CN1681840A - 参与钴胺素生物合成的基因的转录活化基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及参与钴胺素生物合成的基因的转录活化基因。更具体地，本发明涉及通过重组DNA技术扩大钴胺素，且更具体地为辅酶B₁₂的生产的方法。

Description

参与钴胺素生物合成的基因的转录活化基因

本发明涉及参与钴胺素生物合成的基因的转录活化基因。更具体地，本发明涉及通过重组DNA技术扩大钴胺素，且更具体地为辅酶B₁₂的产量的方法。

维生素B₁₂是称为钴胺素的分子的一个成员，并且其结构具体见WO91/11518。它被用作治疗恶性贫血、神经疾病、甲基丙二酸尿症等的药剂，以及家禽(fowl)和家养动物的饲料添加剂。由于维生素B₁₂的结构复杂，通过化学合成方法在工业上生产维生素B₁₂是困难的。工业生产的发酵过程使用选自脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)或费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)的微生物。尤其是在脱氮假单胞菌，谢氏丙酸杆菌，鼠伤寒沙门氏菌(Salmollella typhimurium)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中，维生素B₁₂的复杂的生物合成途径已经被很好地研究过。22种以上的cob基因参与钴胺素生物合成(WO91/11518)。然而，没有克隆出催化cob(II)yrinicacid a，c-二酰胺还原的酶的基因，而且没有鉴定由cobE，cobW，和cobX编码的多肽的功能。

在脱氮假单胞菌中没有鉴定出参与钴胺素结构块(building block)例如(R)-1-氨基-2-丙醇或5，6-二甲基苯并咪唑(5，6-dimethylbenzimidazole)(DMBI)的生物合成的其它基因，但所述基因已从光合成细菌荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中分离(美国专利6,156,545)。有一些报道称荚膜红细菌染色体的189-kb的片段是也成群的(clustered)，其中该片段通过在该菌株中进行类比命名为cob基因，而且也在这一个大群中发现了参与1-氨基-2-丙醇和DMBI合成的blu基因。

通过反复的传统诱变和随机筛选，脱氮假单胞菌的维生素B₁₂产量逐渐从0.6mg/l增加到60mg/l。脱氮假单胞菌的维生素B₁₂生产过程的特征是发酵从头到尾都在有氧条件下进行，这与丙酸杆菌的无氧发酵或从无氧到有氧条件的周期性发酵相反。此外，甘氨酸甜菜碱(glycine betaine)(甜菜碱)是在脱氮假单胞菌中过量生产维生素B₁₂的必要物质。甜菜碱通常被认为是渗透保护剂，但它在脱氮假单胞菌中作为N源，C源和能源进行代谢，正如对于根瘤菌科(Rhizobiaceae)所报道的那样。通过由甜菜碱同型半胱氨酸转甲基酶将甲基转移到同型半胱氨酸，可以将甜菜碱转化成二甲基甘氨酸和蛋氨酸。在维生素B₁₂合成中，从蛋氨酸合成的S-腺苷蛋氨酸被用作将8个甲基基团引入类咕啉环时的甲基供体。另一方面，从甜菜碱合成的二甲基甘氨酸可由二甲基甘氨酸脱氢酶和肌氨酸氧化酶借助肌氨酸而被转化成甘氨酸。甘氨酸用于利用琥珀酰-CoA通过C4途径(Shemin途径)合成5-aminolevurinic acid(ALA)，ALA是血红素和维生素B₁₂的共同前体。因此，甜菜碱被认为是维生素B₁₂合成的可能前体。但是，甜菜碱在钴胺素过量生产中的真正作用可以是具有调节性的，这是因为将放射活性从[Me-¹⁴C]甜菜碱掺入钴胺素是间接的。此外，阻断甜菜碱的代谢可以增加维生素B₁₂的产量。目前已鉴定了包括参与甜菜碱代谢的基因在内的DNA片段，但没有鉴定所述片段中的基因。因此，它们不再限于参与甜菜碱代谢的酶的结构基因，所述酶例如甜菜碱同型半胱氨酸转甲基酶，二甲基甘氨酸脱氢酶，或肌氨酸氧化酶。结构基因或参与甜菜碱吸收的基因的调节基因也是候选基因之一。

本发明提供了名为cobR的基因，cobR基因编码参与脱氮假单胞菌的维生素B₁₂生物合成的基因的转录活化物CobR，本发明还提供了所述基因或多肽在改善维生素B₁₂的产生或筛选参与维生素B₁₂合成的基因中的用途。

本发明还提供了CobR作为参与甜菜碱代谢的基因的转录活化物的用途。

尽管发现cobR是脱氮假单胞菌中甜菜碱代谢的必要基因，cobR的限制性位点提示cobR不包括在美国专利5,691,163公开的片段中。因此，本发明还使得不降低甜菜碱代谢的情况下通过适当表达cobR在来改善维生素B₁₂的生产成为可能。

如上所述，目前已发现并充分鉴定了参与脱氮假单胞菌中维生素B₁₂合成的大多数基因已经，但有一些基因仍待发现。为了发现这种基因，我们进行了随机诱变并获得了不能产生维生素B₁₂的数个突变体。在这些突变体中，有一个典型突变体CEEX6，其既不产生维生素B12也不利用甜菜碱。通过使用该突变体，我们发现了脱氮假单胞菌中的新基因cobR，其可以使CEEX6产生维生素B₁₂并同时消耗甜菜碱。CEEX6在cobR中具有点突变，并且cobR基因的破坏导致不能产生维生素B₁₂并且不消耗甜菜碱，这表明cobR是维生素B₁₂的合成和甜菜碱的消耗所必需的基因。这些结果提示CobR可以是参与维生素B₁₂合成和甜菜碱消耗的基因的转录活化物，但在AraC/XylS家族中没有这种基因的转录活化物的实例。然后，利用报道基因通过测定cobE操纵子的启动子活性，我们证明了CobR是参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物，所述操纵子是参与维生素B₁₂合成的部分基因。CobR也与cobE，cobQ和cobF的上游区相互作用。cobR的适当表达可以增加脱氮假单胞菌中的维生素B₁₂生产。

本发明涉及一些包含编码参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物即CobR的DNA序列的DNA序列(如序列表中公开的)以及其互补链，或包括这些序列的DNA序列，与这种序列或其片段杂交(优选在标准条件下杂交)的DNA序列，以及由于遗传密码简并性在标准条件下不与这种序列杂交、但编码具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。

通过杂交鉴定DNA序列的方案是本领域技术人员已知的。所述杂交可以在严格条件下发生，即只形成这样的杂合子，其中探针与靶序列(即用探针处理的多核苷酸)至少70％相同。已知包括洗涤步骤在内的杂交的严格性受缓冲液组分、温度和盐浓度变化的影响或由其决定。所述杂交反应优选在相对于洗涤步骤而言较低的严格性条件下进行。

例如可采用约50-68℃的温度在5xSSC缓冲液中进行杂交反应。此时探针可以和与该探针序列的同一性低于70％的多核苷酸杂交。这样的杂合子较不稳定，可通过在严格条件下洗涤而去除。该过程可通过例如在约50-68℃，将盐浓度降低到2xSSC然后降低到0.5xSSC来实现。可选可将盐浓度降低到0.1xSSC。例如与所用探针序列至少70％或至少80％或至少90％-95％相同的多核苷酸片段可通过以约1-2℃/每个步骤的速度逐步升高杂交温度而得以分离。

本发明的“严格条件”指在缓冲液，例如由5xSSC，0.1％(w/v)N-十二烷酰肌氨酸，0.02％(w/v)SDS，1％的封闭剂(Roche Diagnostics，Cat.No.1096176)组成的缓冲液中、在50℃杂交过夜，并在杂交的洗涤步骤中，两次用2xSSC，0.1％(w/v)SDS在室温洗涤5分钟，然后两次用0.1xSSC，0.1％(w/v)SDS在68℃洗涤15分钟。

本发明还包括与SEQ ID NO：1的DNA序列具有至少80％-85％，优选至少86％-90％，且更优选90％以上同一性的DNA序列或其片段。

本发明还涉及本发明多肽的功能衍生物。这种功能衍生物被定义为，在本发明的氨基酸序列的基础上，添加，插入，缺失和/或取代这种序列的一或多个氨基酸残基，但该衍生物仍具有作为参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物的活性。这种功能衍生物可通过本领域已知的肽化学合成法或通过本领域已知的、基于本发明公开的DNA序列的重组方法来制备。本领域已知蛋白和肽中通常不改变所述分子活性的氨基酸改变。最常出现的交换为：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/gly以及反过来的交换。

此外，本发明的多肽包括根据SEQ ID NO：2的多肽，具体是具有参与钴胺素生物合成的基因的转录活化物CobR的生物活性的那些多肽，以及与SEQ ID NO：2多肽具有至少80-85％，优选至少86-90％，更优选至少91-95％，且尤其优选高于95％的同一性并具有所述活性的那些多肽。

为有效表达cobR基因或通常称为编码CobR活性的DNA序列，可使用各种启动子；例如存在于cobR基因上游的原始启动子，抗生素基因例如Tn5的卡那霉素抗性基因、pBR322的氨苄青霉素抗性基因的启动子以及大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lac)的启动子，trp-，tac-，trc-启动子，λ噬菌体启动子，和任何在以下微生物宿主中起作用的启动子：细菌例如大肠杆菌，脱氮假单胞菌，恶臭假单胞菌(P.putida)，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，放射形土壤杆菌(A.radiobacter)，和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，哺乳动物细胞和植物细胞。

为上述目的，其它调控元件例如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主细胞中可操作的天然和合成序列)以及转录终止子(在宿主细胞中的反向重复结构，包括可操作的任何天然和合成序列)，它们在导入所述编码序列的宿主细胞中是可操作的，并和上述启动子一起使用。

多种宿主/克隆载体的组合可用于克隆双链DNA。克隆载体通常是质粒或噬菌体，其含有复制起点，调控元件，克隆位点包括多克隆位点和选择标记物如抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素，四环素，氯霉素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素和壮观霉素等的抗性基因。

用于在大肠杆菌中表达所述基因的载体的实例选自通常用于大肠杆菌的任何载体，例如pBR322或其衍生物，包括pUC18和pBlue-scriptII，pACYC177和pACYC184及其衍生物，以及来自广泛宿主范围质粒，例如RK2和RSF1010的载体。用于在脱氮假单胞菌，恶臭假单胞菌，根癌土壤杆菌，放射形土壤杆菌，或苜蓿中华根瘤菌中表达目的基因的优选载体是任何可以在这些微生物以及在优选的克隆型微生物例如大肠杆菌中复制的载体。所述优选的载体是广泛宿主范围载体，例如粘粒载体例如pVK100及其衍生物和RSF1010及其衍生物，以及含有在脱氮假单胞菌，恶臭假单胞菌，根癌土壤杆菌，放射形土壤杆菌，或苜蓿中华根瘤菌中有功能的复制起点以及在大肠杆菌中有功能的另一起点的载体。应仔细考虑所述载体的拷贝数和稳定性以便稳定并有效地表达克隆的基因，并有效地培养携带所述克隆基因的宿主细胞。含有转座元件例如Tn5的DNA序列也可用作载体以便将目的基因导入优选宿主，尤其是染色体中。含有分离自优选宿主的任何DNA并含有目的基因的DNA序列可用于将所需的DNA序列导入优选宿主，尤其是染色体中。这种DNA序列可通过转化，转导，转接合或电穿孔而被转入优选的宿主。

可作为优选微生物的细菌例如大肠杆菌，脱氮假单胞菌，恶臭假单胞菌，根癌土壤杆菌，放射形土壤杆菌，苜蓿中华根瘤菌以及任何能产生重组CobR的革兰氏阴性细菌。所述微生物的突变体也可用于本发明中。

编码本发明CobR的DNA序列可通过本领域已知产生表达载体的方法被连入适宜的载体，所述载体含有上述在宿主细胞中可操作的调节区例如启动子和核糖体结合位点以及转录终止子。

为构建携带表达载体的宿主细胞，可使用各种DNA转移方法，包括转化，转导，接合配对(conjugal mating)和电穿孔。用于构建转化的宿主细胞的方法可选自分子生物学领域已知的方法。常用的转化系统可用于大肠杆菌和假单胞菌。转导系统也可用于大肠杆菌。接合配对系统可广泛用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌，恶臭假单胞菌，苜蓿中华根瘤菌和脱氮假单胞菌。

此外，本发明涉及用SEQ ID NO：2多肽筛选参与微生物B₁₂合成的基因，尤其是具有所述转录活化物活性的那些基因的方法。由于转录活化物通过与待活化基因上游的DNA相互作用活化该基因的转录，可利用转录活化物的多肽从基因组DNA片段中分离与该转录活化物相互作用的DNA片段。预期除已经分离并鉴定的cob基因外，参与微生物B₁₂合成的基因可通过利用SEQ ID NO：2多肽或其包含DNA结合结构域的C-末端部分的亲合力而分离。

以下实例用于说明而非限制。

菌株和质短

脱氮假单胞菌PF1-48来自菌株MB580(美国专利3,018,225)并根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM15208。菌株CEEX6是衍生自PF1-48的突变体，其不消耗甜菜碱也不产生维生素B₁₂，并保藏在DSMZ保藏号为DSM 15207。质粒pGUS02用于实施例3-(1)，其是如下构建的。启动子-缺少型(promoter-less)β-葡糖苷酸酶(gus)是通过PCR用以下引物从pBI101(CLONTECH Laboratories，Inc，CA)制备的；N-GUS：SEQ ID NO：3(用Sma和INdeI位点标记)和C-GUS：SEQ ID NO：4(用XhoI和SacI标记)。然后，gus的SmaI-SacI片段被导入pBluescriptII KS-(Stratagene，La Jolla，CA)中的SmaI和SacI位点之间。最后，由SD和三个框架中的三种终止密码子以及PstI，BamHI，和NdeI位点组成的盒(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的退火产物)被导入质粒中的PstI和构建的NdeI之间。

质粒pETcobR用于实施例3-(2)，其是如下构建的。为在cobR的起始密码子位置产生NdeI位点，用引物COBRNde：SEQ ID NO：7，和COBR135R：SEQ ID NO：8针对pCRIIcobRB(pCRII∷4.5kb BamHI)进行PCR。然后，来自PCR产物的0.1kb的NdeI-SphI片段被克隆入pUC18中的NdeI和SphI位点之间，选出具有正确序列的克隆。随后，将来自pCRIIcobRB的0.1kb的NdeI-SphI片段和1.1kb的SphI-EcoRI片段同时克隆到pUC18中的NdeI和EcoRI位点之间。最后，从产生的质粒中切下1.2kb的NdeI-EcoRI片段并克隆入修饰后的pETIIa(Stratagene)中，所述质粒的BamHI位点通过使用EcoRI接头：pGGAATTCC而被转化成EcoRI位点。

接合

大肠杆菌ED8767或DH5α和脱氮假单胞菌菌株之间的接合通过三-亲本接合法(three-parental conjugation)如下进行。携带具有tra基因的pRK2013的大肠杆菌DH5用作接合转移的辅助菌株。在补充适当的抗生素的LB中、在37℃培养大肠杆菌，在LB中在30℃培养脱氮假单胞菌菌株过夜。将大肠杆菌培养物部分以1％的接种体积转移到不含抗生素的LB中并培养6小时。脱氮假单胞菌，供体大肠杆菌，和辅助大肠杆菌以2∶1∶1混合，并将混合物点样到铺在LB琼脂板上的硝酸纤维素滤膜上。所述板在30℃保温过夜以进行配对(mating)。随后在含有100μg/ml链霉素和200μg/ml新霉素或2.5μg/ml四环素的LB板上铺板，使细胞在滤膜上生长，从中选出脱氮假单胞菌的转接合体。

Gus测定

将4ml培养液在4℃、3,000xg离心10分钟来收集细胞。沉淀用含有25mM Tris-HCI，pH7.4的缓冲液3ml洗涤一次，并重悬于相同的缓冲液中。利用牛血清白蛋白作为标准品，使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，ILL)测定细胞悬液的蛋白浓度以后，用所述缓冲液将所述悬液稀释到浓度为1mg蛋白/ml。稀释后的悬液以50μl分配到Eppendorf管中，并在-80℃冷冻一次。冷冻的样品在4℃解冻，加入0.64ml的Z缓冲液(60mM Na₂HPO₄，40mM NaH₂PO₄，10mM KCl，50mM 2-巯基乙醇(2-ME)，1mM MgSO₄·7aq，(使用前加入2-ME))和0.16ml的溶菌酶溶液(2.5mg/ml Z缓冲液)。通过涡旋混合1秒钟后，将样品在37℃保温5分钟。然后加入8μl、10％TritonX-100，混合1秒钟并置于冰上。随后在30℃预保温5min，加入400μl p-硝基苯基-β-葡糖苷酸(PNPG)溶液(4mg/ml Z缓冲液)。在30℃保温2min，快速加入200μl 1M的Na₂CO₃以终止反应。为去除细胞碎片，将反应混合物在12,000rpm离心5min，并在415nm测定上清液的吸光度。p-硝基苯酚的分子消光系数推定为14,000。一个单位定义为在30℃每分钟产生1nmol产物所需的酶量。

通过HPLC测定维生素B12

将100ul含有0.11％KCN和2.2％NaNO₂的0.88M乙酸缓冲液(pH3.5)加入有安全锁的2ml Eppendorf管中的1ml培养液中。利用涡旋充分混合以后，将所述混合物在台式蒸气灭菌器(tabletop steam sterilizer)中高压煮沸5分钟以进行氰化。高压煮沸以后的样品在12,000rpm离心5min，取上清进行HPLC测定。将10μl所述样品注入Kanto Chemical Mightysil RP-18 GP(4.6mm×250mm，5μm)柱，并用0.05M KH₂PO₄∶MeOH(75∶25)，pH4.5以0.8ml/min的流速进行洗脱。在361nm检测在约10分钟时洗脱的维生素B₁₂的吸光度。

通过HPLC分析甜菜碱

将培养液离心去除细胞之后，上清液用Ekicrodisc 25(孔径0.45nm，Pall)过滤并用于HPLC分析。将10μl样品注入YMC-Pack PA(4.6mm×250mm，5μm)柱，并用乙腈∶H₂O(80∶20)以2.0ml/min的流速洗脱。甜菜碱，蔗糖，葡萄糖和果糖通过折射率检测器R18021(Tosoh Corporation，Tokyo，Japan)检测。

用于生产维生素B₁₂的培养基

用于合成维生素B₁₂的培养基是用于接种培养(seed culture)的#688和用于主生产(main production)的CCM-1。1升#688(用1N NaOH调pH为7.4)含有甜菜糖蜜(beat molasses)(90g)，(NH₄)₂HP0₄(3g)，(NH4)₂SO₄(1.5g)，MgSO₄·7H₂O(1.5g)，和ZnSO₄·7H₂O(30mg)。1升的CCM-1(用1NNaOH调pH为7.4)含有蔗糖(40g)，甜菜碱(15g)，酵母提取物Amberex 695AG(1g)，柠檬酸(6g)，谷氨酸钠(1g)，KH₂PO₄(2g)，(NH₄)₂SO₄(2g)，MgSO₄·7H₂O(4g)，FeSO₄·7H₂O(60mg)，ZnSO4·7H₂O(20mg)，CaCl₂·2H₂O(0.5g)，MnSO₄·4-5H₂O(10mg)，CuSO₄·5H₂O(0.5mg)，Co(NO₃)₂·6H₂O(250mg)和5，6-二甲基苯并咪唑(70mg)。用作实施例3中的甜菜碱-缺乏型培养基的CCM-1X与CCM-1的不同之处在于其甜菜碱含量(0g)和谷氨酸钠含量(10g)不同。

实施例1从脱氮假单胞菌分离cobR基因

(1)构建脱氮假单胞菌PF1-48的基因组文库

从脱氮假单胞菌PF1-48制备的染色体DNA用SalI部分消化，并通过制备性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖：0.7％)分离该部分消化物中的15-35kb的片段；切出含有目的片段的所述凝胶片，将所述片段电洗脱(electro-elute)至由40mM Tris-乙酸和2mM EDTA组成的TEA缓冲液中。平行地，将5μg粘粒载体pVK100(ATCC 37156)用SalI完全消化，消化物用虾碱性磷酸酶(United States Biochemical Corporation，Cleveland，USA)根据生产商说明进行处理。去磷酸化的pVK100(130ng)与所述15-35kb的片段(33ng)通过DNA连接试剂盒第1版(Takara Shuzo，Co.Ltd.，Kyoto，Japan)在26℃连接10分钟。然后，所得连接物使用λ体外包装试剂盒(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)根据生产商说明用噬菌体外壳蛋白包装。用产生的噬菌体颗粒感染大肠杆菌ED8767，获得约400个卡那霉素抗性菌落。这些菌落被单独培养，经过生长的细胞被保存于-80℃、15％的甘油中备用。

(2)在基因组文库中筛选能弥补CEEX6的基因

当将CEEX6培养在CCM-1培养基中时，培养液不变为赤褐色，这是由于没有产生维生素B₁₂。利用CEEX6的这种性质，筛选基因组文库中使得CEEX6产生赤褐色色素的基因。通过接合将上述约400个粘粒克隆分别从大肠杆菌ED8767转移到CEEX6中，将产生的转接合体培养在微量滴定板中的100μl CCM-1中，并在30℃震摇1-2天。结果，携带pS4F6的一个CEEX6克隆可以使培养基变为赤褐色。随后，在摇瓶培养中评估所述转接合体在CCM-1中的维生素B₁₂生产力。携带pS4F6的CEEX6同时恢复了维生素B₁₂的生产和甜菜碱的消耗。

(3)亚克隆pS4F6中弥补CEEX6的基因

pS4F6中弥补CEEX6的基因即cobR显示于图1，其中该基因用EcoRI位点描述。来自pS4F6的亚克隆也显示，在色素和维生素B₁₂产生以及甜菜碱消耗方面具有弥补CEEX6的能力。每种EcoRI片段(El-E6)不弥补CEEX6的色素产生能力(E7未检测)。B：BamHI，E：EcoRI，Et：EcoT22I，H：HindIII，P：PstI，S：SalI，X：XhoI。

数种来自pS4F6的SalI片段通过用SalI部分消化pS4F6并进行再连接而被缺失。6种从pS4F6切下的EcoRI片段(E1：8kb包括来自pVK100的5.5kb的EcoRI-SalI片段，E2：5kb，E3：2.7kb，E4：1.8kb，E5：1.3kb，E6：1kb)被单独亚克隆入pVK100。此时没有发现E7(0.4kb)的存在。估计约5kb的片段保持在该载体中而没有被EcoR1切除。用SalI构建的缺失突变体以及携带每种EcoRI片段的pVK100被转入CEEX6，并在CCM-1中评估产生的转接合体的色素产生。

结果，每种EcoRI片段不具有使CEEX6着色的能力。另一方面，一种由SalI构建的缺失突变体pS4F6ΔS94可使CEEX6在培养基中产生赤褐色色素，所述突变体中具有约7kb的插入物以及仅一个EcoRI位点。然而，比S4F6ΔS94少一个1kb的SalI片段的pS4F6ΔS39不使CEEX6具有色素产生能力。随后，构建并分析来自pS4F6ΔS94的其它缺失突变体。质粒pS4F6ΔS110仅具有1kb的SalI片段，其不显示色素产生能力，而pS4F6ΔS132具有1kb SalI片段和相邻的3.2kb片段，其显示色素产生能力。因此，弥补CEEX6的基因应跨两个SalI片段而存在。随后，从pVK100的卡那霉素抗性基因中两个EcoT22I位点之间的pS4F6(pVKcobREt)克隆6.5kb的EcoT22I片段，该片段完整包含上述两个SalI片段。此外，使用位于3.2kbSalI片段中的BamHI，XhoI或PstI位点制备4.5kb的BamHI，2.3kb的XhoI，和1.9kb的PstI片段，所述片段包含位于两个SalI片段之间的SalI位点。用包含pVK100的cos位点的1.7kb BglII片段取代该4.5kb BamHI片段以构建pVKcobRB。将XhoI和PstI片段分别导入pVK100的卡那霉素抗性基因中的XhoI位点和两个EcoT22I位点之间以构建pVKcobRX和pVKcobRP。这些克隆被导入CEEX6并测定其维生素B₁₂生产力和甜菜碱消耗能力。如表1所示，除携带pVKcobRX和pVK100的克隆以外的所有克隆使CEEX6恢复了维生素B₁₂生产和甜菜碱消耗。

表1

菌株	维生素B12生产	甜菜碱消耗
			CEEX6(pS4F6)	+	+
CEEX6(PVKcobREt)	+	+
			CEEX6(pVKcobRB)	+	+
CEEX6(pVKcobRX)	-	-
			CEEX6(pVKcobRP)	+	+
CEEX6(pVK100)	-	+
			PF1-48	+	+

(4)确定CEEX6互补基因的核苷酸序列

为确定弥补CEEX6的基因，测定1.9kb的PstI片段的核苷酸序列，因为该片段是互补CEEX6的最短片段。我们发现命名为cobR的基因的一个ORF在C末端稍跨PstI位点。该ORF由1002bp组成(SEQ ID NO：1：核苷酸位置303和1304之间)，编码334个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。在该ORF中发现了XhoI位点，这与pVKcobRX不互补CEEX6的事实一致。基因产物CobR可以是属于AraC/XylS家族的转录活化物，因为它具有GCG(Genetics Computer Group，University Research Park，WI，USA)中的Motifs程序发现的螺旋-折叠-螺旋基序，该基序在AraC/XylS家族中在C末端附近保守；Hth_Arac_家族_1基序(K，R，Q)(L，I，V，M，A)x2(G，S，T，A，L，I，V)～(F，Y，W，P，G，D，N)x2(L，I，V，M，S，A)x{4，9}(L，I，V，M，F)x2(L，I，V，M，S，T，A)(G，S，T，A，C，I，L)x3(G，A，N，Q，R，F)(L，I，V，M，F，Y)x{4，5}(L，F，Y)x3(F，Y，I，V，A)～(F，Y，W，H，C，M)x3(G，S，A，D，E，N，Q，K，R)x(N，S，T，A，P，K，L)(P，A，R，L)在CobR中的第277-第3 19位残基中保守，如为(R)(L)x{2}(A)～(F，Y，W，P，G，D，N)x{2}(L)x{6}(V)x{2}(V)(A)x{3}(G)(F)x{5}(F)x{3}(Y)～(F，Y，W，H，C，M)x{3}(N)x(S)(P)。克隆pVKcobRP在pVK100中的两个EcoT22I位点之间携带1.9kb的PstI片段，在该克隆中，CobR的C末端4个氨基酸(QMAR)可用来自该载体序列的6个氨基酸(HHQEYG)取代。由此，修饰的CobR可以起作用而互补CEEX6。利用Blast(NCBI，Bethesda，Md.USA)对cobR进行同源性搜索显示，cobR与苜蓿中华根瘤菌1021(保藏号AL591688)基因组序列中的基因SMc04169同源。cobR与SMc04169的同一性在核苷酸水平为86.6％，在氨基酸水平为93.7％。SMc04169的基因产物的功能估计为转录活化物，但很难想象它可以作为参与维生素B₁₂合成的基因的活化物。

实施例2：证实cobR突变与维生素B₁₂生产以及甜菜碱消耗缺陷之间的相关性

(1)确定来自CEEX6的cobR中的点突变

导入cobR基因当然可以互补CEEX6，但这不表示CEEX6在cobR中具有突变。为证实cobR突变导致不消耗甜菜碱也不产生维生素B₁₂，如下所述从CEEX6克隆出cobR基因并确定其核苷酸序列。通过PCR从菌株PF1-48扩增包括cobR的完整ORF的2.1kb片段，用DIG对该片段进行标记，然后将其用作探针。由于我们通过Southern印迹分析发现，4.5kb的BamHI片段也存在于CEEX6中，因此利用上述探针菌落经杂交法克隆出该片段。随后，我们证实，利用pVK100导入该4.5kb BamHI片段并不互补C EEX6。当包括CobR的N末端侧一半序列的2.1kb BamHI-HindIII片段被来自PF1-48的BamHI片段的相应片段取代时，产生的片段也不显示互补活性。因此，我们预测，剩余的编码CobR C末端侧一半序列的2.4kb HindIII-BamHI片段中存在突变。实际上，我们在CEEX6的cobR基因中在属于AraC/XylS家族转录活化物保守区的C末端区中发现了点突变；CEEX6的cobR基因中，Cys299(TGC)变为Arg299(CGC)。

(2)针对包括cobR在内的6.5kb EcoT22I片段进行随机Tn诱变

利用体外Tn诱变试剂盒GSP-1(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA)，用pGPS2.1(Tn中微CAT基因)使带有6.5kb的EcoT22I片段的pCRII载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)突变。从突变样品中切割出包括Tn的8kb的EcoT22I片段并导入pVK100以转化大肠杆菌DH5α。结果，我们获得携带各种突变片段的128Cm抗性转化体。随后，将这些质粒分别转入CEEX6以测定对色素生产的互补能力。128种转接合体中有13种显示没有互补能力。如图2中的总结，在所分析的13种克隆中，携带pVKTn2，5，9，26，46或84的所有6种阴性克隆在cobR ORF中具有Tn。

另一方面，cobR ORF周围的Tn插入物，例如Tn30(下游81bp处)，Tn28(在cobR下游约300bp处一个可移动的(portable)邻接ORF之内)，或Tn35(上游约340bp处)不丧失互补能力。质粒pVKTn3很不寻常地显示弱互补活性，它被插入PstI位点。尽管在pVKcobRP中可用6个残基取代C末端的4个氨基酸残基，但是用另外8个残基(WADNKVLN)取代两个(AR)是不能接受的。

图2显示6.5kb EcoT22I片段的随机诱变：研究的Tn插入位点定位在6.5kb EcoT22I片段中。cobR的ORF显示为开放的盒。具有pVK100上的Tn的每种片段对CEEX6的互补能力用括号内的加号或减号以及定位的Tn插入位点表示。B：BamHI，E：EcoR1，Et：EcoT22I，H：HindIII，P：PstI，S：SalI，X：XhoI。

(3)cobR-空突变体(null mutant)的构建

如上所述，获得数个在cobR中携带Tn的片段。质粒pVKTn26在cobR中心的HindIII和SalI之间具有Tn插入物(图2)，用该质粒构建空突变体。具有来自pVKTn26的Tn(共3.3kb)的1.9kb PstI片段被插入自杀载体pSUP202ΔE的PstI位点，所述自杀载体通过填平pSUP202中EcoRI位点的粘末端来破坏该质粒的CAT基因来构建。随后，利用SalI位点将该自杀质粒中的庆大霉素(Gm)抗性基因用取代Tn内部CAT基因和下一个SalI片段。将产生的质粒导入PF1-48，获得Gm抗性cobR-空突变体Tn26。在CCM-1培养基中，菌株Tn26和CEEX6都完全不产生维生素B12也不消耗甜菜碱。这表明cobR是脱氮假单胞菌中维生素B₁₂合成的一个必要基因。

实施例3：确定cob基因活化中CobR的参与

核苷酸序列和推定的氨基酸序列的分析提示，cobR基因产物CobR可以是一种属于AraC家族的转录活化物。由于cobR缺陷突变体既不消耗甜菜碱也不产生维生素B₁₂，我们预计参与甜菜碱代谢和维生素B₁₂合成的基因由CobR活化。此外，甜菜碱可能是CobR的效应分子。

(1)评估存在或不存在CobR和甜菜碱时cob基因的表达水平

我们采用了启动子探针载体pGus02来评估cob基因的表达水平，所述载体是用gus作为报道基因构建的。我们选择cobEABCD操纵子作为cob基因的代表物，这是因为该操纵子中的cobA编码催化维生素B₁₂合成途径中的第一步反应的酶。此外，我们研究了cobR自身的表达水平以发现cobR是否自我调节。作为包含cobEABCD操纵子的启动子在内的片段，覆盖0.7kbBglII-HindIII片段的0.7kb的HindIII片段插入pGus02的HindIII位点，所述BglII-HindIII片段对应于Crouzet等在GenBank中登记的cobEABCD基因序列(登录号M59236)中第59-第792位的核苷酸，所述0.7kb HindIII片段具有cobE的约500bp5′-非编码区和约200bp编码序列。另一方面，用具有cobR的约0.9kb 5′-非编码区和0.2kb编码区的1.1kb XhoI片段作为可能包括cobR启动子的片段。所述1.1kb XhoI片段被插入pGus02a的两个SalI位点之间，该pGus02a通过将pUC19的多克隆位点插入pGus02的HindIII和BamHI位点之间来构建。随后，从从该载体切出cobE-gus单位(2.6kbXhoI片段)和pcobR-gus的单位(3kb XhoI片段)，并以和pVK100中卡那霉素抗性基因相反的方向导入该质粒的XhoI位点，分别构建pVKpcobEgus和pVKpcobRgus。

随后，将构建的质粒导入PF1-48和CEEX6，并将生成的转接合体培养在CCM-1(含甜菜碱的培养基)和CCM-1X(甜菜碱减少但谷氨酸从1增加到10g/l)中，在其中生长良好的细胞不产生B₁₂。培养两天后，收集细胞并进行gus分析。如表2所示，我们发现，当细胞在甜菜碱减少的培养基中生长时或在cobR缺陷菌株CEEX6中，cobE启动子被抑制。另一方面，即使在甜菜碱缺乏的培养基中，cobR启动子也不被如此地抑制，但其活性在CCM-1中的cobR野生菌株PF1-48中最高。这些结果提示，CobR和甜菜碱一起活化cobE启动子，这是由于尽管cobR可在甜菜碱减少型培养基中表达，但cobE启动子不受抑制，而且CobR在一定程度上和甜菜碱一起进一步活化自身的cobR启动子。

表2

菌株	培养基	启动子活性[gus活性(μmol/min/mg)]
			CEEX6/pVKpcobRgusPF1-48/pVKcobRgus	CCM-1(+甜菜碱)CCM-1(+甜菜碱)	[pcobR活性]461.7639.7
CEEX6/pVKpcobRgusPF1-48/pVKcobRgus	CCM-1X(-甜菜碱)CCM-1X(-甜菜碱)	389.3303.5
			CEEX6/pVKpcobEgusPF1-48/pVKcobEgusCEEX6/pVKpcoERgusPF1-48/pVKcobEgus	CCM-1(+甜菜碱)CCM-1(+甜菜碱)CCM-1X(-甜菜碱)CCM-1X(-甜菜碱)	[pcobE活性]91.2570.061.763.3
CEEX6/pVK100PF1-48/pVK100CEEX6/pVK100PF1-48/pVK100	CCM-1(+甜菜碱)CCM-1(+甜菜碱)CCM-1X(-甜菜碱)CCM-1X(-甜菜碱)	[本底]45.018.819.815.0

(2)通过凝胶位移实验证实CobR功能(在大肠杆菌中表达的CobR)

如前部分所述，启动子活性实验提示CobR和甜菜碱一起活化cobE启动子。为获得CobR参与cob基因活化的更直接的证据，我们进行了凝胶位移实验。

我们使用大肠杆菌BL21(DE3)/pETcobR的无细胞提取物取代纯化的CobR，所述大肠杆菌通过pET系统(Stratagene)表达CobR，并用仅携带pET载体的大肠杆菌的CFE作为阴性对照。在补充了氨苄青霉素的2×10ml LB中培养大肠杆菌细胞过夜，将其转移到2×200ml相同培养基中，在37℃、以180rpm震摇培养4小时。通过以4,000xg离心10分钟收获所述细胞，并用50mMTris-HCl(pH7.5)，5mMMgCl₂洗涤一次。以0.2g湿细胞/ml将洗涤后的细胞重悬于相同的缓冲液中。随后，使细胞悬液以1500kg/cm²通过弗氏压滤器(French pressure cell)两次后，于3,000xg离心10分钟去除细胞碎片，由此制备CEF。另一方面，我们通过使用PCR制备了cobE(cobEF1R1)上游的290bp(从起始密码子起18-307)片段，并用DIG-11-ddUTP、通过DIG凝胶位移试剂盒(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)所含的末端转移酶、对所述片段的3’末端进行标记。

根据生产商提供的方案，利用标记的片段和CFE进行凝胶位移实验。lng标记的片段和包含1.2mg蛋白质的CEF在15μl 20mM HEPES，pH7.6，1mM EDTA，10mM(NH4)₂SO₄，1mM DTT，0.2％(w/v)Tween 20，30mM KCl，50ng/μl聚[d(I-C)]，5ng/μl聚L-赖氨酸中、在室温保温15分钟以进行结合反应。加入5μl的0.25×60％TBE缓冲液、40％甘油后，将10μl样品混合物加样于聚丙烯酰胺凝胶电泳(0.25×TBE中的6％丙烯酰胺，流动缓冲液：0.25×TBE，恒压于80V维持2小时)。通过Trans-Blot SD(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)，使用0.25xTBE作为转移缓冲液，以45分钟、25V将DNA和DNA-蛋白复合物电印迹到带正电的尼龙膜(BoehringerManheim GmbH Cat.No.1209 299)。将该膜在120℃烘烤15分钟而将转移后的DNA分子固定在该膜上，并根据生产商推荐的方案进行检测。结果我们发现，标记后的片段与包含CobR的CFE反应时，所述片段被阻滞。此外，存在过量100倍的非标记cobEF1R1抑制了这种阻滞。反之，来自载体对照物的CFE不使所述DNA片段产生位移。这些结果强烈提示，CobR与cobEABCD操纵子的调控区直接结合，从而活化该操纵子的转录。

(3)证实CobR(脱氮假单胞菌中表达的CobR)参与cob基因的活化

我们发现包含CobR的大肠杆菌CFE可用于凝胶位移实验。这意味着我们可证明CobR直接结合于cobEABCD操纵子的调控序列区。随后，在凝胶位移实验对野生型脱氮假单胞菌菌株PF1-48的CFE与CEEX6(具有点突变的cobR)的CFE进行比较，并用Tn26(cobR-空突变体)作为阴性对照。这些菌株在200ml LB中、30℃、以220rpm震摇的条件下培养16小时，并如实施例3-(2)对大肠杆菌所述制备CFE。除了cobEABCD操纵子以外，还检测了位于其它cob基因上游的区域。我们通过PCR根据Entrez中登记的序列(登录号A30008和M62866)制备了cobF(cobFF1R1)上游的208bp(从起始密码子中的T开始)片段和cobQ(cobQF1R1)上游的281bp(从起始密码子起10-290)片段。这些片段用DIG-11-ddUTP、通过末端转移酶进行标记，并用于凝胶位移实验中。

结果，我们发现cobE和cobQ上游区域的片段明显仅由PF1-48的CFE移动。另一方面，尽管仅有少部分来自cobF上游区域的片段被移动，所述位移仅在将10mM甜菜碱加入结合反应中时才出现。

实施例4：纯化截短的CobR用于制备抗CobR抗血清

虽然用强启动子(例如PET系统的tac和T7)也难以在大肠杆菌中有效表达cobR以及属于AraC/XylS家族的其它转录活化物，我们发现使携带pCRII(pCRIIcobRB)中4.5kb BamHI片段的克隆在HindIII位点(pCRIIcobRBΔH)缺失N末端侧(N-terminal side)可有效将截短型CobR表达为包涵体(inclusion body)而无需IPTG诱导，所述截短型CobR与来自多克隆位点(CobRANHd：20+186/334(CobR)＝206a.a.，23.4kDa)的LacZ N末端(20a.a.)融合。随后，用8M尿素溶解所述包涵体，通过制备性SDS-PAGE如下从该包涵体中纯化CobRΔNHd。通过在补充了卡那霉素的1L LB培养基中进行培养，我们获得了3.3g重组大肠杆菌湿细胞。所述细胞重悬于16.5ml含有50mM Tris/HCl，5mM MgCl₂(pH7.5)的缓冲液A中，将混悬液以1500kg/cm²通过弗氏压滤器两次。随后，所述溶液在3,000xg离心10分钟，以回收具有细胞碎片的包涵体。所述沉淀用缓冲液A洗涤一次，然后该沉淀通过2.5ml缓冲液B温和混合一小时而被溶解，所述缓冲液B含有100mM NaH₂PO₄，10mM Tris，8M尿素(pH8.0)。溶解的蛋白质通过在3,000xg离心10分钟而回收。最后，获得2.5ml的缓冲液B中的125mg蛋白质。将2mg蛋白加样于制备性SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)。将CobRΔNHd的主要蛋白带从凝胶上切下，并用所述凝胶片制备兔抗-cobR抗血清。

实施例5：截短的CobR的DNA结合力

属于AraC/XylS家族的转录活化物的C末端附近具有两个HTH。第一个HTH基序守性较低且相互之间高度不同，而第二个HTH基序不具有这种差异。第二个HTH基序的保守序列是将转录活化物分类成AraC/XylS家族成员的决定因素。自然地，CobR具有C末端中的基序，使得具有CobR C末端一半序列的CobRΔNHd保持DNA结合基序。对于热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasium)Hrc阻抑蛋白，据报道加入任何种类的DNA都显示对复性有效，且所述阻抑蛋白对于含有Hrc结合位点(CIRCE；控制伴侣分子表达的反向重复)的DNA远比对于其它非特异性DNA更为有效。随后，在DNA存在的条件下，将实施例4中8M尿素的溶解的CobRΔNHd进行再折叠(refold)，所述DNA具有CobR结合区。作为这种DNA，我们制备了pCRIIcobApd，其携带2.3kb的BglII-EcoR V片段，所述BglII-EcoR片段包含pCRII载体中的cobEA基因。用20mM Tris-HCI(pH7.5)，5mMEDTA对80μg溶解的CobRΔNHd，5μg pCRIIcobApd进行透析(位于100μl 20mM Tris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，3M尿素中)。用50mM Tris-HCI(pH7.5)、5mMMgCl₂将透出物稀释到1％(8μg蛋白质/ml)。利用1μl所述溶液取代CFE以及实施例3-(3)中制备的标记的cobQF1R1，在实施例3-(2)所述结合反应中进行凝胶位移实验。结果，我们观察到所述片段被复性的CobRΔNHd阻滞。该结果提示N-末端截短的CobR或CobRΔNHd也具有结合cob基因调控区的能力。

实施例6：cobR-扩增的PF1-48的维生素B₁₂生产

携带pVKcobRB的PF1-48和携带pVK100的PF1-48于接种培养基#688中、30℃培养2天。将1ml接种培养液接种到500ml EMF中的30ml CCM-1培养基中。这些主要的发酵在30℃，以220rpm震摇的旋转摇床上进行4天。在第2天，加入5ml接种培养基，所述培养基含450g蔗糖，120g甜菜碱，3gMgSO₄·7aq，和0.105g 5，6-二甲基苯并咪唑/L的，并继续培养2天。对辅酶B₁₂进行氰化后，通过HPLC测定产生的维生素B₁₂的量。结果，前一菌株产生的维生素B₁₂的量比后一菌株高6％。

                              序列表

<110>DSM IP资产公司(DSM IP ASSETS B.V.)

<120>参与钴胺素生物合成的基因的转录活化基因

<130>NDR5233

<140>PCT/EP03/10572

<141>2003-09-23

<150>EP 02021603.2

<151>2002-09-27

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1439

<212>DNA

<213>脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)

<220>

<221>CDS

<222>(303)..(1304)

<400>1

cttttaccga cacccgcacc agccgtgtga agcgtcgcaa tcggcaaaca caaccctgga     60

gagcgctttg cgaatgttgc gtatctctgg cagttcttgt ccgatagcgt caacagcgct    120

gtaaaaactg tcgctttcct tacaaaagcc tgaaagcggg gccgagccgc ctttcaccgc    180

gcgatgtcgc aatgcgaaat ctctttgcgg tcgctgctat ccatgcgaat gtcgcaaaca    240

gacaagccga agagtatctt ccaagcgacg aatataccgc atcgccaagc atgggaagcc    300

tc atg aac aag cca ctg acc aaa aag cgt tct ctc gtc ttc ttc ctg       347

   Met Asn Lys Pro Leu Thr Lys Lys Arg Ser Leu Val Phe Phe Leu

   1               5                   10                  15

gtg ccg aac ttt tcc atg ctg ccc ttt tcg gcg gcg atc gaa acg ctc      395

Val Pro Asn Phe Ser Met Leu Pro Phe Ser Ala Ala Ile Glu Thr Leu

                20                  25                  30

cgc atc gcc aac cgc atg ctc ggc tac gag gcc tat tcc tgg cgc ctc      443

Arg Ile Ala Asn Arg Met Leu Gly Tyr Glu Ala Tyr Ser Trp Arg Leu

            35                  40                  45

gca tcg tcc gac ggc gaa aag gtc ctg tcg tcg agc ggt atc gcg ctc      491

Ala Ser Ser Asp Gly Glu Lys Val Leu Ser Ser Ser Gly Ile Ala Leu

        50                  55                  60

gag gtc aac tcg tcg ctt gca gac gag cgc aag ttt ctc ggc ggc gaa      539

Glu Val Asn Ser Ser Leu Ala Asp Glu Arg Lys Phe Leu Gly Gly Glu

    65                  70                  75

aac cgc ccc tcg atg gtg ctg gtc tgt tcc ggc atc tat gtc gag gac      587

Asn Arg Pro Ser Met Val Leu Val Cys Ser Gly Ile Tyr Val Glu Asp

80                  85                  90                  95

ttc aac aac aag tcg gtc aat gcc tgg ctg cgc gag gtc tac aat cgc      635

Phe Asn Asn Lys Ser Val Asn Ala Trp Leu Arg Glu Val Tyr Asn Arg

                100                 105                 110

ggc gtc gcc gtc ggc agc ctc tgt acc ggc gcc cat gtg ctg gcg tcg      683

Gly Val Ala Val Gly Ser Leu Cys Thr Gly Ala His Val Leu Ala Ser

            115                 120                 125

gcc ggt ctt ctg acc ggc aag cgc tgc gcc atc cac tgg gaa aac ctg      731

Ala Gly Leu Leu Thr Gly Lys Arg Cys Ala Ile His Trp Glu Asn Leu

        130                 135                 140

ccg ggc ttt tcc gaa agc ttc ccg cag gtc gac gtc tat gcc gac ctc      779

Pro Gly Phe Ser Glu Ser Phe Pro Gln Val Asp Val Tyr Ala Asp Leu

    145                 150                 155

tac gaa atc gac agc aac atc tac acc tgc gcc ggc ggc acc gcc tcg      827

Tyr Glu Ile Asp Ser Asn Ile Tyr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ser

160                 165                 170                 175

ctc gac atg atg ctg aac ctg atc gac cag gat ttc ggc gag agc ctc      875

Leu Asp Met Met Leu Asn Leu Ile Asp Gln Asp Phe Gly Glu Ser Leu

                180                 185                 190

gtc aac cgc gtc tgc gaa cag gcg ctg acc gat cgc gtg cgc ggg ccc      923

Val Asn Arg Val Cys Glu Gln Ala Leu Thr Asp Arg Val Arg Gly Pro

            195                 200                 205

cat gac cgc cag cgc ctg ccg ctg cgc gcc cgt ctc ggc gtg cag aac      971

His Asp Arg Gln Arg Leu Pro Leu Arg Ala Arg Leu Gly Val Gln Asn

        210                 215                 220

gcc aag gtg ctg tcc atc arc gaa ctg atg gag gca aac ctc gcc gag     1019

Ala Lys Val Leu Ser Ile Ile Glu Leu Met Glu Ala Asn Leu Ala Glu

    225                 230                 235

ccg ctt tcg ctg ctc gaa atc gcc gag ggc gcc gat ctc tcc cgc cgc     1067

Pro Leu Ser Leu Leu Glu Ile Ala Glu Gly Ala Asp Leu Ser Arg Arg

240                 245                 250                 255

cag atc gag cgc ctc ttc cgc cag gaa atg ggc cgc tcg cct gca cgc     1115

Gln Ile Glu Arg Leu Phe Arg Gln Glu Met Gly Arg Ser Pro Ala Arg

                260                 265                 270

tac tat ctc gaa atc cgc ctc gat cgc gca agg cac ctc ttg atc cag     1163

Tyr Tyr Leu Glu Ile Arg Leu Asp Arg Ala Arg His Leu Leu Ile Gln

            275                 280                 285

tcg tcg atg ccg gtg gtc gaa gtg gcc gta gcc tgc ggc ttc gtc tcc     1211

Ser Ser Met Pro Val Val Glu Val Ala Val Ala Cys Gly Phe Val Ser

        290                 295                 300

gcc tcg cac ttc tcc aag tgt tat cgc gaa ctc tac aac cgc tcg ccg     1259

Ala Ser His Phe Ser Lys Cys Tyr Arg Glu Leu Tyr Asn Arg Ser Pro

    305                 310                 315

cag cag gag cgc gcc gac cgc aag ctg acg ctg cag atg gcg cga         1304

Gln Gln Glu Arg Ala Asp Arg Lys Leu Thr Leu Gln Met Ala Arg

320                 325                 330

taagcggcag atcagatgga tcagacaagg cggagcttct ccgccctttt tcgttggtga   1364

cactttccgc ttgtgccgtc ctggcgcttg cacgcgccgc tgttttggat tgaatggtcg   1424

gcgtttcagg agagc                                                     1439

<210>2

<211>334

<212>PRT

<213>脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)

<400>2

Met Asn Lys Pro Leu Thr Lys Lys Arg Ser Leu Val Phe Phe Leu Val

1               5                   10                  15

Pro Asn Phe Ser Met Leu Pro Phe Ser Ala Ala Ile Glu Thr Leu Arg

            20                  25                  30

Ile Ala Asn Arg Met Leu Gly Tyr Glu Ala Tyr Ser Trp Arg Leu Ala

        35                  40                  45

Ser Ser Asp Gly Glu Lys Val Leu Ser Ser Ser Gly Ile Ala Leu Glu

    50                  55                  60

Val Asn Ser Ser Leu Ala Asp Glu Arg Lys Phe Leu Gly Gly Glu Asn

65                  70                  75                  80

Arg Pro Ser Met Val Leu Val Cys Ser Gly Ile Tyr Val Glu Asp Phe

                85                  90                  95

Asn Asn Lys Ser Val Asn Ala Trp Leu Arg Glu Val Tyr Asn Arg Gly

            100                 105                 110

Val Ala Val Gly Ser Leu Cys Thr Gly Ala His Val Leu Ala Ser Ala

        115                 120                 125

Gly Leu Leu Thr Gly Lys Arg Cys Ala Ile His Trp Glu Asn Leu Pro

    130                 135                 140

Gly Phe Ser Glu Ser Phe Pro Gln Val Asp Val Tyr Ala Asp Leu Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Ile Asp Ser Asn Ile Tyr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ser Leu

                165                 170                 175

Asp Met Met Leu Asn Leu Ile Asp Gln Asp Phe Gly Glu Ser Leu Val

            180                 185                 190

Asn Arg Val Cys Glu Gln Ala Leu Thr Asp Arg Val Arg Gly Pro His

        195                 200                 205

Asp Arg Gln Arg Leu Pro Leu Arg Ala Arg Leu Gly Val Gln Asn Ala

    210                 215                 220

Lys Val Leu Ser Ile Ile Glu Leu Met Glu Ala Asn Leu Ala Glu Pro

225                 230                 235                 240

Leu Ser Leu Leu Glu Ile Ala Glu Gly Ala Asp Leu Ser Arg Arg Gln

                245                 250                 255

Ile Glu Arg Leu Phe Arg Gln Glu Met Gly Arg Ser Pro Ala Arg Tyr

            260                 265                 270

Tyr Leu Glu Ile Arg Leu Asp Arg Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Ser

        275                 280                 285

Ser Met Pro Val Val Glu Val Ala Val Ala Cys Gly Phe Val Ser Ala

    290                 295                 300

Ser His Phe Ser Lys Cys Tyr Arg Glu Leu Tyr Asn Arg Ser Pro Gln

305                 310                 315                 320

Gln Glu Arg Ala Asp Arg Lys Leu Thr Leu Gln Met Ala Arg

                325                 330

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物N-GUS

<400>3

ccaggaatag gcctcgtagc                                                  20

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C-GUS

<400>4

cgcagagctc gagccaccga ggctgtagcc g                                     31

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于盒的寡核苷酸1

<400>5

ggatcctgac taactagcat ctggaggaca ca                                    32

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于盒的寡核苷酸2

<400>6

tatgtgtcct ccagatgcta gttagtcagg atcctgca                              38

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物COBRNde

<400>7

ggcatatgaa caagccactg accaa                                            25

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物COBR135R

<400>8

gtcacccggg catatgttac gtcctgtaga aacc                                  34

Claims (9)

1.分离的DNA，其包含编码CobR的核苷酸序列，其中CobR是参与维生素B12合成的基因的转录活化物，所述DNA选自：

(a)SEQ ID NO：1鉴定的DNA序列或其互补链；

(b)DNA序列，其在严格条件下与(a)中限定的DNA序列的互补DNA序列或其片段杂交，并编码具有参与维生素B12合成的基因的转录活化物CobR的活性；

(c)编码多肽的DNA序列，所述多肽具有(a)或(b)的DNA序列所编码的氨基酸序列；

(d)与编码多肽的DNA至少80％相同的DNA序列，所述多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列；

(e)与编码多肽的DNA至少90％相同的DNA序列，所述多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列；

(f)编码多肽的DNA，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列并优选具有作为参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物的活性；

(g)编码多肽的DNA，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列并优选具有作为参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物的活性。

2.载体或质粒，其包含权利要求1中的(a)-(g)之一所述分离的DNA。

3.宿主细胞，其由权利要求1中的(a)-(g)之一所述分离的DNA或权利要求2的载体或质粒转化或转染。

4.多肽，由权利要求1中的(a)-(g)之一所述分离的DNA编码。

5.制备权利要求4的多肽的方法，其中所述多肽具有作为参与维生素B₁₂合成的基因的转录活化物的活性，所述方法包括在可诱导所述多肽产生的条件下培养权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：脱氮假单胞菌，放射形土壤杆菌，根癌土壤杆菌，大肠杆菌或苜蓿中华根瘤菌。

6.利用生物方法产生钴胺素的方法，其包括将权利要求1中的(a)-(g)之一的分离的DNA导入适当的宿主生物体中，在可诱导钴胺素产生的条件下培养所述宿主生物体并从培养物中回收钴胺素。

7.权利要求6的方法，其中所述宿主生物体是脱氮假单胞菌，放射形土壤杆菌，或苜蓿中华根瘤菌。

8.权利要求6的方法，其中所述宿主生物体是脱氮假单胞菌CEEX6或脱氮假单胞菌PF1-48，所述菌株都根据布达佩斯条约保藏在DSMZ。

9.发现参与维生素B₁₂生物合成的基因的方法，所述方法利用权利要求4的多肽与维生素B₁₂生物合成基因相结合的能力。

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