PT1290200E - Translocação de proteínas para células vegetais - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TRANSLOCAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA CÉLULAS VEGETAIS" A presente invenção refere-se a um método para efetuar uma alteração numa célula não humana, em que um sistema de transferência é colocado em contacto com a célula a alterar, o referido sistema de transferência compreendendo uma membrana com um sistema de transporte de proteínas nela compreendendo um poro que compreende um complexo de VirB e a proteína VirD4, em que o sistema de transferência compreende uma proteína de fusão ou é capaz de fazer uma proteína de fusão que seja introduzida na célula por meio do sistema de transporte de proteínas.

Tal método é sugerido por Zhou, XR. et al., (Journal of Bacteriology, 181 (14), pág. 4342-4352 (1999)) . Esta publicação divulga que a proteína VirE2, uma proteína de ligação a ADN de cadeia simples de Agrobacterium tumefaciens, pode ser transferida para uma célula hospedeira através de uma Agrobacterium tumorigénica. Zhou et al. divulgam que apenas no aminoácido 39 (desde o terminal N, tal como é costume na técnica) foram capazes de introduzir uma sequência de aminoácidos heteróloga, que foi transferida para a célula hospedeira. Concluíram que não é praticamente possível basear um sistema de distribuição de proteínas em fusões numa das duas extremidades de VirE2. Pelo menos proteínas pequenas são toleradas como uma inserção no aminoácido 39. 0 objeto da presente invenção é proporcionar um método que seja simples de executar e, se desejado, seja realizado sem atividade nativa de VirE2 na célula a alterar. 2

Por conseguinte, o método de acordo com a invenção é o método tal como descrito na reivindicação 1.

Surpreendentemente, verificou-se que, desde que sejam satisfeitas as condições acima mencionadas, uma proteína pode ser introduzida a partir do exterior para dentro de uma célula a alterar, cuja proteína é formada através da ligação do polipéptido (segunda parte B) a um aminoácido N-terminal (interno) de VirF, VirD2, VirE2, VirE3 ou MobA (primeira parte A) , em resultado do qual a atividade da segunda parte introduzida de B pode ser expressa na célula a alterar, em resultado do qual a célula é alterada. Esta alteração pode ser temporária (reversível) ou permanente (irreversível). As sequências de aminoácidos de VirF, VirD2, VirE2, VirE3 ou MobA são representadas pelos respetivos nos. de sequência 1-5. Uma estirpe compreendendo um plasmídeo (LBA8250, uma estirpe de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pTil5955, pTil5955 é descrito por Sciaky et al., Plasmid 1, pág. 238-253 (1978)) codificando para todas as proteínas vir, está na coleção Phabagen do Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Holanda com o número de acesso PC2692. A proteína MobA é conhecida do plasmídeo incQ RSF1010, como presente na estirpe K12 C600 de E. coli com o número de acesso PC-V3110 da coleção NCCB do CBS, e descrita por Scholz, P. et al. em Gene 75, pág. 271-288 (1989).

Na presente invenção, um aminoácido correspondente é um aminoácido de acordo com a seguinte tabela: A, G; S, T; D, E; N, Q; 3

R, K; I, L, M F, Y, W

Escusado será dizer que a primeira parte A pode compreender mais aminoácidos adjacentes ou não adjacentes, idênticos ou correspondentes às sequências definidas anteriormente. A primeira parte A pode, se desejado, compreender mais aminoácidos a partir do aminoácido 41 (tal como desde o terminal C) de VirF, ou VirE2 ou VirE3 ou VirD2 ou MobA. Isto na condição mencionada para VirE2.

Na presente invenção um vetor entende-se ser qualquer sequência de ADN ou de ARN que, diretamente ou indiretamente, conduza à formação da proteina de fusão no sistema de transferência. 0 sistema de transferência pode ser uma célula, tal como uma célula bacteriana muito adequada, tal como em particular Agrobacterium tumefaciens, mas pode também ser um sistema artificial, tal como um sistema de mini-célula ou de vesículas artificiais. A proteina de fusão a transferir pode ser formada no próprio sistema de transferência, por exemplo, através de expressão de um vetor contendo um sistema génico funcional que possa ser expresso produzindo a proteina de fusão, ou a própria proteina de fusão pode ser introduzida no sistema de transporte. Nos sistemas de transporte artificiais o caso será geralmente o último. Uma vantagem importante de um tal sistema de transporte artificial é que pode ser 4 introduzido no ambiente, por exemplo para tratamento de uma cultura, sem risco de disseminar material genético.

De preferência, a proteina de fusão é introduzida na célula sem a introdução de uma sequência de ADN ou de ARN. No caso da utilização de Agrobacterium tumefaciens como sistema de transferência isto implica a ausência de ADN-T. Isto significa que é possível alterar uma célula sem introduzir material genético na célula a alterar.

De acordo com uma forma de realização importante, a proteína de fusão introduzida tem atividade de recombinase.

Em tal caso, é de facto possível fazer a célula alterar-se no ADN cromossómico da célula a alterar, sem a introdução de material genético adicional (um vetor codificando para o ADN-T ou péptido B) na célula. Uma aplicação importante é, por exemplo, a remoção de um gene marcador, cuja admissão no ambiente é indesejável. Em particular, isto pode incluir a remoção de genes de resistência a antibióticos presentes entre as sequências de ADN em repetição direta para serem reconhecidos pela recombinase.

Convenientemente, uma bactéria da classe de Rhizobiaceae pode ser utilizada como sistema de transferência.

Tais bactérias, entre as quais Agrobacterium, Rhizobium e Phyllobacterium, são muito adequadas para modificação de plantas, leveduras ou fungos. Outras bactérias pertencentes a esta família, tais como Brucella, são conhecidas pela sua interação com células animais e podem ser utilizadas para modificação destas. 5

De acordo com uma forma de realização preferida, é feito uso de Agrobacterium, que se sabe ser muito adequado para a modificação tanto de procariotas (bactérias) como eucariotas (plantas, leveduras, fungos e células animais).

De acordo com uma forma de realização preferida, uma célula escolhida a partir do grupo que consiste em i) uma célula vegetal; ii) uma célula de levedura; e iii) uma célula fúngica, é utilizada como a célula a modificar. A invenção refere-se também a um vetor, sendo o referido vetor caracterizado pelo fato de codificar para um sistema de transporte de proteínas compreendendo um poro que contém um complexo de VirB e a proteina VirD4, bem como uma proteina de fusão BA tal como definido na reivindicação 7.

Um tal vetor pode ser introduzido num sistema de transferência, tal como uma bactéria. 0 vetor possui então toda a informação que precisa ser expressa para a transferência da proteina de fusão, tornando possivel que a proteina de fusão seja transferida para a célula a alterar.

Finalmente, a invenção refere-se a um conjunto de vetores, que se caracteriza por o conjunto de vetores compreender um ou mais vetores codificando para um sistema de transporte de proteinas compreendendo um poro que contém um complexo de VirB e proteina VirD4 bem como um outro vetor codificando para um péptido de fusão BA tal como definido na reivindicação 7. A vantagem de um tal conjunto de vetores é que o vetor ou vetores codificando para o sistema de transporte de proteinas pode ser introduzido num sistema de transferência 6 separado do outro vetor codificando para a proteina de fusão. Isto torna possivel a utilização de um sistema de transferência, em particular uma bactéria, como um veiculo padrão para a modificação de uma célula, em que o sistema de transporte é proporcionado com um outro vetor que é expresso no sistema de transporte para efetuar a modificação. A invenção será ilustrada com referência aos seguintes exemplos e ao desenho em que a única figura mostra esquematicamente um sistema de teste para demonstrar a atividade de Cre in planta.

Estirpes bacterianas A estirpe LBA1010 de Agrobacterium (Koekman et al., Plasmid 7 (1982); 119-132; Centraal Bureau voor Schimmelcultures;

Baarn, Holanda, número de acesso: PC2805) possui o plasmídeo Ti de tipo selvagem pTiB6 num fundo cromossómico C58. LBA1100 (Beijersbergen et al. Science 256 (1992), 1324-1327; facilmente obtido através da cultura de CBS 102794, Centraal Bureau voor Schimmelcultures; Baarn,

Holanda depositado a 17 de Maio de 2000 na ausência de gentamicina para cura do plasmídeo pSDM 3155 e pesquisa quanto à ausência do plasmídeo pequeno (cerca de 5,5 kb)) é um derivado não oncogénico de LBA1010. Para este fim, ambas as regiões T à esquerda e à direita em pTiB6 bem como os genes tra e occ são substituídos por um marcador de resistência à espectinomicina, resultando no plasmídeo pALHOO, em que a região Vir permaneceu intacta. Para o presente pedido foram utilizados vários mutantes vir, derivados de LBA1100, resp. LBA 1142-1150 (Beijersbergen et al., Science 256 (1992), 1324-1327) (Tabela 1). LBA2561 7 contém uma deleção exata do gene virF em pALHOO (Schrammeijer et al., Mol. Plant Micr. Int. 5 (1998), 429-433) . A transformação e o crescimento de estirpes bacterianas foram realizados tal como descrito noutro lugar (Vergunst et ai. Nucl. Acids Res. 26 (1998) 2729-2734) ou de acordo com técnicas gerais conhecidas dos peritos na técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning. A lab manual". (1989)).

Construções plasmidicas A região de codificação do gene cre foi clonada na tradução no gene virE2 e virF de pTil5955, sob o controlo das respetivas regiões promotoras de vir. Foram feitas ambas as fusões N-terminal e C-terminal. As construções plasmidicas são detalhadas abaixo. 0 plasmídeo de controlo de cre A região de codificação do gene de recombinase cre, presente no plasmideo pUC19cre (Mozo & Hooykaas, Mol. Gen. Genet 236 (1992),1-7), foi clonada como um fragmento

Sphl/EcoRl em pUC21 (Vieira & Messing, Gene 100 (1991), 189-194) resultando em pSDM3120. Para remover o codão de iniciação ATG, foi realizada uma amplificação por PCR na extremidade 5' do gene cre com os iniciadores crel (5' — ggcagatctgTCCAATTTACTG) e cre2 (5'-GATAATCGCGAACATCTTCAGG) em pSDM3120. Após digestão do fragmentos de PCR com BglII e Nrul (sublinhado) este fragmento foi trocado pelo correspondente fragmento em pSDM3120 (resultando em creAATG ou pSDM3121). Um fragmento Sall de pRAL3248 (Melchers et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 249-259) no qual estão localizados virEl e virE2 (estando ausentes os últimos 30 pares de bases do terminal 3') incluindo a região promotora de virE, foi clonado no local de restrição XhoI de pSDM3121 (pSDM3122). Após completa digestão de pSDM3122 com BglII e digestão parcial com BstYI, seguido de isolamento do fragmento do vetor possuindo o promotor de virE, a área codificando virEl, o codão de iniciação ATG de virE2, bem como cre (AATG) , o gene cre foi ligado na tradução através de auto-encerramento do codão de iniciação ATG de virE2 (pSDM3126) . Como resultado, a expressão do gene cre é controlada pelo promotor de virE. Subsequentemente esta construção foi transferida como um fragmento StuI/Xbal para o plasmideo pRL662 digerido com Smal/Xbal, resultando em pSDM3147, i.e. o plasmideo de controlo de cre utilizado nestas experiências. 0 plasmideo não mobilizável pRL662 com um amplo espectro de hospedeiros é obtido através da substituição do gene de resistência à canamicina bem como a região mob de pBBRl MCS2 (Kovach et al., BioTechn. 16 (1994), 800-802) com um marcador de resistência a gentamicina (J. Escudero, Pedido de patente europeia 00200726.8). A fusão cre::virE2

Para criar fusões de tradução entre cre e virE2, o codão STOP do gene cre foi removido; para este fim foi introduzida uma mutação no codão STOP (Itálico) utilizando amplificação por PCR no ADN de pSDM3126 utilizando os iniciadores cre 6 (5'-acgcatcgactATCGCCATCTTCCAGCAGGCGC) e cre 7 (5'-cCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGG). Após digestão com

Ciai e SalI (sublinhado), o correspondente fragmento Clal-Sall de pSDM3126 foi substituído (resultando em creESTOP ou pSDM3127). Um fragmento Xhol/Notl de pBluevirE2(AATG) contendo a área de codificação de virE2, sem o codão de 9 iniciação ATG, foi subsequentemente ligado no vetor pSDM3127 digerido com Sall e NotI (pSDM3128) . pBluevirE2(AATG) foi o resultado da clonagem da região VirEl-virE2 (Xhol-Smal) do plasmideo pRAL3248 (Melchers et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 249-259) em pBLUEscript (Xhol/EcoRV) (Alting-Mees e Short. Nucleic Acids Res. 17 (1989): 9494), subsequente à qual virEl e o codão de iniciação ATG de virE2 foram removidos utilizando um ligador Xhol-StuI (5'-tcgaGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG e 5'-CCTGGATTTCTCATTGCCAGAAAGATC). A fusão cre::virE2 foi subsequentemente transferida para pRL662 (Smal/Xbal) como um fragmento StuI/Xbal de pSDM3128, resultando em pSDM3129 (fusão cre::virE2). A fusão virE2::cre

Um fragmento Sall de pRAL3248 compreendendo virEl e virE2 (estando ausentes as últimas 30 bases 3'-terminais) foi clonado no pICl9R (Marsh et al., Gene 32 (1984): 481-485) (pSDM3123). Nos passos de clonagem subsequentes cre foi fundido com a extremidade 3' de virE2, em que ao mesmo tempo as últimas 30 bases 3'-terminais de virE2, ausentes em pSDM3123, foram restauradas. Para este fim, um fragmento BglII/NruI de pSDM3122, compreendendo as 200 bases 5'-terminais de cre, sem o codão de iniciação ATG, foi clonado em pIC19R (pSDM3151). Um ligador Sall/Bglll, consistindo nas últimas 30 bases 3'-terminais de virE2, foi sintetizado para remover o codão STOP de virE2 (Itálico) (5' — TCGACCGCGTAGCCAAAGCGTCAACAGCTTTcga e 5'-gatctcgAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACGCQG) e para efetuar a fusão de tradução com cre. Este ligador foi clonado no pSDM3151 (pSDM3152). No entanto, após análise da sequência, mostrou-se que que se perdia o local Bglll entre a extremidade 3' 10 de virE2AST0P e a extremidade 5' de creAATG devido a uma única substituição de bases. Esta mutação não está presente na região codificando para virE2 ou cre, e não tem qualquer efeito no enquadramento de leitura da fusão. O fragmento SalI de pSDM3123 foi introduzido no local SalI de pSDM3152 (pSDM3157), clonando a sequência completa de virE2 enquadrada com a extremidade 5' de cre. Um fragmento NruI de cerca de 600 pares de bases de pSDM3157 (a extremidade 3' de virE2ASTOP e a extremidade 5' de creAATG) foi subsequentemente utilizado para substituir o fragmento NruI em pSDM3148 (pSDM3148 é o resultado da clonagem de um fragmento Stul/Xbal de pSDM3122 em pRL662 Xbal/Smal) resultando numa fusão de tradução entre a região completa de virE2 e cre (pSDM3166, i.e. a fusão virE2::cre) sob o controlo do promotor de virE, e expressão conjunta de VirEl. A fusão virF::cre

Um fragmento de 600 pares de bases Saci/EcoRV de pRAL7088 (Schrammeijer et al. MPMI 11 (1998) 429-433) contendo o lado flanqueador 5' de virF e o local de ligação ao ribossoma foi clonado em pBluescriptSK" (Alting-Mees e Short. Nucleic Acids Res. 17 (1989): 9494), resultando em pSDM3183. O sinal de localização nuclear (NLS) do vírus símio 40 (SV40) foi sintetizado com um EcoRV cego e uma extremidade 3' coesiva Sal I (5' — ATCATGGATAAAGCGGAATTAATTCCCGAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATT GGGTACCGG e a cadeia complementar), e clonado em pSDM3183, resultando em pSDM3184. O gene virF sem ATG e codão STOP foi clonado em dois passos enquadrado após o NLS de SV40. O codão de iniciação ATG foi removido através de clonagem de um ligador BamHI/Nsil (5'-GATCCGAAATTCGAGTTTGCGTGATGCA) nos 11 locais BamRI e NsiI de pRAL7088 (pSDM3192). Subsequentemente, um fragmento BamRI/Saci de 1,5 quilopares de bases de pSDM3192 foi clonado em pIC19H (pSDM3193). Um fragmento Sall/Xhol de 500 pares de bases de pSDM3193, compreendendo virFA498-609AATG foi clonado enquadrado com o NLS de SV40 no local Xhol de pSDM3184, resultando em pSDM3185. Subsequentemente, o codão STOP de virF foi removido utilizando dois iniciadores (5' — ATCCCTAACTTGGTCTTCAAC e 5'-cttagatcTAGACCGCGCGTTGATCGAGG) numa reação de PCR em pRAL7088. O fragmento de PCR foi subclonado como um fragmento de 175 pb no vetor pGEM T (Promega) . Um ligador StuI/BglII de 16 pares de bases (5' — cctcgagcccgggata e 5' -gatctatcccgggctcgagg) foi clonado em pSDM3121 digerido com StuI/BglII para introduzir um local Xhol (sublinhado) e para realizar outra clonagem enquadrada de cre com virF (pSDM3121-L) . Subsequentemente, a extremidade 3' de virF foi clonada enquadrada nos locais Xhol/BglII de pSDM3121-L como um fragmento Xhol/BglII de cerca de 110 pares de bases do vetor pGEM-T na extremidade 5' de cre (resultando em pSDM3186). Um fragmento Xhol/Sall de 1,2 kb de pSDM3186 foi ligado no local Xhol de pSDM3185, resultando em pSDM3187. A fusão virF::cre foi subsequentemente introduzida em pUC28 (Benes et al., Gene 130 (1993); 151-152) como um fragmento SacI/PstI, e subsequentemente ligada a partir deste plasmideo como um fragmento EcoRI no local EcoRI de pRL662, resultando em pSDM3153, i.e. o plasmideo da fusão NLS::virF::cre.

As fusões cre::virF

Um fragmento de pSDM3184 de 0,66 kb, possuindo o local flanqueador 5' de virF e a sequência de NLS de SV40, foi eventualmente clonado através de um passo de clonagem 12

Sacl/Sall em pIC19H, seguido de uma clonagem Hindi 11/Sall em pIC19R, como um fragmento Sall/Xhol no local XhoI de pSDM3121. Isto resultou numa fusão enquadrada do NLS de SV40 com a extremidade 5' de cre (pSDM3188) . 0 codão STOP de cre em pSDM3188 foi subsequentemente removido através da substituição do fragmento Clal/Sall (com a extremidade 3' de cre incluindo STOP) com o fragmento Clal/Sall creASTOP de pSDM3127 (pSDM3179). Um fragmento Sall/EagI de 690 bp de pSDM3193 compreendendo virFAATG foi clonado no pSDM3179 digerido com Sall/Notl, resultando em pSDM3189. Um fragmento HindIII/Xbal de pSDM3189 foi clonado nos locais HindiII e Xbal de pRL662, resultando em pSDM3154 (o plasmideo da fusão NLS::cre::virF).

Adicionalmente, foram feitas várias deleções de virF que foram clonadas em tradução no terminal 3' de cre. Utilizando os iniciadores F126 (5'— acgcgtcgaCCTGTCGAGTCGGCTGAG, posição 127 em virF) e pflF2 (5'-GACCAGCACACTTAGATACC, na sequência de ADN adjacente a 3' virF), foi efectuada uma reação de PCR em pRAL7088. O fragmento de PCR de 780 pares de bases foi clonado no vetor pT7pBlue-T (Novagen) (pSDM3194). Um fragmento SalI/EagI (virFAl-126) de 555 pares de bases de pSDM3194 foi clonado em pSDM3179, resultando em pSDM3190. A clonagem da fusão NLS::cre::virFAl-126 no vetor pRL662 como um fragmento HindIII/Xbal resultou em pSDM3155 (o plasmideo da fusão NLS: : cre: :virFAl-126) .

Os 113 nucleótidos 3'-terminais do gene virF foram clonados enquadrados com cre. Para este fim pSDM3189 foi transferido como um fragmento HindIII/Xbal para pUC18 (Yanish-Perron et al., Gene 33 (1985); 103-119), resultando em pSDM3172. A digestão de pSDM3172 com Xho I e Sall, remoção da 13 extremidade 5' coesiva utilizando nuclease de feijão Mung seguida de auto-encerramento do vetor resultou numa fusão enquadrada dos últimos 112 pares de bases 3'-terminais de virF com cre (pSDM3173) . A transferência da fusão NLS::cre::virFAl-498 para pRL662 como um fragmento Xbal/HindlII resultou no plasmideo pSDM3174 (o plasmideo da fusão NLS::cre::virFAl-498).

Os plasmideos foram transferidos para as estirpes bacterianas mostradas na Tabela 1. Além disso, o plasmideo pSDM3191, no qual os genes virD3 e virDA estão localizados sob o controlo do promotor virD, foi mobilizado em LBA1147 e LBA1150. pSDM3191 é o resultado da clonagem de um fragmento BamHI de 4,4 quilopares de bases de pMP3 (Vogel e Das, J. Bacteriology 174 (1992); 5161-5164) no local de restrição BamHI de pLM997 (Melchers, não publicado), que é o resultado da substituição da região T de pBin 19 (Bevan et al., Nucleic Acids Res. 12(1984), 8711-8721) por uma sequência poliligadora pIC19R/H (Marsh et al., Gene 32 (1984): 481-485). TABELA. 1

Estirpes utilizadas Estirpe Plasmideo Marcador de resistência LBA1010 pTiB6 Rif LBA1100 pTiB6ATi,Tr, Atra, Aocc Rif,Sp LBA2561 pALHOOAvirF Rif,Sp LBA1142 pALHOO {virA·. :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1143 pALHOO (virB4: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1144 pALHOO (virB7: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb 14 LBA1145 pALHOO (virG: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1146 pALHOO (vírC2: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1147 pALHOO (virD2: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1148 pALHOO (virD4: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1149 pALHOO (virE2: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb LBA1150 pALHOO (virDl: :Tn3Hohol) Rif,Sp,Cb 0 gene da fusão NLS::cre::virF foi também ligado ao plasmideo ajudante em LBA2561 através da seleção de crossovers únicos entre as regiões de ADN homólogas flanqueando o gene virF e NLS::cre::virF (pSDM3189), resultando em LBA2561::NLS::cre::virF.

Como controlo para a transformação da planta foi utilizado LBA1115(=MOG101 (Hood et ai., Transgenic Res. 2 (1993) 208-218)), que é comparável a LBA1100 mas contendo os genes tra e occ. pSDM3 0 8 8 com o vetor IncP (Vergunst & Hooykaas, Plant Mol. Biol. 38 (1998), 393-406), contendo o gene cre sob o controlo do promotor da manopina-sintetase entre as sequências adjacentes esquerda e direita de Agrobacterium ("repetições de fronteira de ADN-T"), foi transferido para LBA1115.

Linhas de plantas O plasmideo pSDM3043 (ver fig. e Vergunst & Hooykaas Plant Mol. Biol. 38 (1998), 393-406) foi introduzido em

Arabidopsis thaliana C24 por meio de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de raiz (Vergunst et al., em "Methods in Mol. Biol." 82 págs. 227-244(1998)) e os transformantes foram selecionados quanto à resistência a fosfinotricina (30 mg/L). As plantas possuindo o locus de excisão 3043 são sensíveis a canamicina. Uma planta 15 transformada, com segregação 3:1 para o transgene (1 locus), foi selecionada com base na eficiência da excisão do gene bar mediada por Cre (ver fig.), flanqueado por locais lox presentes em repetição direta (ver setas no desenho). A excisão mediada por Cre podia ser alcançada através da transformação de explantes de raiz com o vetor de expressão de Cre pSDM3088. Uma tal excisão resultou simultaneamente na reparação de um marcador de resistência à canamicina.

Transformação de plantas 0 protocolo para transformação de explantes de raiz de Arabidopsis mediada por Agrobacterium foi tal como descrito anteriormente (Vergunst et al., em "Methods in Mol. Biol." 82 págs. 227-244 (1998)). Raizes de plântulas com 10 dias de idade, sendo homozigóticas para o locus de excisão 3043 (T3 ou T4) foram utilizadas em ensaios de transformação, utilizando as estirpes descritas na Tabela 1, contendo as construções descritas acima. Após co-cultura durante 2 dias, os explantes foram transferidos para um meio para indução do crescimento de calos e rebentos, meio que continha canamicina a 50 mg/L e Timentina a 100 mg/L. O número de calos resistentes à canamicina foi determinado 2 e 3 semanas após a co-cultura. A análise por PCR foi realizada em vários rebentos regenerados a partir de calos resistentes a canamicina.

Análise de PCR O método usado para isolamento de ADN cromossómico para análise por PCR e o protocolo para a reação de PCR foram descritos anteriormente (Vergunst et ai., Planta Mol. Biol. 16 38 (1998), 393-406). Como iniciadores (a e b no desenho) para a análise de calos e plantas resistentes à canamicina foi feito uso de: a) (5'-GAACTCGCCGTAAAGACTGGCG-3' ) ligando-se na região do promotor 35S (pDE35S no desenho); e b) (5'-GCGCTGACAGCCGGAACACG-3') ligando-se na sequência de codificação nptll (ver fig.). Os iniciadores utilizados para a construção dos plasmideos são mencionados em pormenor.

Resultados

Para mostrar que Agrobacterium transfere proteinas de fusão para células vegetais receptoras, foi utilizado um ensaio de recombinação que permite a detecção do transporte da recombinase Cre. Para este fim, o núcleo da célula vegetal continha um segmento de ADN, que após deleção especifica por Cre resulta numa caracteristica selecionável de resistência à canamicina. Este substrato para recombinação por Cre (pSDM3043, fig. 1) foi transferido por transformação mediada por Agrobacterium para o genoma de Arabidopsis por meio de seleção quanto a resistência a fosfinotricina. As plantas transgénicas foram sensiveis à canamicina. No entanto, a recombinação mediada por Cre entre dois locais lox orientados em cadeia resulta em excisão do segmento de ADN interveniente, e na ativação do gene nptll através de fusão de tradução da região do promotor 35S incluindo o codão de iniciação ATG e uma parte de codificação N-terminal (determinada pela sequência lox) com a região de codificação de nptll. Esta fusão conduz a resistência à canamicina. Assim, apenas as células em que ocorreu um evento de recombinação mediada por Cre sobrevivem no meio seletivo. Foi isolada uma linha de 17 plantas compreendendo um único locus do substrato de excisão e cuja eficiência de excisão (medida pelo número de calos resistentes à canamicina devido à atividade de Cre) foi comparável à eficiência da transformação mediada por Agrobacterium. Esta foi testada através de co-cultura da linha de plantas com uma estirpe de Agrobacterium possuindo um vetor binário com um ADN-T ancorando o gene cre dirigido por uma sequência promotora forte (LBA1115-pSDM3088). A linha de excisão selecionada foi utilizada noutros ensaios para provar o transporte direto de proteínas, incluindo a recombinase Cre, de Agrobacterium para as células vegetais. Para este fim, a recombinase Cre foi expressa sob controlo do sistema de indução vir em Agrobacterium, sozinha ou como uma fusão N-terminal ou C-terminal com VirF ou VirE2, respetivamente. A expressão das proteínas de fusão em Agrobacterium foi testada através de análise de immunoblot (dados não mostrados) . A atividade de recombinação das proteínas de fusão foi ensaiada através da medição da capacidade para induzir um evento de excisão no plasmídeo pSDM3043, plasmideo que foi introduzido nas estirpes bacterianas relevantes para testar este efeito (dados não mostrados).

Após a co-cultura das células vegetais acima mencionadas com as estirpes de Agrobacterium LBA1010, LBA1100, LBA1149 ou LBA2561, ou com um derivado dessas estirpes ancorando um plasmideo expressando a recombinase Cre (o plasmideo de controlo de cre), foi no máximo verificado um único sobrevivente num meio seletivo. Assim foi obtido o mesmo número de calos resistentes a canamicina ("o fundo") durante co-cultura com estirpes que não expressam Cre que durante co-cultura com estirpes de Agrobacterium que não expressam a recombinase Cre. Assim, concluímos que a 18 recombinase Cre expressa em bactérias não é transferida para as células vegetais.

Os resultados foram, no entanto, totalmente diferentes quando as experiências foram realizadas com células de Agrobacterium expressando proteínas de fusão entre Cre e VirE2 ou VirF. Foram utilizadas estirpes de Agrobacterium (tanto tipo selvagem como mutantes para a respetiva proteina Vir) que expressam fusões C-terminais ou N-terminais de Cre com VirE2 e VirF, respetivamente. Verificou-se que a fusão na região N-terminal da proteina vir (Cre::VirE2; NLS::Cre::VirF), mas não na extremidade C-terminal (VirE2::Cre; NLS::VirF::Cre) foi altamente eficiente na produção de calos resistentes a canamicina. Não foi observada diferença se a fusão Cre::VirF era expressa a partir do plasmídeo ajudante (LBA2561::NLS::cre::virF) ou a partir do plasmideo pRL662 (LBA2561, pRL662 NLS::cre::virF). A co-cultura de estirpes de Agrobacterium (tanto de tipo selvagem como mutante de virF) expressando uma fusão Cre::VirF com uma deleção dos 42 aminoácidos N-terminais de virF(NLS::Cre::VirFAl-126j resultou em calos resistentes a canamicina obtidos a uma frequência significativamente mais elevada. A co-cultura de uma estirpe expressando uma proteina de fusão entre os últimos 37 aminoácidos C-terminais de VirF e Cre (NLS::Cre::VirFAl-458) resultou em números elevados comparáveis de calos resistentes a canamicina.

Como controlos, foram co-cultivadas estirpes ancorando os plasmideos de fusão NLS::cre::virFAl-126 e cre::virE2 com explantes de raiz de Arabidopsis C24 de tipo selvagem, mas tal como esperado, estes não resultaram em resistência à canamicina devido à ausência do locus de excisão. 19 A análise de PCR provou que a resistência à canamicina foi de facto causada pelo previsto evento de excisão mediado por Cre. A análise de PCR em ADN isolado a partir da linha de excisão 3043 resultou num fragmento de 2,3 kb (ver fig.), enquanto em amostras de ADN isoladas a partir de calos resistentes à canamicina que foram obtidos após co-cultura de estirpes expressando cre::virE2 e NLS::cre::virF, obtém-se um fragmento de 0,7 kb. Para excluir contaminação com um vetor de ADN-T expressando cre, foi realizada uma análise de PCR com iniciadores que se ligam na região de codificação de cre. Tal como esperado, não foi detetado qualquer fragmento. os três A análise de PCR dos poucos caules obtidos a partir das experiências de controlo (incluindo aqueles a partir de experiências nas quais a cultura foi realizada com uma estirpe de Agrobacterium não ancorando um gene cre) mostrou que estes eram parcialmente o resultado de uma excisão, possivelmente devida a recombinação homóloga entre os locais lox e parcialmente devido ao crescimento continuo de plantas sensíveis no meio de seleção ("escapes"). No último caso, foi detetado o fragmento de 2,3 kb e não o fragmento de 0,7 kb indicando excisão. Todos estes resultados mostram assim que Agrobacterium pode introduzir a recombinase Cre em células vegetais, mas apenas quando expressa como uma proteina de fusão ligada ao terminal N de VirE2 ou VirF. A eficiência de obtenção de calos resistentes a canamicina após co-cultura da linha vegetal 3043 com as referidas estirpes de Agrobacterium expressando fusões de Cre com 161 ou 37 aminoácidos C-terminais de VirF mostra que deve haver um domínio de transporte nos últimos 37 aminoácidos C-terminais de VirF. Tendo em vista a função in planta de VirE2, virF e VirD2 mostrada anteriormente, 20 aminoácidos invariantes (motivo RPR) no terminal C de VirF, VirE2 e VirD2 sugerem a importância desses aminoácidos para o transporte das proteínas Vir para a planta, utilizando o sistema VirB/VirD4 (ver mais adiante). A mutação de um dos residuos R neste motivo conduziu à perda da função de transporte mas quando o residuo P num residuo escolhido a partir de A, Q, V e S foi alterado, a atividade de transporte permaneceu intata.

Nas presentes experiências, o transporte de proteínas de fusão, detetado como resistência à canamicina após co-cultura com a linha vegetal 3043, ocorre independente da co-transferência de ADN-T. Isto implica uma importante aplicação do sistema de transporte de proteínas, ou seja, a possibilidade de efetuar uma alteração nas células na ausência de ADN-T. Além disso, no entanto, a transferência pode também ocorrer na presença de ADN-T (que pode ou não ser oncogénico), o que alarga a aplicabilidade do sistema. A possivel aplicação pode ser integração dirigida ao local de ADN-T no genoma da célula receptora por meio de co-transporte de uma recombinase que seja expressa como uma proteina de fusão na mesma bactéria ou numa co-transformante.

Para determinar quais das funções de virulência são essenciais para o transporte de proteínas, NLS::cre::virFál-126 e cre::virE2 foram transferidas para um conjunto de mutantes de vir, listados na Tabela 1. A co-cultura da linha de excisão com os mutantes de virA, virB, virG e virD4, que ancoram os plasmideos de fusão, não resultou em excisão mediada por Cre, enquanto os mutantes de virC, virDl/D2, virF e virE2 resultaram em calos com 21 eficiências comparáveis às eficiências do tipo selvagem. Assim, podemos concluir que, neste sistema modelo em que VirA e VirG são responsáveis pela formação de VirB e VirD4, a expressão de genes vir através dos reguladores VirA e VirG é necessária para o transporte. Mas, além disso, só os genes virB e virD4, determinando o canal de secreção de tipo IV (complexo B) e o fator de conjugação (VirD4), são essenciais. A ocorrência de homólogos de virB e virD4 noutros sistemas (por exemplo 0'Callaghan et ai., Mol. Microbiol. 33 (1999): 1210-1220) torna possivel construir sistemas de transporte de proteínas semelhantes em Agrobacterium e noutros microrganismos com base nestes sistemas homólogos. Os outros genes de virulência incluindo aqueles codificando para as proteínas transportadas VirD2, VirE2 e VirF, não pareceram ser necessários para o transporte de proteínas de fusão.

Para provar que sob as mesmas condições Agrobacterium transferirá proteínas de fusão para outras células eucarióticas, foi realizado um ensaio de recombinação semelhante ao descrito acima com células de levedura. As células de levedura não crescem na presença de 5-fluoro-uracilo, a menos que uma recombinase remova o gene presente entre os locais lox, gene que codifica uma proteína que converte o 5-fluoro-uracilo numa substância que é tóxica para a célula de levedura. A recombinase foi introduzida como uma proteína de fusão. Como esperado, a levedura assim tratada tornou-se resistente a 5-fluoro-uracilo (resultados não mostrados). Nestas experiências o transporte da recombinase por meio do terminal C de VirE2 e VirF foi confirmado e, além disso, foi demostrado o transporte através dos terminais C de VirE3 e da proteína MobA do plasmídeo incQ RSF1010 (resultados não mostrados). Na 22 proteína VirE3 a sequência RPR está também presente no terminal C, e em MobA está presente a sequência RQR.

Sequência no. 1

Sequência de aminoácidos de virF_15955(1-609) Código universal Número total de aminoácidos: 202, PM = 22394 ORF Máx: 1-606, 202 AA, PM = 22394

ORIGEM 1 nmBBimm GSmAQVVllK 21 TELXM,FDHV Lmmmhkt 41 NNPVESABÍÍI AMFSKSHRFT Si RDAYRTEPLB KJPS S RUCI LS 81 RmKLLSW RHAATLPDÒE 101 QLSE&QLSQM SSEmTRPVL 121 OmYTKQDGQ PEERLSGMIL Ml mmmimh VFNV&EPIMF 1S1 EVEPIARSIK 181 TAHDDARAEL mmmRSTR 201 GL*

Sequência no. 2

Sequência de aminoácidos de VirD2_pTil5955(1-1275) Código universal Número total de aminoácidos: 424, PM = 47476 ORF Máx: 1-1272, 424 AA, PM = 47476

ORIGEM 23 1 MPDRAQVIIR xvPGGKmcrL 21 QQX XNQéEYIí SRKGKXiEÍASít tl saehldipvp POQIRSXAQS 61 WVTEW3IYDE BQsmmmo âi LTTHXIVSPP AGTDQT&AYS 101 mmwmmw mmoGmm 121 YhTmmmm hpklhvvvhr 141 RSLLGHGHLK ISRHHPQLNY 161 DGLSKKMftSt SLSIIGI¥LDA 181 TSmiRGlÃB R|»ITSfAEHRR 201 LERMQftQKIQ PBOTDFDETS 221 PE1DRRDLSQ SFDPFRSOPS 241 TGEPDSATKH ORQPLEQK&R 261 PQESAGSSM ADARIRVSLE 281 SBÊSAQPSÃS KlP¥IGHFGI 301 KTSYVAEASV RKRSGíFGfS 321 RFVTDVÃMHT vkrôqrskrr 341 ndbe&gpsga mmhKhAQS? 361 DSEANVSSQD TRBDSMKÃM3 381 PVSASIGTEQ PEfcSPKRPRD 401 RKDGELGGRK BÀEGKRRDDG 421 RGOT*

Sequência no. 3

Sequência de aminoácidos de virE2_pTil5955(1-1602) Código universal Número total de aminoácidos: 533, PM = 60502 ORF Máx: 1-1599, 533 AA, PM = 60502

ORIGEM 24 I MDLSGNEKSR pwkkamvsss 21 TISDIQMTNG enlrsgsptr 41 TEVLSPRLDD myms&siã SI SeSESCMQAE IQKSLSALFS 81 NHSLPGNBRR SDEYILVHOT 101 GQDMTGim mmmwim 121 EFHACCKLYR OGAGNYYPPP 141 LAFBKXSVPA QLEETWGHMB m AKERKKUIFQ YKLDVWMHAH 181 ADMGITGTll FYQTOKM1KL 202 BBmXLRmO RTVQTERYGR 221 RBIQKRYQHB LQmSLLPOl 241 MIXXPKÈJDIH FVYRFAGDNY 261 ANKQFSEFEH TVKRRYSGET 281 EIKLKSKS6I MHDSKXLBS» 301 ERGSADIRFA ÊFVSEÍÍK&HN 321 RQFPTATVHM GQQPDGQGGL* 341 TRDRHVSVEF LMQSAPNSPW 361 AQALKKGBLW DRVQLLASJDG 381 MRYLSPHSIíE YSDPEKFTEL 4 01 MNRVOLFASM ORQSHAASIK 421 FBKFOAQAAV ivmmsim 44,1 immwmhQ nvstkdviva 461 Ommm&To tytsvaeybr 481 LQLRLPADAA GVLGEAÃBKY 501 SROFVRPEFA SRPISDSHRI 531 , yesrprsqsv nsf*

Sequência no. 4

Sequência de aminoácidos de virE3-pTil5955(1-2019) Código universal Número total de aminoácidos: 672, PM = 75584 ORF Máx: 1-2016, 672 AA, PM = 75584

ORIGEM 25 I MOSTTKRSFA XBLTADHftRS 21 ÃOEWEWK Alí 17EESAXi.sC 41 RQYRIíESPDR mmmúmi 61 mKmmwm iigykilí» 81 wmmmwMh TRBUGRLRJCT 101 ktvlkr&pvt QEWYLGLHER 121 mwLmssML· YÃADGTLRMK 141 Ewmmmmn SRWERDEEGD 161 1IRTRYMIHG RLFQFVSRHH 181 GAPYRSGFDtf RLYRJDLTSQH 201 GPRRETFRRP DQGNLKRIGS 221 NHVGFSKXSV KAÂÍÍRQTSOT 241 KlQMáGGlFN KSFRSLLDKl 261 GHELGEOILS RRRLYMKRSA 261 WBmTGQLK SAKHTFGmy 301 RSBtDYLSÂG LKKVSKKILG 321 VTYYRRFAAXs SERESEAERL 341 RSFESGAÍRQ rWQESAATPG 361 SPFSESDD1H FAQQSHLAXA 361 sisdhveadvh RVTDGHICVA 401 GQTSSSRQ8H LRBRLDSQSR 421 YKPM4LLSO PBLRADGP&P 441 YEG1AELTLR RONESDGHKS 461 MDQRIRHFLQ PEPLVLPHPG 481 SPiXTKYFGS RGEFLHFSGT S01 LKTAYGETAC HAPVMSSSLD 821 MHQPAPGQQE L L S li LHK A O A 541 PVSVMHDEQ SRLAGEAFGG 561 SFRGSSGRTS SMSSSIFDSD 581 VQSHLWDYS XNPTNGFIDP 601 QSLFGGPOIíS RGPKSGPBII» 821 SEPYBLSME QEM.íLHQXjLS 641 VPLPIPSFKF KSARSMÍFEG 661 SRPRERSTSR GP* 26

Sequência no. 5 de RSF1010 mobA(l-2130)

Sequência de aminoácidos derivada Código universal PM = 77847 Número total de aminoácidos: 709, X ma x vcr i»t a pct* S X akaotí X QREO 41 FIAJB S C3 MM ?EF ©X AO XOtíS RAMO R ftl VSI/riAXíQKA xox O A-SSRX.· RRXX A 121 CHLMISSRIM X F' KR "XXSf O KT PE 161 K. R K2\F? 'L> SQTR 181 2Õ1 K K R PGOT £ .G 3P ν«ί -jd JL 1» TPP ^νίΓ&ν'-Α,ϊ +τ?0Γ 241 IjQEYKEAI.DH 2S1 RHQRVSGA.DR 2 S X RJ® SPAGHEPD 301 VA.ES PAPDRG 32 X €^®«mOSSQR.R: 341 AJU RAMAMROA 3©X DRXmiASPD 381 jmxKsaRMXssro 401 ÍCAMCSCBJRRDX 2. X MMREWSAA1V MAQGMOinf X K 461 JUVOOSUS EFDL· 481 ÁLWBTSPM B Ο X .#W30QIHX^RQQXA 521 PAS M)S RFRíT O S*âX KHTTRAGXQP 3· 3 J3L TATAG RAAV-Q ssx 3.QQ.E KARR1A 601 mXFmxmX^Ol-nr ey> ^ vX wy^re^.w^'»' jsy« kj» /*»»*& o JSr ivii b> ϊ\ ί ^afc-J ,¾81 íS;*S X FR3 ARM X ORAM & & X KPQfiKABT IK 681 !S \í" "7 Ο X P OF SM ^ GSRSGGQSAS KYASDMDKVI, VTS R R.A.O-ν'WE> A.

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Lisboa, 29 de Agosto de 2013

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de realização de uma alteração numa célula não humana, em que um sistema de transferência bacteriano é colocado em contato com a célula a alterar, o referido sistema de transferência possuindo um sistema de transporte de proteínas compreendendo um poro, o canal de secreção de tipo IV, que inclui um complexo de VirB e a proteina VirD4, em que o sistema de transferência compreende uma proteina de fusão ou é capaz de produzir uma proteina de fusão que é introduzida na célula utilizando o sistema de transporte de proteínas, em que uma proteina de fusão BA é introduzida na célula a alterar, proteina de fusão BA que compreende: i) como parte A, um oligopéptido compreendendo os 37 aminoácidos mais próximos do terminal C de VirF, quando fundidos com cre, ou os 40 aminoácidos mais próximos do terminal C de uma proteina bacteriana transportada por um canal de secreção de tipo IV, em que a referida proteina bacteriana transportada por um canal de secreção de tipo IV é selecionada a partir do grupo que consiste em VirF, VirD2, VirE2, VirE3 e MobA; e ii) como parte B, um polipéptido capaz de exercer uma atividade de alteração de células na célula a alterar; em que a extremidade C-terminal do polipéptido da parte B está ligada à extremidade N-terminal da parte A, na condição de se a proteina de fusão compreender uma parte A derivada de VirE2, a proteina de fusão não compreende os 84 aminoácidos N-terminais de VirE2. 2

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão é formada através de expressão no sistema de transferência.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a proteína de fusão é introduzida na célula a alterar sem introdução de uma sequência de ADN ou de ARN.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a proteína de fusão introduzida possui uma atividade de recombinase.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que uma bactéria da classe das Rhizobiaceae é utilizada como sistema de transferência.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a célula a modificar é selecionada a partir do grupo que consiste em i) uma célula vegetal; ii) uma célula de levedura; e iii) uma célula fúngica.

7. Vetor que codifica para um sistema bacteriano de transporte de proteínas possuindo um poro, o canal de secreção de tipo IV, que inclui um complexo de VirB e uma proteína VirD4, bem como para uma proteína de fusão BA que compreende: i) como parte A, um oligopéptido compreendendo os 37 aminoácidos mais próximos do terminal C de VirF, quando fundido com cre, ou os 40 aminoácidos mais próximos do terminal C de uma proteína bacteriana transportada através de um canal de secreção de tipo IV, em que a referida proteína bacteriana transportada por um canal de secreção de tipo IV é selecionada a 3 partir do grupo que consiste em VirF, VirD2, VirE2, VirE3 e MobA; e ii) como parte B, um polipéptido capaz de exercer uma atividade de alteração de células na célula a alterar; em que a extremidade C-terminal do polipéptido da parte B é ligada à extremidade N-terminal da parte A, na condição de que se a proteína de fusão compreender uma parte A derivada de VirE2, a proteína de fusão não compreende os 84 aminoácidos N-terminais de VirE2.

8. Conjunto de vetores, caraterizado pelo facto de o conjunto de vetores compreender um ou mais vetores codificando para o sistema de transporte de proteínas possuindo um poro, o canal de secreção de tipo IV, que inclui um complexo de VirB e a proteína VirD4 bem como um outro vetor codificando para um péptido de fusão BA que compreende i) como parte A, um oligopéptido compreendendo os 37 aminoácidos mais próximos do terminal C de VirF, quando fundido com cre, ou os 40 aminoácidos mais próximos do terminal C de uma proteína bacteriana transportada por um canal de secreção de tipo IV, em que a referida proteína bacteriana transportada por um canal de secreção de tipo IV é selecionada a partir do grupo que consiste em VirF, VirD2, VirE2, VirE3 e MobA; e ii) como parte B, um polipéptido capaz de exercer uma atividade de alteração de células na célula a alterar; em que a extremidade C-terminal do polipéptido da parte B está ligada à extremidade N-terminal da parte A, na condição de se a proteína de fusão compreender 4 uma parte A derivada de VirE2, a proteína de fusão não compreende os 84 aminoácidos N-terminais de VirE2. Lisboa, 29 de Agosto de 2013