WO2024034200A1 - 膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるためのペプチドリンカー及び局在化方法並びに局在化する融合タンパク質 - Google Patents

膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるためのペプチドリンカー及び局在化方法並びに局在化する融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルの間に挿入される剛直性が高いペプチドリンカー、それらを含む融合タンパク質及びペプチドリンカーを挿入することを含む局在化方法を開示する。

Description

膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるためのペプチドリンカー及び局在化方法並びに局在化する融合タンパク質
　本発明は、膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるためのペプチドリンカー及び局在化方法並びに局在化する融合タンパク質に関する。
　膜貫通タンパク質は、細胞膜又はオルガネラ膜に局在する膜タンパク質の一種である。膜貫通タンパク質が膜に局在した状態においては、疎水性の膜貫通領域が脂質二重膜を貫くように存在し、それ以外の領域は脂質二重膜の外側に表出する。主要な膜貫通タンパク質としては、特定の物質を脂質二重膜の反対側に輸送する膜貫通タンパク質（トランスポーター）であるチャネル及びポンプ、細胞外からの特定の入力を細胞内のシグナルとして伝達する膜貫通タンパク質である細胞膜受容体並びに膜局在酵素などが知られており、生体膜の多様な機能を果たしている。
　生体機能に必要不可欠なタンパク質の生合成を行うことができないことは、生命を重篤な危機に瀕させる恐れのある事象であり、特に遺伝病等により先天的に適切な構造のタンパク質の生合成を行うことができない場合、根治は極めて困難である。このような先天的遺伝病の治療方法としては、ヒトの体細胞に対して外部から遺伝子を導入する治療（遺伝子治療）が期待されているものの、実用に至った例は乏しい。
　先天的遺伝病の一つであるミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能不全に起因する疾患の総称であり、筋力の低下及び発達の遅れをはじめとする様々な重篤症状の原因となる疾患である。真核細胞において、ミトコンドリアは核を除くオルガネラとして唯一、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）と呼ばれるオルガネラ固有のＤＮＡを有し、オルガネラ内でタンパク質の発現をすることができるオルガネラであり、ミトコンドリアＤＮＡにより発現されるミトコンドリアタンパク質はミトコンドリアの機能の発揮に必要不可欠であるところ、ミトコンドリア病においては、ミトコンドリアＤＮＡによるタンパク発現の異常が認められる。
　膜貫通タンパク質による物質の輸送及びシグナルの伝達等が細胞に与える影響は、膜貫通タンパク質が局在する箇所に大きく依存することから、その局在制御が試みられている。例えば、非特許文献１には、膜貫通タンパク質であるＡＴＰ合成酵素のサブユニット９のＮ末端のミトコンドリア移行シグナルを重複させることにより、ミトコンドリアへの局在性を向上させる技術が開示されている。また、非特許文献２には、５回膜貫通型の膜貫通タンパク質であるＡＴＰ６について、ｍＲＮＡ自体がミトコンドリアに存在するタンパク質ＳＯＤ２のミトコンドリア移行シグナル領域を５’末端に、ＳＯＤ２の３’非翻訳領域を３’末端にそれぞれ付加することで、ミトコンドリアに局在化させる技術が開示されている。
　膜貫通タンパク質を特定のオルガネラに局在化させる技術は、先天的遺伝病の遺伝子治療への応用をはじめとする医学的応用及び生化学的応用が期待できる。例えば、ミトコンドリアは二重の膜から成るオルガネラであり、ミトコンドリアタンパク質の多くは膜に局在する膜貫通タンパク質であることから、膜貫通タンパク質をミトコンドリアに局在化させる技術は、ミトコンドリアタンパク質の補充によるミトコンドリア病の治療への医学的応用が期待できる。
　しかし、通常のタンパク質（例えば細胞質局在性タンパク質）を標的オルガネラに局在化させる場合と異なり、膜貫通タンパク質に対してオルガネラ移行シグナルを付与したとしても、膜貫通タンパク質は疎水性が高い性質から分子間で凝集、あるいは小胞体に移行してしまい、標的オルガネラにうまく局在化できない場合が多いことが知られている。
　したがって、本発明の目的は、膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるための方法を提供することである。
　本発明者らが鋭意検討を進めたところ、膜貫通タンパク質の末端に、剛直性が高いリンカーとして知られるプロリンが豊富なペプチドリンカー又は２次構造をαヘリックスとするペプチドリンカー（以下、これらをまとめて「剛直性リンカー」とも記載する。）を介してオルガネラ移行シグナルを付与すると、膜貫通タンパク質がオルガネラ移行シグナルに対応したオルガネラに局在化することを見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１５］に関する。
［１］膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるために用いられる、上記膜貫通タンパク質と上記標的オルガネラに対応するオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーであって、上記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、上記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、ペプチドリンカー。
［２］膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるために用いられる、上記膜貫通タンパク質と上記標的オルガネラに対応するオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーであって、上記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、ペプチドリンカー。
［３］膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、上記膜貫通タンパク質と上記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む融合タンパク質であって、上記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、上記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、融合タンパク質。
［４］膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、上記膜貫通タンパク質と上記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む融合タンパク質であって、上記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、融合タンパク質。
［５］膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、の間にペプチドリンカーを挿入することを含む、上記膜貫通タンパク質を上記標的オルガネラに局在化させる方法であって、上記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、上記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、方法。
［６］膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、の間にペプチドリンカーを挿入することを含む、上記膜貫通タンパク質を上記標的オルガネラに局在化させる方法であって、上記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、方法。
［６－１］［１］又は［２］に記載のペプチドリンカーをコードする配列を含む、核酸。
［７］［３］又は［４］に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
［８］［３］又は［４］に記載の融合タンパク質を発現する、ベクター。
［９］上記標的オルガネラが核、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体及びペルオキシソームからなる群より選択される、［１］～［８］のいずれか１つに記載のペプチドリンカー、融合タンパク質、局在化方法、核酸又はベクター。
［１０］上記標的オルガネラが核又はミトコンドリアである、［１］～［８］のいずれか１つに記載のペプチドリンカー、融合タンパク質、方法、核酸又はベクター。
［１１］上記標的オルガネラがミトコンドリアである、［１］～［８］のいずれか１つに記載のペプチドリンカー、融合タンパク質、方法、核酸又はベクター。
［１２］上記標的オルガネラがミトコンドリアであり、［３］若しくは［４］に記載の融合タンパク質又は［８］に記載のベクターを含む、ミトコンドリア病治療薬。
［１３］上記標的オルガネラがミトコンドリアであり、［３］若しくは［４］に記載の融合タンパク質又は［８］に記載のベクターを患者に投与する、ミトコンドリア病の治療方法。
［１４］上記標的オルガネラがミトコンドリアであり、ミトコンドリア病の治療に用いるための、［３］若しくは［４］に記載の融合タンパク質又は［８］に記載のベクター。
［１５］ミトコンドリア病の治療薬の製造における、上記標的オルガネラがミトコンドリアである［３］若しくは［４］に記載の融合タンパク質又は［８］に記載のベクターの使用。
　本発明によれば、膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるためのペプチドリンカー及び局在化方法並びに局在化する融合タンパク質を提供することができる。
図１は、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質の構造の概略を示す図である。 図２は、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルとの間に柔軟性リンカーが挿入された融合タンパク質の概略図を示す図である。ペプチドリンカーが柔軟であるため、オルガネラ移行シグナル及び膜貫通タンパク質が分子内疎水性相互作用を起こし、標的オルガネラに局在化できないことが推測される。 図３は、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルとの間に剛直性リンカーが挿入された融合タンパク質の概略図を示す図である。ペプチドリンカーが剛直であるため、オルガネラ移行シグナル及び膜貫通タンパク質が分子内疎水性相互作用を起こさず、標的オルガネラに局在化できることが推測される。 図４は、補充療法によるミトコンドリア病の治療のメカニズムを示す図である。 図５は、実施例においてタンパク質を細胞に発現させるために用いたプラスミドの翻訳領域に相当する核酸の概略を示す図である。 図６は、実施例１において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と、共局在解析における相関係数との関係を示す図である。 図７は、実施例１において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０残基の群における代表的な蛍光画像を示す図である。 図８は、実施例１において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０残基の群における複数の細胞を含む代表的な蛍光画像を示す図である。 図９は、実施例１において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が７０、８０、９０、１００、１５０及び２００残基の群における代表的な蛍光画像を示す図である。 図１０は、実施例２において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合と、共局在解析における相関係数との関係を示す図である。 図１１は、実施例２において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合が３０％である群における代表的な蛍光画像を示す図である。 図１２は、実施例２において、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合が３０％である群における複数の細胞を含む代表的な蛍光画像を示す図である。 図１３は、実施例３において、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と、共局在解析における相関係数との関係を示す図である。 図１４は、実施例３において、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が３００残基の群における代表的な蛍光画像を示す図である。 図１５は、実施例３において、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が２００残基の群における代表的な蛍光画像を示す図である。
　本発明の一側面は、膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるために用いられる、上記膜貫通タンパク質と上記標的オルガネラに対応するオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーである。
　本発明の他の一側面は、膜貫通タンパク質と、オルガネラ移行シグナルと、上記膜貫通タンパク質と上記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む融合タンパク質である。
　本発明の他の一側面は、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルとの間にペプチドリンカーを挿入することを含む、上記膜貫通タンパク質を上記オルガネラ移行シグナルに対応するオルガネラに局在化させる方法（以下、「局在化方法」とも称する。）である。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質は、図１に示すように、少なくとも、膜貫通タンパク質と、オルガネラ移行シグナルと、上記膜貫通タンパク質と上記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含み、該ペプチドリンカーは、剛直性リンカーである。
　いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質が標的オルガネラに局在化できるメカニズムは、以下のように推察される。膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーが、剛直性が低いリンカー（以下では、柔軟性リンカー、とも記載する。）である場合、膜貫通タンパク質は疎水性が高いため、図２に示すように、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルの疎水的な領域は分子内で疎水性相互作用してしまう。そうすると、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）又はプレ配列受容体等のオルガネラ移行シグナルの認識機構が、オルガネラ移行シグナルを認識できないため、融合タンパク質は標的オルガネラに局在化できないと推察される。これに対し、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーが、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る剛直性リンカーである場合、剛直性リンカーが屈曲せず、膜貫通タンパク質とオルガネラ移行シグナルは分子内で疎水性相互作用しないため、図３に示すように、オルガネラ移行シグナルが膜貫通タンパク質から自由な状態で存在できる。そうすると、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）又はプレ配列受容体等のオルガネラ移行シグナルの認識機構が、オルガネラ移行シグナルを認識できるため、融合タンパク質は標的オルガネラに局在化できると推察される。
（１）膜貫通タンパク質
　膜貫通タンパク質は、生体膜の脂質二重膜を貫通して存在する膜タンパク質であり、生体膜の主要な構成要素となっている。ポンプ、トランスポーター、イオンチャネル、受容体、酵素又は膜構造タンパク質などとして存在し、生体膜の多様な機能を果たしている。膜貫通タンパク質の分子内には１個あるいは複数個の疎水性領域（以下では「膜貫通ドメイン」とも呼ぶ）が存在し、疎水性相互作用により生体膜に固定されており、それ以外の領域は脂質二重膜の外側に表出する。一般に、疎水性領域は２０個程度の疎水性が高いアミノ酸から成り、その両端に電荷をもつアミノ酸などの親水性が高いアミノ酸が存在する。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る膜貫通タンパク質は、細胞膜又はオルガネラ膜に局在化した際に１回以上脂質二重膜を貫通するものであればよく、例えば１回膜貫通型タンパク質であっても、複数回膜貫通型タンパク質であってもよい。特に、１回膜貫通型タンパク質は、翻訳過程で小胞体膜に挿入された状態において小胞体内腔にＮ末端側が露出するＩ型と、Ｃ末端側が露出するＩＩ型に分類されるが、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る１回膜貫通型タンパク質は、Ｉ型であってもよく、ＩＩ型であってもよい。また、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの二次構造は特に限定されず、例えばαヘリックス型であってもよく、βシート型であってもよい。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る膜貫通タンパク質の由来は特に限定されず、自然界に存在するものであってもよく、自然界に存在するタンパク質の機能を損なわない範囲で一部アミノ酸残基を置換又は欠損させたものであってもよく、人工的に作成されたものであってもよい。また、膜貫通タンパク質が真核細胞由来である場合、その生理的条件下における局在は特に限定されず、例えば細胞膜局在性のタンパク質であってもよく、核、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体、ゴルジ体、分泌顆粒、分泌小胞、リソソーム、ファゴソーム、エンドソーム、液胞又はペルオキシソームといったオルガネラの膜局在性のタンパク質であってもよい。また、膜貫通タンパク質は、オルガネラ局在性の膜貫通タンパク質から、オルガネラ移行シグナルに該当するアミノ酸配列の一部又は全体を置換又は欠損させたものであってもよい。
　本発明に係る膜貫通タンパク質としては、例えばアクアポリン、ＣＬＣファミリーイオンチャネル、ベストロフィン、Ｃｙｓループ型リガンド依存性イオンチャネル、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、イオンチャネル型ＡＴＰ受容体、電位依存性カリウムチャネル、環状ヌクレオチド依存性チャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、ＴＲＰチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、ＣａｔＳｐｅｒチャネル、２細孔性カリウムチャネル、内向き整流性カリウムチャネル、電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）、ＡＢＣトランスポーター、Ｐ型ＡＴＰアーゼ、Ｖ型ＡＴＰアーゼ、ＳＬＣ３５遺伝子ファミリートランスポーター、ＳＬＣファミリートランスポーター、ＡＰＣスーパーファミリートランスポーター、ミトコンドリアキャリア、ＭＦＳ型トランスポーター、シデロフレキシン、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、ロドプシンホスホジエステラーゼ、接着Ｇタンパク質共役型受容体、セクレチン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２受容体、ＥＧＦ受容体活性化型キナーゼ、ＦＧＦ受容体活性化型キナーゼ、エフリン受容体活性化型キナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体、ＡＸＬ活性型キナーゼ、インスリン受容体、受容体型グアニル酸シクラーゼ、ＰＤＧＦ受容体、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体、インテグリン、受容体型チロシンホスファターゼ、プレキシン、Ｎｏｔｃｈ、セレクチン、コンタクチン、ＮＡＤＨ－ユビキノン酸化還元酵素、シトクロムｃオキシダーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、非特異的モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、アシル基転移酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、リン酸転移酵素、硫酸転移酵素、非受容体型チロシンリン酸化酵素、リン酸ジエステル加水分解酵素、膜局在性ペプチダーゼ、ヌクレオシドジホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、ＳＡＭ複合体構成タンパク質、ＴＯＭ複合体構成タンパク質、ＴＩＭ複合体構成タンパク質、ミトフシン及びＥＲＭＥＳ複合体構成タンパク質などが挙げられる。
（２）オルガネラ移行シグナル
　本明細書においてオルガネラ移行シグナルとは、タンパク質に付与することで、そのタンパク質をオルガネラ移行シグナルに対応するオルガネラ（標的オルガネラ）に局在化させる性質を有するペプチドを指す。一般に、細胞質局在性タンパク質に代表される細胞中で遊離状態として存在するタンパク質は、オルガネラ移行シグナルの付与により標的オルガネラに局在化されやすいのに対し、生理状態において特定のオルガネラへの強い局在性を示すタンパク質は、オルガネラ移行シグナルにより局在化されにくい。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るオルガネラ移行シグナルは、タンパク質に付与することでそのタンパク質を標的オルガネラに局在化させることができるものであれば特に限定されず、自然界に存在するものであってもよく、自然界に存在するオルガネラ移行シグナルの機能を損なわない範囲で一部アミノ酸残基を置換又は欠損させたものであってもよく、人工的に作成されたものであってもよい。オルガネラ移行シグナルが自然界に存在するものである場合、オルガネラ移行シグナルは標的オルガネラに局在するタンパク質の全長であっても一部であってもよいが、膜貫通タンパク質の機能の阻害を避ける観点から、好ましくは標的オルガネラに局在するタンパク質の一部である。
　標的オルガネラに局在するタンパク質のアミノ酸配列は、公知のタンパク質データベース、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベースから入手することができる。
　標的オルガネラとしては、例えば核、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体、ゴルジ体、分泌顆粒、分泌小胞、リソソーム、ファゴソーム、エンドソーム、液胞又はペルオキシソーム等が挙げられる。細胞におけるタンパク質のダイナミクス又はエネルギー産生を制御する観点から核、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体又はペルオキシソームであることが好ましく、同様の観点から、核又はミトコンドリアであることがより好ましく、細胞の機能を制御する観点から、ミトコンドリアであることが特に好ましい。
　標的オルガネラがミトコンドリアである場合、一般に、オルガネラ移行シグナルはＮ末端に付与される。ミトコンドリア移行シグナル（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ：ＭＴＳとも表記する。）としては、公知文献（例えば、Ｇｕｎｎａｒ　ｖｏｎ　ＨＥＩＪＮＥ　ｅｔ　ａｌ．，「ＥＵＲＯＰＥＡＮ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、１９８９年、１８０巻、ｐ５３５－５４５）に記載されたペプチドを用いることができる。ミトコンドリアへの局在性を高める観点から、ミトコンドリア移行シグナルを構成するアミノ酸残基の数は、１５残基以上３００残基以下であることが好ましく、１６残基以上２５０残基以下であることがより好ましく、１７残基以上２００残基以下であることがさらに好ましく、１８残基以上１６０残基以下であることがより一層好ましい。また、Ｔｏｍ複合体との相互作用によりミトコンドリアへの局在性を高める観点から、ミトコンドリア移行シグナルに含まれるロイシン残基の数が、オルガネラ移行シグナルに含まれる全てのアミノ酸残基の数の１０％以上であってもよい。同様の観点から、ミトコンドリア移行シグナルに含まれるアルギニン残基の数が、オルガネラ移行シグナルに含まれる全てのアミノ酸残基の数の１０％以上であってもよい。ミトコンドリア移行シグナルの一例としては、例えば、タンパク質のＮ末端に付与される、以下の配列番号１～３に示すアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
（ａ）ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬＣＳＳＲＹＬ（配列番号１）
（ｂ）ＭＲＡＰＳＡＲＡＬＬＬＩＰＲＲＧＰＡＶＲＡＷＡＰＡＶＳＳＲＩＷＬＡＳＥＷＴＰＬＶＲＡＷＴＳＬＩＨＫＰＧＳＧＬＲＦＰＡＰＬＳＧＬＰＧＧＶＧＱＷＡＴＳＳＧＡＲＲＣＷＶＬＡＧＰＲＡＡＨＰＬＦＡＲＬＱＧＡＡＡＴＧＶＲＤＬＧＮＤＳＱＲＲＰＡＡＴＧＲＳＥＶＷＫＬＬＧＬＶＲＰＥＲＧＲＬＳＡＡＶ（配列番号２）
（ｃ）ＭＡＬＬＲＡＡＶＳＥＬＲＲＲＧＲＧＡＬＴＰＬＰＡＬＳＳＬＬＳＳＬＳＰＲＳＰＡＳＴＲＰＥＰＮＮＰＨＡＤＲＲＨＶＩＡＬＲＲＣＰＰＬＰＡＳＡＶＬＡＰＥＬＬＨＡＲＧＬＬＰＲＨＷＳＨＡＳＰＬＳＴＳＳＳＳＳＲＰＡＤＫＡＱＬＴＷＶＤＫＷＩＰＥＡＡＲＰＹ（配列番号３）
　標的オルガネラが核である場合、一般に、オルガネラ移行シグナルはペプチドの末端以外にも付与されうることから、核移行シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳとも表記する。）はＮ末端に付与されてもよく、Ｃ末端に付与されてもよく、またＮ末端に付与された核移行シグナルのさらにＮ末端側又はＣ末端に付与された核移行シグナルのさらにＣ末端側にペプチド鎖が付与されていてもよい。核移行シグナルとしては、公知文献（例えば、Ｓｈｕｎｉｃｈｉ　Ｋｏｓｕｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，「ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、２００９年、２８４巻、ｐ４７８－４８５及びＡｌｌｉｓｏｎ　Ｌａｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，「ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、２００７年、２８２巻、ｐ５１０１－５１０５）に記載されたペプチドを用いることができる。核移行シグナルには、シグナル配列がペプチド中の１の領域である単節型と２の領域である双節型が存在するが、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る核移行シグナルは、単節型であってもよく、双節型であってもよい。核移行シグナルを構成するアミノ酸残基の数は、例えば２０残基以下であり、１８残基以下であってもよく、１６残基以下であってもよい。また、核局在性を高める観点から、核移行シグナルを構成するアミノ酸残基の数に占めるリジン残基とアルギニン残基の合計数の割合が、２０％以上であってもよい。核移行シグナルの一例としては、以下の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
（ａ）ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号４）
　標的オルガネラがペルオキシソームである場合、オルガネラ移行シグナルであるペルオキシソーム移行シグナル（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌｓ：ＰＴＳ）は、Ｃ末端側に付与されるＰＴＳ１と、Ｎ末端側に付与されるＰＴＳ２に分類されるが、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るＰＴＳは、ＰＴＳ１であってもよく、ＰＴＳ２であってもよい。ＰＴＳ１としては例えば以下に示すペプチドを、ＰＴＳ２としては例えば以下に示すペプチドを、それぞれ例示することができる。なお、以降において、特別な記載がない限り、記載したアミノ酸配列中のＸは、任意のアミノ酸を示す。
（ａ）ＳＫＬ
（ｂ）ＲＬＸＸＸＸＸＨＬ
　標的オルガネラが葉緑体である場合、一般に、オルガネラ移行シグナルはＮ末端に付与される。葉緑体移行シグナルとしては、公知文献（例えば、Ｇｕｎｎａｒ　ｖｏｎ　ＨＥＩＪＮＥ　ｅｔ　ａｌ．，「ＥＵＲＯＰＥＡＮ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、１９８９年、１８０巻、ｐ５３５－５４５）に記載されたペプチドを用いることができ、また、任意の植物種のルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ、ｒｉｂｕｌｏｓｅ　ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓe、リブロース２リン酸カルボキシル基転移酵素／酸素添加酵素）のスモールサブユニットの葉緑体移行シグナルペプチド（トランジットペプチド）を用いることもできる。葉緑体への局在性を高める観点から、葉緑体移行シグナルを構成するアミノ酸残基の数は、３０以上１００以下であることが好ましい。
（３）ペプチドリンカー
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るペプチドリンカーは、αアミノ酸からなるペプチドリンカー（ペプチド結合したアミノ酸により形成されたリンカー）であって、剛直性が高いリンカーとして知られるプロリンが豊富なペプチドリンカー（以下では、プロリンリンカーとも記載する。）又は２次構造をαヘリックスとするペプチドリンカー（以下では、αヘリックスリンカーとも記載する。）である。なお、本明細書においてαアミノ酸には、プロリンを含む。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るペプチドリンカーがプロリンリンカーである場合、分子内疎水性相互作用を阻害することで融合タンパク質の標的オルガネラへの局在性を高める観点から、ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数は、ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の３０％以上であればよく、４０％以上であることが好ましく、４０％を超えることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。また、同様の観点から、ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基以外のアミノ酸残基について、それぞれのアミノ酸残基とペプチド結合しているプロリン残基の数の平均は、０．８以上であることが好ましく、１．０以上であることがより好ましく、１．２以上であることがさらに好ましく、１．５以上であることがより一層好ましく、１．８以上であることがさらに一層好ましい。また、同様の観点から、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数は、６０残基以上であればよく、６０残基を超えることが好ましく、７０残基以上であることがより好ましく、また発現効率を高める観点から、例えば６００残基以下であり、５００残基以下であってもよく、４００残基以下であってもよく、３００残基以下であってもよい。
　αへリックスリンカーは、２次構造として３．６残基で一巻きする螺旋構造であるαヘリックスを形成することで、屈曲しづらい剛直なリンカーとなる。すなわち、本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るペプチドリンカーがαヘリックスリンカーである場合、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列はαヘリックスを形成可能なものであれば特に限定されず、天然に存在するＬ体のアミノ酸に加えて非天然アミノ酸及びＤ体のアミノ酸等を含んでもよい。本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係るペプチドリンカーがαヘリックスリンカーである場合、分子内疎水性相互作用を阻害することで融合タンパク質の標的オルガネラへの局在性を高める観点から、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数は、７０残基以上であればよく、８０残基以上であることが好ましく、９０残基以上であることがより好ましく、また発現効率を高める観点から、例えば６００残基以下であり、５００残基以下であってもよく、４００残基以下であってもよく、３００残基以下であってもよい。αへリックスリンカーとしては、例えば、以下の配列番号５～１０を繰り返し単位としたペプチドリンカーを挙げることができる。
（ａ）ＥＡＡＡＫ（配列番号５）
（ｂ）ＥＡＡＡＲ（配列番号６）
（ｃ）ＥＡＡＡＱ（配列番号７）
（ｄ）ＤＡＡＡＫ（配列番号８）
（ｅ）ＤＡＡＡＲ（配列番号９）
（ｆ）ＤＡＡＡＱ（配列番号１０）
（４）融合タンパク質
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質は、少なくとも、膜貫通タンパク質と、オルガネラ移行シグナルと、上記膜貫通タンパク質と上記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む。融合タンパク質は、アミノ酸のみからなる単純タンパク質であってもよく、アミノ酸以外の構成要素を含む複合タンパク質であってもよいが、取得の簡便性の観点から、通常は単純タンパク質である。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質は、ペプチドリンカーと膜貫通タンパク質との間及び／又はペプチドリンカーとオルガネラ移行シグナルとの間に、さらにリンカーが挿入されていてもよい。挿入されるリンカーの構造は特に限定されないが、取得の簡便性の観点から、リンカーはペプチド結合したアミノ酸により形成されたリンカーであってもよい。また、融合タンパク質とオルガネラ移行シグナルの間のペプチド鎖の剛直性を確保して分子内疎水性相互作用を阻害することで融合タンパク質の標的オルガネラへの局在性を高める観点から、リンカーの長さは、例えば２００ｎｍ以下であってよく、１５０ｎｍ以下であってもよく、１００ｎｍ以下であってもよく、５０ｎｍ以下であってもよく、２５ｎｍ以下であってもよい。リンカーがペプチド結合したアミノ酸により形成されたリンカーである場合、同様の観点から、リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、例えば４００残基以下であってよく、３００残基以下であってもよく、２００残基以下であってもよく、１００残基以下であってもよく、５０残基以下であってもよく、また例えばペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数の２．０倍以下であってよく、１．５倍以下であってもよく、１．０倍以下であってもよく、０．５倍以下であってもよい。
　本発明のペプチドリンカー、融合タンパク質及び局在化方法に係る融合タンパク質は、融合タンパク質のペプチド末端のうちオルガネラ移行シグナルが結合していない末端に、さらに任意のペプチドドメインを含んでいてもよい。ペプチドドメインは、例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ及びＲＦＰ等の蛍光タンパク質ドメイン並びにＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ及びＧＳＴタグ等のアフィニティタグドメイン等の機能性ドメインを含んでいてもよい。
（５）核酸、ベクター及びそれらの取得方法
　本発明の他の一側面は、本発明の一側面に係る融合タンパク質をコードする核酸又は本発明の一側面に係る融合タンパク質を発現するベクターである。
　本発明の一実施形態に係る核酸は、本発明の一側面に係る融合タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列又は該塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸であれば特に限定されず、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はＤＮＡとＲＮＡの複合体のいずれであってもよく、１本鎖核酸又は２本鎖核酸であってもよく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）であってもよい。本発明の好ましい一実施形態に係る核酸は、本発明の一側面に係る融合タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列又は該塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸である。
　本発明の一実施形態に係るベクターは、本発明の一側面に係る融合タンパク質を細胞に発現できるものであれば特に限定されず、例えば一過性ベクター又は安定発現ベクターであってもよく、少なくともプロモーター配列及び融合タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を含むプラスミドであってもよく、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルス等のウイルスベクターに融合タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を組み込んだベクターであってもよい。核酸を組み込むベクターは、制限酵素部位、挿入された遺伝子の発現のための制御配列、抗生物質耐性遺伝子、形質転換体の選別のための配列等、種々の配列を含むことができる。本発明の一実施形態に係るベクターは、当業者が通常行う方法により容易に取得することができ、例えば本発明の一実施形態に係る核酸をインサートとして任意のベクターにライゲーションにより導入し、クローニングすることで得ることができる。上述した核酸を組み込むベクターとしては、例えば、ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｈｙｇｒｏベクター（富士フイルム和光純薬株式会社）等の市販品を利用することができる。
（６）局在化方法の実施方法
　本発明の一側面に係る局在化方法は、例えば、本発明の一側面に係る融合タンパク質又は該タンパク質を発現するベクターを細胞に導入することにより、実施することができる。細胞への導入は当業者が通常行う方法により容易に行うことができ、例えばベクターがウイルスベクターである場合、細胞の培養環境又は動物個体にウイルスベクターを添加することにより、ベクターを細胞に導入することができる。また、例えばベクターがプラスミドある場合又は融合タンパク質自体を細胞に導入する場合、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ソノポレーション又はマグネトフェクション等により、これらを細胞に導入することができる。
（７）融合タンパク質の取得方法
　本発明の一側面に係る融合タンパク質は、例えば、本発明の一側面に係る局在化方法と同様の方法で融合タンパク質を発現させた宿主細胞から単離精製することにより得ることができる。宿主細胞は特に限定されず、大腸菌、枯草菌等の原核細胞であっても、酵母、動物細胞等の真核細胞であってもよい。動物細胞は、例えば、哺乳動物細胞であってよく、より具体的には、マウス細胞又はヒト細胞であってよい。また、宿主細胞から融合タンパク質を単離する方法は特に限定されず、当業者が通常行う方法により行うことができ、例えば宿主細胞の膜を可溶化した後、透析、塩析、濾過、分別沈澱、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィー等の方法により単離精製することができる。これらの方法は、単独で用いてもよく、複数の方法を組み合わせて用いてもよい。
（８）ミトコンドリア病の治療
　先天的遺伝病の一つであるミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能不全に起因する疾患の総称であり、筋力の低下や発達の遅れをはじめとする様々な重篤症状の原因となる疾患である。ミトコンドリアは核を除くオルガネラとして唯一、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）と呼ばれるオルガネラ固有のＤＮＡを有し、オルガネラ内でタンパク質の発現をすることができるオルガネラであり、ミトコンドリアＤＮＡにより発現されるミトコンドリアタンパク質はミトコンドリアの機能の発揮に必要不可欠であるところ、ミトコンドリア病においては、ミトコンドリアＤＮＡによるタンパク発現の異常が認められる。すなわち、ミトコンドリア病においては、ミトコンドリアＤＮＡにより発現されるタンパク質の欠損又は機能不全を原因として、ミトコンドリア自体の機能不全が生じ、様々な重篤症状を引き起こす。
　ミトコンドリア病の治療方法の１つとして、図４に示すように、ミトコンドリアＤＮＡにより発現されるタンパク質を核のＤＮＡから発現させて、ミトコンドリアに輸送することにより補充するアプローチ（以下、「補充療法」とも呼ぶ。）が考えられる。しかし、ミトコンドリアは脂質二重膜である内膜及び外膜を有する細胞小器官であり、生命機能に必須のミトコンドリアタンパク質の多くは膜貫通タンパク質であるところ、従来技術では膜貫通タンパク質をミトコンドリアに局在化させることは困難であったため、補充療法による治療は難しいとされてきた。他方、本発明の一側面に係る融合タンパク質又はベクターは、細胞において膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させることができるため、ミトコンドリア病の補充療法に利用可能であると考えられる。
　すなわち、本発明の他の一側面は、本発明の一側面に係る融合タンパク質又はベクターを含み、標的オルガネラがミトコンドリアである、ミトコンドリア病治療薬である。本実施形態における融合タンパク質又はベクターに係る膜貫通タンパク質は、ミトコンドリア病において欠損した、若しくは機能不全を起こした膜貫通タンパク質、又は該膜貫通タンパク質の機能を代替可能な膜貫通タンパク質である。本実施形態における融合タンパク質又はベクターに係るオルガネラ移行シグナルは、ミトコンドリア移行シグナルである。
　本発明の一実施形態に係るミトコンドリア病治療薬に含まれる融合タンパク質又はベクターは、リポソーム、マイクロスフェア、ナノスフェア、高分子ミセル又はエキソソーム等の薬物送達キャリアに封入されていてもよい。また、本発明の一実施形態に係るミトコンドリア病治療薬の投与方法は特に限定されず、例えば、経口投与、吸入、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は経皮投与等の方法により投与することができる。
（９）ペプチドリンカーをコードする核酸
　本開示の他の一側面は、本開示の一側面に係るペプチドリンカーをコードする配列を含む、核酸である。本発明の一実施形態に係る核酸は、本発明の一側面に係るペプチドリンカーのアミノ酸配列に対応する塩基配列又は該塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸であれば特に限定されず、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はＤＮＡとＲＮＡの複合体のいずれであってもよく、１本鎖核酸又は２本鎖核酸であってもよく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）であってもよい。本発明の好ましい一実施形態に係る核酸は、本発明の一側面に係るペプチドリンカーのアミノ酸配列に対応する塩基配列又は該塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸である。本発明の一実施形態に係る核酸は、本発明の一側面に係るペプチドリンカーのアミノ酸配列に対応する塩基配列又は該塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列が、該核酸の塩基配列の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％を占める核酸であってもよい。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実験方法１：融合タンパク質及びその発現に用いたベクター］
　実施例において融合タンパク質を細胞に発現させるために用いたプラスミドの翻訳領域に相当する核酸の概略を図５に示す。図５において、左が５’末端である。上記翻訳領域を含むプラスミドは以下に従って作成した。ＣＯＸ８Ｎ２５及びスペーサーをコードする核酸は、これらの配列を含むプライマーを北海道システム・サイエンス株式会社に合成を依頼して、入手した。ペプチドリンカーをコードする核酸はユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を依頼して、入手した。ＣＦＰをコードする核酸はＡＴＵＭ社（ＦＰＢ－４７－６０９）から購入した。膜貫通タンパク質をコードする核酸はマウスｃＤＮＡ（Ｑｕｉｃｋ　Ｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ、６３７３０４、タカラバイオ株式会社）から入手した。これらの核酸を、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　－Ｂｌｕｅ－（ＫＭＭ－２０１、東洋紡株式会社）を用いてＰＣＲクローニングし、ユーロフィンジェノミクス株式会社から購入したｐＥＸ－Ａ２Ｊ２ベクターにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｓｎａｐ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｚ８９４７Ｎ、タカラバイオ株式会社）を使用して挿入することで、タンパク質を発現させるためのコンストラクトを作製した。コンストラクトを東洋紡株式会社のコンピテントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５ａ、ＤＮＡ－９１３Ｆ）に導入して増幅し、タカラバイオ株式会社のプラスミド精製キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ、Ｕ０５８８Ａ）によって精製することで、プラスミドを取得した。なお、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ２ベクターにはチャイニーズハムスターのＨｉｐｐ　１１領域の一部（１６１５　ｂｐ）が組み込まれており、Ｃａｓ９タンパク質を同時に発現させれば、相同組換によるノックインが可能なベクターとなっている（本明細書に記載の実施例では一過的な発現で十分であったため、Ｃａｓ９は発現させていない）。このプラスミドを用いて細胞において発現されたタンパク質は、Ｎ末端から順に、ミトコンドリア移行シグナル（配列番号１、ＣＯＸ８Ｎ２５）、クローニングにおける余剰６残基のペプチド（グリシン－セリン－アラニン－グリシン－セリン－アラニン）、ペプチドリンカー、膜貫通タンパク質ｍＡＢＣＢ１０ｄ１３２（配列番号１１）、スペーサー（配列番号１２）、蛍光タンパク質ＣＦＰ（配列番号１３）及びヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ、６つのヒスチジン残基）からなる。ｍＡＢＣＢ１０ｄ１３２は、ミトコンドリア内膜局在性タンパク質ｍｏｕｓｅＡＢＣＢ１０のＮ末端側１３２アミノ酸を欠損させたタンパク質であり、ミトコンドリア移行シグナルに相当するＮ末端側１３２アミノ酸を欠損させることで、ミトコンドリア局在性を失い、小胞体に局在化する（非特許文献３）。さらに、欠損させたＮ末端側１３２アミノ酸に代わって、他の種類のミトコンドリア局在タンパク質のＭＴＳを付加しても、ミトコンドリアに局在化できないことが報告されている（非特許文献３）。
［実験方法２：融合タンパク質を発現した細胞の調製］
　実施例において用いた、融合タンパク質を発現した細胞の調製方法は以下のとおりである。
　まず、細胞に関し、最終濃度１０％のウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、製品番号１１７６５０５４）培地（以下では、単に培地とも呼ぶ。）中で培養したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲された。細胞登録番号：ＪＣＲＢ９０１８、以下では単に細胞とも呼ぶ。）を、３ウェルディッシュ（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、製品番号３９７０－１０３）に０．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
　次に、形質転換に用いる溶液に関し、２０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、製品番号３１９８５０６２）、実験方法１に従って用意した２００ｎｇのプラスミド、０．２μＬのＰｌｕｓ　ｒｅａｇｅｎｔ及び０．８μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、製品番号１５３３８０３０）を混合し、室温にて２５分間静置して溶液（形質転換溶液）を調製した。
　最後に、融合タンパク質を発現した細胞の調製工程に関し、播種した細胞を培地中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１日培養した後、細胞を培養している培地に対して、形質転換溶液を１ウェルあたり１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４～５時間静置した。その後、培地を形質転換溶液を含まない培地に置換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１日培養した。
［実験方法３：ミトコンドリアの蛍光染色］
　実験方法２で調製した融合タンパク質を発現した細胞を、形質転換溶液の添加から２４時間経過した後に、最終濃度５０ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　Ｄｅｅｐ　Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、製品番号Ｍ２２４２６、以下ではＭＴＤＲとも呼ぶ。）を溶解した培地中において３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１時間培養することで、ミトコンドリアを蛍光染色した。
［実験方法４：蛍光顕微観察］
　実験方法３で得られた細胞は、以下のプロトコールに従って蛍光顕微観察した。ミトコンドリアの蛍光染色から１～６時間後に、１００倍の対物レンズＵｐｌａｎＳＡｐｏ　１００ｘ（オリンパス社製）とデジタルＣＭＯＳカメラＯＲＣＡ－ｆｌａｓｈ４，０Ｖ３（浜松ホトニクス社製、Ｃ１３４４０－２０ＣＵ）を搭載した電動型倒立型顕微鏡ＩＸ８３（オリンパス社製）を用いて、細胞を蛍光顕微観察し、蛍光画像を取得した。蛍光ミラーユニットとして、ＭＴＤＲ（ミトコンドリア）の蛍光観察にはＸ３－ＦＧＷＸＬ（励起波長５３０～５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ以上）、ＣＦＰ（融合タンパク質）の蛍光観察にはＩＸ３－ＦＣＦＰＸＬ（励起波長４２５～４４５ｎｍ、蛍光波長４６０～５１０ｎｍ）を、それぞれ用いた。
［実験方法５：共局在解析］
　実験方法４で得られたＭＴＤＲ及びＣＦＰの蛍光画像は、以下のプロトコールに従って共局在解析した。蛍光画像について、ウィンドウサイズ３５ピクセル（ピクセル解像度１３０ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）のメディアンフィルタによりノイズを含めた高周波成分を除去した画像を作成し、元の蛍光画像から減算することで、蛍光画像から背景光を除去した解析用画像を作成した。ＭＴＤＲ及びＣＦＰの蛍光画像から得られた２枚の解析用画像について、公知文献（Ｃｏｓｔｅｓ　ＳＶ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８６，３９９３－４００３（２００４））に記載の方法に従って、輝度値の相関係数Ｐｅａｒｓｏｎ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（以下では、単に「相関係数」とも呼ぶ。）を算出した。
　異なる群の間の相関係数の有意差検定は、有意水準１％の両側検定（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）により行った。
［実施例１：プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と局在化効果との関係］
　ペプチドリンカーがプロリンリンカーである場合の、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と局在化効果との関係について検討した。
　実験方法１～５に従って、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００残基であって、かつ、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の５０％がプロリン残基である融合タンパク質を発現させた細胞を蛍光顕微観察し、共局在解析した。一例として、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が１００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に、融合タンパク質を発現させるために用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号１５に、それぞれ示した。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が１００残基未満である場合には、配列番号１４に示した融合タンパク質のアミノ酸配列に含まれるプロリンリンカー領域１００残基（配列番号１６）に代わって、配列番号１６のＣ末端側から各群のリンカーに含まれるアミノ酸残基の数に相当する数のアミノ酸残基をプロリンリンカー領域として利用した。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が１５０残基である場合には、配列番号１４に示した融合タンパク質のアミノ酸配列に含まれるプロリンリンカー領域１００残基（配列番号１６）に代わって、配列番号１６に示したアミノ酸配列にさらに配列番号１６のＮ末端側５０残基をＮ末端側に有するアミノ酸配列をプロリンリンカー領域として利用した。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が２００残基である場合には、配列番号１４に示した融合タンパク質のアミノ酸配列に含まれるプロリンリンカー領域１００残基（配列番号１６）に代わって、配列番号１６に示したアミノ酸配列にさらに配列番号１６に示したアミノ酸配列をＮ末端側に有するアミノ酸配列をプロリンリンカー領域として利用した。また、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０である融合タンパク質は、ペプチドリンカー領域を有しない融合タンパク質であり、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドも、ペプチドリンカーをコードする領域を有しないプラスミドである。
　プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数に応じた、共局在解析における相関係数を図６に示す。図６において、グレーの棒グラフは平均値、黒いエラーバーは標準偏差を示し、アスタリスク（＊）は、アミノ酸残基の数が０残基の群との間において相関係数に有意差があることを示す。また、アミノ酸残基の数が０残基の群における代表的な蛍光画像を図７及び図８に、７０、８０、９０、１００、１５０及び２００残基の群における代表的な蛍光画像を図９に、それぞれ示す。図７～９において、アミノ酸残基の数の横又は白線の外側近傍に記載された数値は、各画像について、白線で囲われた領域における相関係数を示す。
　図６に示すように、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が６０残基以上の融合タンパク質において、相関係数の平均値の増加が見られ、アミノ酸残基の数が７０残基以上の融合タンパク質において、アミノ酸残基の数が０残基の融合タンパク質との間で相関係数の差が有意であった。また、図７及び図８に示すように、アミノ酸残基の数が０残基の融合タンパク質は、細胞全体にメッシュ状に分布し、小胞体に移行することが強く示唆されたのに対し、図９に示すように、アミノ酸残基の数が７０、８０、９０、１００、１５０及び２００残基の融合タンパク質は、ＭＴＤＲとよく類似した蛍光像を与え、ミトコンドリアに局在化することが強く示唆された。
［実施例２：プロリンリンカーに含まれるプロリン残基の割合と局在化効果との関係］
　ペプチドリンカーがプロリンリンカーである場合の、プロリンリンカーに含まれるプロリン残基の割合と局在化効果との関係について検討した。
　実験方法１～５に従って、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が１００残基であって、アミノ酸残基の３０％、４０％又は５０％がプロリン残基である融合タンパク質を発現させた細胞を蛍光顕微観察し、共局在解析した。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の３０％がプロリン残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号１８に、それぞれ示す。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の４０％がプロリン残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号２０に、それぞれ示す。プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基の５０％がプロリン残基である場合、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に示したアミノ酸配列と同一であり、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列は配列番号１５に示した塩基配列と同一である。
　プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合に応じた、共局在解析における相関係数を図１０に示す。図１０において、グレーの棒グラフは平均値、黒いエラーバーは標準偏差を示し、シャープ（＃）は、アミノ酸残基の５０％がプロリン残基である群との間において相関係数に有意差があることを示す。また、アミノ酸残基の３０％がプロリン残基である群における代表的な蛍光画像を図１１及び図１２に示す。図１１及び図１２において、白線の外側近傍に記載された数値は、各画像について、白線で囲われた領域における相関係数を示す。
　図１０に示すように、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合が３０％及び４０％の融合タンパク質において相関係数が小さくなり、プロリン残基の割合が５０％の融合タンパク質との間で相関係数の差が有意であった。また、図１１及び図１２に示すように、プロリンリンカーに含まれるアミノ酸残基に占めるプロリン残基の割合が３０％の融合タンパク質は、プロリンリンカー領域を有しない融合タンパク質と同様、細胞全体にメッシュ状に分布し、小胞体に移行することが強く示唆された。プロリン残基の割合が４０％の融合タンパク質でも、同様の傾向が見られた。
［実施例３：αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と局在化効果との関係］
　ペプチドリンカーがαヘリックスリンカーである場合の、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数と局在化効果との関係について検討した。
　実験方法１～５に従って、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０，５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００又は６００残基である融合タンパク質を発現させた細胞を蛍光顕微観察し、共局在解析した。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が５０残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号２２に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が６０残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号２４に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が７０残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２５に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号２６に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が８０残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号２８に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が９０残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２９に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号３０に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が１００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３１に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号３２に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が２００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３３に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号３４に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が３００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３５に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号３６に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が４００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３７に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号３８に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が５００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３９に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号４０に、それぞれ示す。αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が６００残基である場合の、発現させた融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４１に、融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドに含まれる翻訳領域に相当する核酸の塩基配列を配列番号４２に、それぞれ示す。また、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０である融合タンパク質及び融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドは、実施例１で用いたリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が０である融合タンパク質及び融合タンパク質を発現させるのに用いたプラスミドと同一である。
　αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数に応じた、共局在解析における相関係数を図１３に示す。図１３において、グレーの棒グラフは平均値、黒いエラーバーは標準偏差を示し、アスタリスク（＊）は、アミノ酸残基の数が０残基の群との間において相関係数に有意差があることを示す。また、アミノ酸残基の数が３００残基の群における代表的な蛍光画像を図１４に、２００残基の群における代表的な蛍光画像を図１５に、それぞれ示す。図１４及び図１５において、アミノ酸残基の数の横に記載された数値は、各画像について、白線で囲われた領域における相関係数を示す。
　図１３に示すように、αヘリックスリンカーに含まれるアミノ酸残基の数が７０残基以上の融合タンパク質において、相関係数の平均値の増加が見られ、アミノ酸残基の数が９０残基以上の融合タンパク質において、アミノ酸残基の数が０残基の融合タンパク質との間で相関係数の差が有意であった。また、図１４及び１５に示すように、アミノ酸残基の数が２００及び３００残基の融合タンパク質は、ＭＴＤＲとよく類似した蛍光像を与え、ミトコンドリアに局在することが強く示唆された。

Claims (10)

  1. 　膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるために用いられる、前記膜貫通タンパク質と前記標的オルガネラに対応するオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーであって、前記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、前記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、ペプチドリンカー。
  2. 　膜貫通タンパク質を標的オルガネラに局在化させるために用いられる、前記膜貫通タンパク質と前記標的オルガネラに対応するオルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーであって、前記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、ペプチドリンカー。
  3. 　膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、前記膜貫通タンパク質と前記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む融合タンパク質であって、前記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、前記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、融合タンパク質。
  4. 　膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、前記膜貫通タンパク質と前記オルガネラ移行シグナルとの間に挿入されるペプチドリンカーと、を含む融合タンパク質であって、前記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、融合タンパク質。
  5. 　膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、の間にペプチドリンカーを挿入することを含む、前記膜貫通タンパク質を前記標的オルガネラに局在化させる方法であって、前記ペプチドリンカーに含まれるプロリン残基の数が、前記ペプチドリンカーに含まれる全てのアミノ酸残基の数の４０％を超え、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が６０残基以上である、方法。
  6. 　膜貫通タンパク質と、標的オルガネラに局在化させるためのオルガネラ移行シグナルと、の間にペプチドリンカーを挿入することを含む、前記膜貫通タンパク質を前記標的オルガネラに局在化させる方法であって、前記ペプチドリンカーが２次構造をαヘリックスとするペプチドからなり、かつ、前記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数が７０残基以上である、方法。
  7. 　請求項３又は４に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  8. 　請求項３又は４に記載の融合タンパク質を発現する、ベクター。
  9. 　請求項３若しくは４に記載の融合タンパク質又は請求項３若しくは４に記載の融合タンパク質を発現するベクターを含み、前記標的オルガネラがミトコンドリアである、ミトコンドリア病治療薬。
  10. 　請求項１又は２に記載のペプチドリンカーをコードする配列を含む、核酸。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072774A1 (en) * 2002-02-23 2004-04-15 Giovanni Manfredi Methods for expressing and targeting mitochondrial-DNA-encoded peptides and uses thereof
JP2004325253A (ja) * 2003-04-24 2004-11-18 Japan Science & Technology Agency 脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブとそれを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法
JP2018506285A (ja) * 2015-02-16 2018-03-08 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ヴェー． ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを検出するためのセンサー、方法及びキット
JP2019509054A (ja) * 2016-01-08 2019-04-04 メディトープ バイオサイセンシーズ インク．Ｍｅｄｉｔｏｐｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 自己架橋性抗体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072774A1 (en) * 2002-02-23 2004-04-15 Giovanni Manfredi Methods for expressing and targeting mitochondrial-DNA-encoded peptides and uses thereof
JP2004325253A (ja) * 2003-04-24 2004-11-18 Japan Science & Technology Agency 脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブとそれを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法
JP2018506285A (ja) * 2015-02-16 2018-03-08 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ヴェー． ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを検出するためのセンサー、方法及びキット
JP2019509054A (ja) * 2016-01-08 2019-04-04 メディトープ バイオサイセンシーズ インク．Ｍｅｄｉｔｏｐｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 自己架橋性抗体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProtKB/TrEMBL "Putative uncharacterized protein B554R.", XP093139416 *
DATABASE UniProtKB/TrEMBL. "SubName: Full=Uncharacterized protein {ECO:0000313|Ensembl:ENSAMXP00000045064};", XP093139419 *
MATTHIAS A. BRUN, RUDOLF BRUN, LUC GRISS, KUI-THONG REYMOND, JOACHIM TAN, RUUD J.R.W. PIGUET, HORST PETERS, KAI VOGEL, JOHNSSON: "Semisynthesis of Fluorescent Metabolite Sensors on Cell Surfaces", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 133, no. 40, 12 October 2011 (2011-10-12), pages 16235 - 16242, XP055079261, ISSN: 00027863, DOI: 10.1021/ja206915m *

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