatggc cggatgggtc 480

tacatcctgt acgagttatg ggctggagaa ggaaaatctg catgtaatac tgcaagtcct 540

gctgtgcaat cagcttacaa cacaatgatg tatattatca tctttagttg ggcgatttat 600

cctgtaggtt atttcacagg ttacctgatg ggtgacggtg gatcagctct taacttaaac 660

cttatctata accttgctga ctttgttaac aagattctat ttggtttaat tatatggaat 720

gttgctgtta aagaatcttc taatgct 747

<210> 4

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atgaaattat tactgatatt aggtagtgtt attgcacttc ctacatttgc tgcaggtggt 60

ggtgaccttg atgctagtga ttacactggt gtttcttttt ggttagttac tgctgcttta 120

ttagcatcta ctgtattttt ctttgttgaa agagatagag tttctgcaaa atggaaaaca 180

tcattaactg tatctggtct tgttactggt attgctttct ggcattacat gtacatgaga 240

ggggtatgga ttgaaactgg tgattcgcca actgtattta gatacattga ctggttacta 300

acagttcctc tattaatatg tgaattctac ttaattcttg ctgccgtgaa caaaagcgac 360

agcggcatct tctggaggct gatgattggc accctggtga tgctcgtggg cggctacctg 420

ggagaggccg gctacatcaa tgccaccctg ggcttcatta ttggcatggc cggatgggtc 480

tacatcctgt acgagttatg ggctggagaa ggaaaatctg catgtaatac tgcaagtcct 540

gctgtgcaat cagcttacaa cacaatgatg tatattatca tctttggttg ggcgatttat 600

cctgtaggtt atttcacagg ttacctgatg ggtgacggtg gatcagctct taacttaaac 660

cttatctata accttgctga ctttgttaac aagattctat ttggtttaat tatatggaat 720

gttgctgtta aagaatcttc taatgct 747

<210> 5

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Met Lys Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ser Val Ile Ala Leu Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly Asp Leu Asp Ala Ser Asp Tyr Thr Gly Val Ser

20 25 30

Phe Trp Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ser Thr Val Phe Phe Phe

35 40 45

Val Glu Arg Asp Arg Val Ser Ala Lys Trp Lys Thr Ser Leu Thr Val

50 55 60

Ser Gly Leu Val Thr Gly Ile Ala Phe Trp His Tyr Met Tyr Met Arg

65 70 75 80

Gly Val Trp Ile Glu Thr Gly Asp Ser Pro Thr Val Phe Arg Tyr Ile

85 90 95

Asp Trp Leu Leu Thr Val Pro Leu Leu Ile Cys Glu Phe Tyr Leu Ile

100 105 110

Leu Ala Ala Val Asn Lys Ser Asp Ser Gly Ile Phe Trp Arg Leu Met

115 120 125

Ile Gly Thr Leu Val Met Leu Val Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Ala Gly

130 135 140

Tyr Ile Asn Ala Thr Leu Gly Phe Ile Ile Gly Met Ala Gly Trp Val

145 150 155 160

Tyr Ile Leu Tyr Glu Val Phe Ser Gly Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ala

165 170 175

Lys Ser Gly Asn Lys Ala Leu Val Thr Ala Phe Gly Ala Met Arg Met

180 185 190

Ile Val Thr Val Gly Trp Ala Ile Tyr Pro Val Gly Tyr Phe Thr Gly

195 200 205

Tyr Leu Met Gly Asp Gly Gly Ser Ala Leu Asn Leu Asn Leu Ile Tyr

210 215 220

Asn Leu Ala Asp Phe Val Asn Lys Ile Leu Phe Gly Leu Ile Ile Trp

225 230 235 240

Asn Val Ala Val Lys Glu Ser Ser Asn Ala

245 250

<210> 6

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Met Lys Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ser Val Ile Ala Leu Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Gly Asp Leu Asp Ala Ser Asp Tyr Thr Gly Val Ser

20 25 30

Phe Trp Leu Val Ser Met Ala Cys Leu Ala Ser Thr Val Phe Phe Phe

35 40 45

Leu Glu Arg Ser Ser Val Pro Ala Gly Trp Arg Val Ser Met Thr Val

50 55 60

Ala Gly Leu Val Thr Gly Ile Ala Phe Val His Tyr Met Tyr Met Arg

65 70 75 80

Asp Val Trp Ile Met Thr Gly Asp Ser Pro Thr Val Phe Arg Tyr Ile

85 90 95

Asp Trp Leu Leu Thr Val Pro Leu Leu Ile Cys Glu Phe Tyr Leu Ile

100 105 110

Leu Ala Ala Ala Thr Asn Val Ala Gly Ser Leu Phe Lys Lys Leu Leu

115 120 125

Val Gly Ser Leu Val Met Leu Val Phe Gly Tyr Met Gly Glu Ala Gly

130 135 140

Ile Met Ala Ala Trp Pro Ala Phe Ile Ile Gly Cys Leu Ala Trp Val

145 150 155 160

Tyr Met Ile Tyr Glu Leu Trp Ala Gly Glu Gly Lys Ser Ala Cys Asn

165 170 175

Thr Ala Ser Pro Ala Val Gln Ser Ala Tyr Asn Thr Met Met Tyr Ile

180 185 190

Ile Ile Phe Gly Trp Ala Ile Tyr Pro Val Gly Tyr Phe Thr Gly Tyr

195 200 205

Leu Met Gly Asp Gly Gly Ser Ala Leu Asn Leu Asn Leu Ile Tyr Asn

210 215 220

Leu Ala Asp Phe Val Asn Lys Ile Leu Phe Gly Leu Ile Ile Trp Asn

225 230 235 240

Val Ala Val Lys Glu Ser Ser Asn Ala

245

<210> 7

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atgaaattat tactgatatt aggtagtgtt attgcacttc ctacatttgc tgcaggtggt 60

ggtgaccttg atgctagtga ttacactggt gtttcttttt ggttagttac tgctgcttta 120

ttagcatcta ctgtattttt ctttgttgaa agagatagag tttctgcaaa atggaaaaca 180

tcattaactg tatctggtct tgttactggt attgctttct ggcattacat gtacatgaga 240

ggggtatgga ttgaaactgg tgattcgcca actgtattta gatacattga ctggttacta 300

acagttcctc tattaatatg tgaattctac ttaattcttg ctgccgtgaa caaaagcgac 360

agcggcatct tctggaggct gatgattggc accctggtga tgctcgtggg cggctacctg 420

ggagaggccg gctacatcaa tgccaccctg ggcttcatta ttggcatggc cggatgggtc 480

tacatcctgt acgaggtgtt cagcggagag gccggaaaga gggccgccaa gtccggaaat 540

aaggccctgg tgacagcctt cggcgccatg agaatgatcg tcaccgtggg ttgggcgatt 600

tatcctgtag gttatttcac aggttacctg atgggtgacg gtggatcagc tcttaactta 660

aaccttatct ataaccttgc tgactttgtt aacaagattc tatttggttt aattatatgg 720

aatgttgctg ttaaagaatc ttctaatgct 750

<210> 8

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atgaaattat tactgatatt aggtagtgtt attgcacttc ctacatttgc tgcaggtggt 60

ggtgaccttg atgctagtga ttacactggt gtttcttttt ggttagttac tgctgcttta 120

ttagcatcta ctgtattttt ctttgttgaa agagatagag tttctgcaaa atggaaaaca 180

tcattaactg tatctggtct tgttactggt attgctttct ggcattacat gtacatgaga 240

ggggtatgga ttgaaactgg tgattcgcca actgtattta gatacattga ctggttacta 300

acagttcctc tattaatatg tgaattctac ttaattcttg ctgccgtgaa caaaagcgac 360

agcggcatct tctggaggct gatgattggc accctggtga tgctcgtggg cggctacctg 420

ggagaggccg gctacatcaa tgccaccctg ggcttcatta ttggcatggc cggatgggtc 480

tacatcctgt acgaggtgtt cagcggagag gccggaaaga gggccgccaa gtccggaaat 540

aaggccctgg tgacagcctt cggcgccatg agaatgatcg tcaccgtggg ttgggcgatt 600

tatcctgtag gttatttcac aggttacctg atgggtgacg gtggatcagc tcttaactta 660

aaccttatct ataaccttgc tgactttgtt aacaagattc tatttggttt aattatatgg 720

aatgttgctg ttaaagaatc ttctaatgct 750

Claims

1.一种嵌合蛋白，其特征在于，所述嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或5或6所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述序列编码权利要求1所述的嵌合蛋白。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO:1或5或6所示蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO:4或7或8所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:4或7或8所示序列的同源性≥95%且编码SEQ ID NO:1或5或6任一所示蛋白的多核苷酸。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种产生权利要求1所述的嵌合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的嵌合蛋白；和

分离所述嵌合蛋白。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括：

权利要求1所述的嵌合蛋白；和药学上可接受的载体。

8.一种突变型嵌合蛋白，其特征在于，所述的突变型嵌合蛋白为非天然蛋白，且所述突变型嵌合蛋白在SEQ ID NO: 1所示的嵌合蛋白的与线粒体定位和质子泵活性相关的如下核心氨基酸发生突变：

第196位甘氨酸(G) 突变为丝氨酸(S) 和第137位甘氨酸(G) 突变为苏氨酸(T)。

9.如权利要求8所述的突变型嵌合蛋白，其特征在于，所述突变型嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

10.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求8所述的突变型嵌合蛋白。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列的同源性≥95%，且编码SEQ ID NO: 2所示蛋白的多核苷酸。

12.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求10所述的多核苷酸。

13.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求12所述的载体，或其基因组中整合有权利要求10所述的多核苷酸。

14.一种产生权利要求8所述突变型嵌合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞，从而表达出突变型嵌合蛋白；和

分离所述突变型嵌合蛋白。

15.一种蛋白制剂，其特征在于，所述蛋白制剂包含权利要求8所述的突变型嵌合蛋白。

16.一种权利要求8所述的突变型嵌合蛋白或权利要求13所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备一药物或制剂，所述药物或制剂用于治疗神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自下组：帕金森氏疾病、线粒体脑肌病、脊髓性肌萎缩症、或其组合。