CN1244214A - 改进的表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了分离的重组核酸构建物,该构建物包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子。该构建物可用来在细菌细胞中高水平地表达所需多肽。

Description

改进的表达载体

本申请是美国临时申请号60/029,545(1996年11月8日)的部分续展申请，该临时申请纳入本文作参考。

                       发明领域

本发明涉及改进的载体和在细菌细胞中表达重组蛋白的发酵流程。本发明可用来表达任何所需的蛋白，包括用于酶促合成寡糖的酶。

                       发明背景

生物活性多肽和蛋白的生产在经济上对于人和动物药物制剂、酶和其它专用化学物质的生产来说是很重要的。采用细菌、真菌、哺乳动物或昆虫细胞作为表达宿主的重组DNA技术是特别有用的大量生产多肽的手段。

所需蛋白的重组生产通常涉及用一表达载体转染宿主细胞，该表达载体含有当和编码蛋白的基因操作性相连时能控制基因表达的信号。细胞在适于表达重组蛋白的条件下生长。表达控制信号通常包括一个启动子，该启动子影响了位于其下游的基因转录成RNA的速度，并确定了转录的起始位点。对表达控制信号进行选择，以使其在用来生产所需蛋白的宿主细胞中起作用。例如，经常用细菌大肠杆菌来高产量生产重组蛋白。许多文献公开了用大肠杆菌和其它细菌来重组生产蛋白的方法。(例如参见，美国专利No.4,565,785；美国专利No.4,673,641；美国专利No.4,738,921；美国专利No.4,795,706；和美国专利No.4,710,473)。

为了重组生产打算商用的蛋白，特别希望从宿主细胞获得高水平表达的所需的蛋白。提高每一细胞产生的所需蛋白量可减少生产成本(因为获得给定量产物所必须培育的细胞体积减少)，而且还有利于纯化，因为所需产物在宿主细胞所产生的总蛋白中占了更大比例。因此，需要有一种能高水平表达所需蛋白的表达控制信号。本发明填补了这一需要和其它需要。

                       发明概述

本发明提供了一种分离的重组核酸构建物，该构建物包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子。该构建物可用来在细菌宿主细胞中高水平地表达所需多肽。双重启动子包括从tac相关启动子衍生的第一组件，以及从编码半乳糖代谢的一个或数个酶的细菌基因或操纵子获得的第二启动子组件。许多半乳糖启动子可用作第二启动子组件；一个典型的启动子是UDP半乳糖-4-差向异构酶(也称为UDP葡糖-4-差向异构酶)启动子，如从嗜热链球菌获得的启动子。

本发明还提供了表达载体，该载体包括了与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子。表达载体还可进一步包括其它组件如可选择的标记物。构建物还可包括在大肠杆菌或其它宿主细胞中起作用的复制序列起点。本发明中一种较佳的构建物，质粒pTGK(在下文有详细描述)已于1996年5月22日保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号为98059。

本发明还提供含有重组表达盒的细菌细胞，该表达盒包含与异源核酸操作性相连的双重细菌启动子单元。表达盒可以整合入宿主细胞的基因组中，或存在于独立的复制质粒中。较佳的细菌细胞是大肠杆菌。

本发明还提供制备所需多肽的方法。该方法涉及在允许异源核酸表达的条件下使细菌细胞在合适的培养基中培育，其中该细菌细胞含有重组表达盒，该表达盒含有与异源核酸操作性相连的双重细菌启动子单元。通常将大肠杆菌用作宿主细胞。该方法和构建物可用来在细菌细胞中表达各种多肽。典型的多肽包括，激素、生长因子等，以及用于合成糖类的酶。这些酶包括CMP-唾液酸合成酶、UDP-葡糖焦磷酸酶、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、唾液酸醛缩酶、UDP-GlcNAc焦磷酸酶、肌激酶、半乳糖基转移酶和N-乙酰葡糖胺转移酶。

                       附图简述

图1是质粒pPHOX2的图谱。

图2显示了本发明载体中核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)与重组基因起始密码子之间的间隔(SEQ ID NO：2)。

图3是质粒pPHOX2/galE/Kan的图谱。

图4是质粒pTGK的图谱。该质粒基本上与pPHOX2/galE/Kan相同，只是启动子区域的5′XbaI位点和卡那霉素抗性基因(kan′)中的HindIII位点缺失。

图5A和5B表明，用从ATG起始密码子开始的引物寡核苷酸来扩增待表达的DNA，可使本发明载体中核糖体结合位点和待表达基因的起始密码子间的间隔保持最优。图5A表示质粒pTGKS中核糖体结合位点(RBS)和SrfI限制性位点之间的关系(SEQ ID NO：3)。用SrfI消化产生一个平头，该平头连接了从ATG起始密码子开始的平头重组基因，如图5B所示(SEQ ID NO：4)。

图6显示了本发明的一个tac-gal双重启动子实例的核苷酸序列，如图所示(SEQ ID NO：1)，该序列侧接了pPHOX2序列。图中示出了tac和galE启动子的-35和-10共有序列，它们是用于插入需表达重组基因的XbaI和HindIII位点所在的位置。

                       发明详述

本发明提供重组表达所需多肽的改进的启动子和载体。本发明的启动子和载体特别适于在细菌宿主(如大肠杆菌)中表达重组蛋白。另外还提供用本发明的启动子和载体来高水平地表达重组蛋白的发酵流程。

定义

本申请所需的许多命名和通用实验室程序可在Sambrook等，MolecularClonging：A Laboratory Manual(第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，cold Spring Harbor，New York，1989)中找到。该手册在下文中称为“Sambrook等的手册”。

除非另有定义，本文所用的所有科学技术术语的含义均与本发明所述领域技术人员通常所理解的含义相同。Singleton等，(1994)Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology，第二版，John Wiley和Sons(New York)为本领域技术人员提供了本发明所用的许多术语的通用解释。尽管在本发明的实践和测试中可用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来代替之，但是本发明描述了较佳的方法和材料。为便于本发明的说明，对下列术语作了如下定义。

术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限定，其包括以类似于天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有特指，特定的核酸序列包括其互补序列。

术语“操作性相连”指核酸表达控制序列(如启动子、信号序列、或转录因子结合位点的排列)与第二核酸序列间的功能性连接，其中表达控制序列影响到第二序列相应核酸的转录和/或翻译。

术语“重组(体)”用于细胞方面时，表示该细胞复制异源核酸或表达由该异源核酸编码的肽或蛋白。重组细胞可表达不存在于该细胞天然形式(非重组形式)中的基因。重组细胞还可表达存在于该细胞天然形式中的基因，但是其中该基因是通过人工手段修饰并重新导入细胞中的。

本文所用的术语“异源序列”或“异源核酸”是来自外源(或种类)的那些，如果是相同来源，则是从其原来形式经过修饰的序列或核酸。因此，与启动子操作性相连的异源核酸来源于不同于启动子所衍生而得的来源，或者，如果它们来自同一来源，则异源核酸是从其原来形式经过修饰的。例如，UDP葡糖4-差向异构酶基因启动子可以与编码非天然UDP葡糖4-差向异构酶多肽的结构基因连接。例如，通过用限制性酶处理DNA，产生能与启动子操作性相连的DNA片段，就可对异源序列进行修饰。也可用诸如定点诱变的技术来修饰异源序列。

术语“重组表达盒”或简称“表达盒”是一种用重组或合成方法获得的核酸构建物，它具有能影响结构基因在相容于此序列的宿主中表达的核酸元件。表达盒至少包括启动子，还可任选地包括转录终止信号。重组表达盒通常包括待转录的核酸(如编码所需多肽的核酸)和启动子(如含有tac启动子和gal启动子组件的双重启动子)。如本文所述的，还可采用有助于影响表达或必需的其它因子。例如，表达盒还可包括编码引导表达蛋白从宿主细胞分泌的信号序列的核苷酸序列。

术语“分离的”指某物质基本上或几乎不含如其天然状态下发现的通常伴随该物质的组分。因此，例如，分离的蛋白不包括通常与其原处环境相关的物质。通常，如在经银染凝胶上作条带强度测定或其它方法测得的纯度所示，本发明分离的蛋白至少约80％纯，通常至少约90％纯，较佳的至少约95％纯。在本发明中，多肽从其转基因细胞中纯化获得。

UDP葡糖-4-差向异构酶(E.C.5.1.3.2)也称为UDP半乳糖-4-差向异构酶和磷酸核糖酮差向异构酶。这些术语在本文中可互换。

当将两个序列以最大相对应序列对比时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列是相同的，则称两个多核苷酸或多肽是“相同的”。序列比较的最优排列可采用Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、或检验。

术语“基本上相同”用于多肽时是指，在约20-600个残基(通常约50-500个残基，更通常的约250-300个残基)的比较窗口内，多肽包含了至少有80％(较佳的有90％，更佳的有95％或更多)与参比序列相同的序列。相同百分数用上述程序测定。

本文所用的术语“基本上相同”或“序列基本上相同”用于核酸序列时是表示多核苷酸序列的特征，其中，在至少20个核苷酸位(通常至少20-25个核苷酸)的比较窗口(即区域)内与参比序列比较时，该多核苷酸序列与参比序列间至少有85％的序列相同，较佳的至少有90-95％的序列相同，更佳的至少有99％的序列相同，其中序列相同百分数是通过比较参比序列与该多核苷酸序列来计算获得的，该多核苷酸序列可包括在比较窗口内占参比序列20％或更少的缺失或增加。参比序列可以是较大序列的亚组。

核苷酸序列基本相同的另一个指征是两个分子是否能在严谨条件下杂交。严谨条件依赖于序列，在不同环境下是不同的。通常，严谨条件选择在约5-20℃，更通常的在约10-15℃间，低于该具体序列在确定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)。Tm是在确定的离子强度和pH下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。典型的严谨条件是pH7、盐浓度约为0.02摩尔，温度至少约为60℃。例如，在标准的Southem杂交过程中，严谨条件包括42℃以6XSSC初洗，然后在至少约55℃(通常约55℃，更通常地约65℃)以0.2XSSC中再洗涤一次或多次。

对于本发明的目的而言，当核苷酸序列编码的多肽基本上相同时，核苷酸序列也基本上相同。因此，当一个核酸序列编码的多肽与第二个核酸序列所编码的多肽几乎相同时，这两个核酸序列是基本相同的，即使由于遗传密码允许的沉默取代，它们在严谨条件下不杂交(参见Darnell等，(1990)Molecular Cell Biology，第二版Scientific American Books W.H.Freeman and Company New York中关于密码子简并性和遗传密码的解释)。

蛋白纯度或均一性可通过本领域熟知的许多方法来证明，例如对蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后染色显示。出于某些目的需要高分辨度，可采用HPLC或类似方法来纯化。

本发明的实践涉及重组核酸的构建和基因在转染的细菌细胞中的表达。实现这些目的的分子克隆技术是本领域中已知的。适用于构建重组核酸(如表达载体)的各种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员所熟知的。在下列文献中可以找到足以指导本领域技术人员通过许多克隆掌握的这些技术和指导的例子：Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，152卷Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；和Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等编辑，Current Protocols(Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.的合资公司)(1994年增版)(Ausubel))。

足以指导本领域技术人员进行体外扩增方法的过程例子包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术，它们可在Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)的美国专利No，4,683,202；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis等编辑)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim&Levinson(October1，1990)C&EN 36-47；The Joumal Of NIH Research(1991)3，81-94；(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173；Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874；Lomell等，(1989)J.Clin.Chem.35，1826；Landegren等，(1988)Science 241，1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8，291-294；Wu和Wallace，(1989)Gene 4，560；和Barringer等，(1990)Gene 89，117中找到。改进的体外克隆扩增核酸的方法在Wallace等的美国专利No.5,426,039中有所描述。

发明描述

本发明提供了用来在细菌细胞(如大肠杆菌)中高水平表达重组基因的表达盒。另外还提供了包括该表达盒的载体，以及用该表达盒来表达所需异源蛋白的发酵流程。本发明的表达盒含有的双重启动子与编码所需基因产物(通常是多肽)的异源核酸操作性相连。双重启动子包括tac启动子组件，它与参与半乳糖代谢的酶编码基因的启动子(如UDP半乳糖4-差向异构酶基因(galE)的启动子)组件相连。tac-gal双重启动子提供的表达水平高于任一启动子单独提供的水平。双重启动子有协同效果，其水平大于分别表达水平的叠加效果。

为了高水平地表达克隆的基因，表达盒可包括其它序列，如翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。为了能选择包含构建物的细胞，可在表达载体中方便地包括一个或多个可选择的标记物基因(如抗生素抗性基因)。载体可包括其它序列，以使载体能克隆到原核宿主中，如广谱宿主范围的原核复制起始区。技术人员将认识到，这些载体组件的每一种均可进行修饰而不会对其功能有显著影响。

本发明的双重启动子的一个组件是tac启动子，它是lac和trp启动子的组合。含有tac启动子的表达载体一个例子是pKK223-3(Brosius和Holy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6929(1984))；该载体是商业上可获得的(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway NJ)。tac启动子变体，如trc(Amann等，Gene 69：301(1988))也可用作本发明权利要求的双重启动子的第一组件。

本发明的双重启动子的第二组件是从涉及半乳糖代谢的酶编码基因获得的启动子。在细菌中，这些基因通常是簇集的，一个以上的gal基因相互靠得非常近。例如，在嗜热链球菌中，编码UDP半乳糖4-差向异构酶(galE；也称为UDP葡糖4-差向异构酶)和醛糖1-差向异构酶(变旋酶)(galM)基因紧密相连(Poolman等，J.Becteriol 172：4037-4047(1990))。在大肠杆菌中，四个gal基因是相连的(galE，galT(UDP葡糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(uridylyltransferase))、galK(半乳糖激酶)和galM(Bouffard等，J.Mol.Biol.244：269-278(1994)))。类似的，肺炎克雷伯氏杆菌的gal操纵子也包括几个基因(次序为galE，galT和galK)(Peng等，J.Biochem.112：604-608(1992))，而嗜血性流感杆菌(Hemophilus influenzae)在单个操纵子中依次包括galT，galK和galM(Maskell等，Mol.Microbiol.6：3051-3063(1992))，而Streptomyces lividans的gal操纵子基因次序为galT，galE，galK(Adams等，J.Bacteriol.170，203-212(1988))。半乳糖操纵子在一个或多个启动子的控制下表达。例如，S.lividans gal操纵子包括两个启动子，一个(galP1)是半乳糖可诱导的并引导galT，galE和galK基因转录，第二个启动子(galP2)位于galE上游的操纵子中，它是组成型表达的(Fornwald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2130-2134(1987))。除了可诱导启动子外，大肠杆菌gal操纵子还可包括位于galE基因(Id.)上游的组成型启动子。

在一个较佳的实例中，双重启动子包括细菌UDP半乳糖4-差向异构酶(galE)基因的启动子。Poolman等(J.Bacteriol 172：4037-4047(1990))描述的嗜热链球菌UDP半乳糖4-差向异构酶基因是一个特殊的基因例子，从中可获得在本发明中有用的启动子。其它生物的UDP葡糖4-差向异构酶基因的启动子也可用于本发明中，只要该启动子能在大肠杆菌或其它理想的细菌宿主细胞中起作用。含有编码UDP葡糖4-差向异构酶的基因的典型生物包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、S.lividans和E.stewartii，以及沙门氏菌种和链球菌种。

gal基因和其启动子的分离可用本领域技术人员熟知的许多技术来实现。例如，可用能与列举的UDP葡糖4-差向异构酶基因或下述的启动子选择性杂交的寡核苷酸探针来鉴定从另一生物分离的DNA中的所需基因。鉴定同源基因所用杂交技术是本领域中熟知的，不需要作进一步描述。获得的启动子通常与下述列举的葡糖差向异构酶启动子相同或表现出显著的序列相同性。

或者，可用科技文献中描述的熟知的方法来合成具有所需启动子片段核苷酸序列的多核苷酸。例如参见，Carruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418(1982)和Adams等，J.Am.Chem.Soc.105：661(1983)。这样，通过合成互补链并使链在合适条件下退火到一起，或是用DNA聚合酶以合适的引物序列加入互补链，就可以获得双链DNA片段。

本发明的双重启动子所包含的tac和gal启动子可与野生型细菌细胞中的对应启动子相同，或可按需通过(例如)核苷酸插入、缺失或取代来修饰。这种修饰将保留启动子序列中维持启动子功能所需的那些部分。例如，可以保留革兰阳性和革兰阴性细菌(例如参见，Graves等，J.Biol.Chem.261：11409-11415(1986)；Singer和Berg，Genes&Genomes，University Science Books，Mill Vally，CA 1991，pp.140-143)启动子的-10和-35共有序列至获得表达所需的程度。对启动子在大肠杆菌中保持合适功能具有重要性的核苷酸(例如)显示在Singer和Berg所著书的143页中。启动子序列中启动子功能非必需的区域可按需进行修饰，例如可在启动子区域或毗邻处插入限制性位点来促进克隆。

tac和gal组件通常有cAMP受体蛋白(CRP，crp基因产物)结合位点。cAMP是众所周知的碳源可获得性信号，其水平与细胞能量状态成反相关，较差碳源(如果糖、甘油、乙酸)中的细胞生长引起了高于在较好碳源(如葡萄糖)中生长所引起的cAMP水平。cAMP通过与CRP结合来调节基因表达。这一高亲和力的结合在二聚复合体中产生了构象变化，然后该二聚复合体与RNA聚合酶结合位点上游的特异性DNA位点结合。通过促进与RNA聚合酶Eσ⁷⁰形式的初始结合(提高K_B)，转录被激活，至少在gal操纵子例子中如此。

本发明的双重启动子的tac启动子组件通常位于gal启动子组件的上游。两个启动子组件通常分开约0.1-2kb的DNA。更佳的，两个启动子组件分开约0.5-1.5kb。在一个最佳的实例中，tac启动子组件位于gal启动子组件上游约1kb处。分开两个启动子组件的DNA的来源并不特别重要，只要该DNA不含干扰基因表达的序列，如转录终止子。例如，在一个实例中，tac启动子组件通过gal启动子组件天然5′侧翼区获得的DNA而与gal启动子组件分开。在一个较佳的实例中，嗜热链球菌galE基因的5′侧翼区的DNA(约1kb)将tac启动子组件和gal启动子组件分开。

一个较佳的双重启动子的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1中。如图所示，将双重启动子插入pPHOX2表达载体的XbaI位点中，并破坏了上游的XbaI位点。该序列的核苷酸1-146和1490-1561是pPHOX2的序列。tac启动子的-35和-10共有序列分别在核苷酸362-367和384-389。galE启动子共有序列位于核苷酸1438-1443(-35)和1462-1467(-10)。发现核糖体结合位点(RBS)在核苷酸1483-1488。为了在双重启动子下游插入待表达的基因，在RBS后是XbaI限制性位点，在pPHOX2序列中仅挨XbaI位点3′后有HindIII位点。

本发明的载体中还可含有使得载体能在一个或多个选择的宿主细胞中独立复制的核酸序列。通常，该序列是能使载体独立于宿主染色体DNA进行复制的序列，其包括复制起始区或自主复制序列。该序列对于各种细菌是熟知的。例如，质粒pBR322的复制起始区适合大多数革兰阴性细菌。

载体还包含可选择标记基因，以使得能选出携带所需构建物的细菌细胞。这些基因编码了转化宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白。未被含选择基因的载体转化的宿主细胞不能在该培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白赋予了对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素、新霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素)的抗性。或者，可选择标记物编码的蛋白弥补了营养缺陷或提供不能从复合培养基中获得的关键营养物，例如编码Bacilli的D-丙氨酸消旋酶的基因。许多可选择标记物是本领域技术人员已知的，它们在Sambrook等(同上)中举例说明。在用tac-lac双重启动子表达所需多肽中，采用的一个较佳的可选择标记物是卡那霉素抗性标记物(Vieira和Messing，Gene，19：259(1982))。采用卡那霉素选择比(例如)氨苄青霉素选择有利，因为氨苄青霉素会被培养基中的β-乳糖酶迅速降解，从而消除了选择性压力，使得不含载体的细胞在培养基中过度生长。

含有一种或多种上述组件的合适载体的构建可采用上述文献中描述的标准连接方法。分离质粒或切下DNA片段，缝制，以所需形式重新连接，产生所需的质粒。为了确认构建质粒序列是否正确，用标准方法(如限制性内切酶消化)分析质粒，和/或按照已知的方法测序。

许多细菌宿主细胞可用于本发明的载体。有用的细菌例子包括埃希氏杆菌属、肠杆菌属、固氮菌属、欧文氏菌属、杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属和福球菌属。合适的大肠杆菌宿主包括下列菌株：JM101、RR1、DH5α和其它菌株。这些例子是描述性的，而非限制性。根据所用的宿主细胞，用适合此类细胞的标准方法进行转化。合适的方法包括采用氯化钙的钙处理、聚乙二醇或电穿孔。

本发明还提供了用tac-gal双重启动子来高水平表达所需多肽的方法。宿主细胞用含有双重启动子表达盒的载体转化，并在适合所需多肽表达的条件下在培养基中培养细胞。细胞可生长在摇瓶或其它容器内，但是对于大规模制备多肽，在发酵罐中生长是较佳的。为了获得最大水平的表达，在细胞生长周期的适当时间在营养培养基中加入半乳糖，以诱导提高所需多肽的表达。例如，可在含有果糖(最终浓度为0.25％)作为碳源的培养基中开始宿主细胞的生长；也可用使胞内cAMP(腺苷3′，5′-环化单磷酸)浓度增加的其它糖类(如甘油、乙酸)作为碳源。培养开始约5-6小时后，或一旦细胞到达合适的密度(约3-6A₆₀₀)，在培养基(发酵罐分批进料培养方式)中加入果糖和半乳糖溶液(最终浓度为3％果糖，0.6％半乳糖)。半乳糖提高了本发明的tac-gal双重启动子表达盒的表达水平。在生长周期可提高果糖/半乳糖的进料速度(以分级或斜坡方式)，因为培养物随细胞生长而变稠密。较佳的，果糖/半乳糖溶液进料至生长周期结束。

本发明的双重启动子可用来表达出非常高产量的任何所需的多肽或蛋白。多肽可以与细菌宿主细胞同源，或较佳的，与宿主细胞异源。例如，采用了双重启动子，就能以非常高的水平表达酵母、真菌、哺乳动物和植物蛋白。用本发明要求的双重启动子制得的许多多肽将有酶活性。虽然在细菌宿主细胞中可能不会产生某些多肽(例如那些需要糖基化或其它真核特异性加工才有活性的多肽)的活性形式，但是这些无活性的多肽可用作诱导抗体的免疫原、分子量标记物等。可用该双重启动子表达的典型的细菌多肽包括β-内酰胺酶、糖代谢酶、碱性磷酸酶、限制性酶、DNA和RNA聚合酶、连接酶、激酶、内切核酸酶和外切核酸酶等。典型的真菌多肽包括木质素酶、蛋白酶、糖基转移酶等。可用本发明要求的双重启动子在细菌宿主细胞中表达的典型的哺乳动物多肽包括激素，如胰岛素、生长激素(包括人生长激素和牛生长激素)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、肾素、凝血因子如因此VIII和因子IX、铃蟾肽、凝血酶、造血生长因子、血清白蛋白、激素或生长因子的受体、白细胞介素、集落刺激因子、T细胞受体、MHC多肽、病毒抗原、糖基转移酶等。这些酶的清单是列举性的，并不是绝对的，因为本发明的双重启动子可用于实现与双重启动子操作性相连的任何核酸表达单元的转录。这些表达单元不仅包括编码多肽的那些单元，而且还包括所需产物是核酸(例如反义RNA)的那些单元。

该载体特别适合用来表达在糖类酶促合成中所用的酶。采用酶合成糖类比化学方法更具有优点，因为酶能提供实际上完全的立体选择性和连接特异性(Ito等，Pure Appl.Chem.，65：753(1993)；美国专利5,352,670和5,374,541)。美国专利No.5,374,541和WO9425615A中描述了许多糖基转移酶循环(例如，唾液酸转移酶循环、半乳糖转移酶循环和岩藻糖转移酶循环)，其它糖基转移酶循环在Ichikawa等J.Am.chem.Soc.114：9283(1992)，Wong等，J.Org.Chem.57：4343(1992)，DeLuca等，J.Am.Chem.Soc.117：5869-5870(1995)和Ichikawa等，在Carbohydrates and Carbohydrate Polymers.Yaltami编辑，(ATL Press，1993)中有所描述。可用本发明要求的双重启动子来表达的糖类合成所用的典型的酶还包括CMP唾液酸合成酶、UDP-葡糖焦磷酸酶、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、唾液酸醛缩酶、UDP-GlcNAc焦磷酸酶、肌激酶、半乳糖基转移酶、淋病双球菌los基因座编码的糖基转移酶(例如参见国际申请WO96/10086)和N-乙酰葡糖胺转移酶。这些文献中描述的并用于这些循环的任何酶可用本发明的载体来重组表达。

可用本发明要求的tac-gal双重启动子生产的糖基转移酶循环所需酶的典型例子是半乳糖基转移酶循环。用于半乳糖基转移酶循环的反应介质中除了半乳糖基转移酶外，宜含有供体底物、受体糖和二价金属离子、供体底物再循环系统，该系统包含每摩尔受体糖至少1摩尔的葡糖-1-磷酸、磷酸供体、能将磷酸从磷酸供体转移到核苷二磷酸上的激酶、能从UTP和葡糖-1-磷酸形成UDP-葡糖的焦磷酸酶和催化量的UDP和UDP-半乳糖-4-差向异构酶。半乳糖基转移酶是该循环中主要的酶。典型的半乳糖基转移酶包括β(1，3)半乳糖基转移酶、β(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.90，例如参见，Narimatsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4720-4724(1986))、α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如参见Dabkowski等，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等，Nature 345：229-233(1990))和α(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.38)。用于半乳糖基转移酶循环的其它酶包括激酶(例如丙酮酸激酶)、差向异构酶(例如UDP-半乳糖-4-差向异构酶)和焦磷酸酶(例如，葡糖焦磷酸酶)。编码所有这些酶的DNA可通过本发明的载体来表达。

在一些实施例中，编码感兴趣多肽的DNA可与另一多肽融合表达，较佳的是与信号序列或在成熟多肽N端有特异性断裂位点的其它多肽融合表达。通常，信号序列可以是载体的一个组件，或者它可以是插入载体的多肽DNA的一部分。所选的异源信号序列应能被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶断裂)。对于不识别和加工天然多肽信号序列的细菌宿主细胞，信号序列可由细菌信号序列代替。信号序列通过将所需蛋白从细胞中分泌到胞外培养基中，有利于所需多肽的纯化。

原核细胞产生的多肽也许不必合适地折叠。在从大肠杆菌中纯化时，可使表达的多肽先变性，然后复性。这可通过以下方式来实现：将细菌产生的蛋白溶解在离液剂(如盐酸胍)中并用还原剂(如β-巯基乙醇)还原所有半胱氨酸残基。然后用缓慢透析或凝胶过滤来复性。见美国专利No.4,511,503。

表达的多肽的检测可用本领域已知的方法来实现，例如放射免疫试验、Western印迹法、免疫沉淀或活性试验。根据美国专利No.4,511,503中描述的程序可从大肠杆菌中纯化表达的多肽。

                       实施例

给出下列实施例以便于描述，而不是为了限制本发明。

                       实施例1

                      TGK的构建

pPHOX2/galE的构建

质粒pPHOX2(图1)包含碱性磷酸酶基因的磷酸饥饿可诱导启动子(phoA)，当磷酸水平变得非常低时，该启动子能提高其控制的基因的转录。该质粒含有WO94/12636中描述的phoA启动子以及rrnB核糖体终止子(从pKK223-3中获得，Pharmacia Biotech)。将嗜热链球菌的UDP-半乳糖-4-差向异构酶基因(galE)的半乳糖可诱导启动子(Poolman等，J.Bacteriol.172：4037-4047(1990))和tac启动子插入pPHOX2中。

表达质粒pTGK的构建如下。首先，以聚合酶链反应(PCR)，用Pfu聚合酶和XbaI引物在质粒pHP1/tac(在Poolman等，J.Bacteriol.172：4037-4047(1990)中有所描述)的片段的5′和3′末端进行扩增。扩增片段所含tac启动子约在嗜热链球菌UDP半乳糖-4-差向异构酶基因(galE)的半乳糖可诱导启动子上游大约1kb处(Poolman等，同上)。将5′引物(5′-GCTCTA GACGAT CCGTCC GGCGTA-3′；SEQID NO：5)设计成与pHP1/tac上启动子上游的pBR322载体区域杂交，而将3′引物(5′-ATTCTA GACCT CCTTT CTCAG AAAAAA CAATT-3′；SEQ ID NO：6)设计成与含Shine-Dalgamo核糖体结合位点的galE启动子的一个序列区杂交。维持galE核糖体结合位点和重组基因起始密码子间的最优间隔(图2)。该扩增的1.3Kb DNA片段包括tac和galE启动子，用XbaI消化并将其插入XbaI消化的PPHOX2中，后者包含碱性磷酸酶基因(phoA，在WO94/12636中有所描述)的磷酸饥饿可诱导启动子和rrnB核糖体终止子(从pKK223-3，Pharmacia Biotech获得)(图1)。通过BamHI消化来检查双重tac-galE启动子的排列方向。所得质粒称为pPHOX2/galE。

卡那霉素抗性基因的加入

pPHOX2具有β-内酰胺酶编码的氨苄青霉素抗性基因。在培养基中加入氨苄青霉素以维持质粒，但是它被β-内酰胺酶迅速降解而失去效果。在具有抗重组蛋白(如CMP-唾液酸合成酶)的强选择性压力的细胞中，无质粒的细胞将发生过度生长。为了解决这一问题，将质粒重新改工程造成具有卡那霉素抗性(kan^r)基因，该基因提供了更强的选择作用，因为其编码蛋白作用于膜转运系统水平。

用EcoRI消化质粒pUC4K(Vieira和Messing，Gene 19：259(1982))的1.3kbKan^r基因，并插入pPHOX2/galE质粒唯一EcoRI位点中。利用卡那霉素抗性来收集菌落。所得质粒称为pPHOX2/galE/Kan(图3)。

改进载体以便克隆

pPHOX2/galE/Kan质粒中的多个XbaI和HindIII限制性位点使得克隆变得麻烦，因为重组基因是利用这两个位点来插入的。因此，除去了galE启动子片段5′端的XbaI位点和kan^r基因中的HindIII位点。为了除去XbaI位点，用XbaI部分消化pPHOX2/galE质粒，分离线性化质粒。用Klenow聚合酶填平切割的XbaI位点，形成一个平头片段并重新连接。用限制性图谱来筛选菌落，以鉴定那些具有5XbaI位点缺失的质粒(质粒pPHOX2/galEΔXba)的菌落。

设计寡核苷酸(ATGCAT AAAC TTTTGCC ATTCT CAC；ΔH3(SEQ ID NO：7))以改变HindII(AAGCTT)的AAG密码子，使限制性位点缺失，但保留相同的氨基酸密码子(赖氨酸，AAA)。通过第一次PCR反应，用ΔH3寡核苷酸和M13正向引物(New England Biolabs)从质粒pUC4K扩增DNA，产生620bp的片段。通过第二次PCR反应，用M13反向引物(New England Biolabs)和第一次PCR的片段从pUC4K扩增DNA，产生1.3kb的片段。进一步用正向和反向引物来PCR扩增第二次PCR反应的片段。用EocRI(和HindIII来切割非重组体)消化该片段，并连接到质粒pPHOX2/galEΔXba经EcoRI部分消化所分离的线形片段上。用NheI/HindIII消化来确定EcorI片段的正确插入位点。该载体称为pTGK(图4)，已于1996年5月22日保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号为98059。

pTGK载体的修饰

对pTGK载体可作许多修饰变化。例如，可修饰该载体，使其容易克隆和表达平头PCR片段。为了实现这一点，用XbaI消化pTGK，用Klenow聚合酶将末端填平。用CCCGGG寡核苷酸连接该平头末端，使质粒重新环化，然后用XbaI消化以除去非重组体。用SrfI或SmaI消化，在CCC和GGG间产生平头切割，产生的平头末端可以连接PCR或其它方法获得的平头片段。采用以起始密码子ATG为开始的PCR寡核苷酸作为引物，可以维持起始密码子和核糖体结合位点间的最优间隔(图5)。该载体称为pTGKS。

                       实施例2

            tac-gal双重启动子的表达的分析

本实验测试了在大肠杆菌中采用pHP1(含有该基因的天然启动子和tac启动子)后半乳糖诱导嗜热链球菌UDP-半乳糖-4-差向异构酶基因(galE)表达的能力。使含pHP1的大肠杆菌菌株JM101在LB或M9培养基中生长过夜，该培养基按如下所述进行补充。使所有培养物37℃搅拌培育过夜，达到的细胞密度等于A₆₀₀约为2-3。在到达稳定期时收获细胞，并用French压力细胞处理方法破坏。如Kalckar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 45：1776(1959)中所述的那样测定UDP-半乳糖-4-差向异构酶的活性。单位定为每分钟耗用底物的微摩尔数。

本实验的结果显示在表1中，其证明半乳糖诱导了差向异构酶基因在大肠杆菌中表达。

                       表1生长培养基                 U/L差向异构酶LB                         850LB，10mM半乳糖             2000M9，0.5％果糖，1mM半乳糖   2200M9，0.5％果糖，10mM半乳糖  3120M9，1％果糖，10mM半乳糖    3340M9，1.2％甘油，10mM半乳糖  2860

为了确定在双重启动子控制下的天然galE基因以外其它基因的表达是否受半乳糖诱导，我们将编码GlcNAc转移酶的基因插入pTGK中。将该载体转化到大肠杆菌JM101中，使该细菌在含果糖、果糖和半乳糖、或葡萄糖作为碳源的M9培养基中生长。如表2所示，对于GlcNAcT，表达水平相当低；所得的实验误差很大，因而该数据无法说明半乳糖诱导性。

                        表2pTGK/GlcNAcT                U/L，GlcNAcTM9，果糖                    15M9，果糖+半乳糖             16M9，葡萄糖                  12

tac启动子对表达水平有显著作用

为了确定tac启动子是否对tac-gal双重启动子控制下的基因表达有贡献，我们在表达GlcNAc转移酶或Gal转移酶的构建物(Gotschlich，E.C.，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中除去了tac启动子。所有构建物中均存在galE启动子。使菌株在M9+果糖+半乳糖中生长，并测定GlcNAc或Gal转移酶的活性。结果显示在表3中，它表明tac启动子对表达水平有明显贡献。

                      表3

                      U/LA.GlcNAcT构建物pTGK(P_tac，P_galE，Kan)       16pTGK(P_galE，Kan)              0.5B.GalT构建物pTGK(P_tac，P_galE，Kan)       7pTGK(P_galE，Kan)              3

galE和tac对丙酮酸激酶表达水平的作用

由于上表2中相当低的表达水平不能提供统计学上有意义的结论说明半乳糖诱导双重启动子控制下的异源基因表达的能力，因此下列实验选用了表达更高的酶(丙酮酸激酶)。从含丙酮酸激酶构建物的pTGK质粒中除去galE启动子，质粒只留下tac启动子。我们用相同但有两种启动子的构建物作为对照。两个构建物的核糖体结合位点和间隔相同。这些实验的结果显示在表4中，结果证明galE启动子区的存在对于丙酮酸激酶表达有显著效果。有趣的是，两种构建物(包括缺失galE启动子的构建物)均发现有半乳糖诱导。

                              表4

                               U/L，丙酮酸激酶

                        P_tac        P_tac，galEM9，0.5％果糖               1202         3167M9，0.5％果糖+10mM半乳糖    1902         4377M9，0.5％葡萄糖             1208         2625

在另一个实验中，从丙酮酸激酶构建物中除去tac启动子。将该构建物转化入大肠杆菌中，并比较含两种启动子或只含tac启动子的菌株。本实验的结果显示在表5中，结果表明tac和galE启动子的组合作用大于单独活性之和。加入半乳糖提高了表达水平。

                              表5

                                   U/L，丙酮酸激酶

                         P_galE        P_tac      P_tac，galEM9，0.5％果糖                403           1420       3181M9，0.5％果糖+10mM半乳糖     429           1839       3635

                            实施例3

                         重组基因的表达

大肠杆菌表达载体pTGK已用于生产各种重组蛋白，包括大肠杆菌的CMP-唾液酸合成酶、枯草芽胞杆菌的UDP-葡萄糖焦磷酸酶、大肠杆菌的腺苷酸激酶、Bacillus stearothermophilus的丙酮酸激酶、大肠杆菌的唾液酸醛缩酶、大肠杆菌的UDP-GlcNAc焦磷酸酶、兔肌肉肌激酶、奈瑟氏菌属β1，4-半乳糖基转移酶和奈瑟氏菌属N-乙酰基葡糖胺转移酶。所有这些蛋白均有很高的产量。例如，每千克细胞可产生10000000U的兔肌肉肌激酶，从pTGK中可表达出每千克细胞3500000U丙酮酸激酶。

                            实施例4

                     采用pTGK的细菌发酵流程

培养基的准备

1.在2升烧杯中称取下列组分：60克Na₂HPO₄     Sigma S087630克KH₂PO₄      Sigma P53795克NaCl           J.T.Baker 3628-0550克(NH₄)₂SO₄  J.T.Baker 0792R

2.加入1升蒸馏水并混合溶解。

3.在2升烧杯中称取下列组分：120克NZAmineA    Quest Intl.50克酵母抽提物   Difco2毫升Mzau        PPG Chemical DF 204

4.加入1升蒸馏水并混合溶解。

5.将2-4步的溶液加入发酵罐中(如New Brunswick BioFlow IV)。用蒸馏水补至10升。

6.用原地蒸汽灭菌对发酵罐灭菌60分钟。对出入口灭菌15分钟。

7.称取果糖配成50％溶液：

400克果糖    Sigma F0127

8.用蒸馏水配至800毫升并混合。转移到1升瓶中。

9.称取半乳糖配成20％溶液：

100克半乳糖    Sigma G0625

10.用蒸馏水配至500毫升并混合。转移到1升瓶中。

11.称取MgSO₄，配成0.5M溶液：

6克MgSO₄    Sigma M7506

12.用蒸馏水配至100毫升并混合。转移到200毫升瓶中。

13.称取CaCl₂配成1M溶液：

11克CaCl₂    J.T.Baker 1311-01

14.用蒸馏水配至100毫升并混合。转移到200毫升瓶中。

15.高压蒸汽灭菌下列物质45分钟：

50％果糖(步骤8)

20％半乳糖(步骤10)

0.5M MgCl₂(步骤12)

1M CaCl₂(步骤14)

装有1号进料泵导管的1升瓶

16.称取卡那霉素配成25mg/ml溶液：

0.5克卡那霉素    Sigma K4000

17.用蒸馏水配至20毫升并混合。通过0.2微米无菌滤膜过滤除菌。

18.称取FeSO₄立即接种入发酵罐中：

1.0克FeSO₄    Sigma F7002

19.用蒸馏水配至10毫升并混合。通过0.2微米无菌滤膜过滤除菌。

20.将2号进料泵吸入50％NH₄OH。

New Brunswick BioFlow IV发酵罐的发酵罐参数

1.如果需要，标定溶氧(D.O.)探头。起始D.O.应为100％。

2.设定D.O.，使比例级分微商(P.I.D.)设定值为20％。

3.设定搅拌，使P.I.D.设定值为300rpm。改变P.I.D的D.O.设定，并设定为800rpm。数值800会在几秒内回复到300。这说明搅拌从300rpm开始，但是会增加到800rpm以保持D.O.在20％。

4.设定pH，使P.I.D.设定为6.8。

5.设定2号进料为基础设定值(2号进料泵控制NH₄OH的加量)。

6.设定温度，使P.I.D.设定值为37℃。

7.设定空气流量为每分钟4.3-4.7升。

发酵罐的接种

准备进料瓶：

1.在高压蒸汽灭菌过的进料瓶中加入600毫升果糖溶液和300毫升半乳糖溶液。使瓶与发酵罐1号进料管接挂。

2.测定生长接种物的600nm吸光度。在0.5毫升玻璃比色杯中装入用水1/10稀释培养物。空白为水。

3.在无菌的1升烧瓶中加入下列组分：

50毫升果糖

100毫升硫酸镁

1毫升氯化钙

20毫升卡那霉素

2.5毫升硫酸亚铁

冷却后加入发酵罐中。

4.将接种物加入发酵罐中。

所需蛋白的表达

为了用本发明要求的双重启动子通过发酵罐来获得感兴趣的蛋白质，使细胞最初在含少量果糖作为碳源的培养基中生长。一旦细胞增殖(通常在接种约5-6个小时后)，以分批补料方式补加入半乳糖和果糖溶液。随着培养物因细胞生长变稠密时，在发酵时可增加进料速度(以分级或斜坡方式增加)。持续补充碳源至发酵结束。如果需要，然后从培养也(在分泌蛋白的情况下)或从收获的细胞中纯化出感兴趣的多肽。

提供上述实施例是为了描述本发明而不是限定其范围。本领域技术人员显然很容易对本发明作其它变化，这些变化均包括在所附权利要求内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均因各种目的而纳入本文作参考。

                         序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

       (A)姓名：Cytel Corpoation

       (B)街道：3525 John Hopkins Court

       (C)城市：San Diego

       (D)州：California

       (E)国家：USA

       (F)邮政编码：92121

       (G)电话：(619)552-2794

       (H)电传：(619)552-3049

       (I)电报：

(ii)发明名称：改进的表达载体

(iii)序列数目：7

(iv)通信地址：

      (A)收件人：Townsend&Towsend and Crew LLP

      (B)街道：Two Embarcadero Center，Eighth Floor

      (C)城市：San Franciso

      (D)州：California

      (E)国家：USA

      (F)邮编：94111-3834

(v)计算机可读形式：

      (A)记录介质类型：软盘

      (B)计算机：IBM PC兼容型

      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

      (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)本申请资料：

      (A)申请号：US未给予

      (B)申请日：未给予

      (C)分类：

(vii)在先申请资料：

      (A)申请号：US60/029,545

      (B)申请日：1996年11月8日

(viii)律师/代理人信息：

      (A)姓名：Smith，Timothy L.

      (B)登记号：35,367

      (C)参考/案卷号：014137-009610PC

(ix)通讯信息：

      (A)电话：(415)576-0200

      (B)电传：(415)576-0300(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：1561碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

      (A)名称/关键：启动子

      (B)位置：362..389

      (C)其它信息：/注意＝＂tac启动子″

(ix)特征：

      (A)名称/关键：启动子

      (B)位置：1438..1467

      (C)其它信息：/注意＝″galE启动子″

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GTAAAGAAGT TATGGAGCNT CTTNGTCAGT AAAAAGTTAT TTTTTTCAAC AGCGTTCATA    60AAGTGTCACG GCCGGAGAAT TATAGTCGCT TGGTTTTTAT TTTTTAAGTA TTGGTAACTA    120GTACGCAAGT TCACGTAAAA AGGGTAACTA GATAGACGAN GGTCCGGNGT AGAGGATCCG    180GGCTTATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGGTCAG GCAGCCATCG GAAGCTGTGG    240TATGGCTGTG CAGGTCGTAA ATCACTGCAT AATTCGTGTC GCTCAAGGCG CACTCCCGTT    300CTGGATAATG TTTTTTGCGC CGACATCATA ACGGTTCTGG CAAATATTCT GAAATGAGCT    360GTTGACAATT AATCATCGGC TCGTATAATG TGTGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTTCAC    420ACAGGAAACA GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCT AAAAATGCGG TAGCTTCTGA    480TTATCCAAAA TGCCAACTTT GTATGGAAAA TGAAGGTTAT TTGGGTCGCA TTAATCACCC    540AGCCCGCAGC AATCACCGTG TTGTTCGTTT CCAAATGGAA GACAAGGAGT GGGGCTTCCA    600ATACTCGCCT TATGCCTACT TTAACGAACA TTCTATCTTC TTTTATGGTA AGCACGAACC    660AATGCACATC AGTCCATTGA CGTTTGGCCG TCTCCTAACA ATTGTTGAAG CATTCCCCTG    720GTTACTTCGC AGGTTCAAAT GCCGATCTTC CAATTGTAGG TGGTTCAATT CTTACACATG    780AACACTATCA AGGTGGTCGC CATACCTTCC CAATGGAAGT AGCAGGCATT AAAGAAAAAG    840TTAGCTTTGA TGGTTACTCT GATGTTGAGG CTGGCATCGT TAATTGGCCT ATGTCTGTTC    900TTCGTCTAAG AAGTGAAGAC AAGGGAAGAC TTATCGCTCT TGCAACTAAA ATCCTAAATT    960GCTGGCGTGG TTATTCAGAC GAAAAAGCTG GGGTCTTGGC TGAGTCTGAT GGACAACCTC    1020ACCACACCAT TACTCCAATT GCTCGTAGAA AAGACGGCAA ATTTGAATTG GATTTGGTTC    1080TTCGTGACAA TCAAACTTCT GAAGAATATC CAGACGGTAT CTATCACCCA CATAAAGATG    1140TTCAACATAT TAAGAAAGAA AATATTGGTT TGATTGAAGT TATGGGATTG GCCATTCTTC    1200CACCTCGTTT GAAAACAGAA CTTAAAGATG TTGAAGATTA TCTATTAGGT CAAGGTAACC    1260AAGTTGCTCC AATTCACCAA GAATGGGCAG ATGAACTCAA AGCTCAAATC CGAATATTAC    1320GGCTGAGGAA GTGACAGAAG TTGTTCGACA ATCTGTTGCA GATATCTTTG CTCGTGTACT    1380AGAAGATGCA GGTGTTTATA AGACTAATAG TGAAGGCTTG GATCAGTTTA AAGCATTTGT    1440AGATTTTGTA AATTTAGCTG ATTAATTGTT TTTTCTGAAG AAAGGAGGTC TAGAGTCGAC    1500CTGCAGGCAT GCAAGCTTCT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC TGATACAGAT    1560T                                                                    1561(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：27碱基

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GAAAAGAAGT CTAGANNNAT GNNNNNN                     27(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：25碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GAAAAGAAGT CTAGCCCGGG CTAGA                           25(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：27碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GAAAAGAAGT CTAGCCCATG NNNNNNN                         27(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：24碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GCTCTAGACT ATCCGTCCGG CGTA                            24(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：32碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：ATTCTAGACC TCCTTTCTCA GAAAAAACAA TT                   32(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：25碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：ATGCATAAAC TTTTGCCATT CTCAC                           25

Claims (49)

1.一种重组核酸构建物，该构建物包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子，其中该双重细菌启动子包含tac启动子组件和gal启动子组件。

2.根据权利要求1所述的重组核酸，其中tac启动子组件是trc启动子。

3.根据权利要求1所述的重组核酸，其中gal启动子组件是细菌UDP半乳糖-4-差向异构酶启动子。

4.根据权利要求3所述的重组核酸构建物，其中gal启动子组件来自嗜热链球菌。

5.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中双重启动子导致的所需多肽的表达水平高于单独的tac启动子组件或gal启动子组件的水平。

6.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码细菌多肽。

7.根据权利要求6所述的重组核酸构建物，其中异源核酸从淋病双球菌los基因座获得。

8.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码哺乳动物多肽。

9.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码真菌多肽。

10.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码植物多肽。

11.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码CMP-唾液酸合成酶。

12.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码UDP-葡糖焦磷酸酶。

13.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码腺苷酸激酶。

14.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码丙酮酸激酶。

15.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码唾液酸醛缩酶。

16.根据权利要求27所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码UDP-GlcNAc焦磷酸酶。

17.根据权利要求1所述的重组核酸构建物，其中异源核酸编码兔肌肉肌激酶。

18.一种表达载体，该载体包含可选择标记物和重组核酸构建物，该构建物包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子，其中双重细菌启动子包含tac启动子组件和gal启动子组件。

19.根据权利要求18所述的表达载体，其中可选择标记物是卡那霉素抗性基因。

20.根据权利要求18所述的表达载体，它还包括在大肠杆菌中有功能的复制序列起始区。

21.一种质粒，该质粒与保藏在美国典型培养物保藏中心登录号为No.98059的质粒基本上相同。

22.根据权利要求21所述的质粒，其中该质粒与保藏在美国典型培养物保藏中心登录号为No.98059的质粒相同。

23.一种重组核酸构建物，它包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的嗜热链球菌UDP葡萄糖-4-差向异构酶启动子。

24.一种含有重组表达盒的细菌细胞，该表达盒包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子，其中双重细菌启动子包括tac启动子组件和gal启动子组件。

25.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中gal启动子组件来自嗜热链球菌。

26.根据权利要求24所述的细菌细胞，它是大肠杆菌。

27.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中重组表达盒位于独立的复制质粒中。

28.根据权利要求27所述的细菌细胞，其中质粒还包含卡那霉素抗性基因。

29.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码CMP-唾液酸合成酶。

30.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码UDP-葡糖焦磷酸酶。

31.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码腺苷酸激酶。

32.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码丙酮酸激酶。

33.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码唾液酸醛缩酶。

34.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码UDP-GlcNAc焦磷酸酶。

35.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸编码兔肌肉肌激酶。

36.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中异源核酸从淋病双球菌los基因座获得。

37.一种制备所需多肽的方法，该方法包括在使所需多肽表达的条件下在合适的培养基中培育含有重组表达盒的细菌细胞，该表达盒包含与编码所需多肽的异源核酸操作性相连的双重细菌启动子，其中双重细菌启动子包含tac启动子组件和gal启动子组件。

38.根据权利要求37所述的方法，其中gal启动子组件来自嗜热链球菌。

39.根据权利要求37所述的方法，其中细菌细胞是大肠杆菌。

40.根据权利要求37所述的方法，其中将细菌细胞培育在含卡那霉素的培养基中。

41.根据权利要求37所述的方法，其中通过培养基中存在半乳糖来诱导表达所需多肽。

42.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码UDP-葡糖焦磷酸酶。

43.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码腺苷酸激酶。

44.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码丙酮酸激酶。

45.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码唾液酸醛缩酶。

46.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码UDP-GlcNAc焦磷酸酶。

47.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码兔肌肉肌激酶。

48.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸编码CMP-唾液酸合成酶。

49.根据权利要求37所述的方法，其中异源核酸从淋病双球菌的los基因座获得。

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