CN1031111A - 圆球杆菌的bioA,bioD,bioF,bioC,bioH基因的克隆、载体和转化细胞以及生物素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA(脱氧核糖核酸)顺序,它是下
列的在细菌中的生物素的生物合成链的基因之一:
bioA,bioD,bioF,bioC和bioH基因。
包含这些顺序的载体能够转化其它的微生物,以
便能改进生物素的生产。
Description
本发明涉及采用DNA重组体的技术,通过发酵制备生物素。
生物素对于人类,动物,植物和某些微生物来说,是一个必需的维生素。
它可从蛋黄中分离出来,并可以以游离形式或与蛋白质结合的形式存在于啤酒酵母,谷物和各种器官中。
该维生素作为皮肤代谢的调节剂,可治疗脂溢性皮炎。
除了前述的各种来源外,可用某些微生物合成生物素,尤其是用杆菌属的微生物,例如圆球杆菌合成之。
图1表示了在这类微生物中从庚二酸开始的生物素的生物合成链。这种生物合成链包括了不同的五个酶反应,其中起作用的基因分别相继是bioc,bioF,bioA,bioD和bioB。
对工业发酵过程中的从庚二酸开始的生产生物素的系统性的研究,已显示出:某些微生物,尤其是属于圆球杆菌属的微生物能够超生产(hyperproduisent)生物素和生物素的同效维生素(人们称“同效维生素”(“Vitamères”)是指能导致生成生物素的各种中间体)。
对于这些细菌,在一些生物素的前驱当中,DTB(脱硫生物素)代表了主导成分。它是大量地,而且比最终成分,即生物素,还要多的量被生产出来的。
实际上存在一种强烈的抑制生物素合成的转录控制,它取决于在培养基中生物素的量,这种阻遏出现在E.Coli(大肠杆菌)和圆球杆菌(Bacillus sphaericus)中(下称球杆菌)。
然而,在E.Coli中每一个反馈抑制都不调节生物素的合成,而且这种控制也从来没有在球杆菌中描述过。
要对在球杆菌中从庚二酸开始的大量DTB(相对于较少量的生物素)的生产作出完整的解释还必需进行十分重要的生物学上分子结构的研究,以及在这种细菌中生物素合成途径的调节的研究。
初步的研究表明,某些从能生成DTB的球杆菌菌株(Souches)开始的,生物合成的提取物的和半净制的酶,与已知的在E.Coli中的生物素的酶进行比较,并不显示出明显的差别。
然而,通过这种球杆菌菌株的工业发酵生产生物素(IFO3525,NCLB9370),如果其生物素产率有所改进,则可以与现有的化学方法相匹敌。为了达到这个目的,则应使在这些菌株中所有生物合成生物素的基因都取得超表达(hyperexpression)。
当然,人们已经叙述过对去抑制的(déréprimées)E.Coli菌株的选择,或是通过其耐生物素的类似物,如α-脱氢生物素的作用,或是通过选择生物素的超分泌作用的突变体实施之。同样地,也叙述过“顺式支配”(“Cis dominantes”)的突变,而这种突变在使所有的生物素基因被构成双极性操纵子的合成过程中起了多效作用。同样也叙述过反式的突变,除了其消除生物素的基因的转录控制的能力外,还常常具有多效作用的性质,即能在细胞的生理学方面起反响。
如果假设在球杆菌菌株中(Souches)生物素生物合成的分子控制和生物素的基因的总结构与E.Coli中的情况相同。那么,传统的微生物的选择方法也将适用于能生产DTB的球杆菌菌株中。
在所有这些假设中,在大量的工业发酵中和连续的培养中采用突变体菌株时,就需要选择一些回复突变率很小的突变体。这就造成了一个难题,即在实际上缺乏在球杆菌中的精细的基因分析方法。
另有方法可以包括克隆(Cloner)所有的能生成DTB的从球杆菌菌株开始的生物素的生物合成链的基因。然后,在试管内修饰控制区域中的5′以便消除转录控制。
而且,用已知的基因工程技术,特别采用已知在球杆菌菌株中起作用的强的启动子,在活体外进行操作对这些基因进行克隆能探讨它们的一般结构,而且能改进它们在活体内的转录。
能够通过采用已知的转化,转导或结合迁移等技术,实施所有这些超表达(hyperexprimés)基因的再引入(réintroduct-ion),这些基因在球杆菌原始菌株中不再受生物素控制了(但是当提高温度或采用不太费钱的基质(Substrat)时会因此受影响而受到诱导控制)。
同样地,可以把这些基因引入到在食品工业中可以接受的,而且能经受庚二酸影响的许多不同的微生物中去,例如,枯草杆菌,麦酒的酶母属,或者假单胞菌属等菌株。
正如在法国专利8412598中所叙述的那样,可以通过质粒的自体选择(autosélection)或者通过在染色体中的整合作用在这些微生物中实现基因信息的稳定。
日本的专利JP-A-166992/85(1985年7月29日),JP-A-66 532/86(1986年3月25日)和JP-A-95 724/86(1986年4月24日)已经揭露过球杆菌的bioB基因的特征和克隆。
本发明尤其涉及为在这些细菌中的生物素的生物合成链的由下列基因中之一所生产的酶密码的DNA顺序:
-bioA基因
-bioD基因
-bioF基因
-bioC基因
-bioH基因
一些据本发明的DNA顺序与已予先鉴定的bioB基因相连接形成象“一组建筑组群”(“Cluster”)的组合,而该组合包括了大部分的生物素的生物合成链。
在这些有关的DNA顺序中,应该提及为由下列基因所生产的酶密码的DNA顺序:
-bioB和bioD,
-bioB,bioD和bioA,
-bioB,bioD,bioA和bioF,
在适当的载体中使用这种类型的顺序能够从生物素的许多种同效维生素出发制备所需的生物素。
如下文要叙述的那样,以上这些也可以通过使用能表达为由下列基因所生产的酶密码的DNA顺序:
-bioF和bioC
-bioF和bioH
-bioF,bioC和bioH,
以及为(除了前述的顺序外)下列基因密码的顺序:
-bioA
-bioA和bioD,或者
-bioA,bioB和bioD
的载体进行发酵而制备出来。
尽管前述的DNA顺序可以有不同的来源,但是最好采用来源于杆菌菌株的顺序,特别是来源于球杆菌菌株的。
正如前述,这些DNA顺序宜于没有能在细菌中形成生物素的生物合成方法中的酶的转录控制的天然顺序,以便能取消由于生物素的天然调整,以及能把这些DNA顺序置于所选择的成分的控制下,从而确保它们在宿主菌株中的有效转录。
本发明特别涉及在图4至8和图17至19中所表示的整个或部分顺序,而这些顺序为前面已述的基因密码。
据本发明的DNA顺序可以以各种方式加于利用。
这些有关的DNA顺序最好是由一个质粒载体携带,而该载体可用于转化细菌,而且还包含一个由几个成分所组成,并能表达相应基因的组合整体。
这种质粒可以是自主型和自体复制型的,或者相反地,可以整合到宿主菌株的染色体中。
实际上,所实施的各种技术是已知的,或者将在实例中叙述到。
然而,在整合载体的情况下,它至少应包含一个出现在要转化的菌株的基因组中的顺序的同源顺序,它将确保染色体的整合。它显然可以涉及到,相应于天然的基因顺序的同源顺序,或者通过其他的整合的质粒载体所引入的同源顺序。
当载体是自主型和自体复制型时,该载体包含一个在宿主细胞中的有效复制的起源(Origine)。
同样地,依靠要转化的菌株的启动子,这些不同的质粒载体可以包含能确保选择的成分(elements),例如防抗菌素的基因和/或基因标志物。
在这些能起宿主菌株作用的细胞中,特别应该提及以下一些细菌:埃希氏杆菌属,杆菌属和假单胞菌属以及一些酵母,尤其是酵母属的酵母。
在这些相关的宿主细胞中,尤其应该提及球杆菌,枯草杆菌和大肠埃希氏杆菌。
用于被据本发明的DNA顺序所转化的最相关的菌株应该是一些这样的菌株:即它们已经被能确保表达这生物合成过程中的其它基因的载体所转化。也就是说,正如在本专利申请中所叙述的基因F,A,D和B。
在这种条件下,把基因bioC和bioH引入到细菌中能允许这种细菌从链的第一同效维生素出发,即庚二酸盐合成生物素,这在工业方面具有重要的经济好处。
在本发明的领域中,整合的质粒载体最好是如下文要提及的质粒PTG475,它尤其包含诱导启动子。
当载体包含自主复制的起源时,为前述的酶密码的DNA顺序最好是伴随有一些能确保其在宿主菌株中表达的控制成分。它尤其涉及5′-末端的一个强的启动子,它在所述的菌株中是有效的,而且可能还涉及到其它的成分,例如当宿主菌株是酵母或是其它的需要这种顺序的微生物时,是结尾顺序。
本发明也涉及被本发明的质粒载体所转化的细胞,在这些细胞中尤其应提及细菌,特别是杆菌属,埃希氏杆菌属或假单胞菌属,同样也包括酵母,尤其是酵母属。
在这些能被这些载体所转化的菌株中,应该提及那些已生产生物素或其同效维生素的菌株。
本发明还涉及制备生物素的方法,其中包括用前面已述的那些细胞发酵至少含有庚二酸的生长培养基或该生物素的同效维生素,这些细胞能接受庚二酸或所说的生物素的同效维生素的影响,然后回收所生成的生物素。
本发明的方法可以用不同的变种实施之。
借助于用本发明的载体所转化的细胞,可以在原位制备同效维生素。特别是含有基因bioF,bioH和bioC的转化菌株可以用于从庚二酸中生产KAPA,然后,用携带互补基因D,A和B的菌株使KAPA转化成生物素。
如果同时使用适合的菌株,那么也可以达到相继的发酵过程或共发酵(Co-fermentation)。
同样地,可以达到菌株的互补作用,即使这菌株只具有部分的相关基因,或者还可以转化已经生产生物素的菌株,以便能过多地生产。
本发明的其它特征和优点将参照如下附图,并通过下文要叙述的实例加以说明:
图1表示生物素的生物合成链,
图2用图解表示质粒PTG1400,
图3用图解表示质粒PTG47.5,
图4表示没有在其上游密码的顺序LORFn°1,
图5表示顺序LORFn°1是基因bioD,
图6表示顺序LORFn°2是基因bioA,
图7表示顺序LORFn°3是基因Y,
图8表示顺序LORFn°4是基因bioB,
图9用图解表示对PTG1400互补作用的探讨,
图10用图解表示不同种质粒中间的互补作用的探讨,
图11用图解表示质粒PTG1418的结构,
图12用图解表示PTG1418的互补作用的试验,
图13表示在下列质粒中所用的球杆菌的插入的限制作用的图示,
图14用图解表示质粒PTG1418和PTG1420,
图15用图解表示质粒PTG1422和PTG1435,
图16用图解表示质粒PTG1436和PTG1437,
图17表示顺序LORFX,
图18表示顺序LORFW,
图19表示顺序LORFF,
图20图解表示质粒PTG1440,
图21表示质粒PTG1418的插入限制作用的图示,
图22和图23表示从用于互补作用试验中的PTG1418所衍生的各种质粒。
为了简化之,有关的DNA顺序和质粒的结构都用附图表示。尽管如此,它们仍应考虑是本发明说明书的组成部分。
例1
球杆菌IFO3525的基因bioA和bioD的互补作用所形成的克隆以及其与bioB的关系。
a).在大肠杆菌中(E.Coli)
在37℃下用200ml的培养基PAB(抗菌素的DIFCOBacto,介质3,17.5g/l)培养球杆菌IFO3525 17个小时,用离心分离回收细菌,然后用Saito方法(Saito等人BBA1963年,72,619-629)从该细胞中提取总DNA,制得450μg的纯DNA。
把20μg的总DNA用HindⅢ完全限制(3U/μgDNA),被HindⅢ完全消化以后,用碱性磷酸酶处理PBR322。
在50μl含有30mM Nacl,30mM PH7.5的Tris Hcl,10mM Mgcl2,0.2mM PH8的EDTA,2mM DTT,0.5mM PH7的ATP和0.1mg/ml的反应缓冲装置中使被HindⅢ消化的基因组的DNA(2μg)和用2个单位的连接酶T4(Boehringer Mannheim)所处理的PBR322(1μg)相混合以制取杂交的重组质粒,在14℃下保温16个小时,把连接作用的混合组分进行转化试验(Cohen等人,(1972年)PNAS69,2110-2114)。其中使用了E.Coli菌株C600 r- km+ k,并且选择在介质LB中抗氨比西林的(ampicilline)(100μg/ml)菌株。
取抽4个不同的质粒DNA的“样品”(“Pools”),每一样品在转化容器中平均各是104个克隆。
用这些DNA样品转化E.Coli的不同的生物变种,这些转化或是根据在介质LB中存在氨比西林的情况下(100μg/ml),或是在该抗菌素和同时存在生物素的原始营养(Prototrophie)的情况下(介质LB+氨比西林100μg/ml+抗生物素蛋白(avidine)0.2U/ml)选择的。
所测结果列于表1中:
表1
E.Coli 选择氨比西林 选择在氨比西林介质+
基因型 转化株/μgDNA 抗生蛋白0.2U/ml
转化株/μgDNA
C268*ΔbioA,his >1033(样品n°4)
(每一样品) 1(样品n°1)
C173*ΔbioD,his >1032(样品n°4)
(每一样品)
*:Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol 112,830。
从选择氨比西林和抗生蛋白的克隆中分离出质粒,并用限制作用的酶分析之。3个质粒(两个来自C268菌株,另一个来自C173菌株)都包含4.3Kb的HindⅢ插入体,它有一个BgⅢ部位和2个SphⅠ部位,而没有BamHI,SalⅠ,PstⅠ,EcoRV,PVUⅡ,AVaⅠ部位(Site)。
在这些质粒中之一的称作为PTG1400的质粒已在图2中表示其限制作用的图示。在抗氨比西林和生物素的原始营养的情况下选择,无论是C268(ΔbioA),C173(ΔbioD),R877(bioD19)菌株(Cleary和Campbell,1972年)或C162(bioB)菌株都能与只用氨比西林的情况下选择的菌株以平均频率进行重转化(每μg DNA超过103)。
用PTG1400不可能取得任何一个菌株R878(bioC23)或R901(ΔbioA-D)(Cleary和Campbell,1972年)的生物素的营养缺陷体(auxotrophie)的互补作用。
b)在枯草杆菌中
枯草杆菌的生物突变体的互补作用是很难发生的。因为众所周知,即在枯草杆菌所惯用的复制质粒中克隆的外来插入过程中能发生频率很大的缺失。这就是为什么要研制出采用没有复制的质粒进行互补作用试验的根本原因。
如果在基因组DNA和质粒之间存在同源的区域,那么采用枯草杆菌的天然反应潜能细胞就能以足够高的频率(大约104转化株/μg DNA)在枯草杆菌的基因组DNA中出现非复制质粒的整合。
第一步包括质粒PTG475,其结构已如图3中所示,在枯草杆菌的各种生物突变体中的整合。
质粒PTG475包含为C2.3氧化酶密码的基因XylE(Zukowski等人(1983年)PNASUSA,80,1101-1105),它能用作色原的标志物(黄色),它在枯草杆菌的左聚(糖)蔗糖酶的基因的诱导启动子的控制下被表达。该质粒同样包含用于抗氯霉素的基因CAT;基因CAT和XylE是插入到PBR322。
这质粒是整合到枯草杆菌的下列菌株的染色体中:
·bioA菌株:JKB3173(bioA173,aroG932;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121,1-8),
·bioB菌株:BGSCIA92(bioB141,aroG932 SacA32,Arg A2;CH Pai(1975年)J.Bacteriol.121,1-8),
·bio112菌株:JKB3112(bio112;CH Pai(1975年)J.Bacteriol.121,1-8),
上述整合是通过反应潜能细胞的转化技术实施的(R.J.Boyland(1972年),J.Bacteriol.110,281-290),选用TBAB(DIFCO Blood色氨糖(tryptose)琼脂基质)和氯霉素3μg/ml。
在转化克隆中实施各种的控制:当用蔗糖诱导时它们就变黄色,而且对菌株bioA,bioB和bio112进行Southern的杂交控制时能显示出在左聚蔗糖酶的基因启动子中的简单重组作用能使PTG475发生整合作用。这些枯草杆菌的转化菌株叫作bioATG1,bioB TG2和bio112TG3。质粒PTG475携带了在枯草杆菌的基因组中的顺序PBR322,它由此能够通过同源重组作用整合所有的包含相同顺序的外来质粒。
第二步骤,在E.Coli中通过互补作用予先克隆过的质粒PTG1400被用作转化枯草杆菌的菌株bioA TG1,bioB TG2和bio112TG3。选用了介质LB+抗生物素蛋白0.2U/ml+氯霉素10μg/ml的条件。
在这里能够发现,有可能通过菌株bioA TG1和bioB TG2,而不是通过菌株bio112TG3选择到极高频率的生物素的原始营养体转化株,而PTG1400却不能互补bio112突变。
C).PTG1400的HindⅢ插入的最终特征
为了检测在球杆菌IFO3525的基因组DNA中的相同HindⅢ片段,进行了Southern的杂交试验,即PTG1400的插入。
在极端的杂交条件下(50%的甲酰胺,0.6%的Denhardt溶液,0.1%SDS,3×SSC,42℃),使用通过在活体外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而标记为32P的质粒PTG1400(“切口转译”“nick translation”)(2.5×107Cpm/μgDNA),经过在-80℃下的6个小时放射自显影,能产生在球杆菌IFO3525的基因组DNA中的4.3Kb的HindⅢ单带(Seule bande)。人们可以证实,在这种杂交条件下PBR322没有与球杆菌IFO3525的基因组DNA进行杂交反应。在相同的条件下,不可能用作为探查物(Sonde)的PTG1400检测出在被HindⅢ处理过的枯草杆菌BGSCIA289的基因组DNA中和用HindⅢ处理过的E.Coli C600的基因组DNA中的每一个阳性反应。
用“Shotgun”方法分析了4.3Kb的HindⅢ片段的总DNA顺序,也就是说用声处理所得的片段的系统克隆,与低核苷酸-先导物的延伸或“气旋缺失”(“délétions Cyclones”)。
在“Shorgun”方法中,通过超声波处理切断质粒PTG1400。用噬菌体T4的DNA的聚合酶处理DNA片段以后,这些具有自由端的片段移行到低熔点的琼脂凝胶上,而那些大约300Pb的片段被分离出来。
在用SmaⅠ消化并且用磷酸酶处理的载体M13中实现了这些片段的克隆。
那些没有与PBR322进行交叉杂交的空白区域(Plages)被挑选出来,并且顺序了100个克隆。用数字电子计算机分析其结果。
用于取得一组交选克隆(气旋(Cyclone)体系)的新近方法已经被用于DNA的顺序(R、M、K.Dale,B、A、McClure,J.P.Houchins(1985)Plasmid 13,31-40)。这种方法已经与“Shorgun”方法进行比较,以便证实所得的结果,而且这种方法生产包含有生物基因组或者孤立的生物基因的限定缺失的质粒。
PTG1400的HindⅢ片段的完整顺序已如图4,5,6,7和8中所示。
通过用数字电子计算机分析这种顺序显示出:这片段具有为四个长范围的读码(Lecture)密码的能力(LORF)这些可能的转译的起始部位以及Shine和Dalgarno区域都在其下部划着重线予以强调。在顺序的3′末端处用下部着重线强调了回文区域(règion Palindromique),它能显示转录的终止部位。
详细的互补作用的分析显示出第一个区域LORF(图5)(具有3个可能的转译起始部位)是基因bioD。
名叫“超长细胞”(“maxicellules”)的已知试验已用E.Coli CSR603菌株加以实现(recAl,phr-1,UvrA6,thr-1,leu-6,thi-1,argE3,lacY1,galk2,ara14,xy115,mt11,ProA2,Str-31,tsx-33,SupE44,F-,Lambda-);这些试验显示出这个区域为其分子量大约是25Kd的多肽密码。
第二个区域LORF(图6)(具有3个可能的转译的起始部位)是基因bioA,E.Coli CSR603的“超长细胞”试验显示出其分子量大约是40Kd的多肽,这个多肽是基因bioA的产物。
目前尚不能确定第三个顺序LORF基因Y(图7)的作用。但是它的极大的疏水性和在密码区域中存在有可能的顺序符号显示出:这个LORF如果被转录和转译时,能够为与膜相互作用的蛋白质密码。事实上,这基因Y是与其它的基因bioA,bioD和bioB组成“簇”(“Cluster”)。从而显示出:它能为包含在生物素的新陈代谢中的其它功能密码。
第四个区域LORF(图8)(具有三个可能的转译的起始部位)已经被鉴定了,它涉及为基因bioB密码的区域、在这里证实了这个基因是与基因bioA和bioD相连接成“簇”。
用含有PTG1400的4.3Kb HindⅢ插入的亚-克隆(Sous-Clonées)区域的质粒的互补作用的分析清楚地显示出:如同图9中所示,第一区域LORF是基因D的产物;而第二区域LORF是基因A的产物。
例2
用球杆菌IFO3525的基因bioF的互补作用进行克隆
用前述的方法采用前述的球杆菌IFO3525的HindⅢDNA基因组库(banque)转化E.Coli的突变体bioF12。
结果列于表2中:
表2
E.Coli菌株的 选用氨必西林 选用氨必西林介质+抗生
基因型 转化株/μg DNA 物素蛋白0.2U/ml
转化株/μg DNA
R874*bioF12,his >1042(样品n°1)
(每个样品) 2(样品n°3)
4(样品n°4)
*Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol.112,830
把质粒从选用含有氨必西林和抗生物素蛋白的介质的克隆中分离出来,并用限制酶进行分析。
其中的两个质粒包含有大约4.5Kb和0.6Kb的HindⅢ插入,并分别具有SphⅠ,KpnⅠ,HpaⅠ,NdeⅠ,AvaⅠ,ClaⅠ,BgⅠ,XmnⅠ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ部位,而不含有BgⅢ,XbaⅠ,SmaⅠ,PstⅠ,SalⅠ,NruⅠ,BamHⅠ,PvuⅠ,ECORⅠ,HindⅡ,ECoRV,FspⅠ,ApaⅠ,BalⅠ,AatⅡ部位。
其中的一个质粒,PTG1418,在选用抗氨必西林和生物素的原始营养时它可以重转化E.Coli的874菌株(bioF12,his),它的转化时的平均频率与选用氨必西林时的克隆选择的频率相仿(超过104/μg DNA)。
通过亚-克隆试验显示出:只有4.5Kb的HindⅢ片段才为KAPA合成酶功能密码,以确保E.Coli的R874菌株的bioF12突变体的互补作用。
为了检测在球杆菌IFO3525的DNA基因组中的4.5Kb HindⅢ片段,并与PTG1418的4.5Kb插入相比较,进行了“Southern”试验。其中采用了极严厉的杂交条件(50%甲酰胺,3×SSC,0.1%SDS,0.6%的Denhart溶液,42℃),并采用了2×106Cpm/μg DNA M13TG1425(含有通过活体外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而被标记为32P的4.5Kb HindⅢ插入的噬菌体M13),经过在-80℃的7个小时放射自显影以后,在球杆菌IFO3525的DNA基因组中能显示出大约4.5Kb的HindⅢ带。
在同样的条件下,无论在用HindⅢ处理过的枯草杆菌BGSCIA289的DNA基因组上,或在用HindⅢ处理过的E.Coli C600的DNA基因组中都没有检测到任何一个阳性反应。
无论用交迭PTG1400的末端3′的PTG1406的8.3Kb的SphⅠ片段,或用交迭PTG1400的末端5′的PSBOI的8.2Kb的MboⅠ片段,都不能在PTG1400插入和PTG1418插入之间检测出交叉反应(见图10)。
已经分析出PTG1418插入的限制图并显示于图11中。
通过“Southern”分析和对互补作用的研究,证实了球杆菌IFO3525的bioF基因并没有与同一微生物的基因bioA,bioD和bioB相结合(见图12)。
例3
通过与PTG1418及其各种衍生物的整合转化作用进行枯草杆菌的突变体bio112TG3(由JKB3112,bioC/F-112aroG932衍生出来)的互补作用。
枯草杆菌的突变体bio112已通过营养试验加以鉴别,而且在bioF或bioC功能中受影响(C.H、Pai,1975年,J.Bacterial 121,1-8)。在这个突变体中,质粒PTG475已经通过前述的方法被整合到SacR-SacB位点上,由此而获得的新菌株被称为bio112TG3。
用各种质粒(如图13-16所示的PTG1418,1420,1422,1435,1436和1437)实施对菌株bio112TG3的转化作用。其中选用了LB介质+氯霉素10μg/ml+抗生物素蛋白500U/l,互补作用的结果列于表3。其结果是如同用E.Coli的突变体R874(bioF,his)的交叉试验所得的结果枯草杆菌的bio112突变体很可能在基因bioF中受影响,通过对根据所用质粒所取得的互补作用的分析,有可能把基因bioF以限定于限制部位XmnⅠ和NcoⅠ之间的片段确定置于PTG1418的插入上(见图21-23)。
表3
枯草杆菌的bio112TG3菌株的整合转化作用
在介质LB+500U/L抗生物素
质粒 插入
蛋白+10μg/ml氯霉素的互补作用
PTG1418 5.1Kb的HindⅢ插入 ++
PTG1422 含有bioF和部分LORF
W的3.1Kb的ClaⅠ插入 ++
TG1420 含有X和部分LORF W
的2Kb ClaⅠ-HindⅢ插入 -
表3(续)
PTG1436 含有基因bioF的1.3Kb
的XmnⅠ-NcoⅠ的插入 ++
PTG1437 含有基因bioF的1.3Kb
的NcoⅠ-XmnⅠ插入 ++
PTG1435 含有LORFx的0.6Kb
的HpaⅠ-PVUⅡ插入 -
例4
质粒PTG1418的4.53Kb的HindⅢ插入的核苷酸顺序
在多连锁子(Polylinker)的部位上把HindⅢ插入克隆到M13TG131中。把所谓的“气旋”(“Cyclone”)方法实施于质粒M13TG1425上,并用数字电子计算机分析其结果。凭借特种的低核苷酸可以把在顺序中的两股互补的小片段之间的读码(lecture)的某些区别加以澄清。
图17-19已详细图解这顺序。显然,这种插入包含读码的三个开口的范围(Cadre),分别为其分子量是18462,28048和42940道尔顿(daltons)的蛋白质(亚单位基)密码。从读码的含义上来说,最后一个基因是置于被鉴别为bioF的区域中。其中的枯草杆菌的这种蛋白质的分子量是和E.Coli的合成酶KAPA的分子量处于同一个数量级上(M.A.Eisenberg 1973年,adv.Enzymol.38,317-372)。
读码的三个开口范围的并置,如同在质粒PTG1400的插入情况一样,可以具有操纵子的结构。这里需要指出,人们可以鉴别出在第一个基因的上游,有一个15个碱基对的顺序(在图17中用下部着重线表示之)同样出现在质粒PTG1400的插入的第一个基因(bioD)的上游。这种鲜明特征可以显示出:球杆菌的这两组生物素基因至少是接受共同的调节。这个可以是生物素(或是其衍生物)的控制,如同已述的球杆菌的KAPA合成酶(bioF)的情况一样(y.yzumi,K.Sato,y.Tani和K.Ogata,1973年,Agric.Biol chem37,1335)。
从顺序插入的最后一个基因的3′侧,可以鉴别出一个显示转录终止子(terminateur)特征的顺序(在图18中用下部着重线表示之)。
例5
分别借助于质粒PTG1418(1433)和PTG1440的E.Coli突变体R878(bioC,his)和C261(ΔbioFCD,his)的互补作用
用质粒PTG1418及其各种衍生物实施E.Coli的生物突变体的互补作用的惯用方法。
用质粒PTG1418和PTG1433(见表4)使E.Coli突变体R878(bioc,his)的有能力的细胞转化,并接着在介质LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l上摊开之,经过36个小时在37℃温度下的培养,就能检测出生长情况。在这种介质中的转化克隆的出现频率与在介质LB+氨必西林100μg/ml上所测得的出现频率是处于同一个数量线上。
表4
E.Coli突变体R878bio的转化作用.
每μg DNA的转化株数量
质粒 选用介质LB+氨必西 选用介质LB+氨比西林100μg
林(100μg/ml) /ml+抗生物素蛋白(200U/l)
PTG1418 103103Petits
PTG1433 103103Petits
PBR322 1030
(在36个小时在37℃下培养后)
在介质LC+氨必西林中的正常转化克隆的生长在没有生物素的情况下会减弱(介质LB+氨必西林+抗生物素蛋白;最少量的酪蛋白氨基酸,没有生物素)。当它在没有生物素的介质中被各种由PBR322衍生的质粒所转化时,由于完全不存在这同一种突变体的生长,因此,这种突变体R878bioC的生物素的营养缺陷型的互补作用是非常意味深长的。
把质粒PTG1400和PTG1418的插入克隆到PBR322中,以便得到质粒PTG1440(图20)。当把这种质粒PTG1440引入到E.Coli突变体C261(ΔbioFCD,his)时,就可以选用在介质LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l中的克隆。所得的这种转化频率与在介质LB+氨必西林中所得的频率完全地相类似。此外,在介质LB+氨必西林中的正常转化克隆的生长在没有生物素的情况下会减弱的。根据这两种结果(突变体bioC和bioΔFCD的生物素营养缺陷型的互补作用),就能得出清楚的结论:质粒PTG1418的插入同样包含有球杆菌的基因bioC。而这些各种由PTG1418的插入衍生的亚-克隆(图21-23)并不能得到E.Coli的突变体bioC的互补作用。只有含有这三个基因的插入(inserts)才能给与E.Coli的突变体bioC的有效互补作用。
例6
E.Coli突变体bioH(PA505MAΔ108,argH,metA,bioH,malA,Strr)的互补作用。
这种突变体起初是描写成bioB(D.Hatfield,M.Hofnung和M.Schwartz,1969年,J.Bactoriol.98?559-567)。后来又显示出不排出任何同效维生素的特征,而且能够在含有KAPA,DAPA,DTB或者生物素的矿物介质中生长。后来Eisenberg(1985年,Annals New york Academy of Science447,335-349)建议这种基因为庚二酰-COA-合成酶的亚单位(Sous-unité)(bioH)密码。要注意到:能过多地生产生物素的E.Coli的突变体(或者用能生长E.Coli的营养缺陷型bioB的维生素的排泄水平而选择的,或者用抗α-脱氢生物素而选择的)已经全部进行基因鉴别,而且在bioR位点上受影响。这位点为多功能的蛋白质密码(操纵子bioABFCD的信息核糖核酸(RNA)的合成阻遏物(répresseur)和能把生物素固定在具有羧基酶功能的各种脱辅基酶蛋白的细胞溶素残基上的合成酶的全酶)。
所有的至今被鉴别的能过多生产生物素的E.Coli的突变体被放置于为反式活性阻遏物密码的基因中,而不是被放置于操纵子bioABFCD的操纵基因中,假设生物素的生物合成的另一个基因在这个调节下。根据文准窃兀騜ioH是较好的上述基因。
PTG1418的插入包含球杆菌的基因bioF和bioC,人们已研究出第三个基因是bioH。
采用质粒PTG1433能有效地取得E.Coli的突变体bioH的互补作用。另外,在这介质中所得到的生长是缓慢的,然而与对照相比较是非常的有意义的(见表5)。
表5
E.Coli突变体bioH PA505MAΔ108的转化作用每μg DNA的转化株数目
质粒 选用介质LB+(100μg 选用介质LB+(100μg/ml)
/ml)氨必西林 氨必西林+(200U/l)抗生
物素蛋白
PBR322 1040
PTG1433 103103Petits
(在37℃下培养36个小时以后)
如同突变体bioC的互补作用一样,突变体biOH的互补作用所需要的足够条件,是在引入到菌中的质粒上同时存在三个PTG1418插入的基因(图21-23)。
与能够被球杆菌的单独基因所互补的枯草杆菌和E.Coli的突变体bioF相反,在没有生物素的情况下,当引入PTG1418的HindⅢ插入的三个基因的运载的重组质粒的时候,才能得到E.Coli的突变体bioC和bioH。由此能够反映出,其中在球杆菌的庚二酰-COA-合成酶和E.Coli的相对应的酶之间的酶性质上的区别(对于底物的亲和关系的区别,特别是多酶结构),或者在E.Coli中球杆菌的庚二酰-COA-合成酶的还原合成(Synthése réduite),它限制了向KAPA的庚二酸盐的代谢通量。
例7
bioFCH基因的功能试验
借助于从来源于球杆菌的被分离的4.5Kb HindⅢ片段衍生出来的插入的运载重组质粒,通过试验能够证明在bioF,bioH和bioC的DNA上存在有E.Coli的突变体bioF,bioH和bioC的互补作用。
然而,有必要通过从球杆菌的这些克隆基因的产物的活性试验使信息趋于完整化。E.Coli的bioF基因已经显出对由庚二酰-COA向KAPA转化作用的催化特征(Eisenberg,1968年)。目前,两个基因bioC和bioH的产物尚未能清楚地鉴别出来,在一个文献中(Eisenberg,1985年)有人假设,它们是为包含在庚二酰-COA的生物合成中的蛋白质编码的。人们已经作试验以确证顺序bioF,C,H是否有效地保证从庚二酸盐向KAPA的转化作用。
球杆菌的FCH密码部分的运载插入(以连接到PTG1436的SphⅠ-SphⅠ片段的PTG1434的ECORV-SphⅠ片段的相组合的形式加于回收)已经融合到抗四环素的PBR322基因启动子中以产生质粒PTG1446,以便能获得与基因bioF,C,H有关的蛋白质有意义的表达。
接着把这个质粒引入到与E.Coli的bioH菌株匹配的细胞中。接着把这个重组菌株在加有100μg/ml氨必西林和0.5mg/ml的PH7.5的庚二酸盐的GP培养基中(每一升中:20g甘油,30g 蛋白胨,5g不含维生素的酪蛋白氨基酸,1gK2HPO4,0.5gKcl,0.5gMgSO4-5H2O,0.01gFeSO4-7H2O,0.001g PH6.8-7的MnSO4-4H2O,20μg盐酸硫胺素)在37℃下,培养48个小时。
接着把5μl的残存试样在硅石板上进行色层分离(色谱溶剂是正丁醇(60),醋酸(15),水(25),容积/容积,溶剂的迁移10cm)以便分离同效维生素和生物素这两个产物。
在对每个同效维生素进行迁移以后,采用其保存号为ATCC7754的麦酒酵母属的菌株,估算出KAPA的生物剂量数。
在这些跫拢嗣悄芄徊馑愠鲈诿縨l的残存培养物中KAPA的繁殖量是85μg(用生物素当量表示之)。
在同样条件下,进行含有质粒PBR322的同样菌株的培养的对照试验。在这种情况下,没有任何一个突出的KAPA能被检测出来。
然而,在这里显示出:PTG1418的插入是为在由庚二酸盐转化为KAPA中的足够的和必需的一些酶功能编码的,即基因bioC,H和F的产物。
本发明的代表菌株的储藏
E.Coli C600PTG1400和R874PTG1418的菌株,于1986年9月26日,以寄存号为n°1-608和1-609储藏在巴斯德(Pasteur)研究院的国家微生物培养保藏中心,其地址是:法国,巴黎,28rue du Docteur-Roux-75724 Paris Cédex 15。
Claims (31)
1、为在细菌中的生物素的生物合成链的由下列基因中之一所生产的酶编码的DNA顺序,bioA基因;bioD基因;bioF基因;bioC基因;bioH基因。
2、据权利要求1的DNA顺序,其特征是它为基因bioB和bioD所生产的酶编码。
3、据权利要求1的DNA顺序,其特征是它为基因bioD,bioA和bioB所生产的酶编码。
4、据权利要求1的DNA顺序,其特征是它为基因bioD,bioA,bioB和bioF所生产的酶编码。
5、为在细菌中的生物素的生物合成链的由下列基因中之一所生产的酶编码的DNA顺序,
·bioF和bioC,
·bioF和bioH,
·bioF bioC和bioH。
6、据权利要求5的DNA顺序,其特征是它还至少为下列基因中之一所生产的酶编码,
·bioA;bioA和bioD。
7、据权利要求5或6中之一的DNA顺序,其特征是它为由基因bioD,bioA和bioB所生产的酶编码。
8、据权利要求1至7中之一的DNA顺序,其特征是它没有天然的顺序,而该顺序是确保在原始细菌中生物素的生物合成方法中的酶的转录控制。
9、DNA顺序,它是在图4至8和图17至19中所述的整个或部分顺序。
10、据权利要求1至9中之一的DNA顺序,其特征是它来源于杆菌菌株(Souche)。
11、据权利要求10的DNA顺序,其特征是它来源于球杆菌菌株。
12、至少包含一个据权利要求1至11的顺序的质粒载体。
13、据权利要求12的载体,其特征它是包含能整合到宿主菌株的染色体中的DNA顺序。
14、据权利要求13的载体涮卣魉辽侔桓龃嬖谟谝木甑幕蜃橹械模⒛芙姓献饔玫乃承虻耐此承颉?
15、据权利要求14的载体,其特征该同源顺序是天然的基因组的顺序。
16、据权利要求14的载体,其特征该同源顺序是一个依靠整合的质粒载体而已被整合到基因组中的顺序。
17、据权利要求16的载体,其特征是该特定的质粒载体至少包含一个防抗生素的基因和一个从属于欲转化的菌株的启动子的基因标志物。
18、据权利要求17的载体,其特征是该启动子是诱导启动子。
19、据权利要求18的载体,其特征是该整合的质粒载体是质粒PTG475。
20、据权利要求12的载体,其特征是它包含自主复制的起源(Origine)。
21、据权利要求20的载体,其特征是它是一个杆菌菌株,或是大肠埃希氏菌菌株的自主复制起源。
22、据权利要求20或21中之一的载体,其特征是为生物素的生物合成链的酶密码的DNA顺序是伴陪有能在宿主菌株中表达的成分(element)。
23、据权利要求22的载体,其特征是在这些能表达的成分中包括了在宿主菌株中有效的启动子和终止密码子。
24、被据权利要求12至23中之一的载体所转化的细胞。
25、据权利要求24的细胞,其特征它是选自杆菌属,埃希氏菌属或假单胞菌属的细菌。
26、据权利要求24的细胞,其特征它是酵母菌属的酵母。
27、据权利要求25的细胞,其特征它是选自球杆菌,枯草杆菌和大肠埃希氏杆菌。
28、据权利要求24至27中之一的细胞,其特征该转化细胞是生产生物素或其同效维生素的细胞。
29、制备生物素的方法,其特征把至少含有庚二酸或该生物素的同效维生素的培养基用据权利要求24至28中之一的,并能接受庚二酸或所说的同效维生素影响的细胞进行发酵,并由此回收所生成的生物素。
30、据权利要求29的方法,其特征该生物素的同效维生素是通过用生产该同效维生素的据权利要求24至28中之一的细胞对至少含有庚二酸的培养基进行发酵而制得的。
31、据权利要求30的方法,其特征是实施据权利要求24至28中之一的两个细胞菌株的共发酵(co-fermentation),其中之一是用于从庚二酸出发生产生物素的同效维生素,另一个是用于发酵该同效维生素以制备生物素。
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