CN111386126B - 真核细胞系 - Google Patents

真核细胞系 Download PDF

Info

Publication number
CN111386126B
CN111386126B CN201880069487.5A CN201880069487A CN111386126B CN 111386126 B CN111386126 B CN 111386126B CN 201880069487 A CN201880069487 A CN 201880069487A CN 111386126 B CN111386126 B CN 111386126B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell line
cells
gene
cell
viral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880069487.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111386126A (zh
Inventor
斯特凡诺·科洛卡
阿尔弗雷多·尼科西亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nouscom AG
Original Assignee
Nouscom AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nouscom AG filed Critical Nouscom AG
Publication of CN111386126A publication Critical patent/CN111386126A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111386126B publication Critical patent/CN111386126B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞系、所述细胞系的用途以及使用所述细胞系制备感染性病毒颗粒的方法。

Description

真核细胞系
本发明涉及细胞系、所述细胞系的用途以及使用所述细胞系制备感染性病毒颗粒的方法。
发明背景
需要新型疫苗来预防或治疗诸如HIV、丙型肝炎、疟疾、结核病和癌症等疾病。临床前和临床证据支持T细胞免疫，尤其是CD8+T细胞在清除这些疾病中的作用。诱导针对特定抗原的CD8+T细胞应答的一种方法是通过基因递送在细胞内表达该抗原和合适的病原体衍生的先天激活因子；基因疫苗或基于基因的疫苗采用生理抗原加工和I类主要组织相容性复合物(MHC)来激活CD8+T细胞应答。复制缺陷型腺病毒载体已通过用表达盒替换抗原的必需E1区而广泛用于基因疫苗。腺病毒载体作为基因递送系统是有吸引力的，因为它们即感染复制细胞也感染非复制细胞，具有广泛的组织趋向性，在可用的包装细胞系中非常有效地繁殖，并且具有可扩展且可负担的生产过程。实际上，在动物模型和人类临床试验中，基于腺病毒的载体比基于痘病毒、慢病毒、α病毒和裸露的DNA的其他遗传疫苗载体能诱导更有效的抗原特异性CD8+T细胞。然而，腺病毒载体作为基因疫苗载体的成功开发最终将不仅取决于它们的免疫效力，而且取决于可扩展和可再现的生产过程中细胞底物的可用性。腺病毒载体能够表达高水平的抗原蛋白，它们不仅在体内靶组织中递送，而且在补体细胞系(complementing cell line)的生产过程中递送。在当前的载体系统中，转基因表达是由强大的人巨细胞病毒即/早期启动子(HCMV启动子，human cytomegalovirus immediate/early promoter)驱动的，在载体生产过程中该启动子不仅在靶组织中而且在包装细胞系中均可以高水平表达。一些证据表明，包装细胞系中的高转基因表达可以干扰腺病毒的复制。在我们对腺病毒载体拯救和繁殖的广泛经验中，已经观察到转基因过表达对病毒复制的有害影响，从降低的载体产量到完全抑制复制。另外，通过选择重排的载体种类，对载体复制的干扰可能导致载体本身的遗传不稳定性。
在生产过程中能够抑制腺病毒载体携带的转基因表达的细胞系的开发可以防止转基因过表达的负面影响。因此，该系统是基于表达高水平TetR的细胞系，并且是通过携带在人类巨细胞病毒启动子或其他强启动子的控制下的转基因的腺病毒载体，其他强启动子如CASI启动子、CAG启动子、EF1α启动子，其具有两个或多于两个拷贝的插入启动子TATA框的下游的TetR结合位点。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种细胞系，其中四环素阻遏物(Tet-R)在细胞或部分细胞启动子的控制下表达。
在第二方面，本发明涉及根据本发明第一方面的细胞系在制备感染性病毒颗粒中的用途。
在第三方面，本发明涉及一种生产感染性病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(i)使本发明的第一方面的细胞系的细胞生长，所述细胞还包含在不存在
四环素或四环素类似物的情况下能够体外组装成感染性病毒颗粒的病毒
基因组；或
(ii)用病毒载体，优选腺病毒载体感染本发明第一方面的细胞系的细胞；
和
(iii)回收病毒颗粒。
附图说明
在下文中，描述了本说明书中包括的附图的内容。在此上下文中，还请参考上面和/或下面的本发明的详细描述。
图1：pneo/CAG-TetR图。Pneo/CAG-TetR包含四环素阻遏物和G418抗性基因的表达盒。
图2：SeAP在克隆M9和M38中的表达。将克隆接种在培养瓶T25中，并在存在或不存在四环素的情况下以moi 30(感染复数)使其感染ChAdETetOSeap。然后通过计算有和没有四环素的情况下感染后48小时的比率，获得每个单个克隆的得分。克隆M9显示最佳比率+/-tet。
图3：在M9、M38和Hek293细胞中产生AdTetO E1E2p7。使M9、M38和HEK 293以moi100(感染复数)感染AdTetOE1/F78E2p7(没有TetR介导的表达控制不能生长的腺病毒载体)。克隆M9和M38显示出最佳的产量值。
图4：TetR蛋白在M9和M38细胞中的表达。通过使用TetR抗体对克隆M9和M38的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析来评估TetR表达。TetR在M9和M38细胞中均高水平表达。
图5：在M9细胞中Ch9载体的拯救效率。与HEK-293相比，在M9细胞中评估了C类和E类腺病毒载体(ChAdN13 TPA4-T1Poly(图5A)和ChAdE egfp(图5B))的拯救效率。用前腺病毒(preAd)质粒DNA平行转染M9和HEK293细胞的单层细胞。转染后12天基于细胞裂解液通过QPCR评估病毒的产生。结果表明，转染后在M9细胞中产生腺病毒载体的效率更高。
图6：ChAd C-Venus和ChAd E-EGFP载体的产量。与HEK 293和293T细胞相比，评估了黑猩猩腺病毒载体ChAd C-Venus(图6A)和ChAd E-EGFP(图6B)在M9细胞中的产量。使用相同的ChAd感染复数感染细胞单层。感染后72小时收获细胞，并通过QPCR评估粗裂解物中的载体效价。结果表示为细胞特异性的产量。
图7：通过FACS分析评估M9和T-Rex细胞中的转录控制。将细胞系接种在T25培养瓶中，并用ChAd C TetO-VENUS以moi＝100vp/细胞(感染复数)对其进行感染。在单细胞水平上足够量的TetR的表达会关闭venus报告基因的表达。3.8％的M9细胞显示出可检测到的荧光信号，而T-Rex细胞为26％。已证明M9细胞系能够控制96.2％的细胞中的基因表达，而74％的T-Rex细胞有效地控制了表达。
图8：M9(图8A)和T-Rex(图8B)细胞系中的ChAd载体产量。分析是在接种于T培养瓶中的细胞中进行的(T25培养瓶中在10ml培养基中接种了5E6个细胞)。用ChAd-C TetO-VENUS以100vp/细胞的感染复数感染细胞单层。当通过显微镜观察(感染后7天)观察到完全的CPE时，收获细胞。通过QPCR方法用HCMV启动子DNA序列的经设计的探针和引物测定载体的产量。
图9：腺病毒载体和表达盒的图。腺病毒载体携带带有TetO的HCMV启动子，且表达盒包含TetO序列。
图10：将CAG启动子驱动的TetR表达与HCMV驱动的表达相比。HCMV-TetR 293细胞首先是通过在HEK 293细胞中转染HCMV-TetR表达载体而开发的。通过G418选择来分离表达TetR的克隆并进行扩增。在40代和60代通过蛋白质印迹检测TetR的表达，并与60代M9细胞中的TetR的表达进行比较。从3E+06细胞中提取总细胞蛋白，在SDS-PAGE上分离，转移至膜上并用抗TetR抗体探测(抗体稀释度：1:1000，在4℃孵育12小时)。结果表明，由HCMV启动子驱动的TetR表达在细胞培养传代过程中逐渐丢失，而由CAG启动子驱动的TetR表达则经过传代(p60)后保持不变。
图11：通过表观遗传机制的HCMV启动子沉默。HCMV-TetR细胞系中观察到的TetR表达逐渐丢失可以通过将细胞暴露于HDAC抑制剂(Belinostat)来恢复。在200nM的Belinostat(PXD101-HDAC抑制剂)存在下培养HCMV TetR细胞，然后收获细胞，通过蛋白质印迹评估TetR表达。但是，人CMV启动子的重新激活是短暂的，在没有Belinostat的情况下，TetR的表达再次丢失。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们是可变化的。还应理解的是，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地，本文所用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Klbl,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述进行定义。
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。在以下段落中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何一个或多个其他方面组合，除非明确地相反地指出。特别地，指示为可选、优选或有利的任何特征可以与指示为可选、优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
在本说明书的全文中引用了一些文件。本文所引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这种公开。本文引用的一些文档的特征是“通过引用合并”。在这种结合的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间发生冲突的情况下，以本说明书的文本为准。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定的实施方案一起列出。然而，应当理解的是，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建另外的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应认为本申请说明书中公开了本申请中所有描述的要素的任何排列和组合。
定义
在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。在说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下分别具有定义的含义和优选的含义。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，要素前不使用数量词包括复数个对象，除非内容另外明确指出。
在本发明的上下文中使用术语“表达基因”或“表达蛋白质”是指mRNA转录并随后将mRNA翻译成编码的蛋白质的过程。可以在mRNA和/或蛋白质的水平上测量表达水平。如果以mRNA的水平测量，则mRNA的量至少定性地指示细胞中存在的蛋白质的量。在大多数情况下，所有的mRNA都将被翻译成蛋白质，因此对mRNA量的测量可以对新产生的蛋白质的量进行定量。蛋白质的量可以通过许多本领域已知的方法确定，包括用与蛋白质特异性结合的抗体标记。技术人员知道在单细胞的基础上定性和/或定量检测基因表达的几种方法。这些方法包括FISH、细胞内染色(ICS)和单细胞RNA测序。
在本发明的上下文中使用的术语“突变”是指核苷酸或氨基酸分别与核酸序列中的另一个核苷酸和氨基酸序列中的氨基酸交换。在本发明的上下文中使用的术语“缺失”是指分别从核酸序列中去除核苷酸和从氨基酸序列中去除氨基酸。在本发明的上下文中使用的术语“插入”是指将核苷酸添加到核酸序列上和将氨基酸添加到氨基酸序列上。替换也可以看作是插入和缺失的连续过程，反之亦然。在本发明的上下文中，术语取代用于核酸序列或氨基酸序列的改变，其不改变核酸序列的核苷酸数目或氨基酸序列中的氨基酸数目。
在本发明的上下文中使用的术语“永生”或“永生化”是指细胞无限期分裂的特性。永生化的细胞将成长为也称为“细胞系”的细胞群。优选地，这样的细胞系包含或组成为分离的细胞。优选地，这样的细胞系将不会老化。优选地，它在细胞培养条件下也不会进入凋亡。虽然细胞系通常是克隆来源的，即所有细胞都是一个转化细胞的后代，但是通常在细胞系中存在异质性。这是由于在有丝分裂期间可能发生染色体重排、染色体重复或不正确的染色体分离。这种事件在转化细胞中更为常见。术语“转化的”是指细胞系的附加性质，即除无限生长之外的性质。这些性质是与肿瘤细胞相关的一种或多于一种，包括不依赖锚定的生长、失去接触抑制、侵袭性和多倍性。优选地，转化的细胞系被腺病毒或腺病毒颗粒转化。
术语“细胞系”是指在一种或多于一种性质上表现出异质性的细胞系。通常，在细胞系细胞的随后有丝分裂周期中，异质性不会改变或根本不改变。细胞系可能是异质的特定性质是给定转基因，优选Tet-R的表达和/或倍性。
在本发明的上下文中使用术语“Tet-R”是指四环素阻遏物。
术语“TRE”和“TetO”用于表示Tet-R特异性结合的DNA元件。优选地，TetO序列是SEQ ID NO：3的核苷酸序列(TCCCTATCAGTGATAGAGA)。
如果将TetO以多个拷贝插入到基因的基础启动子中或附近，则Tet-R可以充当该基础启动子的转录阻遏物。为了使Tet-R结合的作用最大化，通常期望在一个启动子中连续包含两个或多于两个TetO。优选地，将两个、三个、四个、五个、六个至至少7个拷贝的TetO连续地包含在一个启动子中。
在本发明的上下文中使用术语“异源基因”是指非天然存在的、或从其天然环境中取出并插入到其天然存在于基因组中的不同位置、或插入另一个生物或基因组中。例如，插入到腺病毒基因组中的编码肿瘤抗原的人基因与腺病毒基因组是异源的。
在本发明的上下文中使用术语“毒性”是指化合物抑制细胞系增殖的活性。取决于可以完成抑制作用的化合物和浓度，即单独的细胞停止生长、或进入凋亡状态。
在本发明的上下文中使用术语“病毒颗粒”是指包含核酸序列的病毒，优选重组病毒或病毒体。该核酸序列可以是完整或部分病毒基因组。在后一种情况下，病毒基因组优选包含异源基因。对于某些病毒颗粒，仅需要病毒基因组的非常短的序列就可以组装病毒或病毒体。例如，对于腺相关病毒，短的(约200bp长)重复序列位于给定长度(对于腺相关病毒，通常为4.5kB至5.3kB)的异源核酸的5'和3'端，这允许组装感染性腺相关病毒。如果病毒颗粒与细胞接触时能够将其中包含的核酸转移到细胞中的话，则它在本发明的意义上是“感染性的”。
本发明的优选细胞系是源自HEK293细胞系的，称为M9。该细胞系于2017年8月9日保藏在英格兰公共卫生部的欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，波顿唐，索尔兹伯里SP40JG，英国，登记号为17080901。该保藏基于NOUSCOM股份公司，18，巴塞尔，CH4051，瑞士的权益。该细胞系衍生自早期传代的人胚肾细胞系(智人)。
实施方案
在下文中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何一个或多个其他方面组合，除非明确地相反地指出。特别地，指示为可优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
在产生本发明的工作中，出乎意料地发现，通过根据本发明的细胞系可以实现良好的腺病毒载体产量。
在第一方面，本发明提供了一种细胞系，其中四环素阻遏物(TetR)在细胞或部分细胞启动子的控制下表达。还提供了细胞系，其中四环素阻遏物(TetR)在该细胞系的至少70％的细胞中表达。优选地，细胞系中至少75％，更优选至少80％，并且更优选至少85％，更优选至少90％并且最优选至少95％的细胞表达Tet-R。可以通过本领域已知的方法测量表达Tet-R的细胞系中细胞的百分比，所述方法包括蛋白质或mRNA的荧光染色和FACS分析。
每个细胞的基因表达水平可以通过定量聚合酶链反应(QPCR)，优选单细胞QPCR来测量。定量聚合酶链反应是本领域技术人员已知的方法。请参考Applied BiosystemsQuantStudioTM12K Flex实时PCR系统-出版号4470050，版本A，修订日期2012年3月。
在本发明的第一方面的优选实施方案中，Tet-R在表达Tet-R蛋白的细胞系的那些细胞中以至少103个蛋白质分子/细胞，优选至少104个蛋白质分子/细胞，优选至少105个蛋白质分子/细胞，优选至少106个蛋白质分子/细胞，更优选至少107个蛋白质分子/细胞，例如103个至106个、104个至105个蛋白质分子/细胞的水平表达。相应地，优选地，表达Tet-R蛋白的细胞系包含每细胞103个至106个，更优选104个至105个mRNA拷贝。
在本发明的第一方面的优选实施方案中，细胞系包含稳定地整合有编码四环素阻遏物(Tet-R)的基因的基因组。优选地，编码Tet-R的基因仅稳定地整合到表达Tet-R的细胞中。优选地，编码Tet-R的基因在细胞系的至少70％，优选75％、80％或85％的细胞中稳定整合。更优选地，细胞系内至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％的细胞包含稳定整合到其基因组中的编码Tet-R的基因。
在本发明的第一方面的优选实施方案中，Tet-R的表达随时间稳定。在本发明的上下文中，“时间”可以定义为细胞系的细胞传代的次数。其中，10次传代对应于约30天至70天，优选40天至60天，更优选约50天。在10天的时间范围内，5次传代可以但不必然对应于15天至35天，优选20天至30天，更优选25天。在10天的时间范围内，1次传代可以但不必然对应于3天至7天，优选4天至6天，更优选5天。优选地，随时间稳定是指对于至少40(或大于40)次传代、对于至少45(或大于45)次传代、对于至少50(或大于50)次传代、对于至少60(或大于60)次传代、或对于至少75(或大于75)次传代而言是稳定的。对于所有这些实施方案，表达优选在直至且包括100次传代中是稳定的。可以使用以上所给定的10天、5天和/或1天来计算这些和任何其他传代次数的对应天数。例如，40次传代对应于120天至280天，优选160天至240天，更优选为200天；45次传代对应于135天至315天，优选180天至270天，更优选225天；50次传代对应于150天至350天，优选200天至300天，更优选250天；60次传代对应于180天至420天，优选240天至360天，更优选300天；75次传代对应于225天至525天，优选300天至450天，更优选375天；100次传代对应于300天至700天，优选400天至600天，更优选500天。根据实施方案的优先级，将它们的上限与下限组合。“时间”也与传代无关地仅以天数定义。在这种情况下，将关于传代次数的以上给定的范围用作实施方案(例如，“120天至280天”是指“至少120天至280天”的实施方案，其不受任何传代次数的限制，即可以少于或大于40次传代；随后优选范围代表优选实施方案)。在本文中，“稳定”是指在传代10次至20次期间，平均表达水平的降低的增加不超过平均表达水平的50％，优选不超过25％，更优选不超过10％。在本发明的第一方面的优选实施方案中，在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下，Tet-R抑制在其启动子中包含一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的基因的转录。例如，启动子包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或多于7种TetO。
在本发明第一方面的一个优选实施方案中，Tet-R基因受组成型启动子的控制。在另一个优选的实施方案中，组成型启动子选自EF1α启动子、PGK-1启动子、泛素B启动子、β-肌动蛋白启动子、EGR1启动子、HCMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、小鼠CMV启动子、CASI启动子和CAG启动子。更优选地，Tet-R基因受CAG启动子的控制。启动子优选是细胞或部分细胞的启动子。细胞启动子优选是真核细胞的启动子。优选地，启动子是细胞启动子或部分细胞启动子。细胞启动子的实例是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鸡、特别是人启动子。“部分细胞启动子”是包含一个或多于一个细胞启动子的部分和一个或多于一个非细胞启动子的部分的杂交启动子。非细胞启动子优选是病毒启动子。细胞和非细胞部分是具有启动子活性(导致目的编码序列转录的活性)的融合体。优选的细胞启动子是EF1α启动子、PGK-1启动子、泛素B启动子、β-肌动蛋白启动子和EGR1启动子。优选的部分细胞启动子是CASI启动子(巨细胞病毒部分和鸡部分)和CAG启动子。最优选CAG启动子(在实施例的M9细胞中使用的启动子)。其包含(C)巨细胞病毒早期增强子元件，(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。
包含可以被Tet-R抑制的一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的启动子没有特别限制，例如它们可以是细胞、部分细胞、病毒或部分病毒(包含病毒启动子的部分和非病毒启动子的部分的杂交启动子)启动子。
在另一个优选的实施方案中，对编码Tet-R的基因在真核(优选哺乳动物)细胞中的表达进行密码子优化。在本文中，术语“密码子优化”是指通过用在真核(优选哺乳动物)细胞中具有高频率的密码子代替翻译成相同氨基酸的在真核(优选哺乳动物)细胞中频率较低的密码子来提高在真核(优选哺乳动物)细胞中表达的翻译效率。
在另一个优选的实施方案中，细胞系在其基因组中还包含突变、缺失或插入，该突变、缺失或插入减少或阻止选自一种或多于一种IFN基因，优选cGas和STING的刺激因子，一种或多于一种JAK/STAT转录激活因子和一种或多于一种IFN刺激基因(ISG)，优选PKR、MX1、OAS1、APOBEC3G、TRIM5、ZAP、ISG15、ADAR、IFITM1/2/3、BST2和/或RSAD2的功能蛋白的表达。
在本发明的第一实施方案的优选实施方案中，细胞系还包含编码选择标记的基因。优选地，抗性基因与编码Tet-R的基因遗传连接。在一个优选的实施方案中，编码选择标记的基因选自与编码Tet-R的基因遗传连接的G418、潮霉素B、嘌呤霉素、杀稻瘟素或吉欧霉素抗性基因。更优选地，编码选择标记的基因是与编码Tet-R的基因遗传连接的G418抗性基因。
在另一个优选的实施方案中，细胞系表达形成感染性病毒颗粒所需的至少一种病毒基因。更优选地，如果该细胞系用于生产重组腺病毒，则至少一种病毒基因是在E1区域编码的E1-A和/或E1-B。例如，E1区域可以衍生自人腺病毒或类人猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒、倭黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒。更优选地，细胞系在其基因组中包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列、或其编码相同E1-A和/或E1-B蛋白的变体。
在一个优选的实施方案中，细胞系的细胞是转化细胞。
在另一个优选的实施方案中，细胞系的细胞是人细胞。更优选地，细胞系的细胞是人胚肾细胞。
在一个优选的实施方案中，细胞系的细胞选自HEK293细胞、A549细胞、HeLa细胞、MRC5细胞、VERO细胞、DF-1细胞或SK-OV-3细胞。
在另一个优选的实施方案中，细胞系是在ECACC保藏的登记号为1708091的细胞系。
在另一个优选的实施方案中，细胞系还包含病毒基因组，其能够组装成感染性病毒颗粒并且包含受包含一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的启动子控制的至少一个异源基因。
在另一个优选的实施方案中，病毒基因组选自疱疹病毒基因组，经修饰的牛痘安卡拉病毒基因组和腺病毒基因组。更优选地，病毒基因组是腺病毒基因组。疱疹病毒基因组的一个实例是HSV-1。
在一个优选的实施方案中，异源基因是对细胞有毒性的或干扰病毒复制周期。
在另一个优选的实施方案中，异源基因选自自身抗原、病毒基因、细胞来源基因、编码与肿瘤相关的新抗原的组合的合成序列和编码新表位的序列。优选地，自身抗原选自HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA、PSMA、端粒酶、gplOO、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ES0-1、存活蛋白、溶基质蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML6S、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NYC0-5S、NY-BR-62、hKLP2和VEGF。优选地，病毒基因选自HCV E1-E2蛋白、狂犬病糖蛋白和HIV-1GP 160。优选地，细胞来源的基因选自Tim-3、Her2和E2 F-1。
本发明的第二方面提供了根据本发明的第一方面的细胞系在制备病毒颗粒中的用途。
本发明的第三方面提供了一种制备感染性病毒颗粒的方法，包括以下步骤：
(i)使本发明的第一方面的细胞系的细胞生长，所述细胞还包含在存在或
不存在四环素或四环素类似物的情况下能够体外组装成感染性病毒颗粒的病毒基因组；或
(ii)用病毒载体，优选腺病毒载体感染本发明第一方面的细胞系的细胞；
和
(iii)回收病毒颗粒。
在本发明第三实施方案的一个优选实施方案中，生长步骤(i)是在不存在四环素或四环素类似物的情况下。
本发明尤其涉及以下项目：
1.一种细胞系，其中在细胞系的至少70％的细胞中表达四环素阻遏物(Tet-R)。
2.根据项目1所述的细胞系，其中在表达Tet-R的细胞系的那些细胞中以每个细胞至少1000个mRNA拷贝或Tet-R蛋白分子的水平表达Tet-R。
3.根据项目1或2所述的细胞系，其包含稳定整合到其基因组中的编码四环素阻遏物(Tet-R)的基因。
4.根据项目1至3中任一项所述的细胞系，其中
(i)在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下，Tet-R抑制在其启动子中包含一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的基因的转录，和/或
(ii)Tet-R基因受组成型启动子的控制，优选地，组成型启动子选自EF1α启动子、PGK-1启动子、泛素B启动子、β-肌动蛋白启动子、EGR1启动子、HCMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、小鼠CMV启动子、CASI启动子和CAG启动子，更优选地，组成型启动子是CAG启动子。
5.根据项目1至4中任一项所述的细胞系，其中对编码Tet-R的基因在哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。
6.根据项目1至5中任一项所述的细胞系，在其基因组中还包含突变、缺失或插入，该突变、缺失或插入减少或阻止选自一种或多于一种IFN基因，优选cGas和STING的刺激因子、一种或多于一种JAK/STAT转录激活因子和一种或多于一种IFN刺激基因(ISG)，优选PKR、MX1、OAS1、APOBEC3G、TRIM5、ZAP、ISG15、ADAR、IFITM1/2/3、BST2和/或RSAD2的功能蛋白的表达。
7.根据项目1至6中任一项所述的细胞系，还包括编码选择标记的基因，优选与编码Tet-R的基因遗传连接的G418、潮霉素B、嘌呤霉素、杀稻瘟素或吉欧霉素抗性基因。
8.根据项目1至7中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系的细胞表达形成感染性病毒颗粒所需的至少一种病毒基因，优选其中所述至少一种病毒基因选自E1，优选包含具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因。
9.根据项目1至8中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系的细胞是人细胞，优选人胚肾细胞。
10.根据项目8或9所述的细胞系，其中所述细胞系的细胞是HEK293细胞、A549细胞、HeLa细胞、MRC5细胞、VERO细胞、DF-1细胞或SK-OV-3细胞。
11.根据项目1至10中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系在ECACC保藏，登记号为17080901。
12.根据项目1至11中任一项所述的细胞系，还包含病毒基因组，其能够组装成感染性病毒颗粒并且包含受包含一个或多于一个四环素操纵子(TetO)的启动子控制的至少一个异源基因，优选地，其中
(i)病毒基因组选自疱疹病毒基因组、经修饰的牛痘安卡拉病毒基因组和腺病毒基因组，优选地，病毒基因组是腺病毒基因组和/或
(ii)异源基因对细胞有毒性。
13.根据项目12所述的细胞系，其中异源基因选自自身抗原、病毒基因、细胞来源基因、编码与肿瘤相关的新抗原的组合的合成序列和编码新表位的序列，优选地，其中
(i)自身抗原选自HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA、PSMA、端粒酶、gplOO、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ES0-1、存活蛋白、溶基质蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML6S、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NYC0-5S、NY-BR-62、hKLP2和VEGF，
(ii)病毒基因选自HCV E1-E2蛋白、狂犬病糖蛋白和HIV-1GP 160，和/或
(iii)细胞来源的基因选自Tim-3、Her2和E2 F-1。
14.根据项目1至13中任一项所述的细胞系在制备感染性病毒颗粒中的用途。
15.一种用于制备感染性病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(i)在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下使项目12或13的细胞系的细胞在体外生长；或
(ii)用病毒载体，优选腺病毒载体感染项目1至11中任一项的细胞系的细胞；和
(iii)回收病毒颗粒。
实施例
实施例1：产生表达TetR的稳定克隆
在DMEM，10％胎牛血清中培养并扩增HEK293细胞。在第30代，将细胞接种在T-75细胞培养瓶中，并用BsaX1消化的24μg质粒pneo/CAG-TetR进行转染。Pneo/CAG-TetR包含四环素阻遏物和G418抗性基因的表达盒(图1)。转染后48小时，将HEK293细胞在补充有0.8mg/ml的G-418的完全DMEM中稀释至1:80的比例。使用标准程序挑选出对G-418具有抗性的单个分离的克隆，并转移至24孔板中。每个24孔板用于生成3个板：其中2个用于筛选单克隆，第三个保留为“母板”。在存在或不存在1μg/ml四环素的情况下，用ChAdE TetOSeap一式两份转导所有克隆。感染后48小时，根据制造商的说明，通过化学发光测定法(Phospha-Light试剂盒，Applied Biosystems，Foster City，CA)，评估上清液分泌的碱性磷酸酶表达。通过计算在四环素存在/不存在下SEAP表达的比率对克隆进行排名。该值表示对转录控制的严格性的度量：值越高，转录控制的严格性越强。还评估了最佳克隆的腺病毒载体的产量。M9克隆在通过四环素阻遏物控制表达以及支持高水平的腺病毒载体制备方面非常有效。
实施例2：通过SeAp测定评估TetR调控——比较克隆M9和M38
将M9和M38克隆一式三份接种在T25培养瓶中。当细胞单层达到80％至90％汇合(约3E+06个细胞/瓶)时，进行如下感染。吸出条件培养基并用5ml新鲜培养基代替。然后在存在或不存在四环素(1μg/ml)的情况下，使用ChAdE TetOSeap以30个颗粒/细胞(vp/细胞)的感染复数(moi)感染细胞。感染后两天通过每个培养瓶测试50μl上清液来评估SeAp表达。将每个培养瓶中收获的上清液转移到96孔板的孔中(50μl/孔)，根据制造商的说明通过化学发光测定法(Phospha-Light试剂盒，Applied Biosystems，Foster City，CA)测试碱性磷酸酶活性。该信号是通过使用Envision 2012Multilabel读值器(Perkin Elmer)获得的。通过计算在有和没有四环素的情况下获得的SeAp表达值的比率来评估转录控制的效率，如图2所示。在两个克隆中存在四环素(Tet)时，SeAp表达具有可比性，表明在没有转录控制的情况下，HCMV启动子在M9和M38细胞中均具有完全活性。相反，当培养基中不存在Tet且TetR具有活性并与启动子结合时，M9克隆中的SeAP活性要低约5倍，这表明与M38相比，HCMV启动子的抑制作用更强。
实施例3：M9和M38细胞中腺病毒载体产量的评估
将M9和M38克隆一式两份接种在T25培养瓶中。当细胞达到80％至90％汇合时，使用AdTetOE1/F78E2p7以100vp/细胞的moi感染。AdTetOE1/F78E2p7是一种携带在HEK293细胞中表达时具有毒性的基因的腺病毒载体，因此，如果没有转录控制，它就无法增殖。将平行感染的HEK293细胞作为对照。当通过显微镜观察到完全的细胞病变作用时(感染后4天)，从每个培养瓶中收获细胞和培养基，并在-80℃下冷冻。通过三个冷冻/解冻(-80℃/37℃)循环将病毒载体从感染的细胞中释放。然后，通过离心使细胞裂解物澄清。使用TaqMan报告基因淬灭剂染料化学方法(Biorad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System)，使用设计用于扩增腺病毒载体基因组中存在的人类巨细胞病毒启动子(HCMVp)的特定靶区域的引物，并使用双标记荧光探针(FAM-TAMRA)通过液滴数字聚合酶链式反应分析澄清的上清液。在粗裂解物中评估病毒产量，并以vp/细胞的单位产量表示。结果(图3)显示，与M38相比，克隆M9具有更高的产量，并且亲本HEK293细胞不能支持表达毒性基因的腺病毒载体的产生。M9细胞显示出更高的产量，与图2所示的结果一致，表明与M38相比，M9的转录控制更好。此外，HEK293细胞不能支持表达毒性基因的腺病毒载体的复制。
实施例4：TetR蛋白在M9和M38细胞中的表达
使用细胞裂解物通过蛋白质印迹法评估了克隆M9和M38中TetR的产生。从M9和M38克隆中提取细胞蛋白，并使用Bio-Rad蛋白测定法进行定量，并用牛血清白蛋白(BSA)绘制标准曲线。将45μg蛋白质提取物在含有SDS的上样缓冲液中于100℃变性，然后上样至4％至12％Bis-TrisNu凝胶上。电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并与以1：1000稀释的TetR单克隆抗体(Clontech，目录号631131)一起孵育。通过将膜与偶联有HRP的抗小鼠二抗(SIGMA，目录号A9044)稀释1：3000来显示信号。如图4所示，在M9中，TetR的表达高于在M38细胞中的表达。
实施例5：在M9细胞中ChAd载体的拯救效率
为了进一步评估M9细胞在支持腺病毒载体产生中的效率，我们测试了与亲本HEK293相比，通过DNA转染C类和E类腺病毒载体的拯救效率(ChAdN13 TPA4-T1Poly-图5A和ChAdE egfp-图5B)。按照制造商的说明，使用2000(Thermo FisherScientific目录号11668-019)，在T25培养瓶中培养M9和HEK293细胞，用10μg的preAd质粒DNA进行平行转染。转染后12天，通过QPCR评估细胞裂解物的腺病毒载体的拯救和扩增。测定中使用的引物经设计为扩增人巨细胞病毒(HCMV)启动子的特定靶区域，并且将双标记的荧光探针(FAM-TAMRA)在扩增子内杂交。结果显示在图5中，并证明在转染C种和E种腺病毒载体后，在M9细胞中产生腺病毒载体的效率更高。
实施例6：ChAd C-Venus和ChAd E-EGFP载体的产量
与亲代HEK 293和293T细胞相比，在M9细胞中评估了携带报告基因-ChAdC-Venus(图6A)和ChAdE-EGFP(图6B)的两种不同的黑猩猩腺病毒载体的产量。使用两种ChAd以相同的感染复数感染T25培养瓶中的单层细胞。感染后72小时收获细胞，此时完全细胞病变作用明显。通过三个冷冻/融冻(-80℃/37℃)循环从感染的细胞释放载体。然后通过离心使细胞裂解液澄清，并通过实时QPCR在澄清的细胞裂解液中评估载体滴度。设计所用的引物以扩增腺病毒基因组中人类巨细胞病毒(HCMV)的特定靶区域。将双标记荧光探针(FAM-TAMRA)在扩增子内杂交。结果如图6所示。
实施例7：评估在M9和T-Rex细胞中转录控制的同质性-通过FACS分析的在单个细胞水平上的Venus报道基因表达。
细胞系中转录控制的同质性是设计用于通过腺病毒载体制备方法控制表达的细胞系的重要特征。在用于制备的细胞系中单细胞水平的异质表达可能会导致在不能有效抑制转录的细胞亚群中载体重排质粒种类的选择。与表达Tet-R的可商购获得的T-Rex细胞(Invitrogen，批次编号1804535)相比，在M9细胞中评估了转录控制的同质性。将细胞接种在T25培养瓶中，并使用ChAdC-Venus以moi＝100vp/细胞进行感染。感染后两天，将细胞从培养瓶中分离，并用PBS 1X洗涤并通过离心将其回收。将细胞沉淀以1.5E+06细胞/ml的最终细胞密度重悬于含有1％甲醛、2.5mM的EDTA的PBS 1X中。将200μl细胞悬浮液(总共约3e5个细胞)转移至96孔板的孔中，并通过FACS分析。图7中报道的FACS分析结果表明，在3.8％的M9细胞系中检测到荧光信号，而26％的T-Rex细胞呈阳性。该结果表明，与T-Rex(74％)相比，M9细胞系具有更高的同质性，能够控制表达的细胞的％更高(96.2％)。
实施例8：在M9和T-Rex细胞系中ChAd载体的产量。
为了M9细胞与T-REX细胞(Invitrogen，批号1804535)中腺病毒载体的细胞特异性产量和容积产量，将细胞系接种在T25培养瓶中。使用ChAdC-Venus以100vp/细胞的moi感染接近汇合的细胞单层。当通过显微镜观察(感染后7天)到完全CPE明显时，收获细胞。然后，通过实时QPCR，使用在HCMV启动子序列上设计的引物和在扩增子内杂交的双标记荧光探针(FAM-TAMRA)，确定载体的产量。图8中的结果显示，M9细胞中的ChAdC-Venus的产量高于T-Rex中的产量。
实施例9：通过蛋白质印迹分析HCMV-TetR和M9细胞中的TetR表达。
通过在4℃下将细胞沉淀重悬于20mM TRIS-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTApH 8.0、10％Triton-X、Roche编号为11697498001的蛋白酶抑制剂混合物中持续30分钟，裂解每个样品的3E+06个细胞(见图10)。孵育后，将样品在4℃下以14000rpm离心30分钟以使其澄清。按照生产商的说明，通过Bio-Rad蛋白测定法评估总蛋白浓度，然后通过蛋白质印迹法进行分析。
在还原条件下，在4％至12％SDS-PAGE上分离45ug蛋白提取物，然后通过Dry Blot(iBlot凝胶转移系统，Invitrogen)转移到硝酸纤维素膜上。蛋白质转移后，将膜在室温下用封闭缓冲液(5％牛奶的PBS溶液-吐温0.1％)处理1小时，并在+4℃下与以1：1000稀释的抗TetR单克隆抗体(克隆9G9-Clontech目录号631132)一起孵育12小时。次日，将膜与结合HRP的兔抗小鼠IgG(SIGMA，目录号A9044)在室温下一起孵育1小时，然后，根据制造商方案，通过Pierce ECL蛋白质印迹底物(Thermo Scientific，Rockford，IL)观察。将抗微管蛋白抗体用作对照并使结果归一化。
图10所示的结果表明，由HCMV启动子驱动的TetR的表达随时间下降，并且通过样品HEK293p40-hCMV TetR与HEK293p60-hCMV TetR之间的比较表明，TetR信号明显降低。相反，由CAG启动子驱动的TetR的表达并没有随时间下降。
实施例10：通过将HEK293 p60-hCMV TetR细胞暴露于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的TetR表达的重新激活。
为了探索HCMV沉默的机制，在HDAC抑制剂存在下培养第60代的HEK293 hCMV TetR细胞。向细胞培养基中补充200nM的belinostat(PXD101)，然后在不同的时间点收获，如图11所示。如先前实施例中所示，通过蛋白质印迹评估TetR表达。结果清楚地表明，可以用belinostat将TetR表达重新激活，但对表达的影响只是短暂的。这种重新激活不适用于实际目的，因为在更长时间的暴露之后，belinostate对细胞是具有毒性的。
发明人基于该实验认为，hCMV-IE(病毒启动子)倾向于与DNA甲基化相关的转录沉默。相反，由CAG启动子(本发明最优选的部分细胞启动子)驱动的TetR表达在细胞传代中是稳定的。发明人认为，这一令人惊讶的发现是由于与细胞启动子或部分细胞启动子相比，细胞更易于沉默病毒启动子。
序列表
<110> NOUSCOM股份公司
<120> 真核细胞系
<130> 854-13 PCT
<150> EP17198339.8
<151> 2017-10-25
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4344
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480
tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540
tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600
aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660
tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720
cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780
gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840
cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900
ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960
cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020
caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080
ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140
tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200
gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260
ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320
cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380
ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440
gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500
cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560
ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620
gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680
cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740
ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800
tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860
gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920
caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980
gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040
agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100
aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160
cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220
gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280
gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340
gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400
gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460
tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520
ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580
tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640
agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700
tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760
gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820
acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880
gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940
aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000
ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060
gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120
tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180
acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240
aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300
tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360
gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420
tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480
ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540
tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600
ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660
gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720
ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780
agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840
actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900
acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960
ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020
atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080
cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140
cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200
acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260
gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320
ctttcagtag caagctgatt gcca 4344
<210> 2
<211> 4273
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaggccaata tgataatgag gtgggcgggg 60
cgaggcgggg cgggtgacgt aggacgcgcg agtagggttg ggaggtgtgg cggaagtgtg 120
gcatttgcaa gtgggaggag ctgacatgca atcttccgtc gcggaaaatg tgacgttttt 180
gatgagcgcc gcctacctcc ggaagtgcca attttcgcgc gcttttcacc ggatatcgta 240
gtaattttgg gcgggaccat gtaagatttg gccattttcg cgcgaaaagt gaaacgggga 300
agtgaaaact gaataatagg gcgttagtca tagcgcgtaa tatttaccga gggccgaggg 360
actttgaccg attacgtgga ggactcgccc aggtgttttt tacgtgaatt tccgcgttcc 420
gggtcaaagt ctccgttttt attgtcgccg tcatctgacg cggagggtat ttaaacccgc 480
tgcgctccta aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc tccgctccgt 540
ttcggcgatc gaaaaatgag acatttagcc tgcactccgg gtcttttgtc cggccgggcg 600
gcgtccgagc ttttggacgc tttgctcaat gaggttctga gcgatgattt tccgtctact 660
acccacttta gcccacctac tcttcacgaa ctgtacgatc tggatgtact ggtggatgtg 720
aacgatccca acgaggaggc ggtttctacg ttttttcccg agtctgcgct tttggctgcc 780
caggagggat ttgacctaca cactccgccg ctgcctattt tagagtctcc gctgccggag 840
cccagtggta taccttatat gcctgaactg cttcccgaag tggtagacct gacctgccac 900
gagccgggct ttccgcccag cgacgatgag ggtgagcctt ttgctttaga ctatgctgag 960
atacctgggc tcggttgcag gtcttgtgca tatcatcaga gggttaccgg agaccccgag 1020
gttaagtgtt cgctgtgcta tatgaggctg acctcttcct ttatctacag taagtttttt 1080
tgtgtaggtg ggctttttgg gtaggtgggt tttgtggcag gacaggtgta aatgttgctt 1140
gtgttttttg tacctgcagg tccggtgtcc gagccagacc cggagcccga ccgcgatccc 1200
gagccggatc ccgagcctcc tcgcaggcca aggaaattac cttccatttt gtgcaagcct 1260
aagacacctg tgaggaccag cgaggcggac agcactgact ctggcacttc tacctctcct 1320
cctgaaattc acccagtggt tcctctgggt atacatagac ctgttgctgt tagagtttgc 1380
gggcgacgcc ctgcagtaga gtgcattgag gacttgctta acgatcccga gggacctttg 1440
gacttgagca ttaaacgccc taggcaataa accccaccta agtaataaac cccacctaag 1500
taataaactt taccgccctt ggttattgag atgacgccca atgtttgctt ttgaatgact 1560
tcatgtgtat aataaaagtg agtgtggtca taggtctctt gtttgtctgg gcggggttta 1620
agggtatata agtttctcgg ggctaaactt ggttacactt gaccccaatg gaggcgtggg 1680
ggtgcttgga ggagtttgcg gacgtgcgcc gtttgctgga cgagagctct agcaatacct 1740
atagtatttg gaggtatctg tggggctcta ctcaggccaa gttggtcttc agaattaagc 1800
aggattacaa gtgcgatttt gaagagcttt ttagttcctg tggtgagctt ttgcaatcct 1860
tgaatctggg ccaccaggct atcttccagg aaaaggttct ctcgactttg gatttttcca 1920
ctcccgggcg caccgccgct tgtgtggctt ttgtgtcttt tgtgcaagat aaatggagcg 1980
gggagaccca cctgagtcac ggctacgtgc tggatttcat ggcgatggct ctttggaggg 2040
cttacaacaa atggaagatt cagaaggaac tgtacggttc cgccctacgt cgtccacttc 2100
tgcagcggca ggggctgatg tttcccgacc atcgccagca tcagaatctg gaagacgagc 2160
gagcggagaa gatcagcttg agagccggcc tggaccctcc tcaggaggaa tgaatctccc 2220
gcaggtggtt gagctgtttc ccgaactgag acgggtcctg actatcaggg aggatggtca 2280
gtttgtgaag aagctgaaga gggatcgggg tgagggagat gatgaggcgg ctagcaattt 2340
agcttttagt ctgataactc gccaccgacc ggaatgtatt acctatcagc agattaagga 2400
gagttgtgcc aacgagctgg atcttttggg tcagaagtat agcatagaac agcttaccac 2460
ttactggctt cagcccgggg atgattggga agaggcgatt agggtgtatg caaaggtggc 2520
cctgcggccc gattgcaagt ataagattac taagttggtt aatattagaa actgctgcta 2580
tatttctgga aacggggccg aagtggagat agatactgag gacagggtgg ctattaggtg 2640
ttgcatgata aacatgtggc ccgggatact ggggatggat ggggtgatat ttatgaatgt 2700
gaggttcacg ggccccaact ttaatggtac ggtgttcatg ggcaacacca acttgctcct 2760
gcatggtgcg agtttctatg ggtttaacaa cacctgtata gaggcctgga ccgatgtaaa 2820
ggttcgaggt tgttcctttt atagctgttg gaaggcggtg gtgtgtcgcc ctaaaagcag 2880
gggttctgtg aagaaatgct tgtttgaaag gtgcacccta ggtatccttt ctgagggcaa 2940
ctccagggtg cgccataatg tggcttcgaa ctgcggttgc ttcatgcaag tgaagggggt 3000
gagcgttatc aagcataact cggtctgtgg aaactgcgag gatcgcgcct ctcagatgct 3060
gacctgcttt gatggcaact gtcacctgtt gaagaccatt catataagca gtcaccccag 3120
aaaggcctgg cccgtgtttg agcataacat tctgacccgc tgttccttgc atctgggggt 3180
caggaggggt atgttcctgc cttaccagtg taactttagc cacactaaaa tcctgctgga 3240
acccgagtgc atgactaagg tcagcctgaa tggtgtgttt gatgtgagtc tgaagatttg 3300
gaaggtgctg aggtatgatg agaccaggac caggtgccga ccctgcgagt gcggcggcaa 3360
gcacatgaga aatcagcctg tgatgttgga tgtgaccgag gagcttaggc ctgaccatct 3420
ggtgctggcc tgcaccaggg ccgagtttgg gtctagcgat gaggataccg attgaggtgg 3480
gtaaggtggg cgtggctagc agggtgggcg tgtataaatt gggggtctaa ggggtctctc 3540
tgtttgtctt gcaacagccg ccgccatgag cgacaccggc aacagctttg atggaagcat 3600
ctttagtccc tatctgacag tgcgcatgcc tcactgggcc ggagtgcgtc agaatgtgat 3660
gggttccaac gtggatggac gtcccgttct gccttcaaat tcgtctacta tggcctacgc 3720
gaccgtggga ggaactccgc tggacgccgc gacctccgcc gccgcctccg ccgccgccgc 3780
gaccgcgcgc agcatggcta cggaccttta cagctctttg gtggcgagca gcgcggcctc 3840
tcgcgcgtct gctcgggatg agaaactgac tgctctgctg cttaaactgg aagacttgac 3900
ccgggagctg ggtcaactga cccagcaggt ttccagcttg cgtgagagca gccttgcctc 3960
cccctaatgg cccataatat aaataaaagc cagtctgttt ggattaagca agtgtatgtt 4020
ctttatttaa ctctccgcgc gcggtaagcc cgggaccagc ggtctcggtc gtttagggtg 4080
cggtggattt tttccaacac gtggtacagg tggctctgga tgtttagata catgggcatg 4140
agtccatccc tggggtggag gtagcaccac tgcagagctt cgtgctcggg ggtggtgttg 4200
tatatgatcc agtcgtagca ggagcgctgg gcgtggtgct gaaaaatgtc cttaagcaag 4260
aggcttatag cta 4273
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
tccctatcag tgatagaga 19

Claims (22)

1.一种细胞系，其中所述细胞系的细胞是HEK293细胞，其中所述细胞系是在ECACC保藏的登记号为17080901的细胞系，并且其中在CAG启动子的控制下表达四环素阻遏物(Tet-R)。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其中在所述细胞系的至少90％的细胞中表达四环素阻遏物(Tet-R)。
3.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中表达随时间稳定。
4.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下，Tet-R抑制在所述细胞系的启动子中包含了一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的基因的转录。
5.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中对编码Tet-R的基因在真核细胞中的表达进行密码子优化。
6.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中对编码Tet-R的基因在哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。
7.根据权利要求1或2所述的细胞系，其还包含
(i)在其基因组中的突变、缺失或插入，所述突变、缺失或插入减少或阻止选自一种或多于一种IFN基因的刺激因子、一种或多于一种JAK/STAT转录激活因子和一种或多于一种IFN刺激基因(ISG)的功能蛋白的表达，和/或
(ii)与编码Tet-R的基因遗传连接的编码选择标记的基因。
8.根据权利要求7所述的细胞系，其中所述IFN基因的刺激因子是cGas或STING。
9.根据权利要求7所述的细胞系，其中所述IFN刺激基因(ISG)是PKR、MX1、OAS1、APOBEC3G、TRIM5、ZAP、ISG15、ADAR、IFITM1/2/3、BST2和/或RSAD2。
10.根据权利要求7所述的细胞系，其中所述选择标记是G418、潮霉素B、嘌呤霉素、杀稻瘟素或吉欧霉素抗性基因。
11.根据权利要求1或2所述的细胞系，其包含稳定整合到其基因组中的编码四环素阻遏物(Tet-R)的基因。
12.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系的细胞表达形成感染性病毒颗粒所需的至少一种病毒基因。
13.根据权利要求12所述的细胞系，其中所述至少一种病毒基因选自E1-A和E1-B。
14.根据权利要求12所述的细胞系，其中所述至少一种病毒基因包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因。
15.根据权利要求1或2所述的细胞系，还包含病毒基因组，所述病毒基因组能够组装成感染性病毒颗粒并且包含受包含一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的启动子控制的至少一个异源基因。
16.根据权利要求15所述的细胞系，其中
(i)所述病毒基因组选自疱疹病毒基因组、经修饰的牛痘安卡拉病毒基因组和腺病毒基因组，和/或
(ii)所述异源基因是对细胞有毒性的或干扰病毒复制周期。
17.根据权利要求15所述的细胞系，其中所述病毒基因组是腺病毒基因组。
18.根据权利要求15所述的细胞系，其中所述异源基因选自自身抗原、病毒基因、细胞来源基因、编码与肿瘤相关的新抗原的组合的合成序列和编码新表位的序列。
19.根据权利要求18所述的细胞系，其中
(i)所述自身抗原选自HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA、PSMA、端粒酶、gplOO、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ES0-1、存活蛋白、溶基质蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML6S、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NYC0-5S、NY-BR-62、hKLP2和VEGF，
(ii)所述病毒基因选自HCV E1-E2蛋白、狂犬病糖蛋白和HIV-1GP 160，和/或
(iii)所述细胞来源基因选自Tim-3、Her2和E2 F-1。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的细胞系在制备感染性病毒颗粒中的用途。
21.一种用于制备感染性病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
(i)在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下使权利要求15至19中任一项所述的细胞系的细胞在体外生长；或
(ii)用病毒载体感染权利要求1至14中任一项所述的细胞系的细胞；和
(iii)回收病毒颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
CN201880069487.5A 2017-10-25 2018-10-25 真核细胞系 Active CN111386126B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17198339.8 2017-10-25
EP17198339 2017-10-25
PCT/EP2018/079341 WO2019081673A1 (en) 2017-10-25 2018-10-25 LINE OF EUKARYOTIC CELLS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111386126A CN111386126A (zh) 2020-07-07
CN111386126B true CN111386126B (zh) 2024-01-30

Family

ID=60182488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880069487.5A Active CN111386126B (zh) 2017-10-25 2018-10-25 真核细胞系

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11643666B2 (zh)
EP (1) EP3700560A1 (zh)
JP (1) JP7274225B2 (zh)
KR (1) KR20200101322A (zh)
CN (1) CN111386126B (zh)
AU (1) AU2018356538B2 (zh)
BR (1) BR112020007772A2 (zh)
CA (1) CA3076026A1 (zh)
IL (1) IL274191A (zh)
MX (1) MX2020004305A (zh)
SG (1) SG11202003609VA (zh)
WO (1) WO2019081673A1 (zh)

Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464758A (en) * 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
CA2244412A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor
AU4456699A (en) * 1994-07-01 1999-11-25 Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg Tetracycline-regulated transcriptional modulaters
CA2585523A1 (en) * 2004-11-02 2006-05-11 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Adenoviral amplicon and producer cells for the production of replication-defective adenoviral vectors, methods of preparation and use thereof
CN1898387A (zh) * 2003-12-22 2007-01-17 塞尔蛋白质股份有限公司 用于无抗生素表达的表达载体
WO2007073513A2 (en) * 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
CN101384902A (zh) * 2005-12-16 2009-03-11 Uab研究基金会 与使用病毒载体控制的基因表达相关的组合物和方法
CN101988071A (zh) * 2001-10-11 2011-03-23 默沙东公司 丙型肝炎病毒疫苗
CN102164611A (zh) * 2008-07-24 2011-08-24 Ns基因公司 生长因子metrnl的治疗用途
WO2011126370A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-13 Universiteit Utrecht Holding B.V. Recombinant multimeric influenza proteins
CN102311973A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体
CN102344903A (zh) * 2010-07-29 2012-02-08 首都医科大学附属北京友谊医院 成体大鼠肝脏卵圆细胞系及其用途
WO2012039607A1 (en) * 2010-09-20 2012-03-29 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Methods to produce bunyavirus replicon particles
CN102719478A (zh) * 2004-01-23 2012-10-10 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
CN102747096A (zh) * 2011-04-18 2012-10-24 中国医学科学院基础医学研究所 基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途
WO2013077645A1 (ko) * 2011-11-24 2013-05-30 주식회사 바이로메드 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도
CN103442731A (zh) * 2010-12-30 2013-12-11 欧卡罗斯有限公司 表达系统
CN103820392A (zh) * 2012-11-18 2014-05-28 复旦大学附属华山医院 基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法
CN104212802A (zh) * 2014-09-25 2014-12-17 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
CN104780937A (zh) * 2012-07-05 2015-07-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 涉及由多核苷酸编码的免疫原性多肽的新型初免-加强方案
WO2015127140A2 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 Jody Berry Marburg monoclonal antibodies
GB201513242D0 (en) * 2015-07-28 2015-09-09 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Condon optimised tet repressor proteins
AU2016244220A1 (en) * 2008-12-23 2016-10-27 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
CN107058387A (zh) * 2017-04-13 2017-08-18 新乡医学院 一种适合hek293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用
WO2018213353A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Cairn Biosciences, Inc. Multiplex assay

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008104357A (ja) * 2005-02-09 2008-05-08 Banyu Pharmaceut Co Ltd ＴｅｔＲ発現非ヒトトランスジェニック動物及びその製造方法
JP4944781B2 (ja) 2005-09-15 2012-06-06 独立行政法人科学技術振興機構 テトラサイクリン系抗生物質によるタンパク質分解制御法
US20070122880A1 (en) * 2005-10-19 2007-05-31 Institut Curie Vector for the inducible expression of gene sequences
US9034645B2 (en) * 2008-05-28 2015-05-19 Oregon Health & Science University Methods of identifying inhibitors of gene silencing in mammalian cells
US8796440B2 (en) * 2009-08-31 2014-08-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Promote system for regulatable gene expression in mammalian cells
EP3423473A4 (en) * 2016-03-04 2019-10-30 New York University VIRUS VECTORS FOR EXPRESSING MULTIPLE EPITOPES OF TUMOR ASSOCIATED ANTIGENES TO INDUCT ANTITUMORIMMUNITY
US11185555B2 (en) * 2016-04-11 2021-11-30 Noah James Harrison Method to kill pathogenic microbes in a patient

Patent Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464758A (en) * 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
AU4456699A (en) * 1994-07-01 1999-11-25 Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg Tetracycline-regulated transcriptional modulaters
CA2244412A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor
CN101988071A (zh) * 2001-10-11 2011-03-23 默沙东公司 丙型肝炎病毒疫苗
CN1898387A (zh) * 2003-12-22 2007-01-17 塞尔蛋白质股份有限公司 用于无抗生素表达的表达载体
CN102719478A (zh) * 2004-01-23 2012-10-10 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
CA2585523A1 (en) * 2004-11-02 2006-05-11 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Adenoviral amplicon and producer cells for the production of replication-defective adenoviral vectors, methods of preparation and use thereof
WO2007073513A2 (en) * 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
CN101384902A (zh) * 2005-12-16 2009-03-11 Uab研究基金会 与使用病毒载体控制的基因表达相关的组合物和方法
CN102164611A (zh) * 2008-07-24 2011-08-24 Ns基因公司 生长因子metrnl的治疗用途
AU2016244220A1 (en) * 2008-12-23 2016-10-27 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
WO2011126370A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-13 Universiteit Utrecht Holding B.V. Recombinant multimeric influenza proteins
CN102939102A (zh) * 2010-04-09 2013-02-20 乌得勒支大学控股有限责任公司 重组多聚流感蛋白
CN102311973A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体
CN102344903A (zh) * 2010-07-29 2012-02-08 首都医科大学附属北京友谊医院 成体大鼠肝脏卵圆细胞系及其用途
WO2012039607A1 (en) * 2010-09-20 2012-03-29 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Methods to produce bunyavirus replicon particles
CN103209706A (zh) * 2010-09-20 2013-07-17 农业研究基金会 生产布尼亚病毒复制子颗粒的方法
CN103442731A (zh) * 2010-12-30 2013-12-11 欧卡罗斯有限公司 表达系统
CN102747096A (zh) * 2011-04-18 2012-10-24 中国医学科学院基础医学研究所 基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途
WO2013077645A1 (ko) * 2011-11-24 2013-05-30 주식회사 바이로메드 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도
CN104780937A (zh) * 2012-07-05 2015-07-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 涉及由多核苷酸编码的免疫原性多肽的新型初免-加强方案
CN103820392A (zh) * 2012-11-18 2014-05-28 复旦大学附属华山医院 基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法
WO2015127140A2 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 Jody Berry Marburg monoclonal antibodies
CN104212802A (zh) * 2014-09-25 2014-12-17 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
GB201513242D0 (en) * 2015-07-28 2015-09-09 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Condon optimised tet repressor proteins
WO2017017131A1 (en) * 2015-07-28 2017-02-02 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Codon optimised tet repressor proteins
CN107058387A (zh) * 2017-04-13 2017-08-18 新乡医学院 一种适合hek293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用
WO2018213353A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Cairn Biosciences, Inc. Multiplex assay

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CMV promoter mutants with a reduced propensity to productivity loss in CHO cells;Benjamin Moritz等;《Scientific Reports》;20151119;摘要 *
Cyclic GMP-AMP Synthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I Interferon Pathway;L. SUN等;《SCIENCE》;20130215;786-791 *
Development of inducible EIAV-based lentiviral vector packaging and producer cel1 lines;HJ STEWART等;《GENE THERAPY》;20090305;805-814 *
Specific Knockdown of 0CT4 in Human Embryonic Stem Ce11s by Inducible Short Hairpin RNA Interference;GAETANO ZAFARANA等;《STEM CELLS》;20090401;776-782 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020114699A (ru) 2021-11-25
CA3076026A1 (en) 2019-05-02
MX2020004305A (es) 2020-11-11
JP7274225B2 (ja) 2023-05-16
BR112020007772A2 (pt) 2020-10-06
RU2020114699A3 (zh) 2021-11-25
KR20200101322A (ko) 2020-08-27
WO2019081673A1 (en) 2019-05-02
EP3700560A1 (en) 2020-09-02
JP2021500011A (ja) 2021-01-07
US20200308601A1 (en) 2020-10-01
IL274191A (en) 2020-06-30
SG11202003609VA (en) 2020-05-28
US11643666B2 (en) 2023-05-09
AU2018356538A1 (en) 2020-05-14
CN111386126A (zh) 2020-07-07
AU2018356538B2 (en) 2023-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Berkner Expression of heterologous sequences in adenoviral vectors
US6492169B1 (en) Complementing cell lines
US6677156B2 (en) Non-adenoviral gene product-based complementing cells for adenoviral vectors
US6682929B2 (en) Adenovector complementing cells
US8114637B2 (en) Packaging cells for recombinant adenovirus
US6844192B2 (en) Adenovirus E4 protein variants for virus production
Tan et al. An adenovirus–Epstein-Barr virus hybrid vector that stably transforms cultured cells with high efficiency
DK2393919T3 (en) New permanent human cell line
JP5969044B2 (ja) アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途
US20090253184A1 (en) Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line
CN111386126B (zh) 真核细胞系
US20070014769A1 (en) Adenovirus vectors comprising meganuclease-type endonucleases, and related systems
RU2776531C2 (ru) Эукариотическая клеточная линия
JP5468780B2 (ja) 産生能を増大させるタンパク質因子、新規な細胞株及びその使用
US8709778B2 (en) Method of adenoviral vector synthesis
CA2871531C (en) Nucleic acid construct and use of the same
El-Mogy et al. Transgene Expression under the Adenoviral Major Late Promoter, Tripartite Leader Sequence and E1 Genes in Absence and Presence of Adenovirus Infection
Cultured Epstein-Barr Virus Hybrid− An Adenovirus
Fernandes Bioprocess Design of Canine Adenovirus Vectors for Gene Therapy Applications
WO2009006300A2 (en) Production cell lines for adenoviral manufacturing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant