ES2427928T3 - Translocación de proteínas en células de plantas - Google Patents

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Paul Jan Jacob Hooykaas
Annette Caroline Vergunst
Barbara Schrammeijer
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Universiteit Leiden
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Universiteit Leiden
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Abstract

Método para llevar a cabo una modificación en una célula no humana, en el que un sistema de transferenciabacteriano se pone en contacto con la célula a ser modificada, dicho sistema de transferencia tiene un sistema detransporte de proteínas que comprende un poro, el canal de secreción de tipo IV, que incluye un complejo VirB yproteína VirD4, en el que el sistema de transferencia comprende una proteína de fusión o es capaz de crear unaproteína de fusión que se introduce en la célula utilizando el sistema de transporte de proteínas, en el que seintroduce una proteína de fusión BA en la célula a ser modificada, cuya proteína de fusión BA comprende.

Description

Translocación de proteínas en células de plantas
La presente invención se refiere a un método para llevar a cabo una modificación en una célula no humana, en el que un sistema de transferencia se pone en contacto con la célula a ser modificada, dicho sistema de transferencia comprende una membrana con un sistema de transporte de proteínas en ella que comprende un poro que comprende un complejo VirB y la proteína VirD4, en el que el sistema de transferencia comprende una proteína de fusión o es capaz de crear una proteína de fusión que se introduce en la célula por medio del sistema de transporte de proteínas.
Dicho método se sugirió por Zhou, XR y otros (Journal of Bacteriology, 181 (14), p. 4342-4352 (1999)). Esta publicación da a conocer que la proteína VirE2, una proteína de unión a ADN de hebra única de Agrobacterium tumefaciens, se puede transferir a una célula huésped por un Agrobacterium tumorigénico. Zhou y otros dan a conocer que eran sólo fueron capaces de introducir una secuencia de aminoácidos heteróloga en el aminoácido 39 (a partir del N-terminal, como es habitual en la técnica) que fue transferida a la célula huésped. Se llegó a la conclusión de que no es viable en la práctica basar un sistema de administración de proteínas en fusiones en uno de los dos extremos de VirE2. Como mínimo, las proteínas pequeñas son toleradas como una inserción en el aminoácido 39.
El objeto de la presente invención es dar a conocer un método, que es simple de realizar y, si se desea, se lleva a cabo sin actividad nativa de VirE2 en la célula a ser modificada.
En consecuencia, el método según la presente invención, es el método que se describe en la reivindicación 1.
Sorprendentemente, se ha descubierto que, siempre que se cumplan las condiciones mencionadas anteriormente, una proteína puede ser introducida desde el exterior en una célula a ser modificada, cuya proteína se forma mediante el acoplamiento del polipéptido (segunda parte B) a un aminoácido N-terminal (interno) de VirF, VirD2, VirE2, VirE3 o MobA (primera parte A), como resultado de lo cual la actividad de la segunda parte de B introducida se puede expresar en la célula a ser modificada, como resultado de lo cual se modifica la célula. Esta modificación puede ser temporal (reversible) o permanente (irreversible). Las secuencias de aminoácidos de VirF, VirD2, VirE2, VirE3 y MobA están representadas por las respectivas secuencias número 1-5. Una cepa que comprende un plásmido (LBA8250, una cepa de Agrobacterium tumefaciens, que contiene el plásmido pTi15955. PTi15955 se describe por Sciaky y otros, Plasmid 1, p. 238-253 (1978)) que codifica todas las proteínas Vir, está en la colección Phabagen del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Países Bajos con el número de acceso PC2692. La proteína MobA es conocida a partir del plásmido IncQ RSF1010, que está presente en la cepa de E. coli K12 C600 con el número de acceso PC-V3110 de la colección NCCB del CBS, y se describió por Scholz, P. y otros en Gene 75, p. 271-288 (1989).
En la presente invención, un aminoácido correspondiente es un aminoácido según la tabla siguiente:
A, G;
S, T;
D, E;
N, Q;
R, K;
I, L, M, V; y
F, Y,W.
No es necesario mencionar que la primera parte A puede comprender más aminoácidos adyacentes o no adyacentes, idénticos o correspondientes a las secuencias definidas anteriormente.
La primera parte A, si se desea, comprende más aminoácidos desde el aminoácido 41 (a partir del C-terminal) de VirF, o VirE2 de VirE3 o VirD2 o MobA. Esto bajo la condición mencionada para VirE2.
En la presente invención, un vector se refiere a cualquier secuencia de ADN o ARN que, directa o indirectamente, conduce a la formación de la proteína de fusión en el sistema de transferencia.
El sistema de transferencia puede ser una célula, tal como de forma muy adecuada una célula bacteriana, tal como, en particular, Agrobacterium tumefaciens, pero también puede ser un sistema artificial, tales como una minicélula o
un sistema artificial de vesículas.
La proteína de fusión a ser transferida o bien se puede formar en el propio sistema de transferencia, por ejemplo, mediante la expresión de un vector que contiene un sistema de genes funcionales que se puede expresar produciendo la proteína de fusión, o la propia proteína de fusión se puede introducir en el sistema de transporte. Generalmente, este último será el caso en los sistemas de transporte artificiales. Una ventaja importante de dicho sistema de transporte artificial es que se puede introducir en el medio ambiente, por ejemplo, para el tratamiento de un cultivo, sin riesgo de propagación del material genético.
Preferentemente, la proteína de fusión se introduce en la célula sin la introducción de una secuencia de ADN o ARN. En el caso de la utilización de Agrobacterium tumefaciens como sistema de transferencia, esto implica la ausencia de ADN-T. Esto significa que es posible modificar una célula sin introducir material genético en la célula a ser modificada.
Según una realización importante, la proteína de fusión introducida tiene actividad recombinasa.
En dicho caso, es de hecho posible llevar a cabo un cambio en el ADN cromosómico de la célula a ser modificada, sin la introducción de material genético adicional (un vector que codifica el ADN-T o péptido B) en la célula. Una aplicación importante, por ejemplo, es la eliminación de un gen marcador, cuya admisión en el medio ambiente no es deseable. En particular, esto puede incluir la eliminación de los genes de resistencia a antibióticos presentes entre secuencias de ADN en repetición directa a ser reconocidos por la recombinasa.
Convenientemente, una bacteria de la clase Rhizobiaceae se puede utilizar como sistema de transferencia.
Dichas bacterias, entre las que se encuentran Agrobacterium, Rhizobium y Phyllobacterium, son muy adecuadas para la modificación de plantas, levaduras u hongos. Otras bacterias que pertenecen a esta familia, tales como Brucella, son conocidas por su interacción con células animales y se pueden utilizar para la modificación de las mismas.
Según una realización preferente, se utiliza Agrobacterium, que se conoce que es muy adecuado para la modificación tanto de procariotas (bacterias) como de eucariotas (plantas, levaduras, hongos y células de animales).
Según una realización preferente, una célula seleccionada del grupo que comprende i) una célula de plantas; ii) una célula de levaduras, y iii) una célula de hongos, se utiliza como la célula a ser modificada.
La presente invención también se refiere a un vector, estando dicho vector caracterizado porque codifica un sistema de transporte de proteínas que comprende un poro que contiene un complejo VirB y proteína VirD4, así como una proteína de fusión BA tal como se define en la reivindicación 7.
Dicho vector se puede introducir en un sistema de transferencia, tal como una bacteria. Entonces, el vector posee toda la información que necesita ser expresada para la transferencia de la proteína de fusión, por lo que es posible que la proteína de fusión sea transferida a la célula a ser modificada.
Por último, la presente invención se refiere a un conjunto de vectores, caracterizado porque el conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican un sistema de transporte de proteínas que comprende un poro que contiene un complejo VirB y proteína VirD4, así como un vector adicional que codifica un péptido de fusión BA, tal como se define en la reivindicación 7.
La ventaja de dicho conjunto de vectores es que el vector o vectores que codifican el sistema de transporte de proteínas, se pueden introducir en un sistema de transferencia por separado a partir del vector adicional que codifica la proteína de fusión. Esto hace que sea posible la utilización de un sistema de transferencia, en particular una bacteria, como vehículo estándar para la modificación de una célula, en el que el sistema de transporte está provisto de un vector adicional que se expresa en el sistema de transporte para llevar a cabo la modificación.
La presente invención se ilustrará con referencia a los siguientes ejemplos y al dibujo, en el que la única figura muestra de forma esquemática un sistema de ensayo para demostrar la actividad Cre en plantas.
Cepas bacterianas
La cepa de Agrobacterium LBA1010 (Koekman y otros, Plasmid 7 (1982); 119-132; Centraal Bureau voor Schimmelcultures; Baarn, Países Bajos, número de acceso: PC2805) posee el plásmido Ti no modificado pTiB6 en un fondo cromosómico C58. LBA 1100 (Beijersbergen y otros. Science 256 (1992), 1324-1327; fácilmente obtenido mediante el cultivo de CBS 102794, Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Bajos, depositado el 17 de mayo de 2000 en ausencia de gentamicina para el curado del plásmido pSDM 3155 y el cribado de la ausencia del plásmido pequeño (aprox. 5,5 kb) de plásmido) es un derivado no oncogénico de LBA1010. Para este efecto, tanto las regiones T izquierda y derecha en pTiB6, así como los genes tra y occ se sustituyen por un marcador de
resistencia a espectinomicina, lo que resulta en el plásmido pAL1100, en el que la región Vir se mantiene intacta. En la presente solicitud se utilizaron varios mutantes de vir, derivados de LBA1100, respectivamente LBA 1142-1150 (Beijersbergen y otros. Science 256 (1992), 1324-1327) (Tabla 1). LBA2561 contiene una deleción precisa del gen virF en pAL1100 (Schrammeijer y otros, Mol. Plant Micr. Int. 5 (1998), 429-433). La transformación y el crecimiento de las cepas bacterianas se llevaron a cabo tal como se describe en la literatura (Vergunst y col. Nucl. Acids Res. 26 (1998) 2729-2734) o según técnicas generales conocidas por el experto en la materia (Sambrook y otros. Molecular. Cloning. A lab manual (1989)).
Construcciones de plásmidos
La región de codificación del gen cre se clonó de forma traduccional a los genes virE2 y virF de pTi15955, bajo el control de las respectivas regiones promotoras vir. Se llevaron a cabo fusiones tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal. Las construcciones de plásmidos se detallan a continuación.
Plásmido de control cre
La región de codificación del gen de la recombinasa cre, presente en el plásmido pUC19cre (Mozo y Hooykaas, Mol. Gen. Genet 236 (1992), 1-7), se clonó como un fragmento SphII/EcoRI en pUC21 (Vieira y Messing, Gene 100 (1991), 189-194) que resultó en pSDM3120. Con el fin de eliminar el codón de iniciación ATG, se llevó a cabo una amplificación por PCR en el extremo 5' del gen cre con los cebadores cre1 (5'-ggcagatctgTCCAATTTACTG) y cre2 (5'-GATAATCGCGAACATCTTCAGG) en pSDM3120. Después de la digestión del fragmento de PCR con BglII y NruI (subrayado) este fragmento se intercambió por el fragmento correspondiente en pSDM3120 (que resultó en creMATG o pSDM3121). Un fragmento SalI de pRAL3248 (Melchers y otros, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 249-259) en el que se encuentran virE1 y virE2 (estando ausentes las últimas 30 pares de bases del extremo 3') incluyendo la región promotora virE, se clonó en el lado de restricción XhoI de pSDM3121 (pSDM3122). Después de la digestión completa de pSDM3122 con BgIII y la digestión parcial con BstYI, seguido por el aislamiento del fragmento de vector que porta el promotor virE, la zona de codificación virE1, el codón de inicio ATG de virE2, así como cre (MATG), el gen cre se unió de forma traduccional a través del autocierre al codón de inicio ATG de virE2 (pSDM3126). Como resultado, la expresión del gen cre es controlada por el promotor virE. Posteriormente, este constructo se transfirió como un fragmento StuI/XbaI al plásmido pRL662 digerido con SmaI/XbaI, dando como resultado pSDM3147, es decir, el plásmido de control cre utilizado en estos experimentos. El plásmido pRL662 no movilizable con una amplia gama de huéspedes se obtiene mediante la sustitución del gen de resistencia a kanamicina, así como la región mob de pBBR1 MCS2 (Kovach y otros, BioTechn. 16 (1994), 800-802) con un marcador de resistencia a gentamicina (J. Escudero, Solicitud de Patente Europea Núm. 00200726.8).
Fusión cre::virE2
Con el fin de crear fusiones traduccionales entre cre y virE2, se eliminó el codón de parada del gen cre, para lo que se introdujo una mutación en el codón de parada (cursiva) mediante amplificación por PCR en el ADN de pSDM3126 utilizando los cebadores cre 6 (5'-acgcatcgactATCGCCATCTTCCAGCAGGCGC) y cre 7 (5'cCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGG). Después de la digestión con ClaI y SalI (subrayado), se sustituyó el fragmento ClaI-SalI de pSDM3126 correspondiente (que resultó en creLSTOP o pSDM3127). Un fragmento XhoI/NotI de pBluevirE2 (MATG) que contiene la zona de codificación virE2, sin el codón de iniciación ATG, se ligó posteriormente en el vector pSDM3127 digerido con SalI y NotI (pSDM3128). pBluevirE2 (MATG) fue el resultado de la clonación de la región VirE1-virE2 (XhoI-SmaI) del plásmido pRAL3248 (Melchers y otros, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 249-259) en pBLUEscript (XhoI/EcoRV) (Alting-Mees y Short. Nucleic Acids Res. 17 (1989): 9494), tras lo que se eliminaron virE1 y el codón de inicio ATG de virE2 utilizando un enlazador de XhoI-StuI (5'tcgaGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG y 5'-CCTGGATTTCTCATTGCCAGAAAGATC. La fusión cre::virE2 se transfirió posteriormente a pRL662 (SmaI/XbaI) como un fragmento StuI/XbaI de pSDM3128, lo que resultó en pSDM3129 (fusión cre::virE2).
Fusión virE2::cre
Un fragmento SalI de pRAL3248 que comprende virE1 y virE2 (estando ausente las últimas 30 bases del extremo 3') se clonó en pIC19R (Marsh y otros, Gene 32 (1984):. 481-485) (pSDM3123). En las etapas de clonación posteriores cre se fusionó al extremo 3' de virE2, en el que al mismo tiempo se restauraron las últimas 30 bases del extremo 3' de virE2, ausentes en pSDM3123. Para este fin, se clonó un fragmento BglII/NruI de pSDM3122, que comprende las 200 bases del extremo 5' de cre, sin el codón de iniciación ATG, en pIC19R (pSDM 3151). Se sintetizó un enlazador de SalI/BglII enlazador, que consiste en las últimas 30 bases del extremo 3' de virE2, con el fin de eliminar el codón de parada de virE2 (cursiva) (5'-TCGACCGCGTAGCCAAAGCGTCAACAGCTTTcga y 5'gatctcgAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACGCGG) y para llevar a cabo la fusión traduccional con cre. Este enlazador se clonó en PSDM 3151 (pSDM3152). Sin embargo, después de análisis de la secuencia, el sitio BglII entre el extremo 3' de virE2MSTOP y el extremo 5' de creLATG se demostró que se pierde debido a una sustitución de base única. Esta mutación no está presente en la región que codifica virE2 o cre, y no tiene ningún efecto en el marco de lectura de la fusión. El fragmento SalI de pSDM3123 se introdujo en el sitio SalI de pSDM3152 (pSDM3157),
mediante la clonación de la secuencia completa de virE2 en marco con el extremo 5' de cre. Un fragmento NruI aproximadamente de 600 pares de bases de pSDM3157 (el extremo 3' de virE2LSTOP y el extremo 5' de creLATG) se utilizó posteriormente para reemplazar el fragmento NruI en pSDM3148 (pSDM3148 es el resultado de la clonación de un fragmento StuI/XbaI de pSDM3122 en XbaI/SmaI de pRL662) dando como resultado una fusión traduccional entre la región completa de virE2 y cre (pSDM3166, es decir, la fusión virE2::cre) bajo el control del promotor virE, y la expresión conjunta de VirE1.
Fusión virF::cre
Un fragmento SacI/EcoRV de 600 pares de bases de pRAL7088 (Schrammeijer y otros. MPMI 11 (1998) 429-433) que contiene el lado que flanquea el extremo 5' de virF y el lugar de unión ribosómico fue clonado en pBluescriptSK(Alting-Mees y Short. Nucleic Acids Res. 17 (1989): 9494), lo que resulta en pSDM3183. La señal de localización nuclear (NLS) del virus simian 40 (SV40) se sintetizó con un EcoRV ROMO y un extremo cohesivo SalI 3' (5'-ATCATGGATAAAGCGGAATTAATTCCCGAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGAATTGGGTACCGG y la hebra complementaria), y se clonó en pSDM3183, lo que resultó en pSDM3184. El gen virF sin ATG y codón de parada se clonó en dos etapas en marco después de NLS de SV40. El codón de inicio ATG se eliminó por clonación de un enlazador BamHI/NsiI (5'-GATCCGAAATTCGAGTTTGCGTGATGCA) en los sitios BamHI y NsiI de pRAL7088 (pSDM3192). Posteriormente, se clonó un fragmento BamHI/SacI de 1,5 pares de kilobases de pSDM3192 en pIC19H (pSDM3193). Un fragmento SalI/XhoI de 500 pares de bases de pSDM3193, que comprende virFM498609MATG se clonó en marco con NLS de SV40 en el sitio XhoI de pSDM3184, lo que resultó en pSDM3185. Posteriormente, el codón de parada de virF se eliminó utilizando dos cebadores (5'-ATCCCTAACTTGGTCTTCAAC y 5'-cttagatcTAGACCGCGCGTTGATCGAGG) en una reacción de PCR en pRAL7088. El fragmento de PCR se subclonó como un fragmento de 175 pb en el vector pGEM T (Promega). Un enlazador StuI/BglII (5'cctcgagcccgggata y 5'-gatctatcccgggctcgagg) se clonó en pSDM3121 digerido con StuI/BglII para introducir un sitio XhoI (subrayado) y para llevar a cabo la clonación adicional en marco de cre con virF (pSDM3121- L). Posteriormente, el extremo 3' de virF se clonó en marco en los sitios XhoI/BglII de pSDM3121-L como un fragmento XhoI/BgIII aproximadamente de 110 pares de bases desde el vector pGEM-T hasta el extremo 5' de cre (lo que resultó en pSDM3186). Un fragmento XhoI/SalI de 1,2 kb de pSDM3186 se ligó en el sitio XhoI de pSDM3185, lo que resultó en pSDM3187. La fusión virF::cre se introdujo a continuación en pUC28 (Benes y otros, Gene 130 (1993); 151-152) como un fragmento SacI/PstI, y posteriormente se ligó a partir de este plásmido como un fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pRL662 , lo que resultó en pSDM3153, es decir, el plásmido de fusión NLS:: virF::cre.
Fusiones cre::virF
Un fragmento de 0,66 kb de pSDM3184, que tiene el lado de flanqueo de 5' de virF y la secuencia NLS de SV40, se clonó eventualmente a través de una etapa de clonación de SacI/SalI en pIC19H, seguido de una clonación HindIII/SalI en pIC19R, como un fragmento SalI/XhoI en el sitio XhoI de pSDM3121. Esto dio lugar a una fusión en marco de la NLS de SV40 al extremo 5' de cre (pSDM3188). El codón de parada de cre en pSDM3188 se eliminó posteriormente mediante la sustitución del fragmento ClaI/SalI (con el extremo 3' de cre incluyendo el codón de parada) con el fragmento creMSTOP ClaI/SalI de pSDM3127 (pSDM3179). Un fragmento SalI/EagI de 690 pb de pSDM3193 que comprende virFLATG se clonó en pSDM3179 digerido con SalI/NotI, lo que resultó en pSDM3189. Un fragmento HindIII/XbaI de pSDM3189 se clonó en los sitios HindIII y XbaI de pRL662, lo que resultó en pSDM3154 (el plásmido de fusión NLS::cre::virF).
Además, se realizaron varias deleciones de virF y se clonó en traduccionalmente al extremo 3' de cre. Utilizando los cebadores F126 (5'-acgcgtcgaCCTGTCGAGTCGGCTGAG, posición 127 en virF) y pflF2 (5'-GACCAGCACACTTAGATACC, en la secuencia de ADN adyacente a 3' de virF), se llevó a cabo una reacción de PCR en pRAL7088. El fragmento de PCR de 780 pares de bases se clonó en el vector pT7pBlue-T (Novagen) (pSDM3194). Un fragmento SalI/EagI (VirFM1-126) de 555 pares de bases de pSDM3194 se clonó en pSDM3179, lo que resultó en pSDM3190. La clonación de la fusión NLS::cre::virFL1-126 en el vector pRL662 como un fragmento HindIII/XbaI resultado en pSDM3155 (el plásmido de fusión NLS::cre::virFL1-126).
Los 113 nucleótidos del extremo 3' de virF se clonaron en marco con cre. Para este fin, pSDM3189 se transfirió como un fragmento HindIII/XbaI a pUC18 (Yanish-Perron y otros, Gene 33 (1985);. 103-119), lo que resultó en PSDM 3172. La digestión de pSDM3172 con XhoI y SalI, la eliminación del extremo 5' cohesivo utilizando nucleasa Mung Bean seguido de autocierre del vector, dio como resultado una fusión en marco de las últimas 112 pares de bases del extremo 3' de virF con cre (pSDM3173 ). La transferencia de la fusión NLS::cre::virFL1-498 a pRL662 como un fragmento XbaI/HindIII dio como resultado el plásmido pSDM3174 (el plásmido de fusión NLS::cre::virFL1498).
Los plásmidos fueron transferidos a las cepas bacterianas que se muestran en la tabla 1. Además, el plásmido pSDM3191, en el que los genes virD3 y virD4 se encuentran bajo el control del promotor virD, se movilizó en LBA1147 y LBA1150. pSDM3191 es el resultado de la clonación de un fragmento BamHI de 4,4 pares de kilobases de pMP3 (Vogel y Das, J. Bacteriology 174 (1992); 5161-5164) en el sitio de restricción BamHI de pLM997 (Melchers, no publicado), que es el resultado de la sustitución de la región T de pBin 19 (Devan y otros, Nucleic Acids Res. 12 (1984), 8711-8721) con una secuencia polienlazadora pIC19R/H (Marsh y otros, Gene 32 (1984): 481485).
TABLA 1
Cepas utilizadas
Cepa
Plásmido Marcadores de resistencia
LBA1010
pTiB6 Rif
LBA1100
pTiB6MT1Tr, Ltra, Locc Rif, Sp
LBA2561
pAL1100LvirF Rif, Sp
LBA1142
pAL1100(virA::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1143
pAL1100(virB4::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1144
pAL1100(virB7::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1145
pAL1100(virG::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1146
pAL1100(virC2::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1147
pAL1100(virD2::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1148
pAL1100(virD4::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1149
pAL1100(virE2::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
LBA1150
pAL1100(virD1::Tn3Hoho1) Rif, Sp, Cb
5 El gen de fusión NLS::cre::virF también se acopló al plásmido ayudante en LBA2561 mediante la selección de cruces individuales entre las regiones de ADN homólogas que flanquean el gen virF y NLS::cre::virF (pSDM3189), lo que resultó en LBA2561::NLS::cre::virF.
Como control para la transformación de las plantas se utilizó LBA1115 (= MOG101 (Hood y otros, Transgenic Res. 2
10 (1993) 208-218), que es comparable con LBA1100 pero que contiene los genes tra y occ. El vector IncP de pSDM3088 {Vergunst y Hooykaas, Plant Mol. Biol. 38 (1998), 393-406), que contiene el gen cre bajo el control del promotor de la sintasa de manopina entre las secuencias adyacentes izquierda y derecha de Agrobacterium ("repeticiones del borde de ADN-T"), se transfirió a LBA1115.
15 Líneas de plantas
El plásmido pSDM3043 (véase la figura y Vergunst y Hooykaas Plant Mol. Biol. 38 (1998), 393-406) se introdujo en C24 Arabidopsis thaliana por medio de la transformación mediada por Agrobacterium de explantes de raíz (Vergunst y otros, en Methods in Mol. Biol. 82 pág. 227-244 (1998)) y los transformantes fueron seleccionados por la 20 resistencia a fosfinotricina (30 mg/l). Las plantas que tienen el locus de escisión 3043 son sensibles a kanamicina. Se seleccionó una planta transformada, con segregación 3:1 para el transgén (1 locus), sobre la base de la eficacia de la escisión mediada por Cre del gen bar (véase la figura), flanqueado por sitios lox presentes en repetición directa (ver las flechas en el dibujo). La escisión mediada por Cre se podría lograr mediante la transformación de los explantes de raíz con el vector de expresión de Cre pSDM3088. Dicha escisión simultánea resultó en la reparación
25 de un marcador de resistencia a kanamicina.
Transformación de plantas
El protocolo para la transformación de explantes de raíz de Arabidopsis mediados por Agrobacterium se ha descrito
30 anteriormente (Vergunst y otros, En Methods in Mol. Biol. 82, pág. 227-244 (1998)). Se utilizaron raíces de plántulas de 10 días de edad que son homocigotos para el locus de escisión 3043 (T3 o T4) en los ensayos de transformación utilizando las cepas descritas en la tabla 1, que contienen las construcciones descritas anteriormente. Después de 2 días de cultivo en conjunto, los explantes se transfirieron a un medio para inducir el crecimiento de callos y brotes, cuyo medio contenía 50 mg/l de kanamicina y 100 mg/l de timentina. El número de callos resistentes a kanamicina
35 se determinó entre 2 y 3 semanas después del cultivo en conjunto. El análisis por PCR se llevó a cabo en un número de brotes regenerados a partir de callos resistentes a kanamicina.
Análisis por PCR
40 El método utilizado para el aislamiento de ADN cromosómico para los análisis por PCR y el protocolo para la reacción de PCR se han descrito anteriormente (Vergunst y otros, Plant Mol. Biol. 38 (1998), 393-406). Como cebadores (a y b en el dibujo) para el análisis de callos y plantas resistentes a kanamicina se utilizaron
a) (5'-GAACTCGCCGTAAAGACTGGCG-3') que se hibrida en la región del promotor 35S (pDE35S en el 45 dibujo), y b) (5'-GCGCTGACAGCCGGAACACG-3') que se hibrida en la secuencia codificante nptII (ver figura). Los cebadores utilizados para la construcción de los plásmidos se mencionan en detalle.
Resultados
50 Para demostrar que Agrobacterium transfiere proteínas de fusión a células de plantas receptoras, se utilizó un
ensayo de recombinación que permite la detección del transporte de la recombinasa Cre. Para este fin, el núcleo de la célula de planta contenía un segmento de ADN, que después de la eliminación específica por Cre resulta en un rasgo de resistencia a la kanamicina seleccionable. Este sustrato para la recombinación de Cre (pSDM3043, figura 1) se transfirió mediante una transformación mediada por Agrobacterium en el genoma de Arabidopsis por medio de la selección por resistencia a fosfinotricina. Las plantas transgénicas fueron sensibles a la kanamicina. Sin embargo, la recombinación mediada por Cre entre dos sitios lox orientados en tándem resulta en la escisión del segmento de ADN interventor, y en la activación del gen nptII por fusión traduccional de la región del promotor 35S que incluye el codón de inicio ATG y una parte de codificación del extremo N-terminal (determinada por la secuencia lox) con la región de codificación de nptII. Esta fusión conduce a la resistencia a la kanamicina. Por lo tanto, sólo las células en las que ha tenido lugar un evento de recombinación mediado por Cre sobreviven en el medio selectivo. Se aisló una línea de plantas, que comprende un único locus del sustrato de escisión y cuya eficiencia de escisión (tal como se mide por el número de callos resistentes a kanamicina debido a la actividad de Cre) era comparable a la de la eficiencia de la transformación mediada por Agrobacterium. Esto fue ensayado mediante cultivo conjunto de la línea de plantas con una cepa de Agrobacterium que porta un vector binario con un ADN-T que tiene el gen cre controlado por una secuencia promotora fuerte (LBA1115-pSDM3088). La línea de escisión seleccionada se utilizó en ensayos adicionales para demostrar el transporte directo de proteínas, incluyendo recombinasa Cre, de Agrobacterium a las células de plantas. Para este fin, la recombinasa Cre se expresó bajo el control del sistema de inducción vir en Agrobacterium, ya sea solo o como una fusión N-terminal o C-terminal con VirF o VirE2, respectivamente. La expresión de las proteínas de fusión en Agrobacterium se ensayó mediante análisis de inmunotransferencia (datos no mostrados). Las actividad de recombinación de las proteínas de fusión se ensayó mediante la medición de la capacidad de inducir un evento de escisión en el plásmido pSDM3043, cuyo plásmido se introdujo en las cepas bacterianas pertinentes con el fin de probar este efecto (datos no mostrados).
Después del cultivo conjunto de las células de plantas mencionadas anteriormente con las cepas de Agrobacterium LBA1010, LBA1100, LBA1149, o LBA2561, o con un derivado de estas cepas que tienen un plásmido que expresa la recombinasa Cre (el plásmido de control cre), se encontró como máximo una sola superviviente en un medio selectivo. De esta manera, se obtuvo el mismo número de callos resistentes a kanamicina ("el fondo") durante el cultivo conjunto con las cepas que no expresan Cre, que durante el cultivo conjunto con las cepas de Agrobacterium que sí expresan la recombinasa Cre. Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que bacterias que la recombinasa Cre expresada en bacterias no se transfirió a las células de las plantas.
Sin embargo, los resultados fueron totalmente diferentes cuando los experimentos se realizaron con células de Agrobacterium que expresan proteínas de fusión entre Cre y VirE2 o VirF. Se utilizaron cepas de Agrobacterium (tanto de tipo no modificada así como mutantes de la proteína Vir correspondiente) que expresan o bien fusiones Cterminal o N-terminal de Cre con VirE2 y VirF, respectivamente. Se encontró que la fusión con la región N-terminal de la proteína Vir (Cre::virE2; NLS::Cre::virF), pero no con el extremo C-terminal (VirE2::Cre; NLS::virF::Cre), era altamente eficiente en la producción de callos resistentes a kanamicina. No se observó ninguna diferencia si la fusión Cre::virF se expresó a partir del plásmido ayudante (LBA2561::NLS::cre::virF) o a partir del plásmido pRL662 (LBA2561, pRL662 NLS::cre::virF). El cultivo conjunto de cepas de Agrobacterium (tanto de tipo no modificada como mutante de virF) que expresan una fusión Cre::virF con una deleción de los 42 aminoácidos del extremo N-terminal de virF (NLS::Cre::virFM1-126) dio lugar a callos resistentes a kanamicina, siendo obtenidos en una frecuencia significativamente mayor. El cultivo conjunto de una cepa que expresa una proteína de fusión entre los últimos 37 aminoácidos del extremo C-terminal de VirF y Cre (NLS::Cre::virFM1-498) dio como resultado un comparable número elevado de callos resistentes a kanamicina.
Como controles, las cepas que albergan los plásmidos de fusión NLS::cre::virFL1-126 y cre::virE2 se cultivaron en conjunto con explantes de raíces C24 de Arabidopsis de tipo no modificado, pero tal como se esperaba, esto no dio lugar a resistencia a la kanamicina debido a la ausencia del locus de escisión.
El análisis por PCR demostró que la resistencia a la kanamicina fue de hecho causada por el evento de escisión mediado por Cre predicho. El análisis por PCR en el ADN aislado a partir de la línea 3043 de escisión dio lugar a un fragmento de 2,3 kb (véase la figura), mientras que en muestras de ADN aislado de callos resistentes a kanamicina que se obtuvieron después de cultivo conjunto de las cepas que expresan cre::virE2 y NLS::cre::virF, se obtuvo un fragmento de 0,7 kb. Para excluir la contaminación con un vector de ADN-T que expresa cre, se realizó un análisis por PCR con cebadores que se hibridan en la región de codificación de cre. Tal como era de esperar, no se detectó ningún fragmento.
En análisis por PCR de los pocos callos obtenidos de los experimentos de control (incluidos los de los experimentos en los que el cultivo se llevó a cabo con una cepa de Agrobacterium que no tenía un gen cre) demostró que éstos eran en parte el resultado de una escisión, posiblemente debido a recombinación homóloga entre los sitios lox y en parte debido al crecimiento continuo de las plantas sensibles en el medio de selección ("escapes"). En este último caso, se detectó el fragmento de 2,3 kb, y no se detectó el fragmento de 0,7 kb, que indica escisión. Todos estos resultados muestran, por tanto, que Agrobacterium puede introducir recombinasa Cre en células de plantas, pero sólo cuando se expresa como una proteína de fusión unida al extremo N-terminal de VirE2 o VirF. La eficacia de la obtención de callos resistentes a kanamicina después del cultivo conjunto de la línea de plantas 3043 con dichas cepas de Agrobacterium que expresan fusiones de Cre con 161 ó 37 aminoácidos C-terminales de VirF muestra que
debe haber un dominio de transporte en los últimos 37 aminoácidos C-terminales de VirF. En vista de la función in planta de VirE2, virF y VirD2 mostrada anteriormente, los tres aminoácidos invariantes (motivo RPR) en el extremo C-terminal de VirF, VirD2 y VirE2 sugieren la importancia de estos aminoácidos para el transporte de las proteínas Vir hacia la planta, utilizando el sistema VirB/VirD4 (ver más adelante). La mutación de uno de los residuos R en este motivo conduce a la pérdida de la función de transporte, pero cuando se cambió el residuo P en un residuo seleccionado entre A, Q, V y S, la actividad de transporte se mantuvo intacta.
En los presentes experimentos el transporte de las proteínas de fusión, detectado como resistencia a la kanamicina después del cultivo conjunto con la línea de plantas 3043, se produce independiente de la cotransferencia de ADN-
T. Esto implica una importante aplicación del sistema de transporte de proteínas, a saber, la posibilidad de efectuar una modificación en las células en ausencia de ADN-T. Además, sin embargo, la transferencia puede también ocurrir en presencia de ADN-T (que puede ser oncogénico o no), lo que amplía la aplicabilidad del sistema. Una posible aplicación puede ser la integración dirigida a sitio de ADN-T en el genoma de la célula receptora por medio del cotransporte de una recombinasa que se expresa como una proteína de fusión en la misma bacteria o en cotransformantes.
Para determinar cuál de las funciones de virulencia son esenciales para el transporte de proteínas, se transfirieron NLS::cre::virFL1-126 y cre::virE2 a un conjunto de mutantes de vir, que se enumeran en la tabla 1.
El cultivo conjunto de la línea de escisión con los mutantes de virA, virB, virG y virD4, que tienen los plásmidos de fusión, no dio lugar a la escisión mediada por Cre, mientras que los mutantes virC, virD1/D2, virF y virE2 dieron lugar a callos con eficiencias comparables a las eficiencias del tipo no modifcado. Por lo tanto, se puede conlcuir que en este sistema de modelo en el que virA y virG son responsables de la formación de VirB y VirD4, la expresión de los genes vir a través de los reguladores virA y virG es necesaria para el transporte. Pero, aparte de eso, sólo los genes virB y virD4, que determinan el canal de secreción de tipo IV (complejo B) y el factor de acoplamiento (VirD4), son esenciales. La ocurrencia de los homólogos de virB y virD4 en otros sistemas (por ejemplo, O'Callaghan y otros, Mol. Microbiol. 33 (1999): 1210-1220) hace posible la construcción de sistemas de transporte de proteínas similares en Agrobacterium y otros microorganismos basados en estos sistemas homólogos. Los otros genes de virulencia, incluyendo los que codifican para las proteínas transportadas VirD2, VirE2 y VirF, parecen no ser necesarios para el transporte de las proteínas de fusión.
Para demostrar que en las mismas condiciones el Agrobacterium transferirá proteínas de fusión en otras células eucariotas, se llevó a cabo un ensayo de recombinación similar al descrito anteriormente con células de levadura. Las células de levadura no crecen en presencia de 5-fluoro uracilo, a menos que una recombinasa elimine el gen presente entre los sitios lox, cuyo gen codifica una proteína que convierte 5-fluoro uracilo en una sustancia que es tóxica para la célula de levadura. La recombinasa se introdujo como una proteína de fusión. Tal como era de esperar, la levadura tratada de ese modo se hizo resistente a 5-fluoro uracilo (resultados no mostrados). En estos experimentos, el transporte de la recombinasa por medio del extremo C-terminal de VirE2 y VirF se confirmó y, además, se demostró el transporte a través del extremo C-terminales de VirE3 y la proteína MobA del plásmido RSF1010 de IncQ (resultados no mostrados). En la proteína VirE3 la secuencia RPR también está presente en el extremo C-terminal, y en MobA la secuencia RQR está presente.
Secuencia núm. 1 Secuencia de aminoácidos de virF_15955 (1-609) Código universal Número total de aminoácidos: 202, PM = 22.394 Max ORF: 1-606, 202 AA, PM = 22.394
ORIGEN
1 MRNSSLRDAS GSNDAQVPHK 21 TELLNLPDHV LTEVAKRLAT 41 NNPVESAENI ANFSKSHRFT 61 RDAVRTEPLE KFSSRLKILS 81 RNAKLLSHAV RHAATLPDGE 101 QLSEAQLSQM RSEVATRPVL 121 GVAYTHQDGQ PEERLSGNHL 141 DHKINNIPNL VFNVAEPIMF 161 NEISALEVMA EVRPIARSIK 181 TAHDDARAEL MSADRPRSTR 201 GL *
Secuencia núm. 2 Secuencia de aminoácidos de VirD2_pTi15955 (1-1275) Código universal Número total de aminoácidos: 424, PM = 47.476
Max ORF: 1-1272, 424 AA, PM = 47.476
ORIGEN
5 1 MPDRAQVIIR IVPGGGTKTL 21 QQIINQLEYL SRKGKLELQR 41 SARHLDIPVP PDQIRELAQS 61 WVTEAGIYDE SQSDDDRQQD 81 LTTHIIVSFP AGTDQTAAYE 101 ASREWAAEMF GSGYGGGRYN 121 YLTAYHVDRD HPHLHVVVNR 141 RELLGHGWLK ISRRHPQLNY 161 DGLRKKMAEI SLRHGIVLDA 181 TSRAERGIAE RPITYAEHRR
15 201 LERMQAQKIQ FEDTDFDETS 221 PEEDRRDLSQ SFDPFRSDPS 241 TGEPDRATRH DKQPLEQHAR 261 FQESAGSSIK ADARIRVSLE 281 SERSAQPSAS KIPVIGHFGI 301 ETSYVAEASV RKRSGIFGTS 321 RPVTDVAMHT VKRQQRSKRR 341 NDEEAGPSGA NRKGLKAAQV 361 DSEANVGEQD TRDDSNKAAD 381 PVSASIGTEQ PEASPKRPRD
25 401 RHDGELGGRK RARGNRRDDG 421 RGGT *
Secuencia núm. 3 Secuencia de aminoácidos de virE2_pTi15955 (1-1602) Código universal Número total de aminoácidos: 533, PM = 60.502 Max ORF: 1-1599, 533 AA, PM = 60.502
ORIGEN 35
1 MDLSGNEKSR PWKKANVSSS 21 TISDIQMTNG ENLESGSPTR 41 TEVLSPRLDD GSVDSSSSLY 61 IQKELSALFS SGSEHGNQAE 81 NMSLPGNDRR PDEYILVRQT 101 GQDAFTGIAK GNLDHMPTKA 121 EFNACCRLYR DGAGNYYPPP 141 LAFDKISVPA QLEETWGMME 161 AKERNKLRFQ YKLDVWNHAH 45 181 ADMGITGTEI FYQTDKNIKL 201 DRNYKLRPED RYVQTERYGR 221 REIQKRYQHE LQAGSLLPDI 241 MIKTPKNDIH FVYRFAGDNY 261 ANKQFSEFEH TVKRRYGGET 281 EIKLKSKSGI MHDSKYLESW 301 ERGSADIRFA EFVGENRAHN 321 RQFPTATVNM GQQPDGQGGL 341 TRDRHVSVEF LMQSAPNSPW 361 AQALKKGELW DRVQLLARDG
55 381 NRYLSPHRLE YSDPEHFTEL 401 MNRVGLPASM GRQSHAASIK 421 FEKFDAQAAV IVINGPELRD 441 IHDLSPENLQ NVSTKDVIVA 461 DRNENGQRTG TYTSVAEYER 481 LQLRLPADAA GVLGEAADKY 501 SRDFVRPEPA SRPISDSRRI 521 YESRPRSQSV NSF *
Secuencia núm. 4
65 Secuencia de aminoácidos de virE3_pTil5955 (1-2019) Código universal Número total de aminoácidos: 672, PM = 75.584
Max ORF: 1-2016, 672 AA, PM = 75.584
ORIGEN
5 1 MVSTTKKSFA KSLTADMRRS 21 AQRWEQMRK ALITEEEALK 41 RQTRLESPDR KRKYAADMAI 61 VDKLDVGFRG EIGYKILGNK 81 RLRVDNPKEL TREHGRLRKT 101 KTVLKRNPVT QEVYLGLHER 121 KSWLSVSSHL YAADGTLRMK 141 HVKYKDGRFE ERWERDENGD 161 LIRTRYANRG RLFQPVSEKM 181 GAPYRSGPDN RLYRDLTRQN
15 201 GFRRETFERD DQGNLERIGS 221 NHVGFSKISV KAANRQTSQT 241 KIQKLGGAFN KSFRSLLDKE 261 GNELGRDILS HRRLYNKRSA 281 VYDEATGQLK SAKHTFGKIY 301 RSETDYLSAG LKKVSKKILG 321 VTVYRKFAAL SERESEAERL 341 RSFESGAHRQ IWQERAATPG 361 SPPSESDDIH FAQQSHLAKA 381 NSDHVEADVM RVTDQHIDVA
25 401 GQTSSSRQRN LEERLDSQSR 421 YKPANMLLSD PDLRADGPRP 441 YEGLAELTLR RDNESDGHKE 461 NDQRLRHFLQ PEPLVLPHPG 481 SPEITKVFGS RGEPLHPSGT 501 LHTAVGETAC EAPVMSSSLD 521 NHQPAPGQQE LLSLLHNAPA 541 PVSVAIHDEQ ERLAGEAPGG 561 SFRGSSGRTS SMSESIFDED 581 VQSHLVRDYS INPTNGFIDP
35 601 QSLFGGPDLS RGPKSGPEIP 621 SEDYHLSASE QENLLNQLLS 641 VPLPIPSPKP KSARSMIFEG 661 SRPRERSTSR GF *
Secuencia núm. 5 Secuencia de aminoácidos derivada de RSF1010_mobA (1-2130) Código universal Número total de aminoácidos: 709, PM = 77.847
45 1 MAIYHLTAKT GSRSGGQSAR 21 AKADYIQREG KYARDMDEVL 41 HAESGHMPEF VERPADYWDA 61 ADLYERANGR LFKEVEFALP 81 VELTLDQQKA LASEFAQHLT 101 GAERLPYTLA IHAGGGENPH 121 CHLMISERIN DGIERPAAQW 141 FKRYNGKTPE KGGAQKTEAL 161 KPKAWLEQTR EAWADHANRA 181 LERAGHDARI DHRTLEAQGI
55 201 ERLPGVHLGP NVVEMEGRGI 221 RTDRADVALN IDTANAQIID 241 LQEYREAIDH ERNRQSEEIQ 261 RHQRVSGADR TAGPEHGDTG 281 RRSPAGHEPD PAGQRGAGGG 301 VAESPAPDRG GMGGAGQRVA 321 GGSRRGEQRR AERPERVAGV 341 ALEAMANRDA GFHDAYGGAA 361 DRIVALARPD ATDNRGRLDL 381 AALGGPMKND RTLQAIGRQL
65 401 KAMGCERFDI GVRDATTGQM 421 MNREWSAAEV LQNTPWLKRM 441 NAQGNDVYIR PAEQERHGLV
461 LVDDLSEFDL DDMKAEGREP 481 ALVVETSPKN YQAWVKVADA 501 AGGELRGQIA RTLASEYDAD 521 PASADSRHYG RLAGFTNRKD 5 541 KHTTRAGYQP WVLLRESKGK 561 TATAGPALVQ QAGQQIEQAQ 581 RQQEKARRLA SLELPERQLS 601 RHRRTALDEY RSEMAGLVKR 621 FGDDLSKCDF IAAQKLASRG 10 641 RSAEEIGKAM AEASPALAER 661 KPGHEADYIE RTVSKVMGLP 681 SVQLARAELA RAPAPRQRGM
701 DRGGPDFSM *.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para llevar a cabo una modificación en una célula no humana, en el que un sistema de transferencia bacteriano se pone en contacto con la célula a ser modificada, dicho sistema de transferencia tiene un sistema de transporte de proteínas que comprende un poro, el canal de secreción de tipo IV, que incluye un complejo VirB y proteína VirD4, en el que el sistema de transferencia comprende una proteína de fusión o es capaz de crear una proteína de fusión que se introduce en la célula utilizando el sistema de transporte de proteínas, en el que se introduce una proteína de fusión BA en la célula a ser modificada, cuya proteína de fusión BA comprende
    i) como parte A un oligopéptido que comprende los 37 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de VirF, cuando se fusiona con cre, o los 40 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de una proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV, en el que dicha proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV se selecciona del grupo que comprende VirF, VirD2, VirE2, VirE3 y MobA; y
    ii) como parte B un polipéptido capaz de ejercer una actividad de modificación celular en la célula a ser modificada;
    en el que el extremo C-terminal del polipéptido de la parte B está unido al extremo N-terminal de la parte A, con la condición de que si la proteína de fusión comprende una parte A derivada de VirE2, la proteína de fusión no comprende los 84 aminoácidos del extremo N-terminal de VirE2.
  2. 2.
    Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de fusión se forma mediante la expresión en el sistema de transferencia.
  3. 3.
    Método, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína de fusión se introduce en la célula a ser modificada sin la introducción de una secuencia de ADN o ARN.
  4. 4.
    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína de fusión introducida posee una actividad recombinasa.
  5. 5.
    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque se utiliza una bacteria de la clase Rhizobiaceae como sistema de transferencia.
  6. 6.
    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la célula a ser modificada se selecciona del grupo que comprende i) una célula de plantas, ii) una célula de levaduras, y iii) una célula de hongos.
  7. 7.
    Vector, que codifica un sistema de transporte de proteínas bacterianas que tiene un poro, el canal de secresión de tipo IV, que incluye un complejo VirB y proteína VirD4, así como una proteína de fusión BA que comprende:
    i) como parte A un oligopéptido que comprende los 37 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de VirF, cuando se fusiona con cre, o los 40 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de una proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV, en el que dicha proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV se selecciona del grupo que comprende VirF, VirD2, VirE2, VirE3 y MobA; y
    ii) como parte B un polipéptido capaz de ejercer una actividad de modificación celular en la célula a ser modificada;
    en el que el extremo C-terminal del polipéptido de la parte B está unido al extremo N-terminal de la parte A, con la condición de que si la proteína de fusión comprende una parte A derivada de VirE2, la proteína de fusión no comprende los 84 aminoácidos del extremo N-terminal de VirE2.
  8. 8. Conjunto de vectores, caracterizado porque el conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican un sistema de transporte de proteínas bacterianas que tiene un poro, el canal de secresión de tipo IV, que incluye un complejo VirB y proteína VirD4, así como una proteína de fusión BA que comprende:
    i) como parte A un oligopéptido que comprende los 37 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de VirF, cuando se fusiona con cre, o los 40 aminoácidos más hacia el extremo C-terminal de una proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV, en el que dicha proteína bacteriana transportada por un canal de secresión de tipo IV se selecciona del grupo que comprende VirF, VirD2, VirE2, VirE3 y MobA; y
    ii) como parte B un polipéptido capaz de ejercer una actividad de modificación celular en la célula a ser modificada;
    en el que el extremo C-terminal del polipéptido de la parte B está unido al extremo N-terminal de la parte A, con la condición de que si la proteína de fusión comprende una parte A derivada de VirE2, la proteína de fusión no comprende los 84 aminoácidos del extremo N-terminal de VirE2.
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