CN1415014A - 通过基因扩增增加赖氨酸产量 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过在宿主细胞染色体中扩增氨基酸生物合成途径基因来提高棒杆菌属物种生产氨基酸的产量的方法。在一个优选的实施方案中，本发明提供通过在宿主细胞染色体中扩增L－赖氨酸生物合成途径基因来提高谷氨酸棒杆菌的L－赖氨酸产量的方法。本发明还提供通过在宿主细胞染色体中扩增氨基酸生物合成途径基因和/或通过增强启动子的强度来生产氨基酸的新方法。在一个优选的实施方案中，本发明提供通过在宿主细胞染色体中扩增L－赖氨酸生物合成途径基因来提高谷氨酸棒杆菌L－赖氨酸产量的方法。本发明还提供谷氨酸棒杆菌L－赖氨酸生物合成途径基因的新的分离核酸分子。

Description

通过基因扩增增加赖氨酸产量
发明背景
发明领域
本发明涉及微生物遗传学以及DNA重组技术领域。本发明提供用于生产L-赖氨酸的基因序列，载体，微生物，启动子和调节蛋白。本发明进一步提供一种提高L-赖氨酸产量的方法。
相关技术
L-赖氨酸是一种重要的经济产品，通常利用革兰氏阳性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)工业规模发酵生产(Kleemann，A.等，Amino Acids，ULLMANN’SENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY，A2卷，57-97页，Weinham：VCH-Verlagsgesellschaft(1985))。
发酵生产的氨基酸具有立体特异性，这使得发酵方法相较于合成方法更加有利；通常由微生物发酵方法生产L-型氨基酸。利用廉价的碳源如糖蜜，葡萄糖，乙酸和乙醇，进行发酵生产L-赖氨酸和其它氨基酸，是一种相对低廉的生产方法。
微生物生产氨基酸的方法中采用的微生物可以分为四类：野生型菌株，营养缺陷型突变菌株，调节突变菌株以及营养缺陷型调节突变菌株(K.Nakayama等，NUTRITIONAL IMPROVEMENT OF FOOD AND FEEDPROTEINS，M.Friedman，ed，.(1978)，649-661)。
本领域已知应用营养缺陷型或具有抗性的各种分离菌株生产L-赖氨酸的几种发酵方法：美国专利2,979,439公开了需要氨基酸补充(高丝氨酸，或L-甲硫氨酸和L-苏氨酸)的突变菌株；美国专利3,700,557公开了对L-苏氨酸，L-甲硫氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-苯丙氨酸，L-胱氨酸或L-半胱氨酸有营养需求的突变菌株；美国专利3,707,441公开了对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株；美国专利3,687,810公开了既能够产生L-赖氨酸又能够抗杆菌肽，青霉素G或多粘菌素的突变菌株；美国专利3,708,395公开了对高丝氨酸，L-苏氨酸，L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸或其混合物有营养需求并对L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸或其类似物具有抗性的突变菌株；美国专利3,825,472公开了对L-赖氨酸类似物有抗性的突变菌株；美国专利4,169,763公开了棒杆菌属突变菌株，其能够产生L-赖氨酸并对至少一种天冬氨酸类似物和磺胺类药物有抗性；美国专利5,846,790公开了一种突变菌株，能够在缺乏任何生物素作用抑制剂条件下产生L-谷氨酸和L-赖氨酸；美国专利5,650,304公开了用于生产L-赖氨酸的棒杆菌属或短杆菌属的菌株，其能够抗4-N-(D-丙氨酰)-2，4-二氨-2，4-双脱氧-L-阿拉伯糖2，4-二脱氧-L-阿拉伯糖或其衍生物。
关于棒杆菌属物种中L-赖氨酸合成的生化途径已有大量阐述(最新的回顾是Sahm等，Ann.N.Y.Acad.Sci.782：25-39(1996))。进入L-赖氨酸途径的起点在L-天冬氨酸(见图1)，L-天冬氨酸本身是由草酰乙酸通过转氨作用生成。谷氨酸棒杆菌(C.Glutamicum)的一个特性是能够通过两种不同途径将L-赖氨酸中间体哌啶2，6-二羧酸转化成二氨基庚二酸，即，通过涉及琥珀酰化中间体的反应或者通过二氨基庚二酸脱氢酶的单反应进行。大体上，在两点可以调节碳进入该途径：首先，通过L-苏氨酸和L-赖氨酸的水平反馈抑制天冬氨酸激酶；其次，通过控制二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶的水平。所以，可以通过撤消对这两种酶活性的控制及增强这两种酶的活性来提高棒杆菌属物种中L-赖氨酸的产量。
在利用棒杆菌属物种发酵生产L-赖氨酸技术领域中，更新的进展涉及使用分子生物学技术提高L-赖氨酸的产量。下述提供2例作为本领域的示范例：美国专利4,560,654和5,236,831公开了一种L-赖氨酸生产突变菌株，其制备如下：用重组DNA分子转化对S-(2-氨乙基)-半胱氨酸敏感的棒杆菌或短杆菌属物种微生物宿主，其中赋予S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性及L-赖氨酸产生能力的DNA片段被插入到载体DNA中；美国专利5,766,925公开了一株突变菌株，将来源于棒杆菌的编码天冬氨酸激酶的基因整合到棒杆菌属物种染色体DNA中，该天冬氨酸激酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制是脱敏的，该棒杆菌含有渗漏型高丝氨酸脱氢酶或缺失高丝氨酸脱氢酶基因；利用质粒载体进行基因扩增或者使用基因替换策略从而提高L-赖氨酸的产量。欧洲专利申请EP0811682A2和EP0854189A2都提供了通过基于质粒拷贝数的基因扩增方式提高棒杆菌属物种中L-赖氨酸产量的方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供通过扩增，即增加，宿主细胞中氨基酸生物合成途径的一个或几个基因的数目，来提高棒杆菌属(Corynebacterium)物种中氨基酸的产量的方法。特别优选的棒杆菌属物种包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)。
本发明的一个目的是提供分离的抗反馈天冬氨酸激酶，其中在反馈敏感形式中第380位天然存在的苏氨酸残基，被改变为在ACTT 21529的ask基因中的异亮氨酸。本发明的一个目的是提供分离的ask多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供分离的多核苷酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2的多肽序列的核苷酸序列。本发明的另一目的是提供分离的多核苷酸分子，其包含具有SEQ ID NO：1序列的核酸。
本发明的另一目的是提供一种方法，包括用多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，转化棒杆菌属物种宿主细胞，其中所述分离的多核苷酸分子被整合到所述宿主细胞的染色体中，从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数，以及选出转化的宿主细胞。本发明进一步提供一种包括筛选提高的氨基酸产量的方法。该方法可进一步包括在培养基中培养所述转化的宿主细胞，并纯化所述转化的宿主细胞产生的氨基酸。
在另一实施方案中，提高氨基酸产量的方法包括用分离的编码SEQID NO：2氨基酸序列的核酸分子，转化棒杆菌属物种宿主细胞，其中所述分离的核酸分子被整合到所述宿主细胞的染色体中从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数，其中分离的核酸分子进一步包含下述多核苷酸的至少一个：编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径′lysA氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的多核苷酸；编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的多核苷酸，以及选择转化的宿主细胞。本方法可进一步包括在培养基中培养所述转化的宿主细胞并纯化所述转化的宿主细胞产生的氨基酸。
术语“‘lysA”指申请人使用的并在下文说明的截短的lysA基因或氨基酸序列。术语“lysA”指申请人使用的并在下文说明的全长lysA基因或氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供分离的多核苷酸分子，其包含编码SEQID NO：2谷氨酸棒杆菌赖氨酸途径ask氨基酸序列的核酸分子；和至少一个其它棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：编码asd多肽的核酸分子，编码dapA多肽的核酸分子，编码dapB多肽的核酸分子，编码ddh多肽的核酸分子，编码‘lysA多肽的核酸分子，编码lysA多肽的核酸分子，和编码ORF2多肽的核酸分子。在本发明的一个优选实施方案中，分离的多核苷酸分子包含pK184-KDABH’L。在本发明的另一优选实施方案中，分离的核酸分子包含pK184-KDAB。在本发明的另一优选实施方案中，分离的核酸分子包含pD2-KDABHL。在本发明的另一优选实施方案中，分离的核酸分子包含pD11-KDABH’L。
本发明的另一目的是提供分离的多核苷酸分子转化的宿主细胞，该分离的多核苷酸分子包含编码分离的含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中，分离的核酸分子被整合到宿主细胞的染色体从而增加宿主细胞染色体中氨基酸生物合成途径基因的总数。一个实施方案中，多核苷酸进一步包含至少一个其它棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：编码asd多肽的核酸分子，编码dapA多肽的核酸分子，编码dapB多肽的核酸分子，编码ddh多肽的核酸分子，编码‘lysA多肽的核酸分子，编码lysA多肽的核酸分子，和编码ORF2多肽的核酸分子。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含编码多肽的核酸分子，其中所述asd多肽是SEQ ID NO：4；所述dapA多肽是SEQ ID NO：6；所述dapB多肽是SEQ ID NO：8；所述ddh多肽是SEQ ID NO：10；所述‘lysA多肽是SEQ ID NO：21；所述lysA多肽是SEQ ID NO：14；所述ORF2多肽是SEQ ID NO：16。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含核酸分子，其中所述asd多肽是SEQ ID NO：4；所述dapA多肽是SEQ ID NO：6；所述dapB多肽是SEQ ID NO：8；所述ddh多肽是SEQ ID NO：10；所述‘lysA多肽是SEQ ID NO：21；所述lysA多肽是SEQ ID NO：14；所述ORF2多肽是SEQ ID NO：16。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子，和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子，和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子，和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在另一实施方案中，多核苷酸进一步包含编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子，编码SEQID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子，编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子，和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在一个实施方案中，转化的宿主细胞是一种短杆菌(Brevibacterium)，该短杆菌选自：黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)NRRL-B30218，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NRRL-B30219，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)NRRL-B30220，乳发酵短杆菌NRRL-B30221，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)NRRL-B30222，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NRRL-30234和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)NRRL-30235。在另一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αMCR NRRL-B30228。在另一实施方案中，宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(C.Glutamicum)，其选自：谷氨酸棒杆菌(C.Glutamicum)NRRL-B30236和谷氨酸棒杆菌(C.Glutamicum)NRRL-B30237。
本发明的另一目的是提供一种生产赖氨酸的方法，包括培养含SEQID NO：2氨基酸序列的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含下述特性的一个或多个：(a)相较于基因上未改变的非人的宿主细胞，酶活性增加的一个或多个赖氨酸生物合成途径酶；(b)一个或更多拷贝的每个编码赖氨酸生物合成途径酶的基因；以及，(c)一个或更多转录因子的改变，该转录因子调节一个或更多编码赖氨酸生物合成途径酶的基因的转录，其中所述宿主细胞在所述培养基中产生赖氨酸。本发明的一个实施方案中，增加的酶活性包括一个或更多编码一个或更多赖氨酸生物合成途径酶的基因的超量表达。在本发明的另一实施方案中，增加的酶活性是由一个或更多修饰了的赖氨酸生物合成途径酶的活性产生，其中所述的酶修饰相较于缺乏修饰的酶，导致了动力学参数，别构调节，或两者兼有的变化。在本发明的另一实施方案中，一个或更多转录因子的改变包含转录抑制蛋白中一个或多个突变，转录激活蛋白中一个或多个突变，或者两者兼而有之，其中所述的一个或多个突变相较于由缺乏所述改变的转录因子进行的转录，增强了靶核苷酸序列的转录。
本发明的一个目的是提供分离的多肽，其中所述多肽包含与SEQ IDNO：19的氨基酸序列至少有95％序列同一性的氨基酸序列。本发明还进一步提供分离的含SEQ ID NO：19氨基酸序列的多肽。本发明进一步提供分离的含有具SEQ ID NO：18序列的核酸的多核苷酸。本发明的另一目的是提供宿主细胞NRRL-B30360。
本发明的一个目的是提供分离的多肽，其中所述多肽包含与SEQ IDNO：21氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。本发明进一步提供分离的包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的多肽。本发明进一步提供含有具有SEQ ID NO：20序列的核酸的多核苷酸分子。
本发明的一个目的是提供分离的多核苷酸分子，其含有编码含SEQID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，还进一步含有启动子序列，其中所述启动子序列与SEQ ID NO：17至少有95％的序列同一性。本发明进一步提供分离的多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中多核苷酸分子进一步包含SEQID NO：17的序列。本发明进一步提供宿主细胞NRRL-B30359。
下文将清楚地说明本发明的进一步目的及优点。
附图说明
图1.谷氨酸棒杆菌中L-赖氨酸生物合成途径的示意图(Sahm等)。
图2.ask的核苷酸序列(ATCC 21529序列)(SEQ ID NO：1)。
图3A、B.ask的氨基酸序列(ATCC 21529序列)(SEQ ID NO：2)。
图4.asd的核苷酸序列(ATCC 21529序列)(SEQ ID NO：3)
图5A，B.asd的氨基酸序列(ATCC 21529序列)(SEQ ID NO：4)
图6.dapA的核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：5)
图7.dapA的氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：6)
图8.dapB的核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：7)
图9.dapB的氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：8)
图10.ddh的核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：9)
图11A，B.ddh的氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：10)
图12.用于制备截短的lysA(‘lysA)核苷酸序列的lysA全长核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：11)。带下划线的区域与lysA引物退火。
图13.含有截短的lysA(‘lysA)氨基酸序列(SEQ ID NO：21)的lysA全长氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：12)。带下划线的L：截短的PCR产物编码的lysA的最末氨基酸残基。
图14.lysA全长核苷酸序列(pRS6)(SEQ ID NO：13)。
图15 A，B，C.lysA全长氨基酸序列(pRS6)(SEQ ID NO：14)。
图16.ORF2的核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：15)。
图17.ORF2的氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQ ID NO：16)。
图18.本发明5和6赖氨酸途径基因构建体的构建示意图。
图19.ATCC13032，N13和ATCC21529的天冬氨酸激酶(ask)氨基酸序列比较。
图20.含有P1启动子的pRS6 HpaI-PvuII片段的核苷酸序列(SEQID NO：17)。
图21A，B.pDElia2-KDABHP1L构建体的构建示意图。
图22.pDElia2FC5-KDABHL构建体的构建示意图。
图23.截短的ORF2的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。
图24.截短的ORF2的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图25.截短的lysA(‘lysA)的核苷酸序列(NRRL-B11474)(SEQ IDNO：20)。
图26.截短的lysA(‘lysA)的氨基酸序列(NRRL-B11474)(SEQID NO：21)。
优选实施方案的详细说明A.定义
为清楚一致地理解说明书及权利要求书，包括这类术语所涵盖的范围，提供以下各定义。应注意，“实体”，是指一个或多个该实体；例如“多核苷酸”应理解为代表一个或多个多核苷酸。
变构调节。在此，该术语指通过一个或多个配体(变构剂)与一个或多个结合位点的结合来调节酶活性。配体可以是相同或不同的分子。该分子与酶上酶活性位点以外的位点结合。结合导致在酶中诱导构象的改变，而构象的改变则调节活性位点与底物或其他配体的亲和力。变构剂可提高催化位点的底物亲和力(变构激活物)或减少亲和力(变构阻抑物)。变构剂构成了代谢调节机制例如反馈环的基础(见Copeland，Robert A.，Enzymes.A Practical Introduction toStructure，Mechanism，and Data Analysis，279-296页，Wiley-VCH，New York(1996))。
氨基酸生物合成途径基因。在此，术语“氨基酸生物合成基因”包括编码直接参与氨基酸合成的肽，多肽，蛋白和酶的那些基因或基因片段。这些基因可以与宿主细胞中天然存在的基因相同，并与宿主细胞中任意氨基酸，尤其是赖氨酸的合成相关。可供选择地，这些基因可以有修饰或突变，例如，该基因可以含有不显著影响所编码蛋白的生物学活性的修饰或突变。例如，天然的基因可以通过诱变，或通过导入或替换一个或多个核苷酸，或通过去除该基因中不重要的区域进行修饰。这种修饰可采用常规技术实现。
营养缺陷型。在此，该术语指需要一种外来的特定代谢物才能生长的微生物菌株，该代谢物由于后天的遗传缺陷不能被合成。
氨基酸补充物。在此，该术语指生长所需的氨基酸并将其加入到基本培养基以支持营养缺陷型的生长。
染色体整合。在此，该术语指外源DNA片段被插入到宿主有机体的染色体中，更进一步地，该术语用于指外源DNA片段和宿主细胞染色体的适当区域之间的同源重组。
增强子。在此，该术语指一段DNA序列，该DNA序列能够增强启动子活性，可以是插入的内源元件或异源元件以提高启动子的水平，即强度。
高产量衍生株。在此，该术语指微生物菌株，该菌株相较于其衍生来的亲代菌株，能够从葡萄糖产生更高产量的特定氨基酸。
宿主细胞。在此，术语“宿主细胞”可与术语“微生物”相互替换。当二者有区别时，将阐明其区别。
分离的核酸分子。在此，该术语指核酸分子，DNA或RNA，其从其天然环境中被分离出来。例如，载体中包含的重组DNA分子被认为是本发明意义上分离的。进一步的分离DNA分子的例子包括异源宿主细胞包含的重组DNA分子，或溶液中的(部分或基本上)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子体内或体外RNA转录本。本发明的分离核酸分子进一步包括合成产生的这类分子。
赖氨酸生物合成途径蛋白。在此，术语“赖氨酸生物合成途径蛋白”包括直接参与从天冬氨酸合成赖氨酸的肽，多肽，蛋白和酶。还包括开放阅读框架(ORF)编码的氨基酸序列，其中该ORF与赖氨酸生物合成途径操纵子相关。这些蛋白可以是与宿主细胞中天然存在的相同，并且在宿主细胞中与赖氨酸的合成相关。可供选择地，这些蛋白可以被修饰或突变，例如，该蛋白可包含不显著影响这些蛋白生物活性的修饰或突变。例如，天然蛋白可通过诱变或者导入或替换一个或几个氨基酸，优选通过保守氨基酸的替换，或者通过去除该蛋白非必需区域而被修饰。这种修饰可通过常规技术实施。可供选择地，赖氨酸生物合成蛋白可以是与特定宿主细胞异源的。这类蛋白可来自任何具有编码有相同或相似生物功能的蛋白的基因的有机体。
诱变。在此，该术语指在DNA上产生突变的方法。所谓“随机”透变，是指突变的确切位点是不可预知的，可在微生物基因组中的任何位点发生，这种诱变是通过辐射或化学试剂处理等因素造成物理损伤而引起的。rDNA诱变针对克隆的目的DNA，可以是随机的或位点定向的。
突变。在此，该术语指目的核苷酸序列上一个或多个碱基对的改变，插入或缺失或其结合。
可操作地连接。在此，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件以功能关联的方式连接。当核酸与另一核酸序列在位置上具有功能上的关联时，该核酸即为“可操作地连接的”。例如，启动子或增强子如果影响一个编码序列的转录，则这个启动子或增强子与该编码序列就是可操作地连接。可操作地连接指被连接的DNA序列典型地是邻接的，当必要时，连接在阅读框中邻接的两个蛋白编码区。但是，由于增强子通常在与启动子相距几千个碱基时仍有作用以及内含子序列可以具有不同长度，一些多核苷酸元件可以可操作地连接但不邻接。
操纵子。在此，该术语指转录复合物的邻接部分，该复合物中两个或更多编码多肽的开放阅读框架作为多顺反子的信使RNA被转录，被顺式作用启动子和其它对有效转录所必需的顺式作用序列以及其他对有效转录和翻译所必需的顺式作用序列(如，mRNA稳定性控制区域和转录终止区域)控制。该术语通常还指基因表达和调节单元，包括DNA中的结构基因和调节元件。
亲代菌株。在此，该术语指经历某种形式处理以产生本发明宿主细胞的宿主细胞菌株。
从葡萄糖的百分比产量。在此，该术语指按公式[(g产生的氨基酸/g消耗的葡萄糖)*100]＝％产量的定义，从葡萄糖得到的氨基酸产量。
表型。在此，该术语指依赖于宿主细胞基因组成的可观察到的物理特征。
启动子。在此，术语“启动子”具有本领域公知含义，表示含DNA序列的基因的一部分，该DNA序列能提供RNA聚合酶的结合并起始转录，因此指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。启动子序列通常，但不总是，发现于基因5’非编码区。大体上，编码序列存在于启动子的3’端。启动子内具有起始转录功能的序列元件的特征在于通常具有共有的核苷酸序列。启动子序列由近端的和更远的上游元件(增强子)组成。在此“内源启动子”指在该宿主微生物中天然存在的启动子序列。“异源启动子”是指在该宿主微生物中不是天然存在的启动子序列。异源的启动子序列可以来自任何原核或真核生物。合成的启动子是一段核苷酸序列，其具有启动子活性，并在自然中没有发现。
启动子可全部来自天然的基因，或者是杂合启动子。杂合启动子由自然中发现的不同启动子衍生的不同元件构成，或甚至包括合成的DNA片段。杂合启动子可以是组成型的，诱导型的或环境响应的。
有用的启动子包括组成型的和诱导型的启动子。本领域已知许多这类启动子序列。参见，例如，美国专利4,980,285；5,631,150；5,707,828；5,759,828；5,888,783；5,919,670和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor Press(1989)。其他有用的启动子包括既不是组成型的又不是特定(或已知)诱导物分子应答的。这类启动子可包括能够应答发育信号(如培养物的生长期)或环境信号(如pH，渗透压，温度，或细胞密度)的启动子。
可通过诱导型的启动子实现转录的环境条件包括厌氧条件，提高的温度，或光线的存在。本领域技术人员可以理解不同的启动子可以在不同细胞类型中或应答不同环境条件指导基因表达。导致基因在大多数细胞类型中多数情况下表达的启动子通常称为“组成型的启动子”。还可进一步认为由于在多数情况下，调节序列的精确边界还未完全定义，不同长度的DNA片段可以具有相同或相似的启动子活性。
相对生长。在此，该术语指通过直接比较亲代菌株和子代菌株在一定时期内特定培养基中的生长，用于评价其生长的测量值。
转录因子。在此，术语“转录因子”指RNA聚合酶，和其它以序列特异性方式与DNA相互作用并发挥转录调节效应的蛋白。转录因子可以是转录抑制蛋白或转录激活蛋白。在本发明中，转录因子(或转录复合物)的结合位点通常是包含在转录调节元件中。
转录因子识别位点。在此，“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”指多核苷酸序列或序列基序，其可作为一个或多个转录因子的序列特异性相互作用(经常是以蛋白-DNA直接结合的形式)的位点被鉴定出来。典型地，转录因子结合位点可以通过DNA足迹法，凝胶迁移率变动分析，及类似方法被鉴定出，和/或可在已知共有序列基序的基础上进行预测，或通过本领域技术人员公知的其他方法鉴定。
转录复合物。在此，术语“转录单元”或“转录复合物”指多核苷酸序列，其包含结构基因(一个或多个外显子)，顺式作用连接的启动子和一个或多个其它该结构序列有效转录所必需的顺式作用序列，该结构序列适当转录所必需的远端调节元件，以及其它对有效转录和翻译重要的顺式序列(如，聚腺苷酸化位点，mRNA稳定性控制序列)。参见，如美国专利6,057,299。
转录调节元件。在此，术语“转录调节元件”指可单独或与一个或多个其它DNA序列联合激活转录的DNA序列。一个转录调节元件可以包含启动子，应答元件，负调节元件，沉默元件，抑制基因，和/或增强子。参见，例如美国专利6,057,299。B.微生物学的以及重组DNA的方法学
本发明应用微生物学的和重组DNA技术领域普通技术人员公知的方法和技术。培养细菌细胞，分离的DNA分子导入宿主细胞以及分离核酸分子的分离、克隆和测序等方法和技术，是这类方法和技术的一些范例。这些方法和技术在许多常规实验室手册中说明，例如，Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)，J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1992)；M.Singer和P.Berg，Genes & Genomes，University Science Books，MillValley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufman等，Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology and Medicine，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)；Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，B.R.Glick和J.E.Thompson，eds.，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)；和P.E.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)，在此将其全部完整地列入作为参考。
除非另有说明，本文最新所述的所有核苷酸序列是使用DNA自动测序仪(如Model 373，来自Applied biosystems，Inc.)测定的。所以，如本领域所公知的，如同通过这种自动方法测定的任何DNA序列一样，此处被测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。通过自动测定的核苷酸序列与被测序的DNA分子的真实核苷酸序列典型地具有至少约90％的同一性，更典型地具有至少约95％到至少约99.9％的同一性。真实的DNA序列可通过其他方法更精确的测定，包括本领域公知的手工DNA测序方法。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含核酸，其序列与选自SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18；以及SEQ ID NO：20或其互补序列的序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。
包含其序列与参照核苷酸序列具有至少，例如，95％同一性的核酸的多核苷酸，是指除了该核酸序列在每100个参照核酸序列核苷酸中可包括不超过5个错配之外，该核酸序列与参照序列相同。换言之，为制备与参照核酸序列具有至少95％同一性的核酸，参照核酸序列中最多有5％的核苷酸可以被缺失，或被其它核苷酸替换，或者，在参照序列中最多有全部核苷酸5％的核苷酸可以被插入到参照序列中。参照(查询)序列可以是SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，或者SEQ ID NO：20所示任一核苷酸序列的全部，或任何这些序列的任何片段，如下所述。
事实上，任何特定核酸序列与某一段核苷酸序列，比如说由SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18，或者SEQ ID NO：20，或者这些序列的互补序列组成的核苷酸序列，是否具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性，可以使用序列分析计算机程序常规测定，所述程序例如，OMIGAVERSION 2.0 for Windows，可从Oxford Molecular，Ltd，(Oxford，U.K.)得到。OMIGA使用CLUSTAL W比对算法，使用缓慢全动态编程比对方法，以10开始缺口罚分和5.0延伸缺口罚分的默认参数，找出两个核酸序列之间的最佳比对。当使用CLUSTAL W或任何其他序列比对程序测定特定序列是否例如与本发明的参照核酸具有95％同一性时，参数的设置，当然应使得在全长参照核酸序列的基础上计算同一性的百分比，以允许在参照序列中出现最多占核苷酸总数5％的缺口，错配，或插入。本领域公知地其它序列分析程序可应用于实施本发明。
本发明的该实施方案涉及含有核酸的多核苷酸，该核酸的序列与SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20的核酸序列或其互补序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，而不论它们是否具有功能活性。这是因为即使特定的多核苷酸不具有功能，本领域技术人员仍然可使用该核酸分子，例如，作为杂交探针，S1核酸酶作图探针，或者聚合酶链式反应(PCR)的引物。
但是，优选的是含有核酸的多核苷酸，该核酸的序列与SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的核酸序列或其互补序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，且在棒杆菌属物种中确实具有功能活性。
具有与参照多肽氨基酸序列至少例如，95％“同一的”氨基酸序列的多肽是指所要求保护的多肽序列的氨基酸序列与参照序列相同，除所要求保护的多肽序列可在参照多肽氨基酸序列的每100个氨基酸中包含最多5个氨基酸改变。换言之，为制备具有与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，在参照序列中最多5％的氨基酸残基可以被缺失或被其它氨基酸替换，或者，不超过5％参照序列氨基酸残基总数的氨基酸数量可以被插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基端或羧基端或者在这些端点之间的任何位置，可单独地分布于参照序列的残基中，或以一个或多个连续的组分布在参照序列中。
事实上，任何特定氨基酸序列与，例如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或者核酸序列编码的氨基酸序列，是否具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性，可以通过已知的计算机程序常规测定，例如，Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序测定特定序列是否是与本发明的参照序列具有例如95％同一性时，参数的设置当然应使得在全长参照氨基酸序列的基础上计算同一性的百分比以及允许不超过参照序列氨基酸总数5％的同源性缺口。
在一个具体的实施方案中，参照序列(查询序列，本发明的序列)和主题序列之间的同一性，也称为整体序列比对，使用Brutlag等人的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))基础上的FASTDB计算机程序测定。FASTDB氨基酸比对使用的优选参数是：矩阵＝PAM0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或受试氨基酸序列的长度(若其更短)。根据本实施方案，如果主题序列由于N-或C-末端缺失而非因为内部缺失而短于查询序列，那么考虑到当计算整体同一性百分比时，FASTDB程序并没有计算主题序列N-和C-末端的截短，故对结果进行人工校正。对于相较于查询序列在N-或C-末端截短的主题序列，同一性百分比通过计算查询序列的如下残基数目，作为查询序列总碱基的百分比进行修正，该残基是主题序列的N-和C-末端，与相应的受试残基不相匹配/比对。通过FASTDB序列比对的结果来测定残基是否匹配/比对。从由上述FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中减去该百分比，得到最终同一性百分比数值。这个最终同一性百分比数值用于本实施方案。只有与查询序列不相匹配/比对的主题序列的N-和C-末端，被用来人工调节同一性百分比数值。也就是说，只有查询残基是位于主题序列最远端N-和C-末端残基之外。例如，一个90个氨基酸残基的主题序列与一个100个残基的查询序列比对以测定同一性百分比。在主题序列的N-末端发生缺失，所以FASTDB比对并没有显示在N-末端头10个残基匹配/比对。这10个未匹配的残基代表该序列的10％(在N-和C-末端不匹配的残基数目/查询序列总残基数目)，所以从FASTDB程序计算得到的同一性百分比数值中减去10％。如果剩下的90个残基完全匹配，那么最终的同一性百分比是90％。在另一实例中，一个90个残基的主题序列与一个100个残基的查询序列相比。这一次是内部缺失，所以主题序列的N-或C-末端没有与查询序列不匹配/比对的残基。这种情况下FASTDB计算的同一性百分比不需人工校正。重复一次，只有如FASTDB比对中展示的与查询序列不相配/比对并在主题序列N-和C-末端之外的残基位置，是需要人工修正的。本实施方案不需其它人工修正。C.发明的方法和工艺
本发明的各实施方案提供提高氨基酸产量的方法和从棒杆菌属物种宿主细胞产生氨基酸的工艺。本发明方法和工艺中特别优选的棒杆菌属物种包括：谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，乳发酵短杆菌以及本领域公知的其它棒杆菌属和短杆菌属物种。
本领域技术人员可以理解，术语“棒杆菌属物种”包括文献中以前鉴定为“短杆菌属物种”的那些生物，例如，黄色短杆菌和乳发酵短杆菌现已被归类为棒杆菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.41：255(1981))。
此处说明的方法和工艺中具体的氨基酸生物合成途径基因包括L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-半胱氨酸，L-酪氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，和L-缬氨酸生物合成的基因。特别优选的实施方案是针对L-赖氨酸(Sahm等，Ann.N.Y.Acad.Sci.782：25-39(1996))，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-色氨酸，和L-缬氨酸的生物合成途径基因。
作为举例，棒杆菌属物种中氨基酸生产领域的技术人员公知L-赖氨酸生物合成的氨基酸途径。编码对于从L-天冬氨酸到L-赖氨酸的转化重要的酶的基因包括ask，asd，dapA，dapB，ddh和lysA基因(图1)。这样，本发明这里只为示范目的提供特定的应用L-赖氨酸生物合成途径基因的实施方案。使用氨基酸生物合成途径基因合成其它氨基酸的其它实施方案也包括在此处所述的本发明中。
本发明提高氨基酸产量的方法以及生产氨基酸的工艺都采用需要将分离的核酸分子转化到棒杆菌属物种宿主细胞中的步骤。本领域技术人员可知，分离的核酸分子转化到宿主细胞可以通过电穿孔，转导或其它方法实施。这些方法在此处引用和并入的许多常规实验室手册中有说明。
本发明提高氨基酸产量的方法以及生产氨基酸的工艺都采用需要扩增至少一个氨基酸生物合成途径基因的步骤。本领域技术人员可知，术语扩增是指通过本领域公知手段增加氨基酸生物合成途径一个或几个基因的数目。特别优选的扩增方法包括：(1)通过经例如同源重组插入宿主细胞的染色体中，加入含有生物合成途径基因的拷贝的分离核酸分子，和(2)通过可自我复制的染色体外载体，如质粒，将含有生物合成途径基因的拷贝的分离核酸分子加入到宿主细胞中。
本发明提高氨基酸产量的另一方法包括增加至少一个氨基酸生物合成途径基因的表达。优选的增加表达的方法包括使用异源启动子，可调节启动子，非可调节启动子和其联合。
将分离的核酸分子插入到宿主细胞染色体的方法是本领域技术人员已知的。例如，分离的核酸分子插入到棒杆菌属物种染色体中可以通过使用Jobling，M.等，Nucleic Acids Research 18(17)：5315-5316(1990提交)描述的pK184质粒进行。因为这些载体缺乏棒杆菌属物种复制起点并含有选择标记如卡那霉素(kan)，如果通过同源重组，载体被插入到宿主细胞染色体中，细胞才能够在选择下生长。
在可供选择的实施方案中，本发明还提供增加氨基酸产量的方法和生产氨基酸的工艺，其中生物合成途径基因的扩增通过一个可自我复制的染色体外载体如，质粒，导入到宿主细胞来完成，该载体含有分离的编码氨基酸生物合成途径基因的核酸分子。适用于这些实施方案的质粒包括pSR1和pSR1的其它衍生物(Archer，J等，J.Gen.Microbiol.139：1753-1759(1993))。
本发明提高氨基酸产量的方法的各种不同实施方案中，筛选提高的氨基酸如L-赖氨酸产量，可以通过直接对比培养物中棒杆菌属物种宿主菌株和氨基酸合成基因扩增了的棒杆菌属物种转化宿主菌株产生的L-赖氨酸量进行测定。所选氨基酸产量的水平可以通过下述公式计算从葡萄糖的百分比产量方便地测定：[g氨基酸/L/(g消耗的葡萄糖/L)]*100。
在一个实施方案中，本发明提供一种提高氨基酸产量的方法，包括：(a)用含有编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞；(b)在所述宿主细胞染色体中扩增至少一个所述氨基酸生物合成途径基因的数目；(c)选出转化的宿主细胞；以及(d)相对于所述宿主细胞从所述转化宿主细胞中筛选提高的所述氨基酸产量。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种提高氨基酸产量的方法，包括用分离的多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，该分离的多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，并进一步包含以下核酸分子的至少一个：编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子，编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子，编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子，编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子，编码棒杆菌属物种赖氨酸途径‘lysA氨基酸序列的核酸分子，编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子，和编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在本方法的另一特定实施方案中，分离的多核苷酸分子进一步包含至少下述一个：编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在本方法的另一特定实施方案中，分离的多核苷酸分子进一步包含下述：编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ IDNO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在本方法的另一特定实施方案中，分离的多核苷酸分子进一步包含下述：编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ IDNO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在本方法的另一特定实施方案中，分离的多核苷酸分子进一步包含下述：编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ IDNO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
在本方法的另一特定实施方案中，分离的多核苷酸分子进一步包含下述：编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ IDNO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
本方法的另一实施方案中，本方法进一步包括在培养基中培养所述转化的宿主细胞；并纯化所述转化的宿主细胞产生的氨基酸。
本发明的另一个目的是提供分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含：多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和至少一个额外棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：编码asd多肽的核酸分子，编码dapA多肽的核酸分子，编码dapB多肽的核酸分子，编码ddh多肽的核酸分子，编码‘lysA多肽的核酸分子，编码lysA多肽的核酸分子，和编码ORF2多肽的核酸分子。在一个优选的实施方案中，所述asd多肽是SEQ ID NO：4；所述dapA多肽是SEQ ID NO：6；所述dapB多肽是SEQ ID NO：8；所述ddh多肽是SEQ ID NO：10；所述‘lys多肽是SEQ ID NO：21；所述lysA多肽是SEQ ID NO：14；所述ORF2多肽是SEQ ID NO：16。
本发明的另一目的是提供分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含：多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
本发明的另一目的是提供分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含：多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
本发明的进一步目的是提供分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含：多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
本发明的进一步目的是提供分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含：多核苷酸分子，其包含编码含SEQ ID NO：2的基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；和编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
本发明的进一步目的是提供分离的包含pK184-KDAB的多核苷酸分子。本发明的进一步目的是提供分离的包含pK184-KDABH’L的多核苷酸分子。本发明的进一步目的是提供分离的包含pD11-KDABH’L的多核苷酸分子。本发明的进一步目的是提供分离的包含pD2-KDABHL的多核苷酸分子。
本发明的进一步目的是提供载体，其含有分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；并进一步包含至少一个其它棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：编码asd多肽的核酸分子，编码dapA多肽的核酸分子，编码dapB多肽的核酸分子，编码ddh多肽的核酸分子，编码‘lysA多肽的核酸分子，编码lysA多肽的核酸分子，和编码ORF2多肽的核酸分子。
本发明的进一步目的是提供含有载体的宿主细胞，该载体含有分离多核苷酸分子，该多核苷酸含有编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；并进一步包含至少一个其它棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：编码asd多肽的核酸分子，编码dapA多肽的核酸分子，编码dapB多肽的核酸分子，编码ddh多肽的核酸分子，编码‘lysA多肽的核酸分子，编码lysA多肽的核酸分子，和编码ORF2多肽的核酸分子。
本发明还进一步提供宿主细胞，该宿主细胞是选自下组的短杆菌：黄色短杆菌NRRL-B30218，黄色短杆菌NRRL-B30219，乳发酵短杆菌NRRL-B30220，乳发酵短杆菌NRRL-B30221，乳发酵短杆菌NRRL-B30222，黄色短杆菌NRRL-30234和乳发酵短杆菌NRRL-30235。在另一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌DH5αMCR NRRL-B30228。在另一实施方案中，宿主细胞是选自下组的谷氨酸棒杆菌：谷氨酸棒杆菌NRRL-B30236和谷氨酸棒杆菌NRRL-B30237。
本发明提供氨基酸的生产方法。一个实施方案中，本发明提供生产氨基酸的方法，包括：(a)用分离核酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞；(b)扩增至少一个所述氨基酸生物合成途径基因的染色体拷贝数；(c)选出转化的宿主细胞；(d)在培养基中培养转化的宿主细胞；以及(e)纯化所述氨基酸。
本发明还涉及包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的分离多肽。在本发明的一个实施方案中，该多肽与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。本发明还涉及分离的多核苷酸分子，其包含编码SEQ ID NO：19的多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，该分离的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：18序列的核酸。
本发明还涉及含有多核苷酸分子的载体，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：19氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及含有编码多肽的载体的宿主细胞，该多肽包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是NRRL-B30360。
本发明还涉及一种方法，包括用多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：19氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及选出转化的宿主细胞。在一个实施例中，该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量。在一个优选实施方案中，筛选的氨基酸是赖氨酸。在一个实施方案中，多核苷酸分子被整合到所述宿主细胞的染色体中，从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数。
在另一实施方案中，多核苷酸分子进一步包含下列分子至少一个：(a)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ask氨基酸序列的核酸分子；(b)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子；(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；(f)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径‘lysA氨基酸序列的核酸分子；(g)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子；和(h)编码具有SEQ IDNO：16的ORF2多肽的核酸分子。在这个实施方案中，该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量。在另一实施方案中，筛选的氨基酸是赖氨酸。
在本方法的另一实施方案中，多核苷酸分子进一步包含：(a)编码具有SEQ ID NO：2的ask氨基酸序列的核酸分子；(b)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；和(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子。在本方法的一个实施方案中，该方法还进一步包括筛选提高的氨基酸产量。
本发明还涉及分离的含SEQ ID NO：21氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，该多肽与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。本发明还包括分离的多核苷酸分子，其包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码会与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明还进一步包括多核苷酸分子，其包含具有SEQ ID NO：20的序列的核酸。在一个实施方案中，本发明包括含多核苷酸分子的载体，该多核苷酸分子包含编码含与SEQ IDNO：21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。本发明进一步包括含载体的宿主细胞，该载体包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明包括选自下述的宿主细胞：NRRLB30218，NRRL B30220和NRRL B30222。
本发明进一步涉及一种方法，该方法包括用多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，该多核苷酸分子包含编码含与SEQ ID NO：21氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，并选出转化的宿主细胞。该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量；特别是赖氨酸产量。在一个实施方案中，多核苷酸分子被整合到所述宿主细胞染色体中，从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数。在一个实施方案中该方法还进一步包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子进一步包含下述至少一个：(a)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ask氨基酸序列的核酸分子；(b)编码具有SEQ IDNO：2的棒杆菌属物种赖氨酸途径ask氨基酸序列的核酸分子；(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子；(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；(f)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；(g)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子；和(h)编码截短的棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量。在另一实施方案中，筛选的氨基酸是赖氨酸。
本发明的另一实施方案同样涉及分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中该多核苷酸分子进一步包含具有SEQ ID NO：17的启动子序列。在一个实施方案中，启动子序列是与SEQ ID NO：17具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：17具有至少95％的序列同一性的启动子序列与lysA基因直接可操作地连接。在本发明的另一实施方案中，还包括含有分离多核苷酸分子的载体，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中该多核苷酸分子还进一步包含与SEQ ID NO：17具有至少95％的序列同一性的启动子序列。本发明的另一方面，还包括带有载体的宿主细胞，该载体含有分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含编码含SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，该多核苷酸分子还进一步包含与SEQ ID NO：17具有至少95％的序列同一性的启动子序列。在一个实施方案中，宿主细胞是NRRL-B30359。
本发明还涉及一种方法，包括用多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，该多核苷酸分子包含编码含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中多核苷酸分子进一步包含与SEQ ID NO：17具有至少95％的序列同一性的启动子序列，并选出转化的细胞。在一个实施例中，本发明还进一步包括筛选提高的氨基酸产量。在另一实施方案中，筛选的氨基酸是赖氨酸。本方法的另一实施方案中，多核苷酸分子被整合到所述宿主细胞染色体中，从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数。在本方法的另一实施方案中，多核苷酸分子进一步包含至少下述一个：(a)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；(b)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子；(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子；(f)编码截短的棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子；(g)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子；和(h)编码截短的棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量，特别是赖氨酸产量。
在本方法的另一实施方案中，多核苷酸分子包含：(a)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；(b)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子；(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子；和(f)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子。在该实施方案中，该方法进一步包括筛选提高的氨基酸产量。在一个优选实施方案中，氨基酸是赖氨酸。
本领域技术人员公知的各种培养基可以用于培养产生氨基酸的细胞。合适的碳源的示范性例子包括但不限于：碳水化合物如葡萄糖，果糖，蔗糖，淀粉水解物，纤维素水解物和糖蜜；有机酸，如乙酸，丙酸，甲酸，苹果酸，柠檬酸和富马酸；以及醇如甘油。合适的氮源的示范性例子包括但不限于：氨，包括氨气和氨溶液；无机或有机酸的铵盐，如氯化铵，磷酸铵，硫酸铵和乙酸铵；以及其它含氮源，包括肉提取物，蛋白胨，玉米浸出液，酪蛋白水解物，豆饼水解物，尿素和酵母提取物。
可在本发明的氨基酸生产方法使用的各种发酵技术是本领域公知的。通常，本发明可通过发酵方法如分批发酵或补料分批发酵，商业性地生产氨基酸。在分批型发酵方法中，所有的营养物在发酵开始时加入。在补料分批或持续补料分批发酵中，一种或几种营养物在发酵开始时或在培养达到一定阶段之后，或者当培养液中补加的营养物被消耗完时，连续地补充到培养物中。持续补料型发酵的一个变体是重复补料或fill-and-draw发酵，其中发酵罐内容物的一部分在某个时刻，例如当发酵罐被充满时，被取出，而继续补充营养物。通过这种方式，发酵可以延长很长时间。
另一中发酵类型，连续发酵或恒化培养，使用完全培养基连续培养，其中培养液以发酵罐中培养液的体积保持大约恒定的方式被连续或半连续地取出。连续发酵原则上可维持无限长时间。
在分批发酵中，有机体生长直到培养基中一种基础营养物质被消耗掉，或者直到发酵条件变得不适(如pH降低到抑制微生物生长的数值)。在补料分批发酵中通常通过测量来维持适合的生长条件，如，通过控制pH值，并且通过补充一种或几种基础营养物质来避免这些营养物质被消耗光。微生物会以营养物质的补充速率所限制的生长速率持续生长。通常单一的营养物，经常是碳源，会成为生长的限制因素。在连续发酵中适用同样的原则，通常培养基中一种营养物质的补充是受到限制的，而其他的营养物质是过量的。限制性营养物质以非常低的浓度，经常是低得无法测出，存在于培养液中。可以使用不同的营养限制类型。碳源限制是最常用的。其他的例子是氮源限制，氧限制，特定营养物质如维生素或氨基酸(如果微生物是对这类化合物营养缺陷的)的限制，硫限制和磷限制。
可用本领域公知的方法回收氨基酸。下述文献提供示范性方法：VanWalsem，H.J.& Thompson，M.C.，J.Biotechnol.59：127-132(1997)，和美国专利3,565,951，在此将其并入作为参考。
此处所述的本发明提供分离的含有至少一个赖氨酸生物合成基因的核酸分子。除非另有说明，此处所述的所有核酸序列都是使用DNA自动测序仪(如Applied Biosystems Inc.的Model 373)进行测定，此处所述的DNA分子编码的所有多肽氨基酸序列是通过翻译相关的DNA序列推测得到的。所以，如本领域公知，如同任何通过这种自动方法测定的DNA序列一样，此处测定的核苷酸序列可能含有错误。通过的自动方法测定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列相比，典型地具有至少约90％的同一性，更典型地至少约95％到至少约99.9％的同一性。实际序列可以通过其他方法更精确的测定，包括本领域公知的人工DNA测序方法。
如本领域公知，在被测核酸序列中相较于实际序列，单一的插入或缺失会导致核苷酸序列的翻译框架移动，这样被测核苷酸序列所编码的推测氨基酸序列会在这种插入或缺失的点开始，完全不同于被测DNA分子实际所编码的氨基酸序列。
本发明提供几种分离的核酸分子，其编码包括至少一个谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸生物合成途径基因。更具体的，本发明提供下述分离的核酸分子：来自菌株ATCC 21529的ask基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；来自菌株ATCC 21529的asd基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)；来自菌株NRRL-B11474的dapA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)；来自菌株NRRL-B11474的dapB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)；来自菌株NRRL-B11474的ddh基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和来自菌株NRRL-B11474的ORF2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。另外，此处还提供来自质粒pRS6的lysA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)(Marcel，T.等，Molecular Microbiology 4：1819-1830(1990))。
本领域公知氨基酸在核酸水平是被一个或几个密码子编码的(简并密码子)。本领域公知，密码子的选择可以影响到某个特定氨基酸序列(蛋白，多肽等)的表达。这样，本发明进一步涉及编码SEQ ID NO：2的ask氨基酸序列的核酸分子，其中，该核酸分子包含已知的编码某个特定氨基酸的任何密码子。本发明还进一步涉及核酸序列(SEQ IDNos：1，3，5，7，9，11，13，15，18和20)，其包含替代的密码子以得到蛋白或多肽的最佳表达。
除以上所述分离的核酸分子之外，本发明还提供含有一个以上谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸生物合成途径基因的分离核酸分子。这种分离的核酸分子称为“盒式”构建体。这些盒式构建体简化了实施者为得到L-赖氨酸生物合成基因的基因扩增所需的重组DNA操作的数量。
在涉及盒式构建体的一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含：(a)编码SEQ ID NO：2谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸途径ask氨基酸序列的多核苷酸；以及(b)至少一个额外棒杆菌属物种L-赖氨酸途径基因，该基因选自：(1)编码asd多肽的多核苷酸；(2)编码dapA多肽的多核苷酸；(3)编码dapB多肽的多核苷酸；(4)编码ddh多肽的多核苷酸；(5)编码‘lysA多肽的多核苷酸；和(6)编码ORF2多肽的多核苷酸。
本发明的分离的核酸分子优选在合适的核酸载体中传代和维持。分离和克隆本发明的分离核酸分子的方法是DNA重组技术领域中技术人员公知的。原核和真核宿主中所用的合适载体和方法已在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor，N.Y.1989中描述，在此将其并入作为参考。
许多载体可以用于本发明。这样的载体包括染色体型，附着型以及病毒衍生的载体，如细菌质粒衍生的和噬菌体衍生的载体，及其联合衍生的载体，如质粒和噬菌体基因元件衍生的那些载体，如粘粒和噬菌粒，所有的都可根据本发明的该方面使用。通常，适于在细菌宿主中维持和繁殖多核苷酸的任何载体都可用于此。
已知在细菌中使用的大量合适载体和启动子，其中许多是商业可得到的。优选的原核载体包括质粒如那些在大肠杆菌(E.Coli)中能够复制的质粒(例如，pBR322，ColEl，pSC101，pACYC 184，πVX)。这样的质粒，例如，由Maniatis T等在Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1982)公开。下述载体是示范例：pET(Novagen)，pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBs，phagescript，psiX174，pBlueScript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)，pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。
优选的用于本发明分离的核酸分子的载体包括组合克隆载体pFC1到pFC7新家族(Lonsdale，D.M.等，Plant Molecular BiologyReporter 13：343-345(1995))，pK184载体(Jobling，M.G.和Homes，R.K.，Nucleic Acid Research 18：5315-5316(1990))。
另一组优选的载体是那些能够在棒杆菌属物种中自我复制的载体。这类载体对于通过微生物发酵方法生产氨基酸领域技术人员是公知的，这类的示范例包括pSR1，pMF1014α及其衍生的载体。
本发明提供菌株ATCC 21529的分离的ask多肽氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。在此公开的该分离的ask氨基酸序列包括独特的抗反馈ask酶活性特性，以抵抗培养基中积累的L-赖氨酸和L-苏氨酸水平。相较于其他谷氨酸棒杆菌ask-asd基因序列的DNA序列，本发明公开了在第380位氨基酸残基由苏氨酸到异亮氨酸的变化，导致对反馈抑制的抗性。本发明还包括第380位残基的其它氨基酸改变，导致ask酶对L-苏氨酸和/或L-赖氨酸的敏感度降低。
另外，正如在此更加详细描述的，载体可包含调节及引起表达的控制区域。通常，这类区域通过控制转录进行操纵，如诱导物或阻抑物结合位点和增强子等。
本发明在通常包括选择标记。这类标记还可适于扩增或该载体可含有额外的也用于此目的的标记。就此而言，载体优选包含一个或多个选择标记基因以提供表型特征用于筛选转化的宿主细胞。这类标记包括但不限于，抗生素抗性基因，如氯霉素，氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因，或者营养缺陷型基因，该基因允许宿主细胞在缺乏某种营养物的条件下生长，而该营养物对于正常的宿主细胞菌株是营养缺陷的。
如果载体要在宿主细胞中染色体外维持，则载体还要包含允许其在棒杆菌属物种宿主细胞中复制的复制起点。可供选择地，如果期望载体整合到棒杆菌属物种染色体中，应构建该载体使其不能在棒杆菌中复制。例如，这样的载体可以是能够在另一有机体如大肠杆菌内增殖的，但缺乏在棒杆菌中增殖的合适的复制起点。在本实施方案的另一方面，该载体是能够在多个宿主细胞物种中复制并维持的穿梭质粒，例如，这样的穿梭载体可在棒杆菌属宿主细胞如谷氨酸棒杆菌宿主细胞中复制，也能在大肠杆菌宿主细胞中复制。
本发明进一步提供下述分离的氨基酸序列：菌株ATCC 21529的asd多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)；菌株NRRL-B11474的dapA多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)；菌株NRRL-B11474的dapB多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)；菌株NRRL-B11474的ddh多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)和菌株NRRL-B11474的ORF2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。另外，此处还提供lysA(pRS6)的氨基酸序列(Marcel，T.等，Molecular Microbiology 4：819-830(1990))(SEQ ID NO：14)。
除上述公开的由特定序列定义的分离的多肽序列，本发明还提供保藏的克隆所编码的氨基酸序列。
本领域公知，本发明一些氨基酸序列可以在不显著改变此处所公开蛋白的结构或功能基础上对其进行改变。只要不显著影响酶活性，各种变体可包括缺失，插入，倒位，重复和同型替换。关于氨基酸改变可能是表型沉默的指导可参见Bowie，J.U.等，“Deciphering theMessage in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions”，Science 247：1306-1310(1990)。
本发明的菌株可通过本领域技术人员公知的方法和技术制备。本发明的基因构建体导入到宿主细胞可通过电穿孔，转导或其他方法进行。这些方法在本文提及和引入的许多常规实验手册中描述。
本发明各种实施方案提供作为基因扩增结果具有提高的L-赖氨酸产量的菌株。基因扩增是指以2，3，4，5，10倍或更多拷贝数来在L-赖氨酸生物合成途径基因的正常单拷数基础上增加拷贝数。
在本发明的一个实施方案中，L-赖氨酸生物合成途径基因的额外拷贝数可以整合到染色体中。本发明的另一实施方案中，L-赖氨酸生物合成途径基因的额外拷贝数是染色体外携带的。5倍或更少倍数的扩增可以通过单文件同源重组的方式，将额外的基因拷贝导入到宿主菌株染色体中而得到。在一个最优选的实施方案中，重组事件导致目的基因拷贝的额外拷贝的导入。如果要得到多于5个的基因拷贝数，则本发明还提供携带本发明重组DNA构建体的多拷贝质粒的应用。
本发明分离的核酸分子的合适宿主的代表示范例包括，但不限于，细菌细胞，例如谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌(Escherichia coli)，链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；以及真菌细胞，如酵母细胞。上述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域所公知。
本发明特别优选的宿主细胞包括谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌和乳发酵短杆菌。
根据专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约，申请人已在认可的国际保藏单位(International Depostary Authority)，将带有pK184-KDABH’L多基因构建体的克隆进行保藏。保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604。pK184-KDAB或pK184-KDABH’L多基因构建体已整合到宿主细胞染色体中的保藏物包括下述：(1)pK184-KDAB质粒，整合到染色体中，作为NRRL-B30219和NRRL-B30221保藏，以及(2)pK184-KDABH’L质粒，整合到染色体中，作为NRRL-B30218，NRRL-B30220，和NRRL-B30222保藏。另外，在质粒结构中的pK184-KDABH’L多基因构建体，由大肠杆菌DH5αMCR携带，作为NRRL-B30228保藏。6基因构建体(pDElia2-KDABHL)保藏在大肠杆菌(NRRL-B30233)中。包含pK184-KDABH’L的谷氨酸棒杆菌作为NRRL-B30236保藏。包含pK184-KDABHL的谷氨酸棒杆菌作为NRRL-B30237保藏。包含pDElia2-KDABHL的黄色短杆菌作为NRRL-B30234保藏。包含pDElia2-KDABHL的乳发酵短杆菌作为NRRL-B30235保藏。
本发明的一个目的是提供一种生产赖氨酸的方法，包括培养含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含以下的一个或多个：(a)相较于基因上未改变的宿主细胞，酶活性提高的一个或多个赖氨酸生物合成途径酶；(b)编码赖氨酸生物合成途径酶的每个基因的一个或多个拷贝；以及，(c)调节编码一个或多个赖氨酸生物合成途径酶的基因的转录的一个或多个转录因子的改变，其中所述宿主细胞在所述培养基中产生赖氨酸。在该方法的一个实施方案中，所述提高的酶活性包括编码一个或多个赖氨酸生物合成途径酶的一个或多个基因的超量表达。在该方法的一个实施方案中，所述一个或多个基因直接或间接地与一个或多个启动子序列可操作地连接。在本方法的另一实施方案中，所述可操作地连接的启动子序列是异源的，内源的或杂合的。在本方法的一个优选实施方案中，所述启动子序列是以下的一个或几个：来自谷氨酸棒杆菌内源性基因5’末端的启动子序列，来自能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒的启动子序列，以及，来自可感染谷氨酸棒杆菌的噬菌体基因组的启动子序列。在本方法的一个优选实施方案中，一个或几个所述启动子序列是被修饰的。在另一优选实施方案中，所述修饰包括在5’末端截短，在3’末端截短，一个或多个核苷酸的非末端插入，一个或多个核苷酸的非末端缺失，一个或多个核苷酸在5’端的加入，一个或多个核苷酸在3’端的加入，以及以上所述的联合。
在本方法的另一实施方案中，所述增加的酶活性是归因于一个或多个修饰的赖氨酸生物合成途径酶的活性，其中所述酶修饰相较于缺乏该修饰的酶，导致动力学参数的变化，变构调节，或兼而有之。在本方法的一个实施方案中，所述动力学参数的变化是Km，Vmax或兼而有之的变化。在本方法的另一实施方案中，所述变构调节的改变是在一个或多个酶变构调节位点的改变。在一个实施方案中，所述变构调节的改变是一个或多个酶变构调节位点对于一个配体或多个配体的亲和性的改变。配体可以是相同或不同的。在一个实施方案中，所述酶修饰是由于编码所述酶的核苷酸序列的改变造成的。在一个实施方案中，所述核苷酸序列中的所述改变是一个或多个核苷酸的加入，插入，缺失，替代或其联合。
在本方法的另一实施方案中，所述一个或多个转录因子的改变包括在转录抑制蛋白中的一个或多个突变，转录激活蛋白中的一个或多个突变，或兼而有之，其中，相较于缺乏所述改变的转录因子所进行的转录，所述一个或多个突变增加了靶核苷酸序列的转录。在一个实施方案中，所述一个或多个突变是在所述编码所述转录因子的核苷酸序列上的改变。在另一实施方案中，所述核苷酸序列中的所述改变是一个或多个核苷酸的加入，插入，缺失，替代或其联合。
所有此处提及的专利和出版物均将其全文并入作为参考。实施例实施例1制备L-赖氨酸途径多基因构建体pK184-KDAB和pK184-KDABH’L
申请人为扩增一个或多个棒杆菌属物种染色体中L-赖氨酸生物合成途径基因的数目，已构建了该途径的多基因构建体。同样，通过仔细地研究菌株ATCC 21529的L-赖氨酸生物合成基因，申请人已鉴别出在ATCC 21529的ask基因的380位氨基酸残基由苏氨酸变为异亮氨酸的氨基酸变化。相较于其它谷氨酸棒杆菌ask基因的DNA序列，观察到380位的氨基酸残基由苏氨酸变为异亮氨酸(图19)，这就是天冬氨酸激酶调节中异常的抗反馈属性的原因。
本发明应用的分离的编码L-赖氨酸氨基酸生物合成途径基因的核酸分子，来自下述来源：
基因                                  来源
ask-asd                               菌株ATCC 21529；
DapA                                  菌株NRRL B11474；
DapB                                  菌株NRRL B11474；
Ddh                                   菌株NRRL B11474；
LysA                                  带有分离自菌株AS019的lysA基因的质粒pRS6(Marcel，T.
                                      等，Mol.Microbiol.4：819-830(1990))，该菌株衍生自
                                      菌株ATCC 13059；′lysA                                  NRRL B11474；
lysA                                  NRRL B11474(全长)；以及
ORF2                                  菌株NRRL B11474。
本领域技术人员知晓，本发明不限于申请人提供的本发明分离核酸分子的特定菌株来源。任何棒杆菌属物种，特别是谷氨酸棒杆菌，都可以应用于核酸分子的分离，该核酸用于扩增位于染色体中的氨基酸生物合成途径基因的数目。特别优选的菌株包括NRRL-B11474，ATCC21799，ATCC 21529，ATCC 21543，和E12。
采用重组DNA技术领域的常规方法和技术构建本发明的多基因构建体，可参见本文提及且并入的许多实验室手册，如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)。
多聚酶链式反应(PCR)技术在本发明构建多基因构建体过程中大量使用。在一个典型的反应中，标准10X储藏溶液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，1.5mM MgCl2)稀释到1X使用。用于PCR扩增的典型反应条件：10mM Tris，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％明胶，200μM脱氧核苷酸，0.2-1.0μM引物和2.5U/100μl pfu聚合酶。在PCR反应中使用标准的循环参数：30个循环，94℃下模板变性1min；55℃下退火1min(或使退火温度适于特殊的引物对)；在72℃下产物延伸1min(如果产物＜500bp)，3min(如果产物＞500bp)；以及在循环末尾，在72℃最后延伸7min。克隆实验使用的引物包括：
ask： 5′-GGGTACCTCGCGAAGTAGCACCTGTCAC-3′；
asd： 5′-GCGGATCCCCCATCGCCCCTCAAAGA-3′；
dapB：5′-AACGGGCGGTGAAGGGCAACT-3′；
dap4：5′-TGAAAGACAGGGGTATCCAGA-3′；
ddh   5′-CCATGGTACCAAGTGCGTGGCGAG-3′；
      5′-CCATGGTACCACACTGTTTCCTTGC-3′；
argS：5′-CTGGTTCCGGCGAGTGGAGCCGACCATTCCGCGAGG-3′；和
lysA：5′-CTCGCTCCGGCGAGGTCGGAGGCAACTTCTGCGACG-3′，
在lysA内部退火的引物(在lysA末端上游约500bp处)。‘lysA是来自lysA的截短形式。
申请人在克隆ask-asd，dapB-ORF2-dapA，ddh，‘lysA和lysA的编码序列过程中，应用了标准PCR和亚克隆技术。图18说明了构建过程和中间质粒。申请人在构建下述L-赖氨酸生物合成途径所用的载体时，实施了下述步骤(图18)：
1.pGEMT-ask-asd：使用ask和asd引物得到的含有菌株ATCC21529 ask-asd操纵子的约2.6Kb的PCR产物被克隆到pGEM-T(Promega pGEM-T载体系统)中；
2.pADM21：NRRL-B11474 ddh编码序列的约1.3Kb PCR产物(两个引物上带有操作的Kpnl位点)被克隆到pADM20中；
3.pUC 18-ddh：含有ddh(NRRL-B11474)的pADM21的约1.3KbKpnl片段在Kpnl位点被亚克隆到pC 18中；
4.pLIC 1.7-argS-’lysA：使用模板NRRL-B11474基因组DNA和引物argS和lysA得到的PCR产物被克隆到pPMG-LIC克隆载体中(PharMingen)；
5.pM4-dapB-ORF2-dapA：使用引物dapB和dapA的约3Kb PCR产物在XbaI位点被克隆到pM4中；
6.pFC3-ask-asd：pGEMT-ask-asd的约2.6Kb NsiI-ApsI片段被克隆到经PstI和ApaI切割的pFC3中；
7.pFC1-ddh：pUC18-ddh的约1.3Kb SalI-EcoRI片段被克隆到经SalI和EcoRI切割的pFC1中；
8.pFC1-ddh-′lysA：pLIC1.7-argS-’lysA的约1.5Kb EcoRI片段(含有截短的lysA DNA)在EcoRI位点被克隆到pFC1-ddh中；
9.pFC5-dapB-ORF2-dapA：pM4-dapB-ORF2-dapB的约3.4KbBamHI-BgIII片段在BamHI位点被克隆到pFC5中；
10.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-’lysA：pFC1-ddh-’lysA的约2.8Kb NheI片段在NheI位点被克隆到pFC5-dapB-ORF2-dapA中；
11.pFC-3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA：pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约6.2Kb NotI片段在NotI位点被克隆到pFC3-ask-asd中；
12.pDElia9-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA(pDElia9-KDABH’L)：pFC-3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约8.8KbPmeI片段在EcoRV位点被克隆到pDElia9中；以及
13.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA(pK184-KDABH’L)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约8.8Kb PmeI片段在HincII或SmaI位点被克隆到pK184中。
14.pFC5-ask-asd-dapB-ORF2-dapA(pFC5-KDAB)：pFC3-ask-asd的约2.6Kb KpnI-SmaI片段被克隆到经KpnI和SmaI切割过的pFC5-dapB-ORF2-dapA中。
15.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapA(pK184-KDAB)：pFC5-ask-asd-dapB-ORF2-dapA的约7Kb KpnI-PmeI片段被克隆到经KpnI和HincII切割过的pK184中。
这样，申请人构建了下述L-赖氨酸多基因构建体：
1.pK184-KDABH’L，其中“K”代表编码ask多肽的核苷酸序列；“D”代表编码asd多肽的核苷酸序列；“A”代表编码dapA多肽的核苷酸序列；“B”代表编码dapB多肽的核苷酸序列；“H”代表编码ddh多肽的核苷酸序列；以及“‘L”代表编码‘ lysA多肽的部分核苷酸序列。该构建体称作截短的6基因构建体。以下构建的pK184-KDABHL构建体，称作为全长6基因构建体。
2.pK184-KDAB，其中“K”代表编码ask多肽的核苷酸序列；“D”代表编码asd多肽的核苷酸序列；“A”代表编码dapA多肽的核苷酸序列；“B”代表编码dapB多肽的核苷酸序列。该构建体被称作为4基因构建体。
pK184-KDABH’L和pK184-KDAB，如同在此讨论的其它构建体一样，都包含编码ORF2多肽的核苷酸序列。
应注意，除指明的由“K”，“D”，“A”，“B”，“H”，“L”和“‘L”代表的分离核苷酸序列所编码的多肽序列之外，这些分离核苷酸序列还包括此处给出的操纵子的天然启动子元件。这样，ask-asd序列是以包括各天然启动子元件的方式被克隆的；dapA和dapB序列，代表dapB-ORF2-dapA操纵子，是以一种包括各启动子元件的方式被克隆的；ddh序列是以一种包括各天然启动子元件的方式被克隆的，lysA和‘lysA序列是以一种包括天然启动子元件的方式被克隆的。
有多种可替代的基因启动子元件可以应用于本发明的构建体。例如，已知适于本发明该用途的细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR和PL启动子，trp启动子，或本发明细菌细胞内源性启动子。其它适用于本发明的启动子包括可调节启动子，非可调节启动子和异源启动子。本领域技术人员公知许多这类的启动子。参见Sambrook，E.F.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。实施例2L-赖氨酸生物合成途径基因的2倍扩增
仅为示范作用，申请人此处提供该实施例，其中至少一个L-赖氨酸生物合成途径基因被扩增2倍，方式是：(a)将分离核酸分子导入到谷氨酸棒杆菌宿主细胞中，以及(b)接下来的单交换同源重组事件，将所述分离核酸分子导入到所述谷氨酸棒杆菌宿主细胞染色体中。
如本领域技术人员可以理解的，对本实施例进行很少的改动，至少一个或两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个或九个或十个或更多氨基酸生物合成途径基因可以以至少一或二或三或四或五或六或七或八或九或十倍的倍数被扩增，即，在数量上增加。
pK184-KDAB，pK184-KDABH’L和pD2-KDABHL(实施例4中构建的全长6基因构建体)质粒应用于构建本发明高产量衍生细胞系。这是按照下述完成的：将pK184-KDAB，pK184-KDABH’L或pD2-KDABHL质粒DNA导入棒杆菌属物种，通过单交换同源重组事件，导致pK184-KDAB，pK184-KDABH’L或pD2-KDABHL进入宿主细胞染色体。通过本发明质粒构建体在染色体上的整合，对氨基酸生物合成途径基因进行扩增，引起在几种棒杆菌属物种菌株中L-赖氨酸产量提高。
为本发明分离核酸分子的细胞转化实验，可根据下述过程培养和制备感受态细胞：(1)挑出谷氨酸棒杆菌新鲜的，单一菌落，在30摄氏度下，在250mL摇瓶的10mL CM(SM1)中振荡培养过夜；(2)将过夜培养物在500mL摇瓶中的200mL “生长培养基”上接种，使其660nm光密度(O.D.)达到0.1；(3)在30摄氏度下，振荡培养培养物5-6小时；(4)将培养物移至冷冻的，密封，灭菌的250mL离心瓶中；在4摄氏度，冷冻Sorvall上，以8-10K离心10min；(5)彻底倒出上清液并以等体积冰冷的，灭菌的去离子水重悬细胞沉淀；(6)在相同条件下再次离心样品；(7)保持冰冷条件重复水洗；(8)彻底倒出上清液并在1mL冰冷的，灭菌的10％甘油中重悬细胞沉淀并将细胞移至冷冻的，灭菌1.5mL微量离心管中；(9)在冷冻离心机上离心样品10min；(10)移液管去除上清，以2到3倍沉淀体积(200-400μL)的10％甘油重悬沉淀；以及(11)如果必要，以等分试样将细胞转到冷冻的试管中并在-70摄氏度冷冻。
pK184-KDAB，pK184-KDABH’L和pD2-KDABHL质粒DNAs按下述电穿孔步骤被导入到谷氨酸棒杆菌宿主细胞：(1)将35μL细胞/甘油溶液移液到冰冷的0.1cm电杯的边壁上；(2)将2-4μL质粒移液到该溶液中并通过温和的吹打混合样品；(3)通过温和的敲打使全部溶液流到电杯的底部，避免产生气泡；(4)将样品保持在冰块上直到电休克步骤已准备好，在进行电休克之前，擦去电杯外壁的水分，在1.5kV，200Ω，25μF下休克细胞一次。
可以通过下述过程使细胞从电穿孔中恢复：(1)立即用移液管吸取1mL温的“恢复培养基”加入到电杯中并通过吹打彻底混合溶液；(2)在30摄氏度下孵育溶液(在电杯中)至少3小时，使抗生物素抗性表达和细胞恢复，以及(3)在选择培养基上平板接种并在30摄氏度孵育3天。实施例3筛选和选出L-赖氨酸产量提高的菌株
经过3天的生长，抗生素抗性的细胞单一菌落被单独地选出，以鉴定相较于亲代宿主细胞菌株， L-赖氨酸产量是否提高。
这些实验中所用的所有培养基的成分见表1和2中。在摇瓶中转化的抗生素抗性细胞的培养物上鉴定L-赖氨酸产量。简言之，种子培养基(表1)，以20ml的等分试样被分在深挡板的250ml Bellco摇瓶中，并高压灭菌20min。冷却至室温后，将待测菌株接种到这些接种瓶中，并将其置于摇床。在30摄氏度，振荡，过夜培养。第二天上午，测定每个接种培养物的光密度(波长＝660nm)，将每个接种瓶中的2ml培养物转移至同样是深挡板的21ml等分试样的FM3培养基中。这些“主”瓶然后返回摇床在30摄氏度孵育。
经过48小时的孵育，从每瓶中收集1ml主培养物，然后将培养瓶迅速放回摇床。将1ml样品，通过在0.1N HCl中以1∶50稀释，以溶解培养基中存在的碳酸钙，测定光密度。然后离心每份样品剩余部分，使细胞和碳酸钙沉淀。用水以1∶50稀释上清，测定该稀释液中葡萄糖浓度。同时用HPLC测定细胞外L-赖氨酸浓度。
高产量衍生细胞可以通过常规测定从葡萄糖得到的百分比产量来鉴定，即，根据公式[(g产生的氨基酸/g消耗的葡萄糖)*100]＝％产量，所定义的从葡萄糖得到的氨基酸产量。以下为所得结果，其中亲代菌株E12，NRRL-B11474和ATCC 21799是用本发明鉴定为pK184-KDA，pK184-KDABH’L和pD(Elia)2-KDABHL的L-赖氨酸多基因分离核酸分子转化的。pD2-KDABHL构建体如实施例4制备。
                               赖氨酸滴定量L-赖氨酸产率    细胞保藏物
被测菌株                           (g/L)        (％)
NRRL-B11474                           31         44
NRRL-B11474：：pK184-KDAB             32         45.7      NRRL-B-30219
NRRL-B11474：：pK184-KDABH’L         36         51.8      NRRL-B-30218
NRRL-B11474：：pDElia2-KDABHL         38         54.6      NRRL-B-30234
E12                                   1.4        0.9
E12：：pK184-KDABH′L                 26.8       38        NRRL-B-30236
E12：：pDElia2-KDABHL                 29.8       42.5      NRRL-B-30237
ATCC21799                             26.8       36.9
ATCC21799：：pK184-KDAB               28.5       39        NRRL-B-30221
ATCC21799：：pK184-KDABH’L           31         43        NRRL-B-30220
ATCC21799：：pDElia2-KDABHL           36         50        NRRL-B-30235
一旦鉴定出高产量衍生细胞系，该细胞系进一步被筛选以测定氨基酸生物合成途径基因的扩增确实发生。扩增筛选可以通过如方法常规完成：(1)通过标准Southern印迹方法以确定基因拷贝数或者(2)通过测定由导入到宿主细胞的各分离核酸分子相应生物合成途径基因编码的酶的总酶活性。
通过Southern印迹法测定基因拷贝数可以应用重组DNA技术领域公知的标准方法来完成，如此处提及和列入作为参考的许多实验室手册中所描述，例如，参见Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
  表1.种子培养基， SM1
成分 浓度(g/L)
蔗糖 50
磷酸二氢钾 0.5
磷酸氢二钾 1.5
尿素 3.0
硫酸镁 5.0×10-1
聚胨 20
牛肉膏 5.0
生物素 7.56×10-4
硫胺素 3.0×10-3
烟酰胺 1.25×10-1
L-甲硫氨酸 5.0×10-1
L-苏氨酸 2.5×10-1
L-丙氨酸 5.0×10-1
pH 7.3
       表2.主培养基，FM3
成分 浓度(g/L)
葡萄糖* 60
硫酸铵 50
磷酸二氢钾 1.0
硫酸镁 4.0×10-1
硫酸锰 1.0×10-2
硫酸铁 1.0×10-2
生物素 3.0×10-4
碳酸钙 50
玉米浸泡液(溶解的固体) 20
pH(KOH调节) 7.4
*葡萄糖在高压灭菌后加入实施例4制备L-赖氨酸途径多基因构建体
本发明进一步包括使用PCR技术构建的其它L-赖氨酸多基因构建体。如上所述，使用标准的PCR和亚克隆方法，产生类似于实施例1中的5-基因构建体。本实施例的构建体包含抗生素抗性基因，氯霉素酰基转移酶(CAT)。CAT基因与棒杆菌磷酸果糖激酶启动子可操作地连接用于在棒杆菌中表达。
在构建下述含有CAT基因的构建体时实施下述步骤：
1.pGEMT-ask-asd：使用ask和asd引物得到的含有菌株ATCC21529 ask-asd操纵子的约2.6Kb的PCR产物被克隆到pGEM-T(Promega pGEM-T载体系统)中；
2.pUC 18-ddh：含有ddh(NRRL-B11474)的pADM21的约1.3KbKpnI片段在KpnI位点被亚克隆到pUC 18中；
3.pLIC 1.7-argS-′lysA：使用BF100基因组DNA模板和引物argS和lysA的约3Kb PCR产物被克隆到pPMG-LIC克隆载体中(PharMingen)；
4.pM4-dapB-ORF2-dapA：使用引物dapB和dapA的约3Kb PCR产物在平头的XbaI位点被克隆到pM4中；
5.pFC3-ask-asd：pGEMT-ask-asd的约2.6Kb NsiI-ApsI片段被克隆到经PstI和ApaI切割的pFC3中；
6.pFC1-ddh：pUC18-ddh的约1.3Kb SalI-EcoRI片段被克隆到经SalI和EcoRI切割的pFC1中；
7.pFC1-ddh-′lysA：pLIC1.7-argS-′lysA的约1.5Kb EcoRI片段(含有截短的lysA DNA)在EcoRI位点被克隆到pFC1-ddh中；
8.pFC1-ddh-lysA：pRS6的约2.1Kb EcoRI-PstI片段(含有完整lysA DNA)被克隆到经EcoRI和PstI切割的pFC1-ddh中；
9.pFC5-dapB-ORF2-dapA：pM4-dapB-ORF2-dapA的约3.4KbBamHI-BgIII片段在BamHI位点被克隆到pFC5中；
10.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA：pFC1-ddh-′lysA的约2.8Kb NheI片段在NheI位点被克隆到pFC5-dapB-ORF2-dapA中；
11.pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA：pFC1-ddh-lysA的约3.4KbNheI片段在NheI位点被克隆到pFC5-dapB-ORF2-dapA中；
12.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA(pFC3-KDABH’L)：pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约6.2Kb NotI片段在NotI位点被克隆到pFC3-ask-asd中；
13.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA(pFC3-KDABHL)：pFC5-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA的约6.8Kb NotI片段在NotI位点被克隆到pFC3-ask-asd中；
14.pK184-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA(pK184-KDABH’L)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约8.8Kb PmeI片段在HincII或SmaI位点被克隆到pK184中。
15.pDElia2-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA(pD2-KDABHL)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA的约9.4Kb PmeI片段在HincII位点被克隆到pDElia2中(含有kan基因；是全长6基因构建体)；
16.pDElial1-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA(pD11-KDABH‘L)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-′lysA的约8.8Kb PmeI片段在HincII位点或SmaI位点被克隆到pDElia11中(含有CAT基因；是截短的6基因构建体)；
17.pDElial1-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA(pD11-KDABHL)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-lysA的约9.4KbPmeI片段在HincII位点被克隆到pDElia11中(含有CAT基因；是全长6基因构建体)；
18.pDElia2：pUC4K的约1.24Kb平头PstI片段与pUC19的约1.75Kb DraI-SspI片段连接；
19.pDElia11：含有由谷氨酸棒杆菌fda启动子表达的氯霉素酰基转移酶基因的约1Kb PCR产物，通过使用UCdraI和UCsspI引物和pM4作为模板而获得，再与pUC19的约1.75Kb DraI-SspI片段连接；
克隆方法所用的引物包括：
ask： 5′-GGGTACCTCGCGAAGTAGCACCTGTCAC-3′
asd： 5′-GCGGATCCCCCATCGCCCCTCAAAGA-3′
dapB：5′-AACGGGCGGTGAAGGGCAACT-3′
dapA：5′-TGAAAGACAGGGGTATCCAGA-3′
ddh1  5′-CCAT GGTACCAAGTGCGTGGCGAG-3′
ddh2  5′-CCAT GGTACCACACTGTTTCCTTGC-3′KpnI位点：GGTACC
argS：5′-CTGGTTCCGGCGAGTGGAGCCGACCATTCCGCGAGG-3′
lysA：5′-CTCGCTCCGGCGAGGTCGGAGGCAACTTCTGCGACG-3′在lysA内部退火的引物(在lysA末端上游约500bp处)。
UCdraI 5′-GGATCTTCACCTAGATCC
UCsspI 5′-CCCTGATAAATGCTTC“K”，“D”，“A”，“B”，“H”，“L”和“‘L”所指代的内容如上所述。实施例5L-赖氨酸氨基酸生物合成途径基因的3倍扩增
仅为示范目的，申请人此处提供该实施例，其中，至少一个L-赖氨酸生物合成途径基因被扩增3倍。
质粒pD11-KDABH’L(实施例4中构建)用于构建本发明高产衍生细胞系。为本发明分离核酸分子的细胞转化实验，感受态细胞的培养制备，以及相对生长的测定可根据前述方法进行。
质粒pD11-KDABH’L DNA使用上述电穿孔方法被导入NRRL-B30220(含有pK184-KDABH’L)中。pD11-KDABH’L质粒DNA导入到NRRL-B30220中导致pD11-KDABH’L的一个拷贝通过单交换同源重组事件被并入宿主细胞染色体中。含有两个5基因(pD11-KDABH’L和pK184-KDABH’L)拷贝的宿主细胞作为NRRL-B30222被保藏。
以下显示具有3个5基因拷贝(一个内源拷贝和每个pD11-KDABH’L和pK184-KDABH’L拷贝)的谷氨酸棒杆菌ATCC21799宿主细胞产生的赖氨酸量。
赖氨酸产量
菌株 L-赖氨酸滴定量(g/L) L-赖氨酸产率(％)
ATCC 21799  26.6  45.0
NRRL-B30222  32.0  56.0
实施例6
本实施例说明改变启动子来提高上述这6个基因每一个的表达水平。编码从L-天冬氨酸到L-赖氨酸生物合成途径六种不同酶的六个基因被插入到谷氨酸棒杆菌染色体。每种基因额外的拷贝是来自谷氨酸棒杆菌菌株。调节每种基因表达水平的核苷酸序列(启动子)与在谷氨酸棒杆菌染色体天然基因座位发现的相同。
提高的表达可以导致酶提高的比活性并改善从天冬氨酸到赖氨酸的碳通量。从葡萄糖产生赖氨酸的产率可通过该技术提高。
启动子序列的表达水平称作强度。强启动子相较于弱启动子得到的表达要高。决定一个启动子强度的机制已阐明(Record，M.T.等，“Escherichia coli RNA Polymerase，Promoters，and the Kineticsof the Steps of Transcription Initiation”，Escherichia coli andSalmonella：Cellular and Molecular Biology，ASM Press(1996)，792-881页)。启动子的来源包括如下核苷酸序列，该序列来自谷氨酸棒杆菌染色体天然基因5’末端，来自在谷氨酸棒杆菌中可复制的质粒的序列，来自可感染谷氨酸棒杆菌的噬菌体基因组的序列，或者来自人工组合的(tac，trc)并且天然不存在的序列。核糖体蛋白基因，核糖体RNAs和延伸因子显示高水平的表达。这些基因的启动子可用于提高氨基酸生物合成途径基因的表达。
改变生物合成途径基因启动子的另一个原因是使该途径独立于野生型生物内控制该途径的因子。例如含有谷氨酸棒杆菌赖氨酸生物合成途径二氨基庚二酸脱羧酶的操纵子的天然启动子能够对生长培养基中的精氨酸和赖氨酸产生反应。精氨酸提高转录3倍而赖氨酸使转录降低三分之一(Oguiza等，J.Bact.175：7356-7362(1993))。在补充了10mmM赖氨酸的基本培养基中生长的细胞中二氨基庚二酸脱羧酶的活性降低60％(Cremer等，J.Gen Microbiol.134：3221-3229(1988))。取代编码二氨基庚二酸脱羧酶的lysA的启动子是一个可以使赖氨酸生物合成独立于培养基中精氨酸和赖氨酸的方法。实施例6A
以下是强于调节天冬氨酸激酶基因的askP1启动子的启动子实例，该酶是从天冬氨酸到赖氨酸的途径中第一个酶。
           候选启动子的β-半乳糖苷酶实验
候选者 比活性(微摩尔/min/mg) 来源
E12  0.20 无启动子
E12/pTAC  49.80 pKK223-3
BF100  0.08 无启动子
BF100/pAD151.1  2.22 天冬氨酸激酶P1
E12  0.11 无启动子
E12/pAD151.1  1.96 天冬氨酸激酶P1
E12/5  3.46 BF100基因组
E12/7  8.60 BF100基因组
E12/10  6.56 BF100基因组
E12/32  3.11 BF100基因组
E12/3  22.00 棒杆菌噬菌体
E12/39  11.57 棒杆菌噬菌体
E12/42  10.96 棒杆菌噬菌体
E12是不产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。E12是ATCC 13059衍生的实验室菌株。BF100是赖氨酸高水平生产菌株(NRRL-B11474)。商业可得到的启动子TAC用作强启动子的示例。来自谷氨酸棒杆菌染色体的4个启动子以及来自噬菌体的3个启动子已被鉴定强于天然天冬氨酸激酶启动子。实施例6B
以下是在谷氨酸棒杆菌中表达时提高天冬氨酸激酶比活性的强启动子的示例。
IPTG对于天冬氨酸激酶活性的影响
菌株 调节基因/启动子-基因 诱导物 nmol/min/mg
 BF100  无 无 110
 PD9trc-ask  lacI/trc-ask 无 103
 PD9trc-ask  lacI/trc-ask +IPTG(30mg/L) 269
 131-2  lacI/trc-ask 无 59
 131-2  lacI/trc-ask +IPTG(30mg/L) 117
 131-5  lacI/trc-ask 无 59
 131-5  lacI/trc-ask +IPTG(30mg/L) 123
 pD9是能够在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒
 131菌株带有整合到基因组中的trc-ask构建体
 IPTG诱导由TRC启动子控制的基因
实施例6C
以下是lacI/trc-ask对摇瓶中赖氨酸产量的影响的示例。
菌株 诱导 O.D. 滴定量 产率 S.P.
BF100 无 46  26  43  58
PD9trc-ask 无 49  30  49  61
PD9trc-ask +IPTG 45  30  50  68
BF100 无 43  23  39  53
131-2 无 34  27  46  82
131-5 无 35  28  47  82
O.D.＝660nm下的光密度
滴定量＝克赖氨酸/升
产量＝克得到的赖氨酸/克消耗的葡萄糖
S.P.＝克赖氨酸/O.D.
BF100的赖氨酸产量通过提高天冬氨酸启动子的强度而得到改善。实施例7
本实施例说明在本发明高产细胞系的构建中载体pDElia2-ask-asd-dapA-ORF2-dapB-ddh-P1lysA(pDElia2KDABHP1L)的应用。如Marcel T等，Molecular Microbiology 4：1819-1830(1990)所描述制备含有P1启动子的HpaI-PvaII片段。申请人应用上述的标准PCR和亚克隆技术。为本发明分离核酸分子的细胞转化实验，感受态细胞的培养制备，以及相对生长的测定可根据前述方法进行。
申请人在构建用于赖氨酸生物合成途径的下述载体时实施下述步骤。
1.pGEMT-ask-asd：使用ask和asd引物得到的含有菌株ATCC21529 ask-asd操纵子的约2.6Kb的PCR产物被克隆到pGEM-T(Promega pGEM-T载体系统)中。
2.pUC 18-ddh：含有ddh(BF100基因座位)的pADM21的约1.3KbKpnI片段在KpnI位点被亚克隆到pUC 18中。
3.pFC3-ask-asd：pGEMT-ask-asd的约2.6Kb NsiI-ApsI片段被克隆到经PstI和ApaI切割的pFC3中。
4.pFC3-dapB-ORF2-dapA：NRRL-B11474 dapB-ORF2-dapA编码区的约2.9Kb PCR产物在EcoRV位点被克隆到pFC3中。
5.pFC1-ddh：pUC18-ddh的约1.3Kb PstI-EcoRI片段被克隆到经PsiI和EcoRI切割的pFC1中。
6.pUC19-P1：pRS6的约550Kb HpaI-PvuIII片段(含有argS-lysA操纵子的第一启动子，P1)在SmaI位点被克隆到pUC19中。
7.pUC19-P1lysA：使用lyaA(ATG)和lysA3B引物得到的NRRL-B11474 lysA编码区的约1.45Kb缺乏启动子的PCR产物在HincII位点被克隆到pUC19-P1中。
8.pFC1-P1lysA：pUC19-P1lysA的约2Kb EcoRI-HindIII片段被克隆到经EcoRI和HindIII切割的pFC1中。
9.pFC1-P1lysA-ddh：pFC1-ddh的约1.3Kb EcoRI-NotI片段被克隆到经EcoRI和NotI切割的pFC1-P1lysA中。
10.pFC1-ask-asd-ddh-p1lysA：pFC3-ask-asd的约2.6Kb SwaI-FseI片段被克隆到经SwaI和FseI切割的pFC1-ddh-P1lysA中。
11.pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysA(pFC3-KDABHP1L)：pFC1-ask-asd-ddh-P1lysA的约5.9Kb SpeI片段在SpeI位点被克隆到pFC3-dapB-ORF2-dapA中。
12.pDElia2-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysA(pDElia2-KDABHP1L)：pFC3-ask-asd-dapB-ORF2-dapA-ddh-P1lysA的约8.8Kb PmeI片段在HincII位点被克隆到pDElia2中。
PCR中所用引物：
lysA(ATG)：CCGGAGAAGATGTAACAATGGCTAC
LysA3B：CCTCGACTGCAGACCCCTAGACACC
图20所示为含有P1启动子的HpaI-PvuII片段的核苷酸序列(SEQID NO：17)。含有pDElia2-ask-asd-dapA-ORF2-dapB-ddh-P1lysA(pDElia2 KDABHP1L)构建体的NRRL-B11474的赖氨酸产量结果如下所示。
受测菌株 赖氨酸滴定量 赖氨酸产率(％) 细胞保藏号
NRRL-B11474  30  35
NRRL-B11474：：pDElia2-KDABHP1L  37  42.8  NRRL-B30359
实施例8
本实施例说明在本发明高产细胞系的构建中载体pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysA(pDElia2FC5KDBHL)的使用。pDElia2FC5KDBHL载体包含截短的ORF2基因并且缺乏dapA基因。ORF2基因在内部的ClaI位点被分割，去除3’区域以及dapA基因。缺乏启动子的lysA基因制备自NRRL-B11474。为本发明分离核酸分子的细胞转化实验，感受态细胞的培养制备，以及相对生长的测定可根据前述方法进行。申请人在构建用于赖氨酸生物合成途径的下述载体时实施下述步骤。
1.pGEMT-ask-asd：使用ask和asd引物得到的含有菌株ATCC21529 ask-asd操纵子的约2.6Kb的PCR产物被克隆到pGEM-T(Promega pGEM-T载体系统)中。
2.pFC3-ask-asd：pGEMT-ask-asd的约2.6Kb NsiI-ApsI片段被克隆到经PstI和ApaI切割的pFC3中。
3.pFC3-dapB-ORF2-dapA：NRRL-B11474 dapB-ORF2-dapA编码区的约2.9Kb PCR产物在EcoRV位点被克隆到pFC3中。
4.pFC3-dapB：pFC3-dapB-ORF2-dapA的大ClaI片段被重连接。
5.pUC 18-ddh：含有ddh(NRRL-B11474基因座位)的pADM21的约1.3Kb Kpnl片段在KpnI位点被亚克隆到pUC 18中。
6.pFC1-ddh：pUC18-ddh的约1.3Kb SalI-EcoRI片段被克隆到经SalI和EcoRI切割的pFC1中。
7.pFC1-ddh-lysA：pRS6的约2.1Kb EcoRI-PstI片段(含有完整lysA DNA)被克隆到经EcoRI和PstI切割的pFC1-ddh中。
8.pFC1-ask-asd-ddh-lysA：pFC3-ask-asd的约2.6KbSwaI-FseI片段被克隆到经SwaI和FseI切割的pFC1-ddh-lysA中。
9.pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysA：pFC1-ask-asd-ddh-lysA的约6Kb SpeI片段在SpeI位点被克隆到pFC3-dapB中。
10.pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysA(pDElia2FC5-KDBHL)：pFC3-ask-asd-dapB-ddh-lysA的约7.3Kb NotI-PmeI片段被克隆到经NotI和PmeI切割的pDElia2FC5中。
11.pDElia2FC5：pFC5的小PvuII片段与pDElia2的大PvuII片段连接。
以下显示含有pDElia2FC5-ask-asd-dapB-ddh-lysA(pDElia2FC5-KDBHL)的NRRL-B11474提高的赖氨酸产量结果。
受测菌株 赖氨酸滴定量 赖氨酸产率(％) 细胞保藏号
NRRL-B11474  31  49
NRRL-B11474：：pDElia2FC5-KDBHL  37.8  58 NRRL-B30360
为清楚地理解本发明，通过说明和示例已经详细说明了本发明，本领域技术人员公知，可以对本发明大的等同范围的条件，配方和其它参数进行修饰或改变而同样能够实施本发明，这样的改变也包括在所附权利要求书的范围内。
在说明书中提及的所有的出版物，专利，和专利申请表示本发明所述领域技术人员的技术水平，在此并入作为参考，如同将每个单个出版物，专利或专利申请特定地，分别地并入作为参考。
                           序列表
                                      序列表<110>Archer-Daniels-Midland Company
 Hanke，Paul D.
 Li-D′Elia，Lhing-Yew
 Rayapati，John<120>通过基因扩增增加赖氨酸产量<130>1533.103PC03<150>US 60/173,707<151>1999-12-30<150>US 60/184,130<151>2000-02-22<160>21<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1266<212>DNA<213>ask<220><221>CDS<222>(1)..(1266)<400>1gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg        48Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1               5                   10                  15gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct        96Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
        20                  25                  30gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat        144Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
    35                  40                  45gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt        192Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50                  55                  60gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc        240Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65                  70                  75                  80gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gct caa tct ttc act        288Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
            85                  90                  95ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc        336Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
        100                 105                 110att gtt gac gtc aca ccg ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc        384Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
    115                 120                 125aag atc tgc att gtt gct ggt ttt cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc        432Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130                  135                 140gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg        480Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145                 150                 155                 160ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt        528Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
           165                   170                175gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag        576Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
        180                 185                 190ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc        624Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
    195             200                     205tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat        672Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210                 215                 220gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg        720Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225                 230                 235                 240att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc        768Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
            245                 250                 255ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att        816Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
        260                 265                 270tcc gat aag cca ggc gag gct gcc aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat        864Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
    275                 280                  285gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tcc tct gtg gaa        912Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290                 295                 300gac ggc acc acc gac atc acg ttc acc tgc cct cgc gct gac gga cgc        960Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305                 310                 315                 320cgt gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc        1008Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
            325                 330                 335aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct        1056Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
       340                  345                350ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg        1104Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
    355                 360                 365cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc atc tct gag atc cgc        1152Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Ile Ser Glu Ile Arg
370                 375                 380att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca        1200Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385                 390                395                 400ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat        1248Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
            405                 410                 415gca ggc acc gga cgc taa                                                1266Ala Gly Thr Gly Arg
       420<210>2<211>421<212>PRT<213>ask<400>2Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1               5                   10                  15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
        20                  25                  30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
    35                  40                  45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50                   55                 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65                  70                  75                  80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
            85                  90                  95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
        100                105                  110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
   115                 120                  125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130                  135                140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145                150                 155                 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
           165                  170                 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
       180                  185                 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
   195                  200                 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210                 215                 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225                230                  235                 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
           245                  250                 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
        260                 265                 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
    275                 280                 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290                  295                 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305                 310                 315                 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
          325                 330                 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
       340                 345                  350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
   355                  360                 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Ile Ser Glu Ile Arg370                  375                 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385                390                  395                 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
            405                 410                 415Ala Gly Thr Gly Arg
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   195                  200                 205ctg cca ttc gcc gga aac ctc gtc gat gac ggc acc ttc gaa acc gac        672Leu Pro Phe Ala Gly Asn Leu Val Asp Asp Gly Thr Phe Glu Thr Asp
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    195                 200                 205Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210                 215                 220Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg225                 230                 235                 240Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
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    195                 200                 205ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac tca ttt gca cca ggt         672Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210                 215                  220gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac cca ggc cta gtc gta        720Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val225                230                  235                 240gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taa                                    747Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
            245<210>8<211>248<212>PRT<213>BF100 dapB<400>8Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln1               5                   10                  15Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
        20                  25                  30Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
    35                  40                  45Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50                  55                  60Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly65                  70                  75                  80Phe Asp Asn Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
            85                  90                  95Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
        100                105                 110Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
    115                 120                 125Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly130                  135                 140Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala145                 150                155                 160Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
            165                 170                 175Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
        180                 185                190Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
    195                 200                 205Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210                 215                 220Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val225                 230                 235                 240Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
            245<210>9<211>1023<212>DNA<213>BF 100 ddh<220><221>CDS<222>(1)..(1023)<400>9atg cat ttc ggt aag ctc gac cag gac agt gcc acc aca att ttg gag        48Met His Phe Gly Lys Leu Asp Gln Asp Ser Ala Thr Thr Ile Leu Glu1               5                   10                 15gat tac aag aac atg acc aac atc cgc gta gct atc gta ggc tac gga        96Asp Tyr Lys Asn Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly
        20                  25                  30aac ctg gga cgc agc gtc gaa aag ctt att gcc aag cag ccc gac atg        144Asn Leu Gly Arg Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met
    35                  40                  45gac ctt gta gga atc ttc tcg cgc cgg gcc acc ctc gac aca aag acg        192Asp Leu Val Gly Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr
50                 55                   60cca gtc ttt gat gtc gcc gac gtg gac aag cac gcc gac gac gtg gac        240Pro Val Phe Asp Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp65                  70                  75                  80gtg ctg ttc ctg tgc atg ggc tcc gcc acc gac atc cct gag cag gca        288Val Leu Phe Leu Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala
             85                  90                  95cca aag ttc gcg cag ttc gcc tgc acc gta gac acc tac gac aac cac       336Pro Lys Phe Ala Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His
       100                  105                 110cgc gac atc cca cgc cac cgc cag gtc atg aac gaa gcc gcc acc gca       384Arg Asp Ile Pro Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala
    115                 120                 125gcc ggc aac gtt gca ctg gtc tct acc ggc tgg gat cca gga atg ttc       432Ala Gly Asn Val Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe130                  135                140tcc atc aac cgc gtc tac gca gcg gca gtc tta gcc gag cac cag cag       480Ser Ile Asn Arg Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln145                 150                 155                160cac acc ttc tgg ggc cca ggt ttg tca cag ggc cac tcc gat gct ttg       528His Thr Phe Trp Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu
            165                 170                 175cga cgc atc cct ggc gtt caa aag gcc gtc cag tac acc ctc cca tcc       576Arg Arg Ile Pro Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser
       180                 185                  190gaa gaa gcc ctg gaa aag gcc cgc cgt ggc gaa gcc ggc gac ctc acc       624Glu Glu Ala Leu Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr
    195                 200                 205gga aag caa acc cac aag cgc caa tgc ttc gtg gtt gcc gac gcg gcc       672Gly Lys Gln Thr His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala
210                 215                 220gac cac gag cgc atc gaa aac gac atc cgc acc atg cct gat tacttc        720Asp His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe225                 230                 235                 240gtt ggc tac gaa gtc gaa gtc aac ttc atc gac gaa gca acc ttg gac       768Val Gly Tyr Glu Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Leu Asp
            245                 250                 255gcc gag cac acc ggc atg cca cac ggc gga cac gtg atc acc acc ggc       816Ala Glu His Thr Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly
        260                 265                 270gac acc ggt ggc ttc aac cac acc gtg gaa tac atc ctg aag ctg gac       864Asp Thr Gly Gly Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp
    275                 280                 285cga aac cca gat ttc acc gct tct tca cag atc gct ttc ggc cgc gca       912Arg Asn Pro Asp Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala
290                 295                 300gct cac cgc atg aag cag cag ggc caa agc ggt gct ttc acc gtc ctc       960Ala His Arg Met Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu305                 310                 315                 320gaa gtt gct cca tac ttg ctc tcc ccg gag aac ttg gat gat ctg atc       1008Glu Val Ala Pro Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile
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        340<210>10<211>340<212>PRT<213>BF 100 ddh<400>10Met His Phe Gly Lys Leu Asp Gln Asp Ser Ala Thr Thr Ile Leu Glu1               5                   10                 15Asp Tyr Lys Asn Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly
        20                 25                   30Asn Leu Gly Arg Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met
    35                  40                  45Asp Leu Val Gly Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr
50                  55                  60Pro Val Phe Asp Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp65                 70                   75                  80Val Leu Phe Leu Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala
            85                   90                  95Pro Lys Phe Ala Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His
       100                  105                 110Arg Asp Ile Pro Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala
    115                 120                 125Ala Gly Asn Val Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe
130                 135                 140Ser Ile Asn Arg Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln145                 150                 155                 160His Thr Phe Trp Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu
           165                  170                 175Arg Arg Ile Pro Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser
        180                 185                 190Glu Glu Ala Leu Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr
    195                 200                 205Gly Lys Gln Thr His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala
210                 215                 220Asp His Glu Arg Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe225                 230                 235                240Val Gly Tyr Glu Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Leu Asp
            245                 250                 255Ala Glu His Thr Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly
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    275                 280                 285Arg Asn Pro Asp Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala
290                 295                 300Ala His Arg Met Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu305                 310                 315                 320Glu Val Ala Pro Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile
           325                  330                 335Ala Arg Asp Val
        340<210>11<211>1338<212>DNA<213>全长LysA<220><221>CDS<222>(1)..(1338)<400>11atg gct aca gtt gaa aat ttc aat gaa ctt ccc gca cac gta tgg cca          48Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1               5                   10                  15cgc aat gca gtg cgc caa gaa gac ggc gtt gtc acc gtc gct ggt gtg          96Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
        20                  25                  30cct ctg cct gac ctc gct gaa gaa tacgga acc cca ctg ttc gta gtc        144Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
    35                  40                  45gac gag gac gat ttc cgt tcc cgc tgt cgc gac atg gct acc gca ttc       192Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe50                   55                  60ggt gga cca ggc aat gtg cac tac gca tcc aaa gcg ttc ctg acc aag       240Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65                   70                 75                  80acc att gca cgt tgg gtt gat gaa gag ggg ctg gca ctg gac att gcg       288Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
            85                  90                  95tcc atc aat gaa ctg ggc att gcc ctg gcc gct ggt ttc ccg gcc agc       336Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
        100                 105                 110cgt atc acc gcg cac ggc aac aac aaa ggc gta gag ttc ctg cgc gcg       384Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
    115                 120                 125ttg gtt caa aac ggt gtc ggg cat gtg gtg ctg gac tcc gcg cag gaa       432Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130                 135                 140ttg gaa ctg ctg gat tac gtt gcc gct ggt gaa ggc aag atc cag gac       480Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145                 150                 155                160gtg ttg atc cgc gtg aag cca ggt atc gaa gcc cac acc cac gag ttc       528Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
            165                 170                 175atc gcc act agc cac gaa gac cag aag ttc gga ttc tcc ctg gca tcc       576Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
        180                 185                 190ggt tcc gca ttc gaa gca gcg aaa gca gcc aac aat gca gag aac ttg       624Gly Ser Ala PheGlu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
    195                200                 205aac ctg gtt ggt ctg cac tgc cat gtt ggt tcc cag gtg ttc gac gcc       672Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210                 215                 220gaa ggc ttc aag ctg gca gca gag cgc gtg ttg ggc ctg tac tca cag       720Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225                 230                235                 240atc cac agc gaa cta ggt gtc gcc ctt cct gag ctg gac ctc ggt ggc       768Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
            245                 250                 255gga tac ggc atc gcc tac act gca gat gag gaa cca ctc aac gtc gca       816Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Asp Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
        260                 265                 270gaa gtc gcc tcc gac cta ctc acc gca gtc gga aaa atg gca gcg gaa       864Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
    275                 280                 285cta ggc atc gac gca cca acc gtg ctt gtt gag ccc ggc cgc gct atc        912Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290                 295                 300gca ggc ccc tcc acc gtg acc atc tac gaa gtc ggc acc acc aaa aac        960Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asn305                 310                 315                 320gtc cac gta gac gac gac aaa acc cgc cgc tac gta gcc gtc gac gga        1008Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Val Ala Val Asp Gly
            325                 330                335ggc atg tcc gac aac atc cgc cca gca ctc tac ggc tcc gaa tac gac        1056Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
        340                 345                 350gcc cgc gta gta tcc cgc ttc gcc gaa gga gac cca gta agc acc cgc        1104Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
    355                360                  365atc gtg ggc tcc cac tgc gaa tcc ggc gat atc ctg atc aac gat gaa        1152Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
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            405                 410                415cgg ccc gcc gtc gtg tcc gtc cgc gct ggc agc tcc cgc ctc atg ctg        1296Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
        420                425                  430cgc cgc gaa acc ctc gac gac atc ctc tca cta gag gca taa                1338Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
    435                 440                445<210>12<211>445<212>PRT<213>全长LysA<400>12Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1               5                  10                  15Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
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50                  55                  60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65                  70                  75                  80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
            85                  90                   95Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
        100                 105                 110Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
    115                 120                 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130                 135                 140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145                 150                 155                160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
            165                 170                 175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
        180                 185                 190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys AIa Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
   195                  200                 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210                 215                 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225                230                 235                 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
             245                250                 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Asp Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
        260                 265                 270Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
    275                  280               285Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290                 295                 300Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asn305                 310                 315                 320Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Val Ala Val Asp Gly
            325                 330                 335Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
        340                 345                 350Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
    355                 360                 365Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370                 375                 380Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385                 390                 395                 400Thr GIy Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
            405                 410                  415Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
        420                 425                 430Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
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        20              25                      30cct ctg cct gac ctc gct gaa gaa tac gga acc cca ctg ttc gta gtc        144Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
    35                  40                  45gac gag gac gat ttc cgt tcc cgc tgt cgc gac atg gct acc gca ttc        192Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
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        260                265                   270gaa gtt gcc tcc gac ctg ctc acc gca gtc gga aaa atg gca gcg gaa        864Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
    275                 280                 285cta ggc atc gac gca cca acc gtg ctt gtt gag ccc ggc cgc gct atc        912Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290                  295                300gca ggc ccc tcc acc gtg acc atc tac gaa gtc ggc acc acc aaa gac        960Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp305                 310                 315                 320gtc cac gta gac gac gac aaa acc cgc cgt tac atc gcc gtg gac gga        1008Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
            325                 330                 335ggc atg tcc gac aac atc cgc cca gca ctc tac ggc tcc gaa tac gac        1056Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
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    355                 360                 365atc gtg ggc tcc cac tgc gaa tcc ggc gat atc ctg atc aac gat gaa        1152Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370                 375                 380atc tac cca tct gac atc acc agc ggc gac ttc ctt gca ctc gca gcc        1200Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385                 390                 395                 400acc ggc gca tac tgc tac gcc atg agc tcc cgc tac aac gcc ttc aca        1248Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
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        420                 425                 430cgc cgc gaa acg ctc gac gac atc ctc tca cta gag gca taa                1338Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
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   35                  40                   45Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50                  55                   60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65                  70                  75                  80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
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    115                 120                 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130                135                 140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145                 150                 155                160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
            165                 170                175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
        180                 185                 190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
    195                 200                 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210                 215                 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225                230                 235                 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
            245                 250                 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
        260                 265                 270Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
    275                 280                 285Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290                  295                300Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp305                 310                 315                 320Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
            325                 330                 335Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
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    355                 360                 365Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370                 375                  380Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385                 390                 395                 400Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
            405                 410                 415Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
        420                 425                 430Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
   435                  440                 445<210>15<211>753<212>DNA<213>dapBA操纵子中的orf2<220><221>CDS<222>(1)..(753)<400>15gtg gcc gaa caa gtt aaa ttg agc gtg gag ttg ata gcg tgc agt tct         48Met Ala Glu Gln Val Lys Leu Ser Val Glu Leu Ile Ala Cys Ser Ser1               5                  10                  15ttt act cca ccc gct gat gtt gag tgg tca act gat gtt gag ggc gcg        96Phe Thr Pro Pro Ala Asp Val Glu Trp Ser Thr Asp Val Glu Gly Ala
        20                  25                  30gaa gca ctc gtc gag ttt gcg ggt cgt gcc tgc tac gaa act ttt gat        144Glu Ala Leu Val Glu Phe Ala Gly Arg Ala Cys Tyr Glu Thr Phe Asp
     35                 40                  45aag ccg aac cct cga act gct tcc aat gct gcg tat ctg cgc cac atc        192Lys Pro Asn Pro Arg Thr Ala Ser Asn Ala Ala Tyr Leu Arg His Ile
50                  55                  60atg gaa gtg ggg cac act gct ttg ctt gag cat gcc aat gcc acg atg        240Met Glu Val Gly His Thr Ala Leu Leu Glu His Ala Asn Ala Thr Met65                  70                  75                  80tat atc cga ggc att tct cgg tcc gcg acc cat gaa ttg gtc cga cac        288Tyr Ile Arg Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr His Glu Leu Val Arg His
            85                  90                  95cgc cat ttt tcc ttc tct caa ctg tct cag cgt ttc gtg cac agc gga        336Arg His Phe Ser Phe Ser Gln Leu Ser Gln Arg Phe Val His Ser Gly
        100                 105                 110gaa tcg gaa gta gtg gtg ccc act ctc atc gat gaa gat ccg cag ttg        384Glu Ser Glu Val Val Val Pro Thr Leu Ile Asp Glu Asp Pro Gln Leu
    115                 120                 125cgt gaa ctt ttc atg cac gcc atg gat gag tct cgg ttc gct ttc aat        432Arg Glu Leu Phe Met His Ala Met Asp Glu Ser Arg Phe Ala Phe Asn
130                 135                140gag ctg ctt aat gcg ctg gaa gaa aaa ctt ggc gat gaa ccg aat gca        480Glu Leu Leu Asn Ala Leu Glu Glu Lys Leu Gly Asp Glu Pro Asn Ala145                 150                 155                160ctt tta agg aaa aag cag gct cgt caa gca gct cgc gct gtg ctg ccc        528Leu Leu Arg Lys Lys Gln Ala Arg Gln Ala Ala Arg Ala Val Leu Pro
           165                  170                 175aac gct aca gag tcc aga atc gtg gtg tct gga aac ttc cgc acc tgg        576Asn Ala Thr Glu Ser Arg Ile Val Val Ser Gly Asn Phe Arg Thr Trp
        180                 185                 190agg cat ttc att ggc atg cga gcc agt gaa cat gca gac gtc gaa atc        624Arg His Phe Ile Gly Met Arg Ala Ser Glu His Ala Asp Val Glu Ile
    195                200                  205cgc gaa gta gcg gta gga tgt tta aga aag ctg cag gta gca gcg cca        672Arg Glu Val Ala Val Gly Cys Leu Arg Lys Leu Gln Val Ala Ala Pro
210                 215                 220act gtt ttc ggt gat ttt gag att gaa act ttg gca gac gga tcg caa        720Thr Val Phe Gly Asp Phe Glu Ile Glu Thr Leu Ala Asp Gly Ser Gln225                 230                 235                 240atg gca aca agc ccg tat gtc atg gac ttt taa                            753Met Ala Thr Ser Pro Tyr Val Met Asp Phe
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        20                  25                  30Glu Ala Leu Val Glu Phe Ala G1y Arg Ala Cys Tyr Glu Thr Phe Asp
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50                  55                  60Met Glu Val Gly His Thr Ala Leu Leu Glu His Ala Asn Ala Thr Met65                  70                  75                  80Tyr Ile Arg Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr His Glu Leu Val Arg His
            85                  90                  95Arg His Phe Ser Phe Ser Gln Leu Ser Gln Arg Phe Val His Ser Gly
        100                 105                110Glu Ser Glu Val Val Val Pro Thr Leu Ile Asp Glu Asp Pro Gln Leu
    115                 120                 125Arg Glu Leu Phe Met His Ala Met Asp Glu Ser Arg Phe Ala Phe Asn
130                 135                 140Glu Leu Leu Asn Ala Leu Glu Glu Lys Leu Gly Asp Glu Pro Asn Ala145                 150                155                 160Leu Leu Arg Lys Lys Gln Ala Arg Gln Ala Ala Arg Ala Val Leu Pro
            165                 170                 175Asn Ala Thr Glu Ser Arg Ile Val Val Ser Gly Asn Phe Arg Thr Trp
        180                 185                 190Arg His Phe Ile Gly Met Arg Ala Ser Glu His Ala Asp Val Glu Ile
    195                 200                 205Arg Glu Val Ala Val Gly Cys Leu Arg Lys Leu Gln Val Ala Ala Pro
 210                 215                220Thr Val Phe Gly Asp Phe Glu Ile Glu Thr Leu Ala Asp Gly Ser Gln225                 230                 235                 240Met Ala Thr Ser Pro Tyr Val Met Asp Phe
           245                  250<210>17<211>551<212>DNA<213>含P1启动子的HpaI-PvuII片段<400>17aaccggtgtg gagccgacca ttccgcgagg ctgcactgca acgaggtcgt agttttggta     60catggcttct ggccagttca tggattggct gccgaagaag ctataggcat cgccaccagg     120gccaccggag ttaccgaaga tggtgccgtg cttttcgcct tgggcaggga ccttgacaaa     180gcccacgctg atatcgccaa gtgagggatc agaatagtgc atgggcacgt cgatgctgcc     240acattgagcg gaggcaatat ctacctgagg tgggcattct tcccagcgga tgttttcttg     300cgctgctgca gtgggcattg ataccaaaaa ggggctaagc gcagtcgagg cggcaagaac     360tgctactacc ttttttattg tcgaacgggg cattacggct ccaaggacgt ttgttttctg     420ggtcagttac cccaaaaagc atatacagag accaatgatt tttcattaaa aaggcaggga     480tttgttataa gtatgggtcg tattctgtgc gacgggtgta cctcggctag aatttctccc     540catgacacca g                                                          551<210>18<211>365<212>DNA<213>截短的ORF2<220><221>CDS<222>(1)..(365)<400>18gtg gcc gaa caa gtt aaa ttg agc gtg gag ttg ata gcg tgc agt tct        48Met Ala Glu Gln Val Lys Leu Ser Val Glu Leu Ile Ala Cys Ser Ser1               5                   10                 15ttt act cca ccc gct gat gtt gag tgg tca act gat gtt gag ggc gcg        96Phe Thr Pro Pro Ala Asp Val Glu Trp Ser Thr Asp Val Glu Gly Ala
        20                  25                  30gaa gca ctc gtc gag ttt gcg ggt cgt gcc tgc tac gaa act ttt gat        144Glu Ala Leu Val Glu Phe Ala Gly Arg Ala Cys Tyr Glu Thr Phe Asp
    35                  40                  45aag ccg aac cct cga act gct tcc aat gct gcg tat ctg cgc cac atc        192Lys Pro Asn Pro Arg Thr Ala Ser Asn Ala Ala Tyr Leu Arg His Ile
50                  55                  60atg gaa gtg ggg cac act gct ttg ctt gag cat gcc aat gcc acg atg        240Met Glu Val Gly His Thr Ala Leu Leu Glu His Ala Asn Ala Thr Met65                  70                  75                  80tat atc cga ggc att tct cgg tcc gcg acc cat gaa ttg gtc cga cac        288Tyr Ile Arg Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr His Glu Leu Val Arg His
            85                  90                  95cgc cat ttt tcc ttc tct caa ctg tct cag cgt ttc gtg cac agc gga        336Arg His Phe Ser Phe Ser Gln Leu Ser Gln Arg Phe Val His Ser Gly
        100                 105                110gaa tcg gaa gta gtg gtg ccc act ctc at                                 365Glu Ser Glu Val Val Val Pro Thr Leu Ile
    115                 120<210>19<21l>122<212>PRT<213>截短的ORF2<400>19Met Ala Glu Gln Val Lys Leu Ser Val Glu Leu Ile Ala Cys Ser Ser1               5                   10                  15Phe Thr Pro Pro Ala Asp Val Glu Trp Ser Thr Asp Val Glu Gly Ala
        20                  25                  30Glu Ala Leu Val Glu Phe Ala Gly Arg Ala Cys Tyr Glu Thr Phe Asp
    35                  40                  45Lys Pro Asn Pro Arg Thr Ala Ser Asn Ala Ala Tyr Leu Arg His Ile
50                  55                  60Met Glu Val Gly His Thr Ala Leu Leu Glu His Ala Asn Ala Thr Met65                  70                  75                  80Tyr Ile Arg Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr His Glu Leu Val Arg His
            85                  90                  95Arg His Phe Ser Phe Ser Gln Leu Ser Gln Arg Phe Val His Ser Gly
       l00                  105                 110Glu Ser Glu Val Val Val Pro Thr Leu Ile
   115                 120<210>20<211>833<212>DNA<213>截短的LysA(′LysA)<220><221>CDS<222>(1)..(833)<400>20atg gct aca gtt gaa aat ttc aat gaa ctt ccc gca cac gta tgg cca        48Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1               5                   10                  15cgc aat gca gtg cgc caa gaa gac ggc gtt gtc acc gtc gct ggt gtg        96Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
        20                  25                  30cct ctg cct gac ctc gct gaa gaa tac gga acc cca ctg ttc gta gtc        144Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
    35                   40                  45gac gag gac gat ttc cgt tcc cgc tgt cgc gac atg gct acc gca ttc        192Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50                  55                  60ggt gga cca ggc aat gtg cac tac gca tcc aaa gcg ttc ctg acc aag        240Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65                  70                  75                  80acc att gca cgt tgg gtt gat gaa gag ggg ctg gca ctg gac att gcg        288Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
            85                   90                 95tcc atc aat gaa ctg ggc att gcc ctg gcc gct ggt ttc ccg gcc agc        336Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
        100                105                  110cgt atc acc gcg cac ggc aac aac aaa ggc gta gag ttc ctg cgc gcg        384Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
    115                 120                 125ttg gtt caa aac ggt gtc ggg cat gtg gtg ctg gac tcc gcg cag gaa        432Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130                 135                 140ttg gaa ctg ctg gat tac gtt gcc gct ggt gaa ggc aag atc cag gac        480Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145                 150                 155                160gtg ttg atc cgc gtg aag cca ggt atc gaa gcc cac acc cac gag ttc        528Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
            165                 170                 175atc gcc act agc cac gaa gac cag aag ttc gga ttc tcc ctg gca tcc        576Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
        180                 185                 190ggt tcc gca ttc gaa gca gcg aaa gca gcc aac aat gca gag aac ttg        624Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
    195                 200                 205aac ctg gtt ggt ctg cac tgc cat gtt ggt tcc cag gtg ttc gac gcc        672Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210                 215                 220gaa ggc ttc aag ctg gca gca gag cgc gtg ttg ggc ctg tac tca cag        720Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225                 230                235                  240atc cac agc gaa cta ggt gtc gcc ctt cct gag ctg gac ctc ggt ggc        768Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
            245                 250                255gga tac ggc atc gcc tac act gca gat gag gaa cca ctc aac gtc gca        816Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Asp Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
        260                 265                 270gaa gtc gcc tcc gac ct                                                 833Glu Val Ala Ser Asp Leu
   275<210>21<21l>278<212>PRT<213>截短的LysA(′LysA)<400>21Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1                5                 10                   15Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
        20                  25                  30Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
    35                  40                  45Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50                  55                   60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65                   70                 75                  80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
            85                   90                 95Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
        100                 105                 110Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
    115                 120                 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130                 135                140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145                 150                 155                 160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
            165                 170                 175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
        180                185                  190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
    195                 200                 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210                 215                 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225                 230                 235                 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
            245                 250                 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Asp Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
        260                 265                 270Glu Val Ala Ser Asp Leu
    275
                           134表
Figure A0081792900941
PCT/RO/134表PCT/RO/134表PCT/RO/134表
Figure A0081792900971
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Figure A0081792900991
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Figure A0081792901001
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Figure A0081792901021
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Figure A0081792901031
PCT/RO/134表PCT/RO/134表PCT/RO/134表PCT/RO/134表

Claims (67)

1.分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
2.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1的多肽序列的核苷酸序列。
3.权利要求2的分离的多核苷酸分子，其包含具有SEQ ID NO：1的序列的核酸。
4.包含权利要求2的分离多核苷酸分子的载体。
5.包含权利要求4的载体的宿主细胞。
6.一种方法，包括：
(a)用权利要求2的多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，其中所述分离的多核苷酸分子被整合到所述宿主细胞染色体中，从而增加所述宿主细胞染色体中所述氨基酸生物合成途径基因的总数，以及
(b)选择转化的宿主细胞。
7.权利要求6的方法，进一步包括筛选增加的氨基酸产量。
8.权利要求6的方法，其中所述多核苷酸分子进一步包含下列核酸分子的至少一个：
(a)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径dapB氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ddh氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径‘ lysA氨基酸序列的核酸分子；
(f)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径lysA氨基酸序列的核酸分子；以及
(g)编码棒杆菌属物种赖氨酸途径ORF2氨基酸序列的核酸分子。
9.权利要求8的方法，进一步包括筛选增加的氨基酸产量。
10.权利要求6的方法，其中所述分离的多核苷酸分子进一步包含下列核酸分子的至少一个：
(a)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：21的lysA氨基酸序列的核酸分子；
(f)编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；
(g)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
11.权利要求6的方法，其中所述分离的多核苷酸分子进一步包含下述分子：
(a)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；以及
(d)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
12.权利要求6的方法，其中所述分离的多核苷酸分子进一步包含下述分子：
(a)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；以及
(e)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
13.权利要求6的方法，其中所述分离的多核苷酸分子进一步包含下述分子：
(a)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子；以及
(f)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
14.权利要求6的方法，其中所述分离的多核苷酸分子进一步包含下述分子：
(a)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；以及
(f)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
15.权利要求6的方法，进一步包括：
(a)在培养基中培养所述转化的宿主细胞，以及
(b)纯化所述转化的宿主细胞产生的氨基酸。
16.分离的多核苷酸分子，其包含：
(a)权利要求2的多核苷酸分子；以及
(b)至少一个额外的棒杆菌属物种赖氨酸途径基因，该基因选自：
(i)编码asd多肽的核酸分子；
(ii)编码dapA多肽的核酸分子；
(iii)编码dapB多肽的核酸分子；
(iv)编码ddh多肽的核酸分子；
(v)编码‘lysA多肽的核酸分子；
(vi)编码lysA多肽的核酸分子；以及
(vii)编码ORF2多肽的核酸分子。
17.权利要求16的分离的核酸分子，其中：
(a)所述asd多肽是SEQ ID NO：4；
(b)所述dapA多肽是SEQ ID NO：6；
(c)所述dapB多肽是SEQ ID NO：8；
(d)所述ddh多肽是SEQ ID NO：10；
(e)所述‘lysA多肽是SEQ ID NO：21；
(f)所述lysA多肽是SEQ ID NO：14；而且
(g)所述ORF2多肽是SEQ ID NO：16。
18.分离的多核苷酸分子，其包含：
(a)权利要求2的多核苷酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；以及
(e)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
19.分离的多核苷酸分子，其包含：
(a)权利要求2的多核苷酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；以及
(f)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
20.分离的多核苷酸分子，其包含：
(a)权利要求2的多核苷酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；
(f)编码SEQ ID NO：21的‘lysA氨基酸序列的核酸分子；以及
(g)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
21.分离的多核苷酸分子，其包含：
(a)权利要求2的多核苷酸分子；
(b)编码SEQ ID NO：4的asd氨基酸序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：6的dapA氨基酸序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：8的dapB氨基酸序列的核酸分子；
(e)编码SEQ ID NO：10的ddh氨基酸序列的核酸分子；
(f)编码SEQ ID NO：14的lysA氨基酸序列的核酸分子；以及
(g)编码SEQ ID NO：16的ORF2氨基酸序列的核酸分子。
22.权利要求18的分离多核苷酸分子，其包含pK184-KDAB。
23.权利要求20的分离多核苷酸分子，其包含pD11-KDABH’L。
24.权利要求21的分离多核苷酸分子，其包含pD2-KDABHL。
25.含有权利要求16的多核苷酸分子的载体。
26.含有权利要求25的载体的宿主细胞。
27.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的短杆菌：黄色短杆菌NRRL-B30218，黄色短杆菌NRRL-B30219，乳发酵短杆菌NRRL-B30220，乳发酵短杆菌NRRL-B30221，乳发酵短杆菌NRRL-B30222，黄色短杆菌NRRL-30234，乳发酵短杆菌NRRL-30235。
28.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌DH5αMCR NRRL-B30228。
29.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下组的谷氨酸棒杆菌：谷氨酸棒杆菌NRRL-B30236和谷氨酸棒杆菌NRRL-B30237。
30.产生赖氨酸的方法，包括培养权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含以下的一个或多个：
(a)与基因上未改变的宿主细胞相比，一个或多个赖氨酸生物合成途径酶提高的酶活性；
(b)每个编码赖氨酸生物合成途径酶的基因的一个或多个拷贝；以及
(c)调节一个或多个赖氨酸生物合成途径酶编码基因的转录的一个或多个转录因子的改变，其中，所述宿主细胞在所述培养基中产生赖氨酸。
31.权利要求30的方法，其中提高的酶活性包含超量表达编码一个或多个赖氨酸生物合成途径酶的一个或多个基因。
32.权利要求31的方法，其中所述一个或多个基因直接或间接地与一个或多个启动子序列可操作地连接。
33.权利要求32的方法，其中所述可操作地连接的启动子序列是异源的，内源的或杂合的。
34.权利要求33的方法，其中所述启动子序列是以下的一个或多个：来自谷氨酸棒杆菌内源性基因5’端的启动子序列，来自能够在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒的启动子序列，以及，来自能够感染谷氨酸棒杆菌的噬菌体的基因组的启动子序列。
35.权利要求33或34的方法，其中一个或多个所述启动子序列是经过修饰的。
36.权利要求35的方法，其中所述修饰包含在5’端截短，在3’端截短，非末端插入一个或多个核苷酸，非末端缺失一个或多个核苷酸，在5’端加入一个或多个核苷酸，在3’端加入一个或多个核苷酸，以及其组合。
37.权利要求30的方法，其中所述提高的酶活性是由一个或多个经修饰的赖氨酸生物合成途径酶的活性引起的，其中与缺乏所述修饰的酶相比，所述的酶修饰导致动力学参数的改变，别构调节的改变或兼而有之。
38.权利要求37的方法，其中所述动力学参数的改变是Km、Vmax的改变或兼而有之。
39.权利要求37的方法，其中所述别构调节的改变是一个或多个酶别构调节位点的改变。
40.权利要求37的方法，其中所述修饰是编码所述酶的核苷酸序列的改变所引起的。
41.权利要求40的方法，其中所述核苷酸序列的所述改变是一个或多个核苷酸的加入，插入，缺失，替换或其组合。
42.权利要求30的方法，其中一个或多个转录因子的所述改变包含转录抑制蛋白的一个或多个突变，转录激活蛋白的一个或多个突变，或二者兼有，其中与缺乏所述改变的所述一个或多个转录因子引起的转录相比，所述一个或多个突变能增加靶核苷酸序列的转录。
43.权利要求42的方法，其中所述一个或多个突变是所述编码所述转录因子的核苷酸序列的改变。
44.权利要求43的方法，其中所述核苷酸序列的所述改变是一个或多个核苷酸的加入，插入，缺失，替换或其组合。
45.分离的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
46.权利要求45的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
47.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求45的多肽的核苷酸序列。
48.权利要求47的分离的多核苷酸分子，其包含具有SEQ ID NO：18的序列的核酸。
49.包含权利要求47的多核苷酸分子的载体。
50.包含权利要求49的载体的宿主细胞。
51.权利要求50的宿主细胞，其中所述宿主细胞是NRRL B30360。
52.一种方法，包括：
(a)用权利要求47的多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，以及
(b)选择转化的宿主细胞。
53.分离的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列有至少95％序列同一性的多肽。
54.权利要求53的多肽，其具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
55.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求53的多肽的核苷酸序列。
56.权利要求55的分离的多核苷酸分子，其包含具有SEQ ID NO：20的序列的核酸。
57.包含权利要求55的多核苷酸分子的载体。
58.包含权利要求57的载体的宿主细胞。
59.权利要求58的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：NRRL B30218，NRRL B30220和NRRL B30222。
60.一种方法，包括：
(a)用权利要求55的多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，以及
(b)选择转化的宿主细胞。
61.权利要求2的分离的多核苷酸分子，其进一步包含启动子序列，其中所述启动子序列与SEQ ID NO：17有至少95％的序列同一性。
62.权利要求61的多核苷酸，其中所述启动子序列具有SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
63.权利要求61的分离多核苷酸分子，其中所述启动子直接与lysA基因可操作地连接。
64.包含权利要求61的分离多核苷酸的载体。
65.包含权利要求64的载体的宿主细胞。
66.权利要求65的宿主细胞，其中宿主细胞是NRRL B30359。
67.一种方法，包括
(a)用权利要求61的多核苷酸分子转化棒杆菌属物种宿主细胞，以及
(b)选择转化的宿主细胞。
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NZ (1) NZ520390A (zh)
WO (1) WO2001049854A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107916246A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 江南大学 遗传改造谷氨酸棒杆菌中dhdpr提高赖氨酸产量的方法
CN110945125A (zh) * 2017-06-06 2020-03-31 齐默尔根公司 用于改进大肠杆菌的htp基因工程改造平台
CN111411092A (zh) * 2020-03-08 2020-07-14 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
CN112969797A (zh) * 2018-09-07 2021-06-15 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 工程化棒状杆菌属菌株

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
DK1253195T3 (da) * 2000-01-21 2009-01-12 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin
EP1368367B1 (en) * 2001-02-08 2017-05-03 Archer-Daniels-Midland Company Polynucleotide constructs for increased lysine production
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
US7723097B2 (en) * 2005-03-11 2010-05-25 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains that over-produce L-threonine and processes for their production
US20070244719A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US20070243235A1 (en) * 2006-04-13 2007-10-18 David Peter R Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US7309602B2 (en) 2006-04-13 2007-12-18 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
BRPI0716980A2 (pt) * 2006-09-15 2013-10-22 Cj Cheiljedang Corp Corynebacteria com produtividade de l-lisina aumentada e método de produção da l-lisina usando a mesma
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
KR100987281B1 (ko) * 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR101368922B1 (ko) 2008-03-03 2014-02-27 글로벌 바이오-켐 테크놀로지 그룹 컴퍼니 리미티드 재조합 미생물 및 ｌ－리신을 생산하는 방법
KR101126041B1 (ko) * 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
JP5445453B2 (ja) 2008-07-09 2014-03-19 味の素株式会社 アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法
KR20110035805A (ko) 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
US8839078B2 (en) * 2010-03-05 2014-09-16 Samsung Electronics Co., Ltd. Application layer FEC framework for WiGig
EP2857510A4 (en) 2012-05-29 2016-02-10 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PREPARING 3-ACETYLAMINO-4-HYDROXYBENZOIC ACID
DE102012016716A1 (de) 2012-08-22 2014-02-27 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden
KR101594156B1 (ko) 2013-06-25 2016-02-15 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
EP2940144A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Lysin unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
WO2019118548A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-20 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN110951662B (zh) * 2019-12-26 2024-03-12 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
JP2024509290A (ja) * 2021-03-09 2024-02-29 デサン・コーポレイション Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法
WO2022231049A1 (ko) * 2021-04-30 2022-11-03 대상 주식회사 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
CN116042416A (zh) * 2023-01-09 2023-05-02 天津科技大学 高产ε-聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株及方法与应用

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2979439A (en) 1958-11-04 1961-04-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method of producing l-lysine by fermentation
GB1118719A (en) 1966-03-14 1968-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing l-lysine by fermentation
IT1045451B (it) 1966-03-23 1980-05-10 Ajinomoto Kk Metodo per recuperare lisina da brodo di fermentazione
JPS4828078B1 (zh) 1969-03-20 1973-08-29
JPS5544597B1 (zh) 1969-06-09 1980-11-13
JPS5610036B1 (zh) 1969-07-23 1981-03-05
US3825472A (en) 1972-04-27 1974-07-23 Ajinomoto Kk Method of producing l-lysine by fermentation
JPS5112991A (en) 1974-07-17 1976-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Hatsukohonyoru ll rijinnoseizoho
JPS539394A (en) 1976-07-09 1978-01-27 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-lysine by fermentation
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
US4778762A (en) 1980-04-17 1988-10-18 Ajinomoto Company Incorporated Plasmid
JPS56160997A (en) 1980-05-16 1981-12-11 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-lysine by fermenaition method
JPS57115186A (en) * 1980-12-29 1982-07-17 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-lysine by fermentation
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
IL67510A (en) 1981-12-17 1988-08-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Recombinant vector plasmids autonomously replicable in microorganisms belonging to the genus corynebacterium or brevibacterium and process for the production thereof
US5236831A (en) 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
US4559308A (en) 1983-01-27 1985-12-17 Stauffer Chemical Co. Corynebacterium plasmid and vector
JPS59196098A (ja) 1983-04-23 1984-11-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法
US4601983A (en) 1983-06-15 1986-07-22 Ajinomoto Co., Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-threonine and L-isoleucine
US4861722A (en) 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine
JPH0783714B2 (ja) 1983-08-29 1995-09-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
DE3584848D1 (de) 1984-04-04 1992-01-23 Ajinomoto Kk Zusammengesetztes transduzierbares plasmid.
GB2165546B (en) 1984-08-21 1989-05-17 Asahi Chemical Ind A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom
JPH0746994B2 (ja) 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JPH0655149B2 (ja) 1985-03-12 1994-07-27 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―リジンの製造法
JPH07112431B2 (ja) 1985-09-06 1995-12-06 味の素株式会社 遺伝子発現調節法
JPH06102028B2 (ja) * 1985-10-04 1994-12-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
JPS63273469A (ja) 1986-12-13 1988-11-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 乳糖資化性を有する新規微生物
JP2578468B2 (ja) 1988-04-07 1997-02-05 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アルギニンの製造法
DE3908201A1 (de) 1989-03-14 1990-09-27 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin
US5426052A (en) 1989-04-10 1995-06-20 Regents Of The University Of Minnesota Bacillus MGA3 diaminopimelate decarboxylase gene
US5243039A (en) 1989-04-10 1993-09-07 Regents Of The University Of Minnesota Bacillus MGA3 aspartokinase II gene
CA2016101C (en) 1989-05-05 2000-11-21 Elizabeth M. Tipping Enhancement of conifer seedling growth
JP2876739B2 (ja) 1990-08-03 1999-03-31 味の素株式会社 発酵法によるｌ―リジンの製造法
JP3036912B2 (ja) 1991-09-02 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 遺伝子発現調節ｄｎａ
CA2058820C (en) 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5693781A (en) 1991-06-03 1997-12-02 Mitsubishi Chemical Corporation Promoter DNA fragment from coryneform bacteria
US5726299A (en) 1991-06-03 1998-03-10 Mitsubishi Chemical Corporation Promoter DNA fragment from coryneform bacteria
WO1993003158A1 (fr) 1991-07-30 1993-02-18 Orsan Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries
EP0620852A1 (en) 1991-11-29 1994-10-26 Monsanto Company Cyclic di-guanylate metabolic enzymes
JPH05184366A (ja) * 1992-01-14 1993-07-27 Mitsubishi Petrochem Co Ltd アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用
JP3298135B2 (ja) 1992-03-04 2002-07-02 味の素株式会社 コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子
EP0584375B1 (en) 1992-03-11 2001-12-05 Ajinomoto Co., Inc. Transposable element originating in bacterium of the genus brevibacterium
DE4208785A1 (de) 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5773691A (en) 1992-03-19 1998-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
JP3473042B2 (ja) 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
EP0672161B1 (en) 1992-11-05 1999-09-22 Xyrofin Oy Recombinant method and host for manufacture of xylitol
SK279915B6 (sk) 1992-11-10 1999-05-07 Ajinomoto Co. Dna kódujúca aspartokinázu iii, transformovaný mik
ES2115208T3 (es) 1993-01-13 1998-06-16 Ajinomoto Kk Proteina de la superficie celular de brevibacterium lactofermentum.
JPH06327480A (ja) 1993-05-20 1994-11-29 Mitsubishi Petrochem Co Ltd プラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片
US5876983A (en) 1993-08-24 1999-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid
JPH07155184A (ja) 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
US6057299A (en) 1994-01-13 2000-05-02 Calydon, Inc. Tissue-specific enhancer active in prostate
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
MY113040A (en) 1994-02-24 2001-11-30 Ajinomoto Kk Novel gene derived from coryneform bacteria and use thereof
DK0754756T3 (da) 1994-03-04 2006-03-13 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin
CN1079836C (zh) 1994-08-19 2002-02-27 味之素株式会社 通过发酵生产l-赖氨酸及l-谷氨酸的方法
EP0872547B1 (en) 1994-08-30 2007-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-valine and l-leucine
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
DE69637492T2 (de) 1995-05-05 2009-06-04 Genencor International, Inc., Palo Alto Anwendung von Glukosetransportmutanten zur Herstellung von Verbindungen des aromatischen Syntheseweges
ES2373863T3 (es) * 1995-06-07 2012-02-09 Ajinomoto Co., Inc. Procedimiento de producción de l-lisina.
EP0834559B1 (en) * 1995-06-13 2003-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine by fermentation
EP0756007A3 (en) 1995-06-30 1997-10-29 Ajinomoto Kk Gene-marking process with artificial transposon
JP4035855B2 (ja) 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
US5834231A (en) 1996-10-24 1998-11-10 Archer Daniels Midland Co. Bacterial strains and use thereof in fermentation process for 2-keto-L-gulonic acid production
SK285201B6 (sk) 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP3966583B2 (ja) 1997-06-23 2007-08-29 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
DE19931317A1 (de) 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
AU3837400A (en) 1999-04-19 2000-11-02 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Novel desensitized aspartokinase
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
US6976781B2 (en) * 2002-10-25 2005-12-20 Au Optronics Corp. Frame and bezel structure for backlight unit

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110945125A (zh) * 2017-06-06 2020-03-31 齐默尔根公司 用于改进大肠杆菌的htp基因工程改造平台
CN107916246A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 江南大学 遗传改造谷氨酸棒杆菌中dhdpr提高赖氨酸产量的方法
CN112969797A (zh) * 2018-09-07 2021-06-15 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 工程化棒状杆菌属菌株
CN111411092A (zh) * 2020-03-08 2020-07-14 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用

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