CN1260831A - 小球藻病毒启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了得自小球藻病毒的新的启动子序列。本发明包括含有本发明启动子序列的基因构建体,所述启动子序列与编码结构基因的DNA序列可操作地相连。本发明还提供了表达由本发明基因构建体中的结构基因编码的产物的载体和宿主细胞以及被与启动子可操作相连的异源基因转化的细胞。

Description

小球藻病毒启动子
本发明涉及分离自小球藻(Chlorella)病毒的新启动子，所述新启动子可用于在宿主细胞中表达异源基因。
基因工程可从一个生物体中分离结构基因并在不同的生物体中表达该基因。基因的表达包括核酸转录为mRNA和mRNA翻译成蛋白质。为了在新的生物体中表达结构基因，必须将基因与适当位置处的传递基因转录信号的调节序列连接。调节序列一般包括结构基因上游的启动子序列。启动子序列是指导结构基因转录的DNA序列。结构基因的核酸序列被转录成信使RNA(mRNA)，然后被翻译成特定多肽或蛋白质的特征性氨基酸序列。启动子序列一般位于基因的5’区域，结构基因转录起始位点的上游。
启动子可以是诱导型的，也可以是组成型的。诱导型启动子对诱导剂的反应是活性增加，从而使可操作相连的编码序列的转录速率增加。与之形成对照的是，在组成型启动子的控制下，基因的转录速率不受调节。然而，值得注意的是通过加入操纵基因序列可使组成型启动子变为诱导型启动子。例如，在T7噬菌体启动子中加入lac操纵基因，使其由组成型启动子转变为能被IPTG诱导的启动子(Rosenberg等，美国专利4,952,496)。
尽管不受诱导剂的控制，一些组成型启动子可提供比其它启动子水平更高的转录。提供高水平基因转录的高活性启动子在基因产物的商业生产中具有显著的优点。
通常，启动子在其天然宿主体外指导转录的能力各不相同。另外，特定启动子的转录速率也可随启动子所作用的特定宿主的不同而变化。因此，需要能在广范围宿主细胞中促进高水平转录的新启动子。
小球藻病毒是一组感染某些单细胞的，真核的，小球藻样绿藻系的病毒(Van Etten，1995，Mol.Cells，5：99-106；Van Etten等，1991，微生物学评论，55：586-620)。这些病毒是已知的最大的和最复杂的病毒，一般为直径150-190nm的多角体，其中含有大于300kb的双链DNA。小球藻病毒基因组具有编码几百个基因产物的潜力。
已分离出小球藻病毒甲基转移酶启动子，该启动子显示出在原核和真核宿主细胞系统中都可起作用。这些甲基转移酶启动子在一些细菌和高等植物细胞中能很好地起作用。例见美国专利5,563,328和Mitra等，1994，植物分子生物学，26：85-893(“Mitra”)。
本发明提供了分离自小球藻病毒的新的启动子序列，该启动子可在宽温度范围，如约21℃至37℃，在原核或真核细胞中诱导高水平的基因表达。
本发明提供了分离自小球藻病毒的新的启动子序列(SEQ IDNOS：1-7)。本发明包括含有本发明启动子序列的基因构建体，所述启动子序列与结构基因的DNA序列可操作相连。本发明还提供了表达由本发明基因构建体的结构基因编码的产物的载体和宿主细胞，以及被与启动子可操作相连的异源基因转化的细胞。
本发明的启动子包括诱导型小球藻启动子，例如通过与操纵基因序列融合可使该启动子变为诱导型启动子。在一个优选的实施方案中，本发明的小球藻启动子与lac操纵基因融合。本发明的小球藻启动子在宽温度范围内，如约21℃至约37℃，显示出很强的启动子活性。
在一个实施方案中，结构基因是编码用于在宿主细胞中产生的蛋白质的非小球藻病毒DNA序列。根据此实施方案，非小球藻病毒DNA序列可以是编码肽，蛋白质，激素，酶等的任何适当的结构基因。适当结构基因的例子包括胰高血糖素样肽1(GLP-1)，生长激素释放因子(GRF)，甲状旁腺激素(PTH)，互连肽，酰胺化密码子序列，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，谷胱甘肽乙酰转移酶等。
本发明的基因构建体被导入适当的用于表达基因产物的宿主细胞。直接转化宿主细胞，或通过载体进行转化。在一个实施方案中，用于例如大肠杆菌菌株HB101或JM109的原核细胞的适当载体是质粒pKK232-8。
本发明的启动子可用于多种原核和真核宿主细胞。在一个实施方案中，在包括烟草，小麦和其它植物的植物中使用本发明的启动子促进高水平的基因表达。
本发明还提供了生产蛋白质组分的方法。根据此实施方案，在被本发明基因构建体转化的宿主细胞中产生了蛋白质产物。该基因构建体包括与编码有待在宿主细胞中产生的蛋白质的结构基因可操作相连的本发明的启动子序列。本发明也提供了筛选和分离具有强转录特性的启动子序列(包括下文所示小球藻病毒启动子的截短形式)的方法。
图1图解说明了pKK232-8质粒图谱。
图2图解说明了使用与编码CAT蛋白的异源DNA序列相连的7个小球藻病毒启动子的基因构建体。
图3是用与启动子序列cvp-10，cvp-13，cvp-15和cvp-16可操作相连的CAT基因转化的氯霉素抗性大肠杆菌的CAT活性比较。
图4是转化至大肠杆菌HB101并在多种浓度氯霉素的存在下生长的小球藻病毒启动子cvp-13和tac启动子的启动子活性比较。
图5图解说明了pBN115-glp质粒图谱。
图6是显示不同温度下，由pBN115-glp和pBN115-glp/tac表达GLP-1的SDS-PAGE凝胶。
图7是含有3拷贝GLP-1和YX16启动子或tac启动子的表达盒所表达蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶照片，分别为经诱导和未经诱导，可溶和不可溶的蛋白质，于27℃和37℃。
图8是由8拷贝GLP-1和YX15，YX16或tac启动子形成的表达盒所表达蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶照片，分别为经诱导和未经诱导，可溶和不可溶的蛋白质，于27℃和37℃。
图9图解说明了pBN951nk2[GLP(7-36)AFAM]8HAE(tac)的质粒图谱。
本发明涉及分离自几个小球藻病毒基因组的新的核酸序列，所述分离的核酸序列作为转录启动子起作用[SEQ ID NOS：1-7]。本发明的启动子序列与结构基因可操作相连以指导结构基因在原核或真核细胞中的转录。相对于天然或其它非天然启动子而言，本发明的启动子序列提供了高水平的基因表达，这一点如下文实施例的细菌宿主细胞中所示。
本发明的启动子序列与结构基因序列可操作相连，形成“基因构建体”或“表达盒”。在典型的实施方案中，基因构建体的结构基因序列是异源序列。本文所用的“异源序列”是不同于小球藻病毒中与启动子序列可操作相连之序列的DNA序列。基因构建体也优选包括增强子，标记物，聚腺苷酸化序列或其它调节核酸序列。当欲产生分泌蛋白质时，结构基因的编码序列优选包括编码信号肽的核酸序列。
本发明的基因构建体被用于在宿主细胞中表达由结构基因编码的蛋白质产物。使用已知方法将基因构建体直接地，或经由载体掺入宿主细胞。蛋白质产物保持细胞内后-表达或者当基因构建体中含有编码信号肽的核酸序列时，所述蛋白质产物被分泌到细胞外。小球藻病毒启动子序列
下列核酸序列分离自小球藻病毒，并包括指导结构基因转录的启动子序列。cvp-1[SEQ ID NO：1]CCCGGGGATC GCAGGGCATG GGCATTAAAA GAACTTTATG GAATCAAAAATCTTAGTGAA TTTCCACCAC AGGTATATAG TCTTCAGGAC GCTAACGATGATATCAACGA TTGTATCAAA GGTTATCGTT TGAGGCACTC ATATCAGGTAGTTTCTACAC AGAAACTTGA ACAACGCCTG GGAAAAGATC CTGAGCATAGTAACTTATAT ACTAGCAGAT GTTGTAACGA TGCTTTATAT GAATATGAATTAGCACAACG ACAACTACAA AAACAACTTG ATGAATTTGA CGAAGATGGGTATGATTTTT TTCAGGCACG TATAAATACA TTAGATCCGT CGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-3[SEQ ID NO：2]CCCGGGGATC TAATTCAGGG TGCGAATTTC TTGAACATCA AAGGTCTGTTGGACGTTTTG TGTGCAGCGG TTGCTGATCG CATTGAATCC ATCAATAAACAGATTGGGGT AAATATCAAA CCCAGTTAGT CGGACATTAG AAGGATTTGTGAGACCACCA CATCCAACGA CACCTAATGG TGTTGTGAAT GATATATTAGAAATGTTACT TATCATTGAT ATTTGCATAA CACCATTTCC CTTTGCTTGATTTCTACCTA TACTAATTGA TTGTATTGTA GTGCACGCGG CGTACTTACTTGTATTTGCC GTCTCAGACG TGCTTGATAA TAGTGTGGAA CTCGAGTATGATCCGTCGAC CTGCAGCCAA GCTTcvp-6[SEQ ID NO：3]CCCGGGGATC ATCGAAAGCA ACTGCCGCAT TCGAAACTTC GACTGCCTCGTTATAAAGGT TAGTGAAAGC CATTGTATGT TATTACTGAG TTATTTAATTTAGCTTGCTT AAATGCTTAT CGTGTTGATA TGATAAATGA CAAATGATACGCTGTATCAA CATCTCAAAA GATTAATACG AAGATCCGTC GACCTGCAGCCAAGCTTcvp-10[SEQ ID NO：4]CCCGGGGATC GTTTCTCAGG GCGTCCGGGA GCATATTTCA GACTTGTCCAGCCGTATGAG CATCACGTGC GCGTTCCTAG CAAGAGCGTG TACGTATATTCTTTCGCTCT AGAAGATGCA GATTCGAGAC AACCGAATGG ATCGAATCTATTTGTACCCC GATATATATA GAATCTAGTC TAAACAAAAC GACCGCGGCTCTTGCCAATA AATGTGACGC AATTAACGCA TTCGTGAATG ATGACTTGTCCGCCCCGGTT CTTGACATTC TAAAAAAATG TGGAGTATCC TCGATCCGTCGACCTGCAGC CAAGCTTcvp-13[SEQ ID NO：5]CCCGGGGATC TGCGTATTGC GGGACTTTTG AGCATTTTCC AGAACGGATTGCCGGGACGT ATACTGAACC TCCAGTCCCT TTGCTCGTCG TATTTCCCATAATATACATA TACACTATTT TAATTATTTA CACCGGTTGT TGCTGAGTGATACAATGCAA ATTCCCTCCA CCGAGGAGGA TCGCGAACTG TCCAAATGTCTTCTTTCTGC AGCTCCATAC GGAGTCGTTA GGAAACATTC ACTTAATTATAGGATCCGTC GACCTGCAGC CAAGCTTcvp-15[SEQ ID NO：6]CCCGGGGATC AGGCCTCGCT TATAAATATG GTATTGATGT ACTTGCCGGTGTGATTGACT CAGATTACAG AGGAGAGTTG AAAGCAATCC TTTACAATACTACAGAACGT GACTATATTA TCAAAAAAGG CGATCAGCCA AGCTTCGTCGACCTGCGATC CGTCGACCTG CAGCCAAGCT Tcvp-16[SEQ ID NO：7]CCCGGGGATC GCAAAACTCA CAGTCAACAA ACCAAAACAC GGAATGAAGAAAGGAGAAAC TGTGATCATG TGGCAACAAG ATGGAGGTGT CATAGACTACATTTACCCTC CCTCTGATCA TCGAAAGCAA CTGCCGCATT CGAAACTTCGACTGCCTCGT TATAAAGGTT AGTGAAAGCC ATTGTATGTT ATTACTGAGTTATTTAATTT AGCTTGCTTA AATGCTTATC GTGTTGATAT GATAAATGACAAATGATACG CTGTATCAAC ATCTCAAAAG ATTAATACGA AGATCCGTCGACCTGCAGCC AAGCTT
下文实施例中更全面地描述了发现这些新启动子序列的方法。简而言之，由5株小球藻病毒，CA-4B，A1-1A，PBCV-1，SC-1A和NC-1A的病毒基因组产生限制性DNA片段(Van Etten，1991，微生物学评论，55：586-620)。使用已知方法，通过鸟枪克隆法将限制性片段插入质粒pKK232-8(Sambrook等，1989，分子克隆)。
质粒载体pKK232-8含有无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，在其上游含有多克隆位点以插入DNA限制性片段。然后，用克隆的pKK232-8转化大肠杆菌，用氯霉素抗性筛选携有启动子序列的转化子。为了得到高活性的启动子，使用生长培养基中增加浓度的氯霉素进一步筛选氯霉素抗性转化子。
本文所用的启动子“强度”指的是由启动子指导的转录水平。“强”启动子提供了比弱启动子更高水平的转录。因此，术语“强启动子”可以与“高活性启动子”互换使用。强启动子对于基因产物的商业生产特别有用。
应理解启动子功能可能不需要SEQ ID NOS：1-7中每一个所述的完整核酸序列。使用上文和下文实施例中所述的方法，可进一步地限制，如截短或修饰本发明的启动子序列，并进行筛选以提炼出有活性的启动子区域。制备基因构建体
根据本发明，基因构建体包括至少一种与转录控制区可操作相连的结构基因编码序列。转录控制区包括启动子和其它调节元件，如增强子，调节元件，聚腺苷酸化序列，转录起始区和转录终止序列。SEQID NOS：1-7各包括启动子序列，也可包括其它调节元件。将启动子序列与结构基因序列可操作相连的方法是已知的，例见Itakuri等，1977，科学，198：1056-1063。
本发明基因构建体的结构基因一般编码蛋白质或多肽产物。使用已知方法可将任何已知的或后来发现的编码所需产物的结构基因与本发明的启动子序列可操作相连。适用于与本发明启动子一起使用的已知结构基因的例子包括编码下列物质的那些核酸序列：胰高血糖素样肽1(GLP-1)，生长激素释放因子(GRF)，甲状旁腺激素(PTH)，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，谷胱甘肽乙酰转移酶，互连肽，酰胺化序列，以及其它结构基因。
因此，在一个实施方案中，本发明的启动子序列与编码碳酸酐酶，如人碳酸酐酶的DNA序列可操作相连。在另一个实施方案中，本发明的启动子序列与编码多拷贝所需蛋白质的DNA序列相连。美国专利5,595,887中公开了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的适当多拷贝结构基因的例子。基因转化方法
一旦形成基因构建体，直接将它导入宿主细胞，或亚克隆至适当载体中以转化宿主细胞。
转化细胞的方法是已知的，优选的方法随被转化宿主细胞的类型而变化。本文所用的“宿主细胞”指的是最终表达基因构建体的结构基因的细胞。对于包括细菌，酵母和动物宿主细胞的原核和真核宿主细胞而言，优选的转化方法包括冻融法，氯化钙沉淀法，磷酸钙沉淀法，质粒，原生质体转化，脂质体指导的转化，电穿孔和其它已知的转化方法。
对于植物细胞而言，优选的转化方法包括农杆菌(Agrobacterium)指导的转化，电穿孔，微粒轰击，原生质体融合，这些方法和其它已知转化方法的结合。宿主细胞
本发明的启动子可用于多种宿主细胞，包括原核和真核宿主细胞。用于表达本发明基因构建体的适当细菌宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。本发明的启动子也可用于植物和动物细胞，包括酵母细胞，如烟草，小麦和其它植物细胞，胚胎，肿瘤和其它动物细胞等。
将基因构建体携至宿主细胞的适当载体系统包括例如质粒，病毒，噬菌体和酵母人工染色体(YAC)。如下文实施例中所述，适于用本发明基因构建体转化细菌宿主细胞的适当质粒包括pKK232-8或pB0304。
将外源基因导入植物的方法是已知的，可使用该方法将本发明的基因构建体插入植物宿主，所述方法包括生物和物理植物转化法，例见Miki等，1993，“将外源DNA导入植物的方法”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick和Thompson编，CRC出版公司，Boca Raton，p67-88。选定的方法随宿主植物的不同而不同，包括化学转染法如磷酸钙，微生物指导的基因转移如农杆菌(Horsch等，科学，227：1229-31，1985)，电穿孔，显微注射，和biolistic轰击。
植物细胞的表达载体和体外培养方法或植物的组织转化和再生是已知的，可以获得的，例见Gruber等，1993，“植物转化载体”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick和Thompson编，CRC出版公司，Boca Raton，p89-119。实施例
参照下列实施例更全面地描述本发明，但实施例不以任何方式限制本发明。实施例1产生病毒DNA片断
提取自5株小球藻病毒CA-4B；A1-1A；PBCV-1；SC-1A和NC-1A的病毒DNA由Nebraska大学的Van Etten博士提供。合并提取的病毒DNA(各1.5μg)，通过在(100μl体积的)100mM NaCl，10mM Bis TrisPropane-HCl，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇和100μg/ml BSA中用Sau3A1(New England Biolabs，Beverly，MA)消化产生了病毒DNA片断。将混合物于37℃保温120分钟，通过10mM EDTA终止反应。用乙醇从消化混合物中沉淀出Sau3A1片断，并用乙醇洗涤。实施例2将片断克隆至DKK232-8
通过Sambrook等在1989，分子克隆中所述的鸟枪克隆法将按实施例1所述产生的Sau3A1病毒片断克隆至质粒pKK232-8中。质粒pKK232-8购自Pharmacia(Piscataway，NJ)。pKK232-8的图谱示于图1。按Sambrook等(文献同上)所述或根据厂商的指导进行DNA的制备，补平反应和连接。
将小球藻病毒DNA片断与1μg预先经BamHI和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理过的pKK232-8连接，产生重组质粒pCVP-1；pCVP-3；pCVP-6；pCVP-10；pCVP-13；pCVP-15；和pCVP-16。这7个与异源CAT基因可操作相连的小球藻病毒启动子示于图2。(缩写：Sm，SmaI；Sa，SalI H，HindIII；CAT，氯霉素乙酰转移酶基因)，牛小肠碱性磷酸酶购自Promega(Madison，WI)。T4 DNA连接酶购自BRL(Rockville，MD)。
pKK232-8是pBR322的衍生物，它含有无启动子的氯霉素酰基转移酶(CAT)基因，在其上游含有多克隆位点以插入DNA限制性片段。被pKK232-8转化的大肠杆菌细胞对氨苄青霉素具有抗性，但对氯霉素敏感，除非含有启动子的DNA片断被插入CAT基因的上游以诱导CAT的表达。如果插入这种启动子，携有重组质粒的细胞即表达CAT，从而获得氯霉素抗性。
pKK232-8被设计成降低氯霉素抗性背景并增加筛选强启动子的能力。为了降低背景，CAT基因的侧翼为有效的转录终止子，该转录终止子阻断质粒上存在的其它启动子转录CAT基因。在多克隆位点和CAT基因起始密码子之间的所有3个阅读框中导入翻译终止密码子以防止从克隆的启动子片断可能导入的任何ATG起始密码子开始翻译读。CAT基因也含有其自身的核糖体-结合信号和ATG起始密码子，能有效地翻译CAT mRNA。实施例3转化大肠杆菌和选择转化子
按Sambrook等，1989(文献同上)所述进行大肠杆菌HB101和JM109的转化。所述大肠杆菌菌株购自Promega(Madison，WI)。
筛选经转化的大肠杆菌的可显示被pKK232-8转化的氨苄青霉素抗性和显示启动子插入的氯霉素抗性。通过在递增量的氯霉素存在下测定细胞生长来估计插入的启动子的强度。
在含有30μg/ml氨苄青霉素和多种浓度氯霉素(5，10，20，30，100μg/ml)的Luria肉汤(LB)平板上分离阳性菌落。选择抗100μg/ml氯霉素的大肠杆菌菌落，接种于含200，400，600，700，900μg/ml氯霉素的LB培养基中。通过测定培养物的O.D.600来监测细胞生长。
得到几千个抗30μg/ml氯霉素的转化子。抗氯霉素的转化子数目随抗生素浓度的增加而显著降低。仅有约500个转化子抗100μg/ml氯霉素，仅有36个转化子显示出对500μg/ml氯霉素的抗性。被未插入启动子的对照pKK232-8转化的细胞对浓度大于5μg/ml的氯霉素没有抗性。
将显示出对500μg/ml氯霉素具有抗性的36个转化子进一步暴露于500，700和900μg/ml氯霉素中。7个转化子在含有700μg/ml氯霉素的LB培养基中显示出正常生长，在900μg/ml氯霉素存在下显示出较缓慢的生长(图2)。实施例4比较由小球藻病毒启动子诱导的CAT活性
比较由实施例3氯霉素抗性小球藻病毒启动子转化子表达的CAT活性。在600μg/ml氯霉素存在下，使7个氯霉素抗性大肠杆菌转化子中的4个生长(CVP-10；CVP-13；CVP-15和CVP-16)。通过测定不同时间的细胞密度(O.D.600)来监测细胞生长。如图3所示，4个转化子显示出类似的细胞生长，这表明各个培养物中表达了类似水平的CAT活性。实施例5纯化质粒DNA
使用Wizard微量制备质粒DNA纯化试剂盒(Promega公司，Madison，WI)或Qiagen DNA纯化试剂盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)从显示出最高水平氯霉素抗性(700至900μg/ml)的那些菌落中纯化质粒DNA。通过限制性核酸内切酶消化对质粒进行分析，结果表明所有质粒都携有DNA插入片段。
用SmaI和HindIII消化质粒，并在7.5％聚丙烯酰胺凝胶或0.8％琼脂糖凝胶上电泳。如图2所示，电泳凝胶显示出大小为100至400bp的7个病毒启动子片段。实施例6测定启动平片段的序列
用SmaI和HindIII从pKK232-8载体上切下7个含启动子的病毒DNA片段(cvp-1，cvp-3，cvp-6，cvp-10，cvp-13，cvp-15和cvp-16)并亚克隆至pUC19或pBluescriptSK(+)II以供测序。由NebraskaLincoln大学(UNL)测序实验室使用自动LICOR测序仪进行DNA测序。使用Sanger双脱氧链终止法在两个方向测定序列。
所有7个小球藻病毒片段的序列分析揭示出Sau3A1位点位于小球藻病毒插入物的每个末端，并侧翼于pKK232-8载体的多克隆位点。7个启动子片段DNA序列的大小与通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的限制性片段的大小相符。
    SEQ ID NO：     小球藻病毒DNA插入物
    1     cvp-1
    2     cvp-3
    3     cvp-6
    4     cvp-10
    5     cvp-13
    6     cvp-15
    7     cvp-16
已知的大肠杆菌启动子序列含有3个必需的元件：两个六聚体序列(-35区域和-10区域)和这两个区域之间的16-18bp间隔区。使用lac，lacUV5，trp，tac和PL启动子共有序列作为参照，将-35和-10区域推定序列对7个病毒启动子中的每一个进行排布。如下表I所示，这些六聚体序列与已知大肠杆菌启动子的共有序列或者相同，或者仅稍有不同。例如，cvp-10(TTGACA)或cvp-15(TTTACA)的-35序列区域与trp(TTGACA)或lac(TATGTT)中的相同。
本发明7个分离的病毒启动子中的6个在推定的-35和-10区域之间具有16-18bp间隔区。cvp-13病毒启动子和lac启动子都具有相同的-35六聚体序列(TTTACA)，-35和-10区域之间完全相同的间隔区(18bp)，非常相似的-10六聚体序列(cvp-13为TACAAT，lac为TATAAT)。
启动子    -35位                         -10位          +位共有序列    TTGACA                         TATAAT       SEQ.ID NO：cvp-1    CAAAAACAACTTGATGA ATTTGACGAAGATGGGTATGATTTTTTTCAGGC    10cvp-3    TCAGACGTGCTTGATAATAG TGTGGAACTCGAGTATGATCCG TCGACCT    11cvp-6    GCTTATCGTGTTGATATGATAAATGACAAAT   GATACGCTGTATCAACA    12cvp-10   GCCCCGGTTCTTGACATTCTAAAAAAATGTGGAGTATCCTCGATCCGTCGA    13cvp-13   ATTTTAATTATTTACACCGGTTGTTGCTGAGTGATACAATGCAAATTCCCT    14cvp-15   AAAGCAATCCTTTACAATAC TACAGAACGTGACTATATTATCAAAAAAGG    15cvp-16   ACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTT    16lac      CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTG TGGAATT    17lacUV5   CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTG TGGAATT    18trp      AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTA GTTAACTAGTACGCAAGT    19tac      AAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT  CGGCTCGTATAATGTG TGGAATT    20PL       TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACT GGGGGTGATACTGAG CACATCA    21
黑体“A”表示转录起始位点。缩写：lac，lac启动子；lacUV5，lacUV5启动子；trp，trp启动子；tac，tac启动子；PL，噬菌体λPL启动子。实施例7比较cvp-13和tac的启动子活性
tac启动子是很强的大肠杆菌启动子(de Boer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.80：21-25)，已在研究和工业中被广泛用于基因表达。为了在相同检测系统中将病毒启动子cvp-13的启动子活性和tac的启动子活性进行比较，使用pKK232-8构建tac的启动子质粒。
将含有tac序列的两个互补寡聚体，5′-GGGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATGGCTCGTATAATGTGTGGAAGCTT-3′[SEQ ID NO：8]和5′-CCCTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTCG-3′[SEQ ID NO：9]退火并插入pKK232-8中CAT基因上游，SmaI和HindIII之间。将所得质粒pTAC-cat转化至大肠杆菌HB101中。在100，300或600μg/m1氯霉素存在下培养含有pTAC-cat或pCVP-13的细胞。通过测定不同时间的细胞生长密度来监测抗生素抗性。如图4所示，在所有3个氯霉素浓度水平下，cvp-启动子显示出比tac启动子更高的启动子活性。实施例8构建受调节的病毒启动子
分离自小球藻病毒基因组的7个病毒启动子片段在大肠杆菌中显示出强启动子活性。然而，它们的启动子活性不受调节，因此，只能组成型指导蛋白质表达。已为几个启动子开发了通过融合启动子与lac操纵基因将组成型启动子转变为诱导型启动子的方法，所述启动子如核糖体RNA基因启动子(Brosius和Holy，1984，PNAS USA81：6929-6933)和脂蛋白基因启动子(Nakamura等，1982，EMBO J.1：771-775)。这些经修饰的杂合启动子受lacI基因产物，lac阻遏物的阻遏，所述阻遏物与lac操纵基因特异性的结合抑制转录的起始并且通过如异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)这样的诱导物而解除阻遏，从而防止阻遏蛋白与lac操纵基因结合。
将lac操纵基因与小球藻病毒启动子cvp-1，cvp-15和cvp-16融合以评估小球藻病毒启动子是否可变为诱导型启动子。由OperonTechnology公司(Alameda，CA)化学合成了含有lac操纵基因序列和适当限制性克隆位点的两个互补寡核苷酸。这些寡核苷酸的序列如下：5’-TCGACCGGGTACCTCGCGAGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCTCTAGA-3’[SEQ ID NO：22]5′-AGCTTCTAGAGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTCGCGAGGTACCCGG-3’[SEQ ID NO：23]
变性和退火之后，将所得寡核苷酸双链体插入pKK232-8上SalI和HindIII位点处的病毒启动子下游。将在CAT基因上游含有病毒启动子/操纵基因杂合体的pKK232-8克隆转化至缺乏lacI功能的大肠杆菌HB101。通过测定经转化细胞对氯霉素的抗性而检测到与缺乏lac操纵基因的病毒启动子类似水平的启动子活性。这表明通过与lac操纵基因融合而操作病毒启动子不会导致启动子强度的降低。与lac操纵基因融合的启动子cvp-1，cvp-15和cvp-16分别被称为YX-1，YX-15和YX-16。实施例9由YX-15表达载体表达胰高血糖素样肽(GLP-1)A.构建YX-15表达载体，pBN115-glp
为了将病毒启动子(YX-1，YX-15和YX-16)亚克隆至表达载体(需要限制性位点BglII和XbaI以供克隆)，使用由Operon Technology公司合成的下列寡核苷酸进行聚合酶链反应(PCR)以修饰启动子片段：5’-GGGTTCGAAGATCTAATTCCCGGGGATC-3’[SEQ ID NO：24]和5’-TGCATTTCTAGAATTGTGAATTGTTATCCGCTCA-3’[SEQ ID NO：25]
质粒pGEX-2T购自Pharmacia Biotech公司(piscataway，NJ)，该质粒携有pBR322复制起点，lacIq基因，氨苄青霉素抗性基因，和tac启动子/谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合基因表达盒。首先通过用FspI和SmaI消化除去1.2kb的FspI-SmaI片段以缺失pGEX-2T上的tac/GST表达盒，然后用含有BglII/XbaI/NheI/XhoI位点，可用作克隆位点的DNA片段取而代之。所得质粒被称为pBN115。
GLP-1是29个残基的激素肽。构建合成的8拷贝GLP-1基因并在大肠杆菌中表达之。为了检测在YX-15控制下的GLP-1表达，通过将含有YX-15的BglII-XbaI片段与含有核糖体结合位点和8拷贝GLP-1基因的XbaI-XhoI片段融合，构建YX-15/GLP-1表达盒。然后，将YX-15/GLP-1表达盒插入pBN115唯一的BglII和XhoI位点处，产生pBN115-glp(图5)。通过用含有lac操纵基因的tac启动子替代pBN115-glp上BglII和XbaI位点处的YX-15，构建pBN115-glp/tac以用作对照表达载体。tac启动子也可被IPTG严格调节。B.表达GLP-1
在氨苄青霉素的存在下，将p’BN115-glp和pBN115-glp/tac转化至大肠杆菌宿主菌株HMS174(Novagen公司，Milwaukee，WI)。在37℃至21℃下，用0.1至2mM IPTG诱导GLP-1的表达。诱导15小时之后收获细胞。制备总细胞蛋白供SDS-PAGE分析(图6)。使用Personal Color Scanner和Adobe photoshop和NIH Image Analysis计算机程序，通过凝胶扫描来评价GLP-1的产生。如表1所示，凝胶扫描揭示出37℃下，pBN115-glp表达GLP-1的水平大于总细胞蛋白的46％，而pBN115-glp/tac表达GLP-1的水平大于总细胞蛋白的35％。1 O.D.600细胞中，pBN115-glp产生的GLP-1比pBN115-glp/tac产生的多40％。此结果清楚地表明YX-15作为很强的启动子在大肠杆菌中产生高水平重组蛋白的潜在应用。
                  表1
    大肠杆菌中YX-15指导的GLP-1表达
诱导     GLP-1蛋白带强度的读数tac                YX-15
    未诱导     84(7％)     385(35％)
    37℃     1089(100％)     1544(141％)
    27℃     55(5％)     1248(114％)
    21℃     ND     830(76％)
每次处理时从0.25 O.D.600细胞中提取总蛋白并在16％PAGE凝胶上分析(图6)。用考马斯蓝染色后，使用Personal Color Scanner和Adobe photoshop和NIH Image Analysis计算机程序扫描蛋白质带的强度。圆括号中的百分数表示相对于37℃下由tac启动子驱动的GLP-1表达水平的GLP-1表达水平。C.通过IPTG诱导
尽管在没有IPTG的情况下可检测到携有pBN115-glp的HMS174中GLP-1的基本表达水平，但加入IPTG后，GLP-1表达水平增加了4倍。与之形成对照的是，IPTG诱导pBN115-glp/tac产生的GLP-1增加了13倍。这表明pBN115-glp的GLP-1表达确实对IPTG诱导作出反应。然而，对pBN115-glp的GLP-1表达所作的调节不如对pBN115-glp/tac的严格。
37℃下，检测多种浓度(0，0.25，0.5，1.0和2.0mM)的IPTG对GLP-1表达的诱导能力。在IPTG浓度范围为2mM至0.1mM时，pBN115-glp产生了类似高水平的GLP-1。这表明低至0.1mM的IPTG浓度足以诱导GLP-1超量表达。
在所有受试的IPTG浓度下，pBN115-glp产生的GLP-1比pBN115-glp/tac产生的GLP-1始终要高，这说明YX-15的启动子活性比tac高。D.温度的影响
培养温度对微生物的行为有很大的影响。通常使用37℃作为诱导温度以在大肠杆菌中产生所需的重组蛋白，而在某些情况下，较低的温度在产生活性蛋白质和避免形成无活性的蛋白质聚集体方面显示出优点。然而，在较低的温度下，作为生物化学反应的转录和翻译的速率大大降低，因此，目的蛋白质的终产量降低。因此，使用在较低温度下具有高活性的启动子对于产生高水平的蛋白质是必需的。在本发明之前，这种大肠杆菌启动子还不能得到。如tac启动子和T7启动子这样的常用启动子在37℃下活性很高，但在较低的温度下活性弱得多，下文中有关tac启动子的数据可以说明此现象。
在37℃至21℃的温度范围内，比较YX-15控制GLP-1产生的启动子活性。表1所示的结果(上文)证明YX-15启动子在37℃至21℃的温度范围能驱动高水平GLP-1的表达。27℃下，使用YX-15启动子的表达水平甚至比37℃时使用tac启动子的表达水平稍高。27℃和21℃时，YX-15驱动的GLP-1表达水平降低，与37℃时相比，分别降低20％和50％。与之形成对照的是，使用tac时，27℃与37℃相比，表达降低了95％。21℃时未检测到tac启动子的蛋白质表达。实施例10病毒启动子在植物中的功能
为了检测分离的病毒启动子是否能在植物中起作用，将7个启动子片段插入β-葡糖醛酸酶(GUS)表达载体pBI221(ClotechLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)中的GUS基因上游以替代CaMV35S启动子。通过微粒轰击法将所得质粒导入烟草叶和小麦不成熟的胚中。然后通过计数受试外植体上蓝色GUS焦点的形成，组化检测经转化外植体的GUS表达情况。用含有CaMV 35S启动子的pBI221转化阳性对照外植体。
如表2所示，用启动子cvp-15观察到GUS瞬时测定的阳性结果，但用另外6个启动子未观察到阳性结果。
                           表2
载体     GUS焦点平均范围/外植体/植物*烟草                小麦
pBI221(CaMV 35S)     2.6-9.5     7.6-17.2
  pBI221-YX15     0.7-1.5     0.4-1.6
*n＝3次实验实施例11用pYX16低温表达GLP构建体
上文实施例9中所述的表达质粒pBN115-glp(8拷贝GLP-1)使用YX15启动子(cvp-15加上lac操纵基因)驱动8拷贝GLP-1(7-36)表达盒的表达。通过用YX-16启动子的片段替代pBN115载体中BglII/XbaI启动子片段，构建含有YX16启动子(cvp-16加上lac操纵基因)和3拷贝GLP-1(7-36)的第二个质粒。通过XbaI-XhoI片段的取代用3拷贝GLP-1盒取代8拷贝GLP-1盒。此构建体pGEXlnk2(3拷贝GLP)YX16含有与pBN115相同的质粒骨架，不同之处是启动子是YX16而不是YX15。
使用pBN53表达质粒制备驱动8拷贝GLP-1(7-36)表达的YX16启动子构建体。YX16启动子作为BglII/XbaI片段被克隆至此构建体。所得质粒pBN53lnk28拷贝GLP YX16为四环素抗性，并含有lacIq基因以阻遏未诱导的表达。pBN95质粒与pBN53质粒相同，不同的是它含有lacI基因而不是lacIq基因。这一变化导致pBN95中lacI基因产物较低水平的表达，因此，使用此载体可较低水平地阻遏未诱导的蛋白质水平。
使用上文实施例9中所述的方法和材料将表达载体转化至大肠杆菌细胞。按实施例9中所述，在27℃和37℃下用IPTG诱导GLP-1的表达。
把诱导受tac或YX16启动子控制的3拷贝GLP-1(7-36)和8拷贝GLP-1(7-36)之后从细胞培养物中取出的蛋白质样品在16％TrisTricine SDS-PAGE凝胶上分离，并用考马斯蓝染色。
图7所示的数据阐明YX16启动子在27℃下能较好地发挥作用，而tac启动子在此温度下无活性。GLP前体肽于27℃是可溶性的，而于37℃是不可溶的。
图8所示的数据阐明YX15和YX16启动子在27℃下都能发挥作用，而tac启动子在此温度下无活性。数据表明YX16启动子在低温(27℃)下发挥作用，具有两个独立的靶肽。
上述说明书，实施例和数据提供了制备和使用本发明组分的完整描述。由于在不违背本发明精神和范围的前提下可想出很多本发明的实施方案，本发明包含在下文所附的权利要求书中。
                    序列表(1)一般资料：(i)申请人：BIONEBRASKA，InC.(ii)发明题目：小球藻病毒启动子(iii)序列数：25(iv)通讯地址：
(A)收件人：Merchant，Gould，Smith，Edell，Welter & Schmidt
(B)街道：3100 Norwest Center，90 South 7th Street
(C)城市：Minneapolis
(D)州：MN
(E)国家：美国
(F)邮政编码：55402(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘
(B)计算机：IBM兼容机
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)目前的申请资料：
(A)申请号：(新提交)
(B)申请日：19-MAR-1998
(C)分类号：(vii)在先申请资料：
(A)申请号：08/821,559
(B)申请日：21-MAR-1997  (viii)代理人/律师资料：
(A)姓名：Kettelberger，Denise M
(B)登记号：33,924
(C)资料/文档号：8648.63WOI1(ix)通讯资料：
(A)电话：612-332-5300
(B)传真：612-332-9081
(C)电报：(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
(A)长度：358个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCCGGGGATC GCAGGGCATG GGCATTAAAA GAACTTTATG GAATCAAAAA TCTTAGTGAA     60TTTCCACCAC AGGTATATAG TCTTCAGGAC GCTAACGATG ATATCAACGA TTGTATCAAA    120GGTTATCGTT TGAGGCACTC ATATCAGGTA GTTTCTACAC AGAAACTTGA ACAACGCCTG    180GGAAAAGATC CTGAGCATAG TAACTTATAT ACTAGCAGAT GTTGTAACGA TGCTTTATAT    240GAATATGAAT TAGCACAACG ACAACTACAA AAACAACTTG ATGAATTTGA CGAAGATGGG    300TATGATTTTT TTCAGGCACG TATAAATACA TTAGATCCGT CGACCTGCAG CCAAGCTT      358(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：
(A)长度：374个碱基对
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：AAATGAGCTG TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATT                   48(2)SEQ ID NO：21的资料：(i)序列特征：
(A)长度：49个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：TCTGGCGGTG TTGACATAAA TACCACTGGG GGTGATACTG AGCACATCA                  49(2)SEQ ID NO：22的资料：(i)序列特征：
(A)长度：50个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：TCGACCGGGT ACCTCGCGAG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCCTCTAGA                      50(2)SEQ ID NO：23的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：50个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：AGCTTCTAGA GGAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCTCGCG AGGTACCCGG                      50(2)SEQ ID NO：24的资料：(i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：GGGTTCGAAG ATCTAATTCC CGGGGATC                                              28(2)SEQ ID NO：25的资料：(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：TGCATTTCTA GAATTGTGAA TTGTTATCCG CTCA                                      34

Claims (37)

1.根据SEQ ID No.1的分离的核酸序列。
2.根据SEQ ID No.2的分离的核酸序列。
3.根据SEQ ID No.3的分离的核酸序列。
4.根据SEQ ID No.4的分离的核酸序列。
5.根据SEQ ID No.5的分离的核酸序列。
6.根据SEQ ID No.6的分离的核酸序列。
7.根据SEQ ID No.7的分离的核酸序列。
8.含有SEQ ID Nos.1，2，3，4，5，6或7的核酸序列的启动子。
9.含有与结构基因可操作相连的启动子的基因构建体，所述启动子含有SEQ ID Nos.1，2，3，4，5，6或7的核酸序列。
10.权利要求9的基因构建体，其中所述结构基因编码碳酸酐酶。
11.权利要求9的基因构建体，其中所述碳酸酐酶是人碳酸酐酶。
12.权利要求9的基因构建体，其中所述结构基因编码胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，生长激素释放因子(GRF)或甲状旁腺激素(PTH)。
13.含有基因构建体的宿主细胞，所述基因构建体含有与结构基因可操作相连的启动子，所述启动子含有SEQ ID Nos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
16.权利要求14的宿主细胞，其中所述大肠杆菌包括HB101，JM109，BL21或HMS174。
17.生产蛋白质组分的方法，所述方法包括：
用核酸序列转化宿主细胞，所述基因构建体含有与异源DNA序列可操作相连的启动子，所述启动子含有SEQ ID Nos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列；和
在宿主细胞中表达异源DNA序列以产生蛋白质组分。
18.生产蛋白质组分的方法，所述方法包括：
在宿主细胞中表达核酸序列，其中所述表达受与异源核酸序列可操作相连的启动子驱动，所述启动子含有SEQ ID Nos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列。
19.核酸序列，它含有：
含有SEQ ID No.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的启动子；
lac操纵基因；
和结构基因；
其中启动子，操纵基因和结构基因可操作地相连。
20.权利要求1的核酸序列，其中启动子含有SEQ ID No.15所示的核酸序列。
21.含有SEQ ID No.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的诱导型启动子。
22.含有与lac操纵基因可操作相连的SEQ ID No.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的诱导型启动子。
23.权利要求22的诱导型启动子，它含有SEQ ID No.15所示的核酸序列和lac操纵基因。
24.含有权利要求22的诱导型启动子的宿主细胞。
25.权利要求24的宿主细胞，其中宿主细胞是植物细胞。
26.权利要求24的宿主细胞，其中宿主细胞是原核细胞。
27.权利要求24的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
28.核酸序列，它含有：
小球藻启动子；
lac操纵子；和
结构基因，其中启动子，操纵子和结构基因可操作地相连。
29.权利要求28的核酸序列，其中结构基因含有编码胰高血糖素样肽1，生长激素释放因子，甲状旁腺激素，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或谷胱甘肽乙酰转移酶的核酸序列。
30.在其基因组中携有权利要求28的核酸序列的植物。
31.在其基因组中携有权利要求22的诱导型启动子的植物。
32.在宿主细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：
用含有小球藻启动子、lac操纵基因和编码蛋白质的结构基因的核酸序列转化宿主细胞；和
在足以使结构基因表达为蛋白质的条件下保温经转化的细胞。
33.权利要求32的方法，其中所述经转化的细胞在21至37℃的温度范围内保温。
34.权利要求33的方法，其中所述经转化的细胞在低于37℃的温度下保温。
35.权利要求32的方法，其中所述经转化的细胞在21至30℃的温度范围内保温。
36.权利要求28的启动子，该启动子在21至37℃的温度范围内起作用。
37.权利要求36的启动子，该启动子在低于37℃的温度下起作用。
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