CN105755026B - 过滤载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。本发明还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

Description

过滤载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种用于化学合成的寡聚核苷酸质量检测及正确率提高的过滤载体。更具体地，本发明公开了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体。本发明还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

背景技术

通过化学方法合成的寡聚核苷酸在生命科学的应用非常广泛，比如基因的人工合成,基因测序以及通过PCR方法的基因扩增等等。目前寡聚核苷酸的化学合成主要通过亚磷酰胺法(Phosphoramidite chemistry),每个合成周期包含4个化学反应：去封闭、连接、加保护基团和氧化(Kosuri et al (2014)Nature Methods 11:499-507)。尽管每个化学反应的效率都已经优化,达到98％以上，但每步化学反应都不可能是100％准确的,所以通过化学方法合成的寡聚核苷酸都包含有不同程度的错误序列,而且错误的比例随着寡聚核苷酸长度的增长而显著增加(Bauer et al(1989)Nucleic Acids Res.17:812Wosnick et al(1987)Gene 60:115-127)。通过各种合成后的纯化手段,比如OPC、PAGE或HPLC,合成的寡聚核苷酸纯度会有所提高,但它们不能完全消除错误。寡聚核苷酸供应商报告的错误率约为1/100到1/1000(Hecker et al(1998)BioTechniques 24:256-260)。

在所有通过化学方法合成的寡聚核苷酸的错误类型中，缺失一个或两个核苷酸(N-1、N-2)是最常见的(Hecker et al(1998)BioTechniques 24:256-260McClain et al(1986)Nucleic Acids Res.14:6770)。这些来源于不完全化学反应的产物也是最难以去除的,因为它们和正确产物的区别很小。当这些带有N-1和N-2类型错误的寡聚核苷酸被整合到开放阅读框(ORFs),它们会引入移码突变，导致非功能性基因产物的产生。如果一 个基因的合成或扩增只需要2条或几条寡聚核苷酸,而且通过下游的基因测序方法能够挑选出正确的序列,通常由单条寡聚核苷酸序列错误引起的问题不太严重。但是,当一个基因或其中的片段是由多条寡聚核苷酸拼接而成的时候,包含错误序列的比例会显著增加。比如,如果一条寡聚核苷酸的正确率为98％,那么由8条寡聚核苷酸组装而成的基因片段的正确率只有(0.98 6)85％。当这些带有错误序列的基因或片段被转化到噬菌体或细菌内时(比如在噬菌体或细菌基因文库的构建过程中),携带有包含错误序列基因的菌体通常比携带有包含正确序列基因的菌体有竞争优势,因为由正确序列编码的外源基因产物经常对菌体有毒性,因而抑制菌体的生长(Derda et al(2011)Molecules 16:1776-1803Knappik et al(2000)J.Mol.Biol.296:57-86Thomas et al(2010)Anal.Biochem.407(2):237-240)。因此提高正确基因序列的比例对高质量基因文库的构建是至关重要的。

发明内容

本发明提供了一种方法，用以检测化学合成的简并寡聚核苷酸的质量。同时也能有效地过滤掉不符合阅读框(out-of-frame)的寡聚核苷酸,从而增加简并寡聚核苷酸的正确率。这些质量得到提高了的寡聚核苷酸特别适合应用于各类基因文库的构建，构建的文库的全长基因正确率也因为寡聚核苷酸质量的提高而显著提高。

在本发明的一个方面，提供了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点(优选这些酶切位点为过滤载体上仅有的单切位点，即在载体的其他部分不存在)，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。

在本发明的一个优选实施方案中，所述过滤载体在所述启动子和所述酶切位点之间还包括信号肽编码基因，优选所述信号肽为所述报告基因编码的报告蛋白的信号肽，还优选在信号肽编码基因和所述报告基因之间包括连接肽编码序列，优选所述连接肽在插入所述寡聚核苷酸的所述酶切位点之前，更优选在所述启动子与报告基因之间具有至少两个所述酶切位 点，在这至少两个酶切位点之间包含终止密码子，最优选所述信号肽编码基因和所述报告基因处于所述启动子的控制之下并且两者的相对位置符合两者的阅读框(in-frame)。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述过滤载体还任选地包括选择基因，优选所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、氨基酸合成基因(如果所用宿主菌株为氨基酸缺陷型)和它们的组合，更优选选自抗生素抗性基因如β内酰胺酶基因、四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因，最优选所述报告基因是β内酰胺酶(TEM-1)或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因。总之，可以选择任何合适的选择基因和报告基因，只要可以在宿主(如细菌)中进行筛选都满足条件。

在本发明还有的一个优选实施方案中，所述过滤载体是质粒载体，优选所述β内酰胺酶的成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述连接肽的编码序列如SEQ ID No:4所示，更优选在所述启动子与报告基因之间具有插入所述寡聚核苷酸的酶切位点PvuII位点和SpeI位点，在PvuII位点和SpeI位点之间包括终止密码子taa、tag或tga，还更优选PvuII位点和SpeI位点之间的序列如SEQ ID No:5所示。

在本发明还有的一个优选实施方案中，所述过滤载体是pFV02，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

在本发明还有的一个优选实施方案中，所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，优选所述简并寡聚核苷酸的两端分别具有PCR引物引入的酶切位点，该酶切位点与位于所述过滤载体的启动子与报告基因之间的酶切位点相匹配以将所述简并寡聚核苷酸插入所述过滤载体的所述酶切位点之间，更优选与所述过滤载体的该酶切位点相同。应当指出，尽管简并寡聚核苷酸序列两端通常并不带有酶切位点，但是酶切位点是容易通过PCR引物引入的，因此，很方便地可以在简并寡聚核苷酸的两端引入任何酶切位点与过滤载体的相匹配。

在本发明的另一个方面，提供了一种构建过滤载体pFV02的方法，所 述pFV02的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，所述方法包括以下步骤：

1)扩增CAT基因；

2)在pUC19质粒的β-内酰胺酶(TEM-1)基因两端插入AscI和NotI限制性内切酶位点，得到载体pUC19AN；

3)在β-内酰胺酶(TEM-1)成熟肽和信号肽之间插入酶切位点及连接肽，构建质粒pUC19ANL；

4)将CAT基因插入到上述构建的pUC19ANL质粒中，得到过滤载体pFV01；

5)通过定点突变的方法去除pFV01载体CAT基因内的两个PvuII酶切位点，得到的质粒为pFV01-2；和

6)在pFV01-02载体的β-内酰胺酶(TEM-1)成熟肽和信号肽间插入SpeI和PvuII酶切位点以及连接序列,得到质粒pFV02。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

1)设计并构建根据权利要求1-6中任一项所述的过滤载体；

2)将待检测的寡聚核苷酸通过PCR转换成双链DNA片段；

3)双链DNA片段经酶切后连接到步骤1)中所述的过滤载体中；

4)将连接产物转化到宿主细胞中；

5)通过所述报告基因和/或选择基因筛选具有目标长度的寡聚核苷酸。

在本发明的一个优选实施方案中，所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，所述载体是pFV02，并且所述宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明的一个优选实施方案中，所述连接肽的序列为：cactcgggtgaggtt，所编码的氨基酸序列为HSGEV。这段序列在酶切位点之前，在插入所筛选的寡聚核苷酸时不会被切除。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述终止密码子不在连接肽序列内。在pFV02载体的两个酶切位点(PvuII位点和SpeI位点，下划线标记)之间，插入了一段带有终止密码子(粗体标记)的序列(如下所示)，这段序列会被简并寡聚核苷酸序列替换。

cag ctg agc tta aga gct gag gac act gcc gtc tat tat tgc gcg cgt tgggga ggg gac ggc ttc tat gct atg gac taa cgt cac gtc tga aca cta gtc

应当指出，pFV02是本发明所有过滤载体的母载体，从中可以演化出许多带有不同酶切位点以及不同插入片段的载体，这些衍生的载体同样落入本发明的保护范围之内。

在本发明的另一个方面，提供了本发明所述的过滤载体或方法在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的简并寡聚核苷酸的(长度)正确率中的应用。另一方面，本发明的过滤载体还可以排除包含终止密码子的简并寡聚核苷酸，由此提高基因表达和文库构建的质量。

过滤载体pFV02的DNA序列

tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccaggcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaacaggagggacatctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcacccgacgcactttgcgccgaataaatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcatctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcacccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaaagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacacta gaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacaggcgcgccttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgcgaacctccacccgaggagacggtgactagtgttctattacaccagctgaacctcacccgagtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaagcggccgctgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc

CAT氨基酸序列

MEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFLKTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSSLWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANMDNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGA

成熟TEM-1氨基酸序列

HPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

TEM-1信号肽氨基酸序列

MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA

附图说明

图1.(a)cat-1和cat-2扩增电泳图(M：DNA标记；1,2：cat-1片段，3,4：cat-2片段)；(b)cat全长基因扩增电泳图(M：DNA标记；1,2:cat全长基因)；

图2.(a)pUC19A质粒酶切鉴定图(M：DNA标记；1：pUC19质粒；2：pUC19A未酶切质粒；3：AscI单酶切；4：XbaI单酶切；5,6：AscI和XbaI双酶切)；(b)pUC19AN质粒酶切鉴定图(M1:250bp DNA标记；1,3,5,7,9,11,13:NotI单酶切；2,4,6,8,10,12,14:NotI和PstI双酶切)；

图3.(a)PCR扩增得到的片段1和2；(b)重叠PCR得到片段3的电泳图；

图4.质粒pUC19ANL的酶切鉴定图；

图5.pFV01酶切鉴定图；

图6.(a)pFV01-1质粒酶切鉴定；(b)pFV01-2的酶切鉴定；

图7.(a)片段1和片段2电泳图；(b)片段1和片段2连接得到全长片段；

图8.pFV02的酶切鉴定；

图9.供应商A提供的引物所包含的错误序列；

图10.供应商B提供的引物所包含的错误序列；

图11.供应商C提供的引物所包含的错误序列；

图12.平板实验结果(只能在氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上生长,而不能在氨苄青霉素平板上生长的菌落占5％左右，其中的质粒DNA经测序验证含有不符合阅读框或带终止密码子的简并寡聚核苷酸)；

图13.测序结果；

图14.pFV02的质粒构建流程图；和

图15.本发明优选实施方案的总体技术方案。

具体实施方案

除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。

“过滤载体”在本文中是指用于过滤出具有目标长度的寡聚核苷酸的载 体。所述载体具有复制起点，能够在宿主细胞中复制。所述载体可以包括但不限于质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、粘粒载体等等，只要其能够用于表达本发明的报告基因并在宿主中选择。

“启动子”在本文中是指RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，包括来源于动物、植物、病毒和微生物的启动子，其可以是组成型的、诱导型或组织特异型的启动子。在本发明中特别优选在大肠杆菌中使用的T7启动子。

“报告基因”在本文中是指一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其包括但不限于用于植物细胞、动物细胞和微生物细胞的那些，包括但不限于：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氢叶酸还原酶基因等。优选在本文中“报告基因”与“选择基因”可交换使用。优选“报告基因”与“选择基因”在过滤载体中作为分开的顺反子进行表达。优选所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、氨基酸合成基因和它们的组合，更优选选自抗生素抗性基因，最优选所述报告基因是β内酰胺酶(TEM-1)或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因。

“移码突变”在本文中特别是指待检测的寡核苷酸插入过滤载体后，由于插入的寡核苷酸的碱基数目的原因(例如为非3的倍数，即非目标长度)，造成该点之后的报告基因编码蛋白(报告蛋白)的三联体密码子阅读框发生改变，从而使该基因编码序列产生移位错误的改变，导致非功能性报告蛋白。

“寡核苷酸”在本文中是指短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸，优选为DNA序列)，其长度优选为200个碱基以下，更优选为150、140、130、120、110或100个碱基以下，更优选为90、80、70、60、50、40、30、20或10个碱基以下。在本发明的一个实施方案中，所述“寡核苷酸”是简并寡聚核苷酸，优选这些简并寡聚核苷酸在两端6-100个，例如10-90个、20-80个、30-70个、40-60个、50个 碱基是保持不变的并且含有酶切位点，而寡核苷酸的中间部分具有简并碱基。

“信号肽”在本文中是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度通常为5-30个氨基酸)肽链。外源蛋白在宿主菌，如大肠杆菌中的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体)，少数为细胞外分泌表达。利用信号肽来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间，提高可溶性，可避免因包涵体复性带来的困难。本发明采用的信号肽来自表达系统自身的信号序列或外源信号序列，或两者兼而有之。本发明的信号肽包括但不限于本领域已知的适合于在原核表达系统，如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等，和在真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中使用的信号肽。

“连接肽”在本文中是指连接报告基因编码蛋白(报告蛋白)和信号肽的接头序列(linker)。适当的连接肽(如Gly4Ser1)及其选择和优化是本领域技术人员通过常规实验能够确定的。

“宿主细胞”在本文中是指被过滤载体转化用于表达报告基因/选择基因而筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的细胞，包括但不限于原核细胞(如大肠杆菌)、真核细胞(如酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞，优选大肠杆菌。

在本发明的一个优选实施方案中，在没有插入外源寡核苷酸(例如简并寡核苷酸)时，本发明的过滤载体能够在宿主细胞中复制并且能够通过表达选择基因进行选择，以区分于不含过滤载体的宿主，同时，由于信号肽编码基因和报告基因之间的序列(优选在用于插入外源寡聚核苷酸(例如简并寡核苷酸)的酶切位点之间)包含终止子密码子，因此此时报告基因不能够被表达。当将寡核苷酸(例如简并寡核苷酸)插入本发明的过滤载体的位于启动子与报告基因之间的酶切位点时，所述终止密码子被替换，并且当插入的寡核苷酸的长度为目标长度时(即使得其上游的信号肽编码基因和下游的报告基因的相对位置符合两者的阅读框)且不包含终止密码子时，报告基因得以正确表达，由此通过报告基因表达的报告蛋白的功能可以选择具有目标长度(例如为3的倍数)且不包含终止密码子的寡核苷酸。

在一个优选实施方案中，本发明的总体技术方案参见图15所示流程 图。

现在，将参考下述附图，通过实施例，进一步描述本发明。

实施例1.过滤载体pFV02的构建

除非另外注明，构建过程中所有引物都由苏州金唯智生物科技有限公司合成和提供。

1)扩增CAT基因

用重叠PCR的方法从pACYC184质粒(NEB，#VKNO287)模板中扩增CAT基因，并突变掉其中的BspEI酶切位点。

重叠PCR扩增过程

第一步:以pACYC184质粒为模板，引物对为catF1和cat R1(苏州金唯智生物科技有限公司)，PCR扩增得到片段cat-1(长度560bp)(图1，(a))。

第二步:以pACYC184质粒为模板，引物对为catF 2和catR 2，PCR扩增得到片段cat-2(长度499bp)(图1,(a))。

第三步:以上述片段cat-1和cat-2为模板，引物对为catF1和catR 2，PCR扩增得到全长cat基因(图1,(b))。

2)在pUC19质粒(NEB，#N3041S/L GenBank#L09137)的β-内酰胺酶(TEM-1)基因两端插入AscI和NotI限制性内切酶位点，得到载体pUC19AN。这两个不常见的内切酶位点使β-内酰胺酶(TEM-1)基因的改造变得非常简便。

以pUC19质粒为模板,通过扩环突变首先插入AscI位点,得到质粒pUC19A；接着插入NotI位点,得到质粒pUC19AN。

第一部分：在pUC19质粒的β-内酰胺酶(TEM-1)基因一端插入AscI位点

第一步:以pUC19质粒为模板,引物对为amp_ascF和amp_ascR.

第二步：PCR产物用DpnI内切酶(NEB，#R0176V，500U)在37℃消化2小时。

第三步：消化后的PCR产物转化DH5α菌株(Life Technologies #18265-017)，铺在LB+氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)平板上，在37℃ 过夜静止培养。

第四步：挑取过夜单克隆，接种液体LB培养基，过夜培养，提取质粒。

第五步：质粒用XbaI(NEB，#R0145V)和AscI(NEB，#R0558V，250U)双酶切鉴定,因为XbaI位点在pUC19上是唯一的，而AscI位点是突变后引入的位点。正确的质粒经双酶切后应该出现两个片段：1.2kb和1.5kb左右的片段。得到的质粒命名为pUC19A(图2，(a))。

第二部分：在pUC19A质粒的β-内酰胺酶(TEM-1)基因另一端插入NotI位点,得到载体pUC19AN。

重复第一部分的第一步到第五步，区别是模板为上述构建的pUC19A质粒，引物对是amp_notF和amp_notR。扩环突变后得到带有AscI和NotI酶切位点的载体pUC19AN。因为PstI(NEB，#R0140V)位点在pUC19AN上是唯一的，而NotI(NEB，#R0189S)位点是突变后引入的位点。正确的质粒经双酶切后应该出现两个片段：0.6kb和2.1kb左右的片段。酶切鉴定结果正确(图2，(b))。

3)在β-内酰胺酶(TEM-1)成熟肽和信号肽之间插入酶切位点及连接肽，构建质粒pUC19ANL。

用重叠PCR的方法,以pUC19质粒为模板，引物对为amp_ascF和linker_R；amp_notR和linker_F:

第一步：以pUC19为模板，引物对为amp_ascF和linker_R,PCR扩增得到片段1(图3，(a))；以pUC19为模板，引物对为amp_notR和linker_F，PCR扩增得到片段2(图3,(a))；

第二步：以片段1和片段2为模板，引物对为amp_ascF和amp_notR，重叠PCR扩增得到全长片段3(图3,(b))。

第三步：纯化后的片段3和载体pUC19AN用内切酶AscI和NotI双酶切,酶切后的载体和片段经过胶回收后用T4DNA连接酶进行连接。

第四步：将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，涂布在LB+氨苄青霉素(Ampicillin,终浓度50μg/ml)平板上，在37℃过夜静止培养。

第五步：挑取过夜单克隆，接种液体LB培养基，过夜培养，提取质粒pUC19ANL.酶切鉴定结果正确(图4)。

4)将以上扩增的CAT基因插入到上述构建的pUC19ANL质粒中，得到过滤载体pFV01。

为了方便实验操作,有必要减少过滤载体的长度，因此pUC19ANL中的乳糖操纵子序列被删除。

第一步：用内切酶PvuII酶切质粒pUC19ANL，胶回收其中的长片段，然后用去磷酸化酶(FastAP)(Fermentas,#EF0652)处理；75℃5分钟灭活FastAP后，胶回收载体片段。

第二步：将CAT基因和去磷酸化的载体片段用T4DNA连接酶(Fermentas,#EL0014)在室温连接4小时,把连接产物转化到DH5α菌株，涂布在LB+氨苄青霉素(Ampicillin,终浓度50μg/ml)+氯霉素(Chloramphenicol,终浓度34μg/ml)平板上，在37℃过夜静止培养.

第三步:挑取单菌落，提取质粒并进行酶切鉴定(图5)。将酶切图谱正确的质粒进行测序分析

5)通过定点突变的方法去除pFV01载体CAT基因内的两个PvuII酶切位点，得到的质粒为pFV01-2。

按照后附的基因定点突变操作步骤，去除第一个PvuII位点所用模板为pFV01，引物对为Pvum1_F和Pvum1_R。得到的质粒命名为pFV01-1(图6,(a))。

按照后附的基因定点突变操作步骤，去除第二个PvuII位点所用模板为pFV01-1，引物对为Pvum2_F和Pvum2_R。得到的质粒命名为pFV01-2(图6,(b))。

6)在pFV01-02载体的β-内酰胺酶(TEM-1)成熟肽和信号肽间插入SpeI和PvuII酶切位点以及连接序列,得到质粒pFV02

第一步：以pFV01为模板，引物对为amp_ascF和insert_R，PCR扩增得到片段1(图7，(a))；

第二步：以pFV01为模板，引物对为insert_f和amp_not R，PCR扩增得到片段2(图7，(a))；

第三步：以片段1和片段2为模板，引物对为amp_ascF和amp_not R，PCR扩增得到全长片段3(图7，(b))；

第四步:用AscI和NotI分别双酶切全长片段3和pFV01-2,酶切后的 pFV01-2和片段3经过胶回收后用T4DNA连接酶进行连接。

第五步：将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，涂布在LB+氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)平板上，在37℃过夜静止培养。

第六步：挑取过夜单克隆，接种液体LB培养基，过夜培养，提取质粒。酶切鉴定并且测序验证，结果正确(图8)。

pFV02的质粒构建流程图总结在图14中。

基因定点突变操作步骤：

第一步:以特定质粒为模板,用设计的引物对进行PCR扩增.通常PCR程序为95℃(30秒)[95℃(30秒)，55℃(1分)，68℃(1分钟每kb)]，循环25次。

第二步：PCR产物用DpnI内切酶在37℃消化2小时。

第三步：消化后的PCR产物转化DH5a菌株，铺在LB+氨苄青霉素(Ampicillin,终浓度100μg/ml)平板上，在37℃过夜静止培养。

第四步：挑取过夜单克隆，接种液体LB培养基加氨苄青霉素(Ampicillin,终浓度100μg/ml)，过夜培养，提取质粒。

第五步：质粒用合适的双酶切鉴定。

构建过滤载体过程中使用的引物列表：

catF1:GCGCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTG

catR1:CATACGGAATTCCGGGTGAGCATTCATCAG

catF2:CTGATGAATGCTCACCCGGAATTCCGTATG

catR2:GCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCC

amp_ascF：CTTGGTCTGACAGGCGCGCCTTACCAATGCTTAATC

amp_ascR：GATTAAGCATTGGTAAGGCGCGCCTGTCAGACCAAG

amp_notF:GGATACATATTTGAAGCGGCCGCTGTATTTAGAAAAATAAAC

amp_notR：GTTTATTTTTCTAAATACAGCGGCCGCTTCAAATATGTATCC

linker_R:CACTCGGGTGATATCGGTACCGGTGGAGGTTCGCACCCAGAAACGCTG

linker_F:CGAACCTCCACCGGTACCGATATCACCCGAGTGAGCAAAAACAGGAAG

Pvum1_F：ACAGGAGGGACATCTGATAGAAACAG

Pvum1_R：CTGTTTCTATCAGATGTCCCTCCTGT

Pvum2_F：CCAGACCGTTCACCTGGATATTACGG

Pvum2_R：CCGTAATATCCAGGTGAACGGTCTGG

insert_R:

GAGGTTCAGCTGGTGTAATAGAACACTAGTCACCGTCTCCTCGGGTGGAGGTTCGCACCCAGAAAC

insert_f:

CGAGGAGACGGTGACTAGTGTTCTATTACACCAGCTGAACCTCACCCGAGTGAGCAAAAACAGGAAG

实施例2.利用过滤载体进行简并寡聚核苷酸的质量检测及质量提高

一般流程：

第一步：把单链的简并寡聚核苷酸通过PCR转换成双链DNA片段,所需引物根据简并寡聚核苷酸的序列而变化,双链DNA片段经过酶切后连接到pFV02过滤载体中。

第二步:把连接产物转化到感受态细菌株DH5α，涂布在带氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)和/或氯霉素(34μg/ml)的LB平板上。

第三步：当进行简并寡聚核苷酸的质量检测时,随机挑选一定数目的(通常是12个)生长在LB+氯霉素(注：不含氨苄青霉素)平板上的菌落,在37℃过夜培养后，提取质粒DNA进行测序。

第四步：收集生长在带氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)和氯霉素34μg/ml)的LB平板上的所有菌落，菌落总数应该超过设计的简并寡聚核苷酸理论多样性的十倍，然后从中提取质粒DNA。这些DNA中包含的寡聚核苷酸已去除掉不符合阅读框(out-of-frame)的部分，因而质量得到了提高。质量提高了的寡聚核苷酸保留在质粒里,文库构建时从相应的质粒里通过PCR扩增得到，由此提高了文库构建的质量和效率。

简并引物设计所用核苷酸代码

代码	表示	互补
			A	腺嘌呤	T
G	鸟嘌呤	C

C	胞嘧啶	G
			T	胸腺嘧啶	A
Y	嘧啶(C或T)	R
			R	嘌呤(A或G)	Y
W	弱(A或T)	W
			S	强(G或C)	S
K	酮式(T或G)	M
			M	氨基(C或A)	K
D	A,G,T(非C)	H
			V	A,C,G(非T)	B
H	A,C,T(非G)	D
			B	C,G,T(非A)	V
X/N	任何碱基	X/N
			-	间隙(Gap)	-

质量检测实例1

我们对供应商A提供的简并寡聚核苷酸(目标序列为YW1001和YW1022，见图9)进行质量检测，根据上述流程，我们从LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上随机挑选了12个菌落，提取DNA进行测序。我们发现，供应商A提供的寡聚核苷酸序列YW1001序列有11个是正确的，一个错误是因缺失一个碱基(N-1)而引起的(图9)；而序列YW1022有11个是正确的，一个错误是因增加一个碱基(N+1)而引起的(图9)。通过更多的序列分析，我们发现供应商A提供的简并寡聚核苷酸的平均错误率为8.3％。

注：在本申请质量检测实例1-3和质量提高实例4中所用的扩增简并寡聚核苷酸的引物是相同的。

扩增引物对序列为

F-Primer：

GAACAGCAGCTGAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCCG

R-Primer：GAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACCCC

PCR反应的组分为

PCR程序为96℃(5分)[96℃(15秒)，60℃(15秒)，72℃(7秒)]，循环14次。为了减少PCR引入的突变，我们把PCR的循环次数控制在14次。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶回收，用PvuII和SpeI双酶切，再通过1％琼脂糖凝胶回收后，连接到用PvuII和SpeI双酶切后的pFV02过滤载体骨架中。

质量检测实例2

我们对供应商B提供的简并寡聚核苷酸(目标序列为YW1014，见图10)进行质量检测,根据上述流程，我们从LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上随机挑选了12个菌落，提取DNA进行测序。我们发现，供应商B提供的寡聚核苷酸序列YW1014序列有8个是正确的，一个错误是因增加一个碱基(N+1)而引起的(图10)。而其它3个错误则是由于单碱基突变引起的。供应商B提供的另外4条简并寡聚核苷酸没有任何错误。

质量检测实例3

我们对供应商C提供的简并寡聚核苷酸(目标序列为YW1001,YW1003,YW1004和YW1007H，见图11)进行质量检测,根据上述流程，我们从LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上随机挑选了12个菌落，提取DNA进行测序。我们发现，供应商C提供的寡聚核苷酸序列YW1001序列有10个是正确的，一个错误是因缺失一个碱基(N-1)而引起的(图11)， 而另一个错误是因增加一个碱基(N+1)而引起的(图11)。而序列YW1003有9个是正确的，三个错误都是因缺失一个碱基(N-1)而引起的，但缺失的位置并不相同。序列YW1004有10个是正确的，两个错误都是因缺失一个碱基(N-1)而引起的，但缺失的位置并不相同。序列YW1007H有10个是正确的，两个错误都是因缺失一个碱基(N-1)而引起的，但缺失的位置并不相同。通过更多的序列分析，我们发现，供应商C提供的几乎每一条简并寡聚核苷酸都有错误,平均错误率为23.8％,显著高于供应商A或供应商B的错误率。

质量提高实例-过滤载体提高了简并寡聚核苷酸的正确率，从而提高了组装成的基因文库的正确率。

设计的简并寡核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如附图13所示。

将供应商合成的简并寡核苷酸序列使用本发明的过滤载体根据上述流程进行筛选。我们把生长在LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上的菌落同时划线到LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板和LB+氨苄青霉素平板上(图12)。我们观察到，绝大多数的菌落在两种抗生素平板上都能生长，说明其中的简并寡聚核苷酸是符合阅读框(in-frame)的，对其中的一些菌落测序后证明所含的DNA序列正确。然而有5％左右的菌落只能在LB+氯霉素(不含氨苄青霉素)平板上生长，不能在LB+氨苄青霉素平板上生长，说明其中的简并寡聚核苷酸是不符合阅读框(out-of-frame)或含有终止密码子的,导致连接在下游的β-内酰胺酶基因不能正确翻译，因而不具备氨苄青霉素抗性。我们挑选了这类菌落，提取DNA进行测序。结果表明，其中的简并寡聚核苷酸缺失一个碱基(N-1)所占比例最大(例子见图13),其中也有少数因为碱基突变而引入的终止密码子(图13)。

上述结果表明,含有设计的正确序列(即具有目标长度且不具有内部终止密码子)的细菌能够在氨苄青霉素平板上生长,而含有错误序列的细菌则不能在氨苄青霉素平板上生长,因此,如果我们收集生长在氨苄青霉素平板上的细菌菌落并提取质粒DNA,它们就已经过滤掉了错误的序列,而只留下预期的正确的序列。我们再通过PCR反应把这些正确的序列扩增后用于下游的基因合成或者基因文库的构建，由此大大提高了基因合成 或基因文库的效率和质量。

通过本发明的过滤载体及相应的技术流程,我们对化学合成的数千条简并寡聚核苷酸序列进行过滤纯化,并利用这些已经过滤的简并寡聚核苷酸作为基本组分构建多种复杂的基因文库。通过大量的基因测序验证,我们构建的文库的正确率得到了极大地提高，通常都能达到90％以上。而使用没有经过过滤的简并寡聚核苷酸构建的类似的基因文库的正确率通常只有50％左右。因此，我们发明的过滤载体以及相应的流程对高质量的基因文库的构建是至关重要的。

Claims (16)

1.一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变，其中所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸用于构建基因文库，其中所述过滤载体是pFV02，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

2.一种构建过滤载体pFV02的方法，所述pFV02的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，所述方法包括以下步骤：

1)扩增氯霉素乙酰基转移酶基因；

2)在pUC19质粒的β-内酰胺酶基因两端插入AscI和NotI限制性内切酶位点，得到载体pUC19AN；

3)在β-内酰胺酶成熟肽和信号肽之间插入酶切位点及连接肽，构建质粒pUC19ANL；

4)将氯霉素乙酰基转移酶基因插入到上述构建的pUC19ANL质粒中，得到过滤载体pFV01；

5)通过定点突变的方法去除pFV01载体CAT基因内的两个PvuII酶切位点，得到的质粒为pFV01-2；和

6)在pFV01-02载体的β-内酰胺酶成熟肽和信号肽间插入SpeI和PvuII酶切位点以及连接序列,得到质粒pFV02。

3.一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

1)设计并构建过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变，其中所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，其用于构建基因文库；

2)将待检测的寡聚核苷酸通过PCR转换成双链DNA片段；

3)双链DNA片段经酶切后连接到步骤1)中所述的过滤载体中；

4)将连接产物转化到宿主细胞中；

5)通过所述报告基因筛选具有目标长度的寡聚核苷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述过滤载体在所述启动子和所述酶切位点之间还包括信号肽编码基因，所述信号肽为所述报告基因编码的报告蛋白的信号肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述信号肽编码基因和所述报告基因之间包括连接肽编码序列，所述连接肽在插入所述寡聚核苷酸的酶切位点之前。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述启动子与报告基因之间具有至少两个酶切位点，在这至少两个酶切位点之间包含终止密码子。

7.根据权利要求6所述的，其中所述信号肽编码基因和所述报告基因处于所述启动子的控制之下并且两者的相对位置符合两者的阅读框。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述过滤载体还任选地包括选择基因，所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、氨基酸合成基因和它们的组合，并且通过所述报告基因和/或选择基因和/或其组合筛选具有目标长度的寡聚核苷酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述报告基因是β内酰胺酶或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素乙酰基转移酶基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述过滤载体是质粒载体，所述β内酰胺酶的成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述氯霉素乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。

11.根据权利要求5所述的方法，其中所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述连接肽的编码序列如SEQ ID No:4所示。

12.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述启动子与报告基因之间具有插入所述寡聚核苷酸的酶切位点PvuII位点和SpeI位点，在PvuII位点和SpeI位点之间包括终止密码子taa、tag和tga中的一个或多个，PvuII位点和SpeI位点之间的序列如SEQ ID No:5所示。

13.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其中所述简并寡聚核苷酸的两端分别具有PCR引物引入的酶切位点，该酶切位点与位于所述过滤载体的启动子与报告基因之间的酶切位点相匹配以将所述简并寡聚核苷酸插入所述过滤载体的所述酶切位点之间。

14.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其中所述简并寡聚核苷酸的两端分别具有PCR引物引入的酶切位点，该酶切位点与所述过滤载体的该酶切位点相同。

15.根据权利要求3所述的方法，其中所述载体是pFV02，所述pFV02的核苷酸序列如SEQID No:6所示，并且所述宿主细胞是大肠杆菌。

16.根据权利要求1所述的过滤载体、根据权利要求2所述的方法构建的过滤载体或根据权利要求3-15中任一项所述的方法在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的简并寡聚核苷酸的长度正确率中的应用。

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