CN1898387A - 用于无抗生素表达的表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及待用于营养缺陷型、原核宿主细胞的表达载体,以及含有表达载体和营养缺陷型原核宿主细胞的表达系统。此外,本发明还涉及含有本发明表达载体的无抗生素发酵培养基,以及无抗生素表达肽/蛋白质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及在营养缺陷型、原核宿主细胞中使用的表达载体,以及含有表达载体和营养缺陷型原核宿主细胞的表达系统。此外,本发明还涉及含有上述表达载体的无抗生素发酵培养基,以及无抗生素表达肽/蛋白质的方法。
背景技术
很长时间以来人们已经知道使用表达载体,例如质粒,用于表达例如治疗性肽/蛋白质。因此,通过在例如大肠杆菌中大规模生产重组蛋白质,已经可以提供宽范围的蛋白质用于生化研究、生物技术和甚至用于医学治疗。这种方法成功应用的实例是在中和高细胞密度条件下由细菌制造结合抗原的免疫球蛋白Fab片段(Carter et al.,1992;Schiweck & Skerra,1995)。一般地说,对于遗传学生产治疗性蛋白质,异源生物合成在过去十年中已经获得越来越多的注意。
工业规模生产中经常遭遇到的一个问题是每个细胞表达重组蛋白质的产率降低。这种现象的一个原因是,由于遗传安全的表达载体的分离或结构不稳定性使得功能质粒从高细胞密度培养物中丢失(Corchero & Villaverde,1998)。与带有ColEI的天然载体相比,这种质粒缺乏确保向后代遗传的迁移和分配功能。在实验室条件下,通过用抗性标记对细菌进行抗生素选择来补偿遗传稳定性的降低。然而,在发酵条件下维持这种选择压力是困难的,因此可能出现功能质粒的丢失(Zabriskie & Arcuri,1986;Broesamle et al.,2000)。
另一个对成功高产率生产重组蛋白的重要影响因素,是选择能显著影响合成基因产物浓度的适当的细菌宿主菌株(Sambrook et al.,1989)。其中一个例如是E.coliK21JM83株,它已经成功用于实验室规模经周质分泌表达抗体片段很多年(Skerra etal.,1991;Fiedler and Skerra,1999)。E.coli K21 JM83株是营养缺陷型菌株的一个实例,即这种菌株自身不能产生必需氨基酸。对于E.coli K21 JM83株,这种氨基酸是脯氨酸。如果表达蛋白质分泌到细菌的周质中,与很多其它E.coli菌株相比,这种宿主菌株显示出优越的功能性表达(Skerra 1994a,b)。然而,这种脯氨酸营养缺陷型菌株却不能在发酵试验中使用,因为它不能在基本培养基上生长。对于工业生产规模的发酵一般优选使用合成培养基,因为可以通过使用确定碳源的简单方式来控制生长过程,在多数情况下确定碳源是葡萄糖或甘油(Yee and Blanch,1992)。然而,对于菌株JM83,发现在葡萄糖/氨/矿物盐培养基中补充脯氨酸是不可行的,因为这种氨基酸优选作为碳源和氮源被代谢掉(Neidhard et al.,1990)并因此控制生长速率。
proBA基因座位(Mahan & Csonka,1983;Deucht et al.,1984)编码γ-谷氨酰激酶(ProB)和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(ProA),两者在脯氨酸的合成路径中都扮演关键角色。
在Gene 274(2001)111-118中,M.Fiedler和A.Skerra公开了一种表达载体,更具体而言是一种质粒,其中包含互相可操作连接的以下元件:用于表达控制的阻遏子(TetR),表达启动子(tet),氯霉素抗生素抗性基因以及proBA。然而,上述出版物没有描述这种质粒可以与作为唯一选择方式和唯一标记的所述氨基酸一起使用。进一步说,Fiedler等人没有公开在无抗生素的发酵培养基中使用上述质粒生产重组蛋白。
使用抗生素选择质粒有明显的缺点,特别是在制备治疗性蛋白质时。由于产品对患者将更加安全,无抗生素的方法更容易被管理机构(例如,FDA、EMEA)接受,并且还因为最终产物分析(去除产品中的抗生素)减少导致可以设计明显更低成本的工艺。
因此,本发明的目的是提供一种无抗生素的表达肽/蛋白质的方法。本发明的另一个目的是提供适用于这种方法的发酵培养基和表达系统。
这些目的由本发明独立权利要求的主题实现。在从属权利要求中提供了优选实施方案。
本发明的关键特征是创造能进行无抗生素发酵、即蛋白质/肽表达的表达系统。
更详细的说,本发明涉及以下内容:
根据第一方面,本发明涉及用于营养缺陷型、原核宿主细胞中的表达载体,其中包括互相可操作连接的以下组分:
a)调节序列,
b)编码蛋白质/肽的序列,
c)第一种选择标记基因,和
d)第二种选择标记基因,其中该标记基因编码营养缺陷型宿主不表达的蛋白质,该蛋白质是宿主细胞营养缺陷型氨基酸的生物合成所必需的,其中tet启动子不能作为a)中的调节序列。
调节序列优选是具有核糖体结合位点的tac启动子。然而,除了这个启动子,其它的很多启动子也能被使用,特别是所有基于lac启动子的启动子。这些启动子的实例是pac,rac,trc,tic启动子。关于可用于本发明中的启动子的进一步信息请见BrosiusJ.et al.in J Biol Chem.1985 Mar 25;260(6):3539-41,“Spacing of the-10and-35regionsin the tac promoter.Effect on its in vivo activity.”和Donovan R.S.et al.in J Ind Microbiol.1996Mar;16(3):145-54,“Review:optimizing inducer and culture conditions forexpression of foreign proteins under the control of the lac promoter.”
还可以使用λ噬菌体中的PL、PR启动子和阿拉伯糖启动子ara,它们都是在分子生物学领域中众所周知的启动子。
根据一个实施方案,根据本发明的表达载体具有用于终止转录的终止子,其中特别优选使用λ噬菌体的t0终止子。原则上,该位置能够使用任何功能性终止子。因为多数操纵子或基因旁侧有防止聚合酶通读的终止子结构,所以有很多的实例。
此外,根据本发明的表达载体还携带有阻遏基因,其中特别优选优选lacI基因。在此使用的阻遏基因包括编码结合到启动子位置上之后阻止基因转录的蛋白质的任何基因。根据本发明的这些的实例是上述的lac阻遏基因(特别是E.coli K12中的lac阻遏基因;见实施例)。
另一个众所周知的阻遏物是λ噬菌体中的CI阻遏物,然而,它不能与lac杂合启动子结合,而只能与PL和PR启动子结合。此外,还能使用AraC阻遏物,因为它可以抑制从pBAD(ara)启动子的转录。本领域技术人员已知可以相同方式使用的阻遏物的很多其它实例。
与此方面相关的序列信息例如可以在以下参考文献中发现。
●Cl:
Sauer RT,DNA sequence of the bacteriophage gama cI gene.Nature.1978 Nov 16;276(5685):301-2.
Humayun,Z.DNA sequence at the end of the CI gene in bacteriophage lambda,NucleicAcids.Res.4(7),2137-2143(1977)
序列信息和关于阻遏物的其它参考文献可以在下面的网址中找到:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=9626243&item ID=48&view=gbwithp
arts
●PL和PR:
Horn,G.T.and Wells,R.D.The leftward promoter of bacteriophage lambda.lsolation on asmall restriction fragment and deletion of adjacent regions,J.Biol.Chem.256(4),1998-2002(1981)
Remaut,E.,Stanssens,P.and Fiers,W.Plasmid vectors for high-efficiency expressioncontrolled by the PL promoter of coliphage lambda,Gene 15(1),81-93(1981)
Petrov,N.A.,Karginov,V.A.,Mikriukov,N.N.,Serpinski,O.I.and Kravchenko,V.V.Complete nucleotide sequence of he bacteriophage lambda DNA region containing gene Qand promoter pR′,FEBS Lett.133(2),316-320(1981)
Walz,A.and Pirrotta,V Sequence ofthe PR promoter of phage lambda;Nature 254(5496),118-121(1975)Horn,G.T.and Wells,R.D.The leftward promoter of bacteriophage lambda.Isolation on a small restriction fragment and deletion of adjacent regions,J.Biol.Chem.256(4),1998-2002(1981)
Remaut,E.,Stanssens,P.and Fiers,W.Plasmid vectors for high-efficiency expressioncontrolled by the PLpromoter ofcoliphage lambda,Gene 15(1),81-93(1981)
Petrov,N.A.,Karginov,V.A.,Mikriukov,N.N.,Serpinski,O.I.and Kravchenko,V.V.Complete nucleotide sequence of the bacteriophage lambda DNA region containing gene Qand promoter pR′,FEBS Lett.133(2),316-320(1981)
Walz,A.and Pirrotta,V.Sequence of the PR promoter of phage lambda;Nature 254(5496),118-121(1975)
关于启动子的序列信息可见以下网址:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=1
4819
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=3
41294
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=2
15104
●AraC:
Miyada,C.G.,Horwitz,A.H.,Cass,L.G.,Timko,J.and Wilcox,G.DNA sequence of thearaC regulatory gene from Escherichia coli B/r,Nucleic Acids Res.8(22),5267-5274(1980)
Wallace,R.G.,Lee,N.and Fowler,A.V.The araC gene of Escherichia coli:transcriptionaland translational start-points and complete nucleotide sequence,Gene 12(3-4),179-190(1980)
关于AraC的序列信息可见以下网址:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=4
0935
●pBAD启动子:
Miyada,C.G.,Sheppard,D.E.and Wilcox,G.Five mutations in the promoter region of thearaBAD operon of Escherichia coli B/r,J.Bacteriol.156(2),765-772(1983)
关于araBAD启动子的序列信息可见以下网址:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=1
45308
根据优选实施方案,根据本发明的表达载体含有序列为AGGAGA的核糖体结合位点。
核糖体结合位点是位于起始密码子上游的mRNA上与核糖体小亚基结合的位点。在原核生物中,这通常对应Shine-Dalgarno(SD)序列,SD序列经常位于起始密码子上游3到11个核苷酸处,并显示与16sRNA的3′末端的序列互补。大肠杆菌SD共有序列是UAAGGAGGU。
根据本发明表达载体的另一个实施方案,第一种选择标记基因是抗生素抗性基因,优选卡那霉素抗性基因。可用于本发明的抗生素抗性基因是例如:氨苄青霉素抗性(amp);四环素抗性(tet);氯霉素抗性(cat);新霉素抗性(与卡那霉素抗性基因对应;例如载体pACYC177中的Km抗性基因;见实施例)。
关于pACYC177的信息可见:Rose,R.E.The nucleotide sequence of pACYC177,Nucleic Acids Res.16(1),356(1988),以及链接
http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/sequences/pacyc 177.txt.
正如上面描述的,根据本发明的表达载体含有第二种选择标记基因,其中该标记基因编码营养缺陷型宿主不表达的氨基酸。这第二种选择标记基因也被称为营养缺陷基因。第二种选择标记基因优选是proBA、甲硫氨酸营养缺陷基因metB和/或亮氨酸营养缺陷基因leuB。
关于proBA的文献中的以下数据描述了这些基因及其活性:Baich,A.,(1969)Proline synthesis in Escherichia coli.A proline inhibitable-glutamic acid kinase.BiochimBiophys Acta
192,462-467.Baich,A.,(1971)The biosynthesis of proline in Escherichiacoli,phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase(NADP),the secondenzyme in the pathway.Biochim Biophys Acta
244,129-134.
在关于metB的以下文献中已经描述了该基因及其活性:Duchange,N.,Zakin,M.M.,Ferrara,P.,Saint-Girons,I.,Park,I.,Tran,S.V.,Py,M.C.and Cohen,G.N.Structureof the metJBLF cluster in Escherichia coli K 12.Sequence of the metB structural gene andof the 5′-and 3′-flanking regions of the metBL operon,J.Biol Chem.258(24),14868-14871(1983).
序列数据可见:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=146844&itemID=5&view=gbwithpart
s
关于leuB的以下文献中已经描述了该基因的数据:Blattner,F.R.,Plunkett,G.III,Bloch,C.A.,Perna,N.T.,Burland,V.,Riley,M.,Collado-Vides,J.,Glasner,J.D.,Rode,C.K.,Mayhew,G.F.,Gregor,J.,Davis,N.W.,Kirkpatrick,H.A.,Goeden,M.A.,Rose,D.J.,Mau,B.and Shao,Y.The complete genome sequence of Escherichia coli K-12,Science277(5331),1453-1474(1997).
序列数据可见:
http://www.nchi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=1786250&itemID=37&view=ghwithp
arts
通过根据本发明的表达载体,可以不受任何限制的选择大量编码序列进行表达。已经发现根据本发明的表达载体在表达G-CSF、MIA和/或BMP编码序列时特别有利。此外,所有治疗相关的蛋白质(例如tPA、TNF、HGF、NGF、蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶、肠激酶,β-TGF、干扰素、促红细胞生成素、胰岛素、因子VII、因子VIII、单链抗体、AffilinTM以及这些蛋白质的融合体,G蛋白偶联受体及其结构域,和这些蛋白质的前体形式)可以作为包含体或其可溶性变体而被表达。最后,还可以考虑表达GM-CSF、M-CSF、白细胞介素、干扰素、降钙素、caspases、VEGF、因子III、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIIa、GDF、IGF、金属蛋白酶、抗体、抗体片段或免疫毒素。
根据另外一个实施方案,根据本发明的载体是高拷贝质粒。高拷贝质粒或高拷贝数质粒(也称作多拷贝质粒)分别指以高拷贝数(>20个质粒/染色体)存在的小质粒(通常<15kb)。这些质粒,例如从pBR322衍生的pUC质粒,经常用作克隆和表达载体。
在一个具体实施方案中,根据本发明的表达载体含有相互可操作连接的以下组分:
a)具有核糖体结合位点的tac启动子,
b)编码序列,比如编码MIA,
c)卡那霉素抗性基因,
d)proBA序列,
e)任选的lacI阻遏基因,和
f)任选的λ噬菌体中的t0终止子,用于终止基因转录。
此外,本发明涉及表达载体pSCIL008,其中含有相互可操作连接的以下组分:
a)具有核糖体结合位点的tac启动子,
b)编码序列,例如编码MIA、G-CSF、ProBMP、BMP、tPA、TNF、HGF、NGF、蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶、肠激酶、β-TGF、干扰素、促红细胞生成素、胰岛素、因子VII、因子VIII、单链抗体、AffilinTM以及这些蛋白质的融合体、G蛋白偶联受体及其结构域、和这些蛋白质的前体形式,GM-CSF、M-CSF、白细胞介素、干扰素、降钙素、caspase、VEGF、因子III、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIIa、GDF、IGF、金属蛋白酶、抗体、抗体片段或免疫毒素,
c)抗生素抗性基因,优选卡那霉素抗性基因,
d)proBA序列,
e)任选的结合到启动子的操纵基因的阻遏物,优选lacI阻遏物,和
f)任选的来自λ噬菌体的t0终止子,用于终止基因转录。
根据第二个方面,本发明涉及含有以下组分的表达系统:
a)根据本发明定义的表达载体,和
b)营养缺陷型原核宿主细胞。
根据本发明,宿主细胞优选是营养缺陷型E.coli细胞,它是脯氨酸营养缺陷型细胞。
E.coli细胞优选选自菌株JM106、JM108、JM109、JM83和TB1或其衍生菌株。衍生菌株表示这样的菌株,它们被遗传操作但保留了表达相关的营养缺陷,并因此能够用根据本发明的弥补氨基酸营养缺陷的载体转化。本发明还包含根据现有技术操作而获得能用作选择标记的营养缺陷的那些菌株。
上述E.coli菌株已经在以下DSMZ编号下保藏:
JM83 DSMZ no.3947
JM108 DSMZ no.5585
JM109 DSMZ no.3423
JM106的详细描述可见Yanisch-Perron et al.,1985。TB-1的信息可见Biochemistry23:3663-36671984。
根据第三个方面,本发明涉及无抗生素发酵培养基,其中包含以下组分:
a)以上定义的表达系统,或
b)表达系统,其中含有
aa)具有以下组分的表达载体:
—调节序列,
—编码蛋白质/肽的序列,
—第一种选择标记基因,和
—第二种选择标记基因,其中该标记基因编码所述营养缺陷型宿主不表达的氨基酸,
—任选的用于终止基因转录的终止子。
bb)营养缺陷型原核宿主细胞,和
c)合适的含水矿物盐培养基,和
d)存在阻遏基因时任选的诱导物。
根据第四个方面,本发明涉及无抗生素表达肽/蛋白质的方法,其中包括以下步骤:
a)用本发明定义的表达载体转化营养缺陷型宿主细胞,
b)选择被转化的宿主细胞,其中基于第二种选择标记基因表达的氨基酸进行选择;
c)在进行发酵和表达蛋白质/肽的条件下将被转化的宿主细胞引入上述发酵培养基;和
d)分离并纯化所表达的蛋白质/肽。
根据一个实施方案,用抗生素再进行步骤b)中的选择。
换句话说,在本发明中特别是发酵过程,即表达多肽/蛋白质的实际工艺阶段,是在完全无抗生素的环境中进行。以此方式,就可以避免开始提及的伴随使用抗生素选择质粒的问题,如管理机构关注的产品安全性,最终产品分析(去除产品中的抗生素)和与之相关的风险和成本。通过根据本发明的方法,在发酵培养基中不使用抗生素的条件下进行的发酵过程中仍然维持有选择压力。
在下面,本发明将通过附图和伴随实施例进行更详细的解释。应当理解本发明的范围并不限于这些实施方案,它们只是用于举例说明。
在附图中示出了构建pSCIL043的步骤:
图1:pSCIL043表达载体的质粒图。
所有相关基因区域用不同颜色突出显示。以下区域对载体功能重要:lacI(阻遏物,红色);Km(抗生素抗性,绿色);proBA(选择标记基因,黄色);t0(终止子,深绿色);tac(启动子,蓝色)。
图2:pUC19用AflIII和HindIII限制酶切割
通过这种限制性酶切,从pUC19中去除质粒的非编码区域,获得两个片段:与功能无关的359bp片段和代表载体保留部分的2327bp片段。纯化2327bp片段并在以后使用。1:100bp标记Invitrogen;2:pUC19的AflIII/HindIII限制酶切割;3:未切割的pUC19;4:1Kb标记MBI。
图3:从总λ噬菌体DNA中扩增t0终止子
从MBI-Fermentas获得的染色体λ噬菌体DNA中,用PCR直接扩增t0终止子(94bp)。
图4:从pACYC 177扩增Km盒
使用pACYC177作为Km盒的模板。通过Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化后,PCR产物被亚克隆进入pGEM Teasy(Promega)。
图5:扩增不含Amp盒的pSCIL001
通过Amp盒旁侧的引物扩增pSCIL001,来交换抗生素抗性并引入两个新的限制酶切位点(NheI和ApaI)。
图6:pSCIL002的限制性分析
通过限制酶ApaI/NheI,再次从载体中切除Km盒。通过使用EcoRI、EcoRV和AflIII进行限制性酶切,使载体仅被线性化。1:1kb标记MBI;2:pSCIL002ApaI/NheI;3:pSCIL002EcoRI;4:pSCIL002EcoRV;5:pSCIL002AflIII。
图7:扩增proBA决定子
通过上述引物,能够扩增proBA决定子。该片段含有proBA基因的天然终止子。
图8:pSCIL003用EcoRV限制酶切割
为了确认proBA决定子正确插入pSCIL002中,用EcoRV酶切质粒后应产生以下片段:2479,1542和999bp。在pSCIL002的阴性结果中,载体应只被线性化。1:1kb标记MBI;2:pSCIL003EcoRV;3:未切的pSCIL003。
图9:以pSCIL003补偿JM83中的缺陷型脯氨酸生物合成途径
在完全培养基中,所有菌株(野生型=XL1Blue)的生长与补偿后菌株的生长(未示出)相当。在矿物盐培养基中,只有含pSCIL003的菌株能够生长,但是含pSCIL002的菌株不能生长。
图10:扩增lacI
通过上述引物,从K12染色体DNA中能够直接扩增lacI阻遏基因。将基因连接入亚克隆载体pGEM Teasy(Promega),并通过限制酶性分析和测序来确认PCR产物的完整性。
图11:克隆启动子
通过PCR产物,在连接时两个EcoRI限制性位点中的一个被破坏。
图12:克隆MIA基因
从合成产物中,通过PCR扩增MIA基因。在亚克隆到pGEM Teasy中和限制性酶切后,通过琼脂凝胶电泳分离和纯化片段。随后将DNA片段连接入pSCIL008EcoRI/PstI。
图13:测试SP83-043(JM83[pSCIL043])的表达
在矿物盐培养基中用JM83对pSCIL043进行表达测试。在OD值为0.8时用1mM的IPTG诱导。诱导前以及诱导后期间的表达被示出。1:标记;2:诱导前的SP83-043(MSM);3:诱导后1小时的SP83-043(MSM);4:诱导后2小时的SP83-043(MSM);5:诱导后3小时的SP83-043(MSM)。
图14:SP83-043的质粒稳定性测试
终止表达以后,稀释细胞并接种到固体LB培养基上。将生长的菌落分别挑到不含抗生素和含抗生素的LB-琼脂培养基中。所有菌落在两种培养基中都生长,表现出100%的质粒稳定性。相比而言,在对E.coli BL21平行进行的表达测试中,只检测到12-35%的质粒稳定性。
图15:构建pSCIL043的图解
实施例
实施例1:细胞系SP83-043[JM83(pSCIL043)的说明
1)表达菌株的起源,表型和基因型
用来表达MIA的细菌宿主大肠杆菌Escherichia coli JM83可以从DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig(DSMZ)获得并通过证书鉴定。
所用的大肠杆菌菌株JM83(DSMZ 3947)[F-,ara,Δ(lac-proAB),rpsL(Strr),φ80lacZAM15,thi]具有对链霉素的抗性,这是由于rpsL基因的突变(细菌核糖体30S亚基的12S蛋白)。由于proBA操纵子的突变,这种菌株不能合成脯氨酸。然而,通过使用pSCIL043可以消除这种作用,并且这种营养缺陷被用作选择标记。此外,这种菌株不能代谢阿拉伯糖,和与很多其它K12衍生菌(例如C600;DH5a,JM107)相似不能合成硫胺素(Vieira & Messing,1982)。
2)MIA的表达
在位于pSCIL043中的tac启动子控制下,在大肠杆菌菌株JM83中表达MIA蛋白质。pSCIL043载体是携带卡那霉素抗性的高拷贝质粒。在确定的矿物盐培养基中进行表达并通过加入IPTG来诱导表达。MIA以所谓的包含体形式被合成。
3)参考资料
Vieira,J.and Messing,J.(1982);Gene19,p.259
JM83(DSMZ no.3947)
MIA基因序列(合成序列)
ATGGGCCCGATGCCGAAACTGGCGGATCGTAAACTGTGCGCGGATCAGGA
ATGCAGCCATCCGATTAGCATGGCGGTGGCGCTGCAAGATTACATGGCGC
CGGATTGCCGTTTTCTGACCATTCATCGTGGCCAGGTGGTGTATGTGTTT
AGCAAACTGAAAGGCCGTGGCCGTCTGTTTTGGGGCGGCAGCGTGCAGGG
CGATTACTATGGCGATCTGGCGGCACGTCTGGGCTATTTCCCGAGCAGCA
TTGTGCGTGAAGATCAGACCCTGAAACCGGGCAAAGTGGATGTGAAAACC
GACAAATGGGATTTCTATTGCCAG
pSCIL043表达载体的详细说明
以下给出质粒pSCIL043的详细说明。MunI/EcoRI位点(G1AATTG)被计数为第一个碱基,由于克隆策略该位点不再完整。在图1中示出了质粒图:
位置(bp) | 功能/说明 |
1-7307-7475-8083-406407-412413-418425-430431-525526-531 | 表达相关区域tac启动子,包括RBS(AGGAGA)EcoRI限制性位点(用于克隆)hMIA基因TAATGA终止密码子PstI限制性位点(用于克隆)HindIII限制性位点(用于克隆)λ噬菌体的t0终止子AflIII限制性位点(用于克隆) |
532-1232 | pUC19的复制起始点 |
1233-59291233-12381239-37593760-37653766-47564757-4762 | 选择标记ApaI限制性位点(用于克隆)来自Ecoli K12的作为ApaI/ApaI片段(选择标记)的proBA决定子ApaI限制性位点(用于克隆)来自载体pACYC177的Km抗性基因NheI限制性位点(用于克隆) |
4763-59235924-5929 | 来自Ecoli K12的作为NheI片段的lacI阻遏基因NheI限制性位点(用于克隆) |
5930-6560 | pUC19骨架 |
准备生产质粒pSCIL043
1.将转录终止子插入起始载体=pSCIL001
1.1.起始载体的限制性酶切
●起始质粒=从MBI-Fermentas获得的pUC19
●用HindIII和AflIII限制性酶切pUC19质粒(图2),由此从载体中删除359bp。
1.2.t0终止子的扩增
●使用以下引物通过PCR扩增t0终止子(图3):
1)t0-OD-MCS-HindIII
5`-AAA
AAGCTT HindIIIGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAA-3`|
2)t0-UU-MCS-AflIII
5`-AAA
ACATGT AflIIIATTCTCACCAATAAAAAACGCC-3`|
●用限制性核酸内切酶HindIII(MBI)和AflIII(NEB)限制性酶切终止子片段,随后用Minelute Kit(Qiagen)纯化片段
●将t0终止子连接入pUC19HindIII/AflIII。通过限制性分析和测序确认插入=pSCIL001。
交换pSCIL001中的抗生素抗性=pSCIL002
1.2.卡那霉素盒的扩增
●使用以下引物通过PCR扩增pACYC177(NEB)的Km盒(990bp)(图4):
1)Km-OD-ApaI
5`-AA
GGGCCC ApaIGCCACGTTGTGTGTCTC-3
2)Km-UU-NheI
5`-AAA
GCTAGC NheIGATATCGCCGTCCCGTCAAGTC-3`|
亚克隆PCR产物到pGEM Teasy(Promega)中。通过限制性分析和DNA测序检验片段的完整性。
2.2.扩增无氨苄青霉素抗性盒的pSCIL001
●使用以下引物通过PCR扩增无Amp盒(即所用引物在pUC19中存在的Amp盒两侧)的载体pSCIL001(1462bp)(图5):
1)pUC2451-OD-NheI
5`-AAA
GCTAGC NheIGGGAATAAGGGCGACACGG-3`|
2)pUC1496-UU-ApaI
5`-AAA
GGGCCC ApaIACGTGAGTTTTCGTTCCACTG-3`
●通过ApaI/NheI限制性酶切从载体中切割亚克隆载体pGEM Teasy中的Km盒,并将Km盒连接到已经被切割的pSCIL001(ΔAmp)ApaI/NheI片段(图5)。从而得到pSCIL002。
●通过限制性分析检验pSCIL002。在分析水平进行四种不同的限制性酶(ApaI/NheI,EcoRI,EcoRV和AflIII)分析。在所有限制性分析中,载体应被线性化,只有用ApaI和NheI处理应导致释放插入的Km盒(图6)。
3.第二可选择标记插入pSCIL002=pSCIL003
3.1.从K12染色体DNA中扩增proBA决定子
●使用以下引物通过PCR扩增proBA操纵子(2520bp)(图7)。K12染色体DNA作为PCR的模板。通过DNeasy Tissue Kit(Qiagen)分离DNA。从DSMZ,Braunschweig获得E.coli K12strain(DSMZ 9037):
1)proAB-OD-ApaI
5`-AAA
GGGCCC ApaIGCAACCGACGACAGTCCTGC-3`|
2)proAB-UU-ApaI
5`-AAA
GGGCCC ApaICGGTGGACAAAGGTTAAAAC-3`|
3.2.克隆proBA决定子到pSCIL002Apal中和功能测试
●通过ApaI限制酶从pGEM Teasy载体(Promega)中切割亚克隆的proBA片段并将其连接入载体pSCIL002ApaI。为确认第二种选择标记的正确插入,用EcoRV(NEB)酶切pSCIL003载体(图8)。
●为检验pSCIL003载体的功能,分别用载体pSCIL002(没有proBA)和pSCIL003(有proBA)转化大肠杆菌菌株JM83。所得转化体铺板于矿物盐培养基上并测试它们在该培养基上的生长能力(图9)。这清楚表明由于用pSCIL003转化,JM83菌株能够在矿物盐培养基上生长。质粒上没有proBA决定子使得菌株不能在该培养基上生长。因此,proBA能作为选择标记使用。
4.插入lacI阻遏基因=pSCIL004a
4.1.从K12染色体DNA中扩增lacI阻遏基因
●使用以下引物通过PCR扩增包括天然启动子的lacI基因(1160bp)(图10)。使用K12染色体DNA作为PCR模板。用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)分离该DNA。从DSMZ Braunschweig获得大肠杆菌K12菌株(DSMZ 9037):
1)lacI OD NheI
5`-AAA
GCTAGC NheIGACACCATCGAATGGCGC-3`
2)lacIUU NheI
5`-AAA
GCTAGC NheITCACTGCCCGCTTTCC-3`
4.2.引入阻遏物基因到pSCIL003=pSCIL004a
●经由NheI限制性位点引入阻遏物基因到pSCIL003。因为引入阻遏物基因有两种可能性,通过限制性分析来检验基因片段定位的正确与否。在MCS中为了后者目的基因的表达,通过EcoRV酶切作用可以验证基因插入定位的正确与否(结果没有显示)。
5.将tac启动子插入pSCIL004a=pSCIL008
5.1.扩增tac启动子和克隆策略
●为了PCR扩增tac启动子(67bp),使用以下序列作为引物。载体pKK233-3(Amersham,见附件)作为模板。
1)Prtac-MunI5`
5`-AAA
CAATTG MunITGTTGACAATTAATCATCGGCTC-3`|
2)Prtac-EcoRI3`
5`-AAA
GAATTC EcoRITCTCCTRBSTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3`
●直接用限制性内切酶EcoRI和MunI处理PCR产物。除了EcoRI位点外,3`引物Prtac EcoRI还含有核糖体结合位点。经过连接入EcoRI切割的pSCIL004aEcoRI,启动子能被直接克隆到EcoRI位点上游的MCS中。同样,第二个EcoRI位点被启动子5`端的MunI位点破坏。引入的序列通过测序确定(图11)。
6.连接MIA基因
●由geneART GmbH,Regensburg合成MIA基因
●用限制性内切酶EcoRI和PstI切割合成质粒(图12)中的MIA片段,并将该片段连接入经相同酶切割的载体pSCIL008中。通过限制性分析和测序检验引入序列。通过将MIA基因克隆入pSCIL008质粒,获得表达载体pSCIL043。
●用pSCIL043表达质粒转化大肠杆菌菌株JM83,并通过反复铺板到固体培养基上使菌株适应矿物盐培养基。在一个表达试验中(20ml),检验表达载体的表达性能(图13)。
●通过在诱导结束时检验选择性和非选择性(含卡那霉素)LB琼脂上的细胞,来检测质粒的稳定性。由此获得100%的质粒稳定性(图14)。
7.构建方案
(图15)
实施例2:发酵工艺的实施例
使用现有技术相应的方法,将根据本发明的表达载体转化入感受态大肠杆菌JM83和大肠杆菌BL21细胞中。这些细胞首先被铺板到LB琼脂上并在37℃培养。然后它们必须适应矿物盐培养基。为此目的,将克隆从LB琼脂平板转接到含有矿物盐琼脂培养基平板上并在37℃培养。为了改善对这种培养基的适应性,将克隆从含有矿物盐培养基的琼脂平板转接到另一个含有矿物盐培养基的琼脂平板上并在37℃培养。100ml矿物盐培养基接种来自这个平板的一个克隆。在180rpm和37℃条件下培养过夜,直到光密度达到OD600=3。在这个OD值,从液体培养物制备甘油培养物,它由800μl细胞悬液和200μl甘油组成。
在本实施例中,描述了两个在101实验室发酵罐(B.Braun Biotech)中的发酵。第一个使用大肠杆菌JM83。第二个使用大肠杆菌BL21,其中选择标记是无活性的,因为BL21不是营养缺陷型菌株。按照加料分批工艺进行发酵。批次体积是6升。补料2升基质(料),终体积是8升。
接种一份甘油培养物到100ml矿物盐培养基中,在180rpm和37℃培养过夜(第一预培养物)。用部分体积的第一预培养物接种到含100ml矿物盐培养基的四个烧瓶中,在180rpm和37℃培养(第二预培养物)。在光密度例如OD600=3时,离心细胞悬液并将细胞沉淀重悬于50ml生理盐水中。
从接种开始分批培养阶段,并在达到确定的光密度例如OD600=18时结束,这时开始加料批次阶段,既开始补充基质。根据指数函数“加料流速=常数*exp(μ1*t)”确定给予基质量(加料流速),其中μ是比生长速率和其中μ1=常数<μmax。即在每个时间点的基质量总是小于此时细胞的最大需要量,由此达到一个亚最大生长率。例如选择μ1=0.35h-1。
在确定的光密度值例如OD600=75时,通过加入例如1mM的IPTG诱导蛋白质表达。这时,通过给予基质量(加料流速)使细胞调整为另一个比生长速率μ2,例如μ2=0.1h-1。在确定的培养时间后,例如4小时,终止培养过程。
随着细胞密度的增加,需氧量也持续增加,使用级联控制氧分压pO2使需氧量保持恒定在例如20%饱和度。随着需求的增加导致搅拌器转速增加。如果达到最大转速,就增加了空气的通气速率。如果通气速率达到最大值,就随着输入空气补充纯氧。
通过pH调控氮的补充,其中氨用作碱。磷酸用作酸。当形成强泡沫时自动加入消泡剂。
在发酵的不同时间点取样确定质粒的稳定性。虽然在BL21中迅速遇到质粒全部丢失及相应的蛋白质表达丢失,但是可以在在整个发酵过程中检测到JM83中保持100%质粒稳定性。作为这些样品的平行对照从几个样品中分离质粒(发酵过程中每小时取样)。通过不同的核酸内切酶确定JM83中质粒的完整性并发现在整个发酵过程中质粒完整性没有被影响。限制性分析结果显示出与起始质粒同样的条带。
表1:质粒稳定性
时间 | JM83(pSCIL043) | BL21(pSCIL043) |
诱导前 | 100% | 35% |
诱导后 | 100% | 12% |
Claims (19)
1.用于营养缺陷型原核宿主细胞中的表达载体,包含相互可操作连接的以下组分:
a)调节序列,
b)编码蛋白质/肽的序列,
c)第一种选择标记基因,和
d)第二种选择标记基因,其中该标记基因编码营养缺陷型宿主不表达的蛋白质,该蛋白质是宿主细胞营养缺陷型氨基酸的生物合成所必需的,
其中tet启动子不能作为a)中的调节序列。
2.根据权利要求1的表达载体,还含有终止转录的终止子。
3.根据权利要求1或2的表达载体,其中调节序列是含有核糖体结合位点的tac启动子。
4.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,还含有阻遏基因。
5.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中阻遏基因是lacI基因。
6.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中核糖体结合位点具有序列AGGAGA。
7.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中第一种选择标记基因是抗生素抗性基因,优选卡那霉素抗性基因。
8.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中第二种选择标记基因是proBA、甲硫氨酸营养缺陷基因metB和/或亮氨酸营养缺陷基因leuB。
9.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中使用的序列编码MIA、G-CSF、ProBMP、BMP、tPA、TNF、HGF、NGF、蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶、肠激酶、β-TGF、干扰素、促红细胞生成素、胰岛素、因子VII、因子VIII、单链抗体、AffilinTM以及这些蛋白质的融合体、G蛋白偶联受体及其结构域、和这些蛋白质的前体形式。
10.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中终止子是λ噬菌体中的to终止子。
11.根据一或更多项前述权利要求的表达载体,其中表达载体是高拷贝质粒。
12.根据一或更多项前述权利要求的表达载体pSCIL008,其中含有互相可操作连接的以下组分:
a)具有核糖体结合位点的tac启动子,
b)编码序列,例如编码MIA、G-CSF、ProBMP、BMP、tPA、TNF、HGF、NGF、蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶、肠激酶、β-TGF、干扰素、促红细胞生成素、胰岛素、因子VII、因子VIII、单链抗体、AffilinTM以及这些蛋白质的融合体、G蛋白偶联受体及其结构域、和这些蛋白质的前体形式,GM-CSF、M-CSF、白细胞介素、干扰素、降钙素、caspase、VEGF、因子III、因子X、因子Xa、因子XII、因子XIIa、GDF、IGF、金属蛋白酶、抗体、抗体片段或免疫毒素,
c)抗生素抗性基因,优选卡那霉素抗性基因,
d)proBA序列,
e)任选的结合到启动子的操纵基因的阻遏物,优选lacI阻遏基因,和
f)任选的来自λ噬菌体的to终止子,用于终止基因转录。
13.表达系统,包含以下组分:
a)根据权利要求1-11中一项或更多项的表达载体,和
b)营养缺陷型原核宿主细胞。
14.根据权利要求13的表达系统,其中宿主细胞是营养缺陷型大肠杆菌细胞,它是脯氨酸营养缺陷型。
15.根据权利要求14的表达系统,其中大肠杆菌细胞选自菌株JM106、JM108、JM109、JM83和TB1或其衍生菌株。
16.无抗生素发酵培养基,包含以下组分:
a)根据权利要求13-15的表达系统,或
b)表达系统,其中含有
aa)具有权利要求1的组分a)-d)的表达载体,和
bb)营养缺陷型原核宿主细胞,和
c)含水矿物盐培养基。
17.根据权利要求16的发酵培养基,在阻遏基因存在下还包含诱导物。
18.无抗生素表达肽/蛋白质的方法,包括以下步骤:
a)用根据权利要求1-12的表达载体转化营养缺陷型宿主细胞,
b)选择被转化的宿主细胞,其中基于第二种选择标记基因表达的氨基酸进行选择;
c)在进行发酵和表达蛋白质/肽的条件下将被转化的宿主细胞引入根据权利要求16的无抗生素发酵培养基中;和
d)分离并纯化所表达的蛋白质/肽。
19.根据权利要求18的方法,其中另外用抗生素进行步骤b)中的选择。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20070117 |