CN1247787C - 实现细胞的改变的方法及载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用一种转移系统而实现细胞的改变的方法，其中该转移系统与待改变细胞接触。所述转移系统包括一种融合蛋白，该融合蛋白用VirB/VirD4转移系统转移进所述细胞。根据本发明，一种融合蛋白BA被导入待改变的细胞中，所述融合蛋白BA包括i)第一部分A，即包含三个相邻的与VirF，VirD2，VirE2，VirE3或MobA的C末端第1-40位氨基酸相同或相应的氨基酸的一种寡肽；和ii)第二部分B，即能够在待改变的细胞中履行细胞改变活性的一种多肽，其中该多肽的C末端与第一部分A的N末端相连。

Description

实现细胞的改变的方法及载体

一.技术领域

本发明涉及实现细胞的改变的方法，其中一种转移系统与待改变细胞接触，所述转移系统包括一种膜和在膜中的一种蛋白转运系统，该蛋白转运系统含有一个包含VirB复合物和VirD4蛋白的孔，其中所述转移系统包括或能够产生一种通过蛋白转运系统导入细胞的融合蛋白。

二.背景技术

这种方法是Zhou，X-R等人提出的(细菌学杂志，181(14)，P4342-4352(1999))。这一出版物揭示了VirE2蛋白是根癌农杆菌的单链DNA结合蛋白，可以通过致瘤性农杆菌转移进宿主细胞。Zhou等人公布只能在其第39位氨基酸(从N端开始，如本领域通常所指)插入要转入宿主细胞的外源氨基酸序列。他们的结论是：通过与VirE2的一个末端融合产生的蛋白输送系统实际并不易于操作。但至少小蛋白在39位的插入是可耐受的。

三.发明内容

本发明的目的如前文所述是提供一种便于操作的方法，而且根据需要，操作可以在没有野生型VirE2活性的待改变细胞中进行。相应的，本发明方法的特征在于将一种融合蛋白BA导入待改变的细胞中，所述融合蛋白BA

i)包括第一部分A，即包含三个相邻的与VirF，VirD2，VirE2，VirE3或MobA C末端第1-40位氨基酸相同或相应的氨基酸的一种寡肽；

ii)包括第二部分B，即能够在待改变的细胞中履行细胞改变活性的一种多肽，其中多肽的C末端与第一部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白第一部分A衍生于VirE2，则融合蛋白不包括VirE2N末端84个氨基酸。

令人惊讶的发现是，倘若符合上述条件，由多肽(第二部分B)与VirF，VirD2，VirE2，VirE3或MobA(第一部分A)的(内部)N端氨基酸偶联形成的蛋白可以从胞外被导入待改变的细胞内，其结果是导入的第二部分B的活性可以在待改变的细胞中表达，及细胞发生改变。这种改变可以是暂时的(可逆的)或永久的(不可逆的)。VirF，VirD2，VirE2，VirE3及MobA的氨基酸序列分别如序列号1-5所示。根癌农杆菌菌株，含有编码所有vir蛋白的质粒(LBA8250，一种包含一种编码所有vir蛋白的质粒的菌株(LBA8250，根癌农杆菌菌株，含有质粒pTi15955，质粒pTi15955如Sciaky等人所述，质粒1，p.238-253(1978))，保藏在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心(Phabagen collection of the Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS))，保藏号PC2692。已知MobA蛋白来自incQ质粒RSF1010，CBS的NCCB保藏中心保藏号为PC-V3110的大肠杆菌菌株K12C600中含有该质粒，并如Scholz，P.等人所述，p.271-288(1989)。

本发明中，相应的氨基酸是下表所示的氨基酸：

A，G；

S，T；

D，E：

N，Q；

R，K；

I，L，M，V；及

F，Y，W

不言而喻第一部分A可包括更多相邻的或不相邻的上述序列相同或相应的氨基酸。同样的，一个或多个不相应、不相同的氨基酸可以作为间隔子存在于所述三个相邻的氨基酸和第二部分B之间。而且，这种间隔子可以出现在三个相邻氨基酸的上游。

如果需要，第一部分A可以包括更多个从VirF，或VirE2，VirF3，VirD2或MobA的41位(从C末端开始)开始的氨基酸。这应符合上述VirE2的条件。

本发明中，载体应理解为任何DNA或RNA序列，它们可以直接或间接导致转移系统中融合蛋白的形成。

转移系统可以是细胞，非常适合地例如一种细菌细胞，特别是根癌农杆菌；也可以是人工合成的系统，例如微型细胞或人工合成的囊泡系统。

待转移的融合蛋白可以是转移系统自身形成的，例如，通过表达含有功能基因系统的载体，此系统可以表达产生融合蛋白，或者融合蛋白本身可以导入转移系统。人工合成的转运系统通常与后者相同。这种人工转运系统的主要优点是其可以引入环境中，例如用于处理作物，而没有散播遗传物质的危险。

优选的，第一部分A的寡肽含有RXR或其衍生物。此处X是任何氨基酸。据信由三个氨基酸组成的这种基序对转移系统转运蛋白非常必要。

根据优选实施方案，第一部分A的寡肽含有RPR，RAR，RQR，RSR或RVR或其衍生物。

本发明中“其衍生物”对应于(寡)时肽是指至少一个氨基酸被相应氨基酸替代的(寡)肽。

优选地，融合蛋白无需引入DNA或RNA序列即可导入胞内。使用根癌农杆菌作为转移系统时，这是指没有T-DNA。这意味着不需引入遗传物质到待改变的细胞中即可改变细胞。

根据一重要实施方案，导入的融合蛋白具有重组酶活性。

在这个例子中，事实上可以在待改变的细胞的染色体DNA中进行一改变，而无需引入其它遗传物质(编码T-DNA或肽B的载体)。一重要的应用是，例如，去除不希望进入环境中的标记基因。尤其是，这可包括去除在重组酶识别的直接重复DNA序列之间的抗生素抗性基因。

根瘤菌科中的细菌可方便地用作转移系统。

这些细菌中农杆菌，根瘤菌，和叶菌非常适用于植物，酵母或真菌的修饰。其它属于这个科的细菌，例如，布鲁氏菌，已知它与人类和动物细胞间的相互作用，也可以用于这种修饰。

根据优选的实施方案，使用已知非常适合修饰原核生物(细菌)和真核生物(植物、酵母、真菌和动物细胞)的农杆菌。

根据优选的实施方案，选自i)植物细胞；ii)酵母细胞；和iii)真菌细胞的细胞用作待修饰的细胞。

本发明还涉及一种载体，其特征是编码一种包含孔的蛋白转运系统，所述孔含有VirB复合物和VirD4蛋白，所述载体还编码融合蛋白BA，该融合蛋白BA包括i)第一部分A，即包含三个相邻的与VirF，VirD2，VirE2，VirE3或MobA C末端第1-40位氨基酸相同或相应的氨基酸的一种寡肽；和ii)第二部分B，即能够在待改变的细胞中履行细胞改变活性的一种多肽，其中该多肽的C末端与第一部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白第一部分A衍生于VirE2，则融合蛋白不包括VirE2N末端84个氨基酸。

这种载体可以被引入一转移系统，如细菌中。由此，此载体拥有所有用于转移蛋白必需表达的信息，使融合蛋白得以转入待改变的细胞中。

最后，本发明涉及一种载体套(vector set)，其特征是含有一个或多个编码一种包含孔的蛋白转运系统、所述孔含有VirB复合物和VirD4蛋白的载体，和一另外的载体，其编码融合蛋白BA，该融合蛋白BA包括i)第一部分A，即包含三个相邻的与VirF，VirD2，VirE2，VirE3或MobA C末端第1-40位氨基酸相同或相应的氨基酸的一种寡肽；和ii)第二部分B，即能够在待修饰的细胞中履行细胞修饰活性的一种多肽，其中该多肽的C末端与第一部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白第一部分A衍生于VirE2，则融合蛋自不包括VirE2 N末端84个氨基酸。

这种载体套的优点是编码蛋白转运系统的一或多个载体能够独立于编码融合蛋白的载体而引入转移系统。这样可以利用转移系统，尤其是细菌，作为修饰细胞的标准载体，其中转运系统进一步含有在转运系统中表达以完成修饰的载体。

四.实施例

本发明参照下述实施例及附图得以阐述，其中唯一的附图显示了证实植物中Cre活性的检测系统。

细菌菌株

农杆菌菌株LBA1010(Koekman等，质粒7(1982)；119-132；真菌菌种保藏中心(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)；Baarn.荷兰，保藏号：PC2805)含有在C58染色体背景中的野生型Ti质粒pTiB6。LBA1100(Beijershergen等，科学256(1992)，1324-1327；在不含庆大霉素下通过培养CBS 102794即可获得，真菌菌种保藏中心；Baarn，荷兰，2000年5月17日保藏，为了制备pSDM3155及筛除小质粒(ca.5.5kb))是LBA1010的非致瘤性衍生菌株。为此pTiB6两边的T区及tra和occ基因被大观霉素抗性基因替代，产生质粒pAL1100，其中完整保留Vir区。本发明中使用衍生自LBA1100的几个vir突变体，分别为LBA1142-1150(Beijersbergen等，科学256(1992)，1324-1327)(表1)。LBA2561准确删除了pAL1100中的virF基因(Schammeijer等，国际分子植物微生物学5(1998)，429-433)。细菌菌株的转化和生长按照其它文献所述进行操作(Vergunst等，核酸研究26(1998)2729-2734)或根据本领域熟练技术人员已知的通用技术进行(Sambrook等，分子克隆，实验指南(1989))。

质粒构建

克隆cre基因编码区，分别与pTi15955的virE2和virF基因融合不改变读码框，并各受vir启动子区的控制。形成N末端和C末端融合。质粒构建详述如下。

cre调控质粒

克隆存在于pUC19cre质粒(Mozo & Hooykaas，分子基因遗传学236(1992)，1-7)中的cre重组酶编码区，形成SphI/EcoRI片段插入pUC21(Vieira & Messing，基因100(1991)，189-194)产生pSDM3120。为了去除ATG起始密码子，用引物cre1(5’-ggc agatctgTCCAATTTACTG)和cre2(5’-GATAA TCGCGAACATCTTCAGG)PCR扩增pSDM3120的cre基因5’末端。用BglII和NruI(划线部分)消化PCR片段后，用其替换pSDM3120中相应的片段(产生creΔATG或pSDM3121)。pRAL3248(Melchers等，植物分子生物学，14(1990)，249-259)的SalI片段中含有包括virE启动子区的virE1和virE2(最后30个3’末端碱基对缺失)，将其克隆到pSDM3121的XhoI限制酶切位点(pSDM3122)。用BglII完全酶切，BstYI部分酶切后，分离携带virE启动子，virE7编码区，virE2的ATG起始密码子及cre(ΔATG)的载体，通过自身环化cre基因与virE2的ATG起始密码子相连接且不改变读码框(pSDM3126)。这样cre基因的表达受virE启动子的调控。接着此结构中的StuI/XbaI片段插入SmaI/XbaI消化的pRL662质粒中，产生pSDM3147，即这些实验中使用的cre控制质粒。不可移动的质粒pRL662具有广泛的宿主谱，用庆大霉素抗性标记替换pBBR1 MCS2的卡那霉素抗性基因及mob区(Kovach等，生物技术，16(1994)，800-802)可以获得(Escudero杂志，欧洲专利申请号00200726.8)。cre::virE2融合体

为了构建cre和virE2的翻译融合体，去除cre基因终止密码子；通过引物cre 6(5’-acgc gtcgactATCGCCATCTTCCAGCAGGCGC)和cre 7(5’-cC ATCGATTGATTTACGGCGCTAAGG)PCR扩增pSDM3126DNA，在终止密码子中引入突变(斜体字)。用ClaI和SalI(划线部分)消化后，pSDM3126中相应的ClaI-SalI片段被取代(产生creΔSTOP或pSDM3127)。接着将无ATG起始密码子含有virE2编码区的pBluevirE2(ΔATG)XhoI/NotI片段连入SalI和NotI消化的pSDM3127载体中(pSDM3128)。将质粒pRAL3248(Melchers等，植物分子生物学，14(1990)，249-259)的VirE1-virE2区(XhoI-SmaI)克隆到pBLUEscript(XhoI/EcoRV)(Alting-Mees及Short，核酸研究，17(1989)：9494)中产生pBluevirE2(ΔATG)，接着用XhoI-StuI连接子(5’-tcgaGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG和5’-CCTGGATTTCTCATTGCCAGAAAG-ATC)去除virE1和virE2的ATG起始密码子。然后将pSDM3128中的cre::virE2融合体作为StuI/XbaI片段插入pRL662(SmaI/XbaI)，产生pSDM3129(cre::virE2融合体)。

virE2::cre融合体

将含有virE1和virE2(最后30个3’端碱基缺失)的pRAL3248SalI片段克隆到pIC19R中(Marsh等，基因32(1984)：481-485)(pSDM3123)。随后的克隆步骤中cre与virE2 3’末端融合，同时pSDM3123中缺失的virE2的最后30个3’末端碱基得以恢复。为此，将pSDM3122中含有cre 200个5’碱基但无ATG起始密码子的BglII/NruI片段克隆到pICl9R(pSDM3151)。为了去除virE2终止密码子(斜体)合成由virE2最后30个3’末端碱基组成的SalI/BglII连接子(5’- TCGACCGCGTAGCCAAAGCGTCAACAGCTTTcga和5’g atctcgAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACGCGG)及实现与cre的翻译融合。将此连接子克隆于pSDM3151(pSDM3152)。然而，序列分析显示由于单碱基取代virE2ΔSTOP3’末端与creΔATG5’末端间的BglII位点丢失。此突变不存在于virE2或cre编码区，对融合体的读码框没有影响。将pSDM3123的SalI片段插入pSDM3152SalI位点(pSDM3157)，将整个virE2序列克隆到cre 5’末端并保持读码框一致。用pSDM3157中600个碱基的NruI片段(VirE2ΔSTOP的3’末端和creΔATG的5’末端)替换pSDM3148的NruI片段(pSDM3148是通过将pSDM3122的StuI/XbaI片段克隆到pRL662XbaI/SmaI中产生)在完整的virE2和cre之间产生翻译融合体并受virE启动子调控，与VirE1共同表达。

virF::cre融合体

将pRAL7088(Schrammeijer等，MPMI 11(1998)429-433)中长600个碱基对含有virF 5’侧翼区和核糖体结合位点的SacI/FcoRV片段克隆于pBluescriptSK-(Alting-Mees和Short，核酸研究，17(1989)：9494)，产生pSDM3183。合成具有EcoRV平端和3’SalI粘端的猿猴病毒40核定位序列(NLS)(5’-ATCATGGATAAAGCGGAATTAATTCCCGAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATTGGGTACCGG和互补链)，并克隆于pSDM3183，产生pSDM3184。分两步将不含ATG和终止密码子的virF基因克隆到SV40NLS下游并保持读码框一致。在pRAL7088的BamHI和NsiI位点克隆入BamHI/NsiI连接子(5’-GATCCGAAATTCGAGTTTGCGTGATGCA)去除ATG起始密码子(pSDM3192)。将pSDM3192中1500个碱基对的BamHI/SacI片段克隆到pIC19H中(pSDM3193)。将pSDM3193中含有virFΔ498-609ΔATG的500个碱基对的SalI/XhoI片段克隆到pSDM3184的XhoI位点中并与SV40NLS读码框保持一致，产生pSDM3185。用两个引物(5’-ATCCCTAACTTGGTCTTCAAC和5’-ctt agatcTAGACCGCGCGTTGATCGAGG)PCR扩增pRAL7088去除virF的终止密码子。将175bp的PCR片段亚克隆到pGEM T(Promega)上。将16bp的StuI/BglII连接子(5’-c ctcgagcccgggata和5’-gatctatcccggg ctcgagg)克隆于StuI/BglII消化的pSDM3121上并引入XhoI位点(划线部分)便于进一步克隆读码框一致的cre及virF(pSDM3121-L)。接着将pGEM-T载体上virF3’末端110碱基对的XhoI/BglII片段插入pSDM3121-L cre5’末端的XhoI/BglII位点(产生pSDM3186)。将pSDM3186上1.2kb的XhoI/SalI片段连入pSDM3185的XhoI位点，形成pSDM3187。将virF::cre融合序列以SacI/pstI位点引入pUC28(Benes等，基因130(1993)；151-152)的SacI/PstI位点，再用EcoRI切下融合序列连入pRL662的EcoRI位点，产生pSDM3153，即NLS::virF::cre融合质粒。

cre::virF融合体

最后将pSDM3184中含有virF非翻译区和SV40NLS序列的0.66kb片段通过SacI/SalI克隆到pIC19H上，再通过HindIII/SalI位点克隆到pIC19R上，通过SalI/XhoI位点克隆到pSDM3121的XhoI位点。产生读码框一致的SV40NLS与cre5’末端的融合(pSDM3188)。用pSDM3127上的ClaI/SalI creΔSTOP片段替代pSDM3188上的ClaI/SalI片段(含有cre3’末端及终止密码子)去除cre的终止密码子，形成pSDM3189。将pSDM3189的HindIII/XbaI片段克隆到pRL662的HindIII及XbaI位点，形成pSDM3154(NLS::cre::virF融合质粒)。

另外，对virF进行不同删除并克隆于cre3’末端保持读码框一致。使用引物F126(5’acgc gtcgaCTGTCGAGTCGGCTGAGvirF的第127位)及pflF2(5’-GACCAGCACACTTAGATACC，与3’virF相邻的DNA序列)在pRAL7088上进行PCR。将780bp的PCR片段克隆到载体pT7pBlue-T(Novagen)(pSDM3194)。将pSDM3194上555个碱基对的SalI/EagI片段(virFΔ1-126)克隆到pSDM3179，产生pSDM3190。将NLS::cre::virFΔ1-126融合体作为HindIII/XbaI片段融合于载体pRL662产生pSDM3155(NLS::cre::virFΔ1-126融合质粒)。

将virF3’末端113个核苷酸与cre融合并保持读码框一致。为此，pSDM3189的HindIII/XbaI片段转至pUC18(Yanish-Perron等，基因33(1985)；103-119)，产生pSDM3172。用XhoI和SalI消化pSDM3172，用绿豆核酸酶消除5，粘端后载体自身环化使virF的3’末端最后112个碱基与cre融合并保持读码框一致(pSDM3173)。将NLS::cre::virFΔ1-498融合体作为XbaI/HindIII片段转移到pRL662形成质粒pSDM3174(NLS::cre::virFΔ1-498融合质粒)。

将质粒转入表1所示的细菌菌株。另外，质粒pSDM3191中virD3和virD4基因受virD启动子调控，它可在LBA1147和LBA1150中穿梭。在pLM997(Melchers，未公布)的BamHI限制位点克隆入pMP3(Vogel和Das.，细菌学杂志174(1992)，5161-5164)的4.4kb的BamHI片段，产生pSDM3191，pLM997是将pBin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711-8721)的T区用pIC19R/H多接头序列(Marsh等，基因32(1984)：481-485)替换形成的。

                      表1

                    所用菌株

菌株	质粒	抗性标记
			LBA1010	pTiB6	Rif
LBA1100	pTiB6ΔTl，Tr，Δtra，Δocc	Rif，Sp
			LBA2561	pAL1100ΔvirF	Rif，Sp
LBA1142	pAL1100(virA::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
			LBA1143	pAL1100(virB4::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
LBA1144	pAL1100(virB7::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
			LBA1145	pAL1100(virG::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
LBA1146	pAL1100(virC2::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
			LBA1147	pAL1100(virD2::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
LBA1148	pAL1100(virD4::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
			LBA1149	pAL1100(virE2::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb
LBA1150	pAL1100(virD1::Tn3Hohol)	Rif，Sp，Cb

通过筛选virF基因两侧DNA同源区域与NLS::cre::virF(pSDM3189)间形成的单交换体，NLS::cre::virF融合基因与LBA2561中辅助质粒连接，产生LBA2561::NLS::cre::virF。

作为植物转化的对照，使用与LBA1100相当但含有tra及occ基因的LBA1115(＝MOG101(Hood等，转基因研究2(1993)208-218)。将含有受农杆菌两侧相邻序列(T-DNA边界重复)间甘露碱合酶启动子调控的cre基因的IncP载体pSDM3088(Vergunst&Hooykaas，植物分子生物学，38(1998)，393-406)，转入LBA1115。

植物品系

通过农杆菌介导的根外植体转染法将质粒pSDM3043(参照图及Vergunst&Hooykaas，植物分子生物学38(1998)，393-406)转入Arabidopsis thaliana C24，转化子通过膦丝菌素抗性筛选(30mg/l)。具有切除基因座3043的植物对卡那霉素敏感。转化植物的筛选是根据Cre介导的bar基因(参照附图)的切除效率进行的，bar基因两侧为直接重复的lox位点(参照图中的箭头)，转基因(1个基因座)分离率为3∶1。Cre介导的切除可通过用Cre表达载体pSDM3088转化根外植体完成。这种切除同时使卡那霉素抗性基因恢复。

植物转化

按照文献报道(Vergunst等，分子生物学方法82，pp227-244(1998))进行农杆菌介导的Arabidopsis根外植体转化。将对于切除基因座3043是纯合子的10天龄幼苗(T3或T4)根部用于转化分析，使用菌株含有上文构建质粒，如表1所示。共培养2天后，将外植体转于培养基上诱导愈伤组织及茎的生长，培养基含有50mg/l卡那霉素及100mg/l替门汀。培养2，3周后确定卡那霉素抗性愈伤组织数目。进行PCR分析确定愈伤组织再生的卡那霉素抗性茎的数目。

PCR分析

分离用于PCR分析的染色体DNA的方法和PCR操作步骤如文献报道所述(Vergunst等，植物分子生物学，38(1998)，393-406)。用于分析卡那霉素抗性愈伤组织和植物的引物(图中a和b)为

a)(5’-GAACTCGCCGTAAAGACTGGCG-3’)，与35S启动子区域退火(图中pDE35S)；和

b)(5’-GCGCTGACAGCCGGAACACG-3’)，与npt11编码序列退火(参照附图)。用于质粒构建的引物有详细说明。

结论

为说明农杆菌能够将融合蛋白转入受体植物细胞，使用重组分析检测Cre重组酶的转运。为此，植物细胞核含有一DNA片段，其在Cre作用下产生特异缺失后会具有卡那霉素抗性筛选特性。通过农杆菌介导的转化将这一Cre重组(pSDM3043，图1)底物转移进Arabidopsis基因组中，使用膦丝菌素抗性筛选。转基因植物对卡那霉素敏感。然而，Cre介导的两个lox串联位点间的重组导致该间插DNA片段被切除，而且由于包括ATG起始密码子和N末端编码部分(lox序列所确定的)的35S启动子区与nptII编码区的翻译融合而导致nptII基因活化。这种融合导致卡那霉素抗性。这样，只有发生Cre介导的重组的细胞才能在筛选培养基上存活。分离植物品系，其含有单位点切除底物而且切除效率(通过检测Cre活性造成的卡那霉素抗性愈伤组织数目)与农杆菌介导的转化相当。这通过共培养携带二元载体的农杆菌菌株(LBA1115-pSDM3088)及植物品系进行检测，该二元载体中T-DNA含有强启动子序列驱动的cre基因。筛选的切除品系进一步进行分析证实包括Cre重组酶在内的蛋白质直接从农杆菌种转运至植物细胞中。为此，Cre重组酶在农杆菌vir诱导系统的调控下表达，其单独表达或作为与VirF或VirE2的N末端或C末端的融合体表达。用免疫印迹分析检测农杆菌中融合蛋白的表达(数据未显示)。融合蛋白的重组活性分析通过将质粒pSDM3043转入相关测试菌株中，检测诱导质粒中的切除事件的能力而进行(数据没有显示)。

共培养上述植物细胞及农杆菌菌株LBA1010，LBA1100，LBA1149，或LBA2561，或具有表达Cre重组酶的质粒(cre控制质粒)的这些菌株的衍生物，最多在选择性培养基上仅有一个转化子存活。这样在与不表达Cre的农杆菌菌株共培养时获得的卡那霉素抗性愈伤组织数目(“背景”)和在与表达Cre重组酶的农杆菌菌株共培养时获得的卡那霉素抗性愈伤组织数目相同。所以，我们认为细菌表达的Cre重组酶没有转入植物细胞。

但是当用表达Cre和VirE2或Cre和VirF融合蛋白的农杆菌细胞进行实验时，结果完全不同。分别使用表达与VirE2和VirF的C末端或N末端Cre融合体的农杆菌菌株(对于各Vir蛋白为野生型和突变体)。发现与Vir蛋白N末端区的融合体(Cre::virE2；NLS::cre::virF)，而不是与C末端的融合体(virE2::cre；NLS::virF::cre)，产生具有卡那霉素抗性的愈伤组织的效率很高。辅助质粒(LBA2561::NLS::cre::virF)表达的Cre::virF融合体或质粒pRL662(LBA2561，pRL662NLS::cre::virF)表达的该融合体间没有差别。共培养表达virF N端42个氨基酸缺失的Cre::virF融合体(NLS::cre::virFΔ1-126)的农杆菌菌株(野生型和virF突变体)，获得卡那霉素抗性愈伤组织的频率明显较高。共培养表达VirF C末端最后37个氨基酸与Cre的融合蛋白(NLS::cre::virFΔ1-498)的菌株，获得的卡那霉素抗性愈伤组织数目相当高。

作为对照，将含有融合质粒NLS::cre::virFΔ1-126及cre::virE2的菌株与野生型Arabidopsis C24根部外植体进行共培养，正如所预期的，由于没有切除基因座而不具有卡那霉素抗性。

PCR分析证实卡那霉素抗性确实由推测的Cre介导的切除事件造成。分离自切除品系3043的DNA进行PCR分析，得到2.3kb的片段(参照附图)，而从通过共培养表达cre::virE2和NLS::cre::virF的菌株获得的卡那霉素抗性愈伤组织中分离的DNA样品得到0.7kb的片段。为此用与cre编码区退火的引物进行PCR分析排除表达cre的T-DNA载体的污染。如预期，没有检测到片段。

对照实验(包括与不含cre基因的农杆菌菌株共培养进行的实验)所获得的很少的愈伤组织的PCR分析显示这些部分是由切除产生的，这可能是因为lox位点间的同源重组，也可能部分由于敏感植物在选择性培养基上的继续生长(“逃逸”)造成。第二种情况下，检测到2.3kb的片段，而没有指示切除的0.7kb片段。这样所有结果说明农杆菌能够将Cre重组酶导入植物细胞，但只有在其作为与VirE2或VirF的N末端附着的融合蛋白表达时才能导入。通过共培养植物品系3043和表达Cre与VirF C末端161或37个氨基酸形成的融合蛋白的农杆菌菌株获得卡那霉素抗性愈伤组织的效率显示在VirF C末端最后37个氨基酸中肯定存在一转运结构域。由于已知的VirF，VirE2和VirD2在植物中的功能，VirF、VirE2和VirD2的C末端三个不变的氨基酸(RPR基序)提示这些氨基酸在应用VirB/VirD4系统将Vir蛋白转运入植物时有重要作用(见后)。基序中任一R残基突变导致转运功能丧失，但是如果P残基变成A，Q，V和S中的一个，仍可保持完整的转运活性。

本发明中转运融合蛋白的试验用与植物品系3043共培养后产生的卡那霉素抗性进行检测，它不受T-DNA共转移的影响。这说明蛋白转运系统的一个重要应用，即可在T-DNA缺失的情况下改变细胞。然而另外，转移也可在T-DNA(可是致瘤性的，也可不是)存在的情况下进行，这扩大了系统的应用范围。另一种可能的应用是通过与在同种或共转化的细菌中作为融合蛋白表达的重组酶共转运将T-DNA定点整合于受体细胞基因组中。

将NLS::cre::virFΔ1-126及cre::virE2转入一系列vir突变体中，确定何种侵入性功能对蛋白转运是必需的，列于表1。

将含有融合质粒的virA，virB，virG及virD4突变体与切除品系进行共培养，不产生Cre介导的切除，但virC，virD1/D2，virF及virE2突变体产生愈伤组织的效率与野生型相当。所以我们得出结论在这一模型系统中，VirA和VirG负责形成VirB和VirD4，通过调节子VirA和VirG调控vir基因的表达对转运是必需的。但除此之外，只有确定IV型分泌通道(B-复合物)和偶联因子(VirD4)的virB基因和virD4是必要的。在其他系统中存在virB和virD4的同系物(例如O’Callaghan等，分子微生物学33(1999)：1210-1220)，使得可以根据同源系统在农杆菌和其它微生物中构建相似的蛋白转运系统。其它侵入性基因(virulence genes)包括编码转运蛋白VirD2，VirE2和VirF的基因，似乎并非融合蛋白转运必需的。

在酵母细胞中进行与上述相似的重组分析，以证实相同条件下农杆菌可以将融合蛋白转运至其它真核细胞中。酵母细胞在存在5-氟尿嘧啶时不能生长，除非重组酶去除存在于lox位点间的编码将5-氟尿嘧啶转化成酵母细胞毒性物质的蛋白质的基因。重组酶以融合蛋白形式引入酵母。如预期的，这样处理的酵母对5-氟尿嘧啶产生抗性(结果未显示)。这些实验可以证实VirE3和VirE2 C末端可以转运重组酶，而且说明转运可以通过incQ质粒RSF1010编码的VirE3和MobA蛋白的C末端进行(结果未显示)。第二种蛋白的C-末端同样存在RPR序列，MobA中存在RQR序列。

序列1

virF_15955(1-609)的氨基酸序列

通用密码子

氨基酸总数：202，MW＝22394

最大开放阅读框：1-606，202AA，MW＝22394

起始

1     MRNSSLRDAS GSNDAQVPHK

21    TELLNLPDHV LTEVAKRLAT

41    NNPVESAENI ANFSKSHRFT

61    RDAVRTEPLE KFSSRLKILS

81    RNAKLLSHAV RHAATLPDGE

101   QLSEAQLSQM RSEVATRPVL

121   GVAYTHQDGQ PEERLSGNHL

141   DHKINNIPNL VFNVAEPIMF

161   NEISALEVMA EVRPIARSIK

181   TAHDDARAEL MSADRPRSTR

201   GL^*

序列2

VirD2_pTi15955(1-1275)的氨基酸序列

通用密码子

氨基酸总数：424，MW＝47476

最大开放阅读框：1-1272，424AA，MW＝47476

起始

1    MPDRAQVIIR IVPGGGTKTL

21   QQIINQLEYL SRKGKLELQR

41   SARHLDIPVP PDQIRELAQS

61   WVTEAGIYDE SQSDDDRQQD

81   LTTHIIVSFP AGTDQTAAYE

101  ASREWAAEMF GSGYGGGRYN

121  YLTAYHVDRD HPHLHVVVNR

141    RELLGHGWLK ISRRHPQLNY

161    DGLRKKMAEI SLRHGIVLDA

181    TSRAERGIAE RPITYAEHRR

201    LERMQAQKIQ FEDTDFDETS

221    PEEDRRDLSQ SFDPFRSDPS

241    TGEPDRATRH DKQPLEQHAR

261    FQESAGSSIK ADARIRVSLE

281    SERSAQPSAS KIPVIGHFGI

301    ETSYVAEASV RKRSGIFGTS

321    RPVTDVAMHT VKRQQRSKRR

341    NDEEAGPSGA NRKGLKAAQV

361    DSEANVGEQD TRDDSNKAAD

381    PVSASIGTEQ PEASPKRPRD

401    RHDGELGGRK RARGNRRDDG

421    RGGT^*

序列3

virE2_pTi15955(1-1602)

通用密码子

氨基酸总数：533，MW-60502

最大开放阅读框架：1-1599，533AA，MW＝60502

起始

1      MDLSGNEKSR PWKKANVSSS

21     TISDIQMTNG ENLESGSPTR

41     TEVLSPRLDD GSVDSSSSLY

61     SGSEHGNQAE IQKELSALFS

81     NMSLPGNDRR PDEYILVRQT

101    GQDAFTGIAK GNLDHMPTKA

121    EFNACCRLYR DGAGNYYPPP

141    LAFDKISVPA QLEETWGMME

161    AKERNKLRFQ YKLDVWNHAH

181    ADMGITGTEI FYQTDKNIKL

201    DRNYKLRPED RYVQTERYGR

221    REIQKRYQHE LQAGSLLPDI

241    MIKTPKNDIH FVYRFAGDNY

261    ANKQFSEFEH TVKRRYGGET

281    EIKLKSKSGI MHDSKYLESW

301    ERGSADIRFA EFVGENRAHN

321    RQFPTATVNM GQQPDGQGGL

341    TRDRHVSVEF LMQSAPNSPW

361    AQALKKGELW DRVQLLARDG

381    NRYLSPHRLE YSDPEHFTEL

401    MNRVGLPASM GRQSHAASIK

421    FEKFDAQAAV IVINGPELRD

441    IHDLSPENLQ NVSTKDVIVA

461    DRNENGQRTG TYTSVAEYER

481    LQLRLPADAA GVLGEAADKY

501    SRDFVRPEPA SRPISDSRRI

521    YESRPRSQSV NSF^*

序列4

virE3-pTi15955(1-2019)

通用密码子

氨基酸总数：672，MW＝75584

最大开放阅读框架：1-2016，672AA，MW＝75584

起始

1      MVSTTKKSFA KSLTADMRRS

21     AQRWEQMRK ALITEEEALK

41     RQTRLESPDR KRKYAADMAI

61     VDKLDVGFRG EIGYKILGNK

81     RLRVDNPKEL TREHGRLRKT

101    KTVLKRNPVT QEVYLGLHER

121    KSWLSVSSHL YAADGTLRMK

141    HVKYKDGRFE ERWERDENGD

161    LIRTRYANRG RLFQPVSEKM

181    GAPYRSGPDN RLYRDLTRQN

201    GFRRETFERD DQGNLERIGS

221    NHVGFSKISV KAANRQTSQT

241    KIQKLGGAFN KSFRSLLDKE

261    GNELGRDILS HRRLYNKRSA

281    VYDEATGQLK SAKHTFGKIY

301    RSETDYLSAG LKKVSKKILG

321    VTVYRKFAAL SERESEAERL

341    RSFESGAHRQ IWQERAATPG

361    SPPSESDDIH FAQQSHLAKA

381    NSDHVEADVM RVTDQHIDVA

401    GQTSSSRQRN LEERLDSQSR

421    YKPANMLLSD PDLRADGPRP

441    YEGLAELTLR RDNESDGHKE

461    NDQRLRHFLQ PEPLVLPHPG

481    SPEITKVFGS RGEPLHPSGT

501    LHTAVGETAC EAPVMSSSLD

521    NHQPAPGQQE LLSLLHNAPA

541    PVSVAIHDEQ ERLAGEAPGG

561    SFRGSSGRTS SMSESIFDED

581    VQSHLVRDYS INPTNGFIDP

601    QSLFGGPDLS RGPKSGPEIP

621    SEDYHLSASE QENLLNQLLS

641    VPLPIPSPKP KSARSMIFEG

661    SRPRERSTSR GF^*

序列5

RSF1010_mobA(1-2130)衍生氨基酸序列

通用密码子

氨基酸总数：709，MW＝77847

1     MAIYHLTAKT GSRSGGQSAR

21    AKADYIQREG KYARDMDEVL

41    HAESGHMPEF VERPADYWDA

61    ADLYERANGR LFKEVEFALP

81     VELTLDQQKA LASEFAQHLT

101    GAERLPYTLA IHAGGGENPH

121    CHLMISERIN DGIERPAAQW

141    FKRYNGKTPE KGGAQKTEAL

161    KPKAWLEQTR EAWADHANRA

181    LERAGHDARI DHRTLEAQGI

201    ERLPGVHLGP NVVEMEGRGI

221    RTDRADVALN IDTANAQIID

241    LQEYREAIDH ERNRQSEEIQ

261    RHQRVSGADR TAGPEHGDTG

281    RRSPAGHEPD PAGQRGAGGG

301    VAESPAPDRG GMGGAGQRVA

321    GGSRRGEQRR AERPERVAGV

341    ALEAMANRDA GFHDAYGGAA

361    DRIVALARPD ATDNRGRLDL

381    AALGGPMKND RTLQAIGRQL

401    KAMGCERFDI GVRDATTGQM

421    MNREWSAAEV LQNTPWLKRM

441    NAQGNDVYIR PAEQERHGLV

461    LVDDLSEFDL DDMKAEGREP

481    ALVVETSPKN YQAWVKVADA

501    AGGELRGQIA RTLASEYDAD

521    PASADSRHYG RLAGFTNRKD

541    KHTTRAGYQP WVLLRESKGK

561    TATAGPALVQ QAGQQIEQAQ

581    RQQEKARRLA SLELPERQLS

601    RHRRTALDEY RSEMAGLVKR

621    FGDDLSKCDF IAAQKLASRG

641    RSAEEIGKAM AEASPALAER

661    KPGHEADYIE RTVSKVMGLP

681    SVQLARAELA RAPAPRQRGM

701    DRGGPDFSM^*

Claims (11)

1.实现细胞的改变的方法，其中一种细菌转移系统与待改变的细胞接触，所述转移系统包括一种蛋白转运系统，该蛋白转运系统含有一个包含细菌IV型分泌通道的孔，其中所述转移系统包括一种融合蛋白或能够产生一种融合蛋白，该融合蛋白通过所述蛋白转运系统导入细胞，其中一种融合蛋白BA被导入待改变的细胞中，所述融合蛋白BA包括：

i)一个部分A和一个部分B，两者来自不同的蛋白；

ii)作为部分A的一种寡肽，其包含由IV型分泌通道转运的细菌蛋白的C末端最后37个氨基酸，所述寡肽至少包含序列RXR或其衍生物，其中R是精氨酸，而X是任何氨基酸；和

iii)作为部分B的一种多肽，其能够在待改变的细胞中履行细胞改变活性，其中该多肽的C末端与部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白部分A衍生于VirE2，则融合蛋白不包括VirE2 N末端84个氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中由IV型分泌通道转运的细菌蛋白选自VirF、VirD2、VirE2、VirE3或MobA。

3.权利要求1的方法，其中融合蛋白通过在转移系统中表达而形成。

4.权利要求1的方法，其中将融合蛋白导入待改变的细胞而不导入DNA或RNA序列。

5.权利要求1的方法，其中导入的融合蛋白具有重组酶活性。

6.权利要求1的方法，其中将根瘤菌科的细菌用作转移系统。

7.权利要求1的方法，其中待修饰的细胞选自i)植物细胞；ii)酵母细胞；和iii)真菌细胞。

8.一种载体，其编码一种包含孔的细菌蛋白转运系统，所述孔含有细菌IV型分泌通道，所述载体还编码融合蛋白BA，该融合蛋白BA包括

i)一个部分A和一个部分B，两者来自不同的蛋白；

ii)作为部分A的一种寡肽，其包含由IV型分泌通道转运的细菌蛋白的C末端最后37个氨基酸，所述寡肽至少包含序列RXR或其衍生物，其中R是精氨酸，而X是任何氨基酸；和

iii)作为部分B的一种多肽，其能够在待修饰的细胞中履行细胞修饰活性，其中该多肽的C末端与部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白部分A衍生于VirE2，则融合蛋白不包括VirE2 N末端84个氨基酸。

9.权利要求8的载体，其中由IV型分泌通道转运的细菌蛋白选自VirF、VirD2、VirE2、VirE3或MobA。

10.载体套，其特征在于，所述载体套含有一个或多个编码一种包含孔的蛋白转运系统的载体，所述孔含有细菌IV型分泌通道，且所述载体套还含有一编码融合蛋白BA的另外的载体，该融合蛋白BA包括

i)一个部分A和一个部分B，两者来自不同的蛋白；

ii)作为部分A的一种寡肽，其包含由IV型分泌通道转运的细菌蛋白的C末端最后37个氨基酸，所述寡肽至少包含序列RXR或其衍生物，其中R是精氨酸，而X是任何氨基酸；和

iii)作为部分B的一种多肽，其能够在待修饰的细胞中履行细胞修饰活性，其中该多肽的C末端与部分A的N末端相连，条件是，如果融合蛋白部分A衍生于VirE2，则融合蛋白不包括VirE2 N末端84个氨基酸。

11.权利要求10的载体套，其中由IV型分泌通道转运的细菌蛋白选自VirF、VirD2、VirE2、VirE3或MobA。

Images